Chuong 6- Enzyme Lipase

Chöông 6 - ENZYME LIPASE 1 Giới thiệu chung Lipase (E.C. 3.1.1.3) được ứng dụng chủ yếu để xúc tác thủy phân acylglyceride hoặc một số ester khác như thiol, polyol hay polyacid ester. Ngòai ra lipase còn có thể được sử dụng làm chất xúc tác trong các phản ứng tổng hợp các acylglyceride hay ester có giá trị ứng dụng cao trong đời sống. Lipase có bản chất là một globulin và có thể được sản xuất từ tuyến tụy và màng dạ dày của động vật. Tuy nhiên sinh tổng hợp lipase từ vi sinh vật mang lại độ thuần khiết và hiệu suất cao hơn. Hiện tại người ta ứng dụng rộng rãi lipase trong công nghiệp dược phẩm, hóa mỹ phẩm, dệt da, chất tẩy rửa, thực phẩm hoặc tổng hợp các chất hữu cơ khác nhiên liệu sinh học (bio-fuel). Cũng như đa số các enzyme thủy phân khác, lipase không có nhóm ngọai mà chỉ có trung tâm họat động với các acid amin đặc biệt như imidazol của histidin và nhóm hydroxyl của một trong số các gốc serine.

Lipase thủy phân liên kết ester của lipid nằm tại bề mặt phân giữa lipid và nước. Trong nước, trung tâm họat động chứa serine bị khóa lại bởi vòng xoắn helix.

Khi lipase gắn vào bề mặt phân pha giữa cơ chất lipid và nước thì vòng xoắn helix di chuyển cho phép cơ chất gắn vào trung tâm họat động.

Cơ chế tác dụng của enzyme lipase: do cấu trúc bậc 3 của enzyme mà nhóm hydroxyl của serine và vòng imidazol của histidin tiếp xúc nhau và tạo thành liên kết hydro. Kết quả là oxy của nhóm hydroxyl thu được tính chất ái nhân. Và tâm ái nhân này của enzyme sẽ tương tác trực tiếp với một trong hai nguyên tử tích điện dương của liên kết bị thủy phân. Và do đó liên kết này dễ bị cắt đứt và sự thủy phân thuận lợi hơn. Một cơ chế khác là enzyme tạo thành liên kết tương ứng với cơ chất ở những vị trí liên kết gần gũi với liên kết thủy phân. Kết quả là làm tăng sự khuyết electron vốn đã tồn tại trước đó, và phân bố electron trong phân tử cơ chất thay đổi theo một chiều hướng cần thiết. Nhờ đó mà việc cắt đứt liên kết được dễ dàng, hoặc làm cho một trong hai nguyên tử của liên kết tương tác được với các tác nhân ái nhân. Xúc tác enzym lipase được chia làm 2 lọai như sau: thủy phân và tổng hợp. Phản ứng thủy phân: RCOOR’ + H2O  RCOOH + R’OH 79

