Cap15 Rojo Neutro

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E����� �� ������������� ����� ��� ����������� �� �� ������� �� ������ E������ ������ ������� � Raúl Uribe Hernández 

C LASIFICACIÓN

DE L ENSAYO :

E

P�������� �� �� �� ������ ���� Los organismos vivos integran el efecto tóxico causado por la exposición a diferentes xenobióticos o contaminantes, y responden de manera integral en sus diferentes niveles de organización (subcelular, celular, tejidos, órganos y sistemas) al efecto adverso de comp compuestos uestos o mezclas de ellos. Los bioensayos proveen una medida más directa de la toxicidad ambiental relevante en los sitios contaminados que los análisis químicos, ya que integran la respuesta de los factores ambientales y de los comp compuestos uestos tóxicos. La citotoxicidad de los comp c ompuestos uestos puede ser aborada a través t ravés de pruebas cuyo fundamento es la absorción de colorantes supravitales. Tal es el caso de la aplicación de la prueba de citotoxicidad con Rojo Neutro-50 (Babich y Borenfreund, 1992). Las pruebas de citotoxicidad con este colorante supra vital y modelo biológico han sido utilizadas utilizadas ampliamente ampliamente en la evaluación de 225

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diversas sustancias, como los plaguicidas y metales pesados (Reinecke et al., 2002). Este ensayo se basa en la detección de los daños que producen los compuestos tóxicos sobre la integridad de la membrana de los lisosomas en las células y sobre el control del flujo del colorante a través de la misma. La acumulación del Rojo Neutro ocurre por entrampamiento de la forma protonada del colorante dentro del ambiente ácido del lisosoma o por unión del Rojo Neutro a cargas ácidas fijas, tales como polisacáridos ácidos dentro de la matriz del lisosoma. Como respuesta se observa una disminución en la capacidad de las células para asimilar y retener al colorante Rojo Neutro en el interior de los lisosomas, la cual es indicadora de la viabilidad celular.

M������� Cajas Petri de 110 mm; frascos de vidrio con tapón de rosca de 100 mL; jeringa desechable de 10 mL; matraces Erlenmeyer de 100 y 250 mL; matraces Erlenmeyer con tapón de rosca de 50 y 125 mL; micropipetas de 10, 50,500 y 1000 μL; pipetas graduadas de 1,5 y 10 mL; pipetas Pasteur; probetas de 50 y 100 mL; tubos con tapón de rosca de 120 mm; tubos de centrifuga de 15 mL con tapón de rosca; tubos de ensayo de 13 X 100 mm y vasos de precipitados de 50 y 100 mL.

E����� Agitador vórtex; balanza analítica; cámara Neubauer; campana de flujo laminar; centrífuga; espectrofotómetro de UV-Visible; incubadora hasta 60 °C; microscopio de contraste de fases; balanza analítica y campana de extracción.

R�������� 2-Cloroacetamida; ácido acético; Rojo Neutro 50 µg/mL en solución amortiguadora de fosfatos; azul de tripano al 0.4%; dimetilsulfóxido (DMSO); etanol absoluto; formol al 40%; cloruro de calcio; medio RPMI-1640; solución de sales LBSS (NaCl 71.5 mM, KCl 4.8 mM, CaCl 2 3.8 mM, KH 2PO4 0.4 mM, Na2CO3 4.2 mM, MgSO4 1.1 mM, Na2HPO4 0.3 mM), ajustada a pH 7.3.

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O��������� �� ������ Como material biológico se emplean celomocitos obtenidos de organismos adultos de la lombriz de tierra E. foetida con clitelo en la parte anterior del cuerpo y con peso entre 300 y 600 mg.

P������������ �� �� ������ O�������� �� ��� ����������� Cada lombriz se lava en una solución de NaCl al 4% y se coloca sobre papel filtro humedecido con la misma solución (figura 15.1). Se le aplica un masaje suave en los últimos segmentos de la región posterior del cuerpo y posteriormente se coloca en una caja Petri sobre un trozo de hielo, durante 2 minutos. Se le practica una incisión superficial a nivel de la región abdominal, posterior al segmento donde se encuentra el clitelo. El fluido celómico se extrae por medio de una pipeta Pasteur y se coloca en tubos de vidrio con 5 mL de solución LBSS. Posteriormente, el fluido se lava con solución LBSS, centrifugando a 2000 rpm a 4 ºC durante 10 minutos. Finalmente, el botón celular se resuspende en 1 mL de solución LBSS. Figura 15.1. Lombriz adulta de la especie Eisenia foetida

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C����� ������� � ������������� �� �� ���������� La suspensión celular (0.1 mL) se mezcla en un tubo de ensayo con 0.02 mL de azul de tripano al 0.4 % y se agita. Después de 3 minutos de reposo, se colocan 20 μL de la mezcla en la cámara Neubauer con un cubre objetos sobrepuesto. Se cuenta el número de células teñidas de azul en el cuadrante del centro y en los cuatro de las orillas. El número de células por mL es calculado multiplicando el promedio de los cuadrantes por el factor de dilución y por el volumen de la cámara (104). La viabilidad se calcula dividiendo el número de células viables entre el total y multiplicado por 100.

