Citometro de Flujo BECKMAN

Citómetro de flujo COULTER® EPICS ALTRA™ Sistema COULTER® EPICS ALTRA HyPerSort™

Apéndice de las Instrucciones de uso

Nº ref. 177470A (Noviembre de 2002) Beckman Coulter, Inc. Fullerton, CA 92835

ADVERTENCIAS Y PRECAUCIONES ANTES DE PONER EN MARCHA EL INSTRUMENTO, LEA LOS MANUALES DEL PRODUCTO Y CONSULTE AL PERSONAL ESPECIALIZADO DE BECKMAN COULTER. NO REALICE NINGÚN PROCEDIMIENTO HASTA HABER LEÍDO DETENIDAMENTE TODAS LAS INSTRUCCIONES. SIGA SIEMPRE LAS INDICACIONES DEL PRODUCTO Y LAS RECOMENDACIONES DEL FABRICANTE. SI TIENE ALGUNA DUDA SOBRE LA FORMA DE PROCEDER EN CUALQUIER TIPO DE SITUACIÓN, PÓNGASE EN CONTACTO CON SU REPRESENTANTE DE BECKMAN COULTER. PELIGROS, PRECAUCIONES Y LIMITACIONES SOBRE EL FUNCIONAMIENTO Los avisos de ADVERTENCIA, PRECAUCIÓN e IMPORTANTE alertan de lo siguiente: ADVERTENCIA PRECAUCIÓN IMPORTANTE

-

Puede causar lesiones personales. Puede ocasionar daños en el instrumento. Puede producir resultados erróneos.

BECKMAN COULTER, INC. INSTA A SUS CLIENTES A QUE CUMPLAN TODAS LAS NORMAS NACIONALES SOBRE SALUD Y SEGURIDAD, COMO LA UTILIZACIÓN DE MEDIDAS DE PROTECCIÓN. ENTRE ÉSTAS SE INCLUYEN, AUNQUE SIN LIMITARSE A ELLAS: GAFAS PROTECTORAS, GUANTES E INDUMENTARIA ADECUADA PARA EL TRABAJO EN LABORATORIO, YA SEA DURANTE LA UTILIZACIÓN O EL MANTENIMIENTO DE ESTE ANALIZADOR O DE CUALQUIER OTRO DISPOSITIVO AUTOMÁTICO DE LABORATORIO. ADVERTENCIA El usuario podría sufrir lesiones personales si: r No se cierran y bloquean todas las puertas, cubiertas y paneles antes de poner en marcha el instrumento y durante el funcionamiento del mismo. r Se ve afectada la integridad de los bloqueos y sensores de seguridad. r Se hace caso omiso de las alarmas y los mensajes de error emitidos por los instrumentos. r Se entra en contacto con piezas móviles. r Se manejan de forma inadecuada piezas rotas. r Se abren, cierran, montan y desmontan las puertas, las cubiertas y los paneles sin cuidado. r Se utilizan herramientas inadecuadas para la detección y solución de problemas. Para evitar lesiones: r Mantenga las puertas, las cubiertas y los paneles cerrados y bloqueados cuando utilice el instrumento. r Aproveche al máximo las funciones de seguridad del instrumento. No deje de utilizar los bloqueos y sensores de seguridad. r Cuando reciba alarmas y mensajes de error del instrumento, tome las medidas necesarias para solucionarlos. r Manténgase alejado de las piezas móviles. r Si se produjese la rotura de alguna pieza, informe a su representante de Beckman Coulter. r Abra y cierre, o saque y coloque, las puertas, cubiertas y paneles con cuidado. r Utilice las herramientas adecuadas durante la detección y solución de problemas. PRECAUCIÓN La integridad del sistema podría verse afectada negativamente y podrían producirse fallos en el funcionamiento si: r El equipo se utiliza de una manera distinta de la especificada. Utilice el instrumento siguiendo las instrucciones de los manuales del producto. r Instala software no autorizado por Beckman Coulter en el ordenador. En el ordenador del sistema únicamente debe instalarse software autorizado por Beckman Coulter. r Instala una versión del software que no es la original. Utilice únicamente software original para evitar la contaminación por virus informáticos. IMPORTANTE Si adquirió este producto en algún lugar que no sea Beckman Coulter o un distribuidor autorizado por Beckman Coulter, y si actualmente no dispone de contrato de mantenimiento de servicio con Beckman Coulter, Beckman Coulter no puede garantizar que el producto haya sido actualizado con las últimas revisiones de ingeniería de carácter obligatorio ni que recibirá los boletines de información actualizada relacionados con el producto. Si compró este producto a otra empresa y desea recibir más información sobre este tema, póngase en contacto con su representante de Beckman Coulter.

REVISIONES

Primera edición, 11/02 El apéndice se creó para cumplir la directiva sobre productos sanitarios para diagnósticos in vitro de la UE (98/79/EC).

Este documento es válido para las últimas versiones del software mencionadas y para otras posteriores. Cuando la información de este documento cambie debido a la aparición de una nueva versión del software, publicaremos una nueva edición del documento. Este apéndice contiene información nueva. También puede incluir información de la revisión anterior de este apéndice.

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REVISIONES

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CONTENIDO ADVERTENCIAS Y PRECAUCIONES, ii INTRODUCCIÓN, xi ACERCA DE ESTE MANUAL, xi CONVENCIONES, xi 1

2

ESTACIÓN DE TRABAJO MULTIMEDIA COULTER® FLOWCENTRE, 1-1 1.1

DESCRIPCIÓN GENERAL, 1-1

1.2

INICIO DEL SOFTWARE ALTRA O ELITE™, 1-2 NOTAS SOBRE CÓMO TRABAJAR CON EL SOFTWARE ALTRA O ELITE Y WINDOWS 98 SE, 1-2 INICIO DEL SOFTWARE ALTRA O ELITE, 1-2 INICIO DE WIN 98 SE, 1-2 CÓMO SALIR A MS-DOS DESDE EL SOFTWARE ALTRA O ELITE, 1-2 REINICIO DEL SOFTWARE ALTRA O ELITE DESDE MS-DOS, 1-3

INFORMACIÓN DE REFERENCIA, 2-1 2.1

USO PREVISTO, 2-1

2.2

CALIBRACIÓN DE LA OPCIÓN DE SEPARACIÓN Autoclone™ DESPUÉS DE LA INSTALACIÓN, 2-2

2.3

PRINCIPIOS DE FUNCIONAMIENTO, 2-4 DESCRIPCIÓN GENERAL DEL SISTEMA, 2-4 PRESENTACIÓN DE LA MUESTRA, 2-4 Enfoque hidrodinámico, 2-5 Cámara de flujo, 2-5 Velocidad del líquido envolvente, 2-5 Núcleo de la muestra, 2-6 Diámetro, 2-6 Velocidad, 2-6 Presión del líquido envolvente, 2-6 Proporción de dispensación de la muestra, 2-6 RAYOS LÁSER, 2-7 Principios del láser, 2-7 Perfilación del rayo, 2-8 Lentes de perfilación del rayo, 2-8 Cuadro de selección de perfiladores del rayo, 2-9 Conjuntos de perfilación del rayo, 2-10 Tamaño del punto limitado por difracción, 2-11 Óptica de orientación del rayo, 2-12 ÁREA DE DETECCIÓN, 2-12 Dispersión, 2-12 Fluorescencia, 2-13 Captación de luz, 2-13 Cámara de vídeo, 2-14 Detector de dispersión frontal, 2-14

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CONTENIDO

Punta de la cámara de flujo SortSense™, 2-14 Lentes de fluorescencia, 2-15 Filtros ópticos, 2-15 SEÑALES, 2-17 Detectores, 2-17 Detector de dispersión frontal, 2-18 Tubos fotomultiplicadores (PMT), 2-18 Procesamiento de señales, 2-19 Integración, 2-20 Amplificación, 2-21 Parámetro Time of Flight, 2-21 Compensación de fluorescencia, 2-21 HISTOGRAMAS, 2-22 Discriminadores, 2-22 Peak-Sense-and-Hold (PSH), 2-23 Conversión analógica-digital (ADC), 2-23 Listado de datos, 2-23 Selecciones amorfas, 2-24 Histogramas de un parámetro, 2-24 Histogramas de dos parámetros, 2-24 DATOS EN MODO DE LISTA, 2-24 SEPARACIÓN, 2-24 DATOS ESTADÍSTICOS, 2-25 Datos estadísticos de región lineal, 2-25 Datos estadísticos de región logarítmica, 2-26 Concentración de la muestra, 2-26 Intervalo de tamaños de la muestra, 2-27 Volumen de la muestra, 2-27 Recipiente de muestras, 2-27

3

2.5

CARACTERÍSTICAS DE RENDIMIENTO, 2-27 Rendimiento del análisis, 2-27 Intervalo de detección de fluorescencia, 2-27 Sensibilidad de la fluorescencia, 2-27 Sensibilidad de la dispersión de luz, 2-27

