CEPA IMAPA MICRO ALIM STUDENTI complet 2012-13.doc

GUGUIANU ELEONORA

MICROBIOLOGIA ALIMENTELOR CURS

2011

1

Partea I

NOŢIUNI DE MICROBIOLOGIE GENERALĂ

2

NOŢIUNI INTRODUCTIVE 1.1.DEFINIŢIA ŞI OBIECTUL DE STUDIU AL MICROBIOLOGIEI Microbiologia reuneşte ştiinţele biologice care au ca obiect de studiu vieţuitoarele invizibile cu ochiul liber numite microorganisme. De-a lungul timpului, acestea au purtat denumiri diferite în funcție de nivelul cunoașterii lor: miasme (HIPPOCRATE- 460-377 a. Chr.) , germeni (,,seminaria morbi" în concepţia medicului italian FRACASTORO,14681553),animaliculi (ANTONIUS van LEEUWENHOEK, 1632-1723), fermenţi, microbi. Termenul de ,,microb" a fost inventat de Charles Sedillot în 1878 şi îşi are originea în cuvintele greceşti micros - mic şi bios - viaţă. Deşi nu este considerat academic, el rămâne de uz comun, la fel ca şi sintagma ,,germeni microbieni". Lumea microorganismelor este imensă şi extrem de variată ca urmare a evoluţiei pe parcursul a aproximativ 3 miliarde de ani cu succesiuni de ordinul minutelor între generaţii, justificând opinia potrivit căreia trăim într-o lume a microorganismelor şi nu într-o lume cu microbi. Multă vreme, oamenii au fost tentaţi sa creadă că lumea vie se rezumă numai la ceea ce le relevau organele de simţ, deşi, încă din preistorie sesizaseră o serie de efecte ale activităţii acestora: unele benefice pe care, pragmatici, căutau să le obţină (dospirea pâinii, fermentaţia alcoolică, lactică, acetică etc.), altele extrem de dăunătoare (bolile infecţioase). Medicii, filozofii, chiar şi unii poeţi ai acelor timpuri reflectau asupra cauzelor posibile ale acestor fenomene fără a putea depăşi însă stadiul de simple ipoteze. Descoperirea microorganismelor a devenit posibilă abia în doua jumătate a sec. XVII ca urmare a inventării aparatelor de amplificare optică. Studiul microcosmosului viu cu ajutorul microscoapelor din ce în ce mai performante a relevat existenţa de ființe vii cu structură celulară şi subcelulară (acelulară). Microorganismele celulare sunt algele microscopice, protozoarele, ciupercile microscopice (fungii, micromiceţii) şi bacteriile. Ele au, în general, toate cele trei artibute ale vieţii: flux material, flux energetic și flux informaţional. În categoria microorganismelor acelulare sunt incluse virusurile și viroizii, care dispun doar de flux informaţional, dar și prionii (proteinele

3

infecţioase transmisibile) - agenţi patogeni neconvenţionali pentru a căror descoperire PRUSINER a primit premiul Nobel în 1997. Pe măsura perfecţionării metodelor de studiu şi implicit a acumulării de noi cunoştinţe despre microorganisme, în cadrul microbiologiei s-au conturat numeroase discipline distincte cu un caracter fundamental (algologia, protozoologia, micologia, bacteriologia, virusologia, genetica microorganismelor, ecologia microorganismelor ş,a.) şi aplicativ (microbiologia medicală, microbiologia veterinară, microbiologia alimentelor, microbiologia solului, microbiologia petrolului, microbiologia cosmosului etc.) Principalele caractere distinctive ale microorganismelor, care constituie obiectul de studiu al microbiologiei medicale și veterinare sunt redate în tabelul 1. Microbiologia are numeroase conexiuni interdisciplinare. Ea facilitează înţelegerea şi aprofundarea cunoştinţelor de morfopatologie, boli infecţioase, imunologie, biologie moleculară și reclamă pentru a putea fi înțeleasă și însușită, cunoştinţe de biochimie, indispensabile pentru studiul metabolisului bacterian, noţiuni de biofizică pentru înţelegerea funcţionării unor structuri bacteriene (membrana citoplasmatică, membrana externă a peretelui bacterian etc.), noţiuni de anatomie şi histologie pentru înţelegerea funcţionării unor bariere antimicrobiene mecanice ( epiteliul cutanat şi cel al mucoaselor, ţesutul conjunctiv dens, spălarea mucoaselor prin secreţii şi excrete, transportul mucociliar) ş.a. Tabelul 1 Caracterele diferenţiale între principalele categorii de microorganisme Caracterul diferenţial Tipul de organiz are Tipuri de acid nucleic Organizare a materialulu i genetic Echipament enzimatic şi metabolism propriu Creştere

Prioni

Viroizi

Virusuri

Bacterii

Miceți

acelular acelular

acelular.

Celular procariot

Celular eucariot

-

1 (ARN)

1 (ADN 2 (ADN sau ARN) ARN)

-

ARN de Genom talie viral mică

şi 2 (ADN ARN

Un singur Mai mulţi cromozom şi cromozomi plasmide

Absente Absente

Absente

Prezente

Prezente

Absentă Absentă

Absentă

Prezentă

Prezentă

4

şi

Mod de Sinteză reproducere amplifi cată prin convers ie Diferenţier Nu este e celulară cazul Parazitism Consta absolut nt, obligato riu Forme 1.P.P.C biologice .=protei de existenţă nă în natură prionică celulară normală 2.P.P.S .=protei nă prionică patologi că scrapie

Sunt sintetizaţ i de celula gazdă

Sunt Independent, sintetizate sciziparitate de celula gazdă

Independent, sexuat sau asexuat

Nu este cazul Constant , obligator iu 1.ARN mic intranuc lear

Nu este Absentă cazul Constant, Absent obligatori u

Prezentă

1.Celulă vegetativă, 2.Spor (formă de conservare )

1.Miceliu sau pseudomi celiu 2.Spori de înmulţire 3.Spori de rezistenţă

Poziţia pe La scara graniţa filogenetică dintre viu şi neviu

La graniţa dintre viu şi neviu

1.Virion infecţios, temporar extracelul ar 2.Virus vegetativ, intracelula r, în curs de sinteză 3.Virus integrat, fixat în genomul celulei gazdă La graniţa dintre viu şi neviu

Organisme vii cu organizare simplă (protiste )

Organisme vii cu diverse grade de complexitate.

Absent

1.2. SISTEMATICA MICROORGANISMELOR Stabilirea poziţiei microorganismelor în sistematica biologică a întâmpinat în decursul anilor dificultăţi obiective, generate de criteriile care au stat la baza împărţirii lumii vii în două sau mai multe regnuri (fig. 1), de marea diversitate a acestor vieţuitoare şi de faptul că unele categorii de microorganisme se apropie prin caracteristicile lor de regnul animal (protozoarele) iar altele de regnul vegetal (algele, ciupercile microscopice, bacteriile). 5

Fig.1 Sistematizarea lumii vii în 5 regnuri Privite în ansamblu, aceste vieţuitoare au însă trăsături distinctive de restul lumii vii, fiind situate pe o treaptă inferioară de evoluţie şi organizare. Luându-se drept criteriu de bază nivelul de organizare biologică (subcelular, unicelular sau pluricelular; eucariot sau procariot), la propunerea lui H a e c k e l (1866), reluată de S t a n i e r (1964), microorganismele au fost incluse într-un al treilea regn, alături de cel vegetal şi animal - regnul Protista divizat în protiste superioare, care grupau microorganismele eucariote (algele, protozoarele, miceţii) şi protiste inferioare, reprezentate de microorganismele procariote (algele albastre-verzi şi bacteriile). În 1968, M u r r a y încadrează bacteriile şi algele albastre-verzi în regnul Procaryotae, taxon însuşit de Determinatorul Bergey (1984) – lucrare de o înaltă probitate ştiinţifică, unanim acceptată de bacteriologii din întreaga lume. Un an mai târziu (1969), W h i t t a k e r creează regnul Fungi, care grupează ciupercile microscopice, prin desprinderea subîncrengăturii cu acelaşi nume, subsecventă încrengăturii Thallophyta, din regnul vegetal. Ulterior, virusurile, deoarece se deosebesc de celelalte microorganisme prin cel puţin două trăsături esenţiale – structura subcelulară şi lipsa metabolismului propriu –, au fost încadrate într-un regn de sine stătător, regnul Vira. 6

1.3. ISTORICUL MICROBIOLOGIEI Existenţa fiinţelor microscopice a fost intuită de foarte multă vreme dar, din lipsa mijloacelor tehnice, descrierea acestora a fost posibilă abia după ce inventarea microscopului a permis extinderea simţurilor umane dincolo de capacitatea lor normală de percepţie. Dacă din acest motiv studiul microorganismelor a început foarte târziu, diferitele procese produse de microorganisme - în special bolile contagioase, care decimau milioane de oameni – au fost în atenţia oamenilor de ştiinţă din cele mai vechi timpuri. Până la HIPOCRATE (460-375 îHr) se considera că bolile sunt cauzate de intervenţia unor forţe supranaturale. Hipocrate, fondatorul medicinei raţionale, afirma că toate bolile sunt naturale, produse de factori naturali şi nu de zeităţi, iar în ceea ce priveşte bolile molipsitoare, el le considera ca fiind rezultatul pătrunderii în organism a unor particule prezente şi vehiculate de aer. Aceste particule au fost numite “miasme”, iar teoria care le admitea existenţa, “teoria miasmatică”. Trei sute de ani mai târziu, un scriitor şi filozof roman, Varro (116-23 îH) identifica miasmele cu nişte animale mici – animalia minuta – invizibile cu ochiul liber. El corelează apariţia unor îmbolnăviri cu particularităţile arealului respectiv, cum ar fi existenţa mlaştinilor. În lucrarea sa “Rerum rusticarum de agricultura”, Varro afirma: “Dacă într-un loc sunt mlaştini, acolo cresc animale aşa de mici, că ochii nu pot să le vadă şi acestea ajungând în corp, cu aerul, pe gură sau pe nas, produc boli grele.” Implicaţia practică a teoriei miasmatice a fost considerabilă pentru acele vremuri deoarece recomanda măsuri esenţiale de prevenire a răspândirii bolilor molipsitoare, care constau în fierberea apei şi fumigaţii cu sulf în spaţiile considerate contaminate. Cu toate acestea, până acum un secol şi jumătate epidemiile evoluau nestânjenite; ciuma, holera şi variola decimau uneori 80% din populaţia arealelor geografice afectate (oraşe, ţări, continente), iar difteria, tifosul exantematic, febra tifoidă făceau ca mortalitatea prin boli contagioase să depăşească cu mult pierderile de vieţi omeneşti determinate de toate celelalte calamităţi naturale şi războaie. Istoria evului mediu poate fi considerată, aşadar, istoria marilor epidemii a căror apariţie şi recrudescenţă erau favorizate de pauperitatea măsurilor profilactice de care dispunea omenirea la acea dată şi de empirismul aplicării lor. Măsurile antiepidemice nu au putut fi înţelese până când în sprijinul ipotezelor privind existenţa microorganismelor au fost aduse dovezi clare, indubitabile. Se poate afirma că istoria microbiologiei şi progresele ei sunt strâns legate de curiozitaea ştiinţifică a lui Leeuwenhoeck şi de geniul lui Pasteur. LEEUWENHOECK (1632-1723), negustor și cercetător amator, care avea pasiunea şlefuirii lentilelor, a reuşit să evidenţieze cu ajutorul unui microscop construit de el însuşi, prezența în salivă, urină, puroi, apa de canal şi 7

alte materiale, a unor organisme minuscule pe care le-a denumit “viva animalicula ”. Descrierile lui Leeuwenhoeck sunt însoţite de desene surprinzător de exacte, care au fost reproduse în lucrarea “Arcana naturae ope microspiorum detecta” prezentată în anul 1675 Societăţii Regale de Biologie din Londra şi tipărită la Delf în 1695. Deoarece lucrarea reprezintă primul studiu de microbiologie din lume, ea este considerată certificatul de naştere al microbiologiei. Constatările lui Leeuwenhoeck nu au fost urmate de un progres rapid al cunoştinţelor, aşa cum ar fi fost de aşteptat. În schimb, ele au devenit obiectul unor polemici înverşunate cu privire la originea microorganismelor, între preoţi - partizani ai concepţiei creaţioniste şi oamenii de ştiinţă - susţinători ai teoriei generaţiei spontane. Această teorie, fondată încă din antichitate de marii filozofi materialişti Anaximandru, Democrit, Aristotel, Teofrast şi alţii, încerca să explice apariţia unor vieţuitoare în alt mod decât prin actul creaţiei divine. Aşa s-a ajuns la acreditarea unor idei, cel puţin bizare, potrivit cărora broaştele se nasc spontan din nămol, peştii din frunzele copacilor căzute în apă, şoarecii din rufe murdare, viermii din brânză sau carne alterată, puricii din praf etc. Teoria generaţiei spontane a fost susţinută de numeroşi adepţi până târziu, în cursul secolului XIX. Chiar şi astăzi, ca o expresie a ignoranţei, unii oameni continuă să creadă că puricii pot să apară din praf. Utilizarea microscopului în secolul XVII a relevat organizarea anatomică foarte complexă a acestor vieţuitoare, semănând îndoială în convingerile partizanilor acestei teorii, în sensul că structuri atât de complexe nu ar putea să apară instantaneu din praf sau nămol. Mai mult, în 1668 biologul englez FRANCESCO REDI a demonstrat printr-o experienţă simplă că larvele se nasc din părinţi, acoperind cu tifon, pentru a evita depunerea ouălor de muscă, vasele în care au fost introduse fragmente de carne. Cu toate aceste dovezi ştiinţifice, partizanii generaţiei spontane susţineau că “dacă muştele se nasc din ouă, apoi fiinţele invizibile se nasc de la sine”. Secolul al XVIII-lea a înregistrat puţine progrese în cunoaşterea lumii microorganismelor descoperite de Leeuwenhoeck. Această perioadă se caracterizează prin acumulări de date privind morfologia microorganismelor, consecutiv perfecţionării aparatelor optice şi prin încercări de sistematizare a cunoştinţelor existente. LINNÉ (1707-1778), în celebra lucrare “Systema naturae”, apărută în 1735, încadrează organismele microscopice în genul “Chaos”, înzestrându-le cu puteri infernale (“furia infernalis”) care aveau semnificaţia unei activităţi patogene. În 1854, FERDINAND COHN crează termenul de “bacterie” şi împreună cu EHRENBERG propune desprinderea acestui grup de microorganisme din regnul animal, argumentând încadrarea lui în regnul vegetal pe baza prezenţei peretelui celular. 8

În istoria microbiologiei, secolul al XVIII-lea se încheie cu o realizare empirică genială în domeniul imunologiei. În 1789 EDWARD JENNER (17491823), bazându-se pe o îndelungată experienţă populară, obţine prima imunizare artificială a oamenilor împotriva variolei utilizând o suspensie de cruste recoltate de pe ugerul vacilor bolnave. Toate aceste descoperiri şi experienţe empirice au constituit paşi importanţi în cucerirea microcosmosului invizibil, anticipând trecerea la etapa constituirii microbiologiei ca ştiinţă independentă. Această etapă cuprinde a doua jumătate a secolului XIX şi este indisolubil legată de numele marelui savant LOUIS PASTEUR (1822-1895), considerat în unanimitate părintele microbiologiei. Plecând de la observaţia că fermentaţiile alcoolică, lactică şi butirică sunt rezultatul acţiunii unor microbi, Pasteur fundamentează între anii 1857-1865 teoria microbiană a infecţiilor. El demonstrează experimental relaţia cauzală dintre micobi şi infecţie bazându-se pe rezultatele cercetărilor efectuate asupra agentului etiologic al antraxului. Deşi numeroşi oameni de știință ai acelor timpuri (Delafond, 1838; Pollender, 1849; Rayer şi Davaine, 1850) au observat în sângele animalelor moarte de dalac (antrax) formaţiuni bacilare cu lungimea de două ori mai mare decât diametrul globulelor roşii, iar Davaine le-a intuit rolul etiologic, Pasteur a fost acela care a demonstrat că prezenţa acestor germeni în organele oilor moarte reprezintă cauza reală a morţii şi nu consecinţe ale bolii. Bazat pe descoperirile sale privind mecanismele fermentaţiilor şi a infecţiei, Pasteur demonstrează indubitabil că microorganismele nu apar spontan în substraturile în care se multiplică ci prin contaminare, de vreme ce un mediu nutritiv sterilizat într-un recipient închis etanş rămâne steril la infinit. Flacoanele sale cu lichide sterile se păstrează şi astăzi la fel de limpezi ca în ziua în care au fost sterilizate. El a pus astfel bazele sterilizării, oferind şi mijloacele adecvate: pupinelul sau cuptorul lui Pasteur, autoclavul lui Chamberland. În paralel cu elucidarea cauzelor bolilor contagioase, eminentul cercetător a făcut descoperirea epocală a vaccinurilor microbiene, care a revoluţionat medicina şi gândirea biologică. Vaccinul contra holerei aviare a fost primul vaccin atibacterian bazat pe atenuarea patogenităţii microbilor în condiţii de laborator. Descoperirea principiului atenuării s-a datorat unei neglijenţe a colaboratorul său, Chamberland, care a uitat la termostat un timp mai îndelungat o cultură de Pasteurella multocida, agentul etiologic al holerei aviare. Inoculată la găinile sănătoase, aceasta nu a mai produs infecţia iar păsările respective au devenit rezistente la tulpina virulentă ce le-a fost administrată ulterior. Inspirat de această întâmplare, trei ani mai târziu, în 1881, a procedat la atenuarea unei tulpini de Bacillus anthracis izolată de la oi moarte de antrax, pe care a inoculat-o apoi unor oi sănătoase. Rezultatul a fost acelaşi, în sensul că după reinocularea cu o cultură virulentă oile au supravieţuit deoarece deveniseră imune. 9

La 28 februarie 1881 Pasteur a comunicat această descoperire Academiei de Ştiinţe. Răspunzând neîncrederii cu care a fost primită de adversarii săi, savantul a procedat la efectuarea unei demonstraţii la o fermă din apropierea Parisului, în faţa unei asistenţe compusă din medici umani şi veterinari, farmacişti, agricultori, politicieni şi alte categorii de cetăţeni. Experimentul a constat în vaccinarea anticărbunoasă a unui lot de oi și neadministrarea vaccinului la un lot martor. După 15 zile, întregul efectiv a fost inoculat cu o suspensie de bacili cărbunoşi virulenţi. Experimentul a avut rezultatul scontat, spulberând scepticismul inamicilor vaccinării. Prin aplicarea vaccinării inițiate de Pasteur, incidenţa antraxului s-a redus considerabil, ceea ce a făcut ca utilizarea lui să se extindă cu repeziciune în întreaga lume. Geniul lui Pasteur este şi mai pregnant ilustrat prin prepararea vaccinului antirabic. Fără a cunoaşte natura agentului etiologic al turbării, de a cărui existenţă nu s-a îndoit însă nici un moment, Pasteur a reușit să obţină prin treceri succesive pe creier de iepure, virusul rabic fix. Acesta este incapabil să reproducă turbarea inoculat subcutanat, în schimb conferă imunitate faţă de infecţia cu virus “sălbatic” (“de stradă”). Practica imunizării antirabice cu virusuri fixe s-a păstrat până în zilele noastre. Lui Pasteur îi revine şi meritul de a fi izolat şi descris numeroşi agenţi etiologici ai unor infecţii ale omului şi animalelor: Clostridium septicum (vibrionul septic al lui Pasteur), stafilococii, streptococii, etc. Pasteur a avut numeroşi discipoli, în jurul său constituindu-se o adevărată şcoală la care s-au format eminenţi microbiologi. Dintre aceştia, lui EMILE ROUX şi ALEXANDRE YERSIN li se datorează studiul toxinelor microbiene, ultimul fiind şi descoperitorul agentului etiologic al ciumei (Yersinia pestis), iar Edmond Nocard împreună cu Roux au izolat şi identificat mai mulţi germeni microbieni cunoscuţi astăzi sub denumirea de micoplasme. CHARLES EDUARD CHAMBERLAND este autorul unor inovaţii tehnice deosebit de utile activităţii curente de laborator, ca de exemplu primul filtru bacteriologic şi autoclavul. Pintre discipolii lui Pasteur se numără şi Victor Babeş, fondatorul şcolii româneşti de microbiologie. Marile descoperiri ale lui Pasteur n-au întârziat să-şi găsească laturi aplicative şi în alte domenii ale medicinii. Aşa a fost cazul introducerii antisepsiei în chirurgie de către JOSEPH LISTER (1827-1917), cel mai convins şi activ susţinător al teoriei biologice a infecțiilor formulată de Pasteur, căruia îi scria: “Dacă veţi veni vreodată la Edinburg, veţi găsi, cred, cea mai bogată răsplată văzând în spitalul nostru ce binefaceri pentru umanitate produce opera dumneavoastră”. Este vorba despre considerabila scădere a mortalităţii prin infecţia de spital ca urmare a folosirii fenolului în dezinfecţie. 10

Un alt fondator al microbiologiei, ROBERT KOCH (1843-1910), inspirându-se din lucrările lui Pasteur, va completa conceptul de infecţie introducând criterii stricte de stabilire a responsabilităţii etiologice a unui microorganism, care au rămas în literatura de specialitate sub numele de “postulatele sau triada lui Koch”. Numele său mai este legat de descoperirea agentului etiologic al tuberculozei, introducerea mediilor de cultură solide în practica bacteriologică, semnalarea fenomenului de alergie şi prepararea primei substanţe revelatoare ( tuberculina). În perioada marilor descoperiri ale lui Pasteur şi Koch au fost identificaţi şi descrişi agenţii etiologici a numeroase boli, cum ar fi: Clostridium tetani de către NICOLAER şi KITASATO(1884), salmonelele, de către EBERTH (1884), SALMON şi SMITH (1886), Escherichia coli de către ESCHERICH (1885), ş.a. Secolul XX, a marcat o nouă perioadă de importante descoperiri şi aprofundare a unor aspecte până atunci incomplet elucidate, precum: introducerea substanţelor chimioterapice şi a antibioticelor în terapia infecţiilor, relevarea unor aspecte morfofiziologice de fineţe ale microorganismelor, descoperirea virusurilor şi a mecanismului infecţei virale, efectuarea primelor studii de genetică moleculară, dezvoltarea imunologiei şi afirmarea ei ca ramură independentă a ştiinţelor biologice. În jurul anului 1910 PAUL ERLICH introduce în practica medicală primul chimioterapic – salvarsanul -, folosit cu succes în tratamentul sifilisului. Antibioticele au intrat în patrimoniul terapiei antimicrobiene în anul 1941, când Ernst Chain şi Howard Florey tratează primii pacienţi cu penicilină. Efectul antibacterian al acestei substanţe a fost descoperit încă din 1929 de către ALEXANDER FLEMING, în urma sesizării antagonismului exercitat de o ciupercă din genul Penicillium faţă de o cultură de stafilococ. Aprofundarea cunoaşterii morfologiei şi fiziologiei microorganismelor este tributară progreselor înregistrate în domeniul opticii, electronicii şi chimiei. Astfel, vizualizarea virusurilor şi cunoaşterea ultrastructurii microorganismelor au devenit posibile după inventarea microscopului electronic (1930-1940), iar determinarea structurii chimice a acestora şi a activităţii enzimelor bacteriene, prin folosirea izotopilor radioactivi. În cadrul etapei contemporane de evoluţie a microbiologiei, a debutat şi sa dezvoltat genetica microbiană, ştiinţa care are ca obiect ereditatea şi variabilitatea microorganismelor. Având un aparat genetic mai redus, virusurile şi bacteriile au constituit obiectul de studiu al cercetărilor fundamentale de genetică. Primele observaţii care au contribuit la stabilirea sediului informaţiei genetice la microorganisme şi macroorganisme au fost efectuate de către GRFFITH în 1928 pe bacteria Diplococcus pneumoniae (pneumococul). El a constatat că în contact cu pneumococi virulenţi omorâţi prin căldură, pneumococii nepatogeni devin virulenţi. 11

În 1944, AVERY şi colaboratorii săi au reuşit transformarea genetică a unor pneumococi nevirulenţi în tipul virulent cu ajutorul ADN extras din pneumococii virulenţi, demonstrând astfel, că acidul dezoxiribonucleic (ADN) este suportul material al eredităţii. F. IACOB şi J. MONOD lansează în 1961 ipoteza existenţei unui ARN mesager prin intermediul căruia informaţia genetică este transferată de la ADN la ribozomi. Tot ei elaborează teoria reglajului genetic al activităţii celulare (teoria operonului), pentru care au primit premiul Nobel. Lui GEORGE PALADE, A. CLAUDE şi C. DUVE – laureaţi ai premiului Nobel în 1974, le datorăm descoperirea rolului ribozomilor în sinteza proteinelor. DEZVOLTAREA MICROBIOLOGIEI ÎN ROMÂNIA Începuturile cercetării şi practicii microbiologice în România se situează spre sfârşitul secolului al XIX-lea. VICTOR BABEŞ (1854-1925) a fost fondatorul şcolii româneşti de microbiologie. Marele savant român s-a format lucrând în perioada 1881-1884 în laboratorul lui PASTEUR şi în 1885 în laboratorul lui KOCH. BABEŞ a desfăşurat o prodigioasă activitate ştiinţifică elaborând peste 1.000 lucrări, 25 monografii şi primul tratat de bacteriologie în colaborare cu VICTOR CORNIL în 1883. Descoperirea în 1887 a incluziilor produse de virusul turbării în celulele piramidale din cornul lui Ammon, cunoscute sub numele “incluziile lui Babeş-Negri”, a serurilor imune (împreună cu LEPP în 1889), a paraziţilor din hematiile unor specii de animale, paternitatea acestei descoperiri fiind recunoscută prin crearea genului Babesia în care au fost încadrate microorganismele respective, reprezintă contribuţiile cele mai importante cu care VICTOR BABEŞ a îmbogăţit tezaurul ştiinţei româneşti şi universale. Alături de acestea trebuie menţionate şi numeroasele sale cercetări asupra antagonismului bacterian şi descrierea granulelor metacromatice din citoplasma bacilului difteriei (corpusculii Babeş-Ernst). Paralel cu activitatea ştiinţifică, VICTOR BABEŞ a dezvoltat şi o bogată activitate didactică, organizatorică şi obştească, conturându-se ca o figură luminoasă de savant patriot. Savanţii care ulterior au dezvoltat în mod strălucit şcoala de microbiologie medicală românească au fost: IOAN CANTACUZINO (18631934), CONSTANTIN IONESCU-MIHĂESTI (1883-1962), MIHAI CIUCA (1883-1969), DUMITRU COMBIESCU (1887-1961), iar în domeniul virusologiei CONSTANTIN LEVADITI (1874-1953) şi ŞTEFAN S. NICOLAU (1896-1967). PAUL RIEGLER (1867-1938) a fost fondatorul şcolii româneşti de microbiologie veterinară. Elev al lui VICTOR BABEŞ, el a introdus la noi în ţară practica diagnosticului bacteriologic în medicina veterinară. În 1911 a fondat institutul de seruri şi vaccinuri de uz veterinar (în acea perioadă, al treilea 12

de acest fel în lume), care în 1922 primeşte numele lui PASTEUR. A desfăşurat o susţinută activitate ştiinţifică, remarcându-se prin lucrările sale privind bacilul morvei. ALEXANDRU VECHIU (1890-1954) s-a remarcat printr-o activitate multilaterală. El a condus, după RIGLER, Institutul Pasteur şi Catedra de Microbiologie a Facultății de Medicină Veterinară din Bucureşti. VECHIU a fost printre primii cercetători care au reuşit atenuarea virusului pestei porcine prin lapinizare (adaptarea pe iepure). ALEXANDRU CIUCĂ (1880-1972) a fost profesor de Boli Infecţioase la Facultatea de Medicină Veterinară din Bucureşti. Prin activitatea sa ştiinţifică a adus contribuţii importante în probleme ca: infecţia experimentală cu bacilul morvei la taurine, tipizarea virusului febrei aftoase, tratamentul durinei cu neosalvarsan etc. ILIE POPOVICI (1902-1982), personalitate fecundă şi multilaterală, a adus printre altele, contribuţii deosebite în problema preparării de noi vaccinuri contra febrei aftoase, turbării, agalaxiei contagioase a oilor şi caprelor şi holerei aviare. NICOLAE MUNŢIU (1909-1977), după o serie de lucrări inedite privind bacilul morvei, a iniţiat şi organizat cercetarea şi producţia de biopreparate în domeniul febrei aftoase. NICOLAE STAMATIN, profesor de Microbiologie la Facultatea de Medicină Veterinară din Bucureşti, continuând tradiţia inaugurată de PAUL RIGLER a contribuit la înflorirea şcolii româneşti de Microbiologie Veterinară. Practica veterinară îi datorează, printre altele, două vaccinuri cu mare valoare profilactică: vaccinul anticărbunos preparat din tulpina acapsulogenă 1190 R şi vaccinul antirujetic preparat din tulpina VR2 - vaccinuri adoptate ulterior şi în alte ţări. Totodată, cercetările fundamentale întreprinse în domeniul biologiei sporogenezei, a antagonismului microbian, a bacteriofagilor speciilor din genul Bacillus, contribuţiile aduse în domeniul clasificării stafilococilor şi pasteurelelor, completează palmaresul care îl situează pe NICOLAE STAMATIN printre reprezentanţii de frunte ai Bacteriologiei veterinare româneşti. Pe lângă ,,pionierii” Microbiologiei româneşti, se cuvine a fi menţionate şi alte personalităţi reprezentative, care au desfăşurat o rodnică activitate pe tarâmul microbiologiei veterinare, ca: ♦ ALEXANDRU POP, microbiolog, erudit a adus contribuţii originale în domeniul brucelozei şi al unor probleme de imunologie teoretică. ♦ CONSTANTIN SURDAN a elaborat numeroase lucrări privind pararickettsiile. ♦ VALENTIN VOLINTIR, pionier al unor domenii de cercetare, a diagnosticat şi izolat, primul în ţara noastră, agenţi etiologici ca Listeria monocytogenes, Moraxella bovis etc.

13

♦ POPA OCTAVIAN, autor al unor lucrări privind salmonelozele animalelor şi cursuri de Microbiologie şi Imunologie la F.M.V. Timişoara. ♦ ANDREI STOENESCU (1914-2001), strălucit reprezentant al microbiologiei veterinare româneşti, a condus destinele disciplinei de Microbiologie şi Imunologie în cadrul Facultăţii de Medicină Veterinară Iaşi, din anul 1962 (data înfiinţării disciplinei), până în anul 1974. Profesorul Stoenescu a desfăşurat o prestigioasă activitate de cercetare, concretizată în peste 130 lucrări ştiinţifice originale. Demne de menţionat, datorită priorităţii lor naţionale, sunt studiile privind encefalomielita infecţioasă (boala de Teschen) la porc în nordul Moldovei. ♦ ALEXANDRU GRECIANU (1930-1998), distins intelectual, remarcabil cercetător microbiolog şi cadru didactic de excelenţă, a continuat consolidarea şcolii de Microbiologie din cadrul F.M.V. Iaşi, în perioada 1974-1995. Pe plan ştiinţific, a adus contribuţii originale la metodologia identificării grupului E. coli şi la stabilirea corelaţiilor existente între serogrup şi specia animală receptivă. La ora actuală, cercetarea de vârf în domeniul microbiologiei veterinare la noi în ţară este efectuată de către cadrele didactice și doctoranzii de la cele patru facultăţi de Medicină Veterinară, cercetătorii din cadrul Institutului Pasteur, medicii specialiști din laboratoarele veterinare centrale și din reţeaua laboratoarelor judeţene.

