CALIFICACiÓN DE UN SISTEMA DE CLAR

 

CALI LIFFICACiÓN DE UN SISTEMA DE CLAR DR JUAN CARLOS CARLOS VAZQ VAZQUEZ UEZ LIRA DIPLO DIP LOMA MADO DO HP HPLC LC 20 2014 14

 

VERIFICACION DE DESEMPEÑO. El desempeño de un sistema de CLAR se puede evaluar   mediante el examen de las funciones clave de los distintos módulos que componen el sistema, seguido de pruebas hollís ho ísti tic cas qu que e de dessaf afía ían n el desempeño de lo loss co comp mpon onen ente tess de CLAR como un sistema integrado. La prueba holística que comúnmente se conoce como la calificación de desempeño (PQ). La prueba holística puede ser tan simple como ejecutar un método frecuentemente utilizado en el laboratorio.

 

Eansm ayeonumdooduelanr dlae vcaarilo co nentoeps,eqrauceiósn e re(OQ aliza ifisca cm iónpod OQ), ), puede proporcionar información detallada sobre el funcionamiento de los componentes individuales del CLAR. Es importante hacer tanto en el ensayo de componentes individuales como la prueba holística, para verificar el desempeño del sistema. Los atributos de desempeño comunes para cada módulo CLAR y las expectativas generales para cada atributo, se enumeran en la Tabla

 

MODULO DE BOMBEO •

Exactitud de la velocidad de flujo. Uno de los requisitos de desempeño clave para el módulo de la bomba es la capacidad para mantener un flujo exacto y consistente de la fase móvil . Esto es necesario para proporcionar interacciones estables y repetibles entre los analitos y la fase

estacionaria. •

Exactitud pobre en el flujo afectará el tiempo de rettenció re ión n y la re ressolució ión n de la separa rac ció ión n.

 

MÓDULO DE BOMBEO La exactitud del flujo de la bomba se puede evaluar   simplemente mediante el cálculo del tiempo necesario para recoger un volumen predeterminado de fase móvil a dife di fere rent ntes es aj aju ust stes es de flflu ujo jo.. Materiales: Frasco volumétrico de 5 o 10 ml Cronometro calibrado Condiciones: Condicio nes: Fase Fase móvil: agua agua desgasificada desgasificada Sin columna columna •

•

(extremo abierto) * Flujo: ajustado entre 0,5 y 3,0 mL / min Si existen sistemas de mezcla de alta presión están instalados, esta prueba se tiene que hacer en cada canal de solvente. * Para algunos equipos, por ejemplo, en el caso de caudales bajos, la verificación se realiza mediante el uso de

una columna o de un regulador de contrapresión.  

MÓDULO DE BOMBEO La exactitud del flujo de la bomba se puede evaluar   simplemente mediante el cálculo del tiempo necesario para recoger un volumen predeterminado de fase móvil a dife di fere rent nte es aj ajus uste tess de flfluj ujo. o. .

 

MODULO DE BOMBEO •

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Materiales: Frasco volumétrico de 5 o 10 mL Cron Cr onom omet etro ro ca calilibr brad ado o. Condiciones: Fase móvil: agua grado HPLC Sin Condiciones: columna (extremo abierto) * Flujo: ajustado entre 0.5 y 3.0 mL/min. Si existen sistemas de mezcla de alta p recseiórnee instcaalandaol sd , eessto alvp tien ha nstcáanda ernuteb . a* sPeara aelguqnuoes equipos, por ejemplo, en el caso de caudales bajos, la verificación se realiza mediante el uso de una colu lum mna o de un reg egu ulador de contra rap pre ressió ión n.

