Bombeo de Protones Levadura

BIOQUÍMICA II – 2016 PRÁCTICA

Reporte Nº: 08 I.

Fecha de Entrega: 11/11/16

INFORMACION DE LA PRÁCTICA a) Nombre: Bombeo de protones en Levaduras

Las levaduras son hongos microscópicos (unicelulares) son importantes por su capacidad para realizar la descomposición mediante fermentación de diversos cuerpos orgánicos. (Tortora, 2007) Las levaduras utilizan diversas fuentes de carbono como los aminoácidos, los carbohidratos, además de cierta acción por parte del nitrógeno y de algunas vitaminas. De la segunda fuente se pueden mencionar a la glucosa, fructosa, galactosa y manosa; la maltosa y la sacarosa. El metabolismo energético es la base de las funciones celulares. Una adecuada transferencia de electrones a través de una serie de reacciones de óxido reducción, garantiza la obtención de sustratos energéticos necesarios para el óptimo funcionamiento de las células. Para su funcionamiento las células requieren de energía bioquímica (ATP) la cual consiste en oxidar o fermentar la glucosa y así obtener energía para la célula, lo cual se le conoce como glucolisis, y de una fuente de potencial reductor (NADPH2 o NADH2). El uso intensivo de ambas permite obtener el gran nivel de organización y estructura que caracteriza a los organismos. La síntesis de ATP y potencial reductor se acopla al metabolismo energético de las células, es decir, depende de la fotosíntesis y la respiración. En particular la generación de ATP requiere de la actividad de una clase especial de proteínas asociadas a membranas llamadas bombas de protones, cuya función es transportar protones (H+) hacia volúmenes específicos de las células. Esta actividad crea un gradiente de concentración de H+ lo bastante extenso como para establecer un diferencial de potencial que produce energía libre capaz de desarrollar trabajo (Campbell, 2007)

Fig. 1.

Objetivos: a) Estudiar el Bombeo de Protones, parte del proceso de Fosforilación Oxidativa en Levaduras a través del cambio del pH del medio. b) Estudiar el desacoplamiento de la Bomba de Protones utilizando 2,4 Dinitrofenol.

Materiales y reactivos:     

Suspensión de levaduras 4% 2,4 dinitrofenol Potenciómetro Glucosa al 12 % Tubos de ensayo

Procedimiento: 1. Preparación del Control • Preparar dos diluciones de 5 ml de la levadura con 10 ml de agua destilada en tubos de ensayo A y B. • Al tubo B adicionar 4 mL de glucosa al 10% agitando y midiendo el pH • Determinar el pH de la solución en intervalos de 3 minutos.

• Luego determinar el pH de la solución en intervalos de 5 minutos por 20 minutos y luego en intervalos de 10 minutos por 20 minutos más hasta 45 minutos aproximadamente 2. Preparación del Desacoplamiento • Preparar un tubo C con 5 ml de la levadura con 10 ml de agua destilada y por decantación se adicionó a la solución 0.2 ml de dinitrofenol 40 mM. • Medir pH de la solución a intervalos de 2 minutos luego cada 5 minutos. • Luego adicionar 4 ml de glucosa al 10% agitando y midiendo el pH en tubos de ensayo A y B. • Luego determinar el pH de la solución en intervalos de 5 minutos por 15 minutos. • Anotar los cambios de pH obtenidos en el tiempo y elaborar una gráfica Tiempo vs pH para cada tubo.

Resultados En un intervalo de cada 5 minutos anotamos los cambios obtenidos en el pH con ayuda del papel tornasol, siendo los resultados siguientes:

Tiempo

pH - A

pH - B

pH - C

T0

6

6

6

T1

5.8

5.5

5.5

T2

5.5

5.2

5.3

Grafica Tiempo vs. pH 6.2 6 5.8 5.6 5.4 5.2 5 4.8 0 min.

