CG, HPLC y em

 

MÉTODOS DE CUANTIFICACIÓN, CROMATOGRAFÍA DE GASES, LÍQUIDA CROMATOGRAFÍA CROMATOGRAFÍA Y ESPECTROMETRÍA DE MASAS

 

MÉTODOS DE Límite de cuantifcación

Concentración mínima de un analito que puede ser cuantifcada en una matriz real, la cual es tratada siguiendo todas las etapas del método empleado, produciendo una señal cuantifcable con una nivel de confanza defnido.

CUANTIFICACIÓN

Precisión

Grado de concordancia de un grupo de resultados entre sí. Dispersión de estos resultados alrededor de su media.

Replicabilidad Repetibilidad Reproducibilidad

Validación

Corresponde al intervalo de concentración más fable de medida para la determinación analítica del analito.

Establece por medio de estudios científcos, que un método tiene las características de desempeño que son adecuadas para cumplir los requerimientos de las aplicaciones analíticas pretendidas. Especifcidad

Exactitud

Expresa la cercanía entre el valor que es aceptado, como un valor de reerencia (material de reerencia certifcado) y el valor encontrado (valor promedio) obtenido al aplicar el procedimiento de análisis un cierto número de veces. Determinada en error.

Linealidad

Límite de detección

Basado en el cociente entre la magnitud de la señal de la medida y el ruido de ondo producido por el instrumento o por el blanco analítico.

IUPAC Instrumental Método

Intervalo de valores en que puede encontrarse un resultado, una media de los mismos y el valor considerado verdadero.

 

VALIDACIÓN DE UN MÉTODO Etapas para desarrollar un

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1) Búsq Búsque ueda da bibl biblio iogr gráf áfca ca

La validación de procedimientos analíticos requiere: Instrumentos califcados y

2) Defn Defnir ir co cond ndic icio ione ness - Equipo -Reactivos -Muestreo

calibrados. Métodos documentados. Patrones de reerencia confables.

método analítico



3) Esta Estand ndar ariz izar ar el méto método do -Encontrar las condiciones óptimas 4) Valid alidac ació iónn de dell méto método do



Analistas califcados. Integridad de la muestra La validación de un método analítico representa parámetros que nos permite obtener resultados más confables. 

 

¿QUÉ ES LA CROMATOGRAFÍA? Es un método ísico de separación en De acuerdo a su utilidad la

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el cual los componentes a ser separados son distribuidos entre dos ases, una de las cuales es estacionaria mientras la otra se mueve en una dirección defnida.

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cromatograía se clasifca en: analítica, utilizada para determinar los químicos presentes en una mezcla y en que concentración; y preparativa, utilizada para purifcar grandes cantidades de químicos. Además tenemos:

  •

Es clasifcada por su utilidad y en base al material que se utilice como eluyente para separar los solutos.

Cromatograía de columna Cromatograía de papel Cromatograía de capa fna Cromatograía líquida de alta resolución Cromatograía de gases

 

CROMATOGRAFÍA DE GASES

 

CROMATOGRAFÍA DE GASES (Principio fisicoquímico) •

Es una técnica analítica que puede ser utilizada para separar compuestos orgánicos basada en sus volatilidades. También provee inormación cualitativa y cuantitativa cuantitativa de los componentes presentes en una mezcla. Los componentes son separados por sus dierencias de partición entre la ase móvil gaseosa y la ase estacionaria en la columna, permitiendo que sean separados en tiempo y espacio.

