CINÉTICA FERMENTAÇÕES

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CINÉTICA PROCESSO FERMENTATIVO 1. INTRODUÇÃO

 Cinética das fermentações descreve o crescimento do MO e a formação do produto pelo MO Nutriente (S) + MO (X) Produto (P) + MO (X) 

 Quais substâncias (consumidas e produzidas) devemos escolher para estudo cinético?  S limitante  P de interesse



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CINÉTICA PROCESSO FERMENTATIVO Para ara realiz alizar ar o estud studo o ciné cinéttico ico  proceder à fermentação e de tempos em tempos coletar alíquotas do caldo fermentado para determinar [S], [P] e [X]  Objetivos do estudo cinético  Representação gráfica do processo fermentativo com o tempo 

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CINÉTICA PROCESSO FERMENTATIVO 2. Cinética do Crescimento Microbiano

 Crescimento do MO   Caracterizado por um acréscimo em massa celular  Ocorre somente quando certas condições são satisfeitas  Condições  físicas e químicas  pH, T (°C) e [nutrientes] Crescimento populacional definido como o aumento do n° celúlas ou da massa microbiana  Taxa de crescimento   é a variação do n° de células ou massa de MO por unidade de tempo 

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CURVA CRESCIMENTO MICROBIANO

A – B = fase de latência ou fase lag B – C = fase de transição C – D = fase logarítmica ou fase log D – E = fase linear de crescimento

E – F = fase de desaceleração F – G = fase estacionária G – H = fase de morte ou declínio 4

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CURVA CRESCIMENTO MICROBIANO

A = fase lag B = fase log C = fase estacionária D = fase declínio 5 Bioquímica Industrial- professora Cristina Fantini

CRESCIMENTO MICROBIANO 1) Fase de latência ou fase lag

 Fase de adaptação = fase de ajuste  Período variável  Ainda não há um aumento significativo da população  tx. de crescimento ~ zero  Inicia logo após a inoculação Célula sintetiza enzimas necessárias ao seu metabolismo  reorganização celular no   “novo”   meio  Duração depende de: Valor de X0; composição do meio; idade e viabilidade celular 

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2) Fase de Transição 3) Fase Log

 Células já estão totalmente adaptadas, absorvendo os nutrientes, sintetizando seus constituintes, crescendo e se duplicando  Período de crescimento balanceado    velocidade específica de crescimento, µ é constante  A taxa de crescimento exponencial é variável, de acordo com o tempo de geração do organismo em questão. 

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O tempo de geração (Tg) é o intervalo de tempo necessário para que uma célula se duplique.  O tempo de geração é variável para os diferentes organismos, podendo ser de 10 a 20 minutos até dias, sendo que em muitos dos organismos conhecidos, este varia de 1 a 3 horas  Nesta fase são realizadas as medidas de Tg  Fase log é representada por uma reta no gráfico semilog de lnX versus tempo 

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4) Fase Linear de Crescimento 5) Fase de Desaceleração

 Em algum momento do cultivo rX  começa a diminuir  desaparecimento de algum nutriente ou acúmulo de um P inibidor   velocidade de crescimento  Célula passa por transição até que rX   = zero (fase estacionária) 

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6) Fase Estacionária

 X atinge valor máximo e constante = Xm etapa não há um crescimento líquido da  Nesta população, ou seja, o número de células que se divide é equivalente ao número de células que morrem  Tx. de crescimento = zero  Equilíbrio entre velocidade de crescimento e velocidade de morte  crescimento líquido da população = zero  É na fase estacionária que são sintetizados vários metabólitos secundários 5) Fase de Morte  Rompimento do MO (lise celular) 

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CINÉTICA PROCESSO FERMENTATIVO 2.1 Velocidade Específica de Crescimento Celular

  Devido ao fato de que a concentração microbiana X aumenta durante um cultivo, aumentando consequentemente a concentração do complexo enzimático responsável pela transformação do S em P  Mais correto analisar os valores das velocidades instantâneas com relação à referida concentração microbiana    especificar o valor de X em um dado instante analisado = Velocidade Específica de Crescimento 

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VELOCIDADE ESPECÍFICA DE CRESCIMENTO CELULAR  Em cinética de fermentações não é usado a variável r (veloc. instantânea de crescimento) e sim usado o valor de µ 

X = [celular] (g/L) t = tempo rX = veloc. Instantânea (g/L.h) µ = velocidade específica de crescimento celular (h-1)

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VELOCIDADE ESPECÍFICA DE CRESCIMENTO CELULAR 

 Integrando dX/dt = µ X, quando µ é constante, temos:

 Quando Δt = Tg, isto é, tempo requerido para X2 = 2X1, chamado tempo de geração, temos: 

assim,

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VELOCIDADE ESPECÍFICA DE CRESCIMENTO CELULAR   Podemos representar o crescimento exponencial (fase log) pela seguinte reta: 

µ é a inclinação da reta lnX



tempo

Eq. Usada para calcular µ na fase log

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VELOCIDADE ESPECÍFICA DE CRESCIMENTO CELULAR  µ e Tg são parâmetros importantes em microbiologia  permitem prever a evolução da [X] ao longo da fase log  Usados para avaliar a resposta do MO às diversas condições do ambiente 

µ fase exponencial máx

fase lag

fase estacionária 15 Bioquímica Industrial- professora Cristina Fantini

CINÉTICA PROCESSO FERMENTATIVO 3. Cinética de Consumo de Nutrientes  Dispondo dos dados de concentração de nutrientes no tempo de fermentação, como mostrado, em destaque, na curva da figura abaixo, é possível obter a velocidade de consumo de nutrientes em cada ponto 

