Bombeo de Protones Levaduras

BOMBEO DE PROTONES EN LEVADURAS Y SUS PROCESOS INHIBITORIOS Daniel Tello 10118000, Laura Zamudio 11221264 Universidad Icesi Facultad de Ciencias Naturales Laboratorio de Bioquímica Santiago de Cali, Colombia Abril 24 del 2012 1. Resultados: VASO No.

1 control

2 (DNP)

3 azida

Suspensión de levadura al 20% (ml)

5

5

5

Agua destilada (ml)

40

40

40

Solución de DNP 80 mM (ml)

0.2

Solución de azida de sodio 800 (mM) (ml)

0.5

Tabla 1. Concentración 1 control 6.00

2 (DNP) 5.96

3 azida 6.07

pH después de tres minutos

5.77

5.78

5.96

pH después de seis minutos

5.65

5.74

5.90

pH a los cero minutos

Tabla 2. pH

1 control 5

2 (DNP) 5

3 azida 5

pH a los cinco minutos

5.22

5.20

5.70

pH a los diez minutos

5.00

4.94

5.65

pH a los quince minutos

4.87

4.84

5.61

pH a los veinticinco minutos

4.75

4.74

5.58

pH a los treintaicinco minutos

4.60

4.51

5.52

Solución de glucosa al 10%

Tabla 3. pH

6.1 6 Control

5.9

DNP

5.8

Azida 5.7 5.6 5.5 0 min

3 min

6 min

Gráfica 1. pH antes de añadir glucosa.

pH vs tiempo 5.8 5.6 5.4 Control

5.2 5

DNP

4.8

Azida

4.6 4.4 4.2 4 5 min

10 min

15 min

25 min

35 min

Gráfica 2. pH después de añadir la glucosa.

2. Análisis de resultados: Por teoría sabemos que el DNP actúa como un desacoplante de la cadena de transporte electrónico y el Azida como un inhibidor de la misma, lo que afecta el flujo de protones a través de la membrana mitocondrial interna. Teniendo en cuenta los procesos realizados en el laboratorio con células que realizan procesos anaeróbicos, el proceso es homologo al nombrado anteriormente que se da en células aerobias, ya que utilizan las misma moléculas para poder reducirse u oxidarse y así facilitar el transporte electrónico (NADH Y FADH), por este mecanismo, las células anaerobias mantienen un estado electrónico estacionario mediante la transferencia de electrones desde los transportadores reducidos a los aceptores electrónicos, como en la reducción del piruvato a lactato en la glucólisis anaerobia.

Para entender lo que se nombrará es menester, realizar una comparación entre los desacoplantes e inhibidores: * Básicamente los desacoplantes permiten el paso de H+ desde el espacio intermembrana hacia la matriz con generación de calor. Esto lleva a una disminución en el gradiente de H+, disminuyendo así el potencial electroquímico (negativo y alcalino en el interior), con lo que la fuerza protónmotriz que impulsa el retorno de H+ desde el espacio intermembrana hacia la matriz a través de la ATP sintasa es menor, de modo que la síntesis de ATP disminuye. * Los agentes inhibidores del transporte de electrones actúan en sitios específicos en el ensamblaje de transporte de electrones, impidiendo que se siga generando el bombeo de electrones para contribuir a la fuerza protón-motriz.

En el laboratorio pudimos comprobar la teoría anteriormente nombrada. Con respecto al DESACOPLANTE DNP, se muestra que el pH baja constantemente mientras el tiempo avanza, cuando el DNP se aproxima a la membrana interna desde el exterior se protona, debido al pH más bajo existente en esta zona. Esta protonación aumenta la hidrofobicidad del DNP, lo cual permite que difunda en la membrana, dentro de la matriz, el pH más alto hace que el hidroxilo fenólico de la sustancia se desprotone. Por tanto, el desacoplador tiene el efecto de transporte de H+ nuevamente hacia la matriz, evitando que los electrones fluyan hacia el canal protónico de F0 y no se dé la síntesis de ATP, es por ello que se observa un descenso en el pH ya que el aumento de hidrogeniones produce que el ambiente intracelular esté ácido. El Azida, se sabe por teoría que inhibe el complejo 4 de la cadena de transporte de electrones, uniéndose a la forma oxidada del hemo A3 del enzima, lo que impide la función oxidoreductora de la misma, y por ello no se permite que se cree el gradiente de protones para la posterior síntesis de ATP; se observa que el pH disminuye ya que los protones que están en la matriz proveniente de los otros complejos que están funcionando normalmente se quedan acumulados lo que conlleva a la disminución notable del pH (alta concentración de hidrogeniones en la membrana interna mitocondrial). Es necesario realizar una comparación entre el funcionamiento aerobio y anaerobio, una diferencia notable es la producción menor de ATP en las células anaeróbicas que en las aeróbicas, ya que en las primeras solo hay glucolisis y a partir de la producción de piruvato, se toma la vía de la fermentación para generar más o menos 10 moléculas de

ATP, lo que confirma que en la respiración aerobia hay ausencia del ciclo del ácido cítrico, y solo hay glicólisis y cadena de transporte electrónica. 3. Conclusiones * Para comprobar si los venenos funcionan se utiliza glucosa por que las levaduras hacen glicolisis y en este proceso se reducen moléculas que después van a donar esos electrones y se va a crear una fuerza protón motriz, es por eso que se deben medir los cambios de pH. * Los desacoplantes químicos como el DNP daña la relación entre la cadena de transporte de electrones y la fosforilacion oxidativa por que altera el gradiente protón motriz, algo que es observable con las medidas de pH ya que este disminuye por que la concentración de protones aumenta.

4. Bibliografía * http://biofisicaguillermocordero.blogspot. com/2010/03/inhibidores-ydesacoplantes.html * http://www.monografias.com/trabajos10/ viascat/viascat.shtml * Stryer, Beng, Lubert. Bioquímica 10ta edición, cap.18 – Fosforilación oxidativa, 2008.

* Stryer, Beng, Lubert. Bioquímica 10ta edición, cap.18 – Fosforilación oxidativa, 2008. viascat/viascat.shtml * Stryer, Beng, Lubert. Bioquímica 10ta edición, cap.18 – Fosforilación oxidativa, 2008.