Chromatograhie methodes et principe
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Chromatographie 1 – Généralités Cours TB 2008 - 2009 2008-2009
Chromatographie
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Introduction - ensemble de méthodes de séparation des constituants d’un mélange - très employées (LA méthode de séparation actuelle) parce que : - séparation possible de n’importe quel constituant - mise en œuvre possible à l’échelle analytique, préparative et industrielle - seront envisagés * des généralités : définitions de la chromatographie et classification des méthodes chromatographiques * le principe des méthodes * les méthodologies et applications 2008-2009 2008-2009
Chromatographie
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Chromatographie (1/2) 1 3 - Étude théorique et modélisation
1 – Généralités
1 3 1 - Modélisation intuitive 1 3 2 - Volumes de rétention 1 3 3 - Efficacité de la colonne et résolution
1 1 – Définition de la chromatographie : principes généraux
1 4 – Divers temps d’une chromatographie sur colonne 1 5 – Divers temps d’une chromatographie sur colonne
1 1 1 - Définition 1 1 2 - Caractères généraux
1 2 - Différents types de chromatographies
2 – Principe et utilisation des
méthodes de chromatographie
1 2 1 - Classification selon l’état des phases 1 2 2 - Classification selon le principe des interactions entre soluté et phase stationnaire 1 2 3 - Classification selon le mode d’immobilisation de la phase stationnaire 1 2 4 - Classification selon les modalités de migration de la phase mobile 2008-2009
2 1 – Chromatographie d’adsorption 2 2 – Chromatographie de partage 2 3 – Chromatographie par échange d’ions 2 4 – Chromatographie par gel filtration 2 5 – Chromatographie par interactions biospécifiques 2 6 – Chromatographie par interactions hydrophobes 2 7 – Chromatographie par chélation (IMAC = Immobilised metal affinity chromatography »)
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Chromatographie (2/2) 3 – Méthodologie et applications 3 2 – Applications
3 1 – Méthodologies 3 1 1 – Chromatographie sur colonne A - Chromatographie en phase liquide B - Chromatographie en phase gazeuse
3 1 2 – Chromatographie de surface A – Méthodologie générale B – Différence
2008-2009
3 2 1 – Séparation des acides aminés 3 2 2 – Séparation de médicaments par HPLC 3 2 3 – Séparation des protéines par FPLC 3 2 4 – Autres applications
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1 – Généralités
1 1 – Définition de la chromatographie : principes généraux 1 1 1 - Définition Chromatographie : ensemble de méthodes qui assurent la séparation des constituants d’un mélange en utilisant deux phases non miscibles : les divers constituants sont entraînés d'une manière différentielle par une phase mobile le long d'une phase stationnaire.
Commentaires : « phase » : toute partie homogène d’un système. trois états physiques d’une phase : liquide, gazeux et solide. 2008-2009
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Chromatographie
1 – Généralités
1 1 – Définition de la chromatographie : principes généraux 1 1 2 - Caractères généraux - la séparation de solutés se réalise entre deux phases : * une phase stationnaire, par définition immobile ; choisie pour sa grande affinité pour les divers solutés ; affinité quels mécanismes ? cependant, affinité pas trop importante : les solutés doivent pouvoir être détachés
* une phase mobile qui entraîne les divers solutés
- en fait, les solutés se partagent entre la phase stationnaire et la phase mobile ; chromatographie = phénomène de partage généralisé
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Phase stationnaire
Phase mobile
Phase stationnaire
Phase mobile
Cmo Cst
K
=
Cst ------Cmo
Schématisation 2008-2009
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>1
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1 – Généralités
1 1 – Définition de la chromatographie : principes généraux 1 1 2 - Caractères généraux - la séparation est liée à la vitesse propre d’entraînement du soluté par la phase mobile : * les substances qui migrent le plus sont celles qui ont le plus d’affinité pour la phase mobile, * les substances qui migrent le moins, celles qui ont le moins d’affinité.
- les solutés restent ou non dans la phase stationnaire * initialement, du point de vue historique, les solutés restaient dans la phase stationnaire ; ils étaient colorés et pouvaient être visualisés * vers la seconde guerre mondiale (Tiselius), on a pu commencer à pouvoir mettre en évidence des solutés incolores par colorimétrie (utilisation de la ninhydrine) : il était possible de laisser sortir les solutés de la colonne (chromatographie d’élution). 2008-2009
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Chromatographie
1 – Généralités
1 1 – Définition de la chromatographie : principes généraux 1 1 2 - Caractères généraux - la mise en oeuvre est possible : •à l’échelle laboratoire •à l’échelle préparative * à l’échelle industrielle.
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Chromatographie
1 – Généralités
1 2 - Différents types de chromatographies 1 2 1 - Classification selon l’état des phases 1 2 2 - Classification selon le principe des interactions entre soluté et phase stationnaire 1 2 3 - Classification selon le mode d’immobilisation de la phase stationnaire 1 2 4 - Classification selon les modalités de migration de la phase mobile
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Chromatographie
1 – Généralités
1 2 - Différents types de chromatographies 1 2 1 - Classification selon l’état des phases Phase mobile
Phase station.