2.6

PELIGROS BIOLÓGICOS, 2-27

2.7

SEGURIDAD DEL LÁSER, 2-28 Precauciones de seguridad, 2-28

2.8

PELIGROS DE RADIACIÓN, 2-29

INFORMACIÓN SOBRE PROCEDIMIENTOS ESPECIALES Y SOLUCIÓN DE PROBLEMAS, 3-1 Núcleo de la muestra, 3-1 Dispersión frontal, 3-1 Fluorescencia, 3-1 3.2

vi

PATRONES DE CALIBRACIÓN, 3-2 Calibradores y controles, 3-2

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CONTENIDO

3.3

PROCEDIMIENTOS DE CALIBRACIÓN, 3-2

3.5

VACIADO/LIMPIEZA DEL DEPÓSITO DE RESIDUOS, 3-3

3.6

LUBRICACIÓN DE LA JUNTA TÓRICA DEL TAPÓN DE MUESTRAS (HPSS), 3-9

3.8

SUSTITUCIÓN DE LA PUNTA DE LA CÁMARA DE FLUJO, 3-11

3.9

SUSTITUCIÓN DEL CUERPO DE LA CÁMARA DE FLUJO, 3-16

3.10 SUSTITUCIÓN DEL CONJUNTO DE TUBOS FLEXIBLES DE LA MUESTRA, 3-20 3.11 SUSTITUCIÓN DE FILTROS ÓPTICOS, 3-25 3.12 SUSTITUCIÓN DEL FILTRO DEL LÍQUIDO ENVOLVENTE O DE PURGADO DE RESIDUOS, 3-26 3.13 SUSTITUCIÓN DEL FILTRO DE LA CÁMARA DE ESCURRIDO, 3-29 3.14 SUSTITUCIÓN DEL CONJUNTO DEL PIE DEL TUBO, 3-30 3.15 AJUSTE DEL ADAPTADOR DEL TUBO, 3-31 3.16 SUSTITUCIÓN DEL TAPÓN DE RECOGIDA DE MUESTRAS, 3-31 3.17 SUSTITUCIÓN DE LA LÁMPARA DE FIBRA ÓPTICA, 3-34 3.18 AJUSTE DE PRESIONES (NO HPSS), 3-37 3.19 AJUSTE DE PRESIONES (HPSS), 3-39 3.20 ALINEACIÓN ÓPTICA PARCIAL, 3-40 3.21 ALINEACIÓN ÓPTICA COMPLETA, 3-43 Alineación aproximada de la cámara de flujo, 3-43 Alineación óptica con LED, 3-47 Alineación aproximada del rayo, 3-49 Ajustes finos, 3-54 Establecimiento de trazos para el sistema, 3-55 Ajustes finos finales, 3-57 3.22 SUSTITUCIÓN DEL FILTRO DE PURGADO DE LA MUESTRA EN HPSS, 3-57 3.23 SUSTITUCIÓN DEL FILTRO DE AIRE DEL LÍQUIDO ENVOLVENTE EN HPSS, 3-61 3.24 IDENTIFICACIÓN DE AVERÍAS, 3-64 Solución de problemas del inicio del sistema, 3-65 Solución de problemas del citómetro, 3-67 Solución de problemas de la estación de trabajo multimedia COULTER® FlowCentre™, 3-67 Solución de problemas de la impresora, 3-69 Solución de problemas del láser, 3-69 Solución de problemas de flujo de muestras, 3-70 Solución de problemas de drenaje de residuos, 3-72 Solución de problemas de adquisición, 3-72 Nº ref. 177470A

vii

CONTENIDO

Solución de problemas de fluoroesferas, 3-74 Solución de problemas de separación, 3-75 Solución de problemas de análisis de ADN, 3-83 3.25 MENSAJES DE ERROR DE LA PANTALLA TÁCTIL, 3-84 3.26 PROCEDIMIENTOS DE DIAGNÓSTICO, 3-85 Comprobación de los PMT y los procesadores de señales, 3-85 Comprobación de la configuración del detector óptico de códigos de barras, 3-87 ÍNDICE, ÍNDICE-1 MARCAS COMERCIALES

viii

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CONTENIDO

ILUSTRACIONES 2.1 2.2 2.3 2.4 2.5 2.6 2.7 2.8 2.9 2.10 2.11 2.12 2.13 2.14 2.15 3.1

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Cámara de flujo y cuerpo estándar, 2-5 Cámara de flujo y cuerpo HPSS, 2-5 Perfilación del rayo mediante lentes cilíndricas transversales, 2-8 Perfiladores del rayo, 2-9 Conjunto de orientación del rayo, 2-12 Sistema óptico, 2-13 Detector de dispersión frontal, 2-14 Punta de la cámara de flujo SortSense™, 2-15 Ranuras para filtros , 2-16 Configuración de filtros, ejemplo, 2-17 Tubo fotomultiplicador (PMT), 2-19 Procesamiento de señales, 2-20 Señales integral y de pico, 2-21 Solapamiento de fluorescencia, 2-22 Conversión analógica-digital, 2-23 Conexiones de hardware, 3-66

ix

CONTENIDO

TABLAS 3.1 3.2 3.3 3.4 3.5 3.6 3.7 3.8 3.9 3.10 3.11 3.12 3.13

x

Calibradores y controles, 3-2 Inicio del sistema, 3-65 Citómetro, 3-67 Estación de trabajo multimedia FlowCentre, 3-67 Impresora, 3-69 Láseres, 3-69 Flujo de muestras, 3-70 Drenaje de residuos, 3-72 Adquisición, 3-72 Fluoroesferas, 3-74 Separación, 3-76 Análisis de ADN, 3-83 Mensajes de error de la pantalla táctil, 3-84

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INTRODUCCIÓN Esta sección de introducción contiene los siguientes temas: r

Acerca de este manual

r

Convenciones

ACERCA DE ESTE MANUAL El apéndice de las instrucciones de uso del citómetro de flujo EPICS ALTRA y del sistema EPICS ALTRA HyPerSort contiene información adicional que no se incluye en las instrucciones de uso. Esta información está organizada como se indica a continuación: r

Capítulo 1, Estación de trabajo multimedia COULTER® FlowCentre Contiene información preliminar para arrancar el software ALTRA o ELITE y Windows 98 SE.

r

Capítulo 2, Información de referencia Contiene información de referencia relativa al funcionamiento del instrumento que no se incluye en las instrucciones de uso del citómetro de flujo EPICS ALTRA ni del sistema EPICS ALTRA HyPerSort: Uso previsto, Historial de métodos y Principios de funcionamiento.

r

Capítulo 3, Información sobre procedimientos especiales y solución de problemas Contiene información de solución de problemas relativa al funcionamiento del instrumento que no se incluye en las instrucciones de uso del citómetro de flujo EPICS ALTRA ni del sistema EPICS ALTRA HyPerSort: Calibración, Procedimientos de limpieza, Procedimientos de sustitución y Procedimientos para solucionar problemas.

En la página de Documentación de la contraportada de este manual se detalla el contenido de cada manual. Esta página puede ayudarle a determinar rápidamente cuál es el manual que contiene la información que necesita.

CONVENCIONES En este manual se utilizan las siguientes convenciones: El texto en cursiva indica mensajes que aparecen en pantalla. El texto en negrita indica que se trata de un elemento de menú. La fuente Courier indica texto que el usuario debe escribir utilizando el teclado. ì indica una tecla (por ejemplo: Û). ì+ì quiere decir que las dos teclas señaladas (por ejemplo Þ+Ê) son necesarias para realizar una función específica y deben pulsarse en el orden en el que aparecen: 1. Pulse la primera tecla indicada y, sin soltarla, pulse la segunda tecla. 2. Suelte ambas teclas al mismo tiempo. ì ì indica que se debe pulsar y soltar la primera tecla y después pulsar y soltar la segunda. Por ejemplo, y Û.

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xi

INTRODUCCIÓN CONVENCIONES

Screen tt Analysis

Seleccione el elemento Screen del menú Analysis.

[OKAY]

Utilice el ratón para hacer clic en el botón de la pantalla denominado [OKAY].

→ ÉaÔ

xii

Mueva el ratón para mover o arrastrar algún elemento de la pantalla. Teclas de funciones especiales.

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1ESTACIÓN DE TRABAJO MULTIMEDIA COULTER 1.1

®

FLOWCENTRE

DESCRIPCIÓN GENERAL Esta sección es una introducción de la estación de trabajo multimedia COULTER FlowCentre. La estación de trabajo multimedia FlowCentre es una estación de trabajo de arranque doble que incluye: r

el sistema operativo Microsoft Windows 98, segunda edición (WIN 98 SE);

r

el sistema operativo Microsoft MS-DOS® 6.22 (DOS).

La estación de trabajo multimedia FlowCentre está configurada para ejecutar el software COULTER® EPICS® XL Flow Cytometer SYSTEM II, el software COULTER EPICS ALTRA o el software COULTER EPICS Elite. También puede utilizar el software EXPO32 o EXPO32 ADC Cytometer que, si está instalado, le ofrece la solución a los requisitos de adquisición y análisis de datos del sistema operativo Windows. Windows 98 SE tiene posibilidades multitarea que le permiten adquirir datos e imprimir informes de experimentos en segundo plano mientras trabaja simultáneamente en otra aplicación. El resultado es un aumento de la productividad y la creatividad de los informes, análisis y presentaciones de los datos. El entorno Windows le ofrece todas las herramientas de edición y ayuda en línea con las que está familiarizado. Consulte la documentación que acompaña a su versión del software EXPO32 o EXPO32 ADC si desea instrucciones detalladas de cómo utilizarlo.