14

NOŢIUNI DE BACTERIOLOGIE GENERALĂ Bacteriologia este ramura microbiologiei care se ocupă cu studiul microorganismelor unicelulare cu structură procariotă, numite bacterii (termen creat de Ferdinand Cohn în 1872). Celula bacteriană de tip procariot se caracterizează printr-o organizare simplă, primitivă, fiind lipsită de membrane intracelulare și unele organite (mitocondrii, aparat Golgi şi reticul endoplasmatic propriu-zis) - structuri prezente în celulele eucariote (celula animală, vegetală și micetică). Bacteriile sunt metabolic active deoarece dispun de echipament enzimatic propriu, care realizează reacţiile celulare de degradare şi biosinteză. Principala modalitate de multiplicare a bacteriilor este diviziunea simplă binară sau sciziparitatea. Unele specii bacteriene pot exista în natură sub două forme biologice alternative: forma vegetativă care reprezintă celula bacteriană propriu-zisă, dotată cu toate însuşirile caracteristice speciei din care face parte şi sporul bacterian - formă de rezistenţă şi de conservare a speciei în condiţii ostile, improprii vieţii. 2.1 NOŢIUNI DE TAXONOMIE şi NOMENCLATURĂ BACTERIANĂ 2.1.1 TAXONOMIA BACTERIILOR Taxonomia (gr. taxon = grup) sau sistematica biologică este ştiinţa clasificării. Un taxon biologic reuneşte o sumă de indivizi asemănători între ei în virtutea descendenţei dintr-un strămoş comun, deci posesori ai unei informaţii genetice comune. Prin urmare, clasificarea organismelor vii este o clasificare naturală sau filogenetică. Comparativ cu celelalte regnuri, clasificarea organismelor procariote pe baza acestui criteriu a întâmpinat numeroase dificultăţi, generate de cauze obiective cum ar fi imposibilitatea studierii bacteriilor ca indivizi ci doar ca populaţii din cauza dificultăţilor de manipulare a unei singure celule. Gruparea bacteriilor în categorii taxonomice pe criterii filogenetice a devenit posibilă relativ recent, prin aplicarea tehnologiilor moderne de biologie moleculară şi biochimie în studiile de genetică bacteriană. Principalii parametri luaţi în studiu, în acest scop, sunt : 15

1. conţinutul relativ de guanină + citozină( G+C%) al ADN purificat; cu cât conţinutul G+C a două bacterii este mai apropiat, cu atât acestea sunt mai înrudite; 2. omologia secvenţelor nucleotidice ale ADN, cuantificată prin formarea moleculelor hibride pornind de la două catene ADN cu origini diferite; 3. studiul secvenţelor oligonucleotidice ale ARN ribozomal; gradul de înrudire a două organisme este direct proporţional cu omologia secvenţelor nucleotidice din ADN sau cu numărul de secvenţe oligonucleotidice comune din ARN ribozomal. 4. studiul structurii primare a enzimelor izofuncţionale sau a citocromului C; 5. studiul imunologic al proteinelor bacteriene omoloage. Pe baza criteriului omologiei materialului genetic, în ultimii ani clasificările convenţionale ale bacteriilor dar şi a celorlalte categorii de microorganisme au fost supuse unor repetate remanieri. Deşi acest criteriu de identificare şi încadrare taxonomică a bacteriilor este, indiscutabil, cel mai obiectiv, din cauza gradului crescut de dificultate tehnică şi a aparaturii pe care o reclamă, în practica bacteriologică curentă se recurge în continuare la identificarea pe baza caracteristicilor fenotipice (morfologice, culturale, metabolice, antigenice, ecologice, de patogenitate, de sensibilitate la factori fizici, chimici şi biologici etc. ). Categorii de taxoni Unitatea taxonomică de bază a lumii vii este specia. Specia bacterienă poate fi definită ca populaţii de celule cu caractere fenotipice comune, prin care diferă semnificativ de alte populaţii. Fiecare populaţie care aparţine unei specii poartă numele de tulpină bacteriană, clonă sau suşă. Ea este o cultură pură care îşi are originea într-o singură izolare dintr-un mediu natural. Pentru practica bacteriologică, tulpina bacteriană are, prin analogie cu organismele superioare, valoarea unui individ. Toate examenele necesare identificării bacteriilor şi încadrării lor taxonomice se execută pe tulpini bacteriene şi nu pe celule izolate, plecând de la premiza că o populaţie de celule bacteriene, care constituie o tulpină provine din descendenţa uneia sau a unui număr restrâns de celule şi că este genetic omogenă. Taxonii de rang superior speciei, în succesiunea lor ascendentă, sunt: genul, familia, ordinul, clasa şi diviziunea (încrengătura sau phylum). Genul reprezintă un grup taxonomic alcătuit din mai multe specii înrudite cu specia tip. El poate fi format dintr-o singură specie (gen monotipic) sau din mai multe specii. Toate bacteriile îşi au locul în cadrul unui gen iar identificarea genului stă la baza diagnosticului bacteriologic curent. Familia grupează mai multe genuri înrudite dintre care unul este considerat genul tip. Numeroase genuri nu au fost încadrate încă în familii. 16

Ordinul este un taxon format din familii înrudite, mai rar utilizat, puţine grupe de bacterii fiind încadrate în ordine. Clasa este un taxon superior, care grupează mai multe ordine înrudite. Diviziunea reprezintă o grupare de clase înrudite. Pentru identificarea și încadrarea taxonomică corectă a tulpinilor bacteriene izolate într-un laborator de microbiologie cu dotare clasică este necesară confruntarea caracterelor fenotipice evidențiate pe parcursul examenului bacteriologic cu datele existente în determinatoare, manuale și ghiduri. Determinatorul cu cea mai largă utilizare în întreaga lume este ,, Bergey`s Manual of Systematic Bacteriology". 2.1.2. NOMENCLATURA BACTERIILOR Conform normelor generale de nomenclatură în biologie fiecare bacterie este numită prin două cuvinte latinizate, care caracterizează foarte sintetic bacteria respectivă. Primul cuvânt indică genul și se scrie cu iniţială majusculă iar cel de-al doilea, specia. Numele genurilor sunt inspirate , de regulă, de : - caracterele morfologice, frecvent forma şi modul de grupare (Bacillus = baston mic; Staphylococcus = ciorchine de strugure; Sarcina = pachet, etc.), asociate uneori cu habitatul natural al bacteriei (Lactobacillus = bastonaş din lapte); - numele bacteriologului care a izolat primul bacteria respectivă sau a avut merite deosebite în studiul ei : Brucella (Bruce), Pasteurella (Pasteur), Escherichia (Escherich) etc. Cel de-al doilea cuvânt denumeşte specia şi este descriptiv pentru substantivul care reprezintă genul. Numele speciei se scrie întotdeauna cu literă mică. El se poate referi la : - un caracter morfologic, cultural sau biochimic (Staphylococcus aureus, Lactobacillus acidophilus, etc.); - gazda receptivă (Brucella suis, Streptococcus equi, Mycoplasma gallinarum etc.); - boala, un simptom sau o leziune caracteristică (Clostridium tetani, Bacillus anthracis, Mycoplasma agalactiae, Listeria monocytogenes, etc.); - numele bacteriologului care a descris primul bacteria (Actinobacillus lignieresii, Clostridium chauvoei, Coxiella burneti, etc.). Numeroase specii bacteriene au şi nume comune, folosite deseori în vorbirea curentă, ca de exemplu : bacilul piocianic sau bacilul puroiului albastru , pentru Pseudomonas aeruginosa; bacilul lui Koch sau B.K., pentru Mycobacterium tuberculosis; bacilul tetanosului, pentru Clostridium tetani, etc Ordinul şi familia sunt denumite cu numele genului celui mai reprezentativ pentru gruparea taxonomică respectivă, la care se adaugă sufixele 17

,,ales” pentru ordin şi ,,aceae” pentru familie (ex. genul reprezentativ Rickettsia, ordinul Rickettsiales, familia Rickettsiaceae). Din anul 1980 se consideră valide numai denumirile (taxonii) citați în Lista Oficială a Denumirilor Bacteriene (Aproved List of Bacterial Names), care este reeditată periodic. Taxonii noi propuși și modificările aduse acestei liste după ultima ediție trebuie să fie oficializate prin publicarea în revista ,,International Journal of Systematic Bacteriology” (Răpuntean Ghe. și col., 2005).. 2.2 MORFOLOGIA ȘI BIOLOGIA BACTERIILOR 2.2.1 MORFOLOGIA CELULEI VEGETATIVE Cunoaşterea caracteristicilor morfologice (forma celulei, dimensiunile, modul de grupare, afinităţile tinctoriale) are o importanţă deosebită în identificarea și încadrarea taxonomică a bacteriilor deoarece, în practica curentă a diagnosticului bacteriologic, acestea constituie criterii taxonomice de bază. 2.2.1.1 Forma Și modul de grupare a bacteriilor După forma celulei, bacteriile pot fi grupate în patru categorii distincte: sferice, cilindrice, spiralate sau helicoidale şi pătrate (fig.1).

Fig. 1. Forme posibile la bacterii 1.coc sferic; 2.coc oval; 3.coc asimetric cu un pol ascuţit şi unul rotunjit; 4.coc asimetric reniform; 5.formă cocoidă; 6.cocobacil; 7.bacil fin; 8.bacil asimetric în formă de măciucă; 9.bacil cu capetele retezate; 10.bacil cu capetele rotunjite; 11.vibrion; 12.spirochetă cu spire mari; 13.spirochetă cu spire mici. La cele mai multe specii bacteriene, celulele fiice rezultate în urma diviziunii se separă şi rămân independente. La unele specii însă, majoritatea celulelor-fiice nu se despart timp de una sau mai multe generaţii formând constant grupări caracteristice cu valoare taxonomică. 18

Modul de grupare a bacteriilor este determinat de raportul geometric dintre planurile succesive de diviziune. Bacteriile sferice În terminologia curentă aceste bacterii poartă denumirea de coci. Cocii pot avea formă sferică, ovală, lanceolată sau reniformă, diametrele celulei fiind aproximativ egale. In funcţie de raporturile care se stabilesc între celulele-fiice după diviziune, cocii pot fi izolaţi sau grupaţi. Principalele moduri de grupare sunt (fig. 2): - diplococul, care rezultă prin diviziunea celulelor în planuri succesive paralele, celulele fiice rămânând grupate câte două; - streptococul, constituit din coci înlănţuiţi ca urmare a diviziunilor succesive în planuri paralele şi a persistenţei legăturilor între celulele fiice pe parcursul mai multor generaţii; - tetrada sau tetracocul - o grupare de patru celule rezultată din două diviziuni succesive în planuri perpendiculare; - sarcina - o grupare de opt coci sub forma a două tetrade suprapuse, care rezultă în urma a trei diviziuni în planuri perpendiculare: al doilea pe primul şi al treilea pe primele două; - stafilococul, la care planurile succesive de diviziune sunt dispuse în direcţii diferite astfel încât celulele rezultate formează grămezi neregulate, asemănătoare ciorchinilor de struguri

Fig.2 Modalităţile de grupare a cocilor în funcţie de orientarea planurilor de diviziune celulară.

19

Bacteriile cilindrice cunoscute sub denumirea comună de bacili, au formă de bastonaşe. Raportul dintre cele două axe variază însă foarte mult, încât, unii bacili au un aspect filamentos sau chiar ramificat iar alţii se apropie de forma sferic-ovală, fiind numiţi din acest motiv cocobacili. Bacilii pot fi drepţi sau uşor încurbaţi la mijloc sau la una din extremităţi, cu capetele tăiate drept ca la Bacillus anthracis, rotunjite ca la majoritatea speciilor, ascuţite ca la Fusobacterium fusiformis, sau dilatate în formă de pişcot sau de haltere - caracteristică a genului Corynebacterium. Diviziunea bacililor are loc după un singur plan transversal pe axul longitudinal. După diviziune bacilii pot rămâne izolaţi sau grupaţi câte doi (diplobcili), în lanţuri cu lungimi variabile (streptobacili), în palisadă (asemănător dinţilor unui pieptene) sau sub formă de idiograme chinezeşti (fig. 3).

Fig.3. Modalităţile de grupare a bacililor: 1.diplobacil; 2.grupare în forma literei V; 3.streptobacil; 4.filament; 5.filament cu citoplasmă granulară; 6.formă ramificată; 7.grupare în palisadă; grupare în ideograme chinezeşti. Bacteriile spiralate sau helicoidale In funcţie de numărul de spire şi flexibilitatea peretelui celular, există trei subtipuri morfologice de bacterii spiralate : - vibrionul, cu aspect de virgulă sau asemănător literei ,,S”; - spirilul, cu mai multe spire şi un perete celular rigid, care îi conferă stabilitate morfologică şi dimensională.; - spirocheta, alcătuită de asemenea din mai multe spire dar care sunt flexibile (se pot strânge sau relaxa) datorită elasticităţii peretelui celular . Bacteriile pătrate au fost puse în evidenţă în probele de apă hipersalină prelevate din bălţile Peninsulei Sinai. Ele formează adesea placarde de 4-16 celule rezultate din mai multe diviziuni succesive, la care se disting cu multă claritate planurile de diviziune. Forma pătrată a acestor bacterii şi faptul că sunt mult aplatizate (0,1 – 0,5 µm grosime) se explică prin lipsa presiunii interne a 20

celulelor în mediu hiperosmotic, situaţie în care, teoretic,bacteriile pot lua orice formă. 3.2.1.2. Constantele fizice Dimensiunile bacteriilor variază în funcţie de specie, între 0,1 –15 micrometri (µm) lungime (bacteriile filamentoase ajunând până la 500 µm) şi 0,02 – 2 µm diametru transversal. Din acest punct de vedere bacteriile pot fi grupate în trei categorii : mici 0,3 –1,5/0,1 –0,5 µm (ex. Brucella spp.); mijlocii 2 – 3/0,5 – 1 µm (ex.Escherichia spp.); mari 10 - 15/1 - 2 µm (ex. Bacillus spp., Clostridium spp. ). Volumul bacteriilor oscilează între 0,oo3 x 10-12 (ex. Mycoplasma spp. ) şi 7,068 x 10-12 (Bacillus megatherium ). Densitatea sau greutatea specifică a celulelor bacteriene este ceva mai mare decât a apei, situându-se între 1,07 şi 1,032. Datorită densităţii apropiate de cea a apei bacteriile plutesc în mediile lichide, din care pot fi separate prin centrifugare. 2.2.1.3. Structura celulei bacteriene Celula bacterină este constituită dintr-un înveliş şi un conţinut. Unele specii bacteriene sunt prevăzute în plus cu organite de mişcare (cilii sau flagelii) şi/sau cu organite de aderenţă (pilii sau fimbriile). In figura 4 este reprezentată schematic structura unei bacterii ipotetice, cu toate componentele menţionate.

Fig.4 Schema unei celule bacteriene tipice (www. ArabsLAB. com) ÎNVELIŞUL Principalele componente ale învelişului celulei bacteriene sunt : - membrana citoplasmatică, prezentă la toate bacteriile în contact intim cu citoplasma; 21

- peretele celular situat la exteriorul membranei, prezent la toate bacteriile cu excepţia micoplasmelor; - capsula şi glicocalixul – structuri extraparietale prezente numai la un număr restrâns de specii bacteriene şi numai în anumite condiţii de mediu. Membrana citoplasmatică Numită şi membrană plasmatică sau membrană celulară, această componentă esenţială a tuturor bacteriilor acoperă de jur împrejur citoplasma, separând-o de faţa internă a peretelui celular. Examinată la microscopul electronic, membrana citoplasmatică apare ca o formaţiune triplu stratificată, cu o grosime de 7,5–10 nanometri (nm), constituită dintr-un strat subţire electronotransparent delimitat de ambele părţi de câte un strat mai gros, electronoopac. Scheletul biochimic al membranei este format dintr-un strat dublu de fosfolipide orientate cu extremitatea hidrofilă (radicalul fosforic) spre exteriorul şi respectiv spre interiorul celulei şi extremitatea hidrofobă (două lanțuri de acizi grași), faţă în faţă (fig.5). Acest strat bimolecular fosfolipidic conferă membranei rolul de barieră osmotică şi constituie sediul a numeroase proteine funcționale: porine (prin oligomerizare delimitează pori transmembranari, mai mult sau mai puțin specifici, prin care au acces nutrienții), proteine de legare și transport a nutrienților în celulă şi a cataboliţilor în sens invers, enzime (hidrolitice, respiratorii ș.a.).

Fig.5 Membrana citoplasmatică - reprezentare schematică a unui model tridimensional (după Lodish şi Rothman,1979; cit.de Zarnea G., 1983). Membrana citoplasmatică este implicată, de asemenea, în reglarea proceselor de diviziune celulară şi sporogeneză. Prin invaginarea şi plierea membranei spre interiorul celulei bacteriene iau naştere nişte formaţiuni numite mezozomi, care îi măresc suprafața funcțională. 22

Peretele celular Peretele celular este situat la exteriorul membranei citoplasmatice, mai gros decât aceasta (15 – 30 nanometri), rigid şi poros. Structura morfochimică a peretelui celular este determinantă pentru grosimea, gradul de rigiditate şi afinitatea sa faţă de anumite substanţe colorante (afinitatea tinctorială). In funcţie de modul în care se colorează prin metoda Gram, bacteriile se împart în Gram pozitive (colorate în violet) şi Gram negative (colorate în roşu), iar prin metoda Ziehl – Neelsen, în acidorezistente (colorate în roşu) şi neacidorezistente (colorate în albastru). Peretele celular este format dintr-un strat bazal care aderă la membrana citoplasmatică, similar ca şi compoziţie chimică la toate bacteriile şi un strat superficial cu o structură diferită la cele trei categorii tinctoriale (Gram pozitive, Gram negative, acidorezistente), numit stratul structurilor speciale. Stratul bazal este un polimer glicopeptidic numit peptidoglican sau mureină (lat. murus=zid). El este format din macromolecule lungi de dizaharide aminate înlănțuite alternativ (N-acetilglucozamină şi acid Nacetilmuramic), dispuse paralel şi legate între ele prin punţi polipeptidice, realizând astfel o reţea care încorsetează celula şi îi conferă rezistenţă mecanică (fig.6 A și B).

A

B

23

Fig. 6 Structura rețelei de peptidoglican a peretelui celular la bacteriile Gram pozitive (A) și Gram negative (B). La bacteriile Gram pozitive peretele celular este gros şi rigid, alcătuit din 70-80% peptidoglican structurat într-o rețea tridimensională foarte rezistentă (fig.6 A). Stratul structurilor speciale conţine proteine, acizi teichoici, lipoteichoici şi la numeroase specii, acizi teichuronici, care sporesc rigiditatea peretelui celular (fig. 7 A). Peretele bacteriilor Gram negative, deşi mai subţire, are o structură mai complexă (fig. 7 B). Stratul bazal este format dintr-un complex peptidoglicanlipoproteină, cu un conținut mai mic de peptidoglican (~20%) structurat bidimensional (fig. 6B), iar stratul structurilor speciale este constituit dintr-o membrană externă în care predomină liopopolizaharidele (LPS). Componenta lipidică (lipidul A), situată proximal, se leagă de un miez polizaharidic (core) identic ca structură la toate bacteriile, care se continuă cu un lanț de trei, patru sau cinci unități zaharidice repetate ce constituie un important antigen al bacteriilor Gram negative (atg. O). Diferențele de structură chimică a atg.O identificate la tulpinile unor specii bacteriene (ex. Escherichia coli, Salmonella enterica) a permis clasificarea lor în mai multe grupe serologice. Complexul LPS în întregime are efect toxic constituind endotoxina bacteriilor Gram negative. Intre peretele celular şi membrana citoplasmatică a bacteriilor Gram negative se găseşte un spaţiu periplasmatic, care conţine proteine de legare cu rol în chimiotaxie şi numeroase enzime (fosfataza alcalină, enzime hidrolitice, deoxiribonucleaze etc.) cu rol în pregătirea substanţelor care au traversat peretele pentru trecerea lor prin membrana citoplasmatică. La bacteriile acidorezistente, structurile speciale sunt foarte bogate în complexe formate din acid micolic şi ceruri, fapt care explică rezistenţa acestora la decolorarea cu acizi (coloraţia Ziehl – Neelsen).

A

B 24

Fig. 7 Structura peretelui bacterian: A -la bacteriile Gram pozitive; Bla bacteriile Gram negative (www ArabsLAB.com) Peretele celulelor bacteriene are o semnificaţie biologică multiplă : - prin rigiditatea sa, asigură menţinerea formei celulelor bacteriene; - îndeplineşte rol protector faţă de factorii nocivi de mediu, în special faţă de şocul osmotic, având în vedere că mediile de viaţă ale bacteriilor sunt hipotonice în raport cu conţinutul celulei bacteriene; - prin porii săi, mediază schimbul de substanţe între celula bacteriană și mediu; - participă la procesul de creştere şi diviziune celulară urmând membrana citoplasmatică în formarea septurilor transversale, care separă celula-mamă în cele două celule-fiice; - conţine receptori pentru bacteriofagi şi bacteriocine; - conţine enzime autolitice care se activează în momentul sporulării eliberând sporul prin liza sporangiului şi în momentul germinării determinând liza învelişurilor sporale. Orice factor muralitic, care alterează sau inhibă sinteza peptidoglicanului (lizozimul, antibioticele de tip penicilinic, carenţele nutritive etc.) determină, atât ,,in vitro” cât şi ,,in vivo”, apariţia unor bacterii cu morfologie modificată, cunoscute sub denumirile de protoplaşti - forme bacteriene complet lipsite de perete provenite din bacterii Gram pozitive şi sferoplaşti - forme rezultate din bacterii Gram negative, care mai păstrează urme de perete. Dacă agentul muralitic dispare din mediu, sferoplaștii au capacitatea de a iniția sinteza și ansamblarea peptidoglicanului revenind la forma inițială. Aceste bacterii lipsite de perete celular sau cu peretele deficient sunt distruse prin deshidratare (uscare osmotică) în mediile hipertone și prin plasmoptiză (spargerea celulei prin hiperhidratare) în cele hipotone, deoarece membrana celulară neprotejată de perete este incapabilă să reziste presiunii osmotice. Capsula Capsula este o formaţiune extraparietală, prezentă numai la anumite specii bacteriene şi numai în anumite condiţii de mediu. Speciile patogene capsulează de regulă în organism dar şi pe mediile de cultură care conţin un lichid organic (ser sanguin, plasmă, lichid ascitic). Bacteriile capsulogene care interesează patologia veterinară sunt: Bacillus anthracis, Streptococcus pneumoniae, Klebsiella pneumoniae , Clostridium perfringens, Pasteurella multocida.

25

Capsulele acestor specii se deosebesc prin structura chimică, gradul de aderenţă la peretele cellular şi grosime (fig. 8). .

Fig.8 Tipurile de structuri capsulare la bacterii: 1.microcapsula; 2.capsula propriu-zisă; 3.stratul mucos; 4.zoogleea.P.C. - perete celular; M.C. – microcapsulă; mc – membrană citoplasmatică. Din punct de vedere chimic, capsula este formată din 98% apă, restul fiind reprezentat de polizaharide sau polipeptide (în funcţie de specie), care constituie antigene bacteriene cu o mare specificitate, notate cu litera ,,K". Funcţia biologică a capsulei este de a proteja celula bacteriană faţă de acţiunea unor factori nocivi. În organism, capsula are rol în evitarea procesului de fagocitoză, constituind un important factor de patogenitate. Înafara organismului, prin conţinutul crescut de apă capsula protejează bacteriile de efectele deshidratării. CONŢINUTUL Conţinutul celulei bacteriene se compune din citoplasmă şi genom bacterian. Citoplasma Citoplasma celulei bacteriene are consistenţă de gel, nu prezintă curenţi citoplasmatici şi în consecinţă, nici deplasări evidente ale elementelor componente. Citoplasma reprezintă sediul materialului genetic şi al unor structuri cu caracter de granule, incluzii şi vacuole. Spre deosebire de celulele eucariote, in citoplasma celulelor bacteriene lipsesc mitocondriile, aparatul Golgi şi reticulul endoplasmatic propriu-zis. Ribozomii sau granulele lui Palade reprezintă elementele de bază ale citoplasmei, în care apar ca mici granule relativ sferice, cu un diametru de 10-20 nanometri, numărul lor fiind de ordinul zecilor de mii. Din punct de vedere chimic, ribozomii sunt alcătuiţi din acid ribonucleic (65%) şi proteine (30-35%). Sub raport funcţional, ribozomii constituie sediul sintezei proteinelor structurale şi enzimatice. Incluziile sunt structuri inerte, prezente inconstant în citoplasma bacteriilor. Ele reprezintă materiale de rezervă care se acumulează în celulă 26

direct proporţional cu vârsta şi conţinutul mediului în substanţe nutritive. Din punct de vedere chimic, incluziile sunt formate din polimeri organici (amidon, glicogen, acid poli-β-hidroxibutiric), cristale de substanţe anorganice (sulf, carbonat de calciu) şi polimeri anorganici. Cromatoforii, prezenţi la bacteriile fotosintetizante, sunt organite specializate în procesele de biosinteză prin mecanisme analoage fotosintezei plantelor. Vacuolele sunt variabile ca mărime (0,3 – 0,5 µm) şi număr (6-20/celulă), fiind mai frecvent întâlnite la celulele tinere. Ele pot conţine lichide cu rol în reglarea presiunii osmotice, sau gaze. Pigmenţii sunt substanţe colorate prezente în citoplasma bacteriilor cromogene. Speciile patogene pentru om şi animale, producătoare de pigmenţi sunt: Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Rhodococcus equi, Mycobacterium tuberculosis.. În funcție de localizarea pigmenților, bacteriile pot fi: - cromofore (pigmentul este present în citoplasmă); - paracromofore (pigmentul este legat de fața internă a peretelui cellular), de exemplu, stafilococii; - cromopare (pigmentul este eliberat din celulă în mediul extern) – de exemplu, bacteriile din genul Pseudomonas. Semnificaţia biologică a pigmenţilor bacterieni diferă în funcţie de natura chimică a pigmentului, fără a fi complet elucidată. Ei pot avea rol fotosintetic (clorofilele), protector (pigmenții carotenoizi protejează bacteriile față de radiațiile ultraviolete), funcție vitaminică, antibiotică sau enzimatică (vitamina K, respectiv, piocianina, flavoproteinele). In citoplasma celulelor bacteriene se găseşte cea mai importantă parte din echipamentul enzimatic răspunzător de metabolismul celulei, precum şi diferite tipuri de ARN (mesager, ribozomal şi solubil). Citoplasma constituie sediul metabolismului bacterian unde se desfăşoară procesele de asimilaţie şi dezasimilaţie, precum şi alte funcţii vitale ale celulei bacteriene cum sunt reproducerea şi sporogeneza. Materialul genetic Materialul genetic al bacteriilor este constituit din nucleu şi din plasmide . Nucleul este format dintr-un singur cromozom şi nu este delimitat de o membrană proprie. Pentru a marca aceste diferenţe faţă de nucleul celulelor eucariote, termenul de ,,nucleu” a fost înlocuit cu termenii de ,,nucleoid”, ,,genom bacterian”, ,,cromozom bacterian” sau ,,nucleozom”. Cromozomul este constituit dintr-o macromoleculă de ADN bicatenar care conţine 4 x 106 perechi de nucleotide şi are o lungime de aproximativ 1 mm. Macromolecula de ADN se află însă într-o stare condensată, prin pliere, spiralare şi superspiralare astfel încât ocupă doar 5-16% din volumul celulei. Pe lângă ADN, cromozomul bacterian mai conţine cantităţi reduse de proteine, lipide şi ARN. 27

Plasmidele sunt molecule mici de ADN dublu catenar, independente de cromozom, caracteristice pentru celula procariotă. Atât cromozomul cât şi plasmidele au posibilitatea de autoreplicare. Replicarea plasmidelor are loc independent de cea a cromozomului. Funcţia biologică a materialului genetic constă în determinarea caracterelor care definesc fiecare specie bacteriană şi transmiterea lor ereditară ORGANITELE CELULARE Organitele celulare (cilii sau flagelii, pilii și fimbriile) sunt formaţiuni extraparietale facultative, prezente numai la unele specii bacteriene, cu rol în procesele de adaptare la mediu. Cilii (flagelii ) Cilii sunt organite de formă cilindrică, cu diametrul de 12-25 nanometri şi lungimea de 25-30 micrometri, cu rol în în mişcare, bacteriile ciliate fiind mobile. Cel mai adesea nu pot exista simultan cilii și capsula. Între speciile bacteriene ciliate există diferenţe sub aspectul numărului şi al modului de dispunere a cililor pe suprafaţa celulei bacteriene, distingându-se următoarele categorii de bacterii: atricha (neciliate), monotricha (un singur cil dispus polar), lofotricha (un smoc de cili la unul din poli) amfitricha (unul sau mai mulți cili la ambii poli), și peritricha (numeroși cili pe toată suprafața celulei) – fig. 9.

Fig. 9. Numărul şi modalităţile de dispunere a cililor pe suprafaţa celulei bacteriene: 1- atricha; 2- monotricha; 3- lofotricha; 4- amfiticha; 5peritricha. Bacteriile realizează o mişcare de rostogolire când cilii se rotesc în sensul acelor de ceasornic şi o deplasare în linie dreaptă când aceştia se rotesc în sens antiorar. În determinarea direcţiei de deplasare intervin mecanisme de tip chimiotactic; substanţele utile metabolismului bacterian (glucidele, aminoacizii, ionii de calciu şi de magneziu, oxigenul pentru bacteriile aerobe etc.) sunt atractante, exercitând un chimiotactism pozitiv asupra bacteriilor ciliate iar cele

28

nocive (alcoolii, ionii de hidrogen, ionii hidroxil, metalele grele etc.) au un efect repelant (de respingere) printr-un chimiotactism negativ. Din punct de vedere chimic, cilii sunt compuși dintr-o proteină contractilă numită flagelină. Asemănător substanțelor capsulare, flagelinele bacteriene reprezintă antigeni cu mare specificitate, notați cu litera ;;F". Pilii (fimbriile Pilii sunt apendici filamentoşi mult mai subţiri şi mai scurţi decât cilii dar mult mai numeroşi, aşezaţi peritrich pe suprafaţa bacteriilor şi vizibili numai la microscopul electronic. Denumirile prin care sunt desemnate aceste structuri sugerează caracteristicile lor morfologice: fimbrii (lat. fimbria = franjuri), pili (lat. pilus = păr). In funcţie de unele caractere morfologice, de număr şi de funcţia biologică pe care o îndeplinesc, se deosebesc 6 tipuri de pili, notate cu cifre romane de la I la V şi cu litera F (pilul sexual sau donor). In ultimii ani există tendinţa de a departaja, din punct de vedere semantic, cei doi termeni - ,,fimbrii” şi ,,pili” - în sensul utilizării primului pentru desemnarea tipurilor I-V şi a celui de-al doilea, numai pentru pilii de sex. Fimbriile sunt formaţiuni tubulare compacte, fără canal, cu ajutorul cărora bacteriile aderă la suprafaţa epiteliilor şi a altor substraturi, fiind considerate factori de patogenitate. Pilii de tip F, denumiţi şi pili sexuali, sunt structuri tubulare străbătute de canal axial. Ei sunt codificaţi de o plasmidă numită factorul ,,F” (de fertilitate sau de sex), care conferă celulei purtătoare proprietatea de donor de material genetic sau celulă-mascul (F+). Rolul pililor ,,F” este analog organului copulator, deoarece prin lumenul lor are loc transferul de ADN de la o celulă bacteriană F+ la una F- în cadrul procesului de conjugare - o formă primitivă de sexualitate, singura posibilă la bacterii. 2.2.2. FIZIOLOGIA BACTERIILOR 2.2.2.1. COMPOZIŢIA CHIMICĂ A CELULEI BACTERIENE Compoziţia chimică elementară a bacteriilor, sub aspectul conţinutului în elemente biogene, nu diferă de a celorlalte organisme vii. Compoziţia moleculară se diferenţiază însă de cea a organismelor vegetale şi animale prin prezenţa unor constituenţi moleculari specifici bacteriilor. O celulă bacteriană conţine aproximativ 3000-6000 tipuri de molecule diferite, dintre care aproximativ jumătate aparţin compuşilor anorganici cu masă moleculară mică (apa şi sărurile minerale), iar cealaltă jumătate, compuşilor organici cu diverse grade de complexitate structurală (glucide, lipide, acizi nucleici, proteine). 29

Apa reprezintă 75-80% din masa celulară. Cea mai mare cantitate se găsește liberă în citoplasmă și doar o mică parte sub formă legată (în structura constituienților celulari) Ea provine din mediul extern, de unde bacteriile o preiau prin difuzie simplă și într-o măsură mai mică din unele procese metabolice, fiind rezultatul unor reacții oxidative ale compușilor ce conțin hidrogen în moleculă. Rolul apei: - constituie mediul de dispersie pentru celelalte componente celulare; - participă la procesele metabolice; - în prezența apei libere proteinele structurale, dar mai ales cele enzimatice se degradează termic foarte ușor, asfel încât bacteriile în stare vegetativă sunt omorâte la 55-60°C în 15-20 minute. Sporii, deoarece conțin foarte puțină apă liberă, rezistă la temperaturi mult mai ridicate (100-120°C temperatură umedă). Datorită efectului ei bactericid, căldura utilizată prin diverse procedee (autoclavare, tindalizare, etuvare ș.a.) constituie principalul factor de sterilizare a materialelor din laboratoarele de diagnostic microbiologic. Sărurile minerale reprezintă 3 – 30% din greutatea bacteriilor uscate. Elementele care intră în compoziţia lor sunt: P, K, Na, Cl, S, O, H, Fe şi în proporţii mai reduse, Mg, Cu, şi Zn. Sărurile minerale îndeplinesc următoarele funcţii biologice: • asigură reglarea presiunii osmotice la nivelul membranei citoplasmatice; • realizează sistemul tampon adecvat menţinerii pH-ului optim al mediului celular; • activează unele sisteme enzimatice, rol pe care îl îndeplinesc mai ales ionii de Cu şi de Mg; • intră în structura unui important număr de constituienţi celulari (rol plastic). Proteinele reprezintă 40-80% din greutatea uscată a celulei bacteriene și se găsesc sub formă simplă, sub formă de complexe glucido-lipido-polipeptidice și sub formă de heteroproteine (mucoproteine, cromoproteine, nucleoproteine). În structura lor apar anumiți aminoacizi existenți doar la bacterii (de ex., acizii teichoici, acidul micolic, acidul diaminopimelic, acidul glutamic dextrogir). Din punct de vedere al rolului pe care îl îndeplinesc, proteinele bacteriene pot fi grupate în : • proteine constitutive, care fac parte din structura diferitelor componente celulare, şi • proteine enzimatice, care constituie biocatalizatorii întregii activităţi metabolice a celulei bacteriene. Din aproximativ 3000 de tipuri de proteine ale unei celule bacteriene, 2000 sunt enzime. Numărul mare de enzime conferă bacteriilor o intensă activitate metabolică. Fiecare specie bacteriană dispune de un echipament enzimatic caracteristic, care poate fi pus în evidență utilizând substraturi adecvate enzimelor și diferiți reactivi. 30

Examenul caracterelor metabolice ale bacteriilor constituie un criteriu de bază în identificarea tulpinilor bacteriene (criteriu taxonomic). Clasificarea enzimelor 1. După locul de acțiune: endoenzime (enzime intracelulare care catalizează reacțiile de biosinteză); exoenzime (enzime eliminate de bacterii în mediul exterior, unde acționeză asupra substanțelor cu moleculă complexă transformându-le în nutrienți, sau conferă bacteriilor virulență). 2. După modul de acțiune asupra substratului nutritiv: hidrolaze (proteinaze, RN-aze, DN-aze, lipaze, carbohidraze etc.); transferaze; oxidoreductaze (desmolaze); izomeraze (racemaze). 3. După modul de apariție: enzime constitutive (elaborate permanent); enzime inductibile sau adaptative (sintetizate numai în prezența nutrienților asupra cărora acționează); enzime mutative (absente la o specie, ele apar consecutiv unei mutații iar sinteza lor are loc numai la mutanta respectivă). Glucidele totalizează 14 – 25% din greutatea celulelor bacteriene uscate, proporţia lor variind în funcţie de specia bacteriană, vârsta culturii şi compoziţia chimică a substratului nutritiv. Ele sunt reprezentate de aproximativ 200 tipuri de molecule, incluzând mono-, di-, tri- şi polizaharide. Spre deosebire de celula vegetală, în structura bacteriilor nu intră celuloza. Glucidele îndeplinesc, după caz, rol plastic, energetic sau de material de rezervă. Lipidele, prezente în celula bacteriană în proporţie de 1 – 20 % din greutatea uscată a bacteriilor, pot fi din punct de vedere chimic, gliceride, fosfatide, steride şi ceruri. Fosfatidele şi cerurile sunt prezente cu precădere la bacteriile acido-alcalo-alcoolo-rezistente din genul Mycobacterium. Cu excepția micoplasmelor, bacteriile nu conțin colesterol. Alături de glucide, lipidele constituie rezervele nutritive ale celulei bacteriene cu un potenţial energetic crescut. Acizii nucleici. Spre deosebire de virusuri, care conţin un singur tip de acid nucleic, în celula bacteriană sunt prezenţi ambii acizi nucleici. Acidul dezoxiribonucleic (ADN) reprezintă aproximativ 1/5 din conţinutul celulei, fiind constituientul nucleoidului, respectiv al cromozomului bacterian şi al plasmidelor (fragmente de material genetic extracromozomal). Acidul ribonucleic (ARN), se găseşte în citoplasmă sub cele trei forme diferite sub aspectul mărimii moleculei şi al funcţiei biologice pe care o îndeplinesc în mecanismul sintezei proteinelor: ARN mesager, ARN de transport sau solubil şi ARN ribozomal. ARN-ul total constituie 10 – 20 % din greutatea uscată a celulei.

