CARRILLO LEONOR Microbiologia Agricola Completo

MICROBIOLOGÍA AGRÍCOLA Leonor Carrillo Dra. en Ciencias Químicas (Orientación Biológica) Profesora Titular en Facultad de Ciencias Agrarias, UNJu y Facultad de Ingeniería, UNSa

© Universidad Nacional de Salta ISBN 987-9381-16-5 (http://www.unsa.edu.ar/matbib)

2003

CONTENIDO 1.Microorganismos. Reinos. Organismos procarióticos: eubacterias, arqueobacterias, actinomicetos, cianobacterias, mixobacterias. Organismos eucarióticos: mohos levaduras, macromicetos, mixomicetos, protozoos, algas, líquenes. Organismos acelulares: virus, viroides, priones. Transferencia genética en bacterias: conjugación, transformación, transducción, fusión de protoplastos. 2. Vida y muerte de los microorganismos. Crecimiento. Tipo de nutrición. Factores de crecimiento orgánicos y minerales. Transporte de solutos. Factores ambientales: agua y presión osmótica, tensión superficial, pH, oxígeno, potencial redox, temperatura. Medios de cultivo. Esterilización. Acción del calor, radiaciones, luz ultravioleta, microondas y ultrasonido. Separación por filtración. Desinfección. Interacciones microbianas: antibiosis, mutualismo y simbiosis. Fijación simbiótica del nitrógeno. Micorrizas. Biopelículas. Predación. 3. Actividad microbiana. Suelo. Metabolismo. Degradación de biopolímeros: celulosa, almidón, levanos, xilanos y otras hemicelulosas, pectinas, quitina, lignina, lípidos, proteínas, polinucleótidos. Metabolismo productor de energía. Respiración: degradación de hexosas, ciclo del ácido tricarboxílico, cadena de transporte de electrones, fosforilaciones. Fermentaciones: lácticas, alcohólica, propiónicas, fórmicas, butíricobutanólica, acéticas, de aminoácidos. Oxidaciones incompletas. Respiración anaeróbica. Desnitrificación, reducción a nitritos, sulfatorreducción y metanogénesis. Bacterias autotróficas. Nitrificación, sulfooxidación, ferrooxidación. Biosíntesis. Síntesis de proteínas y otros compuestos. 4. Estructuras fúngicas. Estructuras somáticas. Estructuras reproductoras anamórficas y teleomórficas. 5. Rumen y biogas. Metanogénesis, diversidad de las arqueobacterias metanogénicas. Rumen, un digestor natural. Características del biogas. Digestores anaeróbicos, materia prima, factores ambientales, criterios de diseño y construcción, operación, peligros potenciales y seguridad. 6. Micotoxinas. Hongos en el campo y el almacenamiento. Honhos toxigénicos y micotoxinas “naturales”. Producción de micotoxinas. Peligros. Prevención. 7. Hongos. Clasificación. Macromicetos. Ascomycota y Basidiomycota. Hongos micorrizantes, inoculación de plantines. Cultivo del champiñón, obtención del micelio, preparación del compost, siembra del inóculo, producción. Cultivo de hongos lignívoros, preparación del substrato, inoculación y producción de las setas, cultivo sobre troncos. Apéndice Medios de cultivo y esterilización. Aislamiento y cultivo de microorganismos. Fijación simbiótica de nitrógeno en leguminosas. Microorganismos del suelo. Inhibidores y desinfectantes. Digestión anaeróbica de residuos agrícolas. Morfología microscópica de hongos. Identificación de mohos toxigénicos. Micorrizas. Microorganismos del agua.

ÍNDICE Actinomicetos 1-8 fijadores de nitrógeno 2-7 Aerobio 2-7 Agua 2-5 actividad 2-5 humedad relativa 2-5 microorganismos A-31 potencial 2-6 Algas 1-13 Amonificación A-16 Anaerobio 2-7, 3-19 Antibacteriano 2-14, A-21 Antibiosis 2-14 Antifúngico 2-14, A-21 Arqueobacterias 1-7, 3-21, 5-2 Autotótrofo 2-2, 3-21, A-2 Bacterias butíricas 3-19 celulolíticas 3-6 eubacterias 1-4 fijadoras simbióticas 2 -16 fijadoras vida libre 3-24 formas 1-7 gram-positivas 1-4 gram-negativas 1-4 halófilas 1-8 lisogénicas 1-14 metanógenas 1-8, 3-21, 5-1 ruminales 3-21, 5-4 termoacidófilas 1-8 Bactericida 2-14 Bacteriocinas 2-14 Bacteriófago 1 -14 Bacteriostático 2-14 Bacteroide 2-16, 3-25 Biodegradación 3-5 Biogas 5 -1 características 5-8 Biopelícula 2-18 Biosíntesis 3-20, 3-23 ácidos grasos 3-25 aminoácidos 3-23 glúcidos 3-26 nucleótidos 3-25 proteínas 3 -23 Cadena respiratoria 3-16, 3 -20 Capacidad de campo 2-6, 3-3 Catabolismo 3-14 Células

eucarióticas 1-10 procarióticas 1-3 Cianobacterias 1-9, 3 -25 Ciclo del azufre 3-21 citrato 3-16 nitrógeno 3 -21 Colonias de bacterias 1-6 Coloraciones A-10 Crecimiento 2-1 Cultivos bacterias 2-9, A-8 hongos 7-11, 7-12, A-11 medios 2 -9, A-2 Degradación de almidón 3-8 biopolímeros 3-4 celulosa 3-6, A-18 hemicelulosas 3-9 hexosas 3-15 levanos 3-15 lignina 3-11 lípidos 3-12 pectinas 3-10 polinucleótidos 3 -14 proteínas 3-13 quitina 3-11 xilanos 3-9 Desinfección 2-13, A-21 Desnitrificación 3-19, A-16 Digestión anaeróbica 5-2, A-23 carga 5-13, 5-14 construcción 5-10 criterios de diseño 5-10 digestores rurales 5-5 etapas 5-2 factores ambientales 5-9 microorganismos 5-2 operación 5 -13 otros digestores 5-6 parámetros 5-7. 5-11 residuos 5-6 seguridad 5 -14 División celular 1-7 Endosporos bacterianos 1-6 termorresistencia 2-11 Esporas fúngicas 1-11, 4-2 Esterilización calor 2-11, A-3 filtración 2-13, A-4 presión autoclave 2-11 radiaciones 2-12

Factores de crecimiento 2-3 Factores ambientales 2-5, 3-3, 5-9 actividad agua 2-5 luz ultravioleta 2 -13 microondas 2-13 oxígeno 2-7 pH 2 -6 potencial agua 2-6 potencial de reducción 2-8 presión osmótica 2-5 radiaciones 2-12 temperatura 2-8, 3-3 tensión superficial 2-6, 2-14 ultrasonido 2-13 Facultativo 2-7 Fermentaciones 3-17 acética 3-19 ácida mixta 3-18 aminoácidos 3-19 butanodiólica 3 -18 butírico-butanólica 3-19 etanólica 3-18 fórmicas 3 -18 lácticas 3-17 propiónicas 3-18 Ferrooxidación 3-22 Fijación del CO2 3-26 Fijación de nitrógeno vida libre 3-24, A-17 inoculante 2-17, A-13 mecanismo 3 -24 simbiótica 2-16, A-13 Flagelos bacterianos 1-5 Fotosíntesis bacteriana 3-26 Fotótrofo 2-2, 3-26 Genética bacteriana 1-15 conjugación 1-16 genoma 1-4 plásmidos 1-6 recombinación 1-16 replicación 1-15 transducción 1-18 transforma ción 1-17 Halófilo 2-6 Heterótrofo 2-2, A-2 Hongos 4-1, 7-1, A-25 ascomicetos 4-4, 7 -3 anamorfos 4-2 basidiomicetos 4-5, 7-4 clasificación 7-1 champiñón 7-11 cultivo 7-11, 7-12

deteriorantes 6-1 estructuras somáticas 4-1 estruct. reproductoras 4-1 levaduras 1 -12 lignívoros 3 -11, 7 -12 macromicetos 1-12, 7-3 mohos 1-11 micorrizantes 2-18, 7-8, A -29 teleomorfos 4-4 Humedad relativa 2-5 Inoculantes bacterianos 2-17, A-13 fúngicos 7-10 Interacciones microbianas 2-15 Levaduras 1-12, 4-1 Líquenes 1-13 Macromicetos 1-12, 7 -3 Medios de cultivo 2-9, A-2 Membranas bacterianas citoplasmática 1-4 internas 3-22 Mesófilo 2-8 Metabolismo 3-4 bacteroides 3-25 productor de energía 3-14, 3 -20 Metabolitos secundarios 3 -26, 6 -1 Metanogénesis 3-21, 5-1 Micorrizas ectomicorriza 2-18, 7-9, A-29 endomicorriza 2-18, 7-9, A-29 inoculación 7-10. A-29 Micotoxinas 6-1 mohos toxigénicos 6-3, A-27 prevención 6-6 principales toxinas 6-3 producción 6-2 toxicidad 6-4 Microorganismos 1-1 agua A-31 amilolíticos 3-8 celulolíticos 3-6 desnitrificantes 3 -19 eucariotas 1-10 lignívoros 3 -11, 7 -12 pectinolíticos 3-10 procariotas 1-3 quitinolíticos 3-11 suelo 3-1 tamaño 1-1, A-12 Micronutrientes 2-3 Mixobacterias 1-9 Mixomicetos 1-12

Leonor Carrillo. 2003. Microbiología Agrícola. Apéndice

Apéndice Guía de trabajos prácticos CONTENIDO 1.

Medios de cultivo y esterilización

2.

Aislamiento y cultivo de microorganismos

3.

Fijación simbiótica de N 2 en leguminosas

4.

Microorganismos del suelo

5.

Inhibidores y desinfectantes

6.

Digestión anaeróbica de residuos agrícolas

7.

Morfología microscópica de hongos

8.

Identificación de mohos toxigénicos

9.

Micorrizas

10. Microorganismos del agua

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TRABAJO Nº 1. Medios de cultivo y esterilización Objetivo. Preparar los substratos o medios de cultivo, cuya composición varia según el tipo de

organismos y la selectividad esperada, para estudiar los microorganismos en el laboratorio. Esterilizar estos materiales para eliminar los microorganismos que pudieran alterarlos antes del uso.

Introducción Nutrición

Los microorganismos toman del ambiente circundante los materiales o nutrientes que son el punto de partida para las reacciones metabólicas que los convierten en constituyentes celulares. Hay nutrientes necesarios sin los cuales una célula no puede crecer, y otros útiles pero no indispensables. La primera división en las categorías nutricionales tiene en cuenta dos parámetros: la naturaleza de la fuente de energía y la naturaleza de la fuente principal de carbono. Los organismos que usan la luz como fuente de energía se denominan fotótrofos y los que utilizan fuentes de energía química se denominan quimiótrofos. Los que emplean CO 2 como principal fuente de carbono se definen como autótrofos, pero los que utilizan compuestos orgánicos para el mismo fin se llaman heterótrofos. Los microorganismos necesitan una diversidad de minerales para su crecimiento, y los más comunes son el potasio, sodio, magnesio, calcio e hierro. Los factores de crecimiento son compuestos orgánicos específicos requeridos en muy pequeñas cantidades y no puede ser sintetizados por la célula.

Diseño de un medio de cultivo En el cuadro siguiente se consideran tres medios de distinta complejidad. Medio 1 agua cloruro de amonio fosfato dipotásico carbonato de calcio sulfato de magnesio sulfato ferroso cloruro de calcio sales inorgánicas de Mn, Mo, Cu, Co, Zn

1L 1g 1g 1g 10 mg 10 mg 10 mg 0,02 mg de cada uno

Medio 2 agua peptona o triptona extracto de carne agar

1L 5g 3g 15 g

Medio 3 agua peptona de soja glucosa extracto de levadura agar

1L 10 g 10 g 2,5 g 15 g

Al elaborar un medio de cultivo para un organismo cualquiera, el objetivo pricipal consiste en proporcionar una mezcla equilibrada de los nutrientes requeridos, en concentraciones que permitan un buen crecimiento. El punto de arranque es componer una base mineral que proporcione las sales inorgánicas que pueden suministrarse a cualquier organismo. Esta solución puede suplementarse luego, si es necesario, con una fuente de carbono, una de energía, una de nitrógeno y algún factor de crecimiento requerido. El medio 1 puede permitir el crecimiento de bacterias nitritantes autótrofas que usan el dióxido de carbono como fuente de carbono y oxidan amonio para obtener energía. El medio 2 es un medio complejo que favorece el desarrollo de muchas bacterias heterótrofas que obtienen energía y también carbono de aminoácidos y péptidos, pero no requieren factores de crecimiento. El 3 contiene glucosa, varios constituyentes nitrogenados orgánicos y factores de crecimiento como para cubrir las necesidades nutricionales de mohos y levaduras. Cualquier medio adecuado para el crecimiento de un organismo específico es, en cierto modo, selectivo para él. Los microorganismos deseados pueden obtenerse de los ambientes naturales

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tales como el suelo, empleando medios selectivos. Como agente gelificante de los medios de cultivo se utiliza comúnmente el agar que es obtenido de algas pero no es nutriente para la mayoría de los microorganismos. El gel de agar es firme a las temperaturas de incubación pero se convierte en líquido (sol) cuando se calienta a la temperatura de ebullición del agua, gelificando nuevamente cuando se enfria a 45ºC. Otra manera de proporcionar una superficie nutritiva es utilizar un filtro de membrana de esteres de celulosa depositado sobre un disco de absorbente embebido con el medio de cultivo. El medio traspasa los poros permitiendo el desarrollo de los microorganismos que están en la superficie. El extracto de carne es un extracto acuoso de músculo de bovino, concentrado hasta una consistencia pastosa o desecada hasta polvo, que contiene compuestos solubles tales como azúcares, aminoácidos y sales. El hidrolizado de proteína se obtiene por digestión de músculo con pepsina (peptona) o tripsina (triptona) o de caseína (casitona, tripticase) o de proteina de soja (peptona de soja). Los medios complejos deshidratados contienen algunos componentes cuya concentración varía con cada partida y suelen tener una baja capacidad reguladora del pH.

Esterilización Esterilizar significa eliminar toda clase de microorganismos. Esto puede realizarse de diferentes modos. Pueden eliminarse las bacterias del aire por filtración, como en las cámaras de flujo laminar estéril, y de los líquido a través de membranas fltrantes u otro filtro. La destrucción de las bacterias puede hacerse mediante calor seco o húmedo para el tratamiento de la mayoría de los materiales, o rayos ultravioletas para el caso de superficies, o con radiaciones ionizantes para esterilizar plásticos deseartables. El calor seco se utiliza en estufa de aire caliente, pero no es un método eficaz de calentamiento porque el aire es un mal conductor del calor. En ausencia de humedad las formas más resistentes (endosporos bacterianos) requieren temperaturas por sobre 160ºC durante una hora y media para morir. El vapor a presión es el procedimiento más efectivo de esterilización por calor húmedo. El vapor a una presión absoluta de 2,066 kg/cm2 proporciona una temperatura de 120,6ºC que es mortal para los endosporos bacterianos en pocos minutos, pero el tiempo de aplicación varía según el tiempo necesario para homogeneizar la temperatura en el material tratado. La presión absoluta a la que está sometido el material dentro d el autoclave es igual a la presión leída en el manómetro sumada a la presión atmosférica del lugar. Como esta última varia con la altura sobre el nivel del mar, debe calcularse la presión manométrica necesaria para llevar a cabo la esterilización en cada localidad, haciendo caso omiso de las graduaciones en temperaturas adicionadas al manómetro por los fabricantes a nivel del mar. En la figura 1 se ven las curvas de temperaturas alcanzadas en función del tiempo en un autoclave con distinto grado de purgado del aire. La figura 2 muestra el tiempo requerido para esterilizar distintos volúmenes a 120,6ºC. La temperatura de ebullición del agua puede ser usada para esterilizar materiales nutritivos que se alterarían a temperaturas mayores, mediante el siguiente artilugio: el material es tratado durante 30 minutos el primer día e incubado a la temperatura ambiente, vuelto a calentar 30 minutos el segundo día y otra vez incubado, para finalmente calentarla otros 30 minutos el tercer día. El tratamiento durante el primer día destruye las formas vegetativas, el período de

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incubación permite la germinación de muchos endosporos y las formas sensibles originadas mueren con el segundo calentamiento. Los endosporos que persistieron germinarán durante el segundo período de incubación y las células formadas morirán con el tercer calentamiento. Como se ve, la tindalización es efectiva únicamente cuando el medio a esterilizar es favorable para la germinación de los esporos. No destruirá los endosporos de anaerobios si la incubación no se lleva a cabo en condiciones de anaerobisis y tampoco destruirá a los endosporos del grupo termofílico. Teniendo en cuenta la cinética microbiana el fin práctico de la esterilización mediante un agente letal es lograr que la probabilidad de que el material tratado contenga tan sólo un superviviente, sea muy pequeña. Los procedimientos habituales de esterilización se proyectan siempre de forma que proporcionen un amplio margen de seguridad.

Filtración Los microorganismos quedan retenidos por el pequeño tamaño de los poros del filtro y con algunos tipos de materiales filtrantes por adsorción sobre los mismos, además de la influencia del pH del líquido sobre las cargas de los microorganismos y el filtro. Comúnmente en el laboratorio se usan membranas de esteres de celulosa con porosidades de 0,45 µm ó 0,2 µm, pero también suelen usarse en otros casos unos filtros de porcelana o vidrio fritado (sinterizado).

Procedimiento Preparación del material de vidrio

Obturar con algodón la extremidad no aguzada de las pipetas con la ayuda de un punzón. Colocar dos o tres de ellas en un sobre de papel y cerrarlo con broches metálicos, o bien envolverlas separadamente en una tira de papel. Envolver con papel cada caja de Petri cerrada. Tapar los tubos de ensayo con algodón prensado de tal modo que, se pueda quitar y colocar el tapón sin deformarlo. Reunir unos diez tubos en un paquete.

Esterilización por aire caliente El material limpio y bien seco, una vez tapado con algodón y/o envuelto con papel, se ubica en el interior de la estufa (horno o esterilizador). Luego se calienta hasta que la temperatura alcance 170ºC y se la mantiene durante 30 a 60 minutos enfriar según la carga. Se deja enfriar el aparato antes de abrir, para evitar la rotura del vidrio por el contacto brusco con el aire frío. Al

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terminar la operación, el algodón y/o el papel de diario tendrán un color tostado pálido. Desde los 150ºC ambos comienzan a amarillear, pero a los 180ºC pierden la propiedad de detener las bacterias y se forman residuos carbonosos más o menos antisépticos.

Control de la eficacia de la esterilización

Se coloca en la estufa, junto con el material de vidrio, un tubo con endosporos bacterianos (cultivo seco o suelo tamizado). Una vez sometido al tratamiento térmico, se le agrega un medio nutritivo líquido y se incuba a 30ºC durante 48 horas. Si se ha logrado la esterilización, no habrá desarrollo bacteriano.

Preparación de medios de cultivo

La mayoría de las bacterias heterótrafas pueden multiplicarse en el medio 2 denominado " agar nutritivo". Para disolver el agar se calienta el recipiente en un baño de agua hirviente o en el autoclave a vapor fluente. El pH del medio debe estar próximo a 7. Si se prepara sin agar se obtiene el medio llamado "caldo nutritivo". Los hongos suelen crecer más lento que las bacterias y toleran mejor la acidez, por lo que suele usarse para su cultivo el medio 3 conocido como "agar micológico" cuyo pH es aproximadamente 5,6, al que se le añadió extracto de levadura para que desarrollen aun los organismos exigentes en vitaminas. Los medios se distribuyen en tubos de ensayo o en matraces de Erlenmeyer ocupando sólo un tercio de su capacidad. Tanto los tubos como los matraces llevan tapones de algodón, excepto cuando tienen tapa a rosca esterilizable. Los tubos se reúnen en cestos y se los cubre con dos o tres hojas de papel poroso donde se escribe con lápiz el nombre del contenido. Se cubren los matraces con un capuchón de papel y un hilo atado de tal forma que pueda quitarse fácilmente. Los medios de cultivo se esterilizan en autoclave.

Esterilización por vapor de agua a presión

En el autoclave se logra que la temperatura del vapor de agua sea superior a la ebullición (96ºC a 1300 m s.n.m.) por medio de un aumento de la presión, luego de la eliminación del aire por la espita o válvula de purga. Si funciona a 1,18 kg/cm2 por sobre la presión atmosférica promedio local (0,88 kg/cm2 = 884 HPa), el agua hervirá a 121ºC. Al mantener esta temperatura durante 15 minutos se logra la destrucción de toda forma de vida en volúmenes menores a 100 mL. El mismo resultado se alcanza prácticamente en materiales poco contaminados, calentando a 115ºC (0,84 kg/cm2 de presión manométrica) durante 20 minutos. Los sólidos o liquidos muy viscosos deben ser calentandos a 121ºC durante 30 minutos. Si el autoclave está muy cargado, o los volúmenes son mayores, es necesario prolongar el tiempo de calentamiento. Con estas condiciones de tratamiento pueden sobrevivir los endosporos de bacterias termofílicas, pero éstas no crecen a las temperaturas comunes de incubación (25 - 37ºC). Colocar agua hasta la rejilla, ubicar los recipientes y cerrar el autoclave, ajustando las mariposas opuestas para que la tapa quede bien apoyada sobre la junta de goma. Encender el mechero. Cerrar la espita, o válvula de purga, recién cuando sale un chorro de vapor continuo pues entonces se ha logrado purgar el aparato. A partir de este momento comienza a aumentar la presión, la que se regula y mantiene con la altura de la llama. Vigilar el autoclave durante la esterilización. Cumplido el tiempo, cerrar la llave de gas y esperar hasta que la aguja del manómetro vuelva a cero, antes de abrir la espita para igualar las presiones, interna y externa. Luego abrir la tapa. Si se abriera la espita durante el enfriamiento, la brusca descompresión producirla la ebullición violenta de los líquidos y los proyectarla fuera de los recipientes. Por otra parte si se abre demasido tarde, el vapor se habrá condensado sobre los papeles y algodones, y se habrá acelerado el deterioro de la junta de goma por el vacio formado.

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Control de la temperatura de esterilización Se coloca un tubito con ácido benzoico en polvo (p.f. 121ºC) junto al material a esterilizar.. Si se alcanza la temperatura de fusión durante el proceso de esterilización, luego del enfriamiento quedará una masa homogénea de ácido benzoico. También se usan mezclas indicadoras adheridas sobre cartón u otro material, tal como la compuesta por carbonato de plomo + azufre precipitado + carbonato de litio (10 + 1+ 3). Esta mezcla vira al gris después de 30 minutos a 100ºC, en 3 ó 4 minutos a 110ºC y en 30 segundos a 121ºC. Toma color negro si está expuesta más de 30 minutos a 110ºC y en 5 minutos a 121ºC.

Esterilización por filtración

Se eliminan los bacterias de las soluciones que se descomponen o inactivan al someterlas a la temperatura del autoclave, pasándolas a través de membranas con poros de 0,2 ó 0,45 µm u otros filtros. La membrana o disco filtrante se coloca sobre una superficie porosa rígida, en una suerte de embudo desmontable adaptado a un matraz de Kitasato (ver figura 3) mediante un tapón de goma, para poder hacer un vacio parcial con una bomba o una trompa de agua. La tubuladura lateral del matraz se conecta a un tubo engrosado en su parte media, donde se coloca algodón. Se envuelve el conjunto con papel y se esteriliza en el autoclave. Después se ubica el disco filtrante en el embudo desmontable cumpliendo con las reglas de asepsia y se conecta el matraz de Kitasato a la trompa de agua o la bomba de vacío.

Control de la eficiencia de la filtración Dos porciones del material nutritivo filtrado se transfieren en condiciones de asepsia a recipientes estériles y se incuban, uno a 30ºC y otro a 45ºC, durante 48 horas. Si se logró la esterilización no debe haber desarrollo microbiano. Bibliografia o o o o

Madigan TM et al. Brock- Biología de los Microorganismos. Prentice Hall, Madrid, 1998 Stanier RY et al. Microbiología. Reverté, Barcelona, 1984 Carpenter P, Microbiología, Interamericana, México, 1979 Umbreit W. Modern Microbiology. WH Freeman & Co, San Francisco, 1962

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TRABAJO N° 2. Aislamiento y cultivo de microorganismos Objetivo. Separar por métodos físicos los microrganismos, provenientes de un ambiente natural,

de tal manera que al multiplicarse sobre un substrato nutritivo se obtenga una población (en el caso de bacterias o levaduras) o un individuo (en el caso de un moho). Reconocer al microscopio las características generales de los microorganismos mediante preparaciones en fresco o coloraciones de extendidos del material.

Introducción Microbios uni y pluricelulares Los organismos más sencillos son aquéllos que están constituidos por una sola célula. Como las células se miden en micrómetros (µ m) estos organismos unicelulares caen dentro de la categoría general de microbios o microorganismos. La organización unicelular se observa en protozoos, algunas algas, levaduras y la mayoría de las bacterias. Un tipo más complejo de organización biológica es la de los organismos pluricelulares. Aunque surgen en general a partir de una sola célula, en estado maduro constan de varias células permanentemente unidas unas a otras de un modo característico, lo cual le confiere una forma típica al organismo. Así un moho esta compuesto por filamentos ramificados. Cada filamento se denomina hifa y al conjunto de hifas se lo llama micelio.

Aislamiento, cultivo

Dos clases de operaciones fundamentales en la microbiología clásica son el aislamiento o separación de un microorganismo determinado de las poblaciones mixtas que existen en la naturaleza, y el cultivo o crecimiento del microorganismo en medios artificiales bajo condiciones de laboratorio. Estas operaciones son básicamente iguales para el estudio de las bacterias, los hongos, las algas, los protozoos y las lineas de células vegetales o animales (cultivo de tejidos). Para el aislamiento directo se emplean medios gelificados. Cuando un inoculo mixto que contiene una cierta variedad de organismos diferentes se extiende directamente sobre la superficie de un medio gelificado, todos aquéllos que puedan crecer sobre el mismo producirán colonias. La dispersión de los microbios sobre el medio elimina gran parte de la competencia por los nutrientes y por ello algunos que crecen lentamente son capaces de multiplicarse en el mismo ambiente de los que crecen rápidamente. Como consecuencia del aislamiento aparecen luego de la incubación, poblaciones de bacterias y levaduras e individuos fúngicos sobre la placadel medio de cultivo. Se los puede mantener vivos en el laboratorio mediante transplantes a otros medios de cultivo.

Ambiente Los principales ambientes naturales de los microorganismos son el suelo y el agua. Muchos organismos se encuentran en una capa delgada de suelo de algunos decímetros de espesor. Los microrganismos de las masas de agua, por ejemplo lagos, están concentrados en la superficie y en el fondo por encima del cieno. Los microorganismos transportados por el aire son seres que accidentalmente se encuentran en este medio y provienen del suelo, agua u otros organismos vivos. Es necesario que haya ciertas condiciones en el ambiente para que sirva como reservorio de los microorganismos. El crecimiento depende del abastecimiento adecuado del agua y las substancias nutritivas, el pH conveniente, la tensión de oxigeno suficiente, la temperatura necesaria y otros factores.

Oxígeno

Muchos organismos requieren oxigeno molecular pues dependen de la respiración aerobia para cubrir sus necesidades energéticas y se los denomina aerobios obligados. Entre éstos,

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algunos crecen mejor a presiones parciales de oxigeno menores que la presente en el aire y se los conoce como microaerófilos. Hay microorganismos son anaerobios facultativos, pues pueden crecer tanto en presencia como en ausencia de aire. Comprende dos subgrupos: uno, el de las bacterias que tienen un metabolismo productor de energia exclusivamente fermentativo pero no los afecta la presencia de aire; otro, el de las levaduras o bacterias que pueden pasar del metabolismo respiratorio al fermentativo. En cambio los anaerobios estrictos sólo fermentan y son sensibles al oxigeno.

Crecimiento, colonia

En cualquier sistema biológico el crecimiento puede definirse como el aumento ordenado de todos los constituyentes químicos de un organismo. El crecimiento determina la multiplicación celular y en los organismos unicelulares motiva un aumento del número de individuos, mientras que en los multicelulares lleva al aumento del tamaño del individuo. En el aislamiento se tomó una pequeña cantidad de células microbianas y al deslizar el asa sobre el agar se las distribuyó por la superficie. Durante la incubación la célula aislada se dividió repetidamente hasta formar una masa visible llamada colonia sobre el medio de cultivo. El crecimiento de las poblaciones bacterianas está normalmente limitado por la desaparición de los nutrientes accesibles o por la acumulación de productos metabólicos tóxicos. Al describir una colonia se usan distintos vocablos para describir forma, elevación y borde de la misma como se muestra en la figura 4.

Bacterias

La mayoría son organismos unicelulares que se multiplican por escisión binaria transversal. Se distinguen varios tipos respecto a su forma y agrupación como se esquematiza en la figura 5. Algunas bacterias forman células de reposo, conocidas como endosporos, que tienen bajo contenido de agua, son muy refringentes y se tiñen con dificultad.

Los endosporos soportan el calor, la desecación y algunas substancias químicas, muchos resisten a 100º.C durante unas 20 horas, otros sólo unos minutos a 90ºC Las bacterias móviles tienen uno o varios flagelos. Para verlos con el microscopio óptico se los debe engrosar mediante un mordiente antes de la coloración. Suele obs ervarse el movimiento bacteriano cuando se coloca una gota de un cultivo en medio líquido entre cubre y portaobjetos. Los actinomicetos son un grupo de bacterias filamentosas, ramificadas, que forman un micelio delgado y en la mayoría de los casos células de multiplicación llamadas esporos.

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Coloraciones El tamaño de la mayoría de las células bacterianas es tal que resulta difícil de ver con el microscopio óptico. La principal dificultad es el poco contraste entre la célula y el medio que la rodea, y la manera más simple de aumentarlo es utilizando colorantes. Las células generalmente son tratadas de diversa manera, antes de teñirlas, para coagular el protoplasma en un proceso que se llama fijación. En el caso de las bacterias, la fijación por calor es lo más corriente, aunque también puede emplearse formaldehido, metanol o ácidos. La fijación se realiza habitualmente en células que han sido secadas sobre un portaobjetos. Luego le sigue la tinción. La mayoría de los colorantes usados son compuestos orgánicos que tienen alguna afinidad especifica con los materiales celulares. El azul de metileno es un buen colorante que actúa rápidamente sobre las bacterias y es útil para detectar bacterias en medios naturales, puesto que no tiñe la mayor parte del material extraño.

Tinción de Gram Es un método diferencial de tinción para bacterias. Luego del tratamiento con cristal violeta todas las células están coloreadas. Al agregar iodo se forma un complejo con el colorante en el interior de las mismas. Después de añadir etanol o acetona algunos organismos se decoloran (Gram-negativos) y otros no (Gram-positivos) según la estructura física de la pared, no por los constituyentes químicos pues las levaduras son gram-positivas aunque tienen una pared químicamente distinta a las de las bacterias. Para poner de manifiesto las células incoloras se utiliza una coloración de contraste, tal como safranina o fucsina básica que tiñen de rojo a las células gram-negativas mientras las grampositivas permanecen violetas.

Procedimiento Aislamiento de microorganismos del polvo ambiental La técnica depende del material a partir del cual se intenta aislar los microorganismos y de las características de estos últimos. Vertir unos 15 mL de agar nutritivo, licuado en baño da agua hirviente, en una caja de Petri e igual cantidad de agar de Sabouraud licuado en otra. Dejar gelificar y luego exponer las placas al aire dejando sedimentar el polvo ambiental durante 30 minutos. Incubar a 27—30ºC durante 48 horas la caja con agar nutritivo y a 25-27ºC por 5 días la del agar de Sabouraud. Al cabo de ese tiempo examinar las colonias microbianas presentes.

Aislamiento de bacterias esporuladas del suelo Calentar una suspensión de suelo por 10 minutos en un baño de agua a 80ºC. Flamear el asa hasta que tenga color rojo brillante y dejar que se enfríe dentro de la zona de convección del mechero. Tomar una gota de la suspensión y extenderla sobre la superficie de una placa de agar nutritivo haciendo las primeras estrías como se muestra en la figura 6. Flamear el asa y hacer la segunda serie de estrias con el asa vacia. Flamear otra vez el asa y hacer la tercera serie de estrías con el asa vacía. Incubar las cajas con la tapa hacia abajo (invertidas) a 25-30ºC durante 48 horas.

