Biotehnologii de reproductie

CUPRINS CAP.1 BIOTEHNOLOGIA ~NS|MÂN}|RILOR ARTIFICIALE ......................... 2 1.1 Importan]a `ns\mân]\rilor artificiale .............................................................. 3 1.2 Aspecte organizatorice ale `ns\mân]\rilor artificiale `n ]ara noastr\ ............. 5 1.3 Selec]ia reproduc\torilor masculi folosi]i la `ns\mân]\rile artificiale .............. 8 1.3.1 Materialul de reproduc]ie............................................................... 8 1.3.2 Selec]ia masculilor reproduc\tori .................................................. 9 1.3.2.1 Selec]ia taurilor folosi]i la `ns\mân]\ri artificiale ............ 10 1.3.2.1.1 Stabilirea necesarului de t\ura[i .................... 11 1.3.2.1.2 Identificarea [i nominalizarea anual\ a vacilor mame de tauri ................................... 11 1.3.2.1.3 Selec]ia t\ura[ilor cuprin[i `n testul performan]elor proprii .................................... 12 1.3.2.1.4 Aprecierea taurilor `n testare dup\ descenden]i ............................................ 13 1.3.2.2 Selec]ia berbecilor reproduc\tori ................................... 15 1.3.2.2.1 Testarea berbecilor dup\ descenden]i pentru produc]ia de lân\ ..................... 15 1.3.2.2.2 Testarea berbecilor dup\ descenden]i pentru produc]ia de carne ................... 16 1.3.2.3 Selec]ia vierilor reproduc\tori ........................................ 16 13.2.4 Aprecierea arm\sarilor de reproduc]ie............................ 17 1.4 Principii [i metode de recoltare a spermei .................................................... 18 1.4.1 Bazele fiziologice ale recolt\rii spermei......................................... 18 1.4.1.1 Comportamentul sexual al masculilor............................ 18 1.4.1.2 Specificul reflexelor sexuale la principalele specii de animale.................................................................... 22 1.4.1.2.1 Reflexele sexuale la taur ............................... 22 1.4.1.2.2 Reflexele sexuale la berbec........................... 24 1.4.1.2.3 Reflexele sexuale la vier................................ 25 1.4.1.2.4 Reflexele sexuale la arm\sar......................... 25 1.4.2 Principii [i metode generale de recoltare a spermei ...................... 26 1.4.2.1 Recoltarea spermei la taur ............................................ 27 1.4.2.2 Recoltarea spermei la berbec [i ]ap .............................. 33 1.4.2.3 Recoltarea spermei la vier............................................. 34 1.4.2.4 Recoltarea spermei la arm\sar...................................... 37 1.4.2.5. Recoltarea spermei la p\s\ri ........................................ 38 1.5 Examenul `nsu[irilor spermei ........................................................................ 39 1.6 Diluarea spermei........................................................................................... 41 1.6.1 Considera]ii generale .................................................................... 41 1.6.2 Principiile dilu\rii, `nsu[irile generale ale diluan]ilor [i clasificarea acestora .............................................................. 41 1.6.3 Tehnica prepar\rii diluan]ilor ......................................................... 43 1.6.4 Tehnica dilu]iei .............................................................................. 44 1.6.4.1 Diluarea spermei de taur ............................................... 44 1.6.4.2 Diluarea spermei de berbec ........................................ ..48 1.6.4.3 Diluarea spermei de vier.............................................. ..50 1.6.4.4 Diluarea spermei de arm\sar ...................................... ..52 1.6.4.5 Diluarea spermei de p\s\ri.......................................... ..53 1.7.Conservarea spermei.................................................................................. ..54 1.7.1 Conservarea spermei de taur...................................................... ..61 1.7.2 Conservarea spermei de berbec [i ]ap........................................ ..68 1.7.3 Conservarea spermei de vier ..................................................... ..70 1.7.4 Conservarea spermei de arm\sar ............................................... ..75 1.7.5 Conservarea spermei de p\s\ri .................................................. ..76 1.8 Inocularea spermei ..................................................................................... ..77 1.8.1 Inocularea spermei la vac\ ......................................................... ..77 1.8.1.1 Punctul de `ns\mân]\ri artificiale la vaci (P.I.A.V.) ...... ..77 1.8.1.2 Descoperirea femelelor `n c\lduri [i stabilirea momentului optim al `ns\mân]\rii ............................... ..79 1.8.1.3 Preg\tirea femelelor pentru `ns\mân]are .................... ..81 1.8.1.4 Reanimarea spermatozoizilor ...................................... ..82

1.8.1.5 Tehnica inocul\rii spermei ........................................... ..83 1.8.2 Inocularea spermei la oaie [i capr\............................................. ..85 1.8.2.1 Organizarea punctului de `ns\mân]\ri artificiale la ovine (P.I.A.O.) ....................................................... ..85 1.8.2.2 Depistarea oilor [i caprelor `n c\lduri .......................... ..87 1.8.2.3 Inocularea materialului seminal ................................... ..89 1.8.3 Inocularea spermei la scroaf\ ..................................................... ..91 1.8.3.1 Organizarea [i dotarea punctului de `ns\mân]are artificial\ (P.I.A.S.) cu activitate complex\ .................. ..91 1.8.3.2 Descoperirea scroafelor `n c\lduri ............................... ..92 1.8.3.3 Stabilirea momentului optim de `ns\mân]are............... ..93 1.8.3.4 Aparatura [i instrumentarul folosit pentru `ns\mân]area artificial\ a scroafelor ........................... ..93 1.8.3.5 Inocularea spermei...................................................... ..94 1.8.4 Inocularea spermei la iap\ .......................................................... ..95 1.8.5 Inocularea spermei la p\s\ri ....................................................... ..97 CAP. 2 BIOTEHNOLOGIA TRANSFERULUI DE EMBRIONI LA ANIMALE ... 101 2.1 Istoricul [i importan]a transferului de embrioni ............................................ 101 2.2 Biotehnologia transferului de embrioni la vac\............................................ 103 2.2.1 Selec]ia [i preg\tirea vacilor donatoare....................................... 105 2.2.2 Selec]ia [i preg\tirea vacilor primitoare (receptoare) .................. 106 2.2.3 Sincronizarea estrului [i ovula]iei la vacile donatoare [i primitoare............................................................................. 106 2.3.4 Inducerea poliovula]iei [i `ns\mân]area artificial\ a vacilor donatoare.................................................................. 106 2.3.5 Fecundarea ovocitelor................................................................. 111 2.2.6 Recoltarea embrionilor ................................................................ 111 2.2.7 C\utarea [i aprecierea calit\]ii embrionilor.................................. 113 2.2.8 Conservarea [i deconservarea ................................................... 116 2.2.9 Transferul embrionilor ................................................................ 119 2.3 Biotehnologia transferului de embrioni la rumeg\toarele mici ..................... 120 2.3.1 Alegerea donatoarelor [i receptoarelor ....................................... 122 2.3.2 Sincronizarea estrului [i ovula]iei la femelele donatoare [i receptoare ........................................................................... 123 2.3.2.1 Tratamente progestative de sincronizare..................... 124 2.3.2.2 Tratamente de stimulare ovarian\ ............................... 124 2.3.2.3 Inducerea estrului [i ovula]iei la receptoare................. 125 2.3.3 ~ns\mân]area femelelor donatoare ............................................. 126 2.3.4 Recoltarea embrionilor ................................................................ 127 2.3.5 Examenul [i aprecierea embrionilor ............................................ 130 2.3.6 Congelarea-decongelarea embrionilor ........................................ 131 2.3.7 Transferul embrionilor la femelele receptoare ............................. 131 2.3.7.1 Transferul chirurgical ................................................... 131 2.3.7.2 Transferul embrionilor sub control endoscopic ............. 132 CAP. 3 BIOTEHNICI DERIVATE SAU FINALIZATE PRIN TRANSFERUL DE EMBRIONI ..................................................................................... 134 3.1 Fecunda]ia ,,in vitro“ ................................................................................... 134 3.1.1 Ob]inerea ovocitelor .................................................................... 137 3.1.2 Maturarea ,,in vitro“ a ovocitelor.................................................. 137 3.1.3 Capacitarea spermatozoizilor...................................................... 138 3.1.4 Fecunda]ia [i cultura ,,in vitro“ a embrionilor ............................... 139 3.1.5 Transferul embrionilor ob]inu]i ,,in vitro“ ...................................... 140 3.1.6 Importan]a, perspectivele [i aplica]iile fecunda]iei ,,in vitro“ ........ 141 3.2 Bisec]ia embrionilor .................................................................................... 142 3.3 Sexarea embrionilor.................................................................................... 144 3.4 Transplantarea nucleilor [i ob]inerea de clone............................................ 145 3.4.1 Preg\tirea ovocitelor receptoare ................................................. 146 3.4.2 Izolarea nucleilor embrionului donator......................................... 146 3.4.3 Reconstituirea embrionilor........................................................... 147 3.5 Transgeneza............................................................................................... 147 BIBLIOGRAFIE………………………………………………………………………..151

INTRODUCERE

Cre[terea popula]iei globului concomitent cu tendin]ele de ridicare a standardului de via]\, au impus cercet\torilor [i speciali[tilor din agricultur\ preocuparea pentru accelerarea amelior\rii produc]iilor vegetale [i animale `n vederea asigur\rii necesarului de substan]e proteice din hrana omului. Dintre produsele animale, `n zona temperat\, unde se situeaz\ [i ]ara noastr\, aten]ia speciali[tilor a fost `ndreptat\ spre cre[terea produc]iei de carne, lapte [i ou\, produse strict necesare unei alimenta]ii ra]ionale. Mijlocul prin care se poate interveni `n gr\birea amelior\rii efectivelor de animale `l constituie permanenta `mbun\t\]ire a reproduc]iei celor mai valoro[i indivizi, selec]iona]i pe baza unor criterii [tiin]ifice. A[a se explic\ faptul c\ `n ultimii 20-30 de ani, s-a acordat o aten]ie special\ folosirii celor mai noi tehnologii `n cre[terea animalelor, cu scopul gr\birii ritmului de ameliorare a efectivelor, prin introducerea pe o scar\ din ce `n ce mai larg\, a biotehnologiilor de reproduc]ie. Biotehnologiile de reproduc]ie reprezint\ ansamblul metodelor, procedeelor sau opera]iilor care se folosesc pentru ob]inerea `n condi]ii optime, a unor noi genera]ii de animale, din ce `n ce mai performante. Biotehnologiile de reproduc]ie, sub aspect cronologic [i al complexit\]ii tehnicilor pe care le includ, sunt sistematizate `n patru genera]ii (Thibier, M. [i colab., 1991):

-

`ns\mân]area artificial\; transferul de embrioni; fecunda]ia „in vitro“, clonarea [i sexarea embrionilor (`n curs de aplicare); - transgeneza, `n curs de studiu [i de aplicare sporadic\ la diverse speciii de animale. Chiar dac\ domeniul de aplicare al acestor biotehnologii difer\ mult, au totu[i numeroase puncte comune, unele neputându-se extinde `n produc]ie, datorit\ rezultatelor economice sau tehnice `nc\ slabe. Principala tr\s\tur\ comun\ a biotehnologiilor de reproduc]ie const\ `n ameliorarea `ntr-un ritm accelerat a efectivelor de animale [i a st\rii lor de s\n\tate, `n condi]iile reducerii pre]ului de cost pe unitatea de produs. ~n prezent, interesul economic al biotehnologiilor de reproduc]ie se manifest\ cu prec\dere la bovine, `ns\ majoritatea regulilor de aplicare la aceast\ specie sunt valabile [i pentru rumeg\toarele mici. Unele biotehnologii includ [i anumite biotehnici, precum inducerea estrului [i ovula]iei `n extrasezon, inducerea poliovula]iei, sincronizarea estrului, programarea f\t\rilor etc. Biotehnologiile de reproducere a animalelor reprezint\ domeniul cel mai nou [i de perspectiv\ a biologiei contemporane, motiv pentru care deplina formare a speciali[tilor zootehni[ti va fi condi]ionat\ de preg\tirea teoretic\ [i practic\ `n acest nou domeniu.

1

CAPITOLUL 1 BIOTEHNOLOGIA ÎNSĂMÂNŢĂRILOR ARTIFICIALE REZUMAT

Reproducerea animalelor în condiţii naturale include o serie de procese fiziologice care trebuie să se desfăşoare într-o anumită succesiune. Cunoaşterea modului de realizare a acestor procese în intimitatea lor a permis folosirea unor noi modalităţi de reproducţie, între care însămânţarea artificială este cea mai importantă. În prezent, însămânţarea artificială a devenit tehnică de rutină care se aplică la majoritatea speciilor de animale de interes zootehnic. Extinderea accelerată a aplicării însămânţărilor artificiale în reproducerea animalelor s-a datorat progreselor genetice, mijloacelor moderne de investigaţie, rolului tehnic în programele de ameliorare a creşterii animalelor cât şi rolului ştiinţific în disciplinele de cerecetare, atât în domeniul fiziologiei animale cât şi al criobiologiei. Însămânţarea artificială constă în recoltarea spermei printr-un artificiu variabil, examenul, diluţia şi conservarea acesteia înainte de a fi introdusă pe traiectul căilor genitale femele cu ajutorul unor instrumente adecvate, scopul final fiind obţinerea unei noi generaţii de animale mai performantă. În ultimele 2-3 decenii, o atenţie specială a fost acordată tehnicilor de conservare, pentru a asigura folosirea la maximum a unui număr minim de masculi indemni de boli şi cu cea mai ridicată valoare genetică. Pentru aceasta, este nevoie de un volum maxim de spermă (este rolul diluantului) şi de asigurare a capacităţii optime de fecundare a spermatozoizilor, pe o perioadă de timp cât mai îndelungată (este rolul tehnicii de conservare). Însămânţarea artificială dispune de metodele cele mai sigure şi riguroase din punct de vedere al protecţiei sanitare, cele mai obiective din punct de vedere al selecţiei genetice, cele mai economice din punct de vedere al difuzării practice. Dacă aceste deziderate sunt satisfăcute, conservarea spermei prin congelare, cea mai modernă tehnică de păstrare devine un auxiliar preţios al selecţiei, permiţând stocarea spermei de la reproducătorii tineri până se cunosc aptitudinile descendentului. În acest fel se realizează selecţia după concepţii şi mijloace noi. Datorită standardizării şi simplificării procedeelor s-a pus la îndemâna crescătorilor această biotehnologie modernă de reproducţie de care poate beneficia fiecare crescător la nivelul propriului său efectiv. Congelarea spermei a eliberat pe zootehnician de numeroase constrângeri, singura care persistă este menţinerea unor temperaturi joase pe toată durata conservării.

2

1.1.

Importan]a `ns\mân]\rilor artificiale

Ast\zi, exist\ numeroase ]\ri care `ns\mân]eaz\ artificial `ntregul efectiv de vaci realiz\nd astfel un progres rapid [i substan]ial `n ameliorarea raselor. ~ns\mân]\rile artificiale s-au extins `n practic\ datorit\ avantajelor zoo-economice [i sanitar-veterinare. Din punct de vedere zoo-economic, `ns\mân]\rile artificiale sunt importante pentru c\ folosesc intens reproduc\torii de valoare, cu poten]\ individual\ mare, ceea ce conduce la gr\birea ritmului [i gradului de ameliorare a efectivelor de animale. La `ns\mân]\rile artificiale se folosesc masculi testa]i dup\ descenden]i, astfel `ncât, pe lâng\ calitatea superioar\ a spermei, exist\ [i testarea real\ a valorii de ameliorare. Prin congelarea materialului seminal, reproduc\torul valoros poate fi folosit la reproducere mai mul]i ani, chiar dup\ moartea acestuia prin constituirea depozitului cu sperma provenit\ de la acesta. Datorit\ congel\rii materialului seminal s-a creat posibilitatea schimbului interna]ional de material seminal valoros din puct de vedere genetic, chiar la distan]e intercontinentale, f\r\ trasportul [i aclimatizarea reproduc\torului. Prin folosirea `ns\mân]\rilor artificiale, testarea dup\ descenden]i a reproduc\torilor se poate realiza mult mai repede, iar prin examenul complex, zootehnic [i sanitar-veterinar, se pot descoperi reproduc\torii cu diferite anomalii congenitale ale aparatului genital sau cu tulbur\ri ereditare ale spermatogenezei. Se realizeaz\, astfel, o profilaxie genetic\ a sterilit\]ii. Datorit\ eviden]elor stricte care se ]in pentru toate opera]iile ce se efectueaz\, se poate cunoa[te `ntr-o mai mare m\sur\ paternitatea descenden]ilor. Eviden]ele sunt completate cu determinarea grupei sanguine a p\rin]ilor [i descenden]ilor. Reproduc\torii masculi fiind grupa]i separat de femele, se pot lua m\suri specifice de alimenta]ie ra]ional\ [i `ngrijire corespunz\toare [i se poate institui un regim de recoltare a spermei favorabil ob]inerii de produ[i la un pre] de cost mai sc\zut [i ofer\ posibilitatea cre\rii unor nuclee de animale valoroase. La reproduc\torii de elit\, concentra]i `n unit\]i specializate, se practic\ [i determinarea genofondului, a structurii imunogenetice, ceea ce d\ posibilitatea cunoa[terii prezen]ei sau absen]ei echilibrului genetic `n cadrul unei popula]ii date. ~n condi]iile unor centre mari de `ns\mân]\ri artificiale unde sunt concentra]i mul]i reproduc\tori, este posibil\ stabilirea valorii de ameliorare `n selec]ia concomitent\ pentru mai multe caractere productive. Acest lucru se realizeaz\ pentru c\ se ob]ine un num\r mare de produ[i contemporani, masculi [i femele, care pot fi repartiza]i `n mai multe unit\]i. De asemenea, num\rul mare de reproduc\tori de diferite vârste, concentra]i `n unit\]i specializate, permite alegerea unui moment optim pentru determinarea performan]elor, respectiv a vârstei la care s-ar putea

3

determina, cu cea mai mare precizie, valoarea de ameliorare. Lucr\rile efectuate pe ovine, pentru determinarea valorii de ameliorare `n direc]ia produc]iei de lân\, au demonstrat c\ selec]ia trebuie s\ se fac\ pe baza celei de-a doua tunsori. Sub raport economic, reproduc\torii foarte valoro[i din punct de vedere zootehnic, sunt folosi]i cu mare eficien]\ economic\. ~ntr-un sezon sexual, num\rul femelelor `ns\mân]ate artificial cu sperma de la un taur, comparativ cu monta, este , `n medie, de 50-80 de ori mai mare, de 25 de ori mai mare la oi [i de 3-4 ori mai mare la cabaline [i suine. Astfel, `n cazul practic\rii montei, unui taur i se repartizeaz\ anual 50-70 de femele. Dac\ se practic\ `ns\mân]\rile artificiale, cu sperma conservat\ prin refrigerare se pot `ns\mân]a anual 10003000 de vaci. ~n cazul `n care se conserv\ sperma prin congelare, num\rul vacilor `ns\mân]ate cu sperma provenit\ de la un taur poate ajunge la 1000030000. ~n cazul unor tauri deosebit de valoro[i s-au putut ob]ine pân\ la 50000 de vi]ei pe `ntreaga perioad\ de exploatare a taurului (6-7 ani). Literatura de specialitate citeaz\ cazuri `n care de la un taur, `ntr-un an s-au ob]inut peste 120000 de doze de `ns\mân]are, iar `n toat\ perioada de exploatare a acelui taur de peste o jum\tate de milion de vi]ei. La taurine, pot fi `ns\mân]ate dintr-un singur ejaculat pân\ la 1000 de vaci. La porcine, ovine [i cabaline, dintr-un singur ejaculat se pot `ns\mân]a numai 5-50 de femele. Acest num\r mic de femele `ns\mân]ate artificial este important din punct de vedere economic [i genetic [i a redus r\spândirea `ns\mân]\rilor artificiale la aceste specii. Economicitatea procedeului de congelare a spermei este exemplificat\ cel mai bine de posibilitatea reducerii num\rului de spermatozoizi `n doza de `ns\mân]are f\r\ a sc\dea rata de concep]ie . Dac\ aplicarea tehnicilor de `ns\mân]are artificial\ cu material congelat a progresat la taurine, nu acela[i lucru se poate spune [i despre celelalte specii. Ratele de concep]ie [i num\rul de produ[i la o f\tare realizate cu material seminal congelat sunt mai sc\zute la porcine. La ovine [i cabaline, ratele de concep]ie sunt satisf\c\toare. Aceste rezultate demonstreaz\ diferen]e distincte de specie, `n cerin]ele pentru supravie]uirea optim\ a spermatozoizilor `n perioada congel\rii [i decongel\rii. La vier, esen]ial este modificarea compozi]iei diluantului dup\ decongelarea spermatozoizilor pentru a maximaliza rata de fecundare. Organizarea re]elei de `ns\mân]\ri artificiale pe baza unor centre puternice, cu un num\r mare de reproduc\tori, creeaz\, prin concentrarea [i specializarea produc]iei, o eficien]\ economic\ sporit\ `n raport cu `ntre]inerea [i exploatarea reproduc\torilor masculi `n fiecare ferm\ zootehnic\. Din punct de vedere sanitar-veterinar, prin practicarea `ns\mân]\rilor artificiale a efectivelor de femele, se pot preveni [i combate unele boli transmisibile prin actul montei (ini]ial a constituit principala cauz\ a r\spândirii `ns\mân]\rilor artificiale). Totodat\, se previn [i combat boli cu etiologie

4

parazitar\ (trichomonoza la taurine, durina la cabaline) [i cu etiologie infec]ioas\ (bruceloza, campylobacterioza la taurine, ovine, porcine). Prin practicarea acestei valoroase biotehnologii de reproducere devine posibil\ continuarea reproducerii `n unit\]ile carantinizate. De asemenea, se pot preveni [i combate unele forme de infecunditate la femele, cum ar fi spasmul vaginal [i altele. Metoda actual\ de inoculare a spermei permite efectuarea de observa]ii asupra organelor genitale femele, ceea ce influen]eaz\ favorabil rezultatul `ns\mân]\rilor. Concentrarea de reproduc\tori `n unit\]i specializate permite luarea unor m\suri riguroase [i [tiin]ifice de alimenta]ie, ad\postire [i `ngrijire a animalelor precum [i de prevenire a bolilor, care [i ele pot influen]a negativ sau chiar compromite reproducerea animalelor pe o arie `ntins\, egal\ cu cea deservit\ de centrul respectiv de `ns\mân]\ri artificiale. Materialul seminal recoltat trebuie s\ corespund\ tuturor criteriilor zooigienice [i a standardelor interna]ionale referitoare la `nc\rcarea cu flor\ microbian\, standarde respectate ast\zi de toate ]\rile avansate. ~ns\mân]\rile artificiale prezint\ [i numeroase avantaje [tiin]ifice. Astfel, aplicarea lor a permis dezvoltarea cercet\rilor [tiin]ifice asupra biochimiei, histochimiei [i imunologiei reproduc]iei `n general [i a spermei `n special. Game]ii sunt studia]i la nivel molecular [i de microscopie electronic\. Aceste cercet\ri au constituit baza pentru progresul rapid `n domeniul metodelor de laborator pentru testarea capacit\]ii fecundante a spermei, a congel\rii materialului seminal [i a aplic\rii practice a `ns\mân]\rilor artificiale. Folosindu-se `ns\mân]\rile artificiale, a devenit posibil\ efectuarea unor hibrid\ri `ntre reproduc\tori din specii care nu se `mperecheaz\ `ntre ele `n condi]ii naturale, ca de exemplu `ntre oaie [i capr\, iak [i zebu, iap\ [i m\gar, p\s\ri domestice [i s\lbatice etc . Toate aceste avantaje recomand\ `ns\mân]\rile artificiale ca una din cele mai moderne [i avantajoase metode de reproducere a animalelor domestice. Ea permite `nsemnate realiz\ri `n zootehnie [i progresul rapid al acestui important sector al economiei na]ionale. 1.2. Aspecte organizatorice ale `s\mân]\rilor artificiale `n ]ara noastr\ La nivel na]ional, procesul de ameliorare a popula]iilor de animale din diferite specii, organizarea [i conducerea activit\]ii pe linia `ns\mân]\rilor artificiale este coordonat\ de Ministerul Agriculturii [i Alimenta]iei care stabile[te metodologia [i m\surile de lucru privind aplicarea `ns\mân]\rilor artificiale. Primele Sta]iuni de `ns\mân]\ri artificiale (S.I.A.V.) la vaci au fost `nfiin]ate `n anul 1953. Cele 42 de S.I.A.V. au fost dotate cu reproduc\tori valoro[i, folosi]i la `ns\mân]area artificial\ a vacilor cu sperm\ brut\.

5

~n perioada anilor 1956-1957 au `nceput s\ fiin]eze primele Centre de `ns\mân]\ri artificiale, dotate cu reproduc\tori (tauri, berbeci) a c\ror material seminal -diluat [i conservat prin refrigerare- era difuzat `n teritoriu la punctele de `ns\mân]\ri atificiale (P.I.A.V.). ~n unit\]ile de stat, erau concentra]i reproduc\tori valoro[i folosi]i la `ns\mân]area artificial\ a femelelor de la fiecare unitate zootehnic\, `n a[a-numitele ferme de ameliorare [i reproduc]ie (F.A.R.). ~n anul 1965 a luat fiin]\ Centrul Na]ional de Reproduc]ie [i Selec]ie la Animale care a contribuit la introducerea metodelor unitare [i practice pe `ntregul teritoriu al ]\rii, excep]ie f\când localit\]ile din zonele greu accesibile. ~ncepând cu anul 1969 s-a introdus [i `n ]ara noastr\ conservarea spermei de taur prin congelare, la `nceput `ntr-un num\r restrâns de centre de `ns\mân]\ri artificiale, apoi metoda s-a extins o dat\ cu `nfiin]area, `n anul 1976, a Intreprinderii pentru Testarea Reproduc\torilor [i Producerea Materialului Seminal Congelat (SEMTEST). Pân\ `n anul 1990, `n conformitate cu prevederile programului de ameliorare a taurinelor, activit\]ile men]ionate c\deau `n sarcina acestei intreprinderi, care apar]inea de Institutul de Cercetare [i Produc]ie pentru Cre[terea Bovinelor Balote[ti, având rolul de a coordona activitatea celor 6 complexe teritoriale. Principalele atribu]ii care reveneau acestei intreprinderi, erau: - organizarea cre[terii [i test\rii reproduc\torilor dup\ performan]ele proprii [i descenden]i; - livrarea produ[ilor testa]i, disponibili; - producerea [i livrarea de material seminal congelat pentru `ns\mân]\ri artificiale la animale; - asigurarea [i `ntre]inerea echipamentului criogenic, aprovizionarea cu azot lichid a beneficiarilor de material seminal congelat; - producerea de echipament [i aparatur\ pentru `ns\mân]\rile artificiale [i selec]ia animalelor, a diluan]ilor pentru material seminal pe specii [i ai unor biostimulatori ai func]iei de reproduc]ie la animale. Dup\ anul 1990, re]eaua „SEMTEST“ a fost reorganizat\, cele 6 complexe teritoriale (Bucure[ti, Ia[i, Craiova, Timi[oara, Târgu-Mure[ [i Baia Mare), fiind transformate `n Societ\]i Comerciale cu capital de stat, atribu]iile lor r\mânând acelea[i (fig.1). Teritoriul de activitate al celor [ase societ\]i tip „SEMTEST“ este dictat de zonarea celor trei rase principale de taurine care se cresc `n ]ara noastr\: B\l]at\ româneasc\ (36%), Brun\ de Maramure[ (29%), B\l]at\ cu negru româneasc\ (32%). ~n prezent, denumirea Centrului Republican de Reproduc]ie [i Selec]ie a Animalelor este Agen]ia Na]ional\ pentru Ameliorare [i Reproduc]ie `n Zootehnie „Prof. dr. G.K.Constantinescu“ subordonat\ Ministerului Agriculturii [i Alimenta]iei.

6

D.J.A.R.Z.

Fig. 1 Zonele de activitate ale Societ\]ilor Comerciale SEMTEST S.A.

Majoritatea vacilor se `ns\mân]eaz\ cu sperm\ congelat\ `n paiete mijlocii [i mici, metod\ care, datorit\ avantajelor pe care le prezint\, a `nlocuit conservarea `n granule [i fiole. De la taurii `n exploatare din unit\]ile comerciale „SEMTEST“ se recolteaz\, controleaz\, prelucreaz\, conserv\ [i livreaz\ sperma c\tre Unităţile de Ameliorare şi Reproducţie în Zootehnie (fostele Oficii Jude]ene de Reproduc]ie [i Selec]ie la Animale) [i altor unit\]i. Activit\]ile legate de `ns\mân]area artificial\ la animale revine Unităţilor de Ameliorare şi Reproducţie în Zootehnie(U.A.R.Z.) (fostele O.J.R.S.A.) subordonate direct Direcţiilor Agricole. Unităţile de Ameliorare şi Reproducţie în Zootehnie au, pe lâng\ activitatea de difuzare a materialului seminal congelat sau refrigerat [i obliga]ia de dirijare a `ntregului proces de reproduc]ie pe raza lor de difuzare. Fiecare U.A.R.Z. are `n subordonare 1-4 Centre Teritoriale de Ameliorare si Reproduc]ie în zootehnie care deservesc cresc\torii `n ceea ce prive[te asisten]a tehnic\ de specialitate `n domeniul reproduc]iei [i selec]iei animalelor. Pentru aceasta, fiecare U.A.R.Z. colaboreaz\ cu unit\]ile „SEMTEST“ din zona respectiv\ [i cu Asocia]ia cresc\torilor de animale (taurine, ovine, suine) din jude]. ~ndeplinirea propriu-zis\ a acestor atribu]ii se face de c\tre Centrele de selec]ie [i reproduc]ie la animale, iar subunitatea verig\ de baz\ a re]elei na]ionale de selec]ie [i reproduc]ie este Punctul de `ns\mân]\ri artificiale (P.I.A.V.), ca forma]iune tehnico-organizatoric\ la nivelul fiec\rei unit\]i zootehnice (de stat sau particulare), a fiec\rei comune, având sarcina s\ efectueze opera]iunile de `ns\mân]are artificial\ a femelelor apar]inând diverselor specii (taurine, ovine, suine), a supravegherii respect\rii instruc]iunilor referitoare la activitatea de ameliorare a animalelor etc. Punctul de `ns\mân]are artificial\ este subunitatea de baz\ a `ntregii re]ele

7

de reproduc]ie [i selec]ie a animalelor, prin a c\rei activitate se materializeaz\ [i finalizeaz\ `ntregul proces de reproduc]ie [i ameliorare a efectivelor din toate sectoarele zotehnice. Fiecare punct de `ns\mân]are artificial\ este dotat cu un minim de aparatur\ [i instrumentar necesare desf\[ur\rii `n condi]ii normale a activit\]ii specifice, iar persoanele `ncadrate la aceste puncte trebuie s\ participe nemijlocit la coordonarea procesului de reproduc]ie a efectivelor din ferma sau localitatea respectiv\, s\ ]in\ corect eviden]a evenimentelor de reproduc]ie [i s\ cunoasc\ perfect efectivul matc\, produ[ii [i destina]ia acestora, contribuind la aplicarea m\surilor de prevenire [i combatere a st\rilor de infecunditate. Pentru `ndeplinirea acestor atribu]ii, punctul de `ns\mân]\ri artificiale trebuie s\ `ndeplineasc\ urm\toarele condi]ii: - s\ fie amplasat `n incinta fermelor atunci când asigur\ `n exclusivitate `ns\mân]area artificial\ a femelelor din unitatea respectiv\ sau la periferia localit\]ilor, c\tre locul de p\[unat al animalelor din gospod\riile individuale; - s\ permit\ accesul u[or al mijloacelor de transport; - s\ dispun\ de ap\ curent\ [i s\ fie conectat la re]eaua electric\; - s\ dispun\ `n interior de spa]iul necesar p\str\rii [i conserv\rii materialului seminal, a opera]iilor preg\titoare `ns\mân]\rii artificiale a femelelor, a documentelor necesare eviden]elor minime, a efectu\rii `ns\mân]\rii artificiale propriu-zise. De regul\, `n unit\]ile zootehnice, spa]iul necesar punctului de `ns\mân]are artificial\ se amenajeaz\ la cap\tul unui grajd. ~n condi]iile de stabula]ie a animalelor `n sistem de `ntre]inere legat, `ns\mân]area femelelor se face, de regul\, pe linia grajdului, cu respectarea regulilor de igien\ corespunz\toare. ~n acest caz, punctul de `ns\mân]are artificial\ este dotat cu un c\rucior special `n care este amplasat containerul cu dozele de `ns\mân]are, vasul cu ap\ cald\ necesar\ pentru decongelarea paietelor cu material seminal, m\nu[ile de protec]ie necesare [i pipetele de `ns\mân]are, men]inute `n condi]ii aseptice. ~n situa]ia `ntre]inerii femelelor la p\[une sau `n sistem dezlegat, este necesar un stand de conten]ie. 1.3. Selec]ia reproduc\torilor masculi folosi]i la `ns\mân]\rile artificiale 1.3.1. Materialul de reproduc]ie

Reproducerea efectivelor de animale prin `ns\mân]\ri artificiale constituie una dintre biotehnologiile cele mai importante de optimizare a acestei func]ii. Succesul `ns\mân]\rilor artificiale este condi]ionat, `n mare parte, de calitatea materialului de reproduc]ie folosit, motiv pentru care se impune o riguroas\ selec]ie [i corect\ apreciere a acestuia. ~n no]iunea de material de reproduc]ie se cuprind animalele, popula]iile de animale sau p\s\ri definite genetic, materialul seminal, ou\le fecundate, puii de o zi etc, care, prin calilt\]ile lor sau prin origine, concur\ la reproducerea speciei [i la efectuarea lucr\rilor de selec]ie necesare `n procesul de ameliorare a raselor.

8

La taurine, materialul de reproduc]ie este constituit din: - tauri reproduc\tori folosi]i la `ns\mân]area artificial\ sau mont\; - t\ura[ii crescu]i pentru `nlocuirea acestora, inclu[i sau nu `n ac]iunea de testare; - materialul seminal conservat; - tineretul mascul [i femel (inclusiv vacile primipare) folosit pentru lucr\ri de testare; - toate femelele, indiferent de ras\ sau provenien]\, care trebuie crescute pân\ la ob]inerea primului vi]el [i cunoa[terea poten]ialului lor productiv. La ovine, materialul de reproduc]ie este alc\tuit din: - animalele cuprinse `n controlul oficial al produc]iei; - materialul seminal provenit de la berbecii folosi]i la `ns\mân]\rile artificiale; - embrionii pentru transfer. La porcine, materialul de reproduc]ie este constituit din: - animalele cuprinse `n eviden]ele de selec]ie [i recunoscute pe baz\ de certificat de calitate; - materialul seminal. La cabaline, materialul de reproduc]ie include: - arm\sarii reproduc\tori; - tineretul cabalin din hergheliile organizate [i cel pentru care s-au eliberat certificate de calitate ; - iepele incluse `n planurile de mont\ ale unit\]ilor; - materialul seminal. La p\s\ri, materialul de reproduc]ie include: - ou\le [i puii de o zi din liniile selec]ionate sau combina]ii dintre aceste linii; - liniile ca atare, pe durata certific\rii lor oficiale. 1.3.2. Selec]ia masculilor reproduc\tori

~n activitatea permanent\ pentru `mbun\t\]irea, genera]ie dup\ genera]ie, efectivului de animale dintr-o cresc\torie, reproduc\torul mascul prezint\ pentru selec]ionare o importan]\ deosebit\, care cre[te propor]ional cu num\rul femelelor cu care se va produce `mperecherea. ~n aten]ia selec]ionerului, valoarea unui mascul folosit la mont\ va fi egal\ cu valoarea celor 30-70 de femele cu care urmeaz\ s\ se `mperecheze. Acela[i mascul, folosit pentru `ns\mân]are artificial\, va avea o participare cu mult mai important\ `n procesul de ameliorare, `ntrucât aptitudinile sale - calit\]i sau defecte - se vor reg\si `ntr-un num\r mult mai mare de produ[i. Folosirea intens\ a reproduc\torilor masculi trebuie `mbinat\ `n modul cel mai [tiin]ific cu o cunoa[tere deplin\ a aptitudinilor genetice, deoarece orice caracter nedorit, indiferent sau `nr\ut\]itor, se va reg\si `n to]i cei câteva

9

sute de mii de produ[i rezulta]i `n urma practic\rii `ns\mân]\rilor artificiale. ~n aceast\ situa]ie, cunoa[terea exact\ a fondului genetic al fiec\rui reproduc\tor, verificarea masculilor dup\ nivelul productiv al descenden]ei, starea poten]ialului de transmitere la urma[i a caracterelor [i aptitudinilor folositoare, dorite, devine o necesitate de prim ordin pentru selec]ioner. Perfec]ionarea `ns\mân]\rilor artificiale pe baza conserv\rii materialului seminal prin congelare a deschis perspective noi `ntregii activit\]i de ameliorare [i testare. Aprecierea masculilor de reproduc]ie are ca scop determinarea valorii fenotipice [i genotipice a acestora, pe baza c\reia se stabilesc destina]ia pentru pr\sil\ sau pentru produc]ie [i modul de folosire la reproduc]ie. Masculii de reproduc]ie - taurine, ovine, porcine - se apreciaz\ dup\ un complex de criterii referitoare la origine, dezvoltare corporal\, conforma]ie corporal\-constitu]ie, performan]e productive [i calitatea descenden]ei, prin `ncadrarea `n clase par]iale [i clasa general\ de bonitare. Clasele par]iale [i clasa general\ se stabilesc pe rase, sexe [i categorii de animale. Pe baza criteriilor de bonitare, se acord\ urm\toarele clase par]iale: - clasa dup\ origine, `n func]ie de clasa general\ a p\rin]ilor; - clasa dup\ dezvoltare corporal\, `n func]ie de greutatea corporal\ [i vârst\, pe sexe, categorii [i rase; - clasa dup\ conforma]ie corporal\-constitu]ie, prin examinarea direct\ a `nsu[irilor de exterior [i constitu]ie; - clasa dup\ performan]a productiv\, acordat\ dup\ unele criterii de baz\, diferite `n raport cu specia [i sexul. Clasa general\ se stabile[te pe baza claselor par]iale, conform unor instruc]iuni precise [i dup\ o metodologie consacrat\ [i care va fi detaliat\ la disciplina de Ameliorare [i la celelalte discipline cu profil tehnologic. 1.3.2.1. Selec]ia taurilor folosi]i la `ns\mân]\rile artificiale

~n practica `ns\mân]\rilor artificiale la taurine, problema principal\ a devenit selec]ia taurilor de la care se ob]ine material seminal difuzat pentru `ns\mân]area artificial\ a femelelor. Selec]ia taurilor se face cu scopul de a pune la dispozi]ia centrelor sau laboratoarelor de prelucrare a materialului seminal, reproduc\tori cu mare valoare de ameliorare. Principalele verigi ale programului de ameliorare a taurinelor sunt: - producerea dirijat\ a genera]iilor de t\ura[i destina]i re]elei de `ns\mân]\ri artificiale [i a celei de mont\; - selec]ia riguroas\ a t\ura[ilor de pr\sil\, prin aplicarea unei intensit\]i ridicate de selec]ie; - utilizarea intens\ la reproduc]ie a taurilor testa]i amelioratori, prin folosirea la `ns\mân]\ri artificiale cu material seminal congelat. Prin realizarea acestor ac]iuni, se creaz\ premisele materiale ca fiecare genera]ie de tauri s\ fie superioar\ ca poten]ial genetic genera]iilor

10

anterioare [i s\ asigure astfel condi]iile unui progres genetic continuu. Producerea genera]iilor de t\ura[i destina]i selec]iei `n vederea folosirii lor la `ns\mân]\rile artificiale [i mont\, se bazeaz\ pe stabilirea necesarului de t\ura[i-candida]i pentru re]eaua de reproduc]ie, precum [i pentru identificarea [i nominalizarea anual\ a vacilor-mame de tauri. 1.3.2.1.1. Stabilirea necesarului de t\ura[i

Necesarul de t\ura[i care urmeaz\ a fi folosi]i la `ns\mân]\rile artificiale se calculeaz\ pornind de la: - necesarul anual de tauri pentru `ns\mân]are artificial\ [i mont\; - propor]ia anual\ de reform\ a taurilor folosi]i la `ns\mân]\rile artificiale: - 33% din num\rul de tauri folosi]i la `ns\mân]\ri artificiale cu sperm\ congelat\; - 20% din num\rul de tauri folosi]i la mont\; - indicele de intensitate a selec]iei, care este de 8,33% (un taur selec]ionat din 12 t\ura[i candida]i proveni]i din vaci nominalizate mame de taur); - structura de ras\ a taurilor folosi]i la `ns\mân]are artificial\ sau mont\, stabilit\ conform ponderii prev\zut\ `n perspectiv\ a raselor de taurine din efectivul total al acestora; - stabilirea necesarului de vaci-mame de tauri, estimat `n func]ie de necesarul anual de t\ura[i candida]i pentru reproduc]ie, intensitatea de selec]ie a vacilor-mame de tauri (50%), natalitatea medie (80%), raportul `ntre sexe (1/1). 1.3.2.1.2. Identificarea [i nominalizarea anual\ a vacilor-mame de tauri

Producerea [i asigurarea cu reproduc\tori masculi de `nalt\ valoare, selec]iona]i `n etape succesive, se bazeaz\ pe ac]iunea de nominalizare a vacilor-mame de tauri [i de dirijare individual\ a `mperecherilor. Pentru aceasta, `n fermele de elit\ [i dintre animalele supuse controlului din afara fermelor de elit\, se propun vaci-viitoare mame de taur. Utilizând datele controlului oficial al produc]iei se procedeaz\ la preselectarea exemplarelor care `ndeplinesc cerin]ele minime pentru a deveni mame de tauri [i pe baza ierarhiei valorice, se `ntocme[te lista vacilor candidate mame de tauri. Având `n vedere intensitatea de selec]ie stabilit\ pentru alegerea vacilormame de tauri din diferite rase, se procedeaz\ la nominalizarea definitiv\ a celor mai valoroase exemplare, prin combinarea datelor controlului oficial de produc]ie cu examinarea clinic\ a animalelor. Vacile acceptate ca mame de tauri se comunic\ unit\]ilor interesate, sub forma unui tabel, `n care sunt incluse toate datele necesare unei corecte nominaliz\ri a `mperecherilor, tabele care sunt valabile pe durata unui an. ~n tabelele respective, vacile candidate mame de tauri sunt ierarhizate `n func]ie de produc]ia de lapte,

11

vârsta la prima f\tare, intervalul dintre dou\ f\t\ri, aptitudinile pentru mulsul mecanic etc. Listele cu vacile respective se `nainteaz\ Agen]iei Na]ionale pentru Ameliorare [i Reproduc]ie `n Zootehnie, `n vederea stabilirii vacilor care `ndeplinesc toate cerin]ele [i confrunt\rii cu necesarul anual de mame de tauri. Anual se nominalizeaz\ `mperecherile pentru ob]inerea genera]iei de t\ura[i. Stabilirea taurilor care vor fi folosi]i la `ns\mân]area artificial\ a vacilor-mame de tauri, const\ `n `nscrierea, `n ordinea valorii lor de ameliorare, a taurilor testa]i [i declara]i amelioratori. Num\rul taurilor-ta]i, `nscri[i `n list\ trebuie s\ fie suficient de mare pentru a se evita o consangvinizare strâns\ [i `ngustarea accentuat\ a genofondului popula]iei produc\toare de tauri. Pentru cele mai valoroase vaci nominalizate anual se import\ material seminal congelat de la tauri valoro[i din lume. 1.3.2.1.3. Selec]ia t\ura[ilor cuprin[i `n testul performan]elor proprii

T\ura[ii proveni]i de la mame de tauri, `n urma `mperecherilor nominalizate, sunt supu[i unei prime selec]ii, dup\ fenotipul ascenden]ei [i fenotipul propriu, `n urma c\reia sunt elimina]i circa 17% din totalul celor ob]inu]i (1 din 6 t\ura[i se elimin\). Pentru aceasta, la `mplinirea vârstei de 30 de zile, fiecare t\ura[ se supune unui examen privind dezvoltarea corporal\, corectitudinea conforma]iei [i mai ales ale membrelor [i articula]iilor, prezen]a anomaliilor de conforma]ie, starea de s\n\tate [.a.m.d. T\ura[ii, `n urma ierarhiz\rii pe baza valorii dup\ ascenden]i [i aprecierii dup\ `nsu[irile de dezvoltare (prin cânt\rire [i examenul de ansamblu, a confirm\rii paternit\]ii prin determinarea grupei sanguine) se admit `n vederea selec]iei dup\ testul performan]elor proprii (P.P.). Ace[ti t\ura[i (circa 83% din cei n\scu]i) se introduc `n sta]iuni de testare dup\ performan]e proprii unde li se asigur\ condi]ii de alimenta]ie [i `ntre]inere specifice fiec\rei rase. Testarea dup\ performan]e proprii se poate face [i `n alte unit\]i (gospod\rii individuale) autorizate de Agen]ia Na]ional\ pentru Ameliorare [i Reproduc]ie `n Zootehnie. ~n aceste unit\]i de testare, vi]eii masculi se introduc la vârsta de 3-4 luni, cu respectarea condi]iilor sanitar-veterinare. Testarea t\ura[ilor dup\ performan]ele proprii const\ `n aprecierea sporului mediu zilnic `n greutate [i a capacit\]ii de reproduc]ie. Aprecierea t\ura[ilor dup\ sporul mediu zilnic `n greutate se face `ntre vârsta de 5-6 luni [i vârsta de 11-12 luni, cânt\ririle f\cându-se individual. ~n aceast\ perioad\ se asigur\ t\ura[ilor furaje concentrate normate, `n cantitate egal\ pentru to]i t\ura[ii de aceea[i vârst\ [i consum de furaje fibroase la discre]ie. Pe baza acestui test se elimin\ circa 25% din t\ura[i `n ordinea invers\ a performan]elor. Ierarhizarea t\ura[ilor dup\ performan]ele proprii se efectueaz\ pe baza sporului mediu zilnic `n greutate `nainte de efectuarea testului capacit\]ii de reproduc]ie.

12

Aprecierea t\ura[ilor dup\ capacitatea de reproduc]ie const\ `n controlul comportamentului sexual, `n examenul calit\]ii spermei [i testarea pretabilit\]ii la congelare a materialului seminal. La `ncheierea perioadei de testare a performan]elor proprii se apreciaz\ constitu]ia [i exteriorul, cei cu defecte grave fiind elimina]i [i destina]i sacrific\rii. Aprecierea conforma]iei corporale-constitu]ie se face individual, o dat\ pe an la to]i reproduc\torii folosi]i la `ns\mân]\ri artificiale [i de fiecare dat\ când se face aprecierea [i certificarea calit\]ii reproduc\torilor `n vederea vânz\rii sau cump\r\rii acestora. Aprecierea se face prin inspec]ie, `n sta]iune [i `n mi[care, apreciindu-se armonia de ansamblu, dezvoltarea corporal\, trenul anterior [i posterior, linia superioar\, crupa, bazinul, dezvoltarea musculaturii, aplombul membrelor posterioare, starea chi[i]elor [i ongloanelor. Se elimin\ de la reproduc]ie taurii cu crupa `ngust\, prea `nclinat\ antero-posterior, cu distan]a mic\ `ntre articula]iile coxo-femurale [i ischii, cu musculatura insuficient dezvoltat\, cei cu diferite defecte de aplomb (jarete deschise, `nchise, „coate de vac\“, „sub el dinapoi“, campat etc), defecte care `mpiedic\ efectuarea saltului [i provoac\ distocii la femelele descendente. ~n urma testului capacit\]ii de reproduc]ie [i a celui privind conforma]ia corporal\-constitu]ia, se mai elimin\ din efectivul ini]ial de t\ura[i `nc\ 25%. 1.3.2.1.4. Aprecierea taurilor `n testare dup\ descenden]i

Criteriul principal dup\ care se face diferen]ierea reproductiv\ a taurilor folosi]i la `ns\mân]\rile artificiale este rezultatul test\rii dup\ descenden]a mascul\ pentru `nsu[irile privind produc]ia de carne [i dup\ descenden]a femel\ pentru produc]ia de lapte. La testarea dup\ descenden]i sunt inclu[i taurii `n vârst\ de cel mult 4 ani care provin din ambii p\rin]i cu clasa general\ „record“, sunt clasa]i cu cel pu]in la „elit\“ dup\ dezvoltarea corporal\-constitu]ie, cu paternitatea acceptat\ prin certificat de determinare a grupei sanguine, iar produsul seminal se preteaz\ la congelare. De la fiecare taur `n testare dup\ descenden]i se recolteaz\ [i difuzeaz\ cel pu]in 500 doze de material seminal congelat, cu care se `ns\mân]eaz\ artificial circa 200 de femele `ntr-un interval calendaristic de maximum 90 de zile. Din acest material se ob]in circa 100 de masculi [i circa 100 de femele. Rezultatele test\rii dup\ descenden]i pentru produc]ia de carne se exprim\ prin media diferen]elor de spor mediu zilnic `n greutate realizat de descenden]ii unui taur, fa]\ de sporul mediu zilnic `n greutate realizat de contemporanii fiec\ruia dintre descenden]i, `ntre vârsta de [ase luni±dou\ s\pt\mâni [i vârsta de doisprezece luni±dou\ s\pt\mâni. Se consider\ contemporan orice vi]el mascul provenit de la un alt reproduc\tor de aceea[i ras\ cu cel `n testare, când vi]elul s-a ob]inut din mam\ cu aceea[i apartenen]\ de ras\ ca [i mama descendentului pentru care

13

este contemporan, când s-a n\scut la un interval de ±trei zile fa]\ de acesta [i când a parcurs perioada de `ngr\[are `n acela[i lot cu descendentul. Rezultatul test\rii dup\ descenden]i pentru produc]ia de lapte se exprim\ prin media diferen]elor de gr\sime total\ din lapte pe lacta]ie normal\, la prima lacta]ie, realizate de fiicele unui taur, fa]\ de cantitatea de gr\sime total\ realizat\, `n medie, de contemporanele fiec\reia dintre descendente, la prima lacta]ie normal\. Se consider\ contemporan\ orice primipar\ provenit\ din alt taur de aceea[i ras\ cu cel `n testare, când primipara s-a ob]inut din mam\ de aceea[i apartenen]\ de ras\ ca [i mama descendentei pentru care este contemporan\, când vârsta la prima f\tare a fost cuprins\ `ntre 23 [i 35 de luni, dar f\tarea a avut loc la o diferen]\ de vârst\ de ±3 luni fa]\ de a descendentei, când a `nceput prima lacta]ie `n decurs de 28 de zile fa]\ de descendent\ [i a realizat lacta]ia normal\ (260-305 zile) `n aceea[i ferm\ cu aceasta. Condi]ia de vârst\ la prima f\tare este aceea[i [i pentru descendente. Pe durata cre[terii descenden]ilor [i pân\ la `ncheierea m\sur\rii performan]elor acestora, taurii se afl\ `n a[a numita „perioad\ de a[teptare“. La `ncheierea test\rii, taurii pot fi `ncadra]i `n 4 categorii: - tauri amelioratori ai produc]iei de lapte [i carne, la care media diferen]elor dintre performan]ele descenden]ilor [i contemporanelor este `n favoarea descenden]ilor cu mai mult de 2% pentru produc]ia de lapte [i 1% pentru produc]ia de carne; - tauri amelioratori pentru lapte la care produc]ia de lapte a descendentelor femele este cu 2% mai mare decât a contemporanelor, iar produc]ia de carne a descenden]ilor masculi este mai mic\ decât a contemporanilor, dar nu cu mai mult de 5%; - tauri amelioratori pentru carne, la care descenden]ii au un spor mediu zilnic mai mare decât contemporanii cu 1% iar descendentele au produc]ia de lapte mai mic\ sau nu au `ncheiat prima lacta]ie; - tauri indiferen]i, ai c\ror descenden]i, masculi [i femele, `nregistreaz\ performan]e u[or superioare celor ale contemporanilor. - tauri clasa]i pentru t\iere, când descenden]ii, masculi [i femele, `nregistreaz\ niveluri mai sc\zute, comparativ cu a contemporanilor lor. Pân\ la `ncheierea test\rii, taurii se g\sesc `n categoria „tauri `n testare“. Pentru informarea cresc\torilor cu privire la `nsu[irile reproduc\torilor, furnizorii de material seminal public\ cataloage de reproduc\tori `n care se consemneaz\ numele, num\rul matricol, num\rul din registrul genealogic [i num\rul de cod al reproduc\torului, data na[terii, provenien]a, date privind dezvoltarea corporal\ (greutate, talie etc), rezultate

14

ob]inute la testarea dup\ descenden]i (masculi, femele), date prin care se realizeaz\ identificarea reproduc\torului. ~nsu[irile din cataloage sunt determinante ale pre]ului de livrare a materialului seminal. Totodat\ ofer\ informa]ii referitoare la alegerea taurilor adecva]i scopului urm\rit prin programul de ameliorare `ntocmit de fiecare unitate sau cresc\tor. 1.3.2.2. Selec]ia berbecilor reproduc\tori

O prim\ cerin]\ fa]\ de berbecii reproduc\tori este puritatea de ras\, condi]ie care trebuie s\ evite manifestarea fenomenelor de disjunc]ie a caracterelor [i generarea lipsei de uniformitate a cârdurilor. ~n prezent, din cauza `ncruci[\rilor practicate `ntre diverse rase, uniformitatea cârdurilor este nesatisf\c\toare. Rasa berbecilor de la care urmeaz\ s\ se produc\ material seminal pentru `ns\mân]are artificial\, pe zone de cre[tere, este stabilit\ prin harta de zonare a raselor. Selec]ia berbecilor, indiferent de ras\, se face pe baza urm\toarelor clase par]iale: - clasa dup\ origine, care se acord\ `n func]ie de clasa general\ a p\rin]ilor; - clasa dup\ dezvoltare corporal\ se acord\ pe baza greut\]ii vii `nregistrate la tineretul `nainte de primul tuns; la miori [i mioare la tunsul de baz\; la berbeci [i oi la tunsul din anul curent; - clasa pentru conforma]ie corporal\-constitu]ie, se acord\ prin examinarea direct\ cu ocazia bonit\rii `nsu[irilor de exterior [i constitu]ie; - clasa dup\ performan]a productiv\, care se acord\ `n func]ie de cantitatea de lân\ la tunsul de baz\ sau primul tuns cunoscut, respectiv dup\ calitatea pielicelei de la bonitarea de miel a ovinelor cunoscute pentru produc]ia de pielicele. Clasa general\ se stabile[te pe baza claselor par]iale. Berbecii candida]i pepinieri la `ns\mân]\rile artificiale sunt testa]i dup\ descenden]i pentru produc]ia de lapte [i carne. Lucr\rile de testare se bazeaz\ pe metoda compar\rii valorilor medii ale performan]elor proprii la descenden]i, cu valorile medii ale acelora[i `nsu[iri la contemporani. 1.3.2.2.1. Testarea berbecilor dup\ descenden]i pentru produc]ia de lân\

Se efectueaz\ pe baza produc]iei de lân\ a descendentelor la primul tuns [i se exprim\ prin diferen]a medie a descendentelor fa]\ de produc]ia medie a contemporanelor. Se consider\ contemporan\ orice femel\ provenit\ de la un alt berbec care activeaz\ `n ferm\, n\scut\ `n acela[i sezon de f\t\ri [i crescut\ `n aceea[i ferm\.

15

Valoarea de ameliorare pentru produc]ia de lân\ se atest\ dac\ num\rul de fiice efective este de minim 15, iar contemporanele provin de la cel pu]in al]i 3 berbeci. Valoarea de ameliorare pentru produc]ia de lân\ se completeaz\ cu celelalte `nsu[iri stabilite la bonitare, prin care se caracterizeaz\ lotul de fiice, precum [i cu randamentul mediu la sp\larea lânii. 1.3.2.2.2. Testarea berbecilor dup\ descenden]i pentru produc]ia de carne

Acest test se realizeaz\ prin metoda `ngr\[\rii de control a unui lot de minim 10 descenden]i masculi ai berbecului `n testare. Lotul de descenden]i pentru `ngr\[area de control se constituie din berbecu]i n\scu]i consecutiv `ntr-o perioad\ de maximum 30 de zile. Berbecu]ii din loturile de descenden]i [i contemporanii lor se introduc la `ngr\[area de control dup\ `n]\rcare [i parcurg dou\ etape: - perioada de acomodare (preg\tire) care dureaz\ 25-30 de zile; - perioada `ngr\[\rii de control, cu o durat\ de 60 de zile, `n continuarea perioadei de preg\tire. Hr\nirea se face la discre]ie, cu furaj unic, de aceea[i compozi]ie, `n ambele perioade. La `ncheierea `ngr\[\rii de control, loturile de descenden]i [i contemporani trebuie s\ nu dep\[easc\ vârsta medie de 160 de zile. Valoarea de ameliorare pentru `nsu[irile de carne stabilit\ prin testarea dup\ descenden]i se exprim\ prin diferen]a privind sporul mediu total al loturilor de descenden]i realizat pe perioada `ngr\[\rii de control, fa]\ de contemporani [i se exprim\ `n valori absolute (±g) [i valori relative (%). ~n urma test\rii dup\ descenden]i, berbecii se `ncadreaz\ `n una din urm\toarele categorii: - amelioratori pentru produc]ia de lân\ [i carne; - amelioratori pentru lân\; - amelioratori pentru carne; - indiferen]i; - `nr\ut\]itori (clasa]i pentru t\iere). 1.3.2.3. Selec]ia vierilor reproduc\tori

Selec]ia vierilor folosi]i la `ns\mân]\rile artificiale se face cu scopul de a ob]ine exemplare capabile s\ amelioreze conforma]ia, sporul de cre[tere, valorificarea hranei, calitatea c\rnii, fecunditatea [i prolificitatea scroafelor. Vierii de reproduc]ie se apreciaz\ pe baza claselor par]iale [i clasei generale. Clasele par]iale sunt: - clasa dup\ origine, se acord\ `n func]ie de clasa general\ a p\rin]ilor;

16

clasa dup\ ritmul de dezvoltare se acord\ `n func]ie de performan]ele proprii privind sporul mediu zilnic `n greutate, realizat de la vârsta de 91±3 zile, pân\ la vârsta de 182±3 zile; - clasa dup\ calitatea c\rnii se acord\ `n func]ie de performan]a realizat\ pentru grosimea stratului de gr\sime (mm); - clasa dup\ conforma]ia corporal\-constitu]ie se acord\ `n func]ie de punctajul realizat la aprecierea exteriorului [i constitu]iei. Dup\ luarea deciziei de selec]ie pe baza testului performan]elor proprii, vieru[ii re]inu]i `n ferm\ [i care ajung la vârsta de reproduc]ie primesc un num\r de reproduc\tor [i li se acord\ clase par]iale pe baza c\rora se stabile[te clasa general\. Vieru[ii care au primit num\r de reproduc\tor [i au corespuns la aprecierea capacit\]ii de reproduc]ie se supun test\rii dup\ descenden]i. Testarea dup\ descenden]i se folose[te ca procedeu secundar de selec]ie `n unit\]ile de selec]ie [i testare, bazându-se pe datele `nregistrate la testarea dup\ performan]e proprii. Se consider\ testa]i dup\ descenden]i vierii de la care, `n urma test\rii dup\ performan]ele proprii ale descenden]ilor, se ob]in din primele 8 s\pt\mâni de folosire cel pu]in 4 loturi de purcei proveni]i de la 4 scroafe ne`nrudite `ntre ele, realizând o diferen]\ medie pozitiv\ la compararea cu performan]a medie a seriilor de testare. -

1.3.2.4. Aprecierea arm\sarilor de reproduc]ie

Const\ `n determinarea valorii zootehnice [i de produc]ie a acestora, pe baza unui complex de criterii: originea [i tipul rasei, dimensiunile corporale, conforma]ie corporal\, capacitatea energetic\ [i calitatea descenden]ilor. ~n func]ie de rezultatul aprecierii se stabile[te clasa de calitate [i destina]ia cabalinelor. Originea [i tipul rasei se stabilesc dup\ eviden]ele genealogice, completându-se cu examinarea obligatorie a cabalinelor privind `nsu[irile rasei. Dimensiunile corporale [i datele privind conforma]ia corporal\ [i capacitatea energetic\ se `nscriu de c\tre organele zootehnice ale unit\]ii (herghelii, depozite de arm\sari, hipodroame) `n formularele de clasare, aprecierea general\ f\cându-se de c\tre comisii speciale. Conforma]ia corporal\ se apreciaz\ `n raport cu obiectivul urm\rit `n cre[terea rasei respective (alerg\ri pe hipodrom, trac]iune u[oar\, trac]iune grea, sport, c\l\rie etc), `ncadrând animalul dup\ armonia de ansamblu `n tipul de conforma]ie specific utiliz\rii sale. Capacitatea energetic\ se apreciaz\ pe baza eviden]elor [i actelor ce con]in rezultatele probelor pe hipodromurile oficiale [i pe cele ale hergheliilor (record km).

17

Calitatea descenden]ilor arm\sarilor se stabile[te pe baza datelor din eviden]ele zootehnice, precum [i prin examinarea direct\ efectuat\ de comisia de apreciere la dou\ serii de produ[i. Clasa general\ a arm\sarilor de reproduc]ie se stabile[te, de asemenea, de comisiile de apreciere, pe baza unei metodologii prev\zut\ `n instruc]iunile de bonitare. 1.4. Principii [i metode de recoltare a spermei Recoltarea este opera]ia prin care se ob]ine sperma de la reproduc\tori prin intermediul unei aparaturi speciale sau prin alte procedee. Este o opera]ie important\ [i dificil\, succesul ei fiind determinat de cunoa[terea fiziologiei comportamentului sexual al masculilor `n vederea adopt\rii celor mai adecvate metode de ob]inere a ejaculatului. 1.4.1. Bazele fiziologice ale recolt\rii spermei 1.4.1.1. Comportamentul sexual al masculilor

Comportamentul sexual al mamiferelor se bazeaz\ pe un schimb reciproc de semnale specifice care, `n final se materializeaz\ `n actul sexual propriu-zis. La animalele crescute `n libertate, `ntre]inute `n padocuri sau boxe comune pentru ambele sexe, comportamentul sexual se desf\[oar\ secven]ional: - c\utarea reciproc\ a celor doi parteneri; - sincronizarea comportamental\; - actul sexual propriu-zis. La toate speciile, activitatea sexual\ `ncepe printr-o c\utare reciproc\ de contact `ntre mascul [i femel\. Schimburile de informa]ii senzoriale fac posibil\ identificarea receptivit\]ii sexuale a celor doi parteneri, apoi provoac\ r\spunsurile comportamentale care induc reac]iile de atitudine necesare `mperecherii. Semnalele caracteristice emise de femel\ indic\ stadiul receptivit\]ii sexuale, femela neacceptând saltul masculului decât `n momentul impregnan]ei estrogenice maxime. La toate mamiferele, femela se va imobiliza `naintea `mperecherii, luând o pozi]ie care s\ permit\ masculului intromiterea penisului. Cunoa[terea particularit\]ilor fiziologice ale comportamentului sexual este necesar\ `n momentul obi[nuirii reproduc\torilor folosi]i la `ns\mân]\rile artificiale, cu recoltarea materialului seminal. Obi[nuirea presupune r\bdare [i tact, astfel `ncât, s\ se suprapun\ peste reflexele necondi]ionate, cele condi]ionate pozitive, permi]ând o bun\ recoltare a spermei, f\r\ a stresa masculul respectiv. Dup\ obi[nuirea masculului cu recoltarea spermei, datorit\ reflexelor condi]ionate pozitive, ejaculatul poate fi recoltat u[or, pe o femel\ `n oricare stadiu al ciclului sexual, pe un mascul sau pe un manechin adaptat ca form\, m\rime [i aspect speciei respective.

18

Recoltarea spermei cu ajutorul vaginului artificial se bazeaz\ pe succesiunea fiziologic\ a reflexelor sexuale, cu deosebirea c\ sperma este depus\ `n alt loc decât `n cazul montei, mediul natural de la nivelul sec]iunii copulatoare a aparatului genital femel fiind reconstituit prin mijloace artificiale. Baza fiziologic\ a recolt\rii spermei cu vaginul artificial este reprezentat\ de reflexele sexuale `nn\scute peste care s-au suprapus reflexele dobândite `n urma asocierii lor repetate. ~n desf\[urarea reflexelor sexuale necesare recolt\rii spermei, un rol deosebit revine corpusculilor senzitivi [i termina]iilor nervoase existente la nivelul penisului. ~n tegumentul glandului se g\sesc corpusculii care reac]ioneaz\ la excita]iile termice, corpusculii Meissner care recep]ioneaz\ impulsurile tactile, corpusculii Vater-Paccini, pentru recep]ionarea impulsurilor de presiune, corpusculi pentru recep]ionarea durerii. Totodat\, un rol deosebit revine [i organelor de sim]. Factorii mediului extern (lumina, temperatura, mirosul specific al femelelor `n c\lduri, efectuarea montei `ntre al]i parteneri, `mbr\]i[area efectuat\ de mascul sau femel\ etc) provoac\ excita]ii, care ajunse la nivelul hipotalamusului, declan[eaz\ mecanismul neuro-endocrin care st\ la baza form\rii reflexelor sexuale. Fiziologia actului sexual const\ dintr-o succesiune de etape care se manifest\ prin urm\toarele reflexe sexuale: reflexul de apropiere, reflexul de erec]ie, reflexul de `mbr\]i[are, reflexul de intromisiune [i reflexul de ejaculare. Reflexul de apropiere const\ `ntr-o c\utare reciproc\ de contact `ntre mascul [i femel\. Schimburile de informa]ii senzoriale, care au loc cu acest prilej, provoac\ r\spunsuri comportamentale care induc atitudinile caracteristice desf\[ur\rii actului sexual. Un rol particular `n realizarea contactului `ntre mascul [i femel\ `l au semnalele olfactive datorate feromonilor care declan[eaz\ reac]ii specifice, de stimulare sau inhibi]ie. Fona]ia, audi]ia, contactul corporal `ntre parteneri, jocul, lupta care precede acceptarea masculului, `ndeplinesc un rol deosebit `n apropierea partenerilor. To]i ace[ti factori induc excita]ia precopulatoare. La mamifere, sursa cea mai puternic\ de excita]ii o constituie stimularea tactil\ astfel `ncât este posibil\ declan[area excita]iei precopulatoare chiar prin simple excita]ii mecanice ale zonei genitale. Excita]ia precopulatoare se manifest\ prin libidou, care este datorat impregn\rii structurilor necesare de c\tre hormonii androgeni. Acest tip de excitare se caracterizeaz\ printr-un complex de manifest\ri variate ca: accelerarea pulsului, cre[terea tensiunii arteriale, modific\ri ale circula]iei periferice cu ridicarea temperaturii tegumentului, aflux sanguin, cre[terea tensiunii nervoase etc. Un semn caracteristic al excita]iei sexuale este reac]ia ce se declan[eaz\ `n cadrul excita]iei sexuale precopulatoare (Gluhovschi,1978). Reflexul de erec]ie. Erec]ia const\ `n schimbarea formei, volumului [i constitu]iei organului copulator. ~n repaus, penisul este ad\postit `n furou, [i la unele specii este flasc. Din aceast\ stare, penisul, prin erec]ie, este exteriorizat din furou [i devine rigid printr-o modificare special\ a ]esutului erectil.

19

Erec]ia este consecin]a fenomenelor dilatatoare care se produc la nivelul corpului spongios [i al corpilor caverno[i ai penisului, urmat\ de umplerea acestora cu sânge. ~n urma acumul\rii intense a sângelui, are loc dilatarea cavernelor, capsula fibroas\ se `ntinde, mu[chiul se contract\ [i penisul devine rigid, se alunge[te la maxim [i este propulsat din furou. }esutul erectil al corpului spongios [i al corpilor caverno[i reprezint\ un sistem spongios de spa]ii vasculare, pres\rate cu artere [i vene. ~n stare de repaus, aceste spa]ii sunt colabate [i con]in cantit\]i mici de sânge; o dat\ cu erec]ia ele devin cavit\]i mari, umplute cu sânge. Cre[terea afluxului de sânge este determinat\ pe cale neuro-hormonal\ [i asigurat\ de compresiunea c\ilor venoase de `ntoarcere prin contrac]ia mu[chilor bulbo[i ischiocaverno[i. Afluxul de sânge la nivelul ]esutului cavernos se produce treptat. La `nceput se umplu cu sânge cavernele care, datorit\ vasodilata]iei arteriale, se destind, urmat\ de erec]ia ]esutului spongios din jurul uretrei. }esutul spongios se `ncarc\ cu sânge venos ca urmare a st\rii provocate de stimularea nervilor splahnici pelvieni, iar stimularea inerva]iei simpatice determin\ constric]ia arterelor penisului [i `ncetarea erec]iei. Erec]ia este un reflex `nn\scut provocat\ pe cale reflex\, centrul fiind situat `n m\duva sacral\, la nivelul neuromerelor S1-S2. Arcul reflex include nervii dorsali, ru[inos [i hipogastric, centrul medular, nervii simpatici [i parasimpatici. Senza]iile vizuale, auditive, tactile [i olfactive stimuleaz\ sistemul nervos central de la nivelul c\ruia porne[te impulsul excitator al centrului erec]iei. Din centrul erec]iei pleac\ nervii centrifugi care provoac\ dilata]ia vaselor penisului [i contrac]ia mu[chilor ischio- [i bulbocaverno[i. Erec]ia este determinat\ [i de excitarea mecanic\ a receptorilor penieni, reflex care st\ la baza recolt\rii spermei prin masturba]ie. Erec]ia este `nso]it\ de eliminarea la nivelul meatului a unei secre]ii mucoase, clare, filante cu rol lubrifiant produs\ de glandele Littré [i de glandele bulbo-uretrale. Aceast\ secre]ie, `mpreun\ cu cele ale glandelor Bartholin, faciliteaz\ intromiterea penisului `n conductul vestibulo-vaginal. Erec]ia este `nso]it\ de contrac]ia tunicii externe a burselor testiculare, `n urma c\reia testiculele sunt apropiate de orificiul extern al canalului inghinal. Durata erec]iei depinde de specia [i vârsta reproduc\torului. La masculii tineri, erec]ia se poate men]ine un timp mai `ndelungat (chiar o jum\tate de or\), `ns\ durata erec]iei scade progresiv cu vârsta. Manifestarea erec]iei este determinat\ de nivelul hormonilor androgeni din organism, de tipul de sistem nervos al masculului, de vârst\, condi]ii de exploatare, `ntre]inere etc. Erec]ia diminu\ consecutiv uzurii nervoase, a abuzului sexual, obi[nuin]ei, oboselii, alimenta]iei [i `ntre]inerii necorespunz\toare. ~n caz de `mb\trânire, erec]ia se produce intermitent, pân\ ce dispare complet, stare ce se observ\ la taurii, berbecii [i vierii b\trâni. ~n diversele boli ca meningita, turbarea, tetanosul, erec]ia este mai pronun]at\ decât la animalul s\n\tos. Toxina tetanic\, având o elec]ie special\ pentru sistemul nervos, scade centrul de excitabilitate a tuturor centrilor medulari, deci [i a centrului erec]iei. Substan]ele afrodiziace (iohinibina, stricnina etc), cele

20

parasimpatice comimetice stimuleaz\ erec]ia penian\, fie prin provocarea vasodilata]iei locale (iohinibina), fie prin sc\derea pragului de excitabilitate a centrului erec]iei (stricnina). Anafrodiziacele (opiumul, bromurile etc) intoxica]iile cu diverse s\ruri de mercur, potasiu, arseniu etc, inhib\ erec]ia. Sunt [i numero[i centri nervo[i superiori, localiza]i `n bulb, hipotalamus [i centri corticali, ca sediu al reflexelor condi]ionate care, `n urma excita]iei, determin\ erec]ia. Inerva]ia senzitiv\ parasimpatic\ este vasodilatatoare [i erectil\, pe când cea ortosimpatic\ este vasoconstrictoare. Reflexul de `mbr\]i[are. Excita]iile acumulate `n timpul reflexelor de apropiere [i de erec]ie determin\ necesitatea reflexelor de `mbr\]i[are [i intromisiune. Este un reflex `nn\scut, masculii tineri `ncercând s\ efectueze saltul pe orice femel\ sau pe al]i masculi. Dup\ efectuarea saltului, masculul fixeaz\ femela (sau partenerul de recoltare) cu membrele anterioare [i execut\ mi[c\ri caracteristice de c\utare, cu penisul, a organelor genitale femele externe. Executarea cu siguran]\ a saltului se transmite ereditar [i este unul din semnele bunei fertilit\]i a taurului. ~mbr\]i[area poate fi normal\, când se produce la scurt timp dup\ erec]ie, rapid\, când se produce `naintea erec]iei [i tardiv\, când apare mult dup\ erec]ie (masculii b\trâni, bolnavi, subalimenta]i). Cunoa[terea tipului de reactivitate a masculului este important\ atunci când are loc preg\tirea masculului pentru recoltare, de o corect\ preg\tire a acestuia depinzând volumul spermei. Reflexul de `mperechere (intromisiune, coit). Este un reflex `nn\scut [i const\ `n intromiterea organului copulator `n conductul vestibulo-vaginocervical al femelei `n c\lduri. Intromiterea penisului este facilitat\ de secre]iile glandelor Littré, bulbo-uretrale (par]ial), glandelor Bartholin [i de smegma prepu]ial\. Introducerea penisului are loc la nivelul vaginului la rumeg\toare [i carnivore, pân\ la cervix la cabaline [i pân\ `n uter la suine. Reflexul de ejaculare const\ `n proiectarea, sacadat [i sub presiune, spermei `n afara c\ilor genitale mascule. Ejacularea se produce pe cale reflex\, consecutiv excita]iilor acumulate `n timpul actului coital [i transmise sistemului nervos. ~n primul rând sunt excitate termina]iile nervoase din penis, reprezentate `n special prin corpusculii Vater-Paccini, Meissner [i genitali. Ejacularea este ini]iat\ de stimulii genitali [i mediat\ de nervii care transmit impulsuri la creier. De la creier, `n sens invers, sunt elaborate impulsuri la nivelul sistemului simpatic lombar (L2-L4-centrul ejaculator) de unde impulsurile eferente trec prin ganglionii simpatici, de-a lungul nervului presacral [i a celui pelvin, la toate organele din cavitatea pelvin\. Ele dau fibre motorii pentru mu[chii netezi ai tractusului genital (epididim, canale deferente, canal ejaculator, prostat\, glande seminale). Prin contrac]ia fibrelor musculare netede de la nivelul acestor organe, con]inutul este `mpins `n uretra penian\, segmentul prostatic, unde, din amestecul fluidului testicular [i epididimar cu secre]iile glandelor anexe, se formeaz\ sperma. Sperma, o dat\ format\, ac]ioneaz\

21

reflex [i determin\ `nchiderea gâtului vezicii urinare [i contrac]ia fibrelor musculare netede de la nivelul uretrei pelvine, sporind pesiunea exercitat\ de sperm\ [i `mpingând-o spre baza penisului. ~n acest moment intervin [i mu[chii penisului, bulbo- [i ischiocaverno[i [i contrac]ia ritmic\ a uretrei, `nvingând rezisten]a periferic\ [i expulzând sperma `n jeturi ritmice. La producerea ejacul\rii este necesar\ contrac]ia sincron\ a mu[chilor epididimului, canalelor deferente, canalului ejaculator, uretrei [i penisului. Aceste contrac]ii determin\ ejacularea sacadat\ la arm\sar, vier [i câine [i spontan\ la rumeg\toare. Prin excita]iile electrice produse la nivelul centrului ejaculator din m\duva lombar\, se provoac\ eliminarea spermei. Acest principiu st\ la baza electroejacul\rii. Modul de eliminare a spermei difer\ cu specia: - la taur, berbec [i ]ap to]i componen]ii spermei se elimin\ simultan; - la arm\sar, la `nceput se elimin\ secre]ia glandelor Littré [i a celor bulbo-uretrale, lipsit\ de spermatozoizi, apoi sunt expulza]i spermatozoizii `mpreun\ cu secre]ia prostatic\, la urm\ fiind eliminat\ secre]ia glandelor seminale; - la vier, ejacularea este multifazic\; prefaza, cu o durat\ de 1-2 minute, `n decursul c\reia se elimin\ secre]iile glandelor uretrale lipsite de spermatozoizi (2-5% din con]inutul ejaculatului); faza principal\, cu o durat\ de 2-3 minute, reprezentat\ de secre]iile epididimului, veziculelor seminale, prostatei [i glandelor bulbouretrale (30-50% din con]inutul ejaculatului); faza postspermatic\, cu o durat\ de 4-5 minute, [i un con]inut de 50-60% din ejaculat, s\rac\ `n spermatozoizi, compus\ `n cea mai mare parte din secre]iile veziculelor seminale [i ale glandelor bulbo-uretrale. 1.4.1.2. Specificul reflexelor sexuale la principalele specii de animale 1.4.1.2.1. Reflexele sexuale la taur

Reflexul de apropiere este pu]in exteriorizat [i se bazeaz\, `n principal, pe excita]iile vizuale, taurul apropiindu-se de femele, indiferent de stadiul ciclului sexual `n care se afl\ acestea. ~n cazul recolt\rii spermei cu ajutorul vaginului artificial, taurul se apropie de partenerul de recoltare, conten]ionat `n stand (femel\, mascul) (foto 1). Reflexul de erec]ie este necondi]ionat, peste care se suprapun reflexe condi]ionate, prin intermediul c\rora acest reflex poate fi dirijat `n sens pozitiv. Erec]ia se produce chiar din momentul intr\rii `n sala de recoltare sau numai la vederea vaginului artificial [i a operatorului recoltator cu care s-a obi[nuit. Din aceast\ cauz\, vaginul artificial trebuie s\ fie corect preg\tit, `n caz contrar se formeaz\ reflexe condi]ionate inhibitoare ale acestui reflex.

22

Reflexul de `mbr\-]i[are (salt, cuprindere) (foto 2) este bine eviden]iat la taurii crescu]i `n libertate, `mpreun\ cu femelele. ~n cazul practic\rii montei, se formeaz\ un reflex condi]ionat numai pentru vacile `n c\lduri. ~n cazul recolt\rii spermei cu ajutorul vaginului artificial se creaz\ un reflex condi]ionat pentru masculul partener, recoltarea „taur pe Foto 1 Reflexul de apropiere la taur taur’’ fiind practicat\ `n cvasitotalitatea unit\]ilor care se ocup\ cu producerea de material seminal conservat. La taurii folosi]i la `ns\mân]\ri artificiale se practic\ a[a-numitul salt „`n gol“ cu scopul `mbun\t\]irii volumului ejaculatului. ~n cazul examenului andrologic al taurilor de reproduc]ie, printre altele, se noteaz\ [i modul `n care masculul Foto 2 Reflexul de `mbr\]i[are [i ejaculare efectueaz\ saltul, acesta fiind la taur dependent de temperamentul fiec\ruia [i constituie o `nsu[ire ce se transmite la descenden]i. ~n cazul unor afec]iuni la nivelul coloanei vertebrale, membrelor posterioare etc, acest reflex poate fi inhibat. Reflexul de intromisiune (`mperechere, coit) const\ `n introducerea penisului `n conductul vestibulo-vaginal al femelei `n cazul montei, sau `n lumenul vaginului artificial corect preg\tit, `n cazul practic\rii `ns\mân]\rilor artificiale. {i acest reflex poate fi inhibat `n cazul preg\tirii necorespunz\toare a vaginului artificial: tempera-tur\, presiune [i lubrifiere necorespunz\toare, falduri `n spiral\ etc. Reflexul de ejaculare se produce având la baz\ senza]iile termice, de presiune [i tactile recep]ionate de corpusculii dispu[i la nivelul penisului [i transformate `n stimuli pe calea filetelor nervoase aferente pentru centrul ejaculator lombar de la nivelul c\ruia, pe calea filetelor nervoase eferente, sunt transmise la nivelul musculaturii netede a diverselor segmente ale aparatului genital [i, prin contrac]ia acesteia, se produce expulzarea spermei. Reflexul de ejaculare la taur este foarte rapid, suprapunându-se intromisiunii. ~n cazul recolt\rii spermei cu vaginul artificial, dac\ acesta

23

este corect preg\tit, ejacularea este rapid\, f\r\ a influen]a negativ [i `n timp desf\[urarea reflexelor sexuale la taurii de reproduc]ie. Tipul de sistem nervos influen]eaz\ manifestarea [i desf\[urarea reflexelor sexuale. Cunoa[terea particularit\]ilor temperamentale ale fiec\rui taur folosit la `ns\mân]\ri artificiale este o condi]ie esen]ial\ pentru ob]inerea unei sperme de bun\ calitate. De altfel, selec]ia reproduc\torilor include [i criteriul temperamentului, fiind re]inu]i pentru folosirea la `ns\mân]\ri artificiale taurii cu sistem nervos echilibrat [i cu temperament vioi [i lini[tit. 1.4.1.2.2. Reflexele sexuale la berbec

Pentru animalele `n libertate, comportamentul sexual, care se termin\ `n mod normal printr-o `mperechere, se caracterizeaz\ printr-o secven]\ specific\ a reflexelor sexuale. Reflexul de apropiere const\ `n interesul berbecului pentru oaia `n c\lduri [i c\utarea acesteia. Aceast\ c\utare [i curtenirea care urmeaz\ depinde `n mod egal [i de rolul activ al femelei `n estru. Masculul dirijeaz\ parada sexual\ (apropieri ritualizate laterale, `nso]ite de mi[c\ri ale unui membru anterior). Adulmec\ oaia `n c\lduri, urmând ridicarea capului [i manifestarea unui rictus al buzei superioare. Abordarea oii `n c\lduri se face prin lovirea acesteia cu capul `n regiunea abdomenului [i apoi cu membrul anterior. Imobilizarea oii constituie semnul vizual de identificare a st\rii de estru cu ajutorul unui berbec `ncerc\tor. Recunoa[terea olfactiv\ a acestei st\ri joac\ rolul de „declan[ator“ pentru comportamentul sexual al berbecului. Un berbec tân\r este mai pu]in apt s\ identifice starea de estru a oilor. Atunci când contactul este stabilit, imobilizarea femelei constituie semnalul desf\[ur\rii urm\toarelor reflexe sexuale. Reflexul de erec]ie se realizeaz\ prin [tergerea S-ului penian. Caracteristic erec]iei este `ntinderea [i `ndep\rtarea apendicelui uretral al glandului, urmat\ de executarea unor mi[c\ri ondulatorii ale acestuia. Reflexul de `mbr\]i[are const\ `n cuprinderea oii sau a partenerului de recoltare cu membrele anterioare. Ca [i la taur [i la berbec se formeaz\ reflexul condi]ionat [i pentru oile care nu sunt `n c\lduri sau pentru masculi, recoltarea f\cându-se [i „mascul pe mascul“. Reflexul de intromisiune const\ `n introducerea penisului `n conductul vestibulo-vaginal al oii `n c\lduri, `n cazul montei, sau `n lumenul vaginului artificial, când se practic\ `ns\mân]area artificial\. ~n situa]ia `n care vaginul artificial este corect preg\tit, se produce imediat ejacularea. Reflexul de ejaculare este foarte rapid [i se eviden]iaz\ printr-o zvâcnire evident\ a `ntregului corp [i mai ales a trenului posterior. ~n cazul recolt\rii spermei, aceasta este proiectat\ `n cea mai mare cantitate, direct `n paharul colector, adaptat la vaginul artificial. Când vaginul artificial nu este preg\tit corespunz\tor, actul sexual se `ntrerupe la reflexul de intromisiune.

24

1.4.1.2.3. Reflexele sexuale la vier

Reflexul de apropiere se manifest\ prin c\utarea reciproc\ dintre vier [i scroaf\. Vierul caut\ scroafa folosind sim]ul mirosului, v\zului [i auzului. Vierul, introdus `ntr-un lot de scroafe, cu ajutorul mirosului examineaz\ pe rând aproape toate scroafele, adoptând pozi]ia „cap la cap“, prin aplicarea unor lovituri u[oare `n regiunea flancurilor [i `ncerc\ri de salt. Prin acest comportament, vierul depisteaz\ starea de estru a scroafelor, `ns\ nu se opre[te la cele `n estru. ~n apropierea celor doi parteneri, rolul principal revine scroafelor `n c\lduri. ~n prezen]a scroafei `n c\lduri, vierul se plimb\ `n jurul ei, groh\ie caracteristic, o love[te `n regiunea flancului, adulmec\ regiunea vulvar\, aceast\ agita]ie permanent\ fiind determinat\ de reflexele olfacto-sexuale. Acest „preludiu“ sexual dureaz\, `n medie, 5-10 minute [i este mai evident [i de durat\ `n timp mai mare la vierii tineri. Se mai remarc\ mi[c\ri caracteristice ale maxilarului inferior, urmate de o secre]ie abundent\ de saliv\ [i eliminarea ritmic\ a unor cantit\]i mici de urin\ (Feredean T., 1969).

Reflexul de erec]ie const\ `n exteriorizarea treptat\ a penisului prin [tergerea S-ului de la acest nivel, `n urma ini]ierii „jocurilor“ descrise. Reflexul de `mbr\]i[are const\ `n fixarea crupei scroafei sau p\r]ii posterioare a manechinului cu membrele anterioare, penisul intr\ `n erec]ie deplin\, vierul modificându-[i permanent pozi]ia, c\utând insistent fanta vulvar\. Penisul este introdus `n conductul vestibulo-vaginal, por]iunea spiralat\ ajungând la nivelul conductului cervical, unde st\ fixat pe toat\ durata ejacul\rii. Reflexul de ejaculare se caracterizeaz\ prin contrac]ii ritmice ale musculaturii din regiunea anal\, apropierea testiculelor de orificiul extern al canalului inghinal, concomitent cu retractarea burselor testiculare. Durata ejacul\rii este de 4-8 minute [i se realizeaz\ fazial: prespermatic\, spermatic\ [i postspermatic\. 1.4.1.2.4. Reflexele sexuale la arm\sar

Reflexul de apropiere este evident la arm\sar, care, `n prezen]a iepei devine nelini[tit. Reflexul de erec]ie se manifest\ treptat, `ncepând cu preerec]ia la distan]\ de iap\, penisul fiind eviden]iat circa jum\tate, `nt\rindu-se [i `ngro[ându-se progresiv. Reflexul de `mbr\]i[are se manifest\ energic. Reflexul de intromisiune, de regul\ se desf\[oar\ ajutat de o persoan\ a[ezat\ lateral. Arm\sarul execut\ 5-10 mi[c\ri de pistonare `n urma c\rora penisul ajunge la momentul maxim al erec]iei. Glandul este puternic tumefiat, cu diametrul de 10-12 cm, `n form\ de ciuperc\. Reflexul de ejaculare se desf\[oar\ la câteva secunde de la intromisiune, eliminarea spermei f\cându-se fazial.

25

1.4.2. Principii [i metode de recoltare a spermei

Recoltarea este opera]ia prin care se ob]ine sperma de la reproduc\tor cu ajutorul unei aparaturi speciale sau prin alte procedee. Fiind o opera]ie foarte important\ [i dificil\, recoltarea a constituit obiectul de studiu al multor cercet\tori care au c\utat s\ g\seasc\ noi metode de ob]inere a spermei f\r\ a prejudicia calitatea spermei [i s\n\tatea reproduc\torului mascul. Recoltarea spermei se bazeaz\ pe urm\toarele principii: - realizarea, prin mijloace artificiale, a condi]iilor existente `n sec]iunea copulatoare a femelei `n c\lduri: temperatur\, presiune, lubrifiere, respectiv recoltarea spermei cu vaginul artificial; - excitarea artificial\ a centrului ejaculator din m\duva lombar\ prin intermediul curentului electric de o anumit\ tensiune [i intensitate, respectiv recoltarea spermei prin electroejaculare; - realizarea artificial\ a unor excita]ii mecanice prin masaj local, efectuat manual la diverse niveluri [i anume: masajul penisului prin traversul tecii furoului, respectiv recoltarea spermei prin masturba]ie; - recoltarea spermei prin masajul ampulelor canalelor deferente [i ale glandelor seminale; - masajul regiunii abdominale la masculii p\s\rilor, respectiv recoltarea spermei prin masaj abdominal. ~n prezent, metoda cea mai r\spândit\ pentru recoltarea spermei este metoda cu vaginul artificial, metod\ prin care cantitatea [i calit\]ile ejaculatului nu sunt modificate. Vaginul artificial este alc\tuit dintr-un tub cilindric, rigid sau semirigid, confec]ionat din cauciuc pânzat, ebonit\ sau tabl\ (`n raport cu specia) a c\rui form\ [i dimensiuni variaz\ de asemenea cu specia; o c\ma[\ vaginal\ confec]ionat\ din cauciuc sub]ire; un pahar colector confec]ionat din sticl\ sau cauciuc, de m\rime [i form\ diferen]iate cu specia, cu pere]i simpli sau dubli dup\ cum spermatozoizii speciei sunt mai mult sau mai pu]in rezisten]i la varia]iile de temperatur\. C\ma[a vaginal\ se fixeaz\ prin intermediul unor inele de cauciuc la tubul vaginal, formânduse `n acest fel un spa]iu virtual `n care se introduce ap\ cald\ [i aer, `n raport cu specia. ~n momentul recolt\rii, temperatura interioar\ trebuie s\ fie de 40-420C. Completarea spa]iului virtual se poate face [i cu ap\ rece, `ns\ vaginul artificial astfel preg\tit trebuie s\ fie p\strat la termostat reglat la temperatura de 40-420C. ~n momentul recolt\rii se insufl\ aerul necesar realiz\rii presiunii optime. Presiunea se realizeaz\ atât prin intermediul apei cât [i a aerului introdus `n spa]iul dintre tub [i c\ma[a vaginal\. Lubrifierea se face cu vaselin\ neutr\ sterilizat\, care nu trebuie s\ fie nici `n exces nici insuficient\. Recoltarea spermei prin folosirea vaginului artificial se face fie pe femele care nu se g\sesc `n c\lduri, fie pe manechine, sau mascul pe mascul. Recoltarea spermei se efectueaz\ `n `nc\peri special amenajate. Operatorul recoltator, a[ezat pe una din laturile partenerului de recoltare,

26

]ine vaginul artificial preg\tit pentru recoltare, `nclinat la 35-450 fa]\ de crupa femelei (masculului). ~n momentul `n care masculul execut\ saltul, operatorul prinde cu o mân\ prin traversul furoului penisul acestuia [i `l dirijeaz\ c\tre lumenul vaginului artificial. Dac\ vaginul artificial este corect preg\tit [i manevrat, masculul ejaculeaz\, sperma fiind proiectat\ `n paharul colector, care se trece `n laborator, unde se face controlul spermei. Timpul scurs `ntre intromisiunea penisului `n lumenul vaginului [i ejaculare este dependent de specie, de condi]iile `n care a fost preg\tit vaginul, de tipul de sistem nervos al masculului, de existen]a sau nu a unor reflexe condi]ionate inhibitoare etc. Recoltarea spermei prin electroejaculare a fost preconizat\ de Batelli (1922) citat de I. Dumitrescu [i colab., 1978, ulterior metoda fiind `mbun\t\]it\ de cercet\tori din diverse ]\ri. Metoda se bazeaz\ pe excita]iile produse cu ajutorul curentului electric, de o anumit\ tensiune, intensitate [i durat\ asupra centrului ejaculator din m\duva lombar\. ~n urma excita]iilor se produc contrac]ii ale musculaturii netede din pere]ii c\ilor de eliminare a spermei. Aceast\ metod\ se aplic\ la berbec, taur, p\s\ri. Sperma ob]inut\ nu difer\, cantitativ [i calitativ, de cea ob]inut\ cu ajutorul vaginului artificial. Recoltarea spermei prin masajul ampulelor canalelor deferente [i a glandelor seminale a fost experimentat\ `n anul 1934 `n S.U.A., la bovine de c\tre Miller [i Evans. Metoda se bazeaz\ pe provocarea elimin\rii spermei consecutiv excita]iilor mecanice realizate prin masajul acestor forma]iuni, `n urma contrac]iilor musculaturii netede. Recoltarea spermei prin masajul abdominal a fost imaginat\ de Burrows [i Quinn `n 1937 [i d\ bune rezultate la p\s\ri. Recoltarea spermei prin masturba]ie a fost aplicat\ pentru prima dat\ de Spallazani la câine. Ejacularea are loc `n urma excita]iilor mecanice produse asupra corpusculilor senzoriali de la nivelul glandului [i prepu]ului. Prin acest procedeu se poate recolta sperma de la câine, vier, vulpoi. 1.4.2.1. Recoltarea spermei la taur

Recoltarea spermei la taur se poate face prin trei metode: - cu vaginul artificial; - prin electroejaculare; - prin masajul ampulelor canalelor deferente [i al veziculelor seminale. Recoltarea spermei cu vaginul artificial Este cea mai rapid\ [i comod\ posibilitate de recoltare a spermei a c\rei reu[it\ este condi]ionat\ de realizarea optim\ a celor trei factori de baz\: temperatur\, presiune [i lubrifiere. Vaginul artificial este alc\tuit dintr-un tub rigid sau semirigid, o c\ma[\ vaginal\ [i un pahar colector. Tubul (carcasa) este cilindric, confec]ionat din cauciuc pânzat sau material plastic, prev\zut cu un orificiu, `nchis cu un dop. Tubul are o lungime ce difer\ cu modelul [i unitatea constructoare, care variaz\ `ntre 40 [i 50 cm, cu un diametru de 5,5–6 cm.

27

C\ma[a vaginal\ este cilindric\, cu o lungime de 65–75 cm, l\]ime de 7 cm, confec]ionat\ din cauciuc sub]ire. Dimensiunile c\m\[ii vaginale se coreleaz\ cu cele ale tubului la care se adapteaz\. Paharul colector este reprezentat de un recipient din sticl\ cu pere]ii dubli (`ntre care Fig. 2 Modele de vagin artificial se g\se[te ap\) sau dintr-o eprubet\ gradat\ ce se fixeaz\ la pentru recoltarea spermei de taur vagin printr-un con prelungitor din cauciuc (fig. 2, foto 3). Lungimea vaginului artificial este condi]ionat\ de necesitatea ca materialul seminal s\ fie ob]inut direct `n paharul colector, cu o trecere scurt\ prin c\ma[a vaginal\ sau conul prelungitor din cauciuc spre a evita, pe cât posibil, pierderile de sperm\ [i eventualul efect negativ al acestor Foto 3 Aparatur\ de recoltare a spermei la materiale asupra viabilit\]ii arm\sar, taur, berbec spermatozoizilor. Preg\tirea vaginului artificial pentru recoltare const\ `n introducerea c\m\[ii vaginale `n lumenul carcasei vaginului [i r\sfrângerea capetelor care dep\[esc lungimea corpului peste acesta, astfel `ncât c\ma[a vaginal\ s\ fie moderat de `ntins\, iar faldurile care le face `n interior s\ fie dispuse longitudinal [i nu `n spiral\. Fixarea capetelor c\m\[ii vaginale la tub se face prin intermediul a dou\ inele din cauciuc. ~ntre tub [i c\ma[a vaginal\ se formeaz\ un spa]iu care va fi umplut cu ap\ cald\ [i aer pentru realizarea a dou\ din cele trei deziderate men]ionate: temperatura [i presiunea. Apa se introduce pe la nivelul orificiului existent `n corpul vaginului (150–250 ml), temperatura apei fiind de 55–60oC, astfel `ncât `n momentul recolt\rii, temperatura din interiorul vaginului artificial s\ fie de 40–43oC. Se poate introduce [i ap\ rece, cu condi]ia men]inerii vaginului artificial `n care s-a introdus apa rece, la termostat reglat la 40 – 43oC, cel pu]in 2–3 ore `nainte de recoltare. Pentru realizarea presiunii normale `n interiorul vaginului artificial cantitatea de ap\ introdus\ se completeaz\ cu aer, care se insufl\ cu o par\ din cauciuc pe la nivelul robinetului ce obtureaz\ orificiul. Se introduce aer pân\ când lumenul vaginului este obturat de faldurile c\m\[ii vaginale. Paharul colector se adapteaz\ fie direct la unul din capetele vaginului artificial [i fixat cu ajutorul unui c\p\stru, fie prin intermediul unui tub prelungitor, temperatura apei dintre cei doi pere]i trebuind s\ corespund\ temperaturii vaginului artificial.

28

~n cazul folosirii ca recipient de colectare a eprubetei gradate, aceasta se adapteaz\ la vaginul artificial prin intermediul unui con prelungitor din cauciuc, apoi se introduce `ntr-un man[on termiozolant confec]ionat din burete, temperatura acestuia fiind aceea[i cu a vaginului artificial, prin men]inerea la termostat. La cap\tul opus paharului colector, cu ajutorul unei baghete de sticl\ se lubrifiaz\ 1/3 din lungimea vaginului artificial cu vaselin\ neutr\ hidrosolubil\, cantitatea de vaselin\ folosit\ fiind suficient\ pentru asigurarea lubrifierii. Excesul de vaselin\ neutr\ determin\ scurgerea acesteia `n sperm\, cu efecte negative asupra mobilit\]ii spermatozoizilor, insuficien]a vaselinei neasigurând condi]ia de lubrifiere, de unde [i insuccesul `n recoltarea spermei prin aceast\ metod\. Crearea presiunii necesare `n interiorul vaginului artificial se poate realiza numai cu aer care se insufl\ `naintea recolt\rii propiu–zise. Tehnica recolt\rii ~n unit\]ile specializate, recoltarea spermei se face `ntr-o sal\ special amenajat\ `n acest scop, spa]ioas\ (80–100 m2), luminoas\, aerisit\, prev\zut\ cu un stand de conten]ie [i cu o anex\ `n care se face sp\larea [i dezinfec]ia componentelor vaginului artificial [i `n care se g\se[te [i termostatul electric la temperatura de 41–43oC. Pardoseala s\lii de recoltare este din asfalt, care favorizeaz\ men]inerea cur\]eniei [i menajeaz\ ongloa-nele membrelor posterioare foarte solicitate `n timpul saltului. ~napoia standului de recoltare, pardoseala se acoper\ cu un covor din cauciuc, rumegu[ sau nisip pentru a menaja [i mai bine membrele posterioare. ~nainte de introducerea taurului `n sala de recoltare `ntr-un stand ce se g\se[te `ntr-o antecamer\ se efectueaz\ toaleta orificiului [i a regiunii periprepu]iale care se spal\ cu ap\ cald\ [i s\pun, se [terge cu un prosop curat, individual, propriu fiec\rui taur [i se dezinfecteaz\ orificiul prepu]ial cu o solu]ie de permanganat de potasiu 1o/oo sau alt antiseptic uzual (foto 5). Planificarea taurilor la recoltare, `n unit\]ile specializate se face dup\ un grafic lunar. Pentru aceasta, taurii sunt lotiza]i pe grupe de recoltare constituite din 20–30 de tauri (func]ie de efectivul `n exploatare din fiecare unitate) iar `n cadrul grupelor de recoltare, pe loturi formate din 4–6 tauri. Planificarea la recoltare se face pe grupe `ntr-o anumit\ succesiune (A, B, C, D), `ntr-o zi urmând a se recolta de la to]i taurii din grupa planificat\. Taurii sunt sco[i din grajd pe loturi [i introdu[i pe rând `n sala de recoltare, timp `n care ceilal]i tauri din lot sunt plimba]i. Frecven]a recolt\rilor depinde de vârsta taurilor, de condi]iile de alimenta]ie [i `ntre]inere, de experien]a practic\ a unit\]ilor produc\toare de material seminal, func]ie de autori aceast\ frecven]\ oscilând de la 1 la 6 ejaculate pe s\pt\mân\. Experien]a practic\ a ar\tat c\ cea mai bun\ eficien]\ `n ob]inerea unui num\r optim de spermatozoizi/s\pt\mân\ este atunci când se recolteaz\ 4 ejaculate pe s\pt\mân\, câte dou\ consecutiv pe ziua de recoltare, cu o pauz\ de 3–4 zile, sau dou\ ejaculate pe s\pt\mân\ la interval de 3–4 zile dar cu o atent\

29

preg\tire a taurului `nainte de recoltare. Preg\tirea taurului const\ `n gimnastica func]ional\ a acestuia `naintea introducerii `n sala de recoltare (foto 4), apoi re]inerea acestuia timp de 2–3 minute `nainte de ejaculare, efectuarea a 2–3 salturi `n gol, `n raport [i cu vârsta taurului [i tipul de sistem nervos al acestuia. Pentru obi[nuirea taurilor la recoltare se folose[te ca manechin o vac\ `n c\lduri sau `n oricare stadiu al ciclului sexual, un mascul care este, de regul\, unul din taurii `n exploatare, folosi]i prin rota]ie sau un manechin confec]ionat din lemn sau metal, `mbr\cat cu o piele de taurine, prev\zut `n partea posterioar\ cu un dispozitiv `n care se fixeaz\ vaginul artificial preg\tit corespunz\tor. ~n unit\]ile specializate recoltarea se face „taur pe taur“, taurul manechin f\când parte din lotul de recoltare [i se stabile[te prin rota]ie, la sfâr[itul recolt\rii spermei de la lotul `n cauz\, urmând a se recolta sperma [i de la taurul folosit ca manechin. Partea posterioar\ a corpului taururlui manechin se [terge cu un burete `mbibat `n ap\ cald\, se conten]ioneaz\ `ntr-un stand, iar operatorul recoltator se plaseaz\ pe una din laturile manechinului, ]inând `ntr-o mân\ la o `nclina]ie de 35–45o fa]\ de orizontal\, vaginul artificial preg\tit pentru recoltare (temperatura, presiunea, lubrifierea fiind asigurate la nivel optim) (foto 6).

Foto 4 Gimnastica func]ional\ a taurilor `naintea recolt\rii spermei

Foto 5 Toaleta regiunii prepu]iale la taur

Foto 6 P\strarea la termostat a vaginelor artificiale preg\tite pentru recoltare

30

Taurul este l\sat s\ efectueze dou\ trei salturi `n gol cu pauze de dou\ trei minute `ntre salturi, apoi `n momentul efectu\rii urm\torului salt, operatorul cu una din mâini, prin traversul furoului orienteaz\ penisul spre lumenul vaginului artificial. ~n cazul `n care vaginul artificial a fost preg\tit corespunz\tor, ejacularea se produce la un interval de timp foarte scurt [i se eviden]iaz\ printr-o mi[care brusc\ de pistonare spre `nainte a trenului posterior (zvâcnire). Sperma este proiectat\ direct `n paharul colector (foto 7). Se desprinde cu aten]ie vaginul artificial [i se orienteaz\ cu Foto 7 Recoltarea spermei la taur cu paharul colector `n jos `n vederea vaginul artificial colect\rii `ntregii cantit\]i de sperm\ ejaculat\. Oricare ar fi tipul de vagin artificial (lung sau scurt), pierderile de material seminal se situeaz\ `ntre 10–20%, sperm\ care ader\ de pere]ii vaginului artificial. Indiferent de durata perioadei de re]inere de la s\ritur\ sau de num\rul s\riturilor `n gol, preg\tirea sexual\ trebuie s\ precead\ fiecare ejaculare chiar dac\ se recolteaz\ dou\ ejaculate consecutiv. Aceast\ preg\tire men]ine capacitatea sexual\ a taurului pe toat\ perioada de timp cât se afl\ `n exploatare. Dup\ recoltare, paharul colector cu sperm\ se transmite la laborator pentru examinare, prelucrare [i conservare. Recoltarea spermei prin electroejaculare Se bazeaz\ pe excita]iile produse de curentul electric asupra centrului ejaculator din m\duva lombar\. Musculatura neted\ de la nivelul c\ilor de eliminare a spermei se contract\, sperma fiind eliminat\ la exterior. Se folose[te foarte rar, `n condi]ii de laborator, atunci când e[ueaz\ `ncerc\rile de recoltare cu vaginul artificial. Se aplic\ taurilor cu inhibi]ii ale reflexului de `mbr\]i[are [i ejaculare, celor f\r\ apetit sexual [i celor care au divesre defecte la nivelul membrelor posterioare, tauri care au mare valoare de ameliorare. Electroejaculatorul este constituit dintr-un electrod bipolar conectat la o surs\ de curent, portabil\, circuitele fiind tranzistorizate [i miniaturizate. Conten]ia taurului se face `ntr-un stand sau travaliu. Preg\tirea taurului pentru recoltare const\ `n `nl\turarea materiilor fecale din rect, prin sp\larea acestuia cu câ]iva litri de solu]ie NaCl 5%, care va u[ura conductibilitatea electric\ [i din sp\larea regiunii furoului [i tunderea p\rului de la nivelul orificiului prepu]ial.

31

Se introduce electrodul `n rect, cu precau]ie, se a[teapt\ 3–5 minute dup\ care se `ncepe declan[area impulsurilor electrice. La `nceput se folosesc 15–20 de excita]ii electrice, fiecare cu o durat\ de 2–3 secunde [i desp\r]ite de pauze de 50–60 secunde. Intensitatea curentului cre[te treptat cu fiecare excita]ie, pornindu-se de la 100 miliamperi, la 800–1500 miliamperi [i cu tensiunea de 25–30 V, durata excita]iilor m\rindu-se pân\ la 5–6 secunde. La fiecare excitare se ob]ine ejaculat, format la `nceput de secre]iile glandelor anexe [i apoi frac]iuni cu un con]inut crescut de spermatozoizi. Durata total\ a recolt\rii este de 5–10 minute, cantitatea de sperm\ ob]inut\ fiind egal\ sau u[or mai mare decât volumul spermei recoltat\ cu ajutorul vaginului artificial. Eliminarea spermei se produce f\r\ ca penisul s\ intre `n erec]ie. Recoltarea spermei prin masajul ampulelor canalelor deferente [i al glandelor seminale Metoda prezint\ interes numai `n cazul taurilor care din diverse motive nu pot efectua saltul [i la care recoltarea cu vaginul artificial nu se poate aplica. Taurul se conten]ioneaz\ `ntr-un stand sau travaliu, se execut\ toaleta furoului [i sp\larea bursei prepu]iale cu o solu]ie izotonic\ de NaCl, apoi se videaz\ vezica urinar\ prin masaj transrectal pentru a se evita amestecul urinei cu sperma. Când peretele rectal este destins se palpeaz\ cu precau]ie plan[eul cavit\]ii pelvine unde, sub forma unui cordon dur–cartilaginos, cu un diametru de circa 2–3 cm, se identific\ uretra intrapelvin\. Se palpeaz\ gâtul vezicii urinare apoi, de o parte [i de alta a acesteia, dispuse `n unghi ascu]it, form\ alungit\, aspect boselat, se palpeaz\ glandele seminale. Deasupra vezicii urinare se g\sesc [i dilata]iile canalelor deferente sub forma a dou\ cordoane elastice, ce converg spre gâtul vezicii urinare `n unghi ascu]it, diametrul fiind de 0,8–1,2 cm. Tot la acest nivel se g\se[te prostata. Masajul se face `n sens cranio caudal, pe o distan]\ de 20–30 cm, cu aten]ie, timp de 3–5 minute, dup\ care `ncepe s\ se elimine sperma, pic\tur\ cu pic\tur\. Pe timpul masajului taurul este lini[tit, testiculele sunt retrase spre inelul inghinal, glandul este par]ial exteriorizat din teaca furoului, f\r\ ca penisul s\ intre `n erec]ie. La `nceput se colecteaz\ un lichid alb–apos care reprezint\ secre]ia veziculelor seminale, s\rac `n spermatozoizi, care se `ndep\rteaz\. Urmeaz\ eliminarea unei frac]iuni bogat\ `n spermatozoizi, culoare alb g\lbui, consisten]\ cremoas\. Unii tauri nu r\spund favorabil la colectarea spermei prin acest procedeu. ~n cazul `n care sperma nu se elimin\ `n decurs de 7–10 minute, se renun]\ la masaj, opera]iunea fiind reluat\ `n ziua urm\toare. Metoda prezint\ avantajul c\ nu necesit\ condi]ii speciale de conten]ie [i recoltare [i dezavantajul ob]inerii unei sperme inferioare calitativ, `n urma amestecului cu urin\ [i a venirii `n contact cu aerul un timp mai `ndelungat.

32

1.4.2.2. Recoltarea spermei la berbec [i ]ap

Dou\ tehnici pot fi utilizate pentru colectarea spermei la masculii rumeg\toarelor mici: cu ajutorul vaginului artificial [i prin electroejaculare. Recoltarea spermei cu vaginul artificial este cea mai r\spândit\, u[or accesibil\ centrelor de reproduc]ie, rezultatele ob]inute fiind bune sub aspectul volumului ejaculatului [i calit\]ii spermei. Obi[nuirea masculilor la recoltare necesit\ un anumit interval de timp [i mult\ r\bdare. Se `ncepe totdeauna `n sezonul sexual (sfâr[itul verii [i toamna) folosindu-se pentru obi[nuire o oaie `n oricare stadiu a ciclului sexual. Vaginul artificial este dimensionat pentru aceast\ specie: 20–21 cm lungime, 4–5 cm diametru, prev\zut cu un orificiu astupat cu un dop, pe unde se introduce apa cald\ sau apa cald\ [i aer pentru a asigura condi]iile de temperatur\ [i presiune. Paharul colector este confec]ionat din sticl\ cu pere]i simpli, termoizolat cu un man[on din burete, sau din sticl\ cu pere]i dubli, pentru a evita efectul negativ al [ocului termic (a frigore) asupra viabilit\]ii spermatozoizilor. Temperatura din interiorul lumenului `n momentul recolt\rii trebuie s\ fie de 40–43oC. Adaptarea paharului colector se face la unul din capetele deschise ale vaginului artificial, cu ajutorul acestuia reglându-se presiunea din interiorul vaginului `n func]ie de distan]a pe care se introduce paharul colector. La cap\tul opus paharului colector se lubrifiaz\ cu vaselin\ neutr\ lumenul pe circa 1/3 din lungime, evitându-se folosirea `n exces a vaselinei sau insuficien]a lubrifierii. Se consider\ bine preg\tit vaginul artificial atunci când faldurile formate de c\ma[a vaginal\ au o dispozi]ie longitudinal\ [i optureaz\ complet lumenul. Recoltarea se face `ntr-o sal\ special amenajat\ `n care se g\se[te un stand de conten]ie a oii partener. Sala de recoltare trebuie s\ fie curat\, luminoas\, iar preg\tirea berbecului pentru recoltare se face ca [i la taur. Lâna din jurul orificiului prepu]ial se tunde, se spal\ cu ap\ [i s\pun [i se cl\te[te cu solu]ie izotonic\ de NaCl 0,9% pentru `ndep\rtarea impurit\]ilor. Oaia manechin se conten]ioneaz\ `ntr-un stand metalic fixat pe un podium din lemn. Operatorul, cu vaginul artificial preg\tit, se a[az\ `n genunchi pe una din laturile oii, `n dreptul crupei, ]inând vaginul artificial `nclinat la circa 45o fa]\ de orizontal\, cu paharul colector `n sus. Dup\ efectuarea saltului, operatorul dirijeaz\ cu o mân\, prin traversul furoului, penisul spre lumenul vaginului artificial. ~n cazul `n care vaginul artificial a fost preg\tit corespunz\tor (temperatur\, presiune, lubrifiere) ejacularea coincide cu intromisiunea [i se eviden]iaz\ printr-o mi[care de propulsie a trenului posterior. Dup\ ejaculare, berbecul coboar\ de pe femel\, iar vaginul artificial se desprinde cu aten]ie [i se orienteaz\ cu paharul colectoer `n jos, apoi paharul se scoate [i sperma se transmite la laborator pentru examinare [i prelucrare. Pentru masculii obi[nui]i cu recoltarea, `n sezonul sexual, se prelev\ dou\ ejaculate succesiv la 2–5 minute.

33

Recoltarea spermei prin electroejaculare Se bazeaz\ pe provocarea ejacul\rii prin excitarea electric\ a ganglionilor simpatici lombari care determin\ contrac]ia musculaturii netede de la nivelul ampulelor canalelor deferente [i eliminarea spermei, f\r\ ca penisul s\ intre `n erec]ie. Aceast\ tehnic\ necesit\ un volum mare de munc\ prin conten]ia animalului, o sal\ cu dotare special\, un electroejaculator identic cu cel utilizat la taur, este dureroas\ pentru mascul, iar caracteristicile spermei difer\ de a celei ob]inute prin folosirea vaginului artificial, motive pentru care aceast\ metod\ nu este r\spândit\. Se poate folosi `n condi]ii de laborator, `n cazul unor reproduc\tori de `nalt\ valoare zootehnic\ [i care din diverse motive nu pot efectua saltul. ~n prezent se folosesc electroejaculatoare tranzistorizate, portabile care asigur\ un curent de 2–5–8 V [i 150 mA prev\zut cu un electrod bipolar. Pentru recoltare, berbecul se fixeaz\ `n decubit lateral [i se conten]ioneaz\ pe o mas\ de lucru (sau pe o scar\ `ntins\). Se face o clism\ cu o solu]ie de NaCl 10% [i toaleta furoului [i apoi se fixeaz\ cu o me[\ de tifon steril\ trecut\ pe la baza por]iunii terminale a glandului. Electrodul bipolar se introduce `n rect pân\ ce acesta ajunge `n dreptul regiunii lombare. Paharul colector, termoizolat [i sterilizat, se men]ine `n dreptul deschiderii uretrei. Se stabile[te contactul electric [i se provoac\ câteva impulsuri cu o durat\ de 2–5 secunde, cu pauze de 5–10 secunde. Dup\ 5–7 impulsuri se provoac\ eliminarea spermei care se colecteaz\ `n pahar. Impulsurile continu\ pân\ se ob]ine cantitatea normal\ de sperm\. 1.4.2.3. Recoltarea spermei la vier

Se poate realiza prin trei metode: - cu vaginul artificial; - prin masturbare (metoda manual\); - prin electroejaculare. Recoltarea spermei cu vaginul artificial Recoltarea spermei presupune urm\toarele m\suri preg\titoare: - obi[nuirea vierului cu partenerul de recoltare; - obi[nuirea vierului cu sala de recoltare; - obi[nuirea vierului cu operatorul recoltator. Pentru recoltarea spermei se folose[te un partener natural sau artificial. Partenerul natural poate fi o scroaf\ `n c\lduri sau alte categorii de porci: scroafe care nu sunt `n c\lduri, vieri, masculi castra]i. Scroafa `n c\lduri se folose[te pentru obi[nuirea vierilor. Scroafele care nu sunt `n c\lduri se conten]ioneaz\ sub un manechin special construit din bare metalice, iar vierul partener se conten]ioneaz\ prin fixarea unei frânghii de maxilarul superior, ob]inându-se astfel starea de imobilitate. ~ntrucât partenerul natural obose[te, de regul\ dup\ o recoltare, cel mai folosit este partenerul artificial.

34

Partenerul artificial, manechinul trebuie s\ imite conforma]ia scroafei, motiv pentru care se `nvele[te cu pile de porc. Manechinul trebuie s\ fie simplu, stabil, rezistent [i ieftin. Pentru aceasta exist\ o mare varietate de manechine: din lemn (trunchi de copac, capr\ de lemn etc.), metalice, ultimele fiind cele mai r\spândite. Unele tipuri sunt prev\zute `n interior cu suport pentru fixarea vaginului artificial. De regul\, manechinul, `n partea posterioar\ este prev\zut cu un dispozitiv telescopic pentru a regla `n\l]imea, adaptându-se astfel taliei oric\rui vier de la care urmeaz\ s\ se recolteze sperm\ Foto 8 Manechin pentru recoltarea spermei la vier

(foto 8).

Vaginul artificial se compune dintr-un tub (carcas\) vaginal cu o lungime de circa 20 cm, c\ma[a vaginal\, confec]ionat\ din cauciuc sub]ire, prelungitorul vaginal confec]ionat din material plastic [i paharul colector. Paharul colector este reprezentat dintr-un borcan de sticl\ cu capacitatea de 300–500 ml termoizolat (cu pere]ii dubli sau acoperit de un man[on din burete fixat `ntr-un recipient metalic adecvat) (fig. 3). Pentru re]inerea [i `ndep\rtarea frac]iunii gelatinoase a spermei, la gura paharului se fixeaz\ un filtru confec]ionat din tifon steril. Paharul colector se men]ine la termostat reglat la 41–43oC pân\ `n momentul recolt\rii, astfel `ncât pe toat\ durata recolt\rii, temperatura din interiorul paharului colector s\ nu scad\ sub 35–36oC. Aparatura, sticl\ria [i celelalte ustensile folosite la recoltarea spermei, `nainte de folosire, se spal\ [i sterilizeaz\ dup\ Fig. 3 Schema vaginului artificial pentru recoltarea spermei la vier procedee care difer\ cu materialul din care sunt confec]ionate. Aparatura, sticl\ria [i ustensilele igienizate [i sterilizate se men]in la termostat, reglat la 40–42oC, pân\ la `ntrebuin]are. Vierii de la care urmeaz\ s\ se recolteze se preg\tesc, `ntr-o box\ special amenajat\ `n incinta s\lii de recoltare, prin sp\larea cu ap\ cald\ [i s\pun a zonei prepu]iale [i dezinfectarea cu o solu]ie de permanganat de potasiu 1o/oo [i [tergerea cu un prosop curat. Tehnica recolt\rii Preg\tirea vaginului pentru recoltare se face ca la rumeg\toare, presiunea [i temperatura necesare realizându-se cu ajutorul apei calde [i a

35

aerului. ~n spa]iul dintre tubul [i c\ma[a vaginal\ se introduc 200–300 ml ap\ cald\ la temperatura de 50oC astfel ca `n momentul recolt\rii, temperatura din interiorul vaginului s\ fie de 41–43oC sau se introduce ap\ rece, iar vaginul artificial se men]ine la termostat reglat la temperatura de 41–43oC `mpreun\ cu paharul colector. Pentru realizarea presiunii necesare, pe la nivelul robinetului care astup\ orificiul practicat `n tubul vaginului, se introduce aer pân\ când faldurile c\m\[ii vaginale obtureaz\ lumenul vaginului. Se lubrifiaz\ lumenul vaginului cu vaselin\ neutr\ pe o lungime de circa 10 cm. Se fixeaz\ apoi conul prelungitor, prin intermediul c\ruia se adapteaz\ [i paharul colector. Vaginul artificial preg\tit astfel se fixeaz\ `ntr-un suport ce culiseaz\ `n interiorul manechinului. Dup\ ce vierul a efectuat saltul pe manechin, penisul va fi dirijat spre lumenul vaginului. Ejacularea la vier dureaz\ 5–10 minute, timp `n care presiunea din interiorul vaginului se ridic\ prin insuflarea aerului sau prin presarea manual\ la nivelul conului prelungitor, `n func]ie de tipul de vagin artificial folosit. Dup\ recoltare, paharul colector se deta[eaz\ de vagin [i se trece la laborator pentru examinare [i prelucrare. Materialul seminal ob]inut prin acest procedeu de recoltare este de bun\ calitate `ns\ se impune o bun\ cunoa[tere a exigen]elor fiec\rui vier, func]ie de care se preg\te[te corect vaginul artificial. Recoltarea spermei prin metoda manual\ (masturbare) ~n prezent este cea mai r\spândit\, fiind un procedeu de recoltare simplu [i care nu necesit\ aparatur\ complicat\, calitatea materialului seminal ob]inut fiind foarte bun\. Vierul este condus `n boxa de recoltare, este l\sat s\ efectueze saltul pe manechinul artificial, apoi operatorul plasat de regul\ pe partea dreapt\ a manechinului, prinde cu mâna stâng\ penisul exteriorizat din teaca furoului [i-l trage lateral [i `n jos. Aceast\ extensie a penisului [i presiunea exercitat\ cu mâna la nivelul por]iunii spiralate declan[eaz\ reflexul de ejaculare. Frac]iunea presper-matic\ lipsit\ de spermatozoizi [i cu un con]inut ridicat `n microorganisme se `nl\tur\. Cu cealalt\ mân\ se men]ine paharul colector termoizolat [i prev\zut cu un filtru de tifon, la nivelul orificiului extremit\]ii libere a penisului, pentru recoltarea spermei (foto 9, 10, 11). Primele jeturi de sperm\ care au un aspect l\ptos se colecteaz\ `n pahar, recoltarea Foto 9 Toaleta orificiului [i regiunii prepu]iale continuând pân\ la terminarea la vier elimin\rii spermei. Frac]iunea gelatinoas\ a spermei re]inut\

36

pe filtru se `nl\tur\, iar paharul colector se trimite la laborator pentru evaluare [i prelucrare. Pentru evitarea apari]iei unor reflexe negative se recomand\ ca vierul s\ fie scos din box\ de acela[i operator – recoltator, s\ urmeze acela[i traseu pân\ `n boxa de recoltare iar boxa s\ fie `ntotdeauna aceea[i, f\r\ schimb\ri `n interior. Recoltarea spermei prin electroejaculare Ofer\ posibilitatea examin\rii spermei unui vier de la care nu se ob]ine ejacularea pe Foto 10 Recoltarea spermei la vier prin manechin sau `n caz de metoda manual\ (masturbare) impoten]\. Se poate folosi `n lucr\rile de cercetare pentru examinarea secre]iilor glandelor anexe la vierii nematuri sexual. Se folose[te un electroejaculator prev\zut cu un electrod bipolar [i cu o surs\ de curent alternativ care s\ asigure o tensiune de 10–30 V [i o intensitate de 100–1000 mA. Se conten]ioneaz\ vierul, se igienizeaz\ prepu]ul cu o solu]ie izotonic\ de NaCl 0,9%, se face Foto 11 Recoltarea spermei la vier prin o clism\ rectal\ cu o solu]ie de masturbare NaCl 10% pentru eliminarea con]inutului. Electrodul bipolar se introduce `n rect astfel `ncât electrozii s\ ajung\ pân\ `n dreptul regiunii lombare, vertebrele L2 – L4. La `nceput se produc [ocuri electrice cu o tensiune de 5 V [i o intensitate de 50–100 mA, apoi tensiunea [i intensitatea cresc progresiv cu fiecare impuls. Dup\ fiecare impuls electric se face pauz\ de 5–10 secunde. Eliminarea spermei se produce când tensiunea curentului este de 15–20 V [i intensitatea de 500–1000 mA. 1.4.2.4 Recoltarea spermei la arm\sar

~ns\mân]area artificial\ la cabaline nu constituie o practic\ curent\ de reproduc]ie, atât la noi `n ]ar\ cât [i pe plan mondial. Recoltarea spermei se face numai cu ajutorul vaginului artificial. Tubul vaginului este confec]ionat din tabl\ zincat\, material plastic sau aluminiu, având o lungime de 55 cm, diametrul interior la un cap\t de 12 cm, iar la

37

cel\lalt de 8,5 cm, prev\zut cu un orificiu astupat cu un robinet pe unde se introduce apa cald\ [i aerul pentru a se asigura temperatura [i presiunea necesare `n timpul folosirii la recoltare. C\ma[a vaginal\ este confec]ionat\ din cauciuc, cu lungimea de circa 70 cm [i un diametru de 15–17 cm. Recipientul pentru sperm\ este confec]ionat din material plastic, este cilindric [i se fixeaz\ la tubul vaginal la extremitatea cu diametrul mai mic, prin intermediul unui con prelungitor. Paharul colector este termoizolat. Preg\tirea vaginului se face `n mod asem\n\tor ca pentru taur. Pentru recoltare, iapa se conten]ioneaz\ cu platlonje, se `nf\[oar\ coada iepei cu tifon pentru a se evita lezionarea penisului. Arm\sarul se conten]ioneaz\ cu dou\ pene de c\p\stru, ]inut lateral de `ngrijitori. ~n momentul efectu\rii saltului, operatorul recoltator orienteaz\ penisul arm\sarului spre lumenul vaginului artificial, vagin ]inut oblic, la 45o fa]\ de orizontal\ [i al\turat de crupa iepei. Dup\ executarea unor mi[c\ri de pistonare, ejacularea se produce dup\ 15–17 secunde [i se eviden]iaz\ prin mi[c\ri ritmice la baza cozii. La `ncheierea ejacul\rii, arm\sarul coboar\ de pe iap\, iar operatorul desprinde cu aten]ie vaginul artificial de pe organul copulator. Dup\ recoltare se spal\ penisul arm\sarului cu ap\ cald\ [i se dezinfecteaz\ cu o solu]ie de permanganat de potasiu 1o/oo. 1.4.2.5. Recoltarea spermei la p\s\ri

~n perioada anilor 1902–1937 s-au `ncercat diverse metode de recoltare a spermei la p\s\ri: interpunerea unei canule din sticl\ `ntre cloaca coco[ului [i a g\inii `n timpul c\lcatului, folosirea unui spermocaptator fixat prin intermediul unor curelu[e la cloaca g\inii, folosirea ca spermocaptator a unui prezervativ fixat la cloaca coco[ului, recoltarea prin electroejaculare, recoltarea prin masaj abdominal. Dintre toate aceste variante, cea mai avantajoas\ sub aspect practic este recoltarea spermei prin masaj abdominal [i se poate aplica la toate speciile de p\s\ri de ferm\ fiind ast\zi cea mai utilizat\ metod\ de recoltare pe plan mondial. Recoltarea spermei la coco[ Operatorul se a[az\ pe un taburet [i men]ine coco[ul `n decubit sterno - abdominal pe coapsa stâng\, iar cu mâna dreapt\ prinde ambele picioare ale coco[ului. Imobilizarea membrelor coco[ului se face prin trecerea piciorului drept al operatorului peste cel stâng, prinzând `ntre ele picioarele coco[ului. Cu mâna stâng\ se maseaz\ u[or regiunea sacral\ `n direc]ie cranio–caudal\ iar cu mâna dreapt\ regiunea abdominal\ dinspre apendicele xifoid spre apofizele pubiene. Masajul se face cu blânde]e [i dup\ câteva mi[c\ri coco[ul prolabeaz\ cloaca `n care se observ\ cele dou\ papile mai congestionate (culoare roz-ro[ietic\). Operatorul, cu mâna stâng\ preseaz\ zona pericloacal\, `n timp ce opre[te [i masajul abdominal, iar cu mâna dreapt\ colecteaz\ sperma `n paharul colector. Colectarea spermei se realizeaz\ `ntr-un recipient de sticl\, cu partea superioar\ mai larg\ [i partea inferioar\ tubular\, `nchis\ ca `n deget de m\nu[\ (asem\n\tor paharului colector de la berbec). Recipientele de colectare pot fi [i mici eprubete, pâlnii mici `nchise, etc. Colectarea spermei se mai poate face [i prin

38

aspira]ie `ntr-o fiol\ cu capacitatea de 2 ml astupat\ cu un dop de plut\ sau cauciuc. Prin dop este trecut un tub din sticl\ `ndoit, pu]in mai larg la un cap\t cu care se va colecta sperma [i un al doilea tub tot din sticl\, la care se adapteaz\ un prelungitor din cauciuc sau material plastic pe unde se creaz\ depresiunea prin aspirare. Sperma aspirat\ va c\dea `n fiola respectiv\. Opera]iunea de recoltare se repet\ de trei patru ori. Conten]ia coco[ului se poate face [i sub bra]ul drept al unui ajutor, cu coada `nainte [i cu mâna se imobilizeaz\ ambele picioare. Operatorul maseaz\ cu degetul mare [i ar\t\tor simfiza ischiopubian\ [i protuberan]ele ischiatice. Când coco[ul se excit\, se execut\ compresiuni la nivelul cloacei cu ajutorul degetului mare [i ar\t\tor, sperma exteriorizându-se sub forma unor pic\turi albicioase [i se va colecta `ntr-un pahar. ~n unit\]ile mari `n care coco[ii sunt `ntre]inu]i `n cu[ti, conten]ia coco[ului se face direct la u[a cu[tii de un ajutor, operatorul efectuând masajul abdonimal [i apoi colecteaz\ sperma. ~n acest fel, productivitatea muncii cre[te foarte mult. Recoltarea spermei la curcan Se face cu bune rezultate de o echip\ constituit\ din dou\ persoane. Pentru aceasta se folose[te un scaun dublu cu sp\tar, `n care este practicat un orificiu. Curcanul se conten]ioneaz\ `n decubit sterno-abdominal, cu capul introdus `n orificiul practicat `n sp\tar. Ajutorul se a[az\ `n partea stâng\ a curcanului [i cu spatele imobilizeaz\ aripa stâng\ a acestuia, iar cu piciorul stâng, prin intermediul unei fe[e de tifon imobilizeaz\ piciorul stâng al curcanului. Imobilizeaz\ aripa dreapt\ a curcanului cu mâna stâng\ `ntre cotul [i sp\tarul scaunului imobilizând totodat\ [i piciorul drept al curcanului. Cu mâna dreapt\ ridic\ coada [i eviden]iaz\ orificiul cloacal. Operatorul execut\ masajul abdominal cu ambele mâini [i când curcanul este excitat execut\ pericloacal compresiuni cu degetele mari de la ambele mâini. Sperma se eviden]iaz\ la nivelul cloacei de unde se recolteaz\ `ntr-un pahar sterilizat. 1.5. Examenul însu[irilor spermei Examenul `nsu[irilor spermei are ca necesitate legat\ at`t de cunoa[terea fertilit\]ii reproduc\torului c`t [i de tehnica dilu\rii [i aprecierii spermei 1n diferite faze de prelucrare [I conservare. Examenul spermei este esen]ial pentru aprecierea unui reproduc\tor. Compozi]ia spermei, inclusiv propriet\]ile sale biochimice [i biofizice, variaz\ `n func]ie de specie [i chiar reproduc\tor, calitatea spermei difer\ `n decursul aceleia[i zile, func]ia spermatogenetic\ fiind dependent\ de numero[i factori exogeni [i endogeni. Metodele care se folosesc pentru aprecierea calit\]ii spermei se pot `mp\r]i `n urm\toarele categorii: examenul `nsu[irilor fizice; examenul `nsu[irilor biologice; examenul citologic; examenul biochimic; examenul bacteriologic [i micotic. Tehnicile de lucru, valorile medii ale principalilor indici seminologici, pe specii sunt detaliate `n `ndrumarul practic de la disciplina de Biologia [i patologia reproduc]iei. Rezultatele ob]inute se consemneaz\ `ntr-un formular oficial denumit spermogram\ (tab. 1), hot\r`toare pentru aprecierea unui reproduc\tor.

39

Tabelul 1 Valorile spermogramei fizice [i citologice la reproduc\torii animalelor domestice Specia Taur Berbec }ap Vier Arm\sar Câine

Volum (ml) 4 (5-8) 1,12 (0,4-2) 1,00 (0,5-2,6) 250 (100-500) 50-90 (30-300) 7

6,9

Densitate 1,034

Desime D

6,9

1,035

D

6,4

1,035

D

7,5

1,011

R

7,4

1,011

R

6,4

1,011

M

pH

Mobili- Concentra]ie tate (mlx106) 0,75 1000 (300-2000) 0,80 3000 (2000-5000) 0,80 2600 (650-7500) 0,70 100 (25-300) 0,70 120 (30-800) 0,70

(1-25)

3000

Spermatozoizi anormali Ap% As% n% 3 15 2

80

Redox min/400C 3

Ap\ (%) 90

%vii

2

15

2

85

3

85,2

3

15

2

85

3

-

5

15

2

75

-

95,4

5

15

2

75

-

98

5

15

2

75

-

(1000-9000)

Iepure

1,0

6,66,8

Coco[

(0,4-6) 0,6 (0,5-0,7)

7,5

9698 -

1,012

M

0,70

700

5

15

2

75

-

-

1,038

D

0,80

(100-2000) 2000 (1500-3000)

5

10

2

85

-

-

Ap=anomalii primare As=anomalii secundare n=spermatozoizi nematuri

40

1.6. Diluarea spermei 1.6.1. Considera]ii generale

R\spândirea `ns\mân]\rilor artificiale s-a datorat posibilit\]ilor de diluare [i conservare a spermei. Diluarea spermei reprezint\ o etap\ premerg\toare [i obligatorie pentru conservarea spermei; `n rare situa]ii sperma se `ns\mân]eaz\ sub form\ brut\ sau imediat dup\ diluare, f\r\ a fi conservat\. P\strarea spermei presupune diluarea [i conservarea ei, dou\ etape interdependente ce se aplic\ succesiv [i corelat. Diluarea permite: - cre[terea volumului total al masei spermatice; - posibilitatea frac]ion\rii ejaculatului `n mai multe doze [i, deci, `ns\mân]area unui num\r mult mai mare de femele; - asigurarea unui mediu favorabil prelungirii viabilit\]ii [i capacit\]ii fecundante a spermatozoizilor, etc. ~n cazul `n care nu exist\ dotarea tehnic\ necesar\ conserv\rii, se poate folosi sperma diluat\, dar numai dup\ scurgerea intervalelor de timp necesare echilibr\rii (3-4 ore). Sperma diluat\ trebuie s\ fie inoculat\ femelelor `n c\lduri, `ntr-un interval de timp cât mai scurt, imediat dup\ echilibrare. Indiferent de metoda de conservare a spermei, pentru prelungirea viabilit\]ii [i a capacit\]ii fecundante a spermatozoizilor „in vivo“, sunt necesare: - reducerea form\rii [i acumul\rii produ[ilor rezulta]i din metabolismul celulelor seminale; - neutralizarea substan]elor toxice rezultate din metabolism; - trecerea par]ial\ sau definitiv\ a spermatozoizilor `n anabioz\. Aceste deziderate se realizeaz\ prin diluarea spermei, realizarea unui mediu cu un pH u[or acid (6,2 - 6,4) sau sc\derea temperaturii `n timpul dilu\rii, cu men]inerea temperaturii sc\zute pe toat\ durata conserv\rii. 1.6.2. Principiile dilu\rii spermei, `nsu[irile generale ale diluan]ilor [i clasificarea acestora

Dilu]ia spermei se bazeaz\ pe faptul c\ din num\rul total de spermatozoizi depu[i prin mont\, numai o frac]iune redus\ (circa 5%) ajung pân\ la nivelul treimii anterioare a oviductului, locul unde urmeaz\ s\ se desf\[oare fecunda]ia. ~n acest fel, marea majoritate a spermatozoizilor devin disponibili pentru a fi inocula]i altor femele. Experien]ele `ntreprinse au demonstrat faptul c\ num\rul de spermatozoizi necesari pentru `ns\mân]area unei vaci este de 10-12 miliioane, num\r care poate fi redus pân\ la 5 milioane, f\r\ a fi diminuat nivelul ratei fecunda]iei. La ovine, num\rul de spermatozoizi mobili pe doz\ poate fi redus pân\ la 150- 200 de milioane, la suine, la 2-5 miliarde, iar la cabaline, pân\ la o,5-1,0 miliarde. Principiile care stau la baza dilu\rii spermei sunt: - se dilueaz\ numai sperma corespunz\toare calitativ;

41

-

diluantul trebuie s\ con]in\ substan]e care s\ protejeze [i s\ ajute la activarea [i men]inerea metabolismului spermatozoizilor; - materialul seminal diluat trebuie s\ fie aseptizat prin `ncorporarea unui antibiotic cu spectru larg de ac]iune. Pentru `ndeplinirea condi]iilor create prin diluarea spermei, mediul de dilu]ie trebuie s\ aib\ mai multe `nsu[iri: - s\ con]in\ substan]e care s\ favorizeze metabolismul, vitalitatea [i capacitatea fecundant\ a spermatozoizilor (fructoz\, glucoz\, galactoz\); - s\ con]in\ substan]e care s\ men]in\ un timp mai `ndelungat pHul spermei `n limite fiziologice, numite substan]e tampon, cum ar fi: citra]ii, fosfa]ii, tartra]ii [i sulfa]ii de sodiu [i potasiu (necesare mai ales pentru dilu]ia spermei cu concentra]ie mare `n spermatozoizi); - s\ fie izotonic, izotermic [i s\ aib\ acela[i pH cu sperma; - s\ con]in\ substan]e coloidale care s\ protejeze spermatozoizii (g\lbenu[ de ou, lipoproteine, lecitin\ etc); - s\ aib\ `ncorporate antibiotice cu efect bacteriostatic sau bactericid `ntr-un spectru cât mai larg; - s\ posede `nsu[iri antioxidante; - s\ fie ieftin [i u[or de preparat; - s\ se p\streze, nealterat, un timp cât mai `ndelungat. Diluan]ii se pot clasifica dup\ compozi]ie, scop [i specia la care se folosesc. Dup\ compozi]ie diluan]ii se `mpart `n salini, pe baz\ de lapte [i sintetici. Diluan]ii salini constau `n solu]ii de concentra]ii diverse `n s\ruri de fosfa]i, citra]i, sulfa]i, tartra]i de sodiu [i potasiu, care au rol de substan]e tampon. Solu]iile mai con]in zaharuri (glucoz\, fructoz\, zaharoz\ etc) [i g\lbenu[ de ou, diferen]iat cu specia la care se folosesc. Diluan]ii pe baz\ de lapte con]in: lapte proasp\t de vac\ ecremat sau lapte praf degresat, cu sau f\r\ adaos de g\lbenu[ de ou. Diluan]ii pe baz\ de medii sintetice sunt, `n prezent, cei mai r\spândi]i, sunt produ[i de firme specializate, având `n compozi]ia lor diferite combina]ii de s\ruri, lapte, cu adaosuri de vitamine, hormoni, extracte tisulare etc, func]ie de unitatea produc\toare, pentru fiecare specie `n parte, purtând diferite denumiri comerciale: Laiciphos, Spermasol, Diploten, Triladyl, Seminan etc. Dup\ scopul lor diluan]ii se folosesc pentru sperma conservat\ prin refrigerare, congelare sau la temperatura camerei. Dup\ specia de animale la care se folosesc, diluan]ii se pot prepara dup\ acelea[i formule, pentru o singur\ specie sau pentru mai multe specii (taur, berbec, ]ap).

42

1.6.3. Tehnica prepar\rii diluan]ilor

Prepararea diluan]ilor difer\ `n func]ie de compozi]ia acestora. Diluan]ii salini cu adaos de g\lbenu[ de ou se preg\tesc `n doi timpi. Timpul 1. Se prepar\ solu]ia salin\ prin ad\ugarea `n apa bidistilat\ a cantit\]ilor de s\ruri prev\zute prin receptura diluantului respectiv. Apa bidistilat\ se ob]ine `n distilatoare de sticl\ pentru a nu d\una viabilit\]ii spermatozoizilor. Distilatoarele metalice modific\ pH-ul apei distilate prin ionii de metal ce se formeaz\. Solu]ia salin\ se prepar\ zilnic,`n func]ie de necesar sau pentru mai multe zile, cand se p\streaz\ `n sticle sterilizate la `ntuneric, la temperatura de refrigerare. Diluantul salin se prepar\ la nivelul unor laboratoare zonale sau na]ionale de unde este expediat unit\]ilor specializate `n flacoane `nchise ermetic care se p\streaz\ la frigider o perioad\ de circa 6 luni. Timpul 2. ~nainte de folosirea diluantului se adaug\ g\lbenu[ul de ou `n cantit\]ile prev\zute `n formulele de preparare a acestora. Se folosesc ou\ de g\in\ proaspete (1-3 zile) provenite de la un efectiv s\n\tos. Ou\le se spal\ cu ap\ cald\, se dezinfecteaz\ coaja cu alcool sanitar, se sparg [i se separ\ g\lbenu[ul de albu[, albu[ul netrebuind s\ ajung\ `n diluant deoarece are o reac]ie acid\ [i modific\ pH-ul mediului. Dup\ ob]inerea cantit\]ii necesare de g\lbenu[ de ou se omogenizeaz\ cu o baghet\ din sticl\ sau cu un agitator mecanic timp de 510 minute, apoi, g\lbenu[ul bine omogenizat, se adaug\ peste solu]ia salin\, sub o omogenizare continu\, f\r\ a se forma spum\. Omogenizarea face globulele de gr\sme din g\lbenu[ s\ fie dispersate, evitându-se aglomerarea acestora, ceea ce ar `mpiedeca mi[carea spematozoizilor. Pentru aseptizarea materialului seminal diluat, se adaug\ `n diluant antibiotice cu spectru de ac]iune cât mai larg, conform re]etelor de preparare. ~n ]ara noastr\, cele mai folosite antibiotice sunt: penicilina, streptomicina `n cantit\]i de 500 U.I. [i respectiv 250-500 µg/ml diluant. Se folosesc cele mai eficiente antibiotice conform antibiogramei. Prepararea diluantului cu g\lbenu[ de ou [i antibiotice se face, de regul\, cu 1-2 ore `naintea folosirii, timp necesar ca s\rurile de Na sau K s\ clarifice sau s\ fac\ transparente particulele de globuline din g\lbenu[. Substan]ele care se introduc `n diluant trebuie s\ fie proaspete, nealterate, chimic pure [i s\ nu con]in\ impurit\]i toxice pentru spermatozoizi. Sticl\ria [i ustensilele folosite la prepararea diluantului s\ fie sterilizate. Diluan]ii pe baz\ de lapte se prepar\ astfel: laptele de vac\ proasp\t, integral sau ecremat, se fierbe sau se pasteurizeaz\ la 90-92oC, se r\ce[te [i filtreaz\ printr-o hârtie de filtru, steril\. Când temperatura laptelui ajunge la 20oC se adaug\ propor]ia de g\lbenu[ de ou, stabilit\ prin receptur\, dup\ tehnica descris\. Laptele praf degresat se prepar\ cu ap\ bidistilat\ `n raport de 1/9, apoi se pasteurizeaz\, se filtreaz\, se r\ce[te [i se amestec\ cu cantitatea necesar\ de g\lbenu[ de ou (5-10%).

43

Diluan]ii sintetici sunt cei mai `ntrebuin]a]i `n prezent. Ei sunt produ[i de diferite unit\]i specializate [i sunt livra]i sub form\ de pulberi sau granule, ambalate `n pungi de material plastic, pe care sunt precizate instruc]iunile de folosire. ~n momentul folosirii se dizolv\ con]inutul unui plic `n ap\ bidistilat\ [i se adaug\ g\lbenu[ul de ou proasp\t, `n cantit\]ile precizate `n instruc]iunile `nso]itoare. ~n prezent, aceste medii de dilu]ie se prepar\ pe scar\ industrial\, ceea ce conduce la uniformizarea [i simplificarea tehnicilor de lucru, ob]inerea unor rezultate bune, `n condi]iile sc\derii pre]ului de cost. 1.6.4. Tehnica dilu]iei

Dilu]ia propriu-zis\ difer\ cu specia [i cu modul de conservare a spermei. 1.6.4.1. Diluarea spermei de taur

Pentru conservarea spermei prin refrigerare se folosesc medii pe baz\ de solu]ii saline cu adaos de g\lbenu[ de ou, glucoz\, sau diluan]ii pe baz\ de lapte. Cel mai frecvent sunt `ntrebuin]a]i diluan]ii sintetici, livra]i de diverse firme, cu diferite denumiri, func]ie de ]ara [i unitatea produc\toare. Diluantul sintetic este un mediu uscat, pe baz\ de lapte ecremat, echilibrat [i sterilizat, la care se adaug\ `n final 10% g\lbenu[ de ou [i 7% glicerin\ cu densitate 1,25 (de exemplu Laiciphos). Nivelul relativ sc\zut de g\lbenu[ de ou faciliteaz\ examinarea microscopic\, f\r\ s\ influen]eze negativ fecunditatea. Indiferent de natura diluantului, se adaug\ cantit\]ile necesare de antibiotice (preferabil `n func]ie de antibiogram\), se pasteurizeaz\, se filtreaz\ [i se r\cesc. Diluarea spermei pentru conservare prin refrigerare se face `n dou\ etape: - dilu]ia ini]ial\ (predilu]ia), la 37oC, `n raport de 1/1 [i `n condi]ii de izotermie; - dilu]ia final\ (definitiv\), la 18-20oC, tot `n condi]ii de izotermie, conform raportului final de dilu]ie, calculat `n func]ie de concentra]ia spermei brute [i a celei diluate `n spermatozoizi/mm3 sau pe ml. Formula de calcul este: G.D.F. =

C1 C2

xMx V

`n care:

- G.D.F = gradul de dilu]ie final\; - C1 = concentra]ia spermei brute `n spermatozoizi/ml; - C2 = num\rul de spermatozoizi vii pe care dorim s\-i avem `n doz\; - M = mobilitatea spermatozoizilor dup\ decongelare, exprimat\ `n sistemul zecimal; - V = volumul dozei de sperm\ exprimat `n ml.

44

Exemplu: C1=109; C2=12x106; M=0,6; V=1,0ml. G.F.D.=109x0,6x1,0/12x106=50, sau când V=0,5ml rezult\ G.DF.=109x0,6x0,5/12x106=25. ~n aceast\ situa]ie, la un volum de sperm\ se adaug\ 49 volume de diluant `n primul caz, [i respectiv 24 de volume, `n cazul al doilea. Preciz\m c\ mobilitatea spermatozoizilor dup\ deconservare se calculeaz\ pentru fiecare taur `n parte pe baza mediei mai multor determin\ri. ~n acest caz, raportul de dilu]ie final va fi: R.D.F=1/49; R.D.F=1/24. Pentru calcularea num\rului de doze pe care le putem ob]ine dintr-un ejaculat, se `nmul]e[te volumul ejaculatului cu gradul de dilu]ie final ob]inut [i se `mparte la volumul dozei. ~n exemplul dat, dac\ volumul ejaculatului este de 5 ml, num\rul de doze va fi; Nr. doze=50x5/1=250; sau N=5x25/0,5=250 Gradul de dilu]ie pentru sperma de taur, oscileaz\ `n medie `ntre 20 [i 40, astfel `ncât `ntr-o doz\ de `ns\mân]are s\ se asigure 10-12 milioane de spermatozoizi mobili. Mobilitatea minim\ admis\ pentru sperma de taur conservat\ prin refrigerare este de 60% sau de 0,6, determinat\ `nainte de a fi `ns\mân]at\. Dup\ diluare, se apreciaz\ mobilitatea spermatozoizilor [i dac\ aceasta nu a sc\zut cu mai mult de 10% fa]\ de mobilitatea spermei brute, dilu]ia se consider\ c\ a fost efectuat\ `n condi]ii bune [i se trece la repartizarea `n doze a spermei. Repartizarea spermei `n doze se face cu ajutorul unor seringi semiautomate, `n fiole de sticl\ care se `nchid apoi la flac\r\ oxiacetilenic\, sau `n fiole care se `nchid cu dop de plut\ sau din material plastic. Pentru conservarea spermei de taur prin congelare se folosesc dou\ medii de dilu]ie care se deosebesc numai prin aceea c\ unul con]ine, `n plus, glicerin\, substan]\ crioprotectoare. {i `n acest caz se pot folosi diluan]i salini, pe baz\ de lapte sau sintetici (de exemplu Laiciphos, Tryladil, Seminan etc.) care se prepar\ dup\ tehnicile descrise. Cantitatea de diluant necesar\ se separ\ `n dou\ p\r]i egale (A [i B). Diluantul B con]ine `n plus fa]\ de diluantul A 14-16% glicerin\ chimic pur\, astfel `ncât concentra]ia de glicerin\, `n final, s\ fie de 7-8%. Diluantul A se `mparte `n dou\ p\r]i inegale: o parte (A1) mai redus\ (5-10%) se p\streaz\ la termostat reglat la 37oC, iar cealalt\ parte, (A2) se las\ la temperatura camerei. Diluantul B se p\streaz\ la frigider sau `ntr-o vitrin\ frigorific\ la 2-4oC. Dilu]ia comport\ 3 etape: ini]ial\, intermediar\ [i final\. Dilu]ia ini]ial\ se face la temperatura de 37oC, `n condi]ii de izotermie, `n raport de 1/1, cu diluantul A1, direct `n paharul sau eprubeta colectoare. Dup\ efectuarea acestei prime dilu]ii, paharul sau eprubeta cu sperma astfel diluat\ se scot de la termostat [i se a[az\ al\turi de frac]iunea A2 a diluantului, la temperatura laboratorului (18-20oC). Dilu]ia intermediar\ se face dup\ circa 20-30 de minute, când cele dou\ componente ating aceea[i temperatur\, la temperatura laboratorului,

45

ad\ugându-se diluantul A2 `ntr-un raport care s\ asigure jum\tate din cantitatea total\ de diluant calculat\ prin raportul final de dilu]ie. Dup\ dilu]ia intermediar\, paharul cu sperma se introduce `ntr-o vitrin\ frigorific\ sau la frigider, al\turi de frac]iunea B a diluantului. Dilu]ia final\ se face la temperatura de 2-4oC, tot `n condi]ii de izotermie, dup\ 5060 de minute de la efectuarea dilu]iei intermediare. ~ntrucât glicerina este o substan]\ toxic\ pentru spermatozoizi, diluantul glicerinat se adaug\ treptat, pic\tur\ cu pic\tur\, sub o permanent\ agitare a recipientului cu sperm\ (foto 12). Foto 12 Dilu]ia spermei de taur

Congelarea spermei sub form\ de granule se bazeaz\ pe r\cirea rapid\ a acesteia, `n alveolele unei pl\ci de z\pad\ carbonic\ rezultând pastile cu un volum de 0,1 ml. Dup\ recoltarea spermei se examineaz\ `nsu[irile ejaculatului, `n func]ie de care se determin\ gradul final de dilu]ie [i volumul total al spermei diluate. ~n acest interval de timp, sperma se dilueaz\ `n propor]ie de 1/1 la temperatura de 37oC, `n condi]ii de izotermie `ntre diluant [i sperm\. Cel mai frecvent se folose[te diluant pe baz\ de lactoz\: lactoz\ 11% `n ap\ bidistilat\ - 75,3 ml, g\lbenu[ de ou - 20 ml, glicerin\ anhidr\ - 4,7 ml. Dup\ 15 minute de la dilu]ia ini]ial\, se adaug\ volumul total de diluant glicerinat, cu ajutorul unui dozator automat, cuplat la un omogenizator. Ad\ugarea se face la temperatura laboratorului, raportul de dilu]ie fiind foarte strâns (1/2, 1/4), datorat volumului redus al granulei [i mobilit\]ii mai reduse a spermatozoizilor, comparativ cu alte metode de congelare. Compozi]ia diluan]ilor utiliza]i `n ac]iunea de `ns\mân]\ri artificiale este foarte diferit\, `ns\ se poate afirma c\ cea mai mare parte, apar]ine diluan]ilor salini, pe baz\ de lapte sau sintetici. Fiecare ]ar\ [i unitate specializat\ `n practica `ns\mân]\rilor artificiale au re]ete specifice pentru prepararea diluan]ilor. Din multitudinea de re]ete de preparare a diluan]ilor red\m pe cele mai simple [i mai frecvent folosite: 1) Sulfat de sodiu anhidru (Na2SO4) Glucoz\ anhidr\ Pepton\ Ap\ distilat\ (`nc\lzit\)

46

13,6 g 12,0 g 5,0 g 1000 ml

2) Tartrat de natriu [i potasiu (C4O6H4KNa) 25,6 g Glucoz\ anhidr\ 12,0 g Pepton\ 5,0 g Ap\ distilat\ (`nc\lzit\) 1000 ml 3) Fosfat acid de sodiu (Na2HPO4) Ap\ distilat\

3,5 g 190 ml

0,2 g 4) Fosfat acid de potasiu (KH2PO4) 2,0 g Fosfat acid de sodiu (Na2HPO4) cu 12H2O Ap\ distilat\ clocotit\ 100 ml Dup\ r\cire se adaug\ un volum egal de g\lbenu[ de ou proasp\t [i se omogenizeaz\. 5) Citrat de sodiu (Na3C6H5O5) Ap\ bidistilat\ G\lbenu[ de ou 6) Citrat de sodiu Glucoz\ pur\ Ap\ distilat\ G\lbenu[ de ou

2,9 g 100 ml 20% 1,15 g 3,0 g 100 g 20%

7) Tris hidroximetil-aminometan Acid citric Fructoz\ Ap\ distilat\

6,056g 3,4g

2,5 g 166,32 g

8) Lactoz\ 10% `n ap\ bidistilat\ G\lbenu[ de ou Glicerin\ anhidr\

75,3 ml 20,0 ml 4,7 ml

9) Sulfat anhidru de sodiu (Na2SO4) Glucoz\ anhidr\ Gelatin\ Ap\ bidistilat\

1,36 g 2,2 g 5,0 g 100 ml

10) Diluant pe baz\ de lapte integral pasteurizat Se folose[te lapte cu 3,5% gr\sime, `nc\lzit\ indirect `ntr-o sticl\ pirex sau un vas emailat cu pere]i dubli `n care se fierbe timp de 20 de minute. Dup\ r\cire, laptele se filtreaz\ pentru a fi `ndep\rtate proteinele coagulate. Se daug\ 500 U.I. penicilin\ [i 500 µg streptomicin\ pe ml.

47

11) ~n locul laptelui integral se folose[te laptele ecremat. 12) Diluant pe baz\ de lapte praf ~ntr-un litru de ap\ bidistilat\ se adaug\ 100 g lapte degresat apoi se fierbe 10 minute `ntr-un vas conic. Dup\ r\cire se completeaz\ apa pierdut\ prin evaporare, apoi se adaug\ antibioticele men]ionate la re]eta 10. ~n prezent, pentru diluarea spermei de taur se folosesc diluan]i sintetici, prepara]i de diverse firme [i care `ncorporeaz\ toate substan]ele chimice necesare, `n laborator urmând s\ se adauge, eventual, g\lbenu[ul de ou proasp\t preparat [i apa bidistilat\. Func]ie de firma care-i comercializeaz\, diluan]ii poart\ diverse denumiri: Laiciphos, Spermasol, Dilapten, Triladyl, Seminan etc. 1.6.4.2. Diluarea spermei de berbec [i ]ap

Un mare num\r de `ns\mân]\ri artificiale la ovine, atât pe plan mondial cât [i `n ]ara noastr\ se realizeaz\ cu sperm\ nediluat\, imediat dup\ recoltare [i examinare. Aceast\ metod\ asigur\ o fertilitate ridicat\, `ns\ necesit\ prezen]a masculilor `n aceea[i unitate cu femelele care urmeaz\ a fi `ns\mân]ate. Propriet\]ile biochimice ale spermei de berbec [i ]ap impun anumite precau]ii `n folosirea spermei pentru `ns\mân]\rile artificiale. Astfel, plasma seminal\ nu creeaz\ un mediu optim pentru supravie]uirea spermatozoizilor „in vivo“. Cercet\rile au eviden]iat, spre exemplu, la ]ap, atunci când sperma a fost recoltat\ din epididim ( care nu a venit `n contact cu secre]iile glandelor anexe), a fost diluat\ [i congelat\, c\ propor]ia de spermatozoizi vii [i mobilitatea lor dup\ decongelare sunt mult superioare celor din sperma ejaculat\, ceea ce indic\ faptul c\ venirea `n contact a spermatozoizilor cu secre]iile glandelor anexe reduce supravie]uirea „in vitro“ a acestora. La berbec, ad\ugarea plasmei seminale la spermatozoizii proveni]i din epididim, stimuleaz\ mobilitatea acestora timp de 3-7 ore, apoi mobilitatea se reduce brusc, comparativ cu spermatozoizii care nu vin `n contact cu plasma seminal\ [i care `[i men]in mobilitatea peste 22 de ore. La ]ap, plasma seminal\ pare nefast\ men]inerii calit\]ii spermatozoizilor, pe durata stoc\rii `ndelungate `n azot lichid (G. Baril [i colab., 1993).

La aceste dou\ specii (ovine, caprine), glandele bulbouretrale au capacitatea de a secreta `n cantit\]i `nsemnate o enzim\ numit\ fosfolipaza A, sau a coagul\rii g\lbenu[ului de ou. Aceast\ enzim\ catalizeaz\ hidroliza lecitinelor din g\lbenu[ul oului `n acizi gra[i [i lizolecitin\. Lizolecitina, `n concentra]ie mai ridicat\, este toxic\ pentru supravie]uirea „in vitro“ a spermatozoizilor. Aceast\ particularitate de specie `mpiedic\ folosirea unei cantit\]i importante de g\lbenu[ de ou sau a unui mediu cu con]inut ridicat `n lecitine pentru diluarea spermei. Totu[i, `n cazul aplic\rii `ns\mân]\rilor artificiale la ovine, pe scar\ mai larg\, dilu]ia spermei este necesar\. Compozi]ia diluan]ilor [i tehnica dilu\rii spermei de berbec [i ]ap difer\ `n

48

func]ie de modul `n care se face conservarea: sub form\ lichid\ (refrigerare) sau solid\ (congelare). Dilu]ia spermei pentru conservare sub form\ lichid\ presupune parcurgerea a dou\ etape principale: prepararea diluantului [i dilu]ia propriu-zis\. Diluantul se prepar\ pe baz\ de lapte praf, cu o zi `naintea `ntrebuin]\rii (Baril G [i colab.,1993). Se iau 100 ml de ap\ bidistilat\, sterilizat\ [i `nc\lzit\ la 60oC, `n care se dizolv\ 0,33 g de sulfamide. Se r\ce[te amestecul pân\ la 20-25oC, apoi, `n acest amestec se dizolv\ 11,1 g lapte praf de vac\, ecremat. Se fierbe `ntr-o baie-marie, timp de 15 minute, se r\ce[te la temperatura laboratorului, se adaug\ 0,11 g streptomicin\ [i 100000 U.I. penicilin\. Diluantul astfel preparat se p\streaz\ la 2-4oC, timp de maxim 2-3 zile. ~n practica `ns\mân]\rilor artificiale din ]ara noastr\ [i din lume se folosesc multe re]ete de preparare a diluan]ilor, cel mai frecvent `ntrebuin]a]i fiind diluan]ii sintetici, produ[i de diverse firme specializate. Dup\ recoltarea ejaculatului, acesta se examineaz\ cantitativ [i calitativ, apreciindu-se cel pu]in mobilitatea [i concentra]ia spermatozoizilor, pe baza c\rora se determin\ gradul final de dilu]ie (raportul final de dilu]ie - RDF) func]ie de concentra]ia ini]ial\ [i dup\ dilu]ie a spermei `n spermatozoizi/ml. Diluarea spermei se face `n dou\ etape: ini]ial\ [i final\. Dilu]ia ini]ial\ se face imediat dup\ recoltare, la temperatura de 32oC, `n raport de 1/1, `n condi]ii de izotermie, direct `n paharul colector men]inut `ntr-un termostat la 32oC. Paharul colector `mpreun\ cu sperma prediluat\, se scoate de la termostat [i se men]ine 10-15 minute la temperatura laboratorului, al\turi de restul diluantului. Dilu]ia final\ se face la temperatura ambiant\, `n condi]ii de izotermie, ad\ugându-se restul cantit\]ii de diluant, calculat prin raportul final de dilu]ie. ~n cazul `n care raportul de dilu]ie este mai larg (1/5-1/7), pentru m\rirea vâscozit\]ii materialului seminal, se poate ad\uga la compozi]ia diluantului 2-3% gelatin\ sau polivinil pirolidon etc. Diluarea spermei pentru conservare sub form\ solid\ (congelare) Pentru congelare se folosesc numai ejaculate cu mobilitate de cel pu]in 0,8. Aprecierea volumului [i concentra]iei spermei permite calculul gradului dilu]iei finale. Diluantul se prepar\ cu o zi `nainte sau `n aceea[i zi, pu]in timp `nainte de folosire. Se folosesc doi diluan]i. Primul poate fi: 100 ml ap\ bidistilat\, 10,3 g lactoz\, 20% g\lbenu[ de ou. Cel de-al doilea con]ine diluantul 1 la care se adaug\ 4,0 g de lapte praf ecremat pentru fiecare 100 ml, astfel `ncât, `n final presiunea osmotic\ s\ ating\ 450 miliosmoli. Se adaug\ la acest diluant glicerol, astfel `ncât, `n sperma diluat\, propor]ia de glicerol s\ fie de 4%.

49

Tehnica dilu]iei include dou\ etape principale: - dilu]ia ini]ial\ (predilu]ia) care se face cu diluantul 1 la 32oC, `n condi]ii de izotermie, direct `n paharul colector, men]inut la termostat. Imediat dup\ predilu]ie paharul cu sperma respectiv\ se men]ine la temperatura laboratorului timp de 10-15 minute apoi se introduce `ntr-un frigider (2-4oC) unde este men]inut timp de 2,0-2,5 ore; - dilu]ia final\ se face la temperatura de 2-4oC, `n condi]ii de izotermie, ad\ugându-se cantitatea necesar\ din diluantul 2 (conform R.D.F) astfel `ncât `n final, concentra]ia spermei `n glicerol s\ fie de 4%. Exemple de diluan]i folosi]i pentru sperma de berbec: 1) Ap\ bidistilat\ 100 ml Glucoz\ anhidr\ 0,8 g Citrat de sodiu 2,8 g Streptomicin\ 50000 mcg Penicilin\ 50000 U.I. G\lbenu[ de ou 20% 2) Ap\ bidistilat\ 80 ml Glicocol 0,34 g Citrat trisodic (cu 2 moli de ap\) 2,71 g G\lbenu[ de ou 20% Când se lucreaz\ cu un raport de dilu]ie mai larg (1/5-1/7) `n vederea m\ririi vâscozit\]ii spermei se mai poate ad\uga, de exemplu, 25% polivinil pirolidon. 1.6.4.3. Diluarea spermei de vier

Pentru sperma de vier, cele mai bune rezultate s-au dovedit a fi date de mediile de dilu]ie sintetice, prin care toxicitatea mediului natural pentru spermatozoizi poate fi evitat\, `n cea mai mare parte, prin ad\ugarea de substan]e organice. Astfel, `n sperma nediluat\, spermatozoizii `[i reduc `nc\rc\tura electric\ negativ\ datorit\ surplusului de ioni metalici liberi (Ca, Fe, Mg) [i ac]iunii anticorpilor, ceea ce duce, `n scurt timp la aglutinarea acestora. De aceea mediul de dilu]ie trebuie s\ con]in\ neelectroli]i (zaharuri), substan]e ce con]in [i o surs\ exogen\ de energie. Pentru men]inerea pH-ului `n limite normale, `n mediul de dilu]ie sunt `ncorpora]i anioni polivalen]i (citratul de sodiu), g\lbenu[ de ou sau lecitin\. Pentru a proteja spermatozoizii de efectul nefavorabil al [ocului termic `n mediul de dilu]ie se introduc substan]e chelatoare (complexon III). Multiple cercet\ri `ntreprinse pentru g\sirea celor mai eficiente formule de diluan]i, au eviden]iat faptul c\ bune rezultate se ob]in cu medii pe baz\ de glucoz\citrat-bicarbonat-complexon III - cu adaos de antibiotice cu rol bacteriostatic sau bactericid.

50

O alt\ grup\ important\ o formeaz\ diluan]ii pe baz\ de lapte de vac\, proasp\t sau preparat din lapte praf, sau din lapte+solu]ie glucoz\ 6%+g\lbenu[ de ou 3% [i antibiotice (Feredean [i colab., 1964). Al]i autori recomand\ ca mediul de dilu]ie pentru sperma de vier, laptele integral cu adaos de solu]ie de glucoz\ 3,5% [i 2% g\lbenu[ de ou, iar cercet\tori din China au ob]inut rezultate satisf\c\toare prin folosirea unui mediu alc\tuit din p\r]i egale de lapte degresat, solu]ie de citrat de sodiu 2,9%, solu]ie de glucoz\ 5%, la care se adaug\ 10-20% g\lbenu[ de ou [i antibiotice. De re]inut c\ laptele poate constitui singur sau `n amestec cu alte substan]e, un bun diluant pentru sperma de vier, fiind un mediu biologic complex, cu con]inut favorabil de lipide (lecitin\, cefalin\), proteine (cazein\, lactalbumin\, lactoglobulin\) [i aminoacizi esen]iali (metionin\, treonin\, lizin\, triptofan), glucide (lactoza), substan]e minerale, acid citric, enzime [i vitamine. Acest diluant este foarte u[or de preparat, laptele trebuind s\ provin\ de la vaci s\n\toase, s\ fie proasp\t [i s\ se `nc\lzeasc\ `nainte de folosire, la 85-90oC, timp de 10-15 minute. Pentru congelarea spermei de vier, mediile de dilu]ie trebuie s\ includ\ glucoz\, citrat de sodiu cu tampon format din solu]ie tricin\- tris, la care se adaug\ g\lbenu[ de ou, glicerin\ 3-4% [i antibiotice (Crabo [i colab., 1971; Nouk, B.A.,1971).

Mediile sintetice produse de unit\]i specializate [i care se prezint\ sub form\ de pulbere, ambalat\ `n pungi din material plastic, prev\zute [i cu instruc]iuni de folosire, sunt cele mai folosite `n prezent `n practica `ns\mân]\rilor artificiale la suine. Mediile sintetice se prepar\ numai din substan]e chimic pure, iar apa `n care se dizolv\ aceste substan]e trebuie s\ fie bidistilat\, fiart\ `n prealabil. Diluan]ii pe baz\ de lapte se prepar\ numai `nainte de recoltarea spermei, conform celor men]ionate anterior. Tehnica dilu\rii spermei este cât se poate de simpl\. Dilu]ia trebuie s\ se fac\ cât mai repede de la recoltare, la temperatura de 33oC, prin ad\ugarea treptat\ a diluantului peste sperm\, `n condi]ii de izotermie, `ntr-o baie de ap\ a c\rei temperatur\ este reglat\ la acest nivel. Gradul de dilu]ie se stabile[te pe baza concentra]iei, mobilit\]ii spermatozoizilor [i a num\rului de spermatozoizi mobili pe doza de `ns\mân]are (3-5 miliarde), folosindu-se formula: Vt =

C x M x10 n

9

− 1,

`n care:

Vt=volumul total al spermei diluate; C= concentra]ia spermei/ml; M= mobilitatea spermatozoizilor; n= num\rul de spermatozoizi de dorit `ntr-o doz\ de sperm\.

Dup\ efectuarea dilu]iei ini]iale `n raport de 1/1, paharul cu sperm\ se men]ine 20-30 minute la temperatura laboratorului, apoi se adaug\ treptat, `n condi]ii de izotermie, restul cantit\]ii de diluant calculat prin gradul final de

51

dilu]ie, apoi sperma se repartizeaz\ `n doze, constituite din recipiente din material plastic, având o capacitate de 100 ml, de form\ oval\ sau cilindric\. Câteva exemple de formule de diluan]i pentru sperma de vier: 1) Ap\ bidistilat\ Glucoz\ Bicarbonat de Na G\lbenu[ de ou Streptomicin\ Penicilin\

1000 ml 30,0 g 1,0 g 300 ml 0,5 g 500000 U.I.

2) Ap\ bidistilat\ Glucoz\ Bicarbonat de Na G\lbenu[ de ou Streptomicin\ Penicilin\

1000 ml 40,0 g 2,0 g 250 ml 0,4 g 240000 U.I.

3) Ap\ bidistilat\ Citrat de Na G\lbenu[ de ou Penicilin\ Streptomicin\

1000 ml 30,0 g 200 ml 500000 U.I. 0,5 g

4) Ap\ bidistilat\ Glucoz\ Citrat de Na Glicocol G\lbenu[ de ou Penicilin\ Streptomicin\

1000 ml 10,0 g 3,3 g 3,3 g 200 ml 1000000 U.I 1,0 g

5) Ap\ bidistilat\ Glucoz\ Complexon Citrat de de Na Hidroxid de Na Penicilin\ Streptomicin\

1000 ml 60,0 g 1,84 g 1,78 g 0,16 g 500000 U.I. 0,5 g

1.6.4.4. Diluarea spermei de arm\sar

Sperma de arm\sar, dup\ recoltare, oricare ar fi temperatura la care se p\streaz\, nu con]ine nici un spermatozoid viu dup\ circa o or\. Deci `ns\mân]area cu sperm\ brut\ trebuie s\ se fac\ `n primele 5 minute de la recoltare. Dac\ nu este posibil, sperma trebuie s\ fie diluat\ `n primele dou\ minute dup\ recoltare, rolul diluantului fiind acela de a neutraliza efectele nefaste ale plasmei seminale (E. Palmer [i colab., 1984).

52

Pentru diluarea spermei de arm\sar se folosesc mai multe formule de medii de dilu]ie: pe baz\ de tartrat de sodiu [i potasiu, glucoz\, pepton\, g\lbenu[ de ou [i antibiotice: 1) Tartrat de Na [i K Glucoz\ Sulfamilamid\ Ap\ bidistilat\

0,15 g 6,85 g 0,6 g 100 ml

2) Tartrat de Na [i K Glucoz\ G\lbenu[ de ou Ap\ distilat\

0,67 g 5,76g 30,0 g 100 ml

3) Lapte sterilizat [i filtrat G\lbenu[ de ou Glucoz\

100 ml 0,8 ml 1,3 g

4) Lapte praf degresat 2,4 g Gelatin\ 4,99 g Hidrocarbonat de Na, solu]ie steril\ 1,5% 2,0 ml Ap\ distilat\ 92ml 5) Ap\ bidistilat\ 100ml Glucoz\ 7,0 g G\lbenu[ de ou 0,8 ml ~ns\ cel mai simplu [i ieftin diluant `l constituie laptele semiecremat, sterilizat, la care se adaug\ penicilin\ (50000 U.I./l) [i gentamicin\ (5 mg/l). Un alt diluant folosit cu bune rezultate `n Fran]a este constituit pentru un volum de 2 litri din: 1l de lapte semiecremat [i sterilizat, 1l de solu]ie (glucoz\ 50 g + lactoz\ 3 g + rafinoz\ 3 g + citrat de sodiu 0,6 g + citrat de potasiu 0,82 g + penicilin\ 100000 U.I.) (E. Palmer [i colab.,1984). Indiferent de mediul de dilu]ie folosit, la 100 ml se adaug\ 500000 U.I.penicilin\ [i 0,5 g streptomicin\. Sperma se recolteaz\ cu ajutorul vaginului artificial la interval de 48 de ore, se filtreaz\, apoi se dilueaz\ imediat la 32oC `n condi]ii de izotermie, astfel `ncât dup\ dilu]ie s\ se asigure 20 milioane spermatozoizi/ml. 1.6.4.5. Diluarea spermei de p\s\ri

Dozele de sperm\ pentru `ns\mân]area artificial\ a p\s\rilor trebuie s\ con]in\ 100-120 milioane de spermatozoizi mobili, raportul de dilu]ie cel mai frecvent fiind de 1/2-1/3, f\r\ a dep\[i 1/5. ~n cazul practic\rii `ns\mân]\rilor artificiale `n unit\]ile cu flux tehnologic industrial, nu se recomand\ diluarea spermei, dac\ sperma brut\ se `ns\mân]eaz\ `ntr-un interval maxim de 30-45 de minute dup\ recoltare. ~n cazul `n care acest interval este dep\[it, devine util\ [i necesar\ diluarea spermei [i conservarea acesteia. ~ntrucât, spermatozoizii `[i pierd repede capacitatea fecundant\,

53

dilu]ia spermei trebuie s\ se fac\ pe m\sur\ ce se recolteaz\. Indiferent de specie, dilu]ia spermei nu permite `ns\mân]area unui num\r prea mare de femele dintr-un ejaculat `ntrucât, factorul cel mai important este num\rul de spermatozoizi pe doza de `ns\mân]are. De aceea, apare necesitatea cre[terii volumului dozei de sperm\ diluat\ `n raport invers cu nivelul de dilu]ie, pentru a men]ine constant num\rul de spermatozoizi insemina]i. Diluarea spermei la p\s\ri se face cu diluan]i care s\ prezerve nu numai mobilitatea spermatozoizilor ci [i fecundan]a acestora. Pentru p\s\ri, un diluant bun este acela care diminu\ de o manier\ reversibil\ mobilitatea spermatozoizilor, tamponeaz\ tendin]a de acidifiere a mediului consecutiv metabolismului acestora, chiar la un nivel sc\zut de temperatur\ [i con]ine nutrien]i esen]ialmente energetici. Se cunoa[te faptul c\ este redus\ capacitatea de sintez\ lipidic\ sau proteic\ a spermatozoizilor, fiind lipsi]i de aparat Golgi [i s\raci `n ARN. Când sperma diluat\ nu se congeleaz\, diluan]ii pot fi constitui]i din simple solu]ii tampon, urm\rindu-se `ndeosebi ac]iunea protectoare pentru capacitatea fecundant\ a spermatozoizilor. Aceste solu]ii sunt alc\tuite din ap\ bidistilat\ la care se adaug\ fosfa]i de sodiu [i potasiu (65 g/l) pentru a asigura o presiune osmotic\ de 380-400 mosm/l. Formulele de diluan]i mai cunoscute sunt cele men]ionate de Lake [i colab.(1981) sau Sexton (1977), care au acelea[i condi]ii de osmolaritate [i con]in unul sau mai multe sisteme tampon (citrat, fosfat, acetat, BES sau TES) [i se caracterizeaz\ prin concentra]ii precise `n anumi]i electroli]i (Na+, K+, Mg++) [i chelatan]i (aminoacizi de tip glicin\ sau glutamat). Ace[ti diluan]i mai con]in glucoz\ sau fructoz\. Alt autor (Van Wambike, 1972) folose[te un diluant pe baz\ de lapte [i albu[ de ou cu care ob]ine un nivel de 90-92% fecunditate dup\ 24 de ore de p\strare a spermei [i folosirea unei doze de 100 milioane de spermatozoizi/g\in\/s\pt\mân\. Referitor la gradul de dilu]ie, cantitatea de diluant trebuie s\ fie suficient\ pentru a asigura eficacitatea diluantului (puterea tampon, dispersia spermatozoizilor, dilu]ia sau anularea efectului catabolic toxic). Nivelul dilu]iei optime se situeaz\, `n general, `ntre 1/2 [i 1/3. 1.7. Conservarea spermei ~n prezent, extinderea `ns\mân]\rilor artificiale este condi]ionat\ `ntro propor]ie `nsemnat\ de conservarea spermei, `n vederea folosirii cu maxim\ eficien]\ a unui num\r minim de masculi indemni de boli [i cu cea mai ridicat\ valoare genetic\. Realizarea acestui deziderat se bazeaz\ pe un volum maxim de sperm\ (rolul diluantului) [i asigurarea optim\ a puterii de fecundare a spermatozoizilor `n timpul unei perioade cât mai lungi posibile (rolul tehnicilor de conservare). A conserva spermatozoizii animali `nseamn\ a conserva celule nu numai `n stare vie ci [i func]ional\. De aceea cercet\torii au c\utat s\ pun\ la punct metode care s\ fie cât mai adaptate fiziologic spermatozoidului, `n sensul c\ acesta s\-[i reduc\ metabolismul f\r\ a fi afectat\ capacitatea fecundant\.

54

Tehnicile de conservare a spermei se pot clasifica `n trei grupe: a).- conservarea spermei la temperatura ambiant\ (18-20oC); b).- conservarea spermei la temperatura de refrigerare (2-4oC); c).- conservarea spermei la temperatura de congelare (-79 o 196 C). a). Conservarea spermei la temperatura ambiant\ (18-20oC) ~n acest caz activitatea vital\ a spermatozoizilor nu este limitat\ de temperatur\. Conservarea se bazeaz\ pe ac]iunea inhibitoare a substan]elor chimice incluse `n diluant [i care pot fi u[or eliminate pentru a reanima spermatozoizii. ~n acest scop se folose[te acidul carbonic, provenit din barbotarea bioxidului de carbon `n masa spermatic\ cu apa (CO2+H2O=H2CO3). Spermatozoizii au un metabolism `ncetinit atât timp cât concentra]ia `n bioxid de carbon se men]ine la satura]ie. Când bioxidul de carbon este eliminat, spermatozoizii `[i recap\t\ mi[carea [i capacitatea lor func]ional\. Aceast\ tehnic\ a fost preconizat\ de cercet\torii americani, `ns\ rezultatele ob]inute sunt nesatisf\c\toare pentru conservarea spermei de taur, berbec [i vier. Tehnica nu permite men]inerea puterii fecundante a spermatozoizilor decât pentru un interval de timp de circa 3-4 zile. Folosirea sa nu reclam\ nici un dispozitiv de reglare a temperaturii, `ns\ este necesar ca fiecare doz\ s\ fie pus\ `ntr-un ambalaj etan[ [i separat (fiol\ saturat\ cu gaz carbonic). ~n deceniul [apte s-a propus ca metod\ de conservare a spermei la temperatura camerei, prin folosirea laptelui de nuc\ de cocos. Experien]ele au ar\tat c\ acest mediu permite supravie]uirea [i prelungirea puterii fecundante a celulelor sexuale mascule de taur timp de circa 3-4 zile la temperatura de 15-20oC. Aceast\ tehnic\ a fost adoptat\ `n unele ]\ri din America de Sud [i Africa, `ns\ `n prezent nu este r\spândit\, fiind dep\[it\ tehnologic de conservarea spermei prin refrigerare [i congelare. Sperma este diluat\ normal `ntr-un mediu cu lapte de cocos [i repartizat\ `n tuburi p\strate la temperatura de 15-20oC. b). Conservarea spermei prin refrigerare (2-4oC) Aceast\ tehnic\ a fost cea mai folosit\ pân\ `n deceniul opt pentru conservarea spermei la toate speciile [i se mai folose[te `n prezent pentru conservarea spermei de vier, arm\sar [i p\s\ri cu rezultate mul]umitoare. Mobilitatea spermatozoizilor [i activitatea lor metabolic\ descresc progresiv pe m\sur\ ce temperatura mediului `n care se g\sesc scade. La un nivel de temperatur\ care oscileaz\ `ntre 2oC[i 4oC, `ntr-un mediu de dilu]ie adecvat, mobilitatea aproape a `ncetat. Dac\ se `nc\lze[te mediul, mi[carea spermatozoizilor reapare, sperma reg\sindu-[i activitatea [i puterea de fecunda]ie. ~n general, pentru conservarea la acest nivel de temperatur\, se folosesc diluan]i salini pe baz\ de citrat, tartrat de Na [i K sau de lapte ecremat, sau cel mai eficient, diluan]i sintetici `n asocia]ie cu g\lbenu[ul de ou, a c\rei principal\ func]ie este de a proteja spermatozoizii `mpotriva [ocului „a frigore“. Experien]ele [i practica `n domeniu au demonstrat c\ nivelul de temperatur\ de 2-40C poate fi men]inut mai multe zile f\r\ a altera func]iile spermatozoizilor de taur, berbec, ]ap, vier [i arm\sar. La ]ap [i arm\sar se evit\ includerea `n diluant a g\lbenu[ului de ou care este nefavorabil pentru supravie]uirea spermatozoizilor.

55

Pe parcursul conserv\rii, la temperatura de refrigerare, spermatozoidul `mb\trâne[te progresiv, `mb\trânire care se manifest\ printr-o reducere a capacit\]ii fecundante. Astfel, dac\ se consider\ capacitatea fecundant\ c\ este 100 `n primele 24 de ore de conservare, se reduce la circa 80 `n a doua zi, la 65 `n a treia zi [i la 50 `n a patra zi (Parez M.,1969). ~n acest caz, centrele de reproduc]ie sunt obligate s\ re`noiasc\ stocul de sperm\ la 2-3 zile pentru fiecare reproduc\tor, dac\ se dore[te men]inerea unui procent de fecunditate ridicat. Acest mare dezavantaj care const\ `n reaprovizionarea tuturor punctelor de `ns\mân]are artificial\ la fiecare dou\-trei zile, presupune pierderi mari de sperm\, cheltuieli cu transportul [i nu permite realizarea unui plan na]ional de ameliorare. ~n prezent, pentru unele specii, este singurul mod de conservare a spermei. ~n sperma conservat\ prin refrigerare, men]inerea [i prelungirea mobilit\]ii spermatozoizilor se datore[te: - mediului de dilu]ie, care con]ine substan]e nutritive [i protectoare; - reducerii metabolismului spermatozoizilor, datorit\ sc\derii temperaturii `ntre 2oC [i 4oC. Conservarea spermei prin refrigerare prezint\, totu[i, unele avantaje: - permite difuzarea materialului seminal la punctele de `ns\mân]\ri artificiale situate la o oarecare distan]\ fa]\ de unitatea produc\toare; - se pot constitui rezerve de sperm\ pentru dou\-trei zile care pot fi expediate la solicitarea beneficiarilor, `n caz de necesitate; - contribuie la intensivizarea progresului genetic, prin folosirea pe o scar\ mai larg\ a reproduc\torilor valoro[i. Conservarea spermei prin refrigerare prezint\ [i urm\toarele principale dezavantaje: - sperma este conservat\ pe o perioad\ limitat\ de timp (dou\trei zile); - dificult\]i `n asigurarea temperaturii sc\zute pe timpul transportului [i pe durata conserv\rii; - sunt pierderi apreciabile de material seminal, prin `nl\turarea dozelor care nu au fost inoculate `n intervalul de timp de dou\trei zile; - cheltuielile mari cu transportul dozelor, care trebuie s\ se fac\ `n permanen]\ la un interval de dou\-trei zile, pentru toate punctele de `ns\mân]\ri artificiale deservite de centrul respectiv; - consum crescut de energie pentru men]inerea unei temperaturi sc\zute, constante (2-4oC). c).Conservarea spermei prin congelare La temperaturi sub -15oC, modific\rile biologice pe care le sufer\ celulele sexuale mascule `n cursul timpului sunt abolite. Conservarea spermatozoizilor se face cu scopul de a opri metabolismul lor de o manier\ reversibil\, ceea ce permite conservarea acestora pe o durat\ de timp practic indefinit\.

56

~ns\mân]area femelelor cu sperma conservat\ prin congelare reprezint\ un procedeu cu maxim\ eficacitate. Aceast\ tehnic\ se bazeaz\ pe men]inerea sub form\ solid\ a spermei, spermatozoizii fiind adu[i `ntr-o stare de via]\ extrem de `ncetinit\, nivel la care reac]iile chimice sunt aproape inexistente, motiv pentru care conservarea mobilit\]ii [i capacit\]ii fecundante a spermatozoizilor se poate face `n condi]ii optime, timp de zeci sau chiar sute de ani. Spermatozoizii `[i recap\t\ mobilitatea [i capacitatea fecundant\ `n momentul revenirii la temperatura corporal\. ~n acest fel, numeroasele dificult\]i practice pe care le cauzeaz\ prescrierea `ntr-un termen scurt a dozelor cu material seminal refrigerat, sunt anulate. Congelarea spermei prezint\ acest mare avantaj [i este folosit\ aproape `n totalitate la taurine, cu rezultate optime. Agen]ii criogeni sunt reprezenta]i de z\pada carbonic\ ce asigur\ o temperatur\ medie sc\zut\ (-79oC), de aerul lichid (-183oC) [i azotul lichid (-196oC) cu ajutorul c\rora se realizeaz\ temperaturi foarte joase. Cel mai r\spândit agent criogen `n congelarea spermei este azotul lichid (-196oC) care are o mas\ molecular\ de 28,016, la o densitate de 0,8081, un punct de fierbere de -195,8oC, fiind un lichid incolor, transparent, f\r\ miros [i lipsit de toxicitate. Azotul lichid solidific\ la temperatura de -220oC, nu este inflamabil, nu `ntre]ine arderea [i nu prezint\ pericol de explozie. Pentru congelarea spermei la temperaturi foarte joase s-a mai folosit [i aerul lichid, un amestec de oxigen [i azot lichid, care asigur\ o temperatur\ de -183oC, care, `n contact cu impurit\]i organice, prezint\ pericol de explozie, motiv pentru care `n prezent nu se mai folose[te. P\strarea azotului lichid la unit\]ile de producere a materialului seminal, la unit\]ile beneficiare cât [i pe timpul transportului se realizeaz\ `n recipiente speciale numite containere. Dup\ modul de folosire sau destina]ie, containerele pot fi clasificate astfel: - containere de punct, cu capacitatea de 5-35 litri; - containere de stocaj [i transport, cu capacitatea de 35-50 de litri; - containere de depozit (stocaj), cu capacit\]i cuprinse `ntre 100 [i 750 de litri. Containerele sunt confec]ionate din material inoxidabil sau dintrun aliaj special pe baz\ de aluminiu. La marea majoritate a containerelor, construc]ia se realizeaz\ dup\ acelea[i principii tehnice: „vas `n vas“ cu pere]i multipli izolatori `n vid. Pentru p\strarea vidului pe o perioad\ mai mare de timp `ntre ace[ti pere]i este prev\zut cu absorbant [i preparate pe baz\ de hidrogen. Vasul interior este suspendat de cel exterior, (vasul de protec]ie) la nivelul gâtului confec]ionat din sticl\ plastifiat\ `n care se introduce capacul ce p\trunde pe `ntregul orificiu al gâtului de acces `n container (fig 4). Toate tipurile de containere sunt astupate cu dopuri-capac de diferite dimensiuni. Partea din dop care p\trunde pe gura sau gâtul containerului, este confec]ionat\ din material plastic rigid, care nu optureaz\ ie[irea vaporilor de azot, vapori ce rezult\ din fierberea lent\, dar continu\ a azotului lichid.

57

Containerele cu care sunt dotate punctele de `ns\mân]\ri artificiale sunt de capacitate mic\, num\rul de doze ce pot fi depozitate depinzând de forma de ambalare a materialului seminal (fiol\, paiet\, granul\). De regul\, aceste, containere sunt prev\zute cu 6 canistre cilindrice confec]ionate din tabl\ inoxidabil\, aliaj de aluminiu sau din material plastic. Pentru u[urin]a manipul\rii, canistrele sunt prev\zute cu o tij\ a c\rei Fig. 4 Schema interioar\ a containerului extremitate sub form\ de de punct (dup\ Gh. Liciu [i O. Ro[ca, mâner, se sprijin\ `n loca[uri 1998) speciale practicate la gura 1 – dop container; 2 - [an] prin care containerului, loca[uri inscritrece tija canistrei; 3 – capac; 4 – loj\; 5 – c\ma[\ interioar\; 6 – c\ma[\ p]ionate cu cifre de la 1 la 6, extern\; 7 – izola]ie [i vacuum; canistre; pentru identificarea rapid\ a 9 – tij\; 10 – limitator canistre. materialului seminal provenit de la diver[i reproduc\tori. Autonomia containerelor este dat\ de timpul scurs din momentul efectu\rii plinului [i pân\ `n momentul când nivelul azotului lichid (cantitatea m\surat\ `n container) nu mai poate asigura conservarea `n condi]ii bune a materialului seminal depozitat. Autonomia containerului este condi]ionat\ de tipul constructiv, frecven]a manipul\rilor, mod de exploatare [i `ntre]inere etc [i oscileaz\ `ntre 21 [i 180 de zile. Pentru determinarea ritmului zilnic de evaporare a azotului lichid, periodic se efectueaz\ cotarea azotului lichid din container. ~n acest scop se folose[te o tij\ (vergea) confec]ionat\ din lemn de brad, groas\ de circa 6-8 mm [i cu o lungime mai mare cu circa 10 cm decât `n\l]imea containerului, trecut\ prin flac\r\ pentru a c\p\ta o culoare maro `nchis. Tija este marcat\ `n centimetri. Periodic, tija se introduce vertical `n container pân\ când vârful atinge fundul recipientului , se men]ine 4-5 secunde, se scoate afar\, partea care a fost scufundat\ `n azot lichid, brumându-se. Fiecare punct de `ns\mân]\ri artificiale este dotat cu un container `n care se g\sesc dozele de material seminal necesar, repartizat conform planului de potrivire a perechilor, aprovizionarea cu azot lichid f\cându-se de c\tre Oficiile Jude]ene, (actualmente Direc]iile Jude]ene de Ameliorare [i Reproduc]ie `n Zootehnie) la intervale de timp corespunz\toare gradului de autonomie a containerelor, care, de regul\, trebuie s\ fie de acela[i tip pe o anumit\ rut\. Congelarea spermei prezint\ numeroase avantaje: - testarea reproduc\torilor dup\ descenden]i; - exploatarea intensiv\ a celor mai valoro[i reproduc\tori; - depozitarea [i folosirea spermei pentru un interval mare de timp;

58

-

se asigur\ `n permanen]\ sperma necesar\ pentru `ns\mân]area femelelor, la momentul optim, existând `n acest fel posibilitatea form\rii de linii [i familii cu un poten]ial productiv ridicat; - realizarea unor importante economii, prin folosirea ra]ional\, nelimitat\ `n timp, a spermei congelate, comparativ cu sperma conservat\ prin refrigerare; - se poate transporta la puncte de `ns\mân]are situate la distan]e mari, fiind nevoie doar de reaprovizionarea periodic\ cu azot lichid; - se reduc cheltuielile datorate transportului spermei; - se reduce pre]ul de cost pe doza de material seminal; - permite `ns\mân]area femelelor la p\[une, `n taberele de var\ [i `n zonele greu accesibile mijloacelor de transport; - favorizeaz\ schimburile interna]ionale de sperm\. Primele `ncerc\ri de conservare a spermei au fost f\cute `n anul 1949 de Parkes, Smith [i Polge, care, introducând albumin\ Mayer [i glicol `n mediul de dilu]ie au constatat c\ viabilitatea spermatozoizilor din sperma de p\s\ri este men]inut\ la temperatura de -79oC. Stewart (1951) a `ns\mân]at o vac\ cu sperma congelat\ la -79oC [i a ob]inut un produs (I. Dumitrescu [i colab.,1978). ~n anul 1952, Polge [i L.E.A. Rowson au introdus `n mediul de dilu]ie glicerin\ [i au constatat c\ aceast\ substan]\ are rolul de a proteja, la temperaturi foarte sc\zute, spermatozoizii. Succesul acestei realiz\ri a fost comunicat de Polge [i colab. `n 1952, la al II-lea Congres Interna]ional de Reproduc]ie de la Copenhaga. Schema congel\rii spermei propus\ de Polge [i colab. `n anul 1952, ast\zi este mult simplificat\, fiind p\strate totu[i acelea[i principii: - congelarea cu un diluant cu glicerol; - sc\derea rapid\ a temperaturii pân\ la -196oC; - men]inerea spermei congelate la aceast\ temperatur\ (-196oC), pân\ `n momentul folosirii; - decongelarea spermei, `n vederea inocul\rii, se face prin imersiunea brusc\ a dozei `ntr-o baie la 320C, chiar `n momentul `ntrebuin]\rii. Pân\ `n 1964, metoda congel\rii spermei nu a suferit decât mici modific\ri cu privire la compozi]ia diluantului, cronologia diferitelor opera]iuni [i viteza de r\cire. Erau atunci propuse dou\ solu]ii: congelarea `n fiole de sticl\ de 1-2 ml, congelarea `n paiete cu capacitatea de 1,0, 0,5 [i 0,25 ml, ultimul tip de ambalaj fiind propus de R. Cassou. Extrema simplicitate, rapiditate [i rezultatele foarte favorabile oferite de aceast\ metod\ au condus la introducerea congel\rii spermei `n paiete din material plastic de c\tre numeroase ]\ri, fiind adoptat\ congelarea spermei `n azot lichid la temperatura de -196oC, mai u[or de ob]inut [i mai eficace decât temperatura de -79oC, asigurat\ de z\pada carbonic\, folosit\ pân\ atunci. ~n 1964, comunic\rile lui Nagase [i Niva au repus `n discu]ie congelarea spermei, nu `n ceea ce prive[te folosirea spermei congelate

59

ale c\rei avantaje erau confirmate, ci `n ceea ce prive[te peg\tirea [i prezentarea dozelor. Principiile acestei tehnici japoneze sunt: - folosirea diluan]ilor pe baz\ de glucoz\ [i fructoz\, u[or glicerola]i (5%); - congelarea spermei diluat\ `ntr-un raport strâns (1/3-1/4); - congelarea rapid\ prin simpla depunere de pic\turi de sperm\ cu volum redus (0,1-0,2 ml) pe un bloc de ghea]\ carbonic\ (-79oC); - rediluarea `n momentul decongel\rii `ntr-o simpl\ solu]ie fiziologic\ de diluant. Aceast\ metod\ de congelare este cunoscut\ sub numele de congelare `n pastile sau pilule [i a fost adoptat\ `n multe ]\ri, datorit\ rezultatelor bune ob]inute prin folosirea ei. Ambalarea spermei `n paiete mijlocii [i mici [i `n pastile constituie acele metode care, prin avantajele lor, au asigurat o folosire u[oar\ a spermei congelate. Aceste dou\ metode conduc la ob]inerea unor rezultate asem\n\toare favorizând extinderea lor `n toate ]\rile dezvoltate [i `n curs de dezvoltare. O bun\ selec]ie a animalelor presupune u[urin]a `n manipularea [i identificarea spermei [i siguran]\ deplin\ `n ceea ce prive[te necontaminarea. Aceste trei condi]ii sunt reversul p\r]ii avantajoase a congel\rii spermei sub aspect economic, dat de absen]a ambalajului pentru sperma conservat\ `n pastile. De aceea au fost necesare unele solu]ii privind neamestecul spermei provenit\ de la reproduc\tori diferi]i, stocat\ `n acelea[i containere. Pentru a `nl\tura lipsa de identificare a fiec\rei doze `n parte, granulele cu sperm\ sunt capsulate `n gelatin\, folii de aluminiu, `mpachetate `n folii de material plastic sau introduse `n tuburi de ambalaj, tip past\ de din]i. Numai `n aceste condi]ii de conservare a spermei, `ns\mân]area artificial\ dispune de metodele cele mai sigure [i cele mai riguroase din punct de vedere al protec]iei sanitare, cele mai obiective din punct de vedere al selec]iei genetice, cele mai economice din punct de vedere al difuz\rii `n teren. Satisf\când aceste cerin]e, congelarea a devenit `ntradev\r un auxiliar pre]ios al selec]iei, permi]ând stocarea de sperm\ provenit\ de la reproduc\tori tineri, pân\ când se pot cunoa[te aptitudinile descendentului. Rolul substan]elor crioprotectoare Prezen]a glicerinei `n mediul de dilu]ie a spermei, creeaz\ condi]iile congel\rii spermei, f\r\ modific\ri majore, care s\ afecteze viabilitatea [i capacitatea fecundant\ a spermatozoizilor. Prin introducerea glicerinei `n diluant, punctul de congelare a spermei coboar\ de la 0,53oC la -3oC, iar formarea cristalelor de ghea]\ are loc la -10oC, comparativ cu 1,7oC `n sperma brut\. Când `ncepe formarea cristalelor de ghea]\, temperatura tinde c\tre punctul real de congelare, care se men]ine pân\ când congelarea devine complet\. ~n acel moment se stabile[te un echilibru `ntre sperm\ [i agentul de r\cire. O propor]ie de circa 7% glicerin\ `n lichidul de dilu]ie, determin\ coborârea punctului de congelare pân\ la -3oC, iar punctul de formare al cristalelor de ghea]\ la -10oC. Când se congeleaz\ sperma `ntr-un mediu lichid, cristalizarea

60

`ncepe `n acea parte a lichidului care este cea mai apropiat\ de agentul de r\cire [i se continu\ `n masa lichidului (Dumitrescu I. [i colab., 1978). Când coborârea se face `ncet, cristalizarea se desf\[oar\ lent, cristalele care se formeaz\ sunt mari, ceea ce antreneaz\ o cre[tere a concentra]iei `n s\ruri a frac]iunii necristalizate [i provoac\ ie[irea unei p\r]i din apa intracelular\, diminuând astfel formarea ghe]ii intracelulare. ~n cazul `n care coborârea temperaturii se face `ntr-un ritm rapid, cristalele de ghea]\ care se formeaz\ sunt mici, rezultând o substan]\ destul de omogen\, `n care cristalele sunt constituite numai din ap\, fapt ce determin\ o concentra]ie de electroli]i crescut\, atât intra- cât [i extracelular. ~n aceast\ situa]ie apa intracelular\ nu poate ie[i `n cantitate suficient\, cristalele de ghea]\ se formeaz\ `n cantitate crescut\ intracelular, iar aceste cristale `[i vor m\ri volumul `n momentul congel\rii [i decongel\rii, fapt care conduce la alterarea structurii spermatozoizilor. La un moment dat, aceast\ concentra]ie `n s\ruri este atât de ridicat\ `ncât lipoproteinele din structura spermatozoidului devin solubile, iar `n timpul decongel\rii permeabilitatea celular\ se altereaz\ `n a[a m\sur\ `ncât spermatozoidul moare. Acest efect se eviden]iaz\ `n reducerea cu circa 50% a propor]iei de spermatozoizi vii din sperma decongelat\, astfel mobilitatea spermatozoizilor se reduce de la 70-80% `nainte de congelare, la 30-40% dup\ decongelare. ~n concluzie, compu[ii hidrofili reprezenta]i de diver[i polialcooli, (glicerol), p\trund u[or `n celula seminal\ prin simpla osmoz\, `ntârziind formarea cristalelor de ghea]\, prin coborârea punctului de congelare. Pe de alt\ parte, glicerina limiteaz\ efectele solu]iei, `nlocuind o parte din apa intracelular\, atras\ de cre[terea presiunii osmotice extracelulare. Al]i compu[i pot avea rol protector fa]\ de membranele celulare (hidra]ii de carbon, polivinil, pirolidon etc). 1.7.1. Conservarea spermei de taur

A) Conservarea spermei la temperatura ambiant\ (laborator) La temperatura camerei (laboratorului) sperma de taur se poate conserva pentru o perioad\ scurt\ de timp (3-6 ore) [i pentru o perioad\ mai `ndelungat\ (3-4 zile). Conservarea de scurt\ durat\ se poate face fie sub form\ brut\, fie sub form\ diluat\. Sperma brut\ s-a folosit `n perioada de `nceput a introducerii `ns\mân]\rilor artificiale [i const\ `n inocularea imediat dup\ recoltare a spermei, frac]ionat\ `n mai multe doze, `n condi]ii de asepsie. Sporadic se mai aplic\ [i ast\zi `n unele locuri mai izolate [i lipsite de condi]ii adecvate examin\rii, prelucr\rii [i conserv\rii spermei. Folosirea pentru `ns\mân]area artificial\ a femelelor `n c\lduri a spermei brute este neeconomic\. Sperma diluat\, p\strat\ la temperatura camerei, se poate folosi la `ns\mân]are artificial\ `ntr-un interval de maxim 6-8 ore. Conservarea pentru o perioad\ mai `ndelungat\ a fost consemnat\ sub numele de anabioz\ acid\ (anabiosis = `nviere, revenire la via]\).

61

Diluantul preparat, se barboteaz\ timp de circa 10 minute cu un curent de CO2, `n prealabil purificat prin trecerea succesiv\ printr-o solu]ie de bicarbonat de sodiu 15% [i de permanganat de potasiu 3%, pân\ când pH-ul ajunge la 6,2-6,3. Acidifierea mediului se datoreaz\ form\rii acidului carbonic: CO2+H2=H2CO3. Se dilueaz\ sperma care se p\streaz\ `n ambalaje `nchise ermetic la temperatura de18-20oC, timp de 3-4 zile. Datorit\ dezavantajelor pe care le prezint\, aceast\ metod\ de conservare a spermei nu se mai aplic\ la taur. B) Conservarea spermei de taur prin refrigerare (2-4oC) Aceast\ tehnic\ a fost folosit\ `n perioada anilor ’50-’70, la taur, cu rezultate satisf\c\toare, nivelul sc\zut de temperatur\ fiind asigurat fie de z\pada hidric\, fie `n refrigeratoarele obi[nuite. Tennica de conservare a spermei de taur prin refrigerare este suficient de simpl\. Dup\ efectuarea dilu]iei finale, cu ajutorul unei seringi semiautomate, sperma se repartizeaz\, câte 1 ml, `n fiole cu capacitatea de 1,5-2,0 ml care se `nchid la flac\r\ oxiacetilenic\. Fiolele se grupeaz\ pe tije port-fiole, sau `n recipiente din material plastic, pe ejaculate, care se introduc la frigider `n vederea echilibr\rii. Dup\ 3-4 ore se pot folosi la `ns\mân]area artificial\ a femelelor `n c\lduri, iar pentru transport se folosesc fie frigidere tip, auto, fie termosuri zootehnice, `n care se g\se[te ghea]\ hidric\, ce trebuie s\ `nconjoare din toate p\r]ile dozele de sperm\. La punctele de `ns\mân]\ri artificiale, dozele cu sperm\ se transfer\ `n frigidere, care obligatoriu se g\sesc `n dotarea fiec\rui punct de `ns\mân]are la aceast\ specie. Expedierea dozelor cu material seminal se face `mpreun\ cu un buletin [i fi[\ de utilizare. C) Conservarea spermei de taur prin congelare Cronologic vorbind, congelarea spermei de taur s-a f\cut `n dou\ variante, dup\ ritmul `n care se trece peste punctul crioscopic: lent\ [i rapid\. Congelarea lent\ s-a f\cut la `nceput [i se caracterizeaz\ printr-o coborâre lent\ a temperaturii spermei, `n special de la 35-37oC la -30oC. Fiolele cu sperm\ se introduc `ntr-o baie de alcool etilic, plasat\, la rândul ei, la o temperatur\ de 2-4oC. ~n baia de alcool se ad\ugau la `nceput cantit\]i predeterminate de z\pad\ carbonic\ `n scopul reducerii temperaturii dup\ un anumit ritm. Astfel, r\cirea spermei `ntre 5oC [i 15oC se f\cea cu un grad pe minut, iar de la -15oC la -30oC, sc\derea temperaturii se f\cea cu dou\ grade pe minut. De la -30oC pân\ la -79oC sau -196oC (func]ie de agentul criogen `ntrebuin]at) trecerea fiolelor cu sperm\ se f\cea brusc. ~n prezent sunt aparate moderne, numite frizere, care `n func]ie de program, asigur\ un control electronic al ritmului coborârii temperaturii. ~n momentul de fa]\ aceast\ metod\ nu se mai folose[te datorit\ dezavantajelor pe care le prezint\. Congelarea rapid\ a spermei este folosit\ `n exclusivitate `n prezent, fiind r\spândit\ `n cvasitotalitatea ]\rilor dezvoltate economic [i `n curs de dezvoltare. ~n func]ie de repartizarea `n doze, congelarea rapid\ se poate face `n fiole, paiete [i granule. a) Congelarea spermei `n fiole s-a practicat la `nceputul folosirii spermei congelate de taur [i constituie un procedeu care se mai folose[te

62

cu rezultate bune. Fiolele sunt fabricate din sticl\ neutr\, rezistent\ la varia]ii foarte mari de temperatur\, iar pe corpul lor se imprim\ datele necesare identific\rii reproduc\torului sau codific\rii necesare `n practica de reproduc]ie. Volumul util al materialului seminal diluat este de 1 ml, rezervându-se un spa]iu de dilatare a lichidului `n timpul congel\rii. Acest spa]iu are rolul de a evita, dup\ decongelare, pierderea de material seminal prin refulare `n momentul introducerii `n fiol\ a pipetei de `ns\mân]are. Congelarea spermei Dup\ dilu]ia final\ a spermei se calculeaz\ necesarul de fiole pentru fiecare ejaculat `n parte. Cu ajutorul unei ma[ini automate, fiolele sunt individualizate cu toate datele necesare: numele, ini]iala sau codul laboratorului `n care se produce materialul seminal congelat, numele sau num\rul matricol al taurului, rasa acestuia, data congel\rii. Cu ajutorul unui dispozitiv automat sau a unei seringi semiautomate, sperma se repartizeaz\, câte 1ml, `n fiecare fiol\. Fiolele se `nchid la flac\r\ oxiacetilenic\, apoi se fixeaz\ `n tije port-fiole, confec]ionate din aluminiu, fiecare tij\ fiind prev\zut\ cu câte 6 loca[uri. Tijele se grupeaz\ pe ejaculate apoi se introduc `ntr-un refrigerator, `n vederea ehilibr\rii, unde se men]in 3-4 ore, func]ie de specificul fiec\rei unit\]i produc\toare. ~n acest interval de timp, spermatozoizii se adapteaz\ cu diluantul folosit [i noul nivel de temperatur\, iar antibioticele incluse `n diluant `[i fac efectul specific. Dup\ echilibrare, tijele port-fiole se introduc `n plan orizontal, `n vapori de azot lichid, care se formeaz\ deasupra azotului lichid stocat `ntr-un container cu gura larg\. La circa 3 cm sub nivelul azotului se g\se[te o sit\ confec]ionat\ din sârm\ cu ochiurile mici sau dintr-un capac prev\zut pe toat\ suprafa]a cu orificii. Pe acest capac grilant se a[az\ tijele port-fiole, vaporii de azot lichid având o temperatur\ de -120oC pân\ la -130oC, unde se men]in 8-10 minute, opera]iunea fiind denumit\ precongelare. Dup\ acest interval de timp, tijele port-fiole, grupate pe ejaculate, se introduc `n canistre metalice, având forma unui cilindru cu fundul grilat, prev\zut cu o tij\ terminat\ la cap\t sub forma unui mâner, prin intermediul c\reia canistrele se fixeaz\ la gura containerului, containerul fiind umplut cu azot lichid. ~n aceste containere numite de prestocaj, dozele se men]in pân\ a doua zi, când calitatea materialului seminal este verificat\. Pentru aprecierea calit\]ii acestuia, din fiecare ejaculat se prelev\ dou\-trei fiole, acestea se decongeleaz\ rapid `ntr-un vas cu ap\ cald\ la 37-38oC, se deschid [i se examineaz\ mobilitatea la microscopul prev\zut cu platin\ `nc\lzit\. Dac\ mobilitatea spermatozoizilor este mai mic\ de 30%, toate dozele ejaculatului `n cauz\ se arunc\. Dac\ mobilitatea spermatozoizilor este de cel pu]in 30%, tijele port-fiole se transfer\ `n containere depozit, cu capacitate de 200-500 l, unde se p\streaz\, `n azot lichid, pân\ `n momentul livr\rii c\tre diver[ii beneficiari. Ambalarea spermei `n fiole prezint\ trei dezavantaje majore: pot exploda `n timpul decongel\rii (mai ales fiolele prev\zute cu fisuri aproape imperceptibile), ocup\ un spa]iu de depozitare prea mare,

63

necesit\ o tehnologie de umplere cu o productivitate mai sc\zut\. Din aceste motive, congelarea spermei `n fiole este, `n prezent, abandonat\ `n aproape toate ]\rile. b) Congelarea spermei de taur `n paiete A fost elaborat\ `n anul 1965 de c\tre R. Cassou, `n Fran]a [i constituie una dintre cele mai moderne [i practice forme de ambalare a materialului diluat, care confer\ eficacitate [i productivitate sporite. Paieta este confec]ionat\ din clorur\ de polivinil care nu reac]ioneaz\ chimic cu mediul de dilu]ie. Paieta are forma unui tub cilindric [i este confec]ionat\ `n dou\ variante: - paieta mijlocie, cu lungimea de 133 mm, diametrul de 2,5-2,8 mm, grosimea paietei de 0,14-0,20 mm [i volumul util de 0,54 ml; - paieta fin\, cu lungimea de 133 mm, diametrul de 1,7-2,0 mm [i un volum util de 0,25 ml. Indiferent de tip, paietele au un cap\t deschis, iar cel\lalt astupat cu un dop „uzinal“ constituit din dou\ straturi de bumbac `ntre care s-a pus un strat de pudr\ polivinilic\ preparat\ cu alcool. Lungimea paietelor este aceea[i (133 mm) [i `ntrucât `n timpul umplerii se las\ o bul\ de aer de 10 mm lungime, lungimea coloanei de sperm\ este de 103 mm. Pudra de alcool polivinilic, `n contact cu un lichid polimerizeaz\ [i se transform\ `ntr-un gel care obtureaz\ complet lumenul, ceea ce-i confer\ garan]ia unei protec]ii absolute a spermei congelate fa]\ de germenii florei banale sau patogene prezente eventual `n containerul de depozitare. Pentru imprimarea paietelor se folose[te o ma[in\ semiautomat\, prev\zut\ cu un bloc compostor [i un set de litere [i cifre (foto 13). Imprimarea se face cu cerneal\ special\, rezistent\ la azot lichid [i cu uscare rapid\. Se folose[te cerneal\ de diferite culori `n func]ie de culoarea paietelor care urmeaz\ a fi imprimate, astfel `ncât, contrastul s\ fie cât Foto 13 Ma[in\ semiautomat\ mai evident. Pe fiecare paiet\ Pentru imprimarea paietelor se imprim\ datele necesare pentru identificarea exact\ a probei de sperm\ congelat\, `ntocmai ca pentru fiole. Dup\ umplere, cap\tul deschis al paietelor se astup\ cu pudr\ de alcool polivinilic (dop de laborator) (foto 14) sau se `nchide prin sudarea cu ultrasunete. La ambele tipuri de paiete, se asigur\ o bul\ de aer cu o lungime de circa 10 Foto 14 Vitrin\ pentru `nchiderea mm, absolut necesar\ pentru a paietelor cu pudr\ de alcool polivinilic

64

compensa dilatarea coloanei de material seminal `n timpul congel\rii [i pentru a favoriza omogenizarea coloanei de sperm\ dup\ decongelare. Tehnica de congelare a spermei `n paiete Dup\ efectuarea dilu]iei spermei, conform raportului final de dilu]ie, se calculeaz\ necesarul de paiete, care se imprim\ cu ajutorul ma[inii semiautomate. Frac]ionarea ejaculatului `n doze de `ns\mân]are se face, de regul\, la temperatura de 2-4oC, manual sau automat. • Umplerea manual\ a paietelor. Paietele, imprimate [i uscate se prind `n br\]\ri metalice c\ptu[ite cu cauciuc striat, dimensionate s\ cuprind\ exact 15 paiete mijlocii. Sperma este aspirat\ `n paiete cu ajutorul unei pompe de vid cu presiunea coloanei de mercur de 30-50 cm. La cordonul de cauciuc al pompei de vid se racordeaz\ un pieptene de aspirare prev\zut cu 15 locuri, corespunz\toare num\rului de paiete prinse `n br\]ar\. La pieptenele de aspirare se ata[eaz\ br\]ara cu paiete, astfel `ncât, prinderea acestora s\ se fac\ cu cap\tul prev\zut cu dopul uzinal. La partea superioar\ a pieptenului se g\se[te un orificiu de admisie a aerului care se obtureaz\ cu degetul atunci când paietele sunt introduse cu cap\tul deschis `n sperm\. Umplerea paietelor se face complet, f\r\ a se l\sa bula de aer. Dup\ umplere, paietele se scutur\ energic, ceea ce `ndep\rteaz\ surplusul de sperm\ pe o lungime de circa 10 mm. ~nchiderea paietelor se face prin ap\sarea lor cu cap\tul deschis `ntr-un vas care con]ine pudr\ de alcool polivinilic. Pudra p\trunde pe lumenul paietelor, astupându-l. Apoi, paietele se introduc cu cap\tul astupat de pudra de alcool polivinilic `ntr-un recipient cu ap\ distilat\, astfel `ncât pudra polimerizeaz\ [i astup\ complet [i acest cap\t al paietei. ~n acest fel, coloana de sperm\ este izolat\ etan[ de mediul exterior, protejând-o de eventualele contamin\ri. Paietele se desprind din br\]ara metalic\, se [terg cu un prosop uscat, apoi se a[az\ pe ni[te rame metalice speciale, cu capacitatea de 40-100 de paiete. Stativele cu paietele respective se introduc pentru echilibrare `ntr-un dulap frigorific, la temperatura de 2-4oC, unde se men]in circa 3-4 ore (foto 15). Dup\ echilibrare, ramele cu paiete se introduc `n vapori de azot lichid pentru precongelare, unde sunt men]inute 7-8 minute (foto 16). Apoi se adun\, se introduc `n ni[te pahare din material plastic cu dimensiuni corespunz\toare cani-strelor, numite goblete, acestea se introduc etajat `n canistre, care la rândul lor, se scufund\ `n azot lichid `n Foto 15 Echilibrarea spermei containerele de prestocaj (foto 17). `ntr-o vitrin\ frigorific\

Verificarea materialului seminal [i depozitarea paietelor cu sperm\ se fac `ntocmai ca `n cazul fiolelor (foto18, 19 si 20).

65

Foto 16 Precongelarea spermei `n vapori de azot lichid

Foto 18 Verificarea calit\]ii materialului seminal din containerele de prestocaj

Foto 17 Containere de prestocaj

Foto 19 Depozitarea dozelor cu sperma

O variant\ `mbun\t\]it\ a umplerii manuale a paietelor este reprezentat\ de umplerea sub clopot de vid. Paietele sunt `nchise ermetic pri sudare cu ultrasunete la unul din capete. Sunt apoi individualizate cu toate datele necesare. Se calculeaz\ strict necesarul de paiete, func]ie de capacitatea acestora [i de volumul total de sperm\ diluat\. Cu cap\tul deschis, paietele se introduc `n paharul cu sperm\ diluat\. La rândul lui, paharul se plaseaz\ sub un clopot Foto 20 Diferite tipuri de containere pentru depozitarea de vid. Se porne[te pompa de vacuum `n vederea scoaterii aerului dozelor cu sperm\ din paiete, (aspect ce se verific\ echinivelmetric cu ajutorul unei paiete introdus\ `ntr-un pahar cu lichid colorat). Apoi se d\ drumul la aer, care, datorit\ presiunii `mpinge sperma `n paiete (foto 21). Paietele se `nchid la cap\tul liber cu ajutorul pulberii de alcool polivinilic. Urm\toarele etape ale congel\rii Foto 21 Umplerea paietelor sub un sunt asem\n\toare celor men]ionate clopot de vid mai sus. Folosirea acestei metode

66

impune efectuarea unui calcul precis al necesarului de paiete pentru fiecare ejaculat. ~n caz contrar, fie c\ paietele nu se umplu, fie c\ r\mâne material seminal neabsorbit `n paiete. • Umplerea automat\ a paietelor se face cu ajutorul unor ma[ini semiautomate a c\ror productivitate se situeaz\ la un nivel de 400013000 paiete pe or\. Paietele imprimate cu toate datele necesare, sunt a[ezate pe un rastel adaptat la conveiorul ma[inii care transport\ paietele pân\ `n dreptul orificiilor de umplere. La acest nivel se g\sesc ni[te ace (1-3) racordate prin tuburi de material plastic de unic\ folosin]\, la recipientul cu sperm\, iar pe partea opus\ exist\ acela[i num\r de ace, mai scurte, racordate la o pomp\ de vid [i care las\ liber spa]iul necesar bulei de aer. Dup\ umplere, paietele trec pe rând prin dreptul unui emi]\tor (Bronson) de ultrasunete, cu ac]ionare vertical\, care `nchide etan[ cap\tul paietelor. Pentru `nchiderea paietelor se mai pot folosi bile mici, metalice sau din material plastic care se introduc for]at pe lumenul acestora, `nchizându-se etan[. Echilibrarea, precongelarea, congelarea, verificarea materialului seminal [i stocarea sunt urm\toarele etape ale congel\rii identice celor men]ionate la umplerea manual\. Ambalarea spermei `n paiete prezint\ avantajele: - permite o bun\ individualizare a dozelor; - se evit\ contaminarea spermei cu flora microbian\ existent\ `n azotul lichid; - permite folosirea economic\ a containerului (maxim de doze `n minim de spa]iu), aplicabil mai ales `n cazul ambal\rii spermei `n paiete fine; - necesit\ o tehnic\ de conservare [i inoculare a spermei, simpl\. c) Congelarea spermei `n granule (pastile) A fost propus\ [i experimentat\ de Nagase [i Niva, `n anul 1964 [i reprezint\ singura form\ concentrat\ sub care se conserv\ materialul seminal, `n contact direct cu agentul criogen (azotul lichid). Se bazeaz\ pe congelarea ultrarapid\ a spermei diluate `ntr-un raport de dilu]ie strâns, `n alveolele unui bloc de ghea]\ carbonic\, rezultând granule de sperm\ congelate, cu volum de circa 0,1 ml. Diluantul cel mai frecvent folosit este compus din 75 ml solu]ie de lactoz\ 11% `n ap\ bidistilat\, g\lbenu[ de ou 20 ml [i glicerin\ 4,7 ml. Sperma se dilueaz\ `ntr-un raport de 1/2-1/4, apoi este l\sat\ s\ se r\ceasc\ pe parcursul a 90 de minute la temperatura de 1-3oC. Echilibrarea spermei se face `n frigider, timp de 4-5 ore. Materialul seminal diluat se depune, cu ajutorul unei seringi semiautomate, câte 0,1ml, `n alveolele practicate `n ni[te blocuri de z\pad\ carbonic\, la temperatura de -79oC. Fiecare doz\ granulat\ va cuprinde num\rul de spermatozoizi prestabilit prin aplicarea gradului de dilu]ie `n raport cu volumul granulei. Placa de z\pad\ carbonic\ se acoper\ imediat cu vat\ steril\ [i se las\ circa 7 minute, timp necesar congel\rii spermei sub form\ de pastile. La expirarea timpului de congelare, granulele sunt scuturate de pe placa

67

de z\pad\ carbonic\ (sunt suflate cu un curent de aer) [i colectate `ntr-un recipient cu azot lichid. Granulele care provin de la acela[i reproduc\tor, se ambaleaz\ `mpreun\ `n recipien]i din material plastic, pe care sunt trecute toate datele necesare identific\rii, apoi se a[az\ suprapus, pe o tij\ care se suspend\ `n azot lichid. Se depoziteaz\ numai granulele provenite din probe care dup\ decongelare prezint\ cel pu]in 30% mobilitate [i con]in cel pu]in 10 milioane de spermatozoizi vii cu mi[c\ri rectilinii/doz\. Recipien]ii au o capacitate de 50-100 de granule. Acest procedeu de ambalare a materialului seminal are [i unele dezavantaje legate de imposibilitatea individualiz\rii sigure a granulelor [i a existen]ei riscului de contaminare cu agen]i microbieni proveni]i din azotul lichid `n timpul conserv\rii. 1.7.2. Conservarea spermei de berbec [i ]ap

La ovine [i caprine se poate folosi cu bune rezultate pentru `ns\mân]are sperma brut\ frac]ionat\ `n mai multe doze (circa 10/ejaculat). ~n acest caz, `ns\mân]area femelelor trebuie s\ se fac\ imediat dup\ colectarea spermei care nu se mai dilueaz\. Metoda d\ bune rezultate `n ceea ce prive[te procentul de fecunditate al femelelor `ns\mân]ate. Sperma de berbec se conserv\ sub form\ lichid\ sau solid\, asem\n\tor spermei de taur, `ns\ rezultatele ob]inute, prin `ns\mân]area femelelor cu sperm\ congelat\, sunt mult mai slabe decât la taurine. Conservarea spermei sub form\ lichid\ este destul de r\spândit\, rezultatele ob]inute fiind bune. Temperatura de conservare a spermei diluate este de +15oC (Baril [i colab.,1993) sau la 2-4oC. ~n cazul conserv\rii spermei la aceste niveluri de temperatur\, sperma diluat\ se repartizeaz\ `n fiole (1 ml), `n flacoane sau `n paiete. Pe timpul efectu\rii controlului [i dilu\rii spermei, coborârea temperaturii trebuie s\ se fac\ progresiv `ntre +32oC [i +15oC, deoarece spermatozoizii sunt foarte sensibili la [ocul termic, motiv pentru care trebuie evitate fluctua]iile rapide ale nivelului de temperatur\. ~nchiderea fiolelor se face la flac\r\ oxiacetilenic\, la fel ca la prelucrarea materialului seminal de taurine. ~n cazul `n care se folosesc flacoanele de antibiotice, `n fiecare flacon se introduce un ejaculat, apoi flaconul se `nchide ermetic. Conservarea [i transportul materialului seminal ambalat `n fiole [i flacoane se fac ca la taur, iar distribuirea la fiecare punct de `ns\mân]are se face la interval de dou\ zile. Sperma conservat\ `n stare lichid\ poate fi ambalat\ [i `n paiete. Dup\ omogenizarea spermei diluate, umplerea paietelor se face fie manual, fie semiautomat (dac\ num\rul de doze este mare), fie prin simpla aspirare bucal\ prin traversul dopului uzinal care permite trecerea aerului. Dup\ contactul cu lichidul spermatic, dopul de polivinil formeaz\ o barier\ etan[\ care evit\ pierderile. Cel\lalt cap\t al paietei se obtureaz\ cu pudr\ de alcool polivinilic. Dup\ trecerea printr-un pahar cu ap\ [i [tergerea paietelor cu un prosop curat, acestea se p\streaz\ la termostat reglat fie la +15oC, fie la 2-4oC. ~n cazul conserv\rii spermei la

68

temperatura de +15oC, sperma trebuie s\ fie inoculat\ la intervalul a maximum 8-10 ore de la recoltare, dincolo de acest interval, capacitatea fecundant\ a spermei scade pân\ la un nivel de 34%, 17% `n ziua a 2-a [i a 3-a de la recoltare (Baril G. [i colab., 1993). Congelarea spermei de berbec pân\ `n prezent nu a dat rezultate mul]umitoare, datorit\ faptului c\ nivelul de fecunditate este mai sc\zut cu 20% fa]\ de folosirea spermei brute, num\rul de spermatozoizi necesari este foarte mare, iar tehnica procesului de congelare este costisitoare [i complicat\. ~n prezent [i `n viitor se preconizeaz\ folosirea spermei congelate de berbec prin `ns\mân]area artificial\ intrauterin\, ceea ce permite depunerea spermatozoizilor direct `n uter prin endoscopie. Când sperma se conserv\ prin congelare, trebuie s\ se efectueze diverse opera]ii succesive `ntre colectarea [i conservarea acesteia: dilu]ia, reducerea temperaturii, repartizarea `n paiete sau granule. Dup\ dilu]ia final\ a spermei, calculându-se un nivel de 4% glicerin\, temperatura se reduce progresiv pân\ la 4oC, temperatur\ la care condi]ionarea se face `n paiete [i practic `ncepe procesul de congelare a spermei. Imediat dup\ recoltare, se face dilu]ia ini]ial\ `n raport de 1/1 la temperatura de 28-30oC, care apoi se plaseaz\ `n partea de jos a unui refrigerator (6oC). Dup\ 30 de minute, temperatura spermei scade pân\ la 13-15oC [i dup\ circa dou\ ore ajunge la +6oC. ~n acest stadiu, sperma se scoate din vasul cu ap\ [i se plaseaz\ direct `n refrigerator sau camera frigorific\, apoi la +4oC se adaug\ diluantul cu glicerin\, astfel `ncât, `n final, concentra]ia acesteia s\ fie de 4% (G. Baril [i colab., 1993). Repartizarea spermei `n paiete mijlocii (0,5 ml) se poate face manual, semiautomat sau chiar prin simpla aspirare bucal\. Dup\ `nchiderea paietelor [i echilibrarea spermei, congelarea se poate realiza fie folosind o ma[in\ automat\, fie men]inând paietele circa 8 minute la 20 cm deasupra nivelului azotului lichid, `n vaporii acestuia (-75oC) apoi prin imersarea direct\ `n azot lichid. Congelarea spermei `n pastile s-a dezvoltat `n Australia printr-un procedeu asem\n\tor congel\rii spermei de taur. Dup\ dilu]ia final\ a spermei, se coboar\ temperatura acesteia pân\ la un nivel de +4oC (asem\n\tor celor mai sus precizate), apoi, pic\turi de 0,1-0,2 ml de sperm\ la +4oC sunt depuse direct `n alveolele practicate pe blocul de z\pad\ carbonic\ (-79oC). Dup\ 3-4 minute, pastilele sunt colectate, introduse `ntrun recipient de plastic [i apoi se scufund\ direct `n azot lichid. La caprine, existen]a enzimelor `n plasma seminal\, care ac]ioneaz\ asupra fosfolipidelor din diluant, cu liberarea de compu[i toxici pentru spermatozoizi, antreneaz\ etape diferite de conservare a spermei, comparativ cu ovinele. La ]ap, este recomandat de a se separa plasma seminal\ cât mai repede posibil dup\ recoltare. Pentru folosirea spermei proaspete, dilu]ia direct\ a ejaculatului `ntr-un diluant pe baz\ de lapte ecremat de vac\ este posibil\, `ns\ se interzice prezen]a g\lbenu[ului de ou `n mediul de dilu]ie. Dac\ diluantul con]ine g\lbenu[ de ou este absolut necesar s\ se fac\ sp\larea spermei `nainte de dilu]ie.

69

„Sp\larea“ spermei de ]ap se face prin folosirea unei solu]ii Krebs-Ringer-Fosfate (solu]ie de sp\lare) care con]ine glucoz\, apoi se centrifugheaz\ amestecul pentru a elimina plasma seminal\. Sunt posibile dou\ sp\l\ri succesive. Etapele acestui procedeu sunt: - prepararea solu]iei de sp\lare, `naintea recolt\rii; - `n momentul colect\rii ejaculatului, acesta se dilueaz\ cu solu]ia de sp\lare, astfel `ncât s\ se ob]in\ o concentra]ie de 400X106 spermatozoizi/ml `n suspensia de centrifugat. Paharul colector se introduce `ntr-o centrifug\, timp de 15 minute, cu o accelera]ie de 500-600 g. Supernatantul este eliminat cu o pipet\ [i un nou volum, identic de solu]ie de sp\lare, este ad\ugat\, dup\ care se centrifugheaz\ iar 15 minute. Supernatantul se elimin\ din nou [i spermatozoizii sunt dilua]i `n volumul calculat de diluant constituit din lapte de vac\ ecremat. Sperma diluat\ astfel poate fi folosit\ sub form\ lichid\ sau solid\. Reducerea temperaturii se face astfel: dup\ recoltare, paharul colector se plaseaz\ `ntr-o baie-marie la 28-30oC, imediat ad\ugându-se solu]ia de sp\lare; centrifugare 15 minute, eliminarea supernatantului, ad\ugarea celei de-a doua solu]ii de sp\lare [i iar\[i centrifugare timp de 15 minute. ~n cazul conserv\rii spermei sub form\ lichid\, dup\ circa 35-40 de minute de la recoltare, urmat\ de cele dou\ sp\l\ri, se face dilu]ia final\ la 20oC. Se omogenizeaz\, apoi paharul cu sperm\ se introduce `ntr-un vas plin cu ap\ (20oC) `n refrigerator (+6oC). Dup\ circa 65 de minute, sperma se condi]ioneaz\ `n paiete ca [i sperma de berbec, `ns\ trebuie s\ fie `ntrebuin]at\ `n primele 8 ore de la recoltare, ceea ce limiteaz\ conservarea spermei de ]ap prin refrigerare la 13-15oC. ~n cazul congel\rii spermei de ]ap, dup\ a doua sp\lare [i dou\ ore de la recoltare se adaug\ prima parte a diluantului glicerol (+4oC), dup\ 10 minute se adaug\ a doua parte a diluantului glicerol, iar dup\ alte 10 minute se adaug\ [i a treia parte a diluantului glicerol tot la temperatura de +4oC. Dup\ 30 de minute, sperma se condi]ioneaz\ `n paiete de 0,25 ml, se precongeleaz\ `n vapori de azot (ca [i sperma de berbec) [i apoi se congeleaz\ `n azot lichid (-196oC). Sperma de ]ap se poate conserva [i `n pastile, `ntocmai ca sperma de berbec. 1.7.3. Conservarea spermei de vier

Sperma de vier are unele particularit\]i, `n raport cu cea a rumeg\toarelor: volum mare, concentra]ie sc\zut\ `n spermatozoizi, sensibilitate crescut\ la schimb\rile de temperatur\, plasma seminal\ bogat\ `n electroli]i, ceea ce `ngreuneaz\ posibilit\]ile tehnice de conservare (Feredean [i colab., 1964). Dac\ sperma corespunde calitativ, imediat dup\ recoltare se dilueaz\, la temperatura de 33-35oC, `n raport de 1/1 [i `n condi]ii de izotermie. Se omogenizeaz\ con]inutul paharului cu sperm\ prin u[oare rotiri ale paharului, apoi sperma se p\streaz\ la 18-20oC, 15-20 de minute pentru echilibrare.

70

Gradul de dilu]ie se calculeaz\ `n func]ie de concentra]ia ejaculatului `n spermatozoizi, mobilitatea spermei [i num\rul de spermatozoizi pe care dorim s\-i con]in\ doza de `ns\mân]are. La diluarea spermei de vier, gradul de dilu]ie variaz\ `n limite mai restrânse decât la rumeg\toare, 1/2-1/8. Sperma de vier diluat\, se ambaleaz\ `n recipiente de sticl\ sau de material plastic, cu capacitatea de 100 ml. Dac\ sperma se folose[te imediat dup\ diluare, aceasta se repartizeaz\ direct `n recipientul adaptat cateterului de `ns\mân]are. Dac\ sperma diluat\ se conserv\ mai multe zile, ambalarea se poate face pentru cantitatea total\ (`n sticle cu pere]i dubli) sau `n doze a câte 100 ml, direct `n recipiente de material plastic. ~n practica `ns\mân]\rilor artificiale la porcine, metodele de conservare a spermei sunt: - conservarea la temperatura de 15-20oC; - conservarea `n medii u[or acide; - conservarea la temperatura de 4-5oC; - conservarea prin congelare. A) Conservarea spermei la temperatura camerei (15-20oC) Sperma de vier, diluat\ [i ambalat\ se poate p\stra una-dou\ zile dac\ temperatura de p\strare este constant\, con]ine substan]e saline, energetice [i antibiotice, `n cantit\]i optime, toate cu rol protector pentru men]inerea mobilit\]ii [i capacit\]ii fecundante a spermatozoizilor. Ritmul de coborâre a temperaturii spermei diluate va fi lent, f\r\ varia]ii bru[te, atingerea temperaturii de conservare trebuind s\ se realizeze `n 90-120 de minute. La aceast\ temperatur\ sperma se p\streaz\ pân\ `n momentul inocul\rii, când trebuie re`nc\lzit\ pân\ la o temperatur\ apropiat\ de cea a corpului (37-40oC) (Feredean T. [i colab., 1961). Conservarea spermei la temperatura de 15-20oC timp de 48 de ore, asigur\ un nivel de fecunditate al scroafelor `ns\mân]ate de circa 75% (Feredean T., 1977)

Conservarea spermei `n medii u[or acide se bazeaz\ pe crearea anabiozei acide. Diluantul folosit con]ine bicarbonat de sodiu la care se adaug\ bioxid de carbon, cu rol `n acidifierea mediului, prin formarea acidului carbonic. Aceast\ metod\ a fost adoptat\ pentru conservarea spermei de vier de c\tre du Mesnill, du Buisson [i Dauzier `n anul 1959. De atunci, metoda s-a folosit `n mod curent pentru conservarea spermei de vier. Reactivarea spermatozoizilor se face prin simpla `nc\lzire a spermei ce urmeaz\ a fi folosit\ sau prin ad\ugarea unei substan]e chimice alcaline, ambele condi]ii reg\sindu-se `n uterul scroafei. Pentru conservarea spermei `n medii u[or acide, cel mai r\spândit este urm\torul diluant: citrat trisodic cu 5,5 H2O 24,82 g, bicarbonat de sodiu 2,1 g, clorur\ de potasiu 0,4 g, glucoz\ anhidr\ 3,0 g, sulfamid\ 3 g; dup\ r\cire se mai adaug\ 1 milion U.I. de penicilin\ [i 1 g de streptomicin\, toate aceste componente calculate pentru 1000 ml ap\ bidistilat\. Diluarea se realizeaz\ la temperatura de 31-33oC, `n final ad\ugându-se circa dou\-trei volume de diluant la un volum de sperm\, astfel `ncât s\ se ob]in\ 3-4 miliarde de spermatozoizi `ntr-o doz\ de 40-

71

50 ml. Sperma diluat\ se barboteaz\ cu un curent de CO2, timp de 10 minute, pân\ când pH-ul coboar\ la 6,2-6,4. Din recipientul `n care s-a f\cut barbotarea spermei diluate, aceasta se repartizeaz\ `n fiole de sticl\ de circa 50 ml, care se `nchid la flac\r\ oxiacetilenic\ [i se p\streaz\ la o temperatur\ constant\ de 15oC. ~n momentul folosirii, fiecare doz\ se dilueaz\ din nou cu acela[i diluant ]inut la 30oC, pân\ la un volum final de 100 ml [i apoi se folose[te la `ns\mân]area scroafelor `n c\lduri. Conserva]i astfel, spermatozoizii `[i prezerv\ capacitatea fecundant\ timp de 4-5 zile. Totu[i, datorit\ laboriozit\]ii metodei [i a promov\rii `n prezent a altor procedee de conservare a spermei nu se mai practic\ sau se aplic\ `n mod cu totul sporadic. B) Conservarea spermei de vier la temperatura de 4-5oC La noi `n ]ar\, din anii ’90, pe lâng\ diluantul salin de tip „SEMTEST“ Balote[ti folosit pentru conservarea spermei timp de 48 de ore la temperatura de 15-20oC, se mai utilizeaz\, cu rezultate bune, un mediu de dilu]ie propus de Institutul de Biologie [i Nutri]ie Animal\ Balote[ti, pe baz\ de g\lbenu[ de ou, folosit `n dou\ variante (O. Ro[ca, 1994): a) adaosul g\lbenu[ului de ou `n mediul de dilu]ie codificat MDSV-11, cu o zi `nainte de folosire a lui la dilu]ia spermei; b) adaosul g\lbenu[ului de ou `n mediul de dilu]ie, MDSV-11, cu 7 zile `nainte de folosire la dilu]ia spermei. ~n cazul folosirii acestor medii de dilu]ie, sperma diluat\ poate fi folosit\ la `ns\mân]area artificial\ a scroafelor timp de 4-5 zile de la data dilu]iei, cu condi]ia ca sperma s\ fie p\strat\ la frigider (+4oC). ~nainte de `ns\mân]are, dozele de sperm\ se `nc\lzesc pân\ la temperatura de 37oC. Calit\]ile bioprotectoare ale acestui mediu de dilu]ie (MDSV-11) au fost testate pe un lot de 2505 scroafe, ob]inându-se o fecunditate la prima `ns\mân]are de 65,9% (O. Ro[ca, 1994). Acest mediu posed\ unele `nsu[iri biologice, precum: - este un mediu mixt, salin [i biologic, crioprotector, cu antibiotice [i antimicotice; - con]ine substan]e protectoare pentru spermatozoizi; - men]ine o bun\ activitate metabolic\, p\streaz\ `nc\rc\tura electric\ a spermatozoizilor, iar prin con]inutul `n neelectroli]i zahara]i [i aminoacizi asigur\ o surs\ de energie exogen\; - con]ine substan]e neutralizante pentru acizi [i baze f\r\ a influen]a concentra]ia ionilor de H+; - balan]a ionic\ pentru spermatozoizi este asigurat\ prin s\ruri cu anioni bi- [i trivalen]i care protejeaz\ `nveli[ul lipo-proteic al spermatozoizilor, iar ionii polivalen]i regleaz\ concentra]ia cationilor bi- [i trivalen]i; - con]ine ioni de fosfor cu rol tampon, care particip\ la reac]iile energetice; - spermatozoizii sunt proteja]i `mpotriva [ocului „a frigore“ [i prin introducerea `n mediul de dilu]ie a fosfolipidelor semisolubile bogate `n acizi gra[i nesatura]i; - pH-ul de 6,4-6,8 realizat, produce o anabioz\, protejeaz\ acrozomul, membrana celular\ [i este diminuat\ activitatea

72

dezoxiribonucleazei, cu efect favorabil asupra viabilit\]ii spermatozoizilor. Condi]iile tehnice obligatorii pentru prepararea spermei diluate cu mediul de dilu]ie MDSV-11 sunt urm\toarele: - dilu]ia s\ se fac\ `n condi]ii de izotermie; - diluantul se adaug\ treptat, omogenizând con]inutul continuu prin u[oare mi[c\ri de rota]ie; - num\rul mediu de spermatozoizi `n doza de `ns\mân]are este de circa un miliard; - `n momentul folosirii se adaug\ 20% g\lbenu[ de ou proasp\t. Ambalarea se face `n flacoane de sticl\ cu capacitatea de 250, 350, 500 sau 1000 ml [i se conserv\ la frigider, la temperatura de 2-4oC, spermatozoizii men]inându-[i capacitatea fecundant\ timp de 7 zile (O. Ro[ca, 1994).

C) Conservarea spermei de vier prin congelare Congelarea spermei de vier a preocupat cercet\torii `n ultimele patru decenii, `ns\ numai din anii ’70 aceste cercet\ri s-au amplificat. Primele rezultate ob]inute cu sperm\ congelat\, dup\ `ns\mân]area transcervical\ sunt ale lui Crabo [i Grinarsson, `n 1971, care au folosit ca lichid pentru decongelare plasma seminal\ de vier (Dumitrescu I. [i colab., 1978). Dup\ aceast\ reu[it\, diverse colective de cercet\tori din diferite ]\ri s-au preocupat de g\sirea celei mai eficiente tehnologii de congelare a spermei de vier, plecând de la faptul c\ spermatozoizii de vier reac]ioneaz\ diferit de cei proveni]i de la rumeg\toare, la niveluri de temperatur\ sc\zut\ [i ultrasc\zut\. Crioconservarea spermei are drept consecin]\ un anumit grad de distrugere a biomembranelor spermatozoizilor, prin trecerea `n plasm\ a lipidelor, albuminelor, fermen]ilor, grupelor sulfhidrice, afectarea echilibrului ionic etc (Nauk B.A., 1991). Gradul de stabilitate a spermei animalelor domestice la temperaturi foarte sc\zute este dependent, `n mare m\sur\, de comportarea albuminelor. Con]inutul `n aminaz\ a membranelor plasmatice ale spermatozoizilor de vier este mai sc\zut comparativ cu spermatozoizii rumeg\toarelor. Experien]ele au demonstrat faptul c\ substan]ele albuminice [i complexele acestora sunt mai stabile la temperaturi sc\zute decât lipidele. Spermatozoizii de vier con]in mai multe fosfolipide comparativ cu spermatozoizii rumeg\toarelor. Experien]ele `ntreprinse au eviden]iat faptul c\ la temperaturi ultrasc\zute cre[te procesul de oxidare peroxidic\ a lipidelor din spermatozoizi. ~n ceea ce prive[te participarea glicerinei `n mediul de dilu]ie, cele mai bune rezultate, referitoare la nivelul fecundit\]ii scroafelor `ns\mân]ate, s-au ob]inut atunci când concentra]ia crioprotectorului `n sperm\ a fost de circa 2-3%. O alt\ problem\ care reduce r\spândirea `ns\mân]\rilor artificiale cu sperm\ congelat\ const\ `n randamentul slab al acestei metode, supravie]uirea spermatozoizilor se situeaz\, `n medie, `ntre 30% [i 40%, ceea ce `nseamn\ c\ dintr-un ejaculat nu se pot face mai mult de 3-4 `ns\mân]\ri. De asemenea, prolificitatea scroafelor `ns\mân]ate cu sperm\ congelat\ este mai sc\zut\.

73

Crioconservarea spermei de vier se practic\ `n mai multe variante, neconcentrat\ sau concentrat\, fie sub form\ de granule, fie sub form\ de paiete mari cu volum de 2,0-2,5 ml etc. Fiecare centru de recoltare, examinare [i prelucrare `[i are propria metod\ de congelare, `ns\ trebuie s\ preciz\m faptul c\, datorit\ dezavantajelor men]ionate, la care se adaug\ [i laboriozitatea accentuat\ a tehnologiei de congelare a spermei, crioconservarea spermei de vier nu d\ `ntodeauna rezultate bune [i de aceea nu cunoa[te o r\spândire larg\. Dintre metodele folosite `n prezent, men]ion\m pe cea care este r\spândit\ `n unele centre de `ns\mân]\ri artificiale din SUA, Canada, Anglia, Germania, unde se congeleaz\ sperm\ de vier `n scopuri comerciale (Dumitrescu I. [i colab.,1978). Se folose[te un diluant constituit din TES, TRIS, glucoz\ [i g\lbenu[ de ou (20%), preparat cu 24 de ore `nainte de folosire [i men]inut la frigider. ~nainte de folosire, diluantul se centrifugheaz\, iar supernatantul se folose[te ca diluant, fiind `mp\r]it `n dou\ p\r]i egale: o parte este folosit\ la temperatura camerei pentru prima dilu]ie, dup\ ce i s-a ad\ugat 2% glicerin\, iar a doua parte se men]ine la frigider pentru a se realiza cea de a doua dilu]ie. Mediul `n care se face decongelarea este constituit din glucoz\, citrat trisodic, bicarbonat de sodiu, sare disodic\ de EDTA, clorur\ de potasiu. Sperma, dup\ recoltare [i examinarea calitativ\, este l\sat\ s\ se r\ceasc\ 2-3 ore la temperatura laboratorului, timp `n care se adaug\ antibioticele necesare. Sperma se transfer\ `n fiole de centrifug\, apoi se centrifugheaz\ 10 minute la 1500 rota]ii /minut pân\ când sperma se separ\ de plasma seminal\. Supernatantul este eliminat apoi se adaug\ `n eprubete o cantitate mic\ de diluant f\r\ glicerin\, la 200C. Spermatozoizii sedimenta]i sunt amesteca]i u[or cu o baghet\ de sticl\ [i sperma `n suspensie se transfer\ `ntr-un cilindru gradat de 100 ml. Se adaug\ din nou o cantitate de diluant f\r\ glicerin\, `n a[a fel `ncât s\ se ajung\ la jum\tate din volumul final. Cilindrul gradat cu sperm\ diluat\ se plaseaz\ `ntr-un vas de 250 ml care con]ine circa 50 ml de mediu lichid la 20oC [i amândou\ se introduc la frigider timp de dou\ ore, astfel `ncât temperatura amestecului de sperm\ s\ scad\ la 8oC. Se face a doua dilu]ie cu diluant ce con]ine 2% glicerin\, ad\ugându-se diluantul pân\ ce se ajunge la volumul final, dilu]ia f\cându-se `n condi]ii de izotermie. Sperma se depune `n excava]iile practicate `n blocul de z\pad\ carbonic\, formându-se pastile de 0,1-0,2 ml fiecare. Dup\ 3-5 minute, pastilele din sperm\ se colecteaz\ `ntr-o pâlnie cu azot lichid, se apreciaz\ calitatea spermei [i dac\ mobilitatea spermatozoizilor este de minimum 20% pastilele se transfer\ `n eprubete (150/16 mm) marcate cu datele necesare identific\rii vierului, apoi fiolele se trec `ntr-un container cu azot lichid. Fiecare fiol\ con]ine 10 pastile cu sperm\. La noi `n ]ar\, un colectiv de speciali[ti de la SEMTEST Balote[ti, a folosit congelarea spermei de vier `n paiete din plastic cu capacitatea de 2,5 ml, cu 2,5 miliarde de spermatozoizi/paiet\, care s-a precongelat `n vapori de azot lichid. ~n ]ara noastr\ `nc\ nu este elaborat\ o tehnologie specific\ de lucru care s\ garanteze o fecunditate corespunz\toare a femelelor `ns\mân]ate.

74

1.7.4. Conservarea spermei de arm\sar

La arm\sar, sperma se recolteaz\ la interval de dou\ zile, se examineaz\ [i cea care corespunde calitativ se dilueaz\ imediat la +32oC, astfel `ncât s\ se asigure o concentra]ie de 20X106 spermatozoizi/ml, doza fiind format\ din 20 ml, ceea ce `nseamn\ c\ se asigur\ circa 400 de milioane de spermatozoizi mobili/doz\. Cele mai eficiente antibiotice folosite sunt penicilina [i gentamicina. Dintr-un ejaculat pot rezulta `n medie 30 de doze. Sc\derea temperaturii trebuie s\ se fac\ treptat. Astfel, sperma diluat\ la +32oC se men]ine 20-30 de minute la temperatura laboratorului [i apoi dozele cu sperm\ se introduc la frigider. Sperma este distribuit\ `n fiole sau cel mai frecvent `n tuburi cu volum de 20 ml. Fiolele sau tuburile se `nchid ermetic [i se men]in la frigider, capacitatea fecundant\ fiind asigurat\ doar pe un interval de 24 de ore (conservarea prin refrigerare). Conservarea spermei prin congelare Oricare ar fi mediul de dilu]ie, se constat\ o mortalitate ridicat\ a spermatozoizilor la congelare, dar [i o reducere a capacit\]ii fecundante a spermatozoizilor mobili (Palmer E. [i colab., 1984). Rezisten]a spermatozoizilor la congelare variaz\ mult cu particularit\]ile individuale ale arm\sarilor. Cel mai ridicat procent de supravie]uire a spermatozoizilor la congelare s-a observat la arm\sarii care dau o sperm\ concentrat\ [i cu volum redus. Congelarea spermei se realizeaz\ prin diluare [i sc\derea temperaturii. Sperma diluat\ pentru congelare se ambaleaz\ `n tuburi metalice sau din material plastic, p\strate `n azot lichid. Tuburile metalice sunt confec]ionate din aluminiu, au o lungime de 12 cm, diametrul de 2,5 cm, `nchise ermetic. Mediul de dilu]ie preconizat de Busch [i colab.,1982 are urm\toarea compozi]ie: ap\ bidistilat\ 10 ml, glucoz\ 11 g, EDTA (sare de etilen-diamin-tetraacetil- bisodic) 100 mg, hidrocarbonat de sodiu (solu]ie apoas\ 2%) 0,2 ml, solu]ie de citrat de sodiu 0,25 ml, g\lbenu[ de ou 2 ml, glicerin\ 3,5 ml, 500000 U.I. penicilin\ [i 0,5 µg streptomicin\. Sperma este l\sat\ s\ sedimenteze, iar frac]iunea bogat\ `n spermatozoizi men]inut\ `n baia-marie la 32oC, se amestec\ cu diluantul men]inut la aceea[i temperatur\. Sperma se p\streaz\ la temperatura camerei timp de 30 minute, apoi se introduce `n tuburile de aluminiu cu o capacitate de 20 ml. Dup\ umplere, tuburile se `nchid ermetic, se ]in la frigider (2-4o) dou\ ore pentru echilibrare. Sperma se dilueaz\ la aceast\ temperatur\ `n raport de 1/3-1/4. Tuburile se introduc `n vapori de azot lichid (precongelare) la temperatura de -120oC, unde se men]in 3-6 minute, apoi sunt scufundate direct `n azot lichid (-196oC). Congelarea spermei `n tuburi de material plastic Martin [i Klug (1979) au folosit tuburi cu o capacitate de 4 ml [i recomand\ dou\ medii de dilu]ie. Diluantul I: 6,0 g glucoz\, 0,37 g sare sodic\ etilen diamin tetraacetat, 0,12 g hidrocarbonat de sodiu, 0,375 g trisodiucitrat-2-hidrat, 100 ml ap\ bidistilat\, 500000 U.I. penicilin\, 50 mg streptomicin\.

75

Diluantul II: 50 ml lactoz\ solu]ie 11%, 25 ml diluant Mark, 20 ml g\lbenu[ de ou, 0,8 ml Equex STM, 5 ml glicerin\. Diluarea se face `n doi timpi: `n prima etap\ se face dilu]ia `n raport de 1/1, cu diluantul I, la temperatura de 30-32oC, apoi amestecul se centrifugheaz\ 5 minute (1000 rota]ii/minut). Supernatantul se `nl\tur\, apoi sperma r\mas\ se amestec\ cu diluantul II la temperatura de 2-4oC, urmeaz\ echilibrarea 3-4 ore la acest nivel de temperatur\, apoi sperma se repartizeaz\ `n tuburi din material plastic care se `nchid [i la cel\lalt cap\t cu pudr\ de alcool polivinilic sau prin alt procedeu. Congelarea se face `n acela[i fel ca pentru tuburile de aluminiu. Congelarea spermei `n granule (pastile) nu a dat rezultate satisf\c\toare pân\ `n prezent, fecunditatea iepelor `ns\mân]ate cu sperm\ congelat\ `n granule oscilând `ntre limite foarte largi (11-60%, Oshida [i colab., 1966 ; Knoop, 1976), fapt ce a dus la aplicarea din ce mai redus\ a acestui procedeu. Tehnologia prevede dilu]ia [i centrifugarea spermei, `nl\turarea supernatantului, iar sperma r\mas\ se repartizeaz\ `n alveole practicate pe un bloc de z\pad\ carbonic\ [i apoi introducerea `n tuburi [i scufundarea `n azot lichid unde se p\streaz\. 1.7.5. Conservarea spermei de p\s\ri

Sperma diluat\ `[i poate men]ine capacitatea fecundant\ circa 24 de ore dac\ temperatura de p\strare se situeaz\ la un nivel de 12-15°C, la coco[ [i curcan, cu condi]ia ca oxigenarea spermei s\ fie men]inut\ tot timpul p\str\rii. Congelarea spermei la p\s\ri `ntâmpin\ unele dificult\]i: - degradarea membranei spermatozoizilor cauzat\ de apari]ia de microcristale [i deshidratarea care intervine `n momentul congel\rii spermei ; - fenomene de toxicitate datorate cre[terii concentra]iei intracelulare a solu]iilor. Sperma se dilueaz\ `n raport 1/1, se r\ce[te progresiv pân\ la 4°C când se adaug\ restul cantit\]ii de diluant care con]ine substan]\ crioprotectoare (glicerol, DMSO-dimetil sulfat oxid, dimetil acetamid 4%). Congelarea propriu-zis\ se face `n azot lichid, sperma fiind ambalat\ `n fiole, paiete sau pastile. Cele mai bune rezultate s-au ob]inut cu sperma conservat\ `n paiete. Stocajul are loc `n azot lichid. Lake, respectând aceste condi]ii, a ob]inut o fecunditate de 93%, `ns\ a efectuat 4 `ns\mân]\ri artificiale `n 10 zile, ceea ce a totalizat 1,2 miliarde de spermatozoizi, cam de 6-10 ori mai mult decât atunci când se folose[te sperma brut\. Rezultatele lui Sexton, care a folosit DMSO se situeaz\ la un nivel mai sc\zut (40-60%), cu varia]ii mari de la un mascul la altul. Aceste rezultate destul de modeste, nu permit a se spera la o dezvoltare important\ a congel\rii spermei la p\s\ri, mai ales c\ [i pre]ul de cost al puilor ob]inu]i este foarte ridicat.

76

1.8. Inocularea spermei Constituie ultima etap\ `n biotehnologia `ns\mân]\rilor artificiale [i const\ `n depunerea materialului seminal, `n prealabil recoltat, examinat, prelucrat [i conservat sau brut, pe traiectul c\ilor genitale ale femelelor `n estru. ~n esen]\, `ntreaga biotehnologie a `ns\mân]\rilor artificiale const\ `n modificarea locului de depunere a spermei, aceasta fiind colectat\ `ntr-un recipient special, [i dup\ evaluare [i prelucrare, trebuie s\ reajung\ acolo unde avea destina]ia natural\, pe traiectul c\ilor genitale femele. Inocularea prin mijloace artificiale trebuie s\ ]in\ seama de particularit\]ile fiziologice ale locului de depunere a spermei prin mont\, sperma urmând a fi depus\ cel pu]in la nivelul segmentului genital femel unde este depus\ fiziologic. De asemenea, prin `ns\mân]are artificial\ se `ntrebuin]eaz\ numai sperma care a corespuns unor parametri minimi de calitate [i care provine de la reproduc\tori valoro[i. De aceea, tehnica de inoculare, difer\ cu specia [i are `n vedere particularit\]ile anatomo-fiziologice ale tractusului genital. Sperma trebuie s\ fie depus\ numai `n momentul optim, astfel `ncât s\ asigure realizarea unor indici de reproduc]ie cât mai buni. Func]ie de locul unde se depune, inocularea poate fi: - vaginal\, care se aplic\ la mioare [i vi]ele; - cervical\, aplicabil\ la rumeg\toare; - uterin\, practicat\ la iap\ [i scroaf\; - tubar\, se aplic\ la p\s\ri. 1.8.1. Inocularea spermei la vac\

Indiferent de forma de proprietate a efectivelor de taurine, `ns\mân]area artificial\ presupune existen]a unei scheme organizatorice adecvate, institu]iile specializate fiind responsabile de desf\[urarea `n condi]ii cât mai bune a `ntregii activit\]i de reproduc]ie [i selec]ie a animalelor, structur\ organizatoric\ ale c\rei atribu]ii au fost precizate `n primul capitol. 1.8.1.1 Punctul de `ns\mân]\ri artificiale la vaci (P.I.A.V.)

Punctul de `ns\mân]are artificial\ a vacilor este subunitatea-verig\ a `ntregii re]ele de reproduc]ie a animalelor, prin a c\rei activitate se concretizeaz\ `ntregul proces de reproduc]ie la taurine din sectorul de stat, asociativ sau individual. Punctul de `ns\mân]are artificial\ a vacilor este amenajat la nivelul fiec\rei comune sau ferme de vaci, este `ncadrat cu un tehnician sau operator `ns\mân]\tor c\ruia `i revin sarcinile pe linia reproduc]iei [i selec]iei efectivelor de animale arondate punctului de `ns\mân]\ri artificiale. Punctul de `ns\mân]are artificial\ este o structur\ tehnico-organizatoric\ cu sarcini complexe [i permanente care presupune o mare responsabilitate. Pe lâng\ aplicarea corect\ [i oportun\ a tehnicii de `ns\mân]are, tehnicienii [i operatorii de `ns\mân]\ri artificiale trebuie s\ participe direct la coordonarea tehnic\ a reproduc]iei efectivelor de animale din

77

ferme sau localitatea respectiv\, s\ ]in\ la zi eviden]a clar\ a evenimentelor de reproduc]ie, s\ cunoasc\ bine efectivul-matc\, produ[ii [i destina]ia acestora, contribuind [i la aplicarea m\surilor de prevenire [i combatere a st\rilor de infecunditate. ~n condi]iile extinderii ini]iativei particulare `n cre[terea [i exploatarea efectivelor de taurine, func]ioneaz\ [i operatori `ns\mân]\tori , autoriza]i de institu]iile abilitate `n acest sens, care s\ efectueze pe cont propriu ac]iunile de `ns\mân]are a animalelor, având mijloc de transport propriu. Ace[tia, pe baza unor contracte ferme `ncheiate cu unit\]ile beneficiare, efectueaz\ activit\]ile specifice `ns\mân]\rilor artificiale, procurându-[i, tot pe cont propriu, dozele de material seminal de la unit\]ile specifice autorizate, aparatura [i instrumentarul de congelare, deconservare [i inoculare a materialului seminal. De regul\, punctul de `ns\mân]are artificial\ este amplasat `ntr-un ad\post al fermei sau pe lâng\ circumscrip]iile sanitar-veterinare, cu personalul c\rora operatorul trebuie s\ coopereze. Dotarea punctelor de `ns\mân]are artificial\ a vacilor trebuie s\ satisfac\ un minim de cerin]e tehnice privind folosirea materialului seminal diluat [i conservat prin congelare (fiol\, paiet\, granul\), precum [i a verific\rii calit\]ii acestuia, cum ar fi: microscop, termosuri, termometre, pense, specul vaginal, m\nu[i din plastic, pipete de `ns\mân]are, containere cu material seminal. Aprovizionarea cu material seminal congelat la nivelul punctelor de `ns\mân]are artificial\ se face prin serviciul specializat la nivelul ORSA sau a Centrelor de Reproduc]ie [i Selec]ie a Animalelor. Distribuirea materialului seminal se organizeaz\ [i preg\te[te prin: - consultarea eviden]elor de la „SEMTEST“-ul care furnizeaz\ material seminal, `n vederea stabilirii pe rase, tauri [i vechime de conservare a dozelor care urmeaz\ a fi distribuite; - orice mi[care de sperm\ congelat\ se execut\ numai `n azot lichid [i `n cel mai scurt timp posibil; - procurarea materialului seminal se face, func]ie de situa]ia financiar\, anual, semestrial sau trimestrial, cu ajutorul containerelor de transport cu capacitatea de 35-50 litri; - `n containerele de la punct, dozele se repartizeaz\ astfel `ncât `ntr-o canistr\ acestea s\ apar]in\ unui singur reproduc\tor; - distribuirea materialului seminal la punctele de `ns\mân]are artificial\ se face numai prin transferul paharelor din plastic, care con]in paietele din canistrele containerului de transport `n canistrele containerului cu care este dotat fiecare punct de `ns\mân]\ri artificiale; - containerul de la fiecare punct de `ns\mân]\ri artificiale este reaprovizionat periodic cu azot lichid, la intervale de timp corespunz\toare autonomiei recipientului respectiv (trei s\pt\mâni, o lun\, trei luni, [ase luni). Respectându-se aceste minime condi]ii, `n fiecare moment se g\sesc la nivelul punctelor de `ns\mân]are artificial\ dozele cu material seminal necesar `ns\mân]\rii la momentul optim, `n decursul anului, a femelelor `n c\lduri.

78

1.8.1.2. Descoperirea femelelor `n c\lduri [i stabilirea momentului optim al `ns\mân]\rii

Identificarea femelelor `n c\lduri constituie o ac]iune important\ pentru succesul `ns\mân]\rii artificiale. Pentru femelele `ntre]inute permanent `n stabula]ie, depistarea c\ldurilor se face cu destul\ greutate, bazându-se pe unele semne particulare, care uneori se manifest\ discret: nelini[te, sc\derea apetitului [i a produc]iei de lapte, atent\ la intrarea personalului `n grajd, linge o mân\ `ntins\, scurgerea printre labiile vulvare a mucusului specific de c\lduri etc. Pentru ca semnele specifice estrului s\ fie mai bine eviden]iate, se recomand\ mi[care zilnic\ pentru vaci, fie `n padoc, fie la p\[une. Primul semn psihic al c\ldurilor `l constituie starea permanent\ de agita]ie a femelei, efectueaz\ salturi pe alte femele (`n libertate) sau pe masculii genitostimulatori, uneori chiar pe personalul de `ngrijire. Semnul concludent al st\rii de estru se consider\ atunci când femela respectiv\ accept\, f\r\ tendin]a de a fugi, saltul altor femele sau masculi cu care st\ `mpreun\. Vaca `n c\lduri va suporta din partea celorlalte vaci atâtea salturi `ncât pielea de la nivelul primelor vertebre coccigiene prezint\ o depila]ie mai mult sau mai pu]in evident\, acest moment considerându-se a fi optim pentru `ns\mân]area artificial\. Vulva, vestibulul vaginal [i vaginul sunt congestionate, labiile vulvare sunt edema]iate, dispar pliurile vulvare, clitorisul se eviden]iaz\. Printre labiile vulvare se scurge un mucus translucid, filant, care poate s\ se `ntind\ de la comisura inferioar\ a vulvei pân\ la p\mânt. La mijlocul perioadei de estru, cantitatea de mucus cre[te [i are o elasticitate maxim\, ceea ce constituie alt semn specific de c\lduri (fig. 5). ~n cazul `n care surprindem femelele diminea]a, `n decubit sternoabdominal, mucusul de c\lduri este eliminat pe pardoseal\ `n dreptul fantei vulvare, semn caracteristic al c\ldurilor [i al momentului optim pentru efectuarea `ns\mân]\rii artificiale. Palparea transrectal\ a uterului eviden]iaz\ turgescen]a coarnelor uterine, delimitarea clar\ a acestora, care sunt foarte sensibile, erectile, situate pe plan[eul cavit\]ii pelvine. Aceast\ reactivitate a coarnelor uterine constituie un alt indiciu c\ femela se afl\ `n momentul optim de `ns\mân]are. C\tre sfâr[itul c\ldurilor, reactivitatea uterului este mult mai sc\zut\. Examenul transrectal al ovarului, care trebuie s\ se fac\ cu maxim de precau]ie, eviden]iaz\ pe suprafa]a acestuia existen]a unei denivel\ri, cu un diametru de 10-15 mm, cu pere]ii sub]iri, tensiune interioar\ crescut\, `n interior sesizându-se o oarecare fluctua]ie a lichidului folicular. Este momentul când se recomand\ `ns\mân]area artificial\. Coroborând modific\rile comportamentului sexual cu cele vizibile sau palpabile ale organelor genitale, `n determinarea momentului optim `n care trebuie efectuat\ `ns\mân]area artificial\, se poate concluziona: - femela accept\ salturile celorlalte femele din lot; - femela prezint\ vulva edema]iat\, mucoasa vestibular\ congestionat\ [i scurgerea unui mucus filant [i translucid pe la comisura inferioar\ a vulvei;

79

Fig. 5 Perioada optim\ pentru `ns\mân]area artificial\ a vacilor

-

cervixul este `ntredeschis, mucusul specific se scurge pe la nivelul orificiului vaginal al acestuia, floarea involt\ [i mucoasa vaginului congestionate; - coarnele uterine, prin palpare transrectal\, sunt erectile, bine eviden]iate, cu tonicitate crescut\; - foliculul ovarian este u[or palpabil, fluctuant, cu un diametru de 10-15 mm. Examenul transrectal al ovarului, care trebuie s\ se fac\ cu maxim Descoperirea vacilor `n c\lduri trebuie s\ se fac\ cu mult profesionalism pentru a se evita pierderile de cicluri, care se pot ridica la 20-30%. Depistarea trebuie s\ se fac\ de dou\ ori pe zi , diminea]a [i seara. ~n complexele de vaci, depistarea c\ldurilor ridic\ unele probleme nu numai datorit\ efectivului mare de animale care trebuie urm\rite zilnic, dar [i datorit\ semnelor clinice, deseori mai [terse. Pentru

80

cre[terea eficien]ei `n descoperirea vacilor `n c\lduri se pot folosi `n astfel de unit\]i, masculi biostimulatori (epididimotomiza]i, deferotomiza]i sau cu deviere de penis). ~n acest caz se consider\ suficient un taur biostimulator pentru100-200 de vaci. ~n majoritatea cazurilor, descoperirea femelelor `n c\lduri se face numai pe baza modific\rilor morfo-fiziologice [i de comportament din stadiul de estru. De asemenea, `n alegerea momentului optim al `ns\mân]\rii, este necesar s\ se urm\reasc\ cu aten]ie evolu]ia perioadei puerperale, astfel `ncât s\ se previn\ `mboln\virile, care sunt frecvente `n aceast\ etap\, iar puerperiumul s\ se desf\[oare fiziologic. Majoritatea autorilor recomand\ ca `ns\mân]area artificial\ s\ se fac\ cel mai devreme `ntre 45-50 de zile de la f\tare, `n func]ie de modul cum decurge perioada puerperal\, de nivelul produc]iei de lapte etc, [tiut fiind c\ femelele care dau o produc]ie mare de lapte se `ns\mân]eaz\ prima dat\ dup\ un interval de cel pu]in 60 de zile de la parturi]ie. ~ns\mân]area vacilor descoperite `n estru trebuie s\ se fac\ imediat dup\ depistarea c\ldurilor [i apoi s\ se repete dup\ 8-10 ore, având `n vedere durata estrului, momentul ovula]iei, viabilitatea game]ilor pe traiectul c\ilor genitale femele. 1.8.1.3. Preg\tirea femelelor pentru `ns\mân]are

Const\ `n notarea de c\tre operatorul `ns\mân]\tor a num\rului matricol, grajdul [i lotul din care fac parte vacile ce urmeaz\ a fi `ns\mân]ate pentru a fi dirijate spre punctul de `ns\mân]\ri artificiale. La nivelul punctului de `ns\mân]\ri se execut\ igiena trenului posterior al femelei, se spal\ [i [terge cu tampoane de vat\ regiunea vulvar\ [i zona perivulvar\. Identitatea femelei este c\utat\ `n registru, cu care ocazie este analizat\ [i interpretat\ starea ginecologic\ a femelei. Cu aceast\ ocazie se `nscrie `ns\mân]area `n registru [i se face [i programarea urm\ririi peste 18-23 de zile a eventualei reintr\ri a femelei `n c\lduri. Preg\tirea instrumentarului pentru `ns\mân]are ]ine seama de tehnica de `ns\mân]are folosit\ [i de modul `n care este ambalat materialul seminal (refrigerat, congelat `n paiete, fiole sau granule). ~n cazul `n care se practic\ metoda colposcopic\ de `ns\mân]are, speculul va fi sterilizat prin fierbere, timp de 10-15 minute, se verific\ func]ionarea sursei de lumin\, se asigur\ lubrifierea cu vaselin\ neutr\. Pentru `ns\mân]are, speculul vaginal se `nc\lze[te pân\ la aproximativ 45-50oC, apoi se lubrifiaz\ cu vaselin\ neutr\. Se preg\te[te pipeta de `ns\mân]are care se scoate din dulapul de p\strare, se preg\te[te registrul de `ns\mân]are, ap\ cald\, o solu]ie aseptizant\, m\nu[ile de plastic, etc. ~n institu]ia `n care se practic\ `ns\mân]area tactil-recto-cervical\ (recto-vaginal\) se preg\tesc eviden]ele, solu]iile [i substan]ele aseptizante, `mbr\c\mintea de lucru [i m\nu[ile de plastic pentru explora]ie. ~n func]ie de materialul seminal folosit, se va preg\ti o pipet\ din sticl\ sau din material plastic, un pistolet Cassau sau o pipet\ universal\ de tip „SEMTEST“.

81

1.8.1.4. Reanimarea spermatozoizilor

Presupune scoaterea dozei de `ns\mân]are din cutia care se g\se[te `n termosul cu ghea]\ [i l\sarea ei la temperatura camerei timp de câteva minute, `ntr-un stativ de lemn preg\tit special `n acest scop (`n cazul `n care se folose[te sperma conservat\ prin refrigerare). ~n cazul folosirii spermei conservate prin congelare se recomand\: - decongelarea cât mai rapid\ a dozei cu material seminal; - `ntre decongelare [i `ns\mân]are curba de temperatur\ a spermei s\ fie `n continu\ cre[tere; - un interval de timp `ntre decongelare [i `ns\mân]are cât mai scurt (maximum 15 minute); - instrumentarul folosit pentru `ns\mân]are s\ aib\ aceea[i temperatur\ ca sperma; - canistrele din containere s\ nu fie ridicate la o `n\l]ime mai mare de 3-4 cm sub nivelul superior al containerului. Extragerea dozei trebuie f\cut\ foarte rapid, prin intermediul unei pense. Indiferent de prelucrarea ini]ial\ a spermei congelate [i forma sub care se g\se[te, pentru decongelare este nevoie de un termos cu o baie marin\ de 36-40oC [i un termometru. ~n func]ie de modul de prezentare a spermei congelate, pentru reanimarea spermatozoizilor este necesar parcurgerea unor etape de lucru specifice. ~n cazul conserv\rii spermei `n fiole, se parcurg etapele: - preg\tirea b\ii marine la 38oC; - deschiderea containerului, ridicarea canistrei pân\ la gâtul containerului, extragerea fiolei, cufundarea ei `n baia marin\; - decongelarea materialului din fiole dureaz\ 2 minute; - [tergerea [i uscarea fiolei; - deschiderea fiolei prin sec]ionarea gâtului acesteia; - aspirarea spermei `n pipet\; - nu se decongeleaz\ `n acela[i timp mai multe fiole, iar absorb]ia materialului seminal decongelat se face cu instrumentarul `nc\lzit. ~n cazul conserv\rii spermei `n paiete se au `n vedere urm\toarele etape de lucru: - preg\tirea b\ii marine la temperatura de 34-37oC; - deschiderea containerului, ridicarea canistrei pân\ la cel mult 3-4 cm sub nivelul superior al containerului, scoaterea paietei, scuturarea ei de eventualele resturi de azot [i cufundarea `n baia marin\; - decongelarea dureaz\ 13 secunde pentru paieta mijlocie [i 8 secunde pentru paieta fin\; - rea[ezarea canistrei [i `nchiderea containerului; - `nc\lzirea, prin frecare cu hârtie sau vat\, a pipetei sau pistoletului de `ns\mân]are; - scoaterea paietei din baie, uscarea ei prin [tergere cu tifon sau prosop; - transferarea bulei de aer c\tre cap\tul astupat cu dopul de laborator prin lovirea u[oar\ a corpului paietei; - introducerea paietei `n pistoletul sau pipeta de `ns\mân]are;

82

- t\ierea cap\tului paietei cu o sec]iune perpendicular\ pe axul longitudinal, la mijlocul bulei de aer. Se recomand\ s\ nu se decongeleze mai multe paiete `n acela[i timp. ~n cazul conserv\rii spermei `n granule se parcurg etapele: - preg\tirea b\ii marine la temperatura de 38-40oC; a[ezarea pe stative, `n baia marin\ a unor fiole goale deschise cu o capacitate de 2,0-2,5 ml, asem\n\toare celor folosite la ambalarea materialului seminal refrigerat; - introducerea `n fiecare fiol\ a câte 1,0 ml solu]ie de citrat de sodiu 2,9% steril\ (solu]ie extender) `n care se decongeleaz\ granulele; atât fiolele cu solu]ia extender, cât [i fiolele goale trebuie s\ fie introduse `n baia marin\ la jum\tatea `n\l]imilor; - deschiderea containerului, ridicarea canistrei pân\ la gâtul containerului; - ridicarea ambalajului cu granule pân\ la nivelul de unde se extrage cu pensa dopul de pânz\-tifon (granulele se g\sesc tot timpul sub nivelul azotului din container); - r\cirea vârfului pensei sau tijei linguri]\, timp de 10-15 secunde, `n azot lichid; - extragerea cu ajutorul pensei r\cite a unei singure granule [i plasarea rapid\ a acesteia `n fiola cu solu]ie-extender; - agitarea u[oar\ a fiolei pentru omogenizarea spermei cu diluantul. 1.8.1.5. Tehnica inocul\rii spermei

Inocularea materialului seminal se realizeaz\ prin dou\ metode: - metoda colposcopic\ (sau cu speculul vaginal); - metoda tactil-recto-cervical\ (sau recto-vaginal\). Metoda colposcopic\ Inocularea materialului seminal prin aceast\ metod\ se bazeaz\ pe introducerea pipetei de `ns\mân]are pe lumenul cervical, prin conductul vestibulo-vaginal tunelizat cu ajutorul unui specul bivalv, trivalv sau tubar. Unele modele de specul tubar sunt prev\zute cu surse propri de lumin\. La celelalte modele, pentru iluminarea conductului vaginal [i a zonei pericervicale se `ntrebuin]eaz\ o lamp\ frontal\ sau lantern\. La inocularea spermei prin aceast\ metod\ se va proceda astfel: - vaca `n c\lduri se conten]ioneaz\ `ntr-un stand [i se execut\ toaleta organelor genitale externe cu ap\ [i s\pun; - speculul vaginal, dezinfectat, `nc\lzit [i lubrifiat cu vaselin\ neutr\ sterilizat\, se introduce cu partea l\]it\ `n fanta vulvar\. Introducerea se face din jos `n sus, `ntr-un unghi de aproximativ 35-40oC, prin mi[c\ri u[oare [i repetate `n plan vertical, asociat cu `mpingerea prudent\ c\tre `nainte. Dup\ introducerea complet\ a speculului, se efectueaz\ o rotire de 90oC (pentru speculul trivalv) dup\ care se `ndep\rteaz\ valvele; - se lumineaz\ conductul vestibulo-vaginal cu ajutorul l\mpii frontale sau a sursei proprii de lumin\;

83

- se examineaz\ conductul vestibulo-vaginal, floarea involt\ [i se localizeaz\ deschiderea cervical\, dup\ care se introduce pipeta de `ns\mân]are `n conductul cervical; - depunerea spermei se face `n partea anterioar\ a cervixului prin presarea `ntre degete a suzetei sau prin ap\sarea tijei piston urmat\ de un u[or masaj clitoridian. Avantaje: - posibilitatea examin\rii mucoasei vestibulo-vaginale [i cervicale [i buna observare a caracteristicilor mucusului cervical; - permite localizarea cu u[urin]\ a cervixului; - permite depistarea unor eventuale anomalii sau afec]iuni ale vaginului [i cervixului; - este mai estetic\ [i mai comod\ pentru operator. Dezavantaje: - necesit\ conten]ionarea femelelor `ntr-un stand special pentru `ns\mân]are; - impune dezinfec]ia speculului pentru a se evita transmiterea germenilor patogeni de la un animal la altul; - prin aplicarea acestei metode nu se ob]in informa]ii privind starea uterului [i a ovarelor, stadiul de evolu]ie al foliculilor ovarieni etc; - introducerea speculului cu brutalitate creaz\ reflexe de inhibi]ie sau poate stresa animalul. Datorit\ acestor dezavantaje, aceast\ metod\ este mai pu]in folosit\ `n prezent. Metoda tactil-recto-cervical\ (recto vaginal\) Impropriu denumit\ [i bimanual\, aceast\ metod\ este aproape generalizat\ `n practica `ns\mân]\rilor artificiale la taurine. Aceast\ metod\, sigur\ [i eficace, permite executarea `ns\mân]\rii la animalele legate la iesle, `n grajd, `n ad\posturi cu stabula]ie liber\ sau `n padocuri. Se deosebe[te de metoda colposcopic\ prin aceea c\ depunerea materialului seminal `n organele genitale femele se realizeaz\ numai cu ajutorul pipetei (pistoletului) de `ns\mân]are, f\r\ a folosi speculul vaginal. Metoda tactil-recto-cervical\ necesit\ `ns\ o preg\tire corespunz\toare a personalului autorizat s\ efectueze `ns\mân]area, care trebuie s\ cunoasc\ topografia [i modific\rile morfofiziologice ale organelor genitale. Persoanele neinstruite `n acest scop pot cauza, prin manipul\ri brutale, rupturi, lezion\ri sau perfor\ri ale conductului genital, iar datorit\ necunoa[terii topografiei organelor genitale, materialul seminal poate fi depus `ntr-un fald al mucoasei vaginale sau pericervicale, ratându-se `n acest fel `ns\mân]area. Inoculara materialului seminal prin aceast\ metod\ necesit\ efectuarea urm\toarelor opera]iuni: vidarea rectului, cu un u[or masaj pentru eliminarea contrac]iilor rectale, opera]iuni care se efectueaz\ cu mâna protejat\ de o m\nu[\ de polietilen\; - se apreciaz\ forma, topografia, dimensiunile, sensibilitatea [i consisten]a coarnelor [i corpului uterin; - se `ndep\rteaz\ labiile vulvare [i se deschide vestibulul vaginal prin compresiunea exercitat\ prin traversul rectului;

84

- se introduce pipeta printre labiile vulvare sub un unghi de 3040 C `n conductul vaginal; - se urm\re[te, cu mâna introdus\ `n rect, mi[carea de `naintare a pipetei pân\ la nivelul orificiului vaginal al cervixului, pentru a se preveni introducerea vârfului pipetei `ntr-un fald al mucoasei vaginale; - dac\ uterul este normal, se continu\ `naintarea pipetei prin cervix, dup\ ce anterior, a fost localizat\ deschiderea acestuia cu ajutorul degetului mic de la mâna introdus\ `n rect; - se fixeaz\ cervixul, urm\rind cu degetele trecerea vârfului pipetei pân\ ce p\trunde `n corpul uterin pe o distan]\ de 2-3 cm; - materialul seminal se depune la extremitatea anterioar\ a cervixului [i `n corpul uterin prin compresarea suzetei `ntre degete sau `mpingerea tijei-piston; - inocularea spermei prin aceast\ metod\ se `ncheie prin efectuarea unui u[or masaj clitoridian pentru a se preveni spasmul uterin [i a facilita desc\rc\rile hormonale necesare ascensiunii spermatozoizilor pe traiectul c\ilor genitale femele (foto 22). ~n unele cazuri se poate practica `ns\mân]area tactilcervical\, care const\ `n introducerea unei mâini protejate Foto 22 Inocularea spermei la vac\ de o m\nu[\ `n conductul prin metoda tactil recto cervical\ vestibulo - vaginal, reperarea cervixului, iar cu cealalt\ mân\ se introduce cu precau]ie, pipeta de `ns\mân]are pân\ la nivelul orificiului cervical. o

1.8.2. Inocularea spermei la oaie [i capr\ 1.8.2.1.Organizarea punctului de `ns\mân]are artificial\ la ovine (P.I.A.O.)

Organizarea [i desf\[urarea ac]iunii de `ns\mân]are artificial\ la ovine [i caprine se realizeaz\ sub coordonarea [i `ndrumarea Direc]iilor Jude]ene de Ameliorare [i Reproduc]ie [i a Centrelor teritoriale de profil, care asigur\ dotarea [i func]ionarea laboratorului de recoltare, prelucrare [i difuzare a materialului seminal [i a punctelor de `ns\mân]are artificial\. (P.I.A.O. [i P.I.A.C.). Punctele de `ns\mân]\ri artificiale sunt amplasate astfel `ncât efectivele de oi pe care le deservesc s\ nu se deplaseze la p\[unat pe o raz\ mai mare de 1,0-1,5 Km. De altfel, ac]iunea de `ns\mân]are artificial\ se preg\te[te temeinic cu cel pu]in 1,5-2,0 luni de zile `nainte de a fi declan[at\ campania [i se va desf\[ura pe durata a cel pu]in dou\-trei cicluri de c\lduri (45-50 de zile). ~n ]ara noastr\, este larg r\spândit\ `ns\mân]area artificial\ cu sperm\ brut\ sau diluat\, motiv pentru care, `n aceea[i unitate trebuie s\

85

se g\sesc\, pe lâng\ efectivul de femele [i efectivul de berbeci pepinieri, donatori de material seminal pentru efectuarea `ns\mân]\rii oilor. Berbecii folosi]i la `ns\mân]\ri artificiale sunt ale[i dintre: - cei proveni]i din import, cu certificat de origine [i productivitate; - cei testa]i ca amelioratori apar]inând raselor importate [i indigene zonate, precum [i exemplarele cu performan]e proprii superioare din efectivul valoros, apreciate la bonitare. Aceste criterii de alegere se completeaz\ cu: aprecierea `nsu[irilor fenotipice privind exteriorul, dezvoltarea corporal\, `nsu[irile lânii; examenul clinic al organelor genitale [i testul serologic pentru bruceloz\ sau orhiepididimit\ infec]ioas\; examenul produc]iei spermatice [i a comportamentului sexual (calitatea spermei, prezen]a, intensitatea [i durata reflexelor sexuale). Berbecii folosi]i la `ns\mân]\ri artificiale trebuie s\ provin\ din efective indemne [i sunt supu[i examenului clinic [i de laborator, conform legisla]iei `n vigoare, oferind `n acest fel garan]ia necesar\ pentru protec]ia sanitar\ a efectivelor. Perioada de preg\tire a berbecilor pepinieri dureaz\ circa [ase s\pt\mâni [i const\ `n asigurarea unei ra]ii de hran\ adecvate cerin]elor nutritive pentru reproduc]ie, aprecierea comportamentului sexual [i a calit\]ii spermei. Alegerea berbecilor [i ]apilor pentru `ns\mân]are artificial\ se face cu maxim\ exigen]\ pentru toate criteriile, asigurânduse câte un reproduc\tor adult pentru 100 de femele `n cazul `ns\mân]\rii cu sperm\ brut\ [i 300 de femele `n cazul folosirii spermei diluate [i conservat\ prin refrigerare. Preg\tirea oilor [i caprelor pentru campania de `ns\mân]\ri artificiale const\ `n asigurarea unei furaj\ri stimulative [i diferen]iate, `n func]ie cu starea lor de `ntre]inere. ~n]\rcarea oilor [i caprelor mulg\toare se practic\ cu circa o lun\ `naintea declan[\rii campaniei de `ns\mân]\ri artificiale prin `ntreruperea treptat\ a mulsului. Oile [i caprele vor fi examinate individual, f\cându-se clasarea lor pe baza `nsu[irilor fenotipice, privind exteriorul, greutatea corporal\, vârsta, `nsu[irile lânii etc, fiind `nl\turate exemplarele care nu `ndeplinesc condi]iile minime (reformele). Se verific\ [i individualizarea femelelor, acolo unde este cazul completându-se crotaliile pierdute. Pe baza examenului individual, zootehnic [i sanitar-veterinar, se constituie loturile (turmele) pentru `ns\mân]area artificial\, avându-se `n vedere rasa, vârsta, starea de `ntre]inere. M\rimea unei turme trebuie s\ fie de 300-400 oi. Cu circa o lun\ `naintea campaniei de `ns\mân]\ri artificiale, oile [i caprele vor fi `ntre]inute pe p\[uni bune, ra]ia de baz\ fiind suplimentat\ cu nutre]uri concentrate, a[a-numitul „flushing“ care influen]eaz\ pozitiv nivelul indicilor de reproduc]ie. Respectarea [i realizarea tehnic\ a tuturor fazelor din biotehnologia `ns\mân]\rilor artificiale la ovine [i caprine, necesit\ o dimensionare corect\ a volumului zilnic de munc\ prin optimizarea activit\]ii punctului de `ns\mân]\ri artificiale la un efectiv mediu de 1000-1200 de femele, cu durata ac]iunii pe perioada a 50-60 de zile. Pentru o bun\ activitate, P.I.A.O. sau P.I.A.C. trebuie s\ dispun\ de urm\toarele spa]ii [i utilit\]i: o camer\ pentru laborator, un spa]iu pentru recoltarea spermei [i `ns\mân]area artificial\ a femelelor descoperite `n

86

c\lduri, padocuri pentru berbeci `ncerc\tori, oile depistate `n c\lduri, oile `ns\mân]ate artificial, berbecii pepinieri [i ]arcurile `n care se face depistarea oilor [i caprelor `n c\lduri. Laboratorul va fi dotat cu un minim necesar de aparatur\ pentru examenul prelucrarea [i refrigerarea spermei. Camera de recoltare-`ns\mân]are este dotat\ cu: un stand pentru conten]ia oilor ce urmeaz\ a fi `ns\mân]ate, cu dimensiuni [i tipuri constructive adaptate acestei specii, vaginuri artificiale, autoclave pentru sterilizarea aparaturii folosite, speculum vaginal, surs\ de lumin\, materiale consumabile necesare. 1.8.2.2. Depistarea oilor [i caprelor `n c\lduri

Depistarea oilor `n c\lduri constituie o activitate destul de complicat\ `n aplicarea biotehnologiei `ns\mân]\rilor artificiale. Dificult\]ile sunt datorate faptului c\ oile tr\iesc `n cârduri mari, `n care sunt greu de urm\rit individual. Semnele de estru sunt greu observabile pentru om, comparativ cu semnele mult mai evidente manifestate la taurine [i cabaline. Izolarea oilor `n c\lduri [i recunoa[terea lor pentru `ns\mân]are artificial\ necesit\ un mare volum de munc\, deregl\ri ale activit\]ii curente din ferm\, fapt ce a `ngreunat, `n multe ]\ri, extinderea `ns\mân]\rilor artificiale la aceast\ specie (fig. 6). ~ns\mân]area artificial\ se bazeaz\ pe descoperirea oilor `n c\lduri prin intermediul berbecilor `ncerc\tori. Berbecii [i ]apii `ncerc\tori trebuie s\ apar]in\ aceleia[i rase cu femelele care urmeaz\ a fi `ns\mân]ate. Ace[tia sunt autoriza]i [i verifica]i sub raportul calit\]ii materialului seminal pentru a putea fi folosi]i [i la monta, Fig. 6 Depistarea oilor `n c\lduri dup\ `ncheierea campaniei de `ns\mân]\ri artificiale, oilor care nu au r\mas gestante [i manifest\ estrul `n afara intervalului de timp alocat a[a-numitei campanii de `ns\mân]\ri artificiale. Alegerea oilor [i caprelor `n c\lduri se face de dou\ ori/zi, diminea]a [i seara, perioade din zi când manifestarea c\ldurilor este mai intens\, iar berbecii [i ]apii sunt mai activi `n c\utarea femelelor. ~ncerc\torul este un mascul cu reflexe sexuale bine exprimate, care este introdus printre oile care urmeaz\ a fi `ns\mân]ate, `ns\ este `mpiedicat s\ efectueze depunerea spermatozoizilor pe traiectul c\ilor genitale femele. Elementul principal al depist\rii oilor `n c\lduri, cu ajutorul masculilor `ncerc\tori, este atitudinea adoptat\ de femel\ la contactul cu reproduc\torul. Se consider\ c\ femela este `n c\lduri [i este re]inut\ pentru `ns\mân]are artificial\, atunci când accept\ saltul berbecului sau ]apului, stând lini[tit\.

87

Se folosesc trei feluri de berbeci `ncerc\tori [i anume: - berbeci normali, `ns\ echipa]i cu un [or] care acoper\ furoul, `mpiedicând p\trunderea penisului `n vaginul oilor pe care execut\ saltul (fig. 7); - berbeci cu penis deviat, la care, printr-o interven]ie chirurgical\, s-a schimbat direc]ia penisului spre partea lateral\ a corpului, astfel `ncât, s\ Fig. 7 Berbec `ncerc\tor prev\zut nu mai p\trund\ `n conductul cu [ort vestibulo-vaginal; ace[tia s-au dovedit a fi mai pu]in eficien]i, deoarece imposibilitatea ejacul\rii le confer\ un anumit grad de nervozitate [i o mai slab\ eficien]\ a descoperirii oilor `n c\lduri; berbeci vasectomiza]i, la care, tot chirurgical, s-a sec]ionat epididimul sau canalul deferent, blocânduse astfel eliminarea spermatozoizilor din testicul, `ncât pot monta, sperma fiind lipsit\ de spermatozoizi. Pentru a asigura o rat\ optim\ de depistare a oilor `n c\lduri, `nc\rc\tura medie va fi de 30-40 de femele pentru un mascul. ~n vederea unei descoperiri cu un volum mai redus de munc\, berbecul `ncerc\tor se echipeaz\, `n zona pectoral\, cu un cartu[ marcator special ce con]ine o vopsea lavabil\, cartu[, care, `n momentul saltului, vine `n contact cu crupa femelei, iar la coborâre vopse[te lâna [i astfel oaia r\mâne marcat\, putând fi u[or separat\ de cârd. ~n lipsa cartu[ului, oile depistate `n c\lduri vor fi marcate cu „ovisemn“ de c\tre personalul muncitor. Femela se consider\ `n c\lduri atunci când la apropierea berbecului sau ]apului ia pozi]ie campat\, urineaz\ des [i `ntoarce capul spre flanc, se imobilizeaz\ când masculul face saltul [i „caut\ berbecul sau ]apul“. Indiferent de felul cum sunt preg\ti]i [i folosi]i masculii `ncerc\tori pentru alegerea oilor `n c\lduri, turma se introduce `ntr-un padoc, a c\rei suprafa]\ trebuie s\ asigure circa 1 m2 pentru fiecare femel\. ~n padoc, femelele trebuie s\ fie destul de rare, astfel `ncât `ncerc\torii s\ se poat\ mi[ca u[or printre ele. Oile care permit masculilor `ncerc\tori s\ efectueze saltul, se prind cu un baston `nzestrat la un cap\t cu un cârlig [i se trec `n padocul oilor care urmeaz\ a fi `ns\mân]ate. Dup\ ce berbecii `ncerc\tori nu mai sunt activi `n descoperirea oilor `n c\lduri, se retrag din cârd, se `nchid separat [i oile pornesc la p\[unat. Oile alese `n c\lduri sunt ]inute `ntr-un lot separat pân\ sunt `ns\mân]ate, inclusiv pân\ se repet\ `ns\mân]area. Cel mai greu se face depistarea oilor `n c\lduri `n zilele cu precipita]ii (ploaie, ninsoare) când padocul este plin de noroi iar cojocul oilor este `mbibat cu ap\. Alegerea oilor `n c\duri, constituie faza din fluxul tehnologic al `ns\mân]\rilor artificiale cea mai mare consumatoare de for]\ de munc\, constituind o frân\ pentru extinderea acestei biotehnologii. Un mijloc mai modern pentru provocarea [i eviden]ierea estrului este reprezentat de sincronizarea c\ldurilor prin diverse procedee prin

88

intermediul c\rora se poate determina inducerea c\ldurilor la un moment prestabilit (vezi capitolul „Sincronizarea estrului“). Aceasta `nseamn\ c\ `ns\mân]area artificial\ se poate face, la oile supuse tratamentului de sincronizare, f\r\ a se mai efectua alegerea celor `n c\lduri. ~n func]ie de tratamentul de sincronizare aplicat, `ns\mân]area tuturor oilor sincronizate, se face dup\ un anumit interval de timp, de la `ncheierea tratamentului, strict prestabilit, cu rezultate satisf\c\toare. 1.8.2.3. Inocularea materialului seminal

Inocularea spermei la ovine [i caprine, presupune: - recoltarea acesteia, când se folose[te `ns\mân]area artificial\ cu sperm\ brut\ sau diluat-refrigerat\, `n spa]iul adecvat; - examenul macroscopic [i microscopic, dup\ metodologia cunoscut\; - la mioare, datorit\ dimensiunilor mai mici ale conductului vestibulovagino-cervical, sperma se depune pericervical, doza fiind dublat\, iar la multipare sperma se depune intracervical; - existen]a dozelor de sperm\ congelat\, `n containerele de punct, atunci când se practic\ `ns\mân]area artificial\ cu astfel de material seminal; - producerea unui stres cât mai redus, `n cursul fazelor premerg\toare [i de inoculare a materialului seminal. Inocularea spermei brute, diluat\ [i consevat\ prin refrigerare sau congelare, se face prin trei metode: - colposcopic\ (specul vaginal); - vaginal\ (pericervical\, f\r\ specul); - tactil cervical\. Indiferent de metoda de inoculare, depunerea materialului seminal pe c\ile genitale ale femelelor `n c\lduri comport\ lucr\ri preg\titoare, conten]ia [i inocularea propriu-zis\. Lucr\rile preg\titoare se refer\ la preg\tirea aparaturii de inoculare, inclusiv sterilizarea instrumentarului necesar, preg\tirea locului de lucru. Conten]ia oilor presupune un volum mare de munc\, aceasta putându-se realiza `ntr-un stand cu orientare rabatabil\ ce permite ridicarea trenului posterior al oii [i la parapet sau gard, fixarea oii f\cându-se cu/pe genunchiul unui `ngrijitor. Mai r\spândit este standul orizontal, a[ezat la sol iar pentru mai mult\ comoditate, operatorul se poate a[eza `ntr-un [an] practicat `n spatele standului de conten]ie. Pentru inoculare avem nevoie de o sering\ adecvat\, alc\tuit\ dintr-un corp metalic, piston [i canul\ din sticl\, pistonul fiind prev\zut cu un cursor cu ajutorul c\ruia se regleaz\ volumul dozei. Se mai folosesc [i alte pipete de `ns\mân]are, cu canula schimbabil\, semiautomat\, cu o singur\ `nc\rc\tur\ putându-se `ns\mân]a 20-30 de oi, cu respectarea m\surilor de igien\. ~n cazul folosirii paietelor cu material seminal congelat, dup\ decongelarea acestora, paietele se introduc `n pistoletul special construit, asem\n\tor celui folosit pentru taurine. Aparatura auxiliar\ const\ dintr-un specul vaginal, tri- sau bivalv [i o surs\ de lumin\. ~ns\mân]area oilor se face imediat dup\ descoperirea `n c\lduri [i se repet\ la interval de 7-12 ore, având `n vedere viabilitatea game]ilor, femeli [i masculi, pe conductul genital femel, durata estrului [i momentul ovula]iei.

89

Metoda colposcopic\ Personalul necesar pentru efectuarea `ns\mân]\rii este compus din operatorul `ns\mân]\tor [i dou\ ajutoare. Unul dintre ajutoare introduce femelele, pe rând, `n stand [i execut\ toaleta sumar\ a vulvei [i regiunii perivulvare, iar cel de-al doilea scoate oile (caprele) `ns\mân]ate din stand, dup\ o prealabil\ identificare a acestora. Dup\ preg\tirea instrumentarului, femela `n c\lduri se introduce `n camera de `ns\mân]are [i se conten]ioneaz\ `n stand. Se efectueaz\ toaleta regiunii peri- [i vulvare [i se aspir\ sperm\ `n sering\. Speculul, sterilizat prin fierbere, flambare sau cu ajutorul diverselor solu]ii antiseptice, `nc\lzit la temperatura de 38-39oC, se lubrifiaz\ cu vaselin\ neutr\, se introduce `n conductul vestibulo vaginal cu l\]imea pe direc]ia fantei vulvare. Dup\ introducerea cu aten]ie, speculul se rote[te cu 90o, se deschide [i se repereaz\ orificiul cervical. Speculul tubar, prev\zut cu o surs\ proprie de lumin\, lubrifiat [i `nc\lzit la temperatura corpului, se introduce pe conductul vestibuloFig. 8 Inocularea spermei la oaie prin vaginal [i prin mi[c\ri `n plan metoda colposcopic\ vertical [i orizontal se repereaz\ orificiul vaginal al cervixului (fig. 8). ~n cazul folosirii spermei diluate, doza de `ns\mân]are este de 0,2 ml, iar când se face `ns\mân]area cu sperm\ brut\, doza este de 0,1 ml pentru oi [i capre [i de 0,2 ml pentru mioare. Num\rul de spermatozoizi mobili/doz\ trebuie s\ oscileze `ntre 200-250 de milioane. Neputându-se stabili cu exactitate momentul ovula]iei, pentru realizarea unui procent optim de fecunditate, femelele depistate `n c\lduri se `ns\mân]eaz\ imediat cu repetare la 8-12 ore. Femelele cu cicluri prelungite (dou\-trei zile) se `ns\mân]eaz\ `n fiecare zi, pe toat\ durata c\ldurilor. Metoda vaginal\ (pericervical\, f\r\ specul) const\ `n urm\toarea tehnic\: -conten]ia femelei se face `n standul cu orientare rabatabil\ sau prin simpla prindere a femelei de c\tre personalul ajut\tor [i ridicarea trenului posterior; - toaleta regiunii vulvare [i perivulvare; -introducerea pipetei de `ns\mân]are intravaginal [i prin mi[c\ri de tunelizare, rotire [i `naintare pân\ la nivelul orificiului cervical, sperma depunându-se Fig. 9 Inocularea spermei la oaie pericervical (fig. 9). prin metoda vaginal\

90

Metoda tactil-cervical\, `n care dirijarea canulei seringii de inoculare spre orificiul cervical se face cu ajutorul degetului ar\t\tor al operatorului, femela fiind ridicat\ de trenul posterior. Când se face `ns\mân]area artificial\ cu sperm\ brut\, se folose[te sperma cu mobilitate de cel pu]in 70%, cu un volum minim al ejaculatului de 0,6 ml [i o concentra]ie de peste un miliard de spermatozoizi/ml. ~ns\mân]area artificial\ cu material seminal congelat se practic\ foarte pu]in la aceste specii, `ntrucât rezultatele ob]inute sunt slabe. Materialul seminal de berbec [i ]ap este ambalat `n fiole, paiete din material plastic sau granule, conservate cu azot lichid. Pentru `ns\mân]area artificial\ a oilor cu material seminal congelat, `n prealabil trebuie s\ se fac\ decongelarea, dup\ aceea[i tehnic\ descris\ la taurine [i apoi s\ se inoculeze. ~nainte de `ns\mân]are se face controlul mobilit\]ii spermei, care trebuie s\ fie de minim 35%. Tehnica de inoculare a spermei decongelate este identic\ cu cea aplicat\ la `ns\mân]area artificial\ cu sperm\ brut\ sau cu sperm\ refrigerat\. O paiet\ con]ine 0,5 ml sperm\, respectiv dou\ doze de `ns\mân]are, o fiol\ con]ine circa 1 ml sperm\ (4-6 doze) iar o granul\ 0,1 ml (o doz\). 1.8.3. Inocularea spermei la scroaf\ 1.8.3.1. Organizarea [i dotarea punctului de `ns\mân]are artificial\ (P.I.A.S.) cu activitate complex\

Optimizarea procesului de reproduc]ie la porcine prin `ns\mân]are artificial\ presupune urm\toarea structur\ organizatoric\: - centrul de recoltare, prelucrare, conservare [i difuzare a spermei, organizat `n cadrul Centrului de Reproduc]ie [i Selec]ie a Animalelor, atunci când femelele sunt dispersate pe o zon\ mai extins\, ceea ce necesit\ transportul dozelor de sperm\ pân\ la proprietarul scroafelor (ferme de porci, asociativ\ sau particular\, cresc\tori individuali etc); - punctul de `ns\mân]are artificial\ cu activitate complex\: recoltare, prelucrare [i `ns\mân]are artificial\, `n complexele de cre[terea suinelor, `n unit\]i [i ferme familiale cu un efectiv de 300-400 de scroafe [i scrofi]e de reproduc]ie. ~n ambele cazuri trebuie s\ existe spa]ii [i utilit\]i necesare unei bune activit\]i: - compartimente comune pentru vierii tineri, candida]i pepinieri [i cu boxe individuale pentru vierii folosi]i la reproduc]ie (pepinieri); - sala de recoltare, prev\zut\ cu una sau mai multe boxe de recoltare, instala]ii cu du[uri de mân\ cu ap\ cald\, pentru toaleta general\ [i local\ a vierilor; - laboratorul, dotat cu minim de aparatur\ [i instrumentar, necesare pentru opera]iunea de recoltare, examenul, prelucrarea, ambalarea [i conservarea spermei; - compartimente comune pentru scroafele `n a[teptare [i individuale pentru cele care trebuie `ns\mân]ate [i `ns\mân]ate recent (dou\-trei s\pt\mâni dup\ `ns\mân]are).

91

Sperma se recolteaz\ cu vaginul artificial sau prin metoda manual\, de la vierii pepinieri dup\ un program prestabilit (de regul\ la un interval de dou\-trei zile). Sperma recoltat\ se examineaz\ `n laborator dup\ metodologia clasic\, se dilueaz\, repartizeaz\ `n doze (100 ml) [i se conserv\ la temperatura de 15oC sau la 4-5oC. Sperma brut\ proasp\t\, diluat\ sau diluat\-refrigerat\, se distribuie beneficiarilor, fiind transportat\ `n termosuri zootehnice, care men]in o temperatur\ constant\ pân\ la beneficiar (15oC sau 4-5oC). Printr-un ghi[eu practicat `n peretele laboratorului [i care comunic\ cu compartimentul scroafelor ce urmeaz\ a fi `ns\mân]ate, se distribuie imediat dozele cu material seminal, reprezentate de recipien]ii din plastic ce intr\ `n componen]a dispozitivului de `ns\mân]are (compus dintr-un cateter, un tub de leg\tur\ [i un rezervor de 100 ml). 1.8.3.2. Descoperirea scroafelor `n c\lduri

Constituie o etap\ important\ [i complex\. Depistarea femelelor `n estru se face pe baza semnelor clinice, a manifest\rii reflexului de imobilitate `n prezen]a vierului `ncerc\tor sau la ap\sarea pe spate de c\tre om [i prin mijloace electronice bazate pe modificarea caracteristicilor secre]iilor vestibulo-vaginale (pH-ul [i rezisten]a electric\ a mucoasei vestibulo-vaginale). Metoda cea mai simpl\ [i cu bune rezultate const\ `n prezentarea zilnic\ a femelelor cu modific\ri ale organelor genitale externe [i de comportament, vierului `ncerc\tor. ~n cazul `n care scroafa accept\ saltul vierului, este sigur `n perioada de estru. Dac\ accept\ acest salt de la prima `ncercare, momentul declan[\rii estrului se stabile[te prin media intervalului scurs de la controlul anterior. Dac\ accept\ saltul vierului dup\ a doua sau a treia `ncercare, debutul estrului corespunde acestui moment. Vierul nu trebuie bruscat, astfel devine inutilizabil. Cele mai bune rezultate se ob]in atunci când sunt deplasate scroafele (5-10) `n boxa vierului [i nu invers. ~n absen]a vierului `ncerc\tor, starea de estru se poate stabili pe baza modific\rilor de comportament ale scroafelor (nelini[te, groh\ituri caracteristice, poft\ de mâncare capricioas\ etc.) [i ale organelor genitale externe (edema]ierea [i congestia vulvei). Un indiciu sigur al st\rii de estru este reprezentat de reflexul de imobilitate al scroafei la presiunea exercitat\ de `ngrijitor `n regiunea lombo-sacral\ sau a flancurilor, o propor]ie `nsemnat\ (20-30%) nemanifestând, totu[i, starea de imobilitate `n absen]a vierului. Imitarea groh\iturilor vierului prin `nregistrarea pe o band\ magnetic\ sau prin folosirea unor spray-uri cu substan]e care imit\ mirosul secre]iilor prepu]iale sau ale salivei vierului (feromoni), fac s\ reac]ioneze pozitiv circa 70-80% dintre scroafele `n c\lduri. Ca metode ajut\toare se folose[te m\surarea pH-ului vaginal (Schilling [i Rastel, 1964) [i m\surarea rezisten]ei electrice a mucoasei vestibulo-vaginale (Feredean [i Dobrescu, 1972). Cu toate investiga]iile `ntreprinse `n aceast\ direc]ie, `nc\ nu este precizat\ metoda simpl\, practic\ [i eficient\ care s\ permit\ descoperirea sigur\ a tuturor scroafelor `n c\lduri.

92

1.8.3.3. Stabilirea momentului optim de `ns\mân]are

~ns\mân]area scroafelor trebuie s\ se fac\ `n momentul cel mai prielnic, `ncât spermatozoizii s\ ajung\ la locul fecunda]iei `naintea descinderii ovocitelor `n urma dehiscen]ei foliculilor maturi. Pentru a se preveni insuccesele, pentru fiecare scroaf\ ce urmeaz\ a fi `ns\mân]at\, se stabile[te cât mai exact momentul când se produce ovula]ia. Cum ovula]ia la scroaf\ are loc, `n medie, `ntre 36 [i 44 de ore de la debutul estrului, eviden]iat prin apari]ia reflexului de imobilitate la saltul vierului, `ns\mân]area cea mai eficace se consider\ c\ trebuie f\cut\ dup\ un interval de 20-24 de ore de la manifestarea reflexului de imobilitate. Acest aspect presupune ca ac]iunea de descoperire a scroafelor `n c\lduri s\ se desf\[oare cel pu]in de dou\ ori/zi, diminea]a [i seara. Personalul care execut\ aceast\ opera]iune trebuie s\ fie bine preg\tit profesional [i cât se poate de con[tiincios, pentru a se preveni `nregistrarea unei propor]ii ridicate de scroafe nedescoperite a fi `n estru, cu toate c\ se g\sesc `n acest stadiu. Repetarea `ns\mân]\rii se face cu scopul de a prinde ovula]iile [i la scroafele cu o durat\ mai mare a estrului. Când se fac dou\ `ns\mân]\ri `ntr-un ciclu de c\lduri, cel mai bine este ca prima inoculare s\ se fac\ la 15-20 de ore de la depistare, iar a doua la interval de 10-12 ore de la prima. ~n cazul depist\rilor f\cute de dou\ ori/zi (a[a cum se practic\ cel mai frecvent) scroafele la care s-a stabilit starea de estru diminea]a, se `ns\mân]eaz\ `n seara aceleia[i zile, iar scroafele care au fost depistate seara, prima `ns\mân]are se face `n diminea]a zilei urm\toare. Repetarea `ns\mân]\rii se face, a[a cum am men]ionat mai sus, dup\ 8-12 ore de la prima. Dac\ se face o singur\ depistare/zi (diminea]a), prima `ns\mân]are artificial\ se face imediat dup\ stabilirea reflexului de imobilitate pentru vier [i se repet\ dup\ alte 24 de ore de la prima `ns\mân]are (Feredean T.,1978). A treia `ns\mân]are artificial\ nu se recomand\ decât `n cazul scroafelor cu c\lduri prelungite pân\ la 4-5 zile precum [i pentru scroafele la care s-a constatat refularea spermei inoculat\ `n `ns\mân]\rile anterioare. Scroafele cu estru prelungit (superestru) se recunosc prin prelungirea peste limita fiziologic\ a modific\rilor organelor genitale externe [i de comportament specifice st\rii estrale, cât [i prin prezen]a reflexului de imobilitate la vier. ~n asemenea cazuri, a treia `ns\mân]are artificial\ se poate face la interval de 10-12 ore de la a doua inoculare a spermei. 1.8.3.4. Aparatura [i instrumentarul folosite pentru `ns\mân]area artificial\ a scroafelor

Acestea sunt relativ simple. La noi `n ]ar\, `n marea practic\, se folose[te instrumentar confec]ionat din material plastic compus dintr-un rezervor de form\ oval\ sau cilindric\ cu capacitate de 100 de ml având anexat un tub flexibil, tot din material plastic, care face leg\tura cu un cateter (sond\) semirigid, lung de 35-40 cm, prev\zut cu o oliv\, sau un adaptor tirbu[onat la extremitatea care se introduce `n lumenul cervical. Oliva sau adaptorul tirbu[onat au rolul de a se fixa `n lumenul cervixului, `mpiedicând refularea spermei `n timpul `ns\mân]\rii.

93

Acest tip de cateter poate fi substituit cu unul confec]ionat din cauciuc, cu vârful tirbu[onat refolosibil dup\ sterilizare, vârf care imit\ foarte bine extremitatea tirbu[onat\ a penisului vierului. Rezultate bune se ob]in [i cu instrumentarul de provenien]\ japonez\, compus dintr-o sering\ de sticl\ cu o garnitur\ metalic\ [i cu piston din cauciuc semirigid, cu capacitate de 80 ml. La seringi se ata[eaz\ un cateter de cauciuc (40 cm lungime, 0,7-1,0 cm diametru). Tija cateterului este confec]ionat\ dintr-un cauciuc semirigid, prev\zut\ la vârf cu o por]iune mult mai elastic\. O r\spândire destul de larg\ o are [i aparatura conceput\ de Kvasni]ki (1959) pentru `ns\mân]area frac]ionat\ a scroafelor. Este constituit\ din dou\ recipiente distincte, unul pentru sperm\ [i cel\lalt pentru diluant. Aparatura permite s\ se inoculeze prima dat\ sperma [i apoi mediul de dilu]ie. Cateterul este Fig. 10 Instrumentar pentru confec]ionat dintr-o tij\ metalic\, `ns\mân]area scroafelor prev\zut\ la vârf cu un man[on din (dup\ O. Ro[ca, 1994) cauciuc elastic (Dumitrescu I. [i colab., 1978) (fig. 10). 1.8.3.5. Inocularea spermei

Pentru `ns\mân]area artificial\ a scroafelor nu este necesar ca acestea s\ fie conten]ionate, mai ales pentru prima inoculare, care, de regul\, corespunde cu reflexul de imobilitate (Feredean T., 1968). ~n unit\]ile cu flux tehnologic industrial, dup\ depistare, scroafele sunt men]inute `n boxe individuale, unde se `ns\mân]eaz\ [i r\mân pân\ la un eventual ciclu de c\lduri (21 de zile). Aceast\ tehnologie permite efectuarea unei inocul\ri corecte, la timp [i cu rezultate mai bune decât `n cazul `ntre]inerii scroafelor `n boxe comune. ~n cazul `n care se folose[te sperma brut\, dup\ examinarea mobilit\]ii spermatozoizilor, se repartizeaz\ (prin simpla aspirare) `n recipientele din material plastic, `ntr-un volum de 50 ml, iar recipientul, printr-un tub de leg\tur\ din material plastic se adapteaz\ la un cateter. Opera]iunea trebuie s\ se fac\ `ntr-un timp cât mai scurt. Când se folose[te sperma diluat\, dup\ dilu]ie este aspirat\ `n recipientele din material plastic, sau `n cazul seringilor, aspirat\ cu ajutorul acestora.

94

Recipientul cu sperm\ se p\streaz\ o perioad\ scurt\ de timp, `ntr-un termos sau `ntr-o etuv\ reglat\ la 35-37oC. Pentru fiecare scroaf\, se folose[te sperma dintr-un recipient, care se scoate din termos sau etuv\ numai `n momentul inocul\rii. ~n cazul folosirii spermei diluate [i conservate la temperatura de 15oC sau la 4-5oC, dozele cu material seminal se re`nc\lzesc la 35-37oC [i se men]in `n termos sau `n vas cu ap\ cald\ pân\ `n momentul inocul\rii. Opera]iunea se face cu pu]in timp `nainte de inoculare, iar dozele se extrag din termos numai `n momentul `ns\mân]\rii. Se execut\ toaleta vulvei [i a regiunii perivulvare cu un tampon de vat\ `mbibat `ntr-o solu]ie dezinfectant\, cateterul se lubrifiaz\ cu vaselin\ neutr\ [i se introduce `n conductul vestibulo-vaginal, u[or orientat `n sus, pentru a nu fi introdus `n meatul urinar (fig. 11). Când vârful cateterului ajunge la nivelul cervixului, se rote[te u[or spre stânga `n vederea fix\rii cât mai bine `n conductul cervical (mai ales cateterele tirbu[onate). Recipientul cu Fig. 11 Schema inocul\rii spermei sperm\ se adapteaz\ la cateter, la scroaf\ (dup\ O. Ro[ca, 1994) prin intermediul tubului de plastic, apoi se preseaz\ u[or pere]ii acestuia, sincronizat cu timpii de relaxare a musculaturii cervicale, eliminarea `ntregii doze de sperm\ durând unu-dou\ minute. Doza de material seminal este de 100 ml sperm\ diluat\ sau de 50 ml sperm\ brut\ [i un num\r de 3-5 miliarde de spermatozoizi/doz\. ~n cazul folosirii spermei conservate prin congelare, dozele cu sperm\ trebuie decongelate la o temperatur\ de 37-40oC, asem\n\tor dozelor cu sperm\ de la rumeg\toare, apoi se inoculeaz\ ca atare sau completate cu un diluant `nainte sau imediat dup\ inoculare, func]ie de recomand\rile care `nso]esc dozele de sperm\ congelate (paiete, tuburi, granule). 1.8.4. Inocularea spermei la iap\

Eficacitatea inocul\rii spermei la iap\ este condi]ionat\ de mai mul]i factori: calitatea spermei, locul de depunere, momentul inocul\rii, instrumentarul `ntrebuin]at, corectitudinea efectu\rii `ns\mân]\rii, modul de conservare a spermei (brut\, diluat\, refrigerat\, congelat\). Sperma de arm\sar poate fi inoculat\ sub form\ brut\ (imediat dup\ recoltare), diluat\ sau conservat\ prin refrigerare [i congelare. Decongelarea tuburilor de sperm\ se face prin scoaterea lor din container [i trecerea `ntr-o baie-marie, la temperatura de 40oC, timp de 45-50 de secunde. Dup\ deschiderea tubului la unul din capete, se introduce vârful canulei sau sondei `n tub [i se aspir\ sperma, care se inoculeaz\ `ntr-un interval de timp cât mai scurt.

95

Decongelarea granulelor se face prin introducerea lor `ntr-un diluant, men]inut la temperatura de 40oC. Dup\ diluare, se aspir\ sperma `ntr-o sering\ special\ de `ns\mân]are [i se depune pe traiectul c\ilor genitale ale iepelor `n c\lduri. Instrumentarul pentru inoculare este constituit din sonde, confec]ionate din material plastic [i conectate la seringi sau recipien]i din material plastic. Se mai pot folosi diverse pipete din sticl\, lungi de 50cm [i cu un diametru de 4cm, catetere sau canule din cauciuc. Ca instrumentar ajut\tor este necesar un specul vaginal [i o surs\ de lumin\ (lamp\ frontal\, lantern\, sau un specul cu surs\ proprie de lumin\). Inocularea spermei la iap\ nu prezint\ dificult\]i sub aspectul tehnicii de lucru, dar ridic\ probleme legate de momentul inocul\rii `n perioada de c\lduri, moment care se stabile[te cu mult\ greutate `n practic\. Exist\ numeroase oscila]ii ale duratei ciclului sexual la iap\, func]ie de ras\, clim\, tehnologie de cre[tere, exploatare, alimenta]ie, zooigien\ etc. Cu toate acestea, s-a constatat c\ aproape fiecare iap\ are o anumit\ durat\ a ciclului sexual, care este caracteristic\. Iapa prezint\ cele mai tipice manifest\ri de comportament sexual, dintre toate femelele animalelor domestice. Iapa `n c\lduri adopt\ frecvent pozi]ia campat\ (specific\ montei), urineaz\ pu]in [i des, deschide [i `nchide succesiv vulva, cu proiectarea clitorisului `n afar\, este nelini[tit\, foarte sensibil\, uneori devenind retiv\. ~n herghelii, depistarea iepelor `n c\lduri se face prin intermediul arm\sarilor `ncerc\tori la bara sau peretele de `ncercare. Aici, se aduce arm\sarul [i dac\ iapa este `n c\lduri, va manifesta comportamentul sexual men]ionat [i nu va `ncerca lovirea arm\sarului. Dac\ iapa nu este `n c\lduri, refuz\ arm\sarul `ncercând s\-l loveasc\. M\surile de protec]ie a muncii [i a arm\sarului impun obligatoriu verificarea iepelor `n c\lduri la bara sau peretele de `ncercare, altfel, iapa poate lovi arm\sarul cu membrele posterioare, provocând leziuni grave sau chiar fracturi ale membrelor care impun sacrificarea animalelor. Iapa care urmeaz\ a fi `ns\mân]at\, se conten]ioneaz\ cu ajutorul platlonjelor [i iava[alei sau se introduce `ntr-un stand special (travaliu). Inocularea materialului seminal presupune introducerea extremit\]ii libere a sondei cateterului sau pipetei prin canalul cervical pân\ la nivelul cavit\]ii uterine unde urmeaz\ a fi depus\. Inocularea spermei se face prin dou\ metode: - colposcopic\ sau cu speculul vaginal; - manual\ sau tactil cervical\.

Metoda colposcopic\ pentru depunerea spermei la nivelul cavit\]ii uterine a iepei `n c\lduri, necesit\ folosirea canulei sau cateterului adaptat la sering\, speculum vaginal, surs\ de lumin\. ~n prealabil, se face toaleta vulvei [i a regiunii perivulvare cu ajutorul unui tampon de vat\ sau tifon `mbibat `n solu]ie dezinfectant\. Operatorul `ns\mân]\tor dep\rteaz\ pere]ii vaginului cu ajutorul specului vaginal [i apoi intruduce cateterul sau vârful sondei printre valvele speculului vaginal, prin canalul cervical, 10-12 cm [i apoi se depune sperma.

96

Metoda manual\ (tactil-cervical\) presupune dirijarea vârfului sondei sau canulei `n canalul cervical, cu ajutorul mâinii introdus\ `n vagin, mâna fiind protejat\ de o m\nu[\ din material plastic [i lubrifiat\ cu vaselin\ neutr\. Dup\ reperarea orificiului vaginal al cervixului, vârful sondei este dirijat `n lungul degetului ar\t\tor, pe o lungime de 10-12 cm prin canalul cervical `n cavitatea uterin\. Prin ap\sarea recipientului cu sperm\ sau pe pistonul seringii, sperma se depune `n uter. Prin aplicarea acestei metode exist\ riscul infect\rii mucoaselor vaginale [i cervicale cu flora microbian\ introdus\ `n timpul explor\rii vaginale. Doza de material seminal brut con]ine minim 0,5 miliarde spermatozoizi mobili iar volumul spermei brute este de 20 ml, iar a celei diluate 40-50 ml. Inocularea spermei se face imediat ce iapa a fost depistat\ `n c\lduri cu repetare din dou\ `n dou\ zile pân\ la `ncheierea perioadei estrale, având `n vedere c\ durata medie a estrului este de 4-5 zile cu varia]ii cuprinse `ntre 4 [i 9 zile. ~ntr-o perioad\ estral\, de regul\ se fac dou\-trei `ns\mân]\ri, la intervalul de timp men]ionat. Fecunditatea ob]inut\ la iepe, dup\ prima `ns\mân]are artificial\ este de 50-60%, iar dup\ dou\-trei `ns\mân]\ri se ridic\ la 70-80%, elementul principal fiind reprezentat de inocularea `n momentul optim al c\ldurilor, care este, dup\ cum s-a ar\tat, mai dificil de precizat `n condi]ii practice. Sperma proasp\t\ ca [i cea conservat\ prin refrigerare se admite pentru `ns\mân]are artificial\ numai atunci când are o mobilitate minim\ de 60%, iar sperma congelat\, o mobilitate minim\ de 35-40%. Având `n vedere scopul cre[terii cabalinelor, mai ales pentru curse, `n unele ]\ri, `ns\mân]area artificial\ la aceast\ specie este interzis\, fiind acceptat\ numai `n cazul experien]elor `ntreprinse `n centrele de cercetare (Fran]a). 1.8.5. Inocularea spermei la p\s\ri

P\s\rile, din punct de vedere al depunerii spermei, se `ncadreaz\ `n categoria de femele cu `ns\mân]are de tip tubar. Inocularea spermei se face cu scop de cercetare, selec]ie, ameliorare [i practic. P\s\rile pot fi `ns\mân]ate artificial numai `n perioada de ouat, `n afara acesteia, cloaca [i oviductul neputând fi exteriorizate. La g\ini [i curci, `ns\mân]\rile artificiale pot fi utilizate singure sau combinate cu `mperecherea natural\. Organizatoric, activitatea de `ns\mân]are artificial\ la g\ini, parcurge trei etape (Sauveur B. [i colab., 1988). Etapa I-a const\ `n recoltarea, condi]ionarea [i inocularea spermei. ~n aceast\ etap\, sunt necesari 30-50 de masculi [i 500-1000 de femele, pentru a se limita riscurile financiare ale aplic\rii acestei biotehnologii. Aceast\ etap\ premerg\toare este necesar\ `n vederea c\p\t\rii experien]ei necesare examin\rii spermei [i `n special evalu\rii fotometrice a num\rului de spermatozoizi [i a mobilit\]ii acestora, cât [i pentru ca echipa de `ns\mân]\tori s\ se deprind\ cu condi]ionarea [i inocularea spermei recoltate.

97

Etapa a II-a necesit\ mai multe mii de femele [i efectivul de masculi necesar `ns\mân]\rilor artificiale. Prin aceasta se urm\re[te intrarea `ntr-un anumit program [i ritm de munc\ suficient de rapid pentru a `ns\mân]a 250-300 de femele/or\/persoan\, ceea ce presupune o bun\ organizare a muncii. Etapa a III-a se refer\ la extinderea `ns\mân]\rilor artificiale la o scar\ mai mare cu asigurarea unui ridicat nivel de fecunditate [i permanentizarea personalului care deja s-a specializat `n efectuarea `ns\mân]\rilor artificiale. Dac\ se practic\ `ns\mân]area cu sperm\ brut\, aceasta se p\streaz\ `n tubul, fiola colectoare iar atunci când se dilueaz\, solu]ia cea mai simpl\ este cea de a recolta sperma direct `n fiolele care con]in cantitatea necesar\ de diluant. Inocularea spermei presupune folosirea unei aparaturi extrem de simple, format\ `n principiu, dintr-o sering\ din material plastic, cu capacitatea de 1 ml, divizat\ `n 100 de p\r]i, la care se ata[eaz\ o canul\ din material plastic, cu o lungime de 6-8 cm. ~ns\mân]area artificial\ poate fi executat\ [i cu ajutorul unei seringi gradate, tip insulin\ [i echipat\ cu o canul\ adecvat\, sau sperma poate fi ambalat\ `n paiete din material plastic care con]in `ntre 10 [i 50 de doze. Cantitatea de sperm\ brut\ care se inoculeaz\ este de 0,05-0,1 ml la g\ini [i de 0,03 ml la curci. Se mai folose[te [i inocularea cu material seminal diluat [i congelat, a[a cum s-a specificat la diluarea [i conservarea spermei. Timpul optim de `ns\mân]are la p\s\ri se refer\ la perioada sau chiar ora din zi, `n func]ie de ovula]ie [i formarea oului pe traiectul oviductului. Cele mai bune rezultate la curc\ se ob]in `n cazul `ns\mân]\rii efectuate `n a doua parte a zilei (orele11-17). La ra]e, `n schimb, cele mai bune rezultate s-au ob]inut `n urma `ns\mân]\rii efectuate `ntre orele 9-11 diminea]a (Besulin, 1974; Davtian [i colab., 1974 citat de I. Dumitrescu [i colab.). Printre factorii care influen]eaz\ rezultatele inocul\rii spermei la p\s\ri, cei lega]i de organismul femelei au o importan]\ deosebit\, `n specificul activit\]ii zilnice [i rolul complex al c\ilor genitale la p\s\ri. Rezerva de spermatozoizi `n oviductul g\inii este util\ pentru aproximativ o s\pt\mân\. Tehnica inocul\rii spermei La g\ini, inocularea spermei necesit\ aportul a dou\ persoane: una conten]ioneaz\, iar cealalt\ efectueaz\ `ns\mân]area propriu-zis\. G\ina este prins\ cu mâna stâng\ de fluiere [i ridicat\ la nivelul pieptului. Cu mâna dreapt\ se r\sfrânge coada pe spate [i prin apropierea p\s\rii de pieptul operatorului, coapsele g\inii preseaz\ abdomenul [i provoac\ deschiderea cloacei. Cu degetul mare al mâinii drepte se faciliteaz\ deschiderea oviductului pe partea stâng\ a cloacei (G. Bâltan [i colab., 1969).

Dup\ eviden]ierea oviductului, operatorul `ns\mân]\tor introduce canula de la seringa de `ns\mân]are pe o adâncime de 2-3 cm [i inoculeaz\ `ntreaga cantitate de sperm\, dup\ care presiunea asupra abdomenului `nceteaz\. Eviden]ierea oviductului se mai poate realiza [i prin conten]ia g\inii sub bra]ul stâng [i ap\sând abdomenul p\s\rii spre cloac\.

98

Presarea se face pân\ la ie[irea oviductului afar\ sub forma unui deget de m\nu[\ `ntors spre vârf. Cel de al doilea operator execut\ `ns\mân]area la 1-3 cm de deschiderea oviductului (M. Pop, 1963). Pentru g\inile crescute `n baterii, `ngrijitorul prinde pas\rea de picioare [i o conten]ioneaz\ cu partea posterioar\ spre deschiderea cu[tii sprijinind pieptul acesteia spre marginea bateriei. Cu mâna stâng\ `ndoaie u[or coada pe spate. Operatorul `ns\mân]\tor apas\ cu mâna la baza cloacei, provocând prolabarea oviductului, iar cu mâna dreapt\ introduce canula `n oviduct [i inoculeaz\ doza de sperm\ la o distan]\ de 5-6 cm ({tef\nescu [i colab.,1974). La curci, tehnica de inoculare, `n general, este asem\n\toare cu cea folosit\ la `ns\mân]area g\inilor. Dup\ conten]ionarea curcii [i eviden]ierea deschiderii oviductului, sperma se depune pe lumenul oviductului la 4-5 cm de la deschiderea posterioar\.

99

~NTREB|RI RECAPITULATIVE

1. Care sunt principalele avantaje ale aplic\rii `ns\m`n]\rilor artificiale la animale? 2. În ce const\ organizarea [i conducerea activit\]ii pe linia `ns\m`n]\rilor artificiale `n ]ara noastr\? 3. Care sunt etapele selec]iei masculilor de reproduc]ie? 4. Caracteriza]i metodele de prelucrare a spermei la animale. 5. Ce semnific\ spermograma? 6. Enun]a]i principiile dilu\rii spermei [i detalia]i tehnicile de diluare a spermei animalelor. 7. Care sunt avantajele [i dezavantajele conserv\rii spermei la diferite niveluri de temperatur\? 8. Care sunt metodele de inoculare a spermei la animalele domestice?

100

CAPITOLUL II BIOTEHNOLOGIA TRANSFERULUI DE EMBRIONI LA ANIMALE

REZUMAT

Ameliorarea producţiei animale a beneficiat în mod tradiţional de progresele realizate în mai multe domenii: selecţia geneticii, controlul reproducţiei, vaccinarea, echilibrul raţiilor alimentare. Pentru perfecţionarea continuă a procesului de reproducere în ultimele 2-3 decenii, atât pe plan mondial cât şi în ţara noastră, se aplică cu succes biotehnologia transferului de embrioni. Transferul de embrioni este o metodă modernă de intensivizare a reproducţiei care constă în a recolta, după superovulare şi fecundaţie, embrioni din aparatul genital al femelei donatoare şi a-i transfera în aparatul genital ale uneia sau mai multor femele receptoare unde urmează ca aceştia să se dezvolte. Prin acest procedeu, gradul de utilizare al femelelor de mare valoare zootehnică creşte considerabil, numărul de produşi care pot fi obţinuţi în aceeaşi perioadă de la o femelă crescând foarte mult. Biotehnologia transferului de embrioni presupune cunoaşterea proceselor fiziologice intime legate de ovulaţie, particularităţile ciclului sexual al femelelor şi evoluţia zigotului în primele zile de la fecundaţie. Transferul de embrioni include următoarele etape: selecţia şi pregătirea femelelor donatoare şi receptoare, sincronizarea estrului şi ovulaţiei la femelele donatoare şi receptoare, inducerea poliovulaţiei şi însămânţarea artificială a femelelor donatoare, recoltarea, conservarea şi transferul embrionilor.

2.1. Importan]a transferului de embrioni Importan]a transferului de embrioni poate fi zooeconomic\ [i [tiin]ific\. Importan]a zooeconomic\. Lucr\rile de selec]ie [i ameliorare a efectivelor de animale sunt limitate de num\rul redus de produ[i care se ob]in de la o femel\ `n cursul vie]ii sexuale [i de intervalul dintre genera]ii. Asupra animalelor valoroase, ambii factori sunt frenatori, treptele amelior\rii num\rându-se `n genera]ii succesive. Transferul de embrioni d\ posibilitatea folosirii cu eficien]\ crescut\ a rezervelor de ovocite de la animalele de `nalt\ valoare zootehnic\ numite donatoare, prin provocarea matur\rii [i eliber\rii mai multor game]i femeli (poliovula]ie) cu ob]inerea unui num\r mai mare de produ[i de la aceea[i femel\ prin transferul embrionilor `n uterul femelelor receptoare. Astfel,

101

`n decursul vie]ii sexuale este valorificat\ doar o infim\ parte din rezerva de ovocite cu care femela ajunge la maturitatea sexual\. De exemplu, vaca `ncepe perioada genital\ cu o rezerv\ de circa 150000 de ovocite (`n ambele ovare), rezerv\ care diminu\ la circa 21000 la vârsta de 2-3 ani [i la circa 2500 la 12-14 ani. Num\rul de ovocite eliberate `n `ntreaga via]\ sexual\ nu dep\[e[te 50, din care `n condi]ii normale rezult\ maxim 1012 vi]ei. O scroaf\ poate produce `ntr-un ciclu pân\ la 50 de ovule din care se vor dezvolta 10-15 purcei. Prin asigurarea num\rului corespunz\tor de animale primitoare, de la vacile donatoare se pot ob]ine, `n medie 3-4 vi]ei pe an, fiind cunoscute cazuri când `n condi]ii de supraovula]ie, de la o vac\ donatoare s-au ob]inut 30-35 vi]ei. Transferul de embrioni se practic\ [i pentru scurtarea intervalului dintre genera]ii. Prin instalarea gesta]iei, femela intr\ `n repaus productiv (sub raportul procreerii) pe `ntreaga durat\ a gesta]iei. ~n cazul practic\rii transferului de embrioni, produ[ii de concep]ie sunt transfera]i `n alte organisme, ceea ce d\ posibilitatea ob]inerii de noi produ[i de la aceea[i femel\ `n intervalul de timp `n care `n mod normal, ar fi trebuit s\ fie gestant\. Mai mult, `n prezent se pot ob]ine game]i [i de la tineretul femel prepuber prin provocarea prin mijloace hormonale a matur\rii [i expulz\rii ovocitelor, care vor fi apoi transferate `n uterul femelelor receptoare. Scurtându-se mult intervalul dintre genera]ii, se accelereaz\ ameliorarea efectivelor de animale. Transferul de embrioni reduce considerabil costurile de transport, carantin\ [i eventualele restric]ii sanitar-veterinare `n comer]ul cu animale, prin conservarea prin congelare a embrionilor. Totodat\, prin practicarea transferului de embrioni, se pot ob]ine produ[i de la femelele valoroase dar cu diverse afec]iuni genitale incompatibile cu men]inerea gesta]iei sau cu parturi]ia. Prin apelarea la transferul de embrioni se pot ob]ine gemeni de la taurinele de carne, prin transferarea unui embrion suplimentar ob]inut de la femelele dintr-o ras\ convenabil\. De asemenea, prin transferul de embrioni se reduce intervalul de timp necesar cre\rii de noi rase de animale cu `nsu[iri morfo-productive performante care pot forma linii de femele consangvine `n vederea folosirii lor la `ncruci[\ri industriale. ~n sintez\, `n practica de produc]ie, transferul de embrioni se aplic\ pentru rezolvarea urm\toarelor probleme: - reproducerea accelerat\ a animalelor de pr\sil\, de calitate superioar\, a raselor rare, a animalelor din rezerva genetic\ a purt\toarelor unor `nsu[iri valoroase (produc]ii ridicate, capacitate de utilizare intens\ a furajelor, prolificitate mare, longevitate productiv\, rezisten]\ la anumi]i factori nefavorabili etc.); - ob]inerea unui num\r mare de descenden]i de la femelele cu produc]ii ridicate [i cu durat\ prelungit\ de exploatare, `n vederea cre\rii de familii cu aceste `nsu[iri; - ra]ionalizarea importului [i exportului animalelor valoroase, ca urmare a transportului embrionilor congela]i, `nl\turându-se

102

astfel barierele sanitar-veterinare [i `nlesnirea aclimatiz\rii materialului importat, dezvoltarea lui embrionar\ având loc `n organismul primitoarelor; - ob]inerea de embrioni liberi de leucoz\ cu posibilitatea transferului acestora femelelor leuco-negative; - crearea unor b\nci de embrioni `n vederea p\str\rii ra]ionale a rezervelor genetice, ceea ce este mai economic decât `ntre]inerea unor efective numeroase din rezerva genetic\. Importan]a [tiin]ific\ Transferul de embrioni reprezint\ o biotehnologie prin intermediul c\reia se poate efectua, `n condi]ii optime, un aprofundat studiu [tiin]ific al proceselor intime legate de fecunda]ie [i de influen]ele matern\ [i patern\ asupra produsului de concep]ie. Totodat\, poate fi studiat\ dezvoltarea embrionar\ la animale, diversele abateri de la dezvoltarea normal\, cauzele [i factorii care genereaz\ mortalitatea embrionar\. Produ[ii ob]inu]i prin transferul de embrioni permit studierea influen]elor factorilor genetici [i ai mediului extern asupra dezvolt\rii embrionilor, ereditatea grupelor sanguine, ob]inerea de animale „mozaic de gene“, a concentr\rii mai multor caractere pe acela[i individ, a instituirii unei profilaxii [i terapeutici genetice pentru unele boli de metabolism. Pe aceea[i linie, transferul de embrioni reprezint\ baza unei noi genera]ii de biotehnici care deriv\ din aceasta sau `i sunt asociate: bisec]ia embrionilor, sexajul, fecunda]ia „in vitro“ clonarea, transferul de gene, iar ingineria genetic\ folose[te ca verig\ important\, `n metodologie, aceast\ biotehnologie. Micromanipularea [i microchirurgia ovocitelor [i a embrionilor permit desf\[urarea unei cercet\ri [tiin]ifice interesante, [i ob]inerea din punct de vedere practic a unor `nalte performan]e `n reu[ita transferului de embrioni, prin transferul jum\t\]ilor de embrioni. Sexul embrionului poate fi precizat cu mult\ acurate]e, baza investiga]iei fiind dat\ de transferul embrionilor. Reproducerea, f\r\ contribu]ia genetic\ a partenerului, se poate realiza prin ginogenez\, fiind deja ob]inu]i primii [oareci homozigo]i, (Groza I., 1996). Aspecte similare ridic\ androgeneza `n care se poate induce bispermia, adic\ p\trunderea `n ovul a doi spermatozoizi, cu retragerea ulterioar\ a pronucleului femel [i `n consecin]\ diviziunea va continua numai `n zona masculin\ (Groza I., 1996). 2.2. Biotehnologia transferului de embrioni la vac\ La bovine, transferul de embrioni a devenit o biotehnologie de reproduc]ie larg r\spândit\ `n lume. Tehnicile de lucru sunt foarte bine st\pânite, astfel `ncât aceast\ modern\ biotehnologie poate fi extins\ la aproape toate fermele de cre[terea vacilor din lume. Astfel, `n Europa se ob]in anual circa 100000 de produ[i prin transfer de embrioni, iar pe plan mondial circa 300000 de produ[i, extinderea biotehnologiei fiind limitat\ de costurile destul de ridicate. Rezultatele transferului de embrioni la bovine sunt redate `n tabelul 1.

103

Tabelul 1 Situa]ia transferului de embrioni la bovine, `n 1996 (dup\ IETS*) Continent

Nr. vaci superovulate 2321

Embrioni transferabili 17732

Num\r embrioni transfera]i ProaCongeTotal spe]i la]i 6418 3722 10140

(%) din total 2,5

7431

169201

41

13552

49861

12

51851 52655 4008 200102

64119 111321 8354 412996

15,5 27 2 100

Africa America 41601 228242 94887 de Nord America 6375 37922 36309 de Sud Asia 11482 53364 12268 Europa 24133 129095 58666 Oceania 2398 11520 4346 Total 88310 477857 212894 *International Embryo Transfer Society

Transferul de embrioni constituie, totodat\, baza unei noi genera]ii de biotehnici, care deriv\ din aceasta sau `i sunt asociate, cum ar fi: bisec]ia embrionilor, sexajul, fecunda]ia ,,in vitro“, clonarea, transferul de gene. Transferul de embrioni presupune parcurgerea urm\toarelor etape (fig. 12): SELEC}IA DONATOARELOR

SELEC}IA RECEPTOARELOR

TRATAMENTUL DE SUPEROVULARE PMSG -

tipul

-

FSH-p doza schema de administrare SINCRONIZAREA CICLULUI SEXUAL CU AL DONATOARELOR I.A. A DONATOARELOR

RECOLTAREA EMBRIONILOR

CONSERVAREA EMBRIONILOR

TRANSFERUL EMBRIONILOR

Fig. 12 Schema transferului de embrioni la animale

104

-

selec]ia [i preg\tirea vacilor donatoare ; selec]ia [i preg\tirea vacilor primitoare (receptoare); sincronizarea estrului [i ovula]iei la vacile donatoare [i primitoare; inducerea poliovula]iei [i `ns\mân]area artificial\ a vacilor donatoare; recoltarea embrionilor; conservarea embrionilor; transferul embrionilor.

2.2.1. Selec]ia [i preg\tirea vacilor donatoare

Vacile donatoare de embrioni trebuie s\ `ntruneasc\ la cel mai `nalt nivel caracterele zootehnice care intereseaz\. De aceea, când se face selec]ia donatoarelor, se are `n vedere evaluarea urm\toarelor criterii: performan]a reproductiv\, superioritatea genetic\ [i valoarea produsului ob]inut prin transfer embrionar. Vaca donatoare va fi mai performant\ reproductiv atunci când vârsta se situeaz\ `ntre 3 [i 10 ani, a n\scut anual câte un vi]el, a r\mas gestant\ `n maxim dou\ cicluri sexuale, ciclurile de c\lduri au o succesiune fiziologic\ [i nu a avut antecedente ginecologice (distocii, reten]ii placentare, infec]ii genitale etc.). Practic, criteriile care se au `n vedere sunt: o stare ginecologic\ perfect\, intervalul dintre parturi]ie [i primul estru s\ fie mai mic de 60 de zile, intervalul parturi]ie`ns\mân]area fecund\ s\ fie mai redus de 80 zile iar indicele de gesta]ie s\ fie mai mic de 1,5. Superioritatea genetic\ const\ `ntr-un ritm superior de cre[tere, `nainte [i dup\ `n]\rcare [i un randament ridicat la sacrificare. ~n cazul vacilor de lapte, `nsu[irile cu heritabilitate ridicat\ se refer\ la produc]ia de lapte, procentul de gr\sime din lapte [i conforma]ia corporal\. Vacile donatoare trebuie s\ fie s\n\toase, ele suportând mai multe interven]ii de supraovulare [i recoltare de embrioni. O aten]ie deosebit\ trebuie s\ se acorde alimenta]iei ra]ionale a acestei categorii de vaci. Pentru vacile de carne, necesarul de hran\ minim variaz\ cu greutatea corporal\ a femelei, cu stadiul gesta]iei, cu stadiul [i nivelul lacta]iei. Alimenta]ie pentru gesta]ie [i lacta]ie nu este necesar\ pentru vacile donatoare, `ns\ trebuie s\ fie inclus\ `n ra]ia de hran\ a primitoarelor, dup\ instalarea gesta]iei. De regul\, vacile donatoare de embrioni sunt grupate dup\ m\rime [i/sau necesit\]i nutri]ionale pentru care se `ntocmesc de nutri]ioni[ti, ra]ii cât mai complete care s\ asigure necesarul de hran\ zilnic pentru fiecare grup\. Vacile donatoare dup\ supraovulare, vor fi `ns\mân]ate artificial cu material seminal provenit de la cei mai valoro[i tauri. ~ns\mân]area artificial\ se face `n perioada optim\, `n vederea asigur\rii unui nivel ridicat de fecunditate, evitându-se infectarea tractusului genital al femelei donatoare etc.

105

2.2.2. Selec]ia [i preg\tirea vacilor primitoare (receptoare)

Vacile receptoare de embrioni trebuie s\ fie s\n\toase, f\r\ afec]iuni ginecologice, s\ aib\ aceea[i talie cu donatoarele, s\ fie apte s\ nasc\ descenden]i cu aceea[i greutate la na[tere ca donatoarele, avându-se `n vedere c\ gesta]ia constituie un fenomen morfo-fiziologic complex ce presupune eforturi suplimentare deosebite din partea organismului matern. Cele mai bune rezultate se ob]in atunci când transferul de embrioni se face la tineretul femel `n vârst\ de 18-20 de luni. 2.2.3. Sincronizarea estrului [i ovula]iei la vacile donatoare [i primitoare

Sincronizarea ciclului sexual la vacile donatoare [i receptoare de embrioni se poate realiza pe cale natural\ sau medicamentoas\. ~n cazul sincroniz\rii femelelor prin mijloace naturale se urm\resc, `n lotul receptoarelor femelele care `n mod spontan manifest\ estrul `n acela[i timp cu donatoarele. Principalul dezavantaj const\ `n fapul c\ sunt necesare multe animale receptoare `n a[teptare. Aceast\ modalitate de sincronizare s-a practicat `n perioada de `nceput a transferului de embrioni, când s-au folosit pentru transfer embrionii proasp\t recolta]i. ~n aceast\ situa]ie, `n aceea[i unitate trebuia s\ fie [i vaci donatoare [i receptoare, iar transferul embrionilor trebuia s\ se realizeze `ntr-un timp relativ scurt (4-6 ore de la recoltare). Sincronizarea estrului prin mijloace medicamentoase se bazeaz\ pe faptul c\ se urm\resc succesiv dou\-trei cicluri de c\lduri la vacile donatoare [i se stabile[te durata ciclului. ~n acest fel se poate calcula data apari]iei ciclului care intereseaz\ `n transferul de embrioni. ~n func]ie de data previzibil\, se ac]ioneaz\ prin tratamente hormonale asupra unui grup de femele primitoare `n vederea inducerii c\ldurilor, sincronizate cu c\ldurile naturale ale donatoarei. ~n acest caz se ac]ioneaz\ asupra donatoarei numai `n ceea ce prive[te inducerea poliovula]iei. Sincronizarea medicamentoas\ a ciclului estral al femelelor donatoare [i receptoare de embrioni se realizeaz\ pe dou\ c\i: blocarea eliber\rii hormonilor gonadotropi sau prin inducerea luteolizei. Prima cale presupune folosirea progesteronului, sau a progestinelor sintetice care prin retroac]iune `[i exercit\ efectul negativ asupra hipotalamusului, diminuând nivelul hormonilor gonadotropi. (Vezi capitolul „Sincronizarea estrului“). 2.2.4 Inducerea poliovula]iei [i `ns\mân]area artificial\ a vacilor donatoare

Provocarea eliber\rii concomitente la aceea[i perioad\ de c\lduri a unui num\r sporit de ovocite decât cel caracteristic speciei se nume[te poliovula]ie (supraovula]ie, superovula]ie). Coordonarea neurohormonal\ a dezvolt\rii [i matur\rii foliculilor ovarieni ca [i a ovula]iei sunt cunoscute pân\ `n cele mai mici detalii, ceea ce a permis cercet\torilor experimentarea unei serii de scheme de tratamente hormonale care s\ induc\ poliovula]ia. Dintre multiplele scheme de

106

tratament experimentate, practica zootehnic\ a re]inut pe cele mai simple [i mai eficiente. Tratamentele actuale aplicabile in „vitro“ se sprijin\ pe cunoa[terea mecanismelor foliculogenezei, a efectului tonic al hormonilor gonadotropi (FSH, LH) care intervin `ndeosebi `n ultima faz\ a cre[terii [i matur\rii foliculare. Poten]ialul ovarian de foliculi ter]iari (cu antrum) r\mâne relativ constant (`ns\ variabil cu individul) de la vârsta de dou\ luni pân\ la 12 ani (Nibart M., 1991). Fiziologic, la vac\, un singur folicul ajunge la maturitate `n preajma ovula]iei, `n timp ce, `n timpul unui ciclu sexual, 10-20 de foliculi degenereaz\. Injec]ia unui hormon cu activitate de FSH `mpiedic\ atrezia unor foliculi [i stimuleaz\ dezvoltarea [i maturarea simultan\ a mai multor foliculi ter]iari, `n cursul aceluia[i ciclu estral. ~n prezent, dou\ scheme clasice de tratament poliovulator sunt aplicate, ambele bazate pe efectul foliculo stimulant al hormonilor gonadotropi: serul gonadotrop de iap\ gestant\, liofilizat [i standardizat PMSG (Pregnant Mare Serum Gonadotropin) denumit [i Ecvin Chorionic Gonadotropin (ECG), produs de celulele corionice ale iepei gestante [i hormonul de stimulare folicular\ (FSH) extras din hipofiza anterioar\. PMSG se extrage din serul sanguin al iepei gestante [i are o dubl\ activitate: de tip FSH [i LH, raportul FSH/LH variaz\ de la 1/1 la 1/5 (Saumande J., 1987). Perioada de `njum\t\]ire destul de lung\ - 120 ore - a acestui hormon determin\ o u[urin]\ `n folosire, o singur\ injec]ie de 2000-2500 U.I. i.m. fiind eficient\ `n provocarea poliovula]iei. La dou\trei zile de la injectarea PMSG se administreaz\ i.m. o doz\ de 500-750 µg prostaglandin\ F2α, c\ldurile ap\rând la circa 48-60 de ore de la injectarea prostaglandinei. Folosirea PMSG antreneaz\ [i unele efecte negative traduse prin cre[terea folicular\ [i secre]ia ridicat\ de estradiol [i dup\ desc\rcarea preovulatorie de LH. Acest efect negativ poate fi contracarat prin injectarea i.v. a unui anticorp anti PMSG concomitent cu prima sau cea de a doua `ns\mân]are artificial\ (de ex. Neutra -PMSG intervet). Fecundarea ovocitelor se face, de regul\, prin `ns\mân]area artificial\ a vacilor la un interval de 12 ore de la `nceputul estrului cu repetare la 8-12 ore interval. FSH – se prepar\ din extractele purificate par]ial, provenite din hipofiza mamiferelor - `n principal de suine - care con]ine FSH [i LH. Con]inutul `n cei doi hormoni [i raportul dintre ace[tia variaz\ cu lotul. Perioada de `njum\t\]ire foarte scurt\ (circa 70 minute a acestui hormon necesit\ injectarea lui bicotidian timp de 4 zile, `n vederea men]inerii unui nivel sanguin suficient de ridicat. Func]ie de preparatul comercial, raportul dintre FSH [i LH, de regul\ variaz\ de la 1 la 0,5. Dozele totale care se administreaz\, `n vederea producerii poliovula]iei, variaz\ de la 28 mg la vi]elele de lapte, la 40 mg pentru vaci, injec]iile f\cându-se `n ritm descresc\tor, intramuscular sau subcutanat. Preparatele care con]in ace[ti hormoni au denumiri care difer\ cu unitatea produc\toare: FSH-p, Stimufol, Ovaset, Follitropin, Superov, Ovagen, Pluset etc.

107

Ca [i cealalt\ schem\ de tratament, injectarea prostaglandinei F2α, `n doz\ de 500-750 µg se face la 48-72 de ore de la `nceperea tratamentului, estrul ap\rând la circa 50-60 ore de la injectarea prostaglandinei. Fecundarea ovocitelor se face prin `ns\mân]area artificial\ a femelelor supraovulate de dou\ ori, la 12 [i 24 ore de la apari]ia estrului. Scheme de tratament pentru inducerea poliovula]iei Preparatele medicamentoase care con]in hormoni gonadotropi sunt injectate `n faza luteal\ a unui ciclu natural sau indus, cel mai frecvent `ntre ziua a 9-a [i a 13-a. Dou\ zile dup\ injec]ia de PMSG sau concomitent cu a 5-a injec]ie de FSH, se injecteaz\ un analog de PGF2α (de ex. 0,5-1 mg Cloprostenol) care are efect luteolitic permi]ând ovula]iile (fig. 13 [i 14).

POLIOVULA}IE FSH p

1

ANTILUTEOTROP

2 IMPLANT NORGESTOMET 9 zile

POLIOVULA}IE PMSG ANTI-PMSG

3

ANTILUTEOTROP

4 IMPLANT NORGESTOMET 9 zile

Fig. 13 Scheme de inducere a poliovula]iei la vacile donatoare de embrioni (dup\ M. Thibier [i M. Nibart, 1991)

108

PMSG PGF2α

1

PMSG PGF2α Gn-RH

2

PMSG PGF2α HCG

3

FSH PGF2α

4

Fig. 14 Scheme de inducere a poliovula]iei la vacile donatoare de embrioni (dup\ I.C.P.C.B. Balote[ti)

O alt\ schem\ de tratament const\ `n utilizarea progestinelor pe cale oral\, parenteral\, intravaginal sau implant subcutanat timp de 9-12 zile. Progestinele blocheaz\ axul hipotalamo-hipofizo-ovarian, prin neeliberarea de FSH dar mai ales de LH. Cât timp receptorii axului hipotalamo-hipofizar se g\sesc sub ac]iunea temporar\ a progestinelor, femela nu va manifesta estru [i nici nu va ovula. Dup\ suprimarea terapiei cu progestine, se produce o desc\rcare rapid\, compensatoare de Gn-RH, ceea ce va determina, `n decurs de 5-7 zile, intrarea `n c\lduri ovulatorii a femelelor tratate. ~n cursul unui astfel de tratament de blocare a ciclului se poate injecta hormonul de stimulare (FSH-p) bicotidian, `n ritm descresc\tor `ncepând cu a 6-a zi de la blocarea ciclului, concomitent cu o injec]ie intramuscular\ de PGF2α. ~n cazul `ntrebuin]\rii preparatelor hormonale pe baz\ de PMSG, acestea se injecteaz\, `mpreun\ cu o doz\ de prostaglandin\ F2α, `n a 6-a - a 7-a zi de la introducerea implantelor, pesariilor etc., urmat\ de injectarea unei doze de anti PMSG concomitent cu a 2-a `ns\mân]are artificial\ (fig. 13 [i fig. 14).

109

O schem\ mai simpl\ de provocare a poliovula]iei const\ `n `nceperea tratamentului cu hormoni gonadotropi `n a 15-a, a 16-a zi a ciclului estral la vi]ele [i `n a 16-a, a 17-a zi a ciclului sexual la vaci, `ns\ num\rul de embrioni ob]inu]i este mult mai redus. Rezultate bune `n provocarea poliovula]iei s-au ob]inut prin injectarea unei doze de Gn-RH la vacile poliovulate `nainte de prima `ns\mân]are artificial\ sau concomitent cu aceasta, `n vederea grup\rii ovula]iilor. Prin provocarea poliovula]iei se pot ob]ine de circa 8-10 ori mai mul]i embrioni, decât `n cazul recuper\rii unui singur ou de la femelele nesupuse tratamentului poliovulator (foto 23). Exist\ o varia]ie mare `n ceea ce prive[te r\spunsul la tratamentul poliovulator, din partea vacilor. Aceast\ varia]ie pronun]at\ se datoreaz\ hormonului utilizat, purit\]ii acestuia [i de specificul individual al femelelor. Cercet\rile au relevat faptul c\ circa 10-20% dintre vaci nu r\spund la tratamentul poliovulator, alte 20-25% r\spund slab la un astfel de tratament (1-3 embrioni transferabili pe vac\ tratat\) [i doar 30-40% dintre vaci au un r\spuns ideal la tratamentul de superovula]ie furnizând 7-12 embrioni/vac\/tratament iar 5-10% dintre femelele tratate furnizeaz\ mai mult de 20 de embrioni. ~n prezent, stimularea ovarian\ pare a fi atins un anumit plafon `ntrucât, se colecteaz\, `n medie 9-10 embrioni (limite `ntre 0-50), iar cel al embrionilor viabili este de 5-6 (limite `ntre 0-30), din care 3 congelabili (Nibart, Thibier, Chouke 1988).

Foto 23 Ovare superovulate

~n ceea ce prive[te repetarea tratamentelor de superovula]ie la aceea[i donatoare, s-a constatat c\ tratamentele pot fi repetate pe intervalul a mai multor luni sau a mai multor ani. Produc]ia total\ de embrioni de la aceea[i donatoare depinde de aceasta [i de ritmul de colectare. Este necesar un interval de cel pu]in 60 de zile dup\ f\tare `n vederea `nceperii tratamentului poliovulator. Unii cercet\tori constat\ o reducere a num\rului de embrioni transferabili o dat\ cu repetarea tratamentului cu PMSG, fapt ce se explic\ prin formarea `n organismul femelei tratate a anticorpilor anti-PMSG [i reducerea categoriilor de foliculi sensibili la stimulare. Pentru a se evita acest efect negativ,

110

repetarea tratamentului trebuie s\ se fac\ la un interval de 54-60 de zile [i s\ se intercaleze tratamentele pe baz\ de PMSG [i FSH-p. Rezultatele tratamentelor de superovulare sunt influen]ate de vârsta femelelor, ras\, mascul, sezon, nivelul produc]iei de lapte, starea general\, etc. De regul\, vi]elele produc un embrion viabil mai pu]in decât vacile adulte. 2.2.5. Fecundarea ovocitelor

Ovocitele sunt fecundate `n urma `ns\mân]\rii naturale sau artificiale. De regul\, se efectueaz\ dou\ `ns\mân]\ri artificiale la interval de 12-24 de ore de la `nceputul c\ldurilor observate clinic sau, sistematic, dup\ 56 [i 72 de ore de la injec]ia cu PGF2α, sau dup\ 36 [i 48 de ore de la retragerea implantelor sau pesariilor. 2.2.6. Recoltarea embrionilor Embrionii sunt colecta]i atunci când se g\sesc `n cornul uterin, dup\ ie[irea lor din oviduct (`ntre zilele 4-5). Din motive sanitare [i de congelare se prefer\ colectarea embrionilor `nc\ inclu[i `n zona lor pelucid\ (ies `n a 9-a zi). Cel mai frecvent, colectarea se realizeaz\ `ntre zilele 6-8 dup\ fecunda]ie, de regul\ `n ziua a 7-a. Recoltarea embrionilor se face chirurgical [i nechirurgical. Mult timp, metoda chirurgical\ a fost singura utilizat\. Tehnica operatorie presupunea parcurgerea a dou\ etape: laparotomia, cu exteriorizarea aparatului genital `n plag\ [i recoltarea propriu-zis\ a embrionilor prin sp\larea cu un lichid cu o compozi]ie special\, a oviductelor (dup\ un interval de timp mai mic de 3 zile dup\ `ns\mân]are) sau a coarnelor uterine (dup\ un interval de timp mai mare de 4 zile de la `ns\mân]are). ~n prezent, metoda chirurgical\ de recuperare a embrionilor la vac\ este abandonat\, datorit\ inconvenientelor pe care le prezint\. Ast\zi, este generalizat\ metoda nechirurgical\ de prelevare a embrionilor, a c\rei principiu const\ `n sp\larea coarnelor uterine cu un mediu special preparat, sp\lare care se realizeaz\ `n condi]ii de asepsie `n a 7-a zi de la `ns\mân]are. Tehnica nechirurgical\ de colectare a embrionilor s-a perfec]ionat continuu, firme specializate produc pe scar\ industrial\ mediul de recoltare, congelare, decongelare [i `ntreaga aparatur\ necesar\ recolt\rii [i transferului embrionilor. Tehnicile nechirurgicale de recoltare a embrionilor presupun mai multe opera]ii: conten]ia femelei, anestezia, vidarea rectului, toaleta vulvei [i a regiunii perivulvare, identificarea prezen]ei corpilor galbeni pe ovar, introducerea lichidului de sp\lare `n lumenul coarnelor uterine, sp\larea acestora, recuperarea lichidului `mpreun\ cu embrionii, identificarea [i recuperarea embrionilor din lichidul recuperat [i supus decant\rii [i aprecierea morfologic\ a acestora. ~n condi]ii de ferm\, recoltarea embrionilor se face la locul unde se g\se[te femela donatoare, dup\ ce `n prealabil, vecinele acesteia au fost `ndep\rtate. Femela se conten]ioneaz\ adecvat, astfel `ncât s\-i fie limitate mi[c\rile, trecerea sondei prin canalul cervical care este `nchis, provocând dureri animalului [i implicit, reac]ie de ap\rare. Pentru a

111

suprima durerea, se practic\ anestezia epidural\ cu 4-6 ml procain\ 2% sau cu 10 ml ludocain\ 1%, care blocheaz\ nervii coccidieni [i ultimele perechi de nervi sacrali (S3, S4, S5). Acul se introduce `ntre prima [i a doua vertebr\ coccigian\ sau `ntre ultima vertebr\ sacral\ [i prima vertebr\ coccigian\, anestezia instalându-se dup\ circa 10-15 minute [i dureaz\ `n jur de 90 de minute, zonele insensibilizate fiind: coada, anusul, rectul, vulva, vaginul [i uterul. Se introduce, cu precau]iile de rigoare, mâna `n rect, acesta se videaz\ de con]inut, apoi se apreciaz\ r\spunsul femelei la tratamentul poliovulator, palpându-se cu aten]ie ambele ovare [i num\râdu-se corpii galbeni (foto 24). ~n cazul `n care r\spunsul la tratamentul de superovulare este pozitiv, se procedeaz\ cu precau]ie la introducerea cateterului de tip Folley cu dou\ sau trei c\i, prin conductul cervical pân\ `n cornul uterin. Pentru rigidizarea cateterului, se introduce pe lumenul acestuia un mandren (tij\ metalic\), care se men]ine pân\ se ajunge `n lumenul cornului uterin, apoi se retrage. Cateterul este introdus circa 5-8 cm de la bifurca]ia coarnelor uterine, pe unul dintre acestea, apoi se introduce de la exterior, cu seringa, 8-15 ml de aer `n scopul fix\rii cateterului [i pentru a `mpiedica refularea din cervix a lichidului de sp\lare. Vasul din sticl\, ce con]ine lichidul de sp\lare se suspend\ la 1,5 m de la sol [i, prin c\dere, acesta ajunge prin calea de admisie a cateterului `n coarnele uterine. Irigarea acestora se face continuu, calea de evacuare a lichidului este conectat\, printr-un tub de plastic, la vasul de colectare a mediului recuperat (de sp\lare). Recuperarea lichidului de sp\lare se face prin calea de admisie (`n cazul Foto 24 Recoltarea embrionilor prin cateterului cu dou\ c\i la care s-a metoda nechirurgical\ adaptat o pies\ `n forma literei y) prev\zut cu canal de admisie [i evacuare al lichidului, ramura de evacuare a lichidului fiind conectat\ la un filtru de colectare a c\rui orificii au un diametru de 75 µm, care are rolul de re]inere a embrionilor, lichidul ce traverseaz\ filtrul fiind colectat `ntr-un recipient situat sub filtru. Mediul folosit la sp\larea unui corn uterin se folose[te la sp\larea, `n acela[i mod, a celui de-al doilea corn uterin. Cantitatea de mediu care se folose[te pentru sp\larea unui corn uterin este de 300-500 ml, efectuându-se irig\ri repetate [i un masaj transrectal permanent al cornului uterin perfuzat. Exist\ diverse sonde de recuperare a embrionilor, imaginate de diver[i cercet\tori, care se bazeaz\ pe acela[i principiu constructiv (Elsden [i colab., 1978, Newcomb [i colab., 1978, Cassou etc.).

112

~ntre momentul recuper\rii embrionilor [i cel al inocul\ri lor `n uterul receptoarelor, zigo]ii trebuie s\ fie men]inu]i `n via]\ `n condi]ii speciale [i s\ fie manipula]i `n cele mai bune condi]ii tehnice [i igienice. Compozi]ia mediilor de recoltare [i cultivare a embrionilor s-a modificat frecvent `n decursul timpului, pe m\sur\ ce cuno[tin]ele `n domeniu au avansat [i pe baza multiplelor experien]e `ntreprinse. ~n ultimii ani s-a generalizat folosirea unei solu]ii tampon fosfat PBS – (Fosfat bufferet salin) pentru sp\larea coarnelor uterine [i pentru p\strarea embrionilor recupera]i. Acest lichid are un pH de 7,2, o presiune osmotic\ de 290 miliosmoli [i con]ine multe s\ruri minerale, glucoz\ [i protein\ (albumin\ bovin\ seric\, 2-4 g/l, sau ser de vi]el fetal decomplementat 10% (tab. 2). Tabelul 2

Compozi]ia mediului PBS (Fosfat bufferet salin) (dup\ Witthingham G., 1971) Specificare Ap\ deionizat\ Clorur\ de sodiu Piruvat de sodiu Clurur\ de potasiu Na2HPO4 KH2PO4 Glucoz\ (D+) anhidr\ MgCl2-6H2O CaCl2-2H2O Penicilin\ Streptomicin\ Albumin\ bovin\ liofilizat\

U.M. ml g g g g g g g g U.I. mg g

Cantitatea 1000,0 8,g0 0,036 0,2 1,15 0,2 1,0 0,1 0,1 100000 50 2-4

Toate mediile, solu]iile, serurile, enzimele [i substan]ele crioprotectoare care vin `n contact cu embrionii trebuie s\ fie sterile. Tot materialul care nu se arunc\ (sonde colectoare, filtre, recipien]i din sticl\, sonde de transfer, etc.) care necesit\ a fi sterilizate, se spal\ cu o solu]ie de detergent netoxic, se cl\te[te `n ap\ distilat\, se usuc\ [i se `nvele[te `n hârtie `n vederea steriliz\rii. Alegerea metodei de sterilizare depinde de natura materialului (c\ldur\ uscat\, c\ldur\ umed\, substan]e antiseptice, vapori de formol etc.). Rezultatele recuper\rii embrionilor depind `n cea mai mare m\sur\ de abilitatea [i antrenamentul operatorului. Propor]ia embrionilor recupera]i, oscileaz\ `n medie, `ntre 60-70% comparativ cu num\rul de corpi galbeni identifica]i pe ambele ovare. Dup\ colectarea embrionilor se injecteaz\ donatoarei o doz\ de PGF2α, care are rolul de a liza corpii galbeni, evitându-se astfel gesta]ia multipl\. 2.2.7. C\utarea [i aprecierea calit\]ii embrionilor

Dup\ prelevarea embrionilor, vasul cu lichidul recoltat (100-150 ml) este l\sat timp de 20-30 minute pentru decantare. Se `ndep\rteaz\ supernatantul iar stratul inferior `n care se reg\sesc [i embrionii recolta]i, se transfer\ `ntr-o plac\ Petri cadrilat\ cu diametrul de 10 cm, (foto 25) sau se agit\ `n mediu din filtrul colector [i se toarn\ `n placa Petri. Recipientele de recoltare a mediului ca [i filtrul folosit la recuperarea embrionilor se cl\tesc de dou\ trei ori.

113

Examenul embrionilor `n lichidul recoltat trebuie s\ se fac\ `n cele mai bune condi]ii de asepsie, cur\]enie [i la o temperatur\ constant\ a laboratorului (20o-25o). Embrionii bovinelor au un diametru de 150-190 microni, zona pelucid\ având o grosime de 12-15 µm. Pentru identificarea embrionilor, se examineaz\ cu mare aten]ie, la o stereolup\ (grosisment 30-60 uneori 80-200) fiecare p\trat de la nivelul pl\cii Petri, `ntr-o anumit\ ordine, pentru a se evita omiterea vreunuia. Pentru identificarea [i examenul morfologic al embrionilor se folosesc microscoape inversate, obiectivele fiind dispuse `n partea de jos, iar lumina proiectat\ prin partea superioar\ (foto 26). .

Foto 25 Placa PETRI cadrilat\ folosit\ la c\utarea embrionilor

Foto 26 C\utarea embrionilor `n lichidul de sp\lare cu ajutorul stereolupelor

O dat\ identifica]i, embrionii sunt transfera]i cu ajutorul unei seringi de aspirare, la care s-a adaptat, printr-un tub de plastic, o micropipet\, `n pl\ci Petri mai mici, cu diametrul de 5 cm `n care se g\se[te mediul de sp\lare la care s-a ad\ugat 20% albumin\ seric\ bovin\ (BSA). Opera]iunea se repet\ de 3-5 ori, embrionii fiind transfera]i dintr-o pl\cu]\ `n alta, schimbându-se de fiecare dat\ pipeta de aspirare. ~n cazul `n care embrionii sunt destina]i exportului, ace[tia sunt trecu]i prin zece astfel de b\i de sp\lare. Amestecul crioprotectorului cu mediul de conservare (PBS ±40% BSA sau 10-20% ser de vi]el fetal) provoac\ o cre[tere a presiunii osmotice. Pentru a reduce [ocul osmotic, embrionii sunt trecu]i succesiv [i pe câte o durat\ de 5 - 10 minute `n dou\-trei b\i cu mediu de conservare cu o concentra]ie crescând\ `n crioprotector: glicerol 0,7 M [i apoi 1,4 M, DMSO sau etilen glicol 0,5 M, 1,0 M apoi 1,5 M. Aceast\ trecere a embrionilor `n mediul de conservare cu adaos de crioprotector se face la o temperatur\ cuprins\ `ntre+20oC [i +30oC. Dup\ ultima baie, adic\ `n momentul `n care este atins\ concentra]ia final\ `n crioprotector (de exemplu: etilen-glicol 1,5 M), embrionii sunt condi]iona]i pentru congelare, fie `n fiole de sticl\ de 1,2 ml, fie `n paiete de polipropilen de 0,25 ml (de tip paiete fine folosite la conservarea spermei). Paietele sunt identificate individual. Exist\ jancuri de identificare ce permit pe de o parte `nchiderea ermetic\ a paietei [i care poart\ (sunt inscrip]ionate) toate informa]iile necesare. Pentru fiecare paiet\ trebuie s\ se men]ioneze: identificarea donatoarei, rasa, data colect\rii, num\rul de embrioni, centrul de produc]ie.

114

Procedura de umplere a paietelor comport\ trei compartimente lichide separate de bulele de aer. Aceasta limiteaz\ orice risc de pierdere a embrionilor `n momentul manipul\rilor efectuate cu umplerea sau evacuarea con]inutului paietelor. Evaluarea corect\ a embrionilor depinde de autor, nivel de instruire, experien]\, echipament etc. Dup\ criteriile men]ionate embrionii sunt `ncadra]i `n mai multe categorii calitative: excelent, bun, acceptabil, inferior, degenerat, ovocit nefecundat. ~n cursul examenului sub stereolup\ la un grosisment mai mic de 80, embrionul este `ntors cu ajutorul unei micropipete de sticl\ `n vederea aprecierii morfologiei sale din toate unghiurile, unele imperfec]iuni putând sc\pa observa]iei `n anumite pozi]ii ale embrionului. Zona pelucid\ garanteaz\ protec]ia embrionului, motiv pentru care ea trebuie s\ fie perfect integr\, f\r\ fisuri [i perfect sferic\. Gradul de dezvoltare embrionar\ `n raport cu ziua colect\rii este principalul factor luat `n considerare. Embrionii care prezint\ o `ntârziere `n dezvoltare mai mare de 48 de ore sunt elimina]i. Embrionii colecta]i `n a [aptea zi de la debutul estrului trebuie s\ se g\seasc\ `n stadiul de morul\ compact\/blastocist. Embrionii care con]in 16 celule sau mai pu]in, nu se re]in pentru transfer sau congelare, fiind `ntr-o `ntârziere mare a dezvolt\rii. ~n stadiul de morul\ compact\, limitele celulare sunt mai pu]in distincte `ntrucât blastomerele sunt strâns legate `ntre ele [i dau un aspect de mure. Prezen]a câtorva celule deta[ate, `n spa]iul perivitelin nu constituie un motiv de eliminare `ntrucât majoritatea blastomerelor formeaz\ o mas\ sferic\ f\r\ opacitate marcant\. ~n stadiul de blastocist, diversele structuri (blastocel, butonul embrionar, trofoblastul) trebuie s\ fie vizibile [i s\ prezinte contururi bine delimitate. Prezen]a blastomerelor `n spa]iul perivitelin [i a unor granula]ii la suprafa]a celulelor pot fi observate. Aceste anomalii asociate unei `ntârzieri `n dezvoltare, absen]ei contururilor celulare sau unei opacit\]i marcante ale blastomerelor constituie criteriu de eliminare a embrionilor. Embrionii a c\ror aspect este `ndoielnic sunt conserva]i una-dou\ ore apoi vor fi examina]i din nou. Excelent este considerat embrionul perfect ca aspect morfologic [i corespunz\tor vârstei (foto 27). Embrionul bun calitativ prezint\ unele imperfec]iuni: zona pelucid\ oval\, dimensiuni mai mici ale embrionului, `ntârziere `n dezvoltare cu o zi, pu]ine celule extrudate, mici. Embrionul acceptabil este cel care este bine conturat, `ns\ prezint\ unele Foto 27 Embrioni buni pentru anormalit\]i: un num\r moderat congelare de celule excluse, dimensiuni

115

mai mici, unele degener\ri [i `ntârzierea cu o zi. Embrionul inferior prezint\ diverse degrad\ri considerabile: celule veziculate, variabilitate mare `n ceea ce prive[te dimensiunile celulelor, `ntârzierea `n dezvoltare cu dou\ zile, absen]a compact\rii. Embrionul degenerat prezint\ degener\ri evidente, iar ovocitele nefecundate sunt cele care prezint\ structur\ simpl\ a gametului femel, f\r\ celulele rezultate din segmentare (Seidel F.G. [i colab.,1991). 2.2.8. Conservarea [i deconservarea embrionilor

Embrionii pot fi conserva]i câteva ore „in vitro“ la 20oC `ntr-un mediu de conservare: PBS adi]ionat cu 4 g/l albumin\ seric\ bovin\, sau cu 10% ser de vi]el fetal decomplementat. ~n acest mediu, embrionii sunt men]inu]i pân\ când sunt transfera]i la receptoare. ~n cazul `n care transferul nu se realizeaz\ `n 6-8 ore de la recoltare, se recomand\ congelarea prin refrigerare a embrionilor, la o temperatur\ de 0o-4oC `ntr-un mediu de conservare identic. ~n acest fel embrionii pot fi conserva]i una-dou\ zile f\r\ ca viabilitatea s\ fie afectat\. Conservarea de lung\ durat\ a embrionilor – congelarea - r\mâne cea mai avantajoas\ metod\ de men]inere pentru un interval de timp practic nelimitat a viabilit\]ii embrionilor. Pentru aceasta, embrionii, trebuie s\ fie men]inu]i `n stare solid\, `n azot lichid, la temperatura de circa -196oC. La temperaturi mai sc\zute de -100oC, metabolismul celular este complet blocat, singura problem\ mai dificil\ constând `n atingerea acestor temperaturi f\r\ a omor` embrionii. ~n timpul congel\rii, intervin doi factori letali pentru embrioni: formarea ghe]ii intracelulare [i concentra]ia salin\ ridicat\. Pentru a pre`ntâmpina efectul negativ al acestor doi factori, metoda de r\cire const\ `n deshidratarea par]ial\ a celulelor [i evitarea [ocului produs de concentra]iile ridicate `n s\ruri prin utilizarea unui Crioprotector, `n general glicerol cu o concentra]ie de 1,5 M (sau 10% `n volum) `n mediul de congelare. Ca agen]i criopro-tectori se mai pot folosi: dimetilsulfoxid (DMSO), etilenglicol, glicerol, propilen-glicol. ~n prezent sunt numeroase aparate programabile (freezere) care permit realizarea unei curbe optimale de r\cire (foto 28). Substan]ele crioprotectoare (`n general polialcooli) sunt capabile s\ p\trund\ u[or `n celule printr-o simpl\ difuziune (osmoz\), `ntârziind formarea cristalelor de ghea]\ prin coborârea punctului de `nghe]. Totodat\, substan]ele criopro-tectoare limiteaz\ efectele negative ale concentra]iei saline ridicate, `nlocuind o parte din apa intracelular\ atras\ prin cre[terea presiunii osmotice extracelulare. Al]i compu[i pot avea un rol protector fa]\ de membranele celulare (hidra]i de carbon, (Baril [i polivinilpirolidon), colab., 1993).

Foto 28 Model de freezer

116

Viteza de coborâre a temperaturii are importan]\ mare `n protejarea viabilit\]ii embrionilor. Mediul care con]ine embrionii (extracelular) este mai bogat `n ap\ decât mediul celular. Prin coborârea temperaturii, primele cristale de ghea]\ se produc mai `ntâi `n mediul extracelular, ceea ce va antrena o ridicare a concentra]iei `n solu]ie a frac]iunii necristalizate. Aceast\ concentra]ie salin\ ridicat\ va provoca ie[irea unei p\r]i din apa celular\, reducând `n acest fel formarea ghe]ii intracelulare. Dac\ ritmul de r\cire este prea rapid, apa intracelular\ nu poate ie[i `n cantitate suficient\, cristalele de ghea]\ se formeaz\ `n cantitate mare `n interiorul celulelor [i aceste cristale `[i m\resc talia lor `n timpul congel\rii [i decongel\rii distrugând structurile celulare. ~n cazul `n care ritmul de r\cire este lent, deshidratarea progresiv\ a celulelor antreneaz\ o cre[tere important\ a concentra]iei `n electroli]i, `n mediul celular, modificând propriet\]ile fizico-chimice (efectul solu]iei), consecin]a fiind totdeauna pierderea viabilit\]ii celulelor. Astfel, integritatea celulelor vii dup\ congelare este strâns legat\ de dinamica apei intracelulare `n timpul r\cirii [i deci de viteza de congelare. ~n cazul embrionilor, ritmul de r\cire trebuie s\ corespund\ pentru toate tipurile de celule care-l compun. Rezultatele cercet\rilor `ntreprinse pentru clarificarea aspectelor referitoare la ritmul de congelare confirm\ faptul c\ acesta trebuie s\ se desf\[oare `n dou\ etape diferite: o congelare lent\, `n dou\ trepte: la `nceput 4oC/min pân\ la –6 –7oC [i 0,3-0,6oC/min `ntre –7oC [i –30 –35oC, apoi o congelare rapid\ (brusc\) de la -35oC pân\ la temperatura de p\strare -196oC. Timpul de a[teptare al embrionilor din momentul recolt\rii [i pân\ la `nceperea congel\rii, nu trebuie s\ dep\[easc\ dou\-trei ore. Protocolul de congelare a embrionilor bovini prevede urm\toarele: - alegerea embrionilor - calitate excelent sau bun; - timp de la recoltare pân\ la `nceperea congel\rii: dou\-trei ore; - introducerea embrionilor `n mediul de congelare la temperatura laboratorului (20oC); - introducerea embrionilor `n paiete identificate (mediu, bul\ de aer, embrioni +mediu, bul\ de aer, mediu); - r\cirea pân\ la -6oC sau -7oC cu o vitez\ de 4oC/minut; - inducerea cristaliz\rii (palier 5-10 minute); - r\cirea pân\ la –30oC sau –35oC cu o vitez\ de 0,3 0,6oC/minut; - introducerea paietelor ce con]in embrionii, direct `n azot lichid [i stocarea lor (-196oC). Paietele se vor p\stra `n permanen]\ `n azot lichid pân\ `n momentul transferului la femelele receptoare. Durata stoc\rii embrionilor `n azot lichid nu influen]eaz\ supravie]uirea ulterioar\ a acestora. Decongelarea embrionilor [i `nl\turarea crioprotectorului Embrionii congela]i la -35oC nu sunt decât par]ial deshidrata]i, o anumit\ cantitate de ghea]\ se formeaz\ inevitabil `n celule, `n momentul imersiei `n azot lichid (-196oC). Pentru a se evita ca prin decongelare s\ se produc\ o cre[tere a acestor mici cristale de ghea]\ care s\ distrug\

117

celulele, decongelarea trebuie s\ se fac\ `n timp, cât mai repede posibil (circa 2000oC/minut). Pentru aceasta, paietele se scot repede din containerul cu azot lichid [i se introduc direct `ntr-o baie de ap\ la 37oC, unde se men]in circa 30 de secunde. Imediat dup\ decongelare, `nl\turarea rapid\ a crioprotectorului este indispensabil\ supravie]uirii embrionilor. Totu[i, celulele care con]in o concentra]ie ridicat\ de crioprotector nu trebuie s\ fie introduse direct `ntr-un mediu izotonic, `ntrucât diferen]a mare de presiune osmotic\ va provoca p\trunderea prea rapid\ a apei `n celul\, ceea ce va risca s\ explodeze. De aceea, este necesar\ o `ndep\rtare progresiv\ a crioprotectorului astfel `ncât ie[irea acestuia [i p\trunderea apei `n celul\ s\ fie compatibile cu permeabilitatea membranei celulare. Pentru aceasta sunt mai multe metode care realizeaz\ o rehidratare lent\ a celulelor embrionare. Dilu]ia crioprotectorului pe etape const\ `n trecerea succesiv\ a embrionilor prin b\i cu concentra]ii descrescânde `n crioprotector (de ex: etilen glicol 1,5 M, apoi 1,0 M, 0,5 M [i 0 M). Men]inerea embrionilor `n fiecare baie este de 5-10 minute. ~n acest caz concentra]ia mediului `n crioprotector este invers\ celei din perioada congel\rii. Dup\ `nl\turarea lichidului de r\cire, calitatea embrionilor poate fi apreciat\ printr-un examen morfologic efectuat cu ajutorul unei stereolupe (grosisment x80). ~n urma examenului morfologic, de regul\ sunt elimina]i ca necorespunz\tori calitativ, 10-30% dintre embrionii decongela]i. Dilu]ia crioprotectorului prin folosirea unui mediu care con]ine sucroz\ are la baz\ accelerarea ie[irii acestuia din celule. Molecula de sucroz\ având o greutate molecular\ mare (344) nu p\trunde `n celule prin simpl\ difuziune; prezen]a sa `n mediu creaz\ o m\rire a presiunii osmotice din mediul extracelular, ceea ce va determina o difuziune accelerat\ a crioprotectorului din celule. Pentru aceasta, embrionii decongela]i sunt introdu[i direct `ntr-o solu]ie de PBS care con]ine 0,250,5 M sucroz\, apoi `n dou\-trei b\i succesive de PBS `nainte de examinare [i transfer. Se poate realiza retragerea crioprotectorului prin intermediul sucrozei, direct `n interiorul paietei. Pentru aceasta, `n momentul introducerii embrionilor `n paiete pentru congelare, alternan]a diverselor medii din paiet\ este: la mijloc embrionul `n mediu PBS+ etilenglicol 1,5 M, `nconjurat de bule de aer [i apoi la exterior PBS+sucroz\ 0,25 M. Dup\ decongelare paieta se scutur\ `n vederea amestec\rii mediilor pe baz\ de etilen glicol [i cele pe baz\ de manoz\, ceea ce va permite difuzia crioprotectorului `n afara celulei `n câteva minute. Embrionii sunt transfera]i f\r\ selec]ie prealabil\, `mpreun\ cu con]inutul paietei direct `n uterul femelelor receptoare. Aceast\ metod\ mai necesit\ unele verific\ri. Nivelul supravie]uirii embrionilor dup\ decongelare este condi]ionat de mai mul]i factori: stadiul de dezvoltare a embrionilor, calitatea embrionilor `nainte de congelare, femela donatoare etc. Embrionii transfera]i `n stadiul de morul\ realizeaz\ o propor]ie de supravie]uire „in vitro“ mai redus\ (64%), comparativ cu cei transfera]i `n stadiul de blastocist (81%), (Martinez [i colab., 1985).

118

Congelarea nu trebuie aplicat\ decât embrionilor de bun\ calitate, caz `n care procentul de supravie]uire dup\ transfer fiind u[or inferior (10%) fa]\ de nivelul supravie]uirii ob]inut dup\ transfer direct, f\r\ congelare. Dac\ embrionul este de calitate mijlocie sau mediocr\ `naintea congel\rii, pierderile de viabilitate vor fi amplificate prin crioconservare [i nivelul de supravie]uire va fi mediocru. Originea genetic\ a donatoarei pare a avea un rol `nsemnat asupra aptitudinii embrionului de a fi congelat. Acela[i efect denumit [i „efectul donatoarei“ a fost demonstrat prin faptul c\ procentul de supravie]uire a embrionilor congela]i `n acelea[i condi]ii poate varia de la 0 la 78% `n raport cu donatoarea. ~n prezent sunt testate diferite tehnici de congelare rapid\ a embrionilor, cu rezultate promi]\toare. 2.2.9. Transferul embrionilor

O aten]ie deosebit\ va fi acordat\ selec]iei femelelor receptoare, `ntrucât condi]ioneaz\ `n mare parte rezultatele dup\ transfer. Condi]iile de mediu `n care receptoarele sunt `ntre]inute trebuie s\ corespund\ unui microclimat optim de igien\ [i de statut sanitar. A[a cum s-a men]ionat `n capitolul anterior, receptoarele trebuie s\ aib\ o activitate sexual\ ciclic\, s\ fie bine dezvoltate corporal, f\r\ afec]iuni ale tractusului genital. Alegerea receptoarelor poate porni de la vi]ele `n vârst\ de 18 luni cu condi]ia atingerii a cel pu]in 2/3 din greutatea corporal\ a adultului. Aprecierea curbei de cre[tere cu cel pu]in 30 de zile `naintea `nceperii tratamentului sau a transferului d\ posibilitatea corect\rii sau optimiz\rii alimenta]iei (dac\ este necesar). Transferul embrionilor se face cu foarte bune rezultate [i la vaci adulte `n vârst\ de 3-6 ani dac\ func]ia de reproduc]ie s-a desf\[urat normal. Examenul femelelor receptoare se completeaz\ cu aprecierea ultimului estru, care trebuie s\ aib\ loc `ntre parametrii fiziologici (comportament sexual, calitatea mucusului cervical, starea de s\n\tate a conductului vestibulo-vaginal [i al orificiului vaginal al cervixului). Preg\tirea receptoarelor const\ `ntr-o sincronizare cât mai perfect\ a ciclului sexual cu cel al femelei donatoare. Se pot folosi femele receptoare, fie `n c\lduri naturale fie `n c\lduri induse printr-un tratament de control al ciclurilor sexuale (vezi cele men]ionate anterior). O aten]ie special\ se va acorda depist\rii ciclurilor (diminea]a, prânz, seara) apoi se determin\ momentul exact al `nceputului estrului. ~naintea transferului propriu-zis se face un examen transrectal al ovarelor pentru a identifica corpul galben pe unul din ovare. Transferul embrionului se va face `n vârful cornului uterin adiacent ovarului pe suprafa]a c\ruia este prezent corpul galben. Rezultate bune s-au ob]inut [i prin depunerea embrionului la circa 10 cm de la bifurca]ia coarnelor uterine `n lumenul cornului uterin ipsilateral ovarului cu corp galben. ~nainte [i imediat dup\ transfer se va evita orice stres: vaccin\ri, tratamente antiparazitare, ecorn\ri, lotiz\ri, tuberculin\ri, recolt\ri de sânge etc. Se va evita schimbarea brusc\ a regimului alimentar: de exemplu introducerea masei verzi prim\vara 4 s\pt\mâni dup\ transfer. Varia]iile climatice determin\ o cre[tere a mortalit\]ii embrionilor dup\ transfer. ~n cazul folosirii embrionilor proaspe]i, receptoarele se ]in `ntr-un grajd curat [i cât mai

119

aproape de donatoare. ~n acest mod se evit\ pierderile de timp [i se amelioreaz\ factorii de reu[it\. Transferul propriu-zis al embrionilor la femelele receptoare se realizeaz\ prin dou\ metode: chirurgical [i nechirurgical. Transferul chirurgical s-a aplicat `n perioada de `nceput [i a constat `n deschiderea cavit\]ii abdominale (pe linia alb\ sau `n flanc), exteriorizarea cornului uterin [i depunerea embrionului pe cornul uterin corespunz\tor ovarului cu corp galben prin punc]ionarea peretelui acestuia. Este o metod\ laborioas\, costisitoare, traumatizant\ pentru femele, ceea ce a condus la abandonarea ei. Metoda actual\ care d\ cele mai concludente rezultate este cea nechirurgical\. Aceast\ metod\ folose[te calea vagin-cervix, asem\n\tor `ns\mân]\rii artificiale. Pentru transfer se folose[te un pistolet tip Cassou `n care se introduce paieta cu embrionul deconservat sau proasp\t recoltat. Pentru a se evita contaminarea `nveli[ului din material plastic al pistoletului Cassou pe timpul travers\rii conductului vestibulo-vaginal, se fixeaz\ un al doilea `nveli[ din material plastic care este sec]ionat pe toat\ lungimea sa. Dup\ ce pistoletul ajunge `n lumenul cervical, acest `nveli[ protector se retrage. Pentru a `nvinge rezistean]a cervixului (`n aceast\ faz\ cervixul fiind `nchis) se folosesc uneori dilatatoare. La circa 10 cm de bifurca]ie, pe cornul uterin corespunz\tor ovarului ce con]ine corpul galben, se depune embrionul, asem\n\tor `ns\mân]\rii artificiale. Aceast\ metod\ este exclusiv folosit\ `n prezent, progresul depinzând de antrenamentul [i obi[nuin]a operatorilor. Traversarea cervixului trebuie s\ se realizeze cu mare precau]ie `n vederea evit\rii lezion\rii mucoasei acestuia. ~n vederea relax\rii cervixului, a evit\rii contrac]iilor organelor genitale se efectueaz\ anestezia epidural\ cu 4-6 ml procain\ 2%, sau alte preparate medicamentoase cu efect similar. 2.3. Biotehnologia transferului de embrioni la rumeg\toarele mici Ca [i la rumeg\toarele mari, folosirea transferului de embrioni la rumeg\toarele mici se practic\ cu scopul multiplic\rii descenden]ei femelelor cu `nalt poten]ial genetic peste posibilit\]ile naturale ale speciei, introducerii de noi genotipuri prin importul de embrioni congela]i [i asigur\rii bazei morfo-fiziologice ale unui model modern de cercet\ri fundamentale `n reproduc]ia animalelor [i biologia celular\. Reglarea [i controlul func]iei de reproduc]ie la rumeg\toarele mici sunt influen]ate considerabil de factorii de mediu. La latitudini mai mari de 35o, rumeg\toarele mici au un sezon de reproducere limitat, care `ncepe c\tre sfâr[itul verii [i se `ncheie c\tre finele sezonului de toamn\. ~n decursul unui an, func]ia sexual\ la oaie se caracterizeaz\ prin alternarea a dou\ perioade: - o perioad\ de anestru fiziologic, cuprins\ `ntre sfâr[itul iernii [i `nceputul verii; - o perioad\ de activitate sexual\, cu derularea mai multor cicluri sexuale, cuprins\ `ntre sfâr[itul verii [i `nceputul iernii (10-14 s\pt\mâni dup\ cea mai lung\ zi).

120

Anestrul fiziologic se datoreaz\ atât factorilor materni (anestru de lacta]ie), cât [i factorilor climatici (anestru sezonier), efectul acestor factori suprapunându-se. Periodicitatea sexual\ sezonier\ este atribuit\ influen]ei modulatoare a fotoperiodismului, temperaturii, umidit\]ii [i alimenta]iei asupra unui ritm ciclic anual de baz\, condi]ionat genetic. Factorul principal `n stimularea func]iei sexuale la oi este reprezentat de reducerea progresiv\ a num\rului de ore lumin\, iar cel subordonat este sc\derea temperaturii [i schimbarea alimenta]iei. Din punct de vedere reproductiv oile sunt considerate ca „animalele zilelor scurte“. Fotoperiodismul regleaz\ func]ia de reproduc]ie la oi prin intermediul melatoninei, hormon secretat de glanda epifiz\. Lumina ac]ioneaz\ asupra glandei epifize prin excita]iile provocate la nivelul retinei, apoi pe calea nervilor optici, acestea ajung la nucleul suprachiasmatic care controleaz\ secre]ia melatoninei. Pentru activitatea secretorie a epifizei se impune o ritmicitate nictemeral\ bine pronun]at\. Concentra]ia melatoninei este mai ridicat\ `n timpul nop]ii, când celulele epifizei `[i intensific\ activitatea [i determin\ liberarea noradrenalinei de la nivelul termina]iilor nervoase din apropierea pinealocitelor. Noradrenalina stimuleaz\ biosinteza melatoninei. Epifiza controleaz\ momentul apari]iei maturit\]ii sexuale [i sezonul de reproduc]ie. Melatonina regleaz\ func]ia de reproduc]ie prin schimbarea secre]iei hormonilor gonadotropi. Nucleul suprachiasmatic are rolul unui mecanism biologic care determin\ reac]iile fotoperiodice, prin intermediul ac]iunii asupra epifizei, care este subordonat\ acestuia. O dat\ cu mic[orarea zilei lumin\, secre]ia melatoninei cre[te [i activeaz\ func]ia sexual\. Factorii de mediu trebuie s\ aib\ un anumit nivel pentru a influen]a pozitiv func]ia de reproduc]ie: temperatura aerului 8-18oC, umiditatea relativ\ 65-85%, durata zilei lumin\ - 4-7 ore. Al]i factori ai mediului ambiant (rela]iile dintre indivizi, masculi/femele, femele/miei, nivelul alimentar) au un rol modulator `n blocarea sau declan[area activit\]ii reproductive. Utilizarea acestor factori (de ex. efectul „mascul“) permite s\ se controleze mai bine perioadele de reproduc]ie. Gradul de ovula]ie variaz\ `n timpul sezonului de reproduc]ie. Nivelul acestui indice este maxim la mijlocul perioadei sexuale. Oile ]inute la temperaturi sc\zute, `n timpul verii, `ncep sezonul de reproduc]ie mai devreme decât cele care `n sezonul estival, au fost ]inute la temperaturi obi[nuite acestui anotimp. Oile expuse stresului termic `n orele de dinainte sau de dup\ estru, prezint\ tulbur\ri de fecunditate. Varia]iile ra]iei de hran\ (date de varia]iile disponibilit\]ilor alimentare) determin\ oscila]ii ale nivelului de fertilitate. La latitudini medii, varia]iile fotoperioadei r\mân factorul principal care declan[eaz\ activitatea reproduc]iei la oi (Thimonier J. [i colab., 1986).

121

2.3.1. Alegerea donatoarelor [i receptoarelor

Femelele care intr\ `ntr-un protocol al transferului de embrioni trebuie s\ fie selec]ionate `naintea `nceperii opera]iilor propriu-zise. Prima selec]ie a donatoarelor se face dup\ valoarea lor genetic\ pa baza unor criterii apropiate aptitudinilor zootehnice cercetate la rasa respectiv\. ~n general, `n alegerea donatoarelor se are `n vedere ca acestea s\ se fi n\scut `n sezonul de reproduc]ie precedent, f\r\ tulbur\ri ginecologice, s\ nu fie gestante, cu ovare normale, capabile s\ r\spund\ la tratamentul superovulator (examen f\cut prin ecografie sau endoscopie) (laparoscopie). ~n cazul repet\rii tratamentelor de superovulare, se investigheaz\, prin probe de laborator, prezen]a sau absen]a anticorpilor contra hormonilor folosi]i la tratamentul de superovulare. Femelele tratate de mai multe ori se pot imuniza contra gonadotropinelor heterospecifice [i nu mai r\spund la administrarea preparatelor hormonale de acest tip. ~n cazul folosirii nuliparelor, acestea trebuie s\ aib\ o greutate corporal\ de cel pu]in 60% din greutatea femelei adulte [i s\ fie `n vârst\ de cel pu]in 8-10 luni. ~naintea lotiz\rii, donatoarele (ca [i receptoarele) se supun mai multor teste serologice pentru depistarea maladiilor contagioase, susceptibile a le afecta (bruceloza, febra Q, clamidioza etc.). Acest criteriu este impus [i de legisla]ia sanitar-veterinar\ din mai multe ]\ri, care prevede pentru femelele donatoare s\ fie indemne de boli contagioase. Lotizarea femelelor donatoare [i receptoare se va face cu cel pu]in dou\ luni `naintea tratamentului, pentru a se evita efectele negative ale stresului de adaptare la un nou mediu [i pentru a se instala o nou\ ierarhie `n interiorul lotului reconstituit. Donatoarele [i receptoarele trebuie s\ fie supuse unui tratament antiparazitar cu spectru larg cu cel pu]in o lun\ `naintea `nceperii tratamentului. ~n cazul examenului coprologic pozitiv, tratamentul va fi `n special dirijat contra infesta]iei constatate. Alimenta]ia donatoarelor [i receptoarelor se va face dup\ norme [tiin]ifice. Neasigurarea `n totalitate a nevoilor energetice, azotate, minerale sau vitaminice, sau `n cazul diverselor dezechilibre alimentare (cantitate prea mic\) se constituie `n factori care provoac\ perturb\ri `n func]ia de reproduc]ie. Astfel, la oile Merinos australian, insuficien]a valorii energetice a alimenta]iei `n toamn\, este cauza slabei produc]ii de embrioni constatat\ `n acest sezon (Jabbour [i colab., 1991, citat de Baril G. [i colab., 1993).

Cre[terea nivelului energetic alimentar pe durata a trei s\pt\mâni care precede folosirea la reproduc]ie (flushing) provoac\, la ovine, o cre[tere a nivelului ovula]iei pentru femelele supuse tratamentului de inducere a ovula]iei [i o diminuare a luteolizei premature pentru oile supuse superovul\rii. Practica „flushing“-ului este recomandabil\ atât pentru donatoare cât [i pentru receptoare [i `n special când alimenta]ia nu acoper\ `n totalitate nevoile energetice. La receptoare, nevoile nutri]ionale suplimentare datorate gesta]iei, nu sunt diferite de cele legate de o gesta]ie natural\, dar ele trebuie luate `n considera]ie pentru a se evita avortul consecutiv subalimenta]iei.

122

~n preajma f\t\rii, o supraveghere atent\ a femelelor previne mortalitatea perinatal\ [i erorile de descenden]\ (filia]ie). Alegerea donatoarelor se face pe baza performan]elor genetice, starea fiziologic\ [i sanitar\. Donatoarele, `n general, trebuie s\ fie de vârst\ medie, s\ aib\ o carier\ de reproduc]ie f\r\ tulbur\ri notabile, s\ fie s\n\toase `n urma examenului clinic general [i ginecologic, f\cut la trei luni `naintea transferului de embrioni. Se respect\ un interval de cel pu]in 5 luni `ntre ultima f\tare [i `nceputul tratamentului. Alegerea receptoarelor se face, `n general, dup\ acelea[i criterii ca donatoarele, valoarea genetic\ nefiind luat\ `n considera]ie. Nuliparele sunt cele mai recomandate. ~n momentul transferului, receptoarele trebuie s\ fie `n vârst\ de 8-10 luni [i cu o greutate de cel pu]in 60% din greutatea medie a femelei adulte din rasa respectiv\ (30-35 Kg). ~n cazul `n care receptoarele sunt achizi]ionate, acestea se integreaz\ cresc\toriei cu cel pu]in trei luni `naintea `nceperii tratamentului, pentru a se adapta la noile condi]ii, dup\ ce au fost alese pe baza unor criterii stricte, `ntrucât femelele destinate reformei prezint\ adeseori probleme de reproduc]ie [i sanitare. La caprine, `n fiecare lot de receptoare se creaz\ o ierarhie. Animalul dominant se men]ine `n lot pentru a men]ine echilibrul social `n grupul respectiv, `ns\ nu se folose[te la transfer (Vallet J.C. [i colab., 1991). Cu trei luni `naintea transferului embrionar [i pân\ la f\tare se evit\ orice tip de stres: alimentar, traumatic, profilactic, sanitar, social etc. 2.3.2. Sincronizarea estrului [i ovula]iei la femelele donatoare [i receptoare

Tratamentele hormonale specifice donatoarelor [i receptoarelor se fac pentru a induce estrul [i superovularea (donatoarelor) sau ovula]ia (receptoarelor) la un moment predeterminat. Aceste tratamente urm\resc de fapt un control temporar al activit\]ii ovariene, prin mimarea, mai mult sau mai pu]in, a mecanismelor endocrine care controleaz\ ciclul sexual. Donatoarele [i receptoarele sunt supuse unei serii de interven]ii, cronologic precise. ~nainte de provocarea hormonal\ a superovula]iei se impune stabilirea cu exactitate a momentului apari]iei ciclului estral. Depistarea manifest\rii c\ldurilor se face de dou\ ori pe zi (diminea]a [i seara) prin folosirea berbecilor `ncerc\tori de calitate. Pentru provocarea superovula]iei, se folosesc oi cu ciclu natural sau sincronizat. Pentru standardizarea st\rii fiziologice a donatoarelor la `nceputul stimul\rii [i mai ales sincronizarea intr\rii `n estru la terminarea tratamentului stimulativ, acestea sunt supuse unui tratament progestativ. La sfâr[itul tratamentului progestativ, stimularea cre[terii foliculare se face prin administrarea hormonilor gonadotropi cu scopul cre[terii num\rului de ovula]ii/femel\ (superovula]ie). Atât pentru sincronizare (tratamente progestative) cât [i pentru stimularea ovarin\ (tratament gonadotrop) se folosesc mai multe variante.

123

2.3.2.1. Tratamente progestative de sincronizare

Difer\ prin substan]ele progestagene folosite [i prin calea de administrare: a) injec]ii zilnice a câte 12 mg de progesteron intramuscular timp de 17-21 de zile la capr\ sau 12-14 zile la oaie; b) implante vaginale, reprezentate de bure]i de poliuretan impregna]i cu 60 mg acetat de medroxiprogesteron (MAP) sau 30-40 mg acetat de fluorogeston (FGA) sunt `n prezent cele mai folosite; c) implante cu synchro-mat B (norgestomet-6 mg) care sunt inserate sub pielea de la nivelul suprafe]ei externe a urechii. Eficacitatea acestei c\i de administrare a progesteronului este asem\n\toare celei a pesariilor vaginale. Cel mai folosit tratament de sincronizare este cel care apeleaz\ la pesariile vaginale impregnate cu FGA. Durata tratamentului difer\ `n raport cu specia [i cu sezonul. La ovine, oricare ar fi sistemul de impregnare folosit, durata recomandat\ a tratamentului variaz\ `n func]ie de perioada anului: 14 zile `n timpul sezonului sexual [i 12 zile `nafara sezonului sexual. La caprine, durata tratamentului trebuie s\ fie de 17-21 zile (tratament lung), fie 10-12 zile (tratament scurt) `n asociere cu prostaglandinele. ~n cazul tratamentului scurt, la caprele donatoare, durata acestuia este mai scurt\ decât cea a unui corp galben ciclic, de aceeea se intervine cu o injec]ie de PGF2α (50 µg Cloprostenol, Estrumate, Flavoliz etc), 48 ore `naintea tratamentului progestativ pentru a liza corpii galbeni ce pot fi `nc\ activi `n momentul retragerii suportului de progestagen. d) sincronizarea estrului poate fi f\cut\ f\r\ a se realiza impregnarea printr-un progestagen. Se poate induce luteoliza sincron\ prin dou\ injec]ii, la interval de 10-14 zile, de prostaglandin\ F2α, (50100 µg de Cloprostenol etc). Aceast\ metod\ nu d\ rezultate la femelele neciclice (`n afara sezonului sexual), iar pe de alt\ parte, procentul ou\lor divizate este mai slab la femelele donatoare decât `n cazul unui tratament progestativ. 2.3.2.2. Tratamentele de stimulare ovarian\

Stimularea cre[terii foliculare pentru inducerea superovula]iei donatoarelor sau ovula]iei receptoarelor survine cel mai adesea la sfâr[itul tratamentului progestativ, [i este realizat\ prin injec]ii intramusculare de gonadotropine hipofizare sau extrahipofizare. Tratamentul gonadotrop pentru inducerea superovula]iei poate fi efectuat `n cursul unui ciclu natural, prin `nceperea stimul\rii cu 48 de ore `naintea momentului prezumat al luteolizei spontane, `ns\ aceast\ metod\ este ineficace `n perioada anovulatorie [i dificil de aplicat `n cazul tratamentului mai multor femele nesincronizate `n prealabil. Administrarea gonadotropinelor are loc, `n general, la finele tratamentului progestativ (ceea ce corespunde fazei foliculare a ciclului sexual), care va determina o cre[tere a num\rului de foliculi preovulatori [i la ovula]ia mai multor foliculi.

124

Stimularea cu ajutorul PMSG const\ `ntr-o injec]ie de 750-1500 U.I. PMSG efectuat\ 48 de ore `naintea termin\rii tratamentului progestativ. Durata relativ lung\ a activit\]ii biologice (circa 4-5 zile), nivelul ridicat de PMSG `nc\ `n circula]ie `n preajma estrului provoac\ o activitate folicular\ anormal\ `n acest stadiu care perturb\ mediul hormonal `n timpul fecunda]iei [i a primelor faze ale dezvolt\rii ou\lor. Aceste efecte au drept consecin]\ general\ o slab\ produc]ie de embrioni de bun\ calitate [i ca urmare, acest hormon este din ce `n ce mai pu]in folosit pentru inducerea poliovula]iei. Repetarea tratamentului superovulator cu PMSG determin\ o reducere accentuat\ a r\spunsului ovulator. Stimularea cu ajutorul FSH-ului este cea mai frecvent\ metod\ folosit\ pentru provocarea superovula]iei la rumeg\toarele mici. Cantit\]ile de FSH care se administreaz\ pentru a ob]ine superovularea sunt adesea exprimate `n mg standard Armour (1 mg Armour este o unitate a activit\]ii unui test biologic ce corespunde a circa 10-14 µg de hormon FSH pur). Administrarea FSH-p se face `n zilele 2, 3 sau 4 dup\ tratamentul progestativ, `n doz\ de 12-24 mg/femel\. Perioada scurt\ de `njum\t\]ire (3-4 ore), face ca doza s\ fie repartizat\ `n mai multe injec]ii pentru a determina superovularea. ~n intervalul de dou\-patru zile de la `ncheierea tratamentului progestativ se injecteaz\ FSH-p, 4-8 injec]ii, de dou\ ori/zi, la interval de 10-12 ore, `n doze descrescânde (trei zile de tratament). Tratamentul de superovulare se poate face [i cu extracte hipofizare de cabaline - HAP (horse anterior pituitary) - sau HMG (human menupausal gonadotropin) care determin\ un r\spuns ovulator [i o produc]ie de embrioni similare celor observate dup\ tratamentul cu FSH-p la caprine [i ovine, `ns\ aceste preparate sunt pu]in disponibile. Pentru provocarea superovula]iei se poate asocia tratamentul pe baz\ de PMSG cu cel pe baz\ de FSH-p. Pentru aceasta, se asociaz\ 48 de ore `naintea retragerii spongiilor vaginale cu o injec]ie de 12-18 mg de FSH-p ce se administreaz\ `n 6 injec]ii sau `ntr-o singur\ injec]ie concomitent cu administrarea de PMSG. R\spunsul superovulator este condi]ionat de mai mul]i fatori, `ntre care men]ion\m: rasa, individul, apari]ia anticorpilor `n cazul repet\rii tratamentului, tipul de hormon folosit etc. 2.3.2.3. Inducerea estrului [i ovula]iei la receptoare

Programarea estrului la femelele receptoare se face printr-un tratament progestativ identic celui folosit la donatoare. Atunci când transferul se face f\r\ interval (imediat), tratamentul progestativ al donatoarelor [i receptoarelor `ncepe `n acela[i moment, astfel `ncât s\ se g\seasc\ `n acela[i stadiu fiziologic `n momentul transferului embrionar. O injec]ie de PMSG se face c\tre sfâr[itul tratamentului progestativ: injec]ia cu PMSG se face cu 48 ore `naintea retragerii spongiilor vaginale la capr\ [i `n momentul retragerii acestora la oaie. Pentru caprele receptoare, injec]ia se face cu 48 ore `naintea retragerii bure]ilor vaginali impregna]i cu progestagene, iar ovula]ia se produce cu circa 12 ore mai târziu decât la donatoarele supuse aceluia[i tratament asociat cu FSH-p. ~n acest caz, pentru receptoare se `ntârzie terminarea

125

tratamentului progestativ cu circa 12 ore `n raport cu donatoarele care au fost tratate cu progesteron asociat cu FSH-p. La oile receptoare, injec]ia de PMSG se face `n momentul retragerii spongiilor vaginale. Oile intr\ `n c\lduri dup\ circa 36 de ore, cu o `ntârziere de 12 ore, `n raport cu donatoarele tratate cu FSH-p. Costul total al tratamentului este de circa 150-225 ff. Dozele de PMSG variaz\ cu sezonul, vârsta [i nivelul produc]iei de lapte (caprine). Detec]ia estrului este necesar\ pentru a putea alege momentul `ns\mân]\rii artificiale a donatoarelor pe de o parte, [i pentru a aprecia momentul ovula]iei la receptoare pe de alt\ parte. La donatoare, variabilitatea momentului ovula]iei este un factor limitant al nivelului de fecunditate, mai ales critic `n cazul folosirii spermei congelate. Principalul criteriu folosit pentru depistarea `nceputului estrului este manifestarea reflexului de acceptare a saltului masculului. Pentru a determina practic debutul estrului, se folose[te un mascul vasectomizat sau prev\zut cu [or], care este pus `n prezen]a femelei la interval de 4-6 ore, `ntre 20 [i 60 de ore dup\ terminarea tratamentului progestativ. Insuficien]a libidoului la mascul poate fi un factor limitant al eficacit\]ii detec]iei estrului. 2.3.3. ~ns\mân]area femelelor donatoare

Fecundarea donatoarelor poate fi f\cut\ fie pe cale natural\, practicându-se monta liber\ sau dirijat\, fie prin `ns\mân]are artificial\, când se poate `ntrebuin]a sperma proasp\t\ sau congelat\ care poate fi depus\ fie pe cale cervical\ sau direct `n uter sub controlul endoscopic. ~n toate cazurile este important s\ folosim masculii cu o fertilitate ridicat\. Când se practic\ monta, masculii trebuie s\ fie ap]i s\ efectueze saltul `n mod repetat. Când se folose[te `ns\mân]area artificial\, aptitudinea masculilor de a ejacula `ntr-un vagin artificial trebuie s\ fie prezent\, iar cantitatea [i calitatea spermei produse va fi corespunz\toare. Monta a fost cea mai `ntrebuin]at\ metod\ de `ns\mân]are a femelelor donatoare `n cursul sezonului sexual atât la ovine cât [i la caprine, `ns\ nu permite folosirea ra]ional\ a masculilor valoro[i, reparti]ia geografic\ a acestora fiind neuniform\, ace[tia fiind concentra]i `n centrele `n care se practic\ `ns\mân]area artificial\ (depozite ORSA), când se practic\ monta liber\, masculii [i femelele sunt l\sa]i `mpreun\ pe perioada estimat\ a c\ldurilor, pentru fiecare mascul repartizându-se 3-4 femele. ~n cazul practic\rii montei dirijate, fiecare femel\ descoperit\ `n c\lduri trebuie s\ fie dat\ la mont\ de cel pu]in dou\ ori la interval de 10-12 ore. Momentul `ns\mân]\rii artificiale cea mai eficace este `ntre 12 [i 24 de ore de la `nceputul estrului. Când se practic\ monta `n contrasezon, absen]a sau slaba manifestare a libidoului masculilor sunt cauzele nerealiz\rii procentului de fecunditate normal la femelele donatoare, la care se adaug\ [i puterea fecundant\ foarte sc\zut\ a spermei `n aceast\ perioad\.

126

~ns\mân]area artificial\ permite valorificarea spermei masculilor a c\ror valoare genetic\ este cunoscut\. Cercet\rile au demonstrat faptul c\ transportul [i supravie]uirea spermatozoizilor `n c\ile genitale femele sunt perturbate dup\ tratamentul progestativ [i/sau cu prostaglandine asociate [i a induc]iei ovula]iei (Evans [i colab., 1984). Eficacitatea `ns\mân]\rii artificiale endo- sau exocervicale la rumeg\toarele mici superovulate este sensibil redus\ comparativ cu animalele martor nesuperovulate. Nivelul ou\lor divizate ob]inute prin aceast\ metod\ este adeseori insuficient [i inferior celui ob]inut dup\ mont\. Mai mult, nivelul fecunda]iilor este strâns dependent de nivelul r\spunsului ovulator la tratamentul de stimulare. La ovine, se folose[te pentru `ns\mân]are numai sperma proasp\t\. Conservarea spermei de berbec reduce sub 40% procentul de fecunditate a oilor `ns\mân]ate pe cale cervical\. Doza de sperm\ este de 2x400x106 spermatozoizi total `n sperma proasp\t\, sperma depunânduse la intrarea `n cervix. Anatomia cervixului nu permite trecerea instrumentelor clasice de `ns\mân]are. La caprine, conservarea spermei prin congelare este o practic\ curent\. Sperma se depune pe canalul cervical la 48 [i 54 de ore (dou\ `ns\mân]\ri artificiale) sau la 30, 48 [i 54 de ore (trei `ns\mân]\ri artificiale) dup\ sfâr[itul tratamentului progestativ. Totu[i, procentul ou\lor fertilizate este sc\zut, datorit\ faptului c\ nivelul ridicat de estrogeni dup\ un r\spuns bun la tratamentul progestativ, inhib\ transportul spermatozoizilor pe c\ile genitale femele. ~ns\mân]area artificial\ intrauterin\, sub controlul endoscopic, este destul de r\spândit\ la rumeg\toarele mici. Aceast\ tehnic\ permite folosirea spermei congelate [i ob]inerea unui procent de fecunditate ridicat pentru ovocite. Num\rul de spermatozoizi mobili/doz\ prin practicarea acestei tehnici poate fi redus la circa 80-100 milioane [i se face o singur\ `ns\mân]are artificial\. ~ns\mân]area artificial\ intrauterin\ se face la 48-60 de ore dup\ sfâr[itul tratamentului progestativ sau la 20-24 de ore dup\ `nceputul estrului la capre sau la 32 de ore dup\ `nceputul c\ldurilor la oi (87% embrioni viabili). 2.3.4. Recoltarea embrionilor

Opera]iile de colectare [i transfer a embrionilor sunt eficiente sub anestezie general\, femelele fiind supuse, `n prealabil, unei diete alimentare [i hidrice `n cursul a 24 de ore care premerg interven]ia chirurgical\. Embrionii sunt recolta]i prin „sp\l\ri succesive“ a celor dou\ coarne uterine `n a 6-a sau a 7-a zi dup\ `nceputul estrului. Acest interval de timp relativ scurt `n care embrionii pot fi recolta]i, este condi]ionat de mai mul]i factori: - trecerea embrionilor din lumenul oviductului `n cel al coarnelor uterine se produce `ncepând cu a 4-a zi; - pentru ra]iuni sanitare, legisla]ia prevede ca embrionul s\ fie transferat `nainte de a ie[i din zona pelucid\, care poate surveni `ncepând cu a 8-a zi;

127

-

congelarea embrionilor se poate face cel mai bine când ace[tia se g\sesc `n stadiile de morul\ compact\ [i blastocist (a 6-a sau a 7-a zi de la `nceputul estrului). Mediul de colectare este PBS (phosphate buffered saline) cu adaos de 2% albumin\ seric\ bovin\ sau de 10% ser de vi]el fetal men]inut la 37oC. Embrionii sunt recolta]i aproape `n exclusivitate, fie prin laparotomie abdominal\ (metoda chirurgical\), fie sub control endoscopic (colectare prin endoscopie sau laparoscopie). Toate materialele care se folosesc sunt sterilizate astfel `ncât recoltarea s\ se fac\ `n condi]ii aseptice. S-a `ncercat colectarea embrionilor [i prin mijloace nechirurgicale, pe cale cervical\, asem\n\tor ca la rumeg\toarele mari sau la cabaline, `ns\ rezultatele sunt foarte slabe, datorit\ travers\rii dificile a conductului cervical [i a imposibilit\]ii manipul\rii coarnelor uterine prin palpare rectal\. Recoltarea prin metoda chirurgical\ se face pe femela sub anestezie general\, conten]ionat\ pe o mas\ `n decubit dorsal, cu o `nclinare antero posterioar\ de 35-45o. Se face o incizie lung\ de 8-10 cm pe linia alb\ `naintea ata[\rii mamelei. Se exteriorizeaz\ coarnele uterine, se num\r\ corpii galbeni de pe ambele ovare, pentru a se aprecia r\spunsul la tratamentul de superovulare (foto 29). ~n cazul `n care recoltarea se face dup\ dou\patru zile de la debutul estrului, majoritatea embrionilor se reg\sesc `n Foto 29 Laparotomia [i eviden]ierea oviductului. Un coarnelor uterine [i aprecierea r\spunsului lumenul cateter cu un diametru de 1 ovarelor la tratamentul de superovulare la mm se introduce circa 2 cm oaie (I.C.P.C.O.C. Palas-Constan]a) pe lumenul oviductului prin pavilion, apoi 4 ml de PBS sunt injecta]i cu scopul de a-i antrena `n coarnele uterine. Apoi se spal\ coarnele uterine sau se recupereaz\ la nivelul pavilionului oviduc-tului perfuzatul injectat la baza coarnelor uterine (foto 30). ~n cazul `n care recoltarea embrionilor se face `n zilele 6-7, se spal\ fiecare corn uterin cu Foto 30 Sp\larea coarnelor uterine [i recuperarea lichidului de sp\lare la oaie ajutorul lichidului special introdus la acest nivel. Se (I.C.P.C.O.C. Palas-Constan]a)

128

face o punc]ie la baza coarnelor uterine, la nivelul ligamentului intercornual. Pe la nivelul punc]iei se introduce o sond\ Folley. Lumenul uterin la baza coarnelor uterine este obturat, prin umflarea balona[ului situat la extremitatea sondei. Printr-un cateter introdus la nivelul jonc]iunii utero-tubare se injecteaz\ 40-50 ml de PBS, recuperarea lichidului care antreneaz\ [i embrionii f\cându-se prin sonda Folley. Mediul de sp\lare poate fi injectat la nivelul sondei Folley [i recuperat prin cateterul introdus anterior (perfuzie anterograd\ ) legat cu un tub steril plasat `ntr-o baie marin\ la 37oC. Se procedeaz\ la sp\larea succesiv\ [i separat\ a celor dou\ coarne uterine apoi se introduce un antibiotic `n cavitatea abdominal\ [i se `nchide plaga de la nivelul coarnelor uterine [i al peretelui abdominal. Aceast\ metod\ este cea mai r\spândit\ la rumeg\toarele mici. Nivelul de recuperare a embrionilor oscileaz\ `ntre 70 [i 90%, `ns\ diminu\ mult atunci când se fac recolt\ri repetate de la acela[i animal (52-24%) la ovine [i 65-42% la caprine `n cazul colect\rilor 2 [i 3. Recoltarea prin endoscopie (laparoscopie). Femela anesteziat\ se conten]ioneaz\ pe o mas\ de opera]ie, `n decubit dorsal, cu o `nclinare antero-posterioar\ de 30-45oC. O prim\ punc]ie se face la 4-5 cm `naintea glandei mamare [i la 10-15 cm la stânga liniei albe. Se introduce o canul\ cu un diametru de 7 mm, care poart\ endoscopul. Se insufl\ aer filtrat `n cavitatea abdominal\ pentru a separa viscerele de organele genitale. A doua canul\, cu un diametru de 5 mm, se introduce `n partea opus\ primei, `n raport cu linia alb\ [i prin care se introduce o pens\ atraumatic\ pentru a manipula tractusul genital. Cu ajutorul pensei, corpii galbeni de pe fiecare ovar pot fi num\ra]i. Un corn uterin se prinde la nivelul ligamentului intercornual [i se punc]ioneaz\ cu un ac având diametru de 2,5 mm. A treia canul\, cu diametru de 5 mm, se plaseaz\ pe linia alb\, la 15 cm de prinderea glandei mamare. Prin aceast\ canul\ se introduce o sond\ cu trei c\i pân\ `n lumenul uterului. Balona[ul fixat la sond\ este umflat cu aer prin intermediul unei seringi cu scopul de a obstrua lumenul uterin la baza coarnelor uterine. Extremitatea cateterului este deplasat\ cât mai aproape posibil de jonc]iunea utero-tubar\. Pensa se fixeaz\ la nivelul istmului pentru a se evita refularea mediului de colectare `n oviduct. Mediul de colectare se injecteaz\ prin corpul sondei (40-50 ml pentru fiecare corn). Presiunea creat\ de lichidul introdus permite returul acestuia prin cateter. Se poate folosi [i o sond\ cu dou\ c\i. ~n acest caz, a doua punc]ie se face la vârful cornului uterin pe unde se inser\ un cateter de injec]ie, fixat la pensa atraumatic\. Mediul de colectare injectat prin cateter este recuperat prin sonda plasat\ la baza coarnelor uterine. Propor]ia de embrioni recupera]i prin endoscopie este inferioar\ cu 10-15% celei ob]inute prin chirurgie, `ns\ repetarea colect\rilor de la aceea[i femel\ prin endoscopie nu provoac\ reducerea propor]iei de embrioni colecta]i.

129

2.3.5. Examenul [i aprecierea embrionilor

Mediul de colectare recuperat dup\ cl\tirea coarnelor uterine este turnat `ntr-o plac\ Petri cu fundul cadrilat care s\ u[ureze cercetarea embrionilor la o lup\ binocular\. Embrionii depista]i sunt aspira]i cu ajutorul unei pipete fine sau a unei seringi racordat\ la un tub transparent din plastic [i introdu[i `ntr-o cutie Petri mai mic\ ce con]ine PBS filtrat [i suplimentat cu 4% albumin\ seric\ bovin\ sau 10% ser de oaie sau de capr\. Se apreciaz\ calitatea embrionilor recupera]i. Mediul de colectare [i examen a embrionilor este men]inut la o temperatur\ de +25+27oC, clasificarea embrionilor f\cându-se `n urm\toarele categorii: nefecunda]i, degenera]i, retarda]i sau morul\ compact\, blastoci[ti tineri, blastoci[ti extin[i sau blastoci[ti ie[i]i din zona pelucid\. Viabili se consider\ embrionii care au o form\ regulat\, sferic\, cu citoplasma omogen\, `nveli\ transparent, blastomere de dimensiuni identice distribuite uniform. Foarte important\ este [i stabilirea nivelului de segmentare, dat fiind c\ `ncetinirea ritmului de diviziune constituie, `n majoritatea cazurilor, dovada unui `nceput de degenerare a embrionilor. Embrionii sunt clasa]i `n excelen]i, buni, de calitate medie sau necorespunz\tori. Num\rul de embrioni degenera]i cre[te considerabil cu vârsta acestora, `ncepând cu a 5-a zi de la `ns\mân]area artificial\. Abaterile de la morfologia normal\ survin la animalele donatoare sub ac]iunea nefavorabil\ a unor concentra]ii ridicate de steroizi ovarieni. Majoritatea embrionilor degenereaz\ `n stadiul de morul\ pân\ `n ziua a 8-a. ~n practic\ se poate asigura un procent ridicat de f\t\ri alegându-se embrioni dup\ atingerea stadiului de blastocist. ~n momentul colect\rii - `n ziua a 7-a - unii embrioni de oaie [i capr\ pot prezenta o u[oar\ `ntârziere `n dezvoltare (morul\ compact\) pe când al]ii sunt `ntr-un stadiu de dezvoltare mai avansat (blastocist ie[it din zona pelucid\). La capre, dezvoltarea embrionar\ precoce apare cu o `ntârziere de 12-24 de ore `n raport cu cea observat\ la oi. ~n ziua a 7-a dup\ debutul estrului, propor]ia embrionilor `n stadiul de blastocist ie[it din zona pelucid\ este mai ridicat la oi decât la capre (oaie: 95%; capr\: 63%) (Meineche-Tillman, 1990 citat de G. Baril [i colab., 1993). Embrionii care au o `ntârziere `n dezvoltare mai mare de 48 de ore sunt elimina]i. ~n stadiul de blastocist, diversele structuri (blastocel, trofoblast, buton embrionar) trebuie s\ fie vizibile [i s\ prezinte un contur bine delimitat. Prezen]a blastomerelor `n spa]iul perivitelin, a granula]iilor la suprafa]a celulelor, absen]a contururilor celulare vizibile sau prezen]a unei opacit\]i evidente a blastomerelor, constituie criterii de eliminare a embrionilor. Dup\ aprecierea calit\]ii embrionilor, embrionii transferabili sunt trecu]i prin 10 b\i succesive de PBS `n vederea `nl\tur\rii eventualelor bacterii sau viru[i. Aceast\ practic\ este recomandat\ de Societatea Interna]ional\ de Transfer Embrionar [i confer\ o siguran]\ sanitar\ pentru stocarea sau folosirea unui embrion s\n\tos.

130

2.3.6. Congelarea-decongelarea embrionilor

~ntr-un interval de timp care nu dep\[e[te dou\ ore de la colectare, dup\ cl\tire, embrionii sunt trecu]i prin mai multe b\i succesive de PBS adi]ionat cu glicerol: 0,7 M (10 minute), apoi 1,4 M (10 minute) sau etilen glicol 0,5 M (5 minute), 1 M (5 minute), 1,5 M (5 minute), asem\n\tor celor precizate la bovine. Embrionii sunt condi]iona]i `n paiete mici (0,25 ml) [i congela]i treptat, sc\derea temperaturii mediului f\cându-se cu circa 1oC/minut pân\ la -7oC. ~n acest stadiu, cristalizarea este indus\ (vezi cele men]ionate la congelarea embrionilor bovini), apoi sc\derea temperaturii se face cu câte 0,3oC/minut pân\ la -35oC, dup\ care paietele sunt introduse direct `n azot lichid. Decongelarea se face, ca [i la embrionii bovini, prin imersia paietelor cu embrioni, timp de 30 secunde, `ntr-o baie-marie la 37oC. Apoi embrionii sunt trecu]i succesiv prin 3-4 b\i de PBS, la care s-a ad\ugat crioprotector `n concentra]ie descrescând\ (invers decât la congelare): glicerol (1,0 M, 0,7 M, 0,3 M, 0,0 M); etilen-glicol (1,0 M, 0,5 M, 0,0 M). Aceasta permite o rehidratare progresiv\ a celulelor embrionare. Se apreciaz\ iar\[i calitatea embrionilor, cei care au suferit `n timpul acestor opera]ii fiind elimina]i. 2.3.7. Transferul embrionilor la femelele receptoare

Transferul embrionilor trebuie s\ se fac\ `ntr-un interval cât mai scurt de timp de la recoltare (sub 4 ore) sau decongelare (30-40 de minute). Transferul se realizeaz\ aproape `n exclusivitate chirurgical, laparoscopic. 2.3.7.1. Transferul chirurgical

Dup\ anestezia femelei receptoare, se face o incizie de 7-8 cm `n lungul liniei albe, 3-4 cm `naintea ata[\rii glandei mamare. Se exteriorizeaz\ coarnele uterine, se examineaz\ ovarele pentru a se alege cornul uterin pe care urmeaz\ s\ se fac\ transferul. Embrionii sunt aspira]i `ntr-un volum mic de PBS (30-50 µl), aplicând principiul celor trei compartimente (vezi transferul de embrioni la bovine), de regul\ `ntr-un cateter adaptat la o sering\ de 1 ml. Diametrul extern al capilarului-cateter trebuie s\ fie de circa 1 mm. Se punc]ioneaz\ cornul cu un ac cu vârful conic, apoi se introduce 2-3 cm capilarul f\r\ a leza mucoasa [i se expulzeaz\ u[or embrionii c\tre treimea superioar\ a cornului uterin ipsilateral ovarului care prezint\ un corp galben func]ional. De regul\, se transfer\ doi embrioni `n acela[i corn uterin. Dup\ transfer se instil\ `n cavitatea abdominal\ 1000000 U.I. penicilin\, peritoneul [i pielea fiind apoi suturate (foto 31).

131

Foto 31 Transferul embrionilor la oile receptoare (I.C.P.C.O.C. Palas-Constan]a)

2.3.7.2. Transferul embrionilor sub controlul endoscopic

Receptoarea anesteziat\ este fixat\ `n decubit dorsal pe o mas\ de conten]ie `nclinat\ la 30-35oC. Se preg\te[te [i dezinfecteaz\ câmpul operator, `naintea glandei mamare. Se face o punc]ie `n abdomen pe unde se introduce canula endoscopului. Se insufl\ pu]in aer prin canul\ pentru a se u[ura vizualizarea tractusului genital. O a doua canul\ este inserat\ `n partea opus\ primei, `n apropierea liniei albe, prin care se introduce o pens\ de manipulare atraumatic\. Cu ajutorul acestei pense se controleaz\ r\spunsul ovulator pe fiecare ovar [i se alege cornul uterin pe care urmeaz\ s\ fie transfera]i embrionii, corespunz\tor ovarului care are corpul galben func]ional. Cornul uterin ales pentru transferul embrionilor este prins `n apropierea jonc]iunii utero-tubare [i punc]ionat cu un ac lung de 30 cm [i cu un diametru de 1,5 mm, `n prealabil inserat sub linia alb\. Embrionii sunt cundi]iona]i `ntr-un volum de 30-50 µl (sistem cu 3 compartimente: lichid, aer, lichid+embrion) `ntr-un capilar lung de 70 mm, cu diametrul de 1 mm, adaptat la o sering\ de 1ml printr-un tub lung de 20 de cm. Capilarul [i furtunul sunt introduse `ntr-un tub metalic care asigur\ rigiditatea [i maniabilitatea ansamblului. Printr-o a 3-a canul\ plasat\ pe linia alb\ la 15 cm de la ata[area glandei mamare, capilarul de transfer este introdus `n cavitatea abdominal\, apoi, prin punctul de jonc]iune `n lumenul uterin unde cei doi embrioni sunt depu[i cu aten]ie. Dup\ retragerea instrumentelor, se pulverizeaz\ un antibiotic la nivelul celor trei locuri de punc]ie a peretelui abdominal. Dup\ c\p\tarea dexterit\]ii necesare, transferul prin endoscopie se poate face `n 5-10 minute, iar traumatismul provocat este mult mai redus decât `n cazul transferului pe cale chirurgical\. Procentajul de reu[it\ a transferului de embrioni prin cele dou\ metode variaz\ `ntre 70,5% [i 75,6% la caprine [i `ntre 69% [i 74% la ovine. Pentru reu[ita transferului de embrioni la rumeg\toarele mici, o condi]ie important\ const\ `n sincronizarea cât mai bun\ a ciclurilor estrale la donatoare [i receptoare, astfel `ncât, s\ existe concordan]\ `ntre particularit\]ile dezvolt\rii embrionului [i modific\rile mediului uterin.

132

ÎNTREBĂRI RECAPITULATIVE

1. Definiţi şi detaliaţi importanţa transferului de embrioni la animale. 2. Care sunt etapele transferului de embrioni? 3. Prin ce mijloace se poate realiza sincronizarea estrului şi ovulaţiei la femelele donatoare şi receptoare de embrioni? 4. Care sunt schemele de tratament poliovulator la vaci? 5. Care sunt schemele de tratament poliovulator la oi? 6. Care sunt particularităţile recoltării embrionilor la vacă? 7. Care sunt particularităţile recoltării embrionilor la oaie? 8. Care sunt criteriile după care sunt evaluaţi calitativ embrionii recoltaţi de la femelele donatoare? 9. În ce constau tehnicile de conservare a embrionior? 10. Care sunt tehnicile transferului de embrioni la vacă şi oaie?

133

CAPITOLUL III BIOTEHNICI DERIVATE SAU FINALIZATE PRIN TRANSFER DE EMBRIONI

REZUMAT

-

Elaborarea unor tehnici care să concureze la utilizarea mai eficientă la reproducţie a femelelor de certă valoare reprezintă o necesitate de primă importanţă în creşterea şi ameliorarea efectivelor de animale. Pentru perfecţionarea continuă a procesului de reproducţie, în ultimul timp, atât pe plan mondial cât şi în ţara noastră, se aplică sau sunt în curs de implementare o serie de biotehnici care contribuie la ameliorarea într-un ritm accelerat a efectivelor de animale şi la creşterea numerică a acestora, cum sunt: fecundaţia „in vitro“; bisecţia embrionilor; sexarea embrionilor; sincronizarea estrului şi ovulaţiei în sezonul şi contrasezonul de reproducţie; inducerea poliovulaţiei (superovulaţiei); clonarea.

3.1. Fecunda]ia „in vitro“ Este o biotehnic\ de actualitate, prin intermediul c\reia procesele fiziologice de maturare a game]ilor femeli [i de capacitare a spermatozoizilor, fecunda]ie [i cultur\ a embrionilor pân\ la stadiul transferului acestora `n organismul femelelor receptoare, sunt dirijate [i se produc, par]ial sau total, `n afara organismului femelei („in vitro“) `n diferite medii de cultur\. Aceast\ biotehnic\, de[i bazele teoretice [i practice au fost puse cu circa 4-5 decenii mai `nainte, a c\p\tat un interes mai deosebit `n ultimele dou\ decenii. Cu toate preocup\rile destul de intense `n acest domeniu, succesul `nregistrat la mamiferele domestice este destul de limitat. Rezultate recente referitoare la num\rul de embrioni produ[i „in vitro“ pe plan mondial sunt redate `n tab. 3.

134

Tabelul 3 Situa]ia mondial\ a transferului de embrioni produ[i „in vitro“ (dup\ AETE*, 1997) Regiunea

Embrioni proaspe]I

Embrioni congela]i

Asia Japonia 1791 2851 Europa Fran]a 150 70 Ungaria 6 Irlanda 1487 97 Italia 100 3050 Olanda 1603 282 Spania 3 5140 6340 Total AETE*=Asocia]ia european\ a transferului de embrioni

Total embrioni 4642 220 6 1584 3150 1885 3 11490

La mamifere, fecunda]ia fiind intern\, analiza intim\ a mecanismelor implicate `n acest proces biologic este delicat\ [i costisitoare. Fecunda]ia „in vitro“ constituie o biotehnic\ ce permite studierea „in vitro“ a interac]iunilor dintre cei doi game]i sub rezerva reproducerii artificiale a condi]iilor identice existente ,,in vivo“. Dup\ cum s-a studiat la capitolul „Fecunda]ie“, elementele esen]iale ale acestui interesant [i complex proces, constau dintr-o serie de interac]iuni `ntre cei doi game]i care, `n final, conduc la unirea lor [i la combinarea genotipurilor. Principalele „secven]e“ ale fecunda]iei se refer\ la: - fixarea spermatozoizilor de zona pelucid\, urmat\ de str\baterea acestei membrane; - fuzionarea membranelor plasmatice ale celor doi game]i; - `ncorporarea spermatozoidului `n ooplasm\ [i activarea ovocitului; - singamia. ~n momentul ovula]iei, ovocitul este captat de pavilion [i descinde de-a lungul oviductului. La majoritatea animalelor de ferm\, celulele coroanei radiata sunt eliminate rapid dup\ ovula]ie. Spermatozoizii dobândesc puterea lor fecundant\ `n cursul `naint\rii prin tractusul genital femel. Num\rul game]ilor masculi care ajung la nivelul oviductului, `n momentul ovula]iei, este foarte restrâns, astfel `ncât raportul dintre spermatozoizi [i ovocite la rumeg\toare variaz\ de la 1 la 10. De asemenea, reac]ia acrozomului spermatozoidului se produce la nivelul zonei pelucide. ~n consecin]\, rolul oviductului este de a asigura dezvoltarea embrionului pân\ la stadiul de 8-16 celule, apoi acesta trece `n vârful cornului uterin. Cercet\rile efectuate au relevat faptul c\ fluidul oviductului (sau lichidul tubar) nu este un simplu transsudat sanguin, ci este un mediu cu unele `nsu[iri fizico-chimice speciale: concentra]ie mai ridicat\ a ionilor de K+ [i un nivel mai sc\zut al concentra]iei ionilor de Mg++, comparativ cu serul sanguin. Volumul secre]iei tubare este hormono dependent. Lichidul tubar poate suferi unele schimburi cu lichidul peritoneal.

135

~n condi]ii naturale, embrionul p\r\se[te oviductul, `n general, dup\ al 3-lea clivaj, iar dezvoltarea zigotului la nivelul oviductului nu este strict specific\. Astfel, embrionii bovini se dezvolt\ `n oviductul ligaturat de oaie sau iepuroaic\. Aceast\ dezvoltare a embrionului pân\ la stadiul de blastocist la nivelul oviductului chiar provenind de la alt\ specie, constituie un fenomen remarcabil. Primele rezultate ob]inute cu ovocite maturate „in vivo“ au fost ob]inute `n anul 1954 la iepuroaic\, `n 1969 la [oarece [i `n 1980 la bovine (Marquant B. [i colab.,1991). Primul produs ob]inut printr-o astfel de biotehnic\ este consemnat `n anul 1959 la iepure, 1978 la om [i `n 1982 la bovine. ~n ceea ce prive[te produ[ii rezulta]i prin fecunda]ia cu ovocite maturate „in vitro“, `n 1972 s-au ob]inut primii zigo]i de [oarece prin fecundarea ovocitelor cu spermatozoizi recolta]i de la nivelul epididimului; `n anul 1973 s-au ob]inut produ[i la iepure prin fecundarea ovocitelor cu spermatozoizi capacita]i `n uter; `n anul 1986 s-au ob]inut primii miei, prin folosirea la fecundarea ovocitelor a spermatozoizilor ejacula]i; `n 1986 s-au ob]inut primii vi]ei folosindu-se pentru fecundarea ovocitelor spermatozoizi conserva]i prin congelare (Marquant B. [i colab.,1991).

Dup\ aceste prime succese `nregistrate, fecunda]ia „in vitro“ s-a generalizat, dup\ cum s-a v\zut, la toate mamiferele de interes zootehnic, `ns\ ob]inerea unui nivel ridicat de fecunda]ie „in vitro“ s-a `nregistrat mult mai târziu. Nivelul relativ sc\zut de fecunda]ie `nregistrat `n perioada de `nceput a aplic\rii fecunda]iei „in vitro“s-a datorat `n special, folosirii unei temperaturi inadecvate acestei etape. S-a demonstrat c\ temperatura central\ la mamifere este de 39oC ceea ce face ca nivelul procentului de fecunda]ie `nregistrat la incubarea game]ilor la 37oC s\ fie extrem de sc\zut (tab. 4). Tabelul 4 Influen]a temperaturii asupra nivelului fecunda]iei „in vitro“ (dup\ Chang [i colab., Lenz [i colab., cit. de Marquant [i colab., 1991) Specia Suine Taurine Ovine

Temperatura 37oC 39 oC 37oC 39 oC 37oC 39 oC

Etapele fecunda]iei „in vitro“ sunt: - ob]inerea ovocitelor; - maturarea „in vitro“ a ovocitelor; - capacitarea spermatozoizilor; - fecundarea [i cultura „in vitro“; - transferul embrionilor rezulta]i.

136

Fecunda]ia 1% 89% 7% 53% 9% 80%

3.1.1. Ob]inerea ovocitelor

Sursele posibile pentru ovocite sunt: - ovocite provenite prin punc]ia foliculilor maturi de la femele cu estru spontan sau superovulat, recoltate `nainte sau imediat dup\ ovula]ie; - ovocite ob]inute din foliculi imaturi, recoltate din ovarele femelelor sacrificate sau ovariectomizate; - ovocite rezultate din oviducte, imediat dup\ ovula]ie. Prima [i a treia surs\ de ovocite sunt limitate, deoarece numai un num\r mic de foliculi se matureaz\ [i ovuleaz\ spontan, sau numai un num\r relativ restrâns de foliculi pot fi activa]i prin injectarea hormonilor gonadotropi. Ovocitele mature pot fi recoltate din foliculi maturi sau din oviduct `n primele 6 ore de la ovula]ie, plasate `ntr-un mediu Krebs-Ringer [i incubate la 38oC, umiditatea relativ\ de 100% [i 5% atmosfer\ de CO2. Ovocitele ob]inute prin punc]ia ovarelor provenite de la animalele sacrificate la abator sau a ovarelor ob]inute prin abla]ia acestora, constituie o surs\ important\ de game]i femeli, `ns\ aceste ovocite necesit\ a fi maturate ,,in vitro“. Punc]ia foliculilor pe animalul viu permite folosirea donatoarelor de ovocite cu poten]ial genetic cunoscut. Pentru recoltarea ovocitelor `n astfel de condi]ii se mai poate folosi un endoscop, cuplat la un sistem de aspirare, `n vederea prelev\rii lichidelor foliculilor cu un diametru de 2-6 mm, de la vaci stimulate sau nu cu hormoni gonadotropi exogeni. De asemenea, punc]ia foliculilor, ghidat\ prin ecografie transvaginal\ permite colectarea fluidului folicular [i a complexelor ovocite-cumulus. Aceast\ tehnic\ poate fi repetat\ de mai multe ori `n cursul aceluia[i ciclu, f\r\ a afecta fertilitatea ulterioar\ a femelei donatoare. 3.1.2. Maturarea „in vitro “ a ovocitelor

Ovocitele prelevate din foliculii antrali, prin laparotomie sau sacrificarea femelelor, reiau spontan meioza dac\ sunt plasate `ntr-un mediu special de cultur\, la 38oC, incubate `ntr-o atmosfer\ de 5% CO2. Prezen]a unui cumulus compact [i intact `n momentul cultiv\rii ovocitelor favorizeaz\ reluarea meiozei pentru majoritatea ovocitelor. Studii de microscopie electronic\ au ar\tat c\ celulele cumulus-ului emit numeroase prelungiri ce traverseaz\ zona pelucid\ [i stabilesc leg\turi func]ionale complexe cu citoplasma ovocitului. Aceste leg\turi, par]ial sunt `ntrerupte, dup\ 3 ore de cultur\ a ovocitului `n mediul special, pentru ca dup\ 16-18 ore de cultur\, contactele dintre celulele cumulusului [i ovocit s\ dispar\ complet. Ruperea membranei nucleare se produce dup\ 6-12 ore de cultur\ [i emiterea primului globul polar dup\ 24 de ore. Aceste transform\ri nucleare, ce deosebesc maturarea „in vitro“ a ovocitelor, modific\ri observabile prin tehnici histologice, sunt `nso]ite de modific\ri citoplasmatice mult mai greu de decelat prin mijloace actuale de investigare. S-a dovedit, prin multiple experien]e, c\ ovocitele cultivate `n foliculul lor se matureaz\ asem\n\tor celei observate ,,in vitro“.

137

La oaie, Staigmiller [i Moor, 1984 (cita]i de Marquant B., 1991) au ar\tat c\ ad\ugarea unei suspensii de celule ob]inute din granuloasa foliculilor ovarieni `n mediul de cultur\, permite o maturare normal\ a ovocitelor. La vac\, nivelul matur\rii ovocitelor `n medii cu sau f\r\ adaos de celule din granuloas\, nu variaz\ mult, `ns\ prezen]a acestor celule permite restabilirea poten]ialului de dezvoltare a ovocitelor dup\ fecunda]ia „in vitro“. Ovocitele ob]inute prin punc]ia foliculilor dispu[i mai `n profunzimea cortexului ovarian au un poten]ial de maturare [i dezvoltare ulterioar\ mult mai slabe, comparativ cu ovocitele ob]inute prin punc]ia foliculilor mari, maturi, situa]i la suprafa]a ovarului. 3.1.3. Capacitarea spermatozoizilor

Spermatozoizii mamiferelor nu sunt capabili de fecundare a ovocitelor, din momentul ejacul\rii. Spermatozoizii trebuie s\ parcurg\ o perioad\ de preg\tire, numit\ „capacitare“, care are loc „in vivo“, `n tractusul genital femel. Capacitarea este o etap\ preg\titoare necesar\, `n urma c\reia spermatozoizii dobândesc capacitatea de a se fixa pe zona pelucid\ a ovocitului [i sufer\, apoi, reac]ia acrozomului. Studiile de microscopie electronic\ au ar\tat c\ `n decursul etapei de „capacitare“ au loc dou\ fenomene mai importante: - modific\ri la nivelul membranelor spermatozoidului [i acrozomic\ extern\, precum, migrarea proteinelor de acoperire cu formarea de zone libere de proteine, ceea ce permite fuziunea membranelor plasmatice [i acrozomic\ extern\, `n momentul reac]iei acrozomului. Prin orificiile create, se elimin\ o cantitate din colesterolul care antreneaz\ o diminuare a raportului colesterol/fosfolipide, asociate unei permeabilit\]i membranare crescute pentru ionii de calciu. Pe baza acestei constat\ri, toate mediile de capacitare folosite au `n comun prezen]a serului albuminic, care este un acceptor de colesterol; - modificarea mi[c\rii spermatozoidului care, din liniar\ (prin `n[urubare) traiectoria devine, mai mult sau mai pu]in circular\, mi[care ce se datoreaz\ cre[terii permeabilit\]ii pentru ionii de calciu. Amplitudinea mi[c\rilor cozii se m\re[te, spermatozoidul fiind calificat ca „hipermobil“. Diversele medii [i tehnici `ntrebuin]ate pentru capacitarea spermatozoizilor ,,in vitro“ au `n vedere faptul de a permite spermatozoizilor s\ sufere toate aceste modific\ri [i mai ales s\ le men]in\ o mobilitate ridicat\. Capacitarea spermatozoizilor s-a ob]inut prin incubarea acestora la 37oC, timp de una-dou\ ore, `ntr-un mediu cu o for]\ ionic\ crescut\, ceea ce a dus la deta[area proteinelor de acoperire. Aplicarea acestei tehnici la sperma recoltat\ prin ejaculare de la taur, a permis ob]inerea unui procent de fecunda]ie ridicat [i na[terea de vi]ei normali, dup\ transferul embrionilor ob]inu]i prin fecundarea game]ilor `n astfel de medii. Diversele studii `ntreprinse pe aceast\ problem\, au ar\tat c\

138

fenomenul de capacitare a spermatozoizilor ,,in vitro“ este mult diferit de cea realizat\ „in vivo“. ~n oviduct, `n condi]ii naturale, fecunda]ia are loc `n absen]a celulelor din cumulus, pe când „in vitro“ ovocitele nude, `n momentul contactului cu spermatozoizii sunt fecundate `ntr-o propor]ie foarte sc\zut\ comparativ cu ovocitele `nconjurate de celule din cumulus. Aceasta presupune c\ celulele din cumulus au probabil un rol `n capacitarea „in vitro“ a spermatozoizilor. Majoritatea cercet\torilor care se ocup\ de aspectele fecunda]ei „in vitro“ folosesc sperma congelat\, cu rezultate bune. Alte medii capacitante pentru spermatozoizi sunt cele care con]in ionoforul calcic, asociat sau nu cu cafeina. Totodat\, cafeina pare a fi un agent capacitant mai apropiat de condi]iile naturale, deoarece aceast\ substan]\ se g\se[te pe traiectul c\ilor genitale dup\ ovula]ie. S-a dovedit c\ spermatozoizii de taur posed\ receptori pentru heparin\, ace[tia ac]ionând `n func]ie de doz\ [i u[ureaz\ p\trunderea calciului `n spermatozoid. Se mai folose[te, `n mediile capacitante, lichidul folicular, care, `ntre altele, con]ine [i heparin\. Un nivel de capacitare satisf\c\tor se ob]ine atunci când se practic\ o concentra]ie ridicat\ de spermatozoizi `n mediu, care trebuie s\ fie de 3-4 miliarde spermatozoizi/ml, când nivelul fecunda]iei atinge 87% dintre ovocite. 3.1.4. Fecunda]ia [i cultura „in vitro“ a embrionilor

Fecundarea se realizeaz\ prin cultura timp de o zi `ntr-un mediu special a 0,1ml suspensie de spermatozoizi, cu concentra]ie ridicat\, `mpreun\ cu ovocite mature, `n atmosfer\ de 5%CO2, 5%O2 [i 90%N2. Dup\ 24 de ore de cultur\ `mpreun\ cu spermatozoizii, ovocitele fecundate sunt transferate `ntr-un mediu special `n vederea dezvolt\rii ulterioare. Ovocitele se examineaz\ la stereolup\ [i sunt considerate ca fecundate atunci când se constat\: - prezen]a spermatozoizilor `n spa]iul perivitelin; - prezen]a spermatozoizilor `n ovoplasm\; - prezen]a pronucleilor [i apari]ia segmenta]iei. „In vivo“, dup\ fecunda]ie, embrionul `ncepe dezvoltarea sa `n oviduct, `nainte de a ajunge `n uter (ziua 4-5 la rumeg\toare), `n stadiul de morul\ tân\r\. „In vitro“, oricare este mediul de cultur\ folosit, zigo]ii se blocheaz\ `n stadiul de 8 celule. Pentru mult timp, singurul mijloc de a asigura dep\[irea stadiului de blocaj evolutiv l-a constituit transferul tinerilor zigo]i `n oviductul unei gazde intermediare (iepuroaic\) [i apoi transferul lor `n uterul femelelor receptoare. Experien]ele au dovedit c\ cultura zigo]ilor de rumeg\toare pe un strat de celule tubare a permis ob]inerea blastoci[tilor [i a nou-n\scu]ilor, dup\ transferul la femelele receptoare. Totodat\ s-a demonstrat c\ prin co-cultura zigo]ilor cu vezicule trofoblastice permitea la circa 40% dintre ace[tia s\ dep\[easc\ stadiul de 8 celule (Marquant B. [i colab.,1991). Ou\le fecundate „in vivo“, apoi cultivate „in vitro“ pe un strat de celule prelevate din oviduct, unde evolueaz\ pân\ la stadiul de blastocist, au un aspect morfologic normal. Totu[i, studiul histologic atent a relevat

139

faptul c\ ace[ti blastoci[ti, comparativ cu cei preleva]i „in vivo“ sunt alc\tui]i dintr-un num\r redus de celule, multe dintre ele pe cale de degenerare. ~ns\ cultura embrionilor pe un strat de celule tubare, apoi uterine [i adi]ionarea unui factor de cre[tere `n mediul de cultur\ a permis realizarea unui nivel important de dezvoltare pân\ la stadiul de blastocist ca [i a unui nivel de ecloziune, comparabil cu cel realizat „in vivo“. Aceste experien]e demonstreaz\ faptul c\ oviductul nu `ndepline[te un rol specific `n trecerea de la starea de blocaj spre stadiile ulterioare evolutive, deoarece blastoci[tii pot fi ob]inu]i [i prin co-cultura cu celule trofoblastice, din cumulus, ca [i cu celule prelevate din oviduct. 3.1.5. Transferul embrionilor ob]inu]i „in vitro“

Se face `n uterul femelelor receptoare, din aceea[i specie, a c\rei ciclu sexual a fost sincronizat cu vârsta embrionilor ob]inu]i „in vitro“. Nivelul gesta]iei `n urma transferului sincron [i asincron a embrionilor bovini cultiva]i „in vitro“ arat\ c\ nivelul cel mai ridicat de gesta]ii s-a ob]inut atunci când femelele receptoare se g\sesc `n ceea ce prive[te ciclul sexual, `n `ntârziere cu una-dou\ zile, fa]\ de vârsta teoretic\ a embrionilor (tab. 5). Embrionii ob]inu]i con]in un num\r mai redus de celule, cu toate c\ morfologic apar normali, de aceea nivelul gesta]iei este mai ridicat atunci când receptoarele sunt din punct de vedere al ciclului sexual `n `ntârziere, `n raport cu vârsta teoretic\ a embrionului. Aceasta eviden]iaz\ faptul c\ mediile de cultur\ folosite nu sunt adecvate integral. Nivelurile de dezvoltare a embrionilor ob]inu]i „in vitro“ transfera]i receptoarelor [i a gesta]iei sunt mai sc\zute comparativ cu cei ob]inu]i dup\ transferul de embrioni „in vivo“. Tabelul 5 Nivelul gesta]iei dup\ transferul sincron al embrionilor bovini dup\ maturare, fecundare [i cultur\ „in vivo“ `n condi]iile transferului a câte 2 embrioni/receptoare (Kajihira [i colab.,1990 cit. de Marquant B. [i colab., 1991) Sincronism `ntre stadiul de dezvoltare al embrionilor [i stadiul ciclului sexual al receptoarelor -2,5 -2,0 -1,5 -1,0 0 la +1

Num\r de receptoare

Gesta]ii (%)

8 22 17 27 13

63 82 59 59 46

Pe ansamblul aplic\rii acestei biotehnici, nivelurile gesta]iei sunt mai slabe `n raport cu num\rul ovocitelor folosite, chiar atunci când zigo]ii sunt cultiva]i `n oviductul unei gazde intermediare.

140

3.1.6. Importan]a, perspectivele [i aplica]iile fecunda]iei „in vitro“

Contrar amelior\rilor tehnice aduse `n ultimii ani acestei biotehnici, randamentul global r\mânea relativ sc\zut, fapt ce a `ncetinit ritmul aplic\rii `n practic\ pe o scar\ mult mai mare. Cercet\rile ulterioare trebuie s\ fie orientate, mai ales, spre cre[terea randamentului diverselor etape, `n particular cea a culturii embrionilor. Cu toate dificult\]ile `ntâmpinate, fecundarea „in vitro“ r\mâne un necesar [i indispensabil stadiu pentru `n]elegerea diferitelor fenomene, `ndeosebi a stadiilor dezvolt\rii ini]iale a embrionului. La bovine, folosirea pentru fecunda]ia „in vitro“ a ovocitelor provenite de la femele f\r\ valoare genetic\ (recoltate de la abator) permite stabilirea unui diagnostic precoce a fertilit\]ii taurilor folosi]i la `ns\mân]\ri artificiale. ~ntr-adev\r, s-a pus `n eviden]\ o corela]ie `ntre nivelul dezvolt\rii globale „in vitro“ (num\rul de blastoci[ti/num\r ovocite supuse fecund\rii) [i fertilitatea taurilor „in vivo“ (nivelul NR% la dou\-trei luni). Tehnica matur\rii „in vitro“ permite producerea la pre]uri sc\zute a unui num\r mare de ovocite care pot fi utilizate ca receptoare de nuclei ai embrionilor proveni]i de la vacile cu `nalt poten]ial genetic, `n cursul clon\rii. Acest aspect este valorificat comercial de unele firme americane. Punc]ia foliculilor antrali, pe animalul `n picioare, prin folosirea metodelor endoscopice sau ecografice transvaginale permite folosirea femelelor donatoare de ovocite de un `nalt poten]ial genetic, `ntr-un num\r ridicat. Acest tip de colectare [i maturare „in vitro“ a ovocitelor va deveni rentabil numai atunci când randamentele realizate vor permite producerea, pe donatoare, a unui num\r de embrioni superior celui ob]inut `n prezent prin superovulare, fecunda]ie „in vivo“ [i colectare transcervical\ a zigo]ilor. Prin practicarea acestei biotehnici exist\ posibilitatea reducerii num\rului necesar de spermatozoizi pentru a ob]ine o fecunda]ie, [i `n consecin]\, folosirea cu intensitate sporit\ a spermei provenit\ de la animale valoroase pentru fecundarea unui num\r crescut de ovocite, comparativ cu celelalte biotehnici (`ns\mân]\ri artificiale [i transfer de embrioni). Totodat\, fecunda]ia „in vitro“ va permite `n viitorul apropiat intensivizarea procesului de ameliorare genetic\ a efectivelor de animale. Prin aceast\ biotehnic\, se pot ob]ine mai multe ovocite de la aceea[i femel\, ovocite care pot fi fecundate cu spermatozoizi proveni]i de la mai mul]i reproduc\tori, fapt ce ar constitui un mare avantaj pentru testarea reproduc\torilor masculi [i femeli. Microinjec]ia de spermatozoizi `n ovocitele maturate „in vitro“ reprezint\ o alt\ cale de ob]inere de embrioni normali. Dup\ activarea ovocitei, ou\le au fost cultivate pân\ la stadiul de morul\-blastocist [i transferate la femele receptoare, ob]inându-se, deja, unele rezultate. Posibilitatea de a avea, dup\ fecunda]ia „in vitro“, un num\r crescut de embrioni `ntr-un stadiu precis de dezvoltare prezint\ un mare avantaj pentru o alt\ biotehnic\ de reproduc]ie, transgeneza. ~ntr-adev\r, microinjec]ia artificial\ a unei gene se efectueaz\ `n stadii precise de

141

dezvoltare, `n general `n stadiul de doi pronuclei sau de dou\ blastomere. Deja, unele echipe de cercet\tori [i-au propus s\ foloseasc\ spermatozoidul ca vector al genei ce urmeaz\ a fi transferat\, `n cazul fecunda]iei „in vitro“, rezultate `ncurajatoare ob]inându-se pe [oareci. Oricare ar fi biotehnicile utilizate (clonaj transgenez\), rezultatul este totdeauna un ou `n stadiul de una-dou\ celule pe care trebuie testat\ dezvoltarea ulterioar\ prin tehnici mai pu]in costisitoare, comparativ cu transferul pe cale chirurgical\ `n oviductul unei femele receptoare. Maturarea ovocitelor, fecunda]ia „in vitro“ [i cultura embrionilor ob]inu]i sunt etape de mare interes pentru mamiferele domestice, `ns\ dirijarea acestor trei etape prezint\ importan]\ pentru dezvoltarea tehnicilor de clonare [i transgenez\. 3.2. Bisec]ia embrionilor Tehnicile de micromanipulare perfec]ionate [i simplificate `n ultimul timp, au f\cut posibil\ microchirurgia embrionar\. Micromanipul\rile sunt facilitate de faptul c\ ou\le (zigo]ii) majorit\]ii speciilor de mamifere sunt circumscrise de o zon\ pelucid\ acelular\. Zona pelucid\ `ndepline[te mai mult atribu]ii referitoare la protec]ia fizic\ a zigotului. Rezisten]a acestei membrane permite men]inerea oului `n depresiunea extremit\]ii unei micropipete f\r\ a afecta structura intern\ a oului. Aceast\ `nsu[ire u[ureaz\ mult interven]ia microinstrumentelor. Prin practicarea tehnicilor de micromanipulare, `n prezent se poate interveni pe zigot pentru: - ob]inerea jum\t\]ilor monozigote, prin bisec]ie; - sexarea embrionului; - producerea de himere; - ob]inerea de indivizi transgenici; - producerea clonelor. Bisec]ia embrionilor const\ `n sec]ionarea `n dou\ jum\t\]i a zigo]ilor afla]i `n stadiul de morul\ târzie sau de blastocist tân\r (6-8 zile) (foto 32). Aceast\ biotehnic\ are ca baz\ fiziologic\ constatarea c\ la mamifere, `n mod natural, apar jum\t\]i [i uneori chiar triplete monozigote. Primele studii f\cute pe embrioni de [oareci Foto 32 Bisec]ia embrionilor [i iepure au ar\tat c\ un blastomer protejat de propria zon\ pelucid\ este capabil de a se dezvolta [i de a produce un individ normal. ~ns\, un blastomer izolat, transferat f\r\ zona pelucid\ sau reintrodus `ntr-o zon\ pelucid\ larg deschis\ este incapabil de evolu]ie (Nibart M., 1991).

142

Ozil, 1982 (cit de Nibart M.,1991) a propus sec]ionarea `n dou\ p\r]i egale a embrionilor de 6-8 zile, stadiu `n care rolul zonei pelucide nu mai prezint\ importan]\. El a dezvoltat un sistem de microchirurgie cu ajutorul mai multor instrumente, folosite `n a[a fel `ncât s\ lezioneze cât mai pu]in posibil zona pelucid\ [i repunerea fiec\rui demiembrion `n câte o zon\ pelucid\. Rezultatele ob]inute, exprimate `n G% dup\ transfer, au fost considerate ca excelente: 27 de produ[i pentru 25 de embrioni sec]iona]i. Numero[i autori au continuat bisec]ia embrionilor bovini simplificând tehnica, ce este format\ numai din dou\ microinstrumente. Voelkel [i colab., (1948), Baker [i Shea (1985), Picard [i colab.,(1985, cit. de Nibart M., 1991) [.a. au demonstrat c\ nu mai este

necesar\ repunerea embrionului `ntr-o zon\ pelucid\ `naintea transferului, ceea ce a simplificat mult metoda. Cu ajutorul a dou\ micromanipulatoare, unul purtând micropipeta, cel\lalt microcu]itul, un operator antrenat poate ob]ine `n câteva minute doi demiembrioni, viabili, `n condi]iile bisec]iei unice a embrionilor de bun\ calitate, aprecia]i `n stadiul de morul\ compact\-blastocist tân\r. Dup\ transferul celor dou\ jum\t\]i la femelele receptoare, nivelurile gesta]iei se situeaz\ `ntre 50% [i 65%, `ns\ pentru majoritatea autorilor, nivelurile gemelarit\]ii au fost de 50%. Nu s-au `nregistrat diferen]e `n nivelul ob]inerii de gemeni, indiferent dac\ ace[tia au fost repu[i amândoi `n cornul uterin ipsilateral ovarului cu corp galben sau repus fiecare `n câte un corn uterin al aceleia[i receptoare. S-au ob]inut unele rezultate (50% gesta]ii) dup\ transferul jum\t\]ilor de embrion conservate prin refrigerare timp de 24 de ore la 24oC. Congelarea `n azot lichid a jum\t\]ilor de embrion repuse `n zona pelucid\, a condus la ob]inerea unui nivel sc\zut de gesta]ii (20%). Dac\ `nainte de congelare embrionii sunt men]inu]i `ntr-un mediu de cultur\ (2-24 de ore), nivelul gesta]iilor ob]inute este mult mai ridicat. Rezultatele ob]inute arat\ c\ embrionii buni de 40-80 de celule, sunt capabili, prin bisec]ie, s\ dea doi demiembrioni care, transfera]i `n uterul receptoarelor, s\ evolueze normal, cu toate c\ au de recuperat circa jum\tate din celulele embrionului ini]ial. Rezultate `n ob]inerea gemenilor monozigo]i, sunt superioare când se lucreaz\ cu blastoci[ti tineri, comparativ cu stadiul de morul\ tân\r\. ~ncercarea de a ob]ine gemeni tripli sau cvadrupli, prin sec]ionarea embrionilor `n stadiul de 40-80 de celule nu s-a soldat cu rezultate satisf\c\toare, ceea ce arat\ c\ aceast\ biotehnic\ este limitat\ de num\rul restrâns de gemeni (2) ce pot fi ob]inu]i dintr-un singur embrion. Dac\, de exemplu, consider\m `n medie pe donatoare 5 embrioni viabili (trei buni [i doi medii), dup\ transferul acestora se ob]in `n principiu trei vi]ei. Prin bisec]ia celor trei embrioni buni [i transferul fiec\rei jum\t\]i la câte o receptoare, este posibil s\ se ob]in\ tot trei vi]ei (50% gesta]ie) sau, per total 4 vi]ei. Câ[tigul de un vi]el presupune existen]a a 8 receptoare, `n loc de 5. Dac\ nivelurile gesta]iei sunt mai sc\zute (50%-30%) sporul de un vi]el ob]inut pe o donatoare superovulat\ este anulat. ~n condi]iile atingerii unor rezultate normale, prin practicarea bisec]iei embrionilor se pot ob]ine, `n medie, 4 vi]ei pe

143

donatoare `n loc de trei vi]ei, ceea ce presupune un câ[tig de 33% a num\rului descenden]ilor proveni]i de la fiecare femel\ superovulat\. ~n aceste condi]ii, o selec]ie bine dirijat\, accept\ cu rezerve p\strarea a mai mult de un singur exemplar al unei familii clonate, din cauza reduc]iilor majore survenite `n varian]a genetic\ [i `n sporirea consangvinit\]ii. ~n aceste circumstan]e, producerea unor familii biclonate pentru to]i indivizii distinc]i genetic se poate face numai prin reducerea la jum\tate a num\rului unor astfel de indivizi, prin aceasta sc\zând `ns\[i intensitatea selec]iei. Continuarea bisec]ion\rii embrionilor (clon\rii) erodeaz\ intensitatea selec]iei prin reducerea progresului genetic, m\re[te consangvinitatea, sc\derea intensit\]ii selec]iei nefiind compensat\ prin câ[tigurile ob]inute `n precizia selec]iei sau exactit\]ii rezultatelor ei (Woolliams G.A., 1989). Biotehnica bisec]iei embrionilor este totu[i bun\ pentru producerea adev\ra]ilor gemeni, necesari test\rii unor preparate farmaceutice sau a furajelor, factorul genetic fiind `nl\turat. Ob]inerea himerelor s-a realizat prin microchirurgie, la rumeg\toare [i suine, constând `n amestecul de celule embrionare de la specii diferite. 3.3. Sexarea embrionilor Determinarea sexului embrionului nu este realizabil\ decât la vârsta la care se face transferul acestuia (6-8 zile). Este considerat\ ca o descoperire economic\ de mare importan]\ [i const\ `n prelevarea câtorva celule care sunt investigate citogenetic, imunologic, enzimologic etc. `n vederea determin\rii sexului produsului de concep]ie `nc\ din acest stadiu incipient de dezvoltare. Metoda genetic\ (cariotipic\) se bazeaz\ pe recunoa[terea citologic\ a cromozomului y, specific masculilor. Este vorba de o tehnic\ ce permite efectuarea sex\rii zigo]ilor, pornind de la un num\r mic de celule prelevate de la zigo]i [i care s\ nu compromit\ dezvoltarea ulterioar\ a embrionului. Recent, folosirea unei „sonde“ moleculare specifice cromozomului y la bovine, pare s\ r\spund\ tuturor a[tept\rilor. Unele echipe de cercetare ac]ioneaz\ `n direc]ia trierii spermatozoizilor purt\tori ai cromozomului x [i y , pe baza diferen]ei acestora `n ce prive[te con]inutul `n ADN. Aceast\ metod\, `mpreun\ cu fecunda]ia „in vitro“ ar furniza un procedeu ideal care s\ r\spund\ necesit\]ilor zootehnice moderne. Metoda imunologic\ const\ `n c\utarea pe suprafa]a celulelor masculine a antigenului de citocompatibilitate, prin folosirea unor anticorpi monoclonali specifici pentru acest tip de antigen. Metoda enzimologic\ se bazeaz\ pe faptul c\ unele enzime celulare sunt codificate de c\tre gene apar]inând cromozomului x. Cantitatea acestor enzime este , deci, de dou\ ori mai mare `n celulele femele decât `n celulele mascule. Determinarea activit\]ii acestor enzime `ntr-un blastomer izolat a permis sexarea embrionilor `ntr-o propor]ie ridicat\.

144

Tehnica amplific\rii ADN (PCR). Dup\ descoperirea posibilit\]ilor de amplificare enzimatic\ dirijate de ADN-ul celular, unii cercet\tori au dezvoltat o tehnic\ de sexare prin amplificarea enzimatic\ (PCR-Polimerase Chaine Reaction) a secven]ei lor specifice. Sexajul este efectuat pe 5-10 celule prelevate prin biopsia embrionilor de bun\ calitate. Plecând de la aceste celule, determinarea sexului se sprijin\ pe detectarea unei secven]e specifice a ADN-ului cromozomului y printr-o sond\ molecular\ complementar\. Aceast\ secven]\ este amplificat\ de PCR. ADN-ul amplificat este separat prin electroforez\ [i vizualizat prin fluorescen]\. Având `n vedere tehnicile pentru sexare (eviden]ierea ADN specific) [i sensibilitatea specific\ (amplificarea ADN de ordinul a 105), biopsia trebuie s\ fie realizat\ `n cele mai bune condi]ii igienice [i tehnice. Sexarea embrionilor `nainte de implantare, ofer\ posibilitatea stabilirii raportului de sexe `ntr-o popula]ie, `n sensul dorit de cresc\tori func]ie de necesarul de animale de reproduc]ie, carne, lapte etc. 3.4. Transplantarea nucleilor [i ob]inerea de clone Clonajul embrionar const\ `n producerea mai multor animale pornind de la un singur embrion. Acestea pot fi ob]inute prin simpla sec]iune sau disociere a unui embrion, `n stadiul de preimplantare (bisec]ia embrionilor). Prin aceast\ metod\ s-au produs numeroase perechi de vi]ei gemeni, `ns\ foarte rar s-au putut ob]ine triplete sau gemeni cvadrupli. Teoretic, tehnica transferului nucleului permite ob]inerea unui num\r mare de indivizi plecând de la un singur embrion, având `n vedere faptul c\ patrimoniul genetic al tuturor nucleilor unui embrion tân\r este identic, `n sensul c\ poart\ aceea[i informa]ie genetic\. Transferul nucleilor celulelor provenite de la acela[i embrion `n mai multe ovocite enucleate [i activate, este urmat de evolu]ia ovocitelor spre indivizi genetic identici. Posibilitatea ob]inerii de serii de animale identice genetic prezint\ interese multiple pentru zootehnie. Astfel, `n activitatea de selec]ie, folosirea unor clone, chiar limitate numeric, ofer\ posibilitatea evalu\rii cu `nalt\ precizie a valorii reproduc\torilor. Animale cu acela[i genotip, `ntre]inute `n ferme diferite, sunt excelen]i subiec]i de studiere a influen]ei factorilor de mediu asupra performan]elor acestora. Totodat\, ob]inerea mai multor copii a reproduc\torilor foarte valoro[i va contribui la cre[terea [i difuzabilitatea progresului genetic, `ns\ cu reversul mic[or\rii patrimoniului genetic al efectivelor de animale. Pentru produc]ie, plecând de la rasele de carne, embrionii proveni]i de la un genitor cu o excelent\ conforma]ie (caracter cu coeficient mare de heritabilitate) vor putea fi multiplica]i prin clonare [i transplanta]i, cu producerea unor loturi de animale cu carcase omogene [i de calitate superioar\. De asemenea, pe termen lung, ob]inerea [i comercializarea embrionilor clona]i `n mari serii, asociat\ cu maturarea „in vitro“ vor permite sc\derea considerabil\ a transferului embrionar.

145

Briggsi [i King (1952) au ar\tat c\ nucleii preleva]i, `n stadiul de

blastul\, la broasc\ [i grefa]i `n ovocite, pot s\-[i continue dezvoltarea pân\ la stadiul de blastul\, iar `n 1962 Mc Kinnel a ob]inut, prin aceea[i metod\, broa[te adulte. Pentru embrionul de mamifere, `n 1986 Willadsen S., la Cambridge a ob]inut pentru prima dat\ trei miei dup\ transfer de nuclei, proveni]i de la un embrion `n stadiul de 8 celule (Heyman Y. [i colab., 1991). La taurine, s-au ob]inut de c\tre diferite echipe de cercet\tori clone constituite din 8-9 vi]ei, iar la iepure s-a ob]inut o clon\ de 6 indivizi, plecând de la un embrion congelat `n stadiul de morul\. Transferul de nuclei parcurge trei etape (Heyman Y. [i colab., 1991):

-

ob]inerea de ovocite enucleate destinate de a primi nucleii; izolarea nucleilor embrionului donator; reconstituirea de serii de embrioni monocelulari.

3.4.1. Preg\tirea ovocitelor receptoare

Prima opera]ie const\ `n extragerea genomului maternal al ovocitei „receptoare“. Pentru aceasta, se folosesc ovocite mature care, `n absen]a fecunda]iei sau a activ\rii, se g\sesc blocate `n stadiul de metafaz\ II a meiozei. Retragerea nucleului poate fi realizat\ prin micromanipulare, p\trunzând cu vârful unei micropipete `n interiorul celulei [i aspirând u[or cromozomii. Pentru a se evita ruperea membranei viteline a ovocitului, cum se `ntâmpl\ cel mai adesea, ovocitele sunt pretratate cu droguri care inhib\ polimerizarea microfilamentelor [i microfibrilelor scheletului celular. Ovocitele prelevate „in vivo“, imediat dup\ ovula]ie sau ob]inute prin maturare „in vitro“ sunt debarasate de celulele lor periovocitare printr-un tratament enzimatic cu hialuronidaz\ [i apoi incubate `n prezen]a cytochalasinei B (5-7 µg/ml). Dup\ denudare, fiecare ovocit este enucleat, prin imobilizare `n depresiunea unei micropipete, apoi cu cea de-a doua micropipet\ se punc]ioneaz\ zona pelucid\, se aspir\ globulul polar `mpreun\ cu o frac]iune de citoplasm\ adiacent\, con]inând cromozomii metafazici. 3.4.2. Izolarea nucleilor embrionului donator

Embrionul, selec]ionat ca donator de nuclei, este prelevat `n stadiul de morul\, când posed\ 16-64 de celule, func]ie de specie [i vârsta acestuia. ~n acest stadiu evolutiv, punerea `n mi[care a genomului embrionar deja s-a produs. Se folosesc [i embrioni congela]i [i care se g\sesc `n stadiul de morul\. Embrionul donator este debarasat cu mult\ aten]ie de zona pelucid\, folosind o solu]ie de tyrode acid. ~n acest stadiu, celulele au `nceput deja s\ stabileasc\ `ntre ele rela]ii func]ionale (de exemplu gapjonc]ion). Pentru disociere, embrionul este incubat timp de treizeci de minute, `ntr-un mediu lipsit de ioni de calciu, dup\ care blastomerele pot fi separate, f\r\ leziuni, prin intermediul unor micropipete.

146

3.4.3. Reconstituirea embrionilor

Dup\ separarea blastomerelor, `n cel mai scurt timp se introduce fiecare blastomer `n interiorul zonei pelucide a ovocitei „receptoare“, enucleate `n prealabil. Dup\ introducerea blastomerului sub zona pelucid\, fuziunea membranelor celulei donatoare [i ovocitul receptor se realizeaz\ prin electrofuziune. Pentru aceasta, ovocitul se plaseaz\ `ntre doi electrozi [i este supus la unul sau mai multe impulsuri foarte scurte de curent continuu. Stimulii electrici provoac\ pori membranari, destabilizând straturile de fosfolipide juxtapuse, iar membranele fuzionate permit astfel nucleului donator s\ p\trund\ `n noul s\u mediu citoplasmatic. Pe de alt\ parte, stimularea electric\ activeaz\ ovocitul receptor, prin declan[area mecanismelor de reprogramare a nucleului transplantat. Electrofuziunea se realizeaz\ `ntr-un mediu izotonic [i se observ\ `n urm\toarele treizeci de minute de la stimulare [i estimat\, fie prin umflarea nucleului donator `n noul s\u mediu citoplasmatic, fie prin terminarea diviziunii celulare [i apari]ia stadiului de dou\ celule. ~n prezent, unul din factorii limitan]i `n aplicarea acestei biotehnici `l reprezint\ num\rul relativ redus de ovocite „receptoare“. Cre[terea num\rului de ovocite ,,receptoare“ se poate ob]ine prin maturarea „in vitro“ a acestora, pornind de la ovarele recuperate `n abator de la femelele sacrificate. Tot `n plan practic, este de mare interes posibilitatea congel\rii acestor ovocite, astfel `ncât s\ se dispun\ `n orice moment de necesarul de ovocite receptoare. Un alt factor limitant este reprezentat de num\rul relativ redus de celule ale embrionilor de la care urmeaz\ s\ se transfere nucleii. Cu toate dificult\]ile pe care le ridic\, clonajul embrionilor creeaz\ o nou\ cale `n optimizarea reproducerii animalelor. 3.5. Transgeneza Ameliorarea efectivelor de animale s-a bazat, tradi]ional, pe progresele `nregistrate `n selec]ia genetic\, dirijarea reproduc]iei, echilibrul ra]iilor de hran\, etc. Tehnicile geneticii moleculare ofer\, `n prezent, noi posibilit\]i care `ncep a fi exploatate eficient. Astfel, sondele moleculare vor permite cunoa[terea patrimoniului genetic al animalelor iar multiplele combina]ii rezultate din muta]ie [i asocierea secven]elor de ADN ofer\ multe posibilit\]i de reprogramare a unei celule sau a unui organism `ntreg. Astfel, dac\ o gen\ izolat\ este introdus\ `ntr-o celul\, aceasta va sintetiza o nou\ protein\ [i caracteristicile acestei celule vor putea fi astfel modificate. De asemenea, dac\ o gen\ izolat\ este introdus\ `ntr-un organism `ntreg, `nsu[irile genetice ale acestuia vor fi modificate. Aceast\ opera]ie poart\ numele de transgenez\. Gena str\in\, introdus\ `n noul organism, va fi transmis\ la descenden]i ob]inându-se `n acest fel o linie de animale care au `nsu[iri biologice noi. Primele observa]ii `n acest domeniu s-au f\cut `n 1981 pe [oareci. Este posibil\, prin transgenez\, ob]inerea de noi animale, perspectivele deschise de aceast\ nou\ biotehnic\ fiind considerabile.

147

Ob]inerea de animale transgenice include mai multe etape: - izolarea sau construc]ia genei de transferat; - colectarea embrionilor; - introducerea genei `n embrioni; - transferul embrionului la o femel\ receptoare; - identificarea transgenei la nou-n\scu]i; - m\surarea expresiei transgenei; - stabilirea de linii homozigote, pornind de la animale transgenice fondatoare. Izolarea sau construc]ia genelor se face prin tehnici genetice adecvate care permit atât izolarea cât [i mutarea dup\ voin]\ a oric\rei gene. O gen\ func]ional\ material sau reconstruit\ con]ine totdeauna acelea[i elemente: regiunea regulatore, regiunea codant\ [i terminatorul. Astfel, regiunile care particip\ la reglarea transcrip]iei genei se situeaz\ `n amonte de zona codant\. Colec]ia de embrioni. Transgeneza fiind o opera]ie cu randament sc\zut, sunt necesari mai mul]i embrioni pentru a economisi la maximum femele donatoare. Embrionii pot fi ob]inu]i `n mai multe moduri: - prelevând ovare de la femelele sacrificate la abator; - prin maturarea ovocitelor „in vitro“; - prin practicarea fecunda]iei „in vitro“. Introducerea genei `n embrion se poate realiza prin microinjec]ie, prin folosirea de vectori retrovirali sau prin folosirea celulelor ES (Embryo stem cels). Microinjec]ia const\ `n injectarea direct\ a solu]iei de ADN `n pronucleul mascul, care este mai mare, mai apropiat de periferia zigotului `n momentul injec]iei. Un obstacol important la injectare este dat de opacitatea ou\lor, ceea ce face dificil\ vizualizarea celor doi pronuclei. Virusurile, `nainte de a folosi mecanismul celular pentru replicarea lor, sunt ,,a priori“ excelen]i vectori pentru a introduce gene str\ine `ntr-o celul\. Retrovirusurile se `ncorporeaz\ `n genomul gazd\, `n general, `ntr-o singur\ copie [i f\r\ rearanjare, deci sunt extrem de utile pentru introducerea genei str\ine `n celulele somatice `n cultur\ [i apoi se reintroduc aceste celule `n individ. Utilizarea celulelor ES, const\ `n izolarea celulelor unui embrion precoce [i cultivarea lor `n condi]ii `n care celulele nu se diferen]iaz\. Când aceste celule ES sunt reintroduse `ntr-un embrion precoce particip\ la dezvoltarea embrionului, dând na[tere la animale himere. O gen\ str\in\ poate fi introdus\, prin procedee clasice de transfer, `n celule ES, `n cultur\. Aceste celule reintroduse `n embrion constituie vectorul transgenei. Animalele himere transgenice care rezult\ sunt mozaicate. Descenden]ii lor mo[tenesc sau nu transgena numai dac\ celulele germinale parentale con]in sau nu transgena. Transgenele introduse, prin una din aceste metode, se inser\ `n genomul gazd\ `n pozi]ii imprevizibile. Introducerea transgenelor se mai poate realiza [i prin alte mijloace. Unul dintre aceste mijloace const\ `n a pune `n contact ADN-ul [i spermatozoizii [i a proceda apoi la o fecunda]ie „in vitro“sau „in

148

vivo“. O alt\ cale prin care gena str\in\ poate fi transferat\ `n celule `n cultur\, cu o eficacitate `nalt\, este electropora]ia. Tehnica aceasta const\ `n a supune celulele incubate `n prezen]a ADN, la câmpuri electrice care destabilizeaz\ membrana [i creeaz\ pori prin care ADN-ul p\trunde `n celule. Aceast\ tehnic\ se folose[te [i pentru spermatozoizii [i embrionii de mamifere. Detectarea transgenelor se face prin metode clasice ale geneticii moleculare. Ele constau `n a hibrida un fragment de ADN complementar genei, radioactivat, cu ADN-ul celular total. Detec]ia produ[ilor transgenici const\ `n a evalua expresia transgenelor prin m\surarea cantit\]ii de ARN corespondent. Proteinele derivate din transgene pot fi m\surate `n sânge, dac\ sunt secretate, cu ajutorul testului RIA (radioimunoanaliz\). Aceste metode permit s\ se determine `n care organ, tip celular [i moment al dezvolt\rii, transgena se exprim\. Tansgeneza a fost `ncercat\ pe multe specii de animale, cu anumite succese. Randamentul biotehnicii, evaluat `n num\r de celule transgenice ob]inute, raportat la num\rul embrionilor microinjecta]i, variaz\ mult cu colectivele de cercet\tori. O evaluare sumar\ a acestui randament arat\ c\ este nevoie de circa 10 [oareci adul]i pentru a spera ob]inerea unuia transgenic, 40 de oi pentru un miel transgenic [i 40 de vaci pentru un vi]el transgenic. Aceste rezultate arat\ c\ pre]ul de cost al unui produs transgenic este foarte ridicat. Prin transgenez\ s-a `ncercat ob]inerea de animale cu un ritm de cre[tere accelerat, cu o produc]ie de lapte mai mare [i cu un con]inut `n protein\ mai ridicat, cu o produc]ie de carne mai bun\, cantitativ [i calitativ, rezistente la diverse maladii etc. Cu toate rezultatele `ncurajatoare ob]inute la diverse specii, aceast\ biotehnic\ se g\se[te doar la perioada de `nceput, necesitând multe ajust\ri, astfel `ncât randamentul ob]inut s\ mic[oreze pre]ul de cost al produsului transgenic [i care s\ fie conform cu normele sanitare [i sanitar-veterinare interna]ionale etc.

149

ÎNTREB|RI RECAPITULATIVE

1. 2. 3. 4.

Ce se înţelege prin fecundaţie “in vitro”? Care sunt etapele fecunda]iei “in vitro”? Care sunt importanţa şi tehnica bisecţiei embrionilor? Care sunt metodele prin intermediul cărora se pot sexa embrionii? 5. Care sunt importanţa şi etapele transferului de nuclei? 6. Care este rolul transgenezei?

150

BIBLIOGRAFIE SELECTIV|

1. Aughtry, S.D., 1987 - Embryo Transfer, 2, 3, p 3-4 2. Baril, G. [i colab., 1993 - Manuel de formation pour l'insémination artificielle ches les ovins et les caprins. Etude FAO, Roma. 3. Baril, G. [i colab, 1993 - Manuel de formation practique pour la transplantation embryonnaire chez la brebis et la chevre. Etude FAO, Roma. 4. Bogdan, Al. [i colab., 1981 - Reproduc]ia animalelor de ferm\. Edit.Scrisul românesc, Craiova 5. Bogdan, Al. [i colab.,1984,1985 - Fertilitatea, natalitatea [i prolificitatea `n zootehnie, vol I [i II, Edit Dacia, Cluj-Napoca 6. Boitor, I., 1979 - Endocrinologia reproduc]iei la animalele de ferm\. Edit. Ceres, Bucure[ti 7. Bunaciu, P., 1977 - ~ns\mân]area artificial\ a g\inilor de reproduc]ie `ntre]inute `n baterii. Rev. de cre[tere a animalelor, nr. 10 8. Cârlan, M., 1982 - Sincronizarea c\ldurilor [i ovula]iei la taurine. Redac]ia de propagand\ tehnic\ agricol\, Bucure[ti 9. Confederat Margareta, 1998 - Cercet\ri cu privire la influen]a alimenta]iei asupra supravie]uirii embrionilor la caprine `n condi]iile efectu\rii transferului de embrioni. Tez\ de doctorat, Univ. Agron. [i de Med. Vet., Ia[i 10. Drugociu, G. [i colab., 1977 - Patologia reproduc]iei [i clinic\ obstetrical\. Edit. Did. [i Ped., Bucure[ti 11. Dumitrescu, I. [i colab., 1976 - Reproduc]ia la bovine. Edit Ceres, Bucure[ti 12. Dumitrescu, I. [i colab., 1978 - ~ns\mân]\rile artificiale la animale. Edit. Ceres, Bucure[ti 13. Dumitrescu, I., 1987 - Reproduc]ia la cabaline. Edit. Ceres, Bucure[ti 14. Elsden Peter, R., 1987 - Manual for embryo transfer, 6599 Country Rd. 29C, Bellvue, , USA 15. Feredean, T., 1974 - Reproduc]ia la porcine. Edit. Ceres, Bucure[ti 16. Feredean, T., Drume, Ch., 1977 - Transferul de embrioni la animale. Edit. Ceres, Bucure[ti 17. Gluhovschi, N. [i colab., 1972 - Biologia [i patologia reproduc]iei. Edit. Did. [i Ped.,Bucure[ti 18. Groza, {t. I., 1996 - Actualit\]i [i perspective `n biotehnologia transferului de embrioni la specia ovin\. Edit. Ceres, Bucure[ti 19. Halga, P. [i colab., 1999 – Alimenta]ia [i reproduc]ia la erbivore domestice. Edit. Dosoftei, Ia[i 20. Hansel, W. [i colab.,1983 - Fiziologia ciclului estral. Rev. Soc. de Med. Vet., Bucure[ti 21. Haubebine, L. M., 1991 - Rec. Med. Vet., 167(314), 323-333 22. Heyman, Y., Chesne, Renard, J.P.,1991 - Rec. Med. Vet., 167(314), 315-322

151

23. Liciu, Gh., Ro[ca, O., 1988 - Ghid tehnic privind `ns\mân]area la ovine [i caprine. Edit. Ceres, Bucure[ti 24. Liciu, GH.,Ro[ca, O., 1998 – Tehnica `ns\mân]\rii artificiale la bovine – Ghid practic. Edit. Ceres, Bucure[ti. 25. Liciu, GH., Ro[ca, O., 1999 - Tehnica `ns\mân]\rii artificiale la suine - Ghid practic. Edit. Ceres, Bucure[ti. 26. Mantea, {t., 1998 - Contribu]ii la biotehnologia transferului de embrioni la suine. Tez\ de doctorat, Fac. de Med. Vet., Bucure[ti 27. Mapletoft, R. J., 1987 - Embryo Transfer, 2, 3, p. 4-6 28. Marquant, Le Guienne, 1991 Rec. de Med. Vet., Ian. 167, nr. 314, p. 303-312 29. Nibart, M., 1991 - Rec. de Med. Vet., 167(314), 261-290 30. Paraipan, V., 1982 - Hormonoterapia `n reproduc]ia animalelor. Edit. Ceres, Bucure[ti 31. Paraschivescu, M., 1969 - Reproduc]ia la ovine. Edit. Agro-Silvic\, Bucure[ti 32. Peyraud, J. C., 1986 - La transplantion embryonnaire s'implante, Elevage 2000, nr. 1, p. 47-49 33. Ro[ca, O ., 1994 - Biotehnica reproduc]iei la porcine prin `ns\mân]are artificial\. Edit. Ceres, Bucure[ti 34. Runceanu, L.,1995 - Reproduc]ia [i patologia reproduc]iei. Lito., Univ. Agron. Ia[i 35. Sauveur, B., Reviers, M., 1988 - Reproduction des volailles et production d'oeufs. INRA, Station de Recharches Avicoles, Paris 36. Seiciu, Fl. [i colab.,1989 - Reproduc]ia normal\ [i patologic\ la animalele domestice, vol. I [i II, Edit. Ceres, Bucure[ti 37. T\nase, D.,1993 - Biologia reproducerii animalelor [i transferul de embrioni . Lito., Univ. Agron. Ia[i 38. T\nase, D.,1995 - Biologia [i patologia reproducerii animalelor. Curs, Lito., Univ. Agron. Ia[i 39. Vallet, J. Ch. [i colab., 1991 - Rec. Med. Vet., 167(314), 293-301 40. Woolliams, G. A., 1989 - Animal Production, t 48, partea I, p.31-36, Anglia

152