 

MODULO DE BOMBEO

 

MÓDULO DE BOMBEO

 

MÓDULO DE BOMBEO

 

MÓDULO DE BOMBEO EXACTITUD Y PRECISION DEL GRADIENTE

P rainiesltraarnláalisfaissedm e ógvrilae dn iendtie suam v,erslaascfaupearc ziadsaddeddeisolalvebnotm e baatrapvaéra s del tiempo mediante la variación de la composición de la fase móvil con exactitud es crucial para lograr la separación cromatográfica adecuada y reproducibilidad. La precisión de funcionamiento del gradiente puede evaluarse indirectamente mediante el control de la desviación estándar relativa de los tiempos de retención de los picos en lo los s cr crom omat atog ogra rama mas s de la las s in iny yec ecci cion ones es re repe pettid idas as..

 

MÓDULO DE BOMBEO LINEALIDAD DEL GRADIENTE

Lase exactitud y linealidad del gradiente de disolvente suministrado puede verificar indirectamente mediante la supervisión del cambio de absorbancia cuando la composición de los dos disolventes de dos canales diferentes cambia . Gradiente de alta presión se ejecuta por lo general implicando dos sistemas de solventes. Gradiente de baja presión Bombas LC suelen estar equipados con válvulas dosificadoras cuaternarias, que puede manejar hasta cuatro disolventes.

 

MÓDULO DE BOMBEO La prueba se realizará para dos canales a la vez, bomba LC de

gradiente tiene cuatro canales: A, B, C, y D. Canal llenaBcon un solvente puro tal como metanol, mientras que A el se canal se llena con un disolvente que contiene un trazador UV-activo , tal como la cafeína (15 mg por litro de disolvente), una mezcla 99,5: 0,5 (v / v) de metanol y acetona se utiliza utili za a menudo como trazador también.

 

MÓDULO DE BOMBEO LINEALIDAD DEL GRADIENTE

El perfil de gradiente está programado para variar la composición de la mezcla a partir partir de 100% A a 100% de B en un corto corto período período de tiempo, y luego volver a cambiar a 100% de A en una manera escalonada.

 

MÓDULO DE BOMBEO LINEALIDAD DEL GRADIENTE

Lase exactitud y linealidad del gradiente de disolvente suministrado puede verificar indirectamente mediante la supervisión del cambio de absorbancia cuando la composición de los dos disolventes de dos canales diferentes cambia . Gradiente de alta presión se ejecuta por lo general implicando dos sistemas de solventes. Gradiente de baja presión Bombas LC suelen estar equipados con válvulas dosificadoras cuaternarias, que puede manejar hasta cuatro disolventes.

 

MÓDULO DE BOMBEO LINEALIDAD DEL GRADIENTE

El cambio de absorbancia a partir de 100% A (línea de base) a 100% de B se frente mide yasetiempo expresa comoellaporcentaje altura H ende la disolvente grafica de absorbancia ti empo .Como B disminuye en la mezcla de disolventes, la absorbancia de UV de la mezcla debe disminuir en consecuencia. Si la composición de la mezcla 20% A y 80% de B es exacta, la altura B1, que corresponde a la absorbancia a 80% de B, debe estar cerca de 80% de la altura H. Del mismo modo, las verificación de exactitud puede ser determinada en 60%, 40%, 20%, y 0% B.

 

MÓDULO DE BOMBEO LINEALIDAD DEL GRADIENTE

La linealidad del gradiente de entrega puede ser verificada por el trazado de la absorbancia a diferentes composiciones de fase móvil, en comparación con la composición teórica, El proceso completo puede repetirse para los canales C y D.

 

MÓDULO DE BOMBEO Condiciones: Capilar de acero Inoxidable, por ejemplo, 2000 x 0,12 mm instalado en lugar de una columna

•

Detección: UV-Detector ajustado a 265 nm Fase móvil A: agua grado HPLC. Fase móvil móvil B: agua agua desgasificada desgasificada que contiene contiene 0,5%

•

de acetona Velocidad de flujo: 1,0 ml / min

•

•

 

MÓDULO DE BOMBEO

 

MÓDULO DE BOMBEO

 

MÓDULO DE BOMBEO Empezar la prueba mediante el bombeo de agua durante al menos 10 min para equilibrar el sistema. El valor de cero% al principio de la prueba es la línea base. Todas Todas las etapas se miden al comienzo de la parte horizontal de la línea, ya sea por software o manualmente en el papel de impresión, utilizando una regla

 

MÓDULO DE BOMBEO Ondulación de la composición de gradiente Es el porcentaje de ruido de la línea de 50% desde el programa de gradiente.