Aislamiento de rizobios de nódulos radicales de leguminosas Lavar la raíz para quitar el suelo adherido. Elegir los nodulos de mayor tamaño, separarlos y colocarlos en un tubo o frasquito. Lavarlos nuevamente, agitando con fuerza para eliminar la

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Leonor Carrillo. 2003. Microbiología Agrícola. Apéndice mayor parte de los residuos. Poner los nodulos durante 30 segundos en etanol 95% y luego sumergir en lavandina concentrada diluida al 1/10 durante 3 a 6 minutos. Lavar tres o cuatro veces, agitando enérgicamente, en sendos tubos de agua estéril. Para transferir los nodulos de un recipiente a otro usar una pinza con la punta previamente mojada en alcohol y flameada. Tomar un nodulo y colocarlo entre dos portaobjetos cuyas caras enfrentadas habían sido flameadas. Aplastarlo y tomar el material del nodulo con el asa para hacer estrías sobre la placa del medio de cultivo especifico como se muestra en la figura 6. Incubar a 25-30ºC. El medio de cultivo para rizobios contiene manitol 10 g, extracto de levadura 4 g, carbonato de calcio 3 g, fosfato dipotásico 0,5 g, sulfato de magnesio 0,2 g, cloruro de sodio 0,l g, agar 15 g, rojo Congo 25 ppm o verde brillante 125 ppm, agua 1 litro; pH 7,0. Se esteriliza a 115ºC durante 20 minutos.

Observación de las placas de aislamiento El inoculo fue diluido progresivamente en cada estría sucesiva de tal manera que, después de la incubación en la estufa, el crecimiento es confluente en los trazos iniciales y las colonias están bien aisladas a lo largo de las últimas estrías. Observar las características macromorfológicas de las colonias y registrarlas en la planilla de informes correspondiente. Tomar con un asa material de una colonia y hacer un extendido sobre un portaobjetos. Luego de secar y fijar por calor, hacer una coloración de Gram para observar las células somáticas o de Wirtz para ver los endosporos.

Tinción de Gram Poner el portaobjetos sobre un soporte y cubrirlo con una solución de violeta cristal. Luego de 1 minuto agregar solución de iodo. Después de 1 minuto, lavar con agua. Decolorar con alcohol 96°. Lavar con agua y cubrir con una solución de safranina durante 1 minuto. Lavar con agua y secar. Colocar una gota de aceite para inmersión. Llevar el portaobjetos a la platina de un microscopio. Mirar a través del objetivo de bajo aumento (10x) y una vez enfocado el objeto colocar el objetivo de inmersión en aceite (100x) moviendo el revólver. Levantar el condensador pues la intensidad de la luz debe ser mayor con los objetivos de mayor aumento. Ajustar el enfoque mediante el tornillo micrométrico. Regular la cantidad de luz por medio del diafragma. Las bacterias Gram-negativas se tiñen de rojo anaranjado y las Gram-positivas adquieren color violeta. Dibujar lo observado manteniendo la proporción respecto al campo microscópico . La solución de violeta cristal contiene 1 g de colorante disuelto en 20 mL de alcohol 96° y 80 mL de agua. La de safranina se prepara de igual manera usando 0,25 g de colorante. La solución de iodo según Lugol contiene 1 g de iodo y 2 g de ioduro de potasio en 100 mL de agua.

Coloración de endosporos Cubrir el extendido con solución de verde de malaquita. Encender un hisopo embebido en alcohol y calentar el portaobjetos por debajo del soporte. Apagar y repetir la operación luego de un minuto. Repetir el calentamiento dos veces más. Lavar con agua. Cubrir con solución de safranina durante 1 minuto. Lavar con agua y secar. Colocar una gota de aceite para inmersión. Los endosporos se verán verdes y las células somáticas de color rojo anaranjado. Dibujar lo observado. La solución de verde de malaquita contiene 2 g de colorante disuelto en 20 mL de alcohol 96° y 80 mL de agua.

Selección y transplantes de colonias Elegir colonias de bacterias y hongos en las placas anteriores y repicarlas como se muestra

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en la figura 7. Incubar los cultivos de bacterias a 30-35°C en la obscuridad, si se trata de hongos colocarlos a 25-27°C preferentemente donde reciban una iluminación diurna difusa para favorecer la esporulación.

a) cultivo de bacterias en aerobiosis

sobre medios gelificados . Flamear el asa hasta que tenga color rojo brillante. Tomar el tubo con la mano izquierda. Quitar el tapón de algodón sosteniéndolo con el dedo meñique de la mano derecha. Pasar la boca del tubo por la llama del mechero. Introducir el asa, estéril y fría, en el tubo y extraer un poco de material microbiano. Volver a flamear la boca del tubo y colocar el tapón. Tomar el tubo con medio estéril, destapar y flamear como el anterior. Introducir el asa y depositar los microorganismos rayando en zig-zag la superficie del medio gelificado, con mucha suavidad. Sacar el asa, flamear la boca del tubo y tapar. Flamear el asa. en medios líquidos . Proceder igual que en el caso anterior y depositar los organismos dentro del medio líquido.

b) cultivo de hongos

El procedimiento para sembrar levaduras es similar al empleado para bacterias. Para cultivar hongos se emplea un gancho, inserto en el mango de Kolle, que permite tomar los filamentos para transferirlos al nuevo medio. microcultivo. Colocar sobre un portaobjetos, previamente flameado y enfriado, un trozo de medio gelificado de 1 cm de lado y 2 a 3 mm de espesor, tomado de una placa estéril. Sembrar en los bordes libres del trozo de agar como se muestra en la figura 8. Colocar un cubreobjetos, también flameado y enfriado. Incubar los microcultivos en una cámara húmeda, lograda poniendo algodón mojado bajo el soporte de los portaobjetos dentro de un recipiente cerrado.

Observación de los cultivos en tubos macroscópica Después de la incubación observar los cultivos a simple vista o con ayuda de la lupa y registrar en el informe las características morfológicas (ver figura 9). Evitar la agitación del medio líquido pues si ha crecido una película superficial, esta puede caer confundiéndose con el sedimento.

microscópica

Hacer un preparado de las bacterias (ver figura 10), fijar por calor en la llama o microondas, y colorearlo según el método de Gram. Suspender los hongos en agua, líquido de Patterson o colorante de Gueguén al hacer el preparado en fresco y con ayuda de dos agujas separar los filamentos.

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El colorante de Gueguén contiene 0,1 g de azul de algodón y 0,1 g de Sudán III en 100 g de ácido láctico, además de 10 gotas de tintura de iodo. El líquido de Patterson se prepara mezclando 50 mL de solución acuosa de acetato de potasio al 2%, con 20 mL de glicerina y 30 mL de etanol 96º Observar el microcultivo con el objetivo de menor aumento, luego de enfocar un objeto adherido a la cara inferior del cubreobjetos se podrá utilizar el siguiente objetivo.

Medida del tamaño de los microorganismos El método más práctico usa un ocular autoenfocable, con una escala arbitraria dividida en cien pequeñas partes iguales, a veces numeradas, la que debe calibrarse con la escala de 1 mm con cien divisiones de diez micrómetros cada una, grabada en un portaobjetos llamado micro-métrico (ver figura 11). Enfocar al portaobjetos y mover éste de modo que su escala quede paralela a la del ocular. Observar cual número de las pequeñas divisiones de 10 µm grabadas en el portaobjetos coincide con un número entero de las contenidas en el ocular. Calcular el valor en micrómetros correspondiente a una división pequeña de la escala del ocular mediante la regla de tres simple. Calibrar la escala del ocular para cada aumento del microscopio. Tener en cuenta que las rayas del ocular siempre tendrán el mismo espesor mientras que las del portaobjetos irán engrosándose al cambiar los objetivos.

Bibliografia o o o

Hall GS et al. Methods for the Examination of Organismal Diversity in Soils and Sediments. CAB International, Wallingford, 1996 Seeley HW & Van Demarck PJ. Microbios en Acción. Blume, Madrid, 1973 Umbreit W. Modern Microbiology. WH Freeman & Co, San Francisco, 1962

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TRABAJO Nº 3. Fijación simbiótica de N 2 en leguminosas Objetivo. Observar las características macro y micromorfológicas de los nódulos radicales de

leguminosas. Comprobar la capacidad de nodular de la cepa de rizobio aislada.

Introducción Fijación simbiótica del nitrógeno molecular

Una de las simbiosis más importantes es la que se da entre leguminosas y bacterias de los géneros Rhizobium y Bradyrhizobium. Figura 12 La infección de las raíces con una cepa adecuada de la bacteria (hay especificidad de huésped) conduce a la formación de nódulos radicales que tienen distinta forma según la planta hospedadora (figura 12). Los rizobios específicos entran en la raíz por el extremo de los pelos absorbentes que se retuercen en forma de báculo. Se forma en el pelo uno o varios tubos de infección dentro de los cuales los rizobios se hallan dispuestos en fila. El tubo de infección penetra en las células del córtex de la raíz. Algunas células de la raíz se dividen activamente produciendo un meristema. Los rizobios contenidos en el tubo de infección son liberados en el citoplasma de estas células meristemáticas donde adquieren una forma distinta al rizobio de vida libre y se los llama bacteroides. éstos son capaces de fijar el nitrógeno molecular. En los nódulos la presión parcial de oxígeno es muy baja, si se eleva la enzima nitrogenasa quedaría inhibida y no se produciría la fijación. Sin embargo el nódulo consume oxigeno provisto por la leghemoglobina, una molécula transportadora de O2 que contiene grupo hemo y da a los nódulos color rojizo.

Nodulación de leguminosas Nódulos efectivos

o o o o o

pocos y situados sobretodo en la raíz primaria voluminosos, con superficie lisa o rugosa actividad meristematica y nodular prolongada infección generalizada, zona bacteriana grande con muchos bacteroides interior pigmentado de rojo por la leghemoglobina.

Nodulos inefectivos

o o o o o

numerosos y repartidos en todo el sistema radicular pequeños con superficie lisa actividad meristematica y nodular corta pocas células infectadas, pocos o sin bacteroides y granulos de almidón interior no coloreado de rojo.

Inoculante para leguminosas La búsqueda y selección de buenas cepas de rizobios puede resultar inútil si las leguminosas nodulan eficientemente con las cepas nativas, situación frecuente en especies tropicales. Pero, en muchos suelos el nivel y la eficiencia de las cepas nativas pueden no ser los adecuados y la nodulación y la fijación de nitrógeno resultan insuficientes para satisfacer las demandas del cultivo. La inoculación artificial resulta imprescindible cuando se introducen nuevas leguminosas, sobre todo si son hospedadores de alta especificidad o cuando la deficiencia en nitrógeno limita

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Leonor Carrillo. 2003. Microbiología Agrícola. Apéndice el desarrollo vegetal. El método y las condiciones de inoculación deben permitir la supervivencia de los rizobios, además la semilla inoculada debe poseer la especie de rizobio adecuada y en número suficiente. Las condiciones del suelo próximo a la semilla deben favorecer la colonización de la rizósfera por la bacteria para lograr la formación de los nodulos y su funcionamiento efectivo. Para determinar la necesidad de inoculación se suele emplear un ensayo Figura 13 simple de tres tratamientos: - la inoculación con una cepa de rizobio conocida para saber si es efectiva en el hospedador, - la fertilización para asegurar un buen desarrollo del hospedador si no hay inhibidores en el suelo, Ensayo - el control no inoculado para observar la presencia o ausencia de rizobios nativos Testigo y su efectividad. Las cepas usadas en los inoculantes deben ser cuidadosamente seleccionadas y mantenidas, y probarse anualmente para minimizar la posibilidad de cambio en las propiedades simbióticas. La eficencia de la fijación se evalúa por el número de nódulos, la masa nodular, el peso seco de la planta y el contenido de nitrógeno de la parte aérea. Son bacterias eficaces las que, por intermedio de los nódulos radicales, aportan nitrógeno reducido a la planta hospedadora produciendo un aumento de peso de la misma.

Procedimiento Examen de los nódulos y bacteroides

Tomar un nódulo de la raíz de una leguminosa, medirlo y dibujar su forma. Cortarlo y observar el color. Si la fijación de nitrógeno era efectiva se lo verá rosado o rojo, a veces pardo. Aplastarlo entre dos portaobjetos. Extender el material interno mezclado con una gota de agua, haciendo movimientos circulares con el asa. Secar cerca de una llama. Fijar pasando tres veces el portaobjetos por dentro de la llama. Colocar el portaobjetos sobre un soporte colocado en una bandeja o la pileta. Cubrirlo la solución colorante (fucsina básica 0,3 g, etanol 96º 10 mL, fenol 5 g, agua destilada 90 mL). Luego de un minuto lavar con agua. Secar cerca de una llama. Depositar una gota de aceite de inmersión, apoyar un cubreobjetos y sobre éste poner otra gota de ese aceite. Observar al microscopio los bacteroides coloreados y dibujarlos tratando de mantener la proporción respecto al campo microscópico. Anotar el aumento.

Germinación de semillas de leguminosas Colocar las semillas necesarias, de buen poder germinativo, en un matraz de Erlemeyer con etanol al 70% v/v y agitar durante 3 a 5 minutos. Volcar y añadir agua lavandina al 10% v/v, agitando por igual tiempo. Lavar varias veces con agua destilada estéril. Depositarlas sobre agar-agua estéril y dejar germinar.

Preparación del inoculante Sembrar en matraces con 50 mL de medio de cultivo con la cepa aislada de nódulos durante el desarrollo del trabajo nº2. El medio de cultivo contiene: fosfato monopotásico 0,5 g, fosfato

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dipotásico 0,5 g, cloruro de sodio 0,1 g, nitrato de potasio 0,8 g, sulfato de magnesio 0,2 g, extracto de levadura 4 g, fosfato diamónico 0,3 g, glicerol 10 g, agua 1 L, pH 6,8. Esterilizar a 121ºC durante 15 minutos.

Inoculación de leguminosas

Escoger de las placas de germinación las dieciseis plántulas de mejor aspecto y trasladarlas al medio mineral inclinado en tubos grandes. Dejar en lugar iluminado y ventilado. Uno o dos días después verter 1 mL del cultivo homogeneizado de rizobio sobre la radícula de ocho plántulas cultivadas. El medio mineral contiene: fosfato dipotásico 0,5 g, sulfato de magnesio 0,2 g, cloruro de sodio 0,1 g, cloruro férrico 0,01 g, fosfato tricálcico 2 g, agua 1 L, agar 15 g, pH 7. Esterilizar a 110ºC durante 20 minutos.

Control de las leguminosas inoculadas Medir la longitud de las plantas inoculadas y las testigo. Observar y registrar la ubicación, tamaño y forma de los nódulos. Controlar la humedad del substrato. Bibliografía o o

o

Balatti AP & Jardim Freire JR. Legume Inoculants. Selection and Characterization of Strains. Production, Use and Management. Kingraf, La Plata, 1996 Frioni L. Ecología Microbiana del Suelo. Universidad de la República, Montevideo, 1990 Umbreit W. Modern Microbiology. WH Freeman & Co, San Francisco, 1962

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TRABAJO Nº 4. Microorganismos del suelo Objetivo. Demostrar la biodiversidad de los grupos fisiológicos de microorganismos del suelo

mediante cultivos selectivos que provean las condiciones ambientales y disponibilidad de nutrientes adecuadas.

Introducción Los microoganismos juegan un papel significativo en la mayoría de los procesos naturales que afectan al ambiente. Un ejemplo es la fijación del nitrógeno molecular por los organismos de vida libre y los simbióticos, otro es el reciclado de materiales orgánicos. La materia orgánica que llega al suelo a través de residuos de cosechas, la caída del follaje, las raíces y sus productos de descamación y exudación, los restos animales y microbianos sufren una serie de procesos de degradación que asegura la continuidad de los ciclos biogeoquímicos. Empleando medios selectivos se puede lograr cultivos enriquecidos en microorganismos con una característica fisiológica determinada, por ejemplo si carece de una fuente de nitrógeno soluble sólo crecerán las bacterias capaces de reducir el nitrógeno gaseoso disuelto, procedente de la atmósfera.

Amonificación

El nitrógeno orgánico de los productos de hidrólisis de proteínas y polinucleótidos, se convierte en amoníaco por el proceso de desaminación. La urea se hidroliza rápidamente a amoníaco y dióxido de carbono por la enzima ureasa producida por muchos microorganismos. La evolución de la microbiota varía según la materia nitrogenada transformada. En general, primero aparecen bacilos, esporulados o no, y cocos. Después se observan actinomicetos y más tarde mohos. La demostración de la amonificación se basa en investigar amoníaco mediante el reactivo de Nessler en el medio acuoso con aminoácidos (peptona, etc). La solución de yodo-mercuriato potásico alcalinizada origina desde un color amarillo hasta un precipitado rojo ladrillo según la cantidad de amoniaco presente. El amoniaco formado puede ser asimilado directamente por otros microrganismos o ser convertido en nitrato por las bacterias específicas. Si se añade a un suelo materiales tales como estiércol, aumenta en consecuencia la velocidad de nitrificación.

Nitrificación El nitrógeno tiene tres formas estables de oxidación en la naturaleza (nitrógeno molecular, amoníaco, nitrato) cuya interconversión está dada casi exclusivamente por bacterias. Algunos organismos pueden usar directamente amonio para sintetizar sus aminoácidos y otras moléculas nitrogenadas de la célula, pero otros, incluyendo las plantas, prefieren nitrato. La oxidación del amonio a nitrato se denomina nitrificación y unas bacterias autótrofas aerobias las llevan a cabo en dos etapas: 1) oxidación del amonio por Nitrosomonas, Nitrosococcus 2) oxidación del nitrito por Nitrobacter, Nitrococcus Tanto la formación de nitrito como la de nitrato por los microorganismos quimioautótrofos constituyen procesos metabólicos aeróbicos generadores de energía. Ocurre rápidamente en suelos bien drenados a pH neutro. Aunque el nitrato es fácilmente asimilado por las plantas, como es muy soluble en agua resulta rápidamente lavado de los suelos que reciben una gran cantidad de lluvia. Por el contrario, el amonio queda fuertemente adsorbido a las arcillas.

Desnitrificación Es el proceso en el cual algunos organismos que pueden usar el nitrato como aceptor final de electrones durante la respiración anaeróbica producen moléculas reducidas gaseosas (óxido de dinitrógeno, nitrógeno molecular) que desaparecen del ecosistema. Existen otros

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microorganismos que pueden reducir nitrato hasta amonio, manteniendo el nitrógeno en el ecosistema (reducción asimilatoria del nitrato). Si un suelo queda anegado se producen condiciones anaeróbicas y ocurre la desnitrificación, principalmente si es rico en materia orgánica. También sucede cuando se originan puntos de anaerobiosis por otras causas. Como los productos de la desnitrificación son gaseosos se escapan del suelo disminuyendo el contenido en nitrógeno del mismo. En el laboratorio tales gases quedan atrapados en la campanita del medio de cultivo.

Fijación de nitrógeno molecular

La utilización de este como fuente de nitrógeno es una propiedad que poseen ciertas bacterias y cianobacterías. A continuación se da una lista abreviada de organismos fijadores de nitrógeno de vida libre. Algunos géneros de bacterias con especies fijadoras de nitrógeno Aerobios Anaerobios Heterotróficos Fotosintetizadores Heterotróficos Fotosintetizadores Azotobacter cianobacterias Clostridium Chromatium Klebsiella Chlorobium Beijerinckia Rhodospirillum Bacillus Heliobacterium Azomonas Azospirillum (microaerófilo) El nitrógeno es reducido a amonio en el proceso de fijación catalizado por el complejo nitrogenasa, uno de cuyos componentes proteínicos contiene molibdeno, los otros hierro. La enzima es inactivada por el oxígeno. El nitrógeno molecular es muy inerte y su reducción requiere mucha energía. Azotobacter crece en un medio liquido sin agitación, en forma de una película superficial. Es bastante sensible a la acidez pues no suele crecer por debajo de pH 6. Al microscopio se observan bacilos gram-negativos, grandes, de 4 a 6 µm de largo, acompañados de células de mayor tamaño con paredes gruesas y apariencia de levadura, conocidas como cistos. Esta bacteria tiene una gran capacidad respiratoria, medida como velocidad de consumo de oxigeno, para proveer la energía requerida por la fijación. Los clostridios fijadores no sólo son incapaces de crecer en presencia de aire sino que generalmente son muertos por el oxígeno, a menos que se encuentren en forma de endosporos, pero pueden crecer por debajo de la película de Azotobacter, generando burbujas de gas por la fermentación de azúcares.

Sulfo-oxidación El sulfuro de hidrógeno, el azufre elemental y el ion sulfato son tres formas estables importantes del azufre. El sulfuro de hidrógeno es tóxico para la mayoría de los organismos y los sulfuros son oxidados a sulfato por bacterias aerobias del género Thiobacillus y azufre elemental por bacterias fotosintetizadoras anaerobias de ambientes acuáticos, el que se acumula en la célula, sufriendo una posterior oxidación en algunos casos. La mayoría de los microorganismos oxidantes del azufre son autótrofos obligados.

Sulfato-reducción El sulfato y otros compuestos oxigenados del azufre, pueden ser reducidos a sulfuro de hidrógeno por bacterias heterotróficas anaerobias. Esta actividad microbiana es muy evidente en los barros del fondo de estanques y lagos. Suelen usar hexosas, alcoholes o ácidos orgánicos como fuente de carbono, pero algunas especies crecen autotróficamente con hidrógeno molecular y tiosulfato, por ej. Desulfovibrio.

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Celulolisis, amilolisis El almidón y la celulosa están compuestos por unidades de glucosa, pero conectadas de diferente manera: uniones 1,4 α- y 1,4 β-glucosidicas respectivamente, lo que afecta a sus propiedades. La celulosa es insoluble y se digiere a mucho menor velocidad que el almidón soluble. La celulosa forma largas fibrillas a las que se encuentran intimamente asociados los microorganismos que la degradan. Muchos hongos son celulolíticos, pero entre las bacterias esta propiedad está restringida a unos pocos grupos: mixobacterias, clostridios y actinomicetos. El almidón, en cambio, es hidrolizado por muchos hongos y bacterias. Las bacterias celulolíticas predominan en la zona radicular y su densidad decrece en muestras tomadas a cierta distancia de la planta. Por otra parte, es el proceso fundamental que ocurre durante el compostaje de residuos agrícolas, donde predominan los microorganismos termófilos.

Solubilización de fosfatos

Algunos mohos comunes, por ej. Penicillium, Aspergillus, Fusarium, pueden solubilizar fosfatos insolubles como polvo de huesos y apatita. Aproximadamente un décimo de las bacterias del suelo también los solubilizan. La solubilización de fosfato de calcio se aprecia como zonas claras que rodean las colonias y generalmente se produce cuando los microorganismos forman ácidos orgánicos tales como ácido 2-ceto-glucónico (bacterias), ác. citrico u oxálico (hongos), pero éstos son rápidamente degradados por otros organismos del suelo. Los fosfatos de hierro y aluminio pueden ser solubilizados por los microorganismos productores de sulfuro de hidrógeno.

Procedimiento Fijación de nitrógeno molecular El medio contiene: manitol 10 g, carbonato de calcio 0,5 g, solución salina 50 mL, solución de oíigoelementos 1 mL, agua 1 L. Se distribuye en matraces de Erlenmeyer de 250 mL de capacidad, a razón de 50 mL en cada uno y se esteriliza a 110ºC durante 20 minutos. Sembrar unos granulos de suelo e incubar a 25-27°C durante 7 días. La solución salina contiene: fosfato dipotásico 5 g, sulfato de magnesio heptahidrato 2,5 g, cloruro de sodio 2,5 g, sulfato ferroso heptahidrato 0,05 g, agua 1 L, pH 7 - 7,5. La solución de oíigoelementos contiene 0,05 g/L de las sales siguientes: molibdato de potasio, borato de sodio, nitrato de cobalto, sulfato de cadmio, sulfato de cobre, sulfato de zinc, sulfato de manganeso, cloruro férrico. Hacia el tercer día el medio se enturbia ligeramente y en la superfiie aparece un velo grisáceo. Los días siguientes el velo se pliega, dando una superficie rugosa y mamelonada que se vuelve parduzca. Finalmente caen trozos de velo dentro del liquido. A su vez el liquido se enturbia cada vez más y suelen aparecer burbujas en el fondo. La observación microscópica del velo muestra células bacilares, ovales, cocoides y a veces cistos esféricos, mientras que el material tomado del fondo permite ver bacilos esporulados Gram-positivo o variable. Medio para Azotobacter: sacarosa 20 g, fosfato dipotásico 0,05 g, fosfato monopotásico 0,15 g, cloruro de calcio 0,01 g, sulfato de magnesio heptahidrato 0,2 g, molibdato de sodio 0,002 g, cloruro férrico 0,01 g, azul de bromotimol (al 0,5% p/v en etanol) 2 mL, carbonato de calcio 1 g, agua 1 L, pH 6,8. Esterilizar a 110ºC durante 20 minutos. Medio para Derxia: Reemplazar la sacarosa por almidón o glucosa y omitir el carbonato de calcio. Medio para Azospirillum: ácido málico 5 g, fosfato dipotásico 0,5 g, sulfato de magnesio heptahidrato 0,2 g, cloruro de sodio 0,1 g, cloruro de calcio 0,02 g, molibdato de sodio 0,002 g, sulfato de manganeso 0,01 g, etilén -diamino-tetra-acetato férrico (al 1,64% p/v) 4 mL, azul de bromotimol (al 0,5% p/v en etanol) 3 mL, biotina 0,1 mg, agua 1 L, p H 6,8. Medio para Clostridium pasteurianum : glucosa 10 g, fosfato monopotásico 0,75 g, solución

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salina 50 mL, solución de oligoelementos 1 mL, agua 1 L. Distribuir en tubos con campanita de Durham. Luego de sembrar cubrir con agar al 1,5% fundido o vaselina estéril.

Desnitrificación El medio de cultivo contiene: nitrato de potasio 2 g, carbonato de calcio 5 g, glucosa 10 g, solución salina 50 mL, solución de oligoelementos 1 mL, agua 1 L. Los tubos llevan dentro una campanita de vidrio y se esterilizan a 110ºC durante 20 minutos. Inocular unos gránulos de suelo sin agitar e incubar una semana a 25-27ºC. Si se ha reducido el nitrato hasta el estado de nitrógeno molecular u óxido de nitrógeno quedarán retenidos en la campanita inmersa en el tubo. La formación de nitritos se comprueba agregando 1 mL del reactivo de Griess al tubo de cultivo. Aparecerá un color rosado si hay nitritos. Preparar el reactivo de Griess en el momento de usarlo, mezclando partes iguales de las soluciones siguientes: o Disolver 0,05 g de naftilamina en 100 mL de ácido acético al 30% (v/v) en agua. o Disolver 0,32 g de ácido sulfanilico en 100 mL de ácido acético al 30% (v/v) en agua.

Nitrificación El medio de cultivo para formadores de nitritos contiene: sulfato de amonio 0,5 g, carbonato de calcio 1 g, solución salina 50 mL, agua 1 L. Se distribuye en matraces de Erlenmeyer de 250 mL de capacidad, a razón de 50 mL en cada uno. El medio para productores de nitratos contiene 1 g de nitrito de sodio en lugar del sulfato de amonio. Esterilizar a 110ºC durante 20 minutos. Sembrar unos gránulos de suelo en ambos matraces e incubar a 25-27ºC durante dos semanas. Formadores de nitritos. Volcar 5 mL del cultivo en un tubo de ensayo y agregar 1 mL del reactivo de Griess recien preparado. Aparecerá un color rosado si se han formado nitritos por acción microbiana. Formadores de nitratos. Transferir unos 5 mL del cultivo a un tubo de ensayo y agregar 1 mL del reactivo de Griess. Si esta reacción da negativa los microorganismos han oxidado los nitritos a nitratos. Colocar otros 5 mL de cultivo en un tubo, agregar unos 50 mg de urea y 10 gotas de acido sulfúrico. Calentar para eliminar los nitritos. Luego añadir 1 mL de reactivo difenilamina por las paredes del tubo. Si en la zona de contacto aparece un color azul hay nitratos formados por acción microbiana. El reactivo difenilamina contiene: difenilamina 1 g, agua destilada 20 mL, ácido sulfúrico 100 mL. Colocar en frasco obscuro.

Amonificación El medio de cultivo contiene peptona 0,2 g, solución salina 50 mL, solución de oligoelementos 1 mL, agua 1 L. Se distribuye en tubos y se esteriliza a 110ºC durante 20 minutos. Sembrar unos gránulos de suelo e incubar una semana a 25-27ºC. Después agregar 1 mL de reactivo de Nessler a cada tubo a ensayar. La aparición de un color ladrillo indica la presencia de amoniaco. El reactivo de Nessler consta de dos soluciones que se mezclan en partes iguales en el momento de usar. o Colocar en un mortero 5 g de ioduro mercúrico y 3,65 g de ioduro de potasio, añadir un poco de agua destilada y triturar hasta disolver. Completar a 100 mL con agua. o Disolver 15 g de hidroxido de potasio en lentejas en 100 mL de agua destilada.

Celulolisis El medio de cultivo contiene: nitrato de amonio 1 g, solución salina 50 mL, solución de oligoelementos 1 mL, agua 1 L. Se distribuye en tubos con tiras de papel de 1 x 10 cm y esteriliza a 110ºC durante 20 minutos. Sembrar unas gotas de una suspensión de suelo, que haya sido abonado con estiércol, e incubar dos a tres semanas a 25-27C.

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Donde el papel sobresale del líquido se acumulan las bacterias celulolíticas aerobias y suelen colorearlo. Sacar la tira de papel y colocarla en un portaobjetos para observar el ataque de las fibras bajo la lupa. Comp robar si se disgrega con facilidad al tocarla con el asa. Medio para clostridios : sulfato de amonio 0,5 g, cloruro de sodio 0,1 g, fosfato dipotásico 0,7 g, sulfato de magnesio heptahidrato 0,05 g, cloruro de calcio 0,05 g, celulosa en polvo 3 g, carboximetilcelulosa 1 g, extracto de levadura 1 g, azul de metileno (0,005% p/v) 1 mL, agar 15 g, agua 1 L, pH 7,0; esterilizar a 121ºC durante 15 minutos. Agregar 0,5 mL de clorhidrato de cisteína (al 1% p/v) a cada tubo con 10 mL de medio estéril fundido, sembrar de inmediato con unas gotas de la suspensión de suelo y colocar en agua fría para una rápida gelificación.

Amilolisis El medio de cultivo contiene: almidón soluble 2 g, nitrato de amonio 1 g, solución salina 50 mL, solución de oligoelementos 1 mL, agar 15 g, agua 1 L. Esterilizar a 110ºC durante 20 minutos. Distribuir en cajas de Petri. Sembrar con unos gránulos de suelo e incubar a 25-27ºC. Cubrir la superficie con solución acuosa de yodo, por ejemplo la de Lugol. La zona de hidrólisis alrededor del crecimiento microbiano aparece clara sobre un fondo azul.

Sulfato-reducción El medio de cultivo contiene: cloruro de amonio 1 g, fosfato dipotásico 0,5 g, sulfato de magnesio heptahidrato 2 g, sulfato de sodio 0,5 g, cloruro de calcio 0,1 g, lactato de sodio (al 60% p/v) 6 mL, extracto de levadura 1 g, tioglicolato de sodio 1 g, agua 1 L. Repartir en tubos colocando 10 mL en cada uno. Esterilizar a 110ºC durante 20 minutos. Sembrar con unos gránulos de suelo e introducir un clavo previamente pasado por la llama y enfriado. Cubrir con agar al 1,5% fundido o vaselina. Incubar dos o tres semanas a 25-27ºC. Ver si el clavo se ha ennegrecido por la formación de sulfuro de hierro debido a los microorganismos.

Sulfo-oxidación

El medio de cultivo contiene: fosfato dipotásico 0,25 g, cloruro de magnesio 0,1 g, cloruro de sodio 0, 1 g, nitrato de amonio 2 g, carbonato de calcio 5 g, agua destilada 1 L. Repartir en tubos a razón de 5 mL en cada uno y esterilizar 20 minutos a 110ºC. Agregar a cada tubo 1 mL de una solución a 10% de monosulfuro de sodio y sembrar unos gránulos de suelo. Incubar a 25-27ºC durante dos a tres semanas. Volcar 2 mL del cultivo en otro tubo, acidificar con dos gotas de ácido clorhídrico concentrado y añadir 5 gotas de solución acuosa de cloruro de bario al 5%. p/v. La aparición de una opalescencia indica que se han formado sulfatos por la actividad microbiana.

Solubilización de fosfatos

El medio de cultivo contiene: extracto de levadura 2 g, glucosa 20 g, agar 15 g, agua 1 L, fosfato tricálcico 2 g. Se esteriliza a 110ºC durante 20 minutos y se distribuye en caja de Petri. Sembrar unos gránulos e incubar a 25-27ºC. Observar la formación de una zona transparente alrededor de las colonias. Bibliografía o o o

Fenchel T et al. Bacterial Biogeochemistry: The Ecophysiology of Mineral Cycling. Academic Press, San Diego, 1998. Alef K & Nannipieri P. Methods in Applied Soil Microbiology and Biochemistry. Academic Press, London, 1995. Frioni L. Ecología Microbiana del Suelo. Universidad de la República, Montevideo, 1990.

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TRABAJO Nº 5. Inhibidores y desinfectantes Objetivo. Determinar la concentración inhibitoria mínima y la concentración letal mínima de

productos comerciales usados en el campo.