7415003E

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1-1

1

ESTACIÓN DE TRABAJO MULTIMEDIA COULTER® FLOWCENTRE INICIO DEL SOFTWARE ALTRA O ELITE™

1.2

INICIO DEL SOFTWARE ALTRA O ELITE™ NOTAS SOBRE CÓMO TRABAJAR CON EL SOFTWARE ALTRA O ELITE Y WINDOWS 98 SE El software ALTRA y Elite se han validado para funcionar exclusivamente con el sistema operativo MS-DOS. Por ello, el software funciona con el sistema operativo MS-DOS y no con el entorno Windows 98 SE ni en una ventana MS-DOS desde Windows 98 SE. No inicie el software ALTRA o Elite desde un icono del escritorio de WIN 98 SE ni desde la línea de comandos de MS-DOS bajo WIN 98 SE. Durante el inicio del sistema, aparece el menú Startup de WIN 98 SE. El menú muestra 8 opciones para iniciar el sistema operativo, entre las que se incluyen 8. Previous version of MS-DOS, (software ALTRA o Elite) y 1. Normal, (sistema operativo WIN 98 SE). Si no hace una selección en un plazo de 90 segundos, el sistema inicia automáticamente WIN 98 SE.

INICIO DEL SOFTWARE ALTRA O ELITE Para iniciar el software ALTRA o Elite, en el menú Startup de WIN 98 SE pulse 8 y después Û para seleccionar la opción 8. Previous version of MS-DOS durante el arranque del sistema.

INICIO DE WIN 98 SE Para iniciar WIN 98 SE, en el menú Startup de WIN 98 SE pulse 1 y a continuación Û para seleccionar la opción 1. Normal. De esta forma se carga el sistema operativo WIN 98 SE y aparece el escritorio de WIN 98 SE. Tenga en cuenta que el software ALTRA y Elite no es accesible desde el sistema operativo WIN 98 SE. El software EXPO, si está instalado, es accesible desde el escritorio de WIN 98 SE.

Microsoft Windows 98 Startup Menu 1. Normal 2. Logged ( \BOOTLOG.TXT) 3. Safe Mode 4. Safe mode with network support 5. Step-by-step confirmation 6. Command prompt only 7. Safe mode command prompt only 8. Previous version of MS-DOS

MENU

7415005D

CÓMO SALIR A MS-DOS DESDE EL SOFTWARE ALTRA O ELITE Seleccione Exit en el menú Applications para desactivar el software ALTRA o Elite y cambiar al sistema operativo MS-DOS (si desea información sobre el sistema operativo MS-DOS, consulte los manuales correspondientes). El citómetro permanece encendido. Para volver al sistema operativo WIN 98 SE, reinicie la estación de trabajo (pulse Ý+ Þ + á) y seleccione la opción 1. Para desconectar el citómetro y el ordenador, apague el interruptor de alimentación del citómetro.

1-2

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ESTACIÓN DE TRABAJO MULTIMEDIA COULTER® FLOWCENTRE INICIO DEL SOFTWARE ALTRA O ELITE™

REINICIO DEL SOFTWARE ALTRA O ELITE DESDE MS-DOS Para volver al software ALTRA o Elite desde el sistema operativo MS-DOS, escriba CYTOMETE y pulse Û cuando aparezca C:\ALTRA> o C:\ELITE> en la línea de comandos. Nota: consulte el manual de producto del instrumento correspondiente para ver la ubicación de los interruptores de alimentación.

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1-3

1

ESTACIÓN DE TRABAJO MULTIMEDIA COULTER® FLOWCENTRE INICIO DEL SOFTWARE ALTRA O ELITE™

1-4

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2INFORMACIÓN DE REFERENCIA 2 2.1

USO PREVISTO El citómetro de flujo COULTER EPICS ALTRA y el sistema ALTRA HyPerSort (HPSS) son instrumentos de laboratorio de usos generales. Por su diseño, son instrumentos científicos versátiles capaces de ejecutar diversas aplicaciones utilizando una amplia variedad de reactivos y sistemas de reactivos. Tenga cuidado siempre que el instrumento esté configurado para su uso con un determinado reactivo o se hayan efectuado ciertos ajustes para recopilar información específica. Cuando no haya protocolos publicados o se haya establecido el uso de un sistema de reactivos con el citómetro de flujo ALTRA, deberá validarse todo el sistema para garantizar que la configuración es correcta y que los datos generados son coherentes con las expectativas de la aplicación. La mayoría de los procedimientos e información que se incluyen en los manuales del producto se aplican a todos los citómetros de flujo ALTRA. La información que sólo se aplica a los citómetros de flujo del sistema ALTRA HyPerSort (HPSS), incluyen HPSS en el nombre del procedimiento.

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2-1

INFORMACIÓN DE REFERENCIA CALIBRACIÓN DE LA OPCIÓN DE SEPARACIÓN Autoclone™ DESPUÉS DE LA INSTALACIÓN

2.2

CALIBRACIÓN DE LA OPCIÓN DE SEPARACIÓN Autoclone™ DESPUÉS DE LA INSTALACIÓN Si el sistema cuenta con la opción de separación Autoclone, deberá realizar este procedimiento de calibración abreviado después de la instalación o reinstalación del software ALTRA:

IMPORTANTE Riesgo de descarga eléctrica. El voltaje de las placas deflectoras puede producirle una descarga. NO toque las placas deflectoras si está encendido el botón H.V. ON. Si está encendido, púlselo para apagar las placas deflectoras.

2-2

1

Si el botón H.V. ON está encendido, púlselo para apagar las placas deflectoras.

2

Quite la placa trasera que cubre el brazo de Autoclone girando la rueda de desactivación en el sentido contrario a las agujas del reloj.

DA

NG

ER

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INFORMACIÓN DE REFERENCIA CALIBRACIÓN DE LA OPCIÓN DE SEPARACIÓN Autoclone™ DESPUÉS DE LA INSTALACIÓN

3

En la pantalla táctil MAIN del citómetro, seleccione por este orden: Options

Autoclone Control

4

En la pantalla Autoclone, seleccione: Adjust Screen

5

En la pantalla Autoclone Adjustment, seleccione: Calibrate

6

7

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Después de la calibración, retraiga el brazo de Autoclone. Seleccione:

En la pantalla Autoclone Control, seleccione:

Autoclone Control

Retract Screen

2-3

2

INFORMACIÓN DE REFERENCIA PRINCIPIOS DE FUNCIONAMIENTO

8

Siga las instrucciones de la pantalla Retract y pulse: OK

9

2.3

Vuelva a colocar la cubierta de Autoclone.

PRINCIPIOS DE FUNCIONAMIENTO DESCRIPCIÓN GENERAL DEL SISTEMA El sistema mide la fluorescencia y la dispersión de luz de las células de una en una. Las mediciones correlacionadas se presentan en histogramas. Con la preparación de la muestra y los reactivos apropiados, podrá analizar estos histogramas para obtener un perfil de las características de la muestra. Basándose en estas características podrá separar dos clases de partículas. La medición y la separación en citometría de flujo puede dividirse en los siguientes procesos. Para obtener una medición precisa, el citómetro de flujo: r

Presenta la muestra, una célula cada vez, a los sensores y rayos láser.

r

Regula y perfila los rayos láser.

r

Capta y separa la fluorescencia y la luz láser dispersada que emite la célula al pasar por el rayo láser.

r

Convierte la luz en pulsos eléctricos con voltajes proporcionales a la intensidad de la luz. Los pulsos eléctricos deben amplificarse y procesarse.

r

Convierte el voltaje de pico del pulso procesado en un número de canal proporcional para un histograma o datos en modo de lista.

r

Acondiciona el caudal para la separación y toma decisiones de separación basándose en las mediciones.

PRESENTACIÓN DE LA MUESTRA Para analizar cada célula de una suspensión de muestra que pasa por un rayo láser, las células deben separarse unas de otras y el rayo láser debe ser lo suficientemente pequeño para que no puedan atravesarlo dos células al mismo tiempo. Por esta razón, los rayos láser se enfocan hacia una sección transversal muy estrecha. El caudal de partículas de la muestra fluye a través de los rayos láser en ángulo recto. Para separar las células, este caudal también se dirige utilizando el “enfoque hidrodinámico”.

2-4

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INFORMACIÓN DE REFERENCIA PRINCIPIOS DE FUNCIONAMIENTO

Enfoque hidrodinámico El líquido envolvente fluye a través de una boquilla estrecha (cámara de flujo). La suspensión de la muestra se inyecta en el centro del líquido envolvente mediante un tubo pequeño (varilla de inserción de la muestra). El flujo de la suspensión de la muestra y el líquido envolvente que atraviesa la cámara de flujo es laminar y los líquidos no se mezclan. El caudal de la muestra (núcleo de la muestra) queda rodeado por el caudal de líquido envolvente a medida que los líquidos fluyen por la cámara de flujo. Cámara de flujo La cámara de flujo está montada sobre la mesa óptica. En la parte superior se encuentra el tubo de inserción de la muestra. En la cámara de flujo hay un orificio por el que entra el líquido envolvente. La parte superior de la cámara de flujo es cónica y se estrecha hasta convertirse en un canal cuadrado de cuarzo de 250 µm (76 µm con cuarzo de alta velocidad o 150 µm con la opción HPSS) en el área de detección. En la cámara de flujo hay una lente para la captación de la luz; consulte la Figura 2.1. Para ver la cámara de flujo y el cuerpo HPSS, consulte la Figura 2.2. Después de pasar por el área de detección, el líquido sale por un orificio de 76 µm o 100 µm (70 µm con la cámara de flujo 70-µm HyPerSortSense™, o directamente por el canal de 76 µm de la cámara de flujo 76 mm HyPerSortSense, o un orificio de 76 µm con el cuarzo de alta velocidad del HPSS). .