31

Rolul biologic al acizilor nucleici este acelaşi la toate organismele vii. El a fost menţionat la structura celulei bacteriene şi urmează a fi detaliat în capitolul de genetică microbiană. 2.2.2.2. NUTRIŢIA LA BACTERII Microorganismele, ca şi celelalte organisme vii, sunt caracterizate printr-o activitate fiziologică neîntreruptă, mai mult sau mai puţin intensă, în cursul căreia cresc, se divid ,îşi modifică structura, compoziţia chimică şi poziţia în mediu, etc. Exercitarea acestor activităţi presupune prezenţa în mediile lor de viaţă a unor substanţe nutritive utilizabile în sinteza constituienţilor celulari (surse plastice) şi a unor surse de energie . Exigenţe şi tipuri nutritive la bacterii Posibilităţile bacteriilor de a folosi diverse surse plastice şi energetice sunt extrem de variate. Considerate în ansamblu, microorganismele sunt cele mai omnivore organisme cunoscute, deoarece îşi realizează metabolismul folosind cele mai diverse surse de substanţe nutritive: de la N molecular, CO2 şi S, până la substanţele organice complexe. In raport cu sursa de energia pe care o utilizează în procesul de nutriţie, bacteriile se încadrează în două tipuri principale : - tipul fototrof care utilizează energia luminoasă transformând-o în energie de legare chimică cu ajutorul unor pigmenţi asemănători clorofilei; - tipul chimiotrof, lipsit de pigmenţi fotosintetizanţi, pentru care unica sursă de energie o reprezintă reacţiile biochimice de oxidoreducere. Pe baza capacităţii de a utiliza substanţele anorganice şi organice ca surse de material de sinteză şi energie se diferenţiază : - tipul litotrof ( lith = piatră ) sau autotrof ( în sensul de independent , liber ) căruia îi aparţin bacteriile capabile să-şi sintetizeze toţi constituenţii celulari pornind de la surse simple anorganice de C şi de N ca : CO2 , NH3, NO2 ,NO3 ,etc.; - tipul organotrof sau heterotrof în care se încadrează bacteriile dependente de materia organică, care nu se pot dezvolta decât în prezenţa substanţelor organice ca surse de energie , C şi N . Deci, în timp ce autotrofele prin sintezele lor generează substanţe organice, heterotrofele le descompun. Ansamblând cele două criterii, bacteriile fototrofe pot fi împărţite în fotoautotrofe ( fotolitotrofe ) şi fotoorganotrofe ( fotoheterotrofe ), iar bacteriile chimiotrofe se pot clasifica , de asemenea, în chimioautotrofe ( chimiolitotrofe ) şi chimioorganotrofe ( chimioheterotrofe Deoarece bacteriile autotrofe nu interesează bacteriologia medicală şi medical-veterinară, în 32

continuare vor fi menţionate numai sursele de substanţe organice pentru cele mai importante elemente biogene necesare bacteriilor chimioheterotrofe, categorie în care se încadrează majoritatea bacteriilor patogene. Principala sursă de carbon pentru aceste bacterii o reprezintă glucidele şi polialcoolii. Sursele de azot organic sunt reprezentate în primul rând de aminoacizi, urmaţi în cazul a numeroase specii, de alte substanţe cu azot diferite ca grad de complexitate: uree, peptone, proteine . Unele bacterii patogene pot folosi şi surse de azot anorganic, cum este amoniacul rezultat din hidroliza ureei sau din reducerea nitraţilor în nitriţi şi a nitriţilor în amoniac. Inafară de carbon şi azot, toate bacteriile au nevoie de macroelemente (P, S, O, H, K, Mg, Fe, Ca,Mn etc.) şi microelemente ( Cu, Zn, Mo etc.), acestea din urmă fiind indispensabile activităţii catalitice a unor enzime. 2.2.2.3 METABOLISMUL BACTERIAN Prin analogie cu celula vegetală şi animală, metabolismul bacterian implică totalitatea reacţiilor biochimice catalizate enzimatic care permit bacteriilor să obţină din nutrienţi, atât compuşii necesari pentru sinteza constituienţilor celulari, cât şi energia necesară pentru aceste sinteze şi pentru alte activităţi care necesită consum de energie. Activitatea metabolică a bacteriilor poate fi diferenţiată în metabolism energetic care include catabolismul şi respiraţia şi metabolism de sinteză sau anabolismul. 2.2.2.3.1 Catabolismul Substraturile exogene care pot constitui surse energetice şi plastice pentru bacteriile heterotrofe sunt reprezentate în majoritatea cazurilor de compuşi organici cu structură complex : proteine, glucide, lipide. Eliberarea energiei prin procesele de catabolism se realizează treptat, în trei faze distincte. Faza I . Macromoleculele sunt dezansamblate în unităţile lor de construcţie: proteinele în aminoacizi, polizaharidele în monozaharide, iar lipidele în glicerol şi acizi graşi. In această primă fază se eliberează de obicei mai puţin de 1% din energia totală a macromoleculelor care se pierde în bună parte sub formă de căldură. Faza II. Aminoacizii, monozaharidele şi acizii graşi rezultaţi în prima etapă suferă o degradare incompletă cu formarea de produşi intermediari - amoniac, acid piruvic, acizi graşi inferiori, etc.- bioxid de carbon şi apă. Energia eliberată reprezintă aproximativ o treime din energia totală a substraturilor iniţiale. In această fază, hexozele pot fi metabolizate pe căi diferite - calea glicolizei, calea Entner-Doudoroff sau calea hexozomonofosfatului - dar produşii finali nu sunt foarte diferiţi. In mod similar , aminoacizii pot fi 33

catabolizaţi pe căi diferite , dar, indiferent de calea utilizată , rezultatul constă în formarea de acetil-Co A sau de intermediari ai ciclului acizilor tricarboxilici ( ciclul Krebs ) . Faza III In cursul acestei faze, produşii intermediari sunt descompuşi în CO2 şi H2O pe calea acizilor tricarboxilici, rezultând, de regulă, cantitatea maximă de energie. Nu toate substraturile ajung însă la această ultimă fază. In multe cazuri, degradarea se opreşte la produşii intermediari care sunt deseori preluaţi sub formă de precursori şi introduşi în filiera reacţiilor anabolice sub acţiunea enzimelor biosintetizante. Pentru produşii finali rezultaţi din activitatea catabolică, celula bacteriană dispune de multiple căi de utilizare, şi anume : -hidrogenul rezultat din procesele de oxidare este introdus în circuitul respirator pentru reacţiile de reducere cu cedare către alţi acceptori. -oxigenul rezultat în urma reacţiilor de reducere este valorificat în procesele de oxidare; -energia rezultată în diferite etape ale catabolismului este utilizată în procesele endergonice (consumatoare de energie) ale biosintezelor celulare. 2.2.2.3.2 Respiraţia Bacteriile ,ca toate celelalte vieţuitoare, respiră, ceea ce în sensul obişnuit al cuvântului înseamnă că ele consumă oxigen pentru a produce cu ajutorul lui reacţii chimice exoterme eliberatoare de energie. Pasteur a observat cel dintâi că unele specii bacteriene trăiesc şi se înmulţesc în absenţa oxigenului mai bine chiar decât în prezenţa lui, deci respiră fără oxigen. Această constatare, pe lângă altele, a dus la o lărgire a conţinutului noţiunii de respiraţie, în sensul că se numeşte proces respirator orice reacţie chimică eliberatoare de energie care se petrece ,,in vivo" în prezenţa sau în absenţa oxigenului. Bacteriile chimiotrofe îşi procură cea mai importantă parte a energiei prin procesul de respiraţie celulară, care constă într-o succesiune de reacţii de oxidoreducere biologică ce pot avea loc în aerobioză sau anaerobioză. Principala sursă de energie o constituie glucidele, în special glucoza (fig. 10). Prin oxidoreducere biologică se înţelege pierderea atomilor de H (e¯ şi + H ) din molecula unei substanţe chimice ( S ) care se oxidează eliberând energie şi transferul lor către o substanţă acceptoare ( A ), care se reduce, conform ecuaţiei: SH2 + A< => S + AH2 + energie Respiraţia la bacterii se rezumă în esenţă, la preluarea hidrogenului rezultat din reacţiile catabolice prin intermediul unor enzime numite dehidrogenaze şi cedarea lui către un acceptor final care poate fi oxigenul sau altă substanţă. După natura acceptorului final de electroni de H , respiraţia bacteriană este de trei feluri: 34

- respiraţia aerobă (oxibiotică), un proces de oxidare completă a substraturilor cu ajutorul oxigenului molecular ca acceptor final de H şi eliberarea unei cantităţi mari de energie (de exemplu, glicoliza) ; - respiraţia anaerobă (anoxibiotică) în care acceptorul final de H poate fi orice substanţă anorganică, exceptând oxigenul; - fermentaţia, un proces de oxidare parţială, care are loc în condiţii de anaerobioză sau în prezenţa oxigenului dar fără intervenţia lui şi în care electronii din structura unei substanţe organice sunt transferaţi pentru a se forma alţi compuşi organici. Energia este obţinută, aşadar, prin utilizarea compuşilor organici atât ca donatori cât şi ca acceptori de electroni. Spre deosebire de respiraţia aerobă, în cursul fermentaţiei se eliberează o mică parte din energia conţinută în substratul iniţial, rezultând numeroşi produşi de degradare parţială, care diferă în funcţie de microorganismul care a produs fermentaţia (fig.11).

Fig. 10 Glicoliza şi fermentarea glucozei

35

Fig. 11 Produşii de fermentaţie a glucozei relizată de unele bacterii şi levuri

Deoarece eliberarea bruscă a energiei din substraturile oxidate - într-o singură treaptă (aşa cum arată reacţia de mai sus) - ar fi dăunătoare pentru celulă, transferul hidrogenului către acceptor se realizează în mai multe etape, cu participarea unui întreg arsenal de enzime respiratorii (dehidrogenaze piridinice, flavinice, citocromi) .Ele se reduc şi se oxidează succesiv prin preluarea şi respectiv cedarea hidrogenului de la una la alta către acceptorul final, constituind sistemul transportor de electroni sau catena de respiraţie celulară. O parte din energia eliberată prin oxido-reduceri este utilizată direct pentru unele funcţii celulare (transportul activ al nutrienţilor, biosinteze, mobilitate etc.) iar energia suplimentară (care depăşeşte nevoile de moment ale celulei bacteriene) este înmagazinată în macromolecule de adenozin-trifosfat (ATP) - compus macroergic care derivă din acidul adenozin-monofosforic (AMP) prin două fosforilări oxidative consecutive, cuplate cu lanţul respirator.

2.2.2.3.3 Anabolismul Anabolismul constă în reacţii enzimatice prin care se efectuează sinteza constituienţilor celulari, pornind de la produşii intermediari ai catabolismului sau de substanţele preluate din mediu. 36

Ca şi procesele de catabolism, reacţiile de biosinteză se realizează tot în trei faze care se succed în sens invers: - producerea de subunităţi care vor intra în componenţa macromoleculelor specifice fiecărui constituient celular; - activarea subunităţilor cu ajutorul energiei eliberate prin descompunerea compuşilor macroergici de tip ATP (adenozin-trifosfat) în care a fost stocată pe parcursul degradării diferiţilor compuşi ; - formarea de macromolecule prin polimerizarea sau condensarea subunităţilor activate. Totuşi, căile catabolice şi anabolice pentru un anumit substrat nu sunt complet reversibile. Reacţiile anabolice au ca punct de plecare , de cele mai multe ori, compuşi intermediari foarte diferiţi de cei care rezultă din catabolismul compusului respectiv iar enzimele implicate sunt parţial diferite . De exemplu, catabolismul serinei duce la formarea de piruvat, în timp ce sinteza ei începe de la 3-fosfoglicerat; histidina este catabolizată la α-cetoglutarat, iar sinteza ei este iniţiată de la ribozo-5-fosfat; degradarea glicogenului la acid lactic este catalizată de 12 enzime dintre care numai 9 catalizează reacţii reversibile .

2.2.2.4. CRESTEREA ȘI MULTIPLICAREA BACTERIILOR 2.2.2.4.1 Creşterea bacteriilor Creşterea se poate realiza uni- sau multidimensional, în funcţie de locul şi modalitatea de dispunere a substanţei nou elaborate. După Lamanna (cit. de Zarnea, 1984), există următoarele posibilităţi teoretice de creştere a celulei bacteriene: - creşterea la una din extremităţi ; - creştera la ambele extremităţi ; - creşterea în vecinătatea constituirii viitorului sept de diviziune ; -creşterea prin intususcepţiune (depunerea de substanţă nouă diseminat şi intercalat printre constituienţii celulari preexistenţi); - creştere prin depunerea materialului nou în zona periferică a celulei (limitrof învelişului). In cursul creşterii celulei bacteriene, raportul suprafaţă / volum se micşorează treptat datorită faptului că în timp ce suprafaţa bacteriilor creşte cu o raţie pătratică, volumul lor se măreşte cu o raţie cubică. Ori, activitatea normală a bacteriilor este condiţionată de existenţa unui raport optim între volumul celulei, care consumă şi suprafaţa ei, prin care se face absorbţia substanţelor nutritive şi eliminarea cataboliţilor. In consecinţă , pe parcursul creşterii, aportul 37

de substanţe nutritive din mediu satisface din ce în ce mai puţin exigenţele metabolice ale celulei iar echilibrul ei chimic se alterează deoarece circulaţia substanţelor prin difuzie în ambele sensuri devine mai dificilă. Din cauza acestor perturbări, atunci când disproporţia dintre suprafaţă şi volum atinge un anumit punct critic, raportul lor adecvat se restabileşte prin diviziunea celulei. Astfel, diviziunea celulară este prin ea însăşi o formă necesară de reglare a activităţii celulei bacteriene (Buiuc şi colab., 2002) 2.2.2.4.2. Multiplicarea bacteriilor Spre deosebire de organismele pluricelulare la care multiplicarea celulelor duce la mărirea taliei individului, la bacterii şi la toate celelalte organisme unicelulare, ea are ca rezultat creşterea numărului de indivizi şi implicit a populaţiei respective. Majoritatea speciilor bacteriene se multiplică prin diviziune directă (diviziune simplă, sciziparitate) iar un număr redus de grupuri taxonomice se poate multiplica pe alte căi: prin corpi elementari, ramificare, înmugurire, spori. Multiplicarea prin diviziune directă constă în scindarea unei celule bacteriene care a atins punctul critic de creştere în două celule-fiice, cel mai frecvent identice. La bacteriile de formă alungită (bacili, spirochete), diviziunea se face transversal după un plan perpendicular pe marele ax al celulei, în centrul acesteia şi rareori excentric. La coci, diviziunea se poate realiza după unul, două sau trei planuri perpendiculare succesive. In urma diviziunii, celulele rezultate se pot separa sau, la numeroase specii, pot să rămână unite una sau mai multe generaţii realizând grupări caracteristice cu valoare taxonomică. Diviziunea celulei bacteriene este precedată şi iniţiată de replicarea semiconservativă a ADN-ului cromozomial. Nucleoizii nou formaţi sunt segregaţi prin intervenţia mezozomilor, astfel încât cele două celule surori vor fi dotate cu o copie a genomului celulei parentale Multiplicarea prin corpi elementari a fost descrisă la chlamidii, la care, pe lângă diviziunea directă există posibilitatea desfăşurării unui ciclu vital. Punctul de plecare al acestui ciclu este reprezentat de corpii elementari-structuri corpusculare mici (0,2–0,5micrometri), electronoopace. In celula gazdă, fiecare corp elementar creşte transformându-se în corp iniţial sau reticulat (0,8 – 1,5 micrometri), care se multiplică prin diviziune directă. Celulele fiice rezultate se vor reorganiza transformându-se în corpi elementari. Multiplicarea prin ramificare, înmugurire şi spori - proprie ciupercilor microscopice (miceţi filamentoşi şi levuri) – este întâlnită doar la actinomicete şi unele bacterii fotosintetizante. 2.2.2.4.2.1 Dinamica multiplicării bacteriilor

38

Deoarece examinarea directă a bacteriilor în diferite medii naturale este foarte dificilă, se cunosc puţine date referitoare la multiplicarea populaţiilor bacteriene în natură (Zarnea, 1994). Cultivarea bacteriilor în laborator a permis însă un studiu detaliat al dinamicii procesului de multiplicare în condiţii experimentale şi al relaţiilor dintre multiplicare şi factorii de mediu. S-a constatat astfel că o cultură bacteriană prezintă în cursul existenţei sale patru faze, distincte prin viteza de multiplicare a germenilor şi prin numărul de celule vii pe unitatea de volum. Aceste faze sunt: faza iniţială de adaptare ,de latenţă sau de lag1, faza de multiplicare exponenţială sau logaritmică, faza staţionară şi faza de declin. Multiplicarea în mediile lichide. Faza de latenţă este cuprinsă între momentul introducerii celulelor bacteriene în mediu, prin însămânţare sau transplantare şi momentul când ele încep să se multiplice (în medie, 2 ore), perioadă în care cultura nu este vizibilă macroscopic. Faza de multiplicare exponenţială sau logaritmică se caracterizează prin multiplicarea celulelor bacteriene, la debut cu o viteză progresiv mărită, apoi într-un ritm constant şi caracteristic pentru fiecare specie bacterian. La majoritatea bacteriilor patogene, în condiţii optime , diviziunile se succed la intervale de 20-30 de minute, timp care reprezintă vârsta unei generaţii şi care este urmat de dublarea populaţiei bacteriene. Durata fazei de multiplicare logaritmică este în medie de 6-24 de ore Faza staţionară urmează unei scurte perioade (aproximativ 2 ore) în care multiplicarea nu se mai produce în progresie geometrică ci într-un ritm care scade progresiv. Incetinirea multiplicării este determinată de modificarea mediului de cultură (scăderea concentraţiei nutrienţilor, acumularea metaboliţilor toxici în concentraţii inhibitorii, reducerea conţinutului în oxigen, etc.), dar mai ales de realizarea unei concentraţii maxime de celule bacteriene pe unitatea de volum (3× 107 - 3× 109 pe ml). O dovadă a faptului că principala cauză este o problemă de spaţiu, o constituie multiplicarea de înlocuire care caracterizează această perioadă, în care rata de creştere a populaţiei bacteriene este nulă. Practic, diviziunile continuă numai în limita disponibilităţilor de spaţiu create prin moartea unor celule. Această fază durează de la câteva ore până la 7-8 zile, în funcţie de specie. Faza de declin se caracterizează prin absenţa diviziunilor şi moartea logaritmică a celulelor bacteriene până la sterilizarea mediului. Cauzele care duc la moartea bacteriilor sunt multiple şi sunt legate în special de epuizarea substanţe nutritive, diminuarea rezervelor respiratorii şi acţiunea toxică exercitată de cataboliţii acumulaţi în mediu. Uneori un număr mic de bacterii poate supravieţui câteva săptămâni sau luni pe seama substanţelor nutritive eliberate prin autoliza celulelor moarte. 1

(engl. to lag =a întârzia, a rămâne în urmă) 39

Fenomenul este cunoscut sub denumirile de reluarea creşterii, creştere criptică sau canibalism. S-a estimat că pentru un supravieţuitor sunt necesare substanţele provenite de la aproximativ 50 de celule moarte (Grecianu A., 1986 ). In faza de declin, bacteriile prezintă un polimorfism accentuat determinat de prezenţa celulelor îmbătrânite, cu forme atipice (celule sferice, mici sau gigante, deformate, filamentoase, ramificate, etc.) şi cu afinitate tinctorială scăzută. Evitarea erorilor generate de aceste modificări reclamă efectuarea examenelor pentru încadrarea taxonomică, testarea patogenităţii, testarea sensibilităţii bacteriilor ş.a., numai pe culturi în faza exponenţială. Multiplicarea bacteriilor pe mediile solide. Particularităţile multiplicării pe mediile solide se datorează în primul rând absenţei mişcărilor browniene care asigură dispersarea bacteriilor în masa mediilor lichide şi accesul nediscriminatoriu al celulelor la resursele nutritive. Prin urmare, atât pe suprafaţa cât şi în profunzimea mediilor solide, în urma multiplicării rezultă aglomerări de milioane de bacterii care, în funcţie de abundenţa inoculului şi activitatea aparatului ciliar, pot îmbrăca macroscopic două forme: colonia izolată şi gazonul bacterian. Colonia reprezintă o masă compactă de celule rezultate, de regulă, din multiplicarea unei singure celule bacteriene. După declanşarea fazei logaritmice, diviziunile se distanţează treptat pe măsură ce colonia creşte, deoarece între celulele bacteriene care o compun se creează diferenţe privind posibilităţile de acces la substanţele nutritive din mediu sau la oxigen (în cazul speciilor aerobe) în funcţie de poziţia lor: limitrofă mediului sau în centrul coloniei. Celulele de la periferia coloniilor, deoarece beneficiază de un aport optim de oxigen şi de nutrienţi, se multiplică activ în timp ce bacteriile din centrul coloniei pot fi moarte. Dezvoltarea unei colonii bacteriene este condiţionată nu numai de interacţiunile celulelor individuale ci şi de influenţa coloniilor vecine; cu cât coloniile sunt mai numeroase şi mai dese, cu atât sunt mai mici, din cauză că se jenează reciproc prin eliminarea de metaboliţi toxici şi prin diminuarea concentraţiei nutrienţilor. Gazonul reprezintă cultura care rezultă prin confluarea coloniilor în cazul unui inocul abundent, sau prin invazia mediului de către bacteriile ciliate peritrich,- fenomen numit roire sau căţărare. 2.3. MORFOLOGIA ŞI BIOLOGIA SPORULUI BACTERIAN Sporul bacterian este o formă de rezistență a unor specii bacteriene în condiţii nefavorabile pentru celula vegetativă.

40

Procesul de formare a sporului are loc în interiorul celulei vegetative (endospor) şi poartă denumirea de sporogeneză. In condiţii de mediu optime are loc germinarea sporului, din care va rezulta o nouă celulă vegetativă. Faptul că într-o celulă vegetativă se formează un singur spor, iar prin germinarea acestuia rezultă o singură celulă vegetativă, demonstrează că sporogeneza la bacterii nu reprezintă o cale de înmulţire. Excepţie fac actinomocetele, singurele bacterii la care, ca şi la ciupercile microscopice, sporul reprezintă o formă de reproducere. Speciile sporogene patogene pentru om şi animale aparţin genurilor Bacillus şi Clostridium. 2.3.1. Sporogeneza Sporogeneza este un proces de formare în interiorul celulei bacteriene a unei celule de tip nou, diferită din punct de vedere chimic, enzimatic şi fiziologic. In celula vegetativă, asupra genelor care codifică acest proces acţionează inhibitor un represor sintetizat pe baza unor compuşi chimici preluaţi din mediu. Când substanţele respective sunt epuizate şi represorul nu mai este prezent în celulă, genele sunt depresate şi se exprimă fenotipic prin declanşarea procesului de sporogeneză. Alţi factori care influenţează favorabil sporogeneza sunt: anumite limite de temperatură (la Bacillus anthracis între 18o C şi 420 C), uscăciunea, o anumită densitate a germenilor pe unitatea de volum etc. Sporogeneza evoluează în trei faze succesive: stadiul preparator, formarea presporului şi maturarea acestuia (fig. 13).

Fig. 13 Fazele sporogenezei: 1 – celula bacteriană în stadiul premergător sporogenezei; 2 – scindarea materialului genetic cromozomal; 3 – formarea presporului prin constituirea septului de sporogeneză; 4 – formarea cortexului; 5,6 – formarea celorlalte învelişuri sporale; 7 – spor liber (după Răducănescu H. şi col.,1986).

41

Pregătirea celulei pentru procesul de sporogeneză constă în replicarea semiconservativă a AND-ului nuclear cu formarea a doi cromozomi distincţi. Formarea presporului presupune, într-un stadiu incipient, separarea celor doi cromozomi printr-un sept transversal rezultat din invaginarea membranei citoplasmatice. Cele două segmente celulare vor evolua pe căi diferite, unul devenind prespor iar celălalt, sporangiu. Sporangiul se autolizează eliberând sporul (ex. Bacillus cereus), sau rămâne ataşat de spor un timp nedefinit (ex. Clostridium tetani. Maturarea sporului se realizează prin următoarele transformări care se petrec în prespor: • morfogeneza învelişurilor sporale; • apariţia unor compuşi chimici specifici, inexistenţi în celula vegetativă; • reducerea sensibilă a activităţii metabolice; • dobândirea rezistenţei la factorii fizici şi chimici faţă de care celula vegetativă este sensibilă. 2.3.2. Morfologia sporului In frotiuri, sporii se pot găsi liberi, ataşaţi de celula în care s-au format sau în interiorul acesteia, având formă rotundă, ovală sau cilindrică. In cazul când sporul rămâne în interiorul sporangiului el poate fi aşezat central, subterminal (în apropierea unui capăt), terminal (la unul din capete) sau lateral (fig. 14). Diametrul sporului poate fi egal, mai mare sau mai mic în comparaţie cu diametrul transversal al celulei bacteriene. In funcţie de poziţia sporului şi raportul dintre cele două diametre, bacteriile sporulate pot adopta diferite forme cu semnificaţie taxonomică, şi anume: • bacil nedeformat (bacteridie) cu sporul situat central, caracteristică pentru bacteriile din genul Bacillus; • bacil deformat de sporii care depăşesc diametrul transversal al celulei vegetative (clostridie), având aspect de: ♦ lămâie, când sporul este situat central; ♦ sticlă de lampă de petrol, când sporul este situat subterminal; ♦ rachetă de tenis sau băţ de chibrit, cu spor sferic terminal; • bacil asimetric cu sporul excentric, caracteristic speciei Bacillus laterosporus.

42

Fig.14 Raporturi posibile între spor şi sporangiu: 1 – spor liber; 2 – spor central nedeformant; 3 – 6, diferiţi spori cu diametrul transversal mai mare decât al celulei (3 - central; 4 – subterminal; 5 – terminal; 6 – lateral). 2.3.3. Ultrastructura sporului Părţile componente ale sporului bacterian sunt redate în figura 15.