chromatographie liquide - liquide CPL chr. phase chromatographie liquide - solide chromatographie gaz
liquide
- liquide. CPG chr. phase
Chromatographiegazsolide 2008-2009 Chromatographie gazeusedgazeuse
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1 – Généralités
1 2 - Différents types de chromatographies 1 2 2 - Classification selon le principe des interactions entre soluté et phase stationnaire - ADS0RPTION : liaisons de faible énergie (liaisons polaires, ...) assurant la fixation des solutés à la phase stationnaire - PARTAGE : solubilisation des solutés dans une phase stationnaire liquide ; ils sont amenés à se partager entre la phase stationnaire et la phase mobile dans laquelle ils sont moins solubles; - ECHANGE D'IONS : liaisons ioniques entre charges électriques portées par les solutés et par la phase stationnaire (opposées) - GEL FILTRATION : pas de liaisons : diffusion / exclusion de solutés dans la phase stationnaire poreuse (chromatographie d'EXCLUSION DIFFUSION) - INTERACTIONS BIOSPECIFIQUES : interactions biospécifiques (enzyme - substrat, antigène anticorps, ...) entre les solutés et la phase stationnaire porteuse d’un ligand (appliquées aux protéines). - INTERACTIONS HYDROPHOBES : liaisons hydrophobes entre la phase stationnaire et les solutés (nécessite de la présence de parties hydrophobes dans la structure du soluté) (s'applique aux protéines) - CHELATION : liaisons datives entre un métal divalent fixé sur un support (phase stationnaire) et les solutés porteurs de doublets libres (cas classique : His des protéines) . 2008-2009
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1 – Généralités
1 2 - Différents types de chromatographies 1 2 3 - Classification selon le mode d’immobilisation de la phase stationnaire La phase stationnaire immobilisée de 2 manières différentes :
- soit étendue sur une surface plane : chromatographie de surface * la chromatographie sur papier * la chromatographie sur couche mince
- soit à l'intérieur d'une colonne : chromatographie sur colonne . phase stationnaire en suspension dans un solvant (tampon) maintenue dans une colonne introduction en tête de colonne de l'échantillon à analyser (au moyen d'un injecteur) détection des solutés (grâce à un détecteur) collection de fractions (collecteur de fractions) .
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1 – Généralités
1 2 - Différents types de chromatographies 1 2 4 - Classification selon les modalités de migration de la phase mobile A - Chromatographie par élution Sortie des solutés de la phase stationnaire : c'est le cas de la chromatographie sur colonne. ELUANTS : solvants (tampons ) (le plus souvent mélange) qui réalisent la rupture différentielle des interactions entre phase stationnaire et solutés élution en faisant varier la composition du solvant (tampon) utilisé : force ionique, polarité par exemple soit d'une manière brusque (gradient discontinu) soit d'une manière continue (gradient continu). caractérisation des solutés dans l'éluat .
B - Chromatographie par déplacement Maintien des solutés dans la phase stationnaire : ils se déplacent dans la phase stationnaire c'est le cas des chromatographies de surface (papier et couche mince) où on révèle les solutés encore présents dans la phase stationnaire.
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Chromatographie
1 – Généralités
1 3 - Étude théorique et modélisation 1 3 1 – Modélisations
1 3 2 – Le pic de chromatographie idéal
1 3 3 - Efficacité de la colonne et résolution
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1 – Généralités
1 3 - Étude théorique et modélisation 1 3 1 – Modélisations A – Modélisation intuitive - série de barques sans moteur sur une rivière. - courant est supposé constant, c’est à dire qu’il est identique que l’on soit au bord de la rive ou au milieu. - les barques transportent des passagers d’une ligne marquée « départ » à une ligne marquée « arrivée ». - les barques, au gré des passagers, sont susceptibles de s’arrêter sur la berge durant des temps variables.
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Chromatographie
1 – Généralités Au temps 0,.. Elles
1 3 - Étude théorique et modélisation 1 3 1 – Modélisations A – Modélisation intuitive 1 – Modèle de barques sur une rivière :
Au temps zéro
les barques attachées sur la ligne de départ
libérées en même temps, au temps zéro
Départ
Arrivée
Courant
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1 – Généralités
1 3 - Étude théorique et modélisation 1 3 1 – Modélisations A – Modélisation intuitive Départ
Arrivée
- différence de Départ durée du trajet entre les lignes de départ et celle d’arrivée, liée aux arrêts plus ou moins longs.
Arrivée
- avancée, dans le courant, à la même vitesse
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1 – Généralités
1 3 - Étude théorique et modélisation 1 3 1 – Modélisations A – Modélisation intuitive Départ
Arrivée
- temps passé à naviguer tO identique pour toutes les barques - temps départ - arrivée tR différents du fait de la durée des arrêts effectués t’R.. tR = tO + t'R tR : temps mis par les barques pour atteindre l'arrivée tO : temps passé à naviguer t’R: temps des arrêts sur la rive. 2008-2009
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1 – Généralités
1 3 - Étude théorique et modélisation 1 3 1 – Modélisations A – Modélisation intuitive 2 – Retour à la chromatographie
barques = les différents solutés ; berge = la phase stationnaire ; la rivière = la phase mobile. (1) tR = to + t’R tR : temps correspondant à la sortie du soluté de la colonne : temps de rétention dans la colonne to : temps passé dans la phase mobile = temps mort t’R : temps passé dans la phase stationnaire. De même aucun soluté ne peut sortir avant le temps to, temps qui correspond au transport dans la phase mobile. t’R est le temps de rétention réduit du temps mort, c’est à dire tR - to 2008-2009
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1 – Généralités
1 3 - Étude théorique et modélisation 1 3 1 – Modélisations B – Analogie chromatographie / distillation Chromatographie de partage : Martin et Synge 1941 Liquide appauvri en soluté volatil
Vapeur enrichie en soluté volatil
À chaque niveau, partage du soluté - entre la phase liquide et la phase gazeuse (distillation) - entre la phase stationnaire et la phase mobile
Colonne de chromatographie 2008-2009
Colonne à plateau
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1 – Généralités
1 3 - Étude théorique et modélisation 1 3 1 – Modélisations B – Analogie chromatographie / distillation
Chromatographie de partage : Martin et Synge 1941 Liquide appauvri en soluté volatil
Vapeur enrichie en soluté volatil
Plateaux théoriques • Plus une colonne comporte de plateaux (théoriques), meilleure sera la séparation • Ou encore, plus la hauteur d’un plateau sera faible, meilleure sera la séparation
Colonne à plateau 2008-2009
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1 – Généralités
1 3 - Étude théorique et modélisation 1 3 1 – Modélisations B – Analogie chromatographie / distillation Remarque : représentation schématique d’une chromatographie
C
0 2008-2009
tR
tR Chromatographie
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Chromatographie
1 – Généralités
1 3 - Étude théorique et modélisation 1 3 2 – Le pic de chromatographie idéal
2008-2009
Chromatographie
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Chromatographie
1 – Généralités
1 3 - Étude théorique et modélisation 1 3 3 - Efficacité de la colonne et résolution A – Efficacité de la colonne séparation caractérisée par le nombre effectif de plateaux théoriques Neff . Plus ce nombre est élevé, meilleure est la séparation. On démontre que : tR2 L Neff
= ------- = σ2
1,2
11
--------H
Pic gaussien
σ σ
0,6 0,5
ϖ 1/2
σ
= ϖ1/2 / (8 Ln 2 )1/2
ou
H
=
L
/
N ϖ
avec L, longueur de la colonne (en cm) H, hauteur équivalente d’un plateau théorique (en cm) (HEPT) σt2, variance du pic (en unités de temps) 2008-2009
Chromatographie
tR
tR
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Chromatographie
1 – Généralités
1 3 - Étude théorique et modélisation 1 3 3 - Efficacité de la colonne et résolution A – Efficacité de la colonne 1,2
Neff peut également être calculé à partir de tR et de ω, ce dernier paramètre étant déterminé depuis l’intersection des tangentes au point d’inflexion avec la ligne de base. Neff = 16 tR2 / ω2
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Ainsi, pour une valeur de H de 12,5 µm et une longueur de 25 cm, on arrive à 15000 - 20000 plateaux théoriques effectifs. Souvent il est plus facile de mesurer la largeur du pic à mi hauteur ω1/2 : Comme σ = ω1/2 / (8 ln 2)1/2
Neff =
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L tR2 --------- = 5,54 . -----------H ω1/22 Chromatographie
Pic gaussien
σ σ
0,6 0,5
ϖ 1/2
ϖ
σ
= ϖ1/2 / (8 Ln 2)1/2
tR
tR
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Chromatographie
1 – Généralités
1 3 - Étude théorique et modélisation 1 3 4 - Efficacité de la colonne et résolution A – Efficacité de la colonne Calculer de H à partir de l’équation de Van Deemter (CPG initialement).
