Biotehnologii de Reproductie

UNIVERSITATEA DE ŞTIINŢE AGRICOLE ŞI MEDICINĂ VETERINARĂ “ION IONESCU DE LA BRAD” IAŞI

FACULTATEA DE ZOOTEHNIE

TĂNASE DUMITRU

NACU GHERASIM

BIOTEHNOLOGII DE REPRODUCŢIE ANUL III, SEMESTRUL I

MATERIAL DE STUDIU I.D.

IAŞI, 2011

CUPRINS CAP.1 BIOTEHNOLOGIA ÎNSĂMÂNŢĂRILOR ARTIFICIALE.........................3 1.1 Importanţa însămânţărilor artificiale ..........................................................................3 1.2 Aspecte organizatorice ale însămânţărilor artificiale în ţara noastră..........................5 1.3 Principiişi metode de recoltare a spermei...................................................................7 1.3.1 Bazele fiziologice ale recoltării spermei ....................................................7 1.3.1.1 Comportamentul sexual al masculilor ........................................7 1.3.1.2 Specificul reflexelor sexuale la principalele specii de animale .................................................................................10 1.3.1.2.1 Reflexele sexuale la taur.............................................10 1.3.1.2.2 Reflexele sexuale la berbec ........................................12 1.3.1.2.3 Reflexele sexuale la vier.............................................12 1.3.1.2.4 Reflexele sexuale la armăsar ......................................13 1.3.2 Principiişi metode generale de recoltare a spermei ....................................13 1.3.2.1 Recoltarea spermei la taur ..........................................................15 1.3.2.2 Recoltarea spermei la berbecşi ţap .............................................19 1.3.2.3 Recoltarea spermei la vier ..........................................................20 1.3.2.4 Recoltarea spermei la armăsar....................................................22 1.3.2.5. Recoltarea spermei la păsări ......................................................23 1.4 Examenul însuşirilor spermei .....................................................................................24 1.5 Diluarea spermei.........................................................................................................24 1.5.1 Consideraţii generale ..................................................................................24 1.5.2 Principiile diluării, însuşirile generale ale diluanţilor şi clasificarea acestora ............................................................................25 1.5.3 Tehnica preparării diluanţilor .....................................................................26 1.5.4 Tehnica diluţiei...........................................................................................27 1.5.4.1 Diluarea spermei de taur.............................................................27 1.5.4.2 Diluarea spermei de berbec ........................................................29 1.5.4.3 Diluarea spermei de vier.............................................................31 1.5.4.4 Diluarea spermei de armăsar ......................................................33 1.5.4.5 Diluarea spermei de păsări .........................................................33 1.6.Conservarea spermei ..................................................................................................34 1.6.1 Conservarea spermei de taur ......................................................................38 1.6.2 Conservarea spermei de berbecşi ţap..........................................................44 1.6.3 Conservarea spermei de vier .....................................................................46 1.6.4 Conservarea spermei de armăsar ................................................................48 1.6.5 Conservarea spermei de păsări ...................................................................49 1.7 Inocularea spermei......................................................................................................50 1.7.1 Inocularea spermei la vacă .........................................................................50 1.7.1.1 Punctul de însămânţări artificiale la vaci (P.I.A.V.)...................50 1.7.1.2 Descoperirea femelelor în căldurişi stabilirea momentului optim al însămânţării.............................................51 1.7.1.3 Pregătirea femelelor pentru însămânţare ....................................52 1.7.1.4 Reanimarea spermatozoizilor .....................................................53 1.7.1.5 Tehnica inoculării spermei .........................................................64 1.8.2 Inocularea spermei la oaieşi capră..............................................................56 1.8.2.1 Organizarea punctului de însămânţări artificiale la ovine (P.I.A.O.) .....................................................................56 1.8.2.2 Depistarea oilorşi caprelor în călduri .........................................57 1.8.2.3 Inocularea materialului seminal .................................................59 1.7.3 Inocularea spermei la scroafă .....................................................................60 1.8.3.1 Organizareaşi dotarea punctului de însămânţare artificială (P.I.A.S.) cu activitate complexă ..............................60 1.7.3.2 Descoperirea scroafelor în călduri..............................................61 1

1.7.3.3 Stabilirea momentului optim de însămânţare .............................61 1.7.3.4 Aparaturaşi instrumentarul folosit pentru însămânţarea artificială a scroafelor ..........................................62 1.7.3.5 Inocularea spermei......................................................................63 1.7.4 Inocularea spermei la iapă ..........................................................................64 1.7.5 Inocularea spermei la păsări .......................................................................65 CAP. 2 BIOTEHNOLOGIA TRANSFERULUI DE EMBRIONI LA ANIMALE ..67 2.1 Istoriculşi importanţa transferului de embrioni ..........................................................67 2.2 Biotehnologia transferului de embrioni la vacă..........................................................68 2.2.1 Selecţiaşi pregătirea vacilor donatoare .......................................................69 2.2.2 Selecţiaşi pregătirea vacilor primitoare (receptoare) ..................................70 2.2.3 Sincronizarea estruluişi ovulaţiei la vacile donatoare şi primitoare............................................................................................70 2.3.4 Inducerea poliovulaţieişi însămânţarea artificială a vacilor donatoare..................................................................................71 2.3.5 Fecundarea ovocitelor.................................................................................74 2.2.6 Recoltarea embrionilor ...............................................................................74 2.2.7 Căutareaşi aprecierea calităţii embrionilor .................................................76 2.2.8 Conservareaşi deconservarea .....................................................................78 2.2.9 Transferul embrionilor ...............................................................................81 2.3 Biotehnologia transferului de embrioni la rumegătoarele mici ..................................82 2.3.1 Alegerea donatoarelorşi receptoarelor ........................................................83 2.3.2 Sincronizarea estruluişi ovulaţiei la femelele donatoare şi receptoare............................................................................................84 2.3.2.1 Tratamente progestative de sincronizare ....................................85 2.3.2.2 Tratamente de stimulare ovariană...............................................85 2.3.2.3 Inducerea estruluişi ovulaţiei la receptoare ................................86 2.3.3 Însămânţarea femelelor donatoare ..............................................................87 2.3.4 Recoltarea embrionilor ...............................................................................88 2.3.5 Examenulşi aprecierea embrionilor ............................................................89 2.3.6 Congelarea-decongelarea embrionilor........................................................90 2.3.7 Transferul embrionilor la femelele receptoare............................................91 2.3.7.1 Transferul chirurgical .................................................................91 2.3.7.2 Transferul embrionilor sub control endoscopic ....................................................92 CAP. 3 BIOTEHNICI DERIVATE SAU FINALIZATE PRIN TRANSFERUL DE EMBRIONI..................................................................................................94 3.1 Fecundaţia ,,in vitro“ ..................................................................................................94 3.1.1 Obţinerea ovocitelor ...................................................................................95 3.1.2 Maturarea ,,in vitro“ a ovocitelor ...............................................................95 3.1.3 Capacitarea spermatozoizilor......................................................................96 3.1.4 Fecundaţiaşi cultura ,,in vitro“ a embrionilor .............................................97 3.1.5 Transferul embrionilor obţinuţi ,,in vitro“ ..................................................98 3.1.6 Importanţa, perspectiveleşi aplicaţiile fecundaţiei ,,in vitro“ .....................99 3.2 Bisecţia embrionilor................................................................................................ 100 3.3 Sexarea embrionilor................................................................................................ 102 3.4 Transplantarea nucleilorşi obţinerea de clone ........................................................ 103 3.4.1 Pregătirea ovocitelor receptoare ............................................................. 103 3.4.2 Izolarea nucleilor embrionului donator .................................................. 104 3.4.3 Reconstituirea embrionilor ..................................................................... 104 3.5 Transgeneza ............................................................................................................ 105 BIBLIOGRAFIE………………………………………………………………………107

2

CAPITOLUL 1 BIOTEHNOLOGIA ÎNSĂMÂNŢĂRILOR ARTIFICIALE 1.1.

Importanţa însămânţărilor artificiale

Astăzi, există numeroase ţări care însămânţează artificial întregul efectiv de vaci realizănd astfel un progres rapid şi substanţial în ameliorarea raselor. însămânţările artificiale s-au extins în practică datorită avantajelor zooeconomice şi sanitar-veterinare. Din punct de vedere zoo-economic, însămânţările artificiale sunt importante pentru că folosesc intens reproducătorii de valoare, cu potenţă individuală mare, ceea ce conduce la grăbirea ritmului şi gradului de ameliorare a efectivelor de animale. La însămânţările artificiale se folosesc masculi testaţi după descendenţi, astfel încât, pe lângă calitatea superioară a spermei, există şi testarea reală a valorii de ameliorare. Prin congelarea materialului seminal, reproducătorul valoros poate fi folosit la reproducere mai mulţi ani, chiar după moartea acestuia prin constituirea depozitului cu sperma provenită de la acesta. Datorită congelării materialului seminal s-a creat posibilitatea schimbului internaţional de material seminal valoros din puct de vedere genetic, chiar la distanţe intercontinentale, fără trasportul şi aclimatizarea reproducătorului. Prin folosirea însămânţărilor artificiale, testarea după descendenţi a reproducătorilor se poate realiza mult mai repede, iar prin examenul complex, zootehnic şi sanitar-veterinar, se pot descoperi reproducătorii cu diferite anomalii congenitale ale aparatului genital sau cu tulburări ereditare ale spermatogenezei. Se realizează, astfel, o profilaxie genetică a sterilităţii. Datorită evidenţelor stricte care se ţin pentru toate operaţiile ce se efectuează, se poate cunoaşte într-o mai mare măsură paternitatea descendenţilor. Evidenţele sunt completate cu determinarea grupei sanguine a părinţilor şi descendenţilor. Reproducătorii masculi fiind grupaţi separat de femele, se pot lua măsuri specifice de alimentaţie raţională şi îngrijire corespunzătoare şi se poate institui un regim de recoltare a spermei favorabil obţinerii de produşi la un preţ de cost mai scăzut şi oferă posibilitatea creării unor nuclee de animale valoroase. La reproducătorii de elită, concentraţi în unităţi specializate, se practică şi determinarea genofondului, a structurii imunogenetice, ceea ce dă posibilitatea cunoaşterii prezenţei sau absenţei echilibrului genetic în cadrul unei populaţii date. În condiţiile unor centre mari de însămânţări artificiale unde sunt concentraţi mulţi reproducători, este posibilă stabilirea valorii de ameliorare în selecţia concomitentă pentru mai multe caractere productive. Acest lucru se realizează pentru că se obţine un număr mare de produşi contemporani, masculi şi femele, care pot fi repartizaţi în mai multe unităţi. De asemenea, numărul mare de reproducători de diferite vârste, concentraţi în unităţi specializate, permite alegerea unui moment optim pentru determinarea performanţelor, respectiv a vârstei la care s-ar putea determina, cu cea mai mare precizie, valoarea de ameliorare. Lucrările efectuate pe ovine,

3

pentru determinarea valorii de ameliorare în direcţia producţiei de lână, au demonstrat că selecţia trebuie să se facă pe baza celei de-a doua tunsori. Sub raport economic, reproducătorii foarte valoroşi din punct de vedere zootehnic, sunt folosiţi cu mare eficienţă economică. într-un sezon sexual, numărul femelelor însămânţate artificial cu sperma de la un taur, comparativ cu monta, este , în medie, de 50-80 de ori mai mare, de 25 de ori mai mare la oi şi de 3-4 ori mai mare la cabaline şi suine. Astfel, în cazul practicării montei, unui taur i se repartizează anual 50-70 de femele. Dacă se practică însămânţările artificiale, cu sperma conservată prin refrigerare se pot însămânţa anual 1000-3000 de vaci. în cazul în care se conservă sperma prin congelare, numărul vacilor însămânţate cu sperma provenită de la un taur poate ajunge la 10000-30000. în cazul unor tauri deosebit de valoroşi s-au putut obţine până la 50000 de viţei pe întreaga perioadă de exploatare a taurului (6-7 ani). Literatura de specialitate citează cazuri în care de la un taur, într-un an s-au obţinut peste 120000 de doze de însămânţare, iar în toată perioada de exploatare a acelui taur de peste o jumătate de milion de viţei. La taurine, pot fi însămânţate dintr-un singur ejaculat până la 1000 de vaci. La porcine, ovine şi cabaline, dintr-un singur ejaculat se pot însămânţa numai 5-50 de femele. Acest număr mic de femele însămânţate artificial este important din punct de vedere economic şi genetic şi a redus răspândirea însămânţărilor artificiale la aceste specii. Economicitatea procedeului de congelare a spermei este exemplificată cel mai bine de posibilitatea reducerii numărului de spermatozoizi în doza de însămânţare fără a scădea rata de concepţie Dacă aplicarea tehnicilor de însămânţare artificială cu material congelat a progresat la taurine, nu acelaşi lucru se poate spune şi despre celelalte specii. Ratele de concepţie şi numărul de produşi la o fătare realizate cu material seminal congelat sunt mai scăzute la porcine. La ovine şi cabaline, ratele de concepţie sunt satisfăcătoare. Aceste rezultate demonstrează diferenţe distincte de specie, în cerinţele pentru supravieţuirea optimă a spermatozoizilor în perioada congelării şi decongelării. La vier, esenţial este modificarea compoziţiei diluantului după decongelarea spermatozoizilor pentru a maximaliza rata de fecundare. Organizarea reţelei de însămânţări artificiale pe baza unor centre puternice, cu un număr mare de reproducători, creează, prin concentrarea şi specializarea producţiei, o eficienţă economică sporită în raport cu întreţinerea şi exploatarea reproducătorilor masculi în fiecare fermă zootehnică. Din punct de vedere sanitar-veterinar, prin practicarea însămânţărilor artificiale a efectivelor de femele, se pot preveni şi combate unele boli transmisibile prin actul montei (iniţial a constituit principala cauză a răspândirii însămânţărilor artificiale). Totodată, se previn şi combat boli cu etiologie parazitară (trichomonoza la taurine, durina la cabaline) şi cu etiologie infecţioasă (bruceloza, campylobacterioza la taurine, ovine, porcine). Prin practicarea acestei valoroase biotehnologii de reproducere devine posibilă continuarea reproducerii în unităţile carantinizate. De asemenea, se pot preveni şi combate unele forme de infecunditate la femele, cum ar fi spasmul vaginal şi altele. Metoda actuală de inoculare a spermei permite efectuarea de observaţii asupra organelor genitale femele, ceea ce influenţează favorabil rezultatul însămânţărilor. Concentrarea de reproducători în unităţi specializate permite luarea unor măsuri riguroase şi ştiinţifice de alimentaţie, adăpostire şi îngrijire a animalelor precum şi de prevenire a bolilor, care şi ele pot influenţa negativ sau chiar compromite reproducerea animalelor pe o arie întinsă, egală cu cea deservită de centrul respectiv de însămânţări artificiale. 4

Materialul seminal recoltat trebuie să corespundă tuturor criteriilor zooigienice şi a standardelor internaţionale referitoare la încărcarea cu floră microbiană, standarde respectate astăzi de toate ţările avansate. însămânţările artificiale prezintă şi numeroase avantaje ştiinţifice. Astfel, aplicarea lor a permis dezvoltarea cercetărilor ştiinţifice asupra biochimiei, histochimiei şi imunologiei reproducţiei în general şi a spermei în special. Gameţii sunt studiaţi la nivel molecular şi de microscopie electronică. Aceste cercetări au constituit baza pentru progresul rapid în domeniul metodelor de laborator pentru testarea capacităţii fecundante a spermei, a congelării materialului seminal şi a aplicării practice a însămânţărilor artificiale. Folosindu-se însămânţările artificiale, a devenit posibilă efectuarea unor hibridări între reproducători din specii care nu se împerechează între ele în condiţii naturale, ca de exemplu între oaie şi capră, iak şi zebu, iapă şi măgar, păsări domestice şi sălbatice etc . Toate aceste avantaje recomandă însămânţările artificiale ca una din cele mai moderne şi avantajoase metode de reproducere a animalelor domestice. Ea permite însemnate realizări în zootehnie şi progresul rapid al acestui important sector al economiei naţionale. 1.2. Aspecte organizatorice ale îsămânţărilor artificiale în ţara noastră La nivel naţional, procesul de ameliorare a populaţiilor de animale din diferite specii, organizarea şi conducerea activităţii pe linia însămânţărilor artificiale este coordonată de Ministerul Agriculturii şi Alimentaţiei care stabileşte metodologia şi măsurile de lucru privind aplicarea însămânţărilor artificiale. Primele Staţiuni de însămânţări artificiale (S.I.A.V.) la vaci au fost înfiinţate în anul 1953. Cele 42 de S.I.A.V. au fost dotate cu reproducători valoroşi, folosiţi la însămânţarea artificială a vacilor cu spermă brută. În perioada anilor 1956-1957 au început să fiinţeze primele Centre de însămânţări artificiale, dotate cu reproducători (tauri, berbeci) a căror material seminal -diluat şi conservat prin refrigerare- era difuzat în teritoriu la punctele de însămânţări atificiale (P.I.A.V.). în unităţile de stat, erau concentraţi reproducători valoroşi folosiţi la însămânţarea artificială a femelelor de la fiecare unitate zootehnică, în aşa-numitele ferme de ameliorare şi reproducţie (F.A.R.). În anul 1965 a luat fiinţă Centrul Naţional de Reproducţie şi Selecţie la Animale care a contribuit la introducerea metodelor unitare şi practice pe întregul teritoriu al ţării, excepţie făcând localităţile din zonele greu accesibile. începând cu anul 1969 s-a introdus şi în ţara noastră conservarea spermei de taur prin congelare, la început într-un număr restrâns de centre de însămânţări artificiale, apoi metoda s-a extins o dată cu înfiinţarea, în anul 1976, a Intreprinderii pentru Testarea Reproducătorilor şi Producerea Materialului Seminal Congelat (SEMTEST). Până în anul 1990, în conformitate cu prevederile programului de ameliorare a taurinelor, activităţile menţionate cădeau în sarcina acestei intreprinderi, care aparţinea de Institutul de Cercetare şi Producţie pentru Creşterea Bovinelor Baloteşti, având rolul de a coordona activitatea celor 6 complexe teritoriale. Principalele atribuţii care reveneau acestei intreprinderi, erau: - organizarea creşterii şi testării reproducătorilor după performanţele proprii şi descendenţi; - livrarea produşilor testaţi, disponibili; 5

-

producerea şi livrarea de material seminal congelat pentru însămânţări artificiale la animale; - asigurarea şi întreţinerea echipamentului criogenic, aprovizionarea cu azot lichid a beneficiarilor de material seminal congelat; - producerea de echipament şi aparatură pentru însămânţările artificiale şi selecţia animalelor, a diluanţilor pentru material seminal pe specii şi ai unor biostimulatori ai funcţiei de reproducţie la animale. După anul 1990, reţeaua „SEMTEST“ a fost reorganizată, cele 6 complexe teritoriale (Bucureşti, Iaşi, Craiova, Timişoara, Târgu-Mureş şi Baia Mare), fiind transformate în Societăţi Comerciale cu capital de stat, atribuţiile lor rămânând aceleaşi. Teritoriul de activitate al celor şase societăţi tip „SEMTEST“ este dictat de zonarea celor trei rase principale de taurine care se cresc în ţara noastră: Bălţată românească, Brună de Maramureş, Bălţată cu negru româneasc. în prezent, denumirea Centrului Republican de Reproducţie şi Selecţie a Animalelor este Agenţia Naţională pentru Ameliorare şi Reproducţie în Zootehnie „Prof. dr. G.K.Constantinescu“ subordonată Ministerului Agriculturii şi Alimentaţiei. Majoritatea vacilor se însămânţează cu spermă congelată în paiete mijlocii şi mici, metodă care, datorită avantajelor pe care le prezintă, a înlocuit conservarea în granule şi fiole. De la taurii în exploatare din unităţile comerciale „SEMTEST“ se recoltează, controlează, prelucrează, conservă şi livrează sperma către Unităţile de Ameliorare şi Reproducţie în Zootehnie (fostele Oficii Judeţene de Reproducţie şi Selecţie la Animale) şi altor unităţi. Activităţile legate de însămânţarea artificială la animale revine Unităţilor de Ameliorare şi Reproducţie în Zootehnie(U.A.R.Z.) (fostele O.J.R.S.A.) subordonate direct Direcţiilor Agricole. Unităţile de Ameliorare şi Reproducţie în Zootehnie au, pe lângă activitatea de difuzare a materialului seminal congelat sau refrigerat şi obligaţia de dirijare a întregului proces de reproducţie pe raza lor de difuzare. Fiecare U.A.R.Z. are în subordonare 1-4 Centre Teritoriale de Ameliorare si Reproducţie în zootehnie care deservesc crescătorii în ceea ce priveşte asistenţa tehnică de specialitate în domeniul reproducţiei şi selecţiei animalelor. Pentru aceasta, fiecare U.A.R.Z. colaborează cu unităţile „SEMTEST“ din zona respectivă şi cu Asociaţia crescătorilor de animale (taurine, ovine, suine) din judeţ. Îndeplinirea propriu-zisă a acestor atribuţii se face de către Centrele de selecţie şi reproducţie la animale, iar subunitatea verigă de bază a reţelei naţionale de selecţie şi reproducţie este Punctul de însămânţări artificiale (P.I.A.V.), ca formaţiune tehnico-organizatorică la nivelul fiecărei unităţi zootehnice (de stat sau particulare), a fiecărei comune, având sarcina să efectueze operaţiunile de însămânţare artificială a femelelor aparţinând diverselor specii (taurine, ovine, suine), a supravegherii respectării instrucţiunilor referitoare la activitatea de ameliorare a animalelor etc. Punctul de însămânţare artificială este subunitatea de bază a întregii reţele de reproducţie şi selecţie a animalelor, prin a cărei activitate se materializează şi finalizează întregul proces de reproducţie şi ameliorare a efectivelor din toate sectoarele zotehnice. Fiecare punct de însămânţare artificială este dotat cu un minim de aparatură şi instrumentar necesare desfăşurării în condiţii normale a activităţii specifice, iar persoanele încadrate la aceste puncte trebuie să participe nemijlocit la coordonarea procesului de reproducţie a efectivelor din ferma sau localitatea respectivă, să ţină corect evidenţa evenimentelor de reproducţie şi să cunoască perfect efectivul matcă, produşii şi destinaţia acestora, contribuind la aplicarea măsurilor de prevenire şi combatere a stărilor de infecunditate. Pentru îndeplinirea acestor atribuţii, punctul de însămânţări artificiale trebuie să îndeplinească următoarele condiţii:

6

-

să fie amplasat în incinta fermelor atunci când asigură în exclusivitate însămânţarea artificială a femelelor din unitatea respectivă sau la periferia localităţilor, către locul de păşunat al animalelor din gospodăriile individuale; - să permită accesul uşor al mijloacelor de transport; - să dispună de apă curentă şi să fie conectat la reţeaua electrică; - să dispună în interior de spaţiul necesar păstrării şi conservării materialului seminal, a operaţiilor pregătitoare însămânţării artificiale a femelelor, a documentelor necesare evidenţelor minime, a efectuării însămânţării artificiale propriu-zise. De regulă, în unităţile zootehnice, spaţiul necesar punctului de însămânţare artificială se amenajează la capătul unui grajd. În condiţiile de stabulaţie a animalelor în sistem de întreţinere legat, însămânţarea femelelor se face, de regulă, pe linia grajdului, cu respectarea regulilor de igienă corespunzătoare. în acest caz, punctul de însămânţare artificială este dotat cu un cărucior special în care este amplasat containerul cu dozele de însămânţare, vasul cu apă caldă necesară pentru decongelarea paietelor cu material seminal, mănuşile de protecţie necesare şi pipetele de însămânţare, menţinute în condiţii aseptice. în situaţia întreţinerii femelelor la păşune sau în sistem dezlegat, este necesar un stand de contenţie. 1.3. Principii şi metode de recoltare a spermei Recoltarea este operaţia prin care se obţine sperma de la reproducători prin intermediul unei aparaturi speciale sau prin alte procedee. Este o operaţie importantă şi dificilă, succesul ei fiind determinat de cunoaşterea fiziologiei comportamentului sexual al masculilor în vederea adoptării celor mai adecvate metode de obţinere a ejaculatului. 1.3.1. Bazele fiziologice ale recoltării spermei 1.3.1.1. Comportamentul sexual al masculilor Comportamentul sexual al mamiferelor se bazează pe un schimb reciproc de semnale specifice care, în final se materializează în actul sexual propriu-zis. La animalele crescute în libertate, întreţinute în padocuri sau boxe comune pentru ambele sexe, comportamentul sexual se desfăşoară secvenţional: - căutarea reciprocă a celor doi parteneri; - sincronizarea comportamentală; - actul sexual propriu-zis. La toate speciile, activitatea sexuală începe printr-o căutare reciprocă de contact între mascul şi femelă. Schimburile de informaţii senzoriale fac posibilă identificarea receptivităţii sexuale a celor doi parteneri, apoi provoacă răspunsurile comportamentale care induc reacţiile de atitudine necesare împerecherii. Semnalele caracteristice emise de femelă indică stadiul receptivităţii sexuale, femela neacceptând saltul masculului decât în momentul impregnanţei estrogenice maxime. La toate mamiferele, femela se va imobiliza înaintea împerecherii, luând o poziţie care să permită masculului intromiterea penisului. Cunoaşterea particularităţilor fiziologice ale comportamentului sexual este necesară în momentul obişnuirii reproducătorilor folosiţi la însămânţările 7

artificiale, cu recoltarea materialului seminal. Obişnuirea presupune răbdare şi tact, astfel încât, să se suprapună peste reflexele necondiţionate, cele condiţionate pozitive, permiţând o bună recoltare a spermei, fără a stresa masculul respectiv. După obişnuirea masculului cu recoltarea spermei, datorită reflexelor condiţionate pozitive, ejaculatul poate fi recoltat uşor, pe o femelă în oricare stadiu al ciclului sexual, pe un mascul sau pe un manechin adaptat ca formă, mărime şi aspect speciei respective. În desfăşurarea reflexelor sexuale necesare recoltării spermei, un rol deosebit revine corpusculilor senzitivi şi terminaţiilor nervoase existente la nivelul penisului. Totodată, un rol deosebit revine şi organelor de simţ. Factorii mediului extern (lumina, temperatura, mirosul specific al femelelor în călduri, efectuarea montei între alţi parteneri, îmbrăţişarea efectuată de mascul sau femelă etc) provoacă excitaţii, care ajunse la nivelul hipotalamusului, declanşează mecanismul neuro-endocrin care stă la baza formării reflexelor sexuale. Fiziologia actului sexual constă dintr-o succesiune de etape care se manifestă prin următoarele reflexe sexuale: reflexul de apropiere, reflexul de erecţie, reflexul de îmbrăţişare, reflexul de intromisiune şi reflexul de ejaculare. Reflexul de apropiere constă într-o căutare reciprocă de contact între mascul şi femelă. Schimburile de informaţii senzoriale, care au loc cu acest prilej, provoacă răspunsuri comportamentale care induc atitudinile caracteristice desfăşurării actului sexual. Un rol particular în realizarea contactului între mascul şi femelă îl au semnalele olfactive datorate feromonilor care declanşează reacţii specifice, de stimulare sau inhibiţie. Fonaţia, audiţia, contactul corporal între parteneri, jocul, lupta care precede acceptarea masculului, îndeplinesc un rol deosebit în apropierea partenerilor. Toţi aceşti factori induc excitaţia precopulatoare. La mamifere, sursa cea mai puternică de excitaţii o constituie stimularea tactilă astfel încât este posibilă declanşarea excitaţiei precopulatoare chiar prin simple excitaţii mecanice ale zonei genitale. Excitaţia precopulatoare se manifestă prin libidou, care este datorat impregnării structurilor necesare de către hormonii androgeni. Acest tip de excitare se caracterizează printr-un complex de manifestări variate ca: accelerarea pulsului, creşterea tensiunii arteriale, modificări ale circulaţiei periferice cu ridicarea temperaturii tegumentului, aflux sanguin, creşterea tensiunii nervoase etc. Reflexul de erecţie. Erecţia constă în schimbarea formei, volumului şi constituţiei organului copulator. În repaus, penisul este adăpostit în furou, şi la unele specii este flasc. Din această stare, penisul, prin erecţie, este exteriorizat din furou şi devine rigid printr-o modificare specială a ţesutului erectil. Erecţia este consecinţa fenomenelor dilatatoare care se produc la nivelul corpului spongios şi al corpilor cavernoşi ai penisului, urmată de umplerea acestora cu sânge. În urma acumulării intense a sângelui, are loc dilatarea cavernelor, capsula fibroasă se întinde, muşchiul se contractă şi penisul devine rigid, se alungeşte la maxim şi este propulsat din furou. }esutul erectil al corpului spongios şi al corpilor cavernoşi reprezintă un sistem spongios de spaţii vasculare, presărate cu artere şi vene. În stare de repaus, aceste spaţii sunt colabate şi conţin cantităţi mici de sânge; o dată cu erecţia ele devin cavităţi mari, umplute cu sânge. Creşterea afluxului de sânge este determinată pe cale neuro-hormonală şi asigurată de compresiunea căilor venoase de întoarcere prin contracţia muşchilor bulbo- şi ischiocavernoşi. Afluxul de sânge la nivelul ţesutului cavernos se produce treptat. La început se umplu cu sânge cavernele care, datorită vasodilataţiei arteriale, se destind, urmată de erecţia ţesutului spongios din jurul uretrei. }esutul spongios se încarcă cu sânge venos ca urmare a stării provocate de 8

stimularea nervilor splahnici pelvieni, iar stimularea inervaţiei simpatice determină constricţia arterelor penisului şi încetarea erecţiei. Erecţia este un reflex înnăscut provocată pe cale reflexă, centrul fiind situat în măduva sacrală, la nivelul neuromerelor S1-S2. Arcul reflex include nervii dorsali, ruşinos şi hipogastric, centrul medular, nervii simpatici şi parasimpatici. Senzaţiile vizuale, auditive, tactile şi olfactive stimulează sistemul nervos central de la nivelul căruia porneşte impulsul excitator al centrului erecţiei. Erecţia este determinată şi de excitarea mecanică a receptorilor penieni, reflex care stă la baza recoltării spermei prin masturbaţie. Erecţia este însoţită de eliminarea la nivelul meatului a unei secreţii mucoase, clare, filante cu rol lubrifiant produsă de glandele Littré şi de glandele bulbo-uretrale. Această secreţie, împreună cu cele ale glandelor Bartholin, facilitează intromiterea penisului în conductul vestibulo-vaginal. Erecţia este însoţită de contracţia tunicii externe a burselor testiculare, în urma căreia testiculele sunt apropiate de orificiul extern al canalului inghinal. Durata erecţiei depinde de specia şi vârsta reproducătorului. La masculii tineri, erecţia se poate menţine un timp mai îndelungat (chiar o jumătate de oră), însă durata erecţiei scade progresiv cu vârsta. Manifestarea erecţiei este determinată de nivelul hormonilor androgeni din organism, de tipul de sistem nervos al masculului, de vârstă, condiţii de exploatare, întreţinere etc. Erecţia diminuă consecutiv uzurii nervoase, a abuzului sexual, obişnuinţei, oboselii, alimentaţiei şi întreţinerii necorespunzătoare. În caz de îmbătrânire, erecţia se produce intermitent, până ce dispare complet, stare ce se observă la taurii, berbecii şi vierii bătrâni. În diversele boli ca meningita, turbarea, tetanosul, erecţia este mai pronunţată decât la animalul sănătos. Toxina tetanică, având o elecţie specială pentru sistemul nervos, scade centrul de excitabilitate a tuturor centrilor medulari, deci şi a centrului erecţiei. Substanţele afrodiziace (iohinibina, stricnina etc), cele parasimpatice comimetice stimulează erecţia peniană, fie prin provocarea vasodilataţiei locale (iohinibina), fie prin scăderea pragului de excitabilitate a centrului erecţiei (stricnina). Anafrodiziacele (opiumul, bromurile etc) intoxicaţiile cu diverse săruri de mercur, potasiu, arseniu etc, inhibă erecţia. Sunt şi numeroşi centri nervoşi superiori, localizaţi în bulb, hipotalamus şi centri corticali, ca sediu al reflexelor condiţionate care, în urma excitaţiei, determină erecţia. Reflexul de îmbrăţişare. Excitaţiile acumulate în timpul reflexelor de apropiere şi de erecţie determină necesitatea reflexelor de îmbrăţişare şi intromisiune. Este un reflex înnăscut, masculii tineri încercând să efectueze saltul pe orice femelă sau pe alţi masculi. Executarea cu siguranţă a saltului se transmite ereditar şi este unul din semnele bunei fertilităţi a taurului. Îmbrăţişarea poate fi normală, când se produce la scurt timp după erecţie, rapidă, când se produce înaintea erecţiei şi tardivă, când apare mult după erecţie (masculii bătrâni, bolnavi, subalimentaţi). Cunoaşterea tipului de reactivitate a masculului este importantă atunci când are loc pregătirea masculului pentru recoltare, de o corectă pregătire a acestuia depinzând volumul spermei. Reflexul de împerechere (intromisiune, coit). Este un reflex înnăscut şi constă în intromiterea organului copulator în conductul vestibulo-vagino-cervical al femelei în călduri. Intromiterea penisului este facilitată de secreţiile glandelor Littré, bulbo-uretrale (parţial), glandelor Bartholin şi de smegma prepuţială. Introducerea penisului are loc la nivelul vaginului la rumegătoare şi carnivore, până la cervix la cabaline şi până în uter la suine.

9

Reflexul de ejaculare constă în proiectarea, sacadat şi sub presiune, spermei în afara căilor genitale mascule. Ejacularea se produce pe cale reflexă, consecutiv excitaţiilor acumulate în timpul actului coital şi transmise sistemului nervos. În primul rând sunt excitate terminaţiile nervoase din penis, reprezentate în special prin corpusculii VaterPaccini, Meissner şi genitali. Ejacularea este iniţiată de stimulii genitali şi mediată de nervii care transmit impulsuri la creier. De la creier, în sens invers, sunt elaborate impulsuri la nivelul sistemului simpatic lombar (L2-L4-centrul ejaculator) de unde impulsurile eferente trec prin ganglionii simpatici, de-a lungul nervului presacral şi a celui pelvin, la toate organele din cavitatea pelvină. Ele dau fibre motorii pentru muşchii netezi ai tractusului genital (epididim, canale deferente, canal ejaculator, prostată, glande seminale). Prin contracţia fibrelor musculare netede de la nivelul acestor organe, conţinutul este împins în uretra peniană, segmentul prostatic, unde, din amestecul fluidului testicular şi epididimar cu secreţiile glandelor anexe, se formează sperma. Sperma, o dată formată, acţionează reflex şi determină închiderea gâtului vezicii urinare şi contracţia fibrelor musculare netede de la nivelul uretrei pelvine, sporind pesiunea exercitată de spermă şi împingând-o spre baza penisului. În acest moment intervin şi muşchii penisului, bulbo- şi ischiocavernoşi şi contracţia ritmică a uretrei, învingând rezistenţa periferică şi expulzând sperma în jeturi ritmice. La producerea ejaculării este necesară contracţia sincronă a muşchilor epididimului, canalelor deferente, canalului ejaculator, uretrei şi penisului. Aceste contracţii determină ejacularea sacadată la armăsar, vier şi câine şi spontană la rumegătoare. Prin excitaţiile electrice produse la nivelul centrului ejaculator din măduva lombară, se provoacă eliminarea spermei. Acest principiu stă la baza electroejaculării. Modul de eliminare a spermei diferă cu specia: - la taur, berbec şi ţap toţi componenţii spermei se elimină simultan; - la armăsar, la început se elimină secreţia glandelor Littré şi a celor bulbo-uretrale, lipsită de spermatozoizi, apoi sunt expulzaţi spermatozoizii împreună cu secreţia prostatică, la urmă fiind eliminată secreţia glandelor seminale; - la vier, ejacularea este multifazică; prefaza, cu o durată de 1-2 minute, în decursul căreia se elimină secreţiile glandelor uretrale lipsite de spermatozoizi (2-5% din conţinutul ejaculatului); faza principală, cu o durată de 2-3 minute, reprezentată de secreţiile epididimului, veziculelor seminale, prostatei şi glandelor bulbo-uretrale (30-50% din conţinutul ejaculatului); faza postspermatică, cu o durată de 4-5 minute, şi un conţinut de 50-60% din ejaculat, săracă în spermatozoizi, compusă în cea mai mare parte din secreţiile veziculelor seminale şi ale glandelor bulbo-uretrale. 1.3.1.2. Specificul reflexelor sexuale la principalele specii de animale 1.3.1.2.1. Reflexele sexuale la taur Reflexul de apropiere este puţin exteriorizat şi se bazează, în principal, pe excitaţiile vizuale, taurul apropiindu-se de femele, indiferent de stadiul ciclului sexual în care se află acestea. În cazul recoltării spermei cu ajutorul vaginului 10

artificial, taurul se apropie de partenerul de recoltare, contenţionat în stand (femelă, mascul) (foto 1). Reflexul de erecţie este necondiţionat, peste care se suprapun reflexe condiţionate, prin interme-diul cărora acest reflex poate fi dirijat în sens pozitiv. Erecţia se produce chiar din momentul intrării în sala de recoltare sau numai la vederea vaginului artificial şi a operatorului recoltator cu care s-a obişnuit. Din această cauză, vaginul artificial trebuie să fie corect pregătit, în caz contrar se formează reflexe Foto 1 Reflexul de apropiere la taur condiţionate inhibitoare ale acestui reflex. Reflexul de îmbrăţişare (salt, cuprindere) (foto 2) este bine evidenţiat la taurii crescuţi în libertate, împreună cu femelele. În cazul practicării montei, se formează un reflex condiţionat numai pentru vacile în călduri. În cazul recoltării spermei cu ajutorul vaginului artificial se crează un reflex condiţionat pentru masculul partener, recoltarea Foto 2 Reflexul de îmbrăţişare şi ejaculare la „taur pe taur“ fiind practicată în cvasitotalitatea unităţilor taur care se ocupă cu producerea de material seminal conservat. La taurii folosiţi la însămânţări artificiale se practică aşa-numitul salt „în gol“ cu scopul îmbunătăţirii volumului ejaculatului. În cazul unor afecţiuni la nivelul coloanei vertebrale, membrelor posterioare etc, acest reflex poate fi inhibat . Reflexul de intromisiune (împerechere, coit) constă în introducerea penisului în conductul vestibulo-vaginal al femelei în cazul montei, sau în lumenul vaginului artificial corect pregătit, în cazul practicării însămânţărilor artificiale. {i acest reflex poate fi inhibat în cazul pregătirii necorespunzătoare a vaginului artificial: tempera-tură, presiune şi lubrifiere necorespunzătoare, falduri în spirală etc. Reflexul de ejaculare se produce având la bază senzaţiile termice, de presiune şi tactile recepţionate de corpusculii dispuşi la nivelul penisului şi transformate în stimuli pe calea filetelor nervoase aferente pentru centrul ejaculator lombar de la nivelul căruia, pe calea filetelor nervoase eferente, sunt transmise la nivelul musculaturii netede a diverselor segmente ale aparatului genital şi, prin contracţia acesteia, se produce expulzarea spermei. Reflexul de ejaculare la taur este foarte rapid, suprapunându-se intromisiunii. În cazul recoltării spermei cu vaginul artificial, dacă acesta este corect pregătit, ejacularea este rapidă, fără a influenţa negativ şi în timp desfăşurarea reflexelor sexuale la 11

taurii de reproducţie. Tipul de sistem nervos influenţează manifestarea şi desfăşurarea reflexelor sexuale. 1.3.1.2.2. Reflexele sexuale la berbec Pentru animalele în libertate, comportamentul sexual, care se termină în mod normal printr-o împerechere, se caracterizează printr-o secvenţă specifică a reflexelor sexuale. Reflexul de apropiere constă în interesul berbecului pentru oaia în călduri şi căutarea acesteia. Masculul dirijează parada sexuală (apropieri ritualizate laterale, însoţite de mişcări ale unui membru anterior). Adulmecă oaia în călduri, urmând ridicarea capului şi manifestarea unui rictus al buzei superioare. Abordarea oii în călduri se face prin lovirea acesteia cu capul în regiunea abdomenului şi apoi cu membrul anterior. Imobilizarea oii constituie semnul vizual de identificare a stării de estru cu ajutorul unui berbec încercător. Recunoaşterea olfactivă a acestei stări joacă rolul de „declanşator“ pentru comportamentul sexual al berbecului. Un berbec tânăr este mai puţin apt să identifice starea de estru a oilor. Atunci când contactul este stabilit, imobilizarea femelei constituie semnalul desfăşurării următoarelor reflexe sexuale. Reflexul de erecţie se realizează prin ştergerea S-ului penian. Caracteristic erecţiei este întinderea şi îndepărtarea apendicelui uretral al glandului, urmată de executarea unor mişcări ondulatorii ale acestuia. Reflexul de îmbrăţişare constă în cuprinderea oii sau a partenerului de recoltare cu membrele anterioare. Ca şi la taur şi la berbec se formează reflexul condiţionat şi pentru oile care nu sunt în călduri sau pentru masculi, recoltarea făcându-se şi „mascul pe mascul“. Reflexul de intromisiune constă în introducerea penisului în conductul vestibulo-vaginal al oii în călduri, în cazul montei, sau în lumenul vaginului artificial, când se practică însămânţarea artificială. În situaţia în care vaginul artificial este corect pregătit, se produce imediat ejacularea. Reflexul de ejaculare este foarte rapid şi se evidenţiază printr-o zvâcnire evidentă a întregului corp şi mai ales a trenului posterior. În cazul recoltării spermei, aceasta este proiectată în cea mai mare cantitate, direct în paharul colector, adaptat la vaginul artificial. Când vaginul artificial nu este pregătit corespunzător, actul sexual se întrerupe la reflexul de intromisiune. 1.3.1.2.3. Reflexele sexuale la vier Reflexul de apropiere se manifestă prin căutarea reciprocă dintre vier şi scroafă. Vierul caută scroafa folosind simţul mirosului, văzului şi auzului. Vierul, introdus într-un lot de scroafe, cu ajutorul mirosului examinează pe rând aproape toate scroafele, adoptând poziţia „cap la cap“, prin aplicarea unor lovituri uşoare în regiunea flancurilor şi încercări de salt. Prin acest comportament, vierul depistează starea de estru a scroafelor, însă nu se opreşte la cele în estru. În apropierea celor doi parteneri, rolul principal revine scroafelor în călduri. În prezenţa scroafei în călduri, vierul se plimbă în jurul ei, grohăie caracteristic, o loveşte în regiunea flancului, adulmecă regiunea vulvară, această agitaţie permanentă fiind determinată de reflexele olfacto-sexuale. Acest „preludiu“ sexual durează, în medie, 5-10 minute şi este mai evident şi de durată în timp mai mare la vierii tineri. Se mai remarcă mişcări caracteristice ale maxilarului inferior, 12

urmate de o secreţie abundentă de salivă şi eliminarea ritmică a unor cantităţi mici de urină (Feredean T., 1969). Reflexul de erecţie constă în exteriorizarea treptată a penisului prin ştergerea S-ului de la acest nivel, în urma iniţierii „jocurilor“ descrise. Reflexul de îmbrăţişare constă în fixarea crupei scroafei sau părţii posterioare a manechinului cu membrele anterioare, penisul intră în erecţie deplină, vierul modificându-şi permanent poziţia, căutând insistent fanta vulvară. Penisul este introdus în conductul vestibulo-vaginal, porţiunea spiralată ajungând la nivelul conductului cervical, unde stă fixat pe toată durata ejaculării. Reflexul de ejaculare se caracterizează prin contracţii ritmice ale musculaturii din regiunea anală, apropierea testiculelor de orificiul extern al canalului inghinal, concomitent cu retractarea burselor testiculare. Durata ejaculării este de 4-8 minute şi se realizează fazial: prespermatică, spermatică şi postspermatică. 1.3.1.2.4. Reflexele sexuale la armăsar Reflexul de apropiere este evident la armăsar, care, în prezenţa iepei devine neliniştit. Reflexul de erecţie se manifestă treptat, începând cu preerecţia la distanţă de iapă, penisul fiind evidenţiat circa jumătate, întărindu-se şi îngroşându-se progresiv. Reflexul de îmbrăţişare se manifestă energic. Reflexul de intromisiune, de regulă se desfăşoară ajutat de o persoană aşezată lateral. Armăsarul execută 5-10 mişcări de pistonare în urma cărora penisul ajunge la momentul maxim al erecţiei. Glandul este puternic tumefiat, cu diametrul de 10-12 cm, în formă de ciupercă. Reflexul de ejaculare se desfăşoară la câteva secunde de la intromisiune, eliminarea spermei făcându-se fazial. 1.3.2. Principii şi metode de recoltare a spermei Recoltarea este operaţia prin care se obţine sperma de la reproducător cu ajutorul unei aparaturi speciale sau prin alte procedee. Recoltarea spermei se bazează pe următoarele principii: - realizarea, prin mijloace artificiale, a condiţiilor existente în secţiunea copulatoare a femelei în călduri: temperatură, presiune, lubrifiere, respectiv recoltarea spermei cu vaginul artificial; - excitarea artificială a centrului ejaculator din măduva lombară prin intermediul curentului electric de o anumită tensiune şi intensitate, respectiv recoltarea spermei prin electroejaculare; - realizarea artificială a unor excitaţii mecanice prin masaj local, efectuat manual la diverse niveluri şi anume: masajul penisului prin traversul tecii furoului, respectiv recoltarea spermei prin masturbaţie; - recoltarea spermei prin masajul ampulelor canalelor deferente şi ale glandelor seminale; - masajul regiunii abdominale la masculii păsărilor, respectiv recoltarea spermei prin masaj abdominal.

13

În prezent, metoda cea mai răspândită pentru recoltarea spermei este metoda cu vaginul artificial, metodă prin care cantitatea şi calităţile ejaculatului nu sunt modificate. Vaginul artificial este alcătuit dintr-un tub cilindric, rigid sau semirigid, confecţionat din cauciuc pânzat, ebonită sau tablă (în raport cu specia) a cărui formă şi dimensiuni variază de asemenea cu specia; o cămaşă vaginală confecţionată din cauciuc subţire; un pahar colector confecţionat din sticlă sau cauciuc, de mărime şi formă diferenţiate cu specia, cu pereţi simpli sau dubli după cum spermatozoizii speciei sunt mai mult sau mai puţin rezistenţi la variaţiile de temperatură. Cămaşa vaginală se fixează prin intermediul unor inele de cauciuc la tubul vaginal, formându-se în acest fel un spaţiu virtual în care se introduce apă caldă şi aer, în raport cu specia. În momentul recoltării, temperatura interioară trebuie să fie de 40-420C. Completarea spaţiului virtual se poate face şi cu apă rece, însă vaginul artificial astfel pregătit trebuie să fie păstrat la termostat reglat la temperatura de 40-420C. În momentul recoltării se insuflă aerul necesar realizării presiunii optime. Presiunea se realizează atât prin intermediul apei cât şi a aerului introdus în spaţiul dintre tub şi cămaşa vaginală. Lubrifierea se face cu vaselină neutră sterilizată. Recoltarea spermei prin folosirea vaginului artificial se face fie pe femele care nu se găsesc în călduri, fie pe manechine, sau mascul pe mascul. Recoltarea spermei se efectuează în încăperi special amenajate. Operatorul recoltator, aşezat pe una din laturile partenerului de recoltare, ţine vaginul artificial pregătit pentru recoltare, înclinat la 35-450 faţă de crupa femelei (masculului). În momentul în care masculul execută saltul, operatorul prinde cu o mână prin traversul furoului penisul acestuia şi îl dirijează către lumenul vaginului artificial. Dacă vaginul artificial este corect pregătit şi manevrat, masculul ejaculează, sperma fiind proiectată în paharul colector, care se trece în laborator, unde se face controlul spermei. Timpul scurs între intromisiunea penisului în lumenul vaginului şi ejaculare este dependent de specie, de condiţiile în care a fost pregătit vaginul, de tipul de sistem nervos al masculului, de existenţa sau nu a unor reflexe condiţionate inhibitoare etc. Recoltarea spermei prin electroejaculare a fost preconizată de Batelli (1922) citat de I. Dumitrescu şi colab., 1978, ulterior metoda fiind îmbunătăţită de cercetători din diverse ţări. Metoda se bazează pe excitaţiile produse cu ajutorul curentului electric, de o anumită tensiune, intensitate şi durată asupra centrului ejaculator din măduva lombară. În urma excitaţiilor se produc contracţii ale musculaturii netede din pereţii căilor de eliminare a spermei. Această metodă se aplică la berbec, taur, păsări. Sperma obţinută nu diferă, cantitativ şi calitativ, de cea obţinută cu ajutorul vaginului artificial. Recoltarea spermei prin masajul ampulelor canalelor deferente şi a glandelor seminale a fost experimentată în anul 1934 în S.U.A., la bovine de către Miller şi Evans. Metoda se bazează pe provocarea eliminării spermei consecutiv excitaţiilor mecanice realizate prin masajul acestor formaţiuni, în urma contracţiilor musculaturii netede. Recoltarea spermei prin masajul abdominal a fost imaginată de Burrows şi Quinn în 1937 şi dă bune rezultate la păsări. Recoltarea spermei prin masturbaţie a fost aplicată pentru prima dată de Spallazani la câine. Ejacularea are loc în urma excitaţiilor mecanice produse asupra corpusculilor senzoriali de la nivelul glandului şi prepuţului. Prin acest procedeu se poate recolta sperma de la câine, vier, vulpoi.

14

1.3.2.1. Recoltarea spermei la taur Recoltarea spermei la taur se poate face prin trei metode: - cu vaginul artificial; - prin electroejaculare; - prin masajul ampulelor canalelor deferente şi al veziculelor seminale. Recoltarea spermei cu vaginul artificial Este cea mai rapidă şi comodă posibilitate de recoltare a spermei a cărei reuşită este condiţionată de realizarea optimă a celor trei factori de bază: temperatură, presiune şi lubrifiere. Vaginul artificial este alcătuit dintr-un tub rigid sau semirigid, o cămaşă vaginală şi un pahar colector. Tubul (carcasa) este cilindric, confecţionat din cauciuc pânzat sau material plastic, prevăzut cu un orificiu, închis cu un dop. Tubul are o lungime ce diferă cu modelul şi unitatea constructoare, care variază între 40 şi 50 cm, cu un diametru de 5,5–6 cm. Cămaşa vaginală este cilindrică, cu o lungime de 65–75 cm, lăţime de 7 cm, confecţionată din cauciuc subţire. Dimensiunile cămăşii vaginale se corelează cu cele ale tubului la care se adaptează. Paharul colector este reprezentat de un recipient din sticlă cu pereţii dubli (între care se găseşte apă) sau dintr-o eprubetă gradată ce se fixează la vagin printr-un con prelungitor din cauciuc (fig. 1, foto 3). Lungimea vaginului artificial este condiţionată de necesitatea ca materialul seminal să fie obţinut direct în paharul colector, cu o trecere scurtă prin cămaşa vaginală sau conul prelungitor din cauciuc spre a evita, pe cât posibil, pierderile de spermă şi eventualul efect negativ al acestor materiale asupra viabilităţii spermatozoizilor Pregătirea vaginului artificial pentru recoltare constă în introducerea cămăşii vaginale în lumenul carcasei vaginului şi răsfrângerea capetelor care depăşesc lungimea corpului peste acesta, astfel încât cămaşa vaginală să fie moderat de întinsă, iar faldurile care le face în interior să fie dispuse longitudinal. Fixarea Fig. 1 Modele de vagin artificial pentru capetelor cămăşii vaginale la tub se recoltarea spermei de taur face prin intermediul a două inele din cauciuc. Între tub şi cămaşa vaginală se formează un spaţiu care va fi umplut cu apă caldă şi aer pentru realizarea temperaturii şi a presiunii. În momentul recoltării, temperatura din interiorul vaginului artificial trebuie să fie de 40–43oC. Pentru realizarea presiunii normale, cantitatea de apă introdusă se completează cu aer, care se insuflă cu o pară din cauciuc pe la nivelul robinetului ce obturează orificiul. Se introduce aer până când lumenul vaginului este obturat de faldurile Foto 3 Aparatură de recoltare a spermei cămăşii vaginale. la armăsar, taur, berbec 15

Paharul colector se adaptează fie direct la unul din capetele vaginului artificial şi fixat cu ajutorul unui căpăstru, fie prin intermediul unui tub prelungitor, temperatura apei dintre cei doi pereţi trebuind să corespundă temperaturii vaginului artificial. În cazul folosirii ca recipient de colectare a eprubetei gradate, aceasta se adaptează la vaginul artificial prin intermediul unui con prelungitor din cauciuc. La capătul opus paharului colector, cu ajutorul unei baghete de sticlă se lubrifiază 1/3 din lungimea vaginului artificial cu vaselină neutră hidrosolubilă. Excesul de vaselină neutră determină scurgerea acesteia în spermă, cu efecte negative asupra mobilităţii spermatozoizilor, insuficienţa vaselinei neasigurând condiţia de lubrifiere, de unde şi insuccesul în recoltarea spermei prin această metodă. Crearea presiunii necesare în interiorul vaginului artificial se poate realiza numai cu aer care se insuflă înaintea recoltării propiu–zise. Tehnica recoltării În unităţile specializate, recoltarea spermei se face într-o sală special amenajată în acest scop, spaţioasă (80–100 m2), luminoasă, aerisită, prevăzută cu un stand de contenţie şi cu o anexă în care se face spălarea şi dezinfecţia componentelor vaginului artificial şi în care se găseşte şi termostatul electric la temperatura de 41–43oC. Pardoseala sălii de recoltare este din asfalt, care favorizează menţinerea curăţeniei şi menajează ongloanele membrelor posterioare foarte solicitate în timpul saltului. Înapoia standului de recoltare, pardoseala se acoperă cu un covor din cauciuc, rumeguş sau nisip pentru a menaja şi mai bine membrele posterioare. Înainte de introducerea taurului în sala de recoltare într-un stand ce se găseşte într-o antecameră se efectuează toaleta orificiuluişi a regiunii periprepuţiale care se spală cu apă caldă şi săpun, se şterge cu un prosop curat, individual, propriu fiecărui taur şi se dezinfectează orificiul prepuţial cu o soluţie de permanganat de potasiu 1o/oo sau alt antiseptic uzual (foto 4). Planificarea taurilor la recoltare, în unităţile specializate se face după un grafic lunar. Pentru aceasta, taurii sunt lotizaţi pe grupe de recoltare constituite din 20–30 de tauri (funcţie de efectivul în exploatare din fiecare unitate) iar în cadrul grupelor de recoltare, pe loturi formate din 4– Foto 4 Toaleta regiunii prepuţiale la taur 6 tauri. Planificarea la recoltare se face pe grupe într-o anumită succesiune (A, B, C, D), într-o zi urmând a se recolta de la toţi taurii din grupa planificată. Taurii sunt scoşi din grajd pe loturi şi introduşi pe rând în sala de recoltare, timp în care ceilalţi tauri din lot sunt plimbaţi. Frecvenţa recoltărilor depinde de vârsta taurilor, de condiţiile de alimentaţie şi întreţinere, de experienţa practică a unităţilor producătoare de material seminal, funcţie de autori această frecvenţă oscilând de la 1 la 6 ejaculate pe săptămână. Experienţa practică a arătat că cea mai bună eficienţă în obţinerea

unui număr optim de spermatozoizi/săptămână este atunci când se recoltează 4 ejaculate pe săptămână, câte două consecutiv pe ziua de recoltare, cu o pauză de 3–4 zile, sau două ejaculate pe săptămână la interval de 3–4 zile dar cu o atentă pregătire a taurului înainte de recoltare. Pregătirea taurului constă în gimnastica funcţională a acestuia înaintea introducerii în sala de recoltare (foto 5), apoi reţinerea acestuia timp de 2–3 minute înainte de ejaculare, efectuarea a 2–3 salturi în gol, în raport şi cu vârsta taurului şi tipul de sistem nervos al acestuia. 16

Foto 5 Gimnastica funcţională a taurilor înaintea recoltării spermei Pentru obişnuirea taurilor la recoltare se foloseşte ca manechin o vacă în călduri sau în oricare stadiu al ciclului sexual, un mascul care este, de regulă, unul din taurii în exploatare, folosiţi prin rotaţie sau un manechin confecţionat din lemn sau metal, îmbrăcat cu o piele de taurine, prevăzut în partea posterioară cu un dispozitiv în care se fixează vaginul artificial pregătit corespunzător. În unităţile specializate recoltarea se face „taur pe taur“, taurul manechin făcând parte din lotul de recoltare şi se stabileşte prin rotaţie, la sfârşitul recoltării spermei de la lotul în cauză, urmând a se recolta sperma şi de la taurul folosit ca manechin. Taurul manechin se contenţionează într-un stand, iar operatorul recoltator se plasează pe una din laturile manechinului, ţinând într-o mână, la o înclinaţie de 35–45o faţă de orizontală, vaginul artificial (foto 6). După 2 –3 salturi effectuate în gol, operatorul cu una din mâini, prin traversul furoului orientează penisul spre lumenul vaginului artificial. În cazul în care vaginul artificial a fost pregătit corespunzător, ejacularea se produce la un interval de timp foarte scurt şi Foto 6 Recoltarea spermei la taur cu se evidenţiază printr-o mişcare bruscă de pistonare spre înainte a trenului vaginul artificial posterior (zvâcnire). Sperma este proiectată direct în paharul colector. Se desprinde cu atenţie vaginul artificial şi se orientează cu paharul colector în jos în vederea colectării întregii cantităţi de spermă ejaculată. Oricare ar fi tipul de vagin artificial (lung sau scurt), pierderile de material seminal se situează între 10–20%, spermă care aderă de pereţii vaginului artificial. Indiferent de durata perioadei de reţinere de la săritură sau de numărul săriturilor în gol, pregătirea sexuală trebuie să preceadă fiecare ejaculare chiar dacă se recoltează două ejaculate consecutiv. Această pregătire menţine capacitatea sexuală a taurului pe toată perioada de timp cât se află în exploatare. După recoltare, paharul colector cu spermă se transmite la laborator pentru examinare, prelucrare şi conservare. Recoltarea spermei prin electroejaculare Se bazează pe excitaţiile produse de curentul electric asupra centrului ejaculator din măduva lombară. Musculatura netedă de la nivelul căilor de 17

eliminare a spermei se contractă, sperma fiind eliminată la exterior. Se foloseşte foarte rar, în condiţii de laborator, atunci când eşuează încercările de recoltare cu vaginul artificial. Se aplică taurilor cu inhibiţii ale reflexului de îmbrăţişare şi ejaculare, celor fără apetit sexual şi celor care au divesre defecte la nivelul membrelor posterioare, tauri care au mare valoare de ameliorare. Electroejaculatorul este constituit dintr-un electrod bipolar conectat la o sursă de curent, portabilă, circuitele fiind tranzistorizate şi miniaturizate. Contenţia taurului se face într-un stand sau travaliu. Pregătirea taurului pentru recoltare constă în înlăturarea materiilor fecale din rect, prin spălarea acestuia cu câţiva litri de soluţie NaCl 5%, care va uşura conductibilitatea electrică şi din spălarea regiunii furoului şi tunderea părului de la nivelul orificiului prepuţial. Se introduce electrodul în rect, cu precauţie, se aşteaptă 3–5 minute după care se începe declanşarea impulsurilor electrice. La început se folosesc 15–20 de excitaţii electrice, fiecare cu o durată de 2–3 secunde şi despărţite de pauze de 50–60 secunde. Intensitatea curentului creşte treptat cu fiecare excitaţie, pornindu-se de la 100 miliamperi, la 800–1500 miliamperi şi cu tensiunea de 25–30 V, durata excitaţiilor mărindu-se până la 5–6 secunde. La fiecare excitare se obţine ejaculat, format la început de secreţiile glandelor anexe şi apoi fracţiuni cu un conţinut crescut de spermatozoizi. Durata totală a recoltării este de 5–10 minute, cantitatea de spermă obţinută fiind egală sau uşor mai mare decât volumul spermei recoltată cu ajutorul vaginului artificial. Eliminarea spermei se produce fără ca penisul să intre în erecţie. Recoltarea spermei prin masajul ampulelor canalelor deferente şi al glandelor seminale Metoda prezintă interes numai în cazul taurilor care din diverse motive nu pot efectua saltul şi la care recoltarea cu vaginul artificial nu se poate aplica. Taurul se contenţionează într-un stand sau travaliu, se execută toaleta furoului şi spălarea bursei prepuţiale cu o soluţie izotonică de NaCl, apoi se videază vezica urinară prin masaj transrectal pentru a se evita amestecul urinei cu sperma. Când peretele rectal este destins se palpează cu precauţie planşeul cavităţii pelvine unde, sub forma unui cordon dur–cartilaginos, cu un diametru de circa 2–3 cm, se identifică uretra intrapelvină. Se palpează gâtul vezicii urinare apoi, de o parte şi de alta a acesteia, dispuse în unghi ascuţit, formă alungită, aspect boselat, se palpează glandele seminale. Deasupra vezicii urinare se găsesc şi dilataţiile canalelor deferente sub forma a două cordoane elastice, ce converg spre gâtul vezicii urinare în unghi ascuţit, diametrul fiind de 0,8–1,2 cm. Tot la acest nivel se găseşte prostata. Masajul se face în sens cranio caudal, pe o distanţă de 20–30 cm, cu atenţie, timp de 3–5 minute, după care începe să se elimine sperma, picătură cu picătură. Pe timpul masajului taurul este liniştit, testiculele sunt retrase spre inelul inghinal, glandul este parţial exteriorizat din teaca furoului, fără ca penisul să intre în erecţie. La început se colectează un lichid alb–apos care reprezintă secreţia veziculelor seminale, sărac în spermatozoizi, care se îndepărtează. Urmează eliminarea unei fracţiuni bogată în spermatozoizi, culoare alb gălbui, consistenţă cremoasă. Unii tauri nu răspund favorabil la colectarea spermei prin acest procedeu. În cazul în care sperma nu se elimină în decurs de 7– 10 minute, se renunţă la masaj, operaţiunea fiind reluată în ziua următoare. Metoda prezintă avantajul că nu necesită condiţii speciale de contenţie şi recoltare şi dezavantajul obţinerii unei sperme inferioare calitativ, în urma amestecului cu urină şi a venirii în contact cu aerul un timp mai îndelungat.

18

1.3.2.2. Recoltarea spermei la berbec şi ţap Două tehnici pot fi utilizate pentru colectarea spermei la masculii rumegătoarelor mici: cu ajutorul vaginului artificial şi prin electroejaculare. Recoltarea spermei cu vaginul artificial este cea mai răspândită, uşor accesibilă centrelor de reproducţie, rezultatele obţinute fiind bune sub aspectul volumului ejaculatului şi calităţii spermei. Obişnuirea masculilor la recoltare necesită un anumit interval de timp şi multă răbdare. Se începe totdeauna în sezonul sexual (sfârşitul verii şi toamna) folosindu-se pentru obişnuire o oaie în oricare stadiu a ciclului sexual. Vaginul artificial este dimensionat pentru această specie: 20–21 cm lungime, 4–5 cm diametru, prevăzut cu un orificiu astupat cu un dop, pe unde se introduce apa caldă sau apa caldă şi aer pentru a asigura condiţiile de temperatură şi presiune. Paharul colector este confecţionat din sticlă cu pereţi simpli, termoizolat cu un manşon din burete, sau din sticlă cu pereţi dubli, pentru a evita efectul negativ al şocului termic (a frigore) asupra viabilităţii spermatozoizilor. Temperatura din interiorul lumenului în momentul recoltării trebuie să fie de 40– 43oC. Adaptarea paharului colector se face la unul din capetele deschise ale vaginului artificial, cu ajutorul acestuia reglându-se presiunea din interiorul vaginului în funcţie de distanţa pe care se introduce paharul colector. La capătul opus paharului colector se lubrifiază cu vaselină neutră lumenul pe circa 1/3 din lungime, evitându-se folosirea în exces a vaselinei sau insuficienţa lubrifierii. Se consideră bine pregătit vaginul artificial atunci când faldurile formate de cămaşa vaginală au o dispoziţie longitudinală şi opturează complet lumenul. Recoltarea se face într-o sală special amenajată în care se găseşte un stand de contenţie a oii partener. Sala de recoltare trebuie să fie curată, luminoasă, iar pregătirea berbecului pentru recoltare se face ca şi la taur. Lâna din jurul orificiului prepuţial se tunde, se spală cu apă şi săpun şi se clăteşte cu soluţie izotonică de NaCl 0,9% pentru îndepărtarea impurităţilor. Oaia manechin se contenţionează într-un stand metalic fixat pe un podium din lemn. Operatorul, cu vaginul artificial pregătit, se aşază în genunchi pe una din laturile oii, în dreptul crupei, ţinând vaginul artificial înclinat la circa 45o faţă de orizontală, cu paharul colector în sus. După efectuarea saltului, operatorul dirijează cu o mână, prin traversul furoului, penisul spre lumenul vaginului artificial. În cazul în care vaginul artificial a fost pregătit corespunzător (temperatură, presiune, lubrifiere) ejacularea coincide cu intromisiunea şi se evidenţiază printr-o mişcare de propulsie a trenului posterior. După ejaculare, berbecul coboară de pe femelă, iar vaginul artificial se desprinde cu atenţie şi se orientează cu paharul colectoer în jos, apoi paharul se scoate şi sperma se transmite la laborator pentru examinare şi prelucrare. Pentru masculii obişnuiţi cu recoltarea, în sezonul sexual, se prelevă două ejaculate succesiv la 2–5 minute. Recoltarea spermei prin electroejaculare Se bazează pe provocarea ejaculării prin excitarea electrică a ganglionilor simpatici lombari care determină contracţia musculaturii netede de la nivelul ampulelor canalelor deferente şi eliminarea spermei, fără ca penisul să intre în erecţie. Această tehnică necesită un volum mare de muncă prin contenţia animalului, o sală cu dotare specială, un electroejaculator identic cu cel utilizat la taur, este dureroasă pentru mascul, iar caracteristicile spermei diferă de a celei obţinute prin folosirea vaginului artificial, motive pentru care această metodă nu este răspândită.

19

Se poate folosi în condiţii de laborator, în cazul unor reproducători de înaltă valoare zootehnică şi care din diverse motive nu pot efectua saltul. În prezent se folosesc electroejaculatoare tranzistorizate, portabile care asigură un curent de 2–5–8 V şi 150 mA prevăzut cu un electrod bipolar. Pentru recoltare, berbecul se fixează în decubit lateral şi se contenţionează pe o masă de lucru (sau pe o scară întinsă). Se face o clismă cu o soluţie de NaCl 10% şi toaleta furoului şi apoi se fixează cu o meşă de tifon sterilă trecută pe la baza porţiunii terminale a glandului. Electrodul bipolar se introduce în rect până ce acesta ajunge în dreptul regiunii lombare. Paharul colector, termoizolat şi sterilizat, se menţine în dreptul deschiderii uretrei. Se stabileşte contactul electric şi se provoacă câteva impulsuri cu o durată de 2–5 secunde, cu pauze de 5–10 secunde. După 5–7 impulsuri se provoacă eliminarea spermei care se colectează în pahar. Impulsurile continuă până se obţine cantitatea normală de spermă. 1.3.2.3. Recoltarea spermei la vier Se poate realiza prin trei metode: cu vaginul artificial; prin masturbare (metoda manuală); prin electroejaculare. Recoltarea spermei cu vaginul artificial Recoltarea spermei presupune obişnuirea vierului cu partenerul si sala de recoltare si cu operatorul recoltator. Pentru recoltarea spermei se foloseşte un partener natural sau artificial. Partenerul natural poate fi o scroafă în călduri sau alte categorii de porci: scroafe care nu sunt în călduri, vieri, masculi castraţi. Scroafa în călduri se foloseşte pentru obişnuirea vierilor. Scroafele care nu sunt în călduri se contenţionează sub un manechin special construit din bare metalice, iar vierul partener se contenţionează prin fixarea unei frânghii de maxilarul superior, obţinându-se astfel starea de imobilitate. Întrucât partenerul natural oboseşte, de regulă după o recoltare, cel mai folosit este partenerul artificial. Partenerul artificial, manechinul trebuie să imite conformaţia scroafei, motiv pentru care se înveleşte cu pile de porc (foto 7). Vaginul artificial se compune dintr-un tub (carcasă) vaginal cu o lungime de circa 20 cm, cămaşa vaginală, confecţionată din cauciuc subţire, prelungitorul vaginal confecţionat din material plastic şi paharul colector. Paharul colector este reprezentat dintr-un borcan de sticlă cu capacitatea de 300–500 ml termoizolat (cu pereţii dubli sau acoperit de un manşon din Foto 7 Manechin pentru recoltarea spermei burete fixat într-un recipient metalic adecvat) (fig.7). la vier Pentru reţinerea şi îndepărtarea fracţiunii gelatinoase a spermei, la gura paharului se fixează un filtru confecţionat din tifon steril. Paharul colector se menţine la termostat reglat la 41–43oC până în momentul recoltării, astfel încât pe 20

toată durata recoltării, temperatura din interiorul paharului colector să nu scadă sub 35–36oC. Aparatura, sticlăria şi ustensilele igienizate şi sterilizate se menţin la termostat, reglat la 40– 42oC, până la întrebuinţare. Vierii de la care urmează să se recolteze se pregătesc, într-o boxă special amenajată în incinta sălii de recoltare, prin spălarea cu apă caldă şi săpun a zonei prepuţiale şi dezinfectarea cu o soluţie de permanganat de potasiu 1o/oo… Fig. 2 Schema vaginului artificial pentru recoltarea spermei la vier Tehnica recoltării Pregătirea vaginului pentru recoltare se face ca la rumegătoare, presiunea şi temperatura necesare realizându-se cu ajutorul apei calde şi a aerului. Vaginul artificial se fixează într-un suport ce culisează în interiorul manechinului. După ce vierul a efectuat saltul pe manechin, penisul va fi dirijat spre lumenul vaginului. Ejacularea la vier durează 5–10 minute, timp în care presiunea din interiorul vaginului se ridică prin insuflarea aerului sau prin presarea manuală la nivelul conului prelungitor, în funcţie de tipul de vagin artificial folosit. După recoltare, paharul colector se detaşează de vagin şi se trece la laborator pentru examinare şi prelucrare. Materialul seminal obţinut prin acest procedeu de recoltare este de bună calitate însă se impune o bună cunoaştere a exigenţelor fiecărui vier, funcţie de care se pregăteşte corect vaginul artificial. Recoltarea spermei prin metoda manuală (masturbare) În prezent este cea mai răspândită, fiind un procedeu de recoltare simplu şi care nu necesită aparatură complicată, calitatea materialului seminal obţinut fiind foarte bună. Vierul este condus în boxa de recoltare, este lăsat să efectueze saltul pe manechinul artificial, apoi operatorul plasat de regulă pe partea dreaptă a manechinului, prinde cu mâna stângă penisul exteriorizat din teaca furoului şi-l trage lateral şi în jos. Această extensie a penisului şi presiunea exercitată cu mâna la nivelul porţiunii spiralate declanşează reflexul de ejaculare. Fracţiunea presperma-tică lipsită de spermatozoizi şi cu un conţinut ridicat în micro-organisme se înlătură. Cu cealaltă mână se menţine paharul colector termoizolat şi prevăzut cu un filtru de tifon, la nivelul orificiului extremităţii libere a penisului, pentru recoltarea spermei (foto 8 ). Primele jeturi de spermă care au un aspect lăptos se colectează în pahar, recoltarea continuând până la terminarea eliminării spermei. Fracţiunea gelatinoasă a spermei reţinută pe filtru se înlătură, iar paharul colector se trimite la laborator pentru evaluare şI prelucrare. Pentru evitarea apariţiei unor reflexe negative se recomandă ca vierul să fie scos din boxă de acelaşi operator – recoltator, să urmeze acelaşi traseu până în boxa de recoltare iar boxa să fie întotdeauna aceeaşi, fără schimbări în interior.

21

Foto 8 Recoltarea spermei la vier prin metoda manuală (masturbare)

Recoltarea spermei prin electroejaculare Oferă posibilitatea examinării spermei unui vier de la care nu se obţine ejacularea pe manechin sau în caz de impotenţă. Se poate folosi în lucrările de cercetare pentru examinarea secreţiilor glandelor anexe la vierii nematuri sexual. Se foloseşte un electroejaculator prevăzut cu un electrod bipolar şi cu o sursă de curent alternativ care să asigure o tensiune de 10– 30 V şi o intensitate de 100– 1000 mA. Se contenţionează vierul, se igienizează prepuţul cu o soluţie izotonică de NaCl 0,9%, se face o clismă rectală cu o soluţie de NaCl 10% pentru eliminarea conţinutului. Electrodul bipolar se introduce în rect astfel încât electrozii să ajungă până în dreptul regiunii lombare, vertebrele L2 – L4.

La început se produc şocuri electrice cu o tensiune de 5 V şi o intensitate de 50–100 mA, apoi tensiunea şi intensitatea cresc progresiv cu fiecare impuls. După fiecare impuls electric se face pauză de 5–10 secunde. Eliminarea spermei se produce când tensiunea curentului este de 15–20 V şi intensitatea de 500–1000 mA. 1.3.2.4 Recoltarea spermei la armăsar Însămânţarea artificială la cabaline nu constituie o practică curentă de reproducţie, atât la noi în ţară cât şi pe plan mondial. Recoltarea spermei se face cu ajutorul vaginului artificial. Tubul vaginului este confecţionat din tablă zincată, material plastic sau aluminiu, având o lungime de 55 cm, diametrul interior la un capăt, de 12 cm, iar la celălalt de 8,5 cm. Cămaşa vaginală este confecţionată din cauciuc, cu lungimea de circa 70 cm şi un diametru de 15–17 cm. Recipientul pentru spermă, confecţionat din material plastic, este cilindric şi se fixează la tubul vaginal la extremitatea cu diametrul mai mic, prin intermediul unui con prelungitor. Paharul colector este termoizolat. Pregătirea vaginului se face în mod asemănător ca pentru taur. Pentru recoltare, iapa se contenţionează cu platlonje, se înfăşoară coada iepei cu tifon pentru a se evita lezionarea penisului. Armăsarul se contenţionează cu două pene de căpăstru, ţinut lateral de îngrijitori. În momentul efectuării saltului, operatorul recoltator orientează penisul armăsarului spre lumenul vaginului artificial, vagin ţinut oblic, la 45o faţă de 22

orizontală şi alăturat de crupa iepei. După executarea unor mişcări de pistonare, ejacularea se produce după 15–17 secunde şi se evidenţiază prin mişcări ritmice la baza cozii. La încheierea ejaculării, armăsarul coboară de pe iapă, iar operatorul desprinde cu atenţie vaginul artificial de pe organul copulator. După recoltare se spală penisul armăsarului cu apă caldă şi se dezinfectează cu o soluţie de permanganat de potasiu 1o/oo. 1.3.2.5. Recoltarea spermei la păsări În perioada anilor 1902–1937 s-au încercat diverse metode de recoltare a spermei la păsări: interpunerea unei canule din sticlă între cloaca cocoşului şi a găinii în timpul călcatului, folosirea unui spermocaptator fixat prin intermediul unor cureluşe la cloaca găinii, folosirea ca spermocaptator a unui prezervativ fixat la cloaca cocoşului, recoltarea prin electroejaculare, recoltarea prin masaj abdominal. Dintre toate aceste variante, cea mai avantajoasă sub aspect practic este recoltarea spermei prin masaj abdominal şi se poate aplica la toate speciile de păsări de fermă fiind astăzi cea mai utilizată metodă de recoltare pe plan mondial. Recoltarea spermei la cocoş Operatorul se aşază pe un taburet şi menţine cocoşul în decubit sterno – abdominal imobilizand membrele acestuia prin prinderea intre picioarele operatorului. Cu mâna stângă se masează uşor regiunea sacrală în direcţie cranio– caudală iar cu mâna dreaptă regiunea abdominală dinspre apendicele xifoid spre apofizele pubiene. Cocoşul prolabează cloaca în care se observă cele două papile mai congestionate (culoare roz-roşietică). Operatorul, cu mâna stângă presează zona pericloacală, iar cu mâna dreaptă colectează sperma în paharul colector. Colectarea spermei se mai poate face şi prin aspiraţie într-o fiolă cu capacitatea de 2 ml astupată cu un dop de plută sau cauciuc. Prin dop este trecut un tub din sticlă îndoit, puţin mai larg la un capăt cu care se va colecta sperma şi un al doilea tub tot din sticlă, la care se adaptează un prelungitor din cauciuc sau material plastic pe unde se crează depresiunea prin aspirare. Sperma aspirată va cădea în fiola respectivă. Contenţia cocoşului se poate face şi sub braţul drept al unui ajutor, cu coada înainte şi cu mâna se imobilizează ambele picioare. Operatorul efectueaza masajul abdominal si recoltarea spermei. În unităţile mari în care cocoşii sunt întreţinuţi în cuşti, contenţia cocoşului se face direct la uşa cuştii de un ajutor, operatorul efectuând masajul abdonimal şi apoi colectează sperma. În acest fel, productivitatea muncii creşte foarte mult. Recoltarea spermei la curcan Se face cu bune rezultate de o echipă constituită din două persoane. Pentru aceasta se foloseşte un scaun dublu cu spătar, în care este practicat un orificiu. Curcanul se contenţionează în decubit sterno-abdominal, cu capul introdus în orificiul practicat în spătar. Ajutorul se aşază în partea stângă a curcanului şi cu spatele imobilizează aripa stângă a acestuia, iar cu piciorul stâng, prin intermediul unei feşe de tifon imobilizează piciorul stâng al curcanului. Imobilizează aripa dreaptă a curcanului cu mâna stângă între cotul şi spătarul scaunului imobilizând totodată şi piciorul drept al curcanului. Cu mâna dreaptă ridică coada şi evidenţiază orificiul cloacal. Operatorul execută masajul abdominal cu ambele mâini şi când curcanul este excitat execută pericloacal compresiuni cu degetele mari de la ambele mâini. Sperma se evidenţiază la nivelul cloacei de unde se recoltează într-un pahar sterilizat. 23

1.4. Examenul însuşirilor spermei Examenul însuşirilor spermei are ca necesitate legată atît de cunoaşterea fertilităţii reproducătorului cît şI de tehnica diluării şI aprecierii spermei 1n diferite faze de prelucrare şI conservare. Compoziţia spermei, variază în funcţie de specie şi chiar reproducător, calitatea spermei diferă în decursul aceleiaşi zile, funcţia spermatogenetică fiind dependentă de numeroşi factori exogeni şi endogeni. Metodele care se folosesc pentru aprecierea calităţii spermei se pot împărţi în următoarele categorii: examenul însuşirilor fizice; examenul însuşirilor biologice; examenul citologic; examenul biochimic; examenul bacteriologic şi micotic. Rezultatele obţinute se consemnează într-un formular oficial denumit spermogramă, hotărîtoare pentru aprecierea unui reproducător. 1.5. Diluarea spermei 1.5.1. Consideraţii generale Răspândirea însămânţărilor artificiale s-a datorat posibilităţilor de diluare şi conservare a spermei. Diluarea spermei reprezintă o etapă premergătoare şi obligatorie pentru conservarea spermei; în rare situaţii sperma se însămânţează sub formă brută sau imediat după diluare, fără a fi conservată. Păstrarea spermei presupune diluarea şi conservarea ei, două etape interdependente ce se aplică succesiv şi corelat. Diluarea permite: - creşterea volumului total al masei spermatice; - posibilitatea fracţionării ejaculatului în mai multe doze şi, deci, însămânţarea unui număr mult mai mare de femele; - asigurarea unui mediu favorabil prelungirii viabilităţii şi capacităţii fecundante a spermatozoizilor, etc. În cazul în care nu există dotarea tehnică necesară conservării, se poate folosi sperma diluată, dar numai după scurgerea intervalelor de timp necesare echilibrării (3-4 ore). Sperma diluată trebuie să fie inoculată femelelor în călduri, într-un interval de timp cât mai scurt, imediat după echilibrare. Indiferent de metoda de conservare a spermei, pentru prelungirea viabilităţii şi a capacităţii fecundante a spermatozoizilor „in vivo“, sunt necesare: - reducerea formării şi acumulării produşilor rezultaţi din metabolismul celulelor seminale; - neutralizarea substanţelor toxice rezultate din metabolism; - trecerea parţială sau definitivă a spermatozoizilor în anabioză. Aceste deziderate se realizează prin diluarea spermei, realizarea unui mediu cu un pH uşor acid (6,2 - 6,4) sau scăderea temperaturii în timpul diluării, cu menţinerea temperaturii scăzute pe toată durata conservării. 1.5.2. Principiile diluării spermei, însuşirile generale ale diluanţilor şi clasificarea acestora Diluţia spermei se bazează pe faptul că din numărul total de spermatozoizi depuşi prin montă, numai o fracţiune redusă (circa 5%) ajung până la nivelul treimii anterioare a oviductului, locul unde urmează să se desfăşoare fecundaţia. 24

În acest fel, marea majoritate a spermatozoizilor devin disponibili pentru a fi inoculaţi altor femele. Experienţele întreprinse au demonstrat faptul că numărul de spermatozoizi necesari pentru însămânţarea unei vaci este de 10-12 miliioane, număr care poate fi redus până la 5 milioane, fără a fi diminuat nivelul ratei fecundaţiei. La ovine, numărul de spermatozoizi mobili pe doză poate fi redus până la 150- 200 de milioane, la suine, la 2-5 miliarde, iar la cabaline, până la o,51,0 miliarde. Principiile care stau la baza diluării spermei sunt: - se diluează numai sperma corespunzătoare calitativ; - diluantul trebuie să conţină substanţe care să protejeze şi să ajute la activarea şi menţinerea metabolismului spermatozoizilor; - materialul seminal diluat trebuie să fie aseptizat prin încorporarea unui antibiotic cu spectru larg de acţiune. Pentru îndeplinirea condiţiilor create prin diluarea spermei, mediul de diluţie trebuie să aibă mai multe însuşiri: - să conţină substanţe care să favorizeze metabolismul, vitalitatea şi capacitatea fecundantă a spermatozoizilor (fructoză, glucoză, galactoză); - să conţină substanţe care să menţină un timp mai îndelungat pH-ul spermei în limite fiziologice, numite substanţe tampon, cum ar fi: citraţii, fosfaţii, tartraţii şi sulfaţii de sodiu şi potasiu (necesare mai ales pentru diluţia spermei cu concentraţie mare în spermatozoizi); - să fie izotonic, izotermic şi să aibă acelaşi pH cu sperma; - să conţină substanţe coloidale care să protejeze spermatozoizii (gălbenuş de ou, lipoproteine, lecitină etc); - să aibă încorporate antibiotice cu efect bacteriostatic sau bactericid într-un spectru cât mai larg; - să posede însuşiri antioxidante; - să fie ieftin şi uşor de preparat; - să se păstreze, nealterat, un timp cât mai îndelungat. Diluanţii se pot clasifica după compoziţie, scop şi specia la care se folosesc. După compoziţie diluanţii se împart în salini, pe bază de lapte şi sintetici. Diluanţii salini constau în soluţii de concentraţii diverse în săruri de fosfaţi, citraţi, sulfaţi, tartraţi de sodiu şi potasiu, care au rol de substanţe tampon. Soluţiile mai conţin zaharuri (glucoză, fructoză, zaharoză etc) şi gălbenuş de ou, diferenţiat cu specia la care se folosesc. Diluanţii pe bază de lapte conţin: lapte proaspăt de vacă ecremat sau lapte praf degresat, cu sau fără adaos de gălbenuş de ou. Diluanţii pe bază de medii sintetice sunt, în prezent, cei mai răspândiţi, sunt produşi de firme specializate, având în compoziţia lor diferite combinaţii de săruri, lapte, cu adaosuri de vitamine, hormoni, extracte tisulare etc, funcţie de unitatea producătoare, pentru fiecare specie în parte, purtând diferite denumiri comerciale: Laiciphos, Spermasol, Diploten, Triladyl, Seminan etc. După scopul lor diluanţii se folosesc pentru sperma conservată prin refrigerare, congelare sau la temperatura camerei. După specia de animale la care se folosesc, diluanţii se pot prepara după aceleaşi formule, pentru o singură specie sau pentru mai multe specii (taur, berbec, ţap).

25

1.5.3. Tehnica preparării diluanţilor Prepararea diluanţilor diferă în funcţie de compoziţia acestora. Diluanţii salini cu adaos de gălbenuş de ou se pregătesc în doi timpi. Timpul 1. Se prepară soluţia salină prin adăugarea în apa bidistilată a cantităţilor de săruri prevăzute prin receptura diluantului respectiv. Apa bidistilată se obţine în distilatoare de sticlă pentru a nu dăuna viabilităţii spermatozoizilor. Distilatoarele metalice modifică pH-ul apei distilate prin ionii de metal ce se formează. Soluţia salină se prepară zilnic,în funcţie de necesar sau pentru mai multe zile, cand se păstrează în sticle sterilizate la întuneric, la temperatura de refrigerare. Diluantul salin se prepară la nivelul unor laboratoare zonale sau naţionale de unde este expediat unităţilor specializate în flacoane închise ermetic care se păstrează la frigider o perioadă de circa 6 luni. Timpul 2. Înainte de folosirea diluantului se adaugă gălbenuşul de ou în cantităţile prevăzute în formulele de preparare a acestora. Se folosesc ouă de găină proaspete (1-3 zile) provenite de la un efectiv sănătos. Ouăle se spală cu apă caldă, se dezinfectează coaja cu alcool sanitar, se sparg şi se separă gălbenuşul de albuş, albuşul netrebuind să ajungă în diluant deoarece are o reacţie acidă şi modifică pH-ul mediului. După obţinerea cantităţii necesare de gălbenuş de ou se omogenizează cu o baghetă din sticlă sau cu un agitator mecanic timp de 5-10 minute, apoi, gălbenuşul bine omogenizat, se adaugă peste soluţia salină, sub o omogenizare continuă, fără a se forma spumă. Omogenizarea face globulele de grăsme din gălbenuş să fie dispersate, evitându-se aglomerarea acestora, ceea ce ar împiedeca mişcarea spematozoizilor. Pentru aseptizarea materialului seminal diluat, se adaugă în diluant antibiotice cu spectru de acţiune cât mai larg, conform reţetelor de preparare. În ţara noastră, cele mai folosite antibiotice sunt: penicilina, streptomicina în cantităţi de 500 U.I. şi respectiv 250-500 µg/ml diluant. Se folosesc cele mai eficiente antibiotice conform antibiogramei. Prepararea diluantului cu gălbenuş de ou şi antibiotice se face, de regulă, cu 1-2 ore înaintea folosirii, timp necesar ca sărurile de Na sau K să clarifice sau să facă transparente particulele de globuline din gălbenuş. Substanţele care se introduc în diluant trebuie să fie proaspete, nealterate, chimic pure şi să nu conţină impurităţi toxice pentru spermatozoizi. Sticlăria şi ustensilele folosite la prepararea diluantului să fie sterilizate. Diluanţii pe bază de lapte se prepară astfel: laptele de vacă proaspăt, integral sau ecremat, se fierbe sau se pasteurizează la 90-92oC, se răceşte şi filtrează printr-o hârtie de filtru, sterilă. Când temperatura laptelui ajunge la 20oC se adaugă proporţia de gălbenuş de ou, stabilită prin receptură, după tehnica descrisă. Laptele praf degresat se prepară cu apă bidistilată în raport de 1/9, apoi se pasteurizează, se filtrează, se răceşte şi se amestecă cu cantitatea necesară de gălbenuş de ou (5-10%). Diluanţii sintetici sunt cei mai întrebuinţaţi în prezent. Ei sunt produşi de diferite unităţi specializate şi sunt livraţi sub formă de pulberi sau granule. Sunt însoţiţi de instrucţiunile de folosire. În prezent, aceste medii de diluţie se prepară pe scară industrială, ceea ce conduce la uniformizarea şi simplificarea tehnicilor de lucru, obţinerea unor rezultate bune, în condiţiile scăderii preţului de cost.

26

1.5.4. Tehnica diluţiei Diluţia propriu-zisă diferă cu specia şi cu modul de conservare a spermei.

1.5.4.1. Diluarea spermei de taur Pentru conservarea spermei prin refrigerare se folosesc medii pe bază de soluţii saline cu adaos de gălbenuş de ou, glucoză, sau diluanţii pe bază de lapte. Cel mai frecvent sunt întrebuinţaţi diluanţii sintetici, livraţi de diverse firme, cu diferite denumiri, funcţie de ţara şi unitatea producătoare. Diluantul sintetic este un mediu uscat, pe bază de lapte ecremat, echilibrat şi sterilizat, la care se adaugă în final 10% gălbenuş de ou şi 7% glicerină cu densitate 1,25 (de exemplu Laiciphos). Nivelul relativ scăzut de gălbenuş de ou facilitează examinarea microscopică, fără să influenţeze negativ fecunditatea. Indiferent de natura diluantului, se adaugă cantităţile necesare de antibiotice (preferabil în funcţie de antibiogramă), se pasteurizează, se filtrează şi se răcesc. Diluarea spermei pentru conservare prin refrigerare se face în două etape: - diluţia iniţială (prediluţia), la 37oC, în raport de 1/1 şi în condiţii de izotermie; - diluţia finală (definitivă), la 18-20oC, tot în condiţii de izotermie, conform raportului final de diluţie, calculat în funcţie de concentraţia spermei brute şi a celei diluate în spermatozoizi/mm3 sau pe ml. Formula de calcul este: G.D.F. =

C1 C2

xMx V

în care:

- G.D.F = gradul de diluţie finală; - C1 = concentraţia spermei brute în spermatozoizi/ml; - C2 = numărul de spermatozoizi vii pe care dorim să-i avem în doză; - M = mobilitatea spermatozoizilor după decongelare, exprimată în sistemul zecimal; - V = volumul dozei de spermă exprimat în ml. Exemplu: C1=109; C2=12x106; M=0,6; V=1,0ml. G.F.D.=109x0,6x1,0/12x106=50, sau când V=0,5ml rezultă G.DF.=109x0,6x0,5/12x106=25. În această situaţie, la un volum de spermă se adaugă 49 volume de diluant în primul caz, şi respectiv 24 de volume, în cazul al doilea. Precizăm că mobilitatea spermatozoizilor după deconservare se calculează pentru fiecare taur în parte pe baza mediei mai multor determinări. În acest caz, raportul de diluţie final va fi: R.D.F=1/49; R.D.F=1/24. Pentru calcularea numărului de doze pe care le putem obţine dintr-un ejaculat, se înmulţeşte volumul ejaculatului cu gradul de diluţie final obţinut şi se împarte la volumul dozei. 27

În exemplul dat, dacă volumul ejaculatului este de 5 ml, numărul de doze va fi; Nr. doze=50x5/1=250; sau N=5x25/0,5=250 Gradul de diluţie pentru sperma de taur, oscilează în medie între 20 şi 40, astfel încât într-o doză de însămânţare să se asigure 10-12 milioane de spermatozoizi mobili. Mobilitatea minimă admisă pentru sperma de taur conservată prin refrigerare este de 60% sau de 0,6, determinată înainte de a fi însămânţată. După diluare, se apreciază mobilitatea spermatozoizilor şi dacă aceasta nu a scăzut cu mai mult de 10% faţă de mobilitatea spermei brute, diluţia se consideră că a fost efectuată în condiţii bune şi se trece la repartizarea în doze a spermei. Repartizarea spermei în doze se face cu ajutorul unor seringi semiautomate, în fiole de sticlă care se închid apoi la flacără oxiacetilenică, sau în fiole care se închid cu dop de plută sau din material plastic. Pentru conservarea spermei de taur prin congelare se folosesc două medii de diluţie care se deosebesc numai prin aceea că unul conţine, în plus, glicerină, substanţă crioprotectoare. {i în acest caz se pot folosi diluanţi salini, pe bază de lapte sau sintetici (de exemplu Laiciphos, Tryladil, Seminan etc.) care se prepară după tehnicile descrise. Cantitatea de diluant necesară se separă în două părţi egale (A şi B). Diluantul B conţine în plus faţă de diluantul A 14-16% glicerină chimic pură, astfel încât concentraţia de glicerină, în final, să fie de 7-8%. Diluantul A se împarte în două părţi inegale: o parte (A1) mai redusă (510%) se păstrează la termostat reglat la 37oC, iar cealaltă parte, (A2) se lasă la temperatura camerei. Diluantul B se păstrează la frigider sau într-o vitrină frigorifică la 2-4oC. Diluţia comportă 3 etape: iniţială, intermediară şi finală. Diluţia iniţială se face la temperatura de 37oC, în condiţii de izotermie, în raport de 1/1, cu diluantul A1, direct în paharul sau eprubeta colectoare. După efectuarea acestei prime diluţii, paharul sau eprubeta cu sperma astfel diluată se scot de la termostat şi se aşază alături de fracţiunea A2 a diluantului, la temperatura laboratorului (18-20oC). Diluţia intermediară se face după circa 20-30 de minute, când cele două componente ating aceeaşi temperatură, la temperatura laboratorului, adăugându-se diluantul A2 într-un raport care să asigure jumătate din cantitatea totală de diluant calculată prin raportul final de diluţie. După diluţia intermediară, paharul cu sperma se introduce într-o vitrină frigorifică sau la frigider, alături de fracţiunea B a diluantului. Diluţia finală se face la temperatura de 2-4oC, tot în condiţii de izotermie, după 50-60 de minute de la efectuarea diluţiei intermediare. Întrucât glicerina este o substanţă toxică pentru spermatozoizi, diluantul glicerinat se adaugă treptat, picătură cu picătură, sub o permanentă agitare a recipien-tului cu spermă (foto 12). Congelarea spermei sub formă de granule se bazează pe răcirea rapidă a acesteia, în alveolele unei plăci de zăpadă carbonică rezultând pastile cu un volum de 0,1 ml. După recoltarea spermei se examinează însuşirile ejaculatului, în funcţie de care se determină gradul final de diluţie şi volumul total al spermei diluate. În acest interval de timp, sperma se diluează în proporţie de 1/1 la temperatura de 37oC, în condiţii de izotermie între diluant şi spermă. Cel mai frecvent se foloseşte diluant pe bază de lactoză: lactoză 11% în apă bidistilată - 75,3 ml, gălbenuş de ou - 20 ml, glicerină anhidră - 4,7 ml. După 15 minute de la diluţia iniţială, se adaugă volumul total de diluant glicerinat, cu ajutorul unui dozator automat, cuplat la un omogenizator. Adăugarea se face la temperatura laboratorului, raportul de diluţie fiind foarte strâns (1/2, 1/4), datorat 28

volumului redus al granulei şi mobilităţii mai reduse a spermatozoizilor, comparativ cu alte metode de congelare. Compoziţia diluanţilor utilizaţi în acţiunea de însămânţări artificiale este foarte diferită, însă se poate afirma că cea mai mare parte, aparţine diluanţilor salini, pe bază de lapte sau sintetici. Fiecare ţară şi unitate specializată în practica însămânţărilor artificiale au reţete specifice pentru prepararea diluanţilor. Din multitudinea de reţete de preparare a diluanţilor redăm pe cele mai simple şi mai frecvent folosite: 13,6 g 1) Sulfat de sodiu anhidru (Na2SO4) Glucoză anhidră 12,0 g Peptonă 5,0 g Apă distilată (încălzită) 1000 ml 2) Citrat de sodiu (Na3C6H5O5) Apă bidistilată Gălbenuş de ou

2,9 g 100 ml 20%

3) Diluant pe bază de lapte praf Într-un litru de apă bidistilată se adaugă 100 g lapte degresat apoi se fierbe 10 minute într-un vas conic. După răcire se completează apa pierdută prin evaporare, apoi se adaugă antibioticele menţionate la reţeta 10. În prezent, pentru diluarea spermei de taur se folosesc diluanţi sintetici, preparaţi de diverse firme şi care încorporează toate substanţele chimice necesare, în laborator urmând să se adauge, eventual, gălbenuşul de ou proaspăt preparat şi apa bidistilată. Funcţie de firma care-i comercializează, diluanţii poartă diverse denumiri: Laiciphos, Spermasol, Dilapten, Triladyl, Seminan etc. 1.5.4.2. Diluarea spermei de berbec şI ţap Un mare număr de însămânţări artificiale la ovine, atât pe plan mondial cât şi în ţara noastră se realizează cu spermă nediluată, imediat după recoltare şi examinare. Această metodă asigură o fertilitate ridicată, însă necesită prezenţa masculilor în aceeaşi unitate cu femelele care urmează a fi însămânţate. Proprietăţile biochimice ale spermei de berbec şi ţap impun anumite precauţii în folosirea spermei pentru însămânţările artificiale. Astfel, plasma seminală nu creează un mediu optim pentru supravieţuirea spermatozoizilor „in vivo“. Cercetările au evidenţiat, spre exemplu, la ţap, atunci când sperma a fost recoltată din epididim ( care nu a venit în contact cu secreţiile glandelor anexe), a fost diluată şi congelată, că proporţia de spermatozoizi vii şi mobilitatea lor după decongelare sunt mult superioare celor din sperma ejaculată, ceea ce indică faptul că venirea în contact a spermatozoizilor cu secreţiile glandelor anexe reduce supravieţuirea „in vitro“ a acestora. La berbec, adăugarea plasmei seminale la spermatozoizii proveniţi din epididim, stimulează mobilitatea acestora timp de 3-7 ore, apoi mobilitatea se reduce brusc, comparativ cu spermatozoizii care nu vin în contact cu plasma seminală şi care îşi menţin mobilitatea peste 22 de ore. La ţap, plasma seminală pare nefastă menţinerii calităţii spermatozoizilor, pe durata stocării îndelungate în azot lichid (G. Baril şi colab., 1993). 29

La aceste două specii (ovine, caprine), glandele bulbouretrale au capacitatea de a secreta în cantităţi însemnate o enzimă numită fosfolipaza A, sau a coagulării gălbenuşului de ou. Această enzimă catalizează hidroliza lecitinelor din gălbenuşul oului în acizi graşi şi lizolecitină. Lizolecitina, în concentraţie mai ridicată, este toxică pentru supravieţuirea „in vitro“ a spermatozoizilor. Această particularitate de specie împiedică folosirea unei cantităţi importante de gălbenuş de ou sau a unui mediu cu conţinut ridicat în lecitine pentru diluarea spermei. Totuşi, în cazul aplicării însămânţărilor artificiale la ovine, pe scară mai largă, diluţia spermei este necesară. Compoziţia diluanţilor şi tehnica diluării spermei de berbec şi ţap diferă în funcţie de modul în care se face conservarea: sub formă lichidă (refrigerare) sau solidă (congelare). Diluţia spermei pentru conservare sub formă lichidă presupune parcurgerea a două etape principale: prepararea diluantului şi diluţia propriu-zisă. Diluantul se prepară pe bază de lapte praf, cu o zi înaintea întrebuinţării (Baril G şi colab.,1993). Se iau 100 ml de apă bidistilată, sterilizată şi încălzită la 60oC, în care se dizolvă 0,33 g de sulfamide. Se răceşte amestecul până la 20-25oC, apoi, în acest amestec se dizolvă 11,1 g lapte praf de vacă, ecremat. Se fierbe într-o baie-marie, timp de 15 minute, se răceşte la temperatura laboratorului, se adaugă 0,11 g streptomicină şi 100000 U.I. penicilină. Diluantul astfel preparat se păstrează la 24oC, timp de maxim 2-3 zile. În practica însămânţărilor artificiale din ţara noastră şi din lume se folosesc multe reţete de preparare a diluanţilor, cel mai frecvent întrebuinţaţi fiind diluanţii sintetici, produşi de diverse firme specializate. După recoltarea ejaculatului, acesta se examinează cantitativ şi calitativ, apreciindu-se cel puţin mobilitatea şi concentraţia spermatozoizilor, pe baza cărora se determină gradul final de diluţie (raportul final de diluţie - RDF) funcţie de concentraţia iniţială şi după diluţie a spermei în spermatozoizi/ml. Diluarea spermei se face în două etape: iniţială şi finală. Diluţia iniţială se face imediat după recoltare, la temperatura de 32oC, în raport de 1/1, în condiţii de izotermie, direct în paharul colector menţinut într-un termostat la 32oC. Paharul colector împreună cu sperma prediluată, se scoate de la termostat şi se menţine 10-15 minute la temperatura laboratorului, alături de restul diluantului. Diluţia finală se face la temperatura ambiantă, în condiţii de izotermie, adăugându-se restul cantităţii de diluant, calculat prin raportul final de diluţie. În cazul în care raportul de diluţie este mai larg (1/5-1/7), pentru mărirea vâscozităţii materialului seminal, se poate adăuga la compoziţia diluantului 2-3% gelatină sau polivinil pirolidon etc. Diluarea spermei pentru conservare sub formă solidă (congelare) Pentru congelare se folosesc numai ejaculate cu mobilitate de cel puţin 0,8. Aprecierea volumului şi concentraţiei spermei permite calculul gradului diluţiei finale. Diluantul se prepară cu o zi înainte sau în aceeaşi zi, puţin timp înainte de folosire. Se folosesc doi diluanţi. Primul poate fi: 100 ml apă bidistilată, 10,3 g lactoză, 20% gălbenuş de ou. Cel de-al doilea conţine diluantul 1 la care se adaugă 4,0 g de lapte praf ecremat pentru fiecare 100 ml, astfel încât, în final presiunea osmotică să atingă 450 miliosmoli. Se adaugă la acest diluant glicerol, astfel încât, în sperma diluată, proporţia de glicerol să fie de 4%. Tehnica diluţiei include două etape principale: - diluţia iniţială (prediluţia) care se face cu diluantul 1 la 32oC, în condiţii de izotermie, direct în paharul colector, menţinut la termostat. Imediat după prediluţie paharul cu sperma respectivă se menţine la

30

temperatura laboratorului timp de 10-15 minute apoi se introduce întrun frigider (2-4oC) unde este menţinut timp de 2,0-2,5 ore; - diluţia finală se face la temperatura de 2-4oC, în condiţii de izotermie, adăugându-se cantitatea necesară din diluantul 2 (conform R.D.F) astfel încât în final, concentraţia spermei în glicerol să fie de 4%. Exemple de diluanţi folosiţi pentru sperma de berbec: 1) Apă bidistilată Glucoză anhidră Citrat de sodiu Streptomicină Penicilină Gălbenuş de ou

100 ml 0,8 g 2,8 g 50000 mcg 50000 U.I. 20%

2) Apă bidistilată 80 ml Glicocol 0,34 g Citrat trisodic (cu 2 moli de apă) 2,71 g Gălbenuş de ou 20% Când se lucrează cu un raport de diluţie mai larg (1/5-1/7) în vederea măririi vâscozităţii spermei se mai poate adăuga, de exemplu, 25% polivinil pirolidon.

1.5.4.3. Diluarea spermei de vier Pentru sperma de vier, cele mai bune rezultate s-au dovedit a fi date de mediile de diluţie sintetice. Mediul de diluţie trebuie să conţină neelectroliţi (zaharuri), substanţe ce conţin şi o sursă exogenă de energie. Pentru menţinerea pH-ului în limite normale, în mediul de diluţie sunt încorporaţi anioni polivalenţi (citratul de sodiu), gălbenuş de ou sau lecitină. Pentru a proteja spermatozoizii de efectul nefavorabil al şocului termic în mediul de diluţie se introduc substanţe chelatoare (complexon III). Bune rezultate se obţin cu medii pe bază de glucozăcitrat-bicarbonat-complexon III - cu adaos de antibiotice cu rol bacteriostatic sau bactericid. O altă grupă importantă o formează diluanţii pe bază de lapte de vacă, proaspăt sau preparat din lapte praf, sau din lapte+soluţie glucoză 6%+gălbenuş de ou 3% şi antibiotice (Feredean şi colab., 1964). Alţi autori recomandă ca mediul de diluţie pentru sperma de vier, laptele integral cu adaos de soluţie de glucoză 3,5% şi 2% gălbenuş de ou, iar cercetători din China au obţinut rezultate satisfăcătoare prin folosirea unui mediu alcătuit din părţi egale de lapte degresat, soluţie de citrat de sodiu 2,9%, soluţie de glucoză 5%, la care se adaugă 10-20% gălbenuş de ou şi antibiotice. De reţinut că laptele poate constitui singur sau în amestec cu alte substanţe, un bun diluant pentru sperma de vier, fiind un mediu biologic complex, cu conţinut favorabil de lipide (lecitină, cefalină), proteine (cazeină, lactalbumină, lactoglobulină) şi aminoacizi esenţiali (metionină, treonină, lizină, triptofan), glucide (lactoza), substanţe minerale, acid citric, enzime şi vitamine. Acest diluant este foarte uşor de preparat, laptele trebuind să provină de la vaci sănătoase, să fie proaspăt şi să se încălzească înainte de folosire, la 85-90oC, timp de 10-15 minute. Pentru congelarea spermei de vier, mediile de diluţie trebuie să includă glucoză, citrat de sodiu cu tampon format din soluţie tricină- tris, la care se adaugă 31

gălbenuş de ou, glicerină 3-4% şi antibiotice (Crabo şi colab., 1971; Nouk, B.A.,1971). Mediile sintetice produse de unităţi specializate şi care se prezintă sub formă de pulbere, ambalată în pungi din material plastic, prevăzute şi cu instrucţiuni de folosire, sunt cele mai folosite în prezent în practica însămânţărilor artificiale la suine. Mediile sintetice se prepară numai din substanţe chimic pure, iar apa în care se dizolvă aceste substanţe trebuie să fie bidistilată, fiartă în prealabil. Diluanţii pe bază de lapte se prepară numai înainte de recoltarea spermei, conform celor menţionate anterior. Tehnica diluării spermei este cât se poate de simplă. Diluţia trebuie să se facă cât mai repede de la recoltare, la temperatura de 33oC, prin adăugarea treptată a diluantului peste spermă, în condiţii de izotermie, într-o baie de apă a cărei temperatură este reglată la acest nivel. Gradul de diluţie se stabileşte pe baza concentraţiei, mobilităţii spermatozoizilor şi a numărului de spermatozoizi mobili pe doza de însămânţare (3-5 miliarde), folosindu-se formula: Vt =

C x M x10 n

9 − 1,

în care:

Vt=volumul total al spermei diluate; C= concentraţia spermei/ml; M= mobilitatea spermatozoizilor; n= numărul de spermatozoizi de dorit într-o doză de spermă. După efectuarea diluţiei iniţiale în raport de 1/1, paharul cu spermă se menţine 20-30 minute la temperatura laboratorului, apoi se adaugă treptat, în condiţii de izotermie, restul cantităţii de diluant calculat prin gradul final de diluţie, apoi sperma se repartizează în doze, constituite din recipiente din material plastic, având o capacitate de 100 ml, de formă ovală sau cilindrică. Câteva exemple de formule de diluanţi pentru sperma de vier: 1) Apă bidistilată Glucoză Bicarbonat de Na Gălbenuş de ou Streptomicină Penicilină

1000 ml 30,0 g 1,0 g 300 ml 0,5 g 500000 U.I.

2) Apă bidistilată Glucoză Bicarbonat de Na Gălbenuş de ou Streptomicină Penicilină

1000 ml 40,0 g 2,0 g 250 ml 0,4 g 240000 U.I.

3) Apă bidistilată Citrat de Na Gălbenuş de ou Penicilină Streptomicină

1000 ml 30,0 g 200 ml 500000 U.I. 0,5 g 32

1.5.4.4. Diluarea spermei de armăsar Sperma de armăsar, după recoltare, oricare ar fi temperatura la care se păstrează, nu conţine nici un spermatozoid viu după circa o oră. Deci însămânţarea cu spermă brută trebuie să se facă în primele 5 minute de la recoltare. Dacă nu este posibil, sperma trebuie să fie diluată în primele două minute după recoltare, rolul diluantului fiind acela de a neutraliza efectele nefaste ale plasmei seminale (E. Palmer şi colab., 1984). Pentru diluarea spermei de armăsar se folosesc mai multe formule de medii de diluţie: pe bază de tartrat de sodiu şi potasiu, glucoză, peptonă, gălbenuş de ou şi antibiotice: Cel mai simplu şi ieftin diluant îl constituie laptele semiecremat, sterilizat, la care se adaugă penicilină (50000 U.I./l) şi gentamicină(5 mg/l). Indiferent de mediul de diluţie folosit, la 100 ml se adaugă 500000 U.I.penicilină şi 0,5 g streptomicină. Sperma se recoltează cu ajutorul vaginului artificial la interval de 48 de ore, se filtrează, apoi se diluează imediat la 32oC în condiţii de izotermie, astfel încât după diluţie să se asigure 20 milioane spermatozoizi/ml. 1.5.4.5. Diluarea spermei de păsări Dozele de spermă pentru însămânţarea artificială a păsărilor trebuie să conţină 100-120 milioane de spermatozoizi mobili, raportul de diluţie cel mai frecvent fiind de 1/2-1/3, fără a depăşi 1/5. În cazul practicării însămânţărilor artificiale în unităţile cu flux tehnologic industrial, nu se recomandă diluarea spermei, dacă sperma brută se însămânţează într-un interval maxim de 30-45 de minute după recoltare. În cazul în care acest interval este depăşit, devine utilă şi necesară diluarea spermei şi conservarea acesteia. Întrucât, spermatozoizii îşi pierd repede capacitatea fecundantă, diluţia spermei trebuie să se facă pe măsură ce se recoltează. Indiferent de specie, diluţia spermei nu permite însămânţarea unui număr prea mare de femele dintr-un ejaculat întrucât, factorul cel mai important este numărul de spermatozoizi pe doza de însămânţare. De aceea, apare necesitatea creşterii volumului dozei de spermă diluată în raport invers cu nivelul de diluţie, pentru a menţine constant numărul de spermatozoizi inseminaţi. Diluarea spermei la păsări se face cu diluanţi care să prezerve nu numai mobilitatea spermatozoizilor ci şi fecundanţa acestora. Pentru păsări, un diluant bun este acela care diminuă de o manieră reversibilă mobilitatea spermatozoizilor, tamponează tendinţa de acidifiere a mediului consecutiv metabolismului acestora, chiar la un nivel scăzut de temperatură şi conţine nutrienţi esenţialmente energetici. Când sperma diluată nu se congelează, diluanţii pot fi constituiţi din simple soluţii tampon. Aceste soluţii sunt alcătuite din apă bidistilată la care se adaugă fosfaţi de sodiu şi potasiu (65 g/l) pentru a asigura o presiune osmotică de 380-400 mosm/l. Formulele de diluanţi mai cunoscute sunt cele menţionate de Lake şi colab.(1981) sau Sexton (1977), care au aceleaşi condiţii de osmolaritate şi conţin unul sau mai multe sisteme tampon (citrat, fosfat, acetat, BES sau TES) şi se caracterizează prin concentraţii precise în anumiţi electroliţi (Na+, K+, Mg++) şi chelatanţi (aminoacizi de tip glicină sau glutamat). Aceşti diluanţi mai conţin glucoză sau fructoză. Gradul de dilutie este cuprins intre 1/2 şi 1/3. 33

1.6. Conservarea spermei În prezent, extinderea însămânţărilor artificiale este condiţionată într-o proporţie însemnată de conservarea spermei. A conserva spermatozoizii animali înseamnă a conserva celule nu numai în stare vie ci şi funcţională. De aceea cercetătorii au căutat să pună la punct metode care să fie cât mai adaptate fiziologic spermatozoidului, în sensul că acesta să-şi reducă metabolismul fără a fi afectată capacitatea fecundantă. Tehnicile de conservare a spermei se pot clasifica în trei grupe: a).- conservarea spermei la temperatura ambiantă (18-20oC); b).- conservarea spermei la temperatura de refrigerare (2-4oC); c).- conservarea spermei la temperatura de congelare (-79;-196oC). a). Conservarea spermei la temperatura ambiantă (18-20oC) În acest caz, conservarea se bazează pe acţiunea inhibitoare a substanţelor chimice incluse în diluant şi care pot fi uşor eliminate pentru a reanima spermatozoizii. În acest scop se foloseşte acidul carbonic, provenit din barbotarea bioxidului de carbon în masa spermatică cu apa (CO2+H2O=H2CO3). Spermatozoizii au un metabolism încetinit atât timp cât concentraţia în bioxid de carbon se menţine la saturaţie. Când bioxidul de carbon este eliminat, spermatozoizii îşi recapătă mişcarea şi capacitatea lor funcţională. Rezultatele obţinute prin aceasta tehnica sunt nesatisfăcătoare pentru conservarea spermei de taur, berbec şi vier. Tehnica nu permite menţinerea puterii fecundante a spermatozoizilor decât pentru un interval de timp de circa 3-4 zile. Este necesar ca fiecare doză să fie pusă într-un ambalaj etanş şi separat (fiolă saturată cu gaz carbonic). În deceniul şapte s-a propus ca metodă de conservare a spermei la temperatura camerei, prin folosirea laptelui de nucă de cocos. Experienţele au arătat că acest mediu permite supravieţuirea şi prelungirea puterii fecundante a celulelor sexuale mascule de taur timp de circa 3-4 zile la temperatura de 15-20oC, metoda fiind depăşită tehnologic de conservarea spermei prin refrigerare şi congelare. Sperma este diluată normal într-un mediu cu lapte de cocos şi repartizată în tuburi păstrate la temperatura de 15-20oC. b). Conservarea spermei prin refrigerare (2-4oC) Această tehnică a fost cea mai folosită până în deceniul opt pentru conservarea spermei la toate speciile şi se mai foloseşte în prezent pentru conservarea spermei de vier, armăsar şi păsări cu rezultate mulţumitoare. Mobilitatea spermatozoizilor şi activitatea lor metabolică descresc progresiv pe măsură ce temperatura mediului în care se găsesc scade. La un nivel de temperatură care oscilează între 2oCşi 4oC, într-un mediu de diluţie adecvat, mobilitatea aproape a încetat. Dacă se încălzeşte mediul, mişcarea spermatozoizilor reapare, sperma regăsindu-şi activitatea şi puterea de fecundaţie. În general, pentru conservarea la acest nivel de temperatură, se folosesc diluanţi salini pe bază de citrat, tartrat de Na şi K sau de lapte ecremat, sau cel mai eficient, diluanţi sintetici în asociaţie cu gălbenuşul de ou, a cărei principală funcţie este de a proteja spermatozoizii împotriva şocului „a frigore“. La ţap şi armăsar se evită includerea în diluant a gălbenuşului de ou care este nefavorabil pentru supravieţuirea spermatozoizilor. Pe parcursul conservării, la temperatura de refrigerare, spermatozoidul îmbătrâneşte progresiv, îmbătrânire care se manifestă printr-o reducere a capacităţii fecundante. Astfel, dacă se consideră capacitatea fecundantă că este 100 în primele 24 de ore de conservare, se reduce la circa 80 în a doua zi, la 65 în a treia zi şi la 50 în a patra zi (Parez M.,1969). În acest caz, centrele de 34

reproducţie sunt obligate să reînoiască stocul de spermă la 2-3 zile pentru fiecare reproducător. În sperma conservată prin refrigerare, menţinerea şi prelungirea mobilităţii spermatozoizilor se datoreşte: - mediului de diluţie, care conţine substanţe nutritive şi protectoare; - reducerii metabolismului spermatozoizilor, datorită scăderii temperaturii între 2oC şi 4oC. Conservarea spermei prin refrigerare prezintă, totuşi, unele avantaje: - permite difuzarea materialului seminal la punctele de însămânţări artificiale situate la o oarecare distanţă faţă de unitatea producătoare; - se pot constitui rezerve de spermă pentru două-trei zile care pot fi expediate la solicitarea beneficiarilor, în caz de necesitate; - contribuie la intensivizarea progresului genetic, prin folosirea pe o scară mai largă a reproducătorilor valoroşi. Conservarea spermei prin refrigerare prezintă şi următoarele principale dezavantaje: - sperma este conservată pe o perioadă limitată de timp (două-trei zile); - dificultăţi în asigurarea temperaturii scăzute pe timpul transportului şi pe durata conservării; - sunt pierderi apreciabile de material seminal, prin înlăturarea dozelor care nu au fost inoculate în intervalul de timp de două-trei zile; - cheltuielile mari cu transportul dozelor, care trebuie să se facă în permanenţă la un interval de două-trei zile, pentru toate punctele de însămânţări artificiale deservite de centrul respectiv; - consum crescut de energie pentru menţinerea unei temperaturi scăzute, constante (2-4oC). c).Conservarea spermei prin congelare La temperaturi sub -15oC, modificările biologice pe care le suferă celulele sexuale mascule în cursul timpului sunt abolite. Conservarea spermatozoizilor se face cu scopul de a opri metabolismul lor de o manieră reversibilă, ceea ce permite conservarea acestora pe o durată de timp practic indefinită. Însămânţarea femelelor cu sperma conservată prin congelare reprezintă un procedeu cu maximă eficacitate. Această tehnică se bazează pe menţinerea sub formă solidă a spermei, spermatozoizii fiind aduşi într-o stare de viaţă extrem de încetinită, nivel la care reacţiile chimice sunt aproape inexistente, motiv pentru care conservarea mobilităţii şi capacităţii fecundante a spermatozoizilor se poate face în condiţii optime, timp de zeci sau chiar sute de ani. Spermatozoizii îşi recapătă mobilitatea şi capacitatea fecundantă în momentul revenirii la temperatura corporală. Agenţii criogeni sunt reprezentaţi de zăpada carbonică ce asigură o temperatură medie scăzută (-79oC), de aerul lichid (-183oC) şi azotul lichid (-196oC). Cel mai răspândit agent criogen în congelarea spermei este azotul lichid Pentru congelarea spermei la temperaturi foarte joase s-a mai folosit şi aerul lichid, un amestec de oxigen şi azot lichid, care asigură o temperatură de 183oC, care, în contact cu impurităţi organice, prezintă pericol de explozie, motiv pentru care în prezent nu se mai foloseşte. Păstrarea azotului lichid la unităţile de producere a materialului seminal, la unităţile beneficiare cât şi pe timpul transportului se realizează în recipiente speciale numite containere. După modul de folosire sau destinaţie, containerele pot fi clasificate astfel: - containere de punct, cu capacitatea de 5-35 litri; - containere de stocaj şi transport, cu capacitatea de 35-50 de litri; 35

-

containere de depozit (stocaj), cu capacităţi cuprinse între 100 şi 750 de litri. Containerele sunt confecţionate din material inoxidabil sau dintr-un aliaj special pe bază de aluminiu. La marea majoritate a containerelor, construcţia se realizează după aceleaşi principii tehnice: „vas în vas“ cu pereţi multipli izolatori în vid (fig 3). Partea din dop care pătrunde pe gura sau gâtul containerului, este confecţionată din material plastic rigid, care nu opturează ieşirea vaporilor de azot, vapori ce rezultă din fierberea lentă, dar continuă a azotului lichid. Containerele cu care sunt dotate punctele de însămânţări artificiale sunt de capacitate mică, numărul de doze ce pot fi depozitate depinzând de forma de ambalare a materialului seminal (fiolă, paietă, granulă). De regulă, aceste, containere sunt prevăzute cu 6 canistre Fig. 3 Schema interioară a containerului de cilindrice confecţionate din punct (după Gh. Liciu şi O. Roşca, 1998) 1 – dop container; 2 - şanţ prin care trece tija tablă inoxidabilă, aliaj de canistrei; 3 – capac; 4 – lojă; 5 – cămaşă aluminiu sau din material Pentru uşurinţa interioară; 6 – cămaşă externă; 7 – izolaţie şi plastic. vacuum; canistre; 9 – tijă; 10 – limitator manipulării, canistrele sunt prevăzute cu o tijă a cărei canistre. extremitate sub formă de mâner, se sprijină în locaşuri speciale practicate la gura containerului. Autonomia containerelor este dată de timpul scurs din momentul efectuării plinului şi până în momentul când nivelul azotului lichid (cantitatea măsurată în container) nu mai poate asigura conservarea în condiţii bune a materialului seminal depozitat. Autonomia containerului este condiţionată de tipul constructiv, frecvenţa manipulărilor, mod de exploatare şi întreţinere etc şi oscilează între 21 şi 180 de zile. Pentru determinarea ritmului zilnic de evaporare a azotului lichid, periodic se efectuează cotarea azotului lichid din container. Fiecare punct de însămânţări artificiale este dotat cu un container în care se găsesc dozele de material seminal necesar, repartizat conform planului de potrivire a perechilor, aprovizionarea cu azot lichid făcându-se de către Unitatile de Ameliorare si Reproductie in Zootehnie la intervale de timp corespunzătoare gradului de autonomie a containerelor. Congelarea spermei prezintă numeroase avantaje: - testarea reproducătorilor după descendenţi; - exploatarea intensivă a celor mai valoroşi reproducători; - depozitarea şi folosirea spermei pentru un interval mare de timp; - se asigură în permanenţă sperma necesară pentru însămânţarea femelelor, la momentul optim, existând în acest fel posibilitatea formării de linii şi familii cu un potenţial productiv ridicat; 36

-

realizarea unor importante economii, prin folosirea raţională, nelimitată în timp, a spermei congelate, comparativ cu sperma conservată prin refrigerare; - se poate transporta la puncte de însămânţare situate la distanţe mari, fiind nevoie doar de reaprovizionarea periodică cu azot lichid; - se reduc cheltuielile datorate transportului spermei; - se reduce preţul de cost pe doza de material seminal; - permite însămânţarea femelelor la păşune, în taberele de vară şi în zonele greu accesibile mijloacelor de transport; - favorizează schimburile internaţionale de spermă. Primele încercări de conservare a spermei au fost făcute în anul 1949 de Parkes, Smith şi Polge. Stewart (1951) a însămânţat o vacă cu sperma congelată la -79oC şi a obţinut un produs (I. Dumitrescu şi colab.,1978). În anul 1952, Polge şi L.E.A. Rowson au introdus în mediul de diluţie glicerină şi au constatat că această substanţă are rolul de a proteja, la temperaturi foarte scăzute, spermatozoizii. Succesul acestei realizări a fost comunicat de Polge şi colab. în 1952, la al II-lea Congres Internaţional de Reproducţie de la Copenhaga. Schema congelării spermei propusă de Polge şi colab. în anul 1952, astăzi este mult simplificată, fiind păstrate totuşi aceleaşi principii: - congelarea cu un diluant cu glicerol; - scăderea rapidă a temperaturii până la -196oC; - menţinerea spermei congelate la această temperatură (-196oC), până în momentul folosirii; - decongelarea spermei, în vederea inoculării, se face prin imersiunea bruscă a dozei într-o baie la 320C, chiar în momentul întrebuinţării. Până în 1964, metoda congelării spermei nu a suferit decât mici modificări cu privire la compoziţia diluantului, cronologia diferitelor operaţiuni şi viteza de răcire. Erau atunci propuse două soluţii: congelarea în fiole de sticlă de 1-2 ml, congelarea în paiete cu capacitatea de 1,0, 0,5 şi 0,25 ml, ultimul tip de ambalaj fiind propus de R. Cassou. Extrema simplicitate, rapiditate şi rezultatele foarte favorabile oferite de această metodă au condus la introducerea congelării spermei în paiete din material plastic de către numeroase ţări, fiind adoptată congelarea spermei în azot lichid la temperatura de -196oC, mai uşor de obţinut şi mai eficace decât temperatura de -79oC, asigurată de zăpada carbonică, folosită până atunci. În 1964, comunicările lui Nagase şi Niva au repus în discuţie congelarea spermei bazate pe următoarele principii: - folosirea diluanţilor pe bază de glucoză şi fructoză, uşor glicerolaţi (5%); - congelarea spermei diluată într-un raport strâns (1/3-1/4); - congelarea rapidă prin simpla depunere de picături de spermă cu volum redus (0,1-0,2 ml) pe un bloc de gheaţă carbonică (-79oC); - rediluarea în momentul decongelării într-o simplă soluţie fiziologică de diluant. Rolul substanţelor crioprotectoare Prezenţa glicerinei în mediul de diluţie a spermei, creează condiţiile congelării spermei, fără modificări majore, care să afecteze viabilitatea şi capacitatea fecundantă a spermatozoizilor. Prin introducerea glicerinei în diluant, punctul de congelare a spermei coboară de la 0,53oC la -3oC, iar formarea cristalelor de gheaţă are loc la -10oC, comparativ cu 1,7oC în sperma brută. Când începe formarea cristalelor de gheaţă, temperatura tinde către punctul real de congelare, care se menţine până când congelarea devine completă. În acel moment 37

se stabileşte un echilibru între spermă şi agentul de răcire. O proporţie de circa 7% glicerină în lichidul de diluţie, determină coborârea punctului de congelare până la -3oC, iar punctul de formare al cristalelor de gheaţă la -10oC. Când se congelează sperma într-un mediu lichid, cristalizarea începe în acea parte a lichidului care este cea mai apropiată de agentul de răcire şi se continuă în masa lichidului (Dumitrescu I. şi colab., 1978). Când coborârea se face încet, cristalizarea se desfăşoară lent, cristalele care se formează sunt mari, ceea ce antrenează o creştere a concentraţiei în săruri a fracţiunii necristalizate şi provoacă ieşirea unei părţi din apa intracelulară, diminuând astfel formarea gheţii intracelulare. În cazul în care coborârea temperaturii se face într-un ritm rapid, cristalele de gheaţă care se formează sunt mici, rezultând o substanţă destul de omogenă, în care cristalele sunt constituite numai din apă, fapt ce determină o concentraţie de electroliţi crescută, atât intracât şi extracelular. În această situaţie apa intracelulară nu poate ieşi în cantitate suficientă, cristalele de gheaţă se formează în cantitate crescută intracelular, iar aceste cristale îşi vor mări volumul în momentul congelării şi decongelării, fapt care conduce la alterarea structurii spermatozoizilor. La un moment dat, această concentraţie în săruri este atât de ridicată încât lipoproteinele din structura spermatozoidului devin solubile, iar în timpul decongelării permeabilitatea celulară se alterează în aşa măsură încât spermatozoidul moare. Acest efect se evidenţiază în reducerea cu circa 50% a proporţiei de spermatozoizi vii din sperma decongelată, astfel mobilitatea spermatozoizilor se reduce de la 70-80% înainte de congelare, la 30-40% după decongelare. În concluzie, compuşii hidrofili reprezentaţi de diverşi polialcooli, (glicerol), pătrund uşor în celula seminală prin simpla osmoză, întârziind formarea cristalelor de gheaţă, prin coborârea punctului de congelare. Pe de altă parte, glicerina limitează efectele soluţiei, înlocuind o parte din apa intracelulară, atrasă de creşterea presiunii osmotice extracelulare. Alţi compuşi pot avea rol protector faţă de membranele celulare (hidraţii de carbon, polivinil, pirolidon etc). 1.6.1. Conservarea spermei de taur A) Conservarea spermei la temperatura ambiantă (laborator) La temperatura camerei (laboratorului) sperma de taur se poate conserva pentru o perioadă scurtă de timp (3-6 ore) şi pentru o perioadă mai îndelungată (34 zile). Conservarea de scurtă durată se poate face fie sub formă brută, fie sub formă diluată. Sperma brută s-a folosit în perioada de început a introducerii însămânţărilor artificiale şi constă în inocularea imediat după recoltare a spermei, fracţionată în mai multe doze, în condiţii de asepsie. Sperma diluată, păstrată la temperatura camerei, se poate folosi la însămânţare artificială într-un interval de maxim 6-8 ore. Conservarea pentru o perioadă mai îndelungată a fost consemnată sub numele de anabioză acidă (anabiosis = înviere, revenire la viaţă). Diluantul preparat, se barbotează timp de circa 10 minute cu un curent de CO2, în prealabil purificat prin trecerea succesivă printr-o soluţie de bicarbonat de sodiu 15% şi de permanganat de potasiu 3%, până când pH-ul ajunge la 6,2-6,3. Acidifierea mediului se datorează formării acidului carbonic: CO2+H2=H2CO3. Se diluează sperma care se păstrează în ambalaje închise ermetic la temperatura de18-20oC, timp de 3-4 zile. Datorită dezavantajelor pe care le prezintă, această metodă de conservare a spermei nu se mai aplică la taur. 38

B) Conservarea spermei de taur prin refrigerare (2-4oC) Această tehnică a fost folosită în perioada anilor ’50-’70, la taur, cu rezultate satisfăcătoare, nivelul scăzut de temperatură fiind asigurat fie de zăpada hidrică, fie în refrigeratoarele obişnuite. Tennica de conservare a spermei de taur prin refrigerare este suficient de simplă. După efectuarea diluţiei finale, cu ajutorul unei seringi semiautomate, sperma se repartizează, câte 1ml, în fiole cu capacitatea de 1,5-2,0 ml care se închid la flacără oxiacetilenică. Fiolele se grupează pe tije port-fiole, sau în recipiente din material plastic, pe ejaculate, care se introduc la frigider în vederea echilibrării. După 3-4 ore se pot folosi la însămânţarea artificială a femelelor în călduri, iar pentru transport se folosesc fie frigidere tip, auto, fie termosuri zootehnice, în care se găseşte gheaţă hidrică, ce trebuie să înconjoare din toate părţile dozele de spermă. La punctele de însămânţări artificiale, dozele cu spermă se transferă în frigidere. Expedierea dozelor cu material seminal se face împreună cu un buletin şi fişă de utilizare. C) Conservarea spermei de taur prin congelare Cronologic vorbind, congelarea spermei de taur s-a făcut în două variante, după ritmul în care se trece peste punctul crioscopic: lentă şi rapidă. Congelarea lentă s-a făcut la început şi se caracterizează printr-o coborâre lentă a temperaturii spermei, în special de la 35-37oC la -30oC. Fiolele cu spermă se introduc într-o baie de alcool etilic, plasată, la rândul ei, la o temperatură de 2-4oC. În baia de alcool se adăugau la început cantităţi predeterminate de zăpadă carbonică în scopul reducerii temperaturii după un anumit ritm. Astfel, răcirea spermei între 5oC şi -15oC se făcea cu un grad pe minut, iar de la -15oC la -30oC, scăderea temperaturii se făcea cu două grade pe minut. De la -30oC până la -79oC sau -196oC (funcţie de agentul criogen întrebuinţat) trecerea fiolelor cu spermă se făcea brusc. În prezent sunt aparate moderne, numite frizere, care în funcţie de program, asigură un control electronic al ritmului coborârii temperaturii. În momentul de faţă această metodă nu se mai foloseşte datorită dezavantajelor pe care le prezintă. Congelarea rapidă a spermei este folosită în exclusivitate în prezent, fiind răspândită în cvasitotalitatea ţărilor dezvoltate economic şi în curs de dezvoltare. În funcţie de repartizarea în doze, congelarea rapidă se poate face în fiole, paiete şi granule. a) Congelarea spermei în fiole s-a practicat la începutul folosirii spermei congelate de taur şi constituie un procedeu care se mai foloseşte cu rezultate bune. Fiolele sunt fabricate din sticlă neutră, rezistentă la variaţii foarte mari de temperatură, iar pe corpul lor se imprimă datele necesare identificării reproducătorului sau codificării necesare în practica de reproducţie. Volumul util al materialului seminal diluat este de 1 ml, rezervându-se un spaţiu de dilatare a lichidului în timpul congelării. Acest spaţiu are rolul de a evita, după decongelare, pierderea de material seminal prin refulare în momentul introducerii în fiolă a pipetei de însămânţare. Congelarea spermei După diluţia finală a spermei se calculează necesarul de fiole pentru fiecare ejaculat în parte. Cu ajutorul unui dispozitiv automat sau a unei seringi semiautomate, sperma se repartizează, câte 1ml, în fiecare fiolă. Fiolele se închid la flacără oxiacetilenică, apoi se fixează în tije port-fiole, confecţionate din aluminiu, fiecare tijă fiind prevăzută cu câte 6 locaşuri. Tijele se grupează pe ejaculate apoi se introduc într-un refrigerator, în vederea ehilibrării, unde se menţin 3-4 ore, funcţie de specificul fiecărei unităţi producătoare. În acest interval de timp, spermatozoizii se adaptează cu diluantul 39

folosit şi noul nivel de temperatură, iar antibioticele incluse în diluant îşi fac efectul specific. După echilibrare, tijele port-fiole se introduc în plan orizontal, în vapori de azot lichid, care se formează deasupra azotului lichid stocat într-un container cu gura largă. La circa 3 cm sub nivelul azotului se găseşte o sită confecţionată din sârmă cu ochiurile mici sau dintr-un capac prevăzut pe toată suprafaţa cu orificii. Pe acest capac grilant se aşază tijele port-fiole, vaporii de azot lichid având o temperatură de -120oC până la -130oC, unde se menţin 8-10 minute, operaţiunea fiind denumită precongelare. După acest interval de timp, tijele port-fiole, grupate pe ejaculate, se introduc în canistre metalice care se fixeaza in containerele c uazot lichid.. În aceste containere numite de prestocaj, dozele se menţin până a doua zi, când se verifica mobilitatea spermatozoizilor. Dacă mobilitatea este de cel puţin 30%, tijele port-fiole se transferă în containere depozit, cu capacitate de 200-500 l, unde se păstrează, în azot lichid, până în momentul livrării către diverşii beneficiari. In caz contrar, dozele ejaculatului in cauza se arunca. Ambalarea spermei în fiole prezintă trei dezavantaje majore: pot exploda în timpul decongelării, ocupă un spaţiu de depozitare prea mare, necesită o tehnologie de umplere cu o productivitate mai scăzută. Din aceste motive, congelarea spermei în fiole este, în prezent, abandonată în aproape toate ţările. b) Congelarea spermei de taur în paiete A fost elaborată în anul 1965 de către R. Cassou, în Franţa şi constituie una dintre cele mai moderne şi practice forme de ambalare a materialului diluat, care conferă eficacitate şi productivitate sporite. Paieta este confecţionată din clorură de polivinil care nu reacţionează chimic cu mediul de diluţie. Paieta are forma unui tub cilindric şi este confecţionată în două variante: - paieta mijlocie, cu lungimea de 133 mm, diametrul de 2,5-2,8 mm, grosimea paietei de 0,14-0,20 mm şi volumul util de 0,54 ml; - paieta fină, cu lungimea de 133 mm, diametrul de 1,7-2,0 mm şi un volum util de 0,25 ml. Indiferent de tip, paietele au un capăt deschis, iar celălalt astupat cu un dop „uzinal“ constituit din două straturi de bumbac între care s-a pus un strat de pudră polivinilică preparată cu alcool. Lungimea paietelor este aceeaşi (133 mm) şi întrucât în timpul umplerii se lasă o bulă de aer de 10 mm lungime, lungimea coloanei de spermă este de 103 mm. Pudra de alcool polivinilic, în contact cu un lichid polimerizează şi se transformă într-un gel care obturează complet lumenul, ceea ce-i conferă garanţia unei protecţii absolute a spermei congelate faţă de germenii florei banale sau patogene prezente eventual în containerul de depozitare. Pentru imprimarea paietelor se foloseşte o maşină semiauto-mată, prevăzută cu un bloc compostor şi un set de litere şi cifre (foto 9). Imprimarea se face cu cerneală specială, rezistentă la azot lichid şi cu uscare rapidă. Se foloseşte cerneală de diferite culori în funcţie de culoarea paietelor care urmează a fi imprimate, astfel încât, contrastul să fie cât mai evident. Pe fiecare paietă se Foto 9 Maşină semiautomată imprimă datele necesare pentru pentru imprimarea paietelor identificarea exactă a probei de 40

spermă congelată, întocmai ca pentru fiole. După umplere, capătul deschis al paietelor se astupă cu pudră de alcool polivi-nilic (dop de laborator) sau se închide prin sudarea cu ultrasunete. La ambele tipuri de paiete, se asigură o bulă de aer cu o lungime de circa 10 mm, absolut necesară pentru a compensa dilatarea coloanei de material seminal în timpul congelării şi pentru a favoriza omogenizarea coloanei de spermă după decongelare. Tehnica de congelare a spermei în paiete După efectuarea diluţiei spermei, conform raportului final de diluţie, se calculează necesarul de paiete, care se imprimă cu ajutorul maşinii semiautomate. Fracţionarea ejaculatului în doze de însămânţare se face, de regulă, la temperatura de 2-4oC, manual sau automat. • Umplerea manuală a paietelor. Paietele, imprimate şi uscate se prind în brăţări metalice căptuşite cu cauciuc striat, dimensionate să cuprindă exact 15 paiete mijlocii. Sperma este aspirată în paiete cu ajutorul unei pompe de vid cu presiunea coloanei de mercur de 30-50 cm. La cordonul de cauciuc al pompei de vid se racordează un pieptene de aspirare prevăzut cu 15 locuri, corespunzătoare numărului de paiete prinse în brăţară. La pieptenele de aspirare se ataşează brăţara cu paiete, astfel încât, prinderea acestora să se facă cu capătul prevăzut cu dopul uzinal. La partea superioară a pieptenului se găseşte un orificiu de admisie a aerului care se obturează cu degetul atunci când paietele sunt introduse cu capătul deschis în spermă. Umplerea paietelor se face complet, fără a se lăsa bula de aer. După umplere, paietele se scutură energic, ceea ce îndepărtează surplusul de spermă pe o lungime de circa 10 mm. Închiderea paietelor se face prin apăsarea lor cu capătul deschis într-un vas care conţine pudră de alcool polivinilic. Pudra pătrunde pe lumenul paietelor, astupându-l. Apoi, paietele se introduc cu capătul astupat de pudra de alcool polivinilic într-un recipient cu apă distilată, astfel încât pudra polimerizează şi astupă complet şi acest capăt al paietei. În acest fel, coloana de spermă este izolată etanş de mediul exterior, protejând-o de eventualele contaminări. Paietele se desprind din brăţara metalică, se şterg cu un prosop uscat, apoi se aşază pe nişte rame metalice speciale, cu capacitatea de 40-100 de paiete. Stativele cu paietele respective se introduc pentru echilibrare într-un dulap frigorific, la temperatura de Foto 10 Echilibrarea spermei într-o 2-4oC, unde se menţin circa 3-4 ore (foto vitrină frigorifică 10). După echilibrare, ramele cu paiete se introduc în vapori de azot lichid pentru precongelare, unde sunt menţinute 7-8 minute (foto 11). Apoi se adună, se introduc în nişte pahare din material plastic cu dimensiuni corespunzătoare canistrelor, numite goblete, acestea se introduc etajat în canistre, care la rândul lor, se scufundă în azot lichid în containerele de prestocaj (foto 12). Verificarea materialului seminal şi depozitarea paietelor cu spermă se face întocmai ca în cazul fiolelor (foto 13, 14 si 15).

41

Foto 11 Precongelarea spermei în vapori de azot lichid

Foto 12 Containere de prestocaj

Foto 13 Verificarea calităţii materialului Foto 14 Depozitarea dozelor cu sperma seminal din containerele de prestocaj O variantă îmbunătăţită a umplerii manuale a paietelor este reprezentată de umplerea sub clopot de vid. Paietele sunt închise ermetic pri sudare cu ultrasunete la unul din capete. Sunt apoi individualizate cu toate datele necesare. Se calculează strict necesarul de paiete, funcţie de capacitatea acestora şi de volumul total de spermă diluată. Cu capătul deschis, paietele se introduc în paharul cu spermă diluată. La rândul lui, paharul se plasează sub un clopot de vid. Se porneşte pompa de vacuum în vederea scoaterii aerului din paiete, (aspect ce se verifică echinivelmetric cu ajutorul unei paiete introdusă într-un pahar cu lichid colorat). Apoi se dă drumul la aer, care, datorită presiunii împinge sperma în paiete (foto 16). Paietele se închid la capătul liber cu ajutorul pulberii de alcool polivinilic. Următoarele etape ale congelării sunt asemănătoare celor menţionate mai sus. Folosirea acestei metode impune efectuarea unui calcul precis al necesarului de paiete pentru fiecare ejaculat. În caz contrar, fie că paietele nu se umplu, fie că rămâne material seminal neabsorbit în paiete.

Foto 15 Diferite tipuri de containere pentru depozitarea dozelor cu spermă

Foto 16 Umplerea paietelor sub un clopot de vid 42

• Umplerea automată a paietelor se face cu ajutorul unor maşini semiautomate a căror productivitate se situează la un nivel de 4000-13000 paiete pe oră. Paietele imprimate cu toate datele necesare, sunt aşezate pe un rastel adaptat la conveiorul maşinii care transportă paietele până în dreptul orificiilor de umplere. La acest nivel se găsesc nişte ace (1-3) racordate prin tuburi de material plastic, la recipientul cu spermă, iar pe partea opusă există acelaşi număr de ace, mai scurte, racordate la o pompă de vid. După umplere, paietele trec pe rând prin dreptul unui emiţător (Bronson) de ultrasunete, cu acţionare verticală, care închide etanş capătul paietelor. Pentru închiderea paietelor se mai pot folosi bile mici, metalice sau din material plastic care se introduc forţat pe lumenul acestora, închizându-se etanş. Echilibrarea, precongelarea, congelarea, verificarea materialului seminal şi stocarea sunt următoarele etape ale congelării identice celor menţionate la umplerea manuală. Ambalarea spermei în paiete prezintă avantajele: - permite o bună individualizare a dozelor; - se evită contaminarea spermei cu flora microbiană existentă în azotul lichid; - permite folosirea economică a containerului (maxim de doze în minim de spaţiu), aplicabil mai ales în cazul ambalării spermei în paiete fine; - necesită o tehnică de conservare şi inoculare a spermei, simplă. c) Congelarea spermei în granule (pastile) A fost propusă şi experimentată de Nagase şi Niva, în anul 1964 şi reprezintă singura formă concentrată sub care se conservă materialul seminal, în contact direct cu agentul criogen (azotul lichid). Se bazează pe congelarea ultrarapidă a spermei diluate într-un raport de diluţie strâns, în alveolele unui bloc de gheaţă carbonică, rezultând granule de spermă congelate, cu volum de circa 0,1 ml. Sperma se diluează într-un raport de 1/2-1/4, apoi este lăsată să se răcească pe parcursul a 90 de minute la temperatura de 1-3oC. Echilibrarea spermei se face în frigider, timp de 4-5 ore. Materialul seminal diluat se depune, cu ajutorul unei seringi semiautomate, câte 0,1ml, în alveolele practicate în nişte blocuri de zăpadă carbonică, la temperatura de -79oC. Placa de zăpadă carbonică se acoperă cu vată sterilă şi se lasă circa 7 minute, timp necesar congelării.. La expirarea timpului de congelare, granulele sunt scuturate de pe placa de zăpadă carbonică (sunt suflate cu un curent de aer) şi colectate într-un recipient cu azot lichid. Granulele care provin de la acelaşi reproducător, se ambalează împreună în recipienţi din material plastic, pe care sunt trecute toate datele necesare identificării, apoi se aşază suprapus, pe o tijă care se suspendă în azot lichid. Se depozitează numai granulele provenite din probe care după decongelare prezintă cel puţin 30% mobilitate şi conţin cel puţin 10 milioane de spermatozoizi vii cu mişcări rectilinii/doză. Recipienţii au o capacitate de 50-100 de granule. Acest procedeu de ambalare a materialului seminal are şi unele dezavantaje legate de imposibilitatea individualizării sigure a granulelor şi a existenţei riscului de contaminare cu agenţi microbieni proveniţi din azotul lichid în timpul conservării.

43

1.6.2. Conservarea spermei de berbec şi ţap La ovine şi caprine se poate folosi cu bune rezultate pentru însămânţare sperma brută fracţionată în mai multe doze (circa 10/ejaculat). În acest caz, însămânţarea femelelor trebuie să se facă imediat după colectarea spermei care nu se mai diluează. Metoda dă bune rezultate în ceea ce priveşte procentul de fecunditate al femelelor însămânţate. Sperma de berbec se conservă sub formă lichidă sau solidă, asemănător spermei de taur, însă rezultatele obţinute, prin însămânţarea femelelor cu spermă congelată, sunt mult mai slabe decât la taurine. Conservarea spermei sub formă lichidă este destul de răspândită, rezultatele obţinute fiind bune. Temperatura de conservare a spermei diluate este de +15oC (Baril şi colab.,1993) sau la 2-4oC. În cazul conservării spermei la aceste niveluri de temperatură, sperma diluată se repartizează în fiole (1 ml), în flacoane sau în paiete. Pe timpul efectuării controlului şi diluării spermei, coborârea temperaturii trebuie să se facă progresiv între +32oC şi +15oC, deoarece spermatozoizii sunt foarte sensibili la şocul termic, motiv pentru care trebuie evitate fluctuaţiile rapide ale nivelului de temperatură. Conservarea şi transportul materialului seminal ambalat în fiole şi flacoane se fac ca la taur, iar distribuirea la fiecare punct de însămânţare se face la interval de două zile. Sperma conservată în stare lichidă poate fi ambalată şi în paiete. După omogenizarea spermei diluate, umplerea paietelor se face fie manual, fie semiautomat (dacă numărul de doze este mare), fie prin simpla aspirare bucală prin traversul dopului uzinal care permite trecerea aerului. Inchiderea paietelor se face ca la taur. Dozele se păstrează la termostat reglat fie la +15oC, fie la 2-4oC. În cazul conservării spermei la temperatura de +15oC, sperma trebuie să fie inoculată la intervalul a maximum 8-10 ore de la recoltare. Congelarea spermei de berbec până în prezent nu a dat rezultate mulţumitoare, datorită faptului că nivelul de fecunditate este mai scăzut cu 20% faţă de folosirea spermei brute, numărul de spermatozoizi necesari este foarte mare, iar tehnica procesului de congelare este costisitoare şi complicat. După diluţia finală a spermei, calculându-se un nivel de 4% glicerină, temperatura se reduce progresiv până la 4oC, temperatură la care condiţionarea se face în paiete şi practic începe procesul de congelare a spermei. Imediat după recoltare, se face diluţia iniţială în raport de 1/1 la temperatura de 28-30oC, care apoi se plasează în partea de jos a unui refrigerator (6oC). După 30 de minute, temperatura spermei scade până la 13-15oC şi după circa două ore ajunge la +6oC. În acest stadiu, sperma se scoate din vasul cu apă şi se plasează direct în refrigerator sau camera frigorifică, apoi la +4oC se adaugă diluantul cu glicerină, astfel încât, în final, concentraţia acesteia să fie de 4% (G. Baril şi colab., 1993). Repartizarea spermei în paiete mijlocii (0,5 ml) se poate face manual, semiautomat sau chiar prin simpla aspirare bucală. După închiderea paietelor şi echilibrarea spermei, congelarea se poate realiza fie folosind o maşină automată, fie menţinând paietele circa 8 minute la 20 cm deasupra nivelului azotului lichid, în vaporii acestuia (-75oC) apoi prin imersarea directă în azot lichid. Congelarea spermei în pastile s-a dezvoltat în Australia printr-un procedeu asemănător congelării spermei de taur. După diluţia finală a spermei, se coboară temperatura acesteia până la un nivel de +4oC (asemănător celor mai sus precizate), apoi, picături de 0,1-0,2 ml de spermă la +4oC sunt depuse direct în 44

alveolele practicate pe blocul de zăpadă carbonică (-79oC). După 3-4 minute, pastilele sunt colectate, introduse într-un recipient de plastic şi apoi se scufundă direct în azot lichid. La caprine, existenţa enzimelor în plasma seminală, care acţionează asupra fosfolipidelor din diluant, cu liberarea de compuşi toxici pentru spermatozoizi, antrenează etape diferite de conservare a spermei, comparativ cu ovinele. La ţap, este recomandat de a se separa plasma seminală cât mai repede posibil după recoltare. Pentru folosirea spermei proaspete, diluţia directă a ejaculatului într-un diluant pe bază de lapte ecremat de vacă este posibilă, însă se interzice prezenţa gălbenuşului de ou în mediul de diluţie. Dacă diluantul conţine gălbenuş de ou este absolut necesar să se facă spălarea spermei înainte de diluţie. „Spălarea“ spermei de ţap se face prin folosirea unei soluţii Krebs-Ringer-Fosfate (soluţie de spălare) care conţine glucoză, apoi se centrifughează amestecul pentru a elimina plasma seminală. Sunt posibile două spălări succesive. Reducerea temperaturii se face astfel: după recoltare, paharul colector se plasează într-o baie-marie la 28-30oC, imediat adăugându-se soluţia de spălare; centrifugare 15 minute, eliminarea supernatantului, adăugarea celei de-a doua soluţii de spălare şi iarăşi centrifugare timp de 15 minute. În cazul conservării spermei sub formă lichidă, după circa 35-40 de minute de la recoltare, urmată de cele două spălări, se face diluţia finală la 20oC. Se omogenizează, apoi paharul cu spermă se introduce într-un vas plin cu apă (20oC) în refrigerator (+6oC). După circa 65 de minute, sperma se condiţionează în paiete ca şi sperma de berbec, însă trebuie să fie întrebuinţată în primele 8 ore de la recoltare, ceea ce limitează conservarea spermei de ţap prin refrigerare la 13-15oC. În cazul congelării spermei de ţap, după a doua spălare şi două ore de la recoltare se adaugă prima parte a diluantului glicerol (+4oC), după 10 minute se adaugă a doua parte a diluantului glicerol, iar după alte 10 minute se adaugă şi a treia parte a diluantului glicerol tot la temperatura de +4oC. După 30 de minute, sperma se condiţionează în paiete de 0,25 ml, se precongelează în vapori de azot (ca şi sperma de berbec) şi apoi se congelează în azot lichid (-196oC). Sperma de ţap se poate conserva şi în pastile, întocmai ca sperma de berbec.

1.6.3. Conservarea spermei de vier Sperma de vier are unele particularităţi, în raport cu cea a rumegătoarelor: volum mare, concentraţie scăzută în spermatozoizi, sensibilitate crescută la schimbările de temperatură, plasma seminală bogată în electroliţi, ceea ce îngreunează posibilităţile tehnice de conservare (Feredean şi colab., 1964). Dacă sperma corespunde calitativ, imediat după recoltare se diluează, la temperatura de 33-35oC, în raport de 1/1 şi în condiţii de izotermie. Se păstrează la 18-20oC, 15-20 de minute pentru echilibrare. La diluarea spermei de vier, gradul de diluţie variază în limite mai restrânse decât la rumegătoare, 1/2-1/8. Sperma de vier diluată, se ambalează în recipiente de sticlă sau de material plastic, cu capacitatea de 80-100 ml. Dacă sperma se foloseşte imediat după diluare, aceasta se repartizează direct în recipientul adaptat cateterului de însămânţare. Dacă sperma diluată se conservă mai multe zile, ambalarea se poate face pentru cantitatea totală (în sticle cu pereţi dubli) sau în doze a câte 100 ml, direct în recipiente de material plastic. În practica însămânţărilor artificiale la porcine, metodele de conservare a spermei sunt: 45

-

conservarea la temperatura de 15-20oC; conservarea în medii uşor acide; conservarea la temperatura de 4-5oC; conservarea prin congelare.

A) Conservarea spermei la temperatura camerei (15-20oC) Sperma de vier, diluată şi ambalată se poate păstra una-două zile dacă temperatura de păstrare este constantă, conţine substanţe saline, energetice şi antibiotice. Ritmul de coborâre a temperaturii spermei diluate va fi lent, fără variaţii bruşte, atingerea temperaturii de conservare trebuind să se realizeze în 90120 de minute. La această temperatură sperma se păstrează până în momentul inoculării, când trebuie reîncălzită până la o temperatură apropiată de cea a corpului (37-40oC) (Feredean T. şi colab., 1961). Conservarea spermei la temperatura de 15-20oC timp de 48 de ore, asigură un nivel de fecunditate al scroafelor însămânţate de circa 75% (Feredean T., 1977) Conservarea spermei în medii uşor acide se bazează pe crearea anabiozei acide. Diluantul folosit conţine bicarbonat de sodiu la care se adaugă bioxid de carbon, cu rol în acidifierea mediului, prin formarea acidului carbonic. Această metodă a fost adoptată pentru conservarea spermei de vier de către du Mesnill, du Buisson şi Dauzier în anul 1959. Reactivarea spermatozoizilor se face prin simpla încălzire a spermei ce urmează a fi folosită sau prin adăugarea unei substanţe chimice alcaline, ambele condiţii regăsindu-se în uterul scroafei. Diluarea se realizează la temperatura de 31-33oC, în final adăugându-se circa două-trei volume de diluant la un volum de spermă, astfel încât să se obţină 3-4 miliarde de spermatozoizi într-o doză de 40-50 ml. Sperma diluată se barbotează cu un curent de CO2, timp de 10 minute, până când pH-ul coboară la 6,2-6,4. Din recipientul în care s-a făcut barbotarea spermei diluate, aceasta se repartizează în fiole de sticlă de circa 50 ml, care se închid la flacără oxiacetilenică şi se păstrează la o temperatură constantă de 15oC. În momentul folosirii, fiecare doză se diluează din nou cu acelaşi diluant ţinut la 30oC, până la un volum final de 100 ml şi apoi se foloseşte la însămânţarea scroafelor în călduri. Conservaţi astfel, spermatozoizii îşi prezervă capacitatea fecundantă timp de 4-5 zile. Totuşi, datorită laboriozităţii metodei şi a promovării în prezent a altor procedee de conservare a spermei nu se mai practică sau se aplică în mod cu totul sporadic. B) Conservarea spermei de vier la temperatura de 4-5oC La noi în ţară, din anii ’90, pe lângă diluantul salin de tip „SEMTEST“ Baloteşti folosit pentru conservarea spermei timp de 48 de ore la temperatura de 15-20oC, se mai utilizează, cu rezultate bune, un mediu de diluţie propus de Institutul de Biologie şi Nutriţie Animală Baloteşti, pe bază de gălbenuş de ou. În cazul folosirii acestor medii de diluţie, sperma diluată poate fi folosită la însămânţarea artificială a scroafelor timp de 4-5 zile de la data diluţiei, cu condiţia ca sperma să fie păstrată la frigider (+4oC). Înainte de însămânţare, dozele de spermă se încălzesc până la temperatura de 37oC. C) Conservarea spermei de vier prin congelare Congelarea spermei de vier a preocupat cercetătorii în ultimele patru decenii, însă numai din anii ’70 aceste cercetări s-au amplificat. Primele rezultate obţinute cu spermă congelată, după însămânţarea transcervicală sunt ale lui Crabo şi Grinarsson, în 1971, care au folosit ca lichid pentru decongelare plasma seminală de vier (Dumitrescu I. şi colab., 1978). Crioconservarea spermei are drept consecinţă un anumit grad de distrugere a biomembranelor spermatozoizilor, prin trecerea în plasmă a lipidelor, albuminelor, fermenţilor, grupelor sulfhidrice, 46

afectarea echilibrului ionic etc (Nauk B.A., 1991). Gradul de stabilitate a spermei animalelor domestice la temperaturi foarte scăzute este dependent, în mare măsură, de comportarea albuminelor. Conţinutul în aminază a membranelor plasmatice ale spermatozoizilor de vier este mai scăzut comparativ cu spermatozoizii rumegătoarelor. Experienţele au demonstrat faptul că substanţele albuminice şi complexele acestora sunt mai stabile la temperaturi scăzute decât lipidele. Spermatozoizii de vier conţin mai multe fosfolipide comparativ cu spermatozoizii rumegătoarelor. Experienţele întreprinse au evidenţiat faptul că la temperaturi ultrascăzute creşte procesul de oxidare peroxidică a lipidelor din spermatozoizi. În ceea ce priveşte participarea glicerinei în mediul de diluţie, cele mai bune rezultate, referitoare la nivelul fecundităţii scroafelor însămânţate, s-au obţinut atunci când concentraţia crioprotectorului în spermă a fost de circa 2-3%. O altă problemă care reduce răspândirea însămânţărilor artificiale cu spermă congelată constă în randamentul slab al acestei metode, supravieţuirea spermatozoizilor se situează, în medie, între 30% şi 40%, ceea ce înseamnă că dintr-un ejaculat nu se pot face mai mult de 3-4 însămânţări. De asemenea, prolificitatea scroafelor însămânţate cu spermă congelată este mai scăzută. Crioconservarea spermei de vier se practică în mai multe variante, neconcentrată sau concentrată, fie sub formă de granule, fie sub formă de paiete mari cu volum de 2,0-2,5 ml etc. Fiecare centru de recoltare, examinare şi prelucrare îşi are propria metodă de congelare, însă trebuie să precizăm faptul că, datorită dezavantajelor menţionate, la care se adaugă şi laboriozitatea accentuată a tehnologiei de congelare a spermei, crioconservarea spermei de vier nu dă întodeauna rezultate bune şi de aceea nu cunoaşte o răspândire largă. Dintre metodele folosite în prezent, menţionăm pe cea care este răspândită în unele centre de însămânţări artificiale din SUA, Canada, Anglia, Germania, unde se congelează spermă de vier în scopuri comerciale (Dumitrescu I. şi colab.,1978). Se foloseşte un diluant constituit din TES, TRIS, glucoză şi gălbenuş de ou (20%), preparat cu 24 de ore înainte de folosire şi menţinut la frigider. Înainte de folosire, diluantul se centrifughează, iar supernatantul se foloseşte ca diluant, fiind împărţit în două părţi egale: o parte este folosită la temperatura camerei pentru prima diluţie, după ce i s-a adăugat 2% glicerină, iar a doua parte se menţine la frigider pentru a se realiza cea de a doua diluţie. Mediul în care se face decongelarea este constituit din glucoză, citrat trisodic, bicarbonat de sodiu, sare disodică de EDTA, clorură de potasiu. Sperma, după recoltare şi examinarea calitativă, este lăsată să se răcească 2-3 ore la temperatura laboratorului, timp în care se adaugă antibioticele necesare. Sperma se transferă în fiole de centrifugă, apoi se centrifughează 10 minute la 1500 rotaţii /minut până când sperma se separă de plasma seminală. Supernatantul este eliminat apoi se adaugă în eprubete o cantitate mică de diluant fără glicerină, la 200C. Spermatozoizii sedimentaţi sunt amestecaţi uşor cu o baghetă de sticlă şi sperma în suspensie se transferă într-un cilindru gradat de 100 ml. Se adaugă din nou o cantitate de diluant fără glicerină, în aşa fel încât să se ajungă la jumătate din volumul final. Cilindrul gradat cu spermă diluată se plasează într-un vas de 250 ml care conţine circa 50 ml de mediu lichid la 20oC şi amândouă se introduc la frigider timp de două ore, astfel încât temperatura amestecului de spermă să scadă la 8oC. Se face a doua diluţie cu diluant ce conţine 2% glicerină, adăugându-se diluantul până ce se ajunge la volumul final, diluţia făcându-se în condiţii de izotermie.

47

Sperma se depune în excavaţiile practicate în blocul de zăpadă carbonică, formându-se pastile de 0,1-0,2 ml fiecare. După 3-5 minute, pastilele din spermă se colectează într-o pâlnie cu azot lichid, se apreciază calitatea spermei şi dacă mobilitatea spermatozoizilor este de minimum 20% pastilele se transferă în eprubete (150/16 mm) marcate cu datele necesare identificării vierului, apoi fiolele se trec într-un container cu azot lichid. Fiecare fiolă conţine 10 pastile cu spermă. La noi în ţară, un colectiv de specialişti de la SEMTEST Baloteşti, a folosit congelarea spermei de vier în paiete din plastic cu capacitatea de 2,5 ml, cu 2,5 miliarde de spermatozoizi/paietă, care s-a precongelat în vapori de azot lichid. În ţara noastră încă nu este elaborată o tehnologie specifică de lucru care să garanteze o fecunditate corespunzătoare a femelelor însămânţate. 1.6.4. Conservarea spermei de armăsar La armăsar, sperma se recoltează la interval de două zile, se examinează şi cea care corespunde calitativ se diluează imediat la +32oC, astfel încât să se asigure o concentraţie de 20X106 spermatozoizi/ml, doza fiind formată din 20 ml, ceea ce înseamnă că se asigură circa 400 de milioane de spermatozoizi mobili/doză. Cele mai eficiente antibiotice folosite sunt penicilina şi gentamicina. Dintr-un ejaculat pot rezulta în medie 30 de doze. Scăderea temperaturii trebuie să se facă treptat. Astfel, sperma diluată la +32oC se menţine 20-30 de minute la temperatura laboratorului şi apoi dozele cu spermă se introduc la frigider. Sperma este distribuită în fiole sau cel mai frecvent în tuburi cu volum de 20 ml. Fiolele sau tuburile se închid ermetic şi se menţin la frigider, capacitatea fecundantă fiind asigurată doar pe un interval de 24 de ore (conservarea prin refrigerare). Conservarea spermei prin congelare Oricare ar fi mediul de diluţie, se constată o mortalitate ridicată a spermatozoizilor la congelare, dar şi o reducere a capacităţii fecundante a spermatozoizilor mobili (Palmer E. şi colab., 1984). Rezistenţa spermatozoizilor la congelare variază mult cu particularităţile individuale ale armăsarilor. Cel mai ridicat procent de supravieţuire a spermatozoizilor la congelare s-a observat la armăsarii care dau o spermă concentrată şi cu volum redus. Congelarea spermei se realizează prin diluare şi scăderea temperaturii. Sperma diluată pentru congelare se ambalează în tuburi metalice sau din material plastic, păstrate în azot lichid. Tuburile metalice sunt confecţionate din aluminiu, au o lungime de 12 cm, diametrul de 2,5 cm, închise ermetic. Mediul de diluţie preconizat de Busch şi colab.,1982 are următoarea compoziţie: apă bidistilată 10 ml, glucoză 11 g, EDTA (sare de etilen-diamintetraacetil- bisodic) 100 mg, hidrocarbonat de sodiu (soluţie apoasă 2%) 0,2 ml, soluţie de citrat de sodiu 0,25 ml, gălbenuş de ou 2 ml, glicerină 3,5 ml, 500000 U.I. penicilină şi 0,5 µg streptomicină. Sperma este lăsată să sedimenteze, iar fracţiunea bogată în spermatozoizi menţinută în baia-marie la 32oC, se amestecă cu diluantul menţinut la aceeaşi temperatură. Sperma se păstrează la temperatura camerei timp de 30 minute, apoi se introduce în tuburile de aluminiu cu o capacitate de 20 ml. După umplere, tuburile se închid ermetic, se ţin la frigider (24o) două ore pentru echilibrare. Sperma se diluează la această temperatură în raport de 1/3-1/4. Tuburile se introduc în vapori de azot lichid (precongelare) la temperatura de -120oC, unde se menţin 3-6 minute, apoi sunt scufundate direct în azot lichid (-196oC). 48

a) Congelarea spermei în tuburi de material plastic Martin şi Klug (1979) au folosit tuburi cu o capacitate de 4 ml. Diluarea se face în doi timpi: în prima etapă se face diluţia în raport de 1/1, la temperatura de 30-32oC, apoi amestecul se centrifughează 5 minute (1000 rotaţii/minut). Supernatantul se înlătură, apoi sperma rămasă se amestecă cu un alt diluant la temperatura de 2-4oC, urmează echilibrarea 3-4 ore la acest nivel de temperatură, apoi sperma se repartizează în tuburi din material plastic care se închid şi la celălalt capăt cu pudră de alcool polivinilic sau prin alt procedeu. Congelarea se face în acelaşi fel ca pentru tuburile de aluminiu. b) Congelarea spermei în granule (pastile) nu a dat rezultate satisfăcătoare până în prezent, fecunditatea iepelor însămânţate cu spermă congelată în granule oscilând între limite foarte largi (11-60%, Oshida şi colab., 1966; Knoop, 1976), fapt ce a dus la aplicarea din ce în ce mai redusă a acestui procedeu. Tehnologia prevede diluţia şi centrifugarea spermei, înlăturarea supernatantului, iar sperma rămasă se repartizează în alveole practicate pe un bloc de zăpadă carbonică şi apoi introducerea în tuburi şi scufundarea în azot lichid unde se păstrează. 1.6.5. Conservarea spermei de păsări Sperma diluată îşi poate menţine capacitatea fecundantă circa 24 de ore dacă temperatura de păstrare se situează la un nivel de 12-15oC, la cocoş şi curcan, cu condiţia ca oxigenarea spermei să fie menţinută tot timpul păstrării. Congelarea spermei la păsări întâmpină unele dificultăţi: - degradarea membranei spermatozoizilor cauzată de apariţia de microcristale şi deshidratarea care intervine în momentul congelării spermei; - fenomene de toxicitate datorate creşterii concentraţiei intracelulare a soluţiilor. Sperma se diluează în raport de 1/1, se răceşte progresiv până la 4oC când se adaugă restul cantităţii de diluant care conţine substanţă crioprotectoare (glicerol, DMSO-dimetil sulfat oxid, dimetil acetamid 4%). Congelarea propriu-zisă se face în azot lichid, sperma fiind ambalată în fiole, paiete sau pastile. Cele mai bune rezultate s-au obţinut cu sperma conservată în paiete. Stocajul are loc în azot lichid. Lake, respectând aceste condiţii, a obţinut o fecunditate de 93%, însă a efectuat 4 însămânţări artificiale în 10 zile, ceea ce a totalizat 1,2 miliarde de spermatozoizi, cam de 6-10 ori mai mult decât atunci când se foloseşte sperma brută. Rezultatele lui Sexton, care a folosit DMSO se situează la un nivel mai scăzut (40-60%), cu variaţii mari de la un mascul la altul. 1.7. Inocularea spermei Constituie ultima etapă în biotehnologia însămânţărilor artificiale şi constă în depunerea materialului seminal, în prealabil recoltat, examinat, prelucrat şi conservat sau brut, pe traiectul căilor genitale ale femelelor în estru. Inocularea prin mijloace artificiale trebuie să ţină seama de particularităţile fiziologice ale locului de depunere a spermei prin montă, sperma urmând a fi depusă cel puţin la nivelul segmentului genital femel unde este depusă fiziologic. Prin însămânţare artificială se întrebuinţează numai sperma care a corespuns unor parametri minimi de calitate şi care provine de la reproducători valoroşi. 49

Funcţie de locul unde se depune, inocularea poate fi: - vaginală, care se aplică la mioare şi viţele; - cervicală, aplicabilă la oi si vaci; - uterină, practicată la iapă şi scroafă; - tubară, se aplică la păsări. 1.7.1. Inocularea spermei la vacă Indiferent de forma de proprietate a efectivelor de taurine, însămânţarea artificială presupune existenţa unei scheme organizatorice adecvate, structura organizatoricăsi atributiile institutiilor fiind prezentate în primul capitol. 1.7.1.1 Punctul de însămânţări artificiale la vaci (P.I.A.V.) Punctul de însămânţare artificială a vacilor este subunitatea-verigă a întregii reţele de reproducţie a animalelor, prin a cărei activitate se concretizează întregul proces de reproducţie la taurine din sectorul de stat, asociativ sau individual. Punctul de însămânţare artificială a vacilor este amenajat la nivelul fiecărei comune sau ferme de vaci, este încadrat cu un tehnician sau operator însămânţător căruia îi revin sarcinile pe linia reproducţiei şi selecţiei efectivelor de animale arondate punctului de însămânţări artificiale. În condiţiile extinderii iniţiativei particulare în creşterea şi exploatarea efectivelor de taurine, funcţionează şi operatori însămânţători, autorizaţi de instituţiile abilitate în acest sens, care să efectueaza pe cont propriu acţiunile de însămânţare a animalelor. De regulă, punctul de însămânţare artificială este amplasat într-un adăpost al fermei sau pe lângă circumscripţiile sanitar-veterinare, fiind dotat cu instrumentarul si aparatura necesare aplicarii insamantarii artificiale. Aprovizionarea cu material seminal congelat la nivelul punctelor de însămânţare artificială se face prin serviciul specializat la nivelul UARZ sau a Centrelor de Reproducţie şi Selecţie a Animalelor. 1.7.1.2. Descoperirea femelelor în călduri şi stabilirea momentului optim al însămânţării Identificarea femelelor în călduri constituie o acţiune importantă pentru succesul însămânţării artificiale. Modificarile morfofiziologice ale segmentelor aparatului genital si de comportament au fost descrise in cadrul disciplinei de “Reproductie”, capitolul “Ciclul sexual”. Semnul concludent al stării de estru se consideră atunci când femela respectivă acceptă, fără tendinţa de a fugi, saltul altor femele sau masculi cu care stă împreună, acest moment considerându-se a fi optim pentru însămânţarea artificială. Vulva, vestibulul vaginal şi vaginul sunt congestionate, labiile vulvare sunt edemaţiate, dispar pliurile vulvare, clitorisul se evidenţiază. Printre labiile vulvare se scurge un mucus translucid, filant, care poate să se întindă de la comisura inferioară a vulvei până la pământ. La mijlocul perioadei de estru, cantitatea de mucus creşte şi are o elasticitate maximă, ceea ce constituie alt semn specific de călduri (fig. 4). Descoperirea vacilor în călduri trebuie să se facă cu mult profesionalism pentru a se evita pierderile de cicluri, care se pot ridica la 20-30%. Depistarea trebuie 50

Fig. 4 Perioada optimă pentru însămânţarea artificială a vacilor

să se facă de două ori pe zi , dimineaţa şi seara.În complexele de vaci, depistarea căldurilor ridică unele probleme nu numai datorită efectivului mare de animale care trebuie urmărite zilnic, dar şi datorită semnelor clinice, deseori mai şterse. Pentru creşterea eficienţei în descoperirea vacilor în călduri se pot folosi în astfel de unităţi, masculi biostimulatori (epididimotomizaţi, deferotomizaţi sau cu deviere de penis).În acest caz se consideră suficient un taur biostimulator pentru 100-200 de vaci.În majoritatea cazurilor, descoperirea femelelor în călduri se face numai pe baza modificărilor morfo-fiziologice şi de comportament din stadiul de estru. De asemenea, în alegerea momentului optim al însămânţării, este necesar să se urmărească cu atenţie evoluţia perioadei puerperale, astfel încât să se prevină îmbolnăvirile, care sunt frecvente în această etapă, iar puerperiumul să se desfăşoare fiziologic. Majoritatea autorilor recomandă ca însămânţarea artificială să se facă cel mai devreme între 45-50 de zile de la fătare, în funcţie de modul cum decurge perioada puerperală, de nivelul producţiei de lapte etc, ştiut fiind că femelele care dau o producţie mare de lapte se însămânţează prima dată după un interval de cel puţin 60 de zile de la parturiţie. Însămânţarea vacilor descoperite în estru trebuie să se facă imediat după depistarea căldurilor şi apoi să se repete după 8-10 ore, având în vedere durata estrului, momentul ovulaţiei, viabilitatea gameţilor pe traiectul căilor genitale femele.

51

1.7.1.3. Pregătirea femelelor pentru însămânţare Constă în notarea de către operatorul însămânţător a numărului matricol, grajdul şi lotul din care fac parte vacile ce urmează a fi însămânţate. Identitatea femelei este căutată în registru, cu care ocazie este analizată şi interpretată starea ginecologică a femelei. Cu această ocazie se înscrie însămânţarea în registru şi se face şi programarea urmăririi peste 18-23 de zile a eventualei reintrări a femelei în călduri. Pregătirea instrumentarului pentru însămânţare ţine seama de tehnica de însămânţare folosită şi de modul în care este ambalat materialul seminal (refrigerat, congelat în paiete, fiole sau granule). În cazul în care se practică metoda colposcopică de însămânţare, speculul va fi sterilizat prin fierbere, timp de 10-15 minute, se verifică funcţionarea sursei de lumină, se asigură lubrifierea cu vaselină neutră. Pentru însămânţare, speculul vaginal se încălzeşte până la aproximativ 45-50oC, apoi se lubrifiază cu vaselină neutră. Se pregăteşte pipeta de însămânţare si registrul de însămânţare, apă caldă, o soluţie aseptizantă, mănuşile de plastic, etc. În instituţia în care se practică însămânţarea tactil-recto-cervicală (rectovaginală) se pregătesc evidenţele, soluţiile şi substanţele aseptizante, îmbrăcămintea de lucru şi mănuşile de plastic pentru exploraţie.În funcţie de materialul seminal folosit, se va pregăti o pipetă din sticlă sau din material plastic, un pistolet Cassau sau o pipetă universală de tip „SEMTEST“. 1.7.1.4. Reanimarea spermatozoizilor Presupune scoaterea dozei de însămânţare din cutia care se găseşte în termosul cu gheaţă şi lăsarea ei la temperatura camerei timp de câteva minute, într-un stativ de lemn pregătit special în acest scop (în cazul în care se foloseşte sperma conservată prin refrigerare). În cazul folosirii spermei conservate prin congelare se recomandă: - decongelarea cât mai rapidă a dozei cu material seminal; - între decongelare şi însămânţare curba de temperatură a spermei să fie în continuă creştere; - un interval de timp între decongelare şi însămânţare cât mai scurt (maximum 15 minute); - instrumentarul folosit pentru însămânţare să aibă aceeaşi temperatură ca sperma; - canistrele din containere să nu fie ridicate la o înălţime mai mare de 3-4 cm sub nivelul superior al containerului. Extragerea dozei trebuie făcută foarte rapid, prin intermediul unei pense. Indiferent de prelucrarea iniţială a spermei congelate şi forma sub care se găseşte, pentru decongelare este nevoie de un termos cu o baie marină de 36-40oC şi un termometru. În funcţie de modul de prezentare a spermei congelate, pentru reanimarea spermatozoizilor este necesar parcurgerea unor etape de lucru specifice. În cazul conservării spermei în fiole, se parcurg etapele: - pregătirea băii marine la 38oC; - deschiderea containerului, ridicarea canistrei până la gâtul containerului, extragerea fiolei, cufundarea ei în baia marină; - decongelarea materialului din fiole durează 2 minute; - ştergerea şi uscarea fiolei; 52

- deschiderea fiolei prin secţionarea gâtului acesteia; - aspirarea spermei în pipetă; - nu se decongelează în acelaşi timp mai multe fiole, iar absorbţia materialului seminal decongelat se face cu instrumentarul încălzit. În cazul conservării spermei în paiete se au în vedere următoarele etape de lucru: - pregătirea băii marine la temperatura de 34-37oC; - deschiderea containerului, ridicarea canistrei până la cel mult 3-4 cm sub nivelul superior al containerului, scoaterea paietei, scuturarea ei de eventualele resturi de azot şi cufundarea în baia marină; decongelarea durează 13 secunde pentru paieta mijlocie şi 8 secunde pentru paieta fină; - reaşezarea canistrei şi închiderea containerului; - încălzirea, prin frecare cu hârtie sau vată, a pipetei sau pistoletului de însămânţare; - scoaterea paietei din baie, uscarea ei prin ştergere cu tifon sau prosop; - transferarea bulei de aer către capătul astupat cu dopul de laborator prin lovirea uşoară a corpului paietei; - introducerea paietei în pistoletul sau pipeta de însămânţare; - tăierea capătului paietei cu o secţiune perpendiculară pe axul longitudinal, la mijlocul bulei de aer. Se recomandă să nu se decongeleze mai multe paiete în acelaşi timp. În cazul conservării spermei în granule se parcurg etapele: -pregătirea băii marine la temperatura de 38-40oC; aşezarea pe stative, în baia marină a unor fiole goale deschise cu o capacitate de 2,0-2,5 ml, asemănătoare celor folosite la ambalarea materialului seminal refrigerat; -introducerea în fiecare fiolă a câte 1,0 ml soluţie de citrat de sodiu 2,9% sterilă (soluţie extender) în care se decongelează granulele; atât fiolele cu soluţia extender, cât şi fiolele goale trebuie să fie introduse în baia marină la jumătatea înălţimilor; -deschiderea containerului, ridicarea canistrei până la gâtul containerului; ridicarea ambalajului cu granule până la nivelul de unde se extrage cu pensa dopul de pânză-tifon (granulele se găsesc tot timpul sub nivelul azotului din container); -răcirea vârfului pensei sau tijei linguriţă, timp de 10-15 secunde, în azot lichid; extragerea cu ajutorul pensei răcite a unei singure granule şi plasarea rapidă a acesteia în fiola cu soluţie-extender; -agitarea uşoară a fiolei pentru omogenizarea spermei cu diluantul. 1.7.1.5. Tehnica inoculării spermei Inocularea materialului seminal se realizează prin două metode: metoda colposcopică (sau cu speculul vaginal); metoda tactil-recto-cervicală (sau recto-vaginală). Metoda colposcopică Inocularea materialului seminal prin această metodă se bazează pe introducerea pipetei de însămânţare pe lumenul cervical, prin conductul vestibulovaginal tunelizat cu ajutorul unui specul bivalv, trivalv sau tubar. Unele modele de specul tubar sunt prevăzute cu surse propri de lumină. La celelalte modele, pentru 53

iluminarea conductului vaginal şi a zonei pericervicale se întrebuinţează o lampă frontală sau lanternă. La inocularea spermei prin această metodă se va proceda astfel: - vaca în călduri se contenţionează într-un stand şi se execută toaleta organelor genitale externe cu apă şi săpun; - speculul vaginal, dezinfectat, încălzit şi lubrifiat cu vaselină neutră sterilizată, se introduce cu partea lăţită în fanta vulvară. Introducerea se face din jos în sus, într-un unghi de aproximativ 35-40oC, prin mişcări uşoare şi repetate în plan vertical, asociat cu împingerea prudentă către înainte. După introducerea completă a speculului, se efectuează o rotire de 90oC (pentru speculul trivalv) după care se îndepărtează valvele; - se luminează conductul vestibulo-vaginal cu ajutorul lămpii frontale sau a sursei proprii de lumină; - se examinează conductul vestibulo-vaginal, floarea involtă şi se localizează deschiderea cervicală, după care se introduce pipeta de însămânţare în conductul cervical; - depunerea spermei se face în partea anterioară a cervixului prin presarea între degete a suzetei sau prin apăsarea tijei piston urmată de un uşor masaj clitoridian. Avantaje: - posibilitatea examinării mucoasei vestibulo-vaginale şi cervicale şi buna observare a caracteristicilor mucusului cervical; - permite localizarea cu uşurinţă a cervixului; permite depistarea unor eventuale anomalii sau afecţiuni ale vaginului şi cervixului; - este mai estetică şi mai comodă pentru operator. Dezavantaje: - necesită contenţionarea femelelor într-un stand special pentru însămânţare; - impune dezinfecţia speculului pentru a se evita transmiterea germenilor patogeni de la un animal la altul; - prin aplicarea acestei metode nu se obţin informaţii privind starea uterului şi a ovarelor, stadiul de evoluţie al foliculilor ovarieni etc; - introducerea speculului cu brutalitate crează reflexe de inhibiţie sau poate stresa animalul. Datorită acestor dezavantaje, această metodă este mai puţin folosită în prezent. Metoda tactil-recto-cervicală (recto vaginală) Impropriu denumită şi bimanuală, această metodă este aproape generalizată în practica însămânţărilor artificiale la taurine. Această metodă, sigură şi eficace, permite executarea însămânţării la animalele legate la iesle, în grajd, în adăposturi cu stabulaţie liberă sau în padocuri. Se deosebeşte de metoda colposcopică prin aceea că depunerea materialului seminal în organele genitale femele se realizează numai cu ajutorul pipetei (pistoletului) de însămânţare, fără a folosi speculul vaginal. Metoda tactil-recto-cervicală necesită însă o pregătire corespunzătoare a personalului autorizat să efectueze însămânţarea, care trebuie să cunoască topografia şi modificările morfofiziologice ale organelor genitale. Persoanele neinstruite în acest scop pot cauza, prin manipulări brutale, rupturi, lezionări sau perforări ale conductului genital, iar datorită necunoaşterii topografiei organelor

54

genitale, materialul seminal poate fi depus într-un fald al mucoasei vaginale sau pericervicale, ratându-se în acest fel însămânţarea. Inoculara materialului seminal prin această metodă necesită efectuarea următoarelor operaţiuni: - vidarea rectului, cu un uşor masaj pentru eliminarea contracţiilor rectale, operaţiuni care se efectuează cu mâna protejată de o mănuşă de polietilenă; - se apreciază forma, topografia, dimensiunile, sensibilitatea şi consistenţa coarnelor şi corpului uterin; - se îndepărtează labiile vulvare şi se deschide vestibulul vaginal prin compresiunea exercitată prin traversul rectului; - se introduce pipeta printre labiile vulvare sub un unghi de 30-40oC în conductul vaginal; - se urmăreşte, cu mâna introdusă în rect, mişcarea de înaintare a pipetei până la nivelul orificiului vaginal al cervixului, pentru a se preveni introducerea vârfului pipetei într-un fald al mucoasei vaginale; - dacă uterul este normal, se continuă înaintarea pipetei prin cervix, după ce anterior, a fost localizată deschiderea acestuia cu ajutorul degetului mic de la mâna introdusă în rect; - se fixează cervixul, urmărind cu degetele trecerea vârfului pipetei până ce pătrunde în corpul uterin pe o distanţă de 2-3 cm; - materialul seminal se depune la extremitatea anterioară a cervixului şi în corpul uterin prin compresarea suzetei între degete sau împingerea tijei-piston; - inocularea spermei prin această metodă se încheie prin efectuarea unui uşor masaj clitoridian pentru a se preveni spasmul uterin şi a facilita descărcările hormonale necesare ascensiunii spermatozoizilor pe traiectul căilor genitale femele (foto. 17). În unele cazuri se poate practica însămânţarea tactilcervicală, care constă în introducerea unei mâini protejate de o mănuşă în conductul Foto 17 Inocularea spermei la vacă vestibulo - vaginal, reperarea prin metoda tactil recto cervicală cervixului, iar cu cealaltă mână se introduce cu precauţie, pipeta de însămânţare până la nivelul orificiului cervical. 1.7.2. Inocularea spermei la oaie şi capră 1.7.2.1.Organizarea punctului de însămânţare artificială la ovine (P.I.A.O.) Organizarea şi desfăşurarea acţiunii de însămânţare artificială la ovine şi caprine se realizează sub coordonarea şi îndrumarea Direcţiilor Judeţene de Ameliorare şi Reproducţie şi a Centrelor teritoriale de profil, care asigură dotarea şi funcţionarea laboratorului de recoltare, prelucrare şi difuzare a materialului seminal şi a punctelor de însămânţare artificială. (P.I.A.O. şi P.I.A.C.). Punctele de însămânţări artificiale sunt amplasate astfel încât efectivele de oi pe care le 55

deservesc să nu se deplaseze la păşunat pe o rază mai mare de 1,0-1,5 Km. De altfel, acţiunea de însămânţare artificială se pregăteşte temeinic cu cel puţin 1,52,0 luni de zile înainte de a fi declanşată campania şi se va desfăşura pe durata a cel puţin două-trei cicluri de călduri (45-50 de zile). În ţara noastră, este răspândită însămânţarea artificială cu spermă brută sau diluată, motiv pentru care, în aceeaşi unitate trebuie să se găsescă, pe lângă efectivul de femele şi efectivul de berbeci pepinieri, donatori de material seminal pentru efectuarea însămânţării oilor. Berbecii folosiţi la însămânţări artificiale sunt aleşi dintre: - cei proveniţi din import, cu certificat de origine şi productivitate; - cei testaţi ca amelioratori aparţinând raselor importate şi indigene zonate, precum şi exemplarele cu performanţe proprii superioare din efectivul valoros, apreciate la bonitare. Perioada de pregătire a berbecilor pepinieri durează circa şase săptămâni şi constă în asigurarea unei raţii de hrană adecvate cerinţelor nutritive pentru reproducţie, aprecierea comportamentului sexual şi a calităţii spermei. Se asigura câte un reproducător adult pentru 100 de femele în cazul însămânţării cu spermă brută şi 300 de femele în cazul folosirii spermei diluate şi conservată prin refrigerare. Pregătirea oilor şi caprelor pentru campania de însămânţări artificiale constă în asigurarea unei furajări stimulative şi diferenţiate, în funcţie cu starea lor de întreţinere.Înţărcarea oilor şi caprelor mulgătoare se practică cu circa o lună înaintea declanşării campaniei de însămânţări artificiale prin întreruperea treptată a mulsului. Se verifică şi individualizarea femelelor, acolo unde este cazul completându-se crotaliile pierdute. Pe baza examenului individual, zootehnic şi sanitar-veterinar, se constituie loturile (turmele) pentru însămânţarea artificială, avându-se în vedere rasa, vârsta, starea de întreţinere. Mărimea unei turme trebuie să fie de 300-400 oi. Cu circa o lună înaintea campaniei de însămânţări artificiale, oile şi caprele vor fi întreţinute pe păşuni bune, raţia de bază fiind suplimentată cu nutreţuri concentrate, aşa-numitul „flushing“ care influenţează pozitiv nivelul indicilor de reproducţie. Efectivul mediu deservit de un P.I.A.O. este de 1000-1200 de femele, cu durata acţiunii pe perioada a 50-60 de zile. Pentru o bună activitate, P.I.A.O. sau P.I.A.C. trebuie să dispună de următoarele spaţii şi utilităţi: o cameră pentru laborator, un spaţiu pentru recoltarea spermei şi însămânţarea artificială a femelelor descoperite în călduri, padocuri pentru berbeci încercători, oile depistate în călduri, oile însămânţate artificial, berbecii pepinieri şi ţarcurile în care se face depistarea oilor şi caprelor în călduri. Laboratorul va fi dotat cu un minim necesar de aparatură pentru examenul prelucrarea şi refrigerarea spermei. Camera de recoltare-însămânţare este dotată cu: un stand pentru contenţia oilor ce urmează a fi însămânţate, cu dimensiuni şi tipuri constructive adaptate acestei specii, vaginuri artificiale, autoclave pentru sterilizarea aparaturii folosite, speculum vaginal, sursă de lumină, materiale consumabile necesare. 1.7.2.2. Depistarea oilor şi caprelor în călduri Depistarea oilor în călduri constituie o activitate destul de complicată în aplicarea biotehnologiei însămânţărilor artificiale. 56

Dificultăţile sunt datorate faptului că oile trăiesc în cârduri mari, în care sunt greu de urmărit individual. Semnele de estru sunt greu observabile pentru om, comparativ cu semnele mult mai evidente manifestate la taurine şi cabaline. Izolarea oilor în călduri şi recunoaşterea lor pentru însămânţare artificială necesită un mare volum de muncă, dereglări ale activităţii curente din fermă, fapt ce a îngreunat, în multe ţări, extinderea însămânţărilor artificiale la această specie. Însămânţarea artificială se bazează pe descoperirea oilor în călduri prin intermediul berbecilor încercători. Berbecii şi ţapii încercători trebuie să aparţină aceleiaşi rase cu femelele care urmează a fi însămânţate. Aceştia sunt autorizaţi şi verificaţi sub raportul calităţii materialului seminal pentru a putea fi folosiţi şi la monta, după încheierea campaniei de însămânţări artificiale, oilor care nu au rămas gestante şi manifestă estrul în afara intervalului de timp alocat aşa-numitei campanii de însămânţări artificiale. Alegerea oilor şi caprelor în călduri se face de două ori/zi, dimineaţa şi seara, perioade din zi când manifestarea căldurilor este mai intensă, iar berbecii şi ţapii sunt mai activi în căutarea femelelor. Încercătorul este un mascul cu reflexe sexuale bine exprimate, care este introdus printre oile care urmează a fi însămânţate, însă este împiedicat să efectueze depunerea spermatozoizilor pe traiectul căilor genitale femele. Se consideră că femela este în călduri şi este reţinută pentru însămânţare artificială, atunci când acceptă saltul berbecului sau ţapului, stând liniştită. Se folosesc trei feluri de berbeci încercători şi anume: - berbeci normali, însă echipaţi cu un şorţ care acoperă furoul, împiedicând pătrunderea penisului în vaginul oilor pe care execută saltul (fig. 5); - berbeci cu penis deviat, la care, printro intervenţie chirurgicală, s-a schimbat direcţia penisului spre partea laterală a corpului, astfel încât, să nu mai pătrundă în conductul vestibulovaginal; aceştia s-au dovedit a fi mai puţin eficienţi, deoarece imposibilitatea ejaculării le conferă un anumit grad de nervozitate şI o mai slabă eficienţă a descoperirii oilor în călduri; Fig. 5 Berbec încercător prevăzut cu şort - berbeci vasectomizaţi, la care, tot chirurgical, s-a secţionat epididimul sau canalul deferent, blocându-se astfel eliminarea spermatozoizilor din testicul, încât pot monta, sperma fiind lipsită de spermatozoizi. Pentru a asigura o rată optimă de depistare a oilor în călduri, încărcătura medie va fi de 30-40 de femele pentru un mascul.În vederea unei descoperiri cu un volum mai redus de muncă, berbecul încercător se echipează, în zona pectorală, cu un cartuş marcator special ce conţine o vopsea lavabilă, cartuş, care, în momentul saltului, vine în contact cu crupa femelei, iar la coborâre vopseşte lâna.În lipsa cartuşului, oile depistate în călduri vor fi marcate cu „ovisemn“ de către personalul muncitor. Femela se consideră în călduri atunci când la apropierea berbecului sau ţapului ia poziţie campată, urinează des şi întoarce capul spre flanc, se imobilizează când masculul face saltul şi „caută berbecul sau ţapul“. Pentru descoperirea oilor in calduri, acestea se introduc in padoc impreuna cu berbecii incercatori, modul de identificare fiind prezentat anterior. După ce berbecii încercători nu mai sunt activi în descoperirea oilor în călduri, se retrag din cârd, se închid separat şi oile pornesc la păşunat. 57

Oile alese în călduri sunt ţinute într-un lot separat până sunt însămânţate, inclusiv până se repetă însămânţarea. Un mijloc mai modern pentru provocarea şi evidenţierea estrului este reprezentat de sincronizarea căldurilor prin diverse procedee prin intermediul cărora se poate determina inducerea căldurilor la un moment prestabilit (vezi capitolul „Sincronizarea estrului“). Aceasta înseamnă că însămânţarea artificială se poate face, la oile supuse tratamentului de sincronizare, fără a se mai efectua alegerea celor în călduri.În funcţie de tratamentul de sincronizare aplicat, însămânţarea tuturor oilor sincronizate, se face după un anumit interval de timp, de la încheierea tratamentului, strict prestabilit, cu rezultate satisfăcătoare. 1.7.2.3. Inocularea materialului seminal Inocularea spermei brute, diluată şi consevată prin refrigerare sau congelare, se face prin trei metode: - colposcopică (specul vaginal); - vaginală (pericervicală, fără specul); - tactil cervicală. Lucrările pregătitoare se referă la pregătirea aparaturii de inoculare, inclusiv sterilizarea instrumentarului necesar, pregătirea locului de lucru. Contenţia oilor se poate realiza într-un stand cu orientare rabatabilă ce permite ridicarea trenului posterior al oii şi la parapet sau gard, fixarea oii făcându-se cu/pe genunchiul unui îngrijitor. Mai răspândit este standul orizontal, aşezat la sol iar pentru mai multă comoditate, operatorul se poate aşeza într-un şanţ practicat în spatele standului de contenţie. Pentru inoculare avem nevoie de o seringă, alcătuită dintr-un corp metalic, piston şi canulă din sticlă, pistonul fiind prevăzut cu un cursor cu ajutorul căruia se reglează volumul dozei. Se mai folosesc şi alte pipete de însămânţare, cu canula schimbabilă, semiautomată, cu o singură încărcătură putându-se însămânţa 20-30 de oi.În cazul folosirii paietelor cu material seminal congelat, după decongelarea acestora, paietele se introduc în pistoletul special construit, asemănător celui folosit pentru taurine. Aparatura auxiliară constă dintr-un specul vaginal, tri- sau bivalv şi o sursă de lumină. Însămânţarea oilor se face imediat după descoperirea în călduri şi se repetă la interval de 7-12 ore. Metoda colposcopică După pregătirea instrumentarului, femela în călduri se introduce în camera de însămânţare şi se contenţionează în stand. Se efectuează toaleta regiunii perişi vulvare şi se aspiră spermă în seringă. Speculul, sterilizat si încălzit la temperatura de 38-39oC, se lubrifiază cu vaselină neutră, se introduce în conductul vestibulo vaginal cu lăţimea pe direcţia fantei vulvare. După introducerea cu atenţie, speculul se roteşte cu 90o, se deschide şi se reperează orificiul cervica Fig. 6 Inocularea spermei la oaie (fig. 6). prin metoda colposcopică 58

În cazul folosirii spermei diluate, doza de însămânţare este de 0,2 ml, iar când se face însămânţarea cu spermă brută, doza este de 0,1 ml pentru oi şi capre şi de 0,2 ml pentru mioare. Numărul de spermatozoizi mobili/doză trebuie să oscileze între 200-250 de milioane. Femelele depistate în călduri se însămânţează imediat cu repetare la 8-12 ore. Femelele cu cicluri prelungite (două-trei zile) se însămânţează în fiecare zi, pe toată durata căldurilor. Metoda vaginală (pericervicală, fără specul) constă în următoarea tehnică: -contenţia femelei se face în standul cu orientare rabatabilă sau prin simpla prindere a femelei de către personalul ajutător şi ridicarea trenului posterior; - toaleta regiunii vulvare şi perivulvare; -introducerea pipetei de însămânţare intravaginal şi prin mişcări de tunelizare, rotire şi înaintare până la nivelul orificiului cervical, sperma depunându-se pericervical (fig. 7). Metoda tactil-cervicală, în Fig. 7 Inocularea spermei la oaie care dirijarea canulei seringii de prin metoda vaginală inoculare spre orificiul cervical se face cu ajutorul degetului arătător al operatorului, femela fiind ridicată de trenul posterior. Când se face însămânţarea artificială cu spermă brută, se foloseşte sperma cu mobilitate de cel puţin 70%, cu un volum minim al ejaculatului de 0,6 ml şi o concentraţie de peste un miliard de spermatozoizi/ml. Însămânţarea artificială cu material seminal congelat se practică foarte puţin la aceste specii, întrucât rezultatele obţinute sunt slabe. Pentru însămânţarea artificială a oilor cu material seminal congelat, în prealabil trebuie să se facă decongelarea, după aceeaşi tehnică descrisă la taurine şi apoi să se inoculeze.Înainte de însămânţare se face controlul mobilităţii spermei, care trebuie să fie de minim 35%. Tehnica de inoculare a spermei decongelate este identică cu cea aplicată la însămânţarea artificială cu spermă brută sau cu spermă refrigerată. O paietă conţine 0,5 ml spermă, respectiv două doze de însămânţare, o fiolă conţine circa 1 ml spermă (4-6 doze) iar o granulă 0,1 ml (o doză). 1.7.3. Inocularea spermei la scroafă 1.7.3.1. Organizarea şi dotarea punctului de însămânţare artificială (P.I.A.S.) cu activitate complexă Optimizarea procesului de reproducţie la porcine prin însămânţare artificială presupune următoarea structură organizatorică: - centrul de recoltare, prelucrare, conservare şi difuzare a spermei, organizat în cadrul Centrului de Reproducţie şi Selecţie a Animalelor, atunci când femelele sunt dispersate pe o zonă mai extinsă, ceea ce necesită transportul dozelor de spermă până la proprietarul scroafelor; 59

- punctul de însămânţare artificială cu activitate complexă: recoltare, prelucrare şi însămânţare artificială, în complexele de creşterea suinelor, în unităţi şi ferme familiale cu un efectiv de 300-400 de scroafe şi scrofiţe de reproducţie. În ambele cazuri trebuie să existe spaţii şi utilităţi necesare unei bune activităţi: - compartimente comune pentru vierii tineri, candidaţi pepinieri şi cu boxe individuale pentru vierii folosiţi la reproducţie (pepinieri); - sala de recoltare, prevăzută cu una sau mai multe boxe de recoltare, instalaţii cu duşuri de mână cu apă caldă, pentru toaleta generală şi locală a vierilor; - laboratorul, dotat cu minim de aparatură şi instrumentar, necesare pentru operaţiunea de recoltare, examenul, prelucrarea, ambalarea şi conservarea spermei; - compartimente comune pentru scroafele în aşteptare şi individuale pentru cele care trebuie însămânţate şi însămânţate recent (două-trei săptămâni după însămânţare). Sperma recoltată se examinează în laborator, se diluează, repartizează în doze (100 ml) şi se conservă la temperatura de 15oC sau la 4-5oC. Sperma brută proaspătă, diluată sau diluată-refrigerată, se distribuie beneficiarilor, fiind transportată în termosuri zootehnice, care menţin o temperatură constantă până la beneficiar (15oC sau 4-5oC). 1.7.3.2. Descoperirea scroafelor în călduri Depistarea femelelor în estru se face pe baza semnelor clinice, a manifestării reflexului de imobilitate în prezenţa vierului încercător sau la apăsarea pe spate de către om şi prin mijloace electronice bazate pe modificarea caracteristicilor secreţiilor vestibulo-vaginale (pH-ul şi rezistenţa electrică a mucoasei vestibulo-vaginale). Metoda cea mai simplă şi cu bune rezultate constă în prezentarea zilnică a femelelor cu modificări ale organelor genitale externe şi de comportament, vierului încercător.În cazul în care scroafa acceptă saltul vierului, este sigur în perioada de estru. Dacă acceptă acest salt de la prima încercare, momentul declanşării estrului se stabileşte prin media intervalului scurs de la controlul anterior. Dacă acceptă saltul vierului după a doua sau a treia încercare, debutul estrului corespunde acestui moment. Cele mai bune rezultate se obţin atunci când sunt deplasate scroafele (5-10) în boxa vierului şi nu invers. În absenţa vierului încercător, starea de estru se poate stabili pe baza modificărilor de comportament ale scroafelor (nelinişte, grohăituri caracteristice, poftă de mâncare capricioasă etc.) şi ale organelor genitale externe (edemaţierea şi congestia vulvei). Un indiciu sigur al stării de estru este reprezentat de reflexul de imobilitate al scroafei la presiunea exercitată de îngrijitor în regiunea lombo-sacrală sau a flancurilor, o proporţie însemnată (20-30%) nemanifestând, totuşi, starea de imobilitate în absenţa vierului. 1.7.3.3. Stabilirea momentului optim de însămânţare Însămânţarea scroafelor trebuie să se facă în momentul cel mai prielnic, încât spermatozoizii să ajungă la locul fecundaţiei înaintea descinderii ovocitelor în urma dehiscenţei foliculilor maturi. Cum ovulaţia la scroafă are loc, în medie, 60

între 36 şi 44 de ore de la debutul estrului, evidenţiat prin apariţia reflexului de imobilitate la saltul vierului, însămânţarea cea mai eficace se consideră că trebuie făcută după un interval de 20-24 de ore de la manifestarea reflexului de imobilitate. Acest aspect presupune ca acţiunea de descoperire a scroafelor în călduri să se desfăşoare cel puţin de două ori/zi, dimineaţa şi seara. Repetarea însămânţării se face cu scopul de a prinde ovulaţiile şi la scroafele cu o durată mai mare a estrului. Când se fac două însămânţări într-un ciclu de călduri, cel mai bine este ca prima inoculare să se facă la 15-20 de ore de la depistare, iar a doua la interval de 10-12 ore de la prima.În cazul depistărilor făcute de două ori/zi (aşa cum se practică cel mai frecvent) scroafele la care s-a stabilit starea de estru dimineaţa, se însămânţează în seara aceleiaşi zile, iar scroafele care au fost depistate seara, prima însămânţare se face în dimineaţa zilei următoare. Repetarea însămânţării se face, aşa cum am menţionat mai sus, după 8-12 ore de la prima. Dacă se face o singură depistare/zi (dimineaţa), prima însămânţare artificială se face imediat după stabilirea reflexului de imobilitate pentru vier şi se repetă după alte 24 de ore de la prima însămânţare (Feredean T.,1978). A treia însămânţare artificială nu se recomandă decât în cazul scroafelor cu călduri prelungite până la 45 zile precum şi pentru scroafele la care s-a constatat refularea spermei inoculată în însămânţările anterioare. Scroafele cu estru prelungit (superestru) se recunosc prin prelungirea peste limita fiziologică a modificărilor organelor genitale externe şi de comportament specifice stării estrale, cât şi prin prezenţa reflexului de imobilitate la vier.În asemenea cazuri, a treia însămânţare artificială se poate face la interval de 10-12 ore de la a doua inoculare a spermei. 1.7.3.4. Aparatura şi instrumentarul folosite pentru însămânţarea artificială a scroafelor Acestea sunt relativ simple. La noi în ţară, în marea practică, se foloseşte instrumentar confecţionat din material plastic compus dintr-un rezervor cu capacitate de 100 de ml si un racord flexibil, care face legătura cu un cateter (sondă) semirigid, lung de 35-40 cm, prevăzut cu o olivă, sau un adaptor tirbuşonat la extremitatea care se introduce în lumenul cervical. Acest tip de cateter poate fi substituit cu unul confecţionat din cauciuc, cu vârful tirbuşonat refolosibil după sterilizare (fig.8). Rezultate bune se obţin şi cu instrumentarul de provenienţă japoneză, compus dintr-o seringă de sticlă cu o garnitură metalică şi cu piston din cauciuc semirigid cu capacitate de 80 ml. La seringi se ataşează un cateter de cauciuc (40cm lungime, 0,7-1,0 cm diametru). Tija Fig. 8 Instrumentar pentru însămânţarea cateterului este confecţionată dintrun cauciuc semirigid, prevăzută la scroafelor (după O. Roşca, 1994) vârf cu o porţiune mult mai elastică. 61

1.7.3.5. Inocularea spermei Pentru însămânţarea artificială a scroafelor nu este necesar ca acestea să fie contenţionate, mai ales pentru prima inoculare, care, de regulă, corespunde cu reflexul de imobilitate .În unităţile cu flux tehnologic industrial, după depistare, scroafele sunt menţinute în boxe individuale, unde se însămânţează şi rămân până la un eventual ciclu de călduri (21 de zile). În cazul în care se foloseşte sperma brută, după examinarea mobilităţii spermatozoizilor, se repartizează (prin simpla aspirare) în recipientele din material plastic, într-un volum de 50 ml, iar recipientul, printr-un tub de legătură din material plastic se adaptează la un cateter. Când se foloseşte sperma diluată, după diluţie este aspirată în recipientele din material plastic, sau în cazul seringilor, aspirată cu ajutorul acestora. Recipientul cu spermă se păstrează o perioadă scurtă de timp, într-un termos sau într-o etuvă reglată la 35-37oC. Pentru fiecare scroafă, se foloseşte sperma dintr-un recipient, care se scoate din termos sau etuvă numai în momentul inoculării.În cazul folosirii spermei diluate şi conservate la temperatura de 15oC sau la 4-5oC, dozele cu material seminal se reîncălzesc la 35-37oC şi se menţin în termos sau în vas cu apă caldă până în momentul inoculării. Operaţiunea se face cu puţin timp înainte de inoculare, iar dozele se extrag din termos numai în momentul însămânţării. Se execută toaleta vulvei şi a regiunii perivulvare cu un tampon de vată îmbibat într-o soluţie dezinfectantă, cateterul se lubrifiază cu vaselină neutră şi se introduce în conductul vestibulo-vaginal, uşor orientat în sus, pentru a nu fi introdus în meatul urinar (fig. 9). Când vârful cateterului ajunge la nivelul cervixului, se roteşte uşor spre stânga în vederea fixării cât mai bine în conductul cervical (mai ales cateterele tirbuşonate). Recipientul cu spermă se adaptează la cateter, prin intermediul tubului de plastic, apoi se presează uşor pereţii acestuia, sincronizat cu timpii de relaxare a Fig. 9 Schema inoculării spermei la musculaturii cervicale, eliminarea scroafă (după O. Roşca, 1994) întregii doze de spermă durând unudouă minute. Doza de material seminal este de 100 ml spermă diluată sau de 50 ml spermă brută şi un număr de 3-5 miliarde de spermatozoizi/doză. În cazul folosirii spermei conservate prin congelare, dozele cu spermă trebuie decongelate la o temperatură de 37-40oC, asemănător dozelor cu spermă de la rumegătoare, apoi se inoculează ca atare sau completate cu un diluant înainte sau imediat după inoculare, funcţie de recomandările care însoţesc dozele de spermă congelate (paiete, tuburi, granule). 1.7.4. Inocularea spermei la iapă Sperma de armăsar poate fi inoculată sub formă brută (imediat după recoltare), diluată, proaspata sau conservată prin refrigerare sau congelare. Decongelarea tuburilor de spermă se face prin scoaterea lor din container şi trecerea într-o baie-marie, la temperatura de 40oC, timp de 45-50 de secunde. 62

După deschiderea tubului la unul din capete, se introduce vârful canulei sau sondei în tub şi se aspiră sperma, care se inoculează într-un interval de timp cât mai scurt. Decongelarea granulelor se face prin introducerea lor într-un diluant, menţinut la temperatura de 40oC. După diluare, se aspiră sperma într-o seringă specială de însămânţare şi se depune pe traiectul căilor genitale ale iepelor în călduri. Instrumentarul pentru inoculare este constituit din sonde, confecţionate din material plastic şi conectate la seringi sau recipienţi din material plastic. Se mai pot folosi diverse pipete din sticlă, lungi de 50cm şi cu un diametru de 4cm, catetere sau canule din cauciuc. Ca instrumentar ajutător este necesar un specul vaginal şi o sursă de lumin Inocularea spermei la iapă ridică probleme legate de momentul inoculării în perioada de călduri, moment care se stabileşte cu multă greutate în practică. Există numeroase oscilaţii ale duratei ciclului sexual la iapă, funcţie de rasă, climă, tehnologie de creştere, exploatare, alimentaţie, zooigienă etc. Iapa în călduri adoptă frecvent poziţia campată (specifică montei), urinează puţin şi des, deschide şi închide succesiv vulva, cu proiectarea clitorisului în afară, este neliniştită, foarte sensibilă, uneori devenind retivă. În herghelii, depistarea iepelor în călduri se face prin intermediul armăsarilor încercători la bara sau peretele de încercare. Aici, se aduce armăsarul şi dacă iapa este în călduri, va manifesta comportamentul sexual menţionat şi nu va încerca lovirea armăsarului. Măsurile de protecţie a muncii şi a armăsarului impun obligatoriu verificarea iepelor în călduri la bara sau peretele de încercare, altfel, iapa poate lovi armăsarul cu membrele posterioare, provocând leziuni grave sau chiar fracturi ale membrelor care impun sacrificarea animalelor. Iapa care urmează a fi însămânţată, se contenţionează cu ajutorul platlonjelor şi iavaşalei sau se introduce într-un stand special (travaliu). Inocularea materialului seminal presupune introducerea extremităţii libere a sondei cateterului sau pipetei prin canalul cervical până la nivelul cavităţii uterine unde urmează a fi depusă. Inocularea spermei se face prin două metode: colposcopică sau cu speculul vaginal; manuală sau tactil cervicală. Metoda colposcopică pentru depunerea spermei la nivelul cavităţii uterine a iepei în călduri, necesită folosirea canulei sau cateterului adaptat la seringă, speculum vaginal, sursă de lumină. În prealabil, se face toaleta vulvei şi a regiunii perivulvare cu ajutorul unui tampon de vată sau tifon îmbibat în soluţie dezinfectantă. Operatorul însămânţător depărtează pereţii vaginului cu ajutorul specului vaginal şi apoi intruduce cateterul sau vârful sondei printre valvele speculului vaginal, prin canalul cervical, 10-12 cm şi apoi se depune sperma. Metoda manuală (tactil-cervicală) presupune dirijarea vârfului sondei sau canulei în canalul cervical, cu ajutorul mâinii introdusă în vagin, mâna fiind protejată de o mănuşă din material plastic şi lubrifiată cu vaselină neutră. După reperarea orificiului vaginal al cervixului, vârful sondei este dirijat în lungul degetului arătător, pe o lungime de 10-12 cm prin canalul cervical în cavitatea uterină. Prin apăsarea recipientului cu spermă sau pe pistonul seringii, sperma se depune în uter. Prin aplicarea acestei metode există riscul infectării mucoaselor vaginale şi cervicale cu flora microbiană introdusă în timpul explorării vaginale. Doza de material seminal brut conţine minim 0,5 miliarde spermatozoizi mobili iar volumul spermei brute este de 20 ml, iar a celei diluate 40-50 ml. Inocularea spermei se face imediat ce iapa a fost depistată în călduri cu repetare din două în două zile până la încheierea perioadei estrale, având în vedere 63

că durata medie a estrului este de 4-5 zile cu variaţii cuprinse între 4 şi 9 zile.Întro perioadă estrală, de regulă se fac două-trei însămânţări, la intervalul de timp menţionat. Sperma proaspătă ca şi cea conservată prin refrigerare se admite pentru însămânţare artificială numai atunci când are o mobilitate minimă de 60%, iar sperma congelată, o mobilitate minimă de 35-40%. Având în vedere scopul creşterii cabalinelor, mai ales pentru curse, în unele ţări, însămânţarea artificială la această specie este interzisă, fiind acceptată numai în cazul experienţelor întreprinse în centrele de cercetare (Franţa). 1.7.5. Inocularea spermei la păsări Inocularea spermei se face cu scop de cercetare, selecţie, ameliorare şi practic. Păsările pot fi însămânţate artificial numai în perioada de ouat, în afara acesteia, cloaca şi oviductul neputând fi exteriorizate. La găini şi curci, însămânţările artificiale pot fi utilizate singure sau combinate cu împerecherea naturală. Organizatoric, activitatea de însămânţare artificială la găini, parcurge trei etape (Sauveur B. şi colab., 1988). Etapa I-a constă în recoltarea, condiţionarea şi inocularea spermei. Etapa a II-a necesită mai multe mii de femele şi efectivul de masculi necesar însămânţărilor artificiale. Prin aceasta se urmăreşte intrarea într-un anumit program şi ritm de muncă suficient de rapid pentru a însămânţa 250-300 de femele/oră/persoană, ceea ce presupune o bună organizare a muncii. Etapa a III-a se referă la extinderea însămânţărilor artificiale la o scară mai mare cu asigurarea unui ridicat nivel de fecunditate şi permanentizarea personalului care deja s-a specializat în efectuarea însămânţărilor artificiale. Dacă se practică însămânţarea cu spermă brută, aceasta se păstrează în tubul, fiola colectoare iar atunci când se diluează, soluţia cea mai simplă este cea de a recolta sperma direct în fiolele care conţin cantitatea necesară de diluant. Inocularea spermei presupune folosirea unei aparaturi extrem de simple, formată în principiu, dintr-o seringă din material plastic, cu capacitatea de 1 ml, divizată în 100 de părţi, la care se ataşează o canulă din material plastic, cu o lungime de 6-8 cm.Însămânţarea artificială poate fi executată şi cu ajutorul unei seringi gradate, tip insulină şi echipată cu o canulă adecvată, sau sperma poate fi ambalată în paiete din material plastic care conţin între 10 şi 50 de doze. Cantitatea de spermă brută care se inoculează este de 0,05-0,1 ml la găini şi de 0,03 ml la curci. Se mai foloseşte şi inocularea cu material seminal diluat şi congelat, aşa cum s-a specificat la diluarea şi conservarea spermei. Timpul optim de însămânţare la păsări se referă la perioada sau chiar ora din zi, în funcţie de ovulaţie şi formarea oului pe traiectul oviductului. Cele mai bune rezultate la curcă se obţin în cazul însămânţării efectuate în a doua parte a zilei (orele11-17). La raţe, în schimb, cele mai bune rezultate s-au obţinut în urma însămânţării efectuate între orele 9-11 dimineaţa (Besulin, 1974; Davtian şi colab., 1974 citat de I. Dumitrescu şi colab.). Printre factorii care influenţează rezultatele inoculării spermei la păsări, cei legaţi de organismul femelei au o importanţă deosebită, în specificul activităţii zilnice şi rolul complex al căilor genitale la păsări. Rezerva de spermatozoizi în oviductul găinii este utilă pentru aproximativ o săptămână.

64

Tehnica inoculării spermei La găini, inocularea spermei necesită aportul a două persoane: una contenţionează, iar cealaltă efectuează însămânţarea propriu-zisă. Găina este prinsă cu mâna stângă de fluiere şi ridicată la nivelul pieptului. Cu mâna dreaptă se răsfrânge coada pe spate şi prin apropierea păsării de pieptul operatorului, coapsele găinii presează abdomenul şi provoacă deschiderea cloacei. Cu degetul mare al mâinii drepte se facilitează deschiderea oviductului pe partea stângă a cloacei (G. Bâltan şi colab., 1969). După evidenţierea oviductului, operatorul însămânţător introduce canula de la seringa de însămânţare pe o adâncime de 2-3 cm şi inoculează întreaga cantitate de spermă, după care presiunea asupra abdomenului încetează. Evidenţierea oviductului se mai poate realiza şi prin contenţia găinii sub braţul stâng şi apăsând abdomenul păsării spre cloacă. Presarea se face până la ieşirea oviductului afară sub forma unui deget de mănuşă întors spre vârf. Cel de al doilea operator execută însămânţarea la 1-3 cm de deschiderea oviductului (M. Pop, 1963). Pentru găinile crescute în baterii, îngrijitorul prinde pasărea de picioare şi o contenţionează cu partea posterioară spre deschiderea cuştii sprijinind pieptul acesteia spre marginea bateriei. Cu mâna stângă îndoaie uşor coada pe spate. Operatorul însămânţător apasă cu mâna la baza cloacei, provocând prolabarea oviductului, iar cu mâna dreaptă introduce canula în oviduct şi inoculează doza de spermă la o distanţă de 5-6 cm (Ştefănescu şi colab.,1974). La curci, tehnica de inoculare, în general, este asemănătoare cu cea folosită la însămânţarea găinilor. După contenţionarea curcii şi evidenţierea deschiderii oviductului, sperma se depune pe lumenul oviductului la 4-5 cm de la deschiderea posterioară.

65

ÎNTREBĂRI RECAPITULATIVE 1. Care sunt principalele avantaje ale aplicării însămînţărilor artificiale la animale? 2. În ce constă organizarea şi conducerea activităţii pe linia însămînţărilor artificiale în ţara noastră? 3. Care sunt etapele selecţiei masculilor de reproducţie? 4. Ce semnifică spermograma? 5. Enunţaţi principiile diluării spermei şi detaliaţi tehnicile de diluare a spermei animalelor. 6. Care sunt avantajele şi dezavantajele conservării spermei la diferite niveluri de temperatură? 7. Care sunt metodele de inoculare a spermei la animalele domestice? TEME 1. 2. 3. 4. 5.

Studiul aparaturii de recoltare a materialului seminal la rumegătoare, cabaline, suine şi păsări Principiile şi tehnicile controlului spermei. Întocmirea spermogramei Diluţia materialului seminal în vederea conservării la temperatura laboratorului, prin refrigerare şi congelare Modalităţi de conservare a spermei la rumegătoare, cabaline, suine şi păsări Inocularea spermei

REFERATE 1. 2. 3. 4. 5.

Biotehnologia însămânţării artificiale la vacă Biotehnologia însămânţării artificiale la oaie şi capră Biotehnologia însămânţării artificiale la scroafă Biotehnologia însămânţării artificiale la iapă Biotehnologia însămânţării artificiale la păsări

66

CAPITOLUL II BIOTEHNOLOGIA TRANSFERULUI DE EMBRIONI LA ANIMALE

2.1. Importanţa transferului de embrioni Importanţa transferului de embrioni poate fi zooeconomică şi ştiinţifică. Importanţa zooeconomică. Lucrările de selecţie şi ameliorare a efectivelor de animale sunt limitate de numărul redus de produşi care se obţin de la o femelă în cursul vieţii sexuale şi de intervalul dintre generaţii. Transferul de embrioni dă posibilitatea folosirii cu eficienţă crescută a rezervelor de ovocite de la animalele de înaltă valoare zootehnică numite donatoare, prin provocarea maturării şi eliberării mai multor gameţi femeli (poliovulaţie) cu obţinerea unui număr mai mare de produşi de la aceeaşi femelă prin transferul embrionilor în uterul femelelor receptoare. Astfel, în decursul vieţii sexuale este valorificată doar o infimă parte din rezerva de ovocite cu care femela ajunge la maturitatea sexuală. De exemplu, vaca începe perioada genitală cu o rezervă de circa 150000 de ovocite ( în ambele ovare), rezervă care diminuă la circa 21000 la vârsta de 2-3 ani şi la circa 2500 la 12-14 ani. Numărul de ovocite eliberate în întreaga viaţă sexuală nu depăşeşte 50, din care în condiţii normale rezultă maxim 10-12 viţei. Prin asigurarea numărului corespunzător de animale primitoare, de la vacile donatoare se pot obţine, în medie 3-4 viţei pe an, fiind cunoscute cazuri când în condiţii de supraovulaţie, de la o vacă donatoare s-au obţinut 30-35 viţei. Transferul de embrioni se practică şi pentru scurtarea intervalului dintre generaţii. Prin instalarea gestaţiei, femela intră în repaus productiv (sub raportul procreerii) pe întreaga durată a gestaţiei. În cazul practicării transferului de embrioni, produşii de concepţie sunt transferaţi în alte organisme, ceea ce dă posibilitatea obţinerii de noi produşi de la aceeaşi femelă în intervalul de timp în care în mod normal, ar fi trebuit să fie gestantă. Mai mult, în prezent se pot obţine gameţi şi de la tineretul femel prepuber prin provocarea prin mijloace hormonale a maturării şi expulzării ovocitelor, care vor fi apoi transferate în uterul femelelor receptoare. Scurtându-se mult intervalul dintre generaţii, se accelerează ameliorarea efectivelor de animale. Transferul de embrioni reduce considerabil costurile de transport, carantină şi eventualele restricţii sanitar-veterinare în comerţul cu animale, prin conservarea prin congelare a embrionilor. Totodată, prin practicarea transferului de embrioni, se pot obţine produşi de la femelele valoroase dar cu diverse afecţiuni genitale incompatibile cu menţinerea gestaţiei sau cu parturiţia. De asemenea, prin transferul de embrioni se reduce intervalul de timp necesar creării de noi rase de animale cu însuşiri morfo-productive performante care pot forma linii de femele consangvine în vederea folosirii lor la încrucişări industriale. În sinteză, în practica de producţie, transferul de embrioni se aplică pentru rezolvarea următoarelor probleme: - reproducerea accelerată a animalelor de prăsilă, de calitate superioară, a raselor rare, a animalelor din rezerva genetică a purtătoarelor unor însuşiri valoroase

67

(producţii ridicate, capacitate de utilizare intensă a furajelor, prolificitate mare, longevitate productivă, rezistenţă la anumiţi factori nefavorabili etc.); - obţinerea unui număr mare de descendenţi de la femelele cu producţii ridicate şi cu durată prelungită de exploatare, în vederea creării de familii cu aceste însuşiri; - raţionalizarea importului şi exportului animalelor valoroase, ca urmare a transportului embrionilor congelaţi, înlăturându-se astfel barierele sanitarveterinare şi înlesnirea aclimatizării materialului importat, dezvoltarea lui embrionară având loc în organismul primitoarelor; - obţinerea de embrioni liberi de leucoză cu posibilitatea transferului acestora femelelor leuco-negative; - crearea unor bănci de embrioni în vederea păstrării raţionale a rezervelor genetice, ceea ce este mai economic decât întreţinerea unor efective numeroase din rezerva genetică. Importanţa ştiinţifică Transferul de embrioni reprezintă o biotehnologie prin intermediul căreia se poate efectua, în condiţii optime, un aprofundat studiu ştiinţific al proceselor intime legate de fecundaţie şi de influenţele maternă şi paternă asupra produsului de concepţie. Totodată, poate fi studiată dezvoltarea embrionară la animale, diversele abateri de la dezvoltarea normală, cauzele şi factorii care generează mortalitatea embrionară. Produşii obţinuţi prin transferul de embrioni permit studierea influenţelor factorilor genetici şi ai mediului extern asupra dezvoltării embrionilor, ereditatea grupelor sanguine, obţinerea de animale „mozaic de gene“, a concentrării mai multor caractere pe acelaşi individ, a instituirii unei profilaxii şi terapeutici genetice pentru unele boli de metabolism. Pe aceeaşi linie, transferul de embrioni reprezintă baza unei noi generaţii de biotehnici care derivă din aceasta sau îi sunt asociate: bisecţia embrionilor, sexajul, fecundaţia „in vitro“ clonarea, transferul de gene, iar ingineria genetică foloseşte ca verigă importantă, în metodologie, această biotehnologie. Micromanipularea şi microchirurgia ovocitelor şi a embrionilor permit desfăşurarea unei cercetări ştiinţifice interesante, şi obţinerea din punct de vedere practic a unor înalte performanţe în reuşita transferului de embrioni, prin transferul jumătăţilor de embrioni. Sexul embrionului poate fi precizat cu multă acurateţe, baza investigaţiei fiind dată de transferul embrionilor. Reproducerea, fără contribuţia genetică a partenerului, se poate realiza prin ginogeneză, fiind deja obţinuţi primii şoareci homozigoţi, (Groza I., 1996). Aspecte similare ridică androgeneza în care se poate induce bispermia, adică pătrunderea în ovul a doi spermatozoizi, cu retragerea ulterioară a pronucleului femel şi în consecinţă diviziunea va continua numai în zona masculină (Groza I., 1996). 2.2. Biotehnologia transferului de embrioni la vacă La bovine, transferul de embrioni a devenit o biotehnologie de reproducţie larg răspândită în lume. Tehnicile de lucru sunt foarte bine stăpânite, astfel încât această modernă biotehnologie poate fi extinsă la aproape toate fermele de creşterea vacilor din lume. Astfel, în Europa se obţin anual circa 100000 de

68

produşi prin transfer de embrioni, iar pe plan mondial circa 300000 de produşi, extinderea biotehnologiei fiind limitată de costurile destul de ridicate. Transferul de embrioni constituie, totodată, baza unei noi generaţii de biotehnici, care derivă din aceasta sau îi sunt asociate, cum ar fi: bisecţia embrionilor, sexajul, fecundaţia ,,in vitro“, clonarea, transferul de gene. Transferul de embrioni presupune parcurgerea următoarelor etape (fig. 10): selecţia şi pregătirea vacilor donatoare; selecţia şi pregătirea vacilor primitoare (receptoare); sincronizarea estrului şi ovulaţiei la vacile donatoare şi primitoare; inducerea poliovulaţiei şi însămânţarea artificială a vacilor donatoare; recoltarea embrionilor; conservarea embrionilor; transferul embrionilor. SELECŢIA DONATOARELOR

SELECŢIA RECEPTOARELOR

TRATAMENTUL DE SUPEROVULARE PMSG -

tipul

-

FSH-p doza schema de administrare SINCRONIZAREA CICLULUI SEXUAL CU AL DONATOARELOR I.A. A DONATOARELOR

RECOLTAREA EMBRIONILOR

CONSERVAREA EMBRIONILOR

TRANSFERUL EMBRIONILOR

Fig. 10 Schema transferului de embrioni la animale 2.2.1. Selecţia şi pregătirea vacilor donatoare Vacile donatoare de embrioni trebuie să întrunească la cel mai înalt nivel caracterele zootehnice care interesează. De aceea, când se face selecţia donatoarelor, se are în vedere evaluarea următoarelor criterii: performanţa reproductivă, superioritatea genetică şi valoarea produsului obţinut prin transfer embrionar. Vaca donatoare va fi mai performantă reproductiv atunci când vârsta se situează între 3 şi 10 ani, a născut anual câte un viţel, a rămas gestantă în maxim două cicluri sexuale, ciclurile de călduri au o succesiune fiziologică şi nu a avut antecedente ginecologice (distocii, retenţii placentare, infecţii genitale etc.). Practic, criteriile care se au în vedere sunt: o stare ginecologică perfectă, intervalul dintre parturiţie şi primul estru să fie mai mic de 60 de zile, intervalul parturiţie-

69

însămânţarea fecundă să fie mai redus de 80 zile iar indicele de gestaţie să fie mai mic de 1,5. Superioritatea genetică constă într-un ritm superior de creştere, înainte şi după înţărcare şi un randament ridicat la sacrificare. În cazul vacilor de lapte, însuşirile cu heritabilitate ridicată se referă la producţia de lapte, procentul de grăsime din lapte şi conformaţia corporală. Vacile donatoare trebuie să fie sănătoase, ele suportând mai multe intervenţii de supraovulare şi recoltare de embrioni. O atenţie deosebită trebuie să se acorde alimentaţiei raţionale a acestei categorii de vaci. 2.2.2. Selecţia şi pregătirea vacilor primitoare (receptoare) Vacile receptoare de embrioni trebuie să fie sănătoase, fără afecţiuni ginecologice, să aibă aceeaşi talie cu donatoarele, să fie apte să nască descendenţi cu aceeaşi greutate la naştere ca donatoarele, avându-se în vedere că gestaţia constituie un fenomen morfo-fiziologic complex ce presupune eforturi suplimentare deosebite din partea organismului matern. Cele mai bune rezultate se obţin atunci când transferul de embrioni se face la tineretul femel în vârstă de 18-20 de luni. 2.2.3. Sincronizarea estrului şi ovulaţiei la vacile donatoare şi primitoare Sincronizarea ciclului sexual la vacile donatoare şi receptoare de embrioni se poate realiza pe cale naturală sau medicamentoasă. În cazul sincronizării femelelor prin mijloace naturale se urmăresc, în lotul receptoarelor femelele care în mod spontan manifestă estrul în acelaşi timp cu donatoarele. Principalul dezavantaj constă în fapul că sunt necesare multe animale receptoare în aşteptare. Această modalitate de sincronizare s-a practicat în perioada de început a transferului de embrioni, când s-au folosit pentru transfer embrionii proaspăt recoltaţi. În această situaţie, în aceeaşi unitate trebuia să fie şi vaci donatoare şi receptoare, iar transferul embrionilor trebuia să se realizeze întrun timp relativ scurt (4-6 ore de la recoltare). Sincronizarea estrului prin mijloace medicamentoase se bazează pe faptul că se urmăresc succesiv două-trei cicluri de călduri la vacile donatoare şi se stabileşte durata ciclului. În acest fel se poate calcula data apariţiei ciclului care interesează în transferul de embrioni. În funcţie de data previzibilă, se acţionează prin tratamente hormonale asupra unui grup de femele primitoare în vederea inducerii căldurilor, sincronizate cu căldurile naturale ale donatoarei. În acest caz se acţionează asupra donatoarei numai în ceea ce priveşte inducerea poliovulaţiei. Sincronizarea medicamentoasă a ciclului estral al femelelor donatoare şi receptoare de embrioni se realizează pe două căi: blocarea eliberării hormonilor gonadotropi sau prin inducerea luteolizei. Prima cale presupune folosirea progesteronului, sau a progestinelor sintetice care prin retroacţiune îşi exercită efectul negativ asupra hipotalamusului, diminuând nivelul hormonilor gonadotropi. (Vezi capitolul „Sincronizarea estrului“).

70

2.2.4 Inducerea poliovulaţiei şi însămânţarea artificială a vacilor donatoare Provocarea eliberării concomitente la aceeaşi perioadă de călduri a unui număr sporit de ovocite decât cel caracteristic speciei se numeşte poliovulaţie (supraovulaţie, superovulaţie) si este asigurata prin multiple scheme de tratament. Tratamentele actuale aplicabile in „vitro“ se sprijină pe cunoaşterea mecanismelor foliculogenezei, a efectului tonic al hormonilor gonadotropi (FSH, LH) care intervin îndeosebi în ultima fază a creşterii şi maturării foliculare. Potenţialul ovarian de foliculi terţiari (cu antrum) rămâne relativ constant (însă variabil cu individul) de la vârsta de două luni până la 12 ani (Nibart M., 1991). Fiziologic, la vacă, un singur folicul ajunge la maturitate în preajma ovulaţiei, în timp ce, în timpul unui ciclu sexual, 10-20 de foliculi degenerează. Injecţia unui hormon cu activitate de FSH împiedică atrezia unor foliculi şi stimulează dezvoltarea şi maturarea simultană a mai multor foliculi terţiari, în cursul aceluiaşi ciclu estral. În prezent, două scheme clasice de tratament poliovulator sunt aplicate, ambele bazate pe efectul foliculo stimulant al hormonilor gonadotropi: serul gonadotrop de iapă gestantă, liofilizat şi standardizat - PMSG (Pregnant Mare Serum Gonadotropin) denumit şi Ecvin Chorionic Gonadotropin (ECG), produs de celulele corionice ale iepei gestante si hormonul de stimulare foliculară (FSH) extras din hipofiza anterioară. PMSG se extrage din serul sanguin al iepei gestante şi are o dublă activitate: de tip FSH şi LH, raportul FSH/LH variază de la 1/1 la 1/5 (Saumande J., 1987). Perioada de înjumătăţire destul de lungă - 120 ore - a acestui hormon determină o uşurinţă în folosire, o singură injecţie de 2000-2500 U.I. i.m. fiind eficientă în provocarea poliovulaţiei. La două-trei zile de la injectarea PMSG se administrează i.m. o doză de 500-750 µg prostaglandină F2α, căldurile apărând la circa 48-60 de ore de la injectarea prostaglandinei. Folosirea PMSG antrenează şi unele efecte negative traduse prin creşterea foliculară şi secreţia ridicată de estradiol şi după descărcarea preovulatorie de LH. Acest efect negativ poate fi contracarat prin injectarea i.v. a unui anticorp anti PMSG concomitent cu prima sau cea de a doua însămânţare artificială (de ex. Neutra -PMSG intervet). Fecundarea ovocitelor se face, de regulă, prin însămânţarea artificială a vacilor la un interval de 12 ore de la începutul estrului cu repetare la 8-12 ore interval. FSH – se prepară din extractele purificate parţial, provenite din hipofiza mamiferelor - în principal de suine - care conţine FSH şi LH. Conţinutul în cei doi hormoni şi raportul dintre aceştia variază cu lotul. Perioada de înjumătăţire foarte scurtă (circa 70 minute a acestui hormon necesită injectarea lui bicotidian timp de 4 zile, în vederea menţinerii unui nivel sanguin suficient de ridicat. Funcţie de preparatul comercial, raportul dintre FSH şi LH, de regulă variază de la 1 la 0,5. Dozele totale care se administrează, în vederea producerii poliovulaţiei, variază de la 28 mg la viţelele de lapte, la 40 mg pentru vaci, injecţiile făcându-se în ritm descrescător, intramuscular sau subcutanat. Preparatele care conţin aceşti hormoni au denumiri care diferă cu unitatea producătoare: FSH-p, Stimufol, Ovaset, Follitropin, Superov, Ovagen, Pluset etc. Ca şi cealaltă schemă de tratament, injectarea prostaglandinei F2α, în doză de 500-750 µg se face la 48-72 de ore de la începerea tratamentului, estrul apărând la circa 50-60 ore de la injectarea prostaglandinei. Fecundarea ovocitelor se face prin însămânţarea artificială a femelelor supraovulate de două ori, la 12 şi 24 ore de la apariţia estrului. 71

Scheme de tratament pentru inducerea poliovulaţiei Preparatele medicamentoase care conţin hormoni gonadotropi sunt injectate în faza luteală a unui ciclu natural sau indus, cel mai frecvent între ziua a 9-a şi a 13-a. Două zile după injecţia de PMSG sau concomitent cu a 5-a injecţie de FSH, se injectează un analog de PGF2α (de ex. 0,5-1 mg Cloprostenol) care are efect luteolitic permiţând ovulaţiile (fig. 11 şi 12). POLIOVULA}IE FSH p

1

ANTILUTEOTROP

2

IMPLANT NORGESTOMET 9 zile

POLIOVULA}IE PMSG ANTI-PMSG

3

ANTILUTEOTROP

4

IMPLANT NORGESTOMET 9 zile

Fig. 11 Scheme de inducere a poliovulaţiei la vacile donatoare de embrioni (după M. Thibier şi M. Nibart, 1991) O altă schemă de tratament constă în utilizarea progestinelor pe cale orală, parenterală, intravaginal sau implant subcutanat timp de 9-12 zile. Progestinele blochează axul hipotalamo-hipofizo-ovarian, prin neeliberarea de FSH dar mai ales de LH. Cât timp receptorii axului hipotalamo-hipofizar se găsesc sub acţiunea temporară a progestinelor, femela nu va manifesta estru şi nici nu va ovula. După suprimarea terapiei cu progestine, se produce o descărcare rapidă, compensatoare de Gn-RH, ceea ce va determina, în decurs de 5-7 zile, intrarea în călduri ovulatorii a femelelor tratate. În cursul unui astfel de tratament de blocare a ciclului se poate injecta hormonul de stimulare (FSH-p) bicotidian, în ritm descrescător începând cu a 6-a zi de la blocarea ciclului, concomitent cu o injecţie intramusculară de PGF2α.

72

PMSG PGF2α

1

PMSG PGF2α Gn-RH

2

PMSG PGF2α HCG

3

FSH PGF2α

4

Fig. 12 Scheme de inducere a poliovulaţiei la vacile donatoare de embrioni (după I.C.P.C.B. Baloteşti) În cazul întrebuinţării preparatelor hormonale pe bază de PMSG, acestea se injectează, împreună cu o doză de prostaglandină F2α, în a 6-a - a 7-a zi de la introducerea implantelor, pesariilor etc., urmată de injectarea unei doze de anti PMSG concomitent cu a 2-a însămânţare artificială (fig. 11 şi fig. 12). O schemă mai simplă de provocare a poliovulaţiei constă în începerea tratamentului cu hormoni gonadotropi în a 15-a, a 16-a zi a ciclului estral la viţele şi în a 16-a, a 17-a zi a ciclului sexual la vaci, însă numărul de embrioni obţinuţi este mult mai redus. Rezultate bune în provocarea poliovulaţiei s-au obţinut prin injectarea unei doze de Gn-RH la vacile poliovulate înainte de prima însămânţare artificială sau concomitent cu aceasta, în vederea grupării ovulaţiilor. Prin provocarea poliovulaţiei se pot obţine de circa 8-10 ori mai mulţi embrioni, decât în cazul recuperării unui singur ou de la femelele nesupuse tratamentului poliovulator (foto 18).

73

Există o variaţie mare în ceea ce priveşte răspunsul la tratamentul poliovulator, din partea vacilor. Această variaţie pronunţată se datorează hormonului utilizat, purităţii acestuia şi de specificul individual al femelelor. Cercetările au relevat faptul că circa 1020% dintre vaci nu răspund la tratamentul poliovulator, alte 20-25% răspund slab la un astfelde Foto 18 Ovare superovulate tratament (1-3 embrioni transferabili pe vacă tratată) şi doar 30-40% dintre vaci au un răspuns ideal la tratamentul de superovulaţie furnizând 7-12 embrioni/vacă/tratament iar 5-10% dintre femelele tratate furnizează mai mult de 20 de embrioni. În prezent, stimularea ovariană pare a fi atins un anumit plafon întrucât, se colectează, în medie 9-10 embrioni (limite între 0-50), iar cel al embrionilor viabili este de 5-6 (limite între 0-30), din care 3 congelabili (Nibart, Thibier, Chouke 1988). În ceea ce priveşte repetarea tratamentelor de superovulaţie la aceeaşi donatoare, s-a constatat că tratamentele pot fi repetate pe intervalul a mai multor luni sau a mai multor ani. Producţia totală de embrioni de la aceeaşi donatoare depinde de aceasta şi de ritmul de colectare . Este necesar un interval de cel puţin 60 de zile după fătare în vederea începerii tratamentului poliovulator. Unii cercetători constată o reducere a numărului de embrioni transferabili o dată cu repetarea tratamentului cu PMSG, fapt ce se explică prin formarea în organismul femelei tratate a anticorpilor antiPMSG şi reducerea categoriilor de foliculi sensibili la stimulare. Pentru a se evita acest efect negativ, repetarea tratamentului trebuie să se facă la un interval de 5460 de zile şi să se intercaleze tratamentele pe bază de PMSG şi FSH-p. Rezultatele tratamentelor de superovulare sunt influenţate de vârsta femelelor, rasă, mascul, sezon, nivelul producţiei de lapte, starea generală, etc. De regulă, viţelele produc un embrion viabil mai puţin decât vacile adulte. 2.2.5. Fecundarea ovocitelor Ovocitele sunt fecundate în urma însămânţării naturale sau artificiale. De regulă, se efectuează două însămânţări artificiale la interval de 12-24 de ore de la începutul căldurilor observate clinic sau, sistematic, după 56 şi 72 de ore de la injecţia cu PGF2α, sau după 36 şi 48 de ore de la retragerea implantelor sau pesariilor. 2.2.6. Recoltarea embrionilor Embrionii sunt colectaţi atunci când se găsesc în cornul uterin, după ieşirea lor din oviduct (între zilele 4-5). Din motive sanitare şi de congelare se preferă colectarea embrionilor încă incluşi în zona lor pelucidă (ies în a 9-a zi). 74

Cel mai frecvent, colectarea se realizează între zilele 6-8 după fecundaţie, de regulă în ziua a 7-a. Recoltarea embrionilor se face chirurgical şi nechirurgical. Mult timp, metoda chirurgicală a fost singura utilizată. Tehnica operatorie presupunea parcurgerea a două etape: laparotomia, cu exteriorizarea aparatului genital în plagă şi recoltarea propriu-zisă a embrionilor prin spălarea cu un lichid cu o compoziţie specială, a oviductelor (după un interval de timp mai mic de 3 zile după însămânţare) sau a coarnelor uterine (după un interval de timp mai mare de 4 zile de la însămânţare). În prezent, metoda chirurgicală de recuperare a embrionilor la vacă este abandonată, datorită inconvenientelor pe care le prezintă. Astăzi, este generalizată metoda nechirurgicală de prelevare a embrionilor, a cărei principiu constă în spălarea coarnelor uterine cu un mediu special preparat, spălare care se realizează în condiţii de asepsie în a 7-a zi de la însămânţare. Tehnica nechirurgicală de colectare a embrionilor s-a perfecţionat continuu, firme specializate produc pe scară industrială mediul de recoltare, congelare, decongelare şi întreaga aparatură necesară recoltării şi transferului embrionilor. Tehnicile nechirurgicale de recoltare a embrionilor presupun mai multe operaţii: contenţia femelei, anestezia, vidarea rectului, toaleta vulvei şi a regiunii perivulvare, identificarea prezenţei corpilor galbeni pe ovar, introducerea lichidului de spălare în lumenul coarnelor uterine, spălarea acestora, recuperarea lichidului împreună cu embrionii, identificarea şi recuperarea embrionilor din lichidul recuperat şi supus decantării şi aprecierea morfologică a acestora. În condiţii de fermă, recoltarea embrionilor se face la locul unde se găseşte femela donatoare,dupa contentia adecvata. Pentru a suprima durerea, se practică anestezia epidurală cu 4-6 ml procaină 2% sau cu 10 ml ludocaină 1%, care blochează nervii coccidieni şi ultimele perechi de nervi sacrali (S3, S4, S5). Acul se introduce între prima şi a doua vertebră coccigiană sau între ultima vertebră sacrală şi prima vertebră coccigiană, anestezia instalându-se după circa 10-15 minute şi durează în jur de 90 de minute, zonele insensibilizate fiind: coada, anusul, rectul, vulva, vaginul şi uterul. Se introduce, cu precauţiile de rigoare, mâna în rect, acesta se videază de conţinut, apoi se apreciază răspunsul femelei la tratamentul poliovulator, palpându-se cu atenţie ambele ovare şi numărâdu-se corpii galbeni (foto 19). În cazul în care răspunsul la tratamentul de superovulare este pozitiv, se procedează cu precauţie la introducerea cateterului de tip Folley cu două sau trei căi, prin conductul cervical până în cornul uterin. Pentru rigidizarea cateterului, se introduce pe lumenul acestuia un mandren (tijă metalică), care se menţine până se ajunge în lumenul cornului uterin, apoi se retrage. Cateterul este introdus circa 5-8 cm de la bifurcaţia coarnelor uterine, pe unul dintre acestea, apoi se introduce de la exterior, cu seringa, 8-15 ml de aer în scopul fixării cateterului şi pentru a împiedica refularea din cervix a lichidului de spălare. Vasul din sticlă, ce conţine lichidul de spălare se suspendă la 1,5 m de la sol şi, prin cădere, acesta ajunge prin calea de admisie a cateterului în coarnele uterine. Irigarea acestora se face continuu, calea de evacuare a lichidului este conectată, printr-un tub de plastic, la vasul de colectare a mediului recuperat (de spălare). Recuperarea lichidului de spălare se face prin calea de admisie (în cazul cateterului cu două căi la care s-a adaptat o piesă în forma literei y) prevăzut cu canal de admisie şi evacuare al lichidului, ramura de evacuare a lichidului fiind conectată la un filtru de colectare a cărui orificii au un diametru de 75 µm, care are rolul de reţinere a embrionilor, lichidul ce traversează filtrul fiind colectat într-un recipient situat sub filtru.

75

Mediul folosit la spălarea unui corn uterin se foloseşte la spălarea, în acelaşi mod, a celui de-al doilea corn uterin. Cantitatea de mediu care se foloseşte pentru spălarea unui corn uterin este de 300-500 ml, efectuânduse irigări repetate şi un masaj transrectal permanent al cornului uterin perfuzat. Există diverse sonde de recuperare a embrionilor, imaginate de diverşi cercetători, care se bazează pe acelaşi principiu constructiv . Între momentul recuperării embrionilor şi cel al inoculări lor în uterul receptoarelor, zigoţii trebuie să fie menţinuţi în viaţă în condiţii speciale şi să fie manipulaţi în cele mai bune condiţii tehnice şi igienice. În ultimii ani s-a generalizat folosirea unei soluţii tampon fosfat - PBS – (Fosfat bufferet salin) pentru spălarea Foto 19 Recoltarea embrionilor prin coarnelor uterine şi pentru păstrarea metoda nechirurgicală embrionilor recuperaţi. Acest lichid are un pH de 7,2, o presiune osmotică de 290 miliosmoli şi conţine multe săruri minerale, glucoză şi proteină (albumină bovină serică, 2-4 g/l, sau ser de viţel fetal decomplementat 10%. Toate mediile, soluţiile, serurile, enzimele şi substanţele crioprotectoare care vin în contact cu embrionii trebuie să fie sterile. Tot materialul care nu se aruncă (sonde colectoare, filtre, recipienţi din sticlă, sonde de transfer, etc.) care necesită a fi sterilizate, se spală cu o soluţie de detergent netoxic, se clăteşte în apă distilată, se usucă şi se înveleşte în hârtie în vederea sterilizării. Alegerea metodei de sterilizare depinde de natura materialului (căldură uscată, căldură umedă, substanţe antiseptice, vapori de formol etc.). Rezultatele recuperării embrionilor depind în cea mai mare măsură de abilitatea şi antrenamentul operatorului. Proporţia embrionilor recuperaţi, oscilează în medie, între 60-70% comparativ cu numărul de corpi galbeni identificaţi pe ambele ovare. După colectarea embrionilor se injectează donatoarei o doză de PGF2α, care are rolul de a liza corpii galbeni, evitându-se astfel gestaţia multiplă. 2.2.7. Căutarea şi aprecierea calităţii embrionilor După prelevarea embrionilor, vasul cu lichidul recoltat (100-150 ml) este lăsat timp de 20-30 minute pentru decantare. Se îndepărtează supernatantul iar stratul inferior în care se regăsesc şi embrionii recoltaţi, se transferă într-o placă Petri cadrilată cu diametrul de 10 cm, (foto 20) sau se agită în mediu din filtrul colector şi se toarnă în placa Petri. Recipientele de recoltare a mediului ca şi filtrul folosit la recuperarea embrionilor se clătesc de două trei ori. Examenul embrionilor în lichidul recoltat trebuie să se facă în cele mai bune condiţii de asepsie, curăţenie şi la o temperatură constantă a laboratorului 76

(20o-25o). Embrionii bovinelor au un diametru de 150-190 microni, zona pelucidă având o grosime de 12-15 µm. Pentru identificarea embrionilor, se examinează la o stereolupă (grosisment 30-60 uneori 80-200) fiecare pătrat de la nivelul plăcii Petri. (foto 21).

Foto 20 Placa PETRI cadrilată folosită la căutarea embrionilor

Foto 21 Căutarea embrionilor în lichidul de spălare cu ajutorul stereolupelor

O dată identificaţi, embrionii sunt transferaţi cu ajutorul unei seringi de aspirare, la care s-a adaptat, printr-un tub de plastic, o micropipetă, în plăci Petri mai mici, cu diametrul de 5 cm în care se găseşte mediul de spălare la care s-a adăugat 20% albumină serică bovină (BSA). Operaţiunea se repetă de 3-5 ori, embrionii fiind transferaţi dintr-o plăcuţă în alta, schimbându-se de fiecare dată pipeta de aspirare. În cazul în care embrionii sunt destinaţi exportului, aceştia sunt trecuţi prin zece astfel de băi de spălare. Amestecul crioprotectorului cu mediul de conservare (PBS ±40% BSA sau 10-20% ser de viţel fetal) provoacă o creştere a presiunii osmotice. Pentru a reduce şocul osmotic, embrionii sunt trecuţi succesiv şi pe câte o durată de 5 - 10 minute în două-trei băi cu mediu de conservare cu o concentraţie crescândă în crioprotector: glicerol 0,7 M şi apoi 1,4 M, DMSO sau etilen glicol 0,5 M, 1,0 M apoi 1,5 M. Această trecere a embrionilor în mediul de conservare cu adaos de crioprotector se face la o temperatură cuprinsă între+20oC şi +30oC. După ultima baie, adică în momentul în care este atinsă concentraţia finală în crioprotector (de exemplu: etilen-glicol 1,5 M), embrionii sunt condiţionaţi pentru congelare, fie în fiole de sticlă de 1,2 ml, fie în paiete de polipropilen de 0,25 ml (de tip paiete fine folosite la conservarea spermei). Paietele sunt identificate individual. Există bancuri de identificare ce permit pe de o parte închiderea ermetică a paietei şi care poartă (sunt inscripţionate) toate informaţiile necesare. Pentru fiecare paietă trebuie să se menţioneze: identificarea donatoarei, rasa, data colectării, numărul de embrioni, centrul de producţie. Procedura de umplere a paietelor comportă trei compartimente lichide separate de bulele de aer. Aceasta limitează orice risc de pierdere a embrionilor în momentul manipulărilor efectuate cu umplerea sau evacuarea conţinutului paietelor. Embrionii sunt încadraţi în mai multe categorii calitative: excelent, bun, acceptabil, inferior, degenerat, ovocit nefecundat. În cursul examenului sub stereolupă la un grosisment mai mic de 80, embrionul este întors cu ajutorul unei micropipete de sticlă în vederea aprecierii morfologiei sale din toate unghiurile, unele imperfecţiuni putând scăpa observaţiei în anumite poziţii ale embrionului. Zona pelucidă garantează protecţia embrionului, motiv pentru care ea trebuie să fie perfect integră, fără fisuri şi perfect sferică. Gradul de dezvoltare embrionară în raport cu ziua colectării este principalul factor luat în considerare. 77

Embrionii care prezintă o întârziere în dezvoltare mai mare de 48 de ore sunt eliminaţi. Embrionii colectaţi în a şaptea zi de la debutul estrului trebuie să se găsească în stadiul de morulă compactă/blastocist. Embrionii care conţin 16 celule sau mai puţin, nu se reţin pentru transfer sau congelare, fiind într-o întârziere mare a dezvoltării. În stadiul de morulă compactă, limitele celulare sunt mai puţin distincte întrucât blastomerele sunt strâns legate între ele şi dau un aspect de mure. Prezenţa câtorva celule detaşate, în spaţiul perivitelin nu constituie un motiv de eliminare întrucât majoritatea blastomerelor formează o masă sferică fără opacitate marcantă. În stadiul de blastocist, diversele structuri (blastocel, butonul embrionar, trofoblastul) trebuie să fie vizibile şi să prezinte contururi bine delimitate. Prezenţa blastomerelor în spaţiul perivitelin şi a unor granulaţii la suprafaţa celulelor pot fi observate. Aceste anomalii asociate unei întârzieri în dezvoltare, absenţei contururilor celulare sau unei opacităţi marcante ale blastomerelor constituie criteriu de eliminare a embrionilor. Embrionii a căror aspect este îndoielnic sunt conservaţi una-două ore apoi vor fi examinaţi din nou. Excelent este considerat embrionul perfect ca aspect morfologic şi corespunzător vârstei (foto 22). Embrionul bun calitativ prezintă unele imperfecţiuni: zona pelucidă ovală, dimensiuni mai mici ale embrionului, întârziere în dezvoltare cu o zi, puţine celule extrudate, mici. Embrionul acceptabil este cel care este bine conturat, însă prezintă unele anormalităţi: un număr moderat de Foto 22 Embrioni buni pentru celule excluse, dimensiuni mai mici, congelare unele degenerări şi întârzierea cu o zi. Embrionul inferior prezintă diverse degradări considerabile: celule veziculate, variabilitate mare în ceea ce priveşte dimensiunile celulelor, întârzierea în dezvoltare cu două zile, absenţa compactării. Embrionul degenerat prezintă degenerări evidente, iar ovocitele nefecundate sunt cele care prezintă structură simplă a gametului femel, fără celulele rezultate din segmentare (Seidel F.G. şi colab.,1991). 2.2.8. Conservarea şi deconservarea embrionilor Embrionii pot fi conservaţi câteva ore „in vitro“ la 20oC într-un mediu de conservare: PBS adiţionat cu 4 g/l albumină serică bovină, sau cu 10% ser de viţel fetal decomplementat. În acest mediu, embrionii sunt menţinuţi până când sunt transferaţi la receptoare. În cazul în care transferul nu se realizează în 6-8 ore de la recoltare, se recomandă congelarea prin refrigerare a embrionilor, la o temperatură de 0o-4oC într-un mediu de conservare identic. În acest fel embrionii pot fi conservaţi una-două zile fără ca viabilitatea să fie afectată. Conservarea de lungă durată a embrionilor – congelarea - rămâne cea mai avantajoasă metodă de menţinere pentru un interval de timp practic nelimitat a viabilităţii embrionilor. Pentru aceasta, embrionii, trebuie să fie menţinuţi în stare solidă, în azot lichid, la temperatura de circa -196oC. La temperaturi mai scăzute de -100oC, metabolismul celular este complet blocat, singura problemă mai dificilă constând în atingerea acestor temperaturi fără a omorî embrionii. În timpul 78

congelării, intervin doi factori letali pentru embrioni: formarea gheţii intracelulare şi concentraţia salină ridicată. Pentru a preîntâmpina efectul negativ al acestor doi factori, metoda de răcire constă în deshidratarea parţială a celulelor şi evitarea şocului produs de concentraţiile ridicate în săruri prin utilizarea unui Crioprotector, în general glicerol cu o concentraţie de 1,5 M (sau 10% în volum) în mediul de congelare. Ca agenţi criopro-tectori se mai pot folosi: dimetilsulfoxid (DMSO), etilen-glicol, glicerol, propilen-glicol. În prezent sunt numeroase aparate programabile (freezere) care permit realizarea unei curbe optimale de răcire (foto 23). Substanţele crioprotectoare (în general polialcooli) sunt capabile să pătrundă uşor în celule printr-o simplă difuziune (osmoză), Foto 23 Model de freezer întârziind formarea cristalelor de gheaţă prin coborârea punctului de îngheţ. Totodată, substanţele crioprotectoare limitează efectele negative ale concentraţiei saline ridicate, înlocuind o parte din apa intracelulară atrasă prin creşterea presiunii osmotice extracelulare. Alţi compuşi pot avea un rol protector faţă de membranele celulare (hidraţi de carbon, polivinilpirolidon), (Baril şi colab., 1993). Viteza de coborâre a temperaturii are importanţă mare în protejarea viabilităţii embrionilor. Mediul care conţine embrionii (extracelular) este mai bogat în apă decât mediul celular. Prin coborârea temperaturii, primele cristale de gheaţă se produc mai întâi în mediul extracelular, ceea ce va antrena o ridicare a concentraţiei în soluţie a fracţiunii necristalizate. Această concentraţie salină ridicată va provoca ieşirea unei părţi din apa celulară, reducând în acest fel formarea gheţii intracelulare. Dacă ritmul de răcire este prea rapid, apa intracelulară nu poate ieşi în cantitate suficientă, cristalele de gheaţă se formează în cantitate mare în interiorul celulelor şi aceste cristale îşi măresc talia lor în timpul congelării şi decongelării distrugând structurile celulare. În cazul în care ritmul de răcire este lent, deshidratarea progresivă a celulelor antrenează o creştere importantă a concentraţiei în electroliţi, în mediul celular, modificând proprietăţile fizico-chimice (efectul soluţiei), consecinţa fiind totdeauna pierderea viabilităţii celulelor. Astfel, integritatea celulelor vii după congelare este strâns legată de dinamica apei intracelulare în timpul răcirii şi deci de viteza de congelare. În cazul embrionilor, ritmul de răcire trebuie să corespundă pentru toate tipurile de celule care-l compun. Rezultatele cercetărilor întreprinse pentru clarificarea aspectelor referitoare la ritmul de congelare confirmă faptul că acesta trebuie să se desfăşoare în două etape diferite: o congelare lentă, în două trepte: la început 4oC/min până la –6 –7oC şi 0,3-0,6oC/min între –7oC şi –30 –35oC, apoi o congelare rapidă (bruscă) de la -35oC până la temperatura de păstrare -196oC. Timpul de aşteptare al embrionilor din momentul recoltării şi până la începerea congelării, nu trebuie să depăşească două-trei ore. Protocolul de congelare a embrionilor bovini prevede următoarele: - alegerea embrionilor - calitate excelent sau bun; - timp de la recoltare până la începerea congelării: două-trei ore;

79

-

introducerea embrionilor în mediul de congelare la temperatura laboratorului (20oC); - introducerea embrionilor în paiete identificate (mediu, bulă de aer, embrioni +mediu, bulă de aer, mediu); - răcirea până la -6oC sau -7oC cu o viteză de 4oC/minut; - inducerea cristalizării (palier 5-10 minute); - răcirea până la –30oC sau –35oC cu o viteză de 0,3 - 0,6oC/minut; - introducerea paietelor ce conţin embrionii, direct în azot lichid şi stocarea lor (-196oC). Paietele se vor păstra în permanenţă în azot lichid până în momentul transferului la femelele receptoare. Durata stocării embrionilor în azot lichid nu influenţează supravieţuirea ulterioară a acestora. Decongelarea embrionilor şi înlăturarea crioprotectorului Embrionii congelaţi la -35oC nu sunt decât parţial deshidrataţi, o anumită cantitate de gheaţă se formează inevitabil în celule, în momentul imersiei în azot lichid (-196oC). Pentru a se evita ca prin decongelare să se producă o creştere a acestor mici cristale de gheaţă care să distrugă celulele, decongelarea trebuie să se facă în timp, cât mai repede posibil (circa 2000oC/minut). Pentru aceasta, paietele se scot repede din containerul cu azot lichid şi se introduc direct într-o baie de apă la 37oC, unde se menţin circa 30 de secunde. Imediat după decongelare, înlăturarea rapidă a crioprotectorului este indispensabilă supravieţuirii embrionilor. Totuşi, celulele care conţin o concentraţie ridicată de crioprotector nu trebuie să fie introduse direct într-un mediu izotonic, întrucât diferenţa mare de presiune osmotică va provoca pătrunderea prea rapidă a apei în celulă, ceea ce va risca să explodeze. De aceea, este necesară o îndepărtare progresivă a crioprotectorului astfel încât ieşirea acestuia şi pătrunderea apei în celulă să fie compatibile cu permeabilitatea membranei celulare. Pentru aceasta sunt mai multe metode care realizează o rehidratare lentă a celulelor embrionare. Diluţia crioprotectorului pe etape constă în trecerea succesivă a embrionilor prin băi cu concentraţii descrescânde în crioprotector (de ex: etilen glicol 1,5 M, apoi 1,0 M, 0,5 M şi 0 M). Menţinerea embrionilor în fiecare baie este de 5-10 minute. În acest caz concentraţia mediului în crioprotector este inversă celei din perioada congelării. După înlăturarea lichidului de răcire, calitatea embrionilor poate fi apreciată printr-un examen morfologic efectuat cu ajutorul unei stereolupe (grosisment x80). În urma examenului morfologic, de regulă sunt eliminaţi ca necorespunzători calitativ, 10-30% dintre embrionii decongelaţi. Diluţia crioprotectorului prin folosirea unui mediu care conţine sucroză are la bază accelerarea ieşirii acestuia din celule. Molecula de sucroză având o greutate moleculară mare (344) nu pătrunde în celule prin simplă difuziune; prezenţa sa în mediu crează o mărire a presiunii osmotice din mediul extracelular, ceea ce va determina o difuziune accelerată a crioprotectorului din celule. Pentru aceasta, embrionii decongelaţi sunt introduşi direct într-o soluţie de PBS care conţine 0,25-0,5 M sucroză, apoi în două-trei băi succesive de PBS înainte de examinare şi transfer. Se poate realiza retragerea crioprotectorului prin intermediul sucrozei, direct în interiorul paietei. Pentru aceasta, în momentul introducerii embrionilor în paiete pentru congelare, alternanţa diverselor medii din paietă este: la mijloc embrionul în mediu PBS+ etilenglicol 1,5 M, înconjurat de bule de aer şi apoi la exterior PBS+sucroză 0,25 M. După decongelare paieta se 80

scutură în vederea amestecării mediilor pe bază de etilen glicol şi cele pe bază de manoză, ceea ce va permite difuzia crioprotectorului în afara celulei în câteva minute. Embrionii sunt transferaţi fără selecţie prealabilă, împreună cu conţinutul paietei direct în uterul femelelor receptoare. Această metodă mai necesită unele verificări. Nivelul supravieţuirii embrionilor după decongelare este condiţionat de mai mulţi factori: stadiul de dezvoltare a embrionilor, calitatea embrionilor înainte de congelare, femela donatoare etc. Embrionii transferaţi în stadiul de morulă realizează o proporţie de supravieţuire „in vitro“ mai redusă (64%), comparativ cu cei transferaţi în stadiul de blastocist (81%), (Martinez şi colab., 1985). Congelarea nu trebuie aplicată decât embrionilor de bună calitate, caz în care procentul de supravieţuire după transfer fiind uşor inferior (10%) faţă de nivelul supravieţuirii obţinut după transfer direct, fără congelare. Originea genetică a donatoarei pare a avea un rol însemnat asupra aptitudinii embrionului de a fi congelat. Acelaşi efect denumit şi „efectul donatoarei“ a fost demonstrat prin faptul că procentul de supravieţuire a embrionilor congelaţi în aceleaşi condiţii poate varia de la 0 la 78% în raport cu donatoarea. 2.2.9. Transferul embrionilor O atenţie deosebită va fi acordată selecţiei femelelor receptoare, întrucât condiţionează în mare parte rezultatele după transfer. Aşa cum s-a menţionat în capitolul anterior, receptoarele trebuie să aibă o activitate sexuală ciclică, să fie bine dezvoltate corporal, fără afecţiuni ale tractusului genital. Alegerea receptoarelor poate porni de la viţele în vârstă de 18 luni cu condiţia atingerii a cel puţin 2/3 din greutatea corporală a adultului. Transferul embrionilor se face cu foarte bune rezultate şi la vaci adulte în vârstă de 3-6 ani dacă funcţia de reproducţie s-a desfăşurat normal. Examenul femelelor receptoare se completează cu aprecierea ultimului estru, care trebuie să aibă loc între parametrii fiziologici (comportament sexual, calitatea mucusului cervical, starea de sănătate a conductului vestibulo-vaginal şi al orificiului vaginal al cervixului). Pregătirea receptoarelor constă într-o sincronizare cât mai perfectă a ciclului sexual cu cel al femelei donatoare. Se pot folosi femele receptoare, fie în călduri naturale fie în călduri induse printr-un tratament de control al ciclurilor sexuale (vezi cele menţionate anterior). O atenţie specială se va acorda depistării ciclurilor (dimineaţa, prânz, seara) apoi se determină momentul exact al începutului estrului. Înaintea transferului propriu-zis se face un examen transrectal al ovarelor pentru a identifica corpul galben pe unul din ovare. Transferul embrionului se va face în vârful cornului uterin adiacent ovarului pe suprafaţa căruia este prezent corpul galben. Rezultate bune s-au obţinut şi prin depunerea embrionului la circa 10 cm de la bifurcaţia coarnelor uterine în lumenul cornului uterin ipsilateral ovarului cu corp galben. Înainte şi imediat după transfer se va evita orice stres: vaccinări, tratamente antiparazitare, ecornări, lotizări, tuberculinări, recoltări de sânge etc. Se va evita schimbarea bruscă a regimului alimentar: de exemplu introducerea masei verzi primăvara 4 săptămâni după transfer. Variaţiile climatice determină o creştere a mortalităţii embrionilor după transfer. În cazul folosirii embrionilor proaspeţi, receptoarele se ţin într-un grajd curat şi cât mai aproape de donatoare. Transferul propriu-zis al embrionilor la femelele receptoare se realizează prin două metode: chirurgical şi nechirurgical. 81

Transferul chirurgical s-a aplicat în perioada de început şi a constat în deschiderea cavităţii abdominale (pe linia albă sau în flanc), exteriorizarea cornului uterin şi depunerea embrionului pe cornul uterin corespunzător ovarului cu corp galben prin puncţionarea peretelui acestuia. Este o metodă laborioasă, costisitoare, traumatizantă pentru femele, ceea ce a condus la abandonarea ei. Metoda actuală care dă cele mai concludente rezultate este cea nechirurgicală. Această metodă foloseşte calea vagin-cervix, asemănător însămânţării artificiale. Pentru transfer se foloseşte un pistolet tip Cassou în care se introduce paieta cu embrionul deconservat sau proaspăt recoltat. Pentru a se evita contaminarea învelişului din material plastic al pistoletului Cassou pe timpul traversării conductului vestibulo-vaginal, se fixează un al doilea înveliş din material plastic care este secţionat pe toată lungimea sa. După ce pistoletul ajunge în lumenul cervical, acest înveliş protector se retrage. Pentru a învinge rezisteanţa cervixului (în această fază cervixul fiind închis) se folosesc uneori dilatatoare. La circa 10 cm de bifurcaţie, pe cornul uterin corespunzător ovarului ce conţine corpul galben, se depune embrionul, asemănător însămânţării artificiale. Această metodă este exclusiv folosită în present. Traversarea cervixului trebuie să se realizeze cu mare precauţie în vederea evitării lezionării mucoasei acestuia. În vederea relaxării cervixului, a evitării contracţiilor organelor genitale se efectuează anestezia epidurală cu 4-6 ml procaină 2%, sau alte preparate medicamentoase cu efect similar. 2.3. Biotehnologia transferului de embrioni la rumegătoarele mici Ca şi la rumegătoarele mari, folosirea transferului de embrioni la rumegătoarele mici se practică cu scopul multiplicării descendenţei femelelor cu înalt potenţial genetic, introducerii de noi genotipuri prin importul de embrioni congelaţi şi asigurării bazei morfo-fiziologice ale unui model modern de cercetări fundamentale în reproducţia animalelor şi biologia celulară. Reglarea şi controlul funcţiei de reproducţie la rumegătoarele mici sunt influenţate considerabil de factorii de mediu. La latitudini mai mari de 35o, rumegătoarele mici au un sezon de reproducere limitat, care începe către sfârşitul verii şi se încheie către finele sezonului de toamnă. În decursul unui an, funcţia sexuală la oaie se caracterizează prin alternarea a două perioade:o perioadă de anestru fiziologic, cuprinsă între sfârşitul iernii şi începutul verii;o perioadă de activitate sexuală, cu derularea mai multor cicluri sexuale, cuprinsă între sfârşitul verii şi începutul iernii (10-14 săptămâni după cea mai lungă zi). Anestrul fiziologic se datorează atât factorilor materni (anestru de lactaţie), cât şi factorilor climatici (anestru sezonier), efectul acestor factori suprapunânduse. Periodicitatea sexuală sezonieră este atribuită influenţei modulatoare a fotoperiodismului, temperaturii, umidităţii şi alimentaţiei asupra unui ritm ciclic anual de bază, condiţionat genetic. Factorul principal în stimularea funcţiei sexuale la oi este reprezentat de reducerea progresivă a numărului de ore lumină, iar cel subordonat este scăderea temperaturii şi schimbarea alimentaţiei. Din punct de vedere reproductiv oile sunt considerate ca „animalele zilelor scurte“. Fotoperiodismul reglează funcţia de reproducţie la oi prin intermediul melatoninei, hormon secretat de glanda epifiză. Epifiza controlează momentul apariţiei maturităţii sexuale şi sezonul de reproducţie. Melatonina reglează funcţia de reproducţie prin schimbarea secreţiei hormonilor gonadotropi. O dată cu micşorarea zilei lumină, secreţia melatoninei creşte şi activează funcţia sexuală. 82

Factorii de mediu trebuie să aibă un anumit nivel pentru a influenţa pozitiv funcţia de reproducţie: temperatura aerului 8-18oC, umiditatea relativă 65-85%, durata zilei lumină - 4-7 ore. Alţi factori ai mediului ambiant (relaţiile dintre indivizi, masculi/femele, femele/miei, nivelul alimentar) au un rol modulator în blocarea sau declanşarea activităţii reproductive. Utilizarea acestor factori (de ex. efectul „mascul“) permite să se controleze mai bine perioadele de reproducţie. Gradul de ovulaţie variază în timpul sezonului de reproducţie. Nivelul acestui indice este maxim la mijlocul perioadei sexuale. Oile ţinute la temperaturi scăzute, în timpul verii, încep sezonul de reproducţie mai devreme decât cele care în sezonul estival, au fost ţinute la temperaturi obişnuite acestui anotimp. Oile expuse stresului termic în orele de dinainte sau de după estru, prezintă tulburări de fecunditate. Variaţiile raţiei de hrană (date de variaţiile disponibilităţilor alimentare) determină oscilaţii ale nivelului de fertilitate. La latitudini medii, variaţiile fotoperioadei rămân factorul principal care declanşează activitatea reproducţiei la oi (Thimonier J. şi colab., 1986). 2.3.1. Alegerea donatoarelor şi receptoarelor Femelele care intră într-un protocol al transferului de embrioni trebuie să fie selecţionate înaintea începerii operaţiilor propriu-zise. Prima selecţie a donatoarelor se face după valoarea lor genetică pa baza unor criterii apropiate aptitudinilor zootehnice cercetate la rasa respectivă. În general, în alegerea donatoarelor se are în vedere ca acestea să se fi născut în sezonul de reproducţie precedent, fără tulburări ginecologice, să nu fie gestante, cu ovare normale, capabile să răspundă la tratamentul superovulator (examen făcut prin ecografie sau endoscopie) (laparoscopie). În cazul repetării tratamentelor de superovulare, se investighează, prin probe de laborator, prezenţa sau absenţa anticorpilor contra hormonilor folosiţi la tratamentul de superovulare. Femelele tratate de mai multe ori se pot imuniza contra gonadotropinelor heterospecifice şi nu mai răspund la administrarea preparatelor hormonale de acest tip. În cazul folosirii nuliparelor, acestea trebuie să aibă o greutate corporală de cel puţin 60% din greutatea femelei adulte şi să fie în vârstă de cel puţin 8-10 luni. Înaintea lotizării, donatoarele (ca şi receptoarele) se supun mai multor teste serologice pentru depistarea maladiilor contagioase, susceptibile a le afecta (bruceloza, febra Q, clamidioza etc.). Acest criteriu este impus şi de legislaţia sanitar-veterinară din mai multe ţări, care prevede pentru femelele donatoare să fie indemne de boli contagioase. Lotizarea femelelor donatoare şi receptoare se va face cu cel puţin două luni înaintea tratamentului, pentru a se evita efectele negative ale stresului de adaptare la un nou mediu şi pentru a se instala o nouă ierarhie în interiorul lotului reconstituit. Donatoarele şi receptoarele trebuie să fie supuse unui tratament antiparazitar cu spectru larg cu cel puţin o lună înaintea începerii tratamentului. În cazul examenului coprologic pozitiv, tratamentul va fi în special dirijat contra infestaţiei constatate. Alimentaţia donatoarelor şi receptoarelor se va face după norme ştiinţifice. Creşterea nivelului energetic alimentar pe durata a trei săptămâni care precede folosirea la reproducţie (flushing) provoacă, la ovine, o creştere a nivelului ovulaţiei pentru femelele supuse tratamentului de inducere a ovulaţiei şi 83

o diminuare a luteolizei premature pentru oile supuse superovulării. Practica „flushing“-ului este recomandabilă atât pentru donatoare cât şi pentru receptoare şi în special când alimentaţia nu acoperă în totalitate nevoile energetice. La receptoare, nevoile nutriţionale suplimentare datorate gestaţiei, nu sunt diferite de cele legate de o gestaţie naturală, dar ele trebuie luate în consideraţie pentru a se evita avortul consecutiv subalimentaţiei. În preajma fătării, o supraveghere atentă a femelelor previne mortalitatea perinatală şi erorile de descendenţă (filiaţie). Alegerea donatoarelor se face pe baza performanţelor genetice, starea fiziologică şi sanitară. Donatoarele, în general, trebuie să fie de vârstă medie, să aibă o carieră de reproducţie fără tulburări notabile, să fie sănătoase în urma examenului clinic general şi ginecologic, făcut la trei luni înaintea transferului de embrioni. Se respectă un interval de cel puţin 5 luni între ultima fătare şi începutul tratamentului. Alegerea receptoarelor se face, în general, după aceleaşi criterii ca donatoarele, valoarea genetică nefiind luată în consideraţie. Nuliparele sunt cele mai recomandate. În momentul transferului, receptoarele trebuie să fie în vârstă de 8-10 luni şi cu o greutate de cel puţin 60% din greutatea medie a femelei adulte din rasa respectivă (30-35 Kg). În cazul în care receptoarele sunt achiziţionate, acestea se integrează crescătoriei cu cel puţin trei luni înaintea începerii tratamentului, pentru a se adapta la noile condiţii, după ce au fost alese pe baza unor criterii stricte, întrucât femelele destinate reformei prezintă adeseori probleme de reproducţie şi sanitare. Cu trei luni înaintea transferului embrionar şi până la fătare se evită orice tip de stres: alimentar, traumatic, profilactic, sanitar, social etc. 2.3.2. Sincronizarea estrului şi ovulaţiei la femelele donatoare şi receptoare Tratamentele hormonale specifice donatoarelor şi receptoarelor se fac pentru a induce estrul şi superovularea (donatoarelor) sau ovulaţia (receptoarelor) la un moment predeterminat. Aceste tratamente urmăresc de fapt un control temporar al activităţii ovariene, prin mimarea, mai mult sau mai puţin, a mecanismelor endocrine care controlează ciclul sexual. Donatoarele şi receptoarele sunt supuse unei serii de intervenţii, cronologic precise. Înainte de provocarea hormonală a superovulaţiei se impune stabilirea cu exactitate a momentului apariţiei ciclului estral. Depistarea manifestării căldurilor se face de două ori pe zi (dimineaţa şi seara) prin folosirea berbecilor încercători de calitate. Pentru provocarea superovulaţiei, se folosesc oi cu ciclu natural sau sincronizat. Pentru standardizarea stării fiziologice a donatoarelor la începutul stimulării şi mai ales sincronizarea intrării în estru la terminarea tratamentului stimulativ, acestea sunt supuse unui tratament progestativ. La sfârşitul tratamentului progestativ, stimularea creşterii foliculare se face prin administrarea hormonilor gonadotropi cu scopul creşterii numărului de ovulaţii/femelă (superovulaţie). Atât pentru sincronizare (tratamente progestative) cât şi pentru stimularea ovarină (tratament gonadotrop) se folosesc mai multe variante.

84

2.3.2.1. Tratamente progestative de sincronizare Diferă prin substanţele progestagene folosite şi prin calea de administrare: a) injecţii zilnice a câte 12 mg de progesteron intramuscular timp de 17-21 de zile la capră sau 12-14 zile la oaie; b) implante vaginale, reprezentate de bureţi de poliuretan impregnaţi cu 60 mg acetat de medroxiprogesteron (MAP) sau 30-40 mg acetat de fluorogeston (FGA) sunt în prezent cele mai folosite; c) implante cu synchro-mat B (norgestomet-6 mg) care sunt inserate sub pielea de la nivelul suprafeţei externe a urechii. Eficacitatea acestei căi de administrare a progesteronului este asemănătoare celei a pesariilor vaginale. Cel mai folosit tratament de sincronizare este cel care apelează la pesariile vaginale impregnate cu FGA. Durata tratamentului diferă în raport cu specia şi cu sezonul. La ovine, oricare ar fi sistemul de impregnare folosit, durata recomandată a tratamentului variază în funcţie de perioada anului: 14 zile în timpul sezonului sexual şi 12 zile înafara sezonului sexual. La caprine, durata tratamentului trebuie să fie de 17-21 zile (tratament lung), fie 10-12 zile (tratament scurt) în asociere cu prostaglandinele. În cazul tratamentului scurt, la caprele donatoare, durata acestuia este mai scurtă decât cea a unui corp galben ciclic, de aceeea se intervine cu o injecţie de PGF2α (50 µg Cloprostenol, Estrumate, Flavoliz etc), 48 ore înaintea tratamentului progestativ pentru a liza corpii galbeni ce pot fi încă activi în momentul retragerii suportului de progestagen. d) sincronizarea estrului poate fi făcută fără a se realiza impregnarea printr-un progestagen. Se poate induce luteoliza sincronă prin două injecţii, la interval de 10-14 zile, de prostaglandină F2α, (50-100 µg de Cloprostenol etc). Această metodă nu dă rezultate la femelele neciclice (în afara sezonului sexual), iar pe de altă parte, procentul ouălor divizate este mai slab la femelele donatoare decât în cazul unui tratament progestativ. 2.3.2.2. Tratamentele de stimulare ovariană Stimularea creşterii foliculare pentru inducerea superovulaţiei donatoarelor sau ovulaţiei receptoarelor survine cel mai adesea la sfârşitul tratamentului progestativ, şi este realizată prin injecţii intramusculare de gonadotropine hipofizare sau extrahipofizare. Tratamentul gonadotrop pentru inducerea superovulaţiei poate fi efectuat în cursul unui ciclu natural, prin începerea stimulării cu 48 de ore înaintea momentului prezumat al luteolizei spontane, însă această metodă este ineficace în perioada anovulatorie şi dificil de aplicat în cazul tratamentului mai multor femele nesincronizate în prealabil. Administrarea gonadotropinelor are loc, în general, la finele tratamentului progestativ (ceea ce corespunde fazei foliculare a ciclului sexual), care va determina o creştere a numărului de foliculi preovulatori şi la ovulaţia mai multor foliculi. Stimularea cu ajutorul PMSG constă într-o injecţie de 750-1500 U.I. PMSG efectuată 48 de ore înaintea terminării tratamentului progestativ. Durata relativ lungă a activităţii biologice (circa 4-5 zile), nivelul ridicat de PMSG încă în circulaţie în preajma estrului provoacă o activitate foliculară anormală în acest 85

stadiu care perturbă mediul hormonal în timpul fecundaţiei şi a primelor faze ale dezvoltării ouălor. Aceste efecte au drept consecinţă generală o slabă producţie de embrioni de bună calitate şi ca urmare, acest hormon este din ce în ce mai puţin folosit pentru inducerea poliovulaţiei. Repetarea tratamentului superovulator cu PMSG determină o reducere accentuată a răspunsului ovulator. Stimularea cu ajutorul FSH-ului este cea mai frecventă metodă folosită pentru provocarea superovulaţiei la rumegătoarele mici. Cantităţile de FSH care se administrează pentru a obţine superovularea sunt adesea exprimate în mg standard Armour (1 mg Armour este o unitate a activităţii unui test biologic ce corespunde a circa 10-14 µg de hormon FSH pur). Administrarea FSH-p se face în zilele 2, 3 sau 4 după tratamentul progestativ, în doză de 12-24 mg/femelă. Perioada scurtă de înjumătăţire (3-4 ore), face ca doza să fie repartizată în mai multe injecţii pentru a determina superovularea. În intervalul de două-patru zile de la încheierea tratamentului progestativ se injectează FSH-p, 4-8 injecţii, de două ori/zi, la interval de 10-12 ore, în doze descrescânde (trei zile de tratament). Tratamentul de superovulare se poate face şi cu extracte hipofizare de cabaline - HAP (horse anterior pituitary) - sau HMG (human menupausal gonadotropin) care determină un răspuns ovulator şi o producţie de embrioni similare celor observate după tratamentul cu FSH-p la caprine şi ovine, însă aceste preparate sunt puţin disponibile. Pentru provocarea superovulaţiei se poate asocia tratamentul pe bază de PMSG cu cel pe bază de FSH-p. Pentru aceasta, se asociază 48 de ore înaintea retragerii spongiilor vaginale cu o injecţie de 12-18 mg de FSH-p ce se administrează în 6 injecţii sau într-o singură injecţie concomitent cu administrarea de PMSG. Răspunsul superovulator este condiţionat de mai mulţi fatori, între care menţionăm: rasa, individul, apariţia anticorpilor în cazul repetării tratamentului, tipul de hormon folosit etc. 2.3.2.3. Inducerea estrului şi ovulaţiei la receptoare Programarea estrului la femelele receptoare se face printr-un tratament progestativ identic celui folosit la donatoare. Atunci când transferul se face fără interval (imediat), tratamentul progestativ al donatoarelor şi receptoarelor începe în acelaşi moment, astfel încât să se găsească în acelaşi stadiu fiziologic în momentul transferului embrionar. O injecţie de PMSG se face către sfârşitul tratamentului progestativ: injecţia cu PMSG se face cu 48 ore înaintea retragerii spongiilor vaginale la capră şi în momentul retragerii acestora la oaie. Pentru caprele receptoare, injecţia se face cu 48 ore înaintea retragerii bureţilor vaginali impregnaţi cu progestagene, iar ovulaţia se produce cu circa 12 ore mai târziu decât la donatoarele supuse aceluiaşi tratament asociat cu FSH-p. În acest caz, pentru receptoare se întârzie terminarea tratamentului progestativ cu circa 12 ore în raport cu donatoarele care au fost tratate cu progesteron asociat cu FSH-p. La oile receptoare, injecţia de PMSG se face în momentul retragerii spongiilor vaginale. Oile intră în călduri după circa 36 de ore, cu o întârziere de 12 ore, în raport cu donatoarele tratate cu FSH-p. Costul total al tratamentului este de circa 150-225 ff. Dozele de PMSG variază cu sezonul, vârsta şi nivelul producţiei de lapte (caprine). 86

La donatoare, variabilitatea momentului ovulaţiei este un factor limitant al nivelului de fecunditate, mai ales critic în cazul folosirii spermei congelate. Principalul criteriu folosit pentru depistarea începutului estrului este manifestarea reflexului de acceptare a saltului masculului. Pentru a determina practic debutul estrului, se foloseşte un mascul vasectomizat sau prevăzut cu şorţ, care este pus în prezenţa femelei la interval de 4-6 ore, între 20 şi 60 de ore după terminarea tratamentului progestativ. Insuficienţa libidoului la mascul poate fi un factor limitant al eficacităţii detecţiei estrului. 2.3.3. Însămânţarea femelelor donatoare Fecundarea donatoarelor poate fi făcută fie pe cale naturală, practicându-se monta liberă sau dirijată, fie prin însămânţare artificială, când se poate întrebuinţa sperma proaspătă sau congelată care poate fi depusă fie pe cale cervicală sau direct în uter sub controlul endoscopic. În toate cazurile este important să folosim masculii cu o fertilitate ridicată. Monta a fost cea mai întrebuinţată metodă de însămânţare a femelelor donatoare în cursul sezonului sexual atât la ovine cât şi la caprine, însă nu permite folosirea raţională a masculilor valoroşi, repartiţia geografică a acestora fiind neuniformă, aceştia fiind concentraţi în centrele în care se practică însămânţarea artificială (depozite ORSA), când se practică monta liberă, masculii şi femelele sunt lăsaţi împreună pe perioada estimată a căldurilor, pentru fiecare mascul repartizându-se 3-4 femele. În cazul practicării montei dirijate, fiecare femelă descoperită în călduri trebuie să fie dată la montă de cel puţin două ori la interval de 10-12 ore. Momentul însămânţării artificiale cea mai eficace este între 12 şi 24 de ore de la începutul estrului. Când se practică monta în contrasezon, absenţa sau slaba manifestare a libidoului masculilor sunt cauzele nerealizării procentului de fecunditate normal la femelele donatoare, la care se adaugă şi puterea fecundantă foarte scăzută a spermei în această perioadă. Însămânţarea artificială permite valorificarea spermei masculilor a căror valoare genetică este cunoscută. Cercetările au demonstrat faptul că transportul şi supravieţuirea spermatozoizilor în căile genitale femele sunt perturbate după tratamentul progestativ şi/sau cu prostaglandine asociate şi a inducţiei ovulaţiei (Evans şi colab., 1984). Eficacitatea însămânţării artificiale endo- sau exocervicale la rumegătoarele mici superovulate este sensibil redusă comparativ cu animalele martor nesuperovulate. Nivelul ouălor divizate obţinute prin această metodă este adeseori insuficient şi inferior celui obţinut după montă. Mai mult, nivelul fecundaţiilor este strâns dependent de nivelul răspunsului ovulator la tratamentul de stimulare. La ovine, se foloseşte pentru însămânţare numai sperma proaspătă. Conservarea spermei de berbec reduce sub 40% procentul de fecunditate a oilor însămânţate pe cale cervicală. Doza de spermă este de 2x400x106 spermatozoizi total în sperma proaspătă, sperma depunându-se la intrarea în cervix. Anatomia cervixului nu permite trecerea instrumentelor clasice de însămânţare. La caprine, conservarea spermei prin congelare este o practică curentă. Sperma se depune pe canalul cervical la 48 şi 54 de ore (două însămânţări artificiale) sau la 30, 48 şi 54 de ore (trei însămânţări artificiale) după sfârşitul tratamentului progestativ. Totuşi, procentul ouălor fertilizate este scăzut, datorită 87

faptului că nivelul ridicat de estrogeni după un răspuns bun la tratamentul progestativ, inhibă transportul spermatozoizilor pe căile genitale femele. Însămânţarea artificială intrauterină, sub controlul endoscopic, este destul de răspândită la rumegătoarele mici. Această tehnică permite folosirea spermei congelate şi obţinerea unui procent de fecunditate ridicat pentru ovocite. Numărul de spermatozoizi mobili/doză prin practicarea acestei tehnici poate fi redus la circa 80-100 milioane şi se face o singură însămânţare artificială. Însămânţarea artificială intrauterină se face la 48-60 de ore după sfârşitul tratamentului progestativ sau la 20-24 de ore după începutul estrului la capre sau la 32 de ore după începutul căldurilor la oi (87% embrioni viabili). 2.3.4. Recoltarea embrionilor Operaţiile de colectare şi transfer a embrionilor sunt eficiente sub anestezie generală, femelele fiind supuse, în prealabil, unei diete alimentare şi hidrice în cursul a 24 de ore care premerg intervenţia chirurgicală. Embrionii sunt recoltaţi prin „spălări succesive“ a celor două coarne uterine în a 6-a sau a 7-a zi după începutul estrului. Acest interval de timp relativ scurt în care embrionii pot fi recoltaţi, este condiţionat de mai mulţi factori: - trecerea embrionilor din lumenul oviductului în cel al coarnelor uterine se produce începând cu a 4-a zi; - pentru raţiuni sanitare, legislaţia prevede ca embrionul să fie transferat înainte de a ieşi din zona pelucidă, care poate surveni începând cu a 8-a zi; - congelarea embrionilor se poate face cel mai bine când aceştia se găsesc în stadiile de morulă compactă şi blastocist (a 6-a sau a 7-a zi de la începutul estrului). Mediul de colectare este PBS (phosphate buffered saline) cu adaos de 2% albumină serică bovină sau de 10% ser de viţel fetal menţinut la 37oC. Embrionii sunt recoltaţi aproape în exclusivitate, fie prin laparotomie abdominală (metoda chirurgicală), fie sub control endoscopic (colectare prin endoscopie sau laparoscopie). S-a încercat colectarea embrionilor şi prin mijloace nechirurgicale, pe cale cervicală, asemănător ca la rumegătoarele mari sau la cabaline, însă rezultatele sunt foarte slabe, datorită traversării dificile a conductului cervical şi a imposibilităţii manipulării coarnelor uterine prin palpare rectală. Recoltarea prin metoda chirurgicală se face pe femela sub anestezie generală, contenţionată pe o masă în decubit dorsal, cu o înclinare antero posterioară de 35-45o. Se face o incizie lungă de 8-10 cm pe linia albă înaintea ataşării mamelei. Se exteriorizează coarnele uterine, se numără corpii galbeni de pe ambele ovare, pentru a se aprecia răspunsul la tratamentul de superovulare (foto 29). În cazul în care recoltarea se face după două-patru zile de la debutul estrului, majoritatea embrionilor se regăsesc în lumenul oviductului. Un cateter cu un diametru de 1 mm se introduce circa 2 cm pe lumenul oviductului prin pavilion, apoi 4 ml de PBS sunt injectaţi cu scopul de a-i antrena în coarnele uterine. Apoi se spală coarnele uterine sau se recuperează la nivelul pavilionului oviduc-tului perfuzatul injectat la baza coarnelor uterine . În cazul în care recoltarea embrionilor se face în zilele 6-7, se spală fiecare corn uterin cu ajutorul lichidului special introdus la acest nivel. Se face o puncţie 88

la baza coarnelor uterine, la nivelul ligamentului intercornual. Pe la nivelul puncţiei se introduce o sondă Folley. Lumenul uterin la baza coarnelor uterine este obturat, prin umflarea balonaşului situat la extremitatea sondei. Printr-un cateter introdus la nivelul joncţiunii utero-tubare se injectează 40-50 ml de PBS, recuperarea lichidului care antrenează şi embrionii făcându-se prin sonda Folley. Mediul de spălare poate fi injectat la nivelul sondei Folley şi recuperat prin cateterul introdus anterior (perfuzie anterogradă ) legat cu un tub steril plasat întro baie marină la 37oC. Se procedează la spălarea succesivă şi separată a celor două coarne uterine apoi se introduce un antibiotic în cavitatea abdominală şi se închide plaga de la nivelul coarnelor uterine şi al peretelui abdominal. Această metodă este cea mai răspândită la rumegătoarele mici. Nivelul de recuperare a embrionilor oscilează între 70 şi 90%, însă diminuă mult atunci când se fac recoltări repetate de la acelaşi animal (52-24%) la ovine şi 65-42% la caprine în cazul colectărilor 2 şi 3. Recoltarea prin endoscopie (laparoscopie). Femela anesteziată se contenţionează pe o masă de operaţie, în decubit dorsal, cu o înclinare anteroposterioară de 30-45oC. O primă puncţie se face la 4-5 cm înaintea glandei mamare şi la 10-15 cm la stânga liniei albe. Se introduce o canulă cu un diametru de 7 mm, care poartă endoscopul. Se insuflă aer filtrat în cavitatea abdominală pentru a separa viscerele de organele genitale. A doua canulă, cu un diametru de 5 mm, se introduce în partea opusă primei, în raport cu linia albă şi prin care se introduce o pensă atraumatică pentru a manipula tractusul genital. Cu ajutorul pensei, corpii galbeni de pe fiecare ovar pot fi număraţi. Un corn uterin se prinde la nivelul ligamentului intercornual şi se puncţionează cu un ac având diametru de 2,5 mm. A treia canulă, cu diametru de 5 mm, se plasează pe linia albă, la 15 cm de prinderea glandei mamare. Prin această canulă se introduce o sondă cu trei căi până în lumenul uterului. Balonaşul fixat la sondă este umflat cu aer prin intermediul unei seringi cu scopul de a obstrua lumenul uterin la baza coarnelor uterine. Extremitatea cateterului este deplasată cât mai aproape posibil de joncţiunea utero-tubară. Pensa se fixează la nivelul istmului pentru a se evita refularea mediului de colectare în oviduct. Mediul de colectare se injectează prin corpul sondei (40-50 ml pentru fiecare corn). Presiunea creată de lichidul introdus permite returul acestuia prin cateter. Se poate folosi şi o sondă cu două căi. În acest caz, a doua puncţie se face la vârful cornului uterin pe unde se inseră un cateter de injecţie, fixat la pensa atraumatică. Mediul de colectare injectat prin cateter este recuperat prin sonda plasată la baza coarnelor uterine. Proporţia de embrioni recuperaţi prin endoscopie este inferioară cu 10-15% celei obţinute prin chirurgie, însă repetarea colectărilor de la aceeaşi femelă prin endoscopie nu provoacă reducerea proporţiei de embrioni colectaţi. 2.3.5. Examenul şi aprecierea embrionilor Mediul de colectare recuperat după clătirea coarnelor uterine este turnat într-o placă Petri cu fundul cadrilat care să uşureze cercetarea embrionilor la o lupă binoculară. Embrionii depistaţi sunt aspiraţi cu ajutorul unei pipete fine sau a unei seringi racordată la un tub transparent din plastic şi introduşi într-o cutie Petri mai mică ce conţine PBS filtrat şi suplimentat cu 4% albumină serică bovină sau 10% ser de oaie sau de capră. Se apreciază calitatea embrionilor recuperaţi.

89

Mediul de colectare şi examen a embrionilor este menţinut la o temperatură de +25+27oC, clasificarea embrionilor făcându-se în următoarele categorii: nefecundaţi, degeneraţi, retardaţi sau morulă compactă, blastocişti tineri, blastocişti extinşi sau blastocişti ieşiţi din zona pelucidă. Viabili se consideră embrionii care au o formă regulată, sferică, cu citoplasma omogenă, înveliă transparent, blastomere de dimensiuni identice distribuite uniform. Foarte importantă este şi stabilirea nivelului de segmentare, dat fiind că încetinirea ritmului de diviziune constituie, în majoritatea cazurilor, dovada unui început de degenerare a embrionilor. Embrionii sunt clasaţi în excelenţi, buni, de calitate medie sau necorespunzători. Numărul de embrioni degeneraţi creşte considerabil cu vârsta acestora, începând cu a 5-a zi de la însămânţarea artificială. Abaterile de la morfologia normală survin la animalele donatoare sub acţiunea nefavorabilă a unor concentraţii ridicate de steroizi ovarieni. Majoritatea embrionilor degenerează în stadiul de morulă până în ziua a 8-a. În practică se poate asigura un procent ridicat de fătări alegându-se embrioni după atingerea stadiului de blastocist. În momentul colectării - în ziua a 7-a - unii embrioni de oaie şi capră pot prezenta o uşoară întârziere în dezvoltare (morulă compactă) pe când alţii sunt într-un stadiu de dezvoltare mai avansat (blastocist ieşit din zona pelucidă). La capre, dezvoltarea embrionară precoce apare cu o întârziere de 12-24 de ore în raport cu cea observată la oi. În ziua a 7-a după debutul estrului, proporţia embrionilor în stadiul de blastocist ieşit din zona pelucidă este mai ridicat la oi decât la capre (oaie: 95%; capră: 63%) (Meineche-Tillman, 1990 citat de G. Baril şi colab., 1993). Embrionii care au o întârziere în dezvoltare mai mare de 48 de ore sunt eliminaţi. În stadiul de blastocist, diversele structuri (blastocel, trofoblast, buton embrionar) trebuie să fie vizibile şi să prezinte un contur bine delimitat. Prezenţa blastomerelor în spaţiul perivitelin, a granulaţiilor la suprafaţa celulelor, absenţa contururilor celulare vizibile sau prezenţa unei opacităţi evidente a blastomerelor, constituie criterii de eliminare a embrionilor. După aprecierea calităţii embrionilor, embrionii transferabili sunt trecuţi prin 10 băi succesive de PBS în vederea înlăturării eventualelor bacterii sau viruşi. Această practică este recomandată de Societatea Internaţională de Transfer Embrionar şi conferă o siguranţă sanitară pentru stocarea sau folosirea unui embrion sănătos. 2.3.6. Congelarea-decongelarea embrionilor Într-un interval de timp care nu depăşeşte două ore de la colectare, după clătire, embrionii sunt trecuţi prin mai multe băi succesive de PBS adiţionat cu glicerol: 0,7 M (10 minute), apoi 1,4 M (10 minute) sau etilen glicol 0,5 M (5 minute), 1 M (5 minute), 1,5 M (5 minute), asemănător celor precizate la bovine. Embrionii sunt condiţionaţi în paiete mici (0,25 ml) şi congelaţi treptat, scăderea temperaturii mediului făcându-se cu circa 1oC/minut până la -7oC. În acest stadiu, cristalizarea este indusă (vezi cele menţionate la congelarea embrionilor bovini), apoi scăderea temperaturii se face cu câte 0,3oC/minut până la -35oC, după care paietele sunt introduse direct în azot lichid. 90

Decongelarea se face, ca şi la embrionii bovini, prin imersia paietelor cu embrioni, timp de 30 secunde, într-o baie-marie la 37oC. Apoi embrionii sunt trecuţi succesiv prin 3-4 băi de PBS, la care s-a adăugat crioprotector în concentraţie descrescândă (invers decât la congelare): glicerol (1,0 M, 0,7 M, 0,3 M, 0,0 M); etilen-glicol (1,0 M, 0,5 M, 0,0 M). Aceasta permite o rehidratare progresivă a celulelor embrionare. Se apreciază iarăşi calitatea embrionilor, cei care au suferit în timpul acestor operaţii fiind eliminaţi. 2.3.7. Transferul embrionilor la femelele receptoare Transferul embrionilor trebuie să se facă într-un interval cât mai scurt de timp de la recoltare (sub 4 ore) sau decongelare (30-40 de minute). Transferul se realizează aproape în exclusivitate chirurgical, laparoscopic. 2.3.7.1. Transferul chirurgical După anestezia femelei receptoare, se face o incizie de 7-8 cm în lungul liniei albe, 3-4 cm înaintea ataşării glandei mamare. Se exteriorizează coarnele uterine, se examinează ovarele pentru a se alege cornul uterin pe care urmează să se facă transferul. Embrionii sunt aspiraţi într-un volum mic de PBS (30-50 µl), aplicând principiul celor trei compartimente (vezi transferul de embrioni la bovine), de regulă într-un cateter adaptat la o seringă de 1 ml. Diametrul extern al capilarului-cateter trebuie să fie de circa 1 mm. Se puncţionează cornul cu un ac cu vârful conic, apoi se introduce 2-3 cm capilarul fără a leza mucoasa şi se expulzează uşor embrionii către treimea superioară a cornului uterin ipsilateral ovarului care prezintă un corp galben funcţional. De regulă, se transferă doi embrioni în acelaşi corn uterin. După transfer se instilă în cavitatea abdominală 1000000 U.I. penicilină, peritoneul şi pielea fiind apoi suturate (foto 24).

Foto 24 Transferul embrionilor la oile receptoare (I.C.P.C.O.C. Palas-Constanţa)

91

2.3.7.2. Transferul embrionilor sub controlul endoscopic Receptoarea anesteziată este fixată în decubit dorsal pe o masă de contenţie înclinată la 30-35oC. Se pregăteşte şi dezinfectează câmpul operator, înaintea glandei mamare. Se face o puncţie în abdomen pe unde se introduce canula endoscopului. Se insuflă puţin aer prin canulă pentru a se uşura vizualizarea tractusului genital. O a doua canulă este inserată în partea opusă primei, în apropierea liniei albe, prin care se introduce o pensă de manipulare atraumatică. Cu ajutorul acestei pense se controlează răspunsul ovulator pe fiecare ovar şi se alege cornul uterin pe care urmează să fie transferaţi embrionii, corespunzător ovarului care are corpul galben funcţional. Cornul uterin ales pentru transferul embrionilor este prins în apropierea joncţiunii utero-tubare şi puncţionat cu un ac lung de 30 cm şi cu un diametru de 1,5 mm, în prealabil inserat sub linia albă. Embrionii sunt cundiţionaţi într-un volum de 30-50 µl (sistem cu 3 compartimente: lichid, aer, lichid+embrion) într-un capilar lung de 70 mm, cu diametrul de 1 mm, adaptat la o seringă de 1ml printr-un tub lung de 20 de cm. Capilarul şi furtunul sunt introduse într-un tub metalic care asigură rigiditatea şi maniabilitatea ansamblului. Printr-o a 3-a canulă plasată pe linia albă la 15 cm de la ataşarea glandei mamare, capilarul de transfer este introdus în cavitatea abdominală, apoi, prin punctul de joncţiune în lumenul uterin unde cei doi embrioni sunt depuşi cu atenţie. După retragerea instrumentelor, se pulverizează un antibiotic la nivelul celor trei locuri de puncţie a peretelui abdominal. După căpătarea dexterităţii necesare, transferul prin endoscopie se poate face în 5-10 minute, iar traumatismul provocat este mult mai redus decât în cazul transferului pe cale chirurgicală. Procentajul de reuşită a transferului de embrioni prin cele două metode variază între 70,5% şi 75,6% la caprine şi între 69% şi 74% la ovine. Pentru reuşita transferului de embrioni la rumegătoarele mici, o condiţie importantă constă în sincronizarea cât mai bună a ciclurilor estrale la donatoare şi receptoare, astfel încât, să existe concordanţă între particularităţile dezvoltării embrionului şi modificările mediului uterin.

92

ÎNTREBĂRI RECAPITULATIVE 1. Definiţi şi detaliaţi importanţa transferului de embrioni la animale. 2. Care sunt etapele transferului de embrioni? 3. Prin ce mijloace se poate realiza sincronizarea estrului şi ovulaţiei la femelele donatoare şi receptoare de embrioni? 4. Care sunt schemele de tratament poliovulator la vaci? 5. Care sunt schemele de tratament poliovulator la oi? 6. Care sunt particularităţile recoltării embrionilor la vacă? 7. Care sunt particularităţile recoltării embrionilor la oaie? 8. Care sunt criteriile după care sunt evaluaţi calitativ embrionii recoltaţi de la femelele donatoare? 9. În ce constau tehnicile de conservare a embrionior? 10. Care sunt tehnicile transferului de embrioni la vacă şi oaie? TEME 1. Folosirea preparatelor hormonale pentru sincronizarea estrului si inducerea poliovulatiei la rumegatoare 2. Recoltarea embrionilor la taurine 3. Evaluarea embrionilor la rumegatoare 4. Congelarea embrionilor 5. Transferul embrionilor la receptoare REFERATE 1. Biotehnologia transferului de embrioni la taurine 2. Biotehnologia transferului de embrioni la ovine si caprine

93

CAPITOLUL III BIOTEHNICI DERIVATE SAU FINALIZATE PRIN TRANSFER DE EMBRIONI

3.1. Fecundaţia „in vitro“ Este o biotehnică de actualitate, prin intermediul căreia procesele fiziologice de maturare a gameţilor femeli şi de capacitare a spermatozoizilor, fecundaţie şi cultură a embrionilor până la stadiul transferului acestora în organismul femelelor receptoare, sunt dirijate şi se produc, parţial sau total, în afara organismului femelei („in vitro“) în diferite medii de cultură. Această biotehnică, deşi bazele teoretice şi practice au fost puse cu circa 4-5 decenii mai înainte, a căpătat un interes mai deosebit în ultimele două decenii. Cu toate preocupările destul de intense în acest domeniu, succesul înregistrat la mamiferele domestice este destul de limitat. La mamifere, fecundaţia fiind internă, analiza intimă a mecanismelor implicate în acest proces biologic este delicată şi costisitoare. Fecundaţia „in vitro“ constituie o biotehnică ce permite studierea „in vitro“ a interacţiunilor dintre cei doi gameţi sub rezerva reproducerii artificiale a condiţiilor identice existente ,,in vivo“. După cum s-a studiat la capitolul „Fecundaţie“, elementele esenţiale ale acestui interesant şi complex proces, constau dintr-o serie de interacţiuni între cei doi gameţi care, în final, conduc la unirea lor şi la combinarea genotipurilor. Principalele „secvenţe“ ale fecundaţiei se referă la: - fixarea spermatozoizilor de zona pelucidă, urmată de străbaterea acestei membrane; - fuzionarea membranelor plasmatice ale celor doi gameţi; - încorporarea spermatozoidului în ooplasmă şi activarea ovocitului; - singamia. În momentul ovulaţiei, ovocitul este captat de pavilion şi descinde de-a lungul oviductului. La majoritatea animalelor de fermă, celulele coroanei radiata sunt eliminate rapid după ovulaţie. Spermatozoizii dobândesc puterea lor fecundantă în cursul înaintării prin tractusul genital femel. Numărul gameţilor masculi care ajung la nivelul oviductului, în momentul ovulaţiei, este foarte restrâns, astfel încât raportul dintre spermatozoizi şi ovocite la rumegătoare variază de la 1 la 10. De asemenea, reacţia acrozomului spermatozoidului se produce la nivelul zonei pelucide. În consecinţă, rolul oviductului este de a asigura dezvoltarea embrionului până la stadiul de 8-16 celule, apoi acesta trece în vârful cornului uterin. Cercetările efectuate au relevat faptul că fluidul oviductului (sau lichidul tubar) nu este un simplu transsudat sanguin, ci este un mediu cu unele însuşiri fizico-chimice speciale: concentraţie mai ridicată a ionilor de K+ şi un nivel mai scăzut al concentraţiei ionilor de Mg++, comparativ cu serul sanguin. Volumul secreţiei tubare este hormono dependent. Lichidul tubar poate suferi unele schimburi cu lichidul peritoneal. În condiţii naturale, embrionul părăseşte oviductul, în general, după al 3lea clivaj, iar dezvoltarea zigotului la nivelul oviductului nu este strict specifică. 94

Astfel, embrionii bovini se dezvoltă în oviductul ligaturat de oaie sau iepuroaică. Această dezvoltare a embrionului până la stadiul de blastocist la nivelul oviductului chiar provenind de la altă specie, constituie un fenomen remarcabil. Primele rezultate obţinute cu ovocite maturate „in vivo“ au fost obţinute în anul 1954 la iepuroaică, în 1969 la şoarece şi în 1980 la bovine (Marquant B. şi colab.,1991). Primul produs obţinut printr-o astfel de biotehnică este consemnat în anul 1959 la iepure, 1978 la om şi în 1982 la bovine. În ceea ce priveşte produşii rezultaţi prin fecundaţia cu ovocite maturate „in vitro“, în 1972 s-au obţinut primii zigoţi de şoarece prin fecundarea ovocitelor cu spermatozoizi recoltaţi de la nivelul epididimului; în anul 1973 s-au obţinut produşi la iepure prin fecundarea ovocitelor cu spermatozoizi capacitaţi în uter; în anul 1986 s-au obţinut primii miei, prin folosirea la fecundarea ovocitelor a spermatozoizilor ejaculaţi; în 1986 s-au obţinut primii viţei folosindu-se pentru fecundarea ovocitelor spermatozoizi conservaţi prin congelare (Marquant B. şi colab.,1991). După aceste prime succese înregistrate, fecundaţia „in vitro“ s-a generalizat, după cum s-a văzut, la toate mamiferele de interes zootehnic, însă obţinerea unui nivel ridicat de fecundaţie „in vitro“ s-a înregistrat mult mai târziu. Nivelul relativ scăzut de fecundaţie înregistrat în perioada de început a aplicării fecundaţiei „in vitro“s-a datorat în special, folosirii unei temperaturi inadecvate acestei etape. S-a demonstrat că temperatura centrală la mamifere este de 39oC ceea ce face ca nivelul procentului de fecundaţie înregistrat la incubarea gameţilor la 37oC să fie extrem de scăzut. Etapele fecundaţiei „in vitro“ sunt: - obţinerea ovocitelor; - maturarea „in vitro“ a ovocitelor; - capacitarea spermatozoizilor; - fecundarea şi cultura „in vitro“; - transferul embrionilor rezultaţi. 3.1.1. Obţinerea ovocitelor Sursele posibile pentru ovocite sunt: - ovocite provenite prin puncţia foliculilor maturi de la femele cu estru spontan sau superovulat, recoltate înainte sau imediat după ovulaţie; - ovocite obţinute din foliculi imaturi, recoltate din ovarele femelelor sacrificate sau ovariectomizate; - ovocite rezultate din oviducte, imediat după ovulaţie. Prima şi a treia sursă de ovocite sunt limitate, deoarece numai un număr mic de foliculi se maturează şi ovulează spontan, sau numai un număr relativ restrâns de foliculi pot fi activaţi prin injectarea hormonilor gonadotropi. Ovocitele mature pot fi recoltate din foliculi maturi sau din oviduct în primele 6 ore de la ovulaţie, plasate într-un mediu Krebs-Ringer şi incubate la 38oC, umiditatea relativă de 100% şi 5% atmosferă de CO2. Ovocitele obţinute prin puncţia ovarelor provenite de la animalele sacrificate la abator sau a ovarelor obţinute prin ablaţia acestora, constituie o sursă importantă de gameţi femeli, însă aceste ovocite necesită a fi maturate ,,in vitro“. Puncţia foliculilor pe animalul viu permite folosirea donatoarelor de ovocite cu potenţial genetic cunoscut. Pentru recoltarea ovocitelor în astfel de condiţii se mai poate folosi un endoscop, cuplat la un sistem de aspirare, în vederea prelevării lichidelor foliculilor cu un diametru de 2-6 mm, de la vaci stimulate sau nu cu 95

hormoni gonadotropi exogeni. De asemenea, puncţia foliculilor, ghidată prin ecografie transvaginală permite colectarea fluidului folicular şi a complexelor ovocite-cumulus. Această tehnică poate fi repetată de mai multe ori în cursul aceluiaşi ciclu, fără a afecta fertilitatea ulterioară a femelei donatoare. 3.1.2. Maturarea „in vitro “ a ovocitelor Ovocitele prelevate din foliculii antrali, prin laparotomie sau sacrificarea femelelor, reiau spontan meioza dacă sunt plasate într-un mediu special de cultură, la 38oC, incubate într-o atmosferă de 5% CO2. Prezenţa unui cumulus compact şi intact în momentul cultivării ovocitelor favorizează reluarea meiozei pentru majoritatea ovocitelor. Studii de microscopie electronică au arătat că celulele cumulus-ului emit numeroase prelungiri ce traversează zona pelucidă şi stabilesc legături funcţionale complexe cu citoplasma ovocitului. Aceste legături, parţial sunt întrerupte, după 3 ore de cultură a ovocitului în mediul special, pentru ca după 16-18 ore de cultură, contactele dintre celulele cumulus-ului şi ovocit să dispară complet. Ruperea membranei nucleare se produce după 6-12 ore de cultură şi emiterea primului globul polar după 24 de ore. Aceste transformări nucleare, ce deosebesc maturarea „in vitro“ a ovocitelor, modificări observabile prin tehnici histologice, sunt însoţite de modificări citoplasmatice mult mai greu de decelat prin mijloace actuale de investigare. S-a dovedit, prin multiple experienţe, că ovocitele cultivate în foliculul lor se maturează asemănător celei observate ,,in vitro“. La oaie, Staigmiller şi Moor, 1984 (citaţi de Marquant B., 1991) au arătat că adăugarea unei suspensii de celule obţinute din granuloasa foliculilor ovarieni în mediul de cultură, permite o maturare normală a ovocitelor. La vacă, nivelul maturării ovocitelor în medii cu sau fără adaos de celule din granuloasă, nu variază mult, însă prezenţa acestor celule permite restabilirea potenţialului de dezvoltare a ovocitelor după fecundaţia „in vitro“. Ovocitele obţinute prin puncţia foliculilor dispuşi mai în profunzimea cortexului ovarian au un potenţial de maturare şi dezvoltare ulterioară mult mai slabe, comparativ cu ovocitele obţinute prin puncţia foliculilor mari, maturi, situaţi la suprafaţa ovarului.

3.1.3. Capacitarea spermatozoizilor Spermatozoizii mamiferelor nu sunt capabili de fecundare a ovocitelor, din momentul ejaculării. Spermatozoizii trebuie să parcurgă o perioadă de pregătire, numită „capacitare“, care are loc „in vivo“, în tractusul genital femel. Capacitarea este o etapă pregătitoare necesară, în urma căreia spermatozoizii dobândesc capacitatea de a se fixa pe zona pelucidă a ovocitului şi suferă, apoi, reacţia acrozomului. Studiile de microscopie electronică au arătat că în decursul etapei de „capacitare“ au loc două fenomene mai importante: - modificări la nivelul membranelor spermatozoidului şi acrozomică externă, precum, migrarea proteinelor de acoperire cu formarea de zone libere de proteine, ceea ce permite fuziunea membranelor plasmatice şi acrozomică externă, în momentul reacţiei acrozomului. Prin orificiile create, se elimină o cantitate din 96

colesterolul care antrenează o diminuare a raportului colesterol/fosfolipide, asociate unei permeabilităţi membranare crescute pentru ionii de calciu. Pe baza acestei constatări, toate mediile de capacitare folosite au în comun prezenţa serului albuminic, care este un acceptor de colesterol; - modificarea mişcării spermatozoidului care, din liniară (prin înşurubare) traiectoria devine, mai mult sau mai puţin circulară, mişcare ce se datorează creşterii permeabilităţii pentru ionii de calciu. Amplitudinea mişcărilor cozii se măreşte, spermatozoidul fiind calificat ca „hipermobil“. Diversele medii şi tehnici întrebuinţate pentru capacitarea spermatozoizilor ,,in vitro“ au în vedere faptul de a permite spermatozoizilor să sufere toate aceste modificări şi mai ales să le menţină o mobilitate ridicată. Capacitarea spermatozoizilor s-a obţinut prin incubarea acestora la 37oC, timp de una-două ore, într-un mediu cu o forţă ionică crescută, ceea ce a dus la detaşarea proteinelor de acoperire. Aplicarea acestei tehnici la sperma recoltată prin ejaculare de la taur, a permis obţinerea unui procent de fecundaţie ridicat şi naşterea de viţei normali, după transferul embrionilor obţinuţi prin fecundarea gameţilor în astfel de medii. Diversele studii întreprinse pe această problemă, au arătat că fenomenul de capacitare a spermatozoizilor ,,in vitro“ este mult diferit de cea realizată „in vivo“. În oviduct, în condiţii naturale, fecundaţia are loc în absenţa celulelor din cumulus, pe când „in vitro“ ovocitele nude, în momentul contactului cu spermatozoizii sunt fecundate într-o proporţie foarte scăzută comparativ cu ovocitele înconjurate de celule din cumulus. Aceasta presupune că celulele din cumulus au probabil un rol în capacitarea „in vitro“ a spermatozoizilor. Majoritatea cercetătorilor care se ocupă de aspectele fecundaţei „in vitro“ folosesc sperma congelată, cu rezultate bune. Alte medii capacitante pentru spermatozoizi sunt cele care conţin ionoforul calcic, asociat sau nu cu cafeina. Totodată, cafeina pare a fi un agent capacitant mai apropiat de condiţiile naturale, deoarece această substanţă se găseşte pe traiectul căilor genitale după ovulaţie. S-a dovedit că spermatozoizii de taur posedă receptori pentru heparină, aceştia acţionând în funcţie de doză şi uşurează pătrunderea calciului în spermatozoid. Se mai foloseşte, în mediile capacitante, lichidul folicular, care, între altele, conţine şi heparină. Un nivel de capacitare satisfăcător se obţine atunci când se practică o concentraţie ridicată de spermatozoizi în mediu, care trebuie să fie de 3-4 miliarde spermatozoizi/ml, când nivelul fecundaţiei atinge 87% dintre ovocite. 3.1.4. Fecundaţia şi cultura „in vitro“ a embrionilor Fecundarea se realizează prin cultura timp de o zi într-un mediu special a 0,1ml suspensie de spermatozoizi, cu concentraţie ridicată, împreună cu ovocite mature, în atmosferă de 5%CO2, 5%O2 şi 90%N2. După 24 de ore de cultură împreună cu spermatozoizii, ovocitele fecundate sunt transferate într-un mediu special în vederea dezvoltării ulterioare. Ovocitele se examinează la stereolupă şi sunt considerate ca fecundate atunci când se constată: - prezenţa spermatozoizilor în spaţiul perivitelin; - prezenţa spermatozoizilor în ovoplasmă; - prezenţa pronucleilor şi apariţia segmentaţiei. „In vivo“, după fecundaţie, embrionul începe dezvoltarea sa în oviduct, înainte de a ajunge în uter (ziua 4-5 la rumegătoare), în stadiul de morulă tânără. 97

„In vitro“, oricare este mediul de cultură folosit, zigoţii se blochează în stadiul de 8 celule. Pentru mult timp, singurul mijloc de a asigura depăşirea stadiului de blocaj evolutiv l-a constituit transferul tinerilor zigoţi în oviductul unei gazde intermediare (iepuroaică) şi apoi transferul lor în uterul femelelor receptoare. Experienţele au dovedit că cultura zigoţilor de rumegătoare pe un strat de celule tubare a permis obţinerea blastociştilor şi a nou-născuţilor, după transferul la femelele receptoare. Totodată s-a demonstrat că prin co-cultura zigoţilor cu vezicule trofoblastice permitea la circa 40% dintre aceştia să depăşească stadiul de 8 celule (Marquant B. şi colab.,1991). Ouăle fecundate „in vivo“, apoi cultivate „in vitro“ pe un strat de celule prelevate din oviduct, unde evoluează până la stadiul de blastocist, au un aspect morfologic normal. Totuşi, studiul histologic atent a relevat faptul că aceşti blastocişti, comparativ cu cei prelevaţi „in vivo“ sunt alcătuiţi dintr-un număr redus de celule, multe dintre ele pe cale de degenerare. Însă cultura embrionilor pe un strat de celule tubare, apoi uterine şi adiţionarea unui factor de creştere în mediul de cultură a permis realizarea unui nivel important de dezvoltare până la stadiul de blastocist ca şi a unui nivel de ecloziune, comparabil cu cel realizat „in vivo“. Aceste experienţe demonstrează faptul că oviductul nu îndeplineşte un rol specific în trecerea de la starea de blocaj spre stadiile ulterioare evolutive, deoarece blastociştii pot fi obţinuţi şi prin co-cultura cu celule trofoblastice, din cumulus, ca şi cu celule prelevate din oviduct. 3.1.5. Transferul embrionilor obţinuţi „in vitro“ Se face în uterul femelelor receptoare, din aceeaşi specie, a cărei ciclu sexual a fost sincronizat cu vârsta embrionilor obţinuţi „in vitro“. Nivelul gestaţiei în urma transferului sincron şi asincron a embrionilor bovini cultivaţi „in vitro“ arată că nivelul cel mai ridicat de gestaţii s-a obţinut atunci când femelele receptoare se găsesc în ceea ce priveşte ciclul sexual, în întârziere cu una-două zile, faţă de vârsta teoretică a embrionilor (tab. 1). Embrionii obţinuţi conţin un număr mai redus de celule, cu toate că morfologic apar normali, de aceea nivelul gestaţiei este mai ridicat atunci când receptoarele sunt din punct de vedere al ciclului sexual în întârziere, în raport cu vârsta teoretică a embrionului. Aceasta evidenţiază faptul că mediile de cultură folosite nu sunt adecvate integral. Nivelurile de dezvoltare a embrionilor obţinuţi „in vitro“ transferaţi receptoarelor şi a gestaţiei sunt mai scăzute comparativ cu cei obţinuţi după transferul de embrioni „in vivo“. Tabelul 1 Nivelul gestaţiei după transferul sincron al embrionilor bovini după maturare, fecundare şi cultură „in vivo“ în condiţiile transferului a câte 2 embrioni/receptoare (Kajihira şi colab.,1990 cit. de Marquant B. şi colab., 1991) Sincronism între stadiul de dezvoltare al embrionilor şi stadiul ciclului sexual al receptoarelor -2,5 -2,0 -1,5 -1,0 0 la +1 98

Număr de receptoare

Gestaţii (%)

8 22 17 27 13

63 82 59 59 46

Pe ansamblul aplicării acestei biotehnici, nivelurile gestaţiei sunt mai slabe în raport cu numărul ovocitelor folosite, chiar atunci când zigoţii sunt cultivaţi în oviductul unei gazde intermediare. 3.1.6. Importanţa, perspectivele şi aplicaţiile fecundaţiei „in vitro“ Contrar ameliorărilor tehnice aduse în ultimii ani acestei biotehnici, randamentul global rămânea relativ scăzut, fapt ce a încetinit ritmul aplicării în practică pe o scară mult mai mare. Cercetările ulterioare trebuie să fie orientate, mai ales, spre creşterea randamentului diverselor etape, în particular cea a culturii embrionilor. Cu toate dificultăţile întâmpinate, fecundarea „in vitro“ rămâne un necesar şi indispensabil stadiu pentru înţelegerea diferitelor fenomene, îndeosebi a stadiilor dezvoltării iniţiale a embrionului. La bovine, folosirea pentru fecundaţia „in vitro“ a ovocitelor provenite de la femele fără valoare genetică (recoltate de la abator) permite stabilirea unui diagnostic precoce a fertilităţii taurilor folosiţi la însămânţări artificiale. Întradevăr, s-a pus în evidenţă o corelaţie între nivelul dezvoltării globale „in vitro“ (numărul de blastocişti/număr ovocite supuse fecundării) şi fertilitatea taurilor „in vivo“ (nivelul NR% la două-trei luni). Tehnica maturării „in vitro“ permite producerea la preţuri scăzute a unui număr mare de ovocite care pot fi utilizate ca receptoare de nuclei ai embrionilor proveniţi de la vacile cu înalt potenţial genetic, în cursul clonării. Acest aspect este valorificat comercial de unele firme americane. Puncţia foliculilor antrali, pe animalul în picioare, prin folosirea metodelor endoscopice sau ecografice transvaginale permite folosirea femelelor donatoare de ovocite de un înalt potenţial genetic, într-un număr ridicat. Acest tip de colectare şi maturare „in vitro“ a ovocitelor va deveni rentabil numai atunci când randamentele realizate vor permite producerea, pe donatoare, a unui număr de embrioni superior celui obţinut în prezent prin superovulare, fecundaţie „in vivo“ şi colectare transcervicală a zigoţilor. Prin practicarea acestei biotehnici există posibilitatea reducerii numărului necesar de spermatozoizi pentru a obţine o fecundaţie, şi în consecinţă, folosirea cu intensitate sporită a spermei provenită de la animale valoroase pentru fecundarea unui număr crescut de ovocite, comparativ cu celelalte biotehnici (însămânţări artificiale şi transfer de embrioni). Totodată, fecundaţia „in vitro“ va permite în viitorul apropiat intensivizarea procesului de ameliorare genetică a efectivelor de animale. Prin această biotehnică, se pot obţine mai multe ovocite de la aceeaşi femelă, ovocite care pot fi fecundate cu spermatozoizi proveniţi de la mai mulţi reproducători, fapt ce ar constitui un mare avantaj pentru testarea reproducătorilor masculi şi femeli. Microinjecţia de spermatozoizi în ovocitele maturate „in vitro“ reprezintă o altă cale de obţinere de embrioni normali. După activarea ovocitei, ouăle au fost cultivate până la stadiul de morulă-blastocist şi transferate la femele receptoare, obţinându-se, deja, unele rezultate. Posibilitatea de a avea, după fecundaţia „in vitro“, un număr crescut de embrioni într-un stadiu precis de dezvoltare prezintă un mare avantaj pentru o altă biotehnică de reproducţie, transgeneza. Într-adevăr, microinjecţia artificială a unei gene se efectuează în stadii precise de dezvoltare, în general în stadiul de doi pronuclei sau de două blastomere. Deja, unele echipe de cercetători şi-au propus 99

să folosească spermatozoidul ca vector al genei ce urmează a fi transferată, în cazul fecundaţiei „in vitro“, rezultate încurajatoare obţinându-se pe şoareci. Oricare ar fi biotehnicile utilizate (clonaj transgeneză), rezultatul este totdeauna un ou în stadiul de una-două celule pe care trebuie testată dezvoltarea ulterioară prin tehnici mai puţin costisitoare, comparativ cu transferul pe cale chirurgicală în oviductul unei femele receptoare. Maturarea ovocitelor, fecundaţia „in vitro“ şi cultura embrionilor obţinuţi sunt etape de mare interes pentru mamiferele domestice, însă dirijarea acestor trei etape prezintă importanţă pentru dezvoltarea tehnicilor de clonare şi transgeneză. 3.2. Bisecţia embrionilor Tehnicile de micromanipulare perfecţionate şi simplificate în ultimul timp, au făcut posibilă microchirurgia embrionară. Micromanipulările sunt facilitate de faptul că ouăle (zigoţii) majorităţii speciilor de mamifere sunt circumscrise de o zonă pelucidă acelulară. Zona pelucidă îndeplineşte mai mult atribuţii referitoare la protecţia fizică a zigotului. Rezistenţa acestei membrane permite menţinerea oului în depresiunea extremităţii unei micropipete fără a afecta structura internă a oului. Această însuşire uşurează mult intervenţia microinstrumentelor. Prin practicarea tehnicilor de micromanipulare, în prezent se poate interveni pe zigot pentru: - obţinerea jumătăţilor monozigote, prin bisecţie; - sexarea embrionului; - producerea de himere; - obţinerea de indivizi transgenici; - producerea clonelor. Bisecţia embrionilor constă în secţionarea în două jumătăţi a zigoţilor aflaţi în stadiul de morulă târzie sau de blastocist tânăr (6-8 zile) (foto 25). Această biotehnică are ca bază fiziologică constatarea că la mamifere, în mod natural, apar jumătăţi şi uneori chiar triplete monozigote. Primele studii făcute pe embrioni de şoareci şi iepure au arătat că un blastomer protejat de propria zonă pelucidă este capabil de a se dezvolta şi Foto 25 Bisecţia embrionilor de a produce un individ normal. Însă, un blastomer izolat, transferat fără zona pelucidă sau reintrodus într-o zonă pelucidă larg deschisă este incapabil de evoluţie (Nibart M., 1991). Ozil, 1982 (cit de Nibart M.,1991) a propus secţionarea în două părţi egale a embrionilor de 6-8 zile, stadiu în care rolul zonei pelucide nu mai prezintă importanţă. El a dezvoltat un sistem de microchirurgie cu ajutorul mai multor instrumente, folosite în aşa fel încât să lezioneze cât mai puţin posibil zona pelucidă şi repunerea fiecărui demiembrion în câte o zonă pelucidă. Rezultatele obţinute, exprimate în G% după transfer, au fost considerate ca excelente: 27 de produşi pentru 25 de embrioni secţionaţi. Numeroşi autori au continuat bisecţia 100

embrionilor bovini simplificând tehnica, ce este formată numai din două microinstrumente. Voelkel şi colab., (1948), Baker şi Shea (1985), Picard şi colab. (1985, cit. de Nibart M., 1991) ş.a. au demonstrat că nu mai este necesară repunerea embrionului într-o zonă pelucidă înaintea transferului, ceea ce a simplificat mult metoda. Cu ajutorul a două micromanipulatoare, unul purtând micropipeta, celălalt microcuţitul, un operator antrenat poate obţine în câteva minute doi demiembrioni, viabili, în condiţiile bisecţiei unice a embrionilor de bună calitate, apreciaţi în stadiul de morulă compactă-blastocist tânăr. După transferul celor două jumătăţi la femelele receptoare, nivelurile gestaţiei se situează între 50% şi 65%, însă pentru majoritatea autorilor, nivelurile gemelarităţii au fost de 50%. Nu s-au înregistrat diferenţe în nivelul obţinerii de gemeni, indiferent dacă aceştia au fost repuşi amândoi în cornul uterin ipsilateral ovarului cu corp galben sau repus fiecare în câte un corn uterin al aceleiaşi receptoare. S-au obţinut unele rezultate (50% gestaţii) după transferul jumătăţilor de embrion conservate prin refrigerare timp de 24 de ore la 2-4oC. Congelarea în azot lichid a jumătăţilor de embrion repuse în zona pelucidă, a condus la obţinerea unui nivel scăzut de gestaţii (20%). Dacă înainte de congelare embrionii sunt menţinuţi într-un mediu de cultură (2-24 de ore), nivelul gestaţiilor obţinute este mult mai ridicat. Rezultatele obţinute arată că embrionii buni de 40-80 de celule, sunt capabili, prin bisecţie, să dea doi demiembrioni care, transferaţi în uterul receptoarelor, să evolueze normal, cu toate că au de recuperat circa jumătate din celulele embrionului iniţial. Rezultate în obţinerea gemenilor monozigoţi, sunt superioare când se lucrează cu blastocişti tineri, comparativ cu stadiul de morulă tânără. Încercarea de a obţine gemeni tripli sau cvadrupli, prin secţionarea embrionilor în stadiul de 40-80 de celule nu s-a soldat cu rezultate satisfăcătoare, ceea ce arată că această biotehnică este limitată de numărul restrâns de gemeni (2) ce pot fi obţinuţi dintr-un singur embrion. Dacă, de exemplu, considerăm în medie pe donatoare 5 embrioni viabili (trei buni şi doi medii), după transferul acestora se obţin în principiu trei viţei. Prin bisecţia celor trei embrioni buni şi transferul fiecărei jumătăţi la câte o receptoare, este posibil să se obţină tot trei viţei (50% gestaţie) sau, per total 4 viţei. Câştigul de un viţel presupune existenţa a 8 receptoare, în loc de 5. Dacă nivelurile gestaţiei sunt mai scăzute (50%-30%) sporul de un viţel obţinut pe o donatoare superovulată este anulat. În condiţiile atingerii unor rezultate normale, prin practicarea bisecţiei embrionilor se pot obţine, în medie, 4 viţei pe donatoare în loc de trei viţei, ceea ce presupune un câştig de 33% a numărului descendenţilor proveniţi de la fiecare femelă superovulată. În aceste condiţii, o selecţie bine dirijată, acceptă cu rezerve păstrarea a mai mult de un singur exemplar al unei familii clonate, din cauza reducţiilor majore survenite în varianţa genetică şi în sporirea consangvinităţii. În aceste circumstanţe, producerea unor familii biclonate pentru toţi indivizii distincţi genetic se poate face numai prin reducerea la jumătate a numărului unor astfel de indivizi, prin aceasta scăzând însăşi intensitatea selecţiei. Continuarea bisecţionării embrionilor (clonării) erodează intensitatea selecţiei prin reducerea progresului genetic, măreşte consangvinitatea, scăderea intensităţii selecţiei nefiind compensată prin câştigurile obţinute în precizia selecţiei sau exactităţii rezultatelor ei (Woolliams G.A., 1989). 101

Biotehnica bisecţiei embrionilor este totuşi bună pentru producerea adevăraţilor gemeni, necesari testării unor preparate farmaceutice sau a furajelor, factorul genetic fiind înlăturat. Obţinerea himerelor s-a realizat prin microchirurgie, la rumegătoare şi suine, constând în amestecul de celule embrionare de la specii diferite. 3.3. Sexarea embrionilor Determinarea sexului embrionului nu este realizabilă decât la vârsta la care se face transferul acestuia (6-8 zile). Este considerată ca o descoperire economică de mare importanţă şi constă în prelevarea câtorva celule care sunt investigate citogenetic, imunologic, enzimologic etc. în vederea determinării sexului produsului de concepţie încă din acest stadiu incipient de dezvoltare. Metoda genetică (cariotipică) se bazează pe recunoaşterea citologică a cromozomului y, specific masculilor. Este vorba de o tehnică ce permite efectuarea sexării zigoţilor, pornind de la un număr mic de celule prelevate de la zigoţi şi care să nu compromită dezvoltarea ulterioară a embrionului. Recent, folosirea unei „sonde“ moleculare specifice cromozomului y la bovine, pare să răspundă tuturor aşteptărilor. Unele echipe de cercetare acţionează în direcţia trierii spermatozoizilor purtători ai cromozomului x şi y, pe baza diferenţei acestora în ce priveşte conţinutul în ADN. Această metodă, împreună cu fecundaţia „in vitro“ ar furniza un procedeu ideal care să răspundă necesităţilor zootehnice moderne. Metoda imunologică constă în căutarea pe suprafaţa celulelor masculine a antigenului de citocompatibilitate, prin folosirea unor anticorpi monoclonali specifici pentru acest tip de antigen. Metoda enzimologică se bazează pe faptul că unele enzime celulare sunt codificate de către gene aparţinând cromozomului x. Cantitatea acestor enzime este , deci, de două ori mai mare în celulele femele decât în celulele mascule. Determinarea activităţii acestor enzime într-un blastomer izolat a permis sexarea embrionilor într-o proporţie ridicată. Tehnica amplificării ADN (PCR). După descoperirea posibilităţilor de amplificare enzimatică dirijate de ADN-ul celular, unii cercetători au dezvoltat o tehnică de sexare prin amplificarea enzimatică (PCR-Polimerase Chaine Reaction) a secvenţei lor specifice. Sexajul este efectuat pe 5-10 celule prelevate prin biopsia embrionilor de bună calitate. Plecând de la aceste celule, determinarea sexului se sprijină pe detectarea unei secvenţe specifice a ADN-ului cromozomului y printr-o sondă moleculară complementară. Această secvenţă este amplificată de PCR. ADN-ul amplificat este separat prin electroforeză şi vizualizat prin fluorescenţă. Având în vedere tehnicile pentru sexare (evidenţierea ADN specific) şi sensibilitatea specifică (amplificarea ADN de ordinul a 105), biopsia trebuie să fie realizată în cele mai bune condiţii igienice şi tehnice. Sexarea embrionilor înainte de implantare, oferă posibilitatea stabilirii raportului de sexe într-o populaţie, în sensul dorit de crescători funcţie de necesarul de animale de reproducţie, carne, lapte etc.

102

3.4. Transplantarea nucleilor şi obţinerea de clone Clonajul embrionar constă în producerea mai multor animale pornind de la un singur embrion. Acestea pot fi obţinute prin simpla secţiune sau disociere a unui embrion, în stadiul de preimplantare (bisecţia embrionilor). Prin această metodă s-au produs numeroase perechi de viţei gemeni, însă foarte rar s-au putut obţine triplete sau gemeni cvadrupli. Teoretic, tehnica transferului nucleului permite obţinerea unui număr mare de indivizi plecând de la un singur embrion, având în vedere faptul că patrimoniul genetic al tuturor nucleilor unui embrion tânăr este identic, în sensul că poartă aceeaşi informaţie genetică. Transferul nucleilor celulelor provenite de la acelaşi embrion în mai multe ovocite enucleate şi activate, este urmat de evoluţia ovocitelor spre indivizi genetic identici. Posibilitatea obţinerii de serii de animale identice genetic prezintă interese multiple pentru zootehnie. Astfel, în activitatea de selecţie, folosirea unor clone, chiar limitate numeric, oferă posibilitatea evaluării cu înaltă precizie a valorii reproducătorilor. Animale cu acelaşi genotip, întreţinute în ferme diferite, sunt excelenţi subiecţi de studiere a influenţei factorilor de mediu asupra performanţelor acestora. Totodată, obţinerea mai multor copii a reproducătorilor foarte valoroşi va contribui la creşterea şi difuzabilitatea progresului genetic, însă cu reversul micşorării patrimoniului genetic al efectivelor de animale. Pentru producţie, plecând de la rasele de carne, embrionii proveniţi de la un genitor cu o excelentă conformaţie (caracter cu coeficient mare de heritabilitate) vor putea fi multiplicaţi prin clonare şi transplantaţi, cu producerea unor loturi de animale cu carcase omogene şi de calitate superioară. De asemenea, pe termen lung, obţinerea şi comercializarea embrionilor clonaţi în mari serii, asociată cu maturarea „in vitro“ vor permite scăderea considerabilă a transferului embrionar. Briggsi şi King (1952) au arătat că nucleii prelevaţi, în stadiul de blastulă, la broască şi grefaţi în ovocite, pot să-şi continue dezvoltarea până la stadiul de blastulă, iar în 1962 Mc Kinnel a obţinut, prin aceeaşi metodă, broaşte adulte. Pentru embrionul de mamifere, în 1986 Willadsen S., la Cambridge a obţinut pentru prima dată trei miei după transfer de nuclei, proveniţi de la un embrion în stadiul de 8 celule (Heyman Y. şi colab., 1991). La taurine, s-au obţinut de către diferite echipe de cercetători clone constituite din 8-9 viţei, iar la iepure s-a obţinut o clonă de 6 indivizi, plecând de la un embrion congelat în stadiul de morulă. Transferul de nuclei parcurge trei etape (Heyman Y. şi colab., 1991): - obţinerea de ovocite enucleate destinate de a primi nucleii; - izolarea nucleilor embrionului donator; - reconstituirea de serii de embrioni monocelulari. 3.4.1. Pregătirea ovocitelor receptoare Prima operaţie constă în extragerea genomului maternal al ovocitei „receptoare“. Pentru aceasta, se folosesc ovocite mature care, în absenţa fecundaţiei sau a activării, se găsesc blocate în stadiul de metafază II a meiozei. Retragerea nucleului poate fi realizată prin micromanipulare, pătrunzând cu vârful unei micropipete în interiorul celulei şi aspirând uşor cromozomii. Pentru a se evita ruperea membranei viteline a ovocitului, cum se întâmplă cel mai adesea, ovocitele sunt pretratate cu droguri care inhibă polimerizarea microfilamentelor şi microfibrilelor scheletului celular. 103

Ovocitele prelevate „in vivo“, imediat după ovulaţie sau obţinute prin maturare „in vitro“ sunt debarasate de celulele lor periovocitare printr-un tratament enzimatic cu hialuronidază şi apoi incubate în prezenţa cytochalasinei B (5-7 µg/ml). După denudare, fiecare ovocit este enucleat, prin imobilizare în depresiunea unei micropipete, apoi cu cea de-a doua micropipetă se puncţionează zona pelucidă, se aspiră globulul polar împreună cu o fracţiune de citoplasmă adiacentă, conţinând cromozomii metafazici. 3.4.2. Izolarea nucleilor embrionului donator Embrionul, selecţionat ca donator de nuclei, este prelevat în stadiul de morulă, când posedă 16-64 de celule, funcţie de specie şi vârsta acestuia. În acest stadiu evolutiv, punerea în mişcare a genomului embrionar deja s-a produs. Se folosesc şi embrioni congelaţi şi care se găsesc în stadiul de morulă. Embrionul donator este debarasat cu multă atenţie de zona pelucidă, folosind o soluţie de tyrode acid. În acest stadiu, celulele au început deja să stabilească între ele relaţii funcţionale (de exemplu gap-joncţion). Pentru disociere, embrionul este incubat timp de treizeci de minute, într-un mediu lipsit de ioni de calciu, după care blastomerele pot fi separate, fără leziuni, prin intermediul unor micropipete. 3.4.3. Reconstituirea embrionilor După separarea blastomerelor, în cel mai scurt timp se introduce fiecare blastomer în interiorul zonei pelucide a ovocitei „receptoare“, enucleate în prealabil. După introducerea blastomerului sub zona pelucidă, fuziunea membranelor celulei donatoare şi ovocitul receptor se realizează prin electrofuziune. Pentru aceasta, ovocitul se plasează între doi electrozi şi este supus la unul sau mai multe impulsuri foarte scurte de curent continuu. Stimulii electrici provoacă pori membranari, destabilizând straturile de fosfolipide juxtapuse, iar membranele fuzionate permit astfel nucleului donator să pătrundă în noul său mediu citoplasmatic. Pe de altă parte, stimularea electrică activează ovocitul receptor, prin declanşarea mecanismelor de reprogramare a nucleului transplantat. Electrofuziunea se realizează într-un mediu izotonic şi se observă în următoarele treizeci de minute de la stimulare şi estimată, fie prin umflarea nucleului donator în noul său mediu citoplasmatic, fie prin terminarea diviziunii celulare şi apariţia stadiului de două celule. În prezent, unul din factorii limitanţi în aplicarea acestei biotehnici îl reprezintă numărul relativ redus de ovocite „receptoare“. Creşterea numărului de ovocite ,,receptoare“ se poate obţine prin maturarea „in vitro“ a acestora, pornind de la ovarele recuperate în abator de la femelele sacrificate. Tot în plan practic, este de mare interes posibilitatea congelării acestor ovocite, astfel încât să se dispună în orice moment de necesarul de ovocite receptoare. Un alt factor limitant este reprezentat de numărul relativ redus de celule ale embrionilor de la care urmează să se transfere nucleii. Cu toate dificultăţile pe care le ridică, clonajul embrionilor creează o nouă cale în optimizarea reproducerii animalelor.

104

3.5. Transgeneza Ameliorarea efectivelor de animale s-a bazat, tradiţional, pe progresele înregistrate în selecţia genetică, dirijarea reproducţiei, echilibrul raţiilor de hrană, etc. Tehnicile geneticii moleculare oferă, în prezent, noi posibilităţi care încep a fi exploatate eficient. Astfel, sondele moleculare vor permite cunoaşterea patrimoniului genetic al animalelor iar multiplele combinaţii rezultate din mutaţie şi asocierea secvenţelor de ADN oferă multe posibilităţi de reprogramare a unei celule sau a unui organism întreg. Astfel, dacă o genă izolată este introdusă într-o celulă, aceasta va sintetiza o nouă proteină şi caracteristicile acestei celule vor putea fi astfel modificate. De asemenea, dacă o genă izolată este introdusă într-un organism întreg, însuşirile genetice ale acestuia vor fi modificate. Această operaţie poartă numele de transgeneză. Gena străină, introdusă în noul organism, va fi transmisă la descendenţi obţinându-se în acest fel o linie de animale care au însuşiri biologice noi. Primele observaţii în acest domeniu s-au făcut în 1981 pe şoareci. Este posibilă, prin transgeneză, obţinerea de noi animale, perspectivele deschise de această nouă biotehnică fiind considerabile. Obţinerea de animale transgenice include mai multe etape: - izolarea sau construcţia genei de transferat; - colectarea embrionilor; - introducerea genei în embrioni; - transferul embrionului la o femelă receptoare; - identificarea transgenei la nou-născuţi; - măsurarea expresiei transgenei; - stabilirea de linii homozigote, pornind de la animale transgenice fondatoare. Izolarea sau construcţia genelor se face prin tehnici genetice adecvate care permit atât izolarea cât şi mutarea după voinţă a oricărei gene. O genă funcţională material sau reconstruită conţine totdeauna aceleaşi elemente: regiunea regulatore, regiunea codantă şi terminatorul. Astfel, regiunile care participă la reglarea transcripţiei genei se situează în amonte de zona codantă. Colecţia de embrioni. Transgeneza fiind o operaţie cu randament scăzut, sunt necesari mai mulţi embrioni pentru a economisi la maximum femele donatoare. Embrionii pot fi obţinuţi în mai multe moduri: - prelevând ovare de la femelele sacrificate la abator; - prin maturarea ovocitelor „in vitro“; - prin practicarea fecundaţiei „in vitro“. Introducerea genei în embrion se poate realiza prin microinjecţie, prin folosirea de vectori retrovirali sau prin folosirea celulelor ES (Embryo stem cels). Microinjecţia constă în injectarea directă a soluţiei de ADN în pronucleul mascul, care este mai mare, mai apropiat de periferia zigotului în momentul injecţiei. Un obstacol important la injectare este dat de opacitatea ouălor, ceea ce face dificilă vizualizarea celor doi pronuclei. Virusurile, înainte de a folosi mecanismul celular pentru replicarea lor, sunt ,,a priori“ excelenţi vectori pentru a introduce gene străine într-o celulă. Retrovirusurile se încorporează în genomul gazdă, în general, într-o singură copie şi fără rearanjare, deci sunt extrem de utile pentru introducerea genei străine în celulele somatice în cultură şi apoi se reintroduc aceste celule în individ. Utilizarea celulelor ES, constă în izolarea celulelor unui embrion precoce şi cultivarea lor în condiţii în care celulele nu se diferenţiază. Când aceste celule ES sunt reintroduse într-un embrion precoce participă la dezvoltarea embrionului, dând naştere la animale himere. O genă străină poate fi introdusă, prin procedee 105

clasice de transfer, în celule ES, în cultură. Aceste celule reintroduse în embrion constituie vectorul transgenei. Animalele himere transgenice care rezultă sunt mozaicate. Descendenţii lor moştenesc sau nu transgena numai dacă celulele germinale parentale conţin sau nu transgena. Transgenele introduse, prin una din aceste metode, se inseră în genomul gazdă în poziţii imprevizibile. Introducerea transgenelor se mai poate realiza şi prin alte mijloace. Unul dintre aceste mijloace constă în a pune în contact ADN-ul şi spermatozoizii şi a proceda apoi la o fecundaţie „in vitro“sau „in vivo“. O altă cale prin care gena străină poate fi transferată în celule în cultură, cu o eficacitate înaltă, este electroporaţia. Tehnica aceasta constă în a supune celulele incubate în prezenţa ADN, la câmpuri electrice care destabilizează membrana şi creează pori prin care ADN-ul pătrunde în celule. Această tehnică se foloseşte şi pentru spermatozoizii şi embrionii de mamifere. Detectarea transgenelor se face prin metode clasice ale geneticii moleculare. Ele constau în a hibrida un fragment de ADN complementar genei, radioactivat, cu ADN-ul celular total. Detecţia produşilor transgenici constă în a evalua expresia transgenelor prin măsurarea cantităţii de ARN corespondent. Proteinele derivate din transgene pot fi măsurate în sânge, dacă sunt secretate, cu ajutorul testului RIA (radioimunoanaliză). Aceste metode permit să se determine în care organ, tip celular şi moment al dezvoltării, transgena se exprimă. Tansgeneza a fost încercată pe multe specii de animale, cu anumite succese. Randamentul biotehnicii, evaluat în număr de celule transgenice obţinute, raportat la numărul embrionilor microinjectaţi, variază mult cu colectivele de cercetători. O evaluare sumară a acestui randament arată că este nevoie de circa 10 şoareci adulţi pentru a spera obţinerea unuia transgenic, 40 de oi pentru un miel transgenic şi 40 de vaci pentru un viţel transgenic. Aceste rezultate arată că preţul de cost al unui produs transgenic este foarte ridicat. Prin transgeneză s-a încercat obţinerea de animale cu un ritm de creştere accelerat, cu o producţie de lapte mai mare şi cu un conţinut în proteină mai ridicat, cu o producţie de carne mai bună, cantitativ şi calitativ, rezistente la diverse maladii etc. Cu toate rezultatele încurajatoare obţinute la diverse specii, această biotehnică se găseşte doar la perioada de început, necesitând multe ajustări, astfel încât randamentul obţinut să micşoreze preţul de cost al produsului transgenic şi care să fie conform cu normele sanitare şi sanitar-veterinare internaţionale etc. ÎNTREBĂRI RECAPITULATIVE 1. 2. 3. 4. 5.

Care sunt etapele fecundaţiei “in vitro”? Care sunt importanţa şi tehnica bisecţiei embrionilor? Care sunt metodele prin intermediul cărora se pot sexa embrionii? Care sunt importanţa şi etapele transferului de nuclei? Care este rolul transgenezei?

TEME 1. Biotehnici moderne de reproductie REFERAT 1. Realizări moderne în domeniul fecundaţiei “in vitro” 2. Situaţia actuală şi perspectivele clonării şi transgenezei 106

BIBLIOGRAFIE SELECTIVĂ

1. Aughtry, S.D., 1987 - Embryo Transfer, 2, 3, p 3-4 2. Baril, G. şi colab., 1993 - Manuel de formation pour l'insémination artificielle ches les ovins et les caprins. Etude FAO, Roma. 3. Baril, G. şi colab, 1993 - Manuel de formation practique pour la transplantation embryonnaire chez la brebis et la chevre. Etude FAO, Roma. 4. Bogdan, Al. şi colab., 1981 - Reproducţia animalelor de fermă. Edit.Scrisul românesc, Craiova 5. Bogdan, Al. şi colab.,1984,1985 - Fertilitatea, natalitatea şi prolificitatea în zootehnie, vol I şi II, Edit Dacia, Cluj-Napoca 6. Boitor, I., 1979 - Endocrinologia reproducţiei la animalele de fermă. Edit. Ceres, Bucureşti 7. Bunaciu, P., 1977 - Însămânţarea artificială a găinilor de reproducţie întreţinute în baterii. Rev. de creştere a animalelor, nr. 10 8. Cârlan, M., 1982 - Sincronizarea căldurilor şi ovulaţiei la taurine. Redacţia de propagandă tehnică agricolă, Bucureşti 9. Confederat Margareta, 1998 - Cercetări cu privire la influenţa alimentaţiei asupra supravieţuirii embrionilor la caprine în condiţiile efectuării transferului de embrioni. Teză de doctorat, Univ. Agron. şi de Med. Vet., Iaşi 10. Drugociu, G. şi colab., 1977 - Patologia reproducţiei şi clinică obstetricală. Edit. Did. şi Ped., Bucureşti 11. Dumitrescu, I. şi colab., 1976 - Reproducţia la bovine. Edit Ceres, Bucureşti 12. Dumitrescu, I. şi colab., 1978 - Însămânţările artificiale la animale. Edit. Ceres, Bucureşti 13. Dumitrescu, I., 1987 - Reproducţia la cabaline. Edit. Ceres, Bucureşti 14. Elsden Peter, R., 1987 - Manual for embryo transfer, 6599 Country Rd. 29C, Bellvue, , USA 15. Feredean, T., 1974 - Reproducţia la porcine. Edit. Ceres, Bucureşti 16. Feredean, T., Drume, Ch., 1977 - Transferul de embrioni la animale. Edit. Ceres, Bucureşti 17. Gluhovschi, N. şi colab., 1972 - Biologia şi patologia reproducţiei. Edit. Did. şi Ped.,Bucureşti 18. Groza, {t. I., 1996 - Actualităţi şi perspective în biotehnologia transferului de embrioni la specia ovină. Edit. Ceres, Bucureşti 19. Halga, P. şi colab., 1999 – Alimentaţia şi reproducţia la erbivore domestice. Edit. Dosoftei, Iaşi 20. Hansel, W. şi colab.,1983 - Fiziologia ciclului estral. Rev. Soc. de Med. Vet., Bucureşti 21. Haubebine, L. M., 1991 - Rec. Med. Vet., 167(314), 323-333 22. Heyman, Y., Chesne, Renard, J.P.,1991 - Rec. Med. Vet., 167(314), 315322 23. Liciu, Gh., Roşca, O., 1988 - Ghid tehnic privind însămânţarea la ovine şi caprine. Edit. Ceres, Bucureşti

107

24. Liciu, GH.,Roşca, O., 1998 – Tehnica însămânţării artificiale la bovine – Ghid practic. Edit. Ceres, Bucureşti. 25. Liciu, GH., Roşca, O., 1999 - Tehnica însămânţării artificiale la suine - Ghid practic. Edit. Ceres, Bucureşti. 26. Mantea, {t., 1998 - Contribuţii la biotehnologia transferului de embrioni la suine. Teză de doctorat, Fac. de Med. Vet., Bucureşti 27. Mapletoft, R. J., 1987 - Embryo Transfer, 2, 3, p. 4-6 28. Marquant, Le Guienne, 1991 Rec. de Med. Vet., Ian. 167, nr. 314, p. 303312 29. Nibart, M., 1991 - Rec. de Med. Vet., 167(314), 261-290 30. Paraipan, V., 1982 - Hormonoterapia în reproducţia animalelor. Edit. Ceres, Bucureşti 31. Paraschivescu, M., 1969 - Reproducţia la ovine. Edit. Agro-Silvică, Bucureşti 32. Peyraud, J. C., 1986 - La transplantion embryonnaire s'implante, Elevage 2000, nr. 1, p. 47-49 33. Roşca, O ., 1994 - Biotehnica reproducţiei la porcine prin însămânţare artificială. Edit. Ceres, Bucureşti 34. Runceanu, L.,1995 - Reproducţia şi patologia reproducţiei. Lito., Univ. Agron. Iaşi 35. Sauveur, B., Reviers, M., 1988 - Reproduction des volailles et production d'oeufs. INRA, Station de Recharches Avicoles, Paris 36. Seiciu, Fl. şi colab.,1989 - Reproducţia normală şi patologică la animalele domestice, vol. I şi II, Edit. Ceres, Bucureşti 37. Tănase, D.,1993 - Biologia reproducerii animalelor şi transferul de embrioni . Lito., Univ. Agron. Iaşi 38. Tănase, D.,1995 - Biologia şi patologia reproducerii animalelor. Curs, Lito., Univ. Agron. Iaşi 39. Vallet, J. Ch. şi colab., 1991 - Rec. Med. Vet., 167(314), 293-301 40. Woolliams, G. A., 1989 - Animal Production, t 48, partea I, p.31-36, Anglia

108