BiotecnologiaAAIMPORTANTE.pdf

Producción de la lisina utilizando Brevibacterium flavum. La lisina es un aminoácido esencial para el hombre y es utilizada como aditivo alimentario. Se produce comercialmente utilizando la bacteria Brevibacterium flavum. La síntesis de lisina, como la de otros aminoácidos se encuentra estrictamente regulada. Para poder obtener los aminoácidos en forma económica es necesario obtener cepas sobreproductoras, es decir que no sufran el fenómeno general de inhibición por retroalimentación. En la vía bioquímica que conduce desde el aspartato a la lisina, esta última puede inhibir por retroalimentación la actividad de la enzima aspartatoquinasa. La sobreproducción de lisina puede obtenerse aislando mutantes en las cuales la aspartatoquinasa no esté sujeta a retroinhibición. Esto se logra aislando mutantes resistentes a un análogo de la lisina, la Saminoetilcisteína (AEC), que se une al sitio alostérico de la enzima e inhibe su actividad. Las mutantes resistentes a la AEC que se obtienen fácilmente por selección positiva, producen una modificación de la aspartatoquinasa con un sitio alostérico alterado que ya no reconoce la AEC o a la lisina, por lo que la retroinhibición por lisina está muy reducida. Dichas mutantes pueden producir hasta 60 g de lisina por litro en fermentadores industriales.

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Producción de ácido glutámico Un factor muy importante para lograr un proceso de producción comercial de un aminoácido es conseguir la excreción del mismo al medio de cultivo. En general, los organismos no excretan los metabolitos indispensables como los aminoácidos. Aumentando la excreción se evitarían concentraciones relativamente altas dentro de la célula, que podrían ocasionar inhibición por retroalimentación, aún en mutantes resistentes. Una forma de obtener un nivel elevado de excreción de un aminoácido es el que se utiliza en la obtención del ácido glutámico. La producción y excreción del ácido glutámico depende de la permeabilidad celular. El organismo productor del ácido glutámico, Corynebacterium glutamicum, requiere la vitamina biotina, factor indispensable en la biosíntesis de los ácidos grasos. La deficiencia en biotina daña la membrana celular como resultado de una producción deficiente de fosfolípidos y bajo estas condiciones se excreta el ácido glutámico intracelular. El medio empleado para la producción del ácido glutámico contiene en una primera etapa suficiente biotina para obtener un buen desarrollo del microoganismo y en una segunda etapa la deficiencia de biotina asegura la excreción de ácido glutámico al medio. El descubrimiento del papel de la deficiencia en biotina en la producción del ácido glutámico ha permitido el desarrollo de métodos racionales para la formulación de un medio para producir este aminoácido.

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Bioconversión microbiana Los microorganismos pueden usarse para biocatalizar reacciones químicas específicas. Este proceso se denomina bioconversión o biotransformación, e implica el cultivo del MO en fermentadores grandes, seguido de la adición del compuesto químico que ha de ser convertido, en el momento adecuado. Después de un período de incubación, durante el cual el MO actúa sobre el compuesto químico, se extrae el caldo de fermentación y se purifica el producto que se desee. Si bien la bioconversión puede usarse para varios procesos, su principal utilización industrial ha sido la producción de algunas hormonas esteroideas. Producción de cortisona utilizando Rhizopus nigricans

Solo la primera reacción es una bioconversión microbiana típica. Esta oxidación altamente específica es realizada por el hongo Rhizopus nigricans y omite una difícil reacción química. Todos los otros pasos se realizan químicamente.

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Enzimas Las enzimas extracelulares (exoenzimas) se secretan al medio de cultivo y son capaces de digerir polímeros insolubles como la celulosa, las proteínas y el almidón; posteriormente, los productos de digestión son transportados al interior de las células donde se utilizan como nutrientes para el crecimiento. Algunas de estas exoenzimas se utilizan en las industrias alimentaria, láctica, farmacéutica y textil, y se producen en grandes cantidades por síntesis microbiana. Las enzimas son biocatalizadores especialmente útiles porque a menudo actúan en grupos funcionales químicos que son únicos, distinguen fácilmente entre grupos funcionales similares de una misma molécula y, en muchos casos, catalizan reacciones de una forma estereoespecífica, produciendo sólo uno de los dos posibles enantiómeros (por ejemplo, el enantiómero-D de un azúcar , o un L-aminoácido.