Fig.15 Anatomia sporului: 1 – sâmburele sporului; 2 – sporoplasma; 3 – nucleoplasma; 4 – ribozomi; 5 – cortex; 6 - învelişuri sporale externe; 7 – exosporium. 1. inima sporului numită şi

sâmbure, ,, core “ sau protoplast sporal,

cuprinde: sporoplasma, corespunzătoare citoplasmei, dar mai densă şi cu aspect granular, şi ♦ materialul nuclear sau nucleoplasma. 2. membrana internă (intina), similară membranei citoplasmatice, care rezultă din creşterea septului sporal în jurul protoplastului; 3. cortexul sporal constituit din peptidoglican modificat, similar peretelui bacterian; 4. învelişul extern (exina sau tunicile sporale), pluristratificat; 5. exosporium, un înveliş suplimentar analog capsulei, prezent numai la sporii anumitor specii; 6. corpii parasporali, formaţiuni cristaloide obseservate pe suprafaţa sporilor unor specii bacteriene patogene pentru insecte (ex. Bacillus thuringiensis) Afinităţile tinctoriale ale sporului diferă de cele ale celulei vegetative, astfel încât prin metoda Gram se colorează palid numai conturul sporului, nu şi conţinutul. Pentru colorarea acestuia sunt necesare metode energice, care presupun colorarea la cald cu soluţii concentrate, capabile să impregneze structurile dense ale sporului. ♦

43

2.3.3.4. Particularităţile sporului Particularităţile biochimice Din punct de vedere biochimic, sporii se caracterizează printr-un conţinut mai redus în apă liberă, săruri de fosfor, săruri de potasiu şi acizi nucleici. Ei conţin într-o proporţie mai mare decât celula vegetativă, cisteină, ioni de calciu şi ioni magneziu. In spor se găsesc şi unii compuşi chimici absenţi în celula vegetativă, cum sunt enzimele litice sporale şi dipicolinatul de calciu. Particularităţile fiziologice ale sporului constau în faptul că nu realizează schimburi de substanţe cu mediul ambiant, nu creşte şi nu se multiplică. Insuşirile biologice Sporii bacterieni se caracterizează printr-o rezistenţă foarte mare la căldură, radiaţii, uscăciune şi acţiunea substanţelor chimice, asigurând supravieţuirea speciei în natură o perioadă îndelungată (zeci, sute, sau chiar mii de ani)2. De exemplu, sporii de Bacillus anthracis îşi păstrează capacitatea de germinare timp de peste 70 de ani şi rezistă câteva ore la 120 0 C şi câteva minute la 1800 C căldură uscată. Sporii altor specii îşi menţin viabilitatea timp de o săptămână în fenol 5% şi mai multe săptămâni în alcool. Rezistenţa sporilor la factorii nocivi din mediul extern este asigurată de: - starea de deshidratare (apă 40-50%, faţă de 80-90% la formele vegetative) şi conţinutul foarte scăzut în apă liberă; - apa ,,legată” nu poate participa la reacţiile chimice de denaturare şi coagulare a proteinelor prin căldură, antiseptice şi dezinfectante ; - prezenţa unei cantităţi mari de dipicolinat de calciu, care are rolul de a modifica conformaţia proteinelor enzimatice, conferindu-le astfel termostabilitate; - numărul mare de învelişuri protectoare. 2.3.3.5 Implicaţiile sporogenezei în patologie şi epidemiologie Bacteriile sporogene se caracterizează printr-o existenţă saprofită. Nişa ecologică naturală a speciilor sporulate patogene pentru om şi animale este solul. De aici, în mod accidental ele pot ajunge pe diverse căi în organism provocând îmbolnăviri cunoscute sub denumirea generică de infecţii telurice (antraxul, tetanosul, cărbunele emfizematos), sau în alimente unde elaborează toxine determinâd toxiinfecţii alimentare (Clostridium botulinum, Bacillus cereus, Clostridium perfringens). S-au gasit spori viabili în roci care s-au format în era cuaternară şi care au fost scoase de la adâncimi de 37-45 m. Prezenţa unui număr de 5-10 spori pe gram de rocă, exclude contaminarea ulterioară (Zarnea G., 1983) . 2

44

2.4 ACȚIUNEA FACTORILOR FIZICI ȘI CHIMICI ASUPRA BACTERIILOR Ca şi viaţa organismelor superioare, viaţa microorganismelor este dependentă şi permanent influenţată de complexul factorilor fizici, chimici şi biologici, care constituie mediul ambiant. Sub acțiunea unor astfel de factori, care influențează nefavorabil reacțiile metabolice implicate în procesele de creștere și multiplicare, apar dezechilibre care se pot traduce prin: ♦ moartea microorganismelor (efect microbicid); ♦ oprirea reversibilă a multiplicării (efect bacteriostatic, efect micostatic); ♦transformarea în spori, în cazul bacteriilor sporogene; ♦ modificarea microorganismelor, fie prin inducerea mutaţiilor, fie prin selectarea mutantelor rezistente. Determinarea unuia sau altuia dintre aceste efecte depinde de caracteristicile factorului activ (intensitatea sau concentraţia lui), particularităţile morfofiziologice ale microorganismului supus acţiunii sale (structura învelişurilor celulare, sporogeneza, antibiorezistenţa etc.), natura mediului în care are loc acţiunea (microorganismele înglobate în produse patologice, alimente, medii de cultură şi alte substanţe organice complexe sunt mai rezistente decât cele aflate într-o suspensie apoasă), timpul de acţiune (pentru acelaşi efect, timpul de acţiune este direct proporţional cu intensitatea factorilor fizici şi concentraţia celor chimici) etc. Studiul acţiunii factorilor de mediu asupra microorganismelor a avut drept rezultat elaborarea metodelor şi a produselor utilizate pentru prevenirea şi combaterea infecţiilor: metodele de sterilizare, dezinfecţia chimioterapia, antibioterapia. 2.4.1 Acţiunea factorilor fizici asupra bacteriilor Temperatura Spre deosebire de temperaturile extreme, care sunt nocive, temperaturile moderate permit desfăşurarea normală a proceselor metabolice şi prin aceasta, creşterea şi multiplicarea bacteriilor. Ansamblul acestor valori termice reprezintă zona temperaturilor de dezvoltare. În această zonă, cuprinsă între –5 şi 70-800C, există valori care corespund temperaturii optime, minime şi maxime de dezvoltare pentru o specie dată. În funcţie de preferinţele termice, bacteriile, ca şi celelalte microorganisme, au fost grupate în trei categorii: 1. psichrofile (criofile), nepatogene, se multiplică la temperaturi cuprinse între 0° și 35° C, având temperatura optimă de dezvoltare de 15°C; 45

mezofile, al căror interval termic de dezvoltare se situează între 10° și 45°C, optimum termic fiind de 37°C. În această categorie intră majoritatea bacteriilor patogene pentru om și animale. 3. termofile, nepatogene, au un preferendum termic cuprins între 50° şi 800C. Ele sunt prezente în apele uzate calde provenite de la diferite industrii, furajele însilozate, platformele de gunoi. Temperatura maximă la care s-ar putea desfăşura încă procesele metabolice a fost extinsă, pe baza unor date experimentale, până la 1500C (bacterii hipertermofile). Temperaturile care depăşesc limitele maxime tolerabile ale bacteriilor (temperaturile supramaximale) sunt nocive determinând moartea acestora. Efectul bactericid al căldurii – factorul cel mai utilizat în sterilizare - este atribuit în primul rând denaturării proteinelor celulare, în special a enzimelor, care sunt termosensibile Căldura umedă prezintă un grad de penetrație mai ridicat și un efect nociv mai puternic. De aceea metodele de sterilizare prin căldură umedă (fierberea, autoclavarea, tindalizarea, pasteurizarea, ultrapasteurizarea) necesită temperaturi mai mici sau un timp de expunere mai scurt comparativ cu procedeele de sterilizare prin căldură uscată (flambarea, încălzirea la roșu, etuvarea, incinerarea). Temperaturile scăzute sunt mai bine tolerate de microorganisme decât temperaturle supramaximale. La temperaturile frigiderului (+4, + 100 C), majoritatea bacteriilor trec într-o stare de latență, care poate să dureze luni şi chiar ani de zile dacă se evită uscarea. Stocarea în frigider reprezintă şi la ora actuală metoda curentă de conservare a culturilor bacteriene, alimentelor, medicamentelor şi a altor produse biologice. Procesul de îngheţare lentă, la temperaturi puţin sub 00 C, are un puternic efect bactericid determinat de deshidratare, concentrarea electroliţilor în celulă (,,moarte prin sare ”) și ruperea învelişurilor celulei bacteriene sub acţiunea cristalelor de ghiaţă intra- și extracelulare. Înghețul și dezgheţul repetat reprezintă o metodă de dezintegrare a bacteriilor pentru extracţia conţinutului celular. La temperaturi mult mai scăzute (- 300 C, - 400 C), efectul bactericid este practic anulat, deoarece îngheţarea bruscă împiedică cristalizarea apei, care trece într-o stare amorfă, vitroasă (Zarnea G., 1970; Duca Eugenia, 1974). Decongelate brusc până la temperaturile optime de multiplicare şi introduse în medii favorabile, bacteriile îşi reiau metabolismul, creşterea şi multiplicarea. Congelarea bruscă la -300,-800C asociată cu uscarea în vid constituie un procedeu de conservare a unor produse biologice (culturi bacteriene, extracte celulare, toxine, antibiotice etc.), numit liofilizare (gr. lio=lichid; filein=a atrage). 2.

Gradul de ionizare (pH-ul) În general, pH-ul optim pentru bacteriile patogene este neutru sau uşor alcalin, cuprins între 7,2-7,4 - pH care corespunde cu gradul de ionizare al 46

ţesuturilor şi umorilor organismului. Există însă și excepții cum sunt de exemplu, vibrionul holeric adaptat la mediile bazice (pH optim=8,5-9) și specia Helicobacter pylori, căreia i se atribuie responsabilitatea etiologică în ulcerul gastroduodenal la om, capabilă să reziste la aciditatea gastrică (pH=1,6-2,0). Ionii de H (mediile acide) sunt mai toxici decât ionii oxidrilici OH (mediile alcaline) Presiunea osmotică Presiunea osmotică a unei soluţii este direct proproţională cu concentraţia totală a ionilor şi moleculelor prezente în soluţie. În condiţii normale, o soluţie molară a unui ion oarecare are o presiune osmotică de 22,4 atmosfere. În general, presiunea osmotică din interiorul celulelor bacteriene este mai mare decât a mediilor de cultură uzuale, datorită faptului că citoplasma conţine în stare solvită cantităţi mari de substanţe minerale şi organice. Ca urmare, apa din mediu tinde să pătrundă în celulă pentru egalizarea concentraţiilor intra- şi extracelulare a substanţelor solvite, determinând o stare de turgescenţă a acesteia, caracteristică de altfel tuturor celulelor vii. Dezvoltarea bacteriilor decurge normal atunci când mediul lor de viaţă are o presiune osmotică aproximativ echivalentă cu cea intracelulară, deci în condiţii de izotonie. Excepţie fac bacteriile osmofile, care se dezvoltă numai în medii cu presiune osmotică ridicată şi bacteriile osmotolerante sau facultativ osmofile, care se pot dezvolta la presiuni osmotice variabile. Ele se numesc halofile atunci când se dezvoltă în condiţiile unei salinităţi crescute (apa mărilor şi a oceanelor, a lacurilor sărate şi a salinelor, în care concentraţia de NaCl poate atinge 16 – 35 % ) şi zaharofile când se dezvoltă în prezenţa unei concentraţii mari de zahăr (50 – 70%). Dintre bacteriile patogene, doar stafilococii, vibrionii şi listeriile sunt capabile să se dezvolte în medii hipersaline (Larpent J.P., 2000). Majoritatea bacteriilor - protejate de un perete celular suficient de rezistent (mai ales la Gram pozitive) – suportă relativ uşor modificările presiunii osmotice, dacă abaterile de la izotonie survin lent. În cazul variaţiilor mari şi bruşte ale presiunii osmotice, bacteriile suferă două tipuri de modificări: plasmoliza şi plasmoptiza. Plasmoliza (uscarea osmotică, ratatinarea) se produce în mediile hipertone, deoarece apa din celulă trece în mediul extracelular. În consecinţă, unele bacterii intră într-o fază de viaţă latentă, iar altele mor. Uscarea osmotică are aplicaţii în conservarea alimentelor prin saramurare şi zaharare. Prezenţa bacteriilor osmofile în aceste condiţii nu determină întotdeauna alterarea alimentelor, unii halofili având chiar o acţiune utilă prin participarea la procesele de ,,maturare” a unor alimente (brânzeturi, carne sărată, murături ş.a.). Plasmoptiza are loc în cazul suspendării bacteriilor într-un mediu hipotonic (de exemplu, apa distilată). Din cauza pătrunderii apei din exterior, turgescenţa 47

celulei creşte până când presiunea intracelulară, depăşind capacitatea de distensie a peretelui celular, determină ruperea învelişurilor şi moartea bacteriei. Presiunea hidrostatică Rezistenţa bacteriilor la acţiunea presiunilor înalte este variabilă în funcţie de habitatul lor natural şi este favorizată de capacitatea de sporogeneză; sporul este de două ori mai rezistent decât forma vegetativă. În funcţie de comportarea lor în raport cu valoarea presiunii hidrostatice, bacteriile pot fi (Zarnea G., 1994): a) barofobe, sensibile la presiuni care depăşesc 200 de atmosfere – categorie în care se încadrează bacteriile din sol, apele puţin adânci, zonele de suprafaţă a oceanelor şi mărilor; b) barofile - bacterii care populează adâncul mărilor (- 1500m) şi sunt adaptate la presiuni de 400-500 atmosfere, în lipsa cărora unele specii (barofilele absolute) nu se pot dezvolta; c) barotolerante, care preferă presiunea normală (1 atm.) dar suportă şi presiuni moderat ridicate; d) barodure sau abisale, izolate de pe fundul mărilor şi din adâncul oceanelor (5100 m), capabile să reziste la 1000 – 1400 atmosfere (ex. Pseudomonas bathycetes). Majoritatea bacteriilor sunt foarte sensibile la modificările bruşte alternative ale presiunii, astfel încât compresarea şi decompresarea poate constitui un procedeu de distrugere a celulelor bacteriene. Radiaţiile Efectul radiaţiilor solare asupra microorganismelor diferă în funcţie de lungimea de undă a acestora. Conținutul energetic al radiaţiilor cuprinse între 12 000 A0 şi 2000 A0 poate provoca modificări fotochimice cu efect bactericid. O largă utilizare în practica decontaminării o au radiaţiile ultraviolete (UV) cu lungimea de undă cuprinsă între 2540 – 2800 A0, care acționează asupra ADN –ului bacterian, prin ruperea punţilor de hidrogen intercatenare şi înlocuirea lor cu legături mai solide, de tip dimer timină-timină, blocând astfel replicarea ADN-ului (Zarnea G.,1970; Țogoe I.,2006). Efectul letal al UV se exercită şi în mod indirect, prin acţiunea fotochimică asupra mediului (formarea de ozon în aer şi peroxizi în ape). O largă utilizare în decontaminarea aerului și a suprafețelor din laboratoare, boxe de lucru, săli de operație etc., o au lămpile care produc radiații UV în urma descărcărilor electrice între doi electrozi plasați în atmosferă de vapori de mercur. Radiaţiile cu lungimi de undă sub 2000 A0 au un conţinut energetic atât de ridicat încât moleculele situate pe traiectul lor sunt ionizate prin desprinderea electronilor, de unde şi denumirea de radiaţii ionizante dată radiaţiilor X, 48

particulelor alfa, beta şi gama şi radiaţiilor cosmice. Efectul ionizării este mutagen sau letal, în funcţie de capacitatea de penetrare a radiaţiei. Iradierea cu radiații ionizante emise de cobaltul radioactiv (Cobalt60) sau cu acceleratorul de particule este utilizată la scară industrială pentru a steriliza produse medicale (seringi de unică utilizare, sisteme de perfuzie, sonde etc.) și consumabile de laborator (plăci Petri și anse de însămânțare din material plastic), care nu suportă sterilizarea termică. Factorii mecanici Având dimensiuni mici şi un perete rigid, bacteriile sunt în general rezistente la leziunile de ordin mecanic. Totuşi, particulele mici şi dure, sub formă de pudre fine, pot distruge peretele celular dacă sunt agitate energic cu o suspensie bacteriană. Ultrasunetele Ultrasunetele (vibraţiile cu o frecvenţă mai mare de 20 000 Hz) produc moartea bacteriilor prin ,,bombardare" cu bulele de gaz care se formează în apa extra- și intracelulară, ca rezultat al agitaţiei produse de vibraţiile cu frecvenţă înaltă (fenomenul de cavitație).. Acţiunea bactericidă a ultrasunetelor a găsit aplicaţii în industria vaccinurilor pentru dezintegrarea celulelor bacteriene în scopul eliberării antigenelor somatice, în separarea endoenzimelor bacteriene sau a altor constituienţi chimici ai celulei bacteriene şi în sterilizarea anumitor produse.

Factorii chimici În funcţie de natura şi concentraţia lor, substanţele chimice pot exercita asupra bacteriilor un efect favorabil, atunci când pot fi utilizate ca surse plastice şi energetice, sau un efect nociv (bacteriostatic sau bactericid), prin producerea unor dezechilibre fizico–chimice. De exemplu, în concentraţie de 1% zaharoza reprezintă o sursă de carbon şi energie, iar în concentraţii mari (40%) se comportă ca un agent bacteriostatic faţă de majoritatea speciilor. Acţiunea substanţelor chimice diferă nu numai în raport cu natura şi concentraţia unei substanţe date, ci şi în funcţie de particularităţile fiziologice ale bacteriilor supuse acţiunii ei. Mycobacterium tuberculosis, de exemplu, reclamă pentru dezvoltare, prezenţa în mediul de cultură a glicerinei - substanţă nocivă pentru restul speciilor bacteriene. Substanţele cu efect antibacterian au o largă utilizare în acţiunile de prevenire şi combatere a bolilor infecţioase prin decontaminare (dezinfectantele şi antisepticele), precum şi în terapia acestora (antibioticele și chimioterapicele de sinteză). Substanţele utilizate în decontaminare – acţiunea de îndepărtare, neutralizare sau distrugere a microorganismelor de pe suprafaţa elementelor animate şi neanimate - se numesc dezinfectante dacă, din cauza efectelor 49

iritante sau toxice, pot fi aplicate numai pe suprafeţe inerte (duşumele, jgheaburi, pereţi, instrumentar etc.) şi antiseptice, dacă toxicitatea mai redusă permite aplicarea lor pe tegumente, mucoase sau plăgi (Coman I., Bârhală Helena-Maria, Florescu Rodica, 1997; Buiuc D., Neguţ M., 1999). Uneori, aceeaşi substanţă (de exemplu, cloramina) în soluţii diluate este antiseptic, iar în soluţii concentrate, dezinfectant. Agenţii decontaminanţi îşi exercită acţiunea nocivă asupra microorganismelor pe diverse căi: ♦ modificarea permeabilităţii peretelui celular şi a membranei citoplasmatice (fenolul, săpunurile, detergenţii anionici şi cationici); ♦ denaturarea proteinelor, determinând inactivarea enzimelor şi precipitatea sau coagularea proteinelor structurale (acizii, alcalii, alcoolii); ♦ interferenţa cu grupările active ale enzimelor, blocând sau modificând activitatea enzimatică (formaldehida, sărurile metalelor grele, permanganatul de K, peroxizii, clorul ) etc. Chimioterapicele sunt produse de sinteză cu acţiune toxică selectivă asupra microorganismelor, fiind lipsite de nocivitate pentru celula animală, fapt care permite utilizarea lor în terapia infecţiilor. Principalele grupe de substanţe chimioterapice sunt: sulfamidele, nitrofuranul şi derivaţii acestuia, acidul paraaminosalicilic (PAS), hidrazida acidului nicotinic (HIN), etanbutolul, acidul nalidixic şi derivaţii săi, etc. Majoritatea au efect bacteriostatic şi acţionează ca, inhibitori competitivi ai unor produşi de metabolism esenţiali pentru celula bacteriană. Sulfamidele, de exemplu, acţionează prin blocarea sintezei acidului folic - factor indispensabil pentru formarea acizilor nucleici, respectiv pentru creşterea şi multiplicarea bacteriilor. Datorită analogiei sterice cu acidul paraaminobenzoic (vitamina H), care este precursor în sinteza acidului folic, sulfamidele intră în competiţie cu acesta, substituindu-l şi formând analogi nefuncţionali ai acidului folic (fig.25). Bacteriile cu funcţiile de creştere blocate din cauza sulfamidelor, care acţionează ca o antivitamină, sunt distruse de organism prin elementele naturale de apărare ale acestuia.

50

Fig.25 Mecanismul de acţiune al sulfamidelor

NOŢIUNI DE MICOLOGIE GENERALĂ Ciupercile microscopice (micromicetele, fungii, mucegaiurile) reprezintă un grup heterogen de microorganisme larg răspândite în natură. Se apreciază că există aproximativ 3000-4000 de genuri de miceţi cu peste 200000 de specii. Micromicetele au un tip de organizare eucariot, sunt constituite din ansambluri celulare (micelii, pseudomicelii) deseori specializate pe funcţii şi se multiplică printr-o mare diversitate de forme sexuate şi asexuate. Pe baza însuşirilor morfologice şi fiziologice, ciupercile microscopice au fost împărţite în două grupe mari: levurile (drojdiile) şi ciupercile filamentoase (mucegaiurile). Între aceste două forme distincte se plasează 51

fungii dimorfi care, în raport de condiţiile de mediu (organism, mediu de cultură, temperatură etc.), pot creşte fie ca levuri, fie ca fungi filamentoşi. 3.1

ÎNCADRAREA TAXONOMICĂ ȘI NOMENCLATURA CIUPERCILOR MICROSCOPICE

În prezent ciupercile microscopice sunt incluse într-un regn de sine stătător, regnul FUNGI cu două încrengături: PSEUDOMYCOTA și EUMYCOTA. Principalele caractere discriminatorii pentru subdiviziunile taxonomice sunt structura miceliului (septată, neseptată), posibilitatea de reproducerea sexuată și caracteristicele formelor sexuate Încrengătura Pseudomycota cuprinde subîncrengătura Mastigomycotina, care include miceți lipsiți de importanță medicală, cu excepția speciei Rhinosporidium seeberi (Nichita Ileana, 2007). Fungii de importanță medicală sunt plasați în încrengătura Eumycota care se subdivide în patru subîncrengături: Zygomycotina, Ascomycotina, Bazidiomycotina, Deuteriomycotina . Nomenclatura ciupercilor microscopice este cea binară – latină, conformă cu normele Codului Internațional al Nomenclaturii Botanice (International Cod of Botanical Nomenclature – ICBN).

3.2 MORFOLOGIA CIUPERCILOR MICROSCOPICE Unitatea funcţională a micromicetelor este celula, cu o structură specifică şi o compoziţie particulară, care o individualizează în lumea vieţuitoarelor microscopice. În marea lor majoritate, ciupercile microscopice dispun de următoarele structuri: - un perete extern rigid (la levuri, cu o structură mai densă spre exterior şi mai laxă în zonele superficiale), cu funcţii protectoare, în structura căruia intră substanţe proteice, polizaharide (hemiceluloză, glucan, manan, chitină), acizi organici superiori; - membrană citoplasmatică lipoproteică ce conţine steroli (compuşi care la bacterii sunt prezenţi numai la micoplasme); - citoplasmă, în care se găsesc organite (mitocondrii, reticul endoplasmatic, aparat Golgi) şi structuri granulare (ribozomi, substanţe de rezervă); - nucleu, delimitat de membrană nucleară şi alcătuit din carioplasmă, 2-4 cromozomi şi nucleol. Levurile 52

Levurile au, de regulă, o organizare unicelulară asemănătoare bacteriilor. Celulele levurice au formă sferică sau ovală şi pot forma ansambluri celulare numite pseudomicelii (fig.16.).

Fig.16 Aspectul morfologic levurilor cu forme pseudomiceliene

53

al

Ciupercile filamentoase Ciupercile filamentoase reprezintă grupul de fungi situaţi pe o treaptă filogenetică superioară levurilor, deoarece la ele apare diferenţierea ansamblurilor celulare pe principalele funcţii vitale: de nutriţie şi de reproducere. Ele sunt constituite din filamente lungi şi subţiri numite hife, care formează în ansamblul lor un miceliu adevărat numit şi tal. Miceliul majorităţii ciupercilor filamentoase este format din două părţi distincte morfologic şi fiziologic: aparatul vegetativ şi cel reproducător. Aparatul vegetativ este constituit din hife ramificate care pot fi septate delimitând celule cilindrice uninucleate, sau neseptate numite sifonoplaști, alcătuite dintr-o unică celulă multinucleată (fig.17).

Fig.17

Tipuri de micelii fungice: A- miceliu neseptat B- miceliu

septat Septurile prezintă pori prin care citoplasma, uneori şi nucleii trec dintr-o celulă în alta, sub influenţa curenţilor intracitoplasmatici. Ele conferă hifelor un grad crescut de rezistenţă şi rigiditate. Indiferent de tipul de miceliu (septat sau neseptat), numărul nucleilor este relativ constant pentru o anumită specie şi pentru speciile înrudite. Sub aspectul raportului cu mediul pe care se dezvoltă, la un miceliul se pot deosebi două porţiuni: - sistemul rizoidal constituit din hife fine, ramificate şi bine implantate în mediu; - miceliul aerian format din hife care se detaşează din sistemul rizoidal şi care sunt mai puţin ramificate şi mai rezistente. Aparatul reproducător este constituit din hife aeriene specializate pe care se formează organele de înmulţire numite în mod curent “corpi fructificanţi”, deoarece conţin spori în interiorul sau pe suprafaţa lor (endo-, respectiv ectospori). 54

Morfologia corpilor fructificanţi se caracterizează printr-o mare diversitate, constituind un important criteriu de diferenţiere a numeroaselor specii de fungi (criteriu taxonomic). 3.3 MODALITĂŢILE DE ÎNMULŢIRE ALE CIUPERCILOR MICROSCOPICE Reproducerea micromicetelor se face pe cale vegetativă şi prin spori A. Reproducerea vegetativă se poate realiza prin diviziune directă, întâlnită cu precădere la levuri şi prin creşterea în lungime urmată de ramificarea hifelor, caracteristică pentru ciupercile filamentose. B. Reproducerea prin spori este, de asemenea, de două feluri: reproducere prin spori imperfecţi şi reproducere prin spori perfecţi. B.1 Sporii imperfecţi (mitotici, asexuaţi) iau naştere prin transformarea în spor a unor celule constituiente ale miceliului sau pseudomiceliului şi poartă denumirea generică de talospori și printr-un proces de morfogeneză în interiorul sau pe suprafaţa corpilor fructificanţi. Din categoria talosporilor fac parte blastosporii, clamidosporii, artrosporii şi aleuriile, iar sporii asexuaţi derivaţi din corpii fructificanţi sunt sporangiosporii şi conidiosporii. Blastosporii iau naştere printr-un proces de burjeonare sau înmugurire. întâlnit mai frecvent la levuri. Procesul constă în formarea unui ˵mugure", reprezentând o celulă-fiică, prin evaginarea peretelui celular al celulei-mamă. Pe celula de origine, mugurii pot fi dispuşi polar, bipolar sau multilateral. Atunci când celulele-fiice nu se transformă în spori separându-se de celula-mamă ci continuă formarea de muguri adiţionali, rezultă, în cazul levurilor, pseudomicelii arborescente.

Clamidosporii se formează în interiorul celulei hifale (endospori) într-un mod asemănător sporilor bacterieni (fig.28). Ei au peretele îngroşat şi citoplasma condensată, fiind deosebit de rezistenţi la căldură şi uscăciune. Clamidosporii sunt spori de rezistenţă programaţi genetic să asigure, prin structura lor, persistenţa speciei în condiţii nefavorabile, ca şi sporii bacterieni. Prin comparaţie cu aceştia, ceilalţi spori vegetativi şi sporii sexuaţi (meiotici) sunt doar spori de înmulţire deoarece nu rezistă mult timp în mediul ambiant. Ei sunt programaţi genetic să germineze rapid şi să regenereze aparatul micelian, asigurând înmulţirea ciupercilor microscopice în condiţii favorabile de mediu. Artrosporii sau oidiile (Zarnea G.,1970) se formează la mucegaiurile septate prin fragmentarea în celulele componente a unor hife vegetative terminale (fig.18). 55

Fig. 18 Genul Geotrichum: segmentarea hifelor terminale pentru a forma artrospori (A) si modul de formare al clamidosporilor (C); B- artrospor pe cale de germinare Aleuriile sunt sporii unor ciuperci dermatofite ce se dezvoltă pe filamentul micelian, de care rămân ataşaţi; pot avea diferite mărimi (macroaleurii, microaleurii) şi diverse moduri de dispunere (fig.19).

Fig.19 Corpi fructificanti la ciuperci dermatofite: 1.Tricophyton; 2Microsporum Sporangiosporii sunt caracteristici fungilor neseptaţi din genurile Mucor, Absidia şi Rhizopus (fig.20). Ei se formează în interiorul unor corpi fructificanţi cu aspect globulos numiţi sporangi sau sporocişti, rezultaţi prin dilatarea extremităţii unor hife fertile (sporangiofori) şi formarea unui perete transversal care realizează disjuncţia între hifă şi sporange. Uneori, filamentul sporangiofor pe care se edifică sporocistul poate prezenta o dilataţie terminală numită columelă În interiorul sporangelui au loc mitoze repetate, după care nucleii-nou formaţi se înconjoară de o masă de citoplasmă proprie prin formarea unui perete celular, transformându-se în spori. Sporangiosporii pot fi de 2 feluri: - aplanospori, imobili, cu mai mulți nuclei în citoplasmă;

56

- zoospori sau planospori, uninucleați care prezintă pe suprafața un număr variabil de cili cu ajutorul cărora se deplasează în mediile lichide. Multiplicrea prin zoospori se întâlnește la Saprolenia ferax, care are sediul în apă și poate parazita peștii.

Fig.20 Rhizopus nigricans: A-miceliu reproducator: a-sporange imatur:b-columela,c- sporange matur plin cu spori, d-sporange rupt, fspori; B- miceliu vegetativ: g-rizoizi Conidiosporii (conidiile) sunt spori externi care iau naştere pe vârful dilatat al hifei specializate numite conidiofor, printr-un proces asemănător înmuguririi, formând şiraguri. Între hifă şi şiragurile de conidii se interpun nişte piese intermediare numite sterigme. Forma corpilor fructificanţi conidiogeni variază în funcţie de gen sau specie; la Aspergilus spp., de exemplu, au aspect de măciucă, iar la Penicillium spp., aspect de penson (fig. 21) B.2 Sporii perfecți (meiotici, sexuaţi) rezultă din fuzionarea a două celule-gameţi cu potenţial ereditar diferit, situate pe aceeaşi hifă sau pe hife distincte dar apropiate. Cu excepţia unor particularităţi de detaliu corelate cu nivelul evolutiv al miceţilor, procesul de fuzionare a celor două celule se realizează în două faze

Fig. 21 Aspecte de micelii aeriene cu corpi fructificanti: 1-Rhizopus, 2- Aspergillus, 3-Penicillium 57

succesive. În prima fază are loc fuzionarea citoplasmei (plasmogamia) iar în etapa următoare, fuzionarea nucleilor (cariogamia), rezultând astfel un zigot cu nucleu unic diploid (set dublu de cromozomi). După un anumit interval de timp, nucleul suferă o diviziune reducţională (meiotică) reveninindu-se la haploidie. Se deosebesc următoarele tipuri de spori sexuaţi: zigosporii, oosporii, ascosporii şi bazidiosporii. Zigosporii rezultă din gameţi identici ca structură, formă şi dimensiuni (izogameţi sau gametangi) care apar sub forma unor protuberanţe pe două hife apropiate din acelaşi miceliu sau aparţinând unor micelii diferite. Ajungând la un moment dat în contact, membranele celulare se rezorb la acel nivel iar conţinutul lor protoplasmatic se contopeşte rezultând un zigospor (fig.22)

Fig. 22 Etapele succesive ale procesului de formare a unui zigospor. Două celule din acelaşi miceliu sau din micelii diferite se întâlnesc (A,B) produc celule sexuale speciale ( C) care fuzionează (D) şi formează un zigospor acoperit cu un perete protector, negru (E) care rămâne în stare latenţă până la germinare, când formează un corp fructificant de tip asexuat (F) Oosporii rezultă din gameţi diferenţiaţi morfofiziologic (heterogameţi): unul mai mare (oogonul), de sex feminin şi altul mai mic, de sex masculin (anteridia). Oogonul fecundat se transformă în oospor. Atât zigosporii cât şi oosporii sunt întâlniţi la ciupercile inferioare şi reprezintă faza diploidă a ciclului de dezvoltare al acestora. Prin germinarea sporilor se revine la faza haploidă reprezentată atât prin aparatul vegetativ cât şi prin sporii asexuaţi (fig. 32) Ascosporii şi bazidiosporii sunt caracteristici micromiceţilor superiori, la care cariogamia nu are loc imediat după contopirea celor doi gameţi: ascogonul şi anteridia. În urma acestui proces va rezulta mai întâi un miceliu special care va da naştere unor corpi fructificanţi diferiţi ca formă, numiţi asce (aspect saciform) la micromiceţii din subîncrengătura Ascomycotina şi bazidii (aspect de mânuşă cu degete), la cei din subîncrengătura Bazidiomycotina. În interiorul acestor formaţiuni are loc cariogamia prin fuzionarea celor doi nuclei. După un interval de timp, nucleul diploid suferă una sau mai multe diviziuni reducţionale. La ascomicete diviziunea reducţională va conduce la formarea a doi, patru sau opt nuclei haploizi care, la rândul lor, înconjurându-se de un strat de plasmă 58

condensată şi un perete celular, vor genera un număr echivalent de ascospori (fig.23). Eliberarea ascosporilor se face prin ruperea ascelor. Bazidia este întrucâtva similară unei asce, dar, spre deosebire de aceasta, îşi poartă sporii nu în interiorul, ci la exteriorul ei.

Fig. 23 Formarea ascosporului la mucegaiuri. În celula binucleară (A) produsă prin fuzionarea a două celule din acelaşi miceliu sau din micelii diferite, nucleii se unesc (B), se divid repetat (C şi D) formând 8 nuclei sporali (E) conţinuţi într-o celulă numită ască(F). Nucleul diploid al bazidiei se divide de două ori rezultând patru nuclei haploizi. În partea apicală a bazidiei se formează apoi patru mici excrescenţe, numite sterigme, în care vor migra cei patru bazidiospori (fig.24). Pentru eliberarea acestora, la baza sterigmelor apare câte o picătură de lichid care creşte treptat şi care , prin presiunea pe care o exercită, determină deschiderea sterigmelor şi proiectarea sporilor în aer (Zarnea G., 1970).

