Cinética Microbiana_2010

INGENIERÍA BIOQUIMICA Cinética de Crecimiento Microbiano Introducción. Estequiometría, Rendimientos, Velocidad de Reacción Tipos de Modelos Cinéticos. Aproximaciones Crecimiento estacionario y no-estacionario Modelo de Monod. Linealizaciones. Modelos con Inhibición: Por substrato Por producto  Modelos Estructurados. Ejemplos  Modelos Segregados. Ejemplos      

Tipos de Células Procaryota

Eucaryote

Células Eucariotas Estructura de una célula vegetal típica Citoesqueleto filamentoso

Estructura de una célula animal típica 1. Nucleolo, 2. Núcleo, 3. Ribosoma, 4. Vesícula, 5. Retículo endoplasmático rugoso, 6. Aparato de Golgi, 7. Citoesqueleto (microtúbulos), 8. Retículo endoplasmático liso, 9. Mitocondria, 10. Peroxisoma, 11. Citoplasma, 12. Lisosoma. 13. Centriolo.

Crecimiento microbiano Condiciones ambientales: pH, humedad, temperatura, salinidad

Carbono Célula

Energía

Nutrientes

Célula

Aceptor de e-

Subproductos metabólicos

Crecimiento celular Crecimiento celular  consumo de substratos (energía y materia prima) para síntesis de células y de productos de metabolismo  el entorno debe tener todos los elementos necesarios para la formación de células  la DG de los substratos consumidos debe ser superior que la DG de las células y productos formados  los elementos que constituyen los nutrientes deben ser compatibles con el mecanismo enzimático de las células  obedece las leyes de conservación de materia y energía  la cantidad de productos (metabolitos) formados, y el calor generado, son proporcionales a la cantidad consumida de substrato, o de alguno de los productos

X

S (comida) (sustrato)

Para:

-

X + P (células) (producto) (microorg.)

En un: • Biorreactor • Fermentador • Quimiostato

Eliminar S: depuración de agua Producir P: antibióticos Producir X: producción de SCP Primera etapa fermentación

A veces sucede que: Hidratos de carbono (mosto, cereales, patatas, frutas)

bichos

(bichos) + alcohol

Veneno (máximo 12% vol)

Crecimiento celular Conservación de materia  estequiometría

Fuente de C + Fuente de N + O2 + minerales + + nutrientes específicos  Masa celular + Productos + CO2 + H2O Ej. Crecimiento aerobio del Saccharomyces cerevisiae:

C6 H12O6  aO2  bNH3  cCH xOy Nz  dCO2  eH2O

Composición elemental de algunos microorganismos Microorganismo

Nutriente limitante

Fórmula empírica

CH1,78N0,24O0,33

Aerobacter aerogenes Klebisella aerogenes

Glicerol

CH1,74N0,22O0,43

Candida utilis

Glucosa

CH1,84N0,20O0,56

Candida utilis

Etanol

CH1,84N0,20O0,55

Glucosa

CH1,70N0,17O0,46

Saccharomyces cerevisiae

Composición elemental de algunos microorganismos Ejemplo. Determinación de los coeficientes estequiométricos para el crecimiento aerobio del Saccharomyces cerevisiae sobre glucosa:

C6 H12O6  aO2  bNH3  cCH xOy Nz  dCO2  eH2O Fórmula empírica del Saccharomyces cerevisiae sobre glucosa: Balance Balance Balance Balance

de de de de

Carbono: 6=c+d Hidrógeno: 12+3b=1,703c+2e Oxígeno: 6+2a=0,459c+2d+e Nitrógeno: b=0,171c

Solución: a=3,94 ; b=0,33 ; c=1,928; d=4,072; e=4,854

CH1, 70 N 0,17O0, 46

Dato adicional: Coeficiente respiratorio (RQ): mol CO2/mol O2 RQ=1,033=d/a

C6 H12O6  3,942 O2  0,33 NH 3  1,928 CH1, 703O0, 459 N 0,171  4,072 CO2  4,854 H 2O

Velocidad de Reacción y Rendimientos Velocidad de Crecimiento Celular. Velocidad Específica de Crecimiento

rX 

rX (g/l.h)

dX dt





1 dX  X dt

 (h-1)

Rendimientos:

X (g/l)

YX S 

rX DX  rS DS

r DP  P  rS DS

S (g/l)

YP S

P (g/l)

YC S 

; ;

YX O  YP X

rX DX  rO DO

r DP  P  rX DX

rP (g/l.h)