Viabilidad celular =

Número de células no teñidas Número de células totales

* 100

E����� �� ������������� ��� R��� N����� En tubos de ensayo se preparan las diluciones de la muestra problema en una serie logarítmica. En la campana de flujo laminar se adicionan 50 μL de la suspensión celular en cada uno de los tubos y se agregan 1 mL del medio de cultivo RPMI 1640. Todos los tubos se incuban a 22 °C por 24 horas en una atmósfera de CO2 al 5% (figura 15.2). La mezcla de cada tubo se centrifuga a 2,500 rpm por 5 minutos para eliminar los compuestos tóxicos. Las células se resuspenden en una solución amortiguadora de fosfatos y se vuelven a centrifugar. El botón celular se resuspende nuevamente en 1 mL de una solución del colorante Rojo Neutro (50 µg/mL). Posteriormente, todos los tubos son incubados por 3 horas en las mismas condiciones descritas anteriormente. El colorante se elimina por centrifugación a 2,500 rpm durante 5 minutos y el botón celular se resuspende rápidamente en una solución de amortiguadora de fosfatos. A cada tubo se le agregan 1.3 mL de solución de ácido acético al 1% y etanol al 50% y se dejan reposar a temperatura ambiente por 15 minutos. La absorbancia de las muestras se lee en un espectrofotómetro de luz visible a 540 nm. El porcentaje de viabilidad se calcula con la absorbancia obtenida, tomando como referencia al testigo con 100 % de viabilidad (Pérez-Zapata et al., 1998). Se calcula la concentración letal cincuenta efectuando una regresión lineal entre las concentraciones y los porcentajes de viabilidad transformados

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Figura 15.2. Preparación de diluciones para la prueba de citotoxicidad en celomocitos de lombriz de tierra

a logaritmo. El resumen general de las condiciones de la prueba se presenta en la tabla 15.1. Para las pruebas definitivas se utiliza un intervalo de concentraciones más reducido (en serie geométrica), seleccionando aquellos tratamientos en los que se observaron efectos adversos, para insertar entre alguno de ellos este nuevo intervalo de concentraciones (por ejemplo: 100, 50, 25, 12.5, 6.25, 3.125 %). Se elabora la curva dosis-respuesta de las diferentes concentraciones siguiendo el procedimiento descrito anteriormente. En cada ensayo de debe incluir un control del disolvente agregando a las muestras, un control positivo con 2-cloroacetamida y un control negativo en el que se adiciona medio RPMI-1640.

E�������� �� ���������� La prueba de citotoxicidad aguda en celomocitos de lombriz de tierra determina el potencial de toxicidad letal en el cultivo, expresado como la concentra-

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Tabla 15.1. Condiciones recomendadas para las pruebas de citotoxicidad con celomonitos de lombriz de tierra Tipo de ensayo Temperatura Calidad de luz Volumen del recipiente Volumen de la solución de prueba Edad del cultivo usado como inóculo Densidad celular inicial Número de réplicas Incubación Medio de cultivo Factor de dilución Duración de la prueba Respuesta evaluada Resultado final Criterios de aceptación de la prueba Control positivo

In vitro 22 ± 1 °C Oscuridad Tubos de 3 o 5 mL 1.0 mL 24 horas 104 a 105 células/mL Tres Con CO2 al 5 % RPMI-1640 10 24 horas Viabilidad celular CL50 Viabilidad celular igual o >90 % del control 2-cloroacetamida a 35 mg/L

Fuentes: USEPA, 1996; OECD, 1984

ción letal media (CL50). Se utiliza el método Probit, también conocido como método de unidades probabilísticas, para evaluar la relación dosis-respuesta de un contaminante sobre un organismo en términos de la CL 50 y su precisión o intervalo de confianza. Para ello se asigna el valor Probit de tablas correspondiente al porcentaje de mortalidad obtenido para cada concentración (Loomis, 1978). Después se efectua una regresión lineal mediante el método mínimos cuadrados, y utilizando los valores obtenidos de la ecuación de la recta se calcula la CL50, considerando el valor de la “y” a la mitad del número de individuos utilizados en cada lote o tratamiento. Finalmente se calcula el intervalo de confianza al 95% por medio de la desviación estándar y el valor de tablas del estadístico de “t” de student.

B����������� Babich, H. y E. Borenfreund. 1992. Neutral Red Assay for Toxicology in vitro. En: Ronald R. Watson (editor). In vitro Methods of Toxicology . Handbooks in Pharmacology and Toxicology. CRC Press, Boca Raton, EE.UU. Loomis, T. A. 1978. Fundamentos de Toxicología. Primera edición. Editorial Acribia, Zaragoza, España. 274 pp.

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Organization for Economical Cooperation and Development (OECD). 1984. Earthworm acute toxicity test. Guideline for Testing of Chemicals 207. OCDE, París 8 pp. Pérez-Zapata, A. J., M. L. Vega-Barrita y R. Uribe-Hernández. 1998. Estudio in vitro del efecto del plomo en la biosíntesis de porfirinas. Anales de la Escuela Nacional de Ciencias Biológicas 44: 127-139. Reinecke, S.A., B. Helling y A. Reinecke. 2002. Lysosomal response of earthworm (Eisenia foetida), coelomocytes to the fungicide copper oxychloride and relation to life-cycle parameters. Environmental Toxicology Chemistry  21: 1026-1031. United States Environmental Protection Agency (USEPA). 1996. Earthworm subchronic toxicity test. Ecological Effects Test Guidelines. 712-C-96-167. OPPTS 850.6200, Washington DC., EE.UU. 11 pp.