Introducción Los agentes que producen efectos reversibles causan inhibición sin Figura 14 acción mortal inmediata. Los bacteriostáticos actúan sobre las bacterias y los fungistáticos sobre los hongos. Los compuestos de acción irreversible causan la muerte rápida. Los bactericidas y fungicidas matan bacterias y hongos, respectivamente (figura 14). La diferencia es cuantitativa más que cualitativa. La adición de 0,3% de fenol impide el crecimiento de Escherichia coli, pero no mata las células en varias horas mientras que 1% las elimina en minutos (figura 15). La palabra desinfección se empleó para expresar la Figura 15 eliminación de cualquier agente que pudiera causar infección o enfermedad. Los desinfectantes son agentes de esterilización. Las células activas jóvenes tienen una notable sensibilidad a estas substancias. La desinfección es más rápida al aumentar la temperatura del sistema. El medio en que se encuentran los microrganismos puede alterar la eficacia de la desinfección, por combinación del material orgánico con el agente activo. También el pH modifica los mecanismos de desinfección. Los endosporos bacterianos son más difíciles de destruir que las células vegetativas. También presentan cierta resistencia los organismos encapsulados. Otro factor que posibilita la desinfección es un contacto eficaz. La humedad es esencial y los agentes tensoactivos mejoran dicho contacto. Las pruebas de la concentración inhibitoria mínima (CIM) y la concentración letal mínima (CLM) son útiles para comparar la eficacia de diversos productos químicos contra un organismo determinado, o la sensibilidad de diferentes organismos a un mismo producto. Los microorganismos comúnmente usados son cepas de colección de Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Clostridium perfringens, Staphylococcus aureus, para establecer la acción frente a organismos coliformes, seudomónadas, clostridios y otros aerobios, respectivamente. El tamaño del inóculo suele ser de 104 a 10 6 /mL, según el microorganismo y la substancia estudiada.

Procedimiento Concentración inhibitoria mínima Preparar una solución al 1/10 p/v ó v/v del compuesto en agua destilada estéril. Si se trata de un curasemillas con un principio activo poco soluble, usar alcohol o acetona al 1/2 v/v en esta primera dilución. Poner 1 mL de la solución 1/10 en cada uno de los 9 tubos de ensayo estériles. Añadir al primer tubo 1 mL de agua destilada estéril, al segundo 2 mL, al tercero 3 mL y así sucesivamente hasta agregar al noveno 9 mL, obteniendo diluciones que van desde 1/20 a 1/100. Transferir 1 mL de la dilución original al 1/10, y 1 mL de cada una de las otras diluciones a sendos tubos con 9 mL de caldo nutritivo (en el caso del desinfectante) o agua estéril (en caso del curasemillas), comenzando por la más diluida.. Las diluciones obtenidas van de 1/100 a 1/1000.

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Bacterias

Añadir 0,1 a 0,2 mL de un cultivo de 24 hs en caldo, de Staphylococcus aureus o Escherichia coli, a un tubo con 9 mL de caldo nutritivo de tal manera que se obtenga un suspensión de turbiedad poco apreciable a simple vista. Luego transferir 0,2 mL de esta suspensión bacteriana a cada uno de los tubos con diluciones de desinfectante en caldo. Incubar a 35°C durante 48 hs.

Hongos

Agregar agua estéril (con 0,05% v/v de Tween 80) al tubo de cultivo de 5 días a 25°C en medio de Czapek o Sabouraud, de Penicillium expansum, Aspergillus flavus o Cladosporium cladosporioides, agitando para suspender los esporos. Añadir 0,5 a 1 mL de la suspensión de esporos a un matraz con 50 mL de agar de Sabouraud, fundido y enfriado a 45-50°C. Mezclar y volcar en cuatro cajas de Petri estériles. Una vez gelificado, se depositan discos de papel de filtro de 4 mm de diámetro previamente humedecidos con las diluciones del producto, a razón de tres discos por placa. Se incuba a 2528°C durante 5 días.

Concentración letal mínima Preparar, como se indicó arriba, una serie de tubos con 10 mL de cada una de las diluciones del compuesto, que van desde 1/100 a 1/1000, utilizando agua estéril en lugar de caldo. Adicionar a cada dilución 0,2 mL de una suspensión bacteriana preparada como se describió arriba. Anotar la hora a la cual se agregó al primer tubo, y a intervalos de 2, 5, 10 y 15 minutos cargar un asa (con un diámetro interno de 4 mm) de cada dilución y llevar a un tubo de caldo nutritivo que contiene 0,1 % p/v de ácido tioglicólico para neutralizar la acción del desinfectante remanente. Incubar a 35°C durante 48 hs. Bibliografía o o

Collins CH, Lyne PM, Grange JM. Collins and Lyne’s Microbiological Methods. 7º ed. Butterworth Heinemann, Oxford, 1999 Umbreit W. Modern Microbiology. WH Freeman & Co, San Francisco, 1962

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TRABAJO Nº 6. Digestión anaeróbica de residuos agrícolas Objetivo. Transformar los residuos agrícolas en biogas y un lodo útil como fertilizante.

Introducción Se emplea estiércol, paja y lodo procedente de otro digestor. El gas formado en la fermentación metanica es una mezcla de metano y dióxido de carbono. Las denominadas bacterias metánicas implicadas pertenecen a los géneros Methanococcus, Methanobacterium, Methanosarcina y otros. Dependiendo de la composición del material de partida, se puede producir biogas con alrededor de 70%. de metano. Estas bacterias son anaerobias estrictas y reducen al dióxido de carbono. Las bacterias metánicas se diferencian de las demás debido a su peculiar estructura de la pared y la membrana celular, y forman parte de las arqueobacterias junto a las termófilas y las halófilas. Se encuentran en el rumen, los sedimentos de aguas estancadas y en los digestores de las depuradoras de aguas residuales. Las metanobacterias sólo podrán desarrollarse cuando por acción de las bacterias facultativas se haya consumido todo el oxígeno, y las fermentadoras hayan producido suficiente dióxido de carbono e hidrógeno a partir de almidón, celulosa o aminoácidos. Las bacterias metánicas son sensibles al descenso del pH producido por los ácidos orgánicos formados por los clostridios. Pero en un sistema en equilibrio consumen los ácidos a medida que aparecen manteniendo un ambiente neutro. Las instalaciones pequeñas de biogás permiten la obtención de energía en zonas rurales.

Procedimiento Figura 16

Equipo de digestión: 1 fermentador, 2 mecanismo de agitación con varilla, 3 material a fermentar, 4 baño de agua, 5 acuario, 6 calentador conectado a una bomba de circulación, 7 termómetro y termostato, 8 depósito de gas (neumático de bicicleta), 9 frasco lavador (indicador de gas y lavado de CO2), 10 frasco lavador abierto (para equilibrar la presión), 11 llave de triple vía, 12 tubo de vidrio con virutas de hierro (arrestallamas), 13 mechero.

Colocar en un frasco de 1 L, unos 200 g de estiércol fresco de vaca, 25 g de paja cortada en trozos pequeños y agua hasta unos 5 cm de la boca. Poner un tapón atravesado por un agitador y un tubo para la salida de los gases. Instalar el fermentador en un baño de agua a 37ºC. Unir la salida a un frasco lavador y éste a otro frasco abierto para equilibrar la presión, y a una llave de triple via que está conectada al

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depósito de gas y al mechero. Entre el mechero y la llave de triple via se coloca un tubo de vidrio lleno con virutas de hierro para evitar el retroceso de la llama. Controlar la hermeticidad de todos los cierres. Agitar diariamente la mezcla en descomposición. Luego de uno o dos días vaciar la cámara para eliminar la mezcla explosiva de biogás y aire. Dejar hasta que se llene nuevamente el depósito y comprobar cómo arde el biogás a la salida del mechero. Controlar diariamente el nivel de agua del baño, la temperatura y la cantidad de gas. Bibliografía o o

Madigan TM et al. Brock- Biología de los Microorganismos. Prentice Hall, Madrid, 1998 Jagnow G, Dawid W. Biotecnología. Acribia, Zaragoza, 1991

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TRABAJO Nº 7. Morfología microscópica de hongos Objetivo. Conocer las estructuras microscópicas de mohos, levaduras y setas.

Introducción Micelio es el cuerpo filamentoso de un hongo y un trozo del mismo se denomina hifa. Las hifas pueden presentar septos y entonces el micelio está tabicado. Si los tabiques están ausentes es un micelio contínuo. Rizoides son las hifas de succión que penetran en el substrato. Apresorios son unas hifas achatadas de sostén que se adhieren al hospedador o substrato. Cuando el cuerpo del hongo es una sola célula se lo llama levadura. Los cortos filamentos formados por las células brotantes de la levadura se conocen como pseudomicelio. Plecténquima es un conjunto de hifas que se asemeja a un tejido. Esclerocio es un plecténquima generalmente macroscópico que puede permanecer largo tiempo con vida latente. Clamidospora es una célula de resistencia, terminal o intehifal, con pared gruesa y substancias de reserva. Las esporas son los elementos de multiplicación de los hongos. De acuerdo a su forma y origen reciben distinto nombre como se observa en la figura 17 . Anamorfo es el hongo con reproducción asexuada o mitospórica. Los conidios son mitosporas que se hallan sésiles o sobre un conidióforo (simple o ramificado), o dentro del plecténquima de un picnidio. Un esporangio contiene numerosos mitosporas dentro de una membrana peridial simple. Teleomorfo es el hongo con reproducción sexuada o meiospórica. Las ascosporas son meiosporas que se encuentran dentro de los ascos libres de las levaduras, o los ascos encerrados en el plecténquima de un ascoma o sobre el mismo. Las basidiosporas surgen de los esterigmas del basidio donde ocurrió la meiosis. Los basidios generalmente se encuentran sobre laminillas, tubos o espinas del basidioma. Las figuras 17 y 18a muestran Figura 17 esquemas de diversas estructuras fúngicas. Los conidióforos simples son cortos filamentos que generalmente nacen perpendiculares a la hifa y originan en su extremo el o los conidios. Los ramificados suelen terminar en ramas con forma de botellón (fiálides) de donde surgen los conidios. Algunas estructuras son típicas de géneros comunes y llevan su nombre: cabeza aspergilar, penicilio. También los conidióforos simples o ramificados suelen estar reunidos en: coremio (como un fósforo), esporodoquio (como una almohadilla), picnidio (dentro de un plecténquima con forma de pera). Un esporangio contiene innumerables esporas, pero un esporangiolo sólo contiene tres o cuatro y se encuentra en el ápice de una rama lateral del esporangióforo. La columela es la punta dilatada del esporangióforo y está dentro de la esfera del esporangio. En algunos casos, unas pocas esporas están reunidas en merosporangios (bolsitas como dedos de guante) que se asientan sobre la columela. Los ascomas tienen distinta forma: cleistotecio (cerrado) que se rompe al madurar las esporas, peritecio (forma de pera) con abertura u ostíolo por donde salen las esporas maduras, apotecio (forma de copa) con los ascos expuestos.

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Los basidiomas más conocidos son: el champiñón con laminillas en la parte inferior del sombrero donde se originan las esporas, el boleto con poros en vez de laminillas, la bola de nieve que al romperse libera las esporas maduras (figura 18b). Hay otras formas como el basidioma excéntrico de los pleurotos, los estantes rígidos que crecen sobre troncos, las formas gelatinosas.

Figura 18a

Procedimiento Microcultivos Observar los microcultivos con el objetivo 4x y una vez enfocada una estructura próxima al cubreobjetos o adherida al mismo, pasar al objetivo 10x. Luego para ver detalles se puede pasar al objetivo seco de mayor aumento, si la distancia focal de la lente lo permite.

Preparaciones Hacer preparaciones en fresco colocando un trozo de micelio en una gota de lactofenol, o colorante de Gueguén, y desagregar con ayuda de dos agujas, montadas en sendos mangos . Poner un cubreobjetos y observar al microscopio. Dibujar las estructuras vistas. El lactofenol contiene: ácido láctico 100 mL, fenol 20 g, glicerol 50 mL, agua 40 mL. Bibliografía o o

Deacon JW . Introducción a la Micología Moderna. Limusa-Noriega, México, 1993 Alexopoulos CJ. Introducción a la Micología. EUDEBA, Buenos Aires, 1966

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TRABAJO Nº 8. Mohos toxigénicos Objetivo. Reconocer los mohos comunes que deterioran los granos y forrajes almacenados pues

suelen producir toxinas que afectan al hombre y los animales.

Introducción Los problemas causados por los hongos en alimentos y forrajes son numerosos. Los causados por micotoxinas son, con frecuencia, costosos debido a que se descubren muy tarde para prevenir las pérdidas económicas. Una herramienta importante en el control micológico de cereales y especias, es el uso de métodos simples de identificación específica que se realiza en base al aspecto de las colonias y la micromorfología en varios medios de cultivo a distintas condiciones de incubación.

Procedimiento Hacer repiques de un cultivo puro en tres puntos equidistantes de cada placa con los medios: agar malta, agar Czapeck, agar Czapeck glicerol, agar papa sacarosa, e incubar a 25ºC durante 7

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Leonor Carrillo. 2003. Microbiología Agrícola. Apéndice dias. Además repicar en estrías sobre dos tubos de agar malta o Czapeck e incubar uno a 5ºC y el otro a 37ºC. El cultivo en agar papa sacarosa se incuba a la temperatura ambiente con luz solar indirecta. La composición de los medios de cultivo es la siguiente: Agar malta: extracto de malta 20 g, peptona 1 g, glucosa 20 g, agar 20 g, agua destilada 1 litro; esterilzar a 121ºC durante 15 minutos. Solución concentrada de Czapeck: nitrato de sodio 30 g, cloruro de potasio 5 g, sulfato de magnesio 5 g, sulfato ferroso 0 , l g, agua destilada 100 mL; mantener a la temperatura ambiente. Agar Czapeck: fosfato dipotasico 1 g, solución de Czapeck 10 mL, extracto de levadura 5 g, sacarosa 30 g, agar 15 g, agua destilada 1 litro; esterilizar a 121ºC durante 15 minutos. Agar Czapeck glicerol: disolver las sales y extracto, como el anterior, en una mezcla de 250 mL de glicerol y 750 mL de agua destilada; esterilizar de igual manera. Agar papa sacarosa: hervir 200g de papa rallada en 1 L de agua, durante media hora, y completar el volumen a un litro, añadir 10 g de sacarosa y 15 g de agar, esterilizar a 110ºC durante 20 minutos. Observar y registrar el aspecto macromorfológico de las colonias. Hacer preparaciones en fresco con líquido de Patterson o colorante de Gueguén. Observar al microscopio y dibujar las estructuras. Si es necesario prolongar la incubación. Consultar las claves de la bibliografía para identificar el género (si es posible la especie) y cuáles son las micotoxinas que producen. Bibliografía o Pitt JI, Hocking AD. Fungi and food spoilage. Blackie A&P, London, 1997 o Carrillo L. Los hongos de los Alimentos y Forrajes. 2002 http://www.unsa.edu.ar (material bibliográfico)

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TRABAJO Nº 9. Micorrizas Objetivo. Observar los hongos asociados con plantas herbáceas y árboles constituyendo las

micorrizas. Preparar un inoculante para ectomicorrizas.

Introducción Las plantas parecen totalmente autónomas, pero la mayoría están asociadas con hongos, en sus raíces formando micorrizas o, endófitos dentro del tallo.

Endomicorrizas

Cuando el hongo penetra en el interior de las células de la raíz, formando minúsculas arborescencia y vesículas, se las llama endomicorrizas vesículo - arbusculares. Los arbúsculos suelen tener una vida efímera, de algunos días a pocas semanas, siendo luego digeridos por el hospedador. Los hongos de este tipo de micorrizas, generalmente presente en la vegetación herbácea, pertenecen a la familia de la endogonáceas. Hay otros tipos de endomicorrizas como las que forman ovillos intracelulares en las orquídeas Cada una de las diferentes especies de orquídeas tiene una alta especificidad por un hongo particular que generalmente es un zigomiceto. El grado de interdependencia es tal que en muchos casos ninguno de los asociados puede ser cultivado sin el otro, pues forman una verdadera simbiosis. Las raíces se infectan con hongos de las micorrizas vesículo-arbusculares por las hifas desarrolladas a partir de propágulos presentes en el suelo, los que pueden ser esporos o estructuras de resistencia presentes en las raíces muertas.

Ectomicorrizas En ellas el hongo rodea la raíz con un manto de filamentos y una red miceliar penetra entre las células radicales pero no dentro de ellas. Los hongos que forman ectomicorrizas en árboles son macrocárpicos y típicamente basidiomicetos superiores, por ejemplo Amanita, Boletus, Pisolithus, Suillus. Más raramente los ascomicetos forman micorrizas, por ejemplo Tuber. Es poca la especificidad de estas asociaciones ya que varios árboles pueden formar micorrizas con un hongo dado y viceversa. Algunas especies de árboles, por ej. los eucaliptos, poseen a la vez ectoy endo-micorrizas.

Inoculación

La falta de micorrización acarrea problemas en el transplante de las plántulas de árboles y plantas ornamentales, excepto en los casos en que el suelo contenga especies fúngicas. Para inocular con cultivos puros, el substrato (suelo, turba) debe ser previamente pasterizado con el fin de disminuir la población fúngica nativa competitiva. Los hongos son incorporados al substrato de siembra como trozos de raíces micorrizadas, pedazos de ascoma o basidioma, o micelio obtenido in vitro. El agregado de micelio ofrece mayores garantías en el caso de hongos que se desarrollan bien en cultivo axénico. El primer paso de toda inoculación consiste en la selección del hongo. Los siguientes obtener el cultivo y multiplicarlo para añadirlo al suelo donde se coloca la plántula crecida en condiciones asépticas.

Procedimiento Observación de micorrizas

Lavar la raíz con agua corriente. Observar su aspecto y seleccionar un trozo. Cortar en porciones de un centímetro de largo y colocarlos en solución de hidróxido de sodio o potasio al 10% p/v. Calentar a 90ºC durante 30 minutos o más si es necesario. Cuando el material es obscuro sumergirlo en agua oxigenada de 10 volúmenes durante 15 minutos, sino omitir este paso. Lavar 4 veces con agua corriente. Poner los trozos en solución de ácido clorhídrico 0,1 N

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durante 10 minutos. Colorear con azul-lactofenol a 90ºC por 5 minutos. Pasar a lactofenol. Colocar un trozo de la raíz tratada entre dos portaobjetos y aplastarla. Observar al microscopio entre porta y cubreobjetos. El lactofenol contiene: ácido láctico 100 ml, fenol 20 g, glicerol 50 mL, agua 40 ml. La solución colorante se prepara mezclando 5 mL de solución acuosa de azul de algodón o azul tripán o azul de metilo al 1% p/v, con 95 mL de lactofenol.

Preparación del inoculante para ectomicorrizas Cortar el basidioma con un instrumento previamente mojado en alcohol y encendido. Con un gancho o pinza estéril tomar porciones del interior del sombrero y depositarlas sobre la superficie de una placa de agar malta levadura. Incubar a 25-27ºC, dos o más semanas en la obscuridad. El agar malta levadura contiene: extracto de malta 20 g, extracto de levadura 2 g, agar 20 g, agua 1 L. Se esteriliza a 121ºC durante 15 minutos. Repicar en 50 ml de medio líquido de Melin Norkrins modificado en un matraz de Erlenmeyer de 250 mL e incubar a 25-27ºC con una agitación de 100 rpm y en la obscuridad, el tiempo requerido para un buen crecimiento. El medio líquido de Melin Norkins modificado contiene cloruro de calcio 0,05 g, cloruro de sodio 0,025 g, fosfato monopotásico 0,5 g, fosfato diamónico 0,25 g, sulfato de magnesio heptahidrato 0,15 g, cloruro férrico (al 1% p/v) 1,2 mL, extracto de malta 1,5 g, sacarosa 10 g, agua 1 litro. Esterilizar a 110ºC durante 20 minutos. Homogeinizar el cultivo, mezclar con suelo pasterizado previamente con vapor de agua a 60ºC. Llenar unas macetas pequeñas y colocar los plantines. Llevarlos al invernáculo. Bibliografía o o

Deacon JW Introducción a la Micología Moderna. Limusa-Noriega, México, 1993 Frioni L. Ecología Microbiana del Suelo. Universidad de la República, Montevideo, 1990

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TRABAJO Nº 10. Microorganismos del agua Objetivo. Conocer la probable contaminación del agua con patógenos, a través de la búsqueda de

microorganismos indicadores y otros.

Introducción El agua es un sistema ecológico en equilibrio que constituye la base de todas las comunidades vivas. Como es indispensable se procura aumentar sus recursos, especialmente almacenándola, y mejorar su calidad mediante purificación. El análisis biológico del agua para determinar la calidad sanitaria utiliza métodos que indican el grado de contaminación con excrementos. Se emplean técnicas para la detección y recuento de organismos indicadores, porque principalmente interesa conocer el peligro potencial de la transmisión de patógenos a través del agua, antes que la búsqueda de éstos.

Coliformes

Los coliformes son bacterias de origen entérico que son capaces de fermentar la lactosa con producción de gas. Los géneros de enterobacterias incluidos en el grupo de los coliformes a efectos de análisis de aguas son Citrobacter, Enterobacter, Escherichia y Klebsiella. Este grupo es el principal indicador de la conveniencia del agua para uso doméstico, industrial u otro. La prueba de fermentación en una serie de tubos (caldo bilis lactosa verde brillante, caldo McConkey, etc.) con determinación del número más probable (NMP) fue la primera usada, luego se incorporó la técnica de filtración por membrana que, con algunas limitaciones, es comparable a la anterior, y finalmente se introdujo el substrato cromogénico ONPG (onitrofenil-β-D- galactopiranósido) al medio liquido para NMP. Comúnmente para determinar el NMP se realiza una prueba presuntiva basada en la fermentación de la lactosa con producción de gas que queda atrapado en la campanita. La ausencia de gas se interpreta como ausencia de coliformes, pero su presencia es una posibilidad de presunción pero no de seguridad puesto que algunas bacterias lácticas suelen producir gas. El medio de cultivo liquido lleva un indicador de pH para facilitar la lectura y sales biliares para inhibir el desarrollo de las bacterias no entéricas. Los coliformes presentes en el intestino y las heces de animales de sangre caliente, incluido el hombre, son capaces de producir gas al fermentar lactosa a 44,5ºC. Más especifica es la búsqueda de Escherichia coli por cultivo sobre placas de medios que permiten la detección en 7 horas (m-7hFC) o en 24—48 horas (EMB, Endo y otros), o bien un medio liquido con el substrato fluorogénico MUG (4-metilumberiferil-β-D-glucurónido) especifico para bacterias con la enzima β-glucuronidasa (24 hs a 44,5ºC). En los casos que se requiere confirmar la presencia de E. coli se emplean las pruebas de: fermentación de lactosa, sorbitol y celobiosa, hidrólisis de ONPG, producción de indol, viraje del rojo de metilo, producción de acetoína, uso del citrato, motilidad, descarboxilación de lisina y ornitina, oxidasa y formación de pigmento amarillo; las que permiten clasificar las especies de enterobacterias presentes en aguas. El significado de estos análisis se basa en que la falta de coliformes implica una ausencia de contaminación fecal próxima o remota,mientras que su presencia no certifica una contaminación de aguas con materias fecales. En cambio, la presencia de Escherichia coli demuestra una contaminación fecal reciente.

Enterococos

Constituyen un grupo de estreptococos fecales que incluye S. faecalis, S. faecium, S. gallinarum y S. avium. Se diferencian de los otros estreptococos por su capacidad para crecer en presencia de 6,5% cloruro de sodio, a pH 9,6, entre 10 y 45ºC. Son bacterias esféricas, gram positivas, fisiológicamente relacionadas con las bacterias lácticas que dan negativa la prueba de catalasa. Como tienen requerimientos nutricionales más complejos que otras bacterias difícilmente se

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multiplican en el agua aunque resisten mejor la cloración que Escherichia coli. Los enterococos también son indicadores fecales, y para su análisis se emplean pruebas de cultivo en una serie de tubos de medio selectivo (caldo glucosa azida) para determinar el NMP y la filtración por membrana (agar mE, etc), siendo confirmado por repiques en agar bilis esculina u otro medio especial, además de la prueba de catalasa y la coloración de Gram. Los enterococos son indicadores que permiten determinar el grado de la contaminación fecal. Una relación entre el número de coliformes fecales al número de enterococos, mayor que cuatro indica contaminación fecal humana, mientras que si es menor que uno sugiere otra fuente.

Clostridios Clostridium perfringens tiene el mismo significado que los enterococos y una supervivencia mucho mayor que cualquier otro indicador bacteriano de polución fecal, debido a su capacidad formadora de endosporos. En aguas naturales superficiales, no contaminadas, no se suele detectar la presencia de estos microorganismos ni en grandes volúmenes de muestra, aunque se lo pueda observar en agua profundas. La proporción de clostridios frente a otros indicadores fecales es muy reducida. La detección simultánea de Cl. perfringens y coliformes o E. coli constituye una clara evidencia del origen fecal de la contaminación. En cambio la presencia exclusiva de los clostridios debe interpretarse como un indicio de contaminación fecal remota. La existencia de endosporos de clostridios en aguas tratadas carece de significado. El ensayo se funda en el sistema enzimático de la sulfito-reductasa que en el caso de Cl. perfringens es estrictamente endocelular, y la reducción de sulfito a ácido sulfhídrico solo tiene lugar en contacto con la colonia y el ennegrecimiento en una zona muy próxima ella, si en el medio existen sales solubles de hierro. Otros esporulados también suelen reducir el sulfito.

Pseudomonas spp.

En las aguas se suele buscar Pseudomonas aeruginosa, un organismo asociado al tracto respiratorio superior o la piel, que se comporta como patógeno oportunista. Su presencia es poco favorable para la calidad del agua.. Es un indicador primario de la eficiencia de la desinfección, mientras que los coliformes son indicadores de la contaminación de las superficies. Se emplea tanto el método de siembra en una serie de tubos de medio líquido (caldo asparagina u otro) para determinar el NMP, como la técnica de filtración por membrana (agar M-PA). Para la confirmación se suele usar caldo acetamida, agar leche, agar King A y B, agar King A- cetrimida. El bromuro de N-cetil-N,N,N-trimetilamonio (Cetrimide) es un agente antibacteriano de amplio espectro que no afecta a la especie citada por lo que se adiciona en cantidades de 0,1 - 0,3 g/L de medio King A para el aislamiento. Las colonias típicas de estos bacilos Gram negativos son de bordes generalmente irregulares que tiene tendencia a difundirse, las cepas no pigmentadas dan colonias translúcidas, las otras pueden estar teñidas de verde o parduzco. El pigmento colorea a la porción del medio que rodea a la colonia. Pseudomonas aeruginosa forma piocianina que tiene un color azul-verdoso y difunde en el medio cuya producción se ve favorecida en un medio (King A) que contiene sulfato de potasio, cloruro de magnesio y glicerol y no incluye nitratos ni sales de sodio pues actúan como inhibidores. Este pigmento es soluble en agua y cloroformo. La solución azulada se colorea de rojo por el agregado de ácidos. La producción de un compuesto fluorescente por especies de Pseudomonas se favorece en un medio que contiene fosfatos y sulfatos (King B). Es soluble en agua y ácido acético e insoluble en cloroformo. La solución acida es incolora y no fluorescente; la neutra ó alcalina es amarillenta a parda y fluorescente.

Otros microorganismos

En las aguas industriales suele ser conveniente conoer la incidencia de bacterias del azufre y el

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hierro, debido a que intervienen en los procesos de corrosión. Los olores desagradables, como a moho, que ocasionalmente suelen presentarse en aguas potabilizadas pueden deberse a la presencia de geosmina y 2-metilisoborneol producidos por actinomicetos en aguas superficiales. Suele hacerse un recuento de estas bacterias ramificadas en agar almidón caseína con cicloheximida. Los protozoos patógenos de importancia transmitidos por las aguas son quistes de Entamoeba histolytica y Giardia lamblia, así como ooquistes de Cryptosporidium parvum. Este último puede encontrarse en aguas cloradas.

Procedimiento Número más probable de coliformes

Figura 19

Sembrar tres tubos de caldo -lactosa doble concentración con 10 mL de muestra, tres tubos de medio simple con 1 mL y los tres restantes con 0,1 mL cada uno. Incubar a 35ºC durante 24-48 hs. Para coliformes fecales usar el medio EC e incubar a 44,5ºC. El caldo-lactosa simple contiene: extracto de carne 3 g, peptona 5 g, lactosa 5 g, púrpura de bromocresol (al 0,5%) 4 mL, agua 1 L, pH 7,2. Repartir en tubos con campanita. El medio doble concentración contiene los mismos ingredientes en 500 mL de agua. El medio EC simple contiene: peptona 20 g, lactosa 5 g, sales biliares 1,5 g, fosfato dipotasico 4 g, fosfato monopotásico 1,5 g, cloruro de sodio 5 g, agua destilada 1 L. Para el medio doble concentración se disuelven los sólidos en 500 mL de agua. Se reparte en tubos con una campanita (ver figura 19). Observar los tubos que presentan gas en cada una de las series. Obtener el número característico donde la primera cifra corresponde a los tubos de positivos sembrados con 10 mL de muestra, la segunda a los positivos que recibieron 1 mL y la tercera a los positivos con 0, 1 mL de agua. Consultar la tabla para obtener el número más probable de coliformes o coliformes fecales en 100 mL de la muestra.

Escherichia coli

Sembrar 1 asa de cada uno de los tubos positivos para coliformes fecales en sectores de las placas de agar Levine (EMB). Este medio contiene peptona 10 g, lactosa 5 g, sacarosa 5 g, fosfato dipotásio 2 g, agar 15 g, eosina 0,4 g, azul de metileno 0,065 g, agua 1 L, pH 7,2. Incubar a 35°C durante 48 horas. En este medio las colonias son negras con brillo metálico.

Número más probable de enterococos Sembrar cada uno de los tres tubos de caldo-azida doble concentración con 10 mL de muestra. Agregar 1 mL a cada uno de tres tubos de caldo-azida simple y 0,1 mL a los tres restantes. Se incuban a 35º.C y se observan a las 24 y 48 horas. El caldo-azida simple contiene peptona 15 g, extracto de carne 4,5 g, glucosa 7,5 g, cloruro de sodio 7,5 g, azida de sodio 0,2 g, agua destilada 1 L. El medio doble concentración se prepara agregando la misma cantidad de sólidos a 500 mL de agua. Se reparten a razón de 10 mL en cada tubo. Se consideran positivos los tubos que presentan turbiedad debido al crecimiento microbiano.