Figura 2.1 Cámara de flujo y cuerpo estándar Tubo flexible

Figura 2.2 Cámara de flujo y cuerpo HPSS Tubo flexible

Adaptador del tubo

Adaptador del tubo Varilla de inserción de muestras

Refuerzo

Líquido envolvente

Vacío

Varilla de nserción de muestras Líquido envolvente

Junta tórica

Lente 7467108B

Refuerzo

Vacío

Junta tórica

Lente Caudal de líquido

7467107B

Caudal de líquido

Velocidad del líquido envolvente En la velocidad del líquido envolvente influyen varios factores, incluida la presión del líquido y el tamaño del orificio de la punta de la cámara de flujo. Para el análisis/separación de muestras estándar, la velocidad en el canal de 250 µm es de 2 m/segundo. Para el HPSS, la velocidad en el área de detección es de 10 a 28 m/segundo. Nº ref. 177470A

2-5

2

INFORMACIÓN DE REFERENCIA PRINCIPIOS DE FUNCIONAMIENTO

Núcleo de la muestra A medida que se estrecha la cámara de flujo, los diámetros del caudal disminuyen y las velocidades aumentan. La resolución y la sensibilidad dependen parcialmente de la velocidad y el diámetro del núcleo de la muestra. Diámetro Al cambiar el diámetro del núcleo de la muestra cambia la resolución. Como la intensidad de la luz láser es menor en los bordes y mayor en el centro del rayo, todas las células deben seguir la misma trayectoria a través del centro del rayo láser para conseguir la mejor sensibilidad y resolución. El número de trayectorias posibles para una célula a través del rayo láser está limitado por el diámetro del núcleo de la muestra. La mejor resolución se consigue con un diámetro pequeño del núcleo. Velocidad Al cambiar la velocidad cambia la sensibilidad. Cuanto más tiempo permanezca una célula en el rayo láser, más luz láser recibe. A menor velocidad, la célula permanece más tiempo en el rayo láser; la luz dispersada y la fluorescencia de la célula aumentan. La mejor sensibilidad se consigue con una baja velocidad. Presión del líquido envolvente El líquido envolvente se encuentra en un depósito de 5,0 l. La botella recibe presión mediante un compresor interno (presión externa para el HPSS). La presión empuja el líquido envolvente hacia arriba por una sonda que hay en la parte inferior del depósito de líquido envolvente y a través de un tubo hacia la cámara de flujo. La presión del líquido envolvente controla la velocidad y el diámetro del núcleo de la muestra. El ajuste predeterminado de presión del líquido envolvente es de 12,0 psi (para el HPSS, un máximo de 100 psi). La velocidad del líquido envolvente por la cámara de flujo depende de la diferencia de presión en la cámara de flujo. El lado de salida se encuentra a la presión atmosférica, por lo que la velocidad del líquido envolvente por la cámara de flujo depende de la presión del líquido. La velocidad del núcleo de la muestra dentro del líquido envolvente es ligeramente superior a la velocidad del líquido. El ajuste de presión del líquido envolvente junto con el ajuste de la frecuencia influyen en la eficiencia y recuperación de la separación, y en la estabilidad y sensibilidad de los resultados de la separación. Los ajustes altos de presión y frecuencia del líquido envolvente consiguen la mejor eficiencia y recuperación de la separación, pero la sensibilidad y la estabilidad se reducen. Los ajustes bajos de presión y frecuencia del líquido envolvente consiguen la mejor sensibilidad y estabilidad , pero la eficiencia y la recuperación de la separación se reducen. Utilice las frecuencias y ajustes de presión del líquido envolvente recomendados para la cámara de flujo que esté utilizando según la lista del Capítulo 7, SORTING, de la “Operator’s Guide” y ajuste estos parámetros de acuerdo con las necesidades del laboratorio. Proporción de dispensación de la muestra La presión aplicada al tubo de muestras controla la dispensación de la muestra. Si aumenta la presión, la proporción de dispensación de la muestra aumenta. La diferencia entre las presiones del líquido envolvente y de la muestra controlan el diámetro del núcleo de la muestra.

2-6

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INFORMACIÓN DE REFERENCIA PRINCIPIOS DE FUNCIONAMIENTO

Si se mantiene la presión de la muestra constante, puede aumentarse la presión del líquido envolvente para aumentar la velocidad y disminuir el diámetro del núcleo de la muestra y la proporción de dispensación de la muestra. Esto ayuda a la resolución de la medición pero disminuye la sensibilidad y la velocidad de análisis. Si se mantiene el aumento de la presión de líquido envolvente, el flujo de la muestra podría invertirse y hacer que el líquido envolvente volviera al tubo de muestras. Si se mantiene constante la presión del líquido envolvente, puede aumentarse la presión de la muestra para aumentar el diámetro del núcleo de la muestra y la proporción de dispensación de la muestra. Esto aumenta la velocidad del análisis a expensas de la resolución. La sensibilidad y la resolución también dependen de la forma e intensidad del rayo láser, según se explica en la Sección RAYOS LÁSER.

RAYOS LÁSER Para iluminar las células que pasan a través del área de detección y medir su fluorescencia y dispersión de luz, se necesita una única fuente de luz. La dirección, longitud de onda e intensidad de la luz debe ser lo más constante posible. Sólo un láser produce una luz de esta calidad. Principios del láser Láser es el acrónimo del inglés Light Amplification by Stimulated Emission of Radiation. Cuando un átomo absorbe energía, es impulsado a un nivel de energía superior; sus electrones saltan a órbitas más altas. Para pasar a un estado energéticamente más favorable, los electrones saltan a órbitas más bajas. La diferencia de energía entre las órbitas bajas y altas se emite como un fotón de luz. Es lo que se llama emisión espontánea. Al haber sólo unas cuantas transiciones orbitales diferentes para un átomo de una determinada sustancia, sólo emite unas cuantas longitudes de onda de luz diferentes. Los átomos de los láseres se excitan a estados de energía más altos para producir emisión espontánea. En cada extremo del láser hay unos espejos que reflejan la luz de la emisión espontánea hacia atrás y hacia delante por la sustancia del láser. Cuando un fotón de luz pasa cerca de un átomo excitado, el átomo emite un fotón de luz de idéntica longitud de onda, polarización, fase y dirección que el fotón incidente. Es lo que se llama emisión estimulada. Cuando la luz rebota hacia atrás y hacia delante en el láser, se forma un rayo láser entre los espejos. Para conseguir un rayo láser de una única longitud de onda, se coloca un prisma en la trayectoria de la luz, delante del espejo trasero. El prisma selecciona la longitud de onda reflejada. Para conseguir que un rayo láser salga del láser, el espejo delantero sólo refleja el 98% de la luz para mantener la emisión estimulada. El 2% es el rayo láser que sale. Una corriente a través del láser controla el número de átomos excitados, para controlar así la intensidad del rayo láser. En la parte delantera del láser hay un sensor que muestrea el rayo y ajusta la corriente para mantener una intensidad constante.

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2-7

2

INFORMACIÓN DE REFERENCIA PRINCIPIOS DE FUNCIONAMIENTO

Perfilación del rayo Los rayos de los láseres refrigerados por aire tienen unos 700 µm de diámetro (aproximadamente 1.300 µm para el láser de HeCd). Los rayos se enfocan para aumentar la intensidad y para no iluminar más de una célula a la vez. Cuanto menor es el tamaño inicial del rayo, más difícil resulta enfocar el rayo hacia un punto pequeño. La mejor resolución se consigue cuando todas las células reciben la misma cantidad de luz al pasar por el rayo láser, de forma que la intensidad de la luz que atraviese el caudal de la muestra sea lo más uniforme posible. El sistema adapta el rayo utilizando ‘lentes cilíndricas transversales’ (Figura 2.3). Figura 2.3 Perfilación del rayo mediante lentes cilíndricas transversales CÁMARA DE FLUJO

SECCIÓN TRANSVERSAL DESPUÉS DE LA LENTE HORIZONTAL

SECCIÓN TRANSVERSAL DESPUÉS DE LA LENTE VERTICAL

SECCIÓN TRANSVERSAL ANTES DE LAS LENTES

LENTE HORIZONTAL

RAYO LÁSER DIRECCIÓN DEL RAYO LÁSER LENTE VERTICAL

Después de las lentes, los rayos tienen forma elíptica. Los rayos son anchos en comparación con su altura para reducir al mínimo la variación de intensidad en el centro. Incluso si las células no siguen una trayectoria idéntica a través de un rayo, reciben la misma cantidad de luz. Lentes de perfilación del rayo La lente frontal (la más cercana a la cámara de flujo) es horizontal y determina la altura del rayo láser (paralelo al flujo). La lente trasera vertical determina la anchura del rayo láser (ortogonal al flujo). Consulte la Figura 2.4. Cada perfilador del rayo está diseñado para ser confocal o desenfocado. En un conjunto confocal, las lentes están fijas de forma que tengan puntos focales coincidentes. En un 2-8

