Chromatographie Notions

Année 2011 - 2012 2ème année BTS de Biophysicien

Travaux pratiques de Techniques d’Analyse Spectrale et Séparative N°2

C. SAUNIER & L. GODIN http://ligodin.free.fr

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TP n°2 : CHROMATOGRAPHIE LIQUIDE HAUTE PERFORMANCE (H.P.L.C) 2.1 PRINCIPE

4

2.1.1. Généralités sur la chromatographie liquide haute performance 2.1.1.1. Les supports 2.1.1.2. Les phases stationnaires 2.1.1.3. Les phases mobiles 2.1.1.4. Les Modes de travail Mode isocratique Mode gradient 2.1.1.5. L'appareillage Les pompes Les injecteurs Les colonnes Les détecteurs Détecteurs spectrophotométriques

4 5 5 6 8 8 8 9 11 13 14 14 15

2.1.2. Grandeurs importantes en chromatographie 2.1.2.1. Loi de Darcy 2.1.2.2. Grandeurs chromatographiques et facteurs d'identification des solutés 2.1.2.2.1. Grandeurs de rétention 2.1.2.2.1.1. Temps de rétention et largeur du pic 2.1.2.2.1.2. Volumes de rétention 2.1.2.2.1.3. Facteur de rétention ou de capacité k' 2.1.2.2.1.4. Facteur de sélectivité ou de séparation α entre deux solutés 2.1.2.2.1.5. Facteur d'asymétrie des pics 2.1.2.2.2. Efficacité d'une colonne 2.1.2.2.2.1. Le nombre de plateaux théoriques N 2.1.2.2.2.2. La hauteur équivalente à un plateaux théorique H ou H.E.P.T. 2.1.2.3. Séparation des solutés et résolution 2.1.2.3.1. Facteur de résolution RS entre deux pics 2.1.2.3.2. Optimisation de la résolution RS 2.1.2.3.2.1. Augmentation du nombre de plateaux N 2.1.2.3.2.1. Modification des facteurs de rétention 2.1.2.3.2.1. Augmentation de la sélectivité α

17 17 17 18 18 18 19 19 20 20 20 21 21 21 22 22 22 23

2.2. TRAVAUX PRATIQUES

23

2.2.1. But

23

2.2.2. Matériels et réactifs 2.2.2.1. Généralités sur les parabènes 2.2.2.1.1. Présentation 2.2.2.1.2. Utilisation 2.2.2.1.1. Toxicité 2.2.2.2. Les solvants de qualité HPLC 2.2.2.3. Les colonnes utilisées 2.2.2.1. Liste du matériel

24 24 24 25 25 25 25 26

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2.3. MODE OPERATOIRE 2.3.1. Procédure de mise en route de la chaîne HPLC

26 26

2.3.2. Importance du pourcentage de l'eau de la phase mobile dans la séparation d'un mélange de parabènes28 2.3.2.1. Phase mobile: 40/60 eau/MeOH à réaliser 28 2.3.2.2. Phase mobile: 50/50 eau/MeOH (référence) à réaliser 32 2.3.2.3. Phase mobile: 45/55 et 55/45 eau/MeOH : Analyse des résultats 33 2.3.3. Nature du solvant organique utilisé 2.3.3.1. Phase mobile: 50/50 eau/ACN à réaliser 2.3.3.2. Phase mobile: 50/50 eau/THF: Chromatogramme à analyser

34 34 35

2.3.4. Greffage de la phase stationnaire 2.3.4.1. Utilisation d'une colonne phényl-hexyl avec phase mobile: 50/50 eau/MeOH à réaliser 2.3.4.2. Utilisation d'une colonne C8 avec phase mobile: 50/50 eau/MeOH : Analyse des résultats

36 36 37

2.3.5. Optimisation de séparation en mode isocratique : Analyse des résultats

38

2.3.6. Utilisation d'un gradient d'élution 2.3.6.1. Gradient linéaire eau/MeOH 55 → 65 à réaliser 2.3.6.2. Gradient linéaire eau/MeOH 50 → 60 : Analyse des résultats 2.3.6.3. Gradient exponentiel eau/MeOH(courbe -10 et courbe +10) : Analyse des résultats

38 38 40 40

2.3.7. Extinction de la chaîne HPLC

40

2.4. CONCLUSION GENERALE

41

ANNEXE : PROPRIETES PHYSIQUES DE QUELQUES SOLVANTS

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2.1 PRINCIPE 2.1.1. Généralités sur la chromatographie liquide haute performance La Chromatographie Liquide Haute Performance (HPLC en anglais et CLHP en français), initialement appelée Chromatographie Liquide à Haute Pression, est apparue en 1968. Il s’agit, en réalité, d’une amélioration des méthodes chromatographiques liquides sur colonne. En effet, les inconvénients majeurs de ces méthodes étaient : ü la lenteur des séparations (environ 1 à 20 heures) ; ü l’absence de détection aisée et rapide ; ü la quantité considérable d’échantillon ; ü l’absence d’automatisation. La CLHP comble donc ces lacunes. Son succès réside principalement dans la qualité granulométrique de la phase stationnaire. En effet, la mise au point de phase stationnaire de granulométrie plus fine et homogène a ainsi permis d’améliorer considérablement l’efficacité de la chromatographie. De plus, la vitesse des analyses fut notablement accélérée par la fabrication de colonnes de taille plus petite (5 minutes à 1 heure au lieu de 1 à 20 heures)69. Enfin, la possibilité de coupler les résultats d’analyse avec des détecteurs de type spectromètre UV/visible ou spectromètre de masse a favorisé la qualité des études. Son atout majeur d’agir de manière très précise sur la sélectivité entre les composés par le choix de la colonne (qui contient la phase stationnaire) et de la composition de l’éluant (phase mobile) en exploitant donc les interactions soluté/phase mobile/phase stationnaire, explique son utilisation massive. Ceci se schématise selon le triangle suivant : Soluté

Affinité

Phase stationnaire

Solubilité

Compatibilité

Phase mobile

Figure 1 : représentation schématique des interactions soluté/phase mobile/phase stationnaire

Cette méthode permet de séparer des composés de masse molaire variables, de nature chimique différente et même des isomères. La CLHP est devenue la première technique analytique présente dans les laboratoires de recherche et d’analyses. 69

L’utilisation de colonnes de petite taille de granulométrie très fine entraînant ainsi une augmentation du nombre de plateaux théoriques due à l’augmentation de la surface d’échange. Notion qui vous sera détaillée dans la partie « Grandeurs importantes en chromatographie ».

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Elle couvre tous les domaines d’applications. Voici quelques exemples : ü l’agroalimentaire : détermination de la teneur en acides carboxyliques dans le vin ; ü la pharmacie : recherche d’impuretés dans les matières premières, analyse quantitative et identification de principe actif, etc ; ü la cosmétique et la pharmacie : dosage des parabènes dans les crèmes, les médicaments, etc ; ü la biopharmacie ou biologie : analyse de masses molaires de polypeptides, protéines, etc.

2.1.1.1. Les supports Les supports sont des solides très finement divisés dont la principale propriété est d’être inerte vis-à-vis des phases stationnaire et mobile. Le support majoritairement utilisé est le gel de silice formé de grains de diamètre variant de 1,5 à quelques dizaines de micromètres. Ces grains présentent à leur surface des pores de diamètres différents (80 à 300 µm) au travers desquels la phase mobile circule. Selon l’utilisation souhaitée, la granulométrie du support varie ; par exemple, en UPLC, les diamètres utilisés sont très petits (de l’ordre de 1,5 µm), en méthode analytique, on privilégie des diamètres de l’ordre de 5 µm70 alors qu’en méthode semi-préparative ou préparative, les diamètres des grains atteignent des dimensions pouvant aller jusqu’à 50 µm. Il faut préciser que depuis quelques années, de nouveaux supports, différents du gel de silice sont apparus, comme des polymères synthétiques, la zircone ou l’oxyde de zirconium (Zr O2) qui présentent alors une meilleure stabilité en milieu basique/acide.

2.1.1.2. Les phases stationnaires Les phases stationnaires majoritaires sont des phases greffées c'est-à-dire des phases dans lesquelles de véritables liaisons chimiques existent entre la phase stationnaire et le support. Les plus utilisées sont constituées de chaînes aliphatiques greffées, de polarité ou de longueur variables. En chromatographie de partage, méthode la plus rencontrée, on distingue deux types de phase stationnaire : 1. la phase stationnaire normale (phase minoritaire) : phase polaire qui nécessite alors l’utilisation d’une phase mobile peu polaire (hydrocarbures, par exemple) ; 2. la phase stationnaire inverse (la plus utilisée) : phase non polaire, qui nécessite l’utilisation d’une phase mobile plutôt polaire (mélanges eau/méthanol, eau/acétonitrile, eau/tétrahydrofurane, tampon/solvants organiques). Voici par ailleurs quelques exemples de phases stationnaires classées selon la polarité de leurs groupements : ü polaires (ou hydrophiles) tels que les amines, les nitro et nitriles, les dialcools ; ü apolaires (ou hydrophobes) tels que les chaînes alkyles de C4 à C30 (les plus connus sont les chaînes C8 et C18 de formule – Si - (CH2)17 – CH3 pour cette dernière), les phényles. Ces phases stationnaires à base de silice greffée présentent de nombreux désavantages tels que : ü une instabilité face aux pH acides et basiques ; ü un phénomène d’adhérence des chaînes alkyles sur le support dans les phases mobiles très hydrophiles. Ces défauts ont conduit ainsi à la mise au point de nouvelles phases stationnaires. Citons quelques exemples :

70

Dans notre laboratoire, toutes nos colonnes ont une granulométrie de l’ordre de 5 µm.

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ü ü ü ü

des phases alkyles incorporant des groupements polaires (amide, éther ou carbamate) ; de nouvelles polymérisations de la silice pour résister aux pH ; des zircons greffés résistants à pH 13,0 ; des silices fluorées plus hydrophiles que les phases alkyles.

2.1.1.3. Les phases mobiles Elles doivent présenter les propriétés suivantes71 : ü posséder un pouvoir solvant et une inertie chimique vis-à-vis des composés à séparer ; ü posséder également une inertie chimique et une insolubilité vis-à-vis de la phase stationnaire. Le plus souvent, ces phases mobiles sont constituées de plusieurs solvants : mélanges d’eau ou de solutions tamponnées avec un solvant organique dont les proportions peuvent varier ou non au cours de l’analyse. C’est pourquoi le choix de la phase mobile dépend surtout de : ü la nature des composés à analyser ; ü la polarité de la phase stationnaire utilisée. On rappelle, en effet, que le couple phase stationnaire/phase mobile fonctionne en inversé : phase stationnaire polaire ↔ phase mobile apolaire phase stationnaire apolaire ↔ phase mobile polaire Les solvants peuvent donc être classés selon leurs propriétés physiques. Il s’agit principalement de : • leur polarité ou coefficient de polarité ; cette grandeur, sans dimension, comprise entre 0 et 1, est spécifique d’un solvant (par exemple, l’eau, solvant polaire présente un coefficient de 1, celui du tétrahydrofurane, solvant moins polaire, est de 0,45 et celui du dichlorométhane, composé apolaire est de 0,30) ; •

leur pouvoir d’élution.

Voici quelques exemples de solvants organiques usuels et de leurs forces éluantes selon ces deux propriétés physiques.

71

Pour rappel, il faut se référer à la représentation schématique (figure 1) des interactions soluté/phase stationnaire/phase mobile.

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Figure 2 : polarités de quelques familles de composés organiques ainsi que des principaux greffons des phases stationnaires actuelles

Sur phase polaire normale

sur phase à polarité inversée Solvant

FAIBLE

FORT

Hexane Toluène Dichlorométhane Tétrahydrofurane Acétonitrile Méthanol Eau

FORT

FAIBLE

Figure 3 : force ou pouvoir d’élution des solvants utilisés comme phases mobiles

Il est important de noter que selon les solvants utilisés et leur proportion dans le mélange, la viscosité et en conséquence la pression en tête de colonne pourra fortement varier (cf. figure 4 et la loi de Darcy72)

Figure 4 : viscosité de mélanges eau/solvant

Toute la difficulté de la méthode chromatographique est donc de faire le bon choix de phases en fonction des composés à séparer tout en évitant un excès de pression. Enfin, l’utilisation de solvants en CLHP entraîne le respect de quelques règles élémentaires telles que : ü l’utilisation de solvants spécifiques CLHP ; ü l’utilisation d’eau ultrapure exempte de tout composé ionisé (l’eau ultrapure se contamine très vite ; elle doit être fraîche chaque matin : la résistivité doit être de 18,2 MΩ.cm-1)73 ; ü la filtration obligatoire des solvants sur des filtres spéciaux (type FHUP ou FHLC 47 mm 0,45/0,5 µm74) ou le dégazage des solvants après filtration par ultrasons ou par la technique de « bullage » par l’hélium, ou le dégazage dit en ligne.