H = A
H = 2 . dP . λ
+
B / u
+ 2 . τ . DM
Η : hauteur d’un plateau théorique λ : régularité du remplissage dp : diamètre des particules
+
C
.
U
8 . k’ . e2 / u + --------------------------- . u 2 . (1 + k’)2 . DS
τ : facteur de tortuosité DM :: diffusivité de l’échantillon dans la phase mobile DS :: diffusivité de l’échantillon dans la phase stationnaire k’ : facteur de capacité e : épaisseur de la phase stationnaire (grains) u : vitesse linéaire de déplacement de la phase mobile 2008-2009
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Chromatographie
1 – Généralités
1 3 - Étude théorique et modélisation 1 3 4 - Efficacité de la colonne et résolution A – Efficacité de la colonne Calculer de H à partir de l’équation de Van Deemter (CPG initialement).
H =
A
H = 2 . dP . λ Hauteur d’un plateau théorique
+
B / u
+ 2 . τ . DM / u
+ +
C
.
u
8 . k’ . e2 --------------------------- . u 2 . (1 + k’)2 . DS
Α : diffusion de Eddy : facteur correspondant aux chicanes, aux chemins différents entre les molécules : diffusion turbulente B : facteur correspondant à la diffusion normale du liquide pendant l’analyse : diffusion longitudinale C : facteur correspondant à la diffusion dans la phase stationnaire : résistance au transfert de masse
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Chromatographie
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Chromatographie
1 – Généralités
1 3 - Étude théorique et modélisation 1 3 4 - Efficacité de la colonne et résolution A – Efficacité de la colonne Calculer de H à partir de l’équation de Van Deemter (CPG initialement).
H =
A
+
Α : facteur correspondant aux chicanes, aux chemins différents entre les molécules : diffusion turbulente
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B / u
+
B : facteur correspondant à la diffusion normale du liquide pendant l’analyse : diffusion longitudinale
Chromatographie
C
.
u
C : facteur correspondant à la diffusion dans la phase stationnaire : résistance au transfert de masse
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Chromatographie
1 – Généralités
1 3 - Étude théorique et modélisation 1 3 4 - Efficacité de la colonne et résolution A – Efficacité de la colonne Calculer de H à partir de l’équation de Van Deemter (CPG initialement).
H =
A
Hauteur d’un plateau théorique
+
B / u
+
C
.
u
Η
B/u
C.u A u
Conclusions : - existence d’un débit optimum pour obtenir une hauteur minimale d’un plateau théorique (nombre maximal de plateaux théoriques) - pour éviter la diffusion (élargissement des pics), il faut grains de faible diamètre (mais pertes de charge) - importance du remplissage Chromatographie de la colonne. 2008-2009 31
Chromatographie
1 – Généralités
1 3 - Étude théorique et modélisation 1 3 4 - Efficacité de la colonne et résolution B – Résolution
La résolution est, pour une colonne, la capacité de séparation de deux solutés. VR1 - VR2 Rs = 2 --------------------ω1 + ω2
ϖ1 VR1
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Chromatographie
ϖ2 VR2
VR 32
Chromatographie
1 – Généralités
1 4 – Divers temps d’une chromatographie sur colonne - Mise en contact des solutés avec la phase stationnaire (solutés susceptibles d’être fixés et solutés non susceptibles d’être fixés) : charge de la colonne - passage d’une phase mobile 1 : sortie de la colonne (élution) des solutés non susceptibles d’être fixés et obtention de l’éluat 1 (filtrat) - passage d’une phase mobile 2 : éluant vrai qui rompt les liaisons entre soluté et phase stationnaire (élution vraie) et obtention de l’éluat 2. VR 2008-2009
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Chromatographie
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Chromatographie
1 – Généralités
1 5 – Divers types de mise en œuvre d’une chromatographie en phase liquide - basse pression - moyenne / haute pression ; actuellement chromatographie haute performance (CLHP ou HPLC)
VR 2008-2009
Chromatographie
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Chromatographie 2 – Principes des méthodes de chromatographie Cours TB 2008 - 2009 2008-2009
Chromatographie
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Chromatographie 2 – Principe des méthodes de
chromatographie 2 1 – Chromatographie d’adsorption 2 2 – Chromatographie de partage 2 3 – Chromatographie par échange d’ions
3 – Méthodologie et applications 3 1 – Méthodologies 3 1 1 – Chromatographie sur colonne A - Chromatographie en phase liquide B - Chromatographie en phase gazeuse
3 1 2 – Chromatographie de surface A – Méthodologie générale
2 4 – Chromatographie par gel filtration
B – Différence
2 5 – Chromatographie par interactions biospécifiques
3 2 – Applications
2 6 – Chromatographie par interactions hydrophobes 2 7 – Chromatographie par chélation
3 2 1 – Séparation des acides aminés 3 2 2 – Séparation de médicaments par HPLC 3 2 3 – Séparation des protéines par FPLC
3 2 4 – Autres applications 2008-2009
Chromatographie
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Chromatographie 2 – Principe et utilisation des méthodes de chromatographie
2 1 – Chromatographie d’adsorption 2 1 1 − Principe : interaction 2 1 2 − Phase stationnaire 2 1 3 − Phase mobile 2 1 4 − Conditions de fixation et d’élution 2 1 5 − Utilisation
2 2 – Chromatographie de partage 2 3 – Chromatographie par échange d’ions 2 4 – Chromatographie par gel filtration 2 5 – Chromatographie par interactions biospécifiques 2 6 – Chromatographie par interactions hydrophobes 2 7 – Chromatographie par chélation (IMAC = Immobilised metal affinity chromatography ») 2008-2009
Chromatographie
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Chromatographie 2 – Principe des méthodes de chromatographie
2 1 – Chromatographie d’adsorption 2 1 1 − Principe Fixation, en général, par des liaisons liées à la polarité
Ο Η Support solide
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δ−
δ+
Η
δ−
Ο
δ+