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Consultar la tabla para obtener el número más probable de enterococos en 100 mL de muestra. Número más probable por mL de muestra, utilizando series de tres tubos inoculados con 10 mL, 1 mL y 0,1 mL

Número característico 0 0 1 0 0 2 0 0 3 0 1 0 0 1 1 0 1 2 0 1 3 0 2 0 0 2 1 0 2 2 0 2 3 0 3 0 0 3 1 0 3 2 0 3 3 1 0 0 1 0 1 1 0 2 1 0 3 1 1 0 1 1 1 1 1 2 1 1 3 1 2 0 1 2 1 1 2 2 1 2 3 1 3 0 1 3 1 1 3 2 1 3 3

Índice NMP 3 6 9 3 6,1 3,2 12 6,2 9,3 12 16 9,4 13 16 19 3,6 7,2 11 15 7,3 11 15 19 11 15 20 24 16 20 24 29

Número característico 2 0 0 2 0 1 2 0 2 2 0 3 2 1 0 2 1 1 2 1 2 2 1 3 2 2 0 2 2 1 2 2 2 2 2 3 2 3 0 2 3 1 2 3 2 2 3 3 3 0 0 3 0 1 3 0 2 3 0 3 3 1 0 3 1 1 3 1 2 3 1 3 3 2 0 3 2 1 3 2 2 3 2 3 3 3 0 3 3 1 3 3 2

Índice NMP 9 14 20 26 15 20 27 34 21 28 35 42 29 36 44 53 23 39 64 95 43 75 120 160 93 150 210 290 240 460 1100

Clostridios sulfito-reductores Repartir, a razón de 20 mL por tubo, un medio que contine caldo nutritivo 1 L, glucosa 20 g, agar 30 g y esterilizar 30 minutos a 110ºC. Preparar una solución de 1 g sulfito de sodio y 4 gotas de alumbre férrico (al 5%) en 10 mL de agua destilada estéril. Calentar a ebullición 25 mL de muestra. En el momento de usar fundir cinco tubos de medio en baño de agua hirviente, agregar 1 mL de la solución de sulfito y 5 mL de la muestra tratada, evitando la incorporación de aire. Enfriar bajo chorro de agua e incubar a 35ºC durante 48 horas. Contar las colonias negras en cada tubo sembrado con 5 mL de muestra, sumar y calcular el número de organismos presentes en 100 mL de muestra

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Pseudomonas spp. Sembrar 0,1 mL de la muestra o diluciones de la misma (1/10 ó 1/100 en agua estéril) en sendas placas de los medios King A y King B. Incubar el medio A durante 48 hs a 37ºC y el medio B durante 24 hs a 37ºC y luego 3-4 días a temperatura ambiente. El medio King A, que exalta la producción de piocianina, contiene: peptona 20 g, glicerina 10 mL, cloruro de magnesio 1,4 g, sulfato de potasio 10 g, agar 15 g, agua 1 L, pH 7,2. El medio King B, que favorece la producción del pigmento fluorescente, contiene: proteosapeptona 20 g, glicerina 10 mL, fosfato monopotásico 1,5 g, sulfato de magnesio 1,5 g, agar 15 g, agua 1 L, pH 7,2. Esterilizar en autoclave a 121ºC durante 15 minutos. Observar las colonias con pigmentos solubles y/o fluorescentes bajo luz visible y ultravioleta. Bibliografía o o

Eaton AD, Clesceri LS, Greenberg AE. Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater. 19º ed. parte 9000: Microbiological Examination. APHA, Washington, 1995 Guinea J, Sancho J, Parés R. Análisis Microbiológico de Aguas. Omega, Barcelona, 1979

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1. Microorganismos Los ambientes capaces de albergar vida microbiana reflejan el amplio espectro de la evolución de estos organismos. Se han encontrado especies que viven a temperaturas comprendidas entre el punto de congelación y el punto de ebullición del agua, en agua salada y en agua dulce, en presencia y en ausencia de aire. Algunos han desarrollado ciclos de vida que incluyen una fase de latencia en respuesta a la falta de nutrientes. Los microorganismos se hallan capacitados para acometer una extensa gama de reacciones metabólicas y adaptarse a muchos ambientes diferentes (1). Por su poco peso pueden ser transportados por las corrientes de aire y estar en todas partes, pero las características del ambiente determinan cuáles especies pueden multiplicarse. Existen varias clases de microorganismos: mohos, levaduras, bacterias, actinomicetos, protozoos, algas, virus. La figura 1 muestra el tamaño comparativo de algunos microorganismos. El suelo es uno de los ambientes donde un conjunto ingobernable de microorganismos compiten entre sí para obtener lo que todos ellos necesitan: nutrientes y energía. Al mismo tiempo, los productos de su metabolismo alteran la composición química del suelo donde habitan. Más aún, los propios microorganismos evolucionan en respuesta a la presión del ambiente (3). En un suelo agrícola están presentes alrededor de 1010 organismos por g de suelo y constituyen una biomasa de aproximadamente 1500 kg por Ha, lo cual corresponde a un cordero por cien m2 . Un gramo de suelo fértil puede contener 5 m de micelio fúngico, 10 8 células bacterianas, 106 esporos de actinomicetos (4). En los animales monogástricos la población bacteriana alcanza su máximo nivel en el intestino grueso y el impacto metabólico de la microbiota es considerable. En el rumiante la acción de los microorganismos contenidos en el rumen es aún más espectacular, pues al degradar la celulosa permiten al animal alimentarse de forrajes (5). Numerosas especies bacterianas y algunas veces incluso algas microscópicas o protozoos, proliferan en las superficies expuestas a la humedad formando una biopelícula de microorganismos contenidos en una matriz de polisacáridos, cuyo espesor puede oscilar entre algunos micrómetros y pocos milímetros, que se adhiere fuertemente a la base. Las biopelículas se forman en todas las superficies sumergidas, tanto en agua dulce como de mar, o bien sobre soportes constantemente húmedos tales como paredes de la cañería de agua, pisos o dientes. El 99% de toda la actividad microbiana en un ecosistema abierto ocurre sobre las superficies (6). Los mohos y levaduras forman parte de los hongos. Las levaduras son unicelulares en condiciones normales mientras que los mohos crecen como un sistema ramificado de filamentos (micelio). Se trata de organismos eucarióticos cuyas células, al igual que las

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Leonor Carrillo. 2003. Microbiología Agrícola. capítulo 1 de vegetales y animales, tienen un núcleo cerrado por una doble membrana porosa y llevan como mínimo dos cromosomas, a más de veinte en algunas especies (7). Las eubacterias y los actinomicetos son procarióticos. Sus células carecen de membrana nuclear y mitocondrias, además poseen un solo cromosoma que se encuentra libre en el citoplasma y una pared celular rígida. Las células de los procariotas son, en general, mucho menores que las de los eucariotas; unas 10 veces menor en medidas lineales y por lo tanto unas 1000 veces menor en volumen (1). Los protozoos del suelo se alimentan de bacterias y presentan movimientos ligados a la fagocitosis que es la ingestión de partículas mediante invaginación de la membrana citoplasmática y formación de vesículas intracelulares (4). Las eubacterias presentan diversa morfología: esférica, cilíndrica, espiralada e incluso filamentosa. Los actinomicetos incluyen muchos géneros que desarrollan en forma de delgado micelio. Las eubacterias son organismos pequeños, que miden uno o varios micrómetros. Las levaduras, en cambio, miden entre 6 y 12 µm. Los mohos son pluricelulares y aunque sus células aisladas miden a lo sumo 25 µm de largo, su conjunto se distingue a simple vista. Los hongos con reproducción sexual pueden tener cuerpos fructíferos de tamaño notable como los champiñones y otras setas, formados por millones de células (7). La figura 2 es un esquema de las células procariótica y eucariótica.

1.1. Dominios y reinos Las dificultades lógicas para ubicar a los microorganismos en los vegetales o los animales desaparecieron al admitir un tercer reino, el de los protistas. Este reino incluía a todos aquellos organismos que se diferencian de las plantas y los animales, por su falta de especialización morfológica, siendo la mayoría unicelulares. Luego los protistas fueron divididos en dos grupos claramente definidos sobre la base de su estructura celular. Los eucarióticos eran protistas superiores. Este grupo comprendía a los protozoos, hongos y algas. Los procarióticos eran protistas inferiores e incluían a las diversas bacterias y cianobacterias (2). Otra clasificación de los seres vivos estaba fundada en el reconocimiento de cinco reinos (9).

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Los estudios ultraestructurales, bioquímicos y de la biología molecular hicieron insostenible la permanencia de estos reinos, y los procariotas fueron ubicados en los dominios Bacteria y Archaea mientras que el dominio Eukarya comprende a los microorganismos en tres reinos (10). La importancia de esto último radica en que los organismos estudiados por los fitopatólogos han sido distribuidos entre los reinos Chromista, Fungi y Protozoa, aunque se ha sugerido transferir los hongos que están en Chromista al nuevo reino Straminipila (11). Los virus no fueron considerados pues son partículas acelulares, diferentes de todos los otros microorganismos, que pueden proliferar y replicarse solamente dentro de células vivas (12). Por otra parte, parece que las células eucarióticas surgieron de antepasados procarióticos, pues hay pruebas del origen bacteriano de mitocondrias y cloroplastos (13). Dominio Archea Bacteria

Reino

Tipo celular procariótico "

Eukarya

Chromista Protozoa Fungi Plantae

eucariótico " " "

Animalia

"

.

Ejemplos arquibacterias eubacterias, actinomicetos, mixobacterias, cianobacterias oomicetos, algas mixomicetos, protozoos levaduras, mohos, setas, bejines musgos, hepáticas, coníferas, plantas con flores esponjas, corales, gusanos, moluscos, insectos, vertebrados

1.2. Organismos procarióticos La célula procariótica tiene solamente dos sistemas internos principales: una molécula circular de ADN con cadena helicoidal doble y un citoplasma no diferenciado donde se halla inmerso ese ADN. La longitud del anillo de ADN que codifica toda la información genética de la célula apenas es superior a un milímetro (7). El citoplasma contiene gran número de ribosomas, gránulos constituidos por ARN y proteínas, que cumplen la función de enlazar los aminoácidos formando proteínas. Los ribosomas procarióticos son más pequeños que los eucarióticos (1). La replicación del ADN comienza cuando ambas cadenas se separan, permitiendo la síntesis de una cadena complementaria a cada una de ellas mediante la ADN polimerasa. La nueva hélice es un híbrido consistente de una cadena original y una recién formada (replicación conservativa) (14). La duplicación del cromosoma de Escherichia coli en

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Leonor Carrillo. 2003. Microbiología Agrícola. capítulo 1 condiciones favorables tarda 20 minutos. Un gen, o unidad de información genética, está representado por una secuencia específica del ADN y determina la estructura de un polipéptido. El conjunto de genes se denomina genoma. La información contenida en la secuencia del ADN es transferida al ARN mensajero (ARN-m) durante la transcripción. Los aminoácidos son reunidos en una cadena polipeptídica según la secuencia determinada por el ARN-m en un proceso de traducción que implica la participación del ARN-t (ARN que transfiere los aminoácidos), los ribosomas, varias enzimas y ATP. Los microorganismos procarióticos poseen una cubierta celular muy diferente de la de los eucariotas. Las paredes celulares de muchos de los procariotas poseen un componente químico común, el péptidoglucano (mureína), que es el responsable de la forma y consistencia de la pared. El péptidoglucano es un extenso polímero que se halla integrado por β−subunidades alternas de N-acetilglucosamina (que es también el constituyente de la quitina en los eucariotas) y el ácido N-acetilmurámico. Esta última molécula es similar a la N-acetilglucosamina, pero tiene una unidad de ácido láctico unida al tercer átomo de carbono de la glucosa. El ácido láctico sirve como punto de unión de una cadena lateral lineal constituída por cuatro aminoácidos D o L. Las moléculas de péptidoglucano que rodean la célula están entrelazadas por puentes formados por los aminoácidos (1). Algunas bacterias filamentosas forman una envoltura tubular constituída por heteropolisacáridos que se conoce como vaina (12). La flexibilidad metabólica de una bacteria es enorme. Debido al pequeño tamaño, una bacteria esférica tiene espacio para no más que cien mil moléculas de proteínas. Las enzimas no están corrientemente dentro de la célula, sino que su síntesis es inducida por la presencia del substrato en el ambiente (1).

1.2.1. Eubacterias

La cantidad de péptidoglucano de la pared de las células bacterianas varía enormemente, desde el 90% en la pared de algunas bacterias gram-positivas hasta menos del 10% en las bacterias gram-negativas. El término Gram-positivo hace referencia a la capacidad de ciertas bacterias de retener el colorante violeta cristal en presencia de yodo cuando se agrega alcohol, al hacer la coloración de Gram sobre un portaobjetos con las bacterias fijadas. Las bacterias negativas no retienen a este colorante (7). La penicilina y otros antibióticos β-lactámicos que interfieren con la biosíntesis de la pared celular llevan a la producción de protoplastos carentes de pared bajo condiciones osmóticas apropiadas (1). El término esferoplasto se usa para los casos en que persisten restos de pared. La figura 3 muestra un esquema de las paredes celulares. La pared celular de las bacterias Grampositivas contiene pequeñas cantidades de proteínas y polisacáridos, a menudo también ácidos teicoicos (polímeros de ribitol-fosfato o glicerol-fosfato unidos mediante enlaces fosfodiéster) o de ácidos teicourónicos. Estos ácidos están unidos al péptido-glucano por los fosfatos (12). En las proteobacterias (Gramnegativas) la capa interna de la pared celular es pobre en péptidoglucano y la capa externa rica en lipoproteína y lipopolisacáridos, los cuales constituyen más del 80% del peso seco de la pared. El espacio entre la membrana externa y la capa de péptidoglucano, llamado periplásmico, contiene un gran número de proteínas

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enzimáticas. La capa de péptido-glucano está rodeada por una membrana externa compuesta de lípido A y fosfolípidos con proteínas en túnel (porinas) que la atraviesan. El lípido A consiste de un disacárido de glucosamina cuyos grupos hidroxilo están esterificados con ácidos grasos de 12, 14 ó 16 carbonos (12). Los micoplasmas son bacterias carentes de pared celular y parecen protoplastos, pero son más resistentes a la lisis osmótica debido a la naturaleza de su membrana citoplasmática, la que contiene esteroles en un grupo y carotenoides u otros compuestos en los demás (1). La membrana citoplasmática bacteriana contiene alrededor del 70-90% de los lípidos celulares mientras que la membrana constituye solamente 8-15% del peso celular seco. La membrana, con un grosor de 5 nanómetros, consiste de una doble capa lipídica con los extremos hidrofóbicos de los fosfolípidos en el interior y las cabezas hidrofílicas expuestas sobre ambas superficies. También tiene incorporadas proteínas que la atraviesan o están inmersas parcialmente en ella. Otras proteínas unidas a la membrana son conocidas como proteínas periféricas (17). Las substancias hidrofóbicas difunden fácilmente pero no los iones. Las proteínas de la membrana intervienen en la entrada y salida de substancias de la célula, y son específicas para un grupo de moléculas estrechamente relacionadas. En la figura 4 se observa un esquema de la membrana citoplasmática La membrana citoplasmática se extiende y repliega hacia el interior del citoplasma formando los sitios de la generación de energía respiratoria (mesosomas) y fotosintética (tilacoides y cromatóforos) en las bacterias que posean tales actividades metabólicas. Otras bacterias (por ejemplo Nitrobacter, Nitrosomonas, Nitrosococcus) tienen paquetes de láminas paralelas, algunas de las cuales están conectadas a la membrana citoplasmática (12). Muchas bacterias están dotadas de flagelos que les permiten moverse, insertados en la superficie celular. Si los flagelos se encuentran concentrados en un extremo de la célula se denominan polares ; si están distribuídos por toda la superficie celular, reciben el nombre de peritricos (7). La figura 5 muestra la ubicación de los flagelos en las bacterias. Los flagelos posibilitan la quimiotaxis, que es el movimiento hacia la fuente de nutrientes o el alejamiento de un entorno químicamente hostil. La proteína del flagelo, flagelina, está unida a un gancho asociado a un cuerpo basal que causa el movimiento giratorio del flagelo. La base del flagelo está anclada en la membrana citoplasmática, asociada en las gram negativas al péptido glucano y a la membrana externa para estabilizar la estructura flagelar (1). Las bacterias sin flagelos carecen de movimiento excepto aquéllas que se deslizan sobre el substrato. La superficie bacteriana gram negativa también suele tener otras estructuras proteicas filamentosas las fimbrias o pili I que participan en la adhesión a diversas superficies, por ej. las mucosas animales, y los pelos de conjugación o pili F (18). A veces las bacterias acumulan capas de polisácaridos sobre la superficie exterior (ej. Xanthomonas), pero algunas tienen una cápsula polipeptídica (ej. Bacillus). La cápsula no es esencial para la vida y no siempre está presente. Para observarla se suspende al microorganismos en una solución de nigrosina o rojo Congo y como la cápsula no es teñida se ve como un halo claro alredor de la célula. En muchos casos el material capsular puede ser separado en forma de limo, por agitación u homogeinización. Por ejemplo, Leuconostoc mesenteroides convierte rápidamente a una solución de azúcar de caña en una jalea de dextrano (1,6-α-glucano). Por otra parte Acetobacter aceti var. xylinum secreta celulosa formado una cubierta coriácea que rodea a las células y da cohesión a la colonia (12).

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Leonor Carrillo. 2003. Microbiología Agrícola. capítulo 1 Numerosas eubacterias y también arqueobacterias, poseen una envoltura exterior proteica o capa S que suelen perder en las condiciones óptimas del laboratorio. Esta capa favorece la adhesión al substrato para permitir la acción de las exoenzimas y a la virulencia de las bacterias patógenas (19). Un pequeño grupo de eubacterias que se encuentran en el suelo (Bacillus, Clostridium, Sporosarcina, etc.) poseen endosporos. Son paquetes de ADN y otras moléculas que pueden permanecer en estado latente por muchos años, y resultan altamente resistentes al calor (incluso al agua hirviendo), productos quimiotóxicos y otros agentes que ocasionan la muerte a las células. Ya en el ambiente apropiado, el endosporo puede dar origen a una nueva bacteria (7). Si se calienta una suspensión de suelo a 80-100°C durante 10 minutos, sólo sobreviven los endosporos bacterianos. Éstos contienen ácido dipicolínico, una substancia no hallada en la forma somática, en la proporción de 10-15% del peso seco del esporo. Son varias las cubiertas que rodean al citoplasma del endosporo: membrana citoplasmática, pared celular, córtex (péptidoglucanos), envoltura interna, envoltura externa (polipéptidos) y, en ocasiones, exosporio (10). La figura 6 muestra un esquema de la formación y estructura de un endosporo bacteriano. Los plásmidos son pequeños anillos (hay algunos lineales) de ADN extracromosomal que se multiplican independientemente en las células que los alojan y pueden portar genes que confieren ciertas ventajas a las mismas, por ejemplo resistencia a los antibióticos. Las bacterias hospedadoras a su vez, dejan que el ADN plasmídico se replique en ellas hasta cierto punto, asegurando así la presencia continuada del plásmido en las células hijas (20). Los tumores de las plantas producidos por la infección con Agrobacterium tumefaciens se deben al plásmido Ti que es el agente infeccioso real. El ADN plasmídico penetra en la célula vegetal y parte del mismo se incorpora al genoma de la planta. Este proceso se llama transformación oncogénica. La parte integrada del plásmido lleva la información para la producción de opinas que son substancias utilizadas solamente por la bacteria. Otra especie, Agrobacterium rhizogenes desencadena el crecimiento anormal de las raíces mediante el plásmido Ri (21). La conjugación es una forma de transferencia de genes y para que se produzca debe haber contacto entre las células bacterianas a través de los pili F o pelos de conjugación que retienen juntas a las células dadora y receptora. Los sistemas de conjugación en bacterias gram-negativas produce la transferencia de una parte del ADN del cromosoma o de un plásmido de la célula dadora a la receptora (20). Las bacterias forman colonias características sobre la superfice del substrato, que tienden a adoptar una forma circular creciendo por adición de células a su perímetro. Al extenderse la colonia sobre el agar se observa que en el crecimiento participan unos

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elementos en anillos y otros en sectores. A todos los sectores los va formando, por propagación centrífuga, la progenie de un antepasado común. Algunos sectores se diferencian del resto porque las células difieren en su ADN de las de los sectores contiguos debido a mutaciones espontáneas. Las bacterias de un anillo comparten algunas propiedades entre sí pero no están emparentadas, pues tienen parentesco directo con las de la zonas precedente y la siguiente (9). La figura 7 presenta algunas colonias de bacterias de distinto aspecto.

Las bacterias generalmente se multiplican por fisión binaria. Después del crecimiento de la célula, aparece el septo y las células se separan o permanecen unidas con formas características: pares de bacterias, cadenas, paquetes cúbicos y acúmulos planos irregulares entre las bacterias esféricas (cocos), o pares y cadenas en las cilíndricas (bacilos) (12). La multiplicación por brotación es rara en los procariotas pero se observa, por ejemplo, en la bacteria del agua estancada Hyphomicrobium. La figura 8 muestra un esquema de las diversas formas de bacterias. La segregación del ADN es el proceso que distribuye igualitariamente el material genético en las células hijas. Es producida en las bacterias debido a un mecanismo parecido al mitótico. La replicación de los plásmidos en la célula, sobre el replisoma, entraña la formación de un complejo de separación o partición donde se adhiere el plásmido cual región centromérica. Una vez formadas las copias, éstas se alejan activamente unidas a las proteínas de partición hasta que la célula se divide. La división del cromosoma parece ocurrir de igual manera (23). La figura 9 presenta un esquema de la división de una bacteria.

1.2.2. Arqueobacterias Este grupo de procariotas en su bioquímica y en la estructura de los ribosomas, membrana y pared, difieren tanto de los procariotas como de los eucariotas. Se los denomina arqueobacterias pues algunas poseen un metabolismo particularmente adecuado a las condiciones que se supone prevalecieron en los primeros tiempos de la vida sobre la tierra. Comprende tres clases muy diferentes: las metanógenas, las halófilas extremas y las termoacidófilas (8). Las arqueobacterias no tienen péptidoglucano en la pared. La membrana está formada por lípidos no habituales, compuestos por un grupo glicerol ligado a dos cadenas de alquil-isoprenoides por un enlace tipo éter (-O-) (24). Algunas de estas bacterias tiene histonas y nucleosoma de tipo eucariótico (25).

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Leonor Carrillo. 2003. Microbiología Agrícola. capítulo 1 Las metanógenas (Methanobacterium, etc.) viven solamente en ambientes libres de oxígeno y liberan metano mediante la reducción del CO2 . Su apariencia externa es la de las demás bacterias pero su pared celular varía. Algunas metanobacterias contienen pseudomureína donde el ácido acetilmurámico está reemplazado por el ácido Nacetilalosaminurónico pero en otras predominan las proteínas o los heteropolisacáridos en la pared celular. Viven en estrecha asociación con otras bacterias, como los clostridios, que metabolizan materia orgánica en descomposición y desprenden hidrógeno como producto de desecho. Se encuentran en agua estancadas, en las plantas de tratamiento de aguas residuales, en la panza del ganado, en el intestino de los animales, en el fondo del océano y en los manantiales de aguas termales (1) (ver capítulo 5). Las halófilas extremas son bacterias que, para sobrevivir, requieren elevadas concentraciones de sal. Algunas de ellas crecen fácilmente en salmuera saturada. Pueden conferir color rojo a los estanques de evaporación donde se obtiene la sal y alteran al pescado salado. Mantienen fuertes gradientes en la concentración de ciertos iones a través de la membrana celular y utilizan esos gradientes para transportar diversas substancias hacia adentro o hacia afuera de la célula. Poseen un mecanismo fotosintético sencillo que se basa en un pigmento ligado a la membrana: la rodopsina bacteriana. La pared de Halobacterium está formada por proteínas pero la de Halococcus por heteropolisacáridos (12). Entre las termoacidófilas se encuentra Sulfolobus que se halla en los manantiales de aguas termales sulfurosas. Crecen a más de 80°C y a pH inferior a 2. Otro género es Termoplasma, un micoplasma que sólo posee membrana celular y crece a más de 55°C. El medio interior de la célula tiene un pH próximo a la neutralidad; ello exige mantener un considerable gradiente de pH a través de la membrana celular. El gradiente es empleado para bombear moléculas hacia dentro o fuera de la célula (8).

1.2.3 . Actinomicetos

Los actinomicetos constituyen un importante grupo de organismos procarióticos habitantes del suelo y del material vegetal compostado. El género principal del grupo es Streptomyces cuyas especies suelen excretar antibióticos y el olor a tierra mojada se debe a compuestos volátiles fabricados por los mismos. Cuando se los cultiva en medio sólido, no sólo forman un fino micelio ramificado, sino que también producen una hifa aérea que se diferencia en cadenas de conidiosporos. Cada conidiosporo puede, a su vez, generar una colonia micelial. Otro género de interés es Nocardia cuyas colonias carecen de micelio aéreo o es escaso, con unos pocos conidiosporos en los extremos de las cortas ramas hifales o sin ellos, y finalmente las hifas se fragmentan totalmente en elementos bacilares (7). Thermoactinomyces, a diferencia de los otros géneros de actinomicetos, forma endosporos similares a los de Bacillus y Clostridium, en el extremo de pequeñas ramificaciones (29). La figura 10 muestra un esquema de la morfología de algunos actinomicetos. Nocardia, como la bacteria Mycobacterium, no se tiñe fácilmente por el colorante de Gram ni por otros, para colorearla se recurre al método de Ziehl Neelsen donde el colorante (fucsina fenicada)

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se aplica en caliente y con el fin de diferenciarla se decolora a los otros organismos con un ácido mineral diluido. Esto se debe a que el péptidoglucano está unido a los arabino-galactanos esterificados con ácidos micólicos de naturaleza cerosa (1).

1.2.4. Cianobacterias

Son organismos procarióticos, unicelulares o filamentosos (por reunión de células individuales adheridas por sus extremos) que contienen, además de la clorofila, un pigmento azulado llamado ficocianina. Están presentes en suelos, y aguas dulces o saladas. A veces colonizan ambientes extremadamente inhóspitos. Algunos convierten el nitrógeno atmósferico en compuestos que los vegetales aprovechan y fertilizan los campos y de manera muy especial los arrozales (1). Ciertas especies producen metabolitos secundarios tóxicos (por ej. un fosfato orgánico letal) que son liberados de las células en el tracto digestivo de los animales al beber agua con verdín (27). Algunas son unicelulares adheridas por un limo o dentro de una cápsula, ej. Gloeocapsa. Otras también unicelulares generan multiples beocitos en su interior, ej. Dermocarpa. Las que forman cadenas de células (tricomas) que pueden deslizarse, suelen tener células especiales donde ocurre la fijación del nitrógeno molecular (heterocistos) y células de reposo (acinetos), ej. Nostoc, o carecer de ellas, ej. Oscillatoria. Unas pocas tienen una vaina alrededor del tricoma (12). La figura 11 presenta un esquema de la morfología de cianobacterias. Los géneros Anabaena, Aphanizomenon, Microcystis y Nodularia contienen especies tóxicas (27). En cambio el género Spirulina es comestible y apreciado por el alto tenor de proteínas, del orden del 50-60% del peso seco, con un aminograma similar al de la harina de soja. Las cianobacterias también pueden convivir en simbiosis con las plantas, debido a su capacidad de fijar el nitrógeno molecular, por ej. Anabaena en las cavidades dorsales de las hojas del helecho acuático Azolla, y Nostoc en los nódulos caulinares del arbusto tropical Gunnera (28).

1.2.5. Mixobacterias Las mixobacterias son organismos sociales cuyas células son flexibles y no tienen una pared celular rígida, generalmente están embebidas en un limo espeso. Al desplazarse segregan un material mucoso extracelular que se convierte en grandes avenidas por donde avanzan miles de células. El movimiento es muy coordinado. Cuando la población emigra sobre el agar, se desplaza como una unidad indivisa. Incluso las especies que entran en letargo como esporos unicelulares, exhiben hábitos sociales durante buena parte de su ciclo vital. Muchas de ellas nunca se presentan aisladas, por el contrario, entran en una etapa de letargo en forma de cisto pluricelular que luego germina y libera una nueva población de millares de mixosporos (29). Las mixobacterias son organismos del suelo y los cuerpos fructíferos se encuentran sobre material vegetal en descomposición o estiércol. Algunas, como Myxococcus, forman cuerpos fructíferos como gotitas con

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Leonor Carrillo. 2003. Microbiología Agrícola. capítulo 1 menos de 1 mm de diámetro. Otras, como Sporocytophaga forman además de los bacilos delgados, unas células ovales como esporos llamadas microcistos. Pero Cytophaga no forma ni microcistos ni cuerpos fructíferos (12). En el conjunto de la población de mixobacterias se dejan sentir ondas pulsátiles rítmicas. Las oleadas de mixobacterias que se acercan al centro o se alejan hacia el borde de la colonia en crecimiento, forman agregados en puntos específicos para construir los cistos o, en algunas géneros como Chondromyces, complejos cuerpos fructíferos. La producción de estas estructuras responde a cambios físicos y nutricionales en el ambiente. Las células perciben estos cambios y transforman esta percepción en una serie de hechos que implican agregación, construcción del cuerpo fructífero pluricelular y la conversión de las células alargadas en mixosporos redondos, resistentes y metabólicamente en reposo. Durante estos procesos monitorean la densidad celular, controlan el cronometrado de una serie de acontecimientos evolutivos, emprenden comportamientos tácticos, sufren autólisis evolutiva y se orientan en el espacio tridimensional (29). Las mixobacterias depredadoras se alimentan segregando enzimas en los huecos de las colonias para evitar su dilución en el medio acuoso, que disuelven la cubierta celular externa de otros microorganismos. Cuando éstos estallan, las mixobacterias absorben el contenido (22). La figura 12 muestra el diagrama del ciclo de vida de una mixobacteria (Myxococcus xanthus) .

1.3. Organismos eucarióticos Los cromosomas eucarióticos están asociados a una clase de proteínas básicas llamadas histonas, y experimentan movimientos en el momento de la división celular. Como en los procariotas, la información contenida en el ADN es transportada por los ARN mensajeros del núcleo hacia el citoplasma, donde esta información es descodificada y da lugar a la síntesis de las proteínas en los ribosomas (14). Una célula eucariótica contiene orgánulos definidos por membranas que cumplen funciones esenciales, tales como las mitocondrias (producción la energía), el retículo endoplásmico (síntesis de proteínas en los ribosomas adheridos), el aparato de Golgi o dictiosoma (síntesis y almacenamiento de glicoproteínas), y en algas los cloroplastos (fotosíntesis) (12). Las proteínas son dirigidas hacia la ruta secretora por una secuencia terminal (señal péptido) que es reconocida por una partícula reconocedora de la señal. Después de la unión del complejo ribosoma-partícula a la membrana del retículo endoplásmico, el traslado continúa y el polipéptido naciente llega al lumen del retículo endoplásmico donde una endoproteasa específica quita la señal y, tiene lugar el ensamblaje (plegado y formación de puentes disulfuro) y la N-glicosilación de la proteína. Después las proteínas dejan el retículo endoplásmico en vesículas y son transportadas al aparato de Golgi donde ocurren ulteriores modificaciones. De allí salen las proteínas para sus diversos destinos, otra vez en vesículas, hacia la membrana citoplasmática (secreción) o los lisosomas (digestión de moléculas) (24). La mayor parte de la energía obtenida por la oxidación de glucosa y ácidos grasos es transformada en energía química utilizable por la célula mediante la síntesis del trifosfato de adenosina (ATP) en la cadena respiratoria. Estas reacciones ocurren en las mitocondrias. Tienen dos membranas, la interna está invaginada en crestas. Los pliegues contienen los componentes de la cadena de transporte de electrones y la ATP sintasa. También un pequeño número de proteínas es sintetizado en los ribosomas de la matriz mitocondrial, la que contiene también su propio ADN pues estos orgánulos están dotados de la capacidad de multiplicarse (30). Todas las estructuras se desplazan por el citoplasma a lo largo de pequeños tubos huecos, los microtúbulos, que son polímeros de tubulina nucleados por el centrosoma

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(31). La organización de los microtúbulos en flagelos y cilios, permite a algunos

eucariotas unicelulares nadar en el medio en que se encuentra (32).

1.3.1. Mohos Los mohos se caracterizan por tener núcleo verdadero, carecer de pigmentos fotosintéticos, poseer micelio con pared celular constituida por glucanos, quitosano y quitina (polímeros de glucosa, glucosamina y N-acetil-glucosamina, respectivamente) (7). En pocas ocasiones la pared está constituida enteramente de quitina. La pared celular del micelio de los hongos semeja un extenso sistema tubular por el que avanza protegido el citoplasma para su dispersión y búsqueda de nutrientes (1). Los elementos somáticos tubulares que constituyen el micelio reciben el nombre de hifas. Las hifas pueden estar separadas en secciones, generalmente multinucleadas, por medio de septos perforados o bien carecer de ellos. Los hongos pueden reproducirse tanto sexual como asexualmente. Los hongos asexuales (anamorfos) generan varias clases de esporas asexuales por mitosis del núcleo celular (mitosporas) (33). La morfología de las estructuras que contienen las esporas es muy variable y constituye una de las bases de la clasificación de los hongos. El micelio somático no es suficientemente discriminador para utilizarlo en la clasificación. El color de muchos mohos que viven en la materia orgánica en descomposición se debe al color de sus esporas asexuales. Éstas presentan varias tonalidades de color blanco, amarillo, azul, verde, rojo, pardo o negro (7). Los mohos generan varias clases de esporas asexuales, mono o pluricelulares. Las esporas se desarrollan en los esporóforos, estructuras especializadas que se extienden en el aire a partir del micelio vegetativo, y las esporas se acumulan en el extreno superior de los mismos. Si las esporas están encerradas en un esporangio (en forma de bolsa) se las llama esporangiosporas. Los conidios son esporas externas o sea no están encerradas. Al madurar, estas esporas son esparcidas por el viento. Muchos mohos pueden reproducirse también a través de esporas sexuales, generadas por meiosis, o división reductora, de un núcleo diploide (meiosporas). En la meiosis, el número de cromosomas se divide por la mitad. Las esporas sexuales contienen sólo un cromosoma de cada par homólogo. La condición diploide se restablece cuando dos estructuras haploides se unen, completando el ciclo vital. Los mohos a los que no se les conoce ciclo sexual, se consideran hongos imperfectos (33). Los mohos con estructuras reproductoras sexuales (teleomorfos) corresponden a tres grupos: ascomicetos, basidiomicetos y zigomicetos. Los ascomicetos producen sus esporas en ascos, que generalmente se forman dentro de un complejo cuerpo fructífero, el ascoma. De forma similar, los basidiomicetos desarrollan sus esporas sexuales externamente, en los basidios que se hallan en un complejo cuerpo fructífero: el basidioma. Pero este grupo también comprende a los carbones y las royas, organismos de interés agronómico por ser parásitos vegetales. Los zigomicetos producen zigosporas a veces visibles a ojo desnudo. En condiciones naturales, los mohos se reproducen en la mayoría de los casos asexualmente, las estructuras reproductoras sexuales sólo aparecen ocasionalmente en circunstancias favorables (33). La figura 13 muestra un moho (Rhizopus stolonifer).