 

MÓDULO DE INYECCIÓN Precisión . La capacidad del inyector para extraer la misma cantidad de muestra en inyecciones repetidas es crucial para la precisión y la exactitud del área del pico o altura del pico para la cuantificación por comparación con el patrón externo. Si la variabilidad de la muestra y el estándar que se inyectan en la columna no se controlan estrictamente, el principio básico de cuantificación por estándar externo está Ninguna comparación significativa entre las seriamente respuestas comprometido. de la muestra y el estándar se pueden hacer. La exactitud absoluta del volumen de inyección no es crítico, siempre que la misma cantidad de estándar y la muestra sea inyectada.

 

MÓDULO DE INYECCIÓN Precisión.

siónaldeml evnoolusmseenis dienlye incyceic raar  rLeaalip zarencdio otnoer s sereppueetid de as dedm e osutn muestra. La desviación estándar relativa (RSD%) de la respuesta de las inyecciones se calcula a continuación para eval ev alua uarr la pr prec ecis isió ión. n.

 

MÓDULO DE INYECCIÓN CARRY OVER ( REMANENTES ). Pequeñas cantidades de analito pueden arrastrarse de la inyecc osr trey acfeocntarm mnutiefiscta raciósnigueixeancteta ade se taiódna. aEn l taerrria á inaarla lacua lar   muestra subsiguiente. El problema es más grave cuando una muestra diluida se inyecta después de una muestra concentrada. P astreavita anr telarioc latoirnyqeucecióenstádne ela maure r,ontotadm asinalacsión pac rtreuszaddeal d ineyec n contacto con la muestra (el circuito de inyección, la aguja de inyección, y el asiento de la aguja) tienen que ser limpiados efic ef icaz azme ment nte e de desp spué uéss de la in inye yecc cció ión. n.

 

MÓDULO DE INYECCIÓN CARRY OVER ( REMANENTES ). El arrastre se puede evaluar mediante la inyección de un espacio en blanco después de una muestra que contiene una alta concentración de analito. La respuesta del analilitto encontrado en la muestra blanco expresada como un porcentaje de la respuesta d mu oa ncieónntrpaodraarsreasp izín arappaure add nievellade ce osnttramcin truee. d Lae cuatifle ína eesteerrm utinlilizzaardeal para la prueba de arrastre de sistema para evaluar el desempeño de un inyector y sirve como un estándar común para comparar el dese de semp mpeñ eño o de lo loss di dife fere rent ntes es in inye yect ctor ores es..

 

MÓDULO DE INYECCIÓN

Linealidad. M chos yec res re ae dnosvsaorniacbalepa iar vouluch mos enindye e cintoye cscLiC óna. uUtnom voaltuizm dc ees md ue esvtraaria ser reál colocado en un bucle de inyección de la muestra mediante una jeringa u otro dispositivo de medición. La uniformidad del bucle de muestra y la capacidad del dispositivo de medición para depositar diferentes cantidades de muestra en una pro rop porc rciión adecu cua ada afectará a la lin inea eallid ida ad del volu lum men de inyección.

 

MÓDULO DE INYECCIÓN

Linealidad. La linealidad es importante para los métodos que requieren el u otoddeo dve olúam airóianbdlees,latsailm espucre ozm msé ltoe-nbeasjo deen lianyceucacnió tifnicavc ao s. Leal linealidad del inyector se puede demostrar mediante inyecciones, típicamente 5,10, 20, 50, y 100 ul , para cubrir el rango de 0 a 100 ul . La respuesta de la inyección se representa en función del volumen de inyección. El coeficiente de correlación de la grafica se utiliza en la evalu lua ació ión n de la lin inea eallid ida ad de la in inye yec cció ión. n.