72

Cette loi importante sera détaillée dans la partie « Grandeurs importantes en chromatographie ». De nombreux appareils mesurent également le Carbone Organique Total (COT). 74 Il existe aussi des filtres 0,22 µm utilisés surtout en UPLC ou pour éviter les contaminations bactériennes. 73

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Si le solvant contient des tampons, il est fortement conseillé de ne pas laisser la chaîne sous tampon au repos et de filtrer de nouveau le tampon avant sa prochaine utilisation.

2.1.1.4. Modes de travail On peut fonctionner en CLHP de deux façons : 1. si on utilise un solvant pur ou un mélange de solvants de composition constante dans le temps, on travaille en mode ISOCRATIQUE ; 2. si on utilise un mélange de solvants de composition variable dans le temps, on parle de mode GRADIENT.

Mode isocratique Ce mode de travail, très fréquemment utilisé, demande un appareillage moins coûteux, ainsi qu’un entretien, une maintenance et une qualification d’appareil moins stricts que ceux requis par le mode gradient. Il est souvent suffisant pour séparer et analyser des mélanges de composés.

Mode gradient Ce second mode de travail présente de nombreux avantages. Son utilisation permet surtout de diminuer le temps d’analyse tout en respectant à priori une séparation correcte de mélanges complexes de composés. Exemple de son application : en phase inverse, nous savons que la colonne utilisée contient une phase stationnaire apolaire, entraînant l’utilisation soit d’un solvant (phase mobile) polaire à moyennement polaire (eau associée à du méthanol ou de l’acétonitrile). Ainsi, d’après la nature des composés à séparer, il est alors possible et très intéressant de travailler selon différentes proportions des solvants de la phase mobile : on pourrait commencer, par exemple, la séparation avec un mélange 80/20 % eau/acétonitrile pour terminer à la composition de 40/60% ou bien selon le cas de figure appliqué lors de votre séance. Dans la pratique, il existe deux types de gradients, les gradients linéaire et exponentiel. Les premiers utilisent 2 points de concentration de solvant. Les seconds appliquent un facteur de courbure sur le gradient linéaire préalablement défini par les soins de l’utilisateur dont la valeur peut varier de -10 à +10. Exemple de trois gradients exponentiels de facteurs : -10, 0 et 10 qui sont définies comme suit :

-10

0

+10 Figure 5 : représentation des différentes "courbes" d'un gradient exponentiel d'élution

La courbe -10 permet de changer la composition du mélange très rapidement, précisément dès le début du lancement du gradient, à l’inverse du principe de fonctionnement du gradient avec une courbe +10, qui présente

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les mêmes conditions de travail initiales pendant un long temps et un changement de composition plus tardif. Quant à la courbe 0, elle permet le changement linéaire des conditions de mélange dans la durée de l’analyse. Ces changements de pourcentages de solvants permettront donc d’éluer plus facilement et par conséquent de diminuer favorablement le temps d’étude. Cependant, ce mode de travail présente des inconvénients : •

en raison de la longueur de tubulures et de celle de la colonne à traverser, on constate qu’il existe un temps de latence entre l’instant programmé pour le changement de pente et le moment exact du changement de conditions de travail ; il faut donc obligatoirement songer à inclure ce délai dans la programmation de l’appareil ;

•

on constate des dérives de la ligne de base à l’endroit où les conditions de travail varient, même dans le cas d’une programmation d’une pente douce (effet de bosse) ;

•

on note une perte de temps car à la fin de l’analyse, un retour aux conditions initiales est obligatoire pour la colonne ;

•

enfin, on constate qu’il est impossible de travailler en circuit fermé entraînant alors d’éventuelles surconsommations de solvants.

2.1.1.5. L’appareillage En raison des pressions élevées qui doivent être appliquées pour assurer des débits raisonnables75 lorsqu’on utilise des supports dont le diamètre particulaire est de l’ordre de 2 à 10 µm, l’appareillage requis pour cette méthode d’analyse est ainsi nécessairement plus sophistiqué et plus coûteux que celui utilisé pour d’autres méthodes chromatographiques. C’est pourquoi, on retrouvera dans tout appareil de CLHP les éléments de base suivants : ü un ou plusieurs réservoirs (bouteilles) de phases mobiles (200 à 1000 mL) contenant soit des solvants purs, soit des mélanges de concentrations connues ; on y adjoint souvent des dispositifs permettant d’en éliminer les poussières et les gaz dissous76 ; ü une ou plusieurs pompes pour les éluants ; ü un système d’injection comportant une boucle d’échantillonnage calibrée (de type vanne Rhéodyne) ou un injecteur automatique ; ü une colonne remplie en acier inox (ou verre) de quelques cm de long ; ü un détecteur permettant à la fois de mettre en évidence la sortie des solutés de la colonne et de donner un signal proportionnel à la quantité de chacun des composés du mélange analysé ; ü un flacon qui tient le rôle de poubelle de solvants à vider régulièrement.

75

Cf. le descriptif de la loi de Darcy dans « Grandeurs importantes en chromatographie ». Il n’est pas nécessaire que le système de dégazage et les filtres fassent partie intégrante de l’appareil. Il est parfois plus facile de traiter le solvant avant son introduction dans le réservoir en le filtrant sous vide à l’aide d’un filtre approprié Millipore.

76

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Réservoir de phase mobile

Filtre ou crépine

Pompe Manomètre Injecteur Pré-colonne Colonne Thermorégulateur Détecteur Système de données

Enregistreur

Collecteur ou poubelle

Figure 6 : schéma simplifié du principe de base d’un appareil HPLC

Figure 7 : schéma détaillé d'un appareil de chromatographie liquide à haute performance

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Concrètement, chacun de ces éléments est stocké dans un module spécialisé qui se présente dans un boîtier distinct ou intégré dans un même ensemble. Ces modules sont reliés entre eux par des canalisations de très faible diamètre interne, différent selon leur localisation, pour assurer la circulation de la phase mobile. Elles peuvent être en acier inoxydable ou en PEEK (polyether-etherketone), polymère souple, aisé d’utilisation, coloré et résistant aux solvants usuels même sous de fortes pressions (maximum 350 bars). Poubelle à solvants

Réservoirs à solvants

Détecteur Dégazeur en ligne Tubulures en PEEK

Colonne Contrôleur Tubulures en inox

Injecteur

Pompe

Figure 8 : photo de l'ensemble de la chaîne HPLC utilisée

Les pompes Toute installation de chaîne HPLC comporte au moins 1 pompe, dont le but est de forcer le passage de la phase mobile à travers la colonne. Son rôle est double : 1. permettre le maintien d’un débit constant quelles que soient la pression et la variation de composition de la phase mobile ; 2. obtenir un débit suffisant jusqu’à 10 mL/min sans perte d’exactitude et de reproductibilité. Actuellement, on utilise presque exclusivement deux types de pompes : ü dite seringue : la phase mobile est alors poussée par une vis sans fin ; ü dite à piston à mouvement alternatif : deux pistons en série fonctionnent en opposition et entre les deux pistons, avant l’injecteur, se trouve un amortisseur de pulsations (enroulement de tubes aplatis se dilatant pour contrecarrer la variation de pression lors de la phase de pressurisation des pistons).

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Suivant les modèles de chaînes CLHP, on peut distinguer deux cas de figure : •

présence d’une pompe unique pour mélanger à basse pression : dans ce cas-là, le dispositif comporte un système d’électrovanne ou vanne de mélange, dédiée à chaque solvant. L’inconvénient majeur de cet appareillage est un dégazage obligatoire, avec de l’hélium, des filtres, ou un dégazeur en ligne, pour chacun des solvants ;

Figure 9 : principe de fonctionnement d’une pompe à basse pression

•

présence de plusieurs pompes, chacune étant dédiée à un solvant, le mélange s’effectuant par le débit de chaque pompe sous haute pression. Les pompes sont alors appelées binaire, ternaire ou quaternaire suivant le nombre de solvants qu’elles peuvent mélanger.

Figure 10 : exemple de configuration pour gradient haute pression

Remarque : pour résister aux pH acides et basiques des solvants, qui sont d’autant plus corrosifs que la pression augmente, toutes les pièces en contact avec la phase mobile doivent être inertes ; on utilise en général du téflon ou parfois des alliages spéciaux.

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Dans le cas de la pompe LC20AD de Shimadzu, une faible pulsation de débit lente et une période de pulsation réduite permettent une distribution précise. En réduisant le volume d'envoi par course du piston au niveau du microvolume (10 µl) et en appliquant un entraînement haute vitesse, la pulsation du débit et la période de pulsation ont été réduites à des niveaux significativement plus bas que ceux définis pour les autres appareils, il n’y a donc plus besoin d’amortisseurs de pulsations ! Cette fonction permet d'utiliser des détecteurs de haute sensibilité, y compris des détecteurs d'indice de réfraction et des détecteurs électrochimiques, sensibles à la pulsation de débit. Elle permet également la distribution du gradient avec un degré de précision qui, en général, n'est pas possible même avec des débits à micro-niveaux.

Les injecteurs Ils sont de deux types. Mais, seul celui dit de « vanne à boucle externe » permet d’injecter une quantité calibrée (donc reproductible) ou un volume calibré (de 10 à 100 µL) de composés à analyser en un temps bref en tête de colonne. Il s’agit d’une vanne haute pression composée de plusieurs voies, manuelle ou motorisée. La plus connue et la plus couramment utilisée est la vanne dite Rhéodyne.

Figure 11 : modèle de vanne Rhéodyne modèle 7725 en acier inoxydable

Son mode de fonctionnement est en deux étapes : 1. dans la position de chargement ou de remplissage (« load ») : seules la pompe et la colonne étant reliées, l’échantillon à analyser est introduit, à pression atmosphérique, dans une « boucle » avec un volume très supérieur (de l’ordre de 5 fois) au volume d’injection afin d’assurer une constance dans le paramètre de volume injecté ; par exemple, la boucle étant calibrée sur 20 µL, on va prélever et injecter 100 µL d’échantillon ; 2. dans la position injection : l’échantillon est introduit dans le flux de phase mobile par rotation de 60° d’un levier et ce, sans variation importante de la pression dans le circuit allant de la pompe vers l’entrée de la colonne ; la rotation de 60° permet d’inverser le sens de circulation dans la boucle.

Figure 12 : schémas du fonctionnement d'une vanne Rhéodyne

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Les colonnes Le diamètre intérieur varie de quelques mm (3,9 à 10 mm) à quelques cm. Leur longueur moyenne est de l’ordre de 20 cm (variation de 5 à 30 cm). Leur remplissage est délicat en raison de la très fine granulométrie77 qui les caractérise. Citons quelques chiffres : dans les laboratoires, en général, la colonne utilisée possède une longueur de 15 cm, un diamètre intérieur de 4,6 mm et une granulométrie de 5 µm. Le nombre de plateaux théoriques78 (N) est compris entre 40 000 et 60 000 par mètre. Cependant, depuis quelques années, on assiste à l’apparition de colonnes « nouvelle génération » de plus faible diamètre qui permettent avant tout de réaliser de fortes économies de solvants.79 Enfin, la colonne est souvent précédée d’un élément nommé « pré–colonne » ou colonne de garde. C’est un petit dispositif court (de 0,4 à 1 cm), rempli de la même phase stationnaire que la colonne avec lequel il est monté mais toutefois avec une granulométrie ordinairement moins fine. Son rôle est surtout d’être un protecteur de la colonne afin d’améliorer sa durée de vie, qui est sujet, bien évidemment, à l’usure temporelle, tout en préservant ses qualités et performances : •

il protège contre d’éventuels coups de pression ;

•

il limite les problèmes de colmatage ;

•

en cas de pH limite, il préserve la colonne en saturant la phase mobile en silice.