 

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CROMATOGRAFÍA DE GASES (Principio Existen dos tipos de cromatograía de gases: fisicoquímico) La cromatografía gas - líquido tiene gran aplicación en todos los

campos de la ciencia y su denominación se abrevia normalmente como cromatograía de gases (GC). La cromatograía gas - líquido se basa en la distribución del analito entre una ase móvil gaseosa y una ase líquida inmovilizada sobre la superfcie de un sólido inerte. La cromatografía gas - sólido se basa en una ase estacionaria sólida en la cual se produce la retención de los analitos como consecuencia la adsorción ísica. a la retención de semipermanente de lasAplicación moléculaslimitada activas odebido polares y a la obtención de picos de elución con colas (una consecuencia del carácter no lineal del proceso de adsorción), de modo que esta técnica no ha encontrado una gran aplicación excepto peso molecular. para la separación de ciertas especies gaseosas de bajo

 

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CROMATOGRAFÍA DE GASES (Equipo, Un cromatógrao de gases consiste en varios módulos Cromatógrafo)

 básicos ensamblados para: 1) Prop Proporc orciona ionarr un gasto gasto o ujo cconst onstante ante del del gas

transportador (ase móvil). 2) Pe Permitir rmitir llaa intro introducción ducción de vvapores apores de la muestra en la corriente de gas que uye. 3) Contener la longitu longitud d aapropia propiada da de ase ase estacionaria. estacionaria. 4) secuencia Mant Mantener ener del la co column lumnaa a ladetempe temperatu ratura ra apropi apropiada ada (o la programa temperatura). 5) Detect Detectar ar lo loss comp componentes onentes de la muestra conorme eluyen eluyen de la columna. 6) cantidad Prov Proveer eer un una señalcomponente. legibl legiblee prop proporciona orcionall en m magnitu agnitud d a llaa dea cada

 

CROMATOGRAFÍA DE GASES (Equipo, Cromatógrafo) Un cromatógrao de gases consiste de: 1. Fase móvil. 2. Puerto de inyección. 3. Horno de la columna. 4. Columnas 5. Fase estacionaria. 6. Detector.  7. Sistema de registro de datos

 

CROMATOGRAFÍA DE GASES (Equipo, Cromatógrafo)

1) Fase móvil (mobile phases) Gaseosa, líquida o uido supercrítico (potencia disolvente de los uidos a temperaturas y presiones superiores al punto crítico). Estas ases son generalmente gases inertes como Helio, Argón o Nitrógeno. 2) Puerto de inyección (inyection port) Es un dispositivo que permite la introducción de la muestra en la corriente del gas portador.

 

CROMATOGRAFÍA DE GASES (Equipo, 3) Cromatógrafo) En el interior se sitúa la columna, donde Horno de la columna

se debe tener una buena regulación de la temperatura. Dentro del horno la columna se conecta en un extremo al puerto de inyección, y en el otro al detector. La columna debe estar en el centro del horno sin tener contacto con las paredes.

4) Fase estacionaria (stacionary phase) Es la encargada de separar los componentes de la muestra. Esta puede ser un sólido o un líquido, dispuestos sobre un sólido que actúa como soporte (columna). El sólido de la ase estacionaria puede ser de aluminio, sílica gel, carbón o tierra de diatomeas; y el líquido líqui do de la ase estacionaria debe tener una  baja viscosidad y una alta y dierencial solubilidad. 5) Soporte (Support) Sostener ase estacionaria. El soporte de tener elevada superfciequímica por unidad delavolumen, estabilidad térmica,debe dureza mecánica, inactividad y baja resistencia al paso de un gas.

 

CROMATOGRAFÍA DE GASES (Equipo, 6) Columna cromatográca Cromatógrafo) Las columnas están hechas de cobre, acero inoxidable o tubos de vidrio, dobladas o enrrolladas.

Excepto de vidrio,mientras las columnaspara sonlas empacadas se están doblando. Las columnas analíticas tienen una longitud de 1-6 m. de longitud y de 2-4 mm. de diámetro. 7) Detectores Los detectores son dispositivos que indican y miden los solutos en la corriente del gas acarreador, convirtiendo una señal no medible directamente en una señal elaborable de una propiedad ísica. Esta señal es elaborada por una comparación entre el gas acarreador puro (blanco) y el mismo gas llevando cada uno de los componentes previamente separados en la columna, esto es traducido en una señal eléctrica que es amplifcada y registrada al momento de salir de la columna.