Phản ứng tổng hợp: Có thể được chia thành 4 nhóm nhỏ sau: a) Ester hóa (Esterification): RCOOH + R’OH  RCOOR’ + H2O b) Ester hóa tương hỗ (Interesterification): RCOOR’ + R”COOR*  RCOOR* + R”COOR’ c) Rượu phân (Alcoholysis): RCOOR’ + R”OH  RCOOR” + R’OH d) Axit phân (Acidolysis) RCOOR’ + R”COOR  R”COOR’ + RCOOH Trong đó 3 nhóm b, c và d thường được gọi chung là là transesterification. 2 Ưu thế xúc tác lipase so với phương pháp sử dụng xúc tác hóa học Hầu hết các ứng dụng của lipase ngày nay tập trung thay thế các phản ứng xúc tác hóa học để cải biến họăc tạo dẫn xuất của các lọai dầu mỡ. Hiện tại các triacylglyceride mạch trung bình được sản xuất bằng cách ester hóa acid béo với glycerol ở áp suất và nhiệt độ cao (200-250oC) bằng các chất xúc tác vô cơ. Các xúc tác vô cơ này thường không hiệu quả và đòi hỏi phải cung cấp nguồn năng lượng rất lớn. Sản phẩm tạo thành cần phải được tiếp tục đem tinh luyện tiếp bằng cách rữa kiềm, tinh luyện bằng hơi nước, chưng cất phân tử, siêu lọc, hoặc sử lý bằng carbon họat tính v.v Một qui trình sản xuất công nghiệp quan trọng hiện nay là thủy phân dầu thực vật (dầu ô liu, dầu dừa, dầu đậu nành…) để sản xuất các acid béo và glycerol nhằm ứng dụng rộng rãi trong công nghiệp chất tẩy rữa, hóa mỹ phẩm, dược phẩm và thực phẩm. Các quá trình sản xuất hiện tại có điều kiện phản ứng cao: áp suất 3000-5000 kN/m2 và nhiệt độ  250oC. Trong 2h có thể thủy phân được 96-98% dầu để thu được 12% glycerol. Các acid thu được không thể đem sử dụng ngay mà cần phải tiếp tục đem đi chưng cất để tẩy màu và lọai bỏ các sản phẩm phụ. Quá trình này sản xuất kiểu này đòi hỏi tiêu tốn nhiều năng lượng và tạo ra rất nhiều các phản ứng không mong muốn như là các phản ứng trùng hợp của các acid béo nhiều nối đôi và tạo thành các ketone và hydrocarbon. Chi phí đầu tư cho quá trình tách bằng hơi nước rất cao bởi vì cột chưng tách phải có cấu tạo đặc biệt chịu được nhiệt độ và áp suất cao cũng như khả năng chịu ăn mòn acid. Trong khi đó, do xúc tác enzyme được tiến hành ở áp suất và nhiệt độ trung bình thấp (40 - 60oC) nên có thể tiết kiệm được chi phí năng lượng. So với phương pháp sản xuất truyền thống, chi phí sản xuất bằng enzyme cũng được giảm bớt nhờ các bình phản ứng không cần phải chịu ăn mòn cao, cũng như các điều kiện môi trường khắc nghiệt khác. Các sản phẩm của quá trình xúc tác sinh học cũng cho màu sắc và mùi vị tốt hơn, cũng như độ tinh khiết cao (có rất ít họăc không có phản ứng phụ). Và nhờ đó người ta cũng giảm thiểu đựơc chi phí sản xuất do không cần phải tiến hành các quá trình tinh luyện tiếp theo như trong phương pháp xúc tác vô cơ. Ngòai ra nhiệt độ phản ứng thấp cũng góp phần làm giảm thiểu sự phân hủy nhiệt của sản phẩm. Và do đó lipase được sử dụng cho tất cả các mục đích trên. 80

3 Các ứng dụng cụ thể của các loại Lipase 3.1 Thủy phân Thủy phân nhằm tách dầu ra thành các acid và rượu. Sản phẩm mong muốn có thể là một loại acid đặc biệt hoặc là mono, diglycerides, rượu... Một số nghiên cứu, ứng dụng lipase để thủy phân một số cơ chất được trình bày trong Bảng 1. Bảng 1. Xúc tác thủy phân của Lipase Lipase

Cơ chất

Mục đích

Rhizopus delemar + Pencillium + Rhizopus niveus

Dầu đậu nành

Tăng tính hiệu quả thủy phân bằng cách kết hợp nhiều lọai lipase

Canida rugosa, Aspergillus nige

Dầu cá

Làm giàu các PUFA

C. rugosa

Dầu đậu nành

Thủy phân kết hợp với hệ thống màng lọc

C. rugosa

Mỡ bò, mỡ heo

Thủy phân trong dung môi hữu cơ ở nhiệt độ thấp hơn nhiệt độ nóng chảy của mỡ

R. niveus

Dầu cá

Làm giàu acid Docosahexaenoic (DHA)

R. delemar

Dầu cọ

Sản xuất monoglyceride

3.1.1 Trong phân giải lipid Nhờ vào khả năng lipase thủy phân dầu mỡ thành glycerol và các acid béo vốn có ứng dụng quan trọng trong công nghiệp. Hiện tại, các acid béo được sử dụng để sản xuất xà phòng. Các enzym xử dụng cho mục đích này có thể thu từ Candida rugosa và Pseudomonas fluorescens (quy trình đã được công nghiệp hóa). Các phương pháp enzyme này hiệu quả hơn các phương pháp hóa học về mặt chi phí và sản phẩm thu được có màu sắc và mùi vị tốt hơn. Do các phản ứng enzyme xảy ra ở nhiệt độ và áp suất thấp hoặc trung bình nên chúng có thể được sử dụng để sản xuất các lọai acid béo từ các lọai dầu dễ biến tính (chứa nhiều acid béo không no hoặc có nhiều nối đôi liên hợp). Thông thường điều này rất khó đạt được với các phương pháp sản xuất trước đây vì nhiệt độ và áp suất cao dễ dẫn đến oxít hóa dầu mỡ. 3.1.2 Trong công nghệ thuộc da Trong công nghiệp thuộc da, một trong những bước quan trọng là lọai bỏ các phần thịt và mỡ vụn còn dính trên da và lông. Sử dụng các quy trình hóa học như tẩy kiềm thường không hiệu quả. Ngày nay người ta đang dần sử dụng lipase và protease để đạt được mục đích trên. Lấy ví dụ như người ta sử dụng lipase từ Rhizopus nodosus để xử lý tẩy nhờn lông cừu. So với phương pháp xử lý bằng dung môi truyền thống thì chất lượng sản phẩm xử lý bằng enzyme co chất lượng đương nhau, nhưng chí rẻ hơn và ít độc hại hơn. 81