Pour conclure, il sera temps de changer de pré-colonne : •

quand la pression augmentera de 30 % ;

•

quand l’allure des pics sera en dehors des critères de conformité.

Figure 13 : exemples de colonnes de marque Alltech

77

Les phases stationnaires utilisées et les supports sont décrits dans le chapitre précédent. La notion de nombre de plateaux théoriques est détaillée dans « Grandeurs importantes en chromatographie ». 79 Ces nouvelles colonnes de plus faible diamètre sont baptisées « narrow-bore » et « micro-bore ». 78

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Les détecteurs Ces systèmes de détection sont des éléments indispensables au système chromatographique CLHP. Ils permettent de suivre en continu la séparation et de mesurer la concentration instantanée des différents solutés d’un mélange à analyser. Ils doivent donc présenter les caractéristiques suivantes : ü être fidèles, sensibles, stables et linéaires ; ü présenter un faible temps de réponse ; ü avoir un faible volume mort ; ü être exploitable en mode gradient, si l’analyse le nécessite. Etant spécifique de chaque application, il est impératif de connaître exactement le type d’analyses à effectuer pour choisir le détecteur adapté. Les modes de détection les plus courants dépendent des propriétés optiques des composés élués : absorption, fluorescence et indice de réfraction. Cependant, depuis quelques années, de nouveaux modes de détection sont apparus. Le plus couramment utilisé est le couplage de la CLHP avec un spectromètre de masse constituant alors un détecteur universel et un puissant moyen d’identification.80 Voici résumé en quelques lignes un tableau comparatif de quelques détecteurs : Tableau comparatif des principaux détecteurs

Type de détecteurs Spectro UV/visible Spectrofluorimétrie Réfractométrie Electrochimiques Conductimétrie Spectromètre de masse

Limite Optimale de Détection (LOD) 1 pg 10 fg 10 ng 100 fg 500 pg 1 pg

Sensible à la température T faible faible 10-4/°C 1,5 %/°C 2%/°C -

Sensible au débit Non Non Oui Oui Non -

Détecteurs spectrophotométriques Ce sont les détecteurs majoritairement utilisés. Leur domaine d’application est l’UV/visible. Les limites de ces appareils sont les absorptions propres des solvants et des solutés. Leur fonctionnement est régi par la loi de Lambert Beer 81 : ü l’absorbance de la phase mobile est mesurée en sortie de colonne à la longueur d’onde λ ou plusieurs longueurs d’onde ; ü la phase mobile ne doit pas ou très peu absorbée ; ü l’intensité de l’absorption dépend du coefficient d’extinction molaire ε du soluté. Cette détection correspond donc à une détection sélective. Ils peuvent être utilisés en mode gradient d’élution. Dans les meilleurs cas, on peut détecter, au minimum, des quantités de l’ordre du nanogramme.

80

On constate l’apparition de l’Evaporative Light Scattering Detector (ELSD) qui remplacerait le réfractomètre et le Corona. 81 La loi de Lambert Beer lie l’absorbance d’un soluté, sa concentration et le coefficient d’absorption molaire à une longueur d’onde donnée selon la relation A = ε x b x C (mol.L-1).

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Il existe plusieurs types d’appareils : ü à longueur d’onde fixe : λ = 254 nm (raie la plus intense d’une lampe à vapeur de mercure) ; ü à longueurs d’onde variable de 200 à 700 nm ; ü à barrettes de diodes : ce dispositif donne la valeur simultanée des intensités lumineuses sur tout le spectre assurant ainsi la détermination de l’identité des composés séparés ; le spectrochromatogramme obtenu est spectaculaire et sa représentation est souvent en trois dimensions.

Figure 14 : principe du détecteur à barrette de diodes

Figure 15 : représentation tridimensionnelle d'une séparation chromatographique

Le détecteur Shimadzu SPD-20AV comprend à la fois des lampes halogènes au deutérium et au tungstène. La lampe D est utilisée pour des applications dans l’UV, alors que la lampe W étend les capacités d'analyse à la zone visible. Il dispose de 3 modes de mesures - longueur d'onde unique, longueur d'onde double et balayage de longueur d'onde. Le mode longueur d'onde double exécute simultanément la détection de deux longueurs d'onde, et peut fournir des chromatogrammes des deux longueurs d'onde, ou un chromatogramme d'une longueur d'onde et un chromatogramme de ratio. Dans le mode de balayage de longueur d'onde, c'est le spectre d'absorbance qui est mesuré. Le mode balayage de longueur d'onde est conçu pour être utilisé pendant que le flux est arrêté.

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2.1.2. Grandeurs importantes en chromatographie 2.1.2.1. La loi de Darcy La Chromatographie Liquide Haute Performance faisant appel à de nombreuses notions physico-chimiques, comme la pression, le diamètre des particules du support, il est important ici de rappeler la loi de Darcy qui relie tous ces éléments entre eux selon l’équation suivante : P  =  

32 xηxLxV flux D 2 xd P

2

 

Avec  P  la  différence  de  pression  ou  perte  de  charge  dans  la  colonne,     η  la  viscosité  de  la  phase  mobile,  L  la  longueur  de  la  colonne,  Vflux  le  débit  de  la  phase  mobile,  D   le  diamètre  de  la  colonne  et  dP  le  diamètre  des  particules.  

2.1.2.2. Grandeurs chromatographiques d’identification des solutés

et

facteurs

La Chromatographie Liquide Haute Performance est une méthode d’analyse physico-chimique très utilisée qui fait intervenir des mécanismes d’échanges soluté / phase mobile / phase stationnaire basés sur les coefficients d’adsorption ou de partage K82 définis par la relation suivante : K  =  

cS   cM

avec cS la concentration analytique du soluté dans la phase stationnaire, et cM celle dans la phase mobile. Idéalement, cS est toujours proportionnelle à cM. On parle alors de chromatographie linéaire83. Le résultat obtenu après analyse se traduit alors par une courbe, type gaussien, appelé chromatogramme.

Figure 16 : représentation d'un chromatogramme type

Celui-ci correspond à la variation au cours du temps d’un paramètre relié à la concentration instantanée du soluté en sortie de colonne telle que : Intensité  de  signal  =  f(temps)   82

La notion de coefficient de partage K est reliée à la notion de facteur de rétention k’ telle que k’ = K x (VS/VM). Cette subtilité est rappelée dans le chapitre sur le facteur de rétention k’. 83 Cependant, ce principe n’est pas respecté dans tous les cas : par exemple, dans la chromatographie d’adsorption, ceci n’est pas vérifié.

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2.1.2.2.1. Grandeurs de rétention Comme nous l’avons décrit dans le paragraphe précédent, un pic idéal sur un chromatogramme a le même aspect que la représentation graphique de la loi Normale de distributions des erreurs aléatoires : il suit une courbe de Gauss (cf. figure 17). Chaque pic de produit peut donc être étudié et caractérisé par des grandeurs chromatographiques. Nous nous proposons maintenant de les détailler.

Figure 17 : différentes grandeurs chromatographiques

2.1.2.2.1.1. Temps de rétention et largeur du pic Un constituant est caractérisé par son temps de rétention tR, qui représente le temps écoulé entre l’instant d’injection et celui qui correspond sur le chromatogramme au maximum du pic qui lui est lié. Idéalement, le temps de rétention tR est indépendant de la quantité injectée. Le temps t0 ou tM correspond au temps mort : temps de sortie d’un composé non retenu sur la colonne (comme l’acétone ou la thiourée en phase inverse). La largeur du pic est symbolisée par w et on distingue notamment : ü la demi valeur du pic : largeur du pic à mi-hauteur (w1/2) ; ü la largeur à la base du pic (w) entre les tangentes.

2.1.2.2.1.2. Volumes de rétention Les volumes de rétentions bruts VR sont les volumes de phase mobile utilisés pour éluer les solutés à leur concentration maximale depuis leur injection. Il est donné par la relation suivante : VR  =  D  x  tR    avec  D  le  débit  de  la  phase  mobile   Le volume mort V0 ou VM est le volume de phase mobile contenu dans la colonne. De même que précédemment, le volume mort est donné selon la relation suivante : V0  =  D  x  t0  avec  D  le  débit  de  la  phase  mobile  

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Remarque : on peut également calculer des temps de rétention réduits tR’ et des volumes de rétention réduits VR’ qui sont alors les grandeurs caractéristiques d’un soluté pour une colonne donnée (c'est-à-dire en fonction du volume mort de la colonne).

2.1.2.2.1.3. Facteur de rétention ou de capacité k’ Ce facteur, encore appelé facteur de capacité, est un paramètre important qui permet de décrire la vitesse de progression des solutés dans la colonne. Il traduit le rapport des quantités de substances se trouvant entre les deux phases84. Il est indépendant du débit de la phase mobile et de la longueur de la colonne. Il se détermine tout simplement par la mesure des temps t0 et tR tel que : k’  =  

t R − t0   t0

L’analyse de ce facteur montre deux éléments importants : ü lorsque k’ est nul, alors le composé n’est pas retenu par la phase stationnaire ; ü plus k’ est grand, plus le composé est retenu. En théorie, un bon facteur de rétention se situe entre 1 et 10. Cependant, dans les faits, on préfèrera une limite de 2 en cas de risques d’impuretés ou de salissures au temps mort. On constate également que : des valeurs trop élevées de k’ (c'est-à-dire supérieures à 20 ou 30) entraînent un élargissement du pic, qui traduit une dégradation de la sensibilité et une augmentation du temps d’analyse, provoquant alors des coûts supplémentaires liés à l’augmentation du volume de solvants utilisés ; des valeurs trop faibles, à l’inverse, entraînent une élution trop rapide et donc une mauvaise séparation.

2.1.2.2.1.4. Facteur de sélectivité ou de séparation α entre deux solutés Il s’agit d’une grandeur qui concerne deux solutés A et B. Elle est donnée par la relation suivante : α  =  

t R B − t0   t RA − t 0

ou encore : α  =  

k 'B   k'A

avec B le composé le plus retenu. Remarque : cette grandeur, sans dimensions, est toujours supérieure à 1.

84

Il faut préciser que le support en CLHP ne joue aucun rôle dans l’équilibre.

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2.1.2.2.1.5. Facteur d’asymétrie des pics En théorie, les pics d’élution chromatographiques ont l’allure d’un pic gaussien. chromatogrammes expérimentaux sont loin d’être idéaux. La raison de cette différence est de deux ordres :

En réalité, les

1. une irrégularité de concentration des constituants se produit en tête de colonne lors de l’injection ; 2. la vitesse de la phase mobile est différente selon sa localisation dans la colonne : elle est nulle au niveau des parois et maximale au centre du tube. Toutes ces différences se traduisent par une asymétrie de pic caractérisée par deux paramètres selon les pharmacopées : ü le facteur d’asymétrie Fa qui doit être compris entre 0,8 et 1,2 est défini comme étant le rapport entre la largeur du pic au vingtième de sa hauteur et deux fois la distance entre la perpendiculaire abaissée du maximum du pic et le bord d’entrée au vingtième de sa hauteur (soit l’équivalent de 5 %); ü le facteur de traînées Ft mesuré à 10 % de la hauteur du pic.

Figure 18 : représentation graphique explicative pour calculer le facteur d'asymétrie d'un pic

2.1.2.2.2. Efficacité d’une colonne On distingue deux types de grandeurs principales définies à partir de la théorie des plateaux85.

2.1.2.2.2.1. Le nombre de plateaux théoriques N Il s’agit d’une grandeur qui définit l’efficacité théorique de la colonne. Plus cette valeur est grande, plus la colonne est dite efficace. Cette valeur peut varier de quelques centaines à plusieurs centaines de milliers de plateaux. Il dépend à la fois du soluté et des conditions opératoires utilisées.

85

Cette théorie trouve son origine dans les travaux de Martin et Synge, les pionniers de la méthode. Cette théorie explique avec succès la forme gaussienne des bandes ainsi que leur vitesse de progression à travers la colonne. Cependant, elle a été remplacée par une autre théorie (cinétique) car elle ne permettait pas d’expliquer le phénomène d’élargissement des pics que l’on peut constater.