Relación entre las velocidades

  rX   1  Y   PS

rO (g/l.h)

rS (g/l.h)

rC DC  rS DS

 1 rS   Y  XS

rC (g/l.h)

  rP   1  Y   CS

 rC  

Definiciones de Rendimiento Símbolo

Definición

YX/S

g de biomasa seca/g de substrato consumido; Tasa de crecimiento molar: g de biomasa seca/mol de substrato consumido

YX/O

g de biomasa seca/g ó mol de oxígeno consumido

YP/S

g ó mol de producto/g ó mol de substrato consumido

YC/S

mol de CO2/mol de substrato consumido

Rendimientos Bacterianos sobre diversas fuentes de carbono Símbolo

YX/S

YX/O

YD

(g células/g substrato)

(g células/g O2)

(g células/kcal)

Malato

0,34

1,02

0,300

Acetato

0,36

0,70

0,210

Glucosa (melazas, almidón)

0,51

1,47

0,420

Metanol

0,40

0,44

0,120

Etanol

0,68

0,61

0,180

Isopropanol

0,43

0,23

0,074

Parafinas

1,03

0,50

0,160

Metano

0,62

0,20

0,061

Rendimiento Entálpico Rendimiento entálpico: YD: (g de biomasa/ kcal generada)

YD 

YX S (DH S  YX S DH C )



YX S 1  YD DH C   YD DH S

DHS : Entalpía de combustión del sustrato DHC : Entalpía de combustión del material celular Balance de calor para un crecimiento aerobio: DHS (Calor generado por g de sustrato oxidado)

=

-

YX/S.DHC (Calor de combustión de las células producidas a partir del sustrato)

DHG (Calor generado por g de sustrato consumido en la fermentación que produce células, CO2 y H2O)

=

Factores que afectan la interacción célula-medioambiente Condiciones medioambientales

Población celular

• Multicomponente • Reacciones en solución • Equilibrio ácido-base • pH y temperatura variable

• Cambio de las propiedades reológicas

• Multicomponente nutrientes sustratos

• Heterogenidad de cada

productos

• Reacciones múltiples • Mecanismos internos

calor

• Multifásico (gas, líquido)

Interacciones

• Distribución espacial no

mecánicas

uniforme

célula individual

de control • Adaptabilidad • Aleatorio

• Variabilidad genética

Crecimiento celular, consumo de substratos y obtención de productos

Crecimiento celular, consumo de substratos y obtención de productos

Crecimiento celular, consumo de substratos y obtención de productos La aproximación

Estructurado (varios componentes)

No segregado (célula promedio)

CASO IDEAL La población celular se trata como un único componente en solución

Crecimiento Balanceado

Considera los multicomponentes de una célula promedio

Considera los componentes simples de las diferentes células

Crecimiento Balanceado

CASO REAL Considera los multicomponentes de las diferentes células

Promedio celular

Promedio celular

No estructurado (un componente)

Segregado (células diferentes)

Aproximaciones a la Cinética Microbiana

Fases del crecimiento celular discontinuo muerte

X

estacionaria

crecimiento exponencial Al agotarse los nutrientes disminuye la velocidad de crecimiento y luego mueren las células

latencia

tiempo

Periodo de latencia  Es el tiempo que necesitan los microorganismos para adaptarse al nuevo medio (generar nuevas enzimas,…)  Depende de la edad de los microorganismos (puede haber una edad óptima, normalmente los más jóvenes se adaptan más rápidamente).  Se reduce realizando el crecimiento previo en un ambiente análogo.  Se recomienda usar como siembra aproximadamente el 5% del fermentador.  Puede haber varios periodos de inducción, si se van utilizando sucesivamente diferentes sustratos (crecimiento diaúxico).

Fase de Crecimiento Celular Exponencial Ley de Maltus:

dX  X dt  X     (t  tlag ) ln   X0 

td 

ln 2



X  X 0  t  tlag

; 

X  X 0 exp (t  tlag ) 

;

t  tlag

td : tiempo necesario para duplicar la concentración celular

Fase de Crecimiento Celular Exponencial Ley de Maltus:

log (X)



Tiempo

latencia

Fases de crecimiento exponencial y estacionaria Cambio condiciones ambientales 

A) Se acaba la comida alta S0 media S0

X

baja S0

La concentración final de células depende de la concentración inicial de sustrato

tiempo

Fases de crecimiento exponencial y estacionaria Velocidad de consumo de nutrientes:

dS  kS  X dt X  X 0 exp(   t )



dS  k S X 0 exp(  t ) dt S  S0  

kS X 0

S0  S 

kS

S0 

kS







 X   1   X0 

exp(  t )  1   k S X 0 

X  X 0 

X F  X 0 

XF  X0 

 kS

S0

Dependencia de la población máxima (XF) respecto de la concentración inicial de nutriente limitante