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1.3.2. Levaduras La mayoría de la numerosas especies de levaduras se han clasificado desde el punto de vista de la reproducción, que puede ser sexual o asexual. En la reproducción vegetativa, generalmente, una célula madre da lugar a diversas células hijas por la formación repetida de yemas en la superficie celular; en unas pocas levaduras la división asexual se hace por escisión celular luego de la duplicación del núcleo (34). Tres grupos de hongos acogen a las levaduras: los ascomicetos, los basidiomicetos y los hongos imperfectos. El primer grupo incluye las levaduras cuyas estructuras reproductoras sexuales son o l s ascos sencillos que contienen ascosporas. Una célula diploide de levadura sufre meiosis y forma de cuatro a ocho ascosporas, encerradas en el asco. Una ascospora es una célula haploide que al germinar genera una progenie de células haploides por mitosis (reproducción asexual). Las células de diferente polaridad sexual se combinan para formar un nuevo organismo diploide. Entre las levaduras que pertenecen a los ascomicetos se encuentra Saccharomyces cerevisiae empleada para la fabricación del pan y la fermentación alcohólica. Los basidiomicetos agrupan un número reducido de levaduras. Los hongos imperfectos incluyen levaduras que se reproducen sólo de forma asexual, ej. Candida tropicalis (7). En la figura 14 se muestra el aspecto de una levadura que se divide por escisión y forma meiosporas.

1.3.3. Macromicetos Son hongos con cuerpos fructíferos (ascoma o basidioma) que se miden en centímetros. Entre ellos son de interés los que forman asociaciones simbióticas con árboles (ectomicorrizas), por ej. Amanita, Boletus, Cortinarius, Lactarius, Russula, Scleroderma, Suillus, Tricholoma, y los que crecen sobre troncos descomponiendo la madera, por ej. Schyzophyllum, Polyporus, Coriolus, Xylaria (35). La figura 14 también muestra una seta venenosa.

1.3.4. Mixomicetos Los mixomicetos son organismos eucarióticos mucosos que forman plasmodio y luego un cuerpo fructífero de colores destacados, sobre troncos y hojas en descomposición o postes viejos, de 0,5 a 1 cm (36). La asociación celular en los hongos mucilaginosos está mediada por la interacción entre proteínas unidas a carbohidratos de una célula y receptores formados por oligosacáridos específicos de otra. De este modo, la diferenciación de los hongos mucilaginosos desde una forma somática (unicelular) hasta la forma cohesiva (agregada) va acompañada de la aparición de lectinas y glicoproteínas específicas en la superficie celular (17). Las esporas liberadas de los cuerpos fructíferos germinan sobre una superficie húmeda y producen mixoflagelados que nadan o bien mixamebas. Éstos se alimentan de los nutrientes líquidos o por fagocitosis de bacterias, levaduras, esporas fúngicas, etc. Las células flageladas pierden luego su flagelo y

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entran en un estado ameboide. Estas células son mononucleadas. Ocasionalmente se fusionan en pares para dar mixozigotos. Estas amebas diploides se fusionan para dar un plasmodio (estructura multinucleada). Luego el plasmodio da origen al cuerpo fructífero o esporangio con numerosos esporas haploides (33). La figura 15 muestra las estructuras de un mixomiceto.

1.3.5. Protozoos Los protozoos constituyen un grupo muy heterogéneo de microorganismos eucarióticos, unicelulares y móviles (con algunas excepciones). El ciclo de vida comprende dos fases: una de actividad, durante la cual se desplazan, nutren y reproducen; otra de reposo o enquistamiento. Se alimentan de bacterias, levaduras, algas y otros protozoos. Se los agrupan en: rizópodos que se desplazan por pseudópodos (amebas y testáceos o foraminíferos), flagelados con uno o más flagelos, ciliados dotados de cilias y dos núcleos, y esporozoos parásitos. Se observa un esquema de los mismos en la figura 1 y 16. La población de flagelados y amebas es del orden de 103 - 10 5 por gramo de suelo, la de ciliados 103/g y la de rizópodos testáceos 10 3 - 104 /g. Participan en el equilibrio biológico del suelo pues consumen grandes cantidades de bacterias, una ameba ingiere unas 40.000 bacterias entre cada división celular (4).

1.3.6. Algas Son organismos fotosintéticos eucarióticos. Las algas del suelo viven en la proximidad inmediata a la superficie o sobre la misma. Predominan, arriba las diatomeas y abajo las clorofíceas y xantofíceas ubicuas. La humedad óptima es del 40 al 60% de la capacidad de retención del agua por el suelo. Las algas libres o liquenizadas constituyen el estado inicial de la vegetación rocas y suelos minerales infértiles (4). En la figura 17 se muestra un alga roja del suelo.

1.3.7. Líquenes

Un líquen está constituído por un hongo (el micobionte) junto con una o más algas y/o cianobacterias (el fotobionte) viviendo en una relación simbiótica y formando un cuerpo estable e identificable (39). La figura 18 muestra una rama con varios líquenes.

1.4. Organismos acelulares 1.4.1. Virus Un virus es un programa genético que lleva de una célula a otra el mensaje "reprodúceme". Consiste de un ácido nucleico y una cubierta proteínica conocida como

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Leonor Carrillo. 2003. Microbiología Agrícola. capítulo 1 cápside, a veces también tiene una envoltura. Hay muchas clases de virus y se los puede agrupar por el tipo de material genético que portan. Algunos tienen una molécula de ARN monocatenario (cadena "más") compuesto por varios miles de subunidades nucleotídicas, que puede ser leído directamente por el aparato de traducción del hospedador, el ribosoma, como si fuera un ARN mensajero propio. Un ejemplo de este tipo de virus es el del mosaico del tabaco. Otros virus, por ej. el de la rabia, cifran sus mensajes en cadenas "menos" de ARN, las que en el interior de la célula deben transcribirse en cadenas complementarias de tipo "más" para que empiece la replicación. Los retrovirus constituyen una tercera clase de virus de ARN monocatenario. Cuando un retrovirus infecta a una célula, la enzima retrotranscriptasa transforma la cadena de ARN vírico en ADN monocatenario y éste es copiado por la ADN-polimerasa celular a ADN bicatenario que puede integrarse al genoma del hospedador. Los reovirus, patógenos de plantas y animales, tienen ARN bicatenario. Ejemplos de virus con ADN monocatenario son los inovirus y con ADN bicatenario los miovirus, ambos patógenos de bacterias (39). Un fago (virus que infecta a bacterias) posee una sola molécula de ácido nucleico que se inyecta en la célula bacteriana. La figura 19 muestra la forma de un tipo de bacteriófago. En la figura 20 se observa el ciclo de un fago lambda con ADN bicatenario lineal cuyos extremos se unen una vez dentro de la bacteria y los genes dispuestos sobre ese anillo dirigen la síntesis de las proteínas víricas, valiéndose de la maquinaria bacteriana de síntesis. Parte de las proteínas son enzimas implicadas en la replicación del ácido nucleico del fago, tarea que realizan en conjunción con enzimas de la propia bacteria. El virus se reproduce, es decir fabrica nuevas moléculas de ADN y proteínas de la cápsula. Los nuevos ADN se introducen en las cápsulas recién formadas y el hospedador acaba lisándose (40). Por otra parte, el fago puede insertarse en el ADN de la bacteria hospedadora. En el estado integrado, el ADN del fago es replicado junto con el ADN bacteriano y no se expresa la información contenida en el primero. Este fago no infeccioso, que puede pasar de célula en célula por herencia, se denomina profago. La excisión del fago en la célula lisogénica le devuelve la virulencia. Otra forma de agrupar los virus es por la forma. Se llama nucleocápside al ácido nucleico (o virión) con la cápside,

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y puede estar desnuda o recubierta por una membrana. Una cápside consta de capsómeros, y en la mayoría de los casos es simétrica. Se observan dos tipos de estructuras simétrícas: helicoidal e icosahédrica (12). En la figura 21 se muestra la forma de algunos virus.

1.4.2. Viroides Los viroides son más sencillos que los virus, pues son sólo filamentos muy cortos de ARN. Producen enfermedades específicas de las plantas (42).

1.4.3. Priones Se llama así a las proteínas que actúan como agentes infecciosos en algunas enfermedades del sistema nervioso de ovejas, vacas y otros animales (43), pero es discutible si se pueden considerar microorganismos.

1.7. Transferencia genética en bacterias En una bacteria la información genética está codificada en una molécula de ADN larga y muy plegada para caber en la célula. El cromosoma bacteriano circular tiene al menos un milímetro de largo. La doble hélice formada por dos cadenas de nucléotidos consta de varios millones de pares de bases y la información total de la bacteria se despliega en un conjunto de varios miles de genes estructurales. En los procariotas y eucariotas la clave genética y la bioquímica esencial de la transcripción y la traducción son las mismas, pero no así las señales de control. En las bacterias la información genética codificada en un segmento contínuo de la doble hélice de ADN, que constituye el gen estructural, se transcribe directamente en un ARN mensajero cuya traducción da lugar a una proteína, generalmente una enzima (44). Antes de que una célula bacteriana se divida (transferencia vertical) ha de duplicarse su ADN (figura 22). Durante la replicación del ADN se separan los pares de bases al alejarse ambas cadenas helicoidales. Las ADN polimerasas copian cada una de las hebras. Mientras se va construyendo la nueva hebra, ésta se empareja con la que le sirve de molde. Pueden darse errores de replicación por corrimiento cuando alguna de las hebras se desliza y establecen un emparejamiento inadecuado. En cada tanda de división bacteriana asexual habrá alguna célula que porte una mutación. La mutación altera los genes de un microorganismo. La recombinación reoordena los genes o parte de los mismos, y agrupa en un mismo individuo la información genética de dos o más organismos (44). Los tres mecanismos principales de intercambio horizontal de material genético entre bacterias son: conjugación, transformación y transducción. En todos estos procesos se transfiere ADN de la célula donadora a la receptora, pero difieren en la manera en que es transportado. La transferencia es seguida por la recombinación y así el ADN de la

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Leonor Carrillo. 2003. Microbiología Agrícola. capítulo 1 bacteria donadora se integra al de la receptora. El intercambio de genes en las bacterias no está confinado dentro de una especie o especies afines, acontece entre bacterias de géneros o familias diferentes. La recombinación homóloga ocurre cuando los ADN que poseen secuencias de bases similares, se reúnen e intercambian segmentos mediante la rotura y ensamblaje de las cadenas. Otra forma de recombinación que añade nuevas porciones al ADN que ya posee el microorganismo, es la específica de sitio y requiere solo pequeños fragmentos de ADN homólogo para el reconocimiento. Cuando ambos ADN poseen una secuencia de reconocimiento se habla de recombinación específica de sitio doble, por ejemplo la inserción de un fago. Si solamente una molécula de ADN transporta esa secuencia la recombinación específica de sitio es simple y permite la inserción de una secuencia mediante la transposición (12). Ambientes en los que ha observado transferencia genética horizontal (41)

Ambientes Terrestres Acuáticos

Interior de organismos

Transducción Suelos, superficies de plantas Lagos, océanos, ríos, zonas de tratamiento de aguas residuales

Crustáceos, ratones

1.7.1. Conjugación

Conjugación Suelos, superficies de plantas Lagos, océanos, sedimentos marinos, ríos, epiliton (capas gelatinosas que recubren las piedras de los ríos), zonas de tratamiento de aguas residuales Plantas, insectos, gallinas, ratones, humanos

Transformación Suelos Sedimentos marinos, ríos, epiliton de las piedras de los ríos

Plantas, insectos, ratones

Se descubrió cuando se mezclaron mutantes nutricionales (auxotróficos) con diferentes requerimientos de la bacteria Gram-negativa Escherichia coli y crecieron sobre un medio mínimo siendo que, separadamente, necesitaban un suplemento de determinados nutrientes para poder multiplicarse. Los genes silvestres de una cepa completaron los genes mutados de la otra (figura 23). Este proceso requiere el contacto entre las células y se transfiere el factor sexual F (fertilidad) que es una molécula pequeña de ADN circular de doble cadena (plásmido) desde la célula donadora (F+) a la receptora (F-). Las células donadoras tienen en la superficie los pelos de conjugación (pili F) que sirven para facilitar el contacto (figura 24). La presencia de un plásmido altera la capacidad para sintetizar el pelo F y el desplazamiento del ADN para su transferencia a otra célula, además modifica los receptores superficiales.

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Sólo unas pocas bacterias F+ pueden transferir ADN cromosomal. Son las que tienen el factor F integrado al cromosoma. Tales bacterias, llamadas Hfr, transfieren sus genes con una frecuencia muy alta. Durante la transferencia el ADN bacteriano se replica a partir del punto de inserción del factor F y la cadena recién formada entra en la célula aceptora. Este proceso es seguido de la recombinación homóloga del ADN de ambas células dentro de la bacteria receptora (figura 25). La introducción de unas cuantas bacterias con plásmidos en una población receptora, puede convertirla en portadora de plásmidos en poco tiempo (45). En las bacterias Gram-positivas la conjugación no está mediada por pili. Antes del intercambio genético, la célula receptora secreta substancias que estimulan la síntesis de proteínas aglutinantes por las potenciales donadoras. Una vez que las bacterias se asocian, se forman los poros necesarios para la transferencia del ADN (41).

1.7.2. Transformación Algunas bacterias pueden captar ADN desnudo, por ejemplo las células de una colonia rugosa de Streptococcus pneumoniae al ser mezcladas con el ADN de una cepa virulenta con colonias lisas adquieren la cualidad de producir colonias lisas. La transformación suele ocurrir tanto en bacterias Gram-positivas como en Gram-negativas, y es utilizada para introducir genes extraños en una bacteria (12). Un fragmento de ADN se puede insertar en un plásmido pequeño especializado conocido como vector de clonación usando una enzima específica. Este ADN recombinante se usa para transformar las bacterias que crecerán luego en un medio selectivo apropiado para detectarlas. La capacidad de aislar ADN de un organismo e inducir su incorporación en otro no relacionado constituye el fundamento de una de las manipulaciones del ADN recombinante (figura 26). El plásmido sirve así de vector para genes que no tienen equivalente en el organismo receptor y que, por lo tanto, no podrían heredarse de forma estable mediante recombinación homóloga. Estos genes pueden así transmitirse a través de generaciones sucesivas conforme el plásmido va replicándose (44). Pero a veces la bacteria pierde el plásmido espontáneamente. La mayoría de las especies de rizobios, bacterias de gran importancia agronómica, contienen plásmidos con la información genética para la simbiosis en leguminosas (46).

1.7.3. Transducción

Los genes bacterianos se pueden transferir de una cepa a otra usando bacteriófagos como vectores (figura 19), pero este fenómeno no ocurre en todas las especies de bacterias. Según el comportamiento del bacteriófago la transducción puede ser:

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a) general o inespecífica

Comúnmente el bacteriófago se replica dentro de la célula que infecta y con la ruptura de la misma se liberan las nuevas partículas víricas. Estas partículas infectan otras células completando el ciclo de lisis. Ocasionalmente durante el proceso lítico el genoma bacteriano se fragmenta y algunos segmentos pasan a formar parte del nuevo bacteriófago. Éstos suelen carecer de parte de su propio genoma, pero aunque defectuosos son capaces de infectar nuevas bacterias y dejarles la porción de ADN bacteriano que transportan. Este ADN suele recombinarse con el genoma de la célula infectada (figura 27). La porción de genoma bacteriano transportada por bacteriófagos es por lo general menor que 1% del ADN total. La mayoría de las partículas víricas son normales y no participan en la transducción (12). b) especializada

Los bacteriófagos moderados también son capaces de formar una relación estable con sus hospedadores. Luego de la infección suelen incorporarse al genoma bacteriano como profago. Éste suele codificar otras funciones además de las específicas del bacteriófago, por ejemplo la producción de toxinas. La bacterias que albergan profagos se llaman lisogénicas (figura 20). Los profagos suelen vivir en armonía con su hospedador hasta que una situación de stress ambiental induce el ciclo lítico. Cuando el bacteriófago se escinde del genoma bacteriano puede acarrear una porción de este último. Estos fagos defectuosos invaden nuevas bacterias. La integración al genoma de la célula hospedadora es esencial para la trasferencia de los genes. Como cada profago tiene un particular lugar de inserción en el genoma de la bacteria, solamente los

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genes adyacentes pueden ser transferidos por este proceso (12 ). La transposición es la recombinación que presentan los transposones o las secuencias de inserción. Las secuencias de ADN cambian de lugar en el genoma y se insertan en una región que no guarda homología con ella. Si esta integración sucede dentro de un gen se produce una mutación, pues se rompe la continuidad de la información codificada (47).

1.7.4. Fusión de protoplastos Las barreras naturales a la recombinación entre organismos diferentes pueden romperse a menudo mediante la preparación de protoplastos, células bacterianas cuyas paredes externas se han eliminado poniendo al descubierto la membrana celular. Como las membranas celulares poseen aproximadamente la misma composición en la mayoría de los organismos, puede inducirse la fusión de protoplastos de especies distintas, formando un célula híbrida en la que los genes quedan expuestos a la recombinación (figura 28). También es una técnica eficaz para aumentar la frecuencia de recombinación intraespecífica en los que el apareamiento natural es raro. La operación se lleva a cabo en una solución cuya presión osmótica equilibra la presión interior de las células, para que no estalle la membrana celular. Después se induce la regeneración de la pared de los protoplastos híbridos y se obtiene un cultivo normal (44).

Referencias 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18. 19. 20. 21. 22.

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2. Vida y muerte de los microorganismos 2.1. Crecimiento Es el incremento ordenado de todos los componentes de la célula viva, arribando a la duplicación de todas las estructuras, orgánulos y componentes celulares, así como la biogénesis de mitocondrias y cromoplastos cuando ciertos microorganismos se ven súbitamente expuestos a las condiciones en que dichos orgánulos son esenciales. En la mayoría de los organismos unicelulares, la reproducción es consecuencia del crecimiento y lleva al incremento en el número de individuos de la población, mientras que en los pluricelulares el crecimiento conduce al aumento del tamaño del organismo (1). La figura 1 muestra una curva general del crecimiento de un microorganismo unicelular . Después de la inoculación de una porción de medio con unas pocas células, transcurre un período de tiempo (fase de latencia) antes de que se establezca una velocidad constante de crecimiento, debido a que el microorganismo tiene una intensa actividad metabólica para adaptarse al nuevo medio de cultivo antes de poder duplicarse. Cuando el cultivo alcanzó una velocidad constante de crecimiento se dice que está en la fase exponencial debido a que el número de células se puede expresar como función de 2n, donde n es el número de ciclos de duplicación experimentado por la población (3). Una bacteria originará cuatro células (2 2 ) después de dos ciclos, dieciseis (24 ) después de cuatro ciclos, etc. Cada célula de bacteria o levadura da, por escisión o gemación, dos células y el número inicial X o de células (en el instante to=0) se convierte, después de n generaciones en un tiempo t, en X = X o. 2n Como n representa el número de divisiones celulares durante el intervalo de tiempo t, el tiempo de generación g = t/n, y X = Xo.2t/g o sea ln X = ln X o + t.ln 2/g * El término ln 2/g es la velocidad específica de crecimiento (µ) de la población o sea µ = 0,69/g La ecuación * puede escribirse bajo la forma lnX

- lnX o = µ.t por lo tanto X = X o.eµt

y dX/dt = µX En el curso de la fase exponencial la velocidad específica de crecimiento alcanza su valor más elevado (µmáx).

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Leonor Carrillo. 2003. Microbiología Agrícola. Capítulo 2 En condiciones ideales el tiempo de generación de las bacterias puede ser de 20 minutos, de esta forma una única célula producirá 2.097.152 bacterias al cabo de 7 horas. Finalmente el cultivo entra en la fase estacionaria del crecimiento, en la que permanece constante el número de células. Esta fase puede durar mucho tiempo, por ejemplo décadas en el caso de las bacterias endosporuladas, pero siempre será seguida, más temprano o más tarde, por la fase de muerte (3). En los estudios de la cinética del crecimiento individual de los microorganismos pluricelulares, tales como actinomicetos y mohos, se observó que: a) la velocidad de extensión de las hifas cortas es proporcional a la longitud de las mismas y a la velocidad específica de crecimiento, es decir que estas hifas pueden crecer exponencialmente; b) cada ápice hifal puede extenderse a una velocidad independiente de la velocidad de aumento de la biomasa; c) cuando la capacidad de la hifa para extenderse supera las posibilidades brindadas por los puntos de crecimiento existentes, se generan otros nuevos (ramificación) (4).

2.2. Tipos de nutrición Los organismos fotosintéticos y los que obtienen energía por oxidación de compuestos inorgánicos suelen usar generalmente CO2 como fuente única o principal de carbono (autótrofos). Pero, la mayoría de los microorganismos del laboratorio son heterotróficos, es decir necesitan fuentes de carbono orgánico y nitrógeno asimilables, así como sales minerales y en ciertos casos vitaminas. Pueden sintetizar todos sus constituyentes celulares a partir de un único compuesto orgánico que sirve tanto de fuente de carbono y de energía, y de una fuente inorgánica u orgánica de nitrógeno (1). Metabolismo energético de los microorganismos (1) tipo de organismos dependientes de fotótrofos radiación solar fotolitótrofos= autótrofos dadores de electrones inorgánicos fotoorganótrofos dadores de electrones orgánicos quimiótrofos compuestos químicos quimiolitótrofos= autótrofos oxidación de compuestos inorgánicos quimioorganótrofos= heterótrofos oxidación o fermentación de compuestos . orgánicos Algunas bacterias, por ejemplo Azotobacter que vive libre en el suelo, y Rhizobium que crece como simbionte en los nódulos de la raíz de leguminosas, así como cianobacterias, pueden fijar el nitrógeno gaseoso de la atmósfera, es decir reducirlo convirtiéndolo en nitrógeno orgánico. Por otra parte, las formas parásitas obligadas obtienen del hospedador los complejos constituyentes de su materia viva (5). En tanto que los sulfatos pueden ser utilizados por casi todas las bacterias y hongos, los nitratos son a menudo menos adecuados como nutrientes. Sin embargo, la mayoría de los microorganismos hace uso del amonio como fuente única o principal de nitrógeno. Sin embargo, algunas bacterias requieren fuentes de azufre reducido, tal como sulfuro o tiosulfato. Los organismos vivos necesitan también muchos otros elementos, como fósforo, potasio, magnesio, manganeso, calcio, hierro, cobalto, cobre, cinc y molibdeno (1)

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2.3. Factores de crecimiento Son los compuestos, necesarios en pequeña cantidad, que debe suministrar el medio para que tenga lugar el crecimiento de algunos microorganismos. Los organismos que requieren un determinado factor de crecimiento son auxotróficos para ese compuesto. Por ejemplo, Lactobacillus arabinosus crece normalmente en presencia de 10 -4 µg/mL de biotina, pero no en ausencia de esta vitamina (6).

2.3.1. Factores orgánicos

Algunos microorganismos carecen de la capacidad de sintetizar ciertos aminoácidos, nucleótidos o vitaminas. Éstos son generalmente aportados por los extractos de levadura y carne, agregados al medio (3). A veces son adicionados en cantidades demasiado elevadas interfiriendo en el metabolismo microbiano, por ejemplo, las células de Corynebacterium glutamicum cultivadas en un medio rico en biotina no excretan ácido glutámico, mientras que si son suspendidas en un medio pobre en biotina ocurre lo inverso. Generalmente los microorganismos requieren L-aminoácidos, por ejemplo Leuconostoc mesenteroides, pero algunas bacterias necesitan D-alanina (6). Vitaminas del grupo B ácido nicotínico (niacina) ácido pantoténico riboflavina (B2 ) ácido fólico biotina cobalamina (B12 ) piridoxal- piridoxina (B6 ) tiamina (B1 )

Función (1) precursor de piridín-nucleótidos (NAD y NADP) “ “ coenzima A “ “ flavín-nucleótidos (FMN, FAD) participa en transferencia de grupos metilo “ “ biosíntesis de ácidos grasos, fijación de CO2 “ “ síntesis de desoxirribosa y transferencia de restos monocarbonados “ “ transformaciones de aminoácidos y cetoácidos “ “ α-descarboxilaciones

2.3.2. Factores minerales La ausencia total de metales comporta la muerte o enfermedades carenciales en todos los seres vivos, pero todo es cuestión de dosis pues, el efecto es beneficioso hasta un cierto nivel, traspasado el cual se observan trastornos fisiológicos. Algunos elementos esenciales, por ejemplo cinc, cobre, cobalto, hierro, molibdeno, son necesarios para la actividad de enzimas específicas (1). Además, algunos seres vivos tienen requerimientos minerales especiales, como el silicio que es parte esencial de la pared celular de las diatomeas (7).

2. 4. Transporte de solutos El transporte de nutrientes a través de la membrana citoplasmática es específico porque son captados por la célula solamente aquéllos para los cuales existe un sistema transportador. Existen dos tipos principales de transporte. El primario comprende los procesos que conducen a la transferencia de iones (H +, Na+, K +) produciendo alteraciones en el potencial electroquímico. Las fuerzas que intervienen son el transporte de electrones respiratorio o fotosintético, o las bombas iónicas dependientes del ATP o de la descarboxilación de metabolitos. El transporte secundario está guiado por gradientes en el potencial electroquímico (9). La difusión pasiva o simple esté gobernada por el tamaño molecular y las propiedades lipofílicas del material, permitiendo la entrada de agua, toxinas no-polares y ciertos inhibidores. La difusión facilitada se lleva cabo debido a la presencia de una

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Leonor Carrillo. 2003. Microbiología Agrícola. Capítulo 2 permeasa específica para el substrato y depende de la concentración de substrato en el medio. El nutriente no puede ser acumulado dentro de la célula. El transporte activo y la trasladación del grupo se parecen a la anterior en que participan proteínas específicas y difieren en que necesitan la provisión de energía. El nutriente puede ser acumulado dentro de la célula. En el transporte activo la molécula liberada en el interior de la célula es idéntica a la del exterior, mientras que en la trasladación del grupo la molécula fue modificada durante el transporte, por ejemplo por fosforilación en el caso de un azúcar (9). Se distinguen diferentes procesos de transporte activo según la vía por la cual se dispone de la energía necesaria: potencial protón, ATP o fosfoenolpiruvato. El transporte de muchas substancias (azúcares, iones inorgánicos y orgánicos) es empujado por el potencial protón, La célula bacteriana mantiene dicho potencial por bombeo constante de protones y otros iones (Na+) al exterior, en el cual intervienen proteínas de transporte localizadas en la membrana (9). Cada una de estas proteínas tiene una función específica. Por ejemplo, una proteína cataliza el transporte simultáneo de una molécula de azúcar (lactosa, melibiosa o glucosa) y un protón en la misma dirección, lo que se conoce como un simporte de dos (a veces más) substancias. Otras proteínas catalizan el transporte simultáneo de dos substancias en direcciones opuestas, por ejemplo un protón y otro ión (Na+ o un ácido orgánico), lo que se llama antiporte, como se muestra en la figura 2. En las células procarióticas la entrada de azúcares a la célula es favorecida por un simporte acoplado a H +, mientras que en las eucarióticas está casi siempre acoplado a Na+. Además de los sistemas de transporte que dependen del potencial de la bomba de protones hay otros que dependen del ATP, donde intervienen las proteínas del espacio periplásmico en las proteobacterias (8) . Cuando el transporte ocurre mediante trasladación de grupos, la molécula transportada es modificada químicamente. Por ejemplo, la glucosa (manosa, fructosa u otro azúcar) es captada por el sistema fosfotransferasa dependiente del fosfoenolpiruvato y se libera en el interior glucosa-6-fosfato (ver figura 2). En condiciones aerobias y a pH 7,0 la concentración del Fe+++ es a lo sumo 10 -18 moles/L pues se forma el hidróxido férrico casi insoluble, por lo que algunas bacterias excretan substancias que tienden a solubilizar al hierro formando complejos con Fe+++ que permitan transportado. Tales substancias se denominan sideróforos y son compuestos fenólicos e hidroxamatos (9). La levadura de cerveza posee distintos sistemas específicos para la captación de cada ión metálico (Cu++, Fe+++, Mn+, Zn++). En el caso del hierro primero es reducido a

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Fe++ por las reductasas de la membrana citoplasmática, luego interviene un sistema de baja afinidad para su incorporación a las células con hierro, pero cuando hay una deficiencia limitante del crecimiento actúa otro sistema de captación de alta afinidad. La levadura también tiene dos sistemas de captación para la incorporación de manganeso. Por otra parte, en algunas bacterias patógenas la virulencia depende de la capacidad del microorganismo para obtener iones metálicos del hospedador. El conocimiento de los genes que generan los sistemas de captación de iones metálicos de los microorganismos permite obtener vegetales transgénicos que aprovechan mejor los nutrientes del suelo o secuestran metales tóxicos como, por ejemplo unas plantas donde se había expresado un gen que les posibilitó convertir el Hg++ en Hgo (11).

2.5. Factores ambientales El suelo, o material de la superficie terrestre en el que se sustenta la vida vegetal, es uno de los sitios más dinámicos en interacciones biológicas de la naturaleza. Comprende organismos vivos, minerales disgregados, agua, aire y materia orgánica muerta. El agua y el aire representan aproximadamente la mitad del volumen del suelo (12).

2.5.1. Agua y presión osmótica

La disponibilidad de agua en el ambien te se expresa indirectamente en términos de

actividad del agua (aw), la que se define como la razón entre la presión de vapor de

agua del substrato o solución (p ) y la presión de vapor del agua pura (po) a la misma temperatura, es decir, aw = p/p o Este concepto se asocia al de humedad relativa de la atmósfera en equilibrio con el sistema, de la siguiente manera HRE = aw . 100 La mayor parte de las bacterias no crecen a una a w por debajo de 0,91 mientras que los mohos pueden desarrollarse con cifras de 0,80. Los valores más bajos obtenidos para arqueobacterias halófilas son del orden de 0,75 mientras que los mohos xerófilos (amantes de la sequedad) y las levaduras osmófilas (que prefieren presiones osmóticas elevadas) se multiplican muy lentamente aún con valores de 0,65 y 0,60 respectivamente. Los límites de aw dentro de los cuales hay crecimiento, son más amplios a la temperatura óptima de multiplicación. La capacidad de los organismos para crecer a una temperatura dada, disminuye a medida que se reduce al aw . La presencia de ciertos elementos nutritivos amplía los límites de aw dentro de los cuales los organismos pueden sobrevivir (3). La presión osmótica (θ) está relacionada con la actividad del agua a través una

expresión

θ = -RT.ln aw/v que comprende a la constante de los gases (R ), la

temperatura absoluta (T), el logaritmo natural de la actividad del agua (aw) y el volumen molar parcial del agua (v ) (3). El potencial agua de un suelo ψ es la suma de los potenciales osmótico, matricial (o capilar) y gravitacional. La humedad relativa de la fase vapor en equilibrio con el suelo es también una medida indirecta del potencial agua. El potencial osmótico de la solución del suelo (π ) puede expresarse mediante la

π = -RT ρ υ m φ /109 donde ρ es la densidad del agua, υ los iones por molécula de soluto, m la molalidad, φ el coeficiente osmótico a la molalidad m y la temperatura T°K. El potencial matricial (τ) está dado por la ecuación τ = (RT ρ ln p/p o) /106 M donde M es el peso molecular del agua. ecuación

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El término capacidad de campo se refiere al contenido en agua de un suelo, drenado después de la saturación, cuando la velocidad de la pérdida de agua debida a la gravedad es pequeña. No es una medida precisa (12). Las bacterias mantienen siempre su osmolaridad muy por encima de la del medio, y están protegidas por una pared celular capaz de resistir una considerable presión osmótica interna (1). En contraposición a la diversidad de concentraciones de potasio y sodio en los distintos ambientes, los organismos vivos contienen potasio a una concentración más elevada que la del medio externo. Además de neutralizar las cargas negativas de la célula y de regular la función enzimática, el potasio actúa como un soluto implicado en la regulación osmótica de algunos organismos Algunos organismos halófilos que viven en ambientes de alta salinidad sódica, por ejemplo Halobacterium, son la excepción a esta regla (10). Los organismos que son capaces de crecer a elevadas concentraciones de azúcar se denominan osmófilos. Basados en sus respuestas, o tolerancia, a la sequedad los microorganismos se pueden distribuir entre tres grupos definidos por el potencial agua (ψ) óptimo y mínimo para el crecimiento: grupo 1. óptimo –0.1 MPa, mínimo alrededor de –2MPa; contiene algunos hongos y una variedad de bacterias Gram-negativas; grupo 2. óptimo alrededor de –1 MPa, mínimo alrededor –5MPa; contiene principalmente zigomicetos, bacterias Gram-negativas y actinomicetos; grupo 3. óptimo alrededor de –1MPa, mínimo –10 a –15 MPa; contiene una variedad de ascomicetos y basidiomicetos y bacterias Gram-positivas (12).

2.5.2. Tensión superficial

La tensión superficial de los medios de cultivo afecta al desarrollo de un microorganismo. Por ejemplo BaciIIus subtilis tiende a crecer en la superficie a modo de película o velo en los medios corrientes con una tensión superficial entre 57 y 63 dinas, pero si se disminuye a menos de 40 dinas por el agregado de un detergente crece en forma difusa (13). La humectabilidad es función de la tensión superficial. Las soluciones de detergentes pueden penetrar en grietas y espacios muy pequeños e incluso hasta el centro de los agregados de bacterias, donde el agua quedaría por encima sin mostrar penetración alguna.