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INFORMACIÓN DE REFERENCIA PRINCIPIOS DE FUNCIONAMIENTO

conjunto desenfocado, el espacio entre las lentes se reduce deliberadamente. Desplazando el punto focal de la lente trasera, aumenta la anchura del rayo en la cámara de flujo. La anchura del rayo afecta directamente a la sensibilidad y a la resolución. La altura del rayo determina la anchura del pulso de la señal de pico. Para la discriminación de dobletes, el tamaño de la célula debe ser como mínimo la mitad de la altura del rayo. Figura 2.4 Perfiladores del rayo LONGITUD LENTE FRONTAL

LENTE TRASERA

SOPORTE DE LENTE X Z Y 15 X 60 CONFOCAL

15 X 80 CONFOCAL

TAMAÑO REAL

15 X 80

15

15 X 80

6

8 X 80

15

40 X 80 CONFOCAL

10 X 80

15

7469017B

Las lentes cilíndricas son de sílice fundida de grado UV y tienen un espectro ampliado de 200 a >800 nm. Todas las superficies ópticas tienen un fuerte recubrimiento dieléctrico antirreflectante para reducir al mínimo la dispersión y la distorsión de los rayos láser. Cuadro de selección de perfiladores del rayo Puede utilizar el siguiente cuadro para seleccionar el perfilador del rayo más apropiado a sus necesidades.

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2

INFORMACIÓN DE REFERENCIA PRINCIPIOS DE FUNCIONAMIENTO

Tipo de láser Pequeño Refrigerado por aire

Preferencias

Perfilador del rayo

Comentarios

Máxima sensibilidad

La resolución puede perderse debido al aumento de Baja velocidad de flujo de los C.V. a medida que la velocidad de flujo de la muestra aumenta. la muestra

15 x 60

Alta sensibilidad y resolución

El tamaño del punto es elíptico pero sigue siendo algo intenso. Por ello, hay un equilibrio entre la sensibilidad y la resolución.

15 x 80

Es la mejor opción para conseguir un alto rendimiento. La sensibilidad disminuye ligeramente.

15 x 80

Lo más parecido a la óptica del XL™

Bueno para la discriminación de dobletes.

10 x 80

Más fácil de alinear que el 8 x 80.

∆ 15

Discriminación de dobletes

Más difícil de alinear.

8 x 80

Deberá probarlo en su aplicación.

∆ 15

Discriminación de dobletes para células de 5 µm de diámetro. Buena elección para aplicaciones que incluyen combinaciones con láseres pequeños. Sensibilidad muy alta. Alta resolución, alto rendimiento de la muestra, más difícil de alinear. Deberá probarlo en su aplicación.

15 x 80 ∆6

Alta velocidad de los datos de muestra Máxima resolución Alta velocidad de flujo de la muestra

Células de 5 µm de diámetro Grande

Alta sensibilidad

Refrigerado por agua

Cámara de flujo “sense-in-quartz”

confocal

confocal

∆ 15

Recomendado para HPSS. Cámara de flujo “sense-in-air”

Los resultados deben ser similares a un sistema “jet-in-air”.

40 x 80 confocal

Conjuntos de perfilación del rayo En el siguiente cuadro se resumen las características principales de la gama de perfiladores del rayo disponibles. Longitud focal, mm (delantera/ trasera)

2-10

Punto focal, Para uso con Tamaño del desplazamiento, Para uso con tipo de cámara de punto, µm (altura/anchura) mm, D tipo de láser flujo

Bueno para células de 5 µm

Estado

15/60

Confocal

Pequeño

Sense-in-Quartz

12/51

No

Estándar

15/80

Confocal

Pequeño

Sense-in-Quartz

16/85

No

Opcional

15/80

15

Pequeño

Sense-in-Quartz

12/151

No

Estándar

10/80

15

Pequeño

Sense-in-Quartz

8/151

Sí

Opcional

8/80

15

Pequeño

Sense-in-Quartz

6,5/151

Sí

Estándar

15/80

6

Grande

Sense-in-Quartz

6/112

Sí

Estándar

40/80

Confocal

Grande

Jet-in-Air

17/34

No

Estándar

Nº ref. 177470A

INFORMACIÓN DE REFERENCIA PRINCIPIOS DE FUNCIONAMIENTO

El tamaño de los puntos se basa en una longitud de onda de 488 nm y un láser pequeño o grande, tal y como se muestra. En la siguiente página se presentan las dimensiones aproximadas de los puntos para las longitudes de onda de otros láseres. El uso del expansor del rayo aumenta o disminuye las dimensiones del punto del rayo por un factor de 3, dependiendo de su orientación. Tamaño del punto limitado por difracción En el siguiente cuadro se muestran las dimensiones aproximadas del punto del rayo de trabajo obtenido con las diversas combinaciones de láser y lente de enfoque.

Longitud de onda nm

Láser

Diám. del rayo mm

Longitud focal de la lente frontal mm

Longitud focal de la lente trasera, mm (y distancia de desenfoque, mm)

8

60

10

15

40

Altura del rayo, µm

80

80 (5,8)

80 (15,1)

Anchura del rayo µm

Láseres refrigerados por aire Cyonics de argón

488

0,67

6,4

8,0

12,1

33,4

51,3

70,0

86,9

151

Melles Griot® de HeNe rojo

633

0,68

7,6

9,5

14,4

40,0

61,9

85,0

102

169

Melles Griot de HeNe verde

543

0,80

6,3

7,8

11,8

32,1

48,8

67,0

89,8

172

Omnichrome de HeCd

325

1,30

4,1

5,1

7,7

20,6

30,9

41,2

137

343

Láseres refrigerados por agua Coherent Innova 300 Series

Coherent Innova 70 Spectrum Coherent Enterprise II Series

351+365

1,24

3,6

4,5

6,8

18,2

27,4

36,6

169

432

457

1,42

3,3

4,1

6,1

16,3

24,5

32,7

108

271

488

1,46

3,4

4,2

6,3

16,9

25,4

33,9

112

288

515

1,50

3,5

4,3

6,5

17,4

26,1

34,9

114

286

647

1,50

6,3

7,9

11,8

31,6

47,4

63,3

171

418

351+365

0,67

3,4

4,3

6,5

17,7

27,2

37,0

79,2

185,6

488

0,8

3,7

4,6

7,0

19,0

29,0

39,4

99

242

457

1,01

4,8

6,0

9,0

24,3

36,7

49,1

84,5

185,6

Para usar el cuadro: Identifique la línea del cuadro en la que coinciden el láser y la longitud de onda que le interesen. r Lea la altura y la anchura del rayo en las columnas apropiadas para la longitud focal de las lentes del perfilador del rayo que está utilizando. Por ejemplo: r

Láser: Coherent 305, Longitud de onda 488 nm, Perfilador del rayo 8 x 80 mm (desenfocado 5,8 mm) tiene una Altura del rayo de 3,4 µm y una Anchura del rayo de 112 µm. Nº ref. 177470A

2-11

2

INFORMACIÓN DE REFERENCIA PRINCIPIOS DE FUNCIONAMIENTO

Óptica de orientación del rayo La óptica de orientación del rayo se usa cuando se configura el citómetro de flujo ALTRA con múltiples láseres. Permite combinar o separar con precisión los rayos en la cámara de flujo. El componente óptico de los conjuntos de orientación está formado por espejos dicroicos diseñados para pasar y/o reflejar bandas de frecuencia específicas. Con el citómetro de flujo ALTRA se incluye un conjunto de orientación del rayo (Figura 2.5) cuando está configurado con el láser de HeNe de Melles Griot y el láser de argón de Cyonics. El rayo de HeNe de 633 nm es reflejado por el espejo dicroico hacia la cámara de flujo mientras que el rayo de 488 nm lo atraviesa directamente. Ajustando el conjunto de orientación del rayo, puede hacer que el láser de HeNe rojo coincida o esté espacialmente separado del rayo de argón azul en la cámara de flujo. Figura 2.5 Conjunto de orientación del rayo Rueda de giro vertical Rueda de giro horizontal

Tornillo de ajuste de la altura Rueda para ajuste de precisión

Tornillo de ajuste de precisión Tornillo de ajuste del carril

7470036A

ÁREA DE DETECCIÓN Después de la perfilación del rayo, los rayos láser atraviesan el área de detección de la cámara de flujo. El área de detección es una cámara hueca grande, de sección transversal cuadrada, con lados de cuarzo transparentes a la luz láser. Las células atraviesan el centro de los rayos láser en esta cámara. A medida que las células atraviesan los rayos, dispersan la luz láser y emiten luz fluorescente por los fluorocromos con los que están teñidas. Dispersión La cantidad de luz láser dispersada en ángulos cerrados en relación al eje del rayo láser es aproximadamente proporcional al tamaño de la célula. La luz láser dispersada en ángulos rectos está relacionada con la granularidad o la complejidad y se ve afectada por las irregularidades de la superficie.