Fases de crecimiento exponencial y estacionaria Cambio condiciones ambientales  B) Se acumulan materiales tóxicos (o se acaba el espacio)

XS

alta S0 media S0

X

baja S0

La concentración de células final es independiente de la concentración inicial de sustrato

tiempo

Fase estacionaria Población máxima (final)

XF El factor limitante de crecimiento dependerá de la concentración inicial de sustrato

Factor limitante: productos tóxicos Controla el veneno

Concentración inicial de nutrientes

S0

Crecimiento Diauxico Crecimiento diaúxico de E. Coli

El crecimiento diauxico se produce cuando se observan diferentes periodos de latencia debido a que en el medio hay diferentes sustratos que son consumidos a diferente velocidad por los microorganismos. Cuando uno de los sustratos es consumido totalmente, tras un periodo de latencia, los microorganismos consumen el segundo sustrato.

Fases de crecimiento exponencial y estacionaria Ley de Verlhurst (1844); Pearl & Reed (1920):



dX  k ' X  ct max  ct dt ct   ( X  X 0 ) ctmax   ( X F  X 0 )

dX  k  X (XF  X ) dt

XF X 1   exp( kt)



dct dX  dt dt

C Ctt :: concentración concentración de de toxina toxina

dX  k '  X  ( X F  X ) dt  XF  X0    X0 

  

k’.=k

Fase de Crecimiento Celular Exponencial

X/XS

X/XS

k

Tiempo

Fase de Crecimiento Celular Exponencial

X/XS

X/XS



Tiempo

Fase de Crecimiento Celular Exponencial XF

X/XS

X

Tiempo

Fase de Muerte Celular dX d  kd  X v dt dX v  m  X  kd  X v dt dX d  kd  X v dt dX T d ( X v  X d )   m  X v dt dt X v  X v0 exp(  m  kd )  t 

X X v  X v0 exp((  m  k d )  t )

tiempo

Cinética de Crecimiento Celular Substrato (S )  Células ( X )  más Células ( X )  Pr oducto ( P) Ecuación de Monod (1942):

 SX  dX  rX   m  dt  KS  S 

 S  rX 1 dX      m  X X dt  KS  S 

 Cinética de Crecimiento Celular m S  K S

;

  m

Ecuación de Monod

 S  rX      m  X  KS  S 

m/2

S 0   m S K S

KS

S

Ecuación de Monod 2.4



m=2,24

m

2.0

1.6

1.2

0.8

KS= m= m= m= m= m= m= m= m= m= m=

m=0,95

0.4

0.3 0.950 1.045 1.150 1.264 1.391 1.530 1.683 1.851 2.036 2.240

0.0 0

1

2

3

S

4

5

6

Ecuación de Monod 

1.2

KS=0,20 1.0

0.8

0.6

KS=2,979

0.4

m= KS= KS= KS= KS= KS= KS= KS= KS= KS= KS=

KS

0.2

1.100 0.200 0.270 0.365 0.492 0.664 0.897 1.211 1.634 2.206 2.979

0.0 0

1

2

3

S

4

5

6

Cinética de Crecimiento Celular Ecuación de Monod

Crecimiento en glucosa

KS=0,22 mol/l m=1,3 gener./h

Crecimiento en triptofano

KS=1,1 ng/ml m=0,8 gener./h

Velocidad de crecimiento específico de E. Coli

Cinética de Crecimiento Celular Linelizaciones de la ecuación de Monod: 

1 0.9 0.8 0.7

m

0.6 0.5

 S  rX      m  X  KS  S 

0.4 0.3 0.2 0.1 0 0

200

400

600

800 S S

1000

1200

1400

1600

Cinética de Crecimiento Celular Linelizaciones de la ecuación de Monod: 250

 KS  1      m  m  S

1/

1

200

1

1/m

150

pte.  100

o.o. 

KS

m

1

m

50

Lineweaver Burke 0 0

0.2

0.4

0.6

1/S 1/S

0.8

1

1.2

Cinética de Crecimiento Celular Linelizaciones de la ecuación de Monod: 1800

S/ 1600

 1     S  m  m  S

1400

S/m

1200

KS

pte. 

1000

1

m

800 600 400

o.o. 

200

KS

Eadie-Hofstee

m

0 0

200

400

600

800

S S

1000

1200

1400

1600

Efectos ambientales en la Cinética de Crecimiento Celular Efectos de:  Temperatura de operación  pH  Salinidad  Oxígeno  Presión Extremófilos: Organismos que pueden tolerar, o quizás requerir, condiciones extremas para vivir y desarrollarse. Fuera de las condiciones óptimas, la adaptación (compensación celular) puede reducir la velocidad de crecimiento, y por tanto el rendimiento.

