Cinética (6) Cinética Enzimática de Hidrólisis Del Almidón Por Acción de La Diastasa-1

PRACTICA N° 07

“Cinética Enzimática de Hidrólisis del Almidón” Por Acción de la Diastasa I.

OBJETIVOS: 1. Estudiar la Cinética de Hidrólisis Enzimática del Almidón. 2. Observar la eficacia y rendimiento de la hidrólisis del almidón por acción de a enzima Diastasa.

II. ASPECTOS Y PRINCIPOS TEÓRICOS: 1. INTRODUCCIÓN: La Cinética Enzimática, se refiere a los procesos en los cuales participan exclusivamente las enzimas con la finalidad de acelerar la velocidad de reacción. Ésta acción enzimática es denominada catalizadores y específicamente es un biocatalizador, las enzimas o fermentos son sustancias proteicas con actividad catalítica producido por organismos vivos. Las sustancias sobre las cuales actúan se llaman substratos y éstas enzimas pueden actuar tanto en substratos homogéneos como heterogéneos. La característica fundamental de un proceso catalizado por enzimas, es de disminuir la energía de activación. Dentro de las reacciones catalizadas por enzimas, tenemos a la Invertasa, Diastasa, Maltasa, pepsina, tripsina, etc. La Acción Enzimática de las enzimas, se produce con la unión de éstas con una molécula de substrato, para luego formar el complejo enzima-substrato y después del proceso se forma inmediatamente el producto quedando libre la enzima, para unirse con el nuevo substrato.

2. ALMIDÓN: Los almidones son polisacáridos vegetales. Fisiológicamente son sustancias de reserva, análogas al glucógeno animal y no a los constituyentes de estructura del tipo de celulosa o pectinas. Los almidones se encuentran principalmente en los granos de los tubérculos como la patata, mandioca, etc. La función nutricional del los almidones es muy importante porque constituye, después de la hidrólisis digestiva en glucosa, la principal fuente de calorías en la alimentación humana. Los gránulos de almidón se rompen por el calor y una parte del contenido de almidón es soluble en agua caliente. El almidón soluble es la amilosa y constituye del 10-20% de la mayoría de los almidones naturales. El resto, insolubles, es la amilopectina. La amilosa da en soluciones de yodo una reacción bien conocida: color rojo o azul intenso; la amilopectina se vuelve roja en contacto con el yodo. Estructuralmente, la amilosa es una cadena recta de unidades de D-Glucosa, cada una enlazada a la siguiente: Por su lado, la amilopectina está constituida también por unidades de D-Glucosa, pero su estructura está compuesta de cadenas ramificadas de unidades, y sus pesos moleculares en general son más altos que los de la amilosa. La Hidrólisis Parcial de la amilopectina da mezclas llamadas Dextrinas. Naturalmente la hidrólisis completa da D-Glucosa. Se usa las Dextrinas como aditivos de alimentos, mucílagos, pastas y en acabados de papel y tejidos.

De igual manera, cuando los gránulos de almidón se exponen al mismo tiempo al calor y a la humedad, hay una gelatinización, por encima de 55-70°C. Si se prolonga el tratamiento hidrotérmico, puede surgir una ruptura de los granos, hidrólisis parcial y disolución más o menos completas de las moléculas constituyentes. La Diastasa es una enzima de la familia de las amilasas que existen en diferentes fuentes vegetales, animales y microbianas. Ésta enzima cataliza las reacciones de hidrólisis del almidón, para convertirlo en unidades de D-glucosa y dextrinas. Ésta fracción se puede determinar con el reactivo de Fehling, para determinar la respectiva acción enzimática. El almidón como polisacárido puede ser hidrolizado por sustancias que rompen los enlaces -1,4-glucosídico y -1,6-glucosídico, con el objetivo de producir moléculas más pequeñas como las dextrinas. La determinación del grado de hidrólisis, se debe a la cantidad de azúcares reductores que se han formado; específicamente glucosas llamadas también dextrinas y se mide por las unidades de dextrosa equivalente, determinada mediante el licor de Fehling. 3. DETERMINACIÓN DE LA VELOCIDAD DE UNA REACCIÓN ENZIMÁTICA: Los principios de cinética enzimática, puede usarse para escribir a ecuación de la velocidad para un modelo de enzima – substrato y enzima – producto, que fue estudiado por Michailes Menten, es el llamado sistema unireactivo sencillo con la aproximación al equilibrio rápido deducido por M. Menten. La reacción más sencilla catalizada enzimáticamente implica que un único substrato da lugar a un único producto. El sistema se llama uni-uni en la nomenclatura de Cleland, usando la siguiente reacción: E + S

