Bombeo de Protones

PRÁCTICA 1: BOMBEO DE PROTONES POR LAS LEVADURAS Jair Cerón 1139872 JoséLópez Candelo1245560 JesúsAntonio Acosta Universidad del Valle, Santiago de Cali Entrega: septiembre 30 del 2014

RESUMEN El bombeo de protones es uno de los mecanismos utilizados por diferentes organismos, el cual, a partir de gradientes de concentración, permite el ingreso de glucosa, para la producción de energía (ATP), para este caso el modelo, con el que se pretendió analizar la relación que existe entre el bombeo de protones y la producción de energía, fue la levadura (Saccharomycescerevisiae). Para hallar esta relación, se sometió a la levadura, en tres soluciones diferentes, la primera, levadura y glucosa, segunda levadura glucosa desacoplante (DNP) y por ultimolevadura glucosa y inhibidor ( azida de sodio), en donde la solución , de solo sustrato seria usada como control para detectar cómo se desempeña la levadura en condiciones normales, y asi observar, como afecta la presencia de un inhibidor y un desacoplan en la generación del gradiente y la formación de energía (ATP). Para esto se registro el pH en las tres soluciones preparadas en un intervalo de tiempo, añadiendo glucosa, para la solución levadura y glucosa, el pH inicial, registrado antes de adicionar glucosa fuepH= 4.31 y la medida final de pH= 3.58 y su ∆pH = 0.73 y cuyo valor∆[H+][2.14*10^-4], para la solución levadura, glucosa y (DNP), el pH inicial fue de pH = 4.43 y su pH final fue de pH= 4.19, con un disenso de ∆pH = 0.24 con su respectiva [H+] liberados en el descendió cuyo valor es de [H+] = [2.74*10`-5]y por ultimo en el caso de la solución de levadura, azida de sodio el pH inicial ( antes de añadir la glucosa) fue de pH = 5.00 y su pH final de pH = 4.66 con un descenso de pH= 0.34 cuya [H+] = [1.18+10^-5]. Estos resultados se compararon donde se hallo que el gradiente [H+] es vital, para el ingreso del sustrato (glucosa) para la producción de energía (ATP) y en donde se encontró una mayor proddcion de enrgia fue en glucosa seguida por (DNP) y por ultimo azida de sodio. Palabras clave: glucosas (DNP), (Azida de sodio), trasporte de electrones, gradiente de concentración,ATPasa, ATPsintasa.

INTRODUCCION Las levaduras son organismos simples,pertenecientes al grupo de hongos unicelulares, heterótrofos, capaces de desarrollarse en condiciones anaeróbicas y aeróbicas, según sea la cantidad de oxigeno, pueden realizar oxidación de azucares, llevándolos hasta agua y CO2 para generar energía, mediante enzimas ubicadas tanto en la membrana plasmática y la membrana mitocondrial, este mecanismo es denominado bombeo de protones, cuya función primordial es generar un transporte de protones H+ con el fin de generar un gradiente de concentración, denominados gradientes electroquímicos a través de un transporte activo a partir de la hidrólisis de ATP, lo cual va muy ligado a procesos de transporte de nutrientes, iones y metabolitos, modificando el pH al exterior de la célula.(Salvik1994) La levadura fue uno de los primeros organismos, que se usaron para, el estudio de la formación del gradiente, debido a su complejidad simple,A nivel estructural las levaduras poseen en su membrana plasmática una proteína que es una bomba ATPasa de H+ que consume casi el 25% del ATP que produce la célula. Esta bomba se copla por la hidrólisis del ATP por un bombeo de protones hacia a fuera de la célula, al igual que otro tipo de bombas de membrana esta inhibe concentraciones de un producto o una sustancia de un lada y lo pasa al otro. Esto produce un gradiente electroquímico que genera un trasporte de nutrientes al interior celular.( Karp, Gerald) Además de la membrana plasmática, la cual posee un papel muy importante, debido a que está en contacto con el medio externo y es la que se encarga de permitir paso de sustancias al interior o la contención de las mismas para su procesamiento en la mitocondria, la membrana plasmática mitocondrial las levaduras al igual que muchos otros organismos, poseen una bomba llamada ATPsintetasa, que es la encargada de sintetizar ATP que al contrario de la ATPasa que con el flujo de protones rompe ATP, este paso de H+ induce a su síntesis. A partir de esto, muchos de los científicos concluyeron que a que cuando hay disponibilidad de sustrato para la levadura u otro organismo, se observara una disminución progresiva de su concentración en el medio de cultivo con el tiempo y que sucederán cambios en el pH extracelular. (Fonaguera, 2007) Los estudio apuntaban, a la manera, como un organismo generaba el gradiente de concentración, si bien el hallazgo de la l enzima ATPasa, la cual genera un gradiente, que es utilizado para el ingreso de diversas sustancias de importancia metabólica como la glucosa, el co-trasporte de glucosa mediado a través de una proteína se considera como transporte facilitado. Una vez en el interior de la célula, la glucosa es utilizada

para producir energía, necesaria para la vida misma de la célula, y también implicada en mantener los gradientes. (Berg, 2008) Se realizaron estudios, poniendo como sustrato glúcidos, encontrando que juegan un papel muy importante, en la generaciónen la generación de energía y la formación del gradiente, para permitir que el sustrato ingrese(el glúcido) sea metabolizado a partir de un proceso conocido como oxidación de azúcares, aquí, tiene lugar en una serie de reacciones denominadas ciclo del ácido cítrico, que es la vía final común para la oxidación de las moléculas energéticas: carbohidratos, ácidos grasos y aminoácidos. En condiciones aerobias, el piruvato generado a partir de la glucosa sufre una descarboxilación oxidativa para dar acetil-CoA. En los eucariotas, las reacciones del ciclo del ácido cítrico transcurren en el interior de la mitocondria, en tanto que la glicolisis tiene lugar en el citoplasma. El ciclo del ácido cítrico toma electrones del acetil-CoA y los utiliza para formar NADH y FADH2 (transportadores de electrones), los cuales rinden nueve moléculas de ATP cuando se oxidan mediante el O 2 en la fosforilación oxidativa. (Montoya, H. 2008) Los electrones liberados en la reoxidación del NADH Y FADH2 fluyen a través de una serie de proteínas de membrana denominada cadena de transporte de electrones, para generar un gradiente de protones a través de la membrana, este gradiente se puede representar como gradiente de pH ( El pH externo es 1,4 unidades menor que el interno). (Quesada, S. 2007) Entonces estos protones fluyen a través de la ATP sintasa para producir ATP a partir de ADP y fosfato inorgánico. Como es descrito, la fase final de la fosforilacion oxidativa se lleva a cabo por medio de la ATPsintasa, un ensamblaje que sintetiza ATP y que esta propulsado por la vuelta de flujo de protones a la matriz mitocondrial. (Berg, 2008) Al generarse la hidrolización del ATP por acción de la enzima presente en este sitio, se genera un gradiente electroquímico entre el interior y el exterior, este impulsa el funcionamiento de la bomba generando el transporte activo de las sustancias, aunque esto no solo depende del potencial eléctrico que el proceso genera, también depende de las propiedades de permeabilidad de la membrana. Este proceso (movimiento de iones H+) se puede confirmar con la medición del pH del medio extracelular después de agregarle una sustancia que active estos procesos, en este caso la Glucosa. (Sadava , 2010)Estos procesos son de dependencia, ya que para que los iones H+ se muevan necesitan tener disponible el ATP, el cual se produce tras la oxidación y fosforilación de la glucosa, este sistema de dependencia puede verse al medir los cambios de pH en el exterior celular tras haberse tratado con ciertos agentes que inhiben o desacoplan este ciclo en la cadena respiratoria de la mitocondria(s) presentes, limitando o cortando definitivamente la producción de ATP, ya sea por el desacoplamiento de la glucosa al momento de ser oxidada, la fosforilación del ADP o la inhibición total de la enzima al momento de hidrolizar el ATP .(Salvik 1994)

A partir del cambio de la concentración de iones hidrógeno en el medio extracelular (pH), producto de la adición de glucosa a una suspensión de Levadura (Saccharomycescerevisiae) se pretendió comprobar la presencia de las bombas de protones, estableciendo la relación entre el bombeo de protones y el transporte de nutrientes como la glucosa en la generación de energía metabólica con la cadena respiratoria mitocondrial. Además de verificar el efecto o la acción de inhibidores y desacoplantes tales como azida de sodio y 2,4-dinitrofenol respectivamente sobre el gradiente de concentración en H+, junto con las consecuencias, quie implica la obstrucción del gradiente. . (Berg, 2008) MATERIALES Y MÉTODOS El método experimental consistió en la preparación de una solución control formada por glucosa (5mL), levadura (5mL) y agua destilada (35mL). Posteriormente, se midió, usando un pHmetro, el pH de la solución control en intervalos regulares de tiempo (Tabla 1). Las mediciones realizadas del minuto 0 al 6, se realizaron con el fin de obtener una línea basal y utilizarla para calcular ΔpH al final de cada prueba. Para conocer el efecto del 2,4-dinitrofenol (DNP) en el bombeo de protones en la levadura, se preparó una mezcla entre la suspensión de levadura (5mL), agua destilada (35mL) y DNP (0,2mL). Luego de obtener la línea basal del pH para esta prueba, en el minuto 6, se agregó glucosa (5mL) y se siguió midiendo el pH en intervalos regulares de tiempo (Tabla 1). Por último, para conocer el efecto de la azida de sodio en el bombeo de protones en la lavadura, se realizó un procedimiento como el descrito para el DNP, cambiando los 0,2mL de DNP por 0,5mL de azida de sodio. La siguiente formula se utilizó para calcular las concentraciones de iones H + en cada una de los experimentos:

RESULTADOS En la primera prueba, donde se adicionó glucosa a la suspensión de levadura, obtuvimos un valor de ΔpH más alto si se compara con las pruebas con 2,4-DNP y azida de sodio. La primera prueba constituye un control, y las pruebas con 2,4-DNP y azida de sodio, muestran el efecto de estos compuestos sobre el pH extracelular cuando se adiciono glucosa (tabla 1).

pH

0 3 6 11 16 21 26 31 41 51

Respuesta a la disponibilidad de glucosa 4,46 4,34 4,31 4,10 3,92 3,82 3,73 3,69 3,62 3,58

Efecto del 2,4dinitrofenol 4,32 4,38 4,43 4,44 4,38 4,34 4,30 4,28 4,21 4,19

Efecto de la Azida de sodio 4,88 4,93 5,00 4,78 4,79 4,80 4,78 4,73 4,70 4,66

∆pH

0,73

0,24

0,34

Tiempo (minutos)

Tabla1.Cambio del pH en el medio con la adición de glucosa y pruebas de 2,4dinitrofenol y Azida de sodio. Donde a partir de los 6 min en los cuales se adiciono glucosa se calculo el ∆pH Con los datos registrados el la anterior tabla se puede observar la curva para cada una de las pruebas, esta representacion nos muertra la tendencia que tiene el pH en funcion del tiempo en minutos. Se comprueba que el efecto mas marcado fue en la prueba control. Mientras que en las pruebas con DNP y azida de sodio las variaciones de pH fueron mas bajas (figura 2).

6

5

pH

4

glucosa (control) 2,4-dinitrofenol

3

azida de sodio Linear (glucosa (control))

2

Linear (2,4-dinitrofenol) Linear (azida de sodio)

1

0 0

10

20

30

40

50

60

tiempo ( en minutos)

Figura 1. Gráfica de la relación entre pH y el tiempo de tratamiento control de glucosa y de 2,4-dinitrofenol y Azida de sodio.

Para calcular la concentración de H+ que se generó en el bombeo de protones, en las tres pruebas, se realizó mediante la fórmula de pH=-log -base 10) [H+], despejando, nos dice que: [H+] = 10^-p, para luego calcular el ∆H: [H+ final] –[H+inicial]

Levadura en disponibilidad Efecto del 2.4 Dinitrofenol de glucosa ∆H = 2.14*10^-4 ∆H= 2.74*10^10-5

Efecto del Azida de sodio ∆H= 1.18*10^-5

Tabla 3: Donde se observa una mayor efectividad de la levadura en presencia de glucosa, seguido por el desacoplante 2.4 Dinitrofenol y por último el efecto del azida de sodio como inhibidor, indicado que ambos tienen un efecto sobre el bombeo de H+, que repercute en la formación de la energía, se calculó cuantas veces fue más efectivo con respecto al bombeo de la prueba de disponibilidad de sustrato, dando que para 2.4 dinitrofenol fue 7.8 veces más efectivo la prueba de disponibilidad de glucosa, 18 veces más efectivo disponibilidad de glucosa, que azida de sodio.

Concentracion de H+ en el medio extracelular 0.00025 0.0002 0.00015 0.0001

Concentracion de H+ en el medio extracelular

0.00005 0 Levadura en disponibilidad de glucosa

Efecto del 2.4 Efecto del Azida Dinitrofenol de sodio

Figrura 2: complicación de ∆H, que se obtuvieron a partir de la presencia de sustrato (glucosa), entre las pruebas, destacándose la cantidad de protones H+ que fueron liberados al medio externo por parte de las células de la levadura, para la incorporación de sustrato, que en este caso es glucosa, además, se observa claramente el efecto negativo que tiene el 2.4 Dinitrofenol y la azida de sodio sobre el bombeo de protones H+ .

Se pretendió saber en ultima, que porcentaje inhibía la adición de DNP y el azida de sodio en el bombeo de protones, para ello se uso la prueba de glucosa mas levadura como control, el cálculo se hizo mediante ([

] [ [

]) ]

% de efecto de inhibición

Lo cual para la prueba de DNP se obtuvo un % de inhibición del 87% aproximadamente y para el azida de sodio 96% de inhibición en el bombeo de protones a partir de la presencia de sustrato.(glucosa) DISCCUSION Los gradientes de concentración, son importantes para la incorporación de sustratos, estos gradientes son por medio de una diferencia en la concentración de protones entre la matriz mitocondrial y el espacio intermembranal, a esto se le conoce como teoría quimiosmotica. Este proceso es vital, para poder generar una síntesis de ATP, dichos protones son provenientes de la cadena respiratoria, gracias a la fuerza electromotriz de los electrones, permiten que los protones pasen de la matriz mitocondria hacia el espacio intermembranal, de esa manera se aumentan las

concentraciones de protones en el espacio intermembranal, y dicha diferencia permite la incorporación de sustrato para generar energía. El gradiente que se crea tiene dos componentes, uno de concentración y otro eléctrico, por lo que recibe el nombre de gradiente electroquímico. Como la membrana interna es tan impermeable, los protones no pueden pasar simplemente a través de ella, deben hacerlo a través de una proteína específica (canal), esta proteína es la subunidad Fo de la ATP-sintasa. El acople entre el transporte de electrones y la síntesis de ATP en la cadena respiratoria, a partir de ADP + Pi, se conoce con el nombre de fosforilación oxidativa. Para que ésta ocurra, debe existir un gradiente electroquímico, el cual depende del funcionamiento de la cadena respiratoria, que es la responsable de crearlo Existen muchos agentes que pueden alterar la síntesis de ATP asociada a la cadena respiratoria. De acuerdo con su mecanismo de acción, pueden encontrarse desacoplantes e inhibidores como el 2,4-dinitrofenol y la azida de sodio respectivamente.. (Berg, 2008) En las levaduras, Saccharomycescerevisiae, al igual que en las células vegetales y las bacterias, el transporte de solutos hacia el interior de la célula depende de un gradiente electroquímico de H+. Este gradiente es generado por bombas de protones presentes en la membrana plasmática que expulsan H+ de la célula y de ese modo generan un gradiente, con una mayor concentración de H+ en el medio extracelular que en el medio intracelular; durante este proceso la bomba de H+ también crea un pH ácido en el medio que circunda la célula Glucolisis. (Berg, 2008) Tal como se explica antes para los procesos de respiración celular es necesario generar un gradiente de diferencia tanto de concentración como eléctrica lo que hace posible que moléculas como la glucosa entren en una estructura tan impermeable y especializada como lo son las membranas. Específicamente en el proceso de entrada de glucosa a la célula se utiliza la energía que proviene del mismo proceso de bombeo de protones, para ello deben incorporar la glucosa en contra de su gradiente de concentración en coordinación con un protón que ingresa a favor del gradiente de concentración; para este proceso se utiliza una proteína de tiposimporte la cual coordina estos dos procesos simultáneamente.Cuando la proteína emerge en su conformación inicial posee unos centros expuestos los cuales captan 3 protones que permiten la unión con la molécula de glucosa. Dicha unión con la glucosa desencadena otro cambio conformacional el cual expone los sitios de unión de la proteína y el sustrato a la parte interna de la célula. Este proceso devuelve a el equilibrio (la proteína) ya que se necesita una molécula de glucosa y un protón para restablecer la conformación original del transportador lo que permite que se comience de nuevo el ciclo (bombeo) (Taizet al, 2006).

El proceso de respiración se inicia en si en el momento que la glucosa se encuentra dentro del citoplasma de la célula en este caso de la levadura, donde de inmediato la glucosa es oxidada por medio de la glucolisis, en donde da como resultado energético dos moléculas de ATP, y es generado productos comoácidopirúvico. El cual es muy importante ya que entra a la mitocondria por medio de transporte activo, e inmediatamente es oxidado mediante un complejo enzimático de piruvato deshidrogenasa, que da como resultado a acetil-CoA, CO2 y NADH. En donde el acetilCoA ingresa al ciclo de krebs y se oxida nuevamente generando CO2, NADH y FADH2 en donde los últimos dos mencionados son agentes reductores. El NADH y el FADH2total ingresan enel ciclo de la cadena respiratoria la cual se da en la mitocondria y es la encargada de producir ATP, como paso siguiente entregan sus electrones a las proteínas transportadoras de los complejos, las cuales reciben el nombre de citocromos; en el caso del complejo I toma el NADH y el complejo II toma el FADH2, lo que causa que electrones se desplacen entre citocromos, también hay transporte de protones de la matriz de la mitocondria a el espacio intermembranal a través de la membrana (Quesada, 2007). Los electrones se transportan hasta el aceptor final, el cual es conocido como complejo IV. Este complejo posee cuatro citocromos, donde cada uno posee dos átomos de Cu los cuales cumplen una función de captadores. Más específicamente los electrones entran uno a uno en el complejo a través del citocromo, y a su vez son captados o retenidos por los átomos de cobre y a su vez de unen a un núcleo de hierro que está presente en un grupo hemo el cual es perteneciente a el complejo IV. A su vez las moléculas de oxígeno son atraídas por el núcleo del grupo hemo, ya que son electronegativos y esto significa que tienden a unirse con los electrones acumulados, pero pese a esto la transferencia se da bajo condiciones muy especiales y solo ocurre cuando hay cuatro electrones acumulados, esto se debe a que el oxígeno busca la estabilidad y si no están los 4 quedaría inestable. Como paso siguiente el oxígeno(después de que ha aceptado los cuatro electrones), se une con dos protones que provienende la matriz mitocondrial, generando como resultado una molécula de agua (Melo &Cuamatzi, 2007). Y como se ha mencionado anteriormente las membranas son de carácter impermeable a los iones, los que hace que los protones que vuelven a entrar en la matriz, pasando a través de unas proteínas que cumplen con función de canales de protones las cuales se llamanATPsintetasa.la energía resultante por efecto de este proceso utiliza como sintetizador o precursor de ATP a partir de ADP y fosfato. Este proceso se denominafosforilacion oxidativa (Quesada, 2007). Una vez el ATP ha sido sintetizado, es utilizada por la enzima ATPasa-P la cual esta ubicada en la membrana plasmática, para llevar a cabo el proceso de hidrólisis de ATP. Pero para iniciar el proceso la proteína requiere primero ser protonada, ya que su conformación inicial no le permite interactuar con el ATP. Para ello, la enzima toma protone del lado interno(citoplasmático), adquiriendo así una propiedad quinásica que le permite tomar el γ-fosfato del ATP y fosforilar un sustrato específico, que en este

caso es ella misma, haciendo un proceso de transferenciade fosfato a un residuo de aspartato. Haciendo un compuesto llamado fosfoaspartato, el cual es obtenido a partir de un intermediario clave en la catálisis enzimática, ya que la ATPasa-P adquiere una conformación en la que libera el protón al medio extracelular comenzando de nuevo con el proceso del ciclo de hidrólisis (Berget al., 2008) Podemos concluir que el ciclo es de carácter monotransporte con características de tipo electrogénico, ya que involucra el movimiento en esencia de un solo protón, que al estar en el medio extracelular genera una diferencia de cargas entre el medio intra y extracelular usando como muro la membrana plasmática, es decir, en esencia mantiene un gradiente electroquímico que comprende también características como la acidificación del medio interno celularpor la presencia de ácidos metabólicos, y un potencial eléctrico diferente, por la liberaciones de H+ al medio externo, convirtiendo la célula en una especie de turbina hidroeléctrica que genera energía a partir de un proceso de aprovechamiento a partir de esta diferencia y la generación de este gradiente electroquímico(Voet&Voet, 2004). Durante la prueba realizada con el 2,4-dinotrofenol se observó que la mezcla experimentó un incremento del pH, por las características de la sustancia desacoplante.El efecto del 2,4-dinitrofenol es un agente desacoplante que no genera un gradiente de pH pero si deja que continué funcionando la cadena de transporte de electrones (hasta el O2), ocasionando la inhibición de la producción de ATP, (Abate, J 1999) Los agentes desacoplantes cuando se añaden a las mitocondrias, inhiben la producción de ATP, al mismo tiempo que permiten el transporte de e- a lo largo de la cadena respiratoria hasta el O2(Mathews, Van Holde, & Ahern, 2002). El PKa del grupo OH del DNP es tal que se encuentra normalmente disociado al pH intracelular. Pero, cuando ingresa una molécula de DNP aproximándose a la membrana interna desde el exterior se protona, debido al pH más bajo presente en el espacio intermembranal. Con la protonación aumenta la hidrofobicidad del DNP, permitiendo que este difunda en la membrana y la atraviese por efecto de masa. Una vez dentro de la matriz mitocondrial, el aumento del pH hace que el OH fenólico se desprotone. De esta forma, el agente desacoplante transporta H+ de vuelta a la matriz, evitando el canal F0, y por tanto, sin síntesis de ATP (Mathews et al., 2002). El efecto final del DNP es el de disipar el gradiente protónico necesario para la síntesis de ATP por parte de la ATPsintasa, y por tanto, reduciendo la cantidad de ATP disponible para la realización de los procesos metabólicos de la célula (como el bombeo de protones y el cotransporte de la glucosa asociado a este)(Campbell, M. Farrell, S 2004). La propiedad desacoplante del 2,4dinitrofenol permite que lo iones del hidrogeno que están impedidos por la membrana gracias a su impermeabilidad, logren atravesarla, haciendo que se homogenice el gradiente de concentración, y con esto, se detenga la síntesis de ATP pero no el transporte de electrones en la cadena respiratoria hasta el O2. Debido a que el 2,4-

dinitrofenol transporta protones H+ al interior de la célula, la energía de los electrones se disipa y no generan ATP (Abate, J 1999). Para el caso de la prueba de azida, observando la grafica 1, el comportamiento de la muestra que la influencia de azida de sodio es totalmente diferente a la prueba de levadura y glucosa y levaduraDNP y glucosa, inicialmente empezó cdesde un ph mayor que, las otras dos pruebas realizadas, fenómeno que se explica porque la azida en su forma anionica tiene un caracter básico, lo que explica porque el pH experimental fue mayor en comparación con la prueba de levadura y glucosa y con la muestra con DNP. (Melo, V 2006) En este caso, la azidaactua como un inhibidor, por lo tanto se unen al complejo IV(encargado de la transferencia de electrones desde el citocromo c al oxígeno) de la cadena de transporte electrónico y bloquean el transporte electrónico, por ello estos compuestos reducidos se acumulan antes del punto de bloqueo y compuestos oxidados después del bloqueo, por eso no se puede dar el bombeo de protones y no se forma el gradiente de protones y el pH permanecerá casi constante durante el tiempo, lo que conllevara a que no se de la producción de ATP. El mecanismo por el cual inhibe consiste en formar un enlace covalente con el cofactor Hemo a3, este se da la acumulación de especies reducidas y oxidadas y no se produce la fuerza proton motriz para la síntesis de ATP. Mirando el disenso en la tabla 1 ∆pH 0.34, con respecto al DNF, tuvo un mayor descenso, aprocimada mente bajo 3 decimas, la pregunta radicaba en, porque sigui bajando el pH si, en teoría dice que la azida inhibe en la cadena de transporte de electrones, un papel crucial para analizar esta característica, son las cualidades metabólicas de la levadura (Saccharomycescerevisiae), la cual es que pueden desarrollar se en medios tanto anaeróbicos como aeróbicos, la azida inhibe de tal manera que el aceptor de los hidrógenos sea diferente al oxigeno, en este caso las células de levadura, pueden llevar a cabo un tipo de catabolismo parcial, las fermentaciones, donde el aceptor de los hidrógenos del poder reductor es una molécula orgánica. (Devlin, T. 2004) En este caso, el esquema especifica la ruta fermentativa de producción de etanol. Durante el proceso, también se produce una descarboxilación del piruvato hasta acetaldehído, como paso previo a la formación de alcohol (Nelson y Cox 2006).

Sin embargo, al comparar los resultados con el control de glucosa y levadura (Figura 2), la cual no presenta ningún obstáculo en la generación de gradiente para la producción de energía, se observa que el proceso aerobico, ejercido en esas condiciones normales es mucho más efectivo que si se le inhibe, en el citocromo c como sucede en la prueba con azida. Esto va muy ligado a los costos energéticos, mientras que en la levadura y

glucosas se forma el gradiente de H+ de forma optima para el ingreso a la celula de glucosa para que posteriormente sea metabolizada, los costos energéticos para el caso que las células de levadura utilicen la vida de la fermentación son altos. Nelson y Cox 2006). Esto se pudo determinar tas analizar los ∆pH que se observan en la tabla 1, estos fueron comparados entresí para analizar cuanto fue la [H+] que fueron liberados al medio externo en el proceso de bombeo de protones , para la prodición de la energía (ATP) por parte de la ATPsintasa. Para el primer caso de glucosa y levadura, se aprecia que, en el decrecimiento del pH desde que se adiciono glucosa fue de ∆pH=)0.73 y en este decrecimiento de pH el ∆[H+] (tabla 2) , la cual fue muy superior con respecto al la prueba con azida de sodio, a pesar de que tiene un ∆pH = 0.34 (tabla 1), se esperaría que la producción del bombeo de H+, fuera la mitad, pero debido a que el pH inicial y pH final mucho más básico que los pH inicial y final de la prueba de glucolisis y levadura (tabla 1), el ∆[H+] = 1.18*10^-5 (tabla 2), además azida interfirió con el aceptor optimo, la cual es el oxigeno, recurriendo las células de la levadura a una moléculaorgánica como aceptor de los hidrógenos lo que incide de manera negativa en el bombeo, al compararlas, la prueba de levadura y glucolisis bombeo 18 veces más protones de H+ liberados al medio externo, que las levaduras tratadas con azida, debido a que En esas condiciones, el NADH+H+ no puede ser utilizado por la célula para transformarlo en ATP, sino que su función celular consiste simplemente en recibir los protones y los electrones desprendidos en otras reacciones celulares. (Lodish, H 2005) Una vez conseguido esto, su papel se agota, y lo que la célula necesita es regenerar el NAD+, cuya síntesis es costosa, para seguir realizando su metabolismo. (Nelson y Cox 2006). Comparando los resultados obtenidos para la prueba de DNP y levadura con glucosa , con la prueba control de levadura y glucosa(Figura 2), se observo un ∆pH menor que el de la prueba de levadura y glucosa (tabla 1) con una [H+] ) 2.74*10^-5 (tabla 2), el bombeo de H+ fue superior en 7.8 veces más efectivo cuando solo hay presencia de glucosa y levadura (firgura 2), debido a que en DNP actúa es a nivel de la producción del ATP en la atpsintasa mitocondrial debido a que la acción de DNP, produce que la fuerza proton-motriz que se establece en la membrana mitocondrial interna, se disipe continuamente, causando que la energía no se forme en la molécula de ATP si no se libera en forma de calor, y como consecuencia hay disminución en el gradiente.(Nelson y Cox 2006). Concluimos que el efecto del inhibidor que ataque la cadena de transporte de electrones, como en el caso de la azida de sodio, repercute, en gran medida en el bombeo de protones de H+, que si no se afecta la cadena de transporte de electrones, caso que ocurrió con el DNP pero de igual forma ambos resultados son devastadores en las células de levadura, pues no permite generar un gradiente optimo para la

generación de energía (ATP), situación que se comprueba en los % de inhibición obtenidos con 87% para DNP y 96% aproximadamente para azida de sodio. Concluimos que las células de la levadura cuando no hay disponibilidad de oxigeno, estas recurren al proceso de fermentación, pero no es tan efectivo, el bombeo de H+ para la creación de un gradiente que permita crear energía. El 2,4-DNP afecta el bombeo de protones realizado por la levadura, hecho que se evidencia por una menor reducción del pH extracelular (ΔpH) comparado con el control. Se puede concluir que al influir en el bombeo de protones, el DNP reduce la capacidad de la célula para transportar glucosa. Bibliografía         

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