Biotecnologia y Alimentacion

Biotecnología y alimentación

GLORIA MORCILLO ORTEGA ESTRELLA CORTÉS RUBIO JOSÉ LUIS GARCÍA LÓPEZ

UNIVERSIDAD NACIONAL DE EDUCACIÓN A DISTANCIA

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ÍNDICE

Prólogo ...............................................................................................

17

Tema 1. Biotecnología ....................................................................

19

1.1. ¿Qué es la Biotecnología? ......................................................... 1.2. Una larga historia para una tecnología de moda .................... 1.3. La revolución Biotecnológica del siglo XX ............................... 1.4. La Ingeniería Genética: nuevas herramientas para la Biotecnología ....................................................................................... 1.5. Biotecnología tradicional y Biotecnología actual ................... 1.6. Organismos modificados genéticamente ................................ 1.7. Campos de aplicación de la nueva Biotecnología ................... 1.8. Repercusiones económicas de la Biotecnología ..................... 1.9. Los protagonistas de la Biotecnología ..................................... 1.9.1. Las bacterias .................................................................. 1.9.2. Los hongos ..................................................................... 1.10. El futuro de la Biotecnología ...................................................

21 22 23

Bibliografía .........................................................................................

41

Tema 2. Alimentos y Biotecnología ..............................................

43

2.1. 2.2.

45 45 45 46 47

2.3.

La disponibilidad de alimentos ................................................ Historia de la alimentación ...................................................... 2.2.1. Primeros alimentos ........................................................ 2.2.2. Inicios de la agricultura ................................................. 2.2.3. La revolución verde ....................................................... 2.2.4. La nueva revolución: cultivos genéticamente modificados ................................................................................... Alimentos y Biotecnología ........................................................

25 28 31 32 33 34 34 37 39

48 49

8

BIOTECNOLOGÍA Y ALIMENTACIÓN

Alimentación y nutrición .......................................................... Nutrientes .................................................................................. 2.5.1. Hidratos de carbono ...................................................... 2.5.2. Grasas ............................................................................. 2.5.3. Proteínas ......................................................................... 2.5.4. Vitaminas ....................................................................... 2.5.5. Minerales ........................................................................ Digestión de los alimentos ....................................................... Comemos genes cuando ingerimos alimentos ........................ Tipos de alimentos .................................................................... 2.8.1. Por su origen .................................................................. 2.8.2. Por su elaboración ......................................................... 2.8.3. Por su consumo ............................................................. 2.8.4. Clasificación tradicional ................................................ Dieta y requerimientos nutricionales ...................................... Conservación de los alimentos ................................................. 2.10.1. Métodos físicos ............................................................ 2.10.2. Métodos químicos ........................................................ 2.10.3. Métodos biológicos ...................................................... Alimentación y salud ................................................................ 2.11.1. Enfermedades relacionadas con la alimentación ...... 2.11.2. Enfermedades de origen alimentario ......................... Problemas de la alimentación mundial ................................... 2.12.1. Escasez de alimentos ................................................... 2.12.2. Contaminación de los alimentos ................................. 2.12.3. Problemas ambientales generados por la producción de alimentos ................................................................. Nuevos alimentos y alimentos modificados genéticamente ... 2.13.1. La tecnología enzimática y biocatálisis ...................... 2.13.2. Alimentos genéticamente modificados ....................... 2.13.3. Técnicas para la detección de contaminantes y fraude alimentario ...................................................................

50 51 51 52 52 53 55 57 58 59 59 59 59 61 63 65 65 66 69 70 70 72 74 74 75

Bibliografía .........................................................................................

81

Tema 3. DNA, genes y genomas ....................................................

89

3.1. 3.2. 3.3. 3.4. 3.5.

91 92 94 97 99

2.4. 2.5.

2.6. 2.7. 2.8.

2.9. 2.10.

2.11.

2.12.

2.13.

¿Qué es el material genético? ................................................... ¿Qué es un gen? ........................................................................ Estructura del DNA: la doble hélice ........................................ El lenguaje de los genes ............................................................ El DNA se autorréplica .............................................................

75 75 76 78 79

ÍNDICE

9

Los errores en el DNA: mutaciones ......................................... DNA y genes .............................................................................. Genes y cromosomas ................................................................ Genes y genomas ......................................................................

102 103 104 106

Bibliografía .........................................................................................

109

Tema 4. Del gen a la proteína .......................................................

111

4.1. 4.2. 4.3. 4.4. 4.5. 4.6. 4.7. 4.8. 4.9. 4.10.

La información genética se materializa en las proteínas ....... Las proteínas ............................................................................. Del gen a la proteína ................................................................. Un intermediario: el RNA ......................................................... Un diccionario molecular: el código genético ......................... Síntesis de proteínas: traducción ............................................. Cambios en los genes: mutaciones .......................................... Consecuencias de las mutaciones ............................................ Regulación de los genes: activación y represión ..................... Arquitectura de un gen .............................................................

113 114 117 118 120 122 124 125 126 128

Bibliografía .........................................................................................

129

3.6. 3.7. 3.8. 3.9.

Tema 5. Ingeniería genética .......................................................... 131 5.1.

5.2. 5.3. 5.4. 5.5. 5.6.

5.7.

La ingeniería genética .............................................................. 5.1.1. Cortar un gen y separarlo del resto del genoma .......... 5.1.2. Unir el gen a un vector que lo transporte al interior de una célula hospedadora ................................................. 5.1.3. Introducir el gen en la bacteria y establecer un clon o linaje de bacterias que lo reproduzcan y, en su caso, obtener el producto del gen ........................................... Algunas aplicaciones de la ingeniería genética ....................... Las herramientas y las técnicas de la ingeniería genética ...... Enzimas de restricción ............................................................. Otras enzimas ........................................................................... Vectores ..................................................................................... 5.6.1. Plásmidos ....................................................................... 5.6.2. Virus bacteriófagos ........................................................ 5.6.3. Cósmidos ........................................................................ 5.6.4. Otros vectores ................................................................ Introducción en la célula hospedadora ...................................

133 134 134

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BIOTECNOLOGÍA Y ALIMENTACIÓN

Células hospedadoras ............................................................... 5.8.1. Las bacterias como hospedadoras ................................ 5.8.2. Las levaduras como hospedadoras de genes ................ 5.8.3. Levaduras más utilizadas en ingeniería genética ........ 5.8.4. Procesos de transformación en levaduras .................... 5.8.5. Vectores específicos de levaduras ................................. 5.8.6. Células vegetales y células animales ............................. Técnicas para trabajar con genes ............................................. Electroforesis ............................................................................ Hibridación con sondas ............................................................ Secuenciación del DNA ............................................................ Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) ........................... Biochips .....................................................................................

150 150 152 152 154 154 156 158 158 160 163 167 172

Bibliografía .........................................................................................

175

5.8.

5.9. 5.10. 5.11. 5.12. 5.13. 5.14.

Tema 6. Microorganismos y alimentos fermentados ................ 177 Microbiología de los alimentos fermentados .......................... Producción de pan .................................................................... Mejora de la levadura panadera por ingeniería genética ....... Producción de vinos y cavas ..................................................... Levaduras vínicas transgénicas ................................................ La producción de cerveza ......................................................... Levaduras cerveceras modificadas genéticamente ................. Producción de bebidas alcohólicas destiladas ........................ Productos lácteos ...................................................................... 6.9.1. El yogur y las leches fermentadas ................................. 6.9.2. Los quesos ...................................................................... Biotecnología de las bacterias lácticas .................................... Fermentaciones cárnicas .......................................................... Productos vegetales fermentados ............................................. Microorganismos productores de enzimas para la industria alimentaria ................................................................................ Los microorganismos como alimento .....................................

179 181 182 184 186 187 189 191 192 192 193 193 195 196

Bibliografía .........................................................................................

201

6.1. 6.2. 6.3. 6.4. 6.5. 6.6. 6.7. 6.8. 6.9.

6.10. 6.11. 6.12. 6.13. 6.14.

198 200

ÍNDICE

Tema 7. Microorganismos genéticamente modificados. Su aplicación en los alimentos y sus potenciales efectos sobre la salud y nutrición del hombre .........................

11

203

7.1. Aplicación de la tecnología transgénica a los microorganismos empleados en la alimentación .................................................. 7.1.1. Cultivos iniciadores bacterianos ................................... 7.1.2. Levaduras y hongos filamentosos ................................. 7.2. Microorganismos genéticamente modificados viables en los alimentos ................................................................................... 7.3. Enzimas alimentarias de origen microbiano producidas por MGM .......................................................................................... 7.4. Otros componentes de los alimentos producidos por MGM .. 7.4.1. Aromas ............................................................................ 7.4.2. Aditivos alimentarios ..................................................... Ácidos orgánicos ............................................................ 7.5. Consecuencias e impacto del uso de los MGMs en alimentos .............................................................................................. 7.5.1. Interacciones con la microflora humana ..................... 7.5.2. Transferencia génica entre microorganismos asociados al intestino y asociados a los alimentos ................. 7.5.3. El caso concreto del triptófano ..................................... 7.6. Aspectos reguladores ................................................................ 7.6.1. Métodos de evaluación de la seguridad de los MGMs de alimentos ................................................................... 7.6.2. MGMs viables en los alimentos .................................... 7.6.3. Los aspectos de la contención genética ........................ 7.6.4. Enzimas de alimentos ................................................... 7.6.5. Saborizantes, aditivos y otros ingredientes de los alimentos ............................................................................ 7.7. Lagunas en el conocimiento de los microorganismos ............ 7.7.1. Alimentos fermentados .................................................. 7.7.2. Las interacciones con la microflora del anfitrión ........ 7.8. Conclusiones .............................................................................

205 205 205 206

Bibliografía .........................................................................................

224

207 210 212 212 212 212 214 214 217 218 219 219 220 221 222 223 223 223 224 224

Tema 8. La biotecnología en la agricultura: plantas transgénicas ................................................................................... 227 8.1. 8.2.

Importancia de las plantas para la alimentación .................... 229 Unas bases de Botánica ............................................................ 230

12

BIOTECNOLOGÍA Y ALIMENTACIÓN

La modificación genética de las plantas .................................. Un poco de historia ................................................................... Estrategias para la modificación genética de plantas ............ 8.5.1. Cultivos de células vegetales ......................................... 8.5.2. Transformación de las células vegetales ...................... 8.5.3. Diseño de la construcciones génicas ............................ Transferencia de genes con vectores específicos de plantas .. 8.6.1. El plásmido Ti ................................................................ 8.6.2. El plásmido Ri ................................................................ 8.6.3. Vectores víricos .............................................................. Trasferencia directa de genes ................................................... Expresión de genes exógenos en células vegetales ................. 8.8.1. Regiones reguladoras .................................................... 8.8.2. Genes marcadores .......................................................... Algunas aplicaciones de la ingeniería genética en plantas ..... Mejora de las propiedades de los cultivos ............................... 8.10.1. Aumento de la eficiencia del metabolismo de las plantas .......................................................................... 8.10.2. Aumento del valor nutritivo ........................................ 8.10.3. Maduración controlada de frutos y flores .................. 8.10.4. Resistencia a condiciones ambientales extremas ...... Mejora del rendimiento. Cultivos resistentes a plagas, enfermedades y herbicidas ............................................................... 8.11.1. Resistencia a plagas de insectos .................................. 8.11.2. Resistencia a enfermedades víricas ............................ 8.11.3. Resistencia a hongos y bacterias ................................ 8.11.4. Resistencia a herbicidas .............................................. Las plantas como factorías ....................................................... 8.12.1. Producción de fármacos .............................................. 8.12.2. Producción de plásticos biodegradables .................... Descontaminación ambiental ..................................................

231 234 235 236 237 238 239 239 241 241 241 242 242 245 246 247

Bibliografía .........................................................................................

258

Tema 9. Animales transgénicos ....................................................

261

8.3. 8.4. 8.5.

8.6.

8.7. 8.8.

8.9. 8.10.

8.11.

8.12.

8.13.

247 248 249 250 251 251 253 253 254 255 256 257 257

9.1. Métodos de transferencia de genes para la obtención de animales transgénicos .................................................................... 263 9.1.1. Microinyección de DNA en ovocitos o microinyección pronuclear ...................................................................... 264 9.1.2. Otros métodos ................................................................ 268

ÍNDICE

9.2. 9.3.

9.4.

9.5.

9.6.

9.1.3. Obtención de quimeras transgénicas por manipulación de embriones .................................................................. Expresión de genes exógenos en animales transgénicos ........ Clonación del patrimonio genético de un organismo. Individuos clónicos ............................................................................. 9.3.1. Métodos de clonación .................................................... 9.3.2. Historia de la clonación ................................................. Aplicaciones de los animales transgénicos .............................. 9.4.1. Animales transgénicos en la industria cárnica: incremento de la producción ................................................. 9.4.2. Mejora de razas con una mayor resistencia a las enfermedades .......................................................................... 9.4.3. Modificación de la calidad de la leche .......................... 9.4.4. Producción de lana de oveja .......................................... 9.4.5. Granjas farmacéuticas ................................................... 9.4.6. Animales transgénicos como modelo para estudiar algunas enfermedades humanas ...................................... 9.4.7. Xenotransplantes ........................................................... Producción de peces transgénicos ........................................... 9.5.1. Aumento del crecimiento: Mediante la sobreexpresión de la hormona del crecimiento ..................................... 9.5.2. Mejora de la tolerancia al frío y resistencia a las heladas ................................................................................... 9.5.3. Resistencia a las enfermedades. .................................... 9.5.4. Alteración del metabolismo .......................................... 9.5.5. Esterilidad ...................................................................... 9.5.6. Peces productores de fármacos ..................................... Beneficios y riesgos .................................................................. 9.6.1. Beneficios ....................................................................... 9.6.2. Riesgos ............................................................................ 9.6.3. Factores económicos y aceptación pública ..................