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Pour le calculer, il existe plusieurs formules de calculs. Nous choisirons dans notre cas la relation suivante : 2

&t # N  =  16  x   $ R !   %w"

2.1.2.2.2.2. La hauteur théorique H ou H.E.P.T.

équivalente

à

un

plateau

Cette valeur fait appel à la notion de plateau théorique et dépend de la longueur de la colonne telle que la colonne serait divisée en un certain nombre de petits disques fictifs (N), encore appelés plateaux, de même hauteur H. Pour chacun d’eux, la concentration du soluté dans la phase mobile est en équilibre avec la concentration dans la phase stationnaire de ce soluté. Plus cette grandeur H est petite, mieux c’est (à longueur de colonne constante, bien entendu). On la détermine donc par la relation suivante : H  =  

L     N

avec  L  la  longueur  de  la  colonne  (exprimée  le  plus  souvent  en  cm)   Les valeurs habituelles de H sont comprises entre quelques dixièmes de cm et moins d’un centième de millimètre. Remarque : ces deux grandeurs (H et N) sont très souvent utilisées par les fabricants pour démontrer les performances des colonnes. Toutefois, pour que ces deux paramètres aient un sens lors de la comparaison entre colonnes, il est indispensable qu’ils soient déterminés avec le même composé.

2.1.2.3. Séparation des solutés et résolution Pour qu’une séparation soit réussie, on doit obtenir autant de pics gaussiens qu’il y a de produits à séparer. De plus, il faut que les pics obtenus soient suffisamment séparés les uns des autres.

2.1.2.3.1. Facteur de résolution RS entre deux pics Cette valeur représente la mesure de la qualité effective de la séparation de deux pics voisins. Elle est calculée à partir du chromatogramme à l’aide des largeurs de pics w obtenues par les tangentes et se définit, en règle générale, par la relation suivante86 : Rs  =  2  x  

t RB − t RA   w A + wB

avec  B  le  composé  le  plus  retenu   On considère, en analyse quantitative, que la séparation est acceptable à partir de Rs > 1,5 alors qu’en analyse qualitative, la valeur seuil suffisante est 1. Cependant, dans la pratique, il vaut mieux avoir une meilleure résolution, surtout si les deux surfaces de pics sont identiques.87 86

Comme pour calculer le nombre de plateaux théoriques N, il existe plusieurs formules de calculs. Mais notre choix se portera sur celle-ci. 87 L’usure de la colonne influence également ces valeurs seuil. Il faut en tenir compte durant ses appréciations.

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Toutefois, des valeurs trop supérieures ne seraient pas nécessaires car elles prolongeraient inutilement l’analyse. L’idéal est donc d’obtenir une résolution suffisante et non maximale.

Figure 19 : exemples représentatifs de facteurs de résolution

2.1.2.3.1. Optimisation de la résolution RS Pour optimiser une séparation, il est possible d’agir sur les trois paramètres suivants : § § §

le nombre de plateaux théoriques N ; le facteur de rétention k’ ; le facteur de sélectivité α (ce dernier facteur étant de loin le plus puissant).

2.1.2.3.1.1. Augmentation du nombre de plateaux N Cette grandeur caractérisant l’efficacité de la colonne, l’augmenter correspondrait à diminuer la largeur du pic, c'est-à-dire à rétrécir la largeur du pic afin d’éviter qu’il chevauche le pic voisin. Il existe donc deux façons d’augmenter l’efficacité théorique de la colonne : ü allonger la colonne tout en restant dans une limite raisonnable (si le produits restent plus longtemps dans la colonne, ils risquent d’être altérés et d’augmenter la durée d’analyse) ; ü diminuer la hauteur d’un plateau théorique en modifiant : -

la taille des particules de phase stationnaire ;

-

la vitesse de la phase mobile (donc le débit).

La seconde solution étant d’ailleurs bien meilleure !

2.1.2.3.1.2. Modification des facteurs de rétention Ce phénomène ne peut concerner que le composé le plus retenu (c'est-à-dire le composé B dans notre exemple). Dans la limite de k’B < 10, l’augmentation de ce facteur k’B entraînera l’amélioration de la séparation entre les deux pics. De plus, selon la définition du facteur de rétention, si celui–ci s’accroît, alors les volumes de rétention suivent le même processus. Ainsi, un composé apolaire voit son affinité pour la phase stationnaire apolaire augmenter si la polarité de la phase mobile augmente et inversement avec les composés polaires.

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2.1.2.3.1.3. Augmentation de la sélectivité α Ce facteur étant directement lié aux coefficients de partage des solutés88, il s’agit de la meilleure solution pour optimiser une séparation. Différentes méthodes s’offrent à nous : •

Avant tout, dans le choix de la colonne ;

•

Dans l’optimisation du solvant de la phase mobile ;

•

Enfin, dans la dilution de l’échantillon.

Le schéma suivant résume parfaitement les différents cas de figure rencontrés : sélectivité

faible

élevée

N grand

N faible

N grand

Séparation correcte

Séparation correcte mais pic large

Séparation correcte

2.2. TRAVAUX PRATIQUES 2.2.1. But Il s’agit d’une séance d’initiation à la technique chromatographique liquide haute performance. Le but est la prise en main d’une chaîne CLHP dans une optique d’analyse qualitative et quantitative d’un mélange de parabènes. Afin de réaliser cet objectif, vous vous appuierez sur l’étude de plusieurs thèmes :

88

•

l’effet du pourcentage d’eau de la phase mobile ;

•

l’effet du type de solvants organiques de la phase mobile ;

•

l’influence du greffage de la phase stationnaire ;

•

les conséquences du mode de travail utilisé (comparaison modes isocratique et gradient).

Cf. la partie détaillée sur le coefficient de partage K et le facteur de rétention k’.

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2.2.2. Matériels et réactifs 2.2.2.1. Généralités sur les parabènes 2.1.2.3.1. Présentation Le terme de « parabènes » désigne un groupe de produits chimiques largement utilisé comme conservateurs dans l’industrie cosmétique, pharmaceutique et alimentaire pour leurs propriétés antibactériennes et antifongiques. On estime que plus de 80 % des produits de beauté en contiennent, notamment des shampoings, des crèmes hydratantes, des mousses à raser et des gels nettoyants. Ce sont des esters de l’acide parahydroxybenzoïque, résultant de l’estérification de l’acide parahydroxybenzoïque avec un alcool. La structure générale d’un parabène est donnée par la figure suivante :

Figure 20 : structure générale d'un parabène

Bien que l’on parle souvent de parabène au singulier, en fait il existe différents composés dans cette famille qui diffèrent par la nature du groupe alkyle R. Les plus couramment utilisés sont : § § § § § §

le méthylparabène, ou 4-hydroxybenzoate de méthyle (E218), et son sel de sodium (E219) ; l’éthylparabène, ou 4-hydroxybenzoate d’éthyle (E214), et son sel de sodium (E215) ; le propylparabène, ou 4-hydroxybenzoate de propyle (E216), et son sel de sodium (E217) ; l’isopropylparabène ; le butylparabène ; l’isobutylparabène ; le benzylparabène.

Figure 21 : structure chimique du méthylparabène, de l’ethylparabène, du propylparabène, du butylparabène et du benzylparabène

Les parabènes se trouvent aussi à l’état naturel dans certains aliments tels que la mûre, l’orge, la fraise, le cassis, la vanille, la carotte ou l’oignon. Le propylparabène, par exemple, existe dans de nombreuses plantes et chez quelques insectes. On les trouve aussi dans le corps humain comme précurseur du coenzyme Q10 où ils sont rapidement absorbés, métabolisés et excrétés.

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2.1.2.3.2. Utilisation Leur utilisation principale est donc liée à leur activité effective antibactérienne et antimycosique. Les parabènes les plus rencontrés sont le méthylparabène et le propylparabène dont les propriétés de grande solubilité et d’effet synergique compensent une activité antimicrobienne moins importante que celle produite par les parabènes de plus longues chaînes carbonées. Par exemple, on rajoute du méthylparabène dans les anesthésiques locaux pour limiter la contamination89. A l’état pur, le méthylparabène est incolore, insensible au chaud et au froid. En solution, il est stable dans un milieu acide (pH entre 3 et 6) et hydrolysé facilement dans un environnement alcalin. Le propylparabène présente les mêmes caractéristiques. Enfin, le méthylparabène, à l’état solide (sous forme de poudre) est aussi utilisé comme plastifiant pour certains médicaments à cause des ses propriétés semi–conductrices.

2.1.2.3.3. Toxicité Les parabènes sont des conservateurs très controversés. Pourtant, à l’origine, ils sont apparus pour remplacer d’autres conservateurs, les formaldéhydes, jugés alors dangereux et dont l’usage dorénavant est limité à certains vernis à ongles. Leur emploi dans les produits de beauté a soulevé une vive polémique depuis qu’une étude britannique, parue en 2004, les a accusés de provoquer des cancers du sein. D’autres études les soupçonnent d’être néfastes à la fertilité masculine. Cependant, des recherches sont toujours en cours pour déterminer un risque avéré dans l’utilisation médicamenteuse des parabènes et des seuils de toxicité. Aucune disposition réglementaire n’existe donc à l’heure actuelle. En l’absence de confirmations des risques, l’AFSSAPS (Agence française de Sécurité Sanitaire des Produits de Santé) a déclaré le 29 septembre 2005, que « la commission de cosmétologie s’est prononcée favorablement à la poursuite de l’utilisation, aux conditions prévues par la réglementation actuelle, de quatre à cinq des cinq parabènes les plus couramment utilisés (méthyl, éthyl, propy, et butyl parabènes) ». Remarques : face à l’inquiétude des consommateurs, la mention « sans parabène » apparaît sur les emballages et devient un véritable argument de vente. L’utilisation de ces produits est notamment interdite dans les cosmétiques biologiques où ils sont remplacés par des méthodes de conservation naturelles (les huiles essentielles, par exemple).

2.2.2.2. Les solvants de qualité HPLC • Du méthanol MeOH. • De l’acétonitrile ou méthane nitrile ACN. • Du tétrahydrofurane THF. • De l’eau ultrapure (à prélever dans le laboratoire de métrologie).

2.2.2.3. Les colonnes utilisées Au cours de cette séance, vous allez être amenés à utiliser ou à exploiter : ü 3 colonnes de la série Novapak de la marque Phenomenex ; Chaque colonne utilisée possède des caractéristiques communes mais également, et c’est un des thèmes abordés au cours de votre séance d’aujourd’hui, des phases stationnaires différentes90. 89

Ces conservateurs ne remplacent absolument pas les techniques de stérilisation mais aident seulement à diminuer la charge microbiologique. 90 Pour connaître les différentes phases stationnaires, se référer au chapitre sur l’appareillage.

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Par exemple, les colonnes Novapak ont les caractéristiques suivantes résumées dans le tableau 91: Tableau récapitulatif des caractéristiques des colonnes Novapak Nom

Longueur (mm)

Diamètre interne (mm)

Taille des particules (µm)

Taille des pores (µm)

Aire (m2/g)

Taux de C (%)

Stabilité en pH

Novapak C8

150

3,9

4

0,1

400

13,5

1,5-10

Novapak C18

150

3,9

4

0,1

400

17,8

1,5-10

Novapak phenylhexyl

150

3,9

4

0,1

400

17,5

1,5-10

2.2.2.4. Liste du matériel •

une seringue Hamilton de 100 µL ;

•

une seringue d’amorçage de 25 mL ;

•

des bouteilles de solvants de 1000 mL pour l’eau ultrapure, le méthanol (spécial HPLC) et l’acétonitrile (spécial HPLC) ;

•

des colonnes de la famille Novapak (de 15 cm) : C8, C18 et phenyl-hexyl ;

•

une solution de 5 parabènes composée de méthyl, éthyl, propyl, butyl et benzyl parabène à une concentration de 2 mg.L-1 chacun dans un mélange eau/MeOH 50/50 (v/v) ;

•

une chaîne HPLC de Shimadzu : pompe, contrôleur, dégazeur en ligne, détecteur spectrophotométrique bi-longueur d’onde UV/visible, pilotée via ethernet sous Windows XP équipée du logiciel LC Solution ;

2.3. MODE OPERATOIRE La chaîne HPLC que vous allez utiliser aujourd’hui peut être pilotée manuellement ou informatiquement grâce à un logiciel spécifique de la chaîne. Dans notre cas, il s’agit du logiciel LC Solution de chez Shimadzu.