Fig. 24 Etapele succesive ale formării unei bazidii şi eliberarea bazidiosporilor: A- celula binucleată, B- fuziunea nucleilor, C- şi D – diviziunea nucleilor, E- formarea bazidiosporilor, F şi G – eliberarea lor ( după Stanier, cit.Zarnea,G. 1970)

59

3.4 NUTRIȚIA ȘI CREȘTEREA FUNGILOR Fungii au o nutriție de tip chimioheterotrof deoarece, asemănător bacteriilor, utilizează substanțele organice ca principală sursă de carbon și energie, dezvoltându-se pe materia organică moartă (fungii saprofiți) sau pe seama organismelor vii (fungii paraziți). Substanțele cu moleculă mică (monozaharidele, aminoacizii) străbat peretele celulelor hifale și levurice prin difuzie simplă. Substanțele macromoleculare (proteine, polizaharide, lipide), sunt supuse mai întâi unui proces de digestie extracelulară sub acțiunea enzimelor fungice glicolitice, proteolitice, lipolitice, fiind transformate astfel în nutrienți ce pot fi preluați ulterior prin absorbție transparietală. La fungii patogeni, aceste enzime constituie factori de virulență cu ajutorul cărora străbat barierele naturale ale organismelor vii pe care s-au adaptat să trăiască (Ileana Nichita, 2007). Fungii se pot dezvolta la o gamă largă a valorilor de pH (2,0 – 9,0), fiind în general acidofili (pH-ul optim =5,0 – 6,0). Temperatura optimă de dezvoltare este de 22-32o C, limitele extreme situându-se între 5 oC și 45 oC. Umiditatea crescută influențează favorabil metabolismul, creșterea și multiplicarea ciupercilor filamentoase - activități stopate când umiditatea mediului se reduce la 20%. Majoritatea mucegaiurilor sunt aerobe, dezvoltându-se în special la suprafața substraturilor nutritive, iar drojdiile sunt facultativ anaerobe: ele desfășoară un metabolism oxidativ, descompunând carbohidrații până la bioxid de carbon și apă, dar sunt active metabolic și în lipsa oxigenului, când recurg la un metabolism fermentativ cu producere de etanol și bioxid de carbon. Datorită structurii peretelui celular, fungii sunt mai rezistenți la presiunea osmotică în comparație cu bacteriile, fiind capabili să crească și în medii cu o concentrație ridicată de zahăr sau săruri. Dotați cu un echipament enzimatic complex, fungii sunt capabili să utilizeze zaharuri complexe (celuloză, lignină) inaccesibile pentru majoritatea bacteriilor și să-și obțină nutrienții din substraturi cu umiditate redusă. Creşterea fungilor se realizează la extremităţile libere ale hifelor, pe baza substanțelor rezultate din metabolismul de biosinteză,. Celula terminală se alungeşte apoi se formează un sept transversal care o împarte în două celulefiice. Totdeauna, celula terminală continuă procesul de creştere şi diviziune în timp ce celula subterminală participă doar facultativ, atunci când produce o ramnificaţie laterală dotată, la rândul ei, cu capacitatea de creştere apicală. În dinamica procesului de creştere ,,in vitro” se pot distinge 3 faze şi anume: faza de lag, faza de creştere liniară şi faza de învechire. - Faza de lag, în care procesul propriu-zis de creştere este absent. Această fază se caracterizează prin regenerearea hifelor care au servit la însămânţare sau germinarea sporilor. 60

- Faza de creştere lineară corespunde cu apariţia pe suprafaţa mediului de cultură a coloniei circulare. Această colonie are o creştere mai rapidă la periferie, în timp ce zona centrală se caracterizează printr-o creştere mai lentă sau chiar prin absenţa creşterii. Pe medii sărace în substanțe nutritve creşterea are loc în suprafaţă, sub forma unei reţele fine de hife. Pe medii bogate creşterea se face mai lent în diametru transversal, în schimb, miceliul este mai gros. - Faza de învechire se traduce prin încetinirea vitezei de creştere pe măsură ce marginile coloniei se apropie de bariera mecanică, reprezentată de marginea plăcii Petri în care se cultivă respectivul mucegai. Această încetinire este determinată de acumularea produşilor de catabolism, care se face cu atât mai rapid cu cât condiţiile nutritive, de temperatură şi aeraţie sunt mai aproape de exigenţele optime ale speciei cultivate. 3.4. PARTICULARITĂŢILE ECO-FIZIOLOGICE ALE CIUPERCILOR MICROSCOPICE Și IMPLICAȚIILE ÎN ACTIVITATEA OMULUI Majoritatea ciupercilor microscopice sunt saprobiote utilizând în scop trofic substanțele din materia organică moartă. Acestea sunt ubicvitare în mediile naturale, realizeazând prin acţiunea de gradare şi mineralizare a cadavrelor animale şi vegetale, autopurificarea solului şi a apelor şi circuitul general al materiei, fără de care viaţa nu ar fi posibilă. Unele specii, deşi nu atât de numeroase ca cele saprobiote, sunt parazite ale organismele vii – plante, insecte, peşti, reptile, păsări, mamifere, om – provocând boli a căror gravitate depăşeşete uneori pe aceea cauzată de bacterii şi virusuri. Numeroase specii de ciuperci pot trăi în anumite faze ale dezvoltării lor ca saprobiote, iar în anumite condiții ca parazite. Din această categorie fac parte ciupercile facultativ parazite, care se dezvoltă obișnuit pe substraturi lipsite de viață dar pot să se adapteze pentru o perioadă scurtă de timp pe țesuturi vii și ciupercile facultativ saprobiote , care sunt adaptate la parazitism dar pot avea și o existență saprobiotă (Ileana Nichita, 2007). Capacitatea miceţilor de a popula un anumit biotop este condiţionată de posibilităţile de a exploata resursele nutritive şi energetice ale acestuia prin intermediul echipamentului enzimatic de care dispun şi care diferă de la o specie la alta. Din acest punct de vedere, ciupercile microscopice pot fi clasificate în trei categorii: monofage, oligofage şi polifage (Coman I., Mareş M., 2000). Ciupercile monofage şi oligofage dispun de un sistem enzimatic redus, limitat uneori la compoziţia chimică a ţesuturilor unei singure specii vegetale sau animale, ca o consecinţă a adaptării lor la un mod de viaţă strict parazit. În categoria ciupercilor polifage intră majoritatea speciilor saprobiote dar şi cele facultativ parazite şi facultativ saprobiote – specii dotate cu un echipament enzimatic complex. În raport cu activitatea omului, efectele miceţilor pot fi favorabile sau nefavorabile. 61

I. Efectele favorabile constau în activităţile enzimatice ale acestora valorificate în diferite ramuri ale industriei. • Industria alimentară: - obţinerea drojdiei de panificaţie din levura Saccharomyces cerevisiae; - obţinerea alcoolului, berii şi cidrului prin fermentaţia alcoolică a unui substrat glucidic (amidon, zaharoză, suc de fructe), produsă de levuri aparţinând genurilor Saccharomyces, Kluiveromyces, Candida; - fermentarea dirijată a laptelui cu ajutorul unor specii de miceţi din genul Penicillium (P. roqueforti, P. camemberti, P. candidum) pentru obţinerea brânzeturilor din sortimentele “Roquefort”,’’Camembert’’, “Brie”ş.a. ; - prepararea salamurilor crude și uscate cu mucegai de suprafață (Penicillium nalgiovense). • Industria farmaceutică: - obţinerea de antibiotice naturale din categoria penicilinelor şi a cefalosporinelor din culturi de miceţi din genul Penicillium respectiv, Cephalosporium; - sinteza unor hormoni (ex., micetul Rhizopus arrhizus, datorită capacităţii de a hidroliza progesteronul - intermediar în procesul de sinteză a cortizonului reduce considerabil numărul etapelor de sinteză chimică a acestui hormon); - sinteza de interferoni (în 1981 genele interferonului au fost transferate prin inginerie genetică în celulele levurei Sacharomyces cerevisiae, fiecare celulă fiind capabilă să sintetizeze până la 106 molecule de interferon); - sinteza de proteine virale imunogene (antigenul HbsAg) utilizate la prepararea vaccinurilor contra hepatitei B, cu ajutorul levurilor modificate genetic (Sasson A., 1993); - sinteza unor enzime: amilaze (Aspergillus niger, Aspergillus usamii, Rhisopus oryzae, Rhisopus delemar ș.a.), proteaze (Aspergillus spp., Mucor pusillus ș.a.), lipaze (Saccharomycopsis lipolytica ș.a.); • industria producerii de biomasă şi proteine neconvenţionale prin metabolizarea unor deșeuri agricole și industriale de către unele specii de levuri. II. Efectele nocive produse de miceţi constau în alterarea (mucegăirea) alimentelor vegetale și animale și producerea de îmbolnăviri la plante, animale și oameni. Dintre miceții fitopatogeni, o importanță deosebită, prin pierderile economice pe care le determină, au speciile care produc: - mana: Phytophtora infestans (mana cartofilor), Plasmopara helianthi (mana florii soarelui), Peronospora spp. (mana viței de vie) etc. - tăciunele la porumb și grâu (Ustilago maidis); - rugina cerealelor (Puccinia spp.); - putrezirea fructelor (Fusarium spp., Alternaria spp., Trichotecium spp. ș.a.) 62

Bolile produse de ciupercile microscopice la animale și om pot fi clasificate pe baza mai multor criterii. În funcţie de categoria în care se încadrează micetul ele pot fi grupate în levuroze şi micoze propriu-zise iar după mecanismul patogenităţii, în micoze şi micotoxicoze. Micozele se caracterizează prin prezenţa şi multiplicarea miceților în diferite organe şi ţesuturi, îndeosebi la indivizii imunosupresați. În funcție de localizarea proceselor patologice, micozele se clasifică în: dermatomicoze sau micoze externe (tricofiția, candidoza cutanată, microsporidioza, onicomicozele etc.) şi micoze viscerale sau endomicoze ( ex., aspergiloza – în special pulmonară). Micotoxicozele se caracterizează prin leziuni şi tulburări funcționale produse prin ingerarea toxinelor (micotoxinelor) elaborate de speciile de miceți toxigeni în materiile prime, alimentele finite și furajele pe care se dezvoltă. Micotoxinele cu implicaţii majore in sanatatea oamenilor si animalelor sunt: aflatoxinele (carcinoame hepatice, tumori renale, tumori ale aparatului respirator a altor organe), ochratoxinele (nefropatii acute si cronice), fusariotoxinele (estrogenism, cancer esofagian, drunken bred -boala consumului painii care imbata, aleucie toxica alimentara s.a), ergotoxinele (ergotismul gangrenos si convulsiv). Biosinteza micotoxinelor în alimente și furaje are loc în anumite condiții, dintre care Apostu S. (2006) menționează: 1. însușirile genetice; dintre sutele de mii de specii de miceți, ~ 250 au capacitatea de a produce micotoxine prin dezvoltarea lor pe vegetale sau produse de origine vegetală și mai rar pe cele de origine animală; 2. compoziția chimică a substratului: conținutul crescut în glucide favorizează elaborarea micotoxinelor; 3. umiditatea substratului; se apreciază că pentru majoritatea cerealelor punctul critic de umiditate favorabil dezvoltării miceților este de 13%; 4. pH-ul optim = 4-6; 5. prezența unor elemente minerale și vitamine cu rol stimulator: zincul (mai ales pentru biosinteza aflatoxinelor), fierul, manganul, tiamina. 6. competiția intermicrobiană din substrat, care poate reduce sau suprima sinteza micotoxinelor; Aspergillus niger inhibă parțial dezvoltarea speciei Aspergillus flavus și producerea de aflatoxine de către acesta; Flavobacterium auranticum metabolizează aflatoxina B1, reușind să detoxifice complet substraturile naturale contaminate; 7. temperatura de 25-38°C, umiditatea atmosferică de 85% și luminozitatea medie constituie condițiile optime pentru elaborarea majorității micotoxinelor. Contaminarea cu micotoxine a alimentelor de origine animală este, de obicei, consecința absorbției la nivelul intestinelor animalelor în viață a micotoxinelor prezente în furaje, care pot cumula în diferite țesuturi sau se pot elimina prin lapte și ouă. Cu toate acestea, carnea este contaminată cu 63

micotoxine în cazuri foarte rare iar laptele și produsele lactate pot conține rareori cantități semnificative de micotoxine. S-a stabilit că laptele vacilor care au consumat furaje cu un conținut ridicat de aflatoxine conține un metabolit al aflatoxinei B1, cu semnificație patologică importantă, numit inițial ,,milkotoxin" iar în prezent, aflatoxina M1. Cantități mai mari de micotoxine au fost puse în evidență în produsele vegetale: boabe de porumb mucegăite (238-2500 ppb aflatoxine, 100-1000 ppb zearalenonă), semințe de oleaginoase (50-1000 ppb) și uleiul extras din acestea, mere intrate în putrefacţie (25000 ppb patulină) și sucul extras din asemenea fructe (80000ppb) etc. Micotoxinele au efecte nefavorabile asupra organismului uman și animal, care se reflectă asupra creșterii, stării de sănătate și capacității imunogene a organismului. Mecanismele patogenetice sunt complexe: interferarea sintezei principalelor grupe de substanțe nutritive (proteine, glucide, lipide, vitaminele A, D, K), imunosupresie, efect oncogen (cancerigen) etc..

64

NOŢIUNI DE VIRUSOLOGIE GENERALĂ Virusurile sunt definite ca forme acelulare sau subcelulare de viaţă, metabolic inerte şi lipsite de capacitatea de creştere şi multiplicare înafara organismelor vii, fiind parazite obligatoriu intracelular. Virusologia - știinţa care se ocupă cu studiul virusurilor - constituie un domeniu particular al microbiologiei prin specificitatea metodelor de cercetare, care constau în cultivarea virusurilor pe ţesuturi vii, microscopie electronică, metode chimice şi imunologice proprii. 4.1. CARACTERELE GENERALE ALE VIRUSURILOR Virusurile prezintă unele particularităţi care le diferenţiază de celelalte microorganisme, şi anume: 1.- dimensiunile foarte reduse, cuprinse între 10 şi 300 nanometri (nm), care le conferă următoarele proprietăţi: - nu sunt vizibile la microscopul optic, ci numai la microscopul electronic; - traversează fitrele obişnuite, care reţin bacteriile; -sedimentează numai prin ultracentrifugare (>10000 turații/minut). 2.- sunt lipsite de metabolism propriu deoarece nu dispun de enzime metabolice şi prin urmare: -nu cresc și nu se divid singure ci sunt replicate de o celulă gazdă (animală, vegetală, fungică, bacterienă); - relația cu celulele gazdă este una de parazitism deoarece virusul deviază metabolismul acestora în sensul sintezei de noi particule virale pe baza rezervelor nutritive și energetice ale celulei. 4.2.FORMELE DE EXISTENŢĂ A VIRUSURILOR ÎN NATURĂ Virusurile pot exista în natură sub trei forme biologice, fiecare dintre ele reprezentând, în acelaşi timp, un stadiu al ciclului ontogenetic. Virusul complet (virionul) constituie forma matură, care posedă toate componenetele caracteristice virusului şi toate atributele speciei din care face parte. El are capacitatea de a rezista un timp limitat înafara celulei sensibile şi este dotat cu infecţiozitate (posibilitatea de a pătrunde într-o celulă gazdă 65

receptivă, capabilă să-l reproducă) şi patogenitate (capacitatea de a determina modificări morfologice şi funcţionale echivalente cu starea de boală). Virusul vegetativ reprezintă o formă de existenţă intracelulară a virusului, sub formă de elemente structurale dispersate în citoplasma celulei. Conform informaţiei genetice conţinute în acidul nucleic viral, celula cu aparatul ei enzimatic sintetizează componentele virale care, în urma ansamblării, formează noi virioni. Eliberaţi din celula parazitată, aceştia vor pătrunde în alte celule receptive, reluând circuitul care asigură conservarea virusului în natură. În faza de virus vegetativ, dependenţa virusului de celulă este totală, el fiind incapabil de a supravieţui înafara acesteia. Virusul integrat sau provirusul este tot o formă de existenţă intracelulară total dependentă de celula gazdă, cu deosebirea că celula parazitată nu sintetizează material viral. Acidul nucleic viral se integrează în genomul celulei receptive, unde rămâne în stare ocultă un timp nelimitat, comportându-se ca un fragment de material genetic propriu celulei. Această formă de existenţă este bine cunoscută la bacteriofagi (virusuri care parazitează bacteriile) şi la virusurile tumorale. Virusul integrat se poate transforma în virus vegetativ, de obicei sub acţiunea unor factori stresanţi pentru celulă, în care caz genomul viral se desprinde de cromozomul celulei şi începe să codifice sinteza de material viral, trecând în stadiul de virus vegetativ 4.3. MORFOLOGIA şi STRUCTURA VIRUSURILOR 4.3.1. FORMA şi DIMENSIUNILE Din cauza dimensiunilor reduse ale virusurilor, morfologia și structura lor pot fi examinate numai prin microscopia electronică a secțiunilor ultrafine și prin difracția razelor X. Virusurile se prezintă într-o gamă foarte variată de forme, în funcţie de specie: bastonaş drept, filament pliat, icosaedru, corpuscul sferic, cărămidă cu colţurile rotunjite, ghiulea, spermatozoid etc. (fig.25). În general: - forma rotunjită (corpusculară) este specifică virusurilor patogene pentru animale (zoovirusuri); - forma alungită, virusurilor patogene pentru plante (fitovirusuri) şi insecte; - forma spermatozoidică, virusurilor patogene pentru bacterii (bacteriofagi). Dimensiunile virusurilor diferă de la o specie la alta, fiind cuprinse între 10-20 nanometri la virusurile mici (ex. virusul febrei aftoase) şi 300-350 nanometri la virusurile mari (ex. virusurile variolice).

66

Fig. 25 Reprezentarea schematică a formelor şi dimensiunilor comparative ale principalelor grupe Și familii de virusuri.

4.3.2. STRUCTURA VIRUSURILOR Virusurile complete (virionii) sunt formate dintr-un singur acid nucleic – ADN sau ARN -,care constituie genomul viral şi un înveliş proteic în contact direct cu acidul nucleic numit capsidă , formând împreună nucleocapsida. La unele virusuri, nucleocapsida este înconjutată de un înveliş suplimentar numit pericapsidă (anvelopă, peplos), prevăzut cu o serie de emergenţe numite spiculi (fig.27).

67

Fig.27 Structura generală www.anisn.it/omodeo/omodeo/virus.htm).

4.3.2.1

a

virusurilor

(

Genomul viral

Genomul viral este reprezenrat de acidul nucleic viral. În funcţie de natura acestuia, virusurile se împart în ribovirusuri (virusuri cu ARN) şi dezoxiribovirusuri (virusuri cu ADN). La virusurile fitopatogene (patogene pentru plante) acidul nucleic este întotdeauna ARN, în timp ce la virusurile zoopatogene şi bacteriofage, poate fi ADN sau ARN. Configurația acizilor nucleici virali poate fi lineară sau circulară iar structura, în funcţie de numărul lanţurilor din care este constituită molecula, monocatenară sau dublu catenară. De regulă, dezoxiribovirusurile au o moleculă unică de ADN dublu catenar circular iar ribovirusurile, ARN monocatenar linear divizat în segmente separate (BUIUC și col., 2003). Genomul viral conţine între 3 şi 250 de gene şi este componenta esenţială a virusului, deoarece poartă informaţia genetică necesară pentru propria sa replicare și pentru devierea metabolismului celulei gazdă în sensul sintezei celorlalți constituienți ai particulei virale. Ribovirusurile constituie un unicat în biologie, în ce priveşte posibilitatea păstrării informaţiei genetice de către ARN. Masa moleculară a genomului reprezintă 5-30% din masa totală a virionului și este constantă pentru fiecare specie, constituind unul din criteriile taxonomice aplicate în clasificarea virusurilor.

68

4.3.2.2. Învelişul CAPSIDA Învelişul extern, prezent la toate virusurile, se numeşte capsidă (gr. kapsa=cutie) şi este format din mai multe subunităţi de natură proteică identice, numite capsomere (gr. kapsa+meros=părţi ale cutiei). Capsomerele sunt riguros aranjate, conform unei arhitecturi cristalografice, numărul şi simetria lor fiind bine definite pentru fiecare virus în parte. Se cunosc trei tipuri principale de simetrie a capsidei virale. 1. Capsida cu simetrie icosaedrică sau cubică dispusă în jurul genomului (acidului nucleic viral) pliat sub formă de ghem. Icosaedrul, prin cele 20 de fețe în formă de triunghiuri echilaterale, 12 vârfuri și 30 de muchii reprezintă forma ideală de dispunere a capsomerelor deoarece asigură minimum de material pentru maximum de volum. El are trei tipuri de axe de simetrie rotațională – axe în jurul cărora, prin rotație completă, va avea 2, 3, respectiv 5 poziții identice (fig. 28) : - axe de tip 2 care unesc două laturi opuse exact la jumătatea acestora; - axe de tip 3 care trec prin punctele centrale a două fețe triunghiulare opuse; - axe de tip 5 care traversează fiecare două unghiuri opuse.

Fig. 28 Tipurile de axe de simetrie ale icosaedrului (www.britannica.com/ebc/art.697 )

Dispunerea capsomerelor în structura capsidei icosaedrice este următoarea: fețele și laturile sunt formate din hexone sau hexamere (capsomere formate din 6 monomere sau molecule proteice, înconjurate de 6 capsomere identice) iar vârfurile, din pentone sau pentamere (capsomere structurate din 5 molecule proteice) prevăzute cu o prelungire măcicată numită fibra pentonei (fig. 29). 69

Fig. 29 Model de virus cu simetrie icosaedrică: poziția pentonelor și a hexonelor 2. Capsida helicoidală, de forma unui tub cilindric, rezultă din dispunerea capsomerelor în formă de spirală, asemănător unui resort în stare comprimată. Spirala capsomerelor delimitează pe faţa internă a tubului un şanţ în care este aşezat, tot helicoidal, într-un perfect paralelism cu capsida, genomul viral (fig. 30).

Fig. 30 Structura capsidei helicoidale a virusului mozaicului tutunului (schemă). 3.Capsida cu simetrie binară sau dublă este caracteristică bacteriofagilor cu cap şi coadă (fig. 31.). Capsida capului este de tip icosaedric, iar capsida cozii este structurată după tipul de simetrie helicoidal (fig. 32).

70

Fig. 31 Structura bacteriofagului T4 www.manisfield.osu.edu/...)

Fig.32 Simetria capsidei la fagul T4

PERICAPSIDA La unele virusuri, exterior capsidei se găseşte un înveliş suplimentar, nimit pericapsidă, anvelopă, sau peplos (fig.2). Pericapsida derivă din membrana celulei gazdă; în cursul maturării, virionii ,,înmuguresc" prin membrana celulară pregătită în prealabil prin inserția de glicoproteine virus codificate. Aceste proteine vor proemina sub formă de spiculi pe suprafața anvelopei având, după caz, funcție de liganzi (ex. hemaglutininele), mai rar de enzime (ex. neuraminidaza) sau factori de fuziune a membranelor citoplasmatice. Virusurile lipsite de pericapsidă se numesc virusuri nude. Capsida împreună cu pericapsida protejează genomul viral de acţiunea factorilor de mediu şi asigură fixarea virionului de receptorii celulei gazdă 4.4 MULTIPLICAREA VIRUSURILOR ZOOPATOGENE Virusurile sunt cele mai mici structuri biologice care dispun de toată informația genetică necesară pentru propria lor reproducere. Pentru virusuri, termenul de multiplicare nu reflectă întocmai realitatea fenomenelor care au loc în celula gazdă. În interiorul acesteia virusurile nu se multiplică ci sunt sintetizate de celulă prin activitatea metabolică a acesteia redirecționată, în urma substituirii informaţiei genetice a celulei cu cea a virusului, către necesitățile replicative ale acestuia. Acidul nucleic viral deține informația necesară pentru a dirija propria sa replicare, sinteza proteinelor virale și inhibarea biosintezelor celulare normale (uneori - în infecțiile endosimbionte produse de leucovirusuri, virusul sarcomului lui Rous - se stabilește un echilibru virus/gazdă astfel încât, atât genomul viral cât și cel al celulei codifică simultan sinteza de proteine). 71

Componentele particulei virale se constituie pe seama rezervelor energetice şi nutritive (aminoacizi, nucleotide) ale celulei parazitate. Multiplicarea virusurilor implică următoarele etape succesive: adsorbția și penetrarea virionilor în celulă, decapsidarea cu eliberarea intracelulară a genomului viral, replicarea propriu-zisă, morfogeneza noilor virioni și eliberarea acestora din celula gazdă (fig.33)..

Fig. 33 Etapele replicării virusurilor animale 1. Adsorbţia sau fixarea virionilor pe celulă După o serie de ciocniri întâmplătoare ale virusurilor cu celulele animale și după o fază de adsorbție nespecifică reversibilă, urmează faza de adsorbție ireversibilă la nivelul unor receptori celulari specifici. Aceștia sunt reprezentați de grupările chimice ale membranei celulare, complementare sub aspect stereo, electrostatic şi geometric cu capsida sau pericapsida virionului. Specificitatea de receptor explică tropismul celular, tisular și de organ al unor virusuri: virusul rabic se fixează pe receptorii pentru acetilcolină, virusurile gripale pe glicoproteinele care conțin acid sialic și care sunt complementare neuraminidazei (enzima din pericapsida acestor virusuri), virusul poliomielitei, pe receptorii de pe enterocite și neuronii sistemului nervos central etc. Adsorbția poate fi oprită prin blocarea receptorilor în urma acțiunii unor factori fizici, chimici sau biologici. Virionul rămas extracelular este repede distrus de factorii de apărare ai organismului. 2. Pătrunderea virionului în celulă. După fixare, pătrunderea virusurile nude prin membrana celulară se realizează printr-un proces activ de încorporare din partea celulei, numit 72

viropexie. Membrana celulară se invaginează şi se adânceşte progresiv în dreptul virionului până când acesta este complet înglobat în celulă. Virusul pătruns în celulă se află inclus într-o vacuolă delimitată de membrana celulară invaginată (endozom), care se dezintegrează treptat. La virusurile cu anvelopă, de regulă, are loc fuziunea acesteia cu membrana citoplasmatică și eliberarea nucleocapsidei direct în citoplasmă. Spre deosebire de virusurile zoopatogene şi fitopatogene, care pătrund în întregime în celula sensibilă, la bacteriofagi capsida rămâne înafara celulei, în care este introdus numai genomul după o prealabilă decapsidare. 3. Decapsidarea După pătrunderea în celulă are loc mai întâi decapsidarea virusurilor sub acţiunea unor enzime produse de celula gazdă sub determinismul genomului viral. Din momentul decapsidării până în momentul apariției noilor virioni, virusul se află în stare vegetativă (subunităţi dispersate în citoplasmă) fiind complet dependent de celula gazdă și lipsit de infecțiozitate. Acest interval din replicarea virusurilor poartă denumirea de perioadă de eclipsă deoarece virusurile, lipsite de identitate morfologică, nu sunt evidențiabile prin mijloace electronooptice. Primele trei etape ale replicării virale sunt relativ ineficiente deoarece: - rata fixării (eficiența coliziunilor) este redusă (3-5 x 10-9),raportată la multitudinea de particule virale care pătrund în organism; - nucleocapsidele nu sunt eliberate uneori din endozomi; - genomurile virale sunt atacate de endonucleazele celulei gazdă. În acest context, raportul dintre numărul virionilor adsorbiți și al celor efectiv replicați de celulele receptive este subunitar. 4. Replicarea propriu-zisă (Sinteza componentelor virale). Virusurile ARN sunt replicate în citoplasmă, cu excepția virusurilor gripale la care unele faze ale procesului replicativ se desfășoară in nucleu. Virusurile ADN sunt replicate în nucleu, cu excepția poxvirusurilor al căror genom este replicat în citoplasmă. La scurt timp după pătrunderea în celulă, acidul nucleic viral antrenat la locul replicării îşi preia atributele de material genetic autonom, programând şi dirijând sinteza componentelor virale care include: replicarea genomului viral, sinteza ARNm viral și sintezele proteice. Replicarea genomului este controlată de polimeraze (enzime ale celulei gazdă sau incluse în nucleocapsida virală) și are loc în mod diferit în funcţie de structura mono- sau dublu catenară a acidului nucleic: de regulă, replicare semiconservativă la ADN și ARN dublu catenar și replicare mai întâi complementară și apoi semiconservativă când acizii nucleici sunt monocatenari. Sinteza proteinelor virale Prin mecanisme incomplet elucidate, genomul viral scoate din funcţie ADN celular astfel încât în celulă este prezent numai ARNm transcris de pe genomul viral, care va transmite la nivelul ribozomilor un mesaj genetic nou, 73

obligând celula să sintetizeze proteine virale în locul enzimelor şi al celorlalte proteine proprii. Sinteza proteinelor virale are loc la cele mai multe virusuri (în principal, virusurile ADN) în două faze: precoce și tardivă. 1) Faza precoce debutează imediat după infectarea celulei. Proteinele timpurii au rolul de enzime, fiind implicate în sinteza ADN sau ARN viral și a unor precursori ai proteinelor virale structurale precum și în inhibarea sintezelor proprii celulei gazdă. 2) Faza tardivă corespunde sintezei proteinelor virale structurale. Ea se declanșează în momentul când, în urma replicării ADN s-a ajuns la un anumit număr de genomuri virale, genele precoce fiind, de regulă, inhibate. Se pare că la virusurile ARN sinteza proteinelor enzimatice și a celor structurale se desfășoară simultan. 5. Morfogeneza virionilor progeni (nou formați) La sfârşitul fazei de biosinteză, când în celulă s-au acumulat cantităţi mari de acid nucleic şi proteine virale, are loc asamblarea virionilor progeni. La virusurile mici, aşezarea capsomerelor în jurul genomurilor virale (încapsidarea), se petrece spontan printr-un proces de autoasamblare. La cele mai multe virusuri, asamblarea implică însă intervenţia unor enzime. Între sinteza proteinelor capsidale şi apariţia lor în structura virionilor nou formaţi există un interval de aproximativ 20 de minute. Morfogeneza, ca regulă generală, are loc pentru virusurile ARN în citoplasmă, iar pentru virusurile ADN, intranuclear, după migrarea materialului viral din citoplasmă în nucleul celulei gazdă. Componentele virale acumulate în exces pot genera incluzii celulare virale (Buiuc D., 2003). 6. Eliberarea virionilor din celulă Virionii nou formaţi pot fi eliberaţi din celulă prin mai multe mecanisme. 1) Înmugurirea sau burjeonarea este modalitatea de eliberare a virusurilor cu anvelopă. Într-o primă fază, virionii nou asamblaţi sunt incluşi în nişte vezicule (cisterne) care se ataşează de faţa internă a membranei celulare pe care o bombează, proeminând asemănător unor muguri. Ulterior, virusurile se detaşează de celulă prin mici aperturi care apar în membrană. 2) Liza celulei gazdă sub acţiunea unor enzime sintetizate de celulă în ultima fază a morfogenezei virionilor. Acest mecanism, caracteristic bacteriofagilor, se mai întâlneşte la virusurile animale nude (Carp-Cărare Mihai, 2001). 3)Eliberarea virionilor consecutiv morţii celulei şi dezintegrării acesteia. Aceste virusuri apar cel mai târziu, iar punerea lor în libertate se caracterizează printr-o frecvenţă moderată. 4) Trecerea virionilor direct la celula adiacentă celei în care a avut loc multiplicarea, prin porii membranei celulare.

74

4.5. RELAŢIA VIRUS – GAZDĂ. 4.5.1. TROPISMUL VIRUSURILOR Deoarece genomul viral este extrem de simplu, virusurile nu deţin informaţia genetică necesară sintezei enzimelor metabolice (de ex. enzimele necesare catabolizării glucidelor, enzimele care catalizează reacţiile de biosinteză a proteinelor etc.). Fiind lipsite de metabolism propriu, ele sunt obligate să paraziteze diverse gazde celulare. Virusurile sunt, prin urmare, paraziți ai celulelor animale, vegetale, fungilor, protozoarelor sau bacteriilor. Celulele receptive le furnizează atât energia și precursorii necesari sintezei acidului nucleic și proteinelor virale cât și aparatul de biosinteză al acestora. Virusurile animale pătrund în organism pe diverse căi: digestivă (ex. virusul hepatitei A, enterovirusurile), respiratorie (ex. virusurile gripale), transcutanată (ex. virusul rabic), genitală (virusul Herpes simplex tip 2, virusul verucilor umane). Unele virusuri rămân cantonate la poarta de intrare, care poate constitui în același timp și organul țintă (în virozele respiratorii, enteritele virale, virozele genitale) iar altele sunt diseminate în organism prin intermediul sângelui (diseminare hematogenă) sau pe cale nervoasă (diseminare neurogenă). Diseminarea hematogenă sau viremia constă în trecerea virusurilor în sânge la nivelul capilarelor şi vehicularea lor prin intermediul leucocitelor polimorfonucleare neutrofile. Diseminarea neurogenă (neuroprobazia) se realizează de-a lungul axonilor neuronali şi poate fi centrifugă (ex. virusul herpetic) sau centripetă (ex. virusul turbării). Virionii diseminaţi în organism se localizează în anumite ţesuturi faţă de care prezintă un tropism special (histotropism) sau numai în anumite celule (citotropism). Virusurile manifestă, de asemenea , genotropism sau afinitate pentru o anumită specie biologică. Genotropismul a permis împărţirea virusurilor în monopatogene (patogene pentru o specie) şi polipatogene (patogene pentru două, trei, sau mai multe specii), în zoovirusuri, fitovirusuri, bacteriofagi și micofagi. În funcţie de histotropism, virusurile pot fi grupate în : - virusuri epiteliotrope (dermatotrope), care au afinitate pentru piele şi mucoase (ex. virusurile variolice , virusul febrei aftoase, virusurile herpetice); - virusuri neurotrope, cu afinitate pentru ţesutul nervos (ex. virusul rabic, virusul poliomielitei); - virusuri organotrope (viscerotrope), cu afinitate pentru anumite organe interne, care, la rândul lor, pot fi clasificate în: pneumotrope (ex. virusurile gripale, virusul jigodiei), enterotrope (ex. virusul diareei virale – bolii mucoaselor); hepatotrope (virusurile hepatitelor); - virusuri pantrope (mezenchimotrope), cu afinitate pentru toate țesuturile şi organele bogate în celule mezenchimale.(ex. virusurile pestelor la diferite specii animale). 75

Citotropismul reprezintă afinitatea virusurilor pentru anumite celule din cadrul aceluiaşi ţesut. Virusul rabic, de exemplu se multiplică de preferinţă în neuronii piramidali din cornul lui Amon, iar virusul poliomielitei, în neuronii motori din coarnele anterioare ale măduvei spinării. 4.5.2. TIPURI DE INFECŢIE VIRALĂ Virusurile pătrunse în organism determină din partea gazdei reacții de răspuns numite generic infecții virale sau viroze, care pot evolua diferit din punct de vedere clinic. 1.Infecţiile virale acute (manifeste clinic) apar atunci când multiplicarea virusului în organism determină modificări morfologice și funcționale care se manifestată prin semne clinice evidente, corespunzătoare stării de boală. Gravitatea bolii virale clinice este condiţionată de o serie de factori ca: numărul de virioni infectanţi, rezistenţa generală a organismului, vârsta, sexul, alimentaţia, igiena, etc. Un aspect particular al patogenezei infecției virale îl constituie asocierea sinergică virus-bacterie. Această asociere este frecvent întâlnită în virozele respiratorii, în care leziunile produse de virus constituie porți de intrare pentru bacteriile oportuniste prezente în mod normal pe mucoasele căilor respiratorii anterioare. 2. Infecţiile virale persistente, inaparente clinic În unele infecții virale, după un episod acut sau chiar în lipsa acestuia, virusurile pot rămâne în organismul animal, perioade lungi de timp, chiar toată viața, ducând la instalarea infecțiilor persistente. Acestea se caracterizează prin lipsa semnelor clinice și pot fi lente, cronice sau latente . Infecțiile lente se caracterizează printr-o perioadă lungă de incubație (ani de zile) ca urmare a stabilirii unui echilibru între virus și organismul gazdă. Acest tip de infecţie se întâlneşte în anemia infecţioasă a calului, leucozele aviare şi mamifere, sindromul imunodeficienței umane (SIDA) ș.a. Unii factori de mediu (radiaţiile, temperatura, umezeala etc.), sau factori interni (infecţii intercurente, stimuli endocrini) pot determina ruperea acestui echilibru, care este urmată de replicarea virusului și instalarea bolii clinice. În infecțiile cronice, după un episod acut, virusul infectează organismul în mod cronic, adică pentru o lungă perioadă de timp în care simptomele lipsesc sau sunt slab exprimate deși infecția evoluează. Exemplul tipic de infecție cronică evolutivă îl constituie hepatitele umane cu virus B și C . În infecțiile latente, cum sunt cele produse de virusurile herpetice (virusul Herpes simplex, virusul varicela-zoster), genomul viral se inseră în genomul anumitor celule unde rămâne în stare ocultă o perioadă nelimitată. În acest timp, virusul nu este multiplicat iar prezența lui în organism este lipsită de expresie clinică. Ocazional, în situații stresante care induc imunosupresie dar și în condiții necunoscute, aceste infecții se pot activa.