2.5.3. pH

El pH del medio puede influir sobre la expresión de genes y regular el transporte de protones, la degradación de los aminoácidos, la adaptación a condiciones acídicas o básicas y aún la virulencia. Las células perciben los cambios del pH ambiente a través de diferentes mecanismos. La protonacíón y desprotonación de los aminoácidos inducida por el pH, puede alterar la estructura proteínica secundaria y por lo tanto la función que señala el cambio. La célula puede responder sólo a una de las formas de las moléculas de señal. Por ejemplo, los ácidos orgánicos atraviesan la membrana citoplasmática solamente en la forma protonada y un aumento de la concentración intracelular indicaría un incremento en la acidez ambiental. El gradiente de protones a través de la membrana puede servir, por sí mismo, como un sensor para ajustar los procesos dependientes de la energía (8). El pH intracelular puede ser mantenido sobre un valor crítico en el cual las proteínas internas se desnaturalizan irreversiblemente. En Salmonella typhimurium hay tres mecanismos para mantener el pH interno compatible con la vida: la respuesta homeostática, la respuesta de tolerancia al ácido y la síntesis de proteínas de ‘shock’ acídico (14). A pH ambiental mayor que 6,0 las células bacterianas ajustan su pH interno a través de la respuesta homeostática modulando la actividad de las bombas de protones,

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antiportes y simportes, para aumentar la velocidad a la cual los protones son expelidos del citoplasma. El mecanismo homeostático es constitutivo y funciona en presencia de inhibidores de la síntesis proteica. La respuesta de tolerancia al ácido es iniciada por un pH externo de 5,5 a 6,0. Este mecanismo es sensible a los inhibidores de la síntesis proteica y puede mantener el pH interno por sobre 5,0 teniendo el pH externo valores tan bajos como 4,0. La pérdida de la actividad ATPasa, causada por las mutaciones que desorganizan genes o los inhibidores metabólicos, anula la respuesta de tolerancia al ácido pero no el mecanismo homeostático. Esta respuesta también puede conferir protección cruzada frente a otros agentes ambientales de estrés. La síntesis de proteínas de ‘shock’ acídico es la tercera vía por la que la célula regula el pH interno. Esta síntesis es generada por un pH ambiental de 3,0 a 5,0 proveyendo un conjunto de proteínas reguladoras distintas de las proteínas de la respuesta de tolerancia al ácido.

Bacterias Thiobacillus thiooxidans Azotobacter sp. Erwinia carotovora Clorobium limicola Thermus aquaticus Nitrobacter spp. Hongos Aspergillus oryzae Fusarium oxysporum Penicillium italicum Rhizoctonia solani Botrytis cinerea Aspergillus niger

Rango de pH para el crecimiento (2) límite inferior óptimo 0,5 2,0-3,5 5,5 7,0-7,5 5,6 7,1 6,0 6,8 6,0 7,5-7,8 6,6 7,6-8,6 1,6 1,8 1,9 2,5 50 90,4

Los factores ecológicos físicos (humedad, temperatura, luz) actúan directamente sobre la microbiota rizosférica o indirectamente por intermedio de la planta modificando la calidad y cantidad de los exudados radicales. La elevación de la humedad del suelo por sobre un cierto nivel puede modificar considerablemente el equilibrio microbiano (2). Variación de la población fúngica, en miles por gramo, a diferentes niveles de humedad (3) Humedad promedio Total Hifas Esporas Esporas como del suelo % % del total 8,9 99 60 39 39,4 11,2 89 57 32 36,0 18,5 142 113 29 20,5 24,2 149 133 16 10,7 27,1 173 153 20 11,5

Influencia del anegamiento sobre la densidad, en miles por gramo, de diferentes grupos microbianos en la riósfera de maíz cultivado en un suelo salino (1) Suelo a la capacidad de campo Suelo anegado Grupos Densidad en Densidad R/S Densidad en Densidad R/S microbianos la rizósfera fuera de la la rizósfera fuera de la (R) rizósfera (S) (R) rizósfera Sulfatoreductores 44 17 2,6 550 11 50 Azotobacter 0,8 0,8 1,0 6 1 6 Amonificantes 4.200 15 280 22.000 4.500 5 La temperatura actúa directamente sobre los microorganismos del suelo no rizosférico como se observa en el cuadro siguiente, pero también indirectamente controlando los exudados radicales correspondientes a las temperaturas óptimas de crecimiento de las plantas consideradas, 30-32°C para soja y 13-16°C para trigo (1).

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Influencia de la temperatura sobre la densidad microbiana, en millones por gramo, en la rizósfera y el rizoplano de trigo y soja (1) ºC Suelo no Rizosfera R/S Rizoplano Rizósfera R/S Rizoplano rizosférico de trigo trigo de trigo de soja soja de soja 30-32 167 266 1,6 147 3.570 21,4 138 21-24 120 710 5,9 150 230 1,9 62 13-16 78 1.165 14,9 308 186 2,4 28

3.2. Metabolismo La energía requerida para el mantenimiento de la vida y para la síntesis de los componentes celulares es obtenida por la transformación ordenada de las substancias que ingresaron a la célula. Éstas son modificadas por una serie de reacciones enzimáticas sucesivas, a través de rutas metabólicas específicas. Las vías metabólicas tienen las funciones de proveer los precursores para los componentes celulares y obtener energía para los procesos de síntesis y otros que requieran energía. Primero, los nutrientes son rotos en pequeños fragmentos durante el catabolismo y luego convertidos por las reacciones del metabolismo intermediario en ácidos orgánicos y ésteres de fosfato. La mayoría de los compuestos de bajo peso molecular que representan las unidades para sintetizar la célula, son aminoácidos, bases púricas y pirimidínicas, fosfatos de azúcares, ácidos orgánicos y otros metabolitos, algunos producidos al final de largas cadenas de reacciones. Estas substancias sirven para la síntesis de las macromoléculas (ácidos nucleicos, proteínas, materiales de reserva, constituyentes de la pared celular) durante el anabolismo (6). La figura 3 representa las vías metabólicas de organismos que respiran aeróbicamente.

3.3. Degradación de biopolímeros Los carbohidratos son los productos predominantes de la fotosíntesis vegetal y son, también, los principales nutrientes de la mayoría de los microorganismos en los ambientes naturales. Las macromoléculas son comúnmente degradadas fuera de las células a unidades mono o diméricas por la acción de exoenzimas y esos productos son absorbidos por las mismas.

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La mayor parte de la biomasa es descompuesta aeróbicamente por pro y eucariotas, predominando estos últimos en la red de alimentación. También participan en esta red los invertebrados tales como gusanos, moluscos, insectos y sus larvas. Por otra parte, los microorganismos siempre participan en la digestión de los nutrientes en el tracto intestinal de los animales, e inclusive en la degradación de substancias fibrosas, tales como lignocelulosa y celulosa que constituyen más de la mitad de la biomasa vegetal. Esta actividad ocurre bajo condiciones anaeróbicas. Otros ecosistemas anóxicos son los sedimentos de aguas estancadas, los campos de arroz, las ciénagas, los suelos inundados, los depósitos de deshechos y los silos (5). Los carbohidratos constituyen el 5 a 25% de la materia orgánica del suelo. Los restos vegetales contribuyen en forma de azúcares simples, hemicelulosas y celulosa, los que son descompuestos en distinto grado por bacterias, actinomicetos y hongos. Estos organismos a su vez sintetizan sus polisacáridos y otros carbohidratos que constituyen la mayor parte de los glúcidos hallados en el suelo (5). Las proteínas son las moléculas orgánicas más abundantes en el interior de las células y constituyen más del 50% de su peso seco. Los polinucleótidos forman parte del núcleo celular y del citoplasma. Los diversos lípidos están en las membranas citoplasmáticas, las paredes celulares y los materiales de reserva de vegetales y microorganismos. Los polímeros son degradados mediante enzimas extracelulares que producen mono y oligómeros convenientes para la nutrición microbiana (6). Los xenobióticos son substancias sintetizadas químicamente que no se encuentran en la naturaleza. Muchos son agregados voluntariamente al suelo. Entre los

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Leonor Carrillo. 2003. Microbiología Agrícola. Capítulo 3 polímeros xenobióticos se encuentran polietileno y polipropileno que son prácticamente no-degradables. La composición de la biomasa del suelo aproximadamente está representada por la figura 4. La figura 5 muestra el curso de la descomposición de la materia orgánica en el suelo.

3.3.1. Degradación de la celulosa La celulosa es el componente básico de los vegetales y consta de unidades de β-Dglucopiranosa reunidas por enlaces 1,4-glicosídicos. La molécula de celulosa tiene regiones cristalinas alternadas con zonas amorfas. La insolubilidad de la celulosa y su alta resistencia mecánica se debe a la presencia de puentes hidrógeno inter e intramoleculares y a fuerzas de Van der Waals (4). Los aportes de celulosa al suelo varían mucho con la región, el clima y los cultivos (3). La celulolisis es catalizada por un sistema constituído por tres enzimas: • endo-β-1,4-glucanasa que ataca los enlaces β-1,4 en las regiones amorfas internas de la macromolécula dando largos fragmentos solubles (oligosacáridos), • exo-β-1,4-glucanasa que separa el disacárido celobiosa desde los extremos de la molécula, • β-glucosidasa que hidroliza la celobiosa con formación de glucosa (8). La hidrólisis de la celulosa intacta se cumple mejor cuando estas tres enzimas operan al unísono, como ocurre en el celulosoma de Clostridium thermocellum que se encuentra entre la célula y el substrato al cual hidroliza. El celulosoma está constituído por nueve sitios polipeptídicos de adhesión a la molécula de celulosa, unidos a segmentos duplicados que a su vez se unen a otro polipéptido sobresaliente de la capa S en la pared celular (7). En los suelos bien aireados la celulosa es degradada y utilizada por varios microorganismos aerobios (hongos, mixobacterias y otras eubacterias). En el rumen, bajo condiciones anaeróbicas, la celulosa es atacada por bacterias y unos pocos hongos anaeróbicos del grupo Chytridiomycetes (4). Los hongos tienen más éxito que las bacterias durante la celulolisis en los suelos ácidos o en la madera (lignocelulosa). Excretan celulasas que pueden ser aisladas del medio de cultivo así como del micelio. Las bacterias deslizantes y las mixobacterias no excretan celulasas al medio, pero se adhieren a las fibras de celulosa para digerirlas. En los ambientes anaeróbicos la celulosa es degradada por eubacterias meso y termofílicas, por ejemplo Clostridium thermocellum. Esta bacteria crece en un medio mineral con celulosa pero no con glucosa. La digestión de la celulosa por diversas bacterias está acompañada de la secreción de una substancia carotenoide amarilla que sirve como indicador de la hidrólisis. En el rumen, el 90% de la celulosa es metabolizada, siendo el sistema natural más eficiente (4). En la figura 6 se muestra un esquema de la celulosa y las microfibrillas.

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Los principales factores ambientales que afectan la descomposición de la celulosa en el suelo son el nivel de nitrógeno disponible, la temperatura, la aireación, la humedad, el pH, la presencia de otros glúcidos y la proporción de lignina en los restos vegetales (3). Algunos microorganismos que digieren celulosa (4, 7) Organismos eucarióticos Quitridiomicetos Hongos mitospóricos Ascomicetos Basidiomicetos Neocallimastix Aspergillus Chaetomium Coprinus Orpinomyces Botrytis Fomes Piromonas Fusarium Pleurotus Sphaeromonas Humicola Polyporus Myrothecium Trametes Trichoderma Rhizoctonia Organismos procarióticos Mixobacterias Bacterias Bacterias Bacterias Actinomicetos deslizantes aerobias anaerobias Archangium Cytophaga Cellulomonas Bacteroides Micromonospora Polyangium Sporocytophaga Pseudomonas Butyrivibrio Streptomyces Sorangium Clostridium Streptosporangium Eubacterium . Ruminococcus En suelos con pH 6,5 - 7,5 se encuentra Cellulomonas, a pH 5,7 - 6,2 aún desarrolla Cytophaga y si la acidez desciende predominan los hongos. Se pueden encontrar bacterias celulolíticas anaerobias también en suelos ácidos con pH 4,3. Las mixobacterias son las más sensibles a la acidez por lo que se las encuentra en el mantillo de huertos, en suelos abonados y en los ricos en calcio. Los actinomicetos se hallan en suelos muy diversos, entre pH 4,6 y 9,5. Al tratar el suelo con cal cambia la composición de la microbiota activa (3). La celulolisis puede producirse en un amplio rango de temperatura, de 5 a 65°C. Entre los microorganismos termófilos se encuentran Clostridium, Streptomyces, Chaetomium, Humicola, presentes en el estiércol y los vegetales en descomposición. Los microorganismos celulolíticos del suelo son principalmente mesófilos. Una humedad por debajo del 50 al 60% de la capacidad de camp o favorece a las formas filamentosas. En un suelo anegado la degradación se debe a las bacterias anaerobias. Los actinomicetos persisten a un 20% de la capacidad de campo. La influencia de la salinidad suele encontrarse en la naturaleza enmascarada por los otros factores. En el horizonte A de los suelos halomorfos hay mayor diversidad de organismos, mientras que en el B por la acumulaciónlas sales se hallan solamente hongos halotolerantes (1). Las substancias con las que está asociada la celulosa en los desechos vegetales influyen sobre la velocidad de la descomposión. La degradación de 30 g de celulosa, de los cuales 20 a 30% sirven para la síntesis microbiana, exigen la provisión de 1 g de nitrógeno. Cuando la presencia de lignina hace más lenta la celulolisis se requiere menos cantidad de nitrógeno, porque éste es poco a poco reciclado. Para los hongos que hidrolizan lignina y celulosa la relación C/N es mayor que 300. Los nitratos favorecen la actividad de las bacterias mientras que el amonio y los aminoácidos son mejor utilizados por las mixobacterias y los hongos. Azotobacter y otros organismos que fijan nitrógeno atmosférico junto a las bacterias solubilizadoras de fosfatos, favorecen la celulolisis (1). La aplicación de nitratos, amonio, urea y estiércol elevan la velocidad de la descomposición (3). El cálculo del nitrógeno necesario durante la degradación de 100 kg de material vegetal supuestamente libre del mismo, parte de considerar que solamente el 80% se

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Leonor Carrillo. 2003. Microbiología Agrícola. Capítulo 3 puede descomponer con facilidad y la mitad es carbono. Entonces se tiene 40 kg de C para transformar, de los cuales 2/3 se convertirán en CO2 y 1/3 (13 kg) serán incorporados a las células microbianas involucradas en el proceso. Estas células vivas contienen aproximadamente 1 parte de N por cada 10 partes de C y como el 50% del material celular es C, entonces el 5% es N. Por lo tanto los 13 kg de C producirán 26 kg de biomasa microbiana si hay disponible 1,3 kg de N, durante la descomposición de los 100 kg de material vegetal (3). Pero debido a la formación de complejos tanino-proteínas en ciertos mantillos (lo que inactiva a las exoenzimas) y a que las substancias húmicas son fuentes de N (aunque mediocres), la relación C/N en los restos vegetales no es suficiente para determinar la velocidad de la degradación (1).

3.3.2. Degradación de almidón

El almidón es el material de reserva que predomina en las plantas y comúnmente se presenta en gránulos con una típica estructura en capas. Está compuesto de dos glucanos: amilosa y amilopectina. La amilosa es soluble en agua caliente y se tiñe de azul con una solución acuosa de yodo. Consiste de una cadena helicoidal no ramificada de unas 200 - 500 unidades de D -glucosa con enlaces 1,4-α-glicosídicos. La amilopectina se hincha en agua caliente dando una pasta y toma un color pardo violáceo con yodo. Es también un polímero 1,4-α-D-glucosa que, como el glicógeno, está ramificado por enlaces 1,6-α-glucosídicos aproximadamente cada 25 unidades de glucosa (8). Los almidones de distinto origen difieren mucho en su ramificación, el número de unidades por cadena y los residuos fosfato e iones calcio y magnesio que los acompañan. Hay tres tipos de descomposición enzimática de los glucanos: fosforólisis, hidrólisis y transglicosilación. La fosforólisis por la α-1,4-glucanfosforilasa sólo ocurre intracelularmente. La transglicosilación es la formación de ciclodextrinas con 6-8 unidades de glucosa a partir del almidón, por acción de Bacillus macerans y otros (4). El ataque extracelular del almidón es debido a la acción hidrolítica de las amilasas, según se observa en el esquema de la figura 7. La α-amilasa ataca los enlaces 1,4-α-glicosídicos aún en el centro de la cadena, por lo que se la conoce como endoamilasa, produciendo glucosa, maltosa y oligómeros de 3 a 7 unidades. Está presente en plantas, animales y microorganismos. La viscosidad de la solución de almidón y el color de su reacción con yodo se reducen rápidamente

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durante la hidrólisis. Producen amilasas muchos hongos del suelo así como bacterias de los géneros Bacillus, Pseudomonas, Streptomyces entre otras. La β-amilasa, presente en plantas y bacterias, también degrada los enlaces 1,4-αglucosídicos pero comienza su acción por el extremo libre no reductor del almidón, liberando maltosa mientras continúa el color frente al yodo. La hidrólisis se detiene en los puntos de ramificación de la amilopectina y el residuo se conoce como dextrina límite (6). La pululanasa o isoamilasa hidroliza los enlaces 1,6-α-glicosídicos quitando las ramas de la amilopectina o las dextrinas. La maltasa hidroliza la maltosa a glucosa (3). Si estas enzimas acompañan a las anteriores se logra una degradación total del almidón. Las amilasas son inducibles, pero su producción depende del tipo de almidón empleado. Las α-amilasas de Bacillus stearothermophilus y B. licheniformis son termo estables así como las excretadas por algunos clostridios termófilos, los que también excretan pululanasas (4). La actividad amilolítica varía a veces con el tipo de vegetación, la humedad y las características del suelo. El almidón es degradado por clostridios fijadores de nitrógeno en los suelos anegados, a los que recientemente se incorporó material vegetal rico en polisacáridos (3).

3.3.3. Degradación de levanos

Los levanos (polifructosanos) son substancias de reserva producidas por algunas plantas, por ejemplo la inulina de los tubérculos de dalia con enlaces β-2,1 glicosídicos (figura 8), pero otros levanos tienen uniones β-2,6 glicosídicas. Los levanos constituyen el 12-15% del peso seco de algunas pasturas y son degradados por numerosas bacterias, actinomicetos y hongos (4). La inulinasa produce unidades de levulosa (fructosa). Algunos Streptomyces tienen también 2,6fructosanasa que forma levanobiosa (fructobiosa) y ciertos hongos una 2,1-fructosanasa que origina oligómeros (3).

3.3.4. Degradación de xilanos y otras hemicelulosas Las hemicelulosas consisten en polímeros de pentosas (xilosa, arabinosa), hexosas (glucosa, manosa, galactosa) o ácidos urónicos (glucurónico, galacturónico). Son substancias de soporte o de almacenamiento en las plantas (4). La figura 9 representa las hemicelulosas en la pared vegetal. El xilano es el polisacárido más abundante después de la celulosa. La corteza de los árboles y la paja contienen hasta 30% de xilano, la madera de coníferas 7 - 12% y la de árboles de hojas caducas 20 - 25%. La cadena consta de 30 - 100 unidades de β-D-xilopiranosa con enlaces 1,4 -glicosídicos.

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Leonor Carrillo. 2003. Microbiología Agrícola. Capítulo 3 Algunos xilanos también presentan arabinosa, glucosa, galactosa y glucuronato en ramas laterales unidas al C3 de la xilosa. El xilano es degradado más rápidamente que la celulosa. La xilanasa que es constitutiva en algunos clostridios e inducible en otros organismos, produce xilosa, xilobiosa y oligómeros de 2 a 6 unidades. Muchos organismos excretan xilanasas, en los suelos neutros o alcalinos predominan Bacillus, Sporocytophaga, Clostridium y otras bacterias pero en los ácidos, los hongos (4). La temperatura óptima para la descomposición es 37°C, y para los actinomicetos termófilos entre 45 y 50°C. Los mananos constituyen el 11% del peso seco de la madera de algunas coníferas. Son hidrolizados por muchos organismos que también actúan sobre galactomananos y glucomananos. Los galactanos son degradados más lentamente que otras hemicelulosas y tienen enlaces β-1,4 y β-1,3 glicosídicos. Las galactanasas microbianas producen galactosa, galactobiosa y galactotriosa. Algunos organismos producen varias enzimas simultáneamente, como Fusarium oxysporum que creciendo en tomate sintetiza arabanasa, xilanasa, galactanasa y glucanasa. Las enzimas extracelulares pueden ser adsorbidas por las arcillas, disminuyendo su actividad (3). La degradación de las hemicelulosas está determinada la disponibilidad de nitrógeno como ocurre con la descomposición de la celulosa. Las hemicelulosas de plantas maduras son degradadas más lentamente que las del tejido más joven. Por otra parte, al mismo tiempo que se degradan los polímeros vegetales, los microorganismos sintetizan otros polisacáridos como los glucanos y pentosanos de los mohos, los mananos de las levaduras, los glucanos y levanos de las cápsulas bacterianas (1).

3.3.5. Degradación de pectinas

Las pectinas son substancias intercelulares de los tejidos de plantas jóvenes y abundantes en las frutas. Están constituídas por cadenas no ramificadas de ácido Dgalacturónico con enlaces 1,4-α-glicosídicos, parcial o completamente esterificadas con metanol (4), como se presenta en la figura 10. En las pectinas insolubles (protopectina) las cadenas están entrecruzadas por cationes Ca ++ y Mg++ unidos a los grupos carboxilos (3).

La degradación microbiológica de las pectinas es llevada a cabo por esterasas y despolimerasas. La pectinesterasa hidroliza los ésteres y libera metanol. La poligalacturonasa hidroliza las uniones glucosídicas de los ácidos poligalacturónicos residuales (coloidales o solubles), produciendo monómeros y oligómeros del ácido Dgalacturónico. La polimetilgalacturonasa hidroliza los enlaces glucosídicos de las pectinas (1). Las enzimas que fragmentan las cadenas por transferencia de protones generando desoxiácidos (transeliminación) se denominan pectinliasa o pectatoliasa según actúen sobre pectinas o ácidos pécticos. Alrededor del 1-10% de los microorganismos del suelo hidrolizan las pectinas, estimulados por el substrato (3). La fitopatogenicidad de algunos microorganismos (Erwinia, Botrytis, Fusarium) es debidad a la capacidad de excretar "pectinasas". Los microorganismos que descomponen pectinas intervienen en el enriado de lino y cáñamo, liberando los haces de fibras de celulosa del tejido vegetal. Los hongos intervienen en el proceso aerobio mientras en el anaerobio intervienen bacterias butíricas como Clostridium pectinovorum (4). Las

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bacterias anaeróbicas pectinolíticas son más abundantes en los suelos anegados y en los abonados con estiércol (1).

3.3.6.Degradación de quitina La quitina le sigue a la celulosa en abundancia. Forma parte del exoesqueleto de artrópodos y de la pared celular de hongos filamen -tosos. Está constituída por unidades de Nacetil-glucosamina con enlaces β-1,4-glicosídicos (6). La degradación por la quitinasa produce poca N-acetilglucosamina y predominan los oligómeros (quitobiosa, quitotriosa). Los oligómeros son convertidos en monómero por la β-N-acetil-glucosaminidasa. La quitin-desacetilasa transforma la quitina en quitosano y acetato por hidrólisis de los grupos acetamida (10). Un gran número de bacterias y actinomicetos pueden hidrolizar quitina. Entre los hongos con tal propiedad se encuentran Mucor y algunos Aspergillus (4). La síntesis de quitinasas es inducida en las plantas por los agentes patógenos. La figura 11 muestra fibrillas de quitina obtenidas de la pared fúngica.

3.3.7. Degradación de lignina

El contenido en lignina del tejido leñoso varía entre 18 y 30% del peso seco. Está ubicada en la lámina secundaria de las paredes celulares y es el componente de las plantas degradado más lentamente. No es químicamente uniforme y tiene una estructura muy compleja (3). Los monómeros son todos derivados del fenilpropano, principalmente alcohol coniferilo. La complejidad resulta del gran número de diferentes enlaces que unen a los monómeros. Las diferencias en la composición de la ligninas se manifiestan en el contenido de grupos metoxi: 21% en árboles de hojas

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Leonor Carrillo. 2003. Microbiología Agrícola. Capítulo 3 caducas, 16% en abeto, 14% en gramí neas (4). Las unidades fenilpropano están entrecruzadas por múltiples enlaces éter y C-C, que son extremadamente resistentes al ataque enzimático. La lignina es un producto final inerte del metabolismo vegetal y solamente es degradada por microorganismos (1). Dos grupos de hongos se distinguen entre los destructores de madera: los que causan la podredumbre parda que degradan celulosa y hemicelulosas dejando la lignina como residuo. y los que provocan la podredumbre blanca que degradan lignina. Entre estos últimos se encuentran Stereum, Phanerochaete, Pleurotus, Ganoderma, Polyporus, Xylaria (3). La degradación de lignina ocurre en presencia de oxígeno y glucosa. El sistema enzimático contiene peroxidasas que catalizan la ruptura oxidativa de los enlaces β-O-4 éter y los C-C de la lignina y requieren H2 O2 proveniente de la oxidación por la glucosa-oxidasa. La formación de peroxidasas es promovida por la limitación de nitrógeno y la descomposición de la lignina parece tener como principal objetivo el acceso a los componentes nitrogenados de la madera. Sobre los compuestos fenólicos de bajo peso molecular liberados actúan luego las fenoloxidasas (4). En la figura 12 se observa un esquema simplificado de la lignina, mientras que la figura 13 muestra la velocidades de la descomposición de algunos componentes del mantillo.

3.3.8. Degradación de lípidos

De 1,2 a 6,3% de la materia orgánica del suelo se encuentra como grasas, ceras y resinas, aunque los valores pueden ser mayores en suelos forestales y turba. Los fosfolípidos constituyen el 1-5% de los compuestos fosforados del suelo y son de origen microbiano. La fracción hidrófoba de las gramíneas es de unos 2% de la materia seca, pero es más abundantes en ciertos microorganismos que contienen más de 10%. Algunos de los componentes de los lípidos son fitotóxicos, mientras que otros (vitaminas) estimulan el crecimiento de las plantas (5). Por otra parte, ceras y materiales similares son los responsables de la condición

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hidrófuga de ciertas arenas. Numerosos microorganismos telúricos, entre ellos Aspergillus y Penicillium, sintetizan substancias lipídicas que contribuyen a la estabilidad estructural del suelo (1). Los lodos de aguas residuales digeridas anaeróbicamente, que suelen agregarse al suelo, contienen 19,1-19,8% de grasas, aceites y ceras (5). Numerosos microorganismos del suelo producen lipasas, capaces de hidrolizar los glicéridos dando glicerol y ácidos grasos, así como fosfolipasas. El catabolismo posterior de los ácidos grasos se lleva a cabo por una serie de β-oxidaciones, pero en el suelo esta degradación es lenta y limitada. La figura 14 da un esquema de la hidrólisis de un triacilglicérido. Muchas levaduras de la filosfera degradan las ceras de la epidermis vegetal, también mohos tales como Penicillium y Mucorales, y algunas bacterias (1).

3.3.9. Degradación de proteínas

Las proteínas están constituídas por una o varias cadenas polipeptídicas donde los α-aminoácidos están unidos por enlaces amida. Las proteínas conjugadas tienen además otros componentes: nucleótidos, lípidos, glúcidos, cationes metálicos o grupo hemo. Los catalizadores biológicos (enzimas) son también proteínas. Antes que las proteínas puedan incorporarse a las rutas catabólicas deben experimentar hidrólisis completa hasta transformarse en aminoácidos, ya que las moléculas proteicas intactas y la mayoría de los péptidos no pueden atravesar la membrana citoplasmática, mientras que los aminoácidos libres son absorbidos fácilmente (6). Las proteasas excretadas por los microorganismos producen aminoácidos y oligopéptidos al hidrolizar de las uniones peptídicas. Los péptidos son hidrolizados por las exo- y endo-peptidasas. Las exopeptidasas se dividen en dos grupos: las que comienzan su acción por el enlace peptídico adyacente al grupo amino terminal y las que lo hacen por el cercano al carboxilo terminal. Las otras hidrolizan los enlaces del interior de la cadena y son muy específicas, como por ejemplo la acción hidrolítica de la tripsina usada en la producción de peptonas, ocurre solamente si el aminoácido que aporta el grupo carboxilo en la unión peptídica es lisina o arginina (4). La figura 15 muestra la hidrólisis de la unión peptídica. Las proteínas de los organismos muertos son descompuestas por un gran número de hongos y bacterias. Las bacterias termofílicas producen proteasas termoestables. Algunas proteasas

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extracelulares actúan como toxinas, mientras que ciertos polipéptidos bacterianos son antibióticos. La degradación de proteínas en el suelo va seguida de la formación de amonio por la posterior descomposición de los aminoácidos (6).

3.3.10. Degradación de polinucleótidos

Los nucleótidos están formados por una base nitrogenada derivada de la purina o la pirimidina, una pentosa y ácido fosfórico. Son los monómeros de los polinucleótidos donde están unidos por puentes fosfodiéster, como se muestra en la figura 16. Los ácidos nucleicos son el 0,2-2,5% de los compuestos fosforados del suelo y su hidrólisis da oligonucleótidos y mononucleótidos con baja relación C/N (2). Los mononucleótidos a su vez son convertidos en nucleósidos (N-glicósidos de purinas o pirimidinas). Éstos son después hidrolizados en las bases nitrogenadas y pentosas. Luego en el suelo el proceso continua con la amonificación de las purinas y pirimidinas. Las exonucleasas atacan solamente los extremos de las cadenas polinucleotídicas mientras que las endonucleasas hidrolizan enlaces de cualquier punto de las mismas. Las desoxi-ribonucleasas degradan el ADN y las ribonucleasas el ARN, aunque algunas fosfo -diesterasas hudrolizan uniones de nucléotidos de ambos ácidos nucleicos. Entre los numerosos organismos que excretan nucleasas se encuentran algunos Clostridium (4).

3.4. Metabolismo productor de energía Para su crecimiento y multiplicación, los micro-organismos llevan a cabo diversos procesos metabólicos, destinados a obtener energía y nuevo material celular. Los microorganismos fotosintéticos son capaces de utilizar la energía de la luz para convertir el CO 2 , junto con el hidrógeno del H 2O (cianobacterias, algas) o el H2 S (bacterias), en materia orgánica celular. Los autotróficos también fijan el CO2 pero con una fuente química de energía. Los microorganismos heterotróficos necesitan substratos orgánicos para desarrollarse. Los microorganismos pueden dividirse, de acuerdo con sus necesidades ambientales, en tres grupos. Se encuadran en el primero los aeróbicos estrictos, que únicamente pueden respirar y crecer en presencia de oxígeno atmosférico. En el segundo grupo se hallan los anaeróbicos estrictos, que no sólo fermentan y crecen en ausencia de oxígeno libre, sino que requieren su eliminación, por serles perjudicial. En el tercer grupo están los organismos facultativos, capaces de crecer en presencia o en ausencia de oxígeno, que pueden subdividirse en dos grupos según puedan cambiar su metabolismo aeróbico (respiración) en anaeróbico (fermentación) adaptándose al ambiente donde se hallan, o bien son únicamente fermentadores que toleran el oxígeno (aerotolerantes) (6).

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Dentro de los aeróbicos estrictos están muchas bacterias y casi todos los mohos y las actinobacterias. Los anaerobios estrictos están representados por miembros del género bacteriano Clostridium, por ejemplo C. pasteurianum que es un fijador de nitrógeno. Las levaduras y las bacterias coliformes, que pueden respirar o fermentar ciertos substratos, son organismos facultativos. Las bacterias lácticas pertenecen al grupo que obtiene su energía exclusivamente de la fermentación y no sufren lesión por parte de una reducida presión parcial de oxígeno. El metabolismo anaeróbico es siempre menos eficiente que la respiración, ya que la fermentación no aprovecha toda la energía del substrato orgánico (por ejemplo, un azúcar) para la producción del combustible universal de la célula (el ATP) ni, por tanto, para la síntesis de material celular. Las células excretan el producto de degradación que, a su vez, podría ser oxidado ulteriormente a CO2 y H2O. Pero, los productos de la fermentación, tales como el etanol liberado por levaduras, no pueden ser metabolizados, en condiciones anaeróbicas, por el organismo que los produce. El crecimiento aeróbico, por otra parte, capacita a algunos organismos para oxidar completamente una cierta fracción del substrato y extraer así la máxima energía para convertir el resto del substrato en masa celular. Si el objetivo del cultivo microbiano es aumentar la biomasa, por ejemplo en la producción de levadura de panadería, resulta una ventaja obvia tener tener un crecimiento aeróbico con utilización completa del substrato por respiración (13).

3.5.Respiración 3.5.1. Degradación de hexosas Hay varias vías para convertir la glucosa a piruvato, uno de los compuestos intermediarios más importantes del metabolismo. Una es la vía de la fructosa-1,6-difosfato), esquematizada en la figura 17 . El balance es la formación de dos moléculas de ATP (energía química por fosforilación a nivel de substrato) y dos de NADH2 (poder reductor), por lo que constituye la secuencia de reacciones más importante para los orga nismos anaeróbicos. Otra es la vía oxidativa de la pentosa-fosfato que se muestra en la figura 18, la cual además provee ribosafosfato para la síntesis de nucleótidos. El camino inverso es la ruta más importante en la fijación autotrófica de CO2 . La vía del ceto-desoxi-fosfo-

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Leonor Carrillo. 2003. Microbiología Agrícola. Capítulo 3 gluconato que se observa en un amplio grupo de bacterias, se detalla en la figura 19. La oxidación del piruvato se produce, por caminos distintos según los organismos dando acetil-CoA, que en el caso de los aerobios entra en ciclo del ácido tricarboxílico (4).