2.3.1. Procédure de mise en route de la chaîne HPLC L’ensemble chromatographique Shimadzu, chaîne gradient, que vous allez utiliser, se présente sous la forme d’un assemblage d’appareils montés en colonne qui comprend, de haut en bas : ü Les bouteilles de solvants en communication avec l’ensemble pompe + injecteur + colonne et dégazeur ; ü La bouteille réservée à la récupération des solvants dont il faut régulièrement surveiller le niveau afin d’éviter un éventuel débordement ; 91

Toutes les données qui vont suivre sont issues du catalogue du fabricant et commerçant Phenomenex 2010/2011.

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ü le détecteur spectrophotométrique UV/Visible ; ü le dégazeur en ligne ; ü le contrôleur de la chaîne, qui est interfacé avec l’ordinateur ; ü l’ensemble pompe + injecteur relié à la colonne, elle-même reliée aux différentes bouteilles de solvants. Cet appareillage est une chaîne de type gradient, c'est-à-dire qu’elle permet de travailler en mode gradient et présente 4 voies possibles (de A à D) organisées telles que : ü la voie A est pour l’eau ultrapure ; ü la voie B, pour le méthanol ; ü la voie C, pour l’acétonitrile ; ü la voie D, pour le tétrahydrofurane.

Etape 1 : allumage des appareils (en principe déjà réalisé) 1. Allumer le détecteur et laisser chauffer la lampe UV (lecture à 254 nm) pendant au moins 15 minutes. 2. Allumer le contrôleur puis le PC puis l’écran.

Q Q

Quel est l’utilité du dégazeur en ligne ? Quel est son principe de fonctionnement ? Quel autre système peut-on utiliser pour effectuer le même type d’opération ?

Etape 2 : purge des voies A, B, C et D 1. Les groupes 2BIO du jeudi matin et vendredi après-midi iront chercher de l’eau ultrapure dans le laboratoire de Métrologie. Vérifier que le niveau de l’eau distillé soit bien au-dessus de la flèche. Appuyer sur Operate/Stand by et attendre que la conductivité soit 0,054 mS.cm-1 à 25 °C, ce qui correspond à une résistivité de 18,2 MΩ.cm. Enlever le capuchon, et basculer sur Production afin d’effectuer le prélèvement d’eau. Prélever environ 20 mL que vous jeterez, puis remplisser le flacon d’un litre (afin d’éviter les contaminants92). Lorsque vous avez terminé, rebasculer sur Recirculation, puis Stand by ; n’oublier pas de remettre le capuchon sous l’appareil. Retourner au laboratoire TASS... 2. Les groupes 2BIO du jeudi matin et vendredi après-midi plongeront la canalisation A dans l’eau ultrapure, la canalisation B dans le méthanol, la canalisation C dans l’acétonitrile et ils laisseront la canalisation D dans le solvant de repos. 3. Pour tous les groupes : vérifier le niveau des autres bouteilles de solvants que vous allez utiliser pendant la séance. Il faut un minimum de 0,5 litres par réservoir. Remplir si nécessaire. (bouteille commerciale de méthanol et d’acétonitrile sous la hotte).

92

Cf. supra chapitre sur les phases mobiles.

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4. Double cliquer sur l’icône du logiciel LC Solution :

puis cliquer sur Analysis 1 :

et enfin sur OK. Le logiciel se connecte à la chaîne HPLC (un bip se fait entendre). LC Ready doit apparaître. 5. Cliquer sur « Advanced », puis dans File, faire Open Method File, dans le dossier Data → TP TASS → Procédures, choisir le fichier : Méthode-Purge-voiesA-B-C-D. Downloader la méthode vers la chaîne HPLC. Ouvrir le bouton de purge noir sur la face avant de la pompe (1/4 de tour maximum !), puis appuyer sur purge (bouton gris en face avant du Contrôleur LC20AD). 6. La purge est terminée lorsque l’on n’observe plus de bulles à travers les circuits des voies (3 minutes doivent suffire, si ce n’est pas le cas, vider les 20 mL de la seringue d’amorçage et repurger !). Fermer le bouton de purge noir et vider la seringue d’amorçage de 25 mL dans la bouteille de récupération de solvants.

2.3.2. Importance du pourcentage de l’eau de la phase mobile dans la séparation d’un mélange de parabènes UTILISATION D’UNE COLONNE C18 Ce premier thème a pour but de démontrer, en utilisant la même colonne, l’importance du rôle du pourcentage d’eau dans un mélange eau/méthanol sur la qualité de la séparation d’un mélange de cinq parabènes de faible concentration (chaque parabène ayant une concentration de 2 mg.L-1).

2.3.2.1. Phase mobile : 40/60 H2O/MeOH à réaliser Etape 1 : mise en place de la colonne : POUR LA PREMIÈRE MISE EN PLACE, APPELER LE PROFESSEUR POUR DÉMONSTRATION ET BON POSITIONNEMENT DE LA COLONNE ! Pour chaque colonne, vous devrez procéder comme suit : 1. S’assurer que la pression soit proche de 0 (quelques psi). 2. Chaque colonne possède un sens pour son installation. Celui-ci est indiqué par une flèche sur le corps de la colonne. Installer alors la colonne selon le sens logique.

Q

D’après vous, quelle est la position et quel est le sens logique de la colonne ?

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3. Desserrer les deux vis (en PEEK ou en inox selon la colonne) qui sont localisées soit aux extrémités d’une colonne soit à celles d’une union93.

Dans le cas de vis en inox, il faut utiliser une pince multiprise. Remarque 4.

Q

Faire dépasser légèrement de quelques mm la canalisation en inox à travers la vis et visser l’ensemble sur la colonne à chaque extrémité. Faire de même avec la canalisation en PEEK. Selon vous, quel critère peut vous permettre de suspecter une éventuelle fuite de la

phase mobile ?

Après chaque changement de colonne, vous devez procéder, avant toute injection, à une phase d’équilibration dans les conditions de travail souhaitées. Remarque

Q Q

Quel est le but de l’équilibration ?

Selon la colonne utilisée et les conditions de travail choisies, la pression dans la colonne peut être différente. À votre avis, si cette pression est instable, c’est-à-dire qu’elle présente des fluctuations, quels problèmes cela traduit-il ?

Etape 2 : création de la méthode : mode Isocratique – phase mobile : 40/60 H2O/MeOH pendant 15 min Procéder comme suit : ? FILE / NEW METHOD FILE → onglet Data Acquisition ? Dans la fenêtre Instrument Parameters View : cliquer sur Advanced → onglet Data Acquisition : LC Stop Time : 15,00 min, puis cliquer sur Apply to All acquisition time, → onglet Pump : Mode Low pressure gradient Total Pump A Flow : 1,0 mL/min, Solvent B conc : 60 %, Pressure limits (Pump A), Max : 200 bar ; Detector A : décôcher Cell Temperature, puis s’assurer que la longueur d’onde de travail est de 254 nm 93

Quand une chaîne est au repos pendant au minimum 2 jours, il vaut mieux installer une union entre deux vis et stocker la colonne fermée à ses 2 extrémités par des vis spéciales voire du parafilm afin d’éviter toute contamination ou dégradation de la phase stationnaire de la colonne.

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? Sauvegarder la méthode, FILE / SAVE / METHOD FILE SAVE AS, dans le dossier Data → TP TASS, dans le dossier du nom de votre groupe 2BIO ? Charger la méthode dans la Chaîne HPLC, en cliquant sur Download (S’assurer que le titre de la fenêtre générale corresponde bien au nom de la méthode qui vient d’être créée). ? Cliquer sur SINGLE START dans la barre verticale d’assistance :

une fenêtre apparaît, la remplir comme suit : Sample Name : phB action eau 40-60 (Vérifier que le fichier Method File se trouve au bon endroit sur le disque dur) Method File : C:\LabSolutions\Data\TP TASS\numéro du groupe BIO\titre méthode Data File : C:\LabSolutions\Data\TP TASS\numéro du groupe BIO\phB.lcd Data Description : Mélange 5 phB à 2 mg/L sur C18 Novapak 40/60 eau/MeOH. Injection volume : 20 µL Other Handling : côcher Report, puis aller chercher la feuille de style de rapport selon le chemin informatique : Data → Procedures → Reports-ETSL, puis décocher Report. Cliquer sur OK (permet de faire l’équilibration)

Etape 3 : obtention du chromatogramme ? Il apparaît une nouvelle fenêtre : Data Acquisition Start. (à traduire) Ne surtout pas cliquer sur START ! ⇒ Si sur la fenêtre de contrôle, la détection n’est pas à zéro : faire un autozéro, en appuyant sur le bouton zéro du détecteur. ⇒ Prérincer la seringue de 100 µL. ⇒ Attendre que l’équilibration de la colonne soit effective PENDANT 20 MINUTES.

Q

Connaissant les caractéristiques géométriques de la colonne, déterminer son volume

de phase mobile sachant que la phase stationnaire occupe environ 30 % du volume. Connaissant le débit, faire une estimation du temps de remplissage de la colonne par la phase mobile. On estime qu’il faut multiplier par un facteur 25 cette dernière valeur pour obtenir la durée d’équilibration (ce facteur prend en compte, le temps de passage de la phase mobile dans toutes les canalisations, de la bouteille de solvant jusqu’à celle de récupération, ainsi que de la durée mise par les équilibres chimiques entre les deux phases). Déterm iner la durée d’équilibration. ⇒ Prélever 4 à 5 fois la valeur du volume de la boucle d’injection (c’est indiqué dessus).

POUR LA PREMIÈRE INJECTION APPELER LE PROFESSEUR POUR DÉMONSTRATION ET BONNE UTILISATION DE LA SERINGUE ! ⇒ S’assurer que l’injecteur est bien sur LOAD (manette noire vers le haut), enfoncer l’aiguille horizontalement, appuyer sur le piston, puis retirer délicatement l’aiguille, et basculer l’injecteur sur INJECT (manette noire vers le bas).

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HPLC 2.30/42

A Vérifier que le chromatogramme apparaisse en temps réel sur l’écran (courbe noire) ! Noter la pression indiquée. La courbe rouge indique la pression.

Remarque

Q

On peut zoomer, en temps réel, sur l’ensemble du chromatogramme en cliquant sur ⊕ ; pour dézoomer, il suffit de faire Initialize Zoom.

Quel est le facteur de conversion entre les bars et les psi ?

Q

Selon vous, quels critères, peuvent vous permettre de suspecter une éventuelle fuite de la phase mobile ?

Q

La solution que vous avez injectée est un mélange de 5 parabènes. structure topologique d’un parabène ?

Quelle est la

Q

Comment procéderiez-vous pour préparer 100 mL de ce mélange de 5 parabènes à 2 mg.L , à partir de solutions individuelles concentrées de 20 mg.L-1 ? -1

Q

Pourquoi doit-on prélever un volume 4 à 5 fois plus important que celui de la boucle d’échantillonnage ?

Q

D’après-vous, quel est l’ordre logique d’élution des 5 parabènes ? réponse.

Justifier votre

Etape 4 : traitement du chromatogramme et impression ? Cliquer sur l’icône Data Analysis dans la barre verticale d’assistance :

⇒ L’application LC Data Analysis démarre : le chromatogramme apparaît (la fenêtre du haut correspond au chromatogramme général, et celle du bas permet de choisir les zones de zoom)

Si vous ouvrez le fichier, il faut alors cliquer sur :

Remarque

LC Data analysis

puis sur Analyse :

⇒ Cliquer (dans la barre verticale d’assistance) sur l’icône Wizard :

une fenêtre apparaît, cliquer alors sur l’icône Program,

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HPLC 2.31/42

une nouvelle fenêtre apparaît. ⇒ Retirer les pics parasites se trouvant généralement dans la ligne de base, pour cela, cliquer sur l’icône « Integration Off to On » pour encadrer verticalement les zones à pics parasites, puis cliquer sur Simulate, puis OK. ⇒ Revener sur la fenêtre principale de Wizard en cliquant sur OK, puis cliquer sur Suivant, sélectionner tous les pics puis cliquer trois fois sur suivant, et dans chaque cellule Name, indiquer le nom de chaque pic puis cliquer sur terminer. ⇒ Cliquer sur Apply to Method (dans la barre verticale d’assistance),

pour exporter dans le fichier méthode les modifications réalisées et l’enregistrer dans le dossier 2BIO de votre groupe. ⇒ Cliquer sur Data Report (dans la barre verticale d’assistance),

faire un aperçu avant impression, puis imprimer le chromatogramme si celui-ci vous convient. ? Fermer toutes les fenêtres (cliquer sur les croix noires et rouges en haut et à droite des fenêtres), pour ne plus voir apparaître que la fenêtre : LC Real Time Analysis.