76

3. Infecțiile transformante sunt determinate de virusurile oncogene (citochinetice) și se caracterizată printr-o multiplicare anarhică a celulelor infectate, cu apariția de formațiuni tumorale. Ipoteza originii virale a unor tumori este veche (Mecinikov şi Borrel, 1903) iar capacitatea unor virusuri de a produce tumori în condiţii naturale şi experimentale a fost evidenţiată în anul 1908 de Ellerman şi Bang , care au demonstrat că leucozele aviare pot fi transmise în serie prin filtrate acelulare. Dintre virusurile identificate până în prezent la animale, aproximativ ¼ prezintă potenţialul oncogen. Mecanismul oncogenezei virale nu este complet elucidat; se pare că integrarea unor gene virale în genomul celulei gazdă determină transformări care duc la pierderea controlului reglator asupra multiplicării celulare şi implicit apariţia de tumori benigne sau maligne. 4.6. CULTIVAREA VIRUSURILOR ÎN LABORATOR Diagnosticul de certitudine în viroze se bazează pe cultivarea, izolarea și identificarea virusurilor. Din cauza lipsei echipamentului enzimatic, deci a unui metabolism propriu, virusurile nu pot fi cultivate pe medii artificiale ci numai pe gazde vii: culturi de celule, embrioni de găină, animale de laborator. Pentru reușita izolării se va ține seama de tropismul virusului a cărui izolare se urmărește, adică de prezența celulelor receptive capabile să-l replice. 4.6.1 Cultivarea virusurilor pe culturi celulare Relațiile virus-gazdă în infecția naturală sau experimentală au putut fi explicate în mare parte prin studiul relațiilor virus-celulă gazdă ,,in vitro" (în culturi de celule). Culturile celulare se obțin din țesuturi sau organe proaspăt prelevate (culturile primare), din țesuturi embrionare (liniile de celule diploide) și din tumori canceroase (liniile celulare permanente). Cultivarea virusurilor pe linii celulare permanente (denumire atribuită datorită faptului că pot fi subcultivate indefinit) are avantajul că sensibilitatea celulelor respective față de un anumit virus este stabilă șI cunoscută, iar rezultatele obținute în diferite laboratoare sunt comparabile. Două dintre cele mai utilizate linii celulare permanente sunt linia HeLa obținută dintr-un carcinom de col uterin și linia KB din carcinom rinofaringian. Țesuturile sau organele din care se prepară culturile celulare sunt mai întâi fragmentate în piese mici, apoi sunt disociate cu tripsină în celule individuale. Acestea se introduc în recipiente de sticlă sau plastic cu medii nutritive speciale (fig.34). Celulele aderă la pereții interni ai recipientului și se multiplică formând un film continuu de cultură (monostrat de celule)- fig.35. Cultura confluentă este inoculată cu suspensia virală obținută din prelevatele patologice prin omogenizare (pentru eliberarea virusurilor din celule), centrifugare (pentru îndepărtarea resturilor celulare și a eventualelor celule bacteriene) și tratare cu antibiotice (pentru a preveni creșterea bacteriilor și a fungilor contaminanți).

77

Fig.34 Plăci Coli cu medii pentru culturi celulare. (www. Koihealth. org…)

Fig.35 Monostrat de celule neinfectat. Colorație hematoxilină-eozină (100x). După o perioadă de incubație, necesară replicării virusului, culturile celulare sunt examinate pentru detectarea prezenței acestuia pe baza efectelor produse asupra celulelor parazitate. 1.Efectul citopatic constă într-o serie de modificări morfologice ale celulelor infectate cu virusuri: - ratatinarea celulelor – devierea de la forma normală - (arbovirusuri); - formarea de sinciții (celule gigante cu numeroși nuclei) prin fuzionarea celulelor din monostrat (paramixovirusuri) –fig.36; - vacuolizarea citoplasmei (virusurile vacuolizante);

Fig. 36 Efect citopatic (sinciții) produs de virusul Measles (v. rujeolei umane) în filmul liniei celulare permanente HeLa . Colorație hematoxilinăeozină (200x).

78

2. Efectul citolitic este o formă particulară a efectului citopatic, caracterizat prin liza celulelor și desprinderea lor de pe suport. Zonele de liză, care se pot observa cu ochiul liber fiind distincte de restul filmului celular normal, poartă denumirea de ,,plaje". 3. Hemadsorbția constă în adsorbția hematiilor sau eritrocitelor pe suprafața celuleor din monostrat, care au replicat virusuri prevăzute cu hemaglutinine (virusurile gripale, paragripale). Hemadsorbția poate fi mai precoce decât efectul citopatic și poate să se producă chiar în absența lui. 4. Hemaglutinarea este produsă de supernatantul și omogenatul culturilor celulare infectate cu virusuri posesoare de hemaglutinine, fiind consecința adsorbției virionilor pe suprafața globulelor roșii, la nivelul cărora produc modificări de natură electrostatică. Identificarea acestor virusuri se poate face prin reacții serologice de inhibare a hemadsorbției sau a hemaglutinării folosind seruri antivirale specifice. Metoda se bazează pe pierderea capacității de hemadsorbție, respectiv, hemaglutinare a virusului izolat, după neutralizarea acestuia cu anticorpi specifici. 5. Interferența virală. Unele virusuri (ex., virusul rubeolei), fără a produce efect citopatic determină un efect de interferență, astfel încât replicarea lor în culturi celulare se depistează în mod indirect prin incapacitatea culturilor de a replica un virus cunoscut ca fiind citopatogen. 6. Transformarea neoplazică (transformarea celulelor normale în celule canceroase) este efectul multiplicării virusurilor oncogene (ex., virusul sarcomului Rous). Celulele transformate au tendința de rotunjire, metabolism modificat, se divid anarhic într-un ritm accelerat și se aglomează în straturi supraetajate formând tumori miniaturale ca urmare a pierderii inhibiției de contact. 7. Efectul incluziogen. În celulele în care se multiplică un virus apar frecvent structuri corpusculare (acumulări de virioni sau componente virale) de dimensiuni variabile, numite incluzii virale. Ele au fost descrise cu mult înainte de descoperirea virusurilor şi poartă numele celor care le-au observat şi descris pentru prima dată: incluziile Babeş-Negri în turbare; incluziile Bollinger, în variola aviară; incluziile Guarnieri, în infecţiile cu virus vaccinal etc. Evidenţierea incluziilor prin coloraţii speciale în preparate histologice, prin imunofluorescență în amprente de organe și prin alte tehnici reprezintă o metodă frecvent utilizată în diagnosticul virozelor. Specificitatea incluziilor pentru un anumit virus este dată de prezenţa lor în ţesutul pentru care virusul manifestă tropism şi de poziţia lor: în citoplasmă sau în nucleu. La noi în ţară, la nivelul laboratoarelor veterinare judeţene, evidenţierea incluziilor Babeş-Negri în neuronii piramidali din cornul lui Ammon (fig.37 A și B), constituie o metodă curentă în diagnosticul turbării.

79

A B Fig. 37 Incluzii Babeş-Negri (granulele de culoare roz) în citoplasma neuronilor piramidali din cornul lui Ammon (A - 100x; B – 400x). Coloația hematoxilină-eozină. (www.pathguy.com/lectures/rabies.jpg) 4.6.2 Cultivarea virusurilor pe embrioni de găină Oul embrionat constituie un mediu optim pentru cultivarea virusurilor deoarece este constituit din țesuturi în dezvoltare, cu multiplicare activă, este steril și lipsit de mijloacele de apărare antiinfecțioasă existente la animalele adulte (Ivanof A. și col. 1982). Înainte de inoculare ouăle incubate se verifică la ovoscop, în cameră obscură, pentru a le elimina pe cele neembrionate sau cu embrioni morți. Suspensia virală preparată din prelevatele patologice se inoculează ținând cont de vârsta optimă a embrionului (6-15 zile) și de calea optimă de inoculare pentru diverse virusuri: pe membrana corioalantoidiană (virusurile herpetice, poxvirusurile), în cavitatea amniotică sau alantoidiană (ortomyxo- și paramyxovirusurile), în sacul vitelin și mai rar intavenos sau intracerebral (fig. 38).

Fig 38 Structura oului embrionat . Căile de inoculare a suspensiei virale (în chenare).(www studentsguide. in/microbiology/ viruses-vir) După 4-7 zile de incubare la 35-37°C, multiplicarea virusului poate determina moartea embrionului, apariția de pustule (pocks) pe membrana corioalantoidă sau acumulare de hemaglutinine în lichidul amniotic sau alantoidian 2.6.3 Cultivarea virusurilor pe animale de laborator La ora actuală, cultivarea virusurilor pe animalele de laborator este o metodă la care se apelează numai în cazul unor virusuri care nu se pot izola în 80

alte sisteme celulare (ex., arbovirusurile se izolează pe șoricelul nou-născut prin inoculare intracerebrală, deoarece culturile celulare sunt mai puțin sensibile). Pe lângă problema protecției animalelor, experimentarea pe animale de laborator (șoareci albi, șobolani, hamsteri, iepuri etc.) prezintă o serie de inconveniente de ordin practic, cum ar fi specificitatea de gazdă a unor virusuri și reactivarea unor infecții virale latente ale animalelor în cursul experimentului. Ultimul inconvenient poate fi evitat prin utilizarea animalelor germ free (sterile din punct de vedere microbiologic). Replicarea virusului pe animalele inoculate este atestată de: apariția simptomelor caracteristice și eventual, moartea acestora; prezența virusului în organele sau țesuturile țintă, evidențiată prin examene histopatologice, activitatea hemaglutinantă a omogenatelor sau prin infecțiozitatea acestora (capacitatea de a transmite boala prin reinoculare). Ca regulă generală, modificările apărute la gazdele inoculate pentru detectarea virusurilor (culturi celulare, ouă embrionate, animale de experiență) dau indicații asupra grupului de virusuri (familie, gen) căruia aparține virusul inoculat, identificarea speciei făcându-se prin reacții antigen-anticorp. 4.7 ACŢIUNEA UNOR AGENŢI FIZICI şi CHIMICI ASUPRA VIRUSURILOR Cunoaşterea comportamentului virusurilor faţă de factorii fizici şi chimici are implicaţii practice atât pentru identificarea unui virus, cât şi pentru măsurile de profilaxie nespecifică a bolilor virale. Temperatura În general, virusurile sunt sensibile la căldură, unele inactivându-se în mediul extern la temperatura de 20-22ºC, în decurs de câteva ore. Inactivarea virusurilor are loc în majoritatea cazurilor la 56ºC în 30 minute, iar la 100ºC în câteva secunde. Temperatura optimă pentru multiplicarea virusurilor coincide, în marea majoritate a cazurilor, cu temperatura optimă pentru celula gazdă. De aceea reacţia febrilă a organismului în cursul infecţiei trebuie privită ca un mijloc de apărare antivirală, avându-se în vedere că temperatura corporală realizată prin hipertermie este de cele mai multe ori nefavorabilă multiplicării virusului, fără a fi nocivă pentru celula gazdă. Temperaturile scăzute au proprietăţi conservante, metoda folosită pentru păstrarea virusurilor în colecţii, luni sau chiar ani de zile, fiind congelarea la – 40 până la – 196ºC . Variaţiile de pH Limitele de pH în care virusurile îşi menţin viabilitatea se situează între 59, cu unele excepţii cum ar fi enterovirusurile care îşi păstrează infecţiozitatea şi la pH 2,2 (după Buxton şi col. citaţi de Carp-Cărare M., 2001). 81

Energia radiantă Radiaţiile cele mai active faţă de virusuri sunt ultravioletele în doze mari. Efectul acestora este însă diminuat proporţional cu protecţia pe care o exercită asupra virusurilor materia organică în care sunt incluse (secreţii, excreţii, cadavre). Substanţele chimice Diversele substanţe dezinfectante şi antiseptice ca formolul, soda caustică, sublimatul de mercur, soluţiile de iod, soluţiile sărurilor de argint, etc., distrug virusurile, viteza de acţiune fiind în funcţie de durata de contact şi de concentraţia soluţiei. Hidroxidul de sodiu (soda caustică) exercită un puternic efect virulicid mai ales în soluţie ferbinte. Formaldehida este activă dar acţiunea ei antivirală este mai lentă. Ea se utilizează însă în mod curent la prepararea vaccinurilor inactivate (omorâte), deoarece nu modifică structura antigenică a virusurilor. Eterul şi cloroformul au o acţiune electivă, în sensul că sunt inactivante pentru unele virusuri şi inofensive pentru altele, astfel încât sensibilitatea la cele două substanţe reprezintă pentru virusuri, un criteriu taxonomic. Glicerina în soluţie salină 50% constituie un bun conservant pentru majoritatea virusurilor, asigurându-le infecţiozitatea luni şi chiar ani de zile. Antibioticele şi chimioterapicele de uz curent în terapia antibacteriană și antimicotică (penicilina, streptomicina, tetraciclinele, sulfamidele, cefalosporinele etc., respectiv, stamicina, nistatinul, nizoralul ș.a.), sunt inactive faţă de virusuri. Utilizarea în practica medicală a compușilor chimici cu acțiune antivirală este limitată de toxicitatea neselectivă a acestora; deoarece virusurile utilizează mecanismele de biosinteză ale celulei gazdă, este dificil de selectat agenții care să interfereze specific replicarea virală fără să altreze integritatea morfofuncțională a celulei parazitate. Agenții antivirali folosiți în terapie pot fi clasificați în două categorii: naturali și de sinteză. Agenții antivirali naturali sunt interferonii (IFN) - proteine sintetizate în cursul infecției virale de unele celule ale organismul gazdă. Se cunosc trei tipuri de interferon: IFN α, sintetizat, în principal, de leucocite, IFN β – produs de fibroblaști și IFN  – sintetizat numai de limfocitele T. Eliberați din primele celule parazitate de virus, interferonii recunosc receptori specifici pe suprafața celulelor învecinate, de care se fixează, protejându-le. IFN nu exercită o acțiune antivirală directă, ci prin intermediul unor proteine și enzime a căror sinteză este indusă de cuplarea IFN cu receptorii celulari. Acestea blochează replicarea virală prin inhibarea traducerii ARNm.în proteine virale, fără să afecteze sinteza proteinelor normale ale celulei gazdă. Interferonii au un spectru larg de acțiune, în sensul că inhibă replicarea a numeroase alte virusuri , nu numai a virusului care a indus sinteza lor, dar au o 82

strânsă specificitate de specie (ex., protecția omului este realizată numai de IFN uman). Deși la ora actuală interferonii sunt produși în cantități mari prin inginerie genetică (gena umană care codifică sinteza IFN α este clonată în celule bacteriene), din cauza efectelor secundare și a prețului prohibitiv, ei sunt utilizați doar în terapia unor viroze umane cronice, agresive cum sunt hepatitele virale B și C. Agenții terapeutici antivirali de sinteză au ca mecanism de acțiune inhibarea uneia din fazele replicării virale: blocarea penetrării în celula receptivă și a decapsidării (amantadina și rimantadina), sinteza acidului nucleic viral (aciclovir, farmciclovir, zidovudina ș.a.), sinteza proteinelor virale (indinavir, ritonavir). Aceste substanțe au o utilizare restrânsă din cauza fenomenelor adverse multiple și a capacității virusurilor de a dezvolta rezistență prin selecția de mutanți (Buiuc D., 2003). 4.8 BACTERIOFAGII Bacteriofagii sunt virusuri adaptate parazitării celulelor bacteriene. Ei au o largă răspândire în natură, fiind prezenți în toate mediile naturale unde există bacterii, deoarece aproape toate speciile bacteriene pot fi gazde pentru unul sau mai mulți bacteriofagi. Bacteriofagii sau fagii sunt denumiți după gazda naturală și poartă un simbol (de exemplu, T1, T2, T3…T7, λ, Ø x 174 – sunt bacteriofagi care parazitează celulele speciei Escherichia coli). Majoritatea bacteriofagilor prezintă o specificitate de gazdă limitată la tulpinile unei specii bacteriene sau ale unui gen. Uneori spectrul se extinde la genurile bacteriene înrudite (de ex.,există bacteriofagi care infectează tulpini de Shigella și Escherichia), sau, dimpotrivă, se reduce la anumite tulpini din cadrul unei specii bacteriene sau doar la celulele bacteriene posesoare de pili sexuali – organite care constituie receptorii specifici pentru anumiți bacteriofagi (fagii de sex). Compoziția chimică Și structura Bacteriofagii au o compoziția chimică și o arhitectură asemănătoare cu a virusurilor animale, cu excepția unor fagi (de ex. bacteriofagii T2, T4, T6 ai bacteriei Escherichia coli) care prezintă ca particularitate, alcătuirea din două părți distincte: capul și coada (fig. 39). Capul este icosaedral și conține ADN viral (genomul), înconjurat de un înveliș proteic format din capsomere (capsida). Coada este în exclusivitate de natură proteică și este formată din următoarele structuri: a. la exterior, teaca cozii - un manșon format din capsomere dispuse helicoidal și care are proprietăți contractile, putându-și reduce lungimea la jumătate din cea inițială; b. tija cozii (gâtul, cilindrul axial) – formațiune străbătută de canal central; 83

c. d.

gulerul cozii ,de formă hexagonală, situat în partea proximală a tecii cozii; placa bazală, situată în partea distală a cozii, are formă asemănătoare cu gulerul, de colțurile ei fiind atașate croșetele. Acestea sunt subunități proteice care, împreună cu niște filamente numite fibrilele cozii, realizează fixarea fagului pe suprafața bacteriei.

Fig. 39. Structura unui bacteriofag cu cap Și coadă – schemă. Relații bacteriofag – bacterie (multiplicarea fagilor) Există două tipuri de relație fag-bacterie infectată (Debeleac Lucia, 2003, Ivanof I., 1982 ). A.Ciclul litic de multiplicare (ciclul productiv, infecția litică) duce la formarea de noi virioni, care sunt eliberați în mediu prin liza bacteriei. Infecția litică se realizează în mai multe etape: 1. Adsorbția bacteriofagului la receptorii de pe suprafața celulei bacteriene. Mai întâi se fixează fibrele cozii apoi are loc o ancorare mai fermă, prin intermediul croșetelor. Acestea eliberează muramidază – enzimă care determină liza peretelui celular în zona de atașare. 2. Injectarea genomului fagic prin contractarea tecii, străpungerea peretelui bacterian de către tija cozii și trecerea acidului nucleic viral prin canalul acesteia, din capul bacteriofagului în celula bacteriană. Învelișul proteic rămâne la exterior și poartă denumirea de ,,fag fantomă". 3.Multiplicarea bacteriofagului. Imediat după pătrunderea ADNului fagic, apare o scurtă perioadă de eclipsă. Apoi, treptat, ADN-ul bacteriei este blocat, fiind substituit funcțional de ADN-ul fagic care se va autoreplica și va induce sinteza de proteine virale pe seama rezervelor bacteriene. Fagul în multiplicare poartă numele de fag vegetativ. 4. Maturarea fagilor. Genoamele fagice și proteinele structurale se ansamblează formând bacteriofagii maturi virulenți. 5. Eliberarea bacteriofagilor. Înainte de sistarea metabolismului , celula bacteriană parazitată sintetizează o enzimă (endolizina), care lizează peretele bacterian permițând eliberarea fagilor maturi. B. Ciclul lizogen (reductiv) Lizogenia constă în integrarea genomului fagic în cromozomul bacteriei infectate. 84

Integrarea este consecința acțiunii unei proteine bacteriene cu efect represor care inhibă exprimarea funcțiilor vegetative ale fagului (replicarea acidului nucleic, sinteza proteinelor fagice, ansamblarea în virioni) și a unor gene fagice și bacteriene care asigură recombinarea situs-specifică (integrarea într-un locus unde există omologie de baze azotate între ADN-ul fagic și cel bacterian). Bacteria se reproduce normal, transmițând descendenților gena reprezentată de fag, uneori, implicit un caracte nou codificat de aceasta. Producerea de toxină difterică, de exemplu, este consecința lizogenizării bacilului difteric cu bacteriofagul β-tox). . Fagul integrat în genomul bacterian se mai numește profag, fag latent, fag endogen sau fag temperat. Odată instalată, starea de profag este stabilă. Totuși, într-o populație bacteriană cu fag latent (lizogenă), la un număr mic de celule (10-5-10-4) acesta trece spontan în fag vegetativ, multiplicându-se. În contact cu o populaţie bacteriană lipsită de profag (lizosensibilă) fagii eliberaţi de bacteriile lizogene vor produce liza acesteia. Aplicațiile bacteriofagiei În medicină, aplicațiile practice ale bacteriofagiei sunt lizotipia și tratamentul infecțiilor. Lizotipia. Existența unei specificități restrânse fag - bacterie a constituit premiza utilizării fagilor în crearea de diviziuni taxonomice în cadrul unor genuri și specii bacteriene numite lizotipuri. Lizotipia sau tipizarea fagică (operațiunea de încadrare a unei tulpini bacteriene în lizotip cu ajutorul bacteriofagilor cunoscuți) prezintă importanță practică în stabilirea filierei epidemiologice a bolilor contagioase și în toxiinfecțiile alimentare. Tratamentul prin bacteriofag are o utilitate restrânsă deoarece efectul este inconstant și imprevizibil. 4.7. CLASIFICAREA VIRUSURILOR Problema clasificării virusurilor este încă nerezolvată; ea formează obiectul de studiu al unui comitet internaţional. Principalele criterii care stau la baza clasificării virusurilor sunt: - natura chimică a acidului nucleic (ADN sau ARN); - simetria nucleocapsidei (cubică, helicoidală, binară); - prezenţa sau absenţa unui înveliş pericapsidal; - numărul de capsomere pentru virusurile cu simetrie cubică sau diametrul nucleocapsidei pentru virusurile cu simetrie helicoidală. Pe baza acestor criterii, virusurile au fost încadrate în phylum ‘VIRA” împărţit în două subphyla pe baza naturii chimice a genomului viral: - DEZOXIVIRA, - RIBOVIRA 85

În funcţie de simetria capsidei – helicoidală sau cubică - , virusurile se grupează în clase: - dezoxihelica şi dezoxicubica; - ribohelica şi ribocubica. Ordinele se bazează pe prezenţa sau absenţa unui înveliş pericapsidal, iar familiile, în principal, pe numărul de capsomere şi diametrul nucleocapsidei. Pe baza unor criterii suplimentare, în cadrul familiilor au fost individualizate subfamilii şi genuri virale, iar în cadrul fiecărui gen, una sau mai multe specii. Virusurile au o nomenclatură latină cu terminaţiile: - viridae, pentru familii; - virus, pentru gen . Exemple: familia Coronaviridae genul Coronavirus; familia Parvoviridae,genul Parvovirus.

86

Partea a II-a

NOŢIUNI DE MICROBIOLOGIE A ALIMENTELOR

87

Microorganismele sunt prezente din abundenţă în toate mediile în care au fost căutate: sol, ape, aer, corpul fiinţelor vii (om, animale, plante), materia organică moartă, alimente etc. Această ubicvitate decurge din capacitatea de a coloniza şi de a supravieţui în habitatele cele mai puţin adecvate vieţii (fundul oceanelor, gheţurile polare, zăcămintele de ţiţei, izvoarele hidrotermale etc.) şi de a metaboliza cele mai neobişnuite substraturi anorganice (N2, S, CO, CO2) şi organice (hidrocarburi, fenoli, crezoli, lemn, asfalt etc.). În ceea ce priveşte răspândirea pe verticală a microorganismelor, ea este, de asemenea, neobişnuit de extinsă în raport cu a celorlalte vieţuitoare. Cu ajutorul unor sonde speciale, bacteriile au putut fi detectate în atmosferă la înălţimea de 12.000 m, la 4000 m adâncime în pământ şi la 11000 m în adâncul mărilor şi al oceanelor. Practic, nu există mediu natural la nivelul căruia să fie posibilă viaţa şi din care microorganismele să lipsească. Pe baza unor criterii cum sunt prezenţa constantă şi în număr mare, microorganismele din fiecare biotop pot fi grupate în două categorii: - microorganisme adaptate filogenetic la condiţiile fizico– chimice oferite de biotop, care alcătuiesc o comunitate de populaţii (specii) relativ stabilă, formând microbiota autohtonă (normală sau rezidentă) şi - microorganisme provenite din alte medii, a căror prezenţă este în mod obişnuit tranzitorie deoarece sunt mai puţin adaptate la noile condiţii. Ele constituie microbiota alohtonă sau străină a biotopului respectiv. Prin nutrienţii din compoziţia lor, alimentele constituie un mediu de cultură optim pentru multiplicarea unui număr mare de specii bacteriene şi fungice şi asigură supravieţuirea pentru un timp limitat a microorganismelor strict parazite (rickettsii, chlamidii, virusuri). Microbiota autohtonă a alimentelor este constituită din microorganismele saprofite pe care fiecare aliment le întâlneşte în circuitul său, de la obţinere până la consumator. Prezenţa acestor microorganisme în număr mare influenţează negativ sănătatea consumatorului prin produşii rezultaţi din degradarea enzimatică a alimentelor (alterare) și reprezintă un indicator al condiţiilor de igienă necorespunzătoare. De asemenea, prin microorganismele patogene pe care le vehiculează şi prin metaboliţii lor toxici, alimentele pot genera boli infecţioase grave cu poartă de intrare digestivă (tuberculoza, antraxul, hepatitele virale etc. ) şi toxiinfecţii alimentare. 88

6.1 Microbiota unor alimente de origine animală 6.1.1 Microbiota laptelui Microorganismele prezente în lapte sunt de provenienţă mamară şi extramamară ( Apostu S., 2006). La anumalele sănătoase glanda mamară este sterilă. Microorganismele, reprezentate de streptococi, lactobacili, colibacili şi alte bacterii comensale nepatogene sau condiţionat patogene sunt prezente în mod normal doar pe mucoasa treimei inferioare a canalelor galactofore. În cazul reducerii imunităţii locale sau generale (imunosupresie) germenii comensali dotaţi cu factori de virulenţă şi germeni din mediul ambiant (Staphylococcus aureus, Streptococcus agalactiae, Streptococcus dysgalactiae Escherichia coli, Aspergillus spp., Candida albicans etc.) pătrund în mamelă pe cale ascendentă determinând infecţii clinice sau subclinice. Patogeni recunoscuţi ca Mycobacterium bovis, Brucella spp., Rickettsia spp etc., determină mamite primare sau secundare de obicei pe cale descendentă, consecutiv pătrunderii în torentul sanguin Laptele provenit de la animalele sănătoase şi recoltat în condiţii igienice conţine de obicei un număr redus de microorganisme (300 – 500/ml). Încărcătura microbiană a laptelui este mai mare în primele jeturi, deoarece antrenează microflora existentă pe mucoasa canalelor galactofore, apoi scade treptat. În laptele provenit de la animalele cu infecţii ale glandei mamare, numărul microorganismelor pe mililitru poate fi de ordinul sutelor de mii sau chiar mai mult (Grecianu Al. şi col., 1973). Sursele de contaminare a laptelui după recoltare sunt reprezentate de adăposturile insalubre, recipientele sau instalaţiile de muls neigienizate, mâinile murdare ale mulgătorilor, ugerul murdar etc. Imediat după muls, microorganismele sunt repartizate uniform în masa laptelui. În timpul păstrării însă, odată cu ridicarea grăsimilor, ele sunt antrenate la suprafaţă concentrându-se în stratul de smântână. Microbiota normală a unui lapte igienic se compune în cea mai mare parte din bacterii aparţinând genurilor Lactobacillus (L. acidophilus, L.casei . L. bulgaricus ş.a. ) şi Streptococcus (S. lactis, S. cremoris, S. thermophilus etc.) bacterii care prin activitatea lor fermentativă imprimă produselor lactate un gust specific, plăcut, fiind utilizate in industria laptelui sub formă de maiele (culturi selectionate). Mirobiota de contaminare este dependentă calitativ şi cantitativ de condiţiile de recoltare şi de păstrare a laptelui şi este responsabilă de alterarea acestuia. Ea poate însuma specii bacteriene aparţinând genurilor: Pseudomonas, Achromobacter, Leuconostoc, Micrococcus, Propionibacterium, Proteus, Escherichia, Enterobacter, Clostridium etc. (Mănescu S., 1989). Dată fiind originea intestinală a unora dintre aceste bacterii (Escherichia coli, Proteus spp.,Enterococcus spp., Clostridium perfringens), prezenţa lor denotă o poluare de origine fecală şi constituie un indicator al condiţiilor sanitare pe circuitul laptelui. 89

Speciile patogene care pot contamina laptele şi care produc infecţii la om în urma consumului de lapte nefiert sunt: Mycobacterium bovis, Brucella abortus, Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Streptococcus pyogenes etc. 1. Microorganismele nepatogene prezente în lapte 1.1. Microorganisme care actioneaza în principal asupra lactozei În această categorie intră bacteriile lactice homofermentative şi heterofermentative a. Bacteriile lactice homofermentative produc în urma actiunii asupra lactozei 1% - 95% acid lactic si cantitati foarte mici de dioxid de carbon şi acid acetic. Ele sunt reprezentate de specii din genurile Lactobacillus si Streptococcus. Principalele specii de bacterii din aceasta subgrupa, care au importanta pentru tehnologia laptelui şi a produselor lactate sunt: L.lactis, L.bulgaricus, L.helveticus, L.acidophilus, L. casei. L. p!antarum şi S. termophilus, S. lactis, , S. cremoris. b. Bacteriile lactice heterofermentative produc în urma actiunii asupra lactozei cca. 50% acid lactic, 20-25% dioxid de carbon, 20-25% alcooli (etanol, manitol) şi acid acetic. Ele fac parte din genurile Lactobacillus, Leuconostoc , Bifidobacterium, Propionibacterium. Speciile utilizate în tehnologia laptelui şi produselor lactate sunt: Bifidobacterium bifidum, L. desidiosus (caucasicus), L. brevis, Leuc. mesenteroides, Leuc. cremoris (citrovorum). Principala specie din genul Propionibacterium cu semnificatie pentru tehnologia produselor lactate este P.freudenreichii care determina formarea ochiurilor de fermentaţie caracteristice la brânza Schweizer. 1.2 Microorganisme care actioneaza predominant asupra proteinelor din lapte În aceasta grupă intră specii de microorganisme din aproape toate diviziunile taxonomice, care hidrolizează proteinele din lapte în peptone, polipeptide şi aminoacizi. Uneori aminoacizii sunt descompuşi în continuare până la amoniac, indol, scatol, hidrogen sulfurat şi alţi cataboliţi responsabili de modificări organoleptice importante: coagularea dulce, peptonizarea sau proteoliza laptelui, coloraţii si mirosuri anormale. Bacteriile din genurile Bacillus şi Clostridium, fiind microorganisme sporulate ubicvitare, ajung în lapte în timpul mulsului şi manipularii neigienice. Sporii rezistă la procesul de pasteurizare a laptelui crud şi la procesele de fermentare-maturare pe care le suferă produsele lactate, reprezentând o problemă pentru sterilizarea şi prelucrarea industrială a laptelui. Specii ale genului Bacillus ( B.subtilis, B.cereus v. mycoides, B.circulans, B.licheniformis, B.sphaericus, B.coagulans, B.polymixa, B.macerans ş.a.) produc coagularea dulce (cazeoasă) a laptelui pasteurizat în care nu mai există microflora acidolactică concurentă, distrusă prin pasteurizare. Coagulul dulce produs de aceste bacterii este peptonizat în scurt timp, rezultând o masă lichidă galben-maronie cu reacţie alcalină, care conţine cantităţi însemnate de acizi aminaţi (tirozina, leucina), uree şi săruri amoniacale. 90