3.5.2. Ciclo del ácido tricarboxílico

Este ciclo, cuyo esquema se da en la figura 20, sirve no solamente para la oxidación terminal de los nutrientes sino también para la generación de precursores de biosíntesis. Si algunos intermediarios se derivan por otro camino, cesa de funcionar este ciclo. Pero, entonces entra en juego la secuencia de reacciones anapleróticas para reaprovisionar los intermediarios faltantes (6). El ciclo del citrato es también la ruta final para la oxidación de las cadenas carbonadas de los aminoácidos después de la desaminación (ver figura 14).

3.5.3. Cadena de transporte de electrones Es llamada también cadena respiratoria. En los eucariotas las enzimas de la respiración están en unos orgánulos denominados mitocondrias mientras que en los organismos procarióticos se encuentran en la membrana citoplasmática. Cada molécula de NADH2 proveniente del ciclo anterior se reoxida a través de esta cadena con la ganancia de 3 moléculas de ATP mientras que cada molécula de FADH2 genera 2 de ATP. La figura 21 representa la secuencia del transporte de electrones en la membrana de algunas bacterias, desde la flavoproteína hasta el O2 u otro aceptor terminal, mientras que los H + son bombeados fuera. Cuando el oxígeno se reduce, requiere protones del citoplasma para completar la reacción, los que se originan por la disociación del agua. El resultado neto es la generación de un gradiente de pH y un potencial electroquímico a través de la membrana, con la parte interna cargada negativamente, y la externa con carga positiva. Este estado energizado de la membrana se expresa como fuerza motriz de protones (6). La energía puede ser

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usada directamente en el transporte de iones, la rotación de los flagelos o la producción de los enlaces fosfato del ATP a través del sistema ATPasa (fosforilación oxidativa) anclado en la membrana. La respiración provee 38 moléculas de ATP por cada molécula de glucosa oxidada.

3.6. Fermentaciones Las rutas bioquímicas de la fermentación varían mucho. Por ejemplo, las levaduras pueden fermentar una molécula de un monosacárido de seis carbonos, como la glucosa o la fructosa, produciendo dos moléculas de etanol y dos de CO2. Pero, para las bacterias, se pueden agrupar esas vías en dos tipos generales: homofermentativos (un producto principal) o heterofermentativos (dos o más productos). Los productos de la fermentación no pueden ser metabolizados, en condiciones anaeróbicas, por el organismo que los produce. En las fermentaciones el ATP se produce por fosforilación a nivel de substrato, pues se sintetiza durante el catabolismo de un compuesto y en pasos enzimáticos concretos, pero requiere que la fuente genere un intermediario de alta energía (6).

3.6.1. Fermentaciones lácticas Las lactobacterias llevan a cabo este tipo de fermentación en presencia o ausencia de aire, aunque prefieren concentraciones reducidas de oxígeno. En cambio las enterobacterias sólo producen ácido láctico en condiciones anaeróbicas. El ambiente natural de lactobacterias es la leche y los lugares donde es procesada (Lactobacillus delbrueckii var. bulgaricus, Lactococcus lactis), la superficie de plantas intactas o podridas (Lactobacillus plantarum, L. delbrueckii, Leuconostoc mesenteroides), el tracto intestinal y las mucosas de animales y humanos (Lactobacillus acidophilus, Enterococcus faecalis). Por tal motivo suele encontrarse cultivos puros naturales, como en algunos productos lácteos, material ensilado, chucrut (14). Las bacterias homofermentativas (por ejemplo Lactobacillus casei) producen lactato puro o casi puro, metabolizando la glucosa por vía de la fructosadifosfato y reduciendo el piruvato a lactato. Según las especies se forma D (-), L (+) o DL-lactato. Las bacterias heterofermentativas (Lactobacillus brevis) degradan la glucosa al comienzo por la vía de las pentosas y luego transforman el acetil-P en etanol o acetato y el piruvato en lactato (6). La figura 23 muestra un esquema de la fermentación heteroláctica. La fermentación láctica permite la conservación de los forrajes pues las lactobacterias ácido-tolerantes

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Leonor Carrillo. 2003. Microbiología Agrícola. Capítulo 3 desarrollan en cultivo prácticamente puro en el material ensilado, en especial si fué previamente acidificado. Las lactobacterias son imprescindibles en la industria lechera como productores de ácido en la coagulación de la caseína para ciertos quesos, y aroma por la formación de diacetilo en algunas especies. También se emplean lactobacterias en la producción de salames pues la acidificación contribuye a la conservación de estos embutidos (4).

3.6.2. Fermentación alcohólica La levadura Saccharomyces cerevisiae y la bacteria Sarcina ventriculi forman etanol vía la fructosa-difosfato y descarboxilación del piruvato. El rendimiento energético es 2 moléculas de ATP por cada molécula de glucosa fermentada. La bacteria Zymomonas mobilis metaboliza la glucosa por la ruta del ceto-desoxifosfogluconato y descompone el piruvato en CO 2 y acetaldehído, que luego es reducido a etanol (6). Mientras las enzimas de la fermentación son constitutivas en la levadura y se encuentran en el citoplasma, los de la respiración son inducibles. La fermentación con Saccharomyces spp. se emplea para la producción de bebidas alcohólicas y la producción industrial de etanol mientras que la fermentación con Zymomonas se usa en sólo en el último caso (13).

3.6.3. Fermentaciones propiónicas

La formación de propionato, por las especies de Propionibacterium es utilizada en la maduración de quesos tipo suizo. El piruvato proveniente de la ruta de la fructosadifosfato o el lactato resultante de otras fermentaciones son reducidos mediante la vía de la metilmalonil-CoA (4) que se muestra en la figura 24. La producción de propionato debida a Clostridium propionicum y Bacteroides ruminicola ocurre por una ruta más simple, donde la lactil-CoA se reduce a propionil-CoA. Estas bacterias habitan el rumen y el intestino de los rumiantes (6).

3.6.4. Fermentaciones fórmicas La fermentación ácida-mixta es llevada a cabo por Escherichia coli (bacteria facultativa del intestino) y otras proteobacterias patógenas de humanos y animales (por ejemplo Salmonella spp.). produciendo ácidos orgánicos y el pH desciende a 4,2, punto en el que la solución de rojo de metilo tiene color rojo (figura 25). Se investiga la presencia de los organismos con características semejantes a E. coli (coliformes) como indicadores de la contaminación fecal del agua. La fermentación butanodiólica es

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algunos organismos con este tipo de fermentación.

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cumplida por bacterias que se encuentran en el agua y el suelo (por ejemplo Enterobacter aerogenes, Bacillus cereus y Erwinia que es patógena de plantas) con la formación 2,3-butanodiol como principal producto (14). Un intermediario es la acetoína que da positiva la reacción de VogesProskauer, útil para detectar

3.6.5. Fermentación butírico -butanólica Los Clostridium son bacterias esporuladas fermentativas pues solo crecen en condiciones anaeróbicas. La fermentación butírico-butanólica comienza por la conversión de los azúcares en piruvato por la vía de la fructosa-difosfato. El piruvato es descarboxilado dando acetil-CoA y la transformación de esta última da diversos productos (4) como se observa en la figura 26. En las primeras fases los productos predominantes son los ácidos butírico y acético pero luego, al bajar el pH del medio, comienzan a acumularse acetona y butanol que son neutros (6).

3.6.6. Fermentaciones acéticas Algunos clostridios (por ejmplo C. thermoaceticum) fermentan la glucosa por la vía de la fructosa-difosfato. Luego generan acetato por descarboxilación del piruvato y la conversión del CO2 e hidrógeno, producidos antes, en acetato. Otras bacterias convierten los monosacáridos en acetato como por ejemplo Ruminococcus albus, y el hidrógeno producido es aprovechado por Vibrio succinogenes en un cultivo mixto (4), como se presenta en la figura 27.

3.6.7. Fermentación de aminoácidos Varios clostridios obtienen energía fermentando aminoácidos (por ejemplo C. sporogenes). Algunas cepas fermentan pares de aminoácidos, donde uno actúa como dador de electrones y es oxidado, y el otro como aceptor de electrones y es reducido (6).

3.7. Oxidaciones incompletas No todas las reacciones oxidativas catalizadas por microorganismos aeróbicos estrictos se llevan hasta el último extremo. Por ejemplo la conversión de etanol en ácido acético (vinagre) por Acetobacter spp. Aunque estos suboxidadores obtienen energía en forma de ATP a partir de las oxidaciones incompletas, generalmente no pueden obtener moléculas para su crecimiento a partir de dichas reacciones y, por consiguiente, requieren para su desarrollo otros nutrientes suministrados por el medio (6).

3.8. Respiración anaeróbica Es una variación de la respiración en la que los aceptores de electrones utilizados son diferentes al oxígeno, e incluyen nitrato, ión férrico, sulfato, carbonato y ciertos compuestos orgánicos. La figura 28 muestra los contrates entre la respiración aeróbica y la anaeróbica. Los productos de la respiración anaeróbica son fácilmente detectados: las burbujas de N2 , NO2 , CH4 (inflamable); el olor de H2 S; la formación de óxido de hierro diamagnético (2).

3.8.1. Desnitrificación

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Leonor Carrillo. 2003. Microbiología Agrícola. Capítulo 3 La desnitrificación transitoria y localizada en los suelos consiste en la reducción anaeróbica del nitrato a compuestos volátiles (N2 , N2 O, NO). Es producida por bacterias que respiran y solamente pueden crecer anaeróbicamente en presencia de nitrato, por ejemplo Pseudomonas fluorescens, Bacillus licheniformis, Paracoccus denitrificans y Thiobacillus denitrificans. Ocurre con frecuencia en los suelos anegados, especialmente cuando se aplicaron juntos fertilizantes orgánicos y nitrato (1). No se observa este proceso en mohos ni actinomicetos (2). La figura 29 expone la velocidad relativa de la desnitrificación según la cantidad de agua que ocupa los poros del suelo y la figura 30 muestra un esquema del ciclo del nitrógeno.

3.8.2. Reducción a nitritos Algunas bacterias facultativas como Enterobacter y Escherichia, pueden respirar reduciendo el nitrato a nitrito, que se acumula en el ambiente, pero no producen N2 . Luego reducen el nitrito a amonio por la vía asimilatoria, si hay deficiencia de NH 4 + en el medio (4). La figura 22 muestra el proceso de transporte de electrones en Escherichia coli cuando usa nitrato como aceptor de electrones.

3.8.3. Sulfatorreducción

Es la transferencia de hidrógeno al sulfato aceptor terminal de electrones en la respiración anaeróbica, reduciéndolo a H2 S. Este proceso, llamado también reducción desasimilatoria de sulfatos, es cumplido por bacterias anaeróbicas obligadas tales como Desulfovibrio, Desulfatomaculum. Los donantes de hidrógeno son lactato, acetato y otros ácidos grasos, metanol, etanol y compuestos aromáticos. Los microorganismos reductores de sulfato son responsables de la precipitación de Fe++ y otros cationes metálicos en aguas polutas, y la corrosión de metales enterrados. Desulfuromonas y algunas arqueobacterias termofílicas pueden

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reducir el azufre elemental a H2 S (5). Por otra parte, casi todas las bacterias, así como los hongos pueden reducir sulfatos para sintetizar aminoácidos azufrados por la vía de la reducción asimilatoria de sulfatos (5). La figura 31 presenta un esquema del ciclo del azufre.

3.9. Bacterias autotróficas Usan CO2 como fuente de carbono a través del ciclo de la ribulosa-difosfato, excepto las bacterias acetogénicas y metanogénicas. Obtienen energía y moléculas reductoras usando iones amonio, nitrito, sulfuro, tiosulfato, sulfito, ferroso; así como azufre elemental, hidrógeno o monóxido de carbono. Tienen los componentes del transporte electrones y la fuerza motriz de protones como los heterótrofos (4). La figura 28 resume los contrastes del metabolismo autotrófico frente al heterotrófico.

3.9.1. Metanogénesis

El ecosistema donde ocurre la metanogénesis comprende pantanos, arrozales, sedimentos de lagos, estanques y estuarios, digestores de aguas residuales y el rumen. En tales ambientes anaeróbicos los substratos orgánicos son fermentados a acetato, CO2 e H2 . Estos productos son utilizados por las arqueobacterias formadoras de metano entre las que se encuentran Methanobacterium, Methanococcus, Methanosarcina, Methanospirillum (15). Como el CO2 es usado como un aceptor de hidrógeno durante la generación de energía, el proceso se suele llamar respiración del carbonato. Algunas bacterias metanogénicas también pueden convertir el CO en metano. Por otra parte, estas arquibacterias son autótrofas y fijan CO2 por la vía acetil-CoA y piruvato, para la síntesis del material celular (4). Ver 5.3.

3.9.2. Nitrificación En el curso de la degradación de substancias nitrogenadas se libera amonio. La conversión del amonio a nitrito es llevada a cabo por las bacterias nitritantes del suelo: Nitrosolobus, Nitrosomonas, Nitrosospira. En el ambiente marino se encuentra Nitrosococcus. No hay bacterias que conviertan directamente el amonio en nitrato. El nitrito es oxidado a nitrato por las bacterias nitratantes Nitrobacter, Nitrococcus (en el mar) y otras. Ambos pasos constituyen la llamada nitrificación del suelo (1). Estas bacterias autóctonas del suelo pueden ser cultivadas en

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Leonor Carrillo. 2003. Microbiología Agrícola. Capítulo 3 solución mineral con un tiempo de generación entre 10 y 20 horas. Nitrobacter winogradskyi puede asimilar acetato (4). La figura 32 muestra las membranas intracitoplasmicas de una bacteria nitrificante. Los iones amonio son oxidados rápidamente en los suelos bien aireados. La conversión de este catión al anión nitrito o nitrato, trae aparejado una acidificación del suelo con un incremento en la solubilización de minerales (potasio, calcio, magnesio y fosfatos). Por tal motivo los microorganismos nitrificantes fueron vistos como un factor significativo de la fertilidad del suelo (3). El amonio es mejor retenido que el nitrato, especialmente por adsorción sobre arcillas y unión más o menos firme a los componentes del humus. El nitrato, por el contrario, es fácilmente eliminado por el agua (4). El nitrato se acumula en las capas freáticas y puede afectar la salud de los bebés si la concentración en el agua potable supera los 50 mg por litro, pues las bacterias del intestino delgado lo reducen y el nitrito que pasa a la sangre se une irreversiblemente a la hemoglobina (16). El proceso de nitrificación ocurre entre pH 7 y 8, debido a que el amonio libre (en suelos alcalinos) y el ácido nitroso (en suelos ácidos) son tóxicos para Nitrobacter (1). En suelos anegados que fueron fertilizados con sales de amonio, Nitrosomonas y Nitrosovibrio pueden llevar a cabo una desnitrificación. Otras cualidades de las bacterias nitrificantes son su capacidad para oxidar metano, metanol, CO, etileno, propileno, ciclohexano, alcohol bencílico y fenol. En cultivo puro la bacteria heterotrófica Arthrobacter es capaz de formar nitrito a partir de substancias nitrogenadas. También algunos hongos pueden oxidar el nitrógeno amínico o el amonio hasta nitrato. Esta nitrificación heterótrofa no está acoplada al crecimiento y producción de biomasa, y sólo es de importancia en suelos ácidos, por ejemplo bosques de pinos (4).

3.9.3. Sulfooxidación

Los Thiobacillus son unas bacterias capaces de obtener energía por la oxidación de compuestos de azufre (sulfuro, azufre, tiosulfato) hasta sulfatos. La mayoría son autótrofos y dependen de la fijación de CO 2 como T. thiooxidans, T. denitrificans (1). Entre los heterótrofos se encuentran por ejemplo T. novellus y Sulfolobus acidocaldarius. Éste último es una arqueobacteria termofílica de las aguas termales azufradas. T. thiooxidans es un organismo aerobio que produce ácido sulfúrico y tolera una solución 1N del mismo. El agregado de azufre permite neutralizar suelos calizos y reducir la incidencia de algunos patógenos vegetales debido a la acidificación provocada por los sulfooxidantes del suelo. T. denitrificans puede reducir nitratos anaeróbicamente pero no lleva a cabo una reducción asimilatoria y necesita la presencia de sales de amonio en el medio (3). Las bacterias filamentosas Beggiatoa y otras pueden oxidar sulfuros a azufre elemental que se acumula en la célula. Algunas especies de Beggiatoa son organismos heterotróficos (1).

3.9.4. Ferrooxidación Las siderobacterias (por ejemplo Gallionella ferruginea y Leptothrix ochracea) pueden oxidar los iones ferrosos a férricos, y también Thiobacillus ferrooxidans. La vaina de la

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bacteria filamentosa Leptothrix está recubierta de sales férricas. Gallionella excreta un mucus que se impregna de hidróxido férrico formando una especie de pedúnculo (1).

3.10. Biosíntesis En el metabolismo normal, todos los compuestos que necesita la célula se sintetizan en la cantidad justa. Este control se realiza por una serie de reacciones reguladoras estrictas que detienen la formación de productos intermedios y finales de una reacción metabólica, cuando un compuesto dado alcanza una determinada concentración. Sin embargo, existen mutantes en los que el mecanismo de regulación es tan defectuoso que hay una sobreproducción de algunos metabolitos y los excretan al medio, lo que es aprovechado en la producción industrial (13).

3.10.1. Síntesis de proteínas

Casi todos los organismos están capacitados para convertir el nitrógeno inorgánico en proteínas y ácidos nucleicos. El N puede asimilarse en forma de iones amonio y por algunas especies en forma de iones nitrato. Ningún moho o ni levadura fijan nitrógeno gaseoso como lo hacen algunas bacterias, por ejemplo, Azotobacter que vive libre en el suelo y Rhizobium que crece como simbionte en los nódulos de las raíces de leguminosas (14). La mayoría de los microoorganismos son capaces de sintetizar todos los aminoácidos requeridos para síntesis de proteínas. El grupo amino es introducido por aminación directa o por transaminación. La asimilación del nitrógeno molecular, así como la de nitrato y nitrito implica una reducción a amonio antes de su incorporación al compuesto orgánico (4). La figura 33 muestra las rutas más importantes de incorporación de nitrógeno para formar los aminoácidos y la 34 los caminos de síntesis de los aminoácidos La información contenida en el ADN no es transferida directamente durante la síntesis de proteínas que ocurre en los ribosomas. El intermediario es el ARN mensajero (ARNm) monocatenario sintetizado sobre una sola cadena del ADN efectuando la

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Leonor Carrillo. 2003. Microbiología Agrícola. Capítulo 3 transcripción de la información. Los aminoácidos son reunidos en una cadena polipeptídica según la secuencia determinada por el ARN-m dura nte la traducción que implica la participación del ARN de transferencia de los aminoácidos (ARN-t), el ribosoma, varias enzimas y ATP. La figura 35 muestra un esquema de la biosíntesis de las proteínas en bacterias.

3.10.2. Fijación de N 2 (ver 2.9)

La expresión de la nitrogenasa en los bacteroides se modifica por diversos factores aportados por la planta. Una vez establecida la simbiosis, la enzima nitrogenasa se inhibe en presencia de nitrógeno combinado y cesa cuando comienza el desarrollo de las semillas en la planta hospedadora (senescencia de los nódulos). Otros factores que afectan la fijación son la presencia de hidrogenasa (que aumenta el rendimiento de la misma) y circunstancias ambientales como la temperatura (17). En la figura 36 se muestra un esquema de la actividad metabólica en el nódulo. La capacidad para fijar nitrógeno molecular se observa en muchos organismos procarióticos de vida libre. La reacción química responsable del proceso de fijación consiste en la transferencia de seis electrones al N2 para dar NH4 + con el aporte de energía en forma de ATP. La reacción debe estar acoplada a la fermentación o a la respiración de azúcares u otros compuestos energéticos, o bien a la fotofosforilación del ADP, para que transcurra espontáneamente. Los electrones son provistos a través de ferredoxina y flavodoxina. El sistema nitrogenasa está constituído por dos enzimas: la dinitrogenasa reductasa o componente II y la nitrogenasa propiamente dicha o componente I. La dinotrogenasa reductasa tiene dos subunidades idénticas y el grupo prostético es un centro sulfoférrico. El componente I es un tetrámero con dos subunidades alfa y dos beta, que contienen átomos de hierro y molibdeno (4). Algunas bacterias no-nodulantes capaces de fijar nitrógeno molecular (6) aeróbicos facultativos anaeróbicos fototróficos Azotobacter Klebsiella Desulfovibrio Chromatium Azomonas Bacillus polymyxa Desulfotomaculum Rhodospirillum Alcaligenes Methanobacterium Rhodobacter Xanthobacter Methanosarcina Heliobacter Beijerinckia Clostridium Chlorobium Derxia Cianobacterias Azospirillum Anabaena Nostoc En algunas bacterias fijadoras de vida libre la nitrogenasa contiene vanadio en lugar de molibdeno. Además de reducir el nitrógeno molecular, la nitrogenasa puede reducir los H + a H 2 y también otros compuestos como se observa en la figura 37. Casi todas las bacterias fijadoras tienen, unida a la membrana, una hidrogenasa (con níquel en su grupo prostético) como protección del sistema nitrogenasa, que transfiere electrones desde el H2 al O2 difundido hacia adentro de la célula (6). Dada la rápida inactivación

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de la nitrogenasa en presencia de oxígeno, los microorganismos fijadores has desarrollado diversas estrategias para evitarla: una alta tasa respiratoria, la formación de estructuras protectoras, la compatimentación celular o un crecimiento en condiciones anaeróbicas o microaerofílicas (17). Las cianobacterias filamentosas son tolerantes al oxígeno ambiental debido a que la actividad nitrogenasa se localiza generalmente en una célula especial, llamada heterocisto. Los heterocistos poseen una pared poco permeable al oxígeno y pueden generar ATP por fotofosforilación cíclica y fosforilación oxidativa, con lo cual se eliminan las trazas de O2 . El poder reductor necesario para la fijación proviene de las otras células que tienen los dos fotosistemas (6). En la mayoría de los microorganismos fijadores de N2 de vida libre, el amonio producido es asimilado para formar glutamina (4).

3.10.3. Síntesis de otros compuestos Los nucleótidos de purina y pirimidina son las unidades para la síntesis de los ácidos nucleicos. También forman parte de algunas coenzimas. La parte glicosídica deriva de la ribosa-5-fosfato cuya reducción a desoxirribosa ocurre a nivel del nucleótido (6). La figura 38 muestra los precursores de purinas y pirimidinas. Entre los lípidos bacterianos predominan los ácidos grasos saturados o monoinsaturados, los triglicéridos y esteroides son raros. Los más importantes son los lípidos complejos donde un grupo OH del glicerol está esterificado con fosfato o un azúcar. El grupo fosfato a su vez está esterificado con serina, etanolamina o glicerol. La formación de los ácidos grasos de cadena larga implica la condensación, en pasos sucesivos, de los grupos acetilo al butiril-ACP, alargando cada vez la cadena en dos carbonos (6) como se muestra en la figura 39. Cuando las bacterias crecen sobre lactato, piruvato, acetato u otro

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Leonor Carrillo. 2003. Microbiología Agrícola. Capítulo 3 compuesto, se desarrollan rutas metabólicas adicionales (reacciones anapleróticas) para mantener funcionando el ciclo de los ácidos tricarboxílicos (figura 20) y proveer moléculas intermediarias para la síntesis de los azúcares (6). La figura 40 muestra un esquema de la biosíntesis de glúcidos. Muchas bacterias autotróficas y fototróficas, así como las cianobacterias y las plantas, fijan CO2 como única fuente de carbono a través del ciclo de la ribulosadifosfato (figura 41). Pero las metanogénicas y acetogénicas, que también son autotróficas, lo hacen por la vía reductora del acetil-CoA, mientras que las bacterias verdes del azufre fijan CO 2 por el camino reductor en el ciclo del citrato (4) como se muestra en el cuadro de la página siguiente. La actividad de los pigmentos en la fotosíntesis de las eubacterias no libera oxígeno como ocurre con las cianobacterias y las plantas. Hay dos tipos de bacterias de color púrpura, rojo o pardo porque contienen carotenoides, uno comprende a las anaeróbicas (por ejemplo Chromatium dependiente del azufre y Rhodospirillum no dependiente) y otro a las aeróbicas (por ejemplo Erythromonas ). En cuanto a las verdes, algunas, por ejemplo Chlorobium, utilizan H2 S como dador de electrones y otras, por ejemplo Chloroflexus, no. Otras bacterias fototróficas anaeróbicas y esporuladas, frecuentes en suelos tropicales anegados, están reunidas en el género Helicobacterium. Cualquiera sea el mecanismo de captación de la luz y transporte de electrones, se genera una fuerza motriz de protones que permite sintezar ATP (fotofosforilación) (18). La figura 28 resume los contrastes del metabolismo autotrófico frente al fototrófico y la figura 42 muestra el transporte de electrones en algunas bacterias púrpura. Los metabolitos secundarios son compuestos no requeridos para la biosíntesis celular. Estos productos son sintetizados por algunos microorganismos, generalmente en las últimas fases del ciclo de crecimiento. Los ejemplos más conocidos son los antibióticos, otros son las micotoxinas. Los metabolitos secundarios no desempeñan un papel directo en el metabolismo energético ni en el crecimiento del organismo, sino que contribuyen a la supervivencia del organismo al inhibir la acción de competidores que pudieran ocupar el mismo nicho ecológico (14). Ver 6.1.

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Fijación autotrófica del CO2 (4) Vía reductora del acetil-CoA Ø Bacterias fermentadoras homoacetogénicas • Clostridium thermoaceticum • Acetobacter woodii • Sporomusa sp Ø La mayoría de las bacterias reductoras del sulfato • Desulfobacterium autotrophicum • Desulfovibrio baarsii Ø Bacterias metanogénicas • Methanobacterium thermoautotrophicum • Methanosarcina barkeri Ciclo reductor del ácido tricarboxílico Ø Bacterias verde del azufre • Chlorobium limicola Ø Bacterias termofílicasdel hidrógeno • Hydrogenobacter thermphilus Ø Algunas bacterias reductoras del sulfato • Desulfobacter hydrogenophilus Ciclo de la ribulosa difosfato Ø Bacterias fototróficas anoxigénicas • Chromatium vinosum • Rhodospirillum rubrum Ø Bacterias quimioautotróficas • nitrificantes • oxidantes del azufre • bacterias del hidrógeno y el CO • oxidantes del hierro Ø Organismos fototróficos oxigénicos • Cianobacterias • Algas y plantas

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4. Estructuras de los hongos 4.1. Somáticas Micelio es el conjunto de filamentos y un trozo del mismo se denomina hifa. Las hifas pueden presentar septos y entonces el micelio está tabicado. Septos primarios son los formados cuando hay división nuclear y adventicios los otros. Si los tabiques están ausentes se habla de micelio continuo. Los mohos son micromicetos filamentosos. Cuando el hongo es una célula aislada se dice unicelular o levadura . Los cortos filamentos compuestos por las células que brotan de una levadura constituyen el pseudomicelio. Plecténquima es un conjunto de hifas entrelazadas que se asemejan a un tejido. Se dice prosénquima si las hifas pueden ser reconocidas y pseudoparénquima cuando han perdido su individualidad. Esclerocio es un plecténquima generalmente macroscópico que puede permanecer en vida latente. Rizomorfa es un cordón grueso donde el conjunto de las hifas fusionadas ha tomado el aspecto de raíz. Rizoides son las hifas de succión, como raicillas, que penetran en el substrato. Haustorio es la hifa de succión del hongo parásito dentro de la célula del hospedador. Apresorios son unas hifas achatadas que se adhieren al substrato o al hospedador como sostén, especialmente en el comienzo de la infección.

4.2. Reproductoras Anamorfo es el hongo con multiplicación asexuada y teleomorfo es el mismo con reproducción sexuada. Se les asigna distinto género y especie. Holomorfo indica el ciclo de vida total. Esporas son los elementos de perpetuación de la especie. De acuerdo a la morfología reciben distinto nombre: alantospora con forma de banana, aleuriospora con base plana, dictiospora

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Leonor Carrillo. 2003. Microbiología Agrícola. Capítulo 4 con septos longitudinales y transversales, didimospora con un tabique, equinulada como un erizo, escolescospora como un gusano, estaurospora como una estrella, feospora de color obscuro, fragmospora con tabiques transversales, fusiforme como un huso, helicospora como una espiral, hialospora de color claro y translúcido, planospora móvil, verrucosa con verrugas, zoospora con flagelos. Las balistosporas son proyectados violentamente una vez maduras. Las hipnosporas son aquéllas capaces de permanecer con vida latente por largo tiempo. Las esporas pueden ser de origen asexuado (mitosporas) o sexuado (meiosporas), y por su ubicación relativa internas o externas. Las mitosporas se originan en las estructuras anamórficas y las meiosporas en las teleomórficas.

4..3. Anamórficas Artrosporas o artroconidios son esporas desarrolladas en una hifa terminal que al madurar se separan. En algunos hongos se forman artrosporas separadas por una zona libre de citoplasma (disyuntor) cuya pared se rompe liberando las entosporas o clamido-artrosporas. Clamidospora o clamidoconidio es una hipnospora o célula de resistencia, terminal o interh ifal, con pared gruesa y substancias de reserva. Blastosporas o blastoconidios son las esporas que se originan de una parte de una célula somática, una hifa, un conidióforo u otra espora, y se desarrollan antes de la formación del septo que lo separa de la célula de origen. Conidios o conidiosporas son las esporas asexuadas externas. Si están implantadas directamente sobre la hifa se llaman sésiles. La parte del micelio que origina y sostiene a las esporas se denomina esporóforo y si se trata de conidios se dice conidióforo. Fiálide es la célula conidiógena que desde un extremo origina por brotación y sin aumentar su longitud, los fialoconidios o fialosporas. La pared de la fiálide suele extenderse en el ápice formando un collarín. Anélide es una célula conidiógena con el ápice ancho y cicatrices en anillo, que se alarga con la formación de cada espora. Los conidióforos pueden ser simples o ramificados y a veces están agrupados en un conidioma. En Penicillium cada nivel de ramificaciones recibe distinto nombre, se llama métulas a las que sostienen a las

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fiálides productoras de esporas. En Aspergillus las fiálides o las métulas están implantadas sobre una vesícula o dilatación del esporóforo. Los conidios nacen de los conidióforos aisladamente o quedan reunidos, ya sea en una cabezuela mucosa o en cadenas. Éstas se forman por sucesión basípeta cuando todos las esporas surgen de la célula conidiógena o basífuga si es por brotación de la espora anterior. A veces después que se forma un conidio, el conidióforo se alarga lateralmente y origina el segundo conidio. El proceso continúa y las esporas quedan en zig-zag (proliferación simpodial). En algunos hongos surgen, simultáneamente o no, varios conidios en diferentes puntos de la misma célula conidiógena (brotación múltiple). Los conidióforos suelen estar reunidos en un haz llamado coremio o sobre un conjunto de hifas entrelazadas constituyendo un conidioma, ya sea un esporodoquio (almohadilla de fiálides con las esporas expuestas) o una acérvula (estructura chata y cubierta al principio por el tejido del hospedador donde los esporóforos están en empalizada). Funículo es una cuerda de hifas de las cuales surgen, a intervalos, los conidióforos. Picnidio es un conidioma globoso o en forma de pera, cuya pared plectenquimatosa está recubierta internamente por las células conidiógenas y está abierto por un ostíolo. Las esporas originadas se llaman picnidiosporas. También la cavidad picnidial puede estar encerrada en una estructura somática compacta denominada estroma. Esporangio es una estructura globosa con una membrana peridial simple, generalmente en el extremo de un esporangióforo, que contiene innumerables esporangiosporas. El ápice dilatado del esporangióforo se llama columela. Cuando el esporangio tiene pocas esporas se denomina esporangiolo. Los merosporangios son cilíndricos, contienen pocas esporas y están reunidos sobre la columela o los extremos de las ramas del esporangióforo; si son monosporados suelen ser considerados como conidios. Los zoosporangios de los hongos acuáticos o parásitos contienen zoosporas móviles. Conidiosporangio es el zoosporangio inmaduro liberado por algunos hongos.