3.1.3 Trong xử lý nước thải Lipase được sử dụng trong các bùn họat tính và các quy trình xử lý chất thải hiếu khí mà trong đó lớp lipid mỏng trên bề mặt bình hiếu khí được liên tục lọai bỏ để cho phép oxy xâm nhập vào (để duy trì điều kiện sống cho VSV hiếu khí). Ví dụ như Lipase-MY từ Cadida rugosa do công ty Meito Sangyo, Nhật Bản sản xuất được sử dụng trong các nhà máy xử lý nước thải ở Mỹ. Trên thực tế việc phân hủy các chất thải rắn, làm sạch và ngăn chặn lipid làm tắc nghẽn hay tạo thành lớp trong các hệ thống xử lý nước thải, các bình chứa… rất quan trọng trong nhiều nhà máy công nghiệp thực phẩm, thuộc gia, giết mổ gia cầm. 3.1.4 Trong sản xuất chất tẩy rửa gia dụng Cùng nhóm với hai nhóm ứng dụng bên trên, lipase được ứng dụng công nghiệp sản xuất các chất tẩy rửa như bột giặt, nước rửa chuyên dụng… Lipase sản xuất từ Aspergillus oryzae được dùng trong bột giặt do có khả năng chịu kiềm cao. Hàng năm khỏang 1000 tấn lipaza được cho vào 13 triệu tấn bột giặt, với tổng giá trị vào khoảng 30 triệu USD. 3.1.5 Trong sản xuất hương và các sản phẩm từ sữa Các acid béo tự do, các peptide hòa tan và các amino acid tạo nên mùi vị và cấu trúc cho các sản phẩm bơ, phómát, margarine. Bởi vậy các lipase và protease đượng sử dụng để rút ngắn thời gian làm chín phó mát và để sản xuất các mùi vị đặc trưng khác. Mùi vị tạo thành phụ thuộc vào lọai enzyme sử dụng. Hiện tại các PGE (pregastric esterase) được sử dụng để làm phó mát có vị tiêu cay ở Ý. Enzyme từ Penicillium roqueforti thì được dùng để tạo các lọai phómát xanh (blue cheese). Các sản phẩm phómát sản xuất nhanh bằng enzyme (EMC, Enzyme modified cheeses) ngày càng xuất hiện rộng rãi (ví dụ như lipase từ Mucor meihei, Aspergillus niger, A.oryzae). Bên cạnh đó lipase còn được sử dụng để tạo hương cho các sản phẩm bột kem cà phê, kẹo bơ sữa cứng, sôcôla, snack, soup.... 3.1.6 Trong sản xuất các thực phẩm khác Đây là một lĩnh vự đầy tiềm năng để ứng dụng lipase. Phân giải lipid bằng enzyme đã được ứng dụng vào trong sản xuất các lọai thịt, cá không chứa mỡ. Thủy phân một phần triglyceride để làm tăng hàm lượng monoglyceride bằng các cho lipase vào trong bột bánh mì cho phép làm chậm đi quá trình thóai hóa tinh bột. Sự tạo thành mono và diglyceride cũng cho phép cải thiệt tính tạo xốp của lòng trắng trứng gà. Lipase còn được ứng dụng trong sản xuất sữa đậu nành, cá và thịt xông khói, hay ngay cả trong sản xuất thức ăn cho vật nuôi kiểng như chó, mèo. 3.1.7 Trong điều trị bệnh Bên cạnh các chất hydradcarbon và protein, lipid là thành phần không thể thiếu trong cơ thể con người. Vì vậy, nếu xảy ra các sai sót trong quá trình thủy giải, hấp thụ hay tổng hợp lipid đều dẫn đến khả năng gây bệnh cho người. Do đó lipase được sử dụng như là một chất trợ giúp tiêu hóa. Hàm lượng lipase trong serum máu là một chỉ định chẩn đóan tốt cho các bệnh tổn thương về tuyến tụy. Giống như nhiều lọai enzyme khác, lipase cũng có thể được cố định trên các điện cực pH hoặc oxy để chế tạo các sensor sinh học nhằm xác định hàm lượng triglyceride và cholesterol trong máu. PGE cũng được sử dụng cho các bệnh nhân không thể hấp thu được lipid. 82