ES

EP

P + E

El complejo ES y EP es demasiado rápido por lo tanto, la reacción queda expresada como: E + S

ES

P + E

Realizando los cálculos matemático respectivos, la velocidad de una reacción enzimática será igual a: V = Vmax + (S) Ks + (S)

Donde: V Vmax (S) Ks

= = = =

Velocidad enzimática Velocidad Máxima Concentración del Substrato Constante de Michailes

4. FORMA INTEGRADA DE LA ECUACIÓN DE MICHAILES: Está dada por la siguiente relación, determinada después de una serie de cálculos de integraciones matemáticas: 1 Ln So T Si

=

Vmax Km

-

So – Si TKm

La representación gráfica es la siguiente:

1 Ln So T Si

Vmax/Km

m = - (1/Km)

So-Si T 5. FACTORES QUE INFLUYEN EN LA VELOCIDAD DE REACCIONE ENZIMÁTICAS: La velocidad de las reacciones enzimáticas, están influenciadas por diversos factores, dentro de los principales se tiene: a. Concentración del substrato b. Presencia de activadores o inhibidores c. pH óptimos para cada enzima d. Temperaturas.

III. MATERIALES Y EQUIPOS: 1. Materiales:                

Fiolas 100 mL. Termostato. Termómetro. Cronómetro. Matraces de 500 mL. Vasos de Precipitado de 500 mL. Probetas de 100 mL. Pipetas de 10mL. Mecheros Equipo de Titulación Ácido Cítrico Hidróxido de Sodio pHmetro Almidón Reactivo de Fehling. Azul de Metileno

2. Métodos:  Tomar 50 mL de agua destilada y someter a ebullición, en ese momento agregar 10 gramos de almidón soluble. Disolver.  Trasladar la solución a una probeta graduada de 100 mL y añadir y añadir agua destilada hasta completar 85 mL de solución acuosa de almidón.  Añadir ácido cítrico en cantidad necesaria, hasta regular el pH de 4.5. En seguida añadir 15 mL se de solución de enzima diastasa (10%p/v). Obteniéndose una solución acuosa de almidón al 10%.  Verter en un matraz erlenmeyer y someter a baño maría a 50°C. Cada 10 minutos extraer muestras de 5 mL, procediendo a diluir hasta 50 mL de solución. Colocar en una bureta.  Prepara en un vaso de precipitado el Reactivo de Fehlig: 2mL de Fehling A más 2 mL de Fehling B con 2 a 3 gotas de azul de metileno como indicador.

 Proceder a titulación en caliente hasta aparición de un color rojo cobrizo (cobre reducido). Anotar los gastos. Diagrama: 10gr almidón 15mL diastasa 100mL Agua destilada

5mL.