 

MÓDULO DE INYECCIÓN

Linealidad.

 

MÓDULO DE INYECCIÓN

Linealidad.

 

MÓDULO DE DETECCIÓN UV-V Exactitud de la Longitud de onda Se define como la desviación de la lectura de longitud de onda en una banda de absorción o emisión de la longitud de onda conocida de la banda. Los efectos perjudiciales de la desviación de la longitud de onda en la evaluació ión n cualitativa y

c va de etro UVU-VVi-sV.soLna la eu spaenctittraotfio t óm esxaqcutie tudsey relavissaernosnibilrie dsapdecdto e laal medición se verán comprometidas si hay un problema de exa ex actit itu ud de lo lon ngi gittud de onda.

 

MÓDULO DE DETECCIÓN UV-V Para los ensayos de impurezas, el analito principal y las impurezas relacionadas puede tener un perfil UV muy similar. Un cambio en la longitud de onda de detección de la configuración óptima requerida por el método puede tener un

gran efecto en la cuantificación de las impurezas en relación al pico principal.

 

MÓDULO DE DETECCIÓN UV-V

Para los detectores con una funció ión n de verifific ica ació ión n de longit itu ud de de 3o6n0d,a4,1l8a, l4ín5e3a , yd5e36denu mteerino uan 6f5ilt6ronm deoólxaids oba dnedhaoslm io asebsuotric lizió an a menudo. La línea de deuterio y de las bandas de óxido de holmio son fáciles de usar, pero se limita al rango visible. La verificación de longitud de onda del rango UV, donde se realizan la mayor parte de análisis cuantitativos, se puede realizar llenando una celda de flujo con una solución de un compuesto con un espectro de absorción UV bien caracterizado . La solución se escanea en

b u sc a

de

la

absorción

máxima

y

la

mínima.

 

MÓDULO DE DETECCIÓN UV-V Evlavloar locr o  λmax deλm l esinpedcetrl ocosemp co msp aaerantd oe nc nocidoo  oλmin   λmax λmax λmin ue toarp teersmcinoanr leal exactitud de longitud de onda. Solución acuosa de cafeína (12,5 mg / ml), que es fácil de preparar y manejar, con  λmax a 272 y 205

nm y  λmin a 244 nm , se puede utilizar. Aceptación. ± 1 nm en el rango UV (200 a 380 nm ).

 

MÓDULO DE DETECCIÓN UV-V Si están incorporados en los procedimientos de ensayo para la determinación y el ajuste de exactitud de longitud de onda, siga

lca as sos insstus ruacrcel ionpr eoced s dedim el imie mient an uoalde de l rit intosta rum entin ntinua ouaci . Eción n ón. tod caso usa proc nto desc scri cont co . os los demás •

Condic iciiones: Fase móvilil:: 15% de acetonit itrrilo en agua Colu lum mna: RP18, 5   μm 30-50 x 2,1-4.6 mm o capilar 2,0 m x 0,12 mm ID Temperatura del horno: 40 ° C Velocidad de flujo: 1,0 ml / min (ajustado mediante el uso de 15% de acetonitrilo en agua)

D e tecció cción: ión:n:20a nμlálisis de 230 nm a 290 nm (DAD) Volumen de inye in yecc  

MÓDULO DE DETECCIÓN UV-V Método: DAD: Inyectar 20 μl de la solución de cafeína y registrar el

espectro espe ctro. . El máximo má ximo es a 272 es 272 de nm antraceno y el mínimo mínimoyacambiar 244 nm la . UV / VIS: VIS: llenar la celda con la solución longitud de onda onda de 248 248 a 254 254 nm en pasos pasos de 1 nm nm ; grabar grabar el máxim máximo o de absorción. absor ción. El valor valor teórico teórico es de 251 nm nm . Límites: Límites: ± 2 nm