3.1.8 Trong phân tích cấu trúc triglyceride Lipase có thể được phân lọai dựa trên tính đặc hiệu của cơ chất. Có thể bao gồm: - Enzym đặc hiệu ở vị trí sn-1,3 (Rhizopus oryzae, Humicola lanuginosa, Rhizomucor meihei) ; - một loại axit béo đặc trưng như oleic acid (Geotrichum candidum) hoặc linolenic (Brassica napus và Mucor miehei); - hoặc hoàn toàn không đặc hiệu (Candida antarctica, Candida. rugosa, Pseudomonas cepacia). Như vậy sử dụng tính đặc hiệu của Lipase sẽ giúp chúng ta phân tích được cấu trúc của triglyceride. 3.1.9 Trong sản xuất các acid béo Sản xuất dầu ăn giàu các acid béo nhiều nối đôi (PUFA, polyunsaturated fatty acid) như docosahexaenoic acid (DHA) và eicosapentaenoic acid (EPA) là một trong những ứng dụng hết sức được quan tâm hiện nay của lipase. Ví dụ: Sản xuất hỗn hợp giàu acid béo omega-3 từ dầu cá mòi bằng lipase (T. OKADA and M. T. Morrissey - Bộ môn Công nghệ thực phẩm, đại học Oregon State USA). Trong vòng 30 năm gần đây, các nghiên cứu đã cho thấy các acid béo omega-3 có ảnh hưởng tốt đến sức khoẻ, và rất nhiều loại sản phẩm cũng đã được tung ra thị trường. Dầu cá mòi thô trước tiên được tẩy màu bằng carbon hoạt tính (4%), khử mùi bằng cách chân cất chân không và được ổn định với 200 ppm TBHQ. Có thể sử dụng các loại lipase thương mại như từ Candida Rugosa, Candida cylindracea, Aspergillus niger hay Mucor javanicus. Đệm pH bằng phosphate từ 6.5 – 7.0 tùy thuộc vào pH tối ưu của mỗi loại enzyme. Nghiên cứu cho thấy đối với cá mòi thì 500U lipase từ Candida Rugosa có thể thủy phân 82.5% dầu cá trong 9 giờ. Phân tích thành phần acid béo bằng phương pháp sắc ký khí cho thấy so với dầu cá mòi ban đầu thành phần EPA và DHA được cải thiện. Thành phần acid béo

Dầu cá mòi ban đầu

Thủy phân bằng 500U/g lipase từ Candida cylindracea trong 6 giờ

Thủy phân bằng 250U/g lipase từ Candida Rugosa trong 6 giờ

EPA

19,44

35,8

29,75

DHA

7,62

19,23

14,85

Như vậy nghiên cứu cho thấy xử dụng lipase có thể dùng để sản xuất các hỗn hợp lipid giàu các acid béo omega-3 từ dầu cá . 3.1.10 Các ứng dụng khác: Ngoài ra Lipase còn được ứng dụng để tẩy mực in trên giấy, xử lý tơ tằm, hay trong sản xuất nước súc miệng khử mùi.

83

3.2 Tổng hợp ester Khả năng của lipase nhằm xúc tác các phản ứng nghịch của quá trình thủy phân được sử dụng để sản xuất các sản phẩm mong muốn. Hỗn hợp ester hóa thường chỉ chứa các cơ chất và enzyme. Nước chỉ là sản phẩm phụ của phản ứng và được lọai bỏ khá dễ dàng nên đây được coi là quy trình tiên tiến để tổng hợp các chất. Bên cạnh đó quá trình transesterification thay vì tạo ra nước sẽ tạo ra sản phẩm rựơu, acid hay ester, do đó quá trình này sẽ sinh lợi nhiều hơn nếu như các lọai sản phẩm trên là sản phẩm chúng ta mong muốn đạt được. Trong hóa học phản ứng ester hóa chủ yếu nói đến phản ứng giữa acid với rượu, trong khi đó lipase lại có thể xúc tác nhiều lọai cơ chất hơn: ester đường, thiol esters, peptide…

3.2.1 Tổng hợp ester có khối lượng phân tử thấp hoặc trung bình Các ester có khối lượng phân tử thấp như là isoamyl butyrate và benzyl propionate được sử dụng làm chất tạo mùi. Hiện tại bytyl laurate là thành phần hương chủ yếu của đào và lê, và thường được dùng trong sản xuất hương trái cây. Ethyl butyrate được biết đến nhờ hương dứa của nó. Bytyl oleate và butyl laurate được sử dụng làm chất làm mềm dẻo, chất bôi trơn. Và do đó chúng được ứng dụng rộng rãi trong công nghiệp dầu thơm, mỹ phẩm, xà phòng, thực phẩm… Một ứng dụng khác là sử dụng các methyl và ethyl ester để thay thế cho các lọai nhiên liệu. Tất cả các ester trên đều có thể tổng hợp một cách hiệu quả bằng cách sử dụng lipase từ M. miehei, R.delemar, P. cyclopium, G. candidum v.v... 3.2.1 Polyester Lipase được sử dụng để sản xuất các polymer của dimethyl terphthalate, vinyl acetate, butyl acrylate được sử dụng để làm các chất dẻo, sơn và chất kết dính. 84