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Proteasas, amilasas y jarabes ricos en fructosa

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Las enzimas que más se producen comercialmente son las proteasas, que se usan como aditivos en los detergentes para lavar la ropa. La mayoría de los detergentes que se utilizan actualmente contienen proteasas, amilasas, lipasas, reductasas y otras enzimas. Muchas de estas enzimas se aíslan de bacterias alcalófilas del género Bacillus . Otras enzimas importantes fabricadas comercialmente son las amilasas y glucoamilasas, que se emplean en la producción de glucosa a partir de almidón. La glucosa se convierte luego en fructosa (que es más dulce que la glucosa y la sacarosa) por acción de la enzima glucosa isomerasa. Este proceso lleva a la obtención de un edulcorante rico en fructosa a partir de almidón de maíz, trigo o papa.

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Mejoramiento de la cepa de Penicillum chrysogenum, productora de la penicilina. A través de los años y de numerosos procesos la producción de penicilina por el hongo Penicillum chrysogenum pasó de 1-10 ug/ml a 50.000 ug/ml. Este incremento de 50.000 veces se obtuvo por el mejoramiento de la cepa a través de mutación y selección sin incluir manipulación genética y por cambios en el medio y en las condiciones de crecimiento. La introducción de nuevas técnicas genéticas condujo posteriormente a incrementos mucho mas modestos en el rendimiento. Conjunto de mutaciones realizadas por cuatro grupos de investigadores para obtener una cepa de Penicillum chrysogenum capaz de sintetizar penicilina para una exportación comercial. “S”, mutación espontánea; “X”, rayos X; “UV”, radiación ultra violeta; “NM”, gas mostaza. Los métodos fermentativos habituales rinden más de 20 g/litr

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En la conversión del almidón de maíz en el producto llamado jarabe de maíz rico en fructosa funcionan tres reacciones en secuencia, cada una de ellas catalizada por una enzima microbiana diferente. 1- La enzima alfa-amilasa lleva a cabo el ataque inicial sobre el polisacárido almidón, acortando la cadena y reduciendo la viscosidad del polímero. Esta se llama reacción de adelgazamiento. 2-La enzima glucoamilasa produce monómeros de glucosa a partir de los polisacáridos acortados, proceso llamado sacarificación. 3- La enzima glucosa isomerasa lleva a cabo la conversión final de la glucosa en fructosa, proceso que recibe el nombre de isomerización. Las tres enzimas se producen por fermentación microbiana. El producto final de esta serie de reacciones es un  jarabe que contiene cantidades aproximadamente iguales de glucosa y fructosa, el cual se puede adicionar directamente a bebidas refrescantes y a otros productos alimenticios. Esto permitió a Estados Unidos usar el almidón de maíz en lugar de importar la sacarosa y ahorrar millones de dólares por años.

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Enzimas microbianas y sus aplicaciones

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Extremoenzimas: enzimas Extremoenzimas: enzimas de procari procariotas otas que viven viven en ambientes extremos. Alguno Algunoss procar procariot iotas as llamad llamados os hipertermófilos hipertermófilos,, tienen un crecimiento óptimo a temperaturas muy altas y producen proteínas termoestables que funcionan a altas temperaturas. El término extremoenzimas se refiere a enzimas que funcionan en condiciones muy altas o muy bajas de temperatura, pH, salinidad, etc. Los organismos que las producen se denominan extremófilos extremófilos..