Bibliografía .........................................................................................

13

268 269 270 271 271 275 276 279 280 281 282 284 285 285 287 287 288 288 288 290 290 290 291 292 292

Tema 10. Técnicas moleculares aplicadas al análisis de alimentos y detección de fraudes alimentarios ............ 295 10.1. Microorganismos patógenos en alimentos .............................. 297 10.2. Métodos de detección de microorganismos patógenos .......... 299 10.3. Aplicación de las técnicas de Biología molecular para la identificación de patógenos en alimentos ...................................... 301

14

BIOTECNOLOGÍA Y ALIMENTACIÓN

10.4. Técnicas basadas en la hibridación con sondas de DNA ........ 10.4.1. Hibridación en colonia ................................................ 10.4.2. Southern-Blot ............................................................... 10.5. Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) .......................... 10.5.1. Amplificación de secuencias de RNA por retrotranscripción y PCR (RT-PCR) ............................................ 10.5.2. PCR anidada ................................................................. 10.6. Identificación de especies en los alimentos procesados ......... 10.6.1. PCR-RFLP .................................................................... 10.6.2. PCR-SSCP ..................................................................... 10.7. Identificación de alimentos preparados con plantas transgénicas ........................................................................................... 10.7.1. Detección de las secuencias reguladoras del transgén ... 10.7.2. Detección de los genes marcadores ............................ 10.7.3. Detección del gen foráneo ........................................... 10.8. DNA-chips o microarrays .........................................................

302 304 306 307

Bibliografía .........................................................................................

323

311 312 313 315 315 316 317 317 317 322

Tema 11. Los alimentos transgénicos y la seguridad para la salud ..................................................................................... 325 Los alimentos transgénicos ...................................................... El concepto de seguridad en la biotecnología alimentaria .... El principio de la equivalencia sustancial ............................... La legislación en materia de protección al consumidor ......... 11.4.1. La legislación en España y en la Unión Europea ....... 11.4.2. La legislación internacional ........................................ 11.5. El control de la seguridad ........................................................ 11.6. La percepción pública en materia de seguridad de los alimentos transgénicos .................................................................

327 329 331 333 333 342 343

Bibliografía .........................................................................................

349

Tema 12. Los alimentos transgénicos y la seguridad ambiental ......................................................................................

355

11.1. 11.2. 11.3. 11.4.

346

12.1. El concepto de seguridad ambiental y su relación con los alimentos transgénicos ................................................................. 357 12.2. La legislación para la protección del trabajador ..................... 358

ÍNDICE

12.3. La legislación europea y nacional sobre la protección del medio ambiente ............................................................................. 12.3.1. Directivas 90/219, 98/81 y 2009/41 .............................. 12.3.2. Directivas 90/220 y 2001/18 ......................................... 12.3.3. La Ley de Bioseguridad española ............................... Disposiciones generales ............................................... Competencias administrativas .................................... Utilización confinada .................................................. Liberación voluntaria de OMG ................................... Comercialización de OMG .......................................... Información y control .................................................. Obligaciones tributarias .............................................. Infracciones y sanciones ............................................. Órganos colegiales ....................................................... 12.3.4. Comisión Nacional de Bioseguridad .......................... 12.4. La legislación internacional ..................................................... 12.5. Percepción pública sobre los riesgos medioambientales de los alimentos transgénicos ....................................................... Bibliografía .........................................................................................

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363 364 364 365 366 367 367 368 368 368 369 369 369 370 371 372 374

PRÓLOGO

Desde que nuestra especie hizo su aparición sobre la tierra, hace ya muchos miles de años, comenzamos a desarrollar herramientas para utilizar los seres vivos en nuestro propio beneficio, es decir, nos convertimos en verdaderos biotecnólogos. Sin duda uno de los objetivos fundamentales del desarrollo de estas herramientas ha sido y sigue siendo la obtención de alimentos. Por eso la tecnología agroalimentaria representa hoy en día uno de los sectores de mayor actividad dentro del conjunto de la Biotecnología. Mediante la tecnología hemos ido mejorando no sólo la forma de obtener los alimentos sino también la manera de prepararlos, conservarlos, y en definitiva de consumirlos. Las herramientas y las técnicas agroalimentarias han venido progresando continuamente y en este progreso se enmarcan las nuevas técnicas que utiliza la denominada moderna Biotecnología que se inició a principios de 1970 y que ha propiciado una evolución tecnológica muy poderosa que algunos consideran como una auténtica revolución. Este progreso constante está consiguiendo que el consumidor tenga ante sí una oferta cada vez más variada, de mayor calidad y más segura, donde ya no sólo podemos encontrar alimentos que cubran nuestras necesidades nutricionales y apetencias organolépticas, sino que también ejerzan un beneficio añadido sobre nuestra salud. A medida que en la alimentación actual se van introduciendo las nuevas tecnologías que propone la moderna Biotecnología, crece el interés en la sociedad por recibir una información actualizada sobre el potencial de las mismas. Conceptos típicos de la Biotecnología como ingeniería genética, organismos modificados genéticamente, transgénicos, clónicos, nutracéuticos, probióticos, etc., han empezado a formar parte de nuestro vocabulario cotidiano dentro del campo de la alimentación. Pero muchos de estos nuevos procedimientos y conceptos aparecen dispersos en la literatura científica y en los libros de texto, por lo que se hacía necesario con-

18

BIOTECNOLOGÍA Y ALIMENTACIÓN

densar estos conocimientos en un único volumen donde se pueda adquirir rápidamente una visión de conjunto. En este libro se han tratado de una manera sencilla las bases sobre las que se sustenta la nueva Biotecnología de Alimentos; y así en los cinco primeros capítulos se describen los conceptos primordiales que nos ayudan a comprender mejor el fundamento de las herramientas y procesos, para a continuación describir en los siguientes cuatro capítulos las aplicaciones más destacadas de la nueva tecnología atendiendo a los distintos tipos de seres vivos, microorganismos, plantas, y animales de los cuales extraemos la mayor parte de los alimentos. Finalmente, los tres últimos capítulos se dedican al análisis de los alimentos y a las normativas que garantizan su control y seguridad. Los autores deseamos agradecer la ayuda recibida de los compañeros que nos han permitido adaptar y perfilar los capítulos de este libro, y esperamos que esta obra ayude a los estudiantes a comprender mejor las nuevas metodologías que existen en el campo de la Alimentación y que aquí se describen.

Tema 1 BIOTECNOLOGÍA

Antes de adentrarnos en las aplicaciones de la Biotecnología en el campo de la alimentación, es preciso definir qué entendemos por Biotecnología. En primer lugar trataremos de ver en qué consiste y qué la distingue de otras tecnologías. Analizar someramente su larga historia y su desarrollo reciente y esbozar sus diferentes campos de aplicación son los objetivos de este tema. Es asimismo importante definir con precisión, desde el principio, los distintos términos que se utilizan en el difícil y a menudo confuso lenguaje de la Biotecnología. Es frecuente la confusión entre términos relacionados que, a veces, se tratan como sinónimos de forma incorrecta, como son biotecnología, ingeniería genética, organismos modificados genéticamente, transgénicos, clónicos, etc. En este tema se trata de una primera introducción a numerosos conceptos, que se explicarán con mayor detalle en los siguientes capítulos.

ESQUEMA DE CONTENIDOS 1.1. 1.2. 1.3. 1.4. 1.5. 1.6. 1.7. 1.8. 1.9.

¿Qué es la Biotecnología? Una larga historia para una tecnología de moda La revolución Biotecnológica del siglo XX La Ingeniería Genética: nuevas herramientas para la Biotecnología Biotecnología tradicional y Biotecnología actual Organismos modificados genéticamente Campos de aplicación de la nueva Biotecnología Repercusiones económicas de la Biotecnología Los protagonistas de la Biotecnología 1.9.1. Las bacterias 1.9.2. Los hongos 1.10. El futuro de la Biotecnología

1.1.

¿QUÉ ES LA BIOTECNOLOGÍA?

Biotecnología es la utilización deliberada y controlada de agentes biológicos —ya sean seres vivos, sus células o los componentes celulares— para su aplicación en procesos técnicos dirigidos a manufacturar productos u obtener servicios. Dicho de forma más sencilla, cualquier técnica que utilice organismos vivos, o partes de éstos, para elaborar productos es BIOTECNOLOGÍA. Tal vez resulte demasiado sencillo o por el contrario siga sin entenderse exactamente qué quiere decir esta palabra, pero a lo largo de este capítulo iremos precisando su significado con ejemplos concretos de esta tecnología. El término BIOTECNOLOGÍA es bastante reciente, su profusa utilización data de los años sesenta aunque fue propuesto en 1917 por Ereky un ingeniero húngaro. Sin embargo, la humanidad lleva siglos obteniendo productos para su consumo, como el vino, la cerveza, el pan, el yogur, utilizando seres vivos para su elaboración. Quizá sorprenda saber que el hombre utiliza la Biotecnología desde hace más de 8000 años. En su sentido más amplio, la BIOTECNOLOGÍA se entiende como el uso práctico de los seres vivos. Engloba desde las aplicaciones más antiguas, como la agricultura, a las más nuevas; desde las más familiares, como la fabricación de pan, a las más extrañas; desde las más simples, como la fermentación del vino, a las más sofisticadas. En cualquier caso, el objetivo final de cualquier proceso biotecnológico es la obtención de productos comerciales. Consecuentemente, a diferencia de cualquier otra disciplina científica pero a semejanza con otras tecnologías, está fuertemente influida por intereses económicos. A finales del siglo XX, la Biotecnología adquirió una enorme importancia, debido a los impresionantes avances que tuvieron lugar en la Biología, que podemos centrar en dos aspectos:

22

BIOTECNOLOGÍA Y ALIMENTACIÓN

• el conocimiento de los genomas de los seres vivos y de su funcionamiento • la capacidad para transferir genes de unas especies a otras, por ingeniería genética. La irrupción de la Ingeniería Genética provocó una verdadera revolución en la Biotecnología, transformando profundamente las técnicas de trabajo, al permitir aislar genes y modificar el programa genético de los organismos vivos que van a ser utilizados en los distintos procesos Biotecnológicos. Hace posible «diseñar» organismos para desarrollar nuevos y revolucionarios procesos que hasta ahora, con los métodos tradicionales, no era posible abordar. De esta forma no sólo se consigue mejorar la calidad y la eficiencia de los procesos clásicos en los que tradicionalmente se ha empleado la Biotecnología, sino que, además, se ha ampliado enormemente su campo de aplicación.

1.2.

UNA LARGA HISTORIA PARA UNA TECNOLOGÍA DE MODA

La historia de la Biotecnología se remonta a la prehistoria, incluso se piensa que las primeras manifestaciones podrían remontarse a los antecesores del Homo sapiens. Es probable que la primera sustancia obtenida intencionadamente fuese el alcohol corriente, el etanol, no puro, sino como componente de alguna bebida alcohólica sencilla, y, lo más seguro, es que se descubriera casualmente. Imaginemos a nuestros antepasados, cazadores nómadas recolectando algunos frutos silvestres y, tratando de imitar a las hormigas, almacenándolos como provisión para asegurarse alimento en días de escasez. La fermentación ocasional de los frutos almacenados, ricos en azúcares, daría lugar a un líquido, del tipo de la sidra o del mosto, que les reportaría energía, calor y alegría para las largas épocas de invierno. Posteriormente, los procesos de fermentación se fueron perfeccionando, eligiendo y seleccionando solamente aquellos frutos más adecuados. A la vez, se fue perfeccionando el uso de recipientes, que aún rudimentarios, eran pensados y fabricados para este fin. Es decir, se puso en marcha el ingenio y la técnica con un claro objetivo: mejorar la calidad del producto. Esto supuso el inicio del primer proceso técnico con base biológica para obtener un bien manufacturado, el primer proceso biotecnológico.

BIOTECNOLOGÍA

23

Más adelante se desarrollaría la fabricación de bebidas basadas en la fermentación de cocimientos de semillas. Estos procesos, bastante más sofisticados, dieron lugar a la cerveza, el sake y otras muchas bebidas alcohólicas. Estas bebidas se diferencian en el cereal de partida utilizado, y son propias y características de las diferentes culturas primitivas. Los procedimientos actuales de producción de vino, cerveza, y otras muchas bebidas, obtenidas de frutos o de semillas fermentadas, se basan en estos descubrimientos primitivos. De igual manera, la humanidad aprovecha desde tiempos inmemoriales la acción sintetizadora de microorganismos tales como bacterias, levaduras y hongos para la producción de otros alimentos. Así, la utilización de las levaduras para la panificación, de bacterias lácticas para la elaboración de la masa ácida, de mohos para la obtención de alimentos aromáticos (quesos, salsa de soja, etc.), para la elaboración de encurtidos y condimentos culinarios (vinagre) son comunes a muchas culturas. La Biotecnología relacionada con la alimentación representa un elemento clave en nuestra vida diaria, al igual que ocurría con nuestros antepasados. La diferencia radica en que ya no resulta un misterio. Hoy sabemos que en la mayoría de estos procesos participan microorganismos que están perfectamente identificados. Ahora comprendemos como funcionan estos procesos, conocemos los fundamentos químicos de estas transformaciones y hemos aprendido a utilizar estas tecnologías de la manera más eficiente.

1.3.