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4.4. Teleomórficas Gametas son las células diferenciadas que se fusionan y gametangios las estructuras que las producen. Homotálicos son los hongos que forman los gametangios de distinta polaridad en el mismo micelio. Cuando cada micelio da sólo gametangios de la misma polaridad, es necesario enfrentar dos micelios distintos del mismo hongo heterotálico para originar las esporas sexuadas. En muchos macromicetos se produce la somatogamia o fusión de células no diferenciadas que originan un micelio dicariótico, a veces con una conexión hifal a manera de puente (fíbula) entre cada célula. Las oosporas son hipnosporas sexuadas originadas por heterogamia. La estructura femenina u oogonio produce unos elementos grandes inmóviles u oosferas que en algunos hongos se fusionan con los anterozoides (zoosporas) producidos en la estructura masculina o anteridio, y en otros se ponen en contacto con el anteridio por medio de los tubos de fertilización. Las zigosporas son hipnosporas sexuados formados por isogamia. La hifa emite un mamelón en el que se diferencian dos partes: suspensor y gametangio. Los gametangios se fusionan originando la zigospora que suele estar rodeada por hifas protectoras nacidas de los suspensores. Ascosporas son las esporas sexuadas internas que se originan en un número limitado (generalmente 4 u 8) dentro de una célula llamada asco. En las levaduras se fusionan los citoplasmas de dos células de polaridad distinta e inmediatamente o mucho después de la cariogamia ocurre la meiosis formándose las ascosporas dentro del asco libre. En los hongos filamentosos se producen gametangios (anteridio y ascogonio), en general morfológicamente distintos, y los núcleos pasan a través del poro formado en el punto de contacto o de un tubo receptivo llamado tricogino. En algunas especies heterotálicas los espermacios, microconidios incapaces de germinar, cumplen la función de gametas masculinas. Después de la fecundación nacen hifas ascógenas binucleadas cuyas células terminales, en forma de cayado, se convierten en ascos. Las hifas somáticas vecinas a los elementos sexuales suelen formar un plecténquima originando un ascoma que si está cerrado y es esférico se llama cleistotecio. Cuando tiene las hifas fértiles (himenio) estratificadas y generalmente una forma de pera, poseyendo en la madurez un poro u ostíolo por donde salen las ascosporas, se denomina peritecio. Si el plecténquima tiene forma de copa con el himenio expuesto se habla de

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apotecio. El ascostroma es una estructura con cavidades o lóculos que contienen ascos. Los ascos tienen distinta forma según las especies, pueden ser sésiles o pedicelados, estar organizados en un fascículo común o nacer independientemente. Con frecuencia hay entre los ascos hifas estériles alargadas llamadas parafises. En el ostíolo suele haber hifas cortas como pelos, las perifises. Algunos ascomas tienen hifas ornamentales. La liberación de los ascos puede ser explosiva o no. En algunos ascos se abre un opérculo en el momento de liberar las esporas. Los ascos bitunicados tienen dos paredes y la externa se rompe, dejando expandirse la interna, antes de la descarga de las ascosporas. Basidiosporas son las esporas sexuadas externas que se originan en el basidio. Este es una célula hifal binucleada que sufre cambios morfológicos y se llama probasidio al estado o parte de la misma donde se produce la cariogamia. Se denomina metabasidio a la parte o estado en el cual ocurre la meiosis y forma 4 (a veces 2) tubos pequeños o esterigmas en cada uno de los cuales se forma una basidiospora. Hay dos tipos de metabasidios. El holobasidio es cilíndrico o con aspecto de clava y en algunos hongos tiene forma de tenedor. Los fragmobasidios están divididos generalmente en 4 células por septos transversales o longitudinales. En muchos hongos las hifas se agregan para formar un basidioma macroscópico y en aquéllos con el himenio expuesto, las basidiosporas están sobre unas laminillas radiales o tubos o espinas ubicados generalmente en el envés. Algunos basidiomas son como una sombrilla extendida (píleo) sostenida por un pie que a veces tiene un anillo o resto de una membrana que unía al píleo con el pie. Otras veces hay en la base una volva o resto de un velo que envolvía a todo el basidioma joven. Hay hongos cuyos basidiomas se asemejan a un abanico, en otros son cilíndricos, esféricos o coralinos. En el basidioma

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cerrado el peridio envuelve a la gleba fértil y se rompe cuando las esporas están maduras. En las royas y carbones el probasidio es una espora de pared muy gruesa llamada teliospora o teleutospora, que germina formando un tubo o metabasidio que dará origen a las basidiosporas. En el micelio uninucleado de algunas royas se forma el espermogonio o picnio que da gametas llamadas espermacios o picnosporas y lleva las hifas receptivas en la parte exterior, pero no hay autogamia. Las células binucleadas formadas como resultado de la espermatización constituyen el estrato basal del ecidio y comienzan a dividirse produciendo cadenas de ecidiosporas. Por germinación de una ecidiospora surge un micelio binucleado que origina el uredosoro con las uredosporas generalmente de largos pedicelos. Éstos al germinar dan otra vez un micelio dicariótico que puede formar nuevas uredosporas o bien teleutosporas con células binucleadas y paredes gruesas en el teliosoro o teleutosoro. En los carbones el micelio binucleado se forma por fusión de dos células compatibles de diverso tipo y constituye un soro de teleutosporas o ustilosporas. Cada una de éstas al germinar se convierte en un metabasidio sin esterigmas que origina las basidiosporas o esporidios por brotación.

Referencias 1. 2.

Barnett HL, Hunter BB. Ilustrated Genera of Imperfecti Fungi. APS Press, St. Paul, Minnesota, 1998. Bresinsky A. Plantas Inferiores. pp. 553 -757 en: Denffer Dv, Ehrendorfer F, Bresinsky A, Ziegler H.

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5. Rumen y biogas La combinación del reciclado de residuos animales con el cultivo de abonos verdes pueden proporcionar el nitrógeno necesario para la tierra agrícola. El reciclado puede hacerse mediante digestión anaeróbica, pues el contenido relativo de nitrógeno es mayor en el estiércol digerido que en el fresco. El lodo remanente en el digestor es una alternativa para mejorar los suelos hortícolas (1). Además este proceso permite obtener metano, un combustible gaseoso. La metanogénesis ocurre naturalmente en el rumen de los herbívoros. El aumento del interés popular para contrarrestar la polución ambiental hace de la digestión anaeróbica el medio conveniente para tratar tanto los efluentes líquidos como los desechos sólidos, además de constituir una fuente alternativa de energía.

5.1. Metanogénesis El dióxido de carbono es común en la naturaleza y es un producto importante del metabolismo energético de los organismos quimioorganotróficos. Los procariotas reductores de CO2 más importantes son los metanógenos, un grupo de arqueobacterias anaeróbicas estrictas que emplean generalmente el H2 como donante de electrones (2) . Hay por lo menos diez substratos que se convierten en metano por la acción de uno u otro metanógeno, todos los cuales liberan energía adecuada para la síntesis de ATP, incluyendo formiato, acetato, metanol, metilmercaptano y metilamina (3). Se los divide en tres clases: Substratos del tipo CO2 4 H2 + CO 2 à CH4 + 2 H2 O 4 HCOO- + 4 H + à CH4 + 3 CO2 + 2 H 2 O 4 CO + 2 H 2 O à CH4 + 3 CO2 Sustratos con grupo metilo 4 CH 3 OH à 3CH4 + CO2 + 2 H 2 O CH3 OH + H 2 à CH4 + H2 O 4 CH 3 NH 3 Cl + 2 H2 O à 3 CH4 + CO2 +4 NH4 Cl Substrato de acetotróficas CH3 COO - + H2 O à CH4 + HCO 3 La conversión de acetato a metano aparece como un proces o ecológico muy importante en digestores de residuos y en medios anóxicos de agua dulce, donde no hay una competencia excesiva por el acetato con otras bacterias. A pesar de que la producción de metano está muy extendida, son pocos los compuestos de carbono que sirven como precursores directos de la metanogénesis. Por lo tanto, es un proceso que depende de la producción de esos compuestos por otros organismos, a partir de la materia orgánica compleja (2) . En muchos ambientes anóxicos los precursores inmediatos del metano son el H2 y el CO2 que se generan por las actividades de los organismos fermentadores. En el proceso general de producción de metano a partir de la fermentación de un polisacárido, como la celulosa, pueden intervenir hasta cinco grupos fisiológicos de procariotas (3) . Las bacterias celulolíticas rompen la molécula de celulosa, de peso molecular elevado, en

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Leonor Carrillo. 2003. Microbiología Agrícola. Capítulo 5 celobiosa y glucosa libre. Por acción de los fermentadores primarios, la glucosa origina ácidos orgánicos, alcoholes, H2 y CO2 . Todo el hidrógeno producido es consumido inmediatamente por las bacterias metanogénicas, las acetogénicas o las reductoras de sulfato si éste se halla en alta concentración. Además el acetato puede ser convertido en metano por otros metanógenos (2) .

Etapas de la digestión anaeróbica § Hidrólisis de los polímeros complejos § Acidogénesis por fermentación de los monómeros produciendo acetato, propionato, butirato, succinato, alcoholes, H2 y CO2 § Acetogénesis por fermentación secundaria generando acetato, H2 , CO2 § Metanogénesis a partir de H2 , CO2 , acetato Los organismos clave en la conversión de compuestos orgánicos complejos a metano son los fermentadores secundarios, especialmente las bacterias oxidantes de ácidos grasos o alcoholes que producen H2 ,. pues utilizan estos compuestos como fuente de energía en cultivos mixtos con un consumidor de H2 a través de una relación sintrófica (sintrofia = comiendo juntos). La energía libre asociada a las conversiones de los ácidos grasos es positiva, pero si la concentración de H2 se mantiene muy baja debido al consumo constante por los metanógenos pasa a tener signo negativo lo que determina su factibilidad. En la mayoría de los ecosistemas anóxicos, la acetogénesis limita el proceso global porque la velocidad de crecimiento de los microorganismos intervinientes es generalmente muy lenta (3) . Los metanógenos están muy extendidos en la tierra a pesar de su metabolismo especializado. Aunque la producción de metano se produce en gran cantidad en los ambientes claramente anaeróbicos como pantanos, zonas encharcadas o rumen, el proceso también se lleva a cabo en lugares como los suelos de bosques o praderas que podrían ser considerados aerobios, debido a la formación de microambientes anóxicos en el interior de las partículas de suelo (4). La magnitud de la producción de metano por las arqueobacterias es superior a la obtenida anualmente de los pozos de gas natural. Las principales fuentes son los eructos de los rumiantes y el gas liberado en las zonas pantanosas. También se lleva a cabo la metanogénesis en el intestino de los vertebrados y de los insectos que comen madera como las termitas. Se han encontrado metanógenos viviendo como endosimbiontes de amebas y flagelados de vida libre acuática o albergados en el tubo digestivo de invertebrados (3) . La metanogénesis se observa con más frecuencia en los ambientes terrestres y las aguas continentales que en el mar, debido a las proporciones más bien altas de sulfato presentes en aguas y sedimentos marinos donde las bacterias reductoras de sulfato compiten con las poblaciones metanogénicas por el acetato y el H2 disponibles (4). En el océano los principales precursores de metano son las metilaminas apenas utilizadas por los reductores de sulfato, como la trimetilamina que es un producto importante de excreción en los animales marinos (3) .

5.2. Arqueobacterias metanogénicas Se clasifica a las metanobacterias en siete grupos principales que comprenden un total de 17 géneros. Hay bacilos cortos y largos, cocos con variada ordenación, células en forma de placas y metanógenos filamentosos. Unos son Gram positivos, otros Gram negativos (5) .

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Cuando los metanógenos crecen de forma autotrófica, el CO2 es la principal fuente de carbono, sin embargo el crecimiento de casi todos ellos es estimulado por el acetato y en algunas especies por ciertos aminoácidos. En cultivos de laboratorio algunos metanógenos del rumen necesitan de una mezcla de ácidos grasos (3) . Todos los metanógenos utilizan NH + como fuente de nitrógeno y algunas especies fijan N2 (Methanosarcina, Methanococcus). El níquel es un componente de una coenzima metanogénica y está además presente en las enzimas hidrogenasa y COdeshidrogenasa. Estos organismos también requieren hierro y cobalto para su crecimiento. Tienen algunas coenzimas exclusivas que son portadoras de C1 o intervienen en las reacciones de óxido-reducción como donadores de electrones (2) . La reducción del CO 2 por lo general depende del H2 , pero el formiato, el CO e incluso el Feº sirven como donadores de electrones. El Feº es oxidado a Fe++ y los electrones liberados se combinan con los protones para formar H 2 , que es el donador inmediato en la metanogénesis. También los alcoholes pueden aportar electrones en unos pocos casos (2). En condiciones normales la variación de energía libre durante la reducción de CO2 a metano con H2 es -131 kJ/mol, pero debido a la influencia de la concentración de los reactantes en los ambientes naturales baja a cerca de -30 kJ/mol. La concentración de H 2 en las zonas meta nogénicas no es mayor a 10 mM (3) . La etapa terminal de la metanogénesis es la de conservación de la energía. La reducción está asociada con la extrusión de protones a través de la membrana, creando una fuerza motriz de protones. La utilización del gradiente de protones mediante una ATPasa integrada a la membrana, impulsa la síntesis de ATP (2). Las metanobacterias autotróficas convierten el CO2 en material celular a través de la vía del acetil-CoA utilizada también por las bacterias homoacetogénicas y las reductoras de sulfato, pero a diferencia de estas últimas los metanógenos integran las vías biosintética y bioenergética porque comparten intermediarios comunes. Las reacciones de la vía del acetil-CoA también están estrechamente relacionadas con la producción de metano a partir de compuestos de metilo o acetato. El crecimiento de metanobacterias sobre compuestos de metilo también está ligado a la bomba de protones para la síntesis de ATP, pero en ausencia de H2 la generación de los electrones necesarios requiere que alguno de los substratos se oxide. Esto se produce por una bomba de sodio ligada a la membrana citoplasmática, que establece un gradiente de sodio a través de la misma y conduce a la oxidación de grupos metilo a CO2 (3) .

5.3. Rumen Los rumiantes son mamíferos herbívoros que poseen un órgano especial en cuyo interior se lleva a cabo la digestión de celulosa y otros polisacáridos mediante la actividad microbiana, porque estos animales carecen de las enzimas necesarias para digerirlos. El rumen tiene un tamaño relativamente grande, con una capacidad de 100 a 150 litros en una vaca o 6 litros en una oveja, y se encuentra a una temperatura y acidez constantes (39°C, pH 6,5). La naturaleza anóxica del rumen es un factor significativo

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Leonor Carrillo. 2003. Microbiología Agrícola. Capítulo 5 para su funcionamiento (2) . El forraje llega al rumen o panza, mezclado con la saliva que contiene bicarbonato y allí es sometido a un movimiento rotatorio durante el cual ocurren las fermentaciones. Esta acción peristáltica facilita la adherencia microbiana al material celulósico suspendido (3) .

Figura 5.1. Digestión anaeróbica en el rumen (3)

El alimento permanece en el rumen de nueve a doce horas. El fluido ruminal contiene gran cantidad de células, entre ellas 1010 a 1011 bacterias /mL. Las bacterias y los hongos celulolíticos actúan produciendo el disacárido celobiosa y glucosa. Ésta experimenta una acción bacteriana en la que se forman principalmente los ácidos acético, propiónico y butírico, dióxido de carbono y metano (figura 1). Los ácidos grasos atraviesan la pared del rumen y pasan a la sangre. Desde allí van a los tejidos donde son utilizados como la principal fuente de energía. Además los microorganismos del rumen sintetizan aminoácidos y vitaminas esenciales para el animal (3) . La masa de forraje pasa gradualmente a la redecilla donde se forman unas porciones llamadas rumias que regresan a la boca y son masticadas otra vez. Cuando esta masa sólida queda bien fragmentada es engullida de nuevo pero pasa directamente al libro y termina en el cuajar, donde las condiciones son ácidas y allí se inicia un proceso digestivo que continua en el intestino. Muchas de las células microbianas formadas en el rumen son digeridas y constituyen la principal fuente de proteínas y vitaminas del animal, dado que la pastura es un alimento deficiente en proteínas (3) . Las reacciones químicas que ocurren en el rumen requieren la actividad combinada de una variedad de microorganismos entre los que predominan las bacterias anerobias estrictas, dado que el potencial de reducción es de -0,4 V. La concentración de O2 a ese potencial es 10-22 M. Fibrobacter y Ruminococcus son las bacterias celulolíticas más abundantes del rumen, pero también degradan xilano. Fibrobacter posee una celulasa periplásmica (entre la membrana citoplasmática y la membrana externa) por lo que debe permanecer adherido a la fibrilla de celulosa mientras la digiere, en cambio Ruminococcus produce una celulasa que es secretada. Los Ruminobacter y Succinomonas amilolíticos se encuentran en minoría, así como Lachnospira que digiere pectinas. Los productos de fermentación de estas y otras bacterias son utilizados por otros microorganismos. El succinato se convierte en propionato y CO2 , y el lactato es fermentado a acetato y otros ácidos por Megasphera y Selenomonas (3). El H2 producido en el rumen durante los procesos fermentativos nunca se acumula, ya que es utilizado rápidamente por los metanógenos (Methanobrevibacter, Methanomicrobium) para reducir CO2 a CH 4 . Otra fuente de H2 y CO2 es el formiato. La

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composición media de los gases acumulados en el rumen es aproximadamente 65% CO2 y 35% CH4 , y se expulsan al exterior por los eructos del animal. El acetato no llega a convertirse en metano dentro del rumen debido a que el tiempo de retención es demasiado corto para que puedan desarrollarse los organismos acetotróficos y además las bacterias sintróficas degradadoras de ácidos grasos no abundan. Los ácidos atraviesan la pared del rumen hacia la sangre del animal (2) . El contenido ruminal posee aproximadamente 10 6 protozoos /mL, principalmente ciliados. Muchos son anaerobios obligados, una característica poco frecuente entre los organismos eucarióticos. Los protozoos comen bacterias y ejercen algún control sobre densidad de las mismas en el rumen. También hay hongos anaeróbicos que alternan una forma flagelada y otra inmóvil. Degradan celulosa, hemicelulosas, pectinas y parcialmente lignina (2) . Las condiciones ambientales del rumen son constantes para cada tipo de alimentación. El cambio brusco de pasturas a cereales conduce a un desequilibrio en la composición microbiana que causa enfermedad o aún la muerte del animal, por el crecimiento explosivo de Streptococcus bovis que hidroliza almidón produciendo abundante ácido láctico y acidificando el rumen. Esta acidosis causa la eliminación de la microbiota normal (5) .

5.4. Digestores anaeróbicos Para producir biogas se pueden emplearse diversos materiales orgánicos tales como residuos vegetales, estiércol, basura doméstica, camalotes, algas, efluentes de las industrias de alimentos, bebidas, pulpado y papel, y químicas (6) . Durante la bioconversión de materiales orgánicos a metano las distintas etapas tienen distinta velocidad: la degradación de la celulosa ocurre en semanas, la de las hemicelulosas y proteínas en días y la de las moléculas pequeñas, como azúcares, ácidos grasos y alcoholes, en horas, pero la lignina no es degradada en la mayoría de los sistemas de digestión anaeróbica (7). El proceso en un digestor difiere de otros tipos de fermentaciones en que no es necesario utilizar cultivos puros de microorganismos. Las diversas bacterias capaces de descomponer las sustancias orgánicas y producir biogás están ampliamente distribuídas en la naturaleza. Se encuentran, por ejemplo en los excrementos animales y humanos. Estas bacterias pueden activarse y mantenerse indefinidamente con un manejo adecuado (8). El tamaño del digestor está determinado por el contenido de sólidos y el tiempo de retención del residuo para un tipo de carga dado. Los materiales insolubles, tales como papel, paja y otros lignocelulósicos, pueden requerir un tratamiento de días (o aún años en ciertos rellenos sanitarios) mientras que puede lograrse hasta una reducción del 95% con una carga diaria de 20 kg / m3 de digestor cuando el residuo es soluble (5).

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Leonor Carrillo. 2003. Microbiología Agrícola. Capítulo 5 Hay una amplia variedad de diseños pero los digestores de una sola etapa con campana fija o flotante (figuras 2 y 3) son los más usados en ambientes rurales. El estiércol digerido es recuperado como un lodo con 10 a 12% de sólidos y un sobrenadante con 2 a 3% de sólidos. La digestión ruminal está estratificada en dos sub-fases una líquida, y otra con alto contenido en sólidos donde es mayor la actividad metabólica y la concentración de intermediarios. Similarmente los digestores de dos fases tienen un mejor rendimiento en metano que los de una sola (9) . El digestor de campana fija cuyo esquema se muestra en la figura 3, tiene la cubierta inmóvil y cuenta con la presión hidrostática autogenerada para distribuir el biogás. Como se colecta el gas en el mismo digestor, parte de la suspensión digerida es desplazada hacia un tanque de almacenamiento cuyo nivel sube con la producción y baja con el uso del gas. La ventaja de este modelo consiste la ausencia de partes móviles corroíbles (10) . En la figura 2 se da el esquema de un digestor con campana colectora de gas flotante, que puede estar directamente sumergida en la suspensión o bien en el aceite retenido entre las dos paredes concéntricas del tanque para lograr el sellado. La descarga del líquido se hace por rebalse a través de un caño y la de sólidos por una abertura de inspección. La presión del gas depende del peso de la campana, por lo que suele colocarse bolsas de arena sobre la misma (6) . El digestor tipo bolsa que se muestra en la figura 4, es útil en las regiones subtropicales y tropicales (11). Otros tipos de reactores permiten el manejo de grandes cantidades de residuos por unidad de volumen generando biogas a mayor velocidad, como el de contacto anaeróbico (figura 5) (12) .

5.5. Residuos Los materiales que se pueden usar para la generación de metano son muy variados, por ejemplo: • residuos de cosechas: maloja de caña de azúcar, malezas, paja, rastrojo de míz y otros cultivos; • residuos de origen animal: desechos de establos (estiércol, orina, paja de camas), camas de gallinas ponedoras, boñigas de cabras y ovejas, desperdicios de matadero (sangre, vísceras), desperdicios de pesca, restos de lana y cuero; • residuos de origen humano: basura, heces, orina; • residuos agroindustriales: tortas de oleaginosas, bagazo, salvado de arroz, desechos de tabaco y semillas, desperdicios del procesamiento de hortalizas y frutas, limos de prensas de ingenios azucareros, residuos de té, polvo de las desmotadoras e industria textil; • mantillo forestal: ramitas, hojas, cortezas; • plantas acuáticas: camalote, algas marinas (14).

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La DQO es la cantidad total de oxígeno (en mg) necesaria para oxidar completamente las substancias orgánicas e inorgánicas contenidas en un litro de suspensión y se emplea como medida indirecta de la cantidad de substrato transformable. Otra manera de expresar la cantidad de substrato disponible es mediante los valores de sólidos totales (ST) que es el material remanente después de evaporar a 103-105°C o de sólidos volátiles (SV) que es el material orgánico descompuesto a 550 + 50°C (13) . Otro parámetro de la digestibilidad de los residuos es la demanda biológica de oxígeno (DBO) que es el consumo de oxígeno, en mg/L de suspensión, durante la degradación por microorganismos durante 5 días a 20°C. Tanto la DBO como la DQO son proporcionales al contenido de materia orgánica en la suspensión a degradar, pero la primera es más representativa de la degradabilidad de la misma. También puede usarse el valor de carbono orgánico total (COT) que se obtiene midiendo el CO 2 formado en la combustión (8) . En el cuadro siguiente se muestra la digestibilidad de algunos vegetales expresada como el % de sólidos volátiles desaparecidos luego de una incubación de 48 hs con líquido ruminal diluído en buffer fosfato-bicarbonato a 39°C y otras 48 hs con pepsinaHCl, a igual temperatura para hidrolizar parcialmente las proteínas de los microorganismos y del sustrato (7).

Material Gramíneas Brassica sp. Batatas Camalotes Algas marinas

Digestibilidad de algunos vegetales (7) Sólidos volátiles totales Sólidos volátiles digeridos % peso seco % SVT 43,3 - 99,3 15,0 - 87,0 54,6 – 89,8 33,5 – 93,8 69,0 – 97,7 41,0 – 98,7 69,7 – 88,1 12,0 – 80,1 19,7 – 74,5 21,0 – 83,4

La digestión anaeróbica de madera no es técnicamente factible sin algún tipo de pretratamiento que aumente su biodegradabilidad (5). En el recuadro siguiente se muestra la relación C/N de varios materiales residuales.

animales Desperdicios de pescado de matadero Orina Sangre Estiércol equino Estiércol vacuno Estiércol de corral Heces humanas .

Contenido de nitrógeno y relaciòn C/N en varios residuos (14) C/N %N vegetales C/N Heno 12 5,1 6,5-10 Amaranto 11 2 7-10 Alfalfa 16-20 0,8 15-18 Paja 48 3 10-14 Algas marinas 19 25 2,3 Restos de lino 58 18 1,7 Paja de trigo 128 14 2,15 Aserrín 511 6-10 5,5-6,5 domésticos basura 25 peladura papas 25

%N 4 3,6 2,4-3 1,1 1,9 1,0 0,3 0,1 2,2 1,5

Una relación carbono/nitrógeno de 16/1 se considera óptima para una buena producción de gas y para una fermentación estable de los excrementos animales (8), aunque puede obtenerse biogás a valores mayores no se debe superar la relación 30/1 (14). A continuación se indican algunas características de las deyecciones animales.

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Bovinos de carne Cerdos Gallinas ponedoras Ovinos Vacas lecheras

Características de excrementos animales (8) Kg/100kg peso vivo/día Peso Sólidos Sólidos húmedo totales volátiles 4,6 0,70 0,65 5,1 0,69 0,57 6,6 1,67 1,22 3,6 1,07 0,91 9,4 0,89 0,72

N total 0,055 0,039 0,099 0,043 0,036

Los volúmenes de gas producido suelen expresarse como m3 biogas/m3 digestor o como m3 biogas/kg DQO o DBO y difieren según el tipo de residuo, la concentración de sólidos volátiles, la relación carga/volumen del digestor, el tiempo de retención de los residuos dentro del digestor y el diseño del mismo. En general la producción oscila entre 1 y 5 m3 biogas/m3 digestor, o dicho de otra manera entre 0,3 y 0,5 m3 /kg SV (6) .

5.6. Características del biogas El cuadro siguiente resume la composición promedio del biogas según la fuente. El valor calorífico varía entre 17 y 34 MJ/m3 según el contenido de metano.

Gases Metano CO2 Vapor agua Hidrógeno H2S Amoníaco CO Nitrógeno Oxígeno Orgánicos

Composición del biogas derivado de diversas fuentes (6). Desechos Lodos Desechos Rellenos agrícolas cloacales industriales sanitarios 50 - 80% 50 - 80% 50 - 70% 45 - 65% 30 - 50% 20 - 50% 30 - 50% 34 - 55% saturación saturación saturación saturación 0 - 2% 0 - 5% 0 - 2% 0 - 1% 100 - 7000ppm 0 - 1% 0 - 8% 0,5 - 100ppm trazas trazas trazas trazas 0 - 1% 0 - 1% 0 - 1% trazas 0 - 1% 0 - 3% 0 - 1% 0 - 20% 0 - 1% 0 - 1% 0 - 1% 0 - 5% trazas trazas trazas 5ppm

Propiedades combustible ácido, asfixiante corrosivo combustible corrosivo,olor,tóxico corrosivo tóxico inerte corrosivo corrosivos,olores

La condensación del vapor es con frecuencia un problema debido a que el biogas está generalmente más tibio que las cañerías por donde pasa. Es esencial una trampa de agua y puntos de drenaje en la tubería (14) . El hidrógeno es un intermediario en el metabolismo anaeróbico y algunas bacterias pueden producir trazas de CO. La presencia de nitrógeno y/u oxígeno puede indicar una entrada accidental de aire y esto constituye un grave peligro debido al riesgo de explosiones. El oxígeno es consumido por los microorganismos facultativos dejando el nitrógeno residual (6) . Tanto el azufre orgánico, presente por ejemplo en algunos aminoácidos, y el inorgánico pueden ser reducidos a H 2 S, un gas muy tóxico y altamente reactivo con los metales tales como hierro y cobre, originando la corrosión. Esta reactividad hace que su contenido sea muy bajo en el gas de los rellenos sanitarios. Por otra parte el amonio liberado por ejemplo durante la desaminación de las proteínas, permanece en solución (14).

Leonor Carrillo. 2003. Microbiología Agrícola. Capítulo 5

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5.7. Factores ambientales Entre los factores ambientales importantes para el funcionamiento de los digestores figuran: la temperatura, la concentración de sólidos, la concentración de ácidos volátiles, la formación de espuma, la concentración de nutrientes esenciales, las substancias tóxicas y el pH (8) . Las metanobacterias sólo pueden multiplicarse cuando está avanzada la fermentación de los substratos primarios por acción de las bacterias anaerobias facultativas (por ejemplo Escherichia, Enterobacter, Klebsiella o Bacillus spp.) y se haya consumido todo el oxígeno disuelto, de manera que el potencial redox haya alcanzado en un valor menor que -200 mV. Además, el pH no debe bajar demasiado, debido a los ácidos producidos por los Clostridium, para no inhibir el crecimiento de los metanógenos (15) . Comúnmente la concentración de ácidos grasos volátiles no supera los 2 a 3 g/L, expresados como ácido acético. Si se sobrepasa este nivel, la digestión cesará en dos o tres días debido a que los metanógenos no pueden utilizar los ácidos a la misma velocidad con que se producen (8) . El pH óptimo para la digestión está entre 7,0 y 7,2, aunque el rango satisfactorio va de 6,6 a 7,6. La digestión comienza a inhibirse a pH 6,5 (14). Una vez que se ha estabilizado un digestor el lodo está bien amortiguado, es decir la concentración de protones no varía aún cuando se añadan cantidades relativamente grandes de ácido o álcali. Si esta capacidad de amortiguación se destruye y el pH disminuye cesa la metanogénesis (8). El CO2 es soluble en agua y reacciona con los iones hidroxilo para formar bicarbonato. La concentración de HCO 3 -- es afectada por la temperatura, el pH y la presencia de otros materiales en la fase líquida. Las condiciones que favorecen la producción de bicarbonato aumentarán a su vez el porcentaje de metano en la fase gaseosa (14). La gama de temperatura para la digestión anaeróbica tiene dos zonas óptimas una mesófila (30 - 40°C) y otra termófila (45 - 60°C). Casi todos los digestores funcionan dentro de los límites de temperaturas mesófilas y la digestión óptima se obtiene a unos 35°C. La velocidad de digestión a temperaturas superiores a 45°C es mayor que a temperaturas más bajas, sin embargo las bacterias son sumamente sensibles a los cambios ambientales especialmente una disminución repentina de sólo unos pocos grados (8). En la figura 6 se ven las relaciones típicas que existen entre la producción de gas y la temperatura con diferentes tiemp os de retención. Por ejemplo, en un digestor donde los residuos permanecen 12 días, la producción de gas por unidad de sólidos volátiles totales añadidos diariamente, es 20% mayor a 45°C que a 35°C. En los climas cálidos, donde no existen temperaturas de congelación, los digestores pueden funcionar sin añadir calor pero hay que aumentar en cambio el tiempo de retención. La regulación de la temperatura puede lograrse haciendo circular agua caliente a través del tanque por medio de termointercambiadores (8) . Las causas principales de una excesiva producción de ácidos volátiles son la elevada velocidad de carga, una baja temperatura y la formación de espuma que constituye una zona favorable para los acetógenos. La sedimentación

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Leonor Carrillo. 2003. Microbiología Agrícola. Capítulo 5 de los materiales fibrosos y la espuma se puede evitar mezclando el contenido del digestor (14) . Para una digestión óptima, tienen que estar presentes todos los elementos esenciales en forma fácil de asimilar por las bacterias. Se han logrado resultados satisfactorios con concentraciones mayores a 15% de sólidos, sin embargo en la práctica la gama es de 3 a 10% (8) . Los requerimientos nutritivos de DBO : nitrógeno : fósforo en la digestión anaeróbica están en la relación 700 : 5 : 1. Solo los estiércoles están nutricionalmente balanceadas. Además para el crecimiento óptimo de los metanógenos es necesario la presencia de cuatro elementos en concentraciones muy bajas: Fe 2nM, Co 10 nM, Ni 100 nM y Mo 10 nM (6). Los antibióticos empleados en las explotaciones pecuarias llegan a los excrementos pero, como ocurre también con los antihelmínticos, no suelen afectar mayormente la digestión debido a la dilución con materiales no tóxicos. Los metanógenos son sensibles a los antibióticos que afectan la síntesis de proteínas o lípidos y a los interfieren con la función de la membrana citoplasmática. La concentración de nitrógeno amoniacal debe ser inferior a 1,5 g/L si es mayor, como suele ocurrir con la gallinaza, resulta tóxico. Si bien es un amortiguador, su aumento puede llegar a impedir el proceso de digestión. También son tóxicas las sales de zinc, cobre y níquel, aunque este último es necesario en ínfimas cantidades. Las sales de los elementos alcalinos y alcalino-térreos pueden se estimulantes o inhibitorias según la concentración como se observa en el cuadro siguiente (14).

Catión Sodio Potasio Calcio Magnesio

Efecto de la concentración de algunos cationes Concentración g/L estimulante inhibitoria 0,1 – 0,2 3,5 – 5,5 0,2 – 0,4 2,5 – 4,5 0,1 – 0,2 2,5 – 4,5 0,075 – 0,15 1,0 – 1,5

(14)

muy inhibitoria 8,0 12,0 8,0 3,0

Los desinfectantes clorados son muy tóxicos aún a bajas concentraciones (