Support solide Adsorption
Chromatographie
Désorption = remplacement par une autre molécule
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Chromatographie 2 – Principe des méthodes de chromatographie
2 1 – Chromatographie d’adsorption 2 1 2 − Phase stationnaire, Solide insoluble, finement divisé, "actif " (capable de fixer des solutés) - polaire : gel de silice (Kieselguhr), alumine : ces supports sont à « activer ».
- non polaire : carbone actif - sels de calcium : phosphate tricalcique, hydroxyapatite pour les protéines 2 1 3 − Phase mobile Liquide (CPL) ou gazeuse (CPG) Réalise la rupture des liaisons soluté - phase stationnaire (phénomène de désorption) 2008-2009
Chromatographie
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Chromatographie 2 – Principe des méthodes de chromatographie
2 1 – Chromatographie d’adsorption 2 1 4 − Conditions de fixation et d’élution - Cas des liaisons polaires : par ordre d'adsorption croissante, esters, cétones et aldéhydes, alcools et les amines, acides et les bases
Utilisation de gradients de solvants organiques polaires - Cas des protéines : gradient croissant de tampon phosphate
2008-2009
Chromatographie
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Chromatographie 2 – Principe des méthodes de chromatographie
2 1 – Chromatographie d’adsorption 2 1 5 − Utilisation - utilisée pour la séparation des molécules organiques de masse moléculaire
inférieure à 1000 g.mol-1 dans le domaine pharmaceutique et alimentaire : * fixation des colorants des vins et jus de fruits qui pourraient gêner telle ou telle méthode analytique. (phase liquide, échelle analytique) * fixation de substances pyrogènes existant dans une solution destinée à l’usage parentéral. (phase liquide, échelle industrielle) * séparation des acides gras (méthylés) (phase gazeuse, échelle analytique). -gel d'hydroxyapatite et le phosphate tricalcique utilisés pour la séparation des protéines ; techniques concurencées par la chromatographie d’interactions hydrophobes -- mise en œuvre en basse presioon, CLHP, et chromatographie de surface 2008-2009
Chromatographie
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Chromatographie 2 – Principe des méthodes de chromatographie
2 1 – Chromatographie d’adsorption Type d'interaction
Phase stationnaire
Phase mobile
Conditions d'élution
Fixation de solutés sur un support solide par ADSORPTION - Liaisons polaires (le plus souvent) - Liaisons non polaires (cas du carbone actif)
Solide insoluble, finement divisé, "actif " capable de fixer des solutés) - polaire : gel de silice (Kieselguhr), alumine Ces supports sont à activer - non polaire : carbone actif - sels de calcium : phosphate tricalcique, hydroxyapatite pour les protéines
Liquide (CPL) ou gazeuse (CPG) Réalise la rupture des liaisons soluté phase stationnaire (phénomène de désorption)
- Cas des liaisons polaires : par ordre d'adsorption croissante, on a les esters, puis les cétones et aldéhydes, puis les alcools et les amines et enfin les acides et les bases Utilisation de gradients de solvants organiques polaires - Cas des protéines : gradient croissant de tampon phosphate
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Chromatographie
Mise en œuvre et Applications - Sur colonne (CPL, CPG) - Sur couche mince (CCM) - Molécules organiques (M < 1000 g.mol-1) comme métabolites, médicaments - Séparation d'hydrocarbures sur carbone actif - Protéines : recherche (ancien)
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Chromatographie 2 – Principe des méthodes de chromatographie
2 2 – Chromatographie de partage 2 2 1 − Principe 2 2 2 − Supports 2 2 3 − Conditions de fixation et d’élution
2 2 4 − Utilisation 2008-2009
Chromatographie
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Chromatographie 2 – Principe des méthodes de chromatographie
2 2 – Chromatographie de partage 2 2 1 − Principe
Sol
Sol
Support Phase solide stationnaire
Phase mobile
phases normales
Solubilisation dans une phase liquide polaire (adsorbée sur un support solide)
phases inverses
Solubilisation dans une phase liquide apolaire adsorbée sur un support ou fixation sur des radicaux hydrophobes fixés sur un support solide
2008-2009
Chromatographie
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Chromatographie 2 – Principe des méthodes de chromatographie
2 2 – Chromatographie de partage φ n o r m a l e s φ i n v e r s e s
Solubilisation dans une phase liquide (adsorbée sur un support solide)
Solubilisation dans une phase liquide adsorbée sur un support ou radicaux hydrophobes fixés sur un support solide
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Liquide polaire : eau, par exemple
- Liquide apolaire plus ou moins visqueux - Chaînes hydrocarbonées en C8, C16, C18, phényl, …fixées sur de billes de silice, agarose, résine ou verre
Solvants organiques peu polaires
Solvants organiques plus polaires que la phase stationnaire
Chromatographie
Gradient de polarité croissante
Gradient de polarité décroissante
- Sur colonne (CPL, CPG) - Sur couche mince (CCM) - Petites molécules polaires comme les acides aminés
- Sur colonne (CPL, CLHP) - Petites molécules apolaires, comme des dérivés d'acides aminés
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Chromatographie 2 – Principe des méthodes de chromatographie
2 2 – Chromatographie de partage 2 2 2 − Supports - terme "support" à préciser : matériau inerte qui sert de fixateur (inerte) à la phase stationnaire liquide. Il permet à cette phase stationnaire d’être en un état physique liquide. = support à bien distinguer ici de la phase stationnaire. - supports = solides finement divisés qui présentent une très grande surface, ceci afin de retenir dans un petit volume une grande quantité de phase liquide ; rétention énergique de phase stationnaire, sans interaction avec les solutés ; les propriétés d’adsorption doivent être totalement masquées.