Clostridiile, în funcţie de specia contaminantă, pot avea activitate puternic glucidolitică (Cl. butyricum, Cl .paraperfringens), proteolitică (Cl. hystolyticum, Cl.sporogenes) sau mixtă (Cl .perfringens, Cl.acetobutylicum, Cl. aurantibutyricum, Cl.chauvei, Cl.septicum). Clostridiile puternic zaharolitice sunt incriminate în balonarea târzie a brânzeturilor. Acest defect se produce atunci când activitatea bacteriilor acidolactice este deficitară iar clostridiile fermentează cu producere de gaze lactoza nedescompusă de microflora lactică, care în condiţii normale constituie un concurent eficient . Cl.sporogenes, o specie cu activitate proteolitică, poate fi prezentă în brânzeturile obţinute în condiţii neigienice determinând apariţia mirosului de varză alterată din cauza producerii hidrogenului sulfurat. Streptococcus faecalis subsp. liquefaciens, Micrococcus luteus şi alţi coci Gram pozitivi pot produce la început coagularea laptelui apoi acidifiere urmată de proteoliză şi apariţia gustului amar. Bacteriile Gram negative nesporogene aparţinând genului Pseudomonas (Ps.fluorescens, Ps.alcaligenes, Ps.syncyanea) Proteus (Pr.vulgaris) şi Serratia (Serratia marcescens) sunt peptonizante şi alcalinizante. În urma acţiunii acestora laptele devine tulbure de culoare galben-verzuie, fluorescentă, cu miros de amoniac, de peşte sau de urină (Ps fluorescens), de culoare albastru-violet (Ps.syncyanea) sau roz-roşu (S.marcescens). Asemenea modificări de culoare sunt mai evidente la brânzeturi. Unele specii de bacterii din aceasta grupă sunt psihrotrofe (se multiplică la temperaturi pozitive apropiate de O0C) şi determină defecte la laptele şi brânzeturile depozitate la rece. Proteoliza cazeinei, alcalinizarea laptelui şi gustul amar mai pot fi produse de unele actinomicete (A..griseus, A. violaceus) şi de anumite levuri şi mucegaiuri : Torula, Saccharomyces, Mucor, Aspergillus, Penicillium, Cladosporium, Oidium ş.a. 1.3 Microorganisme care actioneaza asupra lipidelor din lapte Microorganismele lipolitice care pot polua laptele şi produsele lactate sunt reprezentate de cele mai diverse grupe de bacterii şi miceţi: Pseudomonas, Micrococcus, Staphylococcus, Serratia, Bacillus, respectiv Cladosporium, Penicillium, Oidium ş.a. Unele dintre acestea sunt psihrotrofe, fiind capabile să se multiplice şi să acţioneze asupra lipidelor şi atunci când produsele în care se află se păstrează la temperaturi joase. Aceste microorganisme dispun de enzime numite lipaze, care determină hidroliza grăsimilor cu formarea unor compuşi chimici ce determină modificări de miros (butiric,înţepător, rânced) şi gust (iute, picant). Deoarece majoritatea microorganismelor lipolitice desfăşoară şi alte activităţi enzimatice, în special activitate proteolitică, modificarile produse de lipaze vor fi aproape întotdeauna însoţite şi de unele modificari proteolitice, cum ar fi mirosul de sulf, de amoniac, gustul amar s.a. 2. Microorganismele patogene 2.1. Virusurile 91

Laptele crud, cel contaminat după pasteurizare şi brânzeturile contaminate joaca un rol important în diseminarea unor virusuri patogene pentru om, mai ales în ţarile în curs de dezvoltare. Enterovirusurile. Aceste virusuri, transmisibile pe cale orală, se multiplică în mucoasa gastro-intestinală a omului şi animalelor. Cele mai patogene pentru om sunt virusul poliomielitei şi virusul Coxsackie, care pot ajunge în lapte prin contaminare fecală de către persoanele purtătoare, clinic sănătoase. S-a demonstrat că şi alte tipuri de virusuri din această grupă pot determina îmbolnaviri la om, cum sunt cele care provoaca"diareea de vară" la copii. Prin examene de laborator s-a demonstrat că virusul poliomielitei este inactivat prin pasteurizările curente corect efectuate în timp ce virusul Coxsackie suspendat în lapte pare a fi mai rezistent la pasteurizarea obişnuită, unele tulpini supravieţuind la tratamente termice de 71oC-15 sec. Virusul febrei aftoase. Virusul febrei aftoase este unul din cele mai contagioase virusuri pentru animale. La om, boala apare foarte rar şi are ca sursă de infecţie laptele crud provenit din fermele contaminate. Virusul trece în lapte în faza de viremie a animalului bolnav dar şi în timpul mulsului prin lichidul care se scurge din aftele deschise prezente pe uger. Virusul nu rezistă la temperatura de pasteurizare şi moare în scurt timp în produsele lactate acide Virusul hepatitei infecţioase de tip A. Hepatita infecţioasă de tip A este considerată ,,boala mâinilor murdare”deoarece se transmite pe cale orală în condiţiile nerespectării unor norme minime de igienă cum ar fi spălatul pe mâini. Acest virus este eliminat prin materii fecale de către persoanele bolnave sau convalescente ajungând în alimente şi apă. Hepatita infecţioasă virală este considerată una din cele mai grave maladii virale în care laptele poate să constituie o importantă sursă de infecţie. Contaminarea laptelui se realizează prin manipulare de persoanele purtătoare şi eliminatoare de virus şi prin apa contaminată folosită în întreprinderile prelucratoare şi de distribuţie. Virusul encefalitei transmisibile prin artropode.. Boala apare la om ca urmare a înţepăturilor produse de capuşele Ixodes persulcatus şi Ixodes ricinus, care constituie vectorii acestui virus sau prin consum de lapte netratat termic provenit de la caprele infectate. Virusul a fost pus in evidentă în laptele de capră, vacă şi oaie infectate natural şi experimental. Concentraţia sa in laptele animalului infectat este de sute de ori mai mare decât în sânge. Aceasta s-ar putea datora multiplicării virusului la nivelul ugerului sau filtrării şi concentrării lui în uger. Virusul a fost pus în evidenţă în smântână, unt şi caş preparate din lapte contaminat. În smântâna şi untul conservate la 4°C, virusul a supravietuit 2 luni iar în caş a rezistat aproximativ 2 saptamâni. Virusul este inactivat în 20 min.la 70°C şi în 30 min. la 62-63°C, deci pasteurizarea comercială curentă execută corect este eficientă. În perspectivă, vaccinarea animalelor de lapte ar putea deveni un mijloc eficient de luptă contra acestei boli transmisibile la om. 92

2.2 Bacterii şi toxine bacteriene S.aureus. Principalul pericol al contaminării laptelui şi produselor lactate cu stafilococi constă în elaborarea unei enterotoxine capabile să provoace la om gastroenterită acută. Enterotoxina stafilococică este termostabilă din care cauză, după elaborarea ei în lapte, este greu sau chiar imposibil de inactivat. De aceea toxiinfecţia cu enterotoxina stafilococică poate să apară şi în urma consumului de lapte pasteurizat dacă laptele a fost contaminat în prealabil şi ţinut în condiţii favorabile multiplicării stafilococilor. S. aureus este frecvent purtat de oamenii sănătoşi care manipulează laptele şi produsele lactate dar şi de animalele de lapte. La om, portajul de S. aureus variază între 30-50%, bacteria fiind prezentă de regulă pe suprafaţa pielii şi mucoasa nazală. Frecvenţa purtătorilor este mai mare printre persoanele care prezintă sau au prezentat furunculi şi panariţii. Sursele de origine animală a contaminării laptelui cu stafilococi sunt mamita stafilococică şi leziunile externe infectate ale ugerului şi mameloanelor. Brânza nematurată preparată din laptele de vacă, oaie sau capră contaminat cu stafilococi enterotoxigeni şi netratat termic poate declanşa gastroenterita acută. S-a stabilit ca enterotoxina stafilococică atinge concentraţii nocive când densitatea celulelor vii de stafilococi este de minimum 500.000-1.000.000/ ml(g) de aliment, valori atinse după 10-12 ore de multiplicare la 30-37° C. Prin păstrarea alimentelor la temperaturi sub 10 ° C, multiplicarea stafilococilor fiind practic inhibată nu mai are loc nici producerea de enterotoxină. Termorezistenţa enterotoxinei stafilococice are o importanţa practică considerabilă, .metodele de pasteurizare fiind ineficace. Abia după o fierbere de 60 min. se constată o reducere însemnată a activităţii enterotoxinei, inactivarea ei fiind posibilă numai prin autoclavare la o presiune de 2 atmosfere. Enterotoxina prezentă în lapte se menţine şi în produsele lactate. Multe cazuri de toxiinfecţii alimentare sunt consecinţa consumului de lapte praf, smântână, brânzeturi la fabricarea carora se foloseşte lapte de calitate inferioară, nepasteurizat. Aciditatea laptelui influenţează atât viabilitatea germenilor cât şi capacitatea lor de a elabora enterotoxină. Astfel, în brânzeturi pe parcursul procesului de maturare numarul de stafilococi se micşorează treptat până la dispariţia lor în raport şi cu încărcătura iniţială cu stafilococi a laptelui materie primă. Brânza Cheddar, de exemplu, fabricată din lapte cu < de 100 stafilococi/ml. devine liberă de stafilococi după 16 săptămâni de la fabricare, pe când cea fabricată din lapte cu >l00 stafilococi/ml., conţine stafilococi vii şi după 20 de săptamâni. Prezenţa de stafilococi patogeni în laptele acru este totuşi semnalată de numeroşi cercetători. Streptococii 93

Streptococcus pyogenes- specia care produce la om mai multe afecţiuni acute (angină, otită medie, scarlatina, erizipelul etc.) ajunge în lapte prin contaminarea acestuia de către persoanele bolnave, convalescente şi purtătorii asimptomatici. Acest lapte, consumat proaspăt sau insuficient tratat termic, poate fi sursă de infecţii sporadice sau epidemice pentru om. Bacteria este distrusă prin pasteurizare încât cazurile de streptococie la om consecutiv consumului de lapte sunt în exclusivitate consecinţa consumului de lapte crud şi lapte contaminat după pasteurizare. Produsele lactate fabricate din lapte crud sau insuficient tratat termic pot fi, de asemenea, contaminate cu această bacterie dar, sensibilitatea ei crescută la procesele biochimice ce se desfasoara în produsele lactate fac ca aceste sortimente să aibă au un rol minor în îmbolnavirea omului. Diplococcus pneumoniae, o specie implicată frecvent în etiologia infecţiilor respiratorii la om, este incriminat şi în producerea unor cazuri de mamită la vaci dar transmiterea la om prin consumul de lapte nu a fost suficient demonstrată. Salmonelele Contaminarea laptelui şi produselor lactate cu agenţii febrelor tifoide şi paratifoide (Salmonella typhi, S. paratyphi) se face în mod direct sau indirect (apă, muşte, recipiente contaminate) exclusiv de purtătorii umani deoarece aceste bacterii nu sunt patogene în mod natural pentru animalele şi prin urmare ele nu constituie surse de contaminare a laptelui. Ajunse în lapte, la temperaturi mai mari de 15°C (laptele nerăcit imediat după recoltare) salmonelele se pot multiplica destul de repede, realizând în scurt timp concentraţii periculoase pentru consumatori. Smântâna, untul şi brânzeturile au fost găsite responsabile de unele epidemii de febră tifoidă. De regulă, salmonelele din brânzeturi mor în 2-3 săptamâni, mai ales cele localizate în straturile superficiale. Înafară de salmonele patogene în exclusivitate pentru om şi serotipurile abortigene (S.abortus ovis, S.abortus equi), majoritatea salmonelelor patogene pentru animale se pot transmite la om prin intermediul alimentelor contaminate producând toxiinfecţii alimentare. Contaminarea laptelui cu salmonele se realizează prin excretarea aestora în lapte de către vacile bolnave dar mai ales în mod indirect, prin fecalele vacilor bolnave sau purtatoare de germeni, prin ustensile, manipulatori şi muşte. Mai multe varietăţi de brânzeturi au fost incriminate în producerea toxiinfecţiilor salmonelice deşi au fost fabricate din lapte pasteurizat. Aceasta denotă o contaminare a laptelui după pasteurizare sau a produselor lactate în timpul procesării. Persistenţa salmonelelor în brânzeturi este influenţată de nivelul pH-ului şi de calitatea culturilor starter dar nu şi de concentraţia de clorură de sodiu. Astfel, în brânza de vaci cu pH 4,1-4,4 salmonelele mor după 3-7 zile dar supravietuiesc şi se multiplică în brânzeturlile cu 8% NaCl. S-a constatat că o concentraţie de 3% NaCl are chiar un uşor efect stimulator asupra multiplicarii. 94

Shigelele. Laptele vehiculează frecvent specii de Shigella (S. flexneri, S. sonnei). Literatura menţionează numeroase episoade de dizenterie bacilară (shigeloză) produse prin consumul de lapte contaminat. În toate cazurile s-a demonstrat că shigelele din lapte proveneau de la persoane purtătoare, care prelucrau sau manipulau laptele.: Aceste bacterii se pot multiplica în laptele păstrat la temperaturi mai mari de 15°C, multiplicarea fiind mai intensă în laptele pasteurizat decât în laptele crud, din cauza lipsei florei concurente. Escherichia.coli enteropatogenă (EPEC) EPEC grupează tulpini de E.coli care provoacă diaree la om (mai frecvent la copii) ca urmare a ataşării celulelor bacteriene prin intermediul fimbriilor la suprafaţa vilozităţilor intestinale, urmate de distrugerea acestora. Din cauza mecanismului patogenetic, această grupă de colibacili mai este denumită şi AEEC (attaching-effacing E.coli). Tulpini de Ecoli enteropatogene pentru copii se izolează deseori din laptele vacilor cu mamite şi fecalele viţeilor cu diaree albă. Laptele pasteurizat şi produsele lactate sunt uneori contaminate de persoanele purtatoare de EPEC, care le manipulează în condiţii necorespunzătoare de igienă. În prezent, determinarea prezenţei şi a numărului de bacteriilor coliforme se face cu regularitate atât la laptele materie primă cât şi la cel pasteurizat .. Bacilii tuberculozei Tuberculoza animalelor producătoare de lapte pentru consum uman este determinată de specia Mycobacterium bovis, care este patogenă şi pentru om Deşi bacteria se elimină prin lapte, transmiterea bolii este posibilă doar prin consum de lapte crud, deoarece bacteria moare la temperaturi care inactivează fosfataza alcalină (63-650C–15minute; 700C–3 minute). Prin urmare, atât pasteurizarea aplicată în unităţile de prelucrare a laptelui cât şi fierberea efectuată în gospodăriile individuale sunt metode eficiente de prevenire a transmiterii tuberculozei pe această cale. Bacteria este prezentă în smântâna, untul şi brânzeturile preparate din lapte crud contaminat. Ieniştea şi col. urmărind timpul de supravieţuire a bacilului tuberculozei tip bovin în brânza telemea fabricată din lapte contaminat experimental, au constatat ca bacilul era viu şi infectant pentru cobai după 60 de zile de la fabricarea brânzei. La 76 de zile de la fabricare, bacilul nu a mai putut fi pus în evidenţa prin inoculări la cobai. Acelaşi colectiv, câţiva ani mai târziu, constata că M. bovis era încă viu şi infectant pentru cobai după 240 zile în untul obţinut din smântâna contaminată experimental. Pentru eradicarea aceastei zoonoze grave, în numeroase ţări, printre care se numără şi ţara noastră, efectivele de taurine sunt controlate prin teste alergice şi serologice în scopul depistării animalelor bolnave şi instituirii unor măsuri eficiente de prevenire a transmiterii la om. 95

Leptospirele Laptele ar putea constitui un mijloc de transmitere a leptospirozei la om, în special când provine de la vaci şi capre cu mamite leptospirice şi când este consumat crud, la scurt timp dupa mulgere. Contaminarea laptelui se poate face de asemenea prin oameni bolnavi sau purtatori de leptospire. Ajunse în lapte, leptospirele dispar odata cu creşterea aciditatii şi datorită existenţei unui factor care determină liza acestora. Acest factor persistă în laptele conservat la 4°C timp de 2 luni şi rezista 5 minute la 80°C.. Leptospirele, eventual prezente în lapte, sunt în mod sigur omorâte în timpul pasteurizarii deoarece prezintă o termosensibilitate crescută. Listeriile Serotipurile de L.monocytogenes patogene pentru animale (bovine, ovine, caprine) sunt în egală măsură patogene şi pentru om. Investigaţiile epidemiologice ale unor episoade de toxiinfecţie alimentară cu L.monocytogenes au incriminat consumul de lapte crud nepasteurizat dar şi laptele pasteurizat care nu a fost în prealabil centifugat. Deoarece listeriile eliminate prin laptele vacilor bolnave se pot găsi în stare fagocitată, ele rezistă în interiorul fagocitelor 33 minute la o pasteurizare la 61,7°C, de unde rezultă necesitatea unui tratament termic mai sever (Bărzoi D., 1999; Apostu S., 2008). La temperatura frigiderului listeriile prezente în lapte şi produsele lactate contaminate se pot multiplica deoarece sunt germeni criofili. Rickettsiile Principala boală produsă de aceste bacterii la om este febra Q., o zoonoză destul de raspândită, ţările indemne fiind foarte rare. Principalele surse de Coxiella (Riekettsia) burneti –agentul etiologic al acestei boli sunt animalele de lapte: bovinele, ovinele şi caprinele. Potrivit datelor din literatura de specialitate, în zonele unde febra Q exista la animale, laptele crud şi chiar pasteurizat este contaminat cu C.burneti într-o proporţie foarte mare. Animalele infectate elimină bacteria prin lapte pe parcursul a luni de zile, chiar până la 2 ani. Cantitatea de germeni din lapte variază de la o zi la alta iar ugerul bolnav şi laptele contaminat nu prezintă, de obicei, modificări vizibile. C.burnetii este relativ termorezistentă (30 minute la 630C şi 60 minute la 700C ), motiv pentru care poate fi găsită în produsele lactate fabricate din asemenea materie primă. În produsele lactate păstrate la congelator (de ex. în unt) bacteria supravieţuieşte foarte mult timp (peste 2 ani la-20°C). În privinta supravieţuirii acestei bacterii în brânzeturi nu există date suficiente. Cu toate acestea, brânzeturile preparate din lapte crud trebuie să fie considerate o posibilă sursă de infecţie în febra Q. Procesul de acrire a iaurtului omoară germenul în 24 ore. Brucelele 96

Bruceloza este un exemplu de zoonoza clasică. Agenţii etiologici Br.melitensis şi B.,abortus se pot transmite la om prin consum de lapte deşi căile obişnuite de infecţie sunt contactul cu ţesuturile şi secreţiile animalelor infectate şi inhalarea prafului contaminat cu brucele. Specia cea mai periculoasa pentru om este Br.melitensis, care nu a fost depistată în ţara noastră. Bacteria este prezentă în efectivele de capre din regiunea mediteraneană, din zona de sud a Rusiei, vestul Asiei, America Latină şi alte zone. 3. CULTURILE SELECTIONATE FOLOSITE LA FABRICAREA PRODUSELOR LACTATE 3.1 Scopul folosirii culturilor selectionate la prepararea brânzeturilor şi laptelui fermentat Scopul principal al folosirii culturilor selectionate de bacterii lactice este acela de a produce acid lactic din lactoza prezentă în lapte. În laptele fermentat, prezenţa acidului lactic previne dezvoltarea microorganismelor nedorite şi îi dă aroma acidă. În alte produse cum sunt crema de brânză, smântâna fermentată, untul şi altele, aciditatea produsă de bacteriile lactice este necesară pentru dezvoltarea compuşilor aromatici. Astfel, speciile de Leuconostoc şi Streptococcus lactis subsp.diacetylactis produc substanţe aromatice (diacetil, acid acetic) din acidul citric prezent în mod normal în lapte. La brânzeturi, bacteriile lactice inhibă dezvoltarea microorganismelor nedorite, care pot da produsului finit diferite defecte de aromă, structură şi aspect sau sunt dăunătoare sănătăţii omului. În plus, aciditatea grăbeşte acţiunea pepsinei şi favorizează eliminarea zerului din coagul. Scăderea conţinutului în apă măreşte capacitatea de păstrare a brânzei. Flora lactică are şi o activitate proteolitică moderată, transformând proteinele în aminoacizi şi alţi compuşi, contribuind în acest mod la îmbunătăţirea aromei şi texturii produsului finit. Înafara bacteriilor lactice amintite se mai folosesc bacteriile propionice, care transformă acidul lactic în acid propionic, acid acetic şi dioxid de carbon. Ele se folosesc în special la fabricarea brânzei Schweizer. Acizii propionic şi acetic contribuie la formarea aromei caracteristice acestui sortiment ("de nucă"), iar dioxidul de carbon formează găurile sau "ochiurile" caracteristice. Pentru fabricarea unor brânzeturi se folosesc anumite specii de mucegaiuri. Astfel, la fabricarea brânzei Camembert se foloseste Penicillium camemberti, care se dezvoltă numai la suprafaţă dar produce enzime proteolitice extracelulare care invadează interiorul brânzei şi produc înmuierea pastei. Prin metabolizarea de către acest mucegai a acidului lactic şi prin descompunerea proteinelor are loc o creştere a pH-ului şi apariţia unor componenţi amoniacali ce conferă produsului aroma caracteristică. Unele tulpini de P.camemberti pot produce micotoxine (acid ciclopiazonic), motiv pentru care se impune verificarea lor înainte de a le introduce în producţie. 97

Penicillium roqueforti se foloseşte la prepararea brânzei Roquefort în asociaţie cu bacteriile lactice. Sporii acestor mucegaiuri se adaugă ca şi bacteriile lactice în lapte înainte de coagularea lui. După formarea şi întărirea brânzei, aceasta se perforează în numeroase locuri cu ace speciale pentru a permite patrunderea aerului necesar dezvoltarii sporilor de mucegai din masa produsului. Pentru dezvoltare, mucegaiul foloseşte o parte din acidul format în brânză iar pH-ul acesteia creşte până la neutralitate. Dezvoltarea mucegaiului este însotită de formarea gustului şi aromei caracteristice datorită proceselor proteolitice şi lipolitice induse de enzimele acestuia. Înafara efectelor menţionate mai sus, culturile folosite pentru fabricarea produselor lactate măresc şi capacitatea lor de conservare prin concurarea eficientă a microflorei de alterare datorită scăderii pH-ului şi prin producerea de perhidrol (H2O2), în special de unele specii de lactobacili. 3.2 Efectul culturilor selectionate asupra calităţii nutritive a produselor lactate In general, se admite că produsele lactate preparate cu adaos de culturi bacteriene selectionate au calitatea nutritivă aproximativ egală cu aceea a laptelui materie prima din care sunt obţinute. Această părere este reală numai în parte, deoarece prin acţiunea florei lactice asupra laptelui, acesta îşi ameliorează calităţile nutritive. S-a constatat că iaurtul şi smântâna fermentată conţin cantităţi mult mai mari de acid folic şi acid nicotinic în comparaţie cu laptele şi smântâna materie primă din care provin. Cantitatea altor componente ale materiei prime ramâne neschimbată sau scade uşor în produsele fermentate aşa cum este cazul unor vitamine din complexul B , care sunt consumate de bacteriile lactice ca factori de creştere. Proteina din iaurt este de doua ori mai digestibilă decât cea din laptele crud, sporul în greutate al şobolanilor alimentaţi cu iaurt în scop experimental fiind mai mare decât al celor hraniti cu lapte crud. Unele sortimente de lapte obţinute utilizând culturi selecţionate de lactobacili sunt folosite ca alimente dietetice şi terapeutice. Astfel, consumul de lapte acidofil duce la popularea tractului intestinal cu Lactobacillus acidophilus, care concurează flora patogenă din tractusul intestinal, fiind indicat în combaterea tulburărilor gastro-intestinale. Mai mult, sa demonstrat că dezvoltarea tumorilor induse experimental în cavitatea peritonală a şoarecilor hrăniţi cu iaurt este inhibată. 6.1.2 Microbiota cărnii În sens strict, carnea reprezintă tesutul muscular al mamiferelor cu "carne rosie". Muschiul este format din elemente miofibrilare contractile şi proteine sarcoplasmatice solubile. Tesutul conjunctiv reprezintă mai mult de un sfert din greutatea muschiului iar grăsimea, aproximativ o treime. În sens larg, aşa cum este denumită legal şi comercial, carnea include pe lângă 98

ţesutul muscular, oasele pe care se inseră şi organele comestibile Compozitia chimica aproximativă a musculaturii mamiferelor adulte, după ce a intrat în rigiditate, este urmatoarea: - apă 75% - proteine 19% - grăsime 2,50/0 - hidraţi de carbon 1,2% (glicogen 0,1%, glucoza+fosfat 0,2%, acid lactic 0,9%) - diferite substanţe solubile ....l,65% (aminoacizi, creatina, P, K s.a.) - vitamine (majoritatea vitaminelor din grupa B). Conţinutul mare în apă şi prezenţa tuturor elementelor biogene conferă cărnii calităţile unui bun mediu de cultură, în special pentru bacterii. Din acestă cauză carnea este un produs perisabil, fiind foarte sensibilă la alterarea microbiană şi este implicată în răspândirea unor boli infecţioase şi declanşarea toxiinfecţiilor alimentare. Deşi carnea reprezintă un mediu favorabil multiplicării microorganismelor, unele modificări fizico-chimice care au loc după tăierea animalelor, inhibă aceasta multiplicare o perioada de timp. Valoarea pH-ului cărnii variază în mod natural de la 7,0 cât este imediat după tăiere pană la 5,0. Valorile mai mici de 5,5 sunt nefavorabile dezvoltarii microbiene prin ele însele. pH-ului cărnii este invers proporţional cu cantitatea de acid lactic produs în urma glicolizei musculare ce are loc post mortem. La rândul ei, cantitate a de acid lactic depinde de cantitatea de glicogen din muschi în momentul morţii. Muşchiul nesupus efortului înainte de tăierea animalului conţine o cantitate apreciabilă de glicogen, care va fi convertită treptat in acid lactic, datorită căruia va avea un pH în jur de 5,5, iar textura, culoarea, aspectul şi consistenţa lui vor fi normale. Dacă înainte de tăiere animalele au fost stresate sau supuse unor eforturi susţinute, cantitatea de glicogen din muşchi este mai mică, iar pH-ul cărnii, rezultat în urma glicolizei, va fi relativ mare (mai mare de 6,2). În acest caz, muschiul va oferi condiţii propice multiplicării microorganismelor fiind impropriu pentru conservare. Potenţialul oxido-reducător al cărnii influenţează, de asemenea, în mare masură microorganismele ce o contaminează. Sacrificarea animalului este urmată de suprimarea aportului de oxigen la nivelul musculaturii şi, ca urmare, conţinutul în oxigen şi potenţialul oxido-reducător scad treptat. Din această cauză, la câteva ore după sacrificare masa de carne devine anaerobă în profunzime . Ca urmare, în straturile superficiale ale cărnii, în care care patrunde oxigenul din mediu, se va dezvolta o microfloră aerobă iar în interiorul ei, o microfloră anaerobă sau facultativ anaerobă. Există o relaţie strânsă între numărul iniţial de microorganisme ce poluează carnea şi momentul apariţiei alterarii; cu cât numarul acestora este mai mare, cu atât alterarea apare într-un timp mai scurt. Astfel, carnea de bovine 99

păstrată la 100 C se altereaza în 16 zile când este contaminată cu 10 3 germeni/cm2 şi în 8 zile când contaminarea este de 105 germeni/cm2 . Profunzimea maselor musculare este, de regulă, contaminată cu un număr foarte mic de bacterii, dintre care semnificaţia cea mai mare pentru conservabilitatea şi salubritatea cărnii o prezintă bacteriile din genul Clostridium. În mod normal, numarul de clostridii pe 1g carne din profunzime este de l germene la 10-100 g. Cu cât starea sanitară a animalului înainte de taiere este mai bună şi procesul de tăiere se face în condiţii mai igienice, cu atât numărul de clostridii din carne este mai mic. Speciile de clostridii mai frecvent întâlnite în carne sunt: C.perfringens, C.oedematiens, C.bifermentans, C.hystolyticum si C sporogenes. Prin urmare, se impune aplicarea unor mijloace de conservare care să prevină alterarea cărnii prin multiplicarea microflorei de contaminare. Conservarea se impune şi pentru instalarea unor caracteristici organoleptice ale cărnii, absente imediat după taierea animalului: frăgezimea, suculenţa, savoarea. Procesele biochimice care stau la baza acestor transformări constituie ceea ce numim ,,maturarea cărnii”, adică transformarea muşchiului în carne. Principalele metode de conservare, care previn multiplicarea majoritaţii bacteriilor de contaminare implicate in procesul de alterare a cărnii sunt: - păstrarea cărnii la temperaturi joase: refrigerare, congelare; - tratarea termică a cărnii şi introducerea ei în recipiente închise ermetic, realizându-se conserve de carne, - tratarea chimică prin folosirea unor substanţe sau amestec de substanţe cu efect conservant: clorura de sodiu, nitritul, ascorbaţii, polifosfaţii s.a.; - deshidratarea: - afumarea. Progresele înregistrate în ultimele decenii în privinţa tehnologiei de prelucrare, conservare şi manipulare nu au înlaturat decât parţial posibilităţile de contaminare a cărnii cu microorganisme de alterare sau patogene. În acelaşi timp, pretenţiile consumatorilor privind calităţile organoleptice ale cărnii au crescut, fiind mai atenţi la modificările de miros, aromă, culoare, astfel încât calitatea microbiologică a cărnii a devenit un factor de mare importantă în comercializarea ei. Sursele de contaminare a cărnii Carnea conţine o floră microbiană foarte variată, dependentă de posibilităţile de contaminare în timpul vieţii animalului şi după sacrificare Carnea destinată consumului public trebuie sa provină numai de la animale sănătoase, cunoscut fiind faptul că o serie de boli infecţioase ale animalelor se pot transmite la om prin contactul sau/şi consumul de carne. În acest scop animalele destinate abatajului sunt supuse în prealabil unui examen sanitarveterinar de triere. Carnea animalelor sănătoase, sterilă în timpul vieţii acestora, suferă un un proces de contaminare în timpul tăierii animalelor, a 100

depozitării şi manipularii carcaselor, prin contactul ei cu murdaria ongloanelor, părul, pielea, conţinutul tubului digestiv, utilajele, ustensilele şi suprafeţele de lucru din unitatea de tăiere şi prelucrare, mâinile şi îmbrăcămintea personalului, apa folosită la spălarea carcaselor, aerul din spaţiile de lucru şi de depozitare. Contaminarea cea mai intensă, cu semnificaţie pentru conservabilitatea şi salubritatea cărnii are loc în timpul prelucrarii primare: sângerare, jupuire, spălare, răcire şi tranşare. Ţesutul muscular al carcaselor provenite de la animale sacrificate în condiţii igienice este în general lipsit de microorganisme în profunzime sau este foarte slab contaminat (o celula microbiană la l0g sau la 100g). Aceste microorganisme provin din tubul digestiv prin trecerea barierei intestinale în faza de agonie sau imediat după sacrificare, urmată de vehicularea lor prin sânge până la nivelul maselor musculare şi a diferitelor organe (ficat, rinichi, splină etc.) . Este ceea ce specialiştii numesc "bacteriemia de abataj". Limfonodulii regionali (ganglionii limfatici) constituie o barieră în calea microorganismelor de aceea sunt adesea contaminaţi, motiv pentru care nu se dau în consum uman. Invadarea musculaturii şi a organelor cu bacterii din tubul digestiv, la nivele superioare celor mentionate mai sus, este favorizată de stresarea animalelor înainte de sacrificare, eviscerarea tardivă şi sângerarea cu instrumente neigienizate. Animalele sunt supuse stresului în următoarele situaţii: - transport pe distanţe mari de la unitatea de creştere-îngrăşare până la abator cu mijloace de transport necorespunzătoare, pe timp nefavorabil (caldură excesivă, ploaie, ger), fără opriri în scopul adăpării; - stabulaţia prelungită în padocurile abatoarelor, în condiţii neadecvate sau, dimpotrivă, nerespectarea repausului şi a dietei înainte de sacrificare; - bruscarea animalelor pe parcurs şi folosirea unor metode brutale de asomare. Factorii stresanţi constituie stimuli ce declanşează o succesiune rapidă de evenimente neuroendocrine prin care organismul încearcă să se adapteze la noile condiţii. În faza incipientă a stresului are loc o hipersecreţie de adrenalină, urmată de stimularea circulaţiei sanguine la nivelul musculaturii şi reducerea glicogenului muscular. Totodată are loc reducerea circulaţiei sanguine la nuvelul aparatului digestiv, care are drept consecinţă diminuarea imunităţii locale (capacitatea de protecţie antiinfecţioasă a diferitelor structuri anatomice şi funcţii) şi pătrunderea microorganismelor din tubul digestiv în circulaţia generală, înainte, în timpul şi imediat după sacrificarea animalelor stresate . Bacteriile, ajunse pe această cale la nivelul musculaturii cu un conţinut redus de glicogen, vor găsi un pH optim pentru multiplicare (6,4 - 7,0),. Prin urmare, carnea provenită de la animalele stresate este predispusă alterării rapide. Eviscerarea tardivă sau neigienică favorizează invadarea ţesutului muscular şi organelor cu microorganismele prezente în conţinutul tubului digestiv. Din această cauză eviscerarea trebuie executată în maximum 30 minute 101

de la sângerare. Ea trebuie facută cu cea mai mare atenţie pentru a se evita ruperea stomacului, intestinelor şi vezicii urinare. Sângerarea (înjunghierea) cu instrumente neigienizate. Cutitele de sângerare neigienizate pot conţine pe lamă milioane de microorganisme. Ele pot pătrunde în sânge în timpul înjunghierii, ajungând astfel în masele musculare unde iniţiază alterarea profunda a carnii, dacă nu se iau măsuri pentru racirea ei rapidă. Contaminarea superficiala a carcase lor esteinevitabilă, nivelul acestei contaminari fiind variabil în raport de condiţiile de sacrificare. În condiţii igienice corespunzatoare, carcasele au un nivel de contaminare superficială de ~103 – 104 microorganisme/cm2. Contaminarea superficiala a carcaselor are loc in timpu1 jupuirii, apoi prin atingerea lor cu diferite suprafeţe de lucru, ustensilele de tranşare, mâinile muncitorilor, echipamentul de protecţie al acestora, neigienizate. O parte din microf1ora prezentă pe suprafaţa carcaselor poate proveni din aerul contaminat al încăperilor de lucru sau depozitare. Condiţiile de mediu, în special temperatura crescută şi umiditatea, permit microflorei existente să se multiplice şi să producă, într-un timp relativ scurt, alterarea (putrefacţia) cărnii prin proteoliză enzimatică. Putrefactia superficiala este tipul de alterare cel mai frecvent. Ea se manifesta printr-un miros dezagreabil, întepator, amoniacal, ihoros, produs de amestecul mai multor produşi volatili ce iau nastere. La scurt timp după apariţia mirosului (mai multe ore - câteva zile) apare pe suprafaţa cărnii un mucus lipicios caracteristic (mâzga) sub forma unui film fin, de culoare albicioasă, albgalbuie sau alb-verzuie. Microorganismele care iau parte la procesul de putrefacţie se succed în funcţie de condiţiile favorabile multiplicării, existente la un moment dat. Astfel, bacteriile aerobe şi anaerobe facultativ, cum sunt micrococii, streptococii, speciile aparţinând genurilor Pseudomonas, Proteus, Achromobacter, bacilii sporulaţi aerobi (Bacillus subtilis, Bacillus mycoides) intervin primele, consumând oxigenul de la suprafaţă şi creând condiţii favorabile dezvoltării bacteriilor anaerobe din genul Clostridium, responsabile de alterarea profundă a cărnii.. Putrefacţia cărnii poate avea loc şi la temperaturi scăzute, când intervin bacteriile psihrofile (criofile) şi mucegaiurile din genurile Mucor, Penicilium, Aspergillus, Cladosporium etc. Prin intermediul cărnii contaminate se pot transmite la om numeroase boli infecţioase (antraxul, tuberculoza, salmoneloza, rujetul, bruceloza, tularemia, morva şi altele) şi se pot declanşa episoade de toxiinfecţii alimentare, în principal, cu .Salmonella spp., S. aureus, Y.enterocolitica, Campylobacter jejuni, C.perfringens . Pentru prevenirea lor se impun urmatoarele măsuri: - controlul sanitar veterinar atent al animalelor înainte şi după tăiere, - asigurarea condiţiilor de igienă la tăierea animalelor şi la manipularea cărnii, 102