3.2.2 Thực phẩm Lipase dùng để tổng hợp monoglyceride như là monolaurin, đường ester và ester của amino và acid béo vốn được sử dụng như là các chất nhũ hóa hoặc các chất nền trong các màng bao ăn được. Hiện tại một sản phẩm quan trọng đựơc sản xuất từ lipase là các sản phẩm thay thế dầu mỡ. Ngày càng có nhiều nhu cầu thay thế các chất dầu mỡ giàu năng lượng. Hơn thế nữa các sản phẩm thay thế lại có tính ổn định nhiệt rất cao. Ví dụ như sản phẩm Olestra, hỗn hợp của hexa-, hepta- và octaester, được hình thành bằng cách ester hóa được sucrose với các acid béo mạch dài do Proter & Gamble đang giữ bản quyền hay sản phẩm ester hóa của glycerol với propoxylate của ARCO Chemical. Các sản phẩm ester trên được sử dụng rộng rãi trong chế biến các nước sốt, mayonnaise, hay kem ăn. 3.2.3 Dược phẩm và hóa mỹ phẩm Mono-, di- và triglyceride của octanoic và decanoic acid có thể được sử dụng làm nền cho các chất màu và mùi trong các sản phẩm hóa mỹ phẩm và dược phẩm. Ester của đường và sorbitol với lauric và stearic acid được dùng trong thuốc chống khối u. Oleyl monooleate được sử dụng trong dầu tắm, các sản phẩm dưỡng tóc, dưỡng da. 3.2.4 Các sản phẩm từ sữa và bánh kẹo Một trong những ứng dụng dễ thấy nhất trong lĩnh vực này là sử dụng lipase để xúc tác các lipid để tổng hợp các triglyceride có tính chất mong muốn. Ví dụ như sử dụng lipase từ C. viscosum, M. miehei, và P.fluorescens để chế tạo chất thay thế bơ cacao từ dầu cọ nhằm sử dụng làm sôcôla và bánh kẹo, hay nếu sản xuất từ dầu olive và hạt bông vải thì sử dụng lipase thương mại Lipozyme (sản xuất từ M. miehei).

85

Ngoài ra người ta cũng dùng lipase để cải biến dầu cọ để thay thế chất béo trong sữa mẹ.

Hiện tại, Lipases chỉ chiếm khoảng 5-10% sản lượng enzyme sử dụng (protease chiếm 60-70%, carbohydrase chiếm 25%). Điều này được lý giải bởi việc sử dụng lipase còn gặp một số mặt hạn chế. Trước hết là lipase thường xúc tác trong môi trường nước, trong khi đó cơ chất lipid thì vốn rất ít tan trong nước. Bên cạnh đó tính ổn định của lipase đối với nhiệt độ, pH… chưa cao. Và sau cùng là khó thu hồi và tái sử dụng lipase nên dẫn đến chi phí sản xuất cao. Tuy nhiên, cùng với sự phát triển của khoa học kỹ thuật, các đặc điểm hạn chế trên của lipase đang từng bước được giải quyết. Ngày nay các lipase có thể họat động trong các dung môi hữu cơ hoặc các lưu chất ở trạng thái siêu tới hạn. Bảng 2 trình bày một số lipase thương mại đang cung cấp cho các ngành nghề trên thị trường.

Bảng 2. Một số lipase thương mại đang cung cấp cho các ngành nghề trên thị trường. Tên

Phạm vi ứng dụng

1

Lipopan®

Bánh kẹo

2

Lipozyme®

Hóa dầu mỡ

3

PalataseTM

Sản phẩm từ sữa

4

Clear-LensTM LIPO

Tẩy rửa

5

Greasex

Thuộc da

6

NovoCorTM AD

Thuộc da

7

LipolaseTM

Bột giặt

8

LipoPrime®

Bột giặt

9

Novozym® 871

Thức ăn cho vật nuôigia súc

STT

86

4 Lipoxygenase 4.1 Giới thiệu chung Lipoxygenase (E.C. 1.13.1.13) xúc tác sự oxi hóa của các acid béo không no nhiều nối đôi như linoleic, linolenic, arachidonic và các ester của chúng. Lipoxygenase rất quan trọng trong công nghệ thực phẩm vì chúng có thể ảnh hưởng đến màu sắc, mùi vị và giá trị dinh dưỡng của sản phẩm. Lipoxygenase có mặt ở nhiều loại mô thực vật và động vật. Đặc biệt là sự có mặt của lipoxygenase trong các hạt mang dầu (ví dụ như đậu nành) có thể được xem là nguyên nhân chính hình thành các peroxide trong quá trình trích ly dầu thực vật.