[]

P

s X

A velocidade de consumo de S é a derivada em cada ponto (rS = dS/dt)

X P

s tempo

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CINÉTICA DE CONSUMO DE NUTRIENTES  No estudo das cinéticas fermentativas não é usado a variável velocidade de consumo de nutrientes (r S) e sim a  Velocidade Específica de Consumo de Nutrientes (µ s) que é definido da seguinte maneira: 

   s  

 dS

X dt

Onde: S = Concentração de nutrientes (g/L) X = Concentração celular (g/L) T = Tempo (h) µs  = Velocidade específica de consumo de nutrientes (h-1) 17 Bioquímica Industrial- professora Cristina Fantini

CINÉTICA PROCESSO FERMENTATIVO 4. Cinética de Formação de Produto 

Formação de produto metabólito pode ser relacionada a

consumo de nutriente.  Além do mais, formação de produto não pode ocorrer sem a presença de células. Assim, é esperado que o crescimento de X e a formação de P estejam intimamente relacionados à utilização de nutrientes.  Dependendo dos controles metabólitos regulatórios, a formação de produto será ligada a crescimento e/ou concentração celular.

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CINÉTICA DE FORMAÇÃO DE PRODUTO 

 A relação cinética entre crescimento e formação de produto

depende do papel do produto no metabolismo celular.  As duas cinéticas mais comuns são aquelas que descrevem a síntese do produto durante o crescimento e após o crescimento ter cessado.  Um exemplo menos comum aplica ao caso onde o crescimento inicialmente ocorre sem formação de produto, mas após algum período de tempo o produto começa a aparecer enquanto o crescimento continua.

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CINÉTICA DE FORMAÇÃO DE PRODUTO [ ]

X

[ ]

X

P

P

t

(a) Formação de P associado ao crescimento

[ ]

t (b) Formação de P parcialmente associado ao crescimento

X P

t (c) Formação de P não associado ao crescimento

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

No gráfico (a)



  a formação de produto é associado ao

crescimento celular.  No gráfico (b)   temos formação de produto associado ao crescimento, de uma forma mais ou menos confusa, chamada de formação de produto parcialmente associada ao crescimento.  No gráfico (c)  temos formação de produto não associada ao crescimento.  A velocidade de formação de produto é a derivada de P em cada ponto dP/dt. Da mesma forma dP/dt não é usado (velocidade de formação de produto) e pode ser transformada em Velocidade Específica de Formação de Produto (µP) que é definido da seguinte maneira:    p 

 dP

X dt

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CINÉTICA PROCESSO FERMENTATIVO 5. Fatores de Conversão 

 O crescimento de X e a formação de P por X são processos de

bioconversão    S é convertido em X e metabólitos, principalmente P  Cada uma destas conversões pode ser quantificada por um coeficiente de rendimento = massa de células ou produto formado por unidade de massa de S consumido  Y X/S  fator de conversão de S em X  Y P/S  fator de conversão de S em P

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 Processos onde o P principal são células, ou seja, o objetivo é a produção de X maximizar o crescimento celular e minimizar a formação de P  YX/S > YP/S  Processos onde o P principal são metabólitos  maximizar formação de P e minimizar o crescimento de X YP/S > YX/S 

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CINÉTICA PROCESSO FERMENTATIVO 6. Influência da [S] sobre a velocidade específica de crescimento  A velocidade de crescimento, como uma velocidade de reação química, é uma função da concentração de compostos químicos.  Os compostos químicos nesse caso são os nutrientes essenciais para o crescimento.  A forma da relação entre velocidade de crescimento e concentração de nutriente foi observada em 1949 por Monod, sendo similar à cinética de saturação exibida por adsorção monomolecular de Langmuir. 

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CINÉTICA PROCESSO FERMENTATIVO 6.1 Equação de Monod 

 A eq. de Monod(1949)



 usada para explicar a relação entre

[S] e µX

µm = Velocidade específica máxima de crescimento celular KS = Constante de saturação

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CINÉTICA PROCESSO FERMENTATIVO 6.2 Significado de KS 

 Se considerarmos KS = S, na equação de Monod temos:

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 No inicio do cultivo, [S] é alto  o MO apresenta µ próximo à µm   Quanto menor o valor de K S  mais amplo será o patamar, quase horizontal da curva µ X S 

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CINÉTICA PROCESSO FERMENTATIVO  Na teoria nunca é atingido o valor de µ m, por mais alta que seja a [S] inicial  Na prática, os valores experimentais podem ser considerados como tal    isso devido aos erros que afetam os valores calculados de µX  A idéia é sempre trabalhar com S que apresente menor valor de KS maior rendimento do processo fermentativo 6.3 Determinação das Constantes Cinéticas  A forma gráfica de determinar as constantes cinéticas da eq. de Monod é chamada de linearização de Lineweaver-Burk = inversão da eq. de Monod 

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CINÉTICA PROCESSO FERMENTATIVO  Os valores de K S  são muito pequenos em relação a [S] nas fermentações industriais  µ ~ µm quando [S] = 10KS  Para [S] < 10 KS  µ é uma forte função da [S]  Durante a fase exponencial µ é constante  Quanto menor valor de K S, maior rendimento da fermentação  Para determinar valores de KS e µ m  fazer linearização e pela equação da reta determinar estas constantes cinéticas 

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