T = 45°C pH = 4.5

2mL (c/u) de Fheling A y B + H2O(d) + gotas indic. IV. DATOS EXPERIMENTALES: Después de un tiempo de 50 minutos, se obtuvieron los siguientes gastos de azúcar reductor como dextrosa:

TABLA N° 01 Tiempo (min) Vol. AR (mL) 10.0 65.0 20.0 57.0 30.0 53.0 40.0 48.0 50.0 42.0 Ahora, será necesario el cálculo de Azúcar Reductor equivalente a Dextrosa en las diferentes muestras a diferentes tiempos. Para lo cual se emplea el método volumétrico de LANE y EYRON, utilizando un factor en relación al gasto en la siguiente expresión: A.R. mg/100 mL disolución = Factor x 100 Título (mL)

El factor es obtenido a partir de las tablas de PEARSON usando 10 mL de reactivo de Fehling. En la tabla (02) se presentan los valores de los factores respectivos para cada gasto de titulación, así como los respectivos resultados en g/100 mL de disolución de azúcar reductor. TABLA N° 02 Tiempo (min) Gasto (mL) Factor 10.0 65.00 52.10 20.0 57.00 51.70 30.0 53.00 51.40 40.0 48.00 51.00 50.0 42.00 50.70

AR g/100 mL 0.0802 0.0907 0.0970 0.1063 0.1270

V. CALCULOS Y RESULTADOS: La reacción de hidrólisis enzimática que se produce en el almidón, es la siguiente: Almidón + H2O

Hidrólisis Parcial: D – Glucosa

Almidón + H2O

Hidrólisis Total: Lactosa + D – Glucosa

Y en la titulación siguiente:

Azúcares Reductores

por acción del reactivo de Fehling, se produce lo

Cu2+ + 2e

Cu0 (s) Color ladrillo

1. Determinación de las Constantes Cinéticas (Km y Vmax): Los cálculos serán realizados empleando la Ecuación Integrada de Michaeiles, que dice: 1 Ln So T Si

=

Vmax - So – Si Km TKm

En la tabla (03), se presentan los cálculos respectivos para las constantes Cinéticas: Km y Vmax, en base a los datos de la tabla (02) y desarrollados en la última expresión; teniendo en cuenta que: Si = S0 - %AR

Si = 10 - %AR

Si 9,92 9,91 9,90 9,84 9,87

(1/T) Ln(So/Si) 0,000803 0,000452 0,000335 0,000280 0,000240

(So-Si)/T 0,0080 0,0045 0,0033 0,0028 0,0024

K 0,000542 0,000127 0,0000556 0,0000311 0,0000311

Aplicando ecuación integrada de Michailes, procedemos a elaborar la gráfica (01): (1/T) Ln(So-Si) Vs.(So-Si)/T, a partir de los datos presentados en la tabla (03), de donde obtenemos las constantes cinéticas que equivalen a la pendiente (1/Km) y al punto de prolongación (Vmax/Km): Km = 10 Vmax = 1 x 10-4

VI. CONCLUSIONES Y DISCUSIONES: 1. La Diastasa es una enzima de la familia de las amilasas que existen en diferentes fuentes vegetales, animales y microbianas. Ésta enzima cataliza las reacciones de hidrólisis del almidón, para convertirlo en unidades de D-glucosa y dextrinas. Ésta fracción se puede determinar con el reactivo de Fehling, para determinar la respectiva acción enzimática. 2. El almidón como polisacárido puede ser hidrolizado por sustancias que rompen los enlaces -1,4-glucosídico y -1,6-glucosídico, con el objetivo de producir moléculas más pequeñas como las dextrinas. La determinación del grado de hidrólisis, se debe a la cantidad de azúcares reductores que se han formado; específicamente glucosas llamadas también dextrinas y se mide por las unidades de dextrosa equivalente. 3. La Acción Enzimática de las enzimas, se produce con la unión de éstas con una molécula de substrato, para luego formar el complejo enzima-substrato y después del proceso se forma inmediatamente el

producto quedando libre la enzima, para unirse con el nuevo substrato.

VII.

BIBLIOGRAFIA: (1) CHEFTEL, J. C.

1999

“Introducción Bca. Alimentos” Editorial Acribia España. Pag.120-129

(2) FIESER, Louis

1964

“Química Orgánica” Editorial Reverté S.A. España Pag. 269-272

(3) JONES, Mark

1969

“Química” Editorial Interamericana S.A. México D.F. Pag. 286-287