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Enzimas inmovilizadas En algunos procesos biocatalíticos se desea convertir enzimas solubles en enzimas inmovilizadas. La inmovilización no solo facilita la reacción enzimática enzim ática en condicione condicioness de producción continua continua a gran escala, escala, sino que también contribuye a la estabilización de las enzimas evitando su desnaturalización.. Existen tres aproximaciones básicas para la desnaturalización inmovilización de enzimas. 1- Polimerización (entrecruzamiento, cross-linkage) cross-linkage) de las moléculas de enzima. El enlace de unas moléculas de enzima con otras se hace a través de una reacción química con un age agente nte bifunc bifuncion ional al de entrecruzamiento como el glutaraldehido glutaraldehido.. 2- Unión de la enzima a un soporte. soporte. La unión puede hacerse por adsorción,, enlace iónico, adsorción iónico, o enlace covalente. covalente. Los soportes usados son celulosas modificadas, modificadas, carbón activado, activado, arcillas minerales, minerales, óxido de aluminio y bolitas de vidrio. vidrio. 3- Inclusión enzimática, enzimática, que comprende la inclusión de la enzima en una membrana semipermeable. semipermeable. Las enzimas pueden encerrarse en microcápsulas,, geles microcápsulas geles,, membranas semipermeables de polímeros, polímeros, o polímeros fibrosos como el acetato de celulosa. Cada uno de estos métodos tiene ventajas y desventajas y el procedimiento utilizado depende de la enzima y de la aplicación industrial particular.

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Células inmovilizadas • • • • •

En algunos casos no es necesario utilizar la enzima purificada. Se pueden utilizar células inmovilizadas para utilizarlas en procesos industriales. En general se utilizan para procesos de flujo continuo. Se utilizan instalaciones mucho mas económicas. Un ejemplo es la utilización de células de Bacillus cuagulans  inmovilizadas para la conversión continua de jarabe de glucosa en  jarabe de fructosa. Este microorganismo es productor de glucosa isomerasa, la enzima que convierte la glucosa en fructosa.

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Producción de productos de mamíferos por microorganismos modificados por ingeniería genética. El mayor interés esta en la producción de proteínas y de péptidos de mamíferos por medios microbianos, ya que muchos de estos compuestos tienen un alto valor farmacéutico, son costosos y difíciles de obtener por otros métodos. A pesar de la excitante promesa de la ingeniería genética en la biotecnología, lograr la comercialización de un producto es una empresa gigantesca. Además de la correcta clonación y expresión del gen de interés en una bacteria o levadura, y de la purificación del producto deseado, se deben tomar en consideración otros aspectos como las pruebas clínicas y permisos gubernamentales. Cualquier producto sintetizado microbiológicamente, que se intente utilizar en el hombre, debe pasar pruebas clínicas exhaustivas. Por ej., la insulina producida microbiológicamente mediante la tecnología del DNA recombinante ha tenido que pasar pruebas clínicas estrictas con voluntarios humanos, a pesar de que se ha demostrado que la insulina producida microbiológicamente es idéntica a la proteína fabricada por humanos. Si todo va bien en las pruebas clínicas, se puede pedir el permiso oficial, pero esto puede ser un proceso que consume mucho tiempo.

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Ejemplos de productos biotecnológicos importantes, fabricados por medio de DNA recombinante.

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Producción de insulina La insulina es un hormona. Es una proteína pancreática que regula el metabolismo de los carbohidratos en mamíferos. La diabetes es una enfermedad caracterizada por una insuficiencia de insulina y afecta a millones de personas. El tratamiento estándar consiste en la administración de ésta hormona periódicamente en forma oral o inyectable. La hormona proveniente de páncreas de terneros o de cerdos no resulta tan eficaz como la insulina humana y , además, el proceso de aislamiento es caro y complejo. Por esta razón se ha llevado a cabo la clonación del “gen” de la insulina humana en bacterias. La insulina humana consta de dos polipéptidos (A y B) conectados por puentes disulfuro. Estos dos péptidos están codificados por partes separadas del mismo gen de la insulina. El gen de la insulina codifica la preproinsulina, un péptido más largo que contiene una secuencia señal (implicada en la secreción de la proteína), los polipéptidos A y B de la molécula de insulina activa, y un polipéptido de unión que está ausente en la insulina madura. La proinsulina se forma a partir de la preproinsulina, y la conversión de proinsulina en insulina implica la ruptura enzimática del polipéptido de unión entre las cadenas A y B.

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Procesamiento de la preproinsulina

La metionina inicial es eliminada de la cadena antes de que se sintetice la molécula completa de preproinsulina. Tras la eliminación del péptido líder, la molécula de insulina se pliega y el péptido C se elimina originando las cadenas A y B de la insulina. Estas cadenas quedan unidas por puentes disulfuro.

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