- refrigerarea rapidă şi continuă a carcaselor, de preferat la temperaturi apropiate de O°C, deoarece majoritatea bacteriilor patogene care se pot transmite la om prin consumul de carne nu se pot multiplica la temperaturi mai mici de 5°C. 6.6.3 Microflora ouălor La depunere, ouăle păsărilor sănătoase sunt sterile. Ele se contaminează ulterior cu microorganismele din cuibare sau de pe grătare şi în timpul manipulării. De pe coaja ouălor proaspete se izolează frecvent bacterii din genurile Proteus, Pseudomonas, Achromobacter, Aeromonas, Escherichia, etc. Ca o consecinţă a învechirii ouălor, aceste bacterii pătrund în interior determinând alterarea conţinutului prin putrefacţie (Grecianu Al., 1986; Mănescu S., 1989). Alterarea prin mucegăire apare sub formă de pete colorate pe faţa internă a cojii şi pe gălbenuş. Mai frecvent implicate în mucegăirea ouălor sunt genurile: Cladosporium, Penicillium, Sporotrichum şi Mucor. În albuşul ouălui proaspăt, microorganismele sunt absente sau în număr foarte redus, datorită acţiunii bactericide a lizozimului (ferment glucidolitic activ faţă de bacteriile Gram pozitive), care se găseşte în cantitate apreciabilă. Dintre bacteriile patogene pentru om, mai frecvent vehiculate prin ou sunt salmonelele, deoarece pot fi transmise pe cale verticală de păsările purtătoare, in principal palmipedele (raţa, gasca). Consumul de ouă contaminate cu salmonele, ca atare sau sub formă de preparate neprelucrate sau insuficient prelucrate termic, constituie o cauză frecventă a toxiinfecţiilor alimentare.

6.7.2.1 ASPECTE ALIMENTARE

GENERALE

PRIVIND

TOXIINFECŢIILE

Principalele relaţii conflictuale macro-microorganism sunt boala infectioasa (infecţia) (lat. inficere = a otrăvi, a deteriora) și toxiinfecția alimentară. Atât boala infecțioasă cât și toxiinfecția alimentară constituie interrelaţii dinamice, la apariţia şi evoluţia cărora participă activ ambii parteneri: microorganismul prin mecanismele sale de patogenitate şi organismul-gazdă prin mecanisme de apărare antiinfecţioasă. Numeroşi factori endogeni şi de mediu pot influenţa această relaţie de tip conflictual în favoarea unuia sau a celuilalt partener. În sens larg, prin infecţie se înţelege pătrunderea pe diverse căi (respiratorie, digestivă, cutanată) şi multiplicarea microorganismelor patogene în 103

organismele cu organizare superioară, precum şi reacţia de răspuns pe care o provoacă acestora. Majoritatea bolilor provocate de ingerarea alimentelor şi apei contaminate cu microorganisme şi/sau toxinele lor sunt considerate toxiinfecţii alimentare (TIA) şi reprezintă o problemă majoră de sănătate publică în întreaga lume. În general, TIA sunt definite ca boli de natură microbiană şi origine alimentară , cu manifestări predominant gastrointestinale acute (greaţă, vomă, diaree) şi, uneori şi neurologice, care apar într-un interval scurt de timp (1-72 ore) la două sau mai multe persoane care au consumat din acelaşi aliment sau aceeaşi băutură. În noţiunea de TIA sunt incluse următoarele grupe de boli: a. Infecţiile alimentare produse de agenţi infecţioşi ingeraţi prin intermediul alimentelor şi care se multiplică la nivelul epiteliului intestinal determinând leziuni însoţite de tulburări gastrointestinale. De exemplu, gastroenterita acută virală. b. Toxiinfecţiile alimentare propriuzise, produse de bacterii şi paraziţi care îşi exercită acţiunea patogenă în acelaşi timp prin invazie şi toxinele pe care le elaborează atât în aliment cât şi în organismul bolnavilor. Exemple: gastroenteritele produse de Salmonella spp., Shigella spp., Escherichia coli, Vibrio cholerae, V. parahaemolyticus, Campylobacter jejuni, Bacillus cereus, Clostridium perfringens, toxoplasmoza, trichineloza ş.a. c. Intoxicaţiile de origine microbiană în care tulburările sunt determinate de prezenţa în alimentul ingerat a toxinelor preformate ca urmare a multiplicării în aliment a unor bacterii (Clostridium botulinum, Staphylococcus aureus, Bacillus cereus) şi miceţi producători de micotoxine sau a acumulării în ţesuturile comestibile ale unor vieţuitoare marine (peşti, moluşte etc.) a toxinelor prezente în organismul unor protozoare cu care acestea se hrănesc (intoxicaţia cu peşte ciguateric, intoxicaţia paralitică cu moluşte bivalve), sau ca urmare a acţiunii asupra propriilor ţesuturi a unor enzime bacteriene (intoxicaţia scombriodă ,tetrodointoxicaţia). În ambele situaţii, toxinele incriminate sunt produse de microorganisme şi ajung în organismul omului prin ingerarea alimentelor în care se găsesc, ceea ce justifică includerea acestor îmbolnăăviri în grupa toxiinfecţiilor alimentare. Bolile de origine alimentară de natură nemicrobiană, cum sunt intoxicaţiile cu metale grele, cu substanţe pesticide, nitriţi, ciuperci otrăvitoare nu sunt incluse în grupa TIA , prezenţa substanţelor toxice implicate în asemenea cazuri neavând nici o legătură cu factorul microbian. 104

Unele boli infecţioase ale animalelor ca antraxul, leptospiroza, bruceloza, tuberculoza, ricketsiozele ş.a., deşi se pot transmite la om prin consum de alimente de origine animală nu sunt considerate TIA deoarece transmiterea lor se realizează în mod obişnuit pe alte căi (contactul direct cu animalele bolnave sau produsele lor, leziunile cutanate, mucoasele respiratorii), tabloul clinic este mult mai complex şi cuprinde manifestări specifice fiecărei boli. Poarta de intrare digestivă este una mai puţin obişnuită pentru agenţii microbieni care detrmină aceste boli deoarece carnea şi laptele acestor animale nu ajung, de obicei, în consum uman; animalele sunt diagnosticate în prealabil şi produsele lor, excluse din consumul public. Spre deosebire de bolile infecţioase amintite, TIA nu apar prin simplul contact al omului cu alimentul contaminat ci, numai prin ingerarea acestuia. Alţi factori care condiţionează apariţia TIA, pe lîngă calea orală de pătrundere a microorganismelor sau toxinelor microbiene, sunt cantitatea mare de germeni şi/sau toxină din aliment şi ingerarea unei cantităţi relativ mari din alimentul contaminat. În aceste situaţii aciditatea gastrică, care distruge microorganismele ingerate în mod obişnuit, nu mai este eficientă. Pe lângă aciditatea gastrică, la nivelul stomacului şi intestinului indivizilor sănătoşi acţionează şi unele bariere fizice şi biologice antimicrobiene, cum sunt: - integritatea mucoaselor şi stratului de mucus, sistemul de protecţie antiinfecţioasă local (sistemul imun) reprezentat de anticorpii de tip IgA şi celule imune, care se opun invazivităţii microorganismelor; motilitatea intestinală, care realizează îndepărtarea continuă a microorganismelor enterice şi a toxinelor; microbiota intestinală autohtonă, care, în condiţii fiziologice antagonizează eficient microorganismele alohtone patogene prin colonizarea mucoaselor şi prin produşii lor de metabolism; Majoritatea germenilor patogeni de origine alimentară colonizează numai în condiţii anormale apărute la nivelul diferitelor segmente ale tubului digestiv. Prin urmare, TIA sunt favorizate de disfuncţiile acestor bariere, în principal de reducerea acidităţii gastrice şi disbiozele intestinale - dezechilibrele în structura microbiotei autohtone, cum sunt cele create de administrarea dozelor mari şi prelungite de antibiotice pe cale orală, care distrug o parte din microflora intestinală normală. Un alt factor important dependent de gazdă, care condiţionează apariţia TIA , este prezenţa receptorilor din mucoasa intestinală, care permit ataşarea specifică a germenilor microbieni şi toxinelor. Persoanele lipsite de asemenea receptori nu contractează infecţia specifică receptorului. Imunodeficienţa de diferite tipuri reprezintă, de asemenea, un factor de risc major dependent de gazdă. Persoanele afectate de SIDA (Sindromul Imunodeficienţei Dobândite) sunt primele victime şi fac forme clinice grave în cazul multor TIA. Factorii de risc microbieni în apariţia TIA sunt reprezentaţi de capacitatea microorganismelor de a coloniza mucoasa intestinală (de a se fixa pe 105

receptori celulari specifici ), de a invada structurile pereţilor intestinali şi de a sintetiza toxine. Factorii de ataşare şi colonizare sunt reprezentaţi de fimbriile bacteriene, unele lipopolizaharide şi proteine din structura membranei externe a peretelui celular la bacteriile Gram negative, acizii lipoteihoici la bacteriile Gram pozitive (vezi cap. Noţiuni de bacteriologie generală), IgA proteazele (enzime care asigură colonizarea prin clivarea anticorpilor IgA), ş.a. Colonizarea mucoasei intestinale este o condiţie obligatorie a patogenităţii microorganismelor enterale, deoarece împiedică eliminarea acestora odată cu conţinutul intestinal sub acţiunea peristaltismului. Invazivitatea este capacitatea unor virusuri enterice (rotavirusurile), a unor bacterii (Escherichia coli enteroinvazivă (EIEC) şi enteropatogenă (EPEC), Shigella spp., Salmonella spp.ş.a.) , şi a unor paraziţi (Giardia lamblia, Cryptosporidium spp. ş.a.) de a invada şi de a distruge epiteliul intestinal, alterând asfel absorbţia normală a lichidelor şi producerea de enzime digestive. Toxinele cele mai importante produse de microorganismele implicate în TIA sunt enterotoxinele şi neurotoxinele. Enterotoxinele constituie un grup particular de toxine, implicate în majoritatea toxiinfecţiilor alimentare (Bârzoi B., Meica S., Neguţ S., 1999). Ele sunt elaborate de specii bacteriene Gram-pozitive (Staphylococcus aureus, Clostridium perfringens, Clostridium difficile, Clostridium sordellii), dar mai ales de bacterii Gram-negative: Escherichia coli enterotoxigenă (ETEC) şi enterohemoragică (EHEC), Vibrio cholerae, Vibrio parahaemolyticus, Salmonella spp., Shigella dysenteriae, Aeromonas hydrophila, Campylobacter jejuni etc. În general, enterotoxinele acţionează direct asupra mucoasei intestinale, determinând fenomene citotoxice şi distructive (liza şi descuamarea enterocitelor) sau tulburări funcţionale, care modifică fluxul apei şi ionilor prin bariera epitelială. Dereglările funcţionale sunt cauzate de activarea enzimelor adenilatciclaza sau guanilat-ciclaza din membrana celulară, urmată de creşterea cantităţilor de AMPc (adenozin-monofosfat ciclic), respectiv GMPc intracelular. Consecinţa acestei acumulări este inversarea polarităţii funcţionale a enterocitului, care, din celulă absorbantă devine celulă excretoare de apă şi electroliţi (Na+, Cl-). Alterările histologice şi funcţionale produse de enterotoxine se traduc, din punct de vedere clinic, printr-o diaree abundentă. Neurotoxinele sunt exotoxine cu tropism pentru ţesutul nervos, determinând tulburări în transmiterea influxului nervos către organele efectoare. Principalele specii implicate în TIA, producătoare de neurotoxine sunt Clostridium botulinum (toxina botulinică) şi Shigella dysenteriae (toxina shiga).

106

BIBLIOGRAFIE SELECTIVĂ

BÂRZOI D., MEICA S., NEGUŢ M., 1999 – Toxiinfecţiile alimentare. Editura Diacon Coresi, Bucureşti. BUIUC D.,NEGU Ţ M., 1999 – Tratat de microbiologie clinică. Editura Medicală. CARP-CĂRARE M.,1991 – Microbiologie. Curs. Institutul Agronomic ,,Ion Ionescu de la Brad” Iaşi. CARP-CĂRARE M., 2001 – Microbiologie veterinară. Virusologie. Casa de Editură Venus. Iaşi. COMAN I.,BÂRHALĂ HELENA-MARIA, FLORESCU RODICA, 1997– Decontaminarea. Vol.I. Editura Satya. Iaşi. DUCA EUGENIA, 1974 – Microbiologie medicală. Editura Didactică şi Pedagogică. Bucureşti. DUCA EUGENIA, DUCA M., FURTUNESCU G., 1979 – Microbiologie medicală. Editura Didactică şi Pedagogică. Bucureşti. GRECIANU Al., 1986 – Microbiologie generală şi imunologie. Curs. Institutul Agronomic ,,Ion Ionescu de la Brad” Iaşi. HART T., SHEARS P., 1997 – Atlas de poche de microbiologie. Médicine – Sciences. Flamarion. Paris. IVANOF A., CIUPE M., SAŞCĂ C., VANCEA DOINA, 1982 – Microbiologie. Editura Didactică şi Pedagogică. Bucureşti. LARPENT J. P., 2000 – Listeria. Technique & Documentation – Lavoisier. Paris. LARPENT J. P. , LARPENT GOURGAUD M., 1990 Mémento – technique de microbiologie. Technique & Documentation – Lavoisier. Paris. MĂNESCU S., 1989 – Microbiologie sanitară. Editura Medicală. Bucureşti. MĂZĂREANU C., 1999, - Microbiologie generală. Editura Alma Mater. Bacău. RAICU P., STOIAN V., 1989 – Gene şi cromozomi. Editura ştiinţifică şi enciclopedică. Bucureşti. RĂPUNTEAN GH., RĂPUNTEAN S., 1999 – Bacteriologie specială veterinară. Tipo Agronomia Cluj-Napoca. STAMATIN N., 1965 – Microbiologie şi imunologie veterinară. Editura Didactică şi Pedagogică. Bucureşti. 107

TĂMAŞ V., ŞERBAN M., COTRUŢ MARIA, 1981 – Biochimie medicală veterinară. Editura Didactică şi Pedagogică. Bucureşti. TOPALĂ D. N., 1978 – Microbiologie generală. Vol.II. Universitatea ,,Al. I. Cuza” Iaşi. TORTORA J.,G., FUNKE R., B., CASE L. CHRISTINE, 1997 – Microbiology. An introduction. Sixth edition. Benjamin/ Cummings Publishing Company. California. ZARNEA G., 1963 – Microbiologie. Editura Didactică şi Pedagogică. Bucureşti. ZARNEA G., 1970 – Microbiologie generală. Editura Didactică şi Pedagogică. Bucureşti. ZARNEA G., 1983 – Tratat de microbiologie generală. Vol.I. Editura Academiei Republicii Socialiste România. ZARNEA G., 1984 – Tratat de microbiologie generală. Vol.II. Editura Academiei Republicii Socialiste România. ZARNEA G., 1986 – Tratat de microbiologie generală. Vol.III. Editura Academiei Republicii Socialiste România. ZARNEA G., 1994 – Tratat de microbiologie generală. Vol. V. Editura Academiei Române.

108

ÎNTREBĂRI RECAPITULATIVE CAPITOLUL I 1. Care este obiectul de studiu al microbiologiei ? 2. Care sunt caracterele distinctive între principalele categorii de microorganisme? 3. Care este poziţia microorganismelor în sistematica biologică? 4. Cine este considerat fondatorul medicinei raţionale şi de ce? 5. Cine a efectuat primele obsrvaţii şi descrieri ale microorganismelor, bazate pe examenul microscopic? 6. Care sunt meritele savanţilor Louis Pasteur şi Robert Koch în constituirea microbiologiei ca ştiinţă şi progresele ei? 7. Cine este fondatorul şcolii româneşti de microbiologie şi în ce constă aportul său la dezvoltarea microbiologiei? 1. CAPITOLUL II Care sunt formele de existenţă a bacteriilor în natură? 2. Ce semnificaţie are conceptul de specie bacteriană? 3. Ce forme pot avea bacteriile şI cum se grupeză celulele bacteriene la unele specii? 4. Între ce limite variază dimensiunile celulelor bacteriene? 5. Care sunt părţile componente ale celulei bacteriene? 6. Care sunt structura şi funcţiile membranei citoplasmatice? 7. Ce elemente morfochimice ale peretelui celular condiţionează modul de colorare a bacteriilor prin metodele Gram şI Ziehl-Neelsen? 8. Care este semnificaţia biologică (rolul) peretelui celular? 9. Ce rol îndeplineşte capsula bacteriană ? 10. Ce structuri conţine citoplasma celulei bacteriene şi care este rolul lor? 11.Din ce se compune materialul genetic al bacteriilor? 12. Ce sunt cilii (flagelii) bacterieni şi ce rol îndeplinesc? 13. Ce sunt pilii bacterieni, de câte feluri sunt şi care este semnificaţia lor biologică? 1.

109

Câte tipuri de bacterii există în raport cu sursele de energie şi carbon pe care le utilizează? 15. În ce constau catabolismul, respiraţia şi anabolismul la bacterii? 16. Pe ce cale se multiplică majoritatea speciilor bacteriene? 17. Care sunt fazele multiplicării bacteriilor în mediile de cultură şi particularităţile generate de starea de agregare a mediului (lichidă, solidă)? 18. Care sunt particularitatilebiochimice, fiziologice si biologice ale sporului bacterian? 19. Cum se clasifica microorganismele in funcţie de preferinţele termice ? 20.Ce particularitate prezinta bacteriile osmofile (halofile, zaharofile)? 21.In ce consta plasmoliza si plasmoptiza bacteriilor? 22. Cum se clasifica bacteriile in funcţie de comportamentul lor în raport cu valoarea presiunii hidrostatice ? 23.Ce efecte au asupra microorganismelor radiatiile UV si radiatiile ionizante si care sunt domeniile de aplicabilitate? 24.Pr ice se diferentiaza substantele antiseptice (antisepsia) de cele dezinfectante (respectiv, dezinfectia)? 14.

CAPITOLUL III Care sunt particularităţile structurale ale celulei micotice, raportate la structura celulei bacteriene? 2. Care este structura fungilor filamentoşi şi care sunt părţile distincte din punct de vedere morfo-fiziologic? 3. Prin ce se deosebesc levurile de fungii filamentoşi? 4. Care sunt modalităţile de multiplicare ale ciupercilor microscopice? 5. Ce rol îndeplinesc în natură miceţii saprobioţi? 6. Care sunt efectele favorabile ale ciupercilor microscopice valorificate in industria alimentelor? 7. Cum se clasifică bolile produse de miceţi? 8. Care sunt cele mai importante micotoxine prin efectul lor asupra sanatatii omului si a animalelor ? 1.

CAPITOLUL IV 1. Care sunt formele de existenţă a virusurilor în natură şi caracteristicile lor? 2. Ce forme şi ce dimensiuni pot avea particulele virale? 3. Care sunt părţile componente ale unui virus? 4. Pe ce căi pătrund şi diseminează virusurile în organism? 5. În ce constă tropismul virusurilor şi cum se clasifică virusurile în funcţie de tropism? 6. Care sunt etapele multiplicării particulelor virale? 110

7. Care sunt efectele multiplicării intracelulare a virusurilor ? 8. Cum se comportă virusurile faţă de temperatură, pH, radiaţii şi substanţele dezinfectante? CAPITOLUL V Cum se clasifică microorganismele dintr-un habitat luând drept criteriu prezenţa constantă şi numărul lor? 2. Care este provenienta microorganismelor din lapte? 3. Care sunt sursele de contaminare a laptelui după recoltare ? 4. Care sunt microorganismele patogene transmisibile prin lapte ? 5. In ce scop sunt utilizate culturile selectionate si care sunt efectele acestora asupra calitătiilor nutritive ale produselor lactate ? 6. Cum variază pH-ul cărnii după sacrificarea animalelor şi care sunt factorii care il influentează ? 7. Care sunt principalele metode de conservare, care previn multiplicarea majoritaţii bacteriilor de contaminare implicate in alterarea carnii ? 8. Care sunt sursele de contaminare microbiologică a carnii ? 9. Cand are loc contaminarea cea mai intensă, cu semnificaţie pentru conservabilitatea şi salubritatea cărnii ? 10.Ce reprezintă bacteriemia de abataj şi care sunt factorii care o pot inflenţa ? 11.Care sunt măsurile de prevenire a bolilor infecţioase şi toxiinfecţiilor alimentare prin consum de carne contaminată cu microorganisme patogene? 12. Care este conditia microbiologica a oualor la depunere si cum evolueaza in timp? 13. Care sunt bacteriile patogene transmise frecvent prin intermediul oualor ? 14.Ce sunt toxiinfectiile alimentare si care boli sunt incluse in notiunea de TIA ? 15.Care sunt barierele chimice, fizice si biologice existente la nivelul stomacului si intestinelor care se opun colonizarii si multiplicarii microorganismelor patogene vehiculate de alimente si implicit, producerii de infectii si TIA ? 16. Care sunt factorii de risc microbieni în apariţia TIA ? 1.

TEST (exemplificare) 111

1. Teoria miasmatică a infecţiilor a fost elaborată de: a.Hipocrat b.Leeuwenhoeck c.Linee 2. Demonstrează natura microbiană a fermentaţiilor şi a infecţiilor; a. Eduard Jenner b. Louis Pasteur c. Joseph Lister 3. Fondatorul şcolii româneşti de microbiologie a fost: a. Ioan Cantacuzino b. Nicolae Stamatin c. Victor Babeş 4. Bacteriile sunt microorganisme: a. unicelulare b. pluricelulare c. eucariote d. procariote 5. Nucleul celulei bacteriene este format: a. dintr-un singur cromozom b. 2-4 cromozomi 6. Capsula protejează bacteriile faţă de: a. fagocitoză b. radiaţiile ultraviolete c. desicaţie (uscăciune) 7. Mobilitatea bacteriilor se datorează: a. cililor b. pililor c. plasmidelor 8. Sediul sintezei proteinelor în celula bacteriană îl constituie: a. vacuolele b. ribozomii c. nucleul 9.Bacteriile autotrofe (litotrofe) utilizează ca sursă de carbon: a. compuşii organici ai carbonului b. compuşii anorganici ai carbonului 10. Bacteriile chimioorganotrofe utilizează: a. energia luminoasă b. energia rezultată din reacţiile de oxidoreducere 11.Respiraţia la bacterii constă în: a. sinteza structurilor celulei bacteriene b. reacţii de oxidoreducere prin care bacteriile îşi procură energia c. preluarea oxigenului din aer şi eliminarea bioxidului de carbon 12. În funcţie de natura chimică a ultimului acceptor de hidrogen, respiraţia la bacterii este de trei tipuri: 112

1…………………………. 2…………………………. 3…………………………. 13. Majoritatea speciilor bacteriene se multiplică prin: a. diviziune directă (sciziparitate) b. înmugurire c. spori 14. Fazele multiplicării bacteriilor în mediile de cultură sunt: 1……………………………….. 2………………………………... 3…………………………………. 4………………………………… 15. În faza staţionară a multiplicării bacteriilor are loc: a. o multiplicare activă la fiecare 15-20 minute b. moartea logaritmică a bacteriilor c. o multiplicare de înlocuire 16. Sunt alcătuiţi din celule care prin înmugurire generază pseudomicelii: a. fungii levuriformi b. fungii filamentoşi 17. Ciupercile microscopice se inmulţesc prin: a. spori sexuaţi b. spori asexuaţi c. porţiuni de miceliu 18. Sunt spori asexuaţi: a. bazidiosporii b. ascosporii c. blastosporii d. artrosporii e. conidiosporii 19. Asigură conservarea miceţilor în condiţii de mediu nefavorabile: a. ascosporii b. clamidosporii 20.Bolile produse de miceţi poartă denumirea generică de ………………………..iar cele produse de toxinele acestora , ………………………. 21. Virusurile au dimensiuni de ordinul: a. micrometrilor b. nanometrilor c. milimetrilor 22. Formele de existenţă a virusurilor în natură sunt: 1……………………………… 2……………………………… 3……………………………… 23. Părţile componente ale unui virus sunt: a. citoplasma 113

b. capsida c. membrana citoplasmatică d. genomul ADN sau ARN 24. Virusurile: a. dispun de echipament enzimatic şi metabolism propriu b. nu dispun de enzime metabolice, din care cauză sunt parazite obligatoriu într-o celulă vie 25. În funcţie de histotropism, virusurile pot fi grupate astfel: 1………………………………….. 2………………………………….. 3…………………………………... 4…………………………………... 26. Virusurile : a. se multiplică prin diviziune directă (sciziparitate) b. sunt multiplicate de celulele în care parazitează 27. Multiplicarea virusurilor parcurge următoarele 4 etape: 1………………………….. 2………………………….. 3………………………….. 4…………………………... 28. Efectul citopatic al multiplicării virusurilor în celule constă în : a. degenerare şi moarte celululară b. multiplicarea anarhică a celulelor infectate c. apariţia unor incluzii intracitoplasmatice sau intranucleare 29. Incluziile Babeş - Negri din neuronii piramidali situaţi în cornul lui a. Amon apar în: a. turbare b. gripă c. variola aviară 30. Substanţele care acţionează distructiv asupra virusurilor sunt: a. hidroxidul de sodiu b. formaldehida c. glicerina d. majoritatea antibioticelor 31. Microorganismele care populează în mod constant un biotop (habitat) constituie: a. microbiota autohtonă a biotopului b. microbiota alohtonă a biotopului 32. Glanda mamara a animalelor de lapte este contaminate cu microorganism, la nivelul: a. tesutului glandular b. mucoasei din treimea inferioara a canalelor galactofore

114

33. Încărcătura microbiană a laptelui este mai mare: a. în primele jeturi de lapte b. în ultimele jeturi de lapte 34. Microbiota normală a unui lapte igienic se compune din urmatoarele microorganisme : a. Lactobacillus (L. acidophilus, L.casei ş.a. ) şi Streptococcus (S. lactis, S. cremoris, S. thermophilus etc.) b. Mycobacterium bovis, Brucella abortus, Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Streptococcus pyogenes 35.Laptele recoltat de la animalele sănătoase : a. este steril b. conţine 300-500 celule bacteriene /ml 36.Microflora normală a unui lapte igienic cuprinde bacterii aparţinând speciilor : a. Staphylococcus aureus, , Escherichia coli, Mycobacterium bovis b. Streptococcus lactis, S. Cremoris, Lactobacillus acidophilus, L. casei 37. Enterotoxina produsa de Staphylococcus aureus: a. este termostabila (termorezistenta) b. este inactivata prin pasteurizare 38 Specii lede fungi (mucegaiuri):utilizate pentru obţinerea brânzeturilor Cammembert şi Roquefort aparţin genului: a. Aspergillus b. Penicillium c. Mucor 39. Invadarea musculaturii şi a organelor cu bacterii din tubul digestiv, la nivele superioare bacteriemiei de abataj, este favorizată de: 1……………………………………….. 2……………………………………….. 3………………………………………… 40. Alterarea (putrefacţia) cărnii determinată de microorganisme poate avea loc: a. numai la temperaturi crescute şi umiditate b. la temperaturi scăzute 41. Ouăle proaspete conţin microorganisme: a. la suprafaţa cojii b. în albuş c. în gălbenuş 42. Dintre bacteriile patogene pentru om, mai frecvent vehiculate prin ou sunt : a. salmonelele b. stafilococii c. bacilii tuberculozei 115

43. În noţiunea de toxiinfecţie alimentară (TIA) sunt incluse următoarele grupe de boli? a. infectiile produse de agenti microbieni ingerati odata cu alimentele si care se multiplica la nivelul epiteliului intestinal, însoţite de tulburări gastrointestinale; b. intoxicatiile de origine microbiana; c. intoxicatiile produse de ingerarea unor substante chimice (metale grele, pesticide etc.) d. intoxicatiile produse de ciupercile otrăvitoare. 44. TIA sunt favorizate de: a. reducerea acidităţii gastrice b. aciditatea gastrică crescută 45.Favorizează TIA produse de bacterii: a. aciditatea gastrică; b. aclorhidria şi peristaltismul intestinal diminuat; c. microflora intestinală normală; 46. Microflora patogenă poate coloniza tractusul digestiv: a. în prezenţa microbiotei normale b. în nişele ecologice abandonate de microflora autohtonă; 47.Enterotoxinele bacteriene: a. acţionează direct asupra mucoasei intestinale determinând fenomene distructive şi tulburări de absorbţie; b. acţionează în exclusivitate asupra SNC; c. acţionează asupra musculaturii striate. 48. Care dintre metodele de sterilizare enumerate mai jos, realizează o sterilizare completă? a. fierberea b. autoclavarea c. pasteurizarea joasă, medie şi înaltă d. ultrapasteurizarea (UHT) 49. Pasteurizarea UHT (Ultra High Temperature) constă în: a. încălzirea lichidelor de sterilizat la 70-75 grade C, timp de 10-20 minute b. încălzirea lichidelor de sterilizat la 80-85 grade C, timp de câteva secunde c. încălzirea instantanee la 150 grade C prin injectarea vaporilor de apă supraîncălziţi 50. Autoclavarea se realizează la următorii parametri: a. 180 grade C,; 1h; b. 1 atm , 120 grade C ; 30 minute; c. 100 grade C; 30 minute 51. Recoltarea probelor de alimente în scopul efectuării examenului microbiologic, se efectuează: 116

a. în recipiente sterile, folosind instrumente sterile b. în cantitate de 100 grame sau mililitri, indiferent de mărimea lotului de alimente 52 NTG se calculează înmulţind numărul coloniilor dintr-o placă cu ......................... 53. Mediile de cultură uzuale pentru bacteriile aerobe sunt:........................................................ 54. Bacteriile Gram pozitive se colorează în: a. roşu b. violet c. verde

117