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Chromatographie
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Chromatographie 2 – Principe des méthodes de chromatographie
2 2 – Chromatographie de partage 2 2 2 − Supports - utilisation possible de la plupart des phases stationnaires de la chromatographie d’adsorption sous forme poreuse ou pelliculaire.
gel de silice très souvent employé car peut retenir jusqu’à 70 % de son poids d’eau ; grande capacité et bonne rétention des solvants mais garde certaines propriétés d’adsorption.. Terre de diatomées, autre support siliceux, naturel (squelette siliceux d’infusoires ou Kieselguhr ou célite) ; peut retenir de grandes quantités de solvant, même polaires.
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Chromatographie
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Chromatographie 2 – Principe des méthodes de chromatographie
2 2 – Chromatographie de partage 2 2 2 − Supports - billes de verres ; billes de silice ; peuvent faire l’objet de greffage de groupements fonctionnels facilitant la fixation de la phase stationnaire : réalisation d’une « silanation », c’est à dire traitement par des dérivés permettant la fixation de groupements hydrophobes (C6, C8, C16 et C18) = utilisation en phases inverses. - sont également utilisables, la poudre de cellulose et un certain nombre de polymères synthétiques dérivés du vinylbenzène.
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Chromatographie
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Chromatographie 2 – Principe des méthodes de chromatographie
2 2 – Chromatographie de partage 2 2 3 − Les phases stationnaires et mobiles A - Les phases stationnaires 1 - Chromatographie en phases normales -phase stationnaire liquide (assez) polaire : classiquement (Martin et Synge) des solutions aqueuses alcalines, acides ou tamponnées, de méthanol ou d’éthanol - simplement eau, - aussi de substances visqueuses : étheroxydes rendus très polaires par la présence de groupements hydroxyles ou nitrile : éthers, glycols, polyéthylène glycols, ββ‘ oxydipropionitrile.
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Chromatographie
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Chromatographie 2 – Principe des méthodes de chromatographie
2 2 – Chromatographie de partage 2 2 3 − Les phases stationnaires et mobiles A - Les phases stationnaires 2 - Chromatographie en phases inverses
- phase stationnaire peu polaire ou apolaire -chromatographie en phase gazeuse : polyesters de glycols, de polyethers de glycols, de silicones, de carbures saturés ; - chromatographie en phase liquide : chaînes alkyles en C8 et C18 greffées sur de la silice - d’une manière générale, phases stationnaires préparées par imprégnation (par exemple, en présence de solvant volatil) ou par greffage (utilisation des dérivés halogénés du silane).
2008-2009
Chromatographie
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Chromatographie 2 – Principe des méthodes de chromatographie
2 2 – Chromatographie de partage 2 2 3 − Les phases stationnaires et mobiles B - Les phases mobiles - choix et conditions d’emploi d’une phase mobile : mêmes considérations générales que celles de la chromatographie d’adsorption. : - pouvoir solvant et inertie chimique vis à vis des solutés - compatibilité avec les systèmes de détection - inertie chimique et insolubilité vis à vis de la phase stationnaire
- Attention : une non miscibilité rigoureuse difficile à obtenir : saturation des phases les unes dans les autres par des contacts préalables : mélange des solvants dans une ampoule à décanter et séparation ultérieure.ou, en CLHP, passage du solvant dans une précolonne, avant le système d’injection, chargée de phase stationnaire.
2008-2009
Chromatographie
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Chromatographie 2 – Principe des méthodes de chromatographie
2 2 – Chromatographie de partage
2 2 3 − Les phases stationnaires et mobiles B - Les phases mobiles
-En chromatographie de partage phases normales, phase stationnaire = eau et phase mobile = butanol, d’alcool benzylique, de chloroforme ou de toluène. En CLHP, on utilise les pentane, cyclohexane, hexane (purs ou additionnés de chloroforme), dichlorométhane, tétrahydrofurane, chloroforme, dioxanne, éther butylique, nitrométhane, hexane méthanol.
- En chromatographie en phases inversées, phase mobile (plus) polaire = eau, méthanol (CH3-OH), acétonitrile (CH3-CN) ou mélange de ces solvants.