5 min. pH - A

pH - B

Gráfica 1. Tiempo vs. pH

10 min. pH - C

Discusiones Los cambios de pH que se presentaron son debido a la ATPasa tipo P bombea K+ y protones en la membrana plasmática, bombea estos últimos del citosol hacia afuera de la célula estableciendo una diferencia electroquímica hasta 2 unidades de pH. Los protones fueron transportados y eso logro el cambio de pH en la levadura. Los cambios de pH en lo solución de levadura-glucosa en el tubo pH - B se debe a la protonación de la glucosa, efecto sucedido por la reacción de levadura, la cual a nivel celular es encargada de los acoplamientos de hidrolisis del ATP, el cual funciona como motor de bombeo de protones H+ hacia a fuera de la célula. La liberación de H+ por la acción de la formación de ATP, acto conseguido por la ATP sintasa ubicado en la mitocondria de la levadura, al obtener los H+ de la glucosa para la formación de ATP, así como el bombeo se genera un gradiente electroquímico de protones que se utiliza para impulsar el transporte de nutrientes al interior de la célula. Se observó entonces que el pH se reduce al pasar de los minutos. Por otra parte, en el tubo pH – C al cual se le agrego 0.2 ml de dinitrofenol 40mM el cual es un agente desacoplante, siendo aquel que no detiene el proceso, sin embargo, impide la comunicación entre procesos que ocurren por sinergia mutua, como lo son la síntesis de ATP y la creación del gradiente químico y electroquímico según el cual se impulsa la ATPasa en la teoría quimiosmótica. El DNP afecta la integridad de la membrana mitocondrial permitiendo que los protones pasen a través de ésta y no obligatoriamente por la ATPasa, tal y como se esperaría la concentración de hidrogeniones aumenta, de mano de la disminución en el pH, ya que éstos escapan indefinidamente al medio, lo que sustenta la tesis de que el DNP es un agente desacoplante.

Conclusiones

 En la operación interna de varias enzimas, la célula mantienen una concentración de H+, por ellos, diferentes autores han tratado de atribuirle un papel predominante a la bomba de protones, en el control de pH interno , sin embargo la función de la bomba de protones como reguladora del pH aun no es muy clara, Jaramillo (2007) dice que por un lado es predominantes la participación de ATPasa para mantener una grande diferencia en el pH, pero no la misma bomba estaría a cargo del pH”, pues más allá de esto se explica que hay mecanismo propios del metabolismo que son capaces de liberar o consumir una buena cantidad de protones que

hacen regular el pH de la célula aun cuando la bomba de protones sea inhibida.  El mecanismo de la bomba de protones por parte de la ATPasa en levadura da lugar no solo a que no se acidifique si no al contrario, en presencia de glucosa, sea más alto, dando lugar a una alcalinización, resulta pues, que la ATPasa funciona más como la responsable de los cambios y no de la reguladora de pH.  Los desacoplantes químicos como el DNP dañan la relación entre la cadena de transporte de electrones y la fosforilación oxidativa por que altera el gradiente protón-motriz, algo que es observable con las medidas de pH ya que este disminuye por que la concentración de protones aumenta.

Referencias Bibliográficas

 Stryer, Beng, Lubert. Bioquímica 10taedición, cap.18. Fosforilación oxidativa, 2008.  Peña A. Studies on the mechanism of K+ transport in yeast. Arch Biochem Biophys. 1975; 167:397-409.  Tortora. (2007). Panamericana.

Introduccion

a

la

microbiologia.

Buenos Aires:

 Campbell, J. &. (2005). Biología (7a ed.). Madrid, España: Panamericana. Recuperado el 22 de Agosto de 2015: https://books.google.com.mx/books? id=QcU0yde9PtkC&pg=PA175&dq=fermentacion+alc

oholica&hl=es&sa=X&ved=0CCQQ6AEwAmoVChMIl8Hp1O27xwIVC0q SCh3xog8W#v=onep age&q=fermentacion%20alcoholica&f=false  Cebedo, M. (28 de Mayo de 2010). Caracterización de la regulación del protón ATPasa PMA1 por parte de la ruta TOR en levadura S. Valencia: UPV. Recuperado el 22 de Agosto de 2015, de: https://riunet.upv.es/bitstream/handle/10251/18485/TFC%20Marc %20cabedo.pdf?seque nce=1  Gonzalez, A. y. (s.f.). Saccharomyces cerevisiae. Recuperado el 23 de Agosto de 2015, de Departamento De Genetica Molecular, Instituto De Fisiologia Celular. Universidad Nacional Autonoma De Mexico: http://www.biblioweb.tic.unam.mx/libros/microbios/Cap16/  González, C. e. (s.f.). RAPIDEZ DE FERMENTACIÓN POR Saccharomyces cerevisiae DE ALGUNOS TIPOS DE GLUCIDOS. Recuperado el 24 de Agosto de 2015, de: http://www.acmor.org.mx/sites/default/files/1103.pdf

Cuestionario 1. Explique el acoplamiento fosforilación oxidativa y transporte de electrones. La hipótesis del acoplamiento quimiosmótico, lo que le valió el Premio Nobel de Química a Peter D. Mitchell, explica que la cadena de transporte de electrones y la fosforilación oxidativa están acopladas por el gradiente de protones. El flujo de protones crea un gradiente de pH y un gradiente electroquímico. Este gradiente de protones es usado por la ATP sintasa para formar ATP vía la fosforilación oxidativa. La ATP sintasa actúa como un canal de iones que "devuelve" los protones a la matriz mitocondrial. Durante esta vuelta, la energía libre de Gibbs producida durante la generación de las formas oxidadas de los transportadores de electrones es liberada. Esta energía es utilizada por la síntesis de ATP, catalizada por el componente F1 del complejo FOF1 ATP sintasa.

El acoplamiento con la fosforilación oxidativa es un paso clave en la producción de ATP. Sin embargo, en ciertas ocasiones desacoplarlo puede tener usos biológicos. En la membrana interna mitocondrial de los tejidos adiposos marrones existe una gran cantidad de termogenina, que es una proteína desacopladora, que actúa como una vía alternativa para el regreso de los protones a la matriz. Esto resulta en consumo de la energía en termogénesis en vez de utilizarse para la producción de ATP. Esto puede ser útil para generar calor cuando sea necesario, por ejemplo, en invierno o durante la hibernación de ciertos animales. 2. Menciones las características del Bombeo de Protones hasta la formación de ATP. En la cadena de transporte de electrones se secuestra protones de la matriz mitocondrial y se translocan al espacio intermembranal. Este transporte de protones, que está acoplado a la propia cadena de transporte de electrones, crea un gradiente tanto en pH como en carga eléctrica y establece un potencial electroquímico que actúa como una batería o reserva de energía para la célula (como condensador eléctrico). Las bombas encargadas de bombear los protones gracias al paso de los electrones son las llamadas bombas redox (que se corresponden con los complejos mitocondriales de la cadena de transporte: los complejos I, III y IV). El bombeo de protones se realiza en contra gradiente, por lo que supone un gasto de energía que es proporcionado por el flujo de electrones de la cadena respiratoria. La membrana mitocondrial interna funciona, pues, de manera similar a un dique en un río, bloqueando el flujo de protones hacia la matriz; los protones solo pueden regresar a la matriz a través de las ATP sintasas; lo hacen a favor de gradiente y ello genera energía en forma de ATP. 3. Explique los complejos del sistema de transporte de electrones que participan en la síntesis de ATP.

Complejo I El complejo I o NADH deshidrogenasa o NADH: ubiquinona oxidoreductasa (EC 1.6.5.3) capta dos electrones del NADH y los transfiere a un transportador liposoluble denominado ubiquinona (Q). El producto reducido, que se conoce con el nombre de ubiquinol (QH2) puede difundir libremente por la membrana. Al mismo tiempo, el Complejo I transloca cuatro protones a través de membrana y produce un gradiente de protones. El flujo de electrones ocurre de la siguiente forma: El NADH es oxidado a NAD+, y reduce al FMN a FMNH2 en un único paso que implica a dos electrones. El siguiente transportador de electrones es un centro Fe-S que sólo puede aceptar un electrón y transferirlo a la ubiquinona

generando una forma reducida, denominada semiquinona. Esta semiquinona vuelve a reducirse con el otro electrón que quedaba, generando el ubiquinol, QH2. Durante este proceso, cuatro protones se translocan a través de la membrana interna mitocondrial, desde la matriz hacia el espacio intermembrana. Complejo II El Complejo II o succinato deshidrogenasa; [1] EC 1.3.5.1 no es una bomba de protones. Además, es la única enzima del ciclo de Krebs asociado a membrana. Antes de que este complejo actúe el FADH2 se forma durante la conversión de succinato en fumarato en el ciclo del ácido cítrico. A continuación, los electrones son transferidos por medio de una serie de centros FeS hacia Q. EL glicerol-3-fosfato y el acetil-CoA también transfieren electrones a Q mediante vías diferentes en que participan flavoproteínas. Complejo III El complejo III o complejo citocromo bc1; EC 1.10.2.2, obtiene dos electrones desde QH2 y los transfiere a dos moléculas de citocromo c, que es un transportador de electrones hidrosoluble que se encuentra en el espacio intermembrana de la mitocondria. Al mismo tiempo, transloca cuatro protones a través de la membrana por los dos electrones transportados desde el ubiquinol. Complejo IV El complejo IV o citocromo c oxidasa; EC 1.9.3.1 capta cuatro electrones de las cuatro moléculas de citocromo c y se transfieren al oxígeno (O2), para producir dos moléculas de agua (H2O). Al mismo tiempo, se translocan cuatro protones al espacio intermembrana, por los cuatro electrones. Además "desaparecen" de la matriz 2 protones que forman parte del H2O.