2-12

Nº ref. 177470A

INFORMACIÓN DE REFERENCIA PRINCIPIOS DE FUNCIONAMIENTO

Fluorescencia La cantidad de fluorescencia de la célula permite medir ciertos aspectos de la célula en función de los fluorocromos y reactivos utilizados. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales conjugados con un fluorocromo muestran la cantidad de un determinado antígeno en la célula. El yoduro de propidio se une al ADN de la célula y muestra la cantidad de ADN. Los fluorocromos absorben luz a una longitud de onda y convierten la luz de alta energía (longitud de onda corta) en luz de baja energía (longitud de onda larga). Cada fluorocromo tiene un espectro de excitación y emisión único; es decir, una gama de longitudes de onda luminosa que, cuando se absorben, producen una gama de luz emitida (fluorescencia). Si se utilizan dos o tres fluorocromos que tienen prácticamente el mismo espectro de excitación pero distintos espectros de emisión, puede usar un láser para excitarlos y medir varias características de la celda al mismo tiempo (fluorescencia multicolor). Utilizando ambos láseres en el sistema, se amplía la gama de fluorocromos que puede utilizar porque ahora hay dos intervalos de espectros de excitación. Captación de luz Para medir la luz, el sistema debe captar la luz, separar los colores de interés y presentar la luz a los sensores apropiados. En el área de detección hay tres sistemas de captación de luz: la cámara de vídeo, las lentes de fluorescencia, y el sensor de dispersión frontal (consulte la Figura 2.6). Figura 2.6 Sistema óptico Láser 1 Láser 2 Espejo dicroico del láser Bloque de filtros PMT 4

PMT 3

PMT 2

Lentes de perfilación del rayo

Lentes de fluorescencia

PMT 1

Cámara de flujo

Óptica de imagen (opcional)

LED

Prisma de la cámara

LÁMPARA

Cámara PMT 5

Sensor de luz frontal

7469009A

Nº ref. 177470A

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2

INFORMACIÓN DE REFERENCIA PRINCIPIOS DE FUNCIONAMIENTO

Cámara de vídeo La cámara de vídeo le permite ver el área de detección para el mantenimiento del sistema y para ajustar y controlar la separación de células. Lo que capta la cámara aparece en el monitor de gráficos (pantalla del osciloscopio) del citómetro. La cámara de vídeo ve la punta de la cámara de flujo y el caudal de líquido envolvente que sale. En la cámara de vídeo hay un filtro que bloquea la mayor parte de la luz láser. Una fuente luminosa en el conjunto del detector de fluorescencia proyecta una imagen sobre la cámara de flujo. El punto láser elíptico y la imagen de la fuente luminosa pueden verse en el monitor de gráficos (pantalla del osciloscopio). La intersección del láser es un punto fluorescente en el centro de la punta de la cámara de flujo. Si realiza ajustes para alinear los dos puntos podrá ajustar las posiciones relativas de la punta de la cámara de flujo, el rayo láser y los sistemas de lentes con seguridad. Detector de dispersión frontal La luz láser dispersada entre 1,4° y 19° del eje del rayo láser es captada por la lente de dispersión frontal y pasa a las celdas fotovoltaicas. Consulte la Figura 2.7. La luz de dispersión frontal es tan brillante que debe haber un filtro de densidad neutral entre la lente y las celdas fotovoltaicas para reducir la intensidad. La máscara FALS que hay delante del detector tiene una barra que bloquea el propio rayo láser. Cada máscara FALS lleva estampada la aplicación para la que está diseñada. Figura 2.7 Detector de dispersión frontal

LENTE

MÁSCARA FALS PRISMA DE LA CÁMARA

BARRA DE OSCURECIMIENTO

5904021A

Punta de la cámara de flujo SortSense™ En la punta de la cámara de flujo SortSense hay cuatro componentes principales, Figura 2.8:

2-14

r

Un alojamiento roscado para fijar el cuerpo de la cámara de flujo.

r

Una cámara de flujo de cuarzo con un canal de flujo cuadrado de 250 µm.

r

Un orificio de 100 µm de diámetro.

r

Una lente de aumento.

Nº ref. 177470A

INFORMACIÓN DE REFERENCIA PRINCIPIOS DE FUNCIONAMIENTO

La lente de aumento está montada directamente en la cámara de flujo, eliminando el espacio de aire y dispensando el gel óptico necesario. Esta lente forma el elemento primario de la óptica de captación de fluorescencia y coincide ópticamente con el conjunto principal. Figura 2.8 Punta de la cámara de flujo SortSense™

Varilla de introducción de muestras

Punta de la cámara de flujo Sortsense (vista en sección)

Alojamiento

Lente de aumento Cámara de flujo

Orificio de inyección

7469018C

Lentes de fluorescencia Todas las lentes están trabajadas y pulidas con precisión. Las superficies ópticas expuestas tienen recubrimientos antirreflectantes. Conjuntamente, aumentan al máximo la captación de señales reduciendo las aberraciones y las pérdidas de dispersión de luz. El conjunto tiene corrección de color para mejorar el rendimiento en toda la gama de interés, es decir todo el espectro visible (320-700 nm) y la parte UV. Hay un filtro espacial optimizado que forma parte del conjunto. Este filtro aumenta la proporción señal-ruido bloqueando la luz que no procede del punto de intersección del láser y la muestra. La luz que pasa hasta los detectores se colima para conseguir un ángulo preciso de incidencia en los divisores del rayo (45°) y los filtros de paso de banda (90°). Esto evita la ampliación o el desplazamiento de la banda de frecuencias analizada. En el conjunto hay un mecanismo de enfoque de precisión. Se encuentra en un lugar muy cómodo y se acciona con el dedo. El mecanismo no tiene juego alguno y es autobloqueante. Filtros ópticos Los filtros ópticos separan la luz de la célula por su longitud de onda. Los principios del filtrado óptico se explican en el Apéndice A, Filtros ópticos, del manual Referencia. Los filtros se caracterizan por su espectro de transmisión, un gráfico del porcentaje de luz transmitido vs. la longitud de onda (puede consultar también el Apéndice A del manual Referencia). Los filtros pueden colocarse en las ranuras para filtros mostradas en la Figura 2.9. Es posible establecer varias configuraciones de filtros distintas para medir distintas combinaciones de fluorocromos. En la Figura 2.10 puede ver un ejemplo de cómo una configuración de filtros Nº ref. 177470A

2-15

2

INFORMACIÓN DE REFERENCIA PRINCIPIOS DE FUNCIONAMIENTO

divide y dirige la luz de distintos fluorocromos hacia determinados PMT. Las señales producidas por cada sensor también se indican en la Figura 2.12. El programa OptiCAD™ de la estación de trabajo multimedia FlowCentre ilustra gráficamente el conjunto de filtros. Este programa demuestra la interacción de cada filtro utilizado con las longitudes de onda de la luz que finalmente llegan a los detectores. Figura 2.9 Ranuras para filtros

610BP

575BP

525BP

L

8D

L

48

0D

488BK

L

0D

60

L

0D

64

675BP

55

488BP

®

7469008C

2-16

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INFORMACIÓN DE REFERENCIA PRINCIPIOS DE FUNCIONAMIENTO

Figura 2.10 Configuración de filtros, ejemplo PMT 4 Ficoeritrina PMT 3

ECD (PE-Texas Red)

PMT 2 Aloficocianina PMT 1

610 BP 575 BP PMT 5

Fluoresceína Dispersión de luz

675 BP 525 BP

640 DL

488 BP

600 DL

Cámara de flujo

550 DL 457-502 BK

488 DL Densidad neutral 1

Rayos láser Dispersión frontal

Detector de dispersión frontal

7469020C

SEÑALES Cada detector produce un voltaje proporcional a la intensidad de luz que recibe. El pulso de voltaje se acondiciona y amplifica para extraer tanta información sobre la muestra como sea posible. Detectores El sistema tiene seis detectores: uno para dispersión frontal, uno para dispersión lateral o fluorescencia y cuatro para fluorescencia. Se utilizan distintos tipos de detectores en función de las distintas intensidades y longitudes de onda de la luz.

Nº ref. 177470A

2-17

2

INFORMACIÓN DE REFERENCIA PRINCIPIOS DE FUNCIONAMIENTO

Detector de dispersión frontal El detector de dispersión frontal es un fotodiodo de silicio. La luz láser dispersada en dirección frontal es muy intensa y se necesita un detector menos sensible que los fotomultiplicadores. Cuando se expone a la luz, el fotodiodo de silicio produce corriente (está hecho del mismo material que las células solares). Esta corriente se transforma en un pulso de voltaje para el procesamiento de señales. La luz de dispersión frontal es tan brillante que necesita bloquearse parcialmente con un filtro de densidad neutral. El filtro de densidad neutra 1 (ND1) se coloca en una ranura antes del fotodiodo. El filtro ND1 reduce la intensidad luminosa a la décima parte de su intensidad original. Tubos fotomultiplicadores (PMT) Los detectores de dispersión lateral y fluorescencia son PMT. Un PMT (Figura 2.11) consta de un fotocátodo, un dínodo (cadena de electrodos) y un ánodo. El fotocátodo es de un material fotosensible que emite electrones cuando se expone a la luz. Los electrones del fotocátodo se aceleran en un campo eléctrico que hay entre el fotocátodo y el primer dínodo. Cuando los electrones llegan al dínodo, éste emite más electrones que se aceleran hacia el segundo dínodo que, a su vez, emite aún más electrones que pasarán por toda la cadena de dínodos y finalmente llegarán al ánodo. La cantidad de electrones que emite cada dínodo viene determinada por el potencial que hay entre cada dínodo. El potencial de los dínodos es mayor hacia el final de la cadena. El potencial aplicado a todo el PMT es el voltaje PMT. Cuanto mayor es el voltaje PMT, mayor es la sensibilidad del detector. El voltaje PMT se ajusta según la sensibilidad necesaria para la muestra. Para un aumento lineal del voltaje PMT, la sensibilidad aumenta exponencialmente. La composición del fotocátodo determina la sensibilidad del PMT según las diferentes longitudes de onda de la luz. Los PMT de fluorescencia son sensibles de 300 nm a 800 nm. La corriente del PMT se transforma en un pulso de voltaje para el procesamiento de señales.