 

MÓDULO DE DETECCIÓN

 

MÓDULO DE DETECCIÓN Linealidad de la respuesta. Dado que el analito en las muestras de interés puede variar en concentración, la capacidad de un detector para producir una respuesta lineal al variar la concentración dentro de un rango razonable, es importante para la exactitud de área de pico y la para com omp paración entre estándar are es y mues esttras. La li lin nealid ida ad de la respuesta del detector puede ser comprobado con una serie de soluciones estándar de varias concentraciones. Las soluciones acuosas de cafeína son convenientes para la medición de

linealidad.  

MÓDULO DE DETECCIÓN Linealidad de la respuesta.

El intervalo de concentración normalmente debe generar  respuestas desde cero a 1,5 UA. Absorbancia superior a 1,5 UA son más propensos a la desviación por luz parásita. Desde la grafica de respuesta frente a la concentración de lcaosncse on lutcraiocnióens, deel lcaoemfic iesntrtae ydela cre osrrpeulaecstió ue an seenptrueedla e calc ca lcul ular ar pa para ra de detter ermi mina narr la liline nea alilida dad d

 

MÓDULO DE DETECCIÓN Linealidad de la respuesta.

 

MÓDULO DE DETECCIÓN Linealidad de la respuesta.

 

MÓDULO DE DETECCIÓN El ruido y la deriva electrónica La bomba y el ruido fotométrico; intensidad baja de la lámpara, una celda de flu lujjo sucia, y la in ine estabililid ida ad térmica contrib ibu uyen al ruido global y la deriva en el detector. El ruido excesivo puede reducir la sensibilidad del detector y por lo tanto afectan a la cuantificación de los analitos de bajo nivel. La precisión de los datos está relacionada con la relaci ción ón de señal a ruido. La deriva del detector puede afectar la determinación de la línea base y la integración del pico La mayoría del software cromatográfific cos son capaces de calcula larr el ruido del detector y la deriva. Las fluctuaciones de temperatura se deben evitar 

dura du rant nte e la pr prue ueba ba..  

MÓDULO DE TERMOSTATIZAC TERMOSTATIZACIÓN IÓN Lteame na dneció CnLAse R revd aruía pfeicraietn uc raiadedela cuo lumcnoalu. m Lana rete ce ceonn 1 la a 3% por cada aumento de 1   ◦ C [17]. La capacidad de mantener estable y exacta la temperatura de la columna es fundamental para lograr el tiempo de retención deseado y los requerimientos de resolución en la separación consistentemente. Incluso para la separación realizada a tte maonstte antoer udnea ltaemcpoelruam am mp be iérnatsuerapuaem debieuntiltie za, r e plaraterm tunra a de la columna estable para evitar que el tiempo de retención de pico se desplaza debido a la variación de

temperatura en el tiempo debido al aire acondicionado y cicl ci clos os de ca cale lefa facc cció ión n / re refr frig iger erac ació ión. n.  

MÓDULO DE TERMOSTATIZAC TERMOSTATIZACIÓN IÓN

La exactitud de la temperatura del calentador de columna se evalúa colocando un termómetro calibrado en el compartimento de la columna para medir la temperatura real del compartimiento. Las lecturas del termómetro se comparan a la temperatura predefinida en 40 y 60 ◦ C. Muchos de equipos LC tiene los requerimientos fifija jado doss afabricantes ± 2 ◦ C.

 

MÓDULO DE TERMOSTATIZAC TERMOSTATIZACIÓN IÓN Exactitud de la termostatizacion Materiales: Termómetro calibrado Método: Establecer la temperatura del horno de columna a 40 ° C, esperar unos 30 minutos para equilibrar el sistema, poner un termómetro calibrado en el horno y leer la temperatura después de 10 minutos. Límites: 38 - 42 ° C.