2008-2009
Chromatographie
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Chromatographie 2 – Principe des méthodes de chromatographie
2 2 – Chromatographie de partage 2 2 4 − Utilisation - utilisée sur colonne, sur papier, sur couche mince et en phase gazeuse. - sert à la séparation de molécules organiques de masse moléculaire inférieure à 1000 g.mol-1 - séparation d’antibiotiques, des substances anticancéreuses, des métabolites, de substances prohibées (drogues, substances « dopantes », ..…) - Phases normales (composés polaires)ou phases inverses (composés plus hydrophobes) - Remarque : une variante, la chromatographie par (de) paires d’ions (voir plus loin)
R1
+
R2 2008-2009
+
−
R3
R1
R4
R2
Échantillon moins hydrophobe Chromatographie
R3
+−
R4 Complexe hydrophobe 54
Chromatographie 2 – Principe des méthodes de chromatographie
2 3 – Chromatographie par échange d’ions 2 3 1 − Principe 2 3 2 − Supports 2 3 3 − Conditions de fixation et d’élutions
2 3 4 − Utilisation 2008-2009
Chromatographie
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Chromatographie 2 – Principe des méthodes de chromatographie
2 3 – Chromatographie par échange d’ions 2 3 1 − Principe
- solutés liés à la phase stationnaire par des liaisons ioniques
phase stationnaire = macromolécules échangeuses d'ions, solide -phase mobile
= tampon de pH et de force ionique définis :
fait cesser les interactions entre solutés et phase stationnaire
2008-2009
Chromatographie
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Chromatographie 2 – Principe des méthodes de chromatographie
2 3 – Chromatographie par échange d’ions 2 3 1 − Principe Support (Su)
Mélange à séparer
−
−
− + − +++ + ++ + + − + + + +++ − − −
− −
Groupement charge ici positiveπορτευρ δε
− Λιβρατιον δε λα πηασε σολιδε (δσορπτιον)
Extraction - purification des enzymes 2005 - 2006
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Chromatographie 2 – Principe des méthodes de chromatographie
2 3 – Chromatographie par échange d’ions 2 3 1 − Principe −
−
−
− − −
+ +++ + ++ + + + ++ +++ − −
− −
− − − − − − + + + + + −− − ++ − + + +++ − − + − −− + − −
−
Μλανγε ◊ σπαρερ αυ χονταχτ δε λα πηασε στατιονναιρε
Φιξατιον δε λα προτινε (↔ αδσορπτιον ≈) αυ σενσ λαργε
Extraction - purification des enzymes 2005 - 2006
− − − − −
− − − − − −
Λιβρατιον δε λα πηασε σολιδε (δσορπτιον) par augmentation du pH
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Chromatographie 2 – Principe des méthodes de chromatographie
2 3 – Chromatographie par échange d’ions
2 3 2 − La phase stationnaire : les échangeurs d’ions A - Les groupements fonctionnels : les 2 types d'échangeurs
Selon le type de charge de l’ion échangé, et la charge de l’échangeur, on distingue : - échangeurs d’anions - échangeurs de cations. 1-
les échangeurs d'anions, échangeurs sous forme cationique
Su-A+ Ye- + Xssupport chargé + Ye- =
2008-2009
Su-A+ Xe-
soluté
+ Ys-
soluté fixé
contre ion
Chromatographie
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Chromatographie 2 – Principe des méthodes de chromatographie
2 3 – Chromatographie par échange d’ions
2 3 2 − La phase stationnaire : les échangeurs d’ions A - Les groupements fonctionnels : les 2 types d'échangeurs
1 - les échangeurs d'anions, échangeurs sous forme cationique Exemples de groupements fonctionnels porteurs de charge positive : en général d’amines I, II, III, IV groupements les plus classiques pour les protéines : groupements DEAE et TEAE. - CH2 - CH3 DEAE, Su O- CH2 - CH2 - N - CH2 - CH3 (échangeur faible, non ionisé à certains pH, pH acides) - CH2 - CH3 pKA = 9,5 - CH2 - CH3 Su O- CH2 - CH2 - N + H+ S O- CH2 - CH2 - N+ - H - CH2 - CH3 - CH2 - CH3 - CH2 - CH3 + TEAE, Su O- CH2 - CH2 - N - CH2 - CH3 - CH2 - CH3 (échangeur fort, ionisé à tous les pH) 2008-2009
Chromatographie
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Chromatographie 2 – Principe des méthodes de chromatographie
2 3 – Chromatographie par échange d’ions 2 3 2 − La phase stationnaire : les échangeurs d’ions A - Les groupements fonctionnels : les 2 types d'échangeurs
2 - Les échangeurs de cations, sous forme anionique Su-A- Ye+ + support chargé -
Xs+
Su-A- Xe+
soluté
+ Ys+
soluté fixé
Ye+ = contre ion
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Chromatographie
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Chromatographie 2 – Principe des méthodes de chromatographie
2 3 – Chromatographie par échange d’ions
ECH ANG E D'IO NS
Fixation de solutés par des liaisons ioniques entre charges opposées (faiblement énergétique)
2008-2009
Billes de composés organiques naturels (dextrane, cellulose, …), synthétiques (polyacrylamide, résines, …) ou minéraux (verre, silice, …) avec greffage de groupements ionisés ou ionisables échangeant des anions ou des cations - Anions : DEAE, AE, … - Cations : CM, SP, …
Liquide : tampons (Tris, phosphate, citrate, …) de pH et de µ donnés variant lors de l'élution
Chromatographie
Gradient de pH (discontinu) et / ou de force ionique croissante (discontinu ou continu)
- Sur colonne (CPL, CLHP) - Séparation d'ions (acides aminés, …) et de macroions (protéines, acides nucléiques, …)
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Chromatographie 2 – Principe des méthodes de chromatographie
2 3 – Chromatographie par échange d’ions 2 3 2 − La phase stationnaire : les échangeurs d’ions A - Les groupements fonctionnels : les 2 types d'échangeurs
2 - les échangeurs de cations, sous forme anionique Exemples de groupements fonctionnels : -SO3-, - COO-, SP, CM
SP : sulfopropyle CM carboxyméthyle
Su - CH2 - CH2 - CH2 -SO3Su - CH2 – COO-
Remarque : certains échangeurs avec les 2 types.(en particulier pour la désionisation de l’eau)
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Chromatographie
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Chromatographie 2 – Principe des méthodes de chromatographie
2 3 – Chromatographie par échange d’ions 2 3 2 − La phase stationnaire : les échangeurs d’ions B - Les supports 1 - Supports organiques a - Polymères synthétiques b - Polymères naturels α - Dérivés du dextrane ß - Dérivés de la cellulose γ - Dérivés de l’agarose δ - Dérivés mixtes
Document
2 - Supports minéraux
2008-2009
Chromatographie
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Chromatographie 2 – Principe des méthodes de chromatographie
2 3 – Chromatographie par échange d’ions 2 3 3 − Conditions de fixation et d’élutions A - Fixation - choix de la nature (forme anionique ou cationique) de l’échangeur utilisé - pH tel que les solutés se fixent - fixation en présence d’un tampon de faible force ionique
B - Elution - modification des interactions électrostatiques entre soluté et phase stationnaire : changement de pH et/ou de force ionique. - en discontinu ou en continu.
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Chromatographie
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Chromatographie 2 – Principe des méthodes de chromatographie
2 3 – Chromatographie par échange d’ions 2 3 4 − Utilisation
- utilisée pour la séparation de toutes substances porteuses de charges électriques (acides aminé, protéines, …) - particulièrement important pour les protéines (supports hydrophiles).
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Chromatographie
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Extraction - purification des enzymes 2005 - 2006
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Charge + des protéines (cations) : séparation sur échangeur - (sur échangeur de cations)
CM
Charge - des protéines (anions) : séparation sur échangeur + (sur échangeur d’anions)
DEAE
Extraction - purification des enzymes 2005 - 2006
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Chromatographie 2 – Principe des méthodes de chromatographie
2 4 – Chromatographie par gel filtration 2 4 1 − Principe 2 1 2 − Supports 2 1 3 − Conditions de fixation et d’élutions
2 1 4 − Utilisation 2008-2009
Chromatographie
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Chromatographie 2 – Principe des méthodes de chromatographie
2 4 – Chromatographie par gel filtration - également appelée chromatographie de perméation de gel, chromatographie d'exclusion - diffusion - origine : mise sur le marché d'un gel hydrophile de dextrane artificiellement réticulé, le SEPHADEXTR, suite aux travaux en 1959 par PORATH et FLORKIN.
2008-2009
Chromatographie
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Chromatographie 2 – Principe des méthodes de chromatographie
2 4 – Chromatographie par gel filtration
GEL FILT RAT ION
Type d'interaction
Phase stationnaire
Phase mobile
ABSENCE d'interactions au sens strict Diffusion plus ou moins grande dans un support poreux : les molécules les plus grosses sont éluées les premières
Liquide contenu dans les billes poreuses dont la matière constitue le support Les supports sont des composés organiques naturels (dextrane, agarose, …), synthétiques (polyacrylamide, résines, …) ou des composés minéraux (verre ou silice)
Liquide : tampons (Tris, phosphate, citrate, …) de pH et µ donnés
2008-2009
Chromatographie
Conditions d'élution
Simple percolation de la colonne par un tampon adéquat, sans modification au cours de l'élution (élution isocratique)
Mise en œuvre et Applications - Sur colonne (CPL, CLHP) - Séparation de macromolécules (ADN, protéines, …) selon leur taille - Détermination de M par la représentation : Kav = - log M + b
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Chromatographie 2 – Principe des méthodes de chromatographie
2 4 – Chromatographie par gel filtration 2 4 1 − Principe - pas de liaison entre soluté et phase stationnaire = pas, ici, de "rétention« - comportement différent des molécules du fait de leur diffusion ou non à l’intérieur d’une matrice poreuse = tamisage moléculaire inverse dans un gel = sortie en premier des grosses molécules, exclues des billes d'un gel, ; en dernier, les petites qui ont diffusé = SEPARATION du fait de cette diffusion plus ou moins grande Remarques : .
- séparation selon la taille des molécules d’un type de forme déterminé (en général forme globulaire) - possibilité de déterminer les masses moléculaires. 2008-2009
Chromatographie
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Chromatographie
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ve
vo vt
2008-2009
Chromatographie
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Chromatographie 2 – Principe des méthodes de chromatographie
2 4 – Chromatographie par gel filtration 2 4 1 − Principe A - La phase stationnaire
- constituée de grains de gel pourvus de pores de diamètres variables, ceci dans une gamme permettant la diffusion des solutés de masses moléculaires déterminées. - pores de plus faible diamètre (diamètre minimal) - pores de plus grand diamètre (diamètre maximal) - ensemble de pores de diamètres intermédiaires
- un support de gel filtration ne permet la séparation que dans une gamme déterminée de masses moléculaires.
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Chromatographie
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Chromatographie 2 – Principe des méthodes de chromatographie
2 4 – Chromatographie par gel filtration 2 4 1 − Principe B -La phase mobile : - ne fait pas cesser des interactions entre solutés et phase stationnaire qui n’existent pas - rôle : simplement à assurer le déplacement linéaire des solutés . -simple liquide qui passe à travers la phase stationnaire = liquide qui permet de garder les molécules dans leur état natif, c’est à dire d’un simple tampon dans le cas des protéines
Copie 2008-2009
Chromatographie
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Chromatographie 2 – Principe des méthodes de chromatographie
2 4 – Chromatographie par gel filtration 2 4 2 − Supports - par définition, poreux - conditionnés sous forme de billes, pour faciliter le passage de la phase mobile, c’est à dire diminuer les pertes de charge et éviter le colmatage - peuvent être organiques, minéraux ou mixtes. Documents
2008-2009
Chromatographie
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Chromatographie 2 – Principe des méthodes de chromatographie
2 4 – Chromatographie par gel filtration 2 4 3 − Conditions de séparation A - Description schématique du phénomène Supposons le gel immobilisé dans une colonne. Le comportement des solutés se divise en 3 classes de comportements : 1 - Les grosses molécules 2 - Les petites molécules 3 - Les molécules de taille intermédiaire Conclusion : Il y a pour chaque gel un domaine de masse moléculaire : - en dessous duquel il n'y a aucune séparation - au dessus duquel il n'y a aucune séparation - la séparation ne se réalise que dans un domaine de masse moléculaire spécifique du gel considéré (en fait, il correspond au diamètre maximum (moyen) et minimum (moyen) des pores). 2008-2009
Chromatographie
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Mélange initial
CONSTITUANTS NON SEPARES CONSTITUANTS NON SEPARES
1 - Les grosses molécules 2 - Les petites molécules 3 - Les molécules de taille intermédiaire Conclusion :
Seule séparation
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Chromatographie
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Chromatographie 2 – Principe des méthodes de chromatographie
2 4 – Chromatographie par gel filtration
2 4 3 − Conditions de fixation et d’élution B - Quantification ; détermination des masses moléculaires 1 - Les divers volumes a – Description : définition des divers volumes
α - Vo : volume mort Aucune substance ne peut sortir avant ce volume : Vo, volume mort de la colonne Il correspond au volume de phase mobile entre les grains du gel ß - Vt : volume total de la colonne Vt = volume du soluté correspondant à la percolation totale de la colonne (extérieur et intérieur des billes) γ - Ve : volume d'élution ; valeur intermédiaire entre vo et vt
2008-2009
Chromatographie
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Chromatographie 2 – Principe des méthodes de chromatographie
2 4 – Chromatographie par gel filtration
2 4 3 − Conditions de fixation et d’élution B - Quantification ; détermination des masses moléculaires 1 - Les divers volumes b – Interprétation de ces divers volumes
Vo : volume entre les grains Ve : volume d'élution de la substance étudiée VT : volume total, c’est à dire somme des volume mort Vo, volume des grains Vg, volume et volume de liquide dans les grains Vs. REMARQUES : - Vo et VT se retrouvent dans tous les types de chromatographie (cf caractères généraux) - Vo et VT sont caractéristiques d’une colonne remplie d’une phase stationnaire donnée, percolée avec une phase mobile à un débit donné ; il y a changement de ces divers volumes caractéristiques d'une colonne selon les conditions : débit de phase mobile, pression, phase mobile, température……d’où nécessité de l’utilisation d’un paramètre caractérisant la diffusion d’un soluté indépendamment de ces conditions ce sera KD. 2008-2009
Chromatographie
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Approche de la valeur de Vs à partir de l’expression du volume total de la colonne
Vt = Vo + Vs + Vg
Vs
Vg
Vo 2008-2009
Chromatographie
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CONSTITUANTS NON SEPARES CONSTITUANTS NON SEPARES
ve
vo vt
1 - Les grosses molécules 2 - Les petites molécules 3 - Les molécules de taille intermédiaire Conclusion : Séparation 2008-2009
Chromatographie
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Chromatographie 2 – Principe des méthodes de chromatographie
2 4 – Chromatographie par gel filtration
2 4 3 − Conditions de fixation et d’élution B - Quantification ; détermination des masses moléculaires 2 - Le coefficient de diffusion KD, le coefficient de diffusion accessible : Kav a - Le coefficient de diffusion KD α - Définition du coefficient de diffusion KD
coefficient de diffusion KD d’un soluté : rapport du volume de soluté supérieur à Vo (soit Ve - Vo) sur le volume contenu dans les grains Vs. Ve - Vo KD = ---------------Vs
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Chromatographie
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Chromatographie 2 – Principe des méthodes de chromatographie
2 4 – Chromatographie par gel filtration
2 4 3 − Conditions de fixation et d’élution B - Quantification ; détermination des masses moléculaires a - Le coefficient de diffusion KD ß - Propriétés du coefficient de diffusion On démontre que KD = ß - α . log MM , d’où KD 1
0
Log MM 2008-2009
Chromatographie
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KD
1 0
Log MM
Mais ceci concerne KD et log MM, avec KD =
Ve - Vo ---------------Vs
Or, pour déterminer KD, il faut connaître Vs. ……… ce qui n’est pas le cas ……….. d’où une approche de la valeur de Vs, par exemple, à partir de l’expression du volume total de la colonne 2008-2009
Chromatographie
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Chromatographie 2 – Principe des méthodes de chromatographie
2 4 – Chromatographie par gel filtration
2 4 3 − Conditions de fixation et d’élution B - Quantification ; détermination des masses moléculaires b - Le coefficient de diffusion accessible KAV
Vt = Vo + Vs + Vg d’où Vs = Vt - Vo - Vg Or Vg est négligeable. On peut donc admettre que Vs = Vt - Vo détermination du coefficient de diffusion; alors appelé coefficient de diffusion accessible ... Kav (available = accessible)
Kav 2008-2009
Ve - Vo = --------------Vt - Vo Chromatographie
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ve
v
vo vt
Log kDa
Kav 2008-2009 Copie
Chromatographie
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Courbes théoriques Courbes expérimentales KAV
log MM
1
0
log MM
et 2008-2009
Log MM
0
1
KAV
= - c . Ve + d
Chromatographie
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Chromatographie 2 – Principe des méthodes de chromatographie
2 4 – Chromatographie par gel filtration
2 4 3 − Conditions de fixation et d’élution B - Quantification ; détermination des masses moléculaires c - Détermination de masse moléculaire par chromatographie de gel filtration
diverses opérations à réaliser : - Détermination de Vo et Vt avec des substances appropriées - Passage de substances étalons (dans de domaine de séparation) ; réalisation des calculs de Kav ; construction de la courbe - passage de la substance à analyser ; calcul de Kav et report sur la courbe
2008-2009
Chromatographie
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Détermination de masse moléculaire par chromatographie de gel filtration 1/2 1 - Détermination de vo et vt avec des substances appropriées
2 - Passage de substances étalons (dans le domaine de séparation) ; réalisation des calculs de Kav ; construction de la courbe Kav Calcul des Kav
Log kDa Copie2008-2009
Chromatographie
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Détermination de masse moléculaire par chromatographie de gel filtration 2 / 2
3 - Passage de la substance à analyser ; calcul de Kav et report sur la courbe Kav Calcul du Kav
Kav
Log kDa Log kDaX
Copie2008-2009
Chromatographie
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Expérience de dessalage
Extraction - purification des enzymes 2005 - 2006
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Extraction - purification des enzymes 2005 - 2006
96
Extraction - purification des enzymes 2005 - 2006
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Chromatographie 2 – Principe des méthodes de chromatographie
2 4 – Chromatographie par gel filtration 2 4 4 − Utilisation - initialement développée pour la séparation des protéines • séparation • détermination de la masse moléculaire, en concurrence avec l'électrophorèse en gel de polyacrylamide en milieu dénaturant - dessalage des solutions protéiques - concentration des solutions protéiques (en batch).
2008-2009
Chromatographie
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Chromatographie 2 – Principe des méthodes de chromatographie
2 5 – Chromatographie par interactions biospécifiques (chromatographie d’affinité)
2 5 1 − Principe A - Généralités - condition sine qua non : soluté à séparer (protéine) capable de se fixer réversiblement à un ligand spécifique qui est attaché à une matrice insoluble. M + L
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