Efecto de la Temperatura de Operación

Efecto de la Temperatura de Operación td 

ln 2



Ln(rX)

Efecto de la temperatura en el crecimiento de E. Coli

Efecto de la Temperatura de Operación Clasificación de los microorganismos según su temperatura optima 40 a 70 ºC 10 a 45 ºC

15 a 18 ºC

70 a 100 ºC

90 a 115 ºC

Efecto de la Temperatura de Operación Temperatura (ºC) Grupo Termófilos Mesófilos

Mínima

Óptima

40 a 45

55 a 75

Máxima 60 a 80

10 a 15

30 a 45

35 a 47

Obligados

-5 a 5

15 a 18

19 a 22

Facultativos

-5 a 5

25 a 30

30 a 35

Psicrófilos

Clasificación de los microorganismos en función de la temperatura óptima de operación

Efecto del pH

Clasificación de los microorganismos según su tolerancia al pH

Efecto del pH m

 m ( pH ) 

m [ H  ] K a2 1   K a1 [ H ]

Efecto del pH en el crecimiento celular (Sinclair & Kristiansen, 1987)

Efecto del pH m

Efecto del pH en el crecimiento del methylococcus capsulatus

Efecto del pH X

Efecto del pH en el crecimiento de S. Cerevisae

Efecto del pH td td 

ln 2



Efecto del pH en el crecimiento de E. Coli

Efecto de la Salinidad

Clasificación de los microorganismos según su tolerancia a la salinidad

Efecto del Oxígeno

Clasificación de los microorganismos según su respuesta al oxígeno a. Areróbicos b. Anaeróbicos c. Facultativos d. Microaeróbicos e. Aerotolerantes

Efecto de la Presión

Clasificación de los microorganismos según su tolerancia a la presión

Estratificación en Sistemas Naturales

Efecto de vertidos de aguas residuales en sistemas acuáticos  Increase in heterotrophic bacterial numbers  Decrease in O2 levels occur immediately upon a spike of organic matter.  Rise in NH4+ followed shortly by the rise in NO3-, as the two-stage process of nitrification proceeds.  The rise in numbers of algae and cyanobacteria is primarily a response to inorganic nutrients, especially PO43 Oxygen levels return to their pre-input levels once most of the oxidizable organic and inorganic compounds are depleted.

Otros modelos cinéticos Ecuación de Monod



rX X

 S      m   KS  S 

Ecuación de Tessier:

  S     m 1  exp   KS 

Ecuación de Moser:

 Sn      m  n   KS  S 

Ecuación de Contois:

  m 

S     B X  S 

    

Cinéticas que tienen en cuenta la inhibición por substrato Ecuación de Andrews y Noack:

  m

S S2 KS  S  K is

Ecuación de Webb:

  S   S 1  K is    m  S2 KS  S  K is

Ecuación de Aiba y cols:

 S   S     m  exp    KS  S   K is

Ecuación de Tessier:

   m exp 

Ecuación de Tseng Y Wymann:

  m 

 





S  K is

  

  S   exp    KS

  

S    K is ( S  SC )  KS  S 

Cinéticas que tienen en cuenta la inhibición por producto 

S  (1  k  P)  KS  S 

Ecuación de Dagley y Hinshelwood:

  m 

Ecuación de Holzber y cols.:

  m  k1  ( P  k2 )

Ecuación de Ghose y Tyagy:

  m 1 

Ecuación de Aiba y Shoda:

  m 

Ecuación de Jerusalimsky y Neronova:

 S  K ip      m     K S  S  K ip  P 

Ecuación de Levenspiel:

P     m 1  *   P 

 

P   Pmax 



S    exp(k  P) K  S  S 

n

 S     KS  S 

Modelo de Han y Levenspiel (Ec. de Monod generalizada)

  S    kobs   KS  S   obs 

k obs

K S obs

 Ci    m 1  *   Ci   Ci   K S 1  *   Ci 

n=0

kobs n1

m

P P*

K Sobs

 C   K S 1  *i   Ci 

m

Modelo de Han y Levenspiel Representaciones de Lineweaver-Burk

n>0 y m=0 Inhibición competitiva

Inhibición generalizada (anticompetitiva)

m>n>0

1  K S obs     kobs  kobs 1

1  S

n=0 y m0

k obs

 C    m 1  *i   Ci 

n>m>0

Inhibición generalizada (anticompetitiva)

Caso general

n>0 y m