Caracterización bioquímica de bacterias mediante pruebas de fermentación de carbohidratos y metabolismo de sustratos orgánicos

Introducción Las pruebas bioquímicas son una serie de análisis clínicos que sirven como apoyo a la hora de identificar bacterias.

Su sistema de funcionamiento generalmente consiste en determinar la actividad de una via metabólica a partir de un sustrato que se incorpora en un medio de cultivo y que la bacteria al crecer incorpora o no.

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De acuerdo a los productos de su actividad química, las bacterias se pueden clasificar en: • 1. Zimógenas •

2. Aerógenas

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3. Anaerógenas

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4. Cromógenas •

5. Fotógenas

Objetivo • Conocer distintas pruebas bioquimicas • Poner de manifiesto algunas bacterias que utilizan carbohidratos y acidos organicos como fuente de carbono • Analizar e interpretar los resultados obtenidos en dichas pruebas

Medio de Kligler

Fundamento • Permite un diagnóstico rápido orientativo del tipo de enterobacteria aislado. Las enterobacterias mas patógenas no suelen fermentar la lactosa. Se detecta la producción de ácidos (acompañada o no del desprendimiento de gases) de glucosa o lactosa y producción de SH2.

REACCIONES

procedimiento

Resultados • • • •

amarillo=acidez rosa=alcalinidad negro = SH2 fractura o desplazamiento del medio = gases

CONCLUCION

Fermentación de carbohidratos prueba rojo de metilo (MR)

Fundamento La prueba de rojo de metilo es una prueba cuantitativa basada en el uso de un indicador de pH, para determinar la concentración de ion H cuando un microorganismo fermenta la glucosa La concentración del ion H depende de la relación de gases (CO2 y H2)

COMPOSICION

Reacciones : Microorganismos RM+ Glucosa + H2O

2-ácido láctico + ácido acético + etanol + 2CO2 + 2H2

Microorganismos RMGlucosa + O

2-3butanodiol + H2O + 2CO2

Procedimiento: Inocular los tubos con las sepas

Esperar la formación de un anillo rojo en la Parte superior del tubo

Incubar los tubos A 37°C durante 24 horas

Añadir al tubo RM sin agitar

• Interpretación de Resultados

antes

después

RM+ debido al anillo rojo que se formo en la superficie del tubo Las muestras RM- no se observo la presencia del anillo

Conclusión • Mediante la aplicación de esta prueba bioquímica es de importancia para la identificación de especies de bacterias que producen ácidos fuertes a partir de la glucosa

Citrato de simmons

FUNDAMENTO El metabolismo del citrato se realiza, en aquellas bacterias poseedoras de citrato permeasa, a través del ciclo del ácido tricarboxílico. El desdoblamiento del citrato da progresivamente, oxalacetato y piruvato. Este último, en presencia de un medio alcalino, da origen a ácidos orgánicos que, al ser utilizados como fuente de carbono, producen carbonatos y bicarbonatos alcalinos.

COMP Fuente de C

Citrato de sodio

Mantiene el balance osmotico

Cloruro de sodio

Sistema buffer

Fostato dipotasico

Fuente de N

Fosfato monoamonico

Cofactor encimatico

Sulfato de magnecio

Indicador de pH

Azul de bromotimos

PROCEDIMIENTO • Siembra A partir de un cultivo puro de 18-24 horas, sembrar en superficie un inóculo ligero , usando una ansa sin arrastrar el agar. Incubación A 35-37 ºC, durante 24-48 horas, en aerobiosis. Algunos microorganismos pueden requerir hasta 4 días de incubación

Interpretación de resultados Una reacción positiva se observa por el crecimiento en el medio con un intenso color azul.

negativa es indicada por la ausencia, o pobre crecimiento sin cambio de color en el medio

Colcuciones • Citrato de Simmons un medio sólido en tubo con pico de flauta el cual posee un indicador de pH (azul de bromotimol) si el microorganismo es capaz de crecer, producira ácidos organicos provenientes de la utilización del citrato

Caldo malonato

Fundamento METABOLISMO CITRATO

Principio igual al del citrato de Simmons Oxalacetato Medio y piruvato alcalino

COLORACION AZUL

Principio igual al del citrato de Simmons El malonato es un inhiobidor (inhibición competitiva) de la enzima succinico deshidrogenasa

Ácidos Orgánicos (Carbonatos y Bicarbonatos alcalinos)

COMP

Aporta nutrientes

Extracto del levadura

Fuente de N

Sulfato de amonio

Sistema buffer

Fosfato dipotásico

SISTEMA BUFFER

Fosfato monopotásico

Mantiene balance osmótico

Cloruro de sodio

FUENTE DE CARBONO

Malonato de sodio

Indicador de ph

Azul de bromotimol

Fuente mínima de C fermentable p/estimular crec

Dextrosa

Procedimento Incubar a 37˚C

INTERPRETACION DE RESULTADOS Los organismos capaces de utilizar malonato y sulfato de sodio, producen alcalinidad en el medio

El color del medio no cambia en presencia de organismos que no puedan utilizar estas sustancias

DURHAM

FUNDAMENTO

Fermentación de carbohidratos prueba Voges Proskauer (VP)

Introducción La prueba Voges-Proskauer (VP) Esta prueba se realiza para determinar la capacidad de un microorganismo de fermentar la glucosa con producción de ácido por la vía ácido mixta o con producción de un producto final neutro (acetoína) por la vía butanodiólica. Esta prueba junto con MR son muy útiles para la clasificación de Enterobacterias

Objetivo Probar la capacidad de los microorganismos de producir acetoína o acetil-metil-carbinol por descarboxilación de dos moléculas de ácido pirúvico (producto final de la glucólisis)

Fundamento • El acido pirúvico, formado en la fermentación de la glucosa, es metabolizado a través varias vías metabólicas. Una de ellas da como resultado la producción de acetoína un producto final de reacción neutra. • En presencia de oxigeno e KOH al 40%, la acetoína es convertida en diacetilo y el α naftol sirve como catalizador para producir un complejo de color rojo.

• Formula

Interpretación Agregar el alfa naftol e KOH-creatina y agitar suavemente • VP+ se observa desarrollo de un color rojo en el medio • VP- no se observa el color rojo

Procedimiento: Inocular los tubos con las sepas

Esperar la formación de un color rojo en el tubo

Incubar los tubos A 37°C durante 24 horas

Añadir al tubo alfa naftol e KOH-creatina y agitar suavemente

• Resultados

Análisis de resultados • Las muestras que resultaron ser VP+ presentaron una coloración roja en el tubo después de haber agregado los reactivos y agitarlos • Las cepas VP- después del procedimiento indicado no presentaron esa coloración roja • Algunas cepas presentaron un color naranja que puede ser un falso positivo por lo que se puede tomar el tubo y calentarlo para promover la formacion del cojor rojo

• Conclusión Esta prueba sirve para identificar a los microorganismos que llevan acabo la fermentación butonodiolica. Siendo los productos finales compuestos neutros como el butanodiol y el etanol, produciéndose acetoína que fue detectado añadiendo al medio KOH y alfa-naftol que reaccionan con este compuesto produciendo un color rojo característico

Conclusiones generales • Las pruebas bioquímicas son de gran utilidad para la determinación de los microorganismos ya que no es suficiente con una observación en microscopio, aplicando estas pruebas bioquímicas se puede saber con exactitud de que microorganismo se trata ya que se pone de manifiesto su metabolismo. (Fermentación de glucosa, sacarosa, lactosa, producción de gas, producción de sulfuros, y produccion de acidos)