a

b

Hình: Cấu trúc (a) và trung tâm họat động (b) của lipoxygenase đậu nành Lipoxygenase thường tồn tại ở nhiều dạng isozymes khác nhau về pH hoạt động tối ưu cũng như là sản phẩm và tính đặc hiệu của cơ chất. Lấy ví dụ như từ đậu nành người ta có thế tách được 4 loại isozyme khác nhau. - Isozyme đậu nành 1: có pH tối ưu là 9.0. Loại này chỉ tác dụng trên các loại acid béo tự do có nhiều nối đôi. Ở nhiệt độ phòng, loại enzyme này hình thành peroxide ở vị trí Cacbon số 9 và 13 theo tỉ lệ 1:9. - Isozyme đậu này 2: có pH tối ưu là 6.8. Loại này có thể xúc tác trên triglyceride cũng như là acid béo tự do có nhiều nối đôi và hình thành peroxide ở vị trí 9 và 13 theo tỉ lệ 1:1 ở nhiệt độ phòng. - Isozyme đậu nành 3: tương tự như isozyme 2 nhưng hoạt tính của nó dễ bị ức chế bởi ion Ca2+ - Isozyme đậu nành 4: tương tự như loại isozyme 3 nhưng có thể được tách bởi phương pháp sắc ký hay điện di Ngoài ra các isozymes còn thường được phân thành loại 1 (pH tối ưu > 7 và đặc hiệu với các acid béo tự do) và loại 2 (pH tối ưu = 7 và oxi hóa được carotenoids). Khả năng lipoxygenase loại 2 có khả năng tẩy màu carotenoids ngày nay được ứng dụng trong việc sản xuất bánh mì trắng (bằng các thêm bột đậu nành vào bột mì để bổ sung lượng isozymes loại 2). Lipoxygenase ở động vật và thực vật thường được họat hóa khi các mô tế bào bị tổn thương hoặc bị phá vỡ. Kết quả là các acid nhiều nối đôi bị oxi hóa thành các hydroperoxide. Sau đó sẽ phân hủy thành nhiều sản phẩm bay hơi khác nhau. 87

Xét về phương diện sản phẩm của quá trình xúc tác, Lipoxygenase tạo ra các sản phẩm bay hơi tương tự như sản phẩm trong quá trình tự oxy hóa khứ, mặc dù tỉ lệ của thành phần sản phẩm khác biệt nhau tùy vào tính đặc hiệu của enzyme cũng như điều kiện phản ứng (Bảng 3). Bảng 3. So sánh thành phần của sản phẩm bay hơi của phản ứng oxy hóa xúc tác bởi lipoxygenase đậu Hà Lan (a) với sự tự oxi hóa khử (b) Cơ chất: Linoleic acid Sản phẩm % (a) % (b) n-pentanal 7 0,7 n-hexanal 41 67 n-hept-2-enal 15 6 n-oct-2-enal 10 18 n-nona-2,45 0,4 dienal 20 5 n-deca-2,4-dieanl

Cơ chất: Linolenic acid Sản phẩm % (a) % (b) Acetaldehyde 5 Propanal 27 n-but-2-enal 3 1 n-penta-2-enal 22 10 n-hex-2-enal 2 1 n-hex-3-enal 14 n-hepta-2,4-dieanl 38 50

4.2 Cơ chế phản ứng Phân tử lipoxygenase có chứa một nguyên tử sắt. Nếu nguyên tử sắt này chuyển từ dạng Fe2+ sang Fe3+ thì lipoxygenase sẽ chuyển từ dạng thụ động sang dạng hoạt hóa để xúc tác phản ứng. Quá trình xúc tác được diễn tả trong sơ đồ 1. Đầu tiên Fe2+ có thể bị oxi hóa thành Fe3+ nếu được tiếp xúc với acid béo peroxide hoặc là OOH. Do đó nếu cơ chất chỉ đơn thuần là acid béo tự do thì quá trình oxy hóa diễn ra khá chậm. Lipoxygenase được kích hoạt sẽ từ từ tách nguyên tử hydro từ nhóm methylene nằm ở giữa của acid béo nhiều nối đôi. Trong điều kiện hiếu khí, phức hợp enzyme-gốc alkyl sẽ được oxi hóa bằng phân tử oxy để trở thành phức hợp enzyme-gốc alkyl peroxide. Sau đó điện tử sẽ được truyền từ nguyên tử sắt sang nhóm peroxide. Và như vậy sự thêm vào và tách proton từ enzyme đã tạo ra sản phẩm hydroperoxide. Trong điều kiện yếm khí thì gốc alkyl sẽ được tách ra khỏi phức hợp enzyme-gốc alkyl, rồi từ đó sẽ hình thành hỗn hợp các sản phẩm như các chất nhị trùng, ketones và epoxides. 4.3 Hạn chế và bất hoạt lipoxygenase Việc lipoxygenase gây ra mùi ôi trong các sản phẩm chứa dầu mỡ là một trong những vấn đề đang được quan tâm. Hiện tại có rất nhiều các nhà nghiên cứu đang làm việc để tối ưu hoá các điều kiện để làm bất hoạt lipoxygenase trong các sản phẩm chứa dầu mỡ. Các phương pháp thịnh hành đang được nghiên cứu và áp dụng là bổ sung các chất chống oxi hóa, hiệu chỉnh pH và nhiệt độ... Lipoxygenase có thể bị hạn chế bởi rất nhiều loại chất chống oxi hóa (ví dụ như pyrocatechol, homocatechol, propylgallate, nordihydroguariaretic acid, resorcinol, phioroglucinol, hydroquinone, butylated hydroxyanisole và nhiều loại flavonoids cũng như các hợp chất liên quan khác.Ngày nay các chất chống oxi hóa có nguồn gốc từ thực vật đang được các khoa học gia hết quan tâm nghiên cứu và khai thác.

88

Sơ đồ 1: Quá trình xúc tác của lipoxygenase Xử lý nhiệt có thể làm ảnh hưởng đến tính tan của protein cũng như làm thay đổi các tính chất chức năng của các sản phẩm protein theo chiều hướng bất lợi. Ví dụ như người ta hiệu chỉnh đậu xanh xuống độ ẩm 16,3% với đệm pH 9,8 sau đó đun nóng trên 90oC trong vòng 10s. Bằng các đó người ta có thể làm bất hoạt 99% lipoxygenase, nhưng bên cạnh đó cũng chỉ giữ lại được 70% tính hoà tan của protein. Người ta cũng thấy rằng lipoxygenase là nguyên nhân chính gây nên hiện tượng trở mùi ở đậu Hà lan xanh. Ngoài ra lipoxygenase cũng chịu trách nhiệm cho việc làm biến đổi mùi vị của chuối. Mức độ bền nhiệt của các loại lipoxygenase trong các loại thực phẩm rất khác nhau. Người ta nhận thấy rằng lipoxygenase trong đậu Hà lan và đậu xanh chiệu nhiệt kém hơn peroxidase ở 60oC trong 10 phút. Do vậy để vô hoạt các loại đậu trên thì cũng chỉ cần xử lý nhiệt ở mức không quá cao. Trong khi đó ở một nghiên cứu khác, người ta lại nhận thấy lipoxygenase trong măng tây lại bền nhiệt hơn so với peroxidase. Bởi vậy cho dù xử lý nhiệt ở nhiệt độ 70oC trong vòng 10 phút có thể làm vô hoạt peroxidase nhưng lại không đủ để vo hoạt lipoxygenase Xử lý nhiệt bằng microwave có thể hạn chế rất hiệu quả hoạt động của lipoxygenase. Người ta nhận thấy xử lý đậu nành bằng microwave có thể vừa làm tăng tính hút nước của hạt lại vừa có thể làm vô hoạt lipoxygenase và các chất ức chế hấp thu trypsin. Do đó người ta có thể xử lý đậu nành (8,7% ẩm độ) bằng sóng siêu vi trong 4 phút trước khi đem đi sản xuất sữa đậu nành. Nếu đậu được đem ngâm nước trước thì thời gian xử lý nhiệt để làm bất hoạt enzyme sẽ càng ngắn hơn.

89

4.4 Những xu hướng phát triển trong tương lai Hiện nay người tiêu dùng ngày càng quan tâm đến những sản phẩm có chứa nhiều DHA và EPA. Và vì thế các sản phẩm này rất dể bi oxi hóa bởi lipoxygenase. Điều này đòi hỏi cần có nhiều nghiên cứu hơn nữa về các chất chống oxi hóa, các phương pháp vật lý để ngăn chặn sự hư hỏng do oxi hóa. Các phương pháp sơ chế dầu ăn (đặc biệt là loại dầu chứa nhiều acid béo có nhiều nối đôi) trước khi đưa vào chế biến thực phẩm được cải tiến sao cho làm giảm thiểu việc tạo nên các peroxide.

5 Sự ôi hóa sinh học của lipid 5.1 Giới thiệu chung Ở các phần trước, chúng ta đã đề cập đến ứng dụng của thủy giải lipid trong các ngành công nghiệp khác nhau. Trong công nghệ thực phẩm nói riêng việc thủy giải lipid cùng với sự oxi hóa các acid béo còn đóng một vai trò rất to lớn đối với chất lượng của sản phẩm trong quá trình chế biến và bảo quản. Trong các sản phẩm động vật và thực vật, hai nhóm lipid chính là phospholipid và triglyceride. Phospholipid là thành phần không thể thiếu trong thành phần màng tế bảo bởi vậy chúng được gọi là lipid cấu trúc. Còn triglyceride thường được gọi là lipid dự trữ năng lượng, và thường được chứa trong các tế bào mỡ được bao bọc bởi các màng phospholipid. Trong thời gian chế biến và bảo quản, lipase và phospholipase sẽ thủy giải triglyceride và phospholipid. Cùng với các acid béo liên kết, các acid béo được tạo ra trong quá trình trên (đặc biệt là các acid béo nhiều nối đôi) sẽ dễ dàng bị oxid hóa bởi các tác nhân hóa học hoặc enzyme lipoxygenase. Cơ chế oxy hóa do lipoxygenase:

90

5.2 Phospholipases Phospholipase A2 (EC 3.1.1.4) là phospholipase đầu tiên được công nhận và đóng vai trò rất quan trọng trong các ứng dụng của phospholipase. Enzyme này xuất hiện rất nhiều trong tự nhiên và có mặt hầu như ở tất cả các lọai tế bào. Phospholipase A2 (PLA2) là một thành phần của thực phẩm từ nguồn động thực vật và vì vậy luôn được đưa vào cơ thể người thông qua đường ăn uống. PLA2 đóng vai trò tích cực trong việc cải thiện các tính năng của lecithin (đậu nành, lòng đỏ trứng), lọai gum trong quá trình tinh luyện dầu..., nhưng bên cạnh đó nó cũng là nguyên nhân gây nên một số hư hỏng trong các sản phẩm. Ngày nay người ta khám phá được rằng nguyên nhân thủy phân phospholipid trong thịt cá chủ yếu là do PLA2. Một số nghiên cứu về PLA2 trong cá quan trọng như: -

PLA2 ở cá Hồi có độ pH tối ưu là 7 và không đòi hỏi ion Ca2+ để họat hóa.

-

PLA2 trong cá Tuyết không phụ thuộc Ca2+ và pHopt >7. PLA2 này có khả năng thủy phân phospholipid trong cá tuyên tăng dần trong 8 tuần trữ lạnh đầu tiên ở 30oC, sau đó sẽ giảm dần đến tuần thứ 12. Và chúng ta cần lưu ý rằng họat động của PLA2 gắng liền với việc cơ của cá trở nên cứng hơn do tác động của các acid béo với các cơ protein.

-

PLA2 trong cá Pôlăc thì đòi hỏi sự có mặt của Ca2+. Khác với PLA2 trong cá Tuyết, pHopt cua PLA2 trong cá Pôlăc có tính kiềm 91

Tuy nhiên người ta người ta vẫn có thể tìm thấy các họat động thủy giải phospholipid acyl khác ở cá. Ví dụ như ở cá ngừ Euthynnus pelamis, PLA1 lại là nguyên nhân tạo ra lysophospholipid trong thịt cá. PLA1 này không phụ thuộc Ca2+ và có pHopt vào khỏang 6,5 – 7,0. Một nghiên cứu khác cho thấy cá thu Đại Tây Dương cũng có loại PLA 1 không phụ thuộc Ca2+ với pHopt khoảng 4,0. Như vậy ở cá nói chung, những tổn hại mô khi bị đánh bắt hoặc do stress sẽ làm tăng hoạt tính của PLA1 và PLA2, và kết quả là ảnh hưỡng đến quá trình bảo quản của sản phẩm. Phospholipase A2 được xúc tác các phản ứng thủy phân phosphoatidylcholine để tạo thành acylglycerophocholine. Phospholipase A2 được sử dụng để thủy phân lecithin để cải biến các tính chất nhũ hóa của nó. Các lecithin thương mại là một hỗn hợp phosphatide của choline, ethanolamine và inositol với một lượng nhỏ các lipid khác và được sử dụng rộng rãi trong nhiều lọai thực phẩm khác nhau. Công dụng của lecithin như là một chất nhũ hóa trong chế biến thực phẩm thì rất phổ biến, tuy nhiên các lọai lecithin chưa đựơc cải biến thì tính chất nhũ hóa của chúng rất hạn chế trong các thực phẩm dầu mỡ. Phospholipase A2 thủy phân liên kết ester giữa glycerol và acid béo tại vị trí sn-2 của lecithin nhằm tạo ra lysolecithin và một phân tử acid béo. Kết quả là lysolecithin tạo thành có khả năng tạo nhũ hoá cao hơn trong nhiều loại thực phẩm khác nhau.

92