LA REVOLUCIÓN BIOTECNOLÓGICA DEL SIGLO XX

El impacto social y económico que ha adquirido la Biotecnología a lo largo del siglo XX hace a veces olvidar que su verdadera historia se remonta a los orígenes de la humanidad. Durante miles y miles de años, se ha elaborado cerveza, vino y otras bebidas alcohólicas, fermentado la masa del pan, convertido la leche en yogur y en queso, conservado en adobo alimentos. Todos estos procesos, aunque la mayoría del tiempo sin ni siquiera saberlo, han sido realizados por microorganismos. Hongos, levaduras y bacterias, invisibles aunque presentes en casi todas las partes, sorprendentemente versátiles e impresionantemente abundantes, han estado trabajando anónimamente para la humanidad, aún cuando ésta ni sospechaba siquiera de su existencia, para elaborar productos de enorme importancia en relación con la alimentación. Su descubrimiento como

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agentes de las fermentaciones marca el inicio de la revolución Biotecnológica que ha tenido lugar a lo largo del siglo anterior Hay tres hitos importantes que permiten distinguir tres etapas en la evolución de la Biotecnología: I. El descubrimiento de los microorganismos como agentes de la fermentación por Louis Pasteur (1865-1940). En los inicios del siglo XX se produce una primera revolución en la Biotecnología. Hasta entonces se desconocía la base biológica de estos procesos y se ignoraba que los microorganismos estaban implicados en los mismos. Con Louis Pasteur se establecen los cimientos de la industria de la fermentación. La identificación de los microorganismos implicados en cada proceso permitió seleccionar y utilizar únicamente las cepas más eficientes y a la vez excluir los gérmenes extraños que, actuando como contaminantes, empobrecen e incluso llegan a dañar el producto. En esta época, primeros años del siglo, gracias a los avances en el conocimiento de la bioquímica del metabolismo, se comenzaron a utilizar los microorganismos, aparte de para obtener alimentos, para producir sustancias químicas tales como butanol, glicerina, y otras muchos compuestos que hasta entonces nunca habían sido obtenidos por estos métodos. II. El desarrollo industrial de los años 30-40 tuvo una importante repercusión también en este campo de la producción. El diseño de aparatos sofisticados de control, los tanques reactores, y las cadenas de producción, conservación y distribución de los productos hacen de la Biotecnología una industria floreciente a mediados de siglo. En esta época comenzó la producción industrial de antibióticos y otros productos farmacéuticos a gran escala. III. La verdadera revolución, de la que estamos obteniendo tan solo los primeros frutos, se produce a finales de siglo, en los años 80. Con las herramientas de la ingeniería genética, se adquirió la capacidad de diseñar los seres vivos que van a actuar en los diferentes procesos biotecnológicos. Hasta este momento se habían mejorado las técnicas de producción, la parte tecnológica, pero no la parte «bio», los verdaderos actores biológicos seguían siendo los mismos. En este momento, el testigo pasó de la ingeniería industrial a la ingeniería genética, que puede rediseñar la pieza clave que va a intervenir en los procesos, los seres vivos. Los nuevos procedimientos biotecnológicos implican, generalmente, una manipulación genética que afecta en mayor o menor grado a los componentes vivos que van a participar en los procesos. La inserción de nuevos genes o simplemente la modificación de algunos de ellos, hace que resulten más adecuados para realizar su función.

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Por tanto, lo nuevo en la Biotecnología moderna no es el hecho de utilizar organismos vivos para obtener bienes de consumo, ni tan siquiera el modificarlos genéticamente, ya que esto ha sido una práctica histórica basada en la selección artificial por los agricultores, cerveceros, ganaderos, etc., de aquellas semillas, cepas o reses más convenientes, sino que lo que verdaderamente ha cambiado son las técnicas para realizar esta selección genética, suministradas por la Ingeniería Genética.

1.4.

LA INGENIERÍA GENÉTICA: NUEVAS HERRAMIENTAS PARA LA BIOTECNOLOGÍA ¿Quién se molestará en producir compuestos cuando puede hacerlo un microbio? Si no eres capaz de encontrar un microbio que produzca lo que quieras ¡créalo! J. B. S. Haldane, 1929

No se podía imaginar Haldane, un brillante biólogo evolucionista impresionado por el auge de la microbiología en aquellos años de importantísimos descubrimientos, lo premonitorio de sus palabras que, por otra parte, tan bien resumen la esencia y la lógica de la Biotecnología. Para diseñar nuevos organismos, como bacterias más eficientes para ser utilizadas en los procesos tradicionales, que sean capaces de elaborar nuevos productos y degradar productos hasta ahora «indestructibles», o incluso para diseñar vacas que se comporten como biofábricas produciendo en su leche sustancias de interés farmacéutico, es necesario modificar o manipular su programa genético. La Ingeniería Genética es un conjunto de técnicas y de estrategias que permiten aislar genes y modificar el programa genético de las células. Es una poderosa herramienta para el desarrollo de la Biotecnología. El programa genético se encuentra en una larga molécula: el DNA. Un gen es un fragmento de esta gran molécula de DNA que contiene una unidad de información. La información de los genes, está escrita en un lenguaje molecular de tan solo cuatro bases nitrogenadas: adenina, timina, guanina, citosina (que podemos representar por cuatro letras: A, T, G, C). Esta información escrita en la cadena de DNA se descifra por medio de un código de tres señales que se transmite a lo largo de una cascada de reacciones hasta sintetizar las proteínas.

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Los genes codifican las proteínas, y las proteínas son las moléculas claves para la función celular, y, por tanto, para la función de los seres vivos. Todos los genes de un ser vivo determinado constituyen su genoma, algo propio y absolutamente específico de cada ser vivo, aunque muy similar en cuanto a la cantidad, es decir, el número de genes y la identidad de los mismos para todos los individuos de una misma especie. El genoma se transmite de generación en generación de forma esencialmente inalterable. Sin embargo, de la combinación y mezcla de los genomas parentales y de los pequeños errores en la copia y transmisión, que ocurren muy ocasionalmente, se establecen la multitud de diferencias que son la esencia de la individualidad de los seres vivos. La Ingeniería Genética permite modificar el genoma de un organismo, permite transferir unidades específicas de información, es decir, genes, de un organismo a otro. Para ello se vale de una serie de ingeniosas estrategias que permiten manipular de forma controlada, dirigida y con la mayor precisión posible el DNA, con el fin de modificar el genoma de un organismo. Hay tres herramientas que son fundamentales para estas técnicas: • Unas tijeras moleculares para cortar genes Unas enzimas, llamadas enzimas de restricción, se utilizan para «cortar» el DNA por unas secuencias determinadas. Hay muchas diferentes, cada una de ellas reconoce y corta el DNA por una secuencia «diana» distinta. Con las enzimas de restricción podemos aislar fragmentos manejables, del tamaño de uno o unos pocos genes, de las largas moléculas de DNA. • Un pegamento molecular para pegar genes Una enzima, llamada ligasa, nos permite «pegar» un gen o unos pocos genes aislados de un genoma e integrarlos a otro genoma distinto. De esta forma se puede transferir genes entre individuos, que pueden ser de la misma especie o de especies totalmente distintas, incluso muy alejadas filogenéticamente. • Un vehículo molecular para transportar genes Para introducir el DNA «extraño» en una célula y lograr que los genes se integren en su genoma, generalmente es necesario disponer de un vehículo que lo transporte al interior de la célula receptora, es lo que en términos científicos se denomina un vector. Afortunadamente hay vectores

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naturales para casi todos los tipos de células. Estos son los plásmidos y los virus. La célula en la que vamos a introducir el gen, que puede ser una bacteria, una levadura o bien una célula vegetal o animal, se llama célula hospedadora. En función del objetivo final que se persiga en el experimento de ingeniería genética, se elegirá la célula hospedadora y el vector adecuado para ella y se diseña la estrategia a seguir. Por ejemplo, si queremos introducir un gen humano en una bacteria con el fin de obtener grandes cantidades de la proteína codificada por este gen, los pasos a seguir serían, a grandes rasgos, los siguientes: — Aislar el gen humano, separándolo del resto de los genes, es decir, cortarlo y purificarlo. Este es un proceso que no vamos a detallar, ya que es tremendamente complejo y delicado. — Unirlo a un vehículo adecuado, es decir, pegarlo a un vector que sea capaz de introducirlo en la célula bacteriana elegida, por ejemplo Escherichia coli. Para esta misión resultan muy útiles los plásmidos que son capaces de introducir genes ajenos en el interior de las bacterias. Un plásmido es un pequeño fragmento de DNA que lleva varios genes, y que puede penetrar en la bacteria e incluso moverse de una bacteria a otra. Dentro del plásmido insertaremos el gen de interés, y como las bacterias se reproducen a grandes velocidades en un medio de cultivo adecuado y rico en nutrientes, en pocas horas tendremos millones de bacterias expresando el gen y produciendo la proteína de interés. Los procesos son un poco más complejos en la mayoría de los casos, ya que el gen humano debe ir acompañado de todos los elementos génicos que promuevan su expresión en el organismo hospedador. Esto requiere una región reguladora, lo que los científicos llaman un promotor, que pueda ser identificada por la maquinaria enzimática de la bacteria. A veces resulta muy útil poder controlar su expresión, para ello se utiliza un promotor activable, por ejemplo, por temperatura, de forma que sólo cuando se sube la temperatura del cultivo bacteriano se expresará la proteína de interés. También hay que planificar cuidadosamente cómo lograr que la proteína humana producida por las bacterias sea funcional, es decir, adquiera la estructura tridimensional correcta dentro de las bacterias. Son muchos los aspectos que hay que tener en cuenta y solventar para lograr alcanzar con éxito los objetivos deseados.

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Los procedimientos resultan todavía más complicados para introducir genes en células de organismos más complejos, como vegetales y animales. Estas células resultan mucho menos receptivas que las bacterias a la hora de incorporar material genético del exterior, y hay que valerse de trucos y diseñar estrategias algo más sofisticadas para lograr introducir genes exógenos al interior de estas células. Actualmente se conocen muchas alternativas para realizar este proceso, pero a modo de ejemplo se pueden citar dos de estas alternativas: — Utilizar vectores naturales, como por ejemplo virus. Pero, previamente, hay que modificar el genoma del propio virus eliminando los genes responsables de la virulencia, ya que si no acabarían afectando a la supervivencia de la célula hospedadora. Por tanto, hay que manipular previamente el virus que, además, hay que forzar para que se integre en el genoma hospedador, algo que no siempre ocurre de forma espontánea. — Otra alternativa disponible muy poderosa, que permite prescindir de los virus eliminando todos los problemas que la utilización de éstos conlleva, se conoce como Biobalística, que consiste en disparar microproyectiles sobre las células. Generalmente se trata de micropartículas metálicas, de oro o tungsteno, recubiertas con el DNA del gen en cuestión; para disparar estos auténticos proyectiles génicos se emplean aparatos de gran precisión.

1.5.

BIOTECNOLOGÍA TRADICIONAL Y BIOTECNOLOGÍA ACTUAL

Algunas personas utilizan, de forma no rigurosa, el término Biotecnología prácticamente como sinónimo de Ingeniería Genética, para referirse a procesos tecnológicos en los que se utilizan técnicas de Ingeniería Genética. Ni toda la Biotecnología recurre a las técnicas de la Ingeniería Genética, que comenzaron a desarrollarse solamente a partir de 1973, ni toda la Ingeniería Genética va encaminada a la realización de procesos biotecnológicos. Pero no cabe duda de que las herramientas que la Ingeniería Genética proporciona han marcado un antes y un después entre la Biotecnología tradicional y la Biotecnología actual, que en algunos casos se denomina también Biotecnología Molecular para diferenciarla. Pero ¿son tan diferentes? Las diversas actividades de la Biotecnología tradicional y las más numerosas y variadas de la actual tienen en común

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una cosa, en todas se aprovechan y para ello se dirigen las facultades primordiales de los seres vivos. Un primer ejemplo de Biotecnología tradicional que implica, sin duda, una modificación genética aunque lenta y no demasiado precisa, es la obtención de plantas y animales de interés agrícola y ganadero por selección y cruzamiento dirigido. La domesticación de las especies vegetales que hoy cultivamos se remonta a los inicios de la agricultura. Supuso provocar cambios sustanciales en los genomas de estas especies, alterando caracteres relacionados con las características del producto y su aptitud para la cosecha. Las especies domesticadas, tras siglos de selección, quedaron bajo el dominio humano, hasta tal punto que la mayoría de ellas han perdido la capacidad de vivir por sí mismas en la naturaleza. Los rudimentos de esta selección genética se basan en la elección únicamente de aquellos individuos que tienen las características deseadas y cruzarlos entre ellos. La selección artificial realizada por el hombre hunde sus raíces en los inicios de la civilización humana, ha dado lugar a las plantas cultivadas y los animales domésticos y ganaderos que hoy día conocemos, que en nada se parecen a las especies silvestres y salvajes de las cuales proceden. La tecnología tradicional agrícola y ganadera de mejora genética por selección y cruce tuvo un importante auge con los avances de la genética y el descubrimiento de las leyes de la herencia y sus bases celulares y moleculares, de forma que durante los últimos 150 años se convirtió en una poderosa y sofisticada tecnología. La mejora genética tradicional, apoyada en nuevos abordajes moleculares como la detección de marcadores, ha resultado de enorme éxito y es responsable, en gran medida, de los altos rendimientos de los cultivos en la agricultura contemporánea. La técnicas de mejora clásica siguen siendo óptimas para el manejo de caracteres que dependen de muchos genes mientras que las de la Ingeniería Genética ofrecen indudables ventajas para la mejora de caracteres que dependen de uno o unos pocos genes. También los procesos clásicos que incluyen la fermentación por medio de microorganismos para obtener diversos alimentos y bebidas, como quesos, yogures, cerveza, vino, vinagre, etc., han evolucionado notablemente, y hoy se utilizan industrialmente los microorganismos para obtener muchos otros productos que nada tienen que ver con los alimentos como, por ejemplo, las enzimas que se añaden a los detergentes modernos.