On peut modifier la durée d’analyse en cours d’analyse, pour cela, sélectionner Change Analysis Time dans le menu Data acquisition. Remarque

2.3.2.2. Phase mobile : 50/50 H2O/MeOH (Référence) à réaliser Etape 1 : mise en place de la colonne : déjà réalisé ! Etape 2 : création de la méthode : mode Isocratique – phase mobile : 50/50 H2O/MeOH pendant 30 min Procéder comme précédemment : ? FILE / NEW METHOD FILE → onglet Data Acquisition ? Dans la fenêtre Instrument Parameters View : cliquer sur Advanced → onglet Data Acquisition : LC Stop Time : 30,00 min, puis cliquer sur Apply to All acquisition time, → onglet Pump : Mode Low pressure gradient Total Pump A Flow : 1,0 mL/min, Solvent B conc : 50 %, Pressure limits (Pump A), Max : 200 bar ; Detector A : décôcher Cell Temperature, puis s’assurer que la longueur d’onde de travail est de 254 nm

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? Sauvegarder la méthode, FILE / SAVE / METHOD FILE SAVE AS, dans le dossier Data → TP TASS, dans le dossier du nom de votre groupe 2BIO ? Charger la méthode dans la Chaîne HPLC, en cliquant sur Download (S’assurer que le titre de la fenêtre générale corresponde bien au nom de la méthode qui vient d’être créée). ? Cliquer sur l’icône SINGLE START (dans la barre verticale d’assistance) : une fenêtre apparaît, il suffit d’actualiser : Sample Name : phB action eau 50-50 (Vérifier que le fichier Method File se trouve au bon endroit sur le disque dur) Data Description : Mélange 5 phB à 2 mg/L sur C18 Novapak 50/50 eau/MeOH. Cliquer sur OK

Etape 3 : obtention du chromatogramme ? Il apparaît une nouvelle fenêtre : Data Acquisition Start. Ne surtout pas cliquer sur START ! ⇒ Si sur la fenêtre de contrôle, la détection n’est pas à zéro : faire un autozéro, en appuyant sur le bouton zéro du détecteur. ⇒ Attendre que l’équilibration de la colonne soit effective. ⇒ Prélever 4 fois la valeur du volume de la boucle d’injection (c’est indiqué dessus). ⇒ S’assurer que l’injecteur est bien sur LOAD, enfoncer l’aiguille horizontalement, appuyer sur le piston, puis retirer délicatement l’aiguille, et basculer l’injecteur sur INJECT. A Vérifier que le chromatogramme apparaisse en temps réel sur l’écran (courbe noire) ! Noter la pression indiquée.

Etape 4 : traitement du chromatogramme et impression : cf procédure en bas de page 31 et haut de page 32 !

2.3.2.3. Phase mobile : 45/55 et 55/45 H2O/MeOH : Analyse des résultats ? Ces deux chromatogrammes ont été réalisés à une pression d’environ 1950 psi et sont à télécharger et à imprimer, à l’adresse suivante : http://ligodin.free.fr/Biophy2.html

• Rendre les 4 chromatogrammes de mélange. • Remplir un tableau récapitulatif des données chromatographiques. Rapport

• Quel est l’impact du pourcentage d’eau dans la phase mobile sur les temps de rétention des composés du mélange ? Étayer votre affirmation en traçant sous Regressi le graphe tR = f(%eau).

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HPLC 2.33/42

• Conclure sur l’ordre d’élution des parabènes, sur la séparation effective ou pas, et sur la durée de l’analyse. Rapport

• Quel est le chromatogramme fournissant le meilleur compromis ?

2.3.3. Nature du solvant organique utilisé UTILISATION D’UNE COLONNE C18 Ce second thème a pour but de démontrer, en utilisant la même colonne, l’importance de la nature du solvant organique utilisé sur la qualité de la séparation du mélange de cinq parabènes de faible concentration (chaque parabène ayant une concentration de 2 mg.L-1). Cette étude est basée sur les propriétés physico-chimiques de trois solvants utilisés classiquement en CLHP.

2.3.3.1. Phase mobile : 50/50 H2O/ACN à réaliser Etape 1 : mise en place de la colonne : déjà réalisé ! Etape 2 : création de la méthode : mode Isocratique – phase mobile : 50/50 H2O/ACN pendant 6 min Procéder comme précédemment : ? FILE / NEW METHOD FILE → onglet Data Acquisition ? Dans la fenêtre Instrument Parameters View : cliquer sur Advanced → onglet Data Acquisition : LC Stop Time : 6,00 min, puis cliquer sur Apply to All acquisition time, → onglet Pump : Mode Low pressure gradient Total Pump A Flow : 1,0 mL/min, Solvent C conc : 50 %, Pressure limits (Pump A), Max : 200 bar ; Detector A : décôcher Cell Temperature, puis s’assurer que la longueur d’onde de travail est de 254 nm ? Sauvegarder la méthode, FILE / SAVE / METHOD FILE SAVE AS, dans le dossier Data → TP TASS, dans le dossier du nom de votre groupe 2BIO ? Charger la méthode dans la Chaîne HPLC, en cliquant sur Download (S’assurer que le titre de la fenêtre générale corresponde bien au nom de la méthode qui vient d’être créée). ? Cliquer sur SINGLE START (dans la barre verticale d’assistance) : une fenêtre apparaît, il suffit d’actualiser : Sample Name : phB action Solvant Organique 50-50 (Vérifier que le fichier Method File se trouve au bon endroit sur le disque dur) Data Description : Mélange 5 phB à 2 mg/L sur C18 Novapak 50/50 eau/ACN. Cliquer sur OK

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Etape 3 : obtention du chromatogramme ? Il apparaît une nouvelle fenêtre : Data Acquisition Start. Ne surtout pas cliquer sur START ! ⇒ Si sur la fenêtre de contrôle, la détection n’est pas à zéro : faire un autozéro, en appuyant sur le bouton zéro du détecteur. ⇒ Attendre que l’équilibration de la colonne soit effective. ⇒ Prélever 4 fois la valeur du volume de la boucle d’injection (c’est indiqué dessus). ⇒ S’assurer que l’injecteur est bien sur LOAD, enfoncer l’aiguille horizontalement, appuyer sur le piston, puis retirer délicatement l’aiguille, et basculer l’injecteur sur INJECT. A Vérifier que le chromatogramme apparasse en temps réel sur l’écran (courbe noire) ! Noter la pression indiquée.

Etape 4 : traitement du chromatogramme et impression : cf procédure en bas de page 31 et haut de page 32 !

Q

Définir la notion de viscosité. Quelle est l’unité du système international de la viscosité dynamique ? Quelle est celle communément employée en HPLC ?

Q

Quelle est la conséquence d’une augmentation de la viscosité de la phase mobile ?

2.3.3.2. Phase mobile : 50/50 H2O/THF : Analyse des résultats ? Ce chromatogramme a été réalisé en 4 minutes à une pression d’environ 2250 psi, et est à télécharger et à imprimer, à l’adresse suivante : http://ligodin.free.fr/Biophy2.html

• Rendre les 2 chromatogrammes de mélange. • Remplir un tableau récapitulatif des données chromatographiques. • Représenter sous forme d’histogramme, le temps de rétention de chaque composé du mélange en fonction de la phase organique utilisée (MeOH, ACN, et THF).

Rapport

• Est-ce que les temps de rétention des 5 parabènes suivent le même ordre de sortie que l’ordre des coefficients de polarité des 3 solvants organiques testés ? • Comparer la viscosité des solvants utilisés avec la pression relevée en tête de colonne. Est-ce conforme avec la loi de variation de Darcy ? • Conclure sur l’importance de la polarité, de la viscosité des solvants. Conclure sur l’élution des parabènes (séparation effective ou pas, durée de l’analyse).

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HPLC 2.35/42

2.3.4. Greffage de la phase stationnaire UTILISATION D’UNE COLONNE C8 & Phenyl-hexyl Le but de cette étude est de démontrer que la nature du greffage de la phase stationnaire contenue dans la colonne influence nettement la qualité de la séparation d’un mélange de cinq parabènes.

2.3.4.1. Utilisation d'une colonne phényl-hexyl avec phase mobile : 50/50 H2O/MeOH à réaliser Etape 1 : mise en place de la colonne : ? Cliquer sur l’icône Instrument On/Off (dans la barre des menus) : pour couper la pompe, vérifier que la pression est proche de 0 (quelques psi). ? Enlever la colonne C18, et placer la colonne phényl-hexyl dans le bon sens, en prenant toutes les précautions qui s’imposent (cf bas de page 28 et haut de page 29), si vous ne voulez pas être confronté à des problèmes de fuites ! ? Cliquer sur l’icône Instrument On/Off pour remettre en fonctionnement la pompe.

Etape 2 : création de la méthode : mode Isocratique – phase mobile : 50/50 H2O/MeOH pendant 17 min Procéder comme précédemment : ? FILE / NEW METHOD FILE → onglet Data Acquisition ? Dans la fenêtre Instrument Parameters View : cliquer sur Advanced → onglet Data Acquisition : LC Stop Time : 17,00 min, puis cliquer sur Apply to All acquisition time, → onglet Pump : Mode Low pressure gradient Total Pump A Flow : 1,0 mL/min, Solvent B conc : 50 %, Pressure limits (Pump A), Max : 200 bar ; Detector A : décôcher Cell Temperature, puis s’assurer que la longueur d’onde de travail est de 254 nm ? Sauvegarder la méthode, FILE / SAVE / METHOD FILE SAVE AS, dans le dossier Data → TP TASS, dans le dossier du nom de votre groupe 2BIO ? Charger la méthode dans la Chaîne HPLC, en cliquant sur Download (S’assurer que le titre de la fenêtre générale corresponde bien au nom de la méthode qui vient d’être créée).

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? Cliquer sur SINGLE START (dans la barre verticale d’assistance) : une fenêtre apparaît, il suffit d’actualiser : Sample Name : phB nature colonne phenyl-hexyl 50-50 (Vérifier que le fichier Method File se trouve au bon endroit sur le disque dur) Data Description : Mélange 5 phB à 2 mg/L sur phenyl-hexyl Novapak 50/50 eau/MeOH. Cliquer sur OK

Etape 3 : obtention du chromatogramme ? Il apparaît une nouvelle fenêtre : Data Acquisition Start. Ne surtout pas cliquer sur START ! ⇒ Si sur la fenêtre de contrôle, la détection n’est pas à zéro : faire un autozéro, en appuyant sur le bouton zéro du détecteur. ⇒ Attendre que l’équilibration de la colonne soit effective PENDANT 20 MINUTES (la durée d’équilibrage est plus longue lors du changement de colonne.) ⇒ Prélever 4 fois la valeur du volume de la boucle d’injection (c’est indiqué dessus). ⇒ S’assurer que l’injecteur est bien sur LOAD, enfoncer l’aiguille horizontalement, appuyer sur le piston, puis retirer délicatement l’aiguille, et basculer l’injecteur sur INJECT. A Vérifier que le chromatogramme apparaisse en temps réel sur l’écran (courbe noire) ! Noter la pression indiquée.

Etape 4 : traitement du chromatogramme et impression : cf procédure en bas de page 31 et haut de page 32 !

2.3.4.2. Utilisation d'une colonne C8 avec phase mobile : 50/50 H2O/MeOH : Analyse des résultats ? Ce chromatogramme a été réalisé en 18 minutes à une pression de 2177 psi, et est à télécharger et à imprimer, à l’adresse suivante : http://ligodin.free.fr/Biophy2.html

Q Q

Que signifie la dénomination hexyl-phényl pour la colonne que vous avez utilisée ? Quel est le rôle du groupement hexyl ?

• Rendre les 2 chromatogrammes de mélange. • Remplir un tableau récapitulatif des données chromatographiques. • Tracer sous Regressi, la courbe tR = f(nombre de C de la colonne). Commenter la courbe. Rapport

• Que dire de la séparation des deux derniers parabènes : butylparabène et benzylparabène ? • Conclure sur l’élution des parabènes (séparation effective ou pas, durée de l’analyse).