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INFORMACIÓN DE REFERENCIA PRINCIPIOS DE FUNCIONAMIENTO

Figura 2.11 Tubo fotomultiplicador (PMT) 10

~2 e / PHOTON

ANODE

210 e

32e 16e 8e DYNODE

4e 2e e

PHOTON

PHOTOCATHODE 5904005A

Procesamiento de señales El diagrama de flujo de la Figura 2.12 muestra el procesamiento de cada señal antes de digitalizarse en el convertidor analógico-digital (ADC). Cada señal se integra y amplifica lineal o logarítmicamente. Cada PMT de fluorescencia produce tres señales finales. A partir de estas señales se pueden elegir hasta ocho parámetros de análisis. Las señales de fluorescencia pueden necesitar sustracción de fluorescencia para producir una medición útil de fluorescencia bicolor.

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2

INFORMACIÓN DE REFERENCIA PRINCIPIOS DE FUNCIONAMIENTO

Figura 2.12 Procesamiento de señales DETECTOR DE DISPERSIÓN INTEGRADOR FRONTAL

AMPLIFICACIÓN LINEAL AMPLIFICACIÓN LOGARÍTMICA

PICO

DISPERSIÓN LATERAL PMT 1

INTEGRADOR

AMPLIFICACIÓN LINEAL AMPLIFICACIÓN LINEAL AMPLIFICACIÓN LOGARÍTMICA

PMT 2

COMPENSACIÓN DE FLUORESCENCIA

INTEGRADOR

CONVERTIDOR ANALÓGICODIGITAL

AMPLIFICACIÓN LINEAL AMPLIFICACIÓN LOGARÍTMICA

SEÑAL PICO

PMT 3

COMPENSACIÓN DE FLUORESCENCIA

INTEGRADOR

AMPLIFICACIÓN LINEAL AMPLIFICACIÓN LINEAL AMPLIFICACIÓN LOGARÍTMICA RATIO

SEÑAL PICO

AMPLIFICACIÓN LINEAL PRISM

PMT 4

COMPENSACIÓN DE FLUORESCENCIA

INTEGRADOR

AMPLIFICACIÓN LINEAL TIME AMPLIFICACIÓN LOGARÍTMICA

SEÑAL PICO

PMT 5

COMPENSACIÓN DE FLUORESCENCIA

INTEGRADOR

AMPLIFICACIÓN LINEAL AMPLIFICACIÓN LINEAL AMPLIFICACIÓN LOGARÍTMICA

SEÑAL PICO

AMPLIFICACIÓN LINEAL

7469022C

Integración La Figura 2.13 ilustra el pulso de voltaje de un PMT a medida que pasa una partícula por el rayo láser y cómo se relaciona el pulso integrado con esta salida. La altura de pico de la señal integral es proporcional al área del pulso sin procesar. La señal integral alcanza su máxima amplitud cuando la célula sale del rayo láser. La altura de pico de la señal integral es proporcional a la cantidad total de fluorescencia de una célula mientras que la señal de pico es 2-20

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INFORMACIÓN DE REFERENCIA PRINCIPIOS DE FUNCIONAMIENTO

proporcional a la concentración máxima de fluorescencia dentro del rayo en un momento dado. Figura 2.13 Señales integral y de pico PARTÍCULA ENTRA EN EL RAYO

PARTÍCULA EN EL CENTRO DEL RAYO

RAYOS LÁSER

LA PARTÍCULA SALE DEL RAYO

CAUDAL DE LA MUESTRA

VOLTAJE

SEÑAL DE PICO SEÑAL INTEGRAL

TIEMPO

5904004A

Amplificación Después de la integración, las señales de los detectores se dividen. Una trayectoria amplifica la señal integral en 1, 1,5, 2, 3, 5, 7,5, 10, 15, 20, 30, 50, 75 o 100. La otra amplifica la señal logarítmicamente. Las señales no pueden tener más de 10 V en la amplitud de pico porque se saldrían de la escala después de la digitalización. La amplificación logarítmica amplía la escala de las señales débiles y comprime la escala de las señales fuertes. Esto le permitirá ver una mayor gama de mediciones en el histograma final. Parámetro Time of Flight El parámetro Time of Flight es el tiempo que una célula o partícula tarda en atravesar el rayo láser. La anchura de un pulso de pico se mide y puede asignarse a cualquier señal de pico. Dos de las aplicaciones del parámetro Time of Flight son la discriminación de dobletes y el cálculo del tamaño de la célula. Hay un ajuste de normalización de la anchura del rayo en el citómetro que le permite restar los efectos de la anchura del rayo láser de la medición Time-of-Flight. Compensación de fluorescencia Las señales de fluorescencia pueden necesitar compensación del solapamiento de la fluorescencia (Figura 2.14). Los filtros del compartimento de detectores intentan limitar la luz que llega a cada PMT a la emisión de un único fluorocromo. A causa de la amplia gama de emisiones de la mayoría de los fluorocromos, no siempre es posible limitar la respuesta del PMT a fluorocromos únicos. Cuando la luz emitida por dos fluorocromos fijados a la misma célula se solapan en el intervalo de detección de un PMT, la señal de fluorescencia puede ser falsamente alta.

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2-21

2

INFORMACIÓN DE REFERENCIA PRINCIPIOS DE FUNCIONAMIENTO

Para compensar este solapamiento de ‘colores’, un PMT de fluorescencia puede sustraer un porcentaje de la señal de otro PMT de fluorescencia. La cantidad de solapamiento es proporcional a la señal del otro PMT. El primer PMT está previsto para detectar la dispersión lateral y no está equipado con compensación de fluorescencia (a menos que tenga la opción Gated Amp, la compensación de PMT1 está disponible entre PMT1 y AUX1 y/o PMT1 y AUX2). Sin embargo, con los filtros apropiados, puede utilizarse para medir la fluorescencia de un fluorocromo que no se solape con ninguna otra emisión de fluorescencia que se esté utilizando simultáneamente. Figura 2.14 Solapamiento de fluorescencia

SOLAPAMIENTO DE FLUORESCENCIA PE EN PMT de FITC SOLAPAMIENTO DE FLUORESCENCIA FITC EN PMT de PE

~ ~ 560 nm

FITC

450 nm

PE

500 nm

550 nm

600 nm

650 nm 5904037B

HISTOGRAMAS A partir de las señales producidas por cada célula se seleccionan los parámetros que va a digitalizar el ADC. La conversión se realiza cuando cualquiera de los pulsos supera el nivel de un discriminador. Los datos digitales se envían a la estación de trabajo multimedia FlowCentre, donde los valores se comparan con las selecciones. Si los datos cumplen los criterios de selección se colocan en histogramas. Los datos también se almacenan en la memoria del ordenador en forma de lista correlacionada de mediciones de cada célula. Los datos en modo de lista pueden reproducirse en histogramas o almacenarse en disco para su análisis posterior. Los datos también siguen un recorrido paralelo en el citómetro para comparaciones de separación. Discriminadores Hay un discriminador para cada parámetro. El discriminador es un nivel de voltaje que se compara con los pulsos de señal. Cada discriminador puede establecerse de 0 a 10 V en incrementos de 0,01 V, o puede desactivarse. Los niveles de los discriminadores se utilizan

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para separar el ruido o la suciedad de la célula de las mediciones reales. Si alguno de los pulsos de señal supera su correspondiente discriminador, el sistema inicia un ciclo de adquisición, comenzando con Peak-Sense-and-Hold (PSH). Cuando utilice señales de pico, ajuste el discriminador basándose en una señal de pico. Después compruebe que el recuadro DISC SAT EXT de la pantalla Options está ajustado al valor adecuado para capturar las señales integrales. Todos los demás discriminadores de señal deberán desactivarse. Peak-Sense-and-Hold (PSH) Cuando se satisface cualquier discriminador, un circuito PSH captura el voltaje pico del pulso de la señal y produce un voltaje CC (pulso ensanchado) igual al valor de pico. Conversión analógica-digital (ADC) La conversión analógica-digital es como medir un pulso con una regla y registrar su altura (Figura 2.15). En este caso, la regla (ADC) mide hasta 10 V y tiene 1.023 divisiones iguales (1.024 canales). Cada canal representa 0,01 V de amplitud de pico. Figura 2.15 Conversión analógica-digital 2 INCREMENTO CANAL 25 30 1 VOLTAJE

20 RECUENTO 10

TIEMPO

10

20

30

CANAL 5904006A

Un ADC mide cada uno de los pulsos ampliados cada vez. Además, si se selecciona, el ADC digitaliza una relación de dos pulsos ampliados cualesquiera. Listado de datos Cuando se digitalizan los datos, los circuitos PSH se borran para la siguiente célula y los números de canal correlacionados de la célula se envían a la estación de trabajo multimedia FlowCentre. La estación de trabajo multimedia FlowCentre mantiene un listado completo de todas las células analizadas y sus números de canal para los parámetros adquiridos. En la estación de trabajo multimedia FlowCentre, los datos se comparan con las selecciones utilizadas y se compilan en histogramas o se almacenan sin tratar como datos en modo de lista. Se pueden adquirir hasta ocho histogramas utilizando 12 de los 26 parámetros medidos y calculados disponibles. Nº ref. 177470A

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Los datos se comparan con las selecciones utilizadas. Un histograma puede seleccionarse mediante las regiones de otros histogramas, de forma que sólo aparezcan las células que se encuentran en las selecciones. Una selección para un histograma de un parámetro es un sencillo intervalo de canales. La selección para un histograma de dos parámetros puede ser rectilínea o amorfa. Selecciones amorfas Una selección amorfa es un área definida dentro de un histograma de dos parámetros. Esta área puede tener cualquier forma. El ordenador toma los valores de canal de las mediciones de dos parámetros y compara las coordenadas con las de la región amorfa. Si la célula está en la región o dentro de ella, las mediciones correlacionadas se incluyen en los histogramas seleccionados sobre la región. El uso de selecciones amorfas no afecta a la velocidad de adquisición ni de separación. Histogramas de un parámetro Un histograma de un parámetro es un gráfico del recuento de células en el eje Y y el parámetro de medición en el eje X. Para cada célula, el ordenador toma el valor de canal del ADC e incrementa el contador de canales del histograma. La altura por encima del eje representa el recuento de canales. Todos los histogramas de un parámetro tienen 1.024 canales. Histogramas de dos parámetros Un histograma de dos parámetros es un gráfico (similar a un mapa topográfico) del recuento de células y dos parámetros de medición. Los ejes X e Y se asignan a los parámetros con 0,0 en la parte inferior izquierda. El ordenador toma los valores de canal de los parámetros e incrementa el contador en la intersección de los canales del histograma de dos parámetros. Puede seleccionar 64 o 256 canales en cada eje de los histogramas de dos parámetros. La pantalla 256 x 256 incluye una opción de zoom. Los recuentos de partículas en la intersección de ambos canales se muestra por la densidad de puntos.

DATOS EN MODO DE LISTA Listmode es una lista de todas las células analizadas, con los números de canal de cada parámetro adquirido. Puede almacenar la lista en disquete en la estación de trabajo multimedia FlowCentre. La ventaja de los datos en modo de lista es que se almacenan todos los datos de todos los parámetros que definen el protocolo para cada evento procesado. Para el análisis, el sistema convierte la lista de números de canal en los histogramas que se especifique. Se pueden establecer los mismos tipos de histogramas que al adquirir datos. La conversión de la lista de datos en histograma no afecta a la lista. Esto significa que si se equivoca al seleccionar ajustes, puede cambiar la selección y reproducir la lista de datos. Adquiera datos en modo de lista cuando la muestra esté diluida, sea rara o difícil de analizar inmediatamente.

SEPARACIÓN Sorting separa dos clases de partículas de una muestra a una velocidad de datos de hasta 10.000 eventos por segundo con la punta de la cámara de flujo SortSense, y con purezas de hasta el 99%. Con la punta Jet-in-Air y un láser refrigerado por agua se alcanza una velocidad 2-24

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de datos de hasta 15.000 eventos por segundo. Con la opción HyPerSort System (HPSS) se alcanza una velocidad de datos de hasta 30.000 eventos por segundo. Las partículas se clasifican según las regiones de separación, similares a las regiones de selección de los histogramas. En la separación, el sistema fuerza al caudal de la muestra y del líquido envolvente a romperse en gotitas cierto tiempo después de salir de la punta de la cámara de flujo. Después de colocar cursores en una pantalla de vídeo del caudal de separación, el sistema calcula el tiempo de recorrido (retardo de separación) entre la intersección del caudal con el láser y el punto de ruptura de las gotas. Utilizando histogramas de la muestra, puede establecer selecciones y criterios de separación que distingan las células que quiere separar a la izquierda y a la derecha. Cuando una célula satisface el criterio de separación, el sistema pone en marcha un temporizador para medir el tiempo hasta la ruptura de la gota. Después de este retardo, el sistema aplica una carga (pulso de separación) al caudal para cargar la gota que contiene la célula cuando se separa del caudal. La polaridad de la carga depende de si se quiere separar las células a la izquierda o a la derecha. Las gotas pasan a través de un par de placas de deflexión cargadas. Las gotas cargadas son atraídas por las placas de deflexión y van hacia la izquierda o la derecha dependiendo de la polaridad de la carga de la gota. Las gotas desviadas con las células son recogidas por tubos de ensayo o portamuestras de microscopio en la zona de recogida para separación.

DATOS ESTADÍSTICOS Datos estadísticos de región lineal Los datos estadísticos de una región de un histograma se calculan de la siguiente forma:

Número de células en la región Porcentaje = -------------------------------------------------------------------------------------------------- x 100 Número total de células en el histograma Área = Número de células en la región Posición del pico = Canal que acumula el mayor número de células dentro de la región (Canal modal) Altura del pico = Número de células en el canal modal de la región Σ ( número de canal × contaje en el canal ) Media = --------------------------------------------------------------------------------------------------área

SD =

2 Σ [ ( número de canal – Media ) × contaje en el canal ] -------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------área

Para la media y la desviación típica, las sumas se realizan en todos los canales que están dentro de la región.

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SD × 100 CV = ---------------------Media CV completo (Full CV) = CV 42, 46 × anchura del pico a la mitad de su altura HPCV = ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------posición del pico Datos estadísticos de región logarítmica

Canal de la media logarítmica = Intensidad media SD SD SD log = Intensidad  Media + ------- – Intensidad  Media – -------    2 2 SDlog × 100 CV log = -----------------------------Media log El software del citómetro de flujo ALTRA muestra números de intensidad relativa en todos los histogramas logarítmicos. Utilice la siguiente fórmula para convertir los números de intensidad relativa de un histograma en números de canal logarítmico (N).

10 x intensidad relativa N = 256 log  --------------------------------------------------------   1.024 La siguiente fórmula se usa para convertir los números de canal logarítmico en números de intensidad relativa (I).

I = 1.024 × 10 donde

L=

  N -   L + D  ----------1024  

0 para amplificadores logarítmicos de 3 décadas -1 para amplificadores logarítmicos de 4 décadas

D = número de décadas N = número de canal logarítmico I=

2.4

número de intensidad relativa

ESPECIFICACIONES DEL SISTEMA Concentración de la muestra Suspensión de partículas individuales de la muestra en concentraciones de 5 x 106 a 2,5 x 107 (hasta 4 x 107 con HPSS) partículas por ml de líquido suspendido, dependiendo de la aplicación.

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INFORMACIÓN DE REFERENCIA CARACTERÍSTICAS DE RENDIMIENTO

Intervalo de tamaños de la muestra Las muestras pueden tener de 0,5 µm a 40 µm de diámetro para las mediciones de dispersión de luz y de 40 µm de diámetro hasta un tamaño coloidal o macromolecular para mediciones de fluorescencia.

Volumen de la muestra Mínimo 150 µl, máximo 10 ml.

Recipiente de muestras El sistema acepta tubos de ensayo de 12 x 75 mm, 12 x 76 mm y 17 x 100 mm .

2.5

CARACTERÍSTICAS DE RENDIMIENTO Rendimiento del análisis El rendimiento nominal es de 60 tubos de muestras por hora para adquirir 10.000 linfocitos, con resultados del análisis (cuando no se utiliza el soporte para tubos de muestras de la opción HPSS).

Intervalo de detección de fluorescencia 300 a 800 nm.

Sensibilidad de la fluorescencia La sensibilidad es 1 °C en 1 hora puede provocar un cambio en la formación de gotas.

NO SE OBTIENE NITIDEZ NI ENFOQUE DE LAS GOTAS CAUDAL ABAJO: r Ningún ajuste de frecuencia Obstrucción o burbujas en el cuerpo 1. Pulse 2 o 3 veces y después . de la cámara de flujo. genera gotas suficientemente enfocadas y 2. Limpie la cámara de flujo. Consulte la sección nítidas. LIMPIEZA DE LA PUNTA DE LA CÁMARA DE FLUJO (SIN QUITARLA) del manual r Las gotas satélite no Procedimientos especiales y solución de desaparecen. problemas. Problema o fuga en el sistema hidráulico o neumático.

1. Inspeccione el tapón del depósito de líquido envolvente, el filtro de líquido envolvente, los tubos de líquido envolvente de todo el sistema (cuando detecte burbujas, utilice agua jabonosa para localizar las fugas). 2. Compruebe que los reguladores de líquido envolvente y muestra funcionan correctamente. Un funcionamiento cíclico del regulador demasiado frecuente (