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El esfuerzo por mejorar y obtener altos rendimientos en estos procesos ha llevado a buscar microorganismos que funcionen mucho más eficazmente o que produzcan enzimas o cualquier otro producto de interés con un alto rendimiento. En este proceso no sólo se ha hecho una selección genética artificial de las cepas mejores, sino que se han buscado nuevas características provocando directamente cambios en el material genético por mutaciones inducidas al irradiar las cepas, en busca de nuevos genes. Este proceso, llamado mutagénesis, y realizado sobre las bacterias y sobre las levaduras, provoca numerosos cambios genéticos aleatorios entre los cuales algunos que producen mayor cantidad o mejor calidad del producto deseado. Estos mutantes posteriormente se aíslan y seleccionan como progenitores. Con estos ejemplos, queremos señalar que aún en las llamadas biotecnologías tradicionales, donde todavía no se hacía uso de las poderosas herramientas de la Ingeniería Genética, el hombre ha modificado el material genético de los seres vivos que ha utilizado para su propio provecho, bien de forma lenta y paulatinamente por cruces y selección, o incluso rápida y drásticamente por mutagénesis inducida y selección. Es importante resaltar que la humanidad, desde sus orígenes históricos hasta nuestros días, siempre ha utilizado la Biotecnología, en el sentido de hacer un uso práctico y aplicado de los seres vivos en su beneficio. Esto ha llevado aparejado una modificación del material genético de las especies utilizadas, realizando una «mejora» desde el punto de vista humano, de aquellos caracteres que resultan más interesantes para el uso específico a que estarán destinados, alejando paulatinamente las especies que «domestica», sean plantas, animales o microorganismos, de sus ancestros naturales. Este es un hecho evidente e incuestionable, pero que a menudo se olvida en las discusiones sobre los efectos de la nueva biotecnología, donde se obvia lo que la humanidad ha hecho hasta ahora con los seres vivos que ha utilizado en su provecho, y parece que partimos del Edén y comenzamos ahora a alterar la naturaleza. Por otra parte, y en contra de lo que pudiera parecer a simple vista y de lo que la mayoría de la gente pudiera pensar, no todos los procesos englobados dentro de lo que podríamos llamar nueva Biotecnología, implican necesariamente una modificación genética de los caracteres de las especies. En este sentido, son numerosas las empresas biotecnológicas que desarrollan productos, como pueden ser aplicaciones muy específicas para diagnóstico clínico, test del embarazo, pruebas de paternidad, etc., que hacen uso de los nuevos conocimientos sobre la biología celular,

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pero que no necesariamente conllevan una modificación del patrimonio genético de las especies. Otro ejemplo, que puede resultar muy llamativo en este sentido es la clonación de seres vivos. Para la obtención de mamíferos clónicos, por ejemplo la famosísima oveja Dolly, se transplantó el núcleo de una célula adulta, con todos sus genes, a una célula huevo, a la cual se había quitado su propio núcleo. El individuo resultante, una vez que se desarrolló el huevo, era una oveja idéntica genéticamente a la adulta de la cual procedía el núcleo, como dos gemelos univitelinos son idénticos genéticamente. Aunque este proceso es una manipulación de las células, y en concreto de la célula huevo, no conlleva una modificación del material genético, al contrario se transfiere todo el núcleo que contiene el «set» completo de instrucciones genéticas. En este proceso hay una manipulación y una transferencia de material genético pero no una modificación del mismo. Por el contrario, en los ejemplos que hemos puesto anteriormente de mutagénesis experimental para seleccionar nuevas características se daba una modificación genética y sin embargo no había una manipulación directa del material genético.

1.6.

ORGANISMOS MODIFICADOS GENÉTICAMENTE

Cualquier ser vivo al cual se le haya modificado su genoma, bien al añadir, eliminar, inactivar o sustituir algún gen se conoce como organismo genéticamente modificado, y se denomina por las siglas OGM (en inglés GMO). Este término se reserva, exclusivamente, para aquellos casos en que se ha producido una modificación planificada y realizada empleando las técnicas de la Ingeniería Genética. Obviamente esta terminología, aplicando estrictamente su significado, podría hacer referencia también a cualquiera de los numerosos organismos que han sido modificados por el hombre, a lo largo de los siglos, por las técnicas tradicionales de selección artificial. Un organismo transgénico es un organismo genéticamente modificado que lleva incorporado uno o más genes provenientes de una especie diferente a la suya. Esto quiere decir que todos los organismos transgénicos están modificados genéticamente, pero no todos los organismos modificados genéticamente son necesariamente transgénicos.

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BIOTECNOLOGÍA Y ALIMENTACIÓN

1.7.

CAMPOS DE APLICACIÓN DE LA NUEVA BIOTECNOLOGÍA

Desde el punto de vista de la aplicación comercial e industrial de la nueva Biotecnología podemos decir que el campo potencial es inmenso y, a medida que avanza la investigación científica básica, se van abriendo nuevas perspectivas y nuevas utilidades antes ni siquiera imaginadas. Dejando aparte el hecho de que las nuevas técnicas biotecnológicas a su vez inciden en el avance de las propias Ciencias de la Vida, desde el punto de vista de su aplicación comercial e industrial, podemos diferenciar cuatro grandes campos de aplicación: Aplicaciones terapéuticas Productos farmacéuticos: Antibióticos Vacunas Hormonas Terapias génicas Diagnósticos Diagnósticos para salud humana Diagnósticos para agricultura y ganadería Ensayos para calidad de alimentos Ensayos para calidad ambiental Alimentación Mejora de procesos tradicionales de obtención de alimentos y bebidas Nuevos alimentos y bebidas Nutracéuticos: alimentos para la mejora de la salud Aditivos alimentarios Medio ambiente Tratamiento de residuos domésticos, urbanos, agrícolas e industriales Biorremediación Producción de energía a partir de biomasa

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BIOTECNOLOGÍA

1.8.

REPERCUSIONES ECONÓMICAS DE LA BIOTECNOLOGÍA

La Biotecnología tiene un considerable impacto económico, especialmente desde 1990 cuando las nuevas técnicas de modificación genética salieron de los laboratorios de investigación básica hacia la industria y se hicieron evidentes sus enormes posibilidades de aplicación en muy diversos campos, que desde entonces se amplia de forma imparable. Muchas de las innovaciones que se están produciendo en estos años, sin embargo, no son tanto de nuevos productos cuanto de mejoras en los procesos. De cualquier manera, ya estamos viendo la entrada en el mercado de nuevos productos, en forma de nuevos fármacos y de plantas transgénicas con características novedosas. Son precisamente los sectores de la alimentación y el agrícola los de mayor importancia económica. En el primero, se han hecho operativos sistemas de diagnóstico y la bioconversión del almidón; se han comercializado edulcorantes, saborizantes y elementos flavorizantes que mejoran la calidad de los alimentos; se han diseñado procesos de producción de enzimas, aminoácidos, pigmentos, vitaminas y productos de fermentación para elaboración de quesos y otros productos lácteos; se dispone ya de levaduras híbridas y bacterias modificadas genéticamente que participan en la base de producción de muchos compuestos y alimentos fermentados, así como en la producción de biocatalizadores y biosensores para la monitorización y detección de fraude alimentario. En el sector agrícola, ya están comercializadas variedades transgénicas de tomates, patatas, algodón, tabaco y soja, que presentan características de resistencia a herbicidas, virus, insectos y algunas cualidades específicas. TABLA 1.1. Impacto de los diferentes campos de la biotecnología en la economía Impacto ecnonómico de la biotecnología en los países de la OCDE Año

Agricultura y alimentación

Productos sanitarios

Producos químicos

Energía

Total (mill. dólares)

1980

37%

37%

12%

11%

5-20.000

1990

21%

29%

13%

37%

20-40.000

2000

48%

22%

12%

18%

45-200.000

Fuente: OCDE.

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Los datos de la Tabla 1.1 permiten inferir que actualmente la riqueza generada por los productos biotecnológicos está determinada, fundamentalmente, por los requerimientos en alimentación, agricultura y sanidad. El sector químico y energético representa sólo una pequeña parte.

1.9.

LOS PROTAGONISTAS DE LA BIOTECNOLOGÍA

Los verdaderos protagonistas de la Biotecnología sólo se pueden ver con ayuda de un microscopio: son las diminutas células de los microbios y las células procedentes de plantas y animales. Diversos organismos unicelulares, bacterias, hongos y algas, todos ellos microscópicos son los actores más cotizados. Participan en los procesos fermentativos que llevan a la producción de alimentos para el ser humano y los animales, así como a la obtención de multitud de compuestos orgánicos. Las bacterias y los hongos, fundamentalmente los unicelulares, son los microorganismos más utilizados especialmente en la Biotecnología alimentaria. Conozcamos algunas características peculiares de estos organismos.

1.9.1.

Las bacterias

Las bacterias han habitado el Planeta desde hace unos 3.500 millones de años. Las primeras células eucariotas, que caracterizan a los otros cuatro reinos, más complejas en su estructura y que acabaron asociándose para formar los organismos pluricelulares (animales y plantas), aparecieron hace unos 2.000 millones de años. Las bacterias vivieron y evolucionaron en solitario durante casi dos mil millones de años, y han continuado adaptándose al cambiante ambiente del planeta y, a su vez, han contribuido como ningún otro ser vivo a cambiar la Tierra. Las bacterias, que constituyen por si solas el Reino Monera, son los seres vivos más abundantes de la Tierra. Casi la mitad de la biomasa del planeta (la masa de la materia viva) consta de microorganismos, fundamentalmente bacterias y hongos. Las plantas sólo representan el 35% y los animales menos del 15% del total. Las bacterias se encuentran en todas las superficies y todos los hábitat de la Tierra, incluidas las superficies externas y digestivas de todos los demás seres vivos. El hecho de que resulten invisibles hacen que nos olvidemos que colectivamente su impacto sobre la Tierra y el resto de los seres vivos es gigantesco.

BIOTECNOLOGÍA

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A pesar de que las bacterias son conocidas por la mayoría de la gente como causantes de muchas de las enfermedades que padecemos los humanos, sólo una pequeña minoría de las bacterias son patógenas. La gran mayoría tienen un papel fundamental en la Biosfera como descomponedoras, función esencial para el reciclaje de materia para el resto de los seres vivos, y como productoras de multitud de compuestos necesarios para la supervivencia de otros organismos. Las bacterias junto con los hongos son los recicladores de la naturaleza, sin ellos los recursos disponibles se agotarían: el carbono, nitrógeno, fósforo, azufre y otros elementos químicos, quedarían atrapados en los organismos muertos, y la falta de materia prima llevaría a la extinción de la vida tal y como la conocemos. Además, algunas bacterias realizan la fotosíntesis fijando el carbono de la atmósfera, para que posteriormente pueda ser utilizado por otros seres vivos, aunque esta función también la realizan las plantas. Sin embargo, solamente las bacterias son capaces de fijar el nitrógeno atmosférico y convertirlo en una molécula que puede ser usada por las plantas. Esta capacidad es esencial para la vida no sólo de las plantas, sino también para todos los animales (incluidos los humanos) que se alimentan de plantas, o de otros animales que se alimentaron, a su vez, de plantas. Todas las bacterias son organismos microscópicos unicelulares, aunque muchas son capaces de asociarse en colonias. Casi todas tienen una gruesa pared celular que constituye un armazón protector, formado por peptidoglucanos. La estructura de la pared varía entre especies y permite distinguir dos grandes grupos de bacterias: las gram+ y las gram-. Éstas últimas tienen una segunda membrana protectora exterior que las hace aún más resistentes. Casi todas las bacterias son móviles y algunas tienen uno o más apéndices, llamados flagelos, que impulsan el movimiento. Las células de las bacterias se conocen con el nombre de procariotas, que quiere decir que no tienen núcleo. La estructura de la célula es relativamente sencilla ya que carece de orgánulos con membrana. Por el contrario, las células eucariotas, que son las del resto de los seres vivos incluidos los pluricelulares, tienen un núcleo diferenciado, donde se aloja el material genético, y multitud de orgánulos y estructuras complejas que compartimentalizan su interior. El material genético de las bacterias está contenido en una única molécula circular de DNA. Este cromosoma bacteriano circular, que está libre en el citoplasma sin proteger por una envoltura nuclear, tiene del orden de unos 3.000 genes, y si se extendiera en toda su longitud la molécula sería unas 1.000 veces más larga que la célula misma. En la

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mayoría de las bacterias, además del DNA cromosómico existen fragmentos circulares de DNA, más pequeños, llamados plásmidos. Los plásmidos se duplican de manera independiente y llevan genes que son esenciales para el intercambio genético entre bacterias, proceso que se conoce como sexualidad bacteriana. También suelen llevar genes que les confieren resistencia a determinados antibióticos, y algunos genes del metabolismo. Los plásmidos pueden transferirse de una bacteria a otra en los procesos de sexualidad, y son utilizados por esta razón como vehículos para transferir genes a las bacterias con las técnicas de la ingeniería genética. Muchos de los procesos metabólicos básicos de las bacterias, es decir, las reacciones bioquímicas por las cuales utilizan los alimentos y obtienen energía, son comunes a todos los seres vivos. De hecho gran parte de nuestro conocimiento sobre el metabolismo celular se obtuvo estudiando estos mecanismos en las células bacterianas. Sin embargo, las bacterias, como grupo, presentan la mayor diversidad de metabolismos posibles entre los organismos y obtienen energía de muchas formas diferentes: pueden ser fotosintéticas, quimiosintéticas y heterótrofas. La diversidad metabólica dentro de este Reino es mucho mayor que la que podemos encontrar en todos los otros cuatro reinos juntos. Hay especies de bacterias capaces de vivir en las condiciones ambientales más extrañas donde no sobrevive ningún otro organismo. Pueden habitar en ambientes hipersalinos, a temperaturas muy elevadas (por encima de 70 °C), en ambientes anaeróbicos sin oxígeno (como pantanos, sedimentos marinos, incluso en el tubo digestivo de los animales) y son capaces de utilizar como nutrientes compuestos químicos muy diversos y obtener energía de la oxidación de sustratos inorgánicos. Prácticamente no existe una molécula orgánica en la naturaleza que no pueda ser utilizada como alimento por alguna especie de bacterias. Por ejemplo, hay bacterias capaces de metabolizar el petróleo, que se utilizan para limpiar los vertidos. Solamente algunos polímeros sintéticos como los plásticos son resistentes al ataque de las bacterias y por eso se dice que no son biodegradables. Esta diversidad que encontramos en las bacterias actuales no es sino la consecuencia de su larga historia de adaptaciones evolutivas que han experimentado los procariotas en el pasado. La única característica que unifica este escenario de diversidad de Reino Monera es la estructura de su célula procariota. Las bacterias nos proporcionan muchos productos de forma espontánea, y también hemos aprendido a utilizarlas de forma que nos resultan esenciales para la obtención de alimentos y la absorción de los mismos, como iremos viendo a lo largo de los siguientes temas.