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HPLC 2.37/42

2.3.5. Optimisation de séparation en mode isocratique : Analyse des résultats Q

D’après vos conclusions, indiquez les conditions de travail et le type de colonne qu’il faudrait judicieusement choisir pour obtenir une séparation correcte de votre mélange ?

Q

Quels paramètres pensez-vous qu’il est utile de changer (un par un, bien entendu)

pour obtenir la meilleure séparation des cinq parabènes et ce dans un temps d’analyse de 10 minutes maximum ?

2.3.6. Utilisation d'un gradient d'élution UTILISATION D’UNE COLONNE Phenyl-hexyl Nous allons maintenant aborder le dernier thème de notre séance : l’influence du mode de travail choisi pour réaliser la séparation du mélange de cinq parabènes. Toutes les analyses précédentes ont été obtenues dans des conditions dites isocratiques. Nous allons, puisque la chaîne le permet, travailler en mode gradient.

Q

Quels sont les avantages et les inconvénients du mode gradient par rapport au mode isocratique ?

Q

Comment procéderiez-vous pour réaliser cette comparaison entre les deux modes de travail utilisés ? Indiquez vos prévisions de programmation ?

2.3.6.1. Gradient linéaire eau/MeOH 55 → 65 à réaliser Etape 1 : mise en place de la colonne : déjà réalisée ! Etape 2 : création de la méthode : mode gradient linéaire – phase mobile : 55 → 65 eau/MeOH pendant 10 min Procéder comme précédemment : ? FILE / NEW METHOD FILE → onglet Data Acquisition ? Dans la fenêtre Instrument Parameters View : cliquer sur Advanced → onglet Data Acquisition : LC Stop Time : 10,00 min, puis cliquer sur Apply to All acquisition time, → onglet Pump : Mode Low pressure gradient Total Pump A Flow : 1,0 mL/min, Solvent B conc : 55 %,

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LC Time Prog. : remplir le tableau comme indiqué ci-dessous : 1 2 3 4

Time 0,01 4 15 15

Module Controller Pumps Pumps Controller

Action Start B.Conc B.Conc Stop

Value 55 65

Remarque : 1 : la ligne 4 est déjà écrite par défaut. Remarque : 2 : Cliquer sur Draw curve pour observer la courbe de programmation de solvant. Pressure limits (Pump A), Max : 200 bar ; Detector A : décôcher Cell Temperature, puis s’assurer que la longueur d’onde de travail est de 254 nm ? Sauvegarder la méthode, FILE / SAVE / METHOD FILE SAVE AS, dans le dossier Data → TP TASS, dans le dossier du nom de votre groupe 2BIO ? Charger la méthode dans la Chaîne HPLC, en cliquant sur Download (S’assurer que le titre de la fenêtre générale corresponde bien au nom de la méthode qui vient d’être créée). ? Cliquer sur SINGLE START (dans la barre verticale d’assistance) : une fenêtre apparaît, il suffit d’actualiser : Sample Name : phB Gradient linéaire – Phenyl-Hexyl - phase mobile 55-65 eau/MeOH (Vérifier que le fichier Method File se trouve au bon endroit sur le disque dur) Data Description : Mélange 5 phB à 2 mg/L sur Phenyl-Hexyl Novapak 55/65 en gradient linéaire. Cliquer sur OK

Etape 3 : obtention du chromatogramme ? Il apparaît une nouvelle fenêtre : Data Acquisition Start. Ne surtout pas cliquer sur START ! ⇒ Si sur la fenêtre de contrôle, la détection n’est pas à zéro : faire un autozéro, en appuyant sur le bouton zéro du détecteur. ⇒ Attendre que l’équilibration de la colonne soit effective PENDANT 10 MINUTES. ⇒ Prélever 4 fois la valeur du volume de la boucle d’injection (c’est indiqué dessus). ⇒ S’assurer que l’injecteur est bien sur LOAD, enfoncer l’aiguille horizontalement, appuyer sur le piston, puis retirer délicatement l’aiguille, et basculer l’injecteur sur INJECT. A Vérifier que le chromatogramme apparaisse en temps réel sur l’écran (courbe noire) ! Noter la pression indiquée en début et en fin d’analyse. A Arrêter à 10 min, l’analyse en cliquant sur Acquisition → Stop.

Q

Pourquoi la pression en tête de colonne est différente en début et en fin d’analyse ?

Etape 4 : traitement du chromatogramme et impression : cf procédure en bas de page 31 et en haut de page 32 !

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2.3.6.2. Gradient linéaire H2O/MeOH 50 → 60 : Analyse des résultats ? Le chromatogramme correspondant a été réalisé à une pression initiale de 2310 psi et une pression finale de 2240 psi, et est à télécharger et à imprimer, à l’adresse suivante : http://ligodin.free.fr/Biophy2.html

2.3.6.3. Gradient exponentiel H2O/MeOH (courbe -10 et courbe +10) : Analyse des résultats ? Les 2 chromatogrammes correspondants ont été réalisés (pressions sensiblement identiques à celles que vous avez obtenus en gradient linéaire), et sont à télécharger et à imprimer, à l’adresse suivante : http://ligodin.free.fr/Biophy2.html

• Imprimer les 4 chromatogrammes. • Comparer les chromatogrammes, (chromatogramme obtenu avec la colonne Phenyl-Hexyl en 50/50 H2O/MeOH en mode isocratique) et ceux obtenus en mode gradient linéaire. Rapport

• Comparer l’impact du choix des courbes -10 et +10, en terme de séparation, de temps d’analyse, et de « bosse » (caractéristique du système gradient, au temps du changement de conditions de travail pendant l’analyse). • Quel est le meilleur programme de gradient et pourquoi ? • Conclure, en indiquant quels sont les avantages et les inconvénients de ce mode de travail ?

2.3.7. Extinction de la chaîne HPLC Etape 1 : retrait de la colonne en place : Etape à réaliser exclusivement par les groupes du jeudi & vendredi après-midi Pour chaque colonne, vous devrez procéder comme suit : 1. S’assurer que le débit est sur 0 mL/min. 2. Desserrer les deux vis (en PEEK ou en inox selon la colonne) qui sont localisées aux extrémités de la colonne pour la remplacer par l’union.

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Etape 2 : circulation du solvant eau/MeOH 50/50 dans les 2 voies A et B pendant 20 minutes : Etape à réaliser par les groupes du jeudi et du vendredi après-midi 1. Cliquer sur l’onglet « Data Acquisition », puis dans File, faire Open Method File, dans le dossier Data → TP TASS → procédures, choisir le fichier : Solvantderepos-voiesAB. Downloader la méthode dans la chaîne HPLC. 2. Cliquer sur SINGLE START : une fenêtre apparaît, cliquer sur OK.

Etape 3 : circulation du solvant de repos dans les 4 voies pendant 20 minutes : Etape à réaliser exclusivement par les groupes du jeudi & vendredi après-midi 1. Plonger les 4 canalisations des 4 voies dans le mélange de repos H2O/MeOH 80/20. 2. Cliquer sur l’onglet « Data Acquisition », puis dans File, faire Open Method File, dans le dossier Data → TP TASS → procédures, choisir le fichier : Méthode-Solvantrepos. Downloader la méthode dans la chaîne HPLC. 3. Cliquer sur SINGLE START : une fenêtre apparaît, cliquer sur OK.

Etape 4 : Éteindre la chaîne HPLC : Tous les groupes 1. L’injecteur doit être sur LOAD. Vider dans la bouteille de récupération adéquate des solvants (sous la hotte) le contenu des bouteilles « poubelle » (celle de la chaîne et celle de l’injecteur). 2. Eteindre l’ensemble de l’appareillage : détecteur, contrôleur-Pompe, PC, et écran.

2.4. CONCLUSION GENERALE Conclure sur l’ensemble des manipulations réalisées. Rapport

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HPLC 2.41/42

ANNEXE : PROPRIETES PHYSIQUES DE QUELQUES SOLVANTS Solvants n-décane isooctane n-hexane cyclohexane butyléther triéthylamine isopropyléther toluène p-xylène benzène benzyléther méthylchlorure éthylchlorure butylalcool butanol tetrahydrofurane éthylacétate propanol-1 propanol-2 chloroforme méthylacétate méthyléthylcétone cyclohexanone nitrobenzène benzonitrile dioxane éthanol pyridine nitroéthane acétone benzylalcool méthoxyéthanol acétonitrile acide acétique diméthylforamide diméthylsulfoxyde méthanol formamide eau

Indice de polarité (-) -0,3 -0,4 0,0 0,0 1,7 1,8 2,2 2,3 2,4 3,0 3,3 3,4 3,7 3,9 3,9 4,2 4,3 4,3 4,3 4,3 4,4 4,5 4,5 4,5 4,6 4,8 5,2 5,3 5,3 5,4 5,5 5,7 6,2 6,2 6,4 6,5 6,6 7,3 9,0

Viscosité (cPo) 0,92 0,50 0,31 0,98 0,70 0,38 0,33 0,59 0,70 0,65 5,33 0,44 0,79 3,00 3,01 0,55 0,47 2,30 2,35 0,57 0,45 0,43 2,21 2,03 1,22 1,54 1,20 0,94 0,68 0,32 5,80 1,72 0,37 1,26 0,90 2,24 0,60 3,76 1,00

Miscibilité (-) 29 29 29 28 26 26 23 24 21 20 20 15 17 19 15 15 19 15,17 17 28 14,20 15,19 17 14 16 15,17 13 13 11,17 14 12 9 12 3 -

Si la différence des miscibilités est supérieure à 14, les deux solvants concernés ne sont pas miscibles. 1 cPo = 10-3 Pa.s.

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HPLC 2.42/42

Eléments de réponses aux questions de préparation

2.3. MODE OPERATOIRE 2.3.1. Procédure de mise en route de la chaîne HPLC Q

Quel est l’utilité du dégazeur en ligne ? Quel est son principe de fonctionnement ?

Le dégazeur en ligne permet d'éliminer en continu les gaz dissous dans les liquides à l'aide d'une membrane spéciale en résine synthétique (Téflon). Grâce au raccordement de ce dégazeur à la pompe pour la chromatographie liquide haute performance, les gaz dissous dans les solvants de phase mobile peuvent être dégazés en continu sans entraîner de changement dans la composition de la phase mobile. Ceci peut empêcher le dégazage et la formation de bulles dans le système, pouvant provoquer un dysfonctionnement au niveau de la pompe, la formation d'un bruit de fond sur la ligne de base ou des variations importantes de la ligne de base. Le dégazeur en ligne améliore également la stabilité et la reproductibilité de l'analyse HPLC. Ce dégazeur est muni de trois ou de cinq tubulures indépendantes mais le processus de dégazage et les différentes fonctions sont identiques pour chaque tubulure. La figure ci-dessous illustre le principe de fonctionnement du dégazeur.

La phase mobile (liquide) à dégazer passe par une membrane spéciale en résine synthétique placée dans la chambre à vide. Le gaz dissous a une taille moléculaire inférieure et une mobilité supérieure à celles du liquide ainsi qu'une affinité plus forte pour la membrane en résine. Il passe à travers la membrane dans la chambre à vide, est évacué du dégazeur et, par conséquent, est éliminé du solvant.

Q

Quel autre système peut-on utiliser pour effectuer le même type d’opération ?

On effectue un barbotage dans chaque flacon de solvants à l’aide d’Hélium de haute pureté (4.6), c’est-à-dire à 99,996 %.

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Préparation 2.1/6

2.3.2. Importance du pourcentage de l’eau de la phase mobile dans la séparation d’un mélange de parabènes 2.3.2.1. Phase mobile : 40/60 H2O/MeOH à réaliser Q

D’après vous, quelle est la position et quel est le sens logique de la colonne ?

La colonne doit être positionnée entre l’injecteur et le détecteur dans le sens du flux indiqué par le constructeur de la colonne. Remarque : les colonnes sont remplies et tassées selon un sens bien déterminé par le constructeur.

Q

Selon vous, quel critère peut vous permettre de suspecter une éventuelle fuite de la

phase mobile ? Une chute brutale de la pression nous indiquera une fuite importante.

Q

Quel est le but de l’équilibration ?

Le but de l’équilibration est la durée nécessaire pour que les équilibres chimiques entre les phases stationnaires et les phases mobiles soient tout à fait effectives.

Q

Selon la colonne utilisée et les conditions de travail choisies, la pression dans la

colonne peut être différente. À votre avis, si cette pression est instable, c’est-à-dire qu’elle présente des fluctuations, quels problèmes cela traduit-il ? Cela traduit un problème de fuites.

Q

Connaissant les caractéristiques géométriques de la colonne, déterminer son volume

de phase mobile sachant que la phase stationnaire occupe environ 30 % du volume. Connaissant le débit, faire une estimation du temps de remplissage de la colonne par la phase mobile. On estime qu’il faut multiplier par un facteur 25 cette dernière valeur pour obtenir la durée d’équilibration (ce facteur prend en compte, le temps de passage de la phase mobile dans toutes les canalisations, de la bouteille de solvant jusqu’à celle de récupération, ainsi que de la durée mise par les équilibres chimiques entre les deux phases). Déterm iner la durée d’équilibration.

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Préparation 2.2/6

Les colonnes utilisées ont une longueur de 150 mm pour un diamètre intérieur de 3,9 mm. Le volume de la colonne est donc de Vcolonne = 150 x

3,92 = 570 mm3 = 0,57 mL, d’où le 4

volume de phase mobile : Vphase mobile = 70 % Vcolonne = 0,40 mL. Le débit utilisé est D = 1 mL/min, d’où la durée de remplissage : tremplissage = Vphase mobile/D = 0,40 min. € Finalem ent, on estim e que la durée d’équilibration est de 10 m inutes.

Q

Quel est le facteur de conversion entre les bars et les psi ?

Facteurs de conversion : 1 psi = 0,06895 bar et 1 bar = 14,50326 psi. Remarque : Le p.s.i., pour « pound per square inch » (« livre par pouce carré », lb/in²), est une unité de mesure de contrainte et de pression anglo-saxonne.

Q

La solution que vous avez injectée est un mélange de 5 parabènes.

Quelle est la

structure topologique d’un parabène ?

Q

Comment procéderiez-vous pour préparer 100 mL de ce mélange de 5 parabènes à 2

mg.L , à partir de solutions individuelles concentrées de 20 mg.L-1 ? -1

On prélève 10 mL de chaque solution individuelle que l’on place dans une fiole jaugée de 100 mL. On complète avec un mélange H2O/MeOH 50/50 jusqu’au trait de jauge, puis on homogénéise. On obtient alors 100 mL d’un mélange de 5 parabènes à 2 mg.L-1.

Q

Pourquoi doit-on prélever un volume 4 à 5 fois plus important que celui de la boucle

d’échantillonnage ? Pour être certain que la boucle ne délivrera que le volume indiqué par cette dernière, et donc pour obtenir une bonne reproductibilité de l’injection. C’est important, surtout pour les mesures quantitatives.

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Préparation 2.3/6

Q

D’après-vous, quel est l’ordre logique d’élution des 5 parabènes ?

Justifier votre

réponse. Étant donné que l’on travaille en phase inverse (phase stationnaire plutôt apolaire, et phase mobile plutôt polaire), ce sont les parabènes les plus polaires qui sortiront en premier, donc ceux qui possèdent un radical alkyle R à chaîne carbonée la plus courte. Dans le cas de cette étude, on doit éluer en premier le méthylparabène, puis l’éthylparabène, le propylparabène, le butylparabène et enfin le benzylparabène.

2.3.3. Nature du solvant organique utilisé 2.3.3.1. Phase mobile : 50/50 H2O/ACN à réaliser Q

Définir la notion de viscosité.

Quelle est l’unité du système international de la

viscosité dynamique ? Quelle est celle communément employée en HPLC ? La viscosité (du latin viscum, gui) peut être définie comme la résistance à l'écoulement uniforme et sans turbulence se produisant dans la masse d'une matière.

La viscosité

dynamique µ (mu) correspond à la contrainte de cisaillement qui accompagne l'existence d'un gradient de vitesse d'écoulement dans la matière. Lorsque la viscosité augmente, la capacité du fluide à s'écouler diminue. La viscosité dynam ique μ (ou encore η (étha)) se mesure en pascal-seconde (Pa.s), cette unité ayant remplacé le poiseuille (Pl) qui a la même valeur. On trouve encore parfois l'ancienne unité du système CGS, la poise (Po) : 1 Pa·s = 10 Po. Remarque : La viscosité cinématique ν (nu) s'obtient en divisant la viscosité dynamique par la masse volumique ρ. Elle s'exprime en m²/s.

Dans le système CGS la viscosité cinématique était exprimée en

stokes (St) ou en centistokes (cSt). La conversion est immédiate, puisque 1 St = 1 cm²/s = 10-4 m²/s et 1 cSt = 1 mm²/s = 10-6 m²/s.

Q

Quelle est la conséquence d’une augmentation de la viscosité de la phase mobile ?

Pour une colonne donnée et un débit donné, la pression en tête de colonne est directement proportionnelle à la viscosité η (d’après la loi de Darcy). Une augmentation de la viscosité entraînera nécessairement une augmentation de la pression.

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Préparation 2.4/6

2.3.4. Greffage de la phase stationnaire 2.3.4.2. Utilisation d’une colonne C8 avec phase mobile : 50/50 H2O/MeOH : Analyse des résultats Q

Que signifie la dénomination hexyl-phényl pour la colonne que vous avez utilisée ?

Cela signifie que la colonne possède le greffon :

Q

Quel est le rôle du groupement hexyl ?

Le groupement hexyl permet de désencombrer stériquement la phase stationnaire, et elle permet dans le même temps de diminuer les interactions entre cycles aromatiques, ce qui permet d’augmenter la vitesse d’élution des composés à groupements aromatiques. D’autre part, la phase stationnaire est moins fragile avec l’utilisation de ce type de groupement.

2.3.5. Optimisation de séparation : Analyse des résultats Q

D’après vos conclusions, indiquez les conditions de travail et le type de colonne qu’il

faudrait judicieusement choisir pour obtenir une séparation correcte de votre mélange ? Pour obtenir une séparation correcte du mélange de cinq parabènes, nous sommes amenés à procéder selon les conditions suivantes : •

Travailler en mode isocratique avec un mélange de solvants de phase mobile de 50/50 H2O/MeOH ;

•

Utiliser une colonne type phényl-hexyl ;

•

Utiliser un débit de 1 mL/min ;

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Préparation 2.5/6

•

Utiliser le mélange inconnu des cinq parabènes à 2 mg.L-1.

Cependant, il demeure un inconvénient : un temps d’analyse beaucoup trop long. En effet, il faut compter environ 30 minutes pour obtenir la sortie correcte du dernier parabène.

Q

Quels paramètres pensez-vous qu’il est utile de changer (un par un, bien entendu)

pour obtenir la meilleure séparation des cinq parabènes et ce dans un temps d’analyse de 10 minutes maximum ? Conditions de travail optimales pour que la résolution soit acceptable en une durée d’analyse inférieure à 10 minutes. Ces nouvelles conditions sont les suivantes : ü Phase mobile de 38/62 eau/MeOH ; ü Débit dans la colonne de 1,2 mL/min ; ü Utiliser une colonne de type phenyl-hexyl ; ü Pression dans la colonne de l’ordre de 2500 psi.

2.3.6. Utilisation d’un gradient d’élution Q

quels sont les avantages et les inconvénients du mode gradient par rapport au mode

isocratique ? Ce mode de travail présente un avantage important en analyse chromatographique : le gain de temps. Mais les inconvénients sont également nombreux : •

dérive de la ligne de base ;

•

matériel plus coûteux ;

•

surconsommation de solvants (travail en circuit fermé impossible) ;

•

accroissement en volume et en poids du nombre de bouteilles de rejet et/ou récupération ;

•

séparation plus ou moins acceptable.

Il faut donc noter que, dans certains cas et selon le matériel à disposition (comme les colonnes), le mode gradient n’est pas la technique la mieux adaptée pour séparer correctement tous les mélanges de produits.

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Préparation 2.6/6

Q

Comment procéderiez-vous pour réaliser cette comparaison entre les deux modes de

travail utilisés ? Indiquez vos prévisions de programmation ? En mode isocratique, on arrive généralement à séparer tous les composés avec du temps. L’utilisation d’un gradient consiste à éliminer les trop grandes durées de séparation entre pics afin de diminuer la durée totale d’analyse, mais il faut faire attention de ne pas provoquer de coélution. On peut donc traiter le chromatogramme par partie en appliquant judicieusement différents gradients séparés ou pas par des paliers isocratiques.

2.3.6.1. Gradient linéaire H2O/MeOH 55 → 65 à réaliser Q

Pourquoi la pression en tête de colonne est différente en début et en fin d’analyse ?

Parce que la viscosité du mélange n’est pas la même en début et en fin d’analyse. En effet la proportion du mélange de solvants varie au cours de l’élution. .

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Préparation 2.7/6

TP N°2 : RAPPORT 2.3. MODE OPERATOIRE 2.3.2. Importance du pourcentage de l’eau de la phase mobile dans la séparation d’un mélange de parabènes 2.3.2.3. Phase mobile : 45/55 et 55/45 H2O/MeOH : Analyse des résultats % eau 40 45 50 55

MetPHB

EtPHB

temps de rétention (min) PropylPHB ButPHB

BenzPHB

% solvant 60 55 50 45

• Quel est l’impact du pourcentage d’eau dans la phase mobile sur les temps de rétention des composés du mélange ? Étayer votre affirmation en traçant sous Regressi le graphe tR = f(%eau).

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Rapport 2.1/6

• Conclure sur l’ordre d’élution des parabènes, sur la séparation effective ou pas, et sur la durée de l’analyse. • Quel est le chromatogramme fournissant le meilleur compromis ?

2.3.3. Nature du solvant organique utilisé 2.3.3.2. Phase mobile : 50/50 H2O/THF : Analyse des résultats solvants Méthanol (50 %) Acétonitrile (50 %) Tétrahydrofurane (50 %)

MetPHB

EtPHB

temps de rétention (min) PropylPHB ButPHB

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BenzPHB

solvants MeOH ACN THF

Rapport 2.2/6

• Est-ce que les temps de rétention des 5 parabènes suivent le même ordre de sortie que l’ordre des coefficients de polarité des 3 solvants organiques testés • Comparer la viscosité des solvants utilisés avec la pression relevée en tête de colonne. Est-ce conforme avec la loi de variation de Darcy ? • Conclure sur l’importance de la polarité, de la viscosité des solvants. Conclure sur l’élution des parabènes (séparation effective ou pas, durée de l’analyse).

2.3.4. Greffage de la phase stationnaire 2.3.4.2. Utilisation d'une colonne C8 avec phase mobile : 50/50 H2O/MeOH : Analyse des résultats nombre de Carbone 8 12 18

MetPHB

EtPHB

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temps de rétention (min) PropylPHB ButPHB

BenzPHB

colonne C8 phenyl C18

Rapport 2.3/6

• Tracer sous Regressi, la courbe tR = f(nombre de C de la colonne). Commenter la courbe.

• Que dire de la séparation des deux derniers parabènes : butylparabène et benzylparabène ? • Conclure sur l’élution des parabènes (séparation effective ou pas, durée de l’analyse).

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Rapport 2.4/6

2.3.6. Utilisation d'un gradient d'élution 2.3.6.3. Gradient exponentiel H2O/MeOH (courbe -10 et courbe +10) : Analyse des résultats

• Comparer les chromatogrammes, (chromatogramme obtenu avec la colonne Phenyl-Hexyl en 50/50 H2O/MeOH en mode isocratique) et ceux obtenus en mode gradient linéaire. • Comparer l’impact du choix des courbes -10 et +10, en terme de séparation, de temps d’analyse, et de « bosse » (caractéristique du système gradient, au temps du changement de conditions de travail pendant l’analyse).

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Rapport 2.5/6

• Quel est le meilleur programme de gradient et pourquoi ? • Conclure, en indiquant quels sont les avantages et les inconvénients de ce mode de travail ?

2.4. Conclusion générale Conclure sur l’ensemble des manipulations réalisées. Discuter des difficultés éventuellement rencontrées.

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Rapport 2.6/6