 

CROMATOGRAFÍA DE GASES (Equipo, Cromatógrafo)

7) Detectores Un buen detector es altamente sensible (sensibilidad), tiene una respuesta lineal (linearidad) sobre un amplio rango de concentración y es relativamente insensible a variaciones de ujo y temperatura (rango

dinámico lineal). Pueden ser clasifcados por: • Grado de selectividad: universales que responden a la mayoría de los solutos; específcosselectivos con respuesta a un grupo particular de sustancias. • Recuperación de la muestra: en reerencia a si la muestra es destruída o no. • Modo de respuesta: dependientes de ujo de masa (cantidad de soluto independientemente de la cantidad de gas portador); dependientes de concentración (cantidad de soluto por unidad de volumen de gas portador). • Proceso de detección: ionización; ópticoespectroscópico; electroquímico.

Detector de conductividad térmica (TCD thermal conductivity detector) - Detector de ionización de ama (FID ame ionization detector) - Detector otométrico de ama (FPD ame -

-

photometric detector) Detector de captura de electrones (ECD electron capture detector) - Detector de otoionización (PID photoionization GC detector)

 

CROMATOGRAFÍA DE GASES (Condiciones de trabajo) A parte de la elección a utilizar, existen muy pocos parámetros

sobre los que se pueda inuir a la hora de realizar una separación en cromatograía de gases, sin embargo se tienen en cuenta: 1. Naturaleza y velocidad de gasdel portador, en la separación, dependerá de las necesidades equipoinerte y la rápidez del análisis. 2. Temper emperatura atura d dee dete detector, ctor, d debe ebe ser siempr siempree más eelev levada ada que llaa máxima temperatura de tabajo. 3. Temper emperatura atura d dee iny inyección ección,, sufci sufcienteme entemente nte ele eleva vada da como ppara ara volatilizar completamente todos los componentes de la muestra. 4. Temper emperatura atura de co columna, lumna, cuando se tr trabaja abaja en co condicion ndiciones es isotermas genera inuencia en la separación en conjunto con el programa de calentamiento.

 

CROMATOGRAFÍA DE GASES (Análisis La cromatograía cualitativo) de gases es uno de los métodos ísicos de separación más efcaces que se conocen; cada componente de una muestra suministra tres unidades de inormación: posición, altura y anchura de los picos en el cromatograma.

 

CROMATOGRAFÍA DE GASES (Análisis cualitativo) Los cromatogramas se utilizan a menudo como criterio

de pureza de compuestos orgánicos. Los contaminantes, si están presentes, se manifestan por la aparición de picos adicionales; las áreas de estos picos proporcionan una estimación aproximada del grado de contaminación. La técnica también es útil para evaluar evaluar la eectividad de los procedimientos de purifcación. La cromatograa de gases es un medio excelente para confrmar la presencia o ausencia de un supuesto componente en una mezcla, siempre que se disponga de un patrón.

 

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CROMATOGRAFÍA DE GASES (Análisis Análisis cuantitativo cualitativo) general de mezclas multicomponentes de orgánicos volátiles. Técnica de separación muy efciente.

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Fenómeno Reparto entre una ase de vapor y elsusubstrato. V entajas enmolecular: el análisis cualitativo: Separa materiales materia les para examen e xamen por medio de otras técnicas. Ventajas en el análisis cuantitativo: Aplicación amplia a los materiales volátiles, análisis de multicomponentes, alta sensibilidad en casos especiales. Muestra promedio deseable: 1 mg. Limitaciones del método: Identifca los materiales solo en casos especiales. Limitaciones para la muestra: Presión de vapor mayor de 1 torr. a la temperatura de entrada de la muestra

 

CROMATOGRAFÍA DE GASES (Análisis cualitativo)  Métodos de coincidencia El método más simple de identifcación cromatográfca consiste en comparar el volumen de retención de un compuesto problema con el de un patrón, determinado en las mismas condiciones operativas y en la misma columna. Retención relativa

Los volúmenes de retención dependen de un gran número de variables operativas, debido a esto es diícil conseguir respuesta idéntica aún en columnas las mismas porselohan tanto, identifcarpreparadas sustancias aenpartir de datoscondiciones; bibliográfcos de para expresar las retenciones como variables reproducibles por dierentes equipos e investigadores. Se han utilizado dos procedimientos generales: a) Cálculo de los volúmenes de retención específcos b) Determinación de retenciones relativas a patrones.

 

CROMATOGRAFÍA DE GASES (Análisis cuantitativo) La señal del detector de una columna cromatográfca gaslíquido se ha utilizado generalmente para análisis cuantitativos y semicuantitativos. En condiciones cuidadosamente controladas se consigue una exactitud (relativa) del 1 %. Como con la mayoría de los instrumentos analíticos, la fabilidad se relaciona directamente con el control de las variables; la exactitud

también depende en parte de la naturaleza de la muestra. La discusión general del análisis cuantitativo cromatográfco, dada anteriormente, se aplica tanto a la cromatografa de gases como a otros tipos; por esta razón ra zón no se hacen aquí más consideraciones sobre este aspecto.

 

CROMATOGRAFÍ TOGRAFÍA A LÍQUIDA CROMA DE ALTA RESOLUCIÓN (HPLC)

  DE ALTA RESOLUCIÓN

 

(HPLC) (Principio fisicoquímico) •

Es una técnica de permite separar, aislar e identifcar losquímicos compuestos analitos (basada de una mezcla en la de transerencia de masa entre la ase estacionaria y la ase móvil), por lo que es utilizada recuentemente analítica para la en separación bioquímica de componentes y química de una sustancia determinada, basándose en dierentes tipos de interacciones químicas.

  DE ALTA RESOLUCIÓN

 

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(HPLC) (Principio fisicoquímico) La cromatograía líquida “clásica” se lleva a cabo en una columna generalmente de vidrio, la cual está

rellena la asese fja. Luego l a amuestra la en la partecon superior, hace uirde la sembrar ase móvil través de la columna por eecto de la gravedad. Con el objeto de aumentar la efciencia en las separaciones, el tamaño de las partículas de ase fja se ue disminuyendo hasta el lospresiones micrones,para lo cual generó necesidad detamaño utilizar de altas lograr que la uya la ase móvil. De esta manera, nació la técnica de cromatograía líquida de alta resolución (HPLC), que requiere de instrumental especial que permita trabajar con las altas presiones requeridas.

 

CROMA CROMATOGRAFÍA TOGRAFÍA LÍQUID LÍQUIDA A DE ALTA RESOLUCIÓN (HPLC) (Carácterístic (Carácterísticas) as) •

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La cromatograía líquida (HPLC), es una técnica utilizada para separar los componentes de una mezcla. Consiste una ase móvil. en unaLa ase ase estacionaria estacionaria noes polar sílica(columna) que se hay tratado con RMe2SiCl. La ase móvil actúa de portador de la muestra. La muestra en solución es inyectada en la ase móvil. Los componentes de la solución emigran de acuerdo a las interacciones no-covalentes de los compuestos con la columna. Estas interacciones químicas, determinan la separación de los contenidos en la muestra. La utilizaciónde delos loscompuestos dierentes detectores dependerá de la naturaleza a determinar.

 

CROMA CROMATOGRAFÍA TOGRAFÍA LÍQUID LÍQUIDA A DE ALTA RESOLUCIÓN (HPLC) (Característic (Características) as) •

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Aplicaciones principales: Técnica de separación para los materiales menos volátiles e iónicos; análisis cuantitativo de multicomponentes. Fenómeno molecular: Reparto entre una solución líquida y un substrato. Ventajas en el análisis cualitativo: Separa materiales para su examen por medio de otras técnicas. V entajas enmenos el análisis cuantitativo: amplia a los materiales volátiles, análisis Aplicación de multicomponentes. Muestra promedio deseable: 10 mg. Limitaciones del método: Se tarda en desarrollar el método. Limitaciones para la muestra: Ninguna

 

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CROMA CROMATOGRAFÍA TOGRAFÍA LÍQUID LÍQUIDA A DE ALTA RESOLUCIÓN (HPLC) (Carácterísticas) (Carácterístic as) Las razones de la popularidad de esta técnica son su sensibilidad, su ácil adaptación a las determinaciones cuantitativas exactas, su idoneidad separación de especiespara no la volátiles o termolábiles y, sobre todo, su gran aplicabilidad a sustancias que son de primordial interés en la industria, en muchos campos ciencia y para la sociedaddeenlageneral.

Aminoácidos, proteínas, ácidos nucleicos, hidrocarburos, hidrocarbur os, carbohidratos, carbohidratos, drogas, terpenoide terpenoides, s, plaguicidas, antibióticos esteroides, especies organometálicas y una cierta variedad de sustancias inorgánicas.

Ensanchamiento de zona

1.

Eectos del tamaño de partícula del relleno.

2. Ensanchamiento deen banda extracolumna cromatograía de líquidos. 3. Eecto del tamaño de muestra en la efcacia de la columna.

 

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CROMATOGRAFÍ TOGRAFÍA A LÍQUIDA LÍQUIDA CROMA DE ALTA RESOLUCIÓN (HPLC) (Equipo) El equipo necesario para la HPLC tiende a ser más sofsticado y caro que el que se utiliza en otros tipos de cromatograía.

 

CROMATOGRAF A L QUIDA DE ALTA RESOLUCIÓN (HPLC) (Cromatograma)

 

CROMA CROMATOGRAFÍA TOGRAFÍA LÍQUID LÍQUIDA A DE ALTA RESOLUCIÓN (HPLC) (Equipo)

1) Recipientes para la fase móvil y sistemas para el tratamiento de los disolventes

En ésta cromatograía se equipa con uno o más recipientes de vidrio o de acero inoxidable, cada uno de los cuales contiene unos 500 mL de un disolvente. Por lo general se equipa con un sistema para eliminar los gases disueltos que pueden generar una intererencia. 2) Sistemas de bombeo

Generación de presiones por encima de 400 kg/cm2 , ujo libre de pulsaciones, pulsaciones, intervalo interva lo de caudal de 0,1 a 10 mL/min, control y reproducibilidad del caudal, y compontes resistentes a la corrosión. 3) Sistemas de inyección de la muestra

Volúmenes pequeños, en orden micro litros (μL) 4) Columnas para cromatografía de líquidos Tubos rectos de acero inoxidable, longitud entre 10 y 30 cm, acoplables, diametro interno de 4 y 10 mm y tamaño de partícula entre 5 y 10 um. 5) Detectores

No hay detectores aplicables universalm universalmente. ente.

 

CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTA RESOLUCIÓN (HPLC) (Condiciones de trabajo Parámetros) Diámetro

interno de la columna Es un aspecto crítico que inuye en

la sensibilidad de la detección y la selectividad de separación en gradiente de elución. Medida de las partículas Fase estacionaria unida al exterior de partículas eséricas de sílica, con dierentes medidas siendo las de 5um de diámetro más utilizadas. Partículas más pequeñas orecen una mayor superfcie y una mayor separación. Tamaño de poro Las ases estacionarias son porosas para proporcionar una mayor superfcie, mientras los poros de mayor medida proporcionan una mejor cinética (proteínas). (proteínas). 

Presión del El rendimiento se mide en su capacidad para producir unasistema velocidad de ujo constante y reproducible.

 

ESPECTROMETRÍA DE MASAS

 

ESPECTROMETRÍA DE MASAS (Principio fisicoquímico) •

Laobtención espectrometría de masas basada en la de iones a partirestá de moléculas orgánicas en ase gaseosa; una vez obtenidos estos iones, se separan de acuerdo consesudetectan fnalmente masa y por su carga, medioyde un dispositivo adecuado.

 

•

ESPECTROMETRÍA DE MASAS  Un(Principio espectro de masas será, fisicoquímico) en consecuencia, una inormación bidimensional

que representa relacionado conun la parámetro abundancia de los dierentes tipos de iones en unción de la relación masa/carga de cada uno de •

•

La inormación orecida por un

ellos. La presencia y abundancia en el espectro de determinados tipos de iones, identifcables a partir de su masa, será

espectro de algunadeorma, masas es, comparable a la obtenida mediante una gran cantidad de reacciones de las utilizadas para la determinación de estructuras por vía

unción estructura química de de lacada compuesto.

química.de la estructura química Inormación

 

ESPECTROMETRÍA DE MASAS Capaz de (Equipo) vaporizar substancias de

3. Capaz de

1.

volatilidades muy dierentes.

ESPECTROMÉTRO

separar los iones en unción de su relación masa/carga.

2. Capaz de

originar iones a partir de las moleculas neutras en ase gaseosa.

4. Capaz de

detectar los iones ormados y registrar la inormación adecuadamente.

 

ESPECTROMETR A DE MASAS (Equipo)

1)Sistema de introducción de muestras

La condición necesaria para que se pueda obtener el espectro de un compuesto, es que su presión de vapor sea igual o superior a 10-6 mm de mercurio, a una temperatura tal que la muestra no pirolice; para poder realizar el espectro, es necesario vaporizar toda la muestra, sino únicamente la cantidad necesaria parano alcanzar la presión indicada anteriormente.

ESPEC ECT TROMETR A DE MASAS

 

(Equipo)

2) Fuente de iones Principalmente, Principalmen te, existen dos métodos para producir la ionización de la muestra en estado gaseoso; la ionización por impacto o bombardeo electrónico, que es con mucho el más utilizado, y la ionización química.  Ionización por impacto electrónico. En este método, las moléculas de muestra son ionizadas por medio de un haz de electrones de elevada energía.  Método de Ionización Ionización Química. En este método, se utiliza como agente ionizante un ion que va a transerir su carga a la molécula de muestra por medio de una reacción bimolecular. •

•

3)Analizador, para la separación de iones

Los analizadores más utilizados, son el de campo magnético, el analizador cuadrupolar, muy utilizado en equipos combinados con un cromatograo de gases, y el analizador de trampa de iones. 4)Sistema detector y registrador

Existen principalmente tres tipos de detectores: - Caja de Faraday placa, ligeramente inclinada para evitar la reexión de iones. - Multiplicador de electrones esencialme esencialmente nte igual a los tubos otomultiplicadores utilizados para la detección de radiación. - Placa fotograca es necesaria una altísima sensibilidad o una extraordinaria resolución.

ESPEC ECT TROMETR A DE MASAS

 

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(Aplicaciones cualitativas)

Determinación del peso molecular de todas las sustancias que pueden volatilizarse por la posición del pico correspondiente a la masa patrón. Determinación de la ormula molecular. Si el instrumento es de gran resolución bastará la determinación precisa de su masa molecular para poder atribuirle una órmula empírica. Identifcación de compuestos por su ragmentación patrón: la ragmentación de la mayor parte de las moléculas produce un gran número de picos que la identifcación i dentifcación numerosos compuestos y elpermiten reconocimiento de ciertosdegrupos uncionales de ellos. Caracterización y análisis de polímeros: el polímero se piroliza en condiciones controladas y los productos volátiles volátil es se hacen pasar a un espectrómetro para su análisis.

 

MASAS

 

Determinación cuantitativa de especies moleculares o (Aplicaciones cuantitativas) tipos de especies moleculares en muestras orgánicas,  biológicas y ocasionalme ocasionalmente nte inorgánicas inorgánicas:: normalmente



tales análisis se columna llevan a cabo haciendo pasar a través de una cromatrográfca o dela muestra electrooresiss capilar y posteriormente por el electrooresi espectrómetro. 

Determinación de la concentración de elementos en muestras inorgánicas y, en menor medida, de muestras orgánicas y biológicas: las concentraciones de analito en este caso se obtienen directamente a partir de las alturas de los picos de los espectros de masas.

 

REFERENCIAS •

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