BIOTECNOLOGÍA

1.9.2.

37

Los hongos

Las palabras hongo y moho tiene para la mayoría de las personas una cierta connotación desagradable, un recuerdo a alimentos echados a perder, a enfermedades, a cosechas perdidas, etc. Sin embargo, los ecosistemas terrestres se colapsarían sin la existencia de los hongos recicladores de la materia viva. Nosotros los humanos obtenemos especialmente muchas otras ventajas de ellos, desde alimentarnos de ellos directamente (setas) o indirectamente usándolos para elaborar alimentos y bebidas, y para obtener muchos otros productos, como por ejemplo antibióticos y otras muchas drogas. Los hongos constituyen por si solos el Reino Fungi, con unas características muy peculiares y diferentes al resto de los seres vivos, aunque también presentan entre ellos una gran diversidad. Los hogos tienen células eucariotas, y casi todos ellos, exceptuando a las levaduras, tienen formas de vida multicelulares. Todos los hongos tienen un metabolismo heterótrofo, necesitan alimentarse de moléculas orgánicas ya elaboradas. Los hongos adquieren los nutrientes absorbiéndolos del medio externo que les rodea. Frecuentemente secretan enzimas al medio que degradan las sustancias complejas para luego poderlas absorber como moléculas más sencillas. La organización básica de sus cuerpos es la de una red de filamentos, llamados hifas. Cada uno de estos filamentos está constituido por muchas células adyacentes que suelen estar separadas por tabiques, aunque a veces, no existen estos tabiques perdiéndose la individualidad celular. Como hemos dicho, también hay hongos unicelulares como es el caso de las muchas especies de levaduras. Se conocen actualmente más de 75.000 especies diferentes de hongos, aunque son muchos los que quedan por identificar. Los especialistas clasifican toda esta diversidad en cuatro grupos, en base a variaciones de su modo de reproducción: Zigomicetos, Basidiomicetos, Ascomicetos (grupo al que pertenecen las levaduras) y Deuteromicetos. Como en el caso de las bacterias, los hongos a parte de su inmenso valor ecológico para la vida en el Planeta, tienen un importante valor comercial por los usos que hemos aprendido a hacer de ellos. A continuación se enumeran, solamente algunos ejemplos concretos de bacterias y hongos utilizados en diversos procesos biotecnológicos: — La levadura Saccharomyces hace «subir» las masas en la producción del pan.

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BIOTECNOLOGÍA Y ALIMENTACIÓN

— Las levaduras convierten, por fermentación, los cocimientos de granos de cereales en cerveza, los zumos de manzana en sidra, y el zumo de uvas en vino. — Los estreptococos y algunas especies de lactobacilos convierten la leche en yogur o en queso. — Las acetobacterias y bacterias del género Erwinia hacen fermentar los granos de café o las hojas de té. — Los lactobacilos convierten las hierbas verdes y frescas en forraje para los animales durante el ensilado. — Disolventes orgánicos, como por ejemplo el etanol o la acetona, de enorme importancia industrial, son producidos por Saccharomyces cerevisiae y por la bacteria Clostridium acetobutylicum. — Ácidos orgánicos, como por ejemplo el ácido cítrico, de enorme importancia en la industria alimenticia como conservante, es producido por Aspergillus niger, o el ácido láctico por lactobacterias. — Polisacáridos como el dextrano por Leuconostoc mesenteroides. — Aminoácidos, como el ácido glutámico, por Corynebacterium glutamicum, o la lisina por Brevibacterium flavum. — Nucleósidos y nucleótidos como 5’IMP o 5’GMP por Bacillus subtilis y Brevibacterium ammoniagenes. — Vitaminas, como la vitamina B12 por Propionibacterium o la vitamina C por especies de Acetobacterias. — Antibióticos, como los β-lactámicos por Penicillium chrysogenum o la tetraciclina por especies de Streptomyces. — Alcaloides del cornezuelo del centeno, por especies de Claviceps. — Enzimas para la industria química y para detergentes como la lipasa por especies de Aspergillus, y para la industria alimenticia, como las amilasas por especies de Bacillus y Aspergillus. — Hormonas peptídicas y esteroideas, como la 11-hidroxi-progesterona por Rhizopus nigricans, o como la insulina humana, actualmente producida por Escherichia coli mediante ingeniería genética. — Algunas especies de bacterias como Thiobacillus ferrooxidans están siendo utilizadas en la lixiviación de minerales.

BIOTECNOLOGÍA

1.10.

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EL FUTURO DE LA BIOTECNOLOGÍA

Si la Biotecnología tradicional estuvo básicamente centrada en la producción de alimentos y productos de interés médico, hoy día, sin abandonar estos objetivos, se han abierto nuevos campos de aplicación de enorme interés: el tratamiento de basuras, la degradación de sustancias tóxicas, la descontaminación de restos de petróleo, el tratamiento y descontaminación de aguas, la producción de proteínas para consumo animal y la producción de energía, son sólo algunos ejemplos. Son multitud los campos de aplicación de la Biotecnología, y se amplían día a día con nuevas posibilidades antes no imaginadas. La industria Biotecnológica mueve mucho dinero. Las patentes biotecnológicas y la salida a bolsa de pequeñas empresas centradas en la producción biotecnológica son noticia frecuente en la prensa diaria. Muchas empresas tradicionales se han reconvertido en empresas biotecnológicas. Desde la producción de hormonas y otros productos terapéuticos, no sólo para uso humano sino también para el ganado, la producción de enzimas para detergentes y para la degradación de contaminantes ambientales, la producción de tejidos para transplantes, la obtención de plantas transgénicas para obtener un mayor rendimiento en las cosechas, la obtención de ganadería clónica para obtener productos en la leche, etc., son algunos de los ejemplos de los que estamos informados por las noticias en la prensa diaria y los medios de comunicación. Es típico que las nuevas tecnologías que afectan a la sociedad a gran escala susciten controversias. Podríamos extenderlo y decir que no sólo las nuevas tecnologías sino también cualquier otro aspecto que implique una novedad, y que conlleve un cambio en los patrones establecidos, provoca tanto alianzas incondicionales como rechazos frontales por parte de la sociedad. Las voces que corresponden a estas posturas extremas son siempre las que más se oyen, frente a posturas más comedidas que no se decantan ni por una idealización ni por una satanización genérica de las nuevas tecnologías, o de las ideas nuevas en general. Estas afirmaciones son aplicables a la nueva Biotecnología. Muchas personas comparten la idea de que, considerada en términos generales, ofrece beneficios y presenta riesgos potenciales, por lo que hay conocer, sopesar y regular, pero siempre analizando los aspectos o aplicaciones concretas, y no rechazar la nueva Biotecnología en general. Vamos a comentar únicamente algunas perspectivas de futuro que se prevén en los diferentes campos de aplicación fundamentales en que se mueve hoy día la industria biotecnológica:

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— Proporcionar métodos de diagnóstico clínico de una precisión hasta ahora insospechada que permitirá prevenir y curar un amplio espectro de enfermedades genéticas e infecciosas. — Incrementar significativamente el rendimiento agrícola con el desarrollo de nuevas plantas de cultivo resistentes a predadores y a enfermedades, y resistentes a condiciones ambientales adversas. — Desarrollar microorganismos que producirán diferentes sustancias químicas de interés como: biopolímeros, enzimas para la industria y diferentes aditivos alimentarios. — Se obtendrán animales de granja y domésticos con mejores características e incluso con nuevos atributos, de forma que pueden tener aplicaciones hasta ahora inéditas como la obtención de órganos para transplantes, productos farmacéuticos secretados en la leche, vacunas en los vegetales crudos, etc. — Mejorarán las biotecnologías relacionadas con la conservación ambiental dirigidas a la eliminación de contaminantes y productos de deshecho, purificación de aguas, y obtención de energías alternativas. Todas estas importantes expectativas, en principio positivas, despiertan a su vez temores y se plantean posibles repercusiones cuyo impacto negativo para la sociedad debe ser también tenido en consideración y serenamente sopesado. Algunas de las cuestiones que se debaten son las siguientes: — Algunos de los organismos modificados por ingeniería genética ¿podrían resultar dañinos para otros seres vivos o perjudiciales para el medio ambiente? — El desarrollo y la utilización extensiva de organismos modificados genéticamente ¿podría alterar y reducir la diversidad genética natural? — La ingeniería genética ¿podría llegar a modificar la especie humana? — Los métodos de diagnóstico molecular y genético ¿podrían llegar a eliminar la privacidad y la libertad individual? — ¿Es lícita la propiedad individual o las patentes sobre seres vivos que portan nuevas combinaciones de genes, aunque estos provengan del acervo natural?

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— Puesto que están en juego importantes intereses comerciales y económicos ¿podría afectar el impulso de la biotecnología al desarrollo de otras importantes tecnologías? ¿podría representar una nueva y más profunda brecha entre el mundo desarrollado y los países pobres y en vías de desarrollo? Algunas de estas cuestiones no son estrictamente científicas o académicas sino que tienen un profundo sentido social y político, como muchos otros aspectos del vertiginoso desarrollo industrial y comercial de la vida contemporánea y como tal deben ser analizados, debatidos y regulados con la implicación de toda la sociedad. En última instancia, nuestro punto de vista sobre la nueva Biotecnología está fuertemente influido por las actitudes individuales que están íntimamente ligadas a nuestras creencias básicas sobre la naturaleza en general, y la naturaleza humana en particular; sin embargo, la percepción de sus objetivos y la comprensión de sus métodos de trabajo son elementos fundamentales para un análisis riguroso y una valoración acertada del papel de la Biotecnología para la sociedad actual y el futuro de la humanidad.

BIBLIOGRAFÍA CARRASCOSA, A. V.: Los microbios que comemos. Editorial CSIC-Catarata, 2011. FENOLL, C. y FERNANDEZ-CANDELAS, F.: Transgénicos. Editorial CSIC-Catarata, 2010. GLICK, B. R. y PASTERNAK, J. J.: Molecular Biotechnology. Principles and applications of recombinant DNA. ASM Press, Washington DC, 1994. GRACE, E. S.: La Biotecnología al desnudo. Promesas y realidades. Editorial Anagrama, 1998. JAGNOW, G. y DAVID, W.: Biotecnología. Introducción con experimentos modelo. Editorial Acribia, 1991. MUÑOZ, E.: Biotecnología y sociedad: encuentros y desencuentros. Cambridge University Press, 2001. PRIMROSE, S. B.: Molecular Biotechnology. Blackwell Scientific Publications. 2nd Edition, 1991. RATLEDGE, C. y KRISTIANSEN, B.: Biotecnología básica (2.a ed.). Editorial Acribia, 2009. RENNENBERG, R.: Biotecnología para principiantes. Editorial Reverté, 2008. REHM, H. J. y REED, G. (Ed.): Biotechnology. A comprehensive treatise in 8 volumes. Verlag Chemie, Weinheim. RIFKIN, J.: El Siglo de la Biotecnología. Editorial Marcombo, 1999. SCRAGG, A.: Biotecnología ambiental. Editorial Acribia, 2001.

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Direcciones en Internet Biotech Applied http://www.accessexcellence.org/AB/BA/#Anchor-47857 Council for Biotechnology Information http://www.whybiotech.com European Initiative for Biotechnology Education (EIBE) http://www.rdg.ac.uk/EIBE/home.html ASEBIO Asociación Española de Bioempresas. Tiene acceso a un Boletín de noticias y enlaces de interés. http://www.asebio.com Fundación Antama Fundación para la Aplicación de las nuevas tecnologías en la Agricultura, el Medio Ambiente y la Alimentación. http://www.fundacion-antama.org/jsp/index.jsp Introducción a la Biotecnología Instituto de Biotecnología de la Universidad de Granada. http://www.ugr.es/eianez/Biotecnologia/introbiotec.htm

Tema 2 ALIMENTOS Y BIOTECNOLOGÍA

La tecnología ha sido aplicada por los seres humanos para satisfacer una gran variedad de necesidades, desde la construcción de viviendas, la obtención de alimentos, la producción de vestidos, el transporte, la transmisión de mensajes, hasta la obtención de diversiones triviales. La alimentación es la más fundamental de todas las necesidades humanas y, lógicamente, ha estado fuertemente influida por el desarrollo de la tecnología. Este tema se centra en el estudio de la alimentación humana y su historia paralela al desarrollo de la civilización. Las técnicas más simples y primitivas, como las prácticas agrícolas tradicionales, se basaban en un conocimiento meramente empírico de la naturaleza. Las actuales más complejas y sofisticadas requieren un profundo conocimiento científico de los seres vivos. La actual Biotecnología molecular de los alimentos utiliza las nuevas oportunidades ofrecidas por el desarrollo de la ingeniería genética para investigar en nuevos procesos de elaboración de productos alimentarios más eficientes y seguros y en nuevos alimentos con mejores cualidades tanto para el consumidor como para el productor.

ESQUEMA DE CONTENIDOS 2.1.

La disponibilidad de alimentos

2.2.

Historia de la alimentación 2.2.1. 2.2.2. 2.2.3. 2.2.4.

Primeros alimentos Inicio de la agricultura La revolución verde La nueva revolución: cultivos modificados genéticamente

2.3.

Alimentos y Biotecnología

2.4.

Alimentación y nutrición

2.5.

Nutrientes 2.5.1. Hidratos de carbono. Grasas. Proteínas 2.5.2. Vitaminas 2.5.3. Minerales

2.6.

Digestión de los alimentos

2.7.

Comemos genes cuando ingerimos alimentos

2.8.

Tipos de alimentos

2.9.

Dieta y requerimientos nutricionales

2.10. Conservación de los alimentos 2.10.1. Métodos físicos 2.10.2. Métodos químicos 2.10.3. Métodos biológicos 2.11. Alimentación y salud 2.11.1. Enfermedades relacionadas con la alimentación Sobrealimentación Malnutrición Deficiencia calórica Desequilibrio nutricional 2.11.2. Enfermedades de origen alimentario Infecciones alimentarias Intoxicaciones alimentarias 2.12. Problemas de la alimentación mundial 2.13. Nuevos Alimentos y alimentos modificados genéticamente 2.13.1. La tecnología enzimática y biocatálisis 2.13.2. Alimentos modificados genéticamente 2.13.3. Técnicas para la detección de contaminantes y fraude alimentario

2.1.

LA DISPONIBILIDAD DE ALIMENTOS

La disponibilidad de alimentos ha sido, sin duda, el principal factor determinante de la conducta alimentaria de nuestra especie, pero no menos cierto es que ésta ha tenido, a su vez, una enorme influencia en la conducta social. Se ha dicho que la historia del hombre es la historia de la lucha contra el hambre. Nuestros más remotos antepasados se alimentaron de cualquier clase de productos naturales capaces de satisfacer su apetito. El descubrimiento del fuego, que permitió la cocción de los alimentos, el comienzo de la agricultura y, posteriormente, la domesticación de los animales para la producción de géneros alimenticios (carnes, huevos) y su uso en la agricultura (ayuda mecánica en la preparación y recolección, y utilización de los desechos como fertilizantes), son quizás los tres hitos más notables que han influido en nuestros hábitos culinarios y en el desarrollo y la organización de las sociedades humanas. La lección más importante que puede derivarse de la información que poseemos sobre la historia de la alimentación es que el hombre es capaz de subsistir consumiendo dietas muy diferentes, como se confirma en la actualidad en los diferentes países y culturas, sin embargo, no todas las dietas permiten mantener un estado de nutrición satisfactorio.

2.2. 2.2.1.

HISTORIA DE LA ALIMENTACIÓN Primeros alimentos

Sólo podemos hacer conjeturas acerca de la alimentación de los primeros homínidos cazadores-recolectores. Parece ser que una fisiología di-

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gestiva menos especializada que la de los primates permitió experimentar con una dieta más variada y, paulatinamente, romper con los hábitos estrictamente vegetarianos de sus parientes primates. Sin embargo, los expertos consideran que los alimentos vegetales debieron predominar en la dieta, frente a la imagen tópica de los hombres primitivos como cazadores y consumidores de carne en las cavernas. Lo que no cabe duda es que la dieta de los cazadores-recolectores era muy variada, y probablemente mucho menos vulnerable que la de los primeros agricultores cuyas cosechas estaban sometidas a los azares climáticos de la naturaleza. Algunos autores consideran que las primeras bebidas fermentadas procedentes de jugos de frutos silvestres precedieron a los inicios de la agricultura.

2.2.2.

Inicios de la agricultura

Las primeras evidencias arqueológicas de cultivos agrícolas proceden del Oriente Próximo y se remontan a unos 10-12 milenios atrás. Parece ser que la agricultura comenzó a desarrollarse en diferentes regiones del planeta de forma casi simultánea. La domesticación de algunos animales ocurrió posteriormente, proporcionando no sólo alimentos adicionales, sino también una ayuda para las tareas agrícolas e incluso fertilizantes para las tierras cultivadas. El inicio de la agricultura corre paralelo al abandono de los hábitos nómadas, totalmente incompatibles con el cuidado constante de las cosechas, y la adaptación a hábitos sedentarios. Esto supuso un nuevo tipo de vida y de organización social, que conlleva una especialización para el reparto de tareas. La vida sedentaria llevó a la creación de ciudades y a la especialización del trabajo, pero supuso también el inicio de la distribución desigual de los alimentos y de la riqueza. Hoy en día se ha podido establecer los orígenes geográficos de las principales cosechas, que seguimos utilizando actualmente como la base de la alimentación humana. El maíz, la patata, la judía y el tomate tienen su origen en el centro y sur de América. El trigo, la cebada, la avena y el centeno en el Oriente próximo. Mientras que el arroz, la soja, y el mijo son originarias del lejano Oriente. En las sociedades primitivas, la alimentación en cada una de las poblaciones dependía, fundamentalmente, de una o unas pocas cosechas que constituían el alimento predominante. El resultado era una dieta muy poco variada, que incluso originaba con frecuencia enfermedades

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metabólicas debidas a deficiencias en nutrientes esenciales. La dependencia de una cosecha hacía a las poblaciones muy vulnerables a las catástrofes naturales, como sequías, inundaciones, etc., provocando con frecuencia hambrunas que diezmaban la población. La domesticación de unas pocas especies vegetales para su cultivo es el resultado de una larga, paciente y continuada tarea de selección artificial de aquellos caracteres que suponían una ventaja para la alimentación y también para la recolección, aunque dejaran a las plantas cultivadas en clara desventaja para su propagación y supervivencia en libertad.

2.2.3.

La revolución verde

Durante la primera mitad del siglo XX se produce un gran avance en la genética. Los trabajos previos de Mendel sobre la herencia y de Darwin sobre la evolución de las especies, junto con los inicios de la genética molecular, permiten aplicar estos conocimientos a técnicas cada vez más depuradas de hibridación y selección para la obtención de multitud de nuevas variedades de cultivares cuyos rendimientos agrícolas eran cada vez mayores. Esto unido a la utilización de fertilizantes químicos, plaguicidas y herbicidas, obtenidos industrialmente, hacen que este periodo, que podemos acotar entre los años 1950 a 1984, sea conocido como el de la Revolución verde por los incrementos espectaculares que se produjeron en el rendimiento de las cosechas, especialmente de cereales. Durante unos años se pensó que estos avances solucionarían los problemas agrícolas y alimentarios de los países llamados del Tercer Mundo. Las nuevas variedades de arroz obtenidas lograron rendimientos entre dos y tres veces superiores a las variedades tradicionales. La producción mundial de trigo y de arroz se incrementó en un 75% entre los años 1965 a 1980. En los Estados Unidos las nuevas variedades de los 17 cereales más cultivados lograron un incremento del 240% entre 1940 y 1980, con un incremento de suelo cultivado de tan solo el 3%. Todo esto llevó aparejado un uso extensivo de maquinaria agrícola, pero también un enorme incremento del agua utilizada para regadío, y una utilización masiva de productos químicos como fertilizantes, herbicidas y pesticidas. El uso intensivo de productos agroquímicos ha degradado el ambiente y contaminado las aguas. El uso masivo de pesticidas ha creado resistencias en las plagas. La diversidad genética de las plantas cultivadas ha disminuido con la desaparición de muchas variedades indígenas que

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han sido sustituidas por las nuevas semillas híbridas comerciales, tanto en los países desarrollados como en vías de desarrollo. En definitiva, la agricultura se ha convertido en una agricultura industrial dependiente de maquinaria, productos agroquímicos y semillas suministradas por las grandes industrias agroquímicas. Este es el panorama actual y real que muchas veces es obviado por los detractores de las nuevas aportaciones de la Biotecnología.

2.2.4.

La nueva revolución: cultivos genéticamente modificados

Actualmente, el incremento anual en la producción de alimentos se ha atenuado ya que la producción agrícola depende de algunos otros factores como la energía, el agua dulce y el suelo laborable que están al límite de su disponibilidad. Hoy día, se destina a usos agrícolas aproximadamente el 54% del agua dulce disponible. Mientras que más de 550 millones de personas padecen escasez de agua para los usos esenciales como bebida e higiene, para el año 2025 se estima que 3.000 millones se encontraran en esta situación. El agua es el principal factor limitante para el incremento de la producción agrícola, y solamente cabe hacer un uso más eficiente de la misma. Lo mismo ocurre con el suelo disponible para uso agrícola. Hace 40 años disponíamos de alrededor de media hectárea por persona, actualmente no llega a la mitad y en cuarenta años se estima que alcanzará la décima parte de esa cifra. Esto es debido al aumento de la población y la escasez de nuevos terrenos laborables. Para incrementar la producción mundial de alimentos de acuerdo al crecimiento demográfico es necesaria la obtención de nuevas variedades de mayor rendimiento, que puedan adaptarse a condiciones adversas, terrenos salinos, escasez de agua. De igual manera es importante que requieran menos tratamientos agroquímicos y que éstos sean más específicos y más respetuosos con el medio ambiente. Es necesario buscar alternativas a la tecnología actual. La aparición de las nuevas generaciones de cultivos procedentes de semillas genéticamente modificadas se considera que puede representar una nueva revolución «la revolución génica», que podría suponer un incremento en la productividad cuando menos equiparable al que supuso la revolución verde de mediados del siglo XX.

ALIMENTOS Y BIOTECNOLOGÍA

2.3.

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La relación entre la alimentación humana y la Biotecnología es estrecha y, ciertamente nada reciente, tiene una larga tradición que se remonta a la prehistoria de la civilización. Prácticamente todos los alimentos de nuestra dieta tienen un origen animal o vegetal. Especialmente los alimentos vegetales o de origen vegetal representan un porcentaje elevadísimo, aproximadamente un 90% de las calorías si consideramos el conjunto de la alimentación global de la humanidad, aunque es algo más reducido en las sociedades y países desarrollados. Pero también es cierto que muy pocos de los alimentos que consumimos hoy día son naturales o silvestres, en el sentido de que se consuman tal y como se encontraban en la naturaleza originariamente. Solamente algunos vegetales procedentes de los bosques, frutos silvestres y setas no cultivadas, algunos animales de caza y los pescados del mar, podemos considerarlos alimentos nativos no manipulados por el hombre, y representan un componente muy reducido de la alimentación mundial. Muchos de los alimentos que tomamos, sean de origen vegetal o animal, han sido transformados por el hombre para su consumo, en este sentido podemos considerarlos artificiales o artesanos ya que ha intervenido la mano y el ingenio del hombre para su fabricación. En este grupo incluimos los alimentos procedentes de especies cultivadas y los alimentos procesados, elaborados con la intervención de microorganismos. Un gran número de alimentos procesados se obtienen por procesos biotecnológicos en los que intervienen microorganismos que transforman por fermentación la materia prima, de origen vegetal o animal, en alimento. Como ejemplos podemos citar: los derivados lácteos (quesos, yogur, y leches fermentadas), los derivados de la fermentación de granos de cereales (pan y todas las masas y sus derivados como pastas, etc.), los encurtidos, los condimentos y conservantes (vinagre, salsa de soja), las bebidas fermentadas alcohólicas y no alcohólicas (cervezas, vinos, cavas, whisky, café, té, cacao), los vegetales fermentados (chucrut, aceituna de mesa). Con respecto a la gran mayoría de alimentos de origen vegetal o animal, aunque no sean fermentados, podemos decir que también son el resultados de un proceso biotecnológico, ya que la humanidad ha modificado en gran medida las pocas especies cultivadas y ganaderas que utiliza para su alimentación, y que en nada o muy poco se parecen a las originarias silvestres.

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BIOTECNOLOGÍA Y ALIMENTACIÓN

2.4.

ALIMENTACIÓN Y NUTRICIÓN

Con mucha frecuencia, los términos nutrición y alimentación son usados como si fuesen sinónimos, cuando en realidad describen dos procesos que, aunque íntimamente relacionados, son diferentes en muchos aspectos. La alimentación es simplemente el proceso mediante el cual tomamos del exterior una serie de sustancias que, contenidas en los alimentos que componen la dieta, son necesarias para la nutrición. Por nutrición entendemos el conjunto de procesos mediante los cuales utilizamos, transformamos e incorporamos a nuestro propio organismo, a nuestras células y tejidos, un cierto número de sustancias que han de cumplir tres fines básicos: — aportar la energía, necesaria para mantener la integridad y el funcionamiento del organismo; — proporcionar los materiales, necesarios para la formación de las estructuras corporales (células y tejidos); — suministrar las sustancias necesarias para regular los procesos que, en su conjunto, conocemos con el nombre de metabolismo. El metabolismo lo podemos definir como el conjunto de reacciones químicas que tienen lugar en el interior de las células de los seres vivos, y a partir de las cuales éstas obtienen energía y sintetizan las moléculas que precisan. Estas sustancias que tomamos de los alimentos y que son necesarias para obtener energía, sintetizar estructuras y regular el metabolismo son los nutrientes. No todos los componentes de los alimentos son utilizados como nutrientes. Es indudable que la salud depende en gran medida del estado nutritivo del hombre, y por ello el estudio de la nutrición adquiere gran importancia desde el punto de vista de la Medicina clínica, terapéutica y preventiva. A su vez, la nutrición depende de un correcto suministro de alimentos por lo que en su estudio inciden campos como la agricultura, la ganadería y la cada vez más importante industria alimentaria, destinada a la preparación, conservación y transformación de alimentos. En los últimos años el estudio de la nutrición ha adquirido un auge extraordinario. Son numerosas las investigaciones en el campo de la fi-

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siología, la rama que estudia las funciones de los seres vivos, centradas en este tema. Cada vez es mayor el número de personas, en los países desarrollados, que intentan seguir un tipo de dieta acorde con sus necesidades, porque cada vez es más claro que no basta comer para vivir, sino que hay que comer de una forma adecuada para poder vivir más y en un mejor estado de salud.

2.5.

NUTRIENTES

Los nutrientes se clasifican en cinco grupos principales: hidratos de carbono, grasas, proteínas, vitaminas y minerales. Las funciones de las diversas categorías de nutrientes se describen a continuación:

2.5.1.

Hidratos de carbono

Los hidratos de carbono aportan gran cantidad de energía en la mayoría de las dietas humanas. Los alimentos ricos en hidratos de carbono suelen ser los más baratos y abundantes en comparación con los alimentos de alto contenido en proteínas o grasa. Los hidratos de carbono se queman durante el metabolismo para producir energía, liberando dióxido de carbono y agua. Pero también se obtiene energía, aunque de manera más compleja, de las grasas y proteínas de la dieta, así como del alcohol. Para simplificar se puede decir que hay dos tipos de hidratos de carbono: «complejos o polisacáridos», que se encuentran principalmente en los cereales, legumbres y tubérculos, y «azúcares sencillos», más abundantes en los vegetales y frutas. Los hidratos de carbono son utilizados por las células en forma de monosacaridos, siendo la glucosa el principal combustible para las células. Tras su absorción desde el intestino delgado, la glucosa se procesa en el hígado, que almacena una parte como glucógeno, un polisacárido que actúa de reserva de glucosa, y el resto pasa a la corriente sanguínea, desde donde es repartida para alimentar a todas las células del cuerpo. Los hidratos de carbono que se encuentran en la mayor parte de los alimentos son los llamados hidratos de carbono complejos. Estos hidratos de carbono se encuentran en alimentos tales como cereales sin refinar, tubérculos, frutas y verduras, alimentos que también aportan otros nutrientes tales como proteínas, vitaminas, minerales y grasas. Sin embargo,

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otros alimentos que contienen azúcares sencillos como por ejemplo sacarosa (azúcar refinado), tales como productos de confitería y las bebidas no alcohólicas, tienen por lo general un alto contenido en calorías pero muy bajo contenido en otros nutrientes, aportando grandes cantidades de lo que los especialistas en nutrición llaman calorías vacías.

2.5.2.

Grasas

Aunque el término más correcto sería lípidos, generalmente en nutrición se utiliza el término grasas para referirse a todos los lípidos. Más escasas en los alimentos que los hidratos de carbono, las grasas producen más del doble de energía por unidad de masa. Al ser un combustible compacto, las grasas se almacenan fácilmente y pueden ser utilizadas después, en caso de que se reduzca el aporte de hidratos de carbono. Resulta evidente que los animales necesitan almacenar grasa para abastecerse en las estaciones frías o secas, lo mismo que los seres humanos en épocas de escasez de alimentos. Sin embargo, en los países donde siempre hay abundancia de alimentos y las máquinas han reemplazado el esfuerzo humano en la mayoría de los trabajos, la acumulación de grasa en el cuerpo se ha convertido en verdadero motivo de preocupación para la salud. Las grasas de la dieta se descomponen en ácidos grasos que pasan a la sangre para formar los triglicéridos propios del organismo. Los ácidos grasos que contienen el mayor número posible de átomos de hidrógeno en la cadena del carbono se llaman ácidos grasos saturados, que proceden sobre todo de los animales. Los ácidos grasos insaturados son aquellos que han perdido algunos átomos de hidrógeno. En este grupo se incluyen los ácidos grasos monoinsaturados que han perdido sólo un par de átomos de hidrógeno y los ácidos grasos poliinsaturados, a los que les faltan más. Las grasas poliinsaturadas se encuentran sobre todo en los aceites vegetales de semillas. Las grasas saturadas elevan el nivel de colesterol en la sangre, mientras que las no saturadas tienden a bajarlo. Las grasas saturadas suelen ser sólidas a temperatura ambiente; mientras que las insaturadas, procedentes de los vegetales, suelen ser líquidas.

2.5.3.

Proteínas

La función primordial de las proteínas en la alimentación es proporcionar aminoácidos, los materiales necesarios para producir las propias proteínas del tejido corporal, sintetizar enzimas, algunas hormonas,

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como la insulina, que regulan la comunicación entre órganos y células, y otras sustancias complejas, que rigen los procesos corporales. Las proteínas animales y vegetales no se utilizan tal como son ingeridas, sino que las enzimas digestivas deben descomponerlas en péptidos más pequeños o en los aminoácidos que las constituyen. Los aminoácidos liberados pueden ser absorbidos por el intestino hasta la sangre y reconvertidos de nuevo en proteínas en el tejido concreto que se necesita. Es fácil disponer de proteínas de origen animal o vegetal. De los 20 aminoácidos que componen las proteínas, ocho se consideran esenciales es decir: como el cuerpo no puede sintetizarlos, deben ser tomados a través de los alimentos. Si estos aminoácidos esenciales no están presentes, los otros aminoácidos no pueden utilizarse para construir las proteínas humanas. Por tanto, para mantener la salud y el crecimiento es muy importante una dieta que contenga estos aminoácidos esenciales. Cuando hay una carencia de alguno de ellos, los demás aminoácidos se convierten en compuestos productores de energía, y se excreta su nitrógeno. Cuando se ingieren proteínas en exceso, lo cual es frecuente en países con dietas ricas en carne, la proteína extra se descompone en compuestos productores de energía. Dado que las proteínas escasean bastante más que los hidratos de carbono aunque producen también 4 calorías por gramo, la ingestión de carne en exceso, cuando no hay demanda de reconstrucción de tejidos en el cuerpo, resulta una forma ineficaz de procurar energía. Los alimentos de origen animal contienen proteínas a las que se les denomina en términos nutricionales como «completas» porque incluyen todos los aminoácidos esenciales para el hombre. En la mayoría de las dietas se recomienda combinar proteínas de origen animal con proteínas vegetales. Se estima que 0,8 gramos por kilo de peso es la dosis diaria saludable para adultos normales. Muchas enfermedades e infecciones producen una pérdida continuada de nitrógeno en el cuerpo. Este problema debe ser compensado con un mayor consumo de proteínas. Asimismo, los niños también precisan más proteína por kilogramo de peso corporal. Una deficiencia de proteínas acompañada de falta de energía da origen a una forma de malnutrición proteico-energética que se caracteriza por pérdida de grasa corporal y desgaste de músculos.

2.5.4.

Vitaminas

Las vitaminas son compuestos orgánicos que actúan sobre todo en los sistemas enzimáticos para regular el metabolismo. Sin estas sustancias no podría tener lugar la descomposición y asimilación de los alimentos.

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Las vitaminas se clasifican en dos grupos: liposolubles e hidrosolubles. Entre las vitaminas liposolubles están las vitaminas A, D, E y K. Entre las hidrosolubles se incluyen la vitamina C y el complejo vitamínico B. Las vitaminas liposolubles suelen absorberse con los alimentos que contienen grasas. El exceso de estas vitaminas se almacena en la grasa corporal, el hígado y los riñones. Debido a que se pueden almacenar, no es necesario consumir estas vitaminas a diario. La vitamina A es esencial para las células epiteliales y para un crecimiento normal. Su insuficiencia produce cambios en la piel y ceguera nocturna, o falta de adaptación a la oscuridad debido a los efectos de su carencia en la retina. Es posible que con el tiempo se llegue a la xeroftalmia, un estado ocular caracterizado por sequedad y engrosamiento de la superficie de la córnea y la membrana conjuntiva. Si no se trata, puede causar ceguera, especialmente en los niños. La vitamina A se puede obtener directamente en la dieta mediante los alimentos de origen animal, tales como leche, huevos e hígado. Casi toda la vitamina A se obtiene del caroteno, que se encuentra en las frutas y verdura, y se transforma en vitamina A en el cuerpo. La vitamina D actúa casi como una hormona, ya que regula la absorción de calcio y fósforo y el metabolismo. Una parte de la vitamina D se obtiene de alimentos como los huevos, el pescado, el hígado, la mantequilla, la margarina y la leche, que pueden haber sido enriquecidos con esta vitamina. Los seres humanos, sin embargo, forman la mayor parte de su vitamina D exponiendo la piel a la luz del Sol. Su insuficiencia produce raquitismo en los niños y osteoporosis en los adultos. La vitamina E es un nutriente esencial para muchos vertebrados, pero aún no se ha determinado su papel en el cuerpo humano. Se ha hecho muy popular como remedio para muchas y diversas dolencias, pero no existen pruebas claras de que alivie ninguna enfermedad concreta. La vitamina E se encuentra en los aceites de semillas y en el germen de trigo. Se cree que funciona como antioxidante, protegiendo las células del deterioro causado por los radicales libres. La vitamina K es necesaria para la coagulación de la sangre. Participa en la formación de la enzima protrombina, la que, a su vez, es indispensable en la producción de fibrina para la coagulación sanguínea. La vitamina K se produce en cantidades suficientes en el intestino gracias a una bacteria, pero también la proporcionan los vegetales de hoja verde, como las espinacas y la col, la yema de huevo y muchos otros alimentos.

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Las vitaminas hidrosolubles (vitamina C y complejo vitamínico B) no se pueden almacenar, por lo que es necesario su consumo diario para suplir las necesidades del cuerpo. La vitamina C, o ácido ascórbico, desempeña un papel importante en la síntesis y conservación del tejido conectivo. Evita el escorbuto, que ataca las encías, piel y membranas mucosas, y su principal aporte viene de los cítricos. Las vitaminas más importantes del complejo vitamínico B son la tiamina (B1), riboflavina (B2), nicotinamida (B3), piridoxina (B6), ácido pantoténico, lecitina, colina, inositol, ácido para-aminobenzoico (PABA), ácido fólico y cianocobalamina (B12). Estas vitaminas participan en una amplia gama de importantes funciones metabólicas y previenen afecciones tales como el beriberi y la pelagra. Se encuentran principalmente en la levadura y el hígado.

2.5.5.

Minerales

Los minerales inorgánicos son necesarios para la reconstrucción estructural de los tejidos corporales y participan en diversos procesos tales como la acción de los sistemas enzimáticos, contracción muscular, reacciones nerviosas y coagulación de la sangre. Estos nutrientes minerales, que deben ser suministrados en la dieta, se dividen en dos clases, en función de su mayor o menor presencia en el organismo: macroelementos, tales como calcio, fósforo, magnesio, sodio, hierro, yodo y potasio; y microelementos, tales como cobre, cobalto, manganeso, flúor y cinc. El calcio es necesario para desarrollar los huesos y conservar su rigidez. También participa en la formación del citoesqueleto y las membranas celulares, así como en la regulación de la excitabilidad nerviosa y en la contracción muscular. Un 90% del calcio se almacena en los huesos, donde puede ser reabsorbido por la sangre y los tejidos. La leche y sus derivados son la principal fuente de calcio. El fósforo, también presente en muchos alimentos y sobre todo en la leche, se combina con el calcio en los huesos y los dientes. Desempeña un papel importante en el metabolismo de energía en las células, afectando a los hidratos de carbono, lípidos y proteínas. El magnesio, presente en la mayoría de los alimentos, es esencial para el metabolismo humano y muy importante para mantener el potencial eléctrico de las células nerviosas y musculares. La deficiencia de magnesio entre los grupos que padecen malnutrición, en especial los alcohólicos, produce temblores y convulsiones.

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BIOTECNOLOGÍA Y ALIMENTACIÓN

El sodio está presente en pequeñas cantidades en la mayoría de los productos naturales y abunda en las comidas preparadas y en los alimentos salados. Está también presente en el fluido extracelular, donde tiene un papel regulador. El exceso de sodio produce edema, que consiste en una superacumulación de fluido extracelular. El exceso de sal en la dieta contribuye a elevar la tensión arterial. El hierro es necesario para la formación de la hemoglobina, pigmento de los glóbulos rojos de la sangre responsables de transportar el oxígeno. Sin embargo, este mineral no es absorbido con facilidad por el sistema digestivo. En los hombres se encuentra en cantidades suficientes, pero las mujeres en edad menstrual, que necesitan casi dos veces más cantidad de hierro debido a la pérdida que se produce en la menstruación, suelen tener deficiencias y deben tomar hierro fácil de asimilar. El yodo es imprescindible para la síntesis de las hormonas de la glándula tiroides. Su deficiencia produce bocio, que es una inflamación de esta glándula en la parte inferior del cuello. La ingestión insuficiente de yodo durante el embarazo puede dar lugar a cretinismo o deficiencia mental en los niños. Se calcula que más de 150 millones de personas en el mundo padecen enfermedades ocasionadas por la insuficiencia de yodo. Los microelementos son otras sustancias inorgánicas que son necesarias para el cuerpo en cantidades mínimas, pero que son esenciales para gozar de buena salud. Se sabe poco de su funcionamiento, y casi todo lo que se conoce de ellos se refiere a la forma en que su ausencia, sobre todo en animales, afecta a la salud. Los microelementos aparecen en cantidades suficientes en casi todos los alimentos. Entre los microelementos más importantes se encuentra el cobre, presente en muchas enzimas y proteínas, de la sangre, el cerebro y el hígado. La insuficiencia de cobre está asociada a la imposibilidad de utilizar el hierro para la formación de la hemoglobina. El cinc también es importante para la formación de enzimas. Se cree que la insuficiencia de cinc impide el crecimiento normal y, en casos extremos, produce enanismo. Se ha descubierto que el flúor, que se deposita sobre todo en los huesos y los dientes, es un elemento necesario para el crecimiento en animales. Los fluoruros, una clase de compuestos del flúor, son importantes para evitar la desmineralización de los huesos. La fluorización del agua ha demostrado ser una medida efectiva para evitar el deterioro de la dentadura, reduciéndolo hasta casi un 40%. Entre los demás microelementos podemos citar el cromo, el molibdeno y el selenio.

ALIMENTOS Y BIOTECNOLOGÍA

2.6.

57

DIGESTIÓN DE LOS ALIMENTOS

Independientemente de qué sea lo que comamos, todos los alimentos deben ser digeridos. La digestión es el proceso por el cual todos los alimentos, generalmente muy complejos, son descompuestos hasta transformarlos en moléculas suficientemente pequeñas para que puedan ser absorbidas, a través del intestino, e incorporadas a nuestra cuerpo. Con estas moléculas más sencillas, extraídas de los alimentos, los organismos fabrican de nuevo sus propias y características moléculas complejas. Esto hace que no nos convirtamos en aquello que comemos. La digestión tiene una parte mecánica que rompe y fragmenta las estructura de los tejidos y las células de los alimentos y una parte química donde las enzimas digestivas, todas ellas proteínas, son capaces de degradar las moléculas complejas o macromoléculas de los hidratos de carbono, grasas, proteínas, y ácidos nucleicos, que son los componentes de todos los alimentos de origen vegetal o animal, en las moléculas sencillas o monómeros que los constituyen, azúcares pequeños, ácidos grasos, aminoácidos y nucleótidos. Otra parte de los alimentos, mayor o menor dependiendo del tipo de alimento, no es aprovechada ya que no puede ser utilizada por el organismo, esto también varía dependiendo del tipo de organismo, y es desechada como residuos. Los nutrientes, obtenidos del alimento, digeridos y absorbidos por el cuerpo son utilizados para fabricar de nuevo moléculas o como combustibles para obtener energía. El cuerpo necesita energía para realizar las actividades vitales y para mantenerse a una temperatura constante. Mediante el empleo del calorímetro, los científicos han podido determinar las cantidades de energía de los combustibles del cuerpo: hidratos de carbono, grasas y proteínas. Un gramo de hidrato de carbono puro o de proteína pura producen 4 calorías; 1 gramo de grasa pura produce unas 9 calorías. En nutrición el término caloría que se usa corrientemente equivale en realidad a la kilocaloría (kcal) empleada por los físicos, que se define como la energía calorífica necesaria para elevar la temperatura de 1 kilo de agua un grado, de 14,5 a 15,5 °C. Los hidratos de carbono son los nutrientes más abundantes en la alimentación mundial, mientras que las grasas son el combustible más concentrado y más fácil de almacenar. Sin embargo, si el cuerpo agota sus reservas de grasas e hidratos de carbono, puede utilizar directamente las proteínas de la dieta o descomponer su propio tejido proteico para generar combustible.

58

BIOTECNOLOGÍA Y ALIMENTACIÓN

El alcohol es también una fuente de energía que produce 7 calorías por gramo. Las células del cuerpo no pueden oxidar el alcohol, por lo que el hígado tiene que procesarlo para convertirlo en grasa, que luego se almacena en el mismo hígado o en el tejido adiposo.

2.7.

COMEMOS GENES CUANDO INGERIMOS ALIMENTOS

Todos los alimentos que ingerimos proceden de animales, vegetales o microorganismos y, puesto que todos los seres vivos contienen genes, se puede afirmar que habitualmente comemos una gran cantidad de genes en nuestra dieta. Sin embargo, no todos los alimentos los contienen. Por ejemplo la leche es un fluido animal que no contiene células, y por tanto no contiene genes, siempre que proceda de un animal sano y no esté contaminada con microorganismos. Los alimentos sometidos a procesos tecnológicos muy intensos, que incluyan extracción, destilación, tratamientos enzimáticos, o simplemente horneado intenso, tratamientos que pueden eliminar o degradar el DNA, pueden estar libres de genes. Este es el caso, por ejemplo, de los aceites vegetales refinados, o las bebidas alcohólicas destiladas. En el extremo opuesto están todos los alimentos que contienen organismos vivos, como los vegetales crudos, frutas y verduras, y los productos fermentados, como por ejemplo el yogur, que contienen gran cantidad de microorganismos vivos. Todas las células de los alimentos constituidos por organismos vivos contienen todos sus genes en perfecto estado. Otros alimentos procesados o cocinados contienen todos los genes, pero buena parte del material genético de sus células está ya degradado cuando los ingerimos. En todos los casos, los genes que ingerimos en los alimentos se exponen a la acción del sistema digestivo. La acción de los jugos gástricos descomponen los genes, es decir los ácidos nucleicos, en unidades muy pequeñas que pierden su capacidad informativa. No se ha detectado la incorporación de genes ingeridos en los alimentos a las células de nuestro organismo. Hay que tener en cuenta, además, que no solo los alimentos que ingerimos, sino también nuestro propio sistema digestivo, especialmente el intestino, alberga miles de millones de microorganismos, que obviamente contienen miles de millones de genes, que nunca se transfieren a nuestras células.

ALIMENTOS Y BIOTECNOLOGÍA

2.8.

59

TIPOS DE ALIMENTOS

Podemos clasificar los alimentos atendiendo a distintos criterios:

2.8.1.

Por su origen

Los alimentos que tomamos en nuestra dieta son o tienen un origen vegetal o animal. 䊏 䊏

vegetales animales

2.8.2.

Por su elaboración

El alimento puede ser tanto materia prima como un derivado de la misma, obtenido mediante un tratamiento industrial o artesanal. Este tratamiento puede transformar, en mayor o menor grado, la materia prima original. El alimento puede ser total o parcialmente comestible. La parte comestible no lo es siempre directamente y en este caso es necesario someterla a un tratamiento previo, culinario o industrial. En algunos casos de alimentos manufacturados, las materias primas de los que proceden no se consideran alimentos comestibles, tal es el caso por ejemplo de la remolacha azucarera, de algunas semillas oleaginosas, algunos cereales, etc. Por su elaboración podemos considerar los alimentos como: 䊏 䊏

frescos transformados o manufacturados 䊊 procesados: fermentados 䊊 elaborados 䊊 cocinados

2.8.3. 䊏

Por su consumo

Alimentos de consumo ordinario Carnes, pescados, leches, huevos, frutas, verduras, y derivados tales como bebidas, café, cacao, etc.

60

BIOTECNOLOGÍA Y ALIMENTACIÓN 䊏

Alimentos específicos de determinadas áreas o culturas Aunque ahora su consumo debido a la globalización empieza a generalizarse. Por ejemplo: avestruces, canguros, lagartos, larvas de insectos, determinadas frutas y vegetales tropicales.

䊏

Alimentos dietéticos Son los alimentos para regímenes especiales. Por ejemplo: preparados para lactantes, destinados a usos médicos como alimentos para sonda, alimentos destinados a personas afectadas de perturbaciones en el metabolismo, como por ejemplo, pobres en sodio, sin gluten, etc.

䊏

Alimentos enriquecidos Suelen ser alimentos de consumo ordinario pero a los que se les ha incorporado, intencionadamente, determinados nutrientes como proteínas, aminoácidos, vitaminas, minerales, etc.

䊏

Alimentos de diseño Se conocen también con el nombre de alimentos funcionales, y son aquellos alimentos a los que se les añade o quita determinados componentes o se les somete a procesos especiales para que tengan efectos saludables. Es decir, se trata de alimentos diseñados para favorecer las funciones del cuerpo y por tanto mantener el estado de salud. Actualmente están de moda en los países más ricos, pero, probablemente, en los próximos años llegarán a ser un arma importante de la medicina preventiva. Se trata de los probióticos, prebióticos, nutraceúticos, farmaalimentos, etc. Probióticos son los microorganismos vivos que se introducen en la dieta como suplemento alimenticio y que, tras ser ingeridos en cantidades suficientes, ejercen un efecto beneficioso en la salud al favorecer el balance y mantenimiento de la microbiota intestinal. Como ejemplos podemos citar a las bifidobacterias y lactobacilos. Paralelamente al desarrollo de los alimentos probióticos, han surgido los prebióticos que son los ingredientes alimenticios que no son digeribles pero que provocan un efecto beneficioso al estimular el crecimiento selectivo y/o la actividad de las bacterias del colon. Algunos ejemplos son los fructo- y galacto-oligosacáridos y la inulina. Dentro de este grupo de alimentos también incluiremos las bebidas energéticas, isotónicas, protectoras del metabolismo muscular y óseo, etc.

ALIMENTOS Y BIOTECNOLOGÍA

61

También los alimentos con fibras, oligosacáridos, polialcoholes, aminoácidos, proteínas, vitaminas, bacterias lácticas, a las que se añaden determinados productos fitoquímicos, como ajo, ginkgo biloba, ginseng, artemisa, etc, que presumen en su comercialización de reducir el riesgo de enfermedades cardiovasculares, cáncer, envejecimiento, obesidad, estimulantes y antidepresivos, etc. 䊏

Alimentos nuevos o con nuevos ingredientes Incluye entre otros, los alimentos obtenidos mediante las nuevas tecnologías: 䊊

䊊

䊊 䊊

2.8.4.

Alimentos o ingredientes que contienen organismos modificados genéticamente Alimentos o ingredientes producidos a partir de organismos modificados genéticamente aunque no los contengan Alimentos o ingredientes con moléculas de diseño químico Alimentos o ingredientes con microorganismos, como algas, hongos o derivados.

La clasificación más tradicional de los alimentos

Los alimentos se pueden clasificar en los siguientes grupos según su procedencia: • panes y cereales • leguminosas o legumbres • tubérculos y rizomas • frutas y verduras • carne • pescado • huevos • leche y derivados • grasas y aceites • azúcares, confituras y almíbares. El grupo de panes y cereales incluye, entre otros, el trigo, arroz, maíz y mijo. Son ricos en almidones y constituyen una fuente fácil y directa de suministro de calorías. Aunque la proteína no abunda en los cereales, la gran cantidad que se consume aporta cantidades significativas, las cuales, sin embargo, deben complementarse con otros alimentos ricos en proteínas

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BIOTECNOLOGÍA Y ALIMENTACIÓN

para obtener todos los aminoácidos esenciales. La harina de trigo blanco y arroz refinado son bajos en nutrientes, pero, como los cereales enteros o integrales contienen, además, el germen y la capa exterior de la semilla, el trigo y el arroz aportan fibra al cuerpo, vitaminas del grupo B: tiamina, niacina y riboflavina, y los minerales cinc, cobre, manganeso y molibdeno. Las legumbres o leguminosas abarcan una amplia variedad de alimentos como las judías, guisantes, lentejas y otros granos. Todos ellos son ricos en almidón, pero aportan bastante más proteína que los cereales o tubérculos. La proporción y el tipo de aminoácidos de las leguminosas es similar a los de la carne. Sus cadenas de aminoácidos a menudo complementan a las del arroz, el maíz y el trigo, que constituyen los alimentos básicos de muchos países. Los tubérculos y los rizomas incluyen varios tipos de patata, la mandioca y otros. Son ricos en almidón y relativamente bajos en proteína, pero aportan gran variedad de vitaminas y minerales. Las frutas y verduras son una fuente directa de muchos minerales y vitaminas que faltan en las dietas de cereales, en especial la vitamina C de los cítricos y la vitamina A procedente del caroteno de las zanahorias y verduras con hoja. En las verduras están presentes el sodio, cobalto, cloro, cobre, magnesio, manganeso, fósforo y potasio. La celulosa de las verduras, casi imposible de digerir, proporciona el soporte necesario para hacer pasar la comida por el tracto digestivo. Muchas de las vitaminas más frágiles hidrosolubles se encuentran en las frutas y verduras, pero se destruyen con gran facilidad con el exceso de cocción. La carne, el pescado y los huevos aportan todos los aminoácidos esenciales que el cuerpo necesita para ensamblar sus propias proteínas. La carne contiene un 20% de proteína, 20% de grasa y 60% de agua. Las vísceras son fuentes ricas en vitaminas y minerales. Todos los pescados contienen un alto porcentaje de proteínas, y los aceites de algunos de ellos son ricos en vitaminas D y A. La clara del huevo es la forma más concentrada de proteína que existe. La leche y sus derivados, como la leche fermentada, el queso, el yogur y los helados, son conocidos por su abundancia en proteína, fósforo y en especial calcio. La leche también es rica en vitaminas pero si es pasteurizada, carece de vitamina C. Aunque la leche es esencial para los niños, su excesivo consumo por parte de los adultos puede producir ácidos grasos saturados que se acumulan en el sistema circulatorio. Las grasas y aceites incluyen la mantequilla, manteca, sebo y aceites vegetales. Todos ellos tienen un alto contenido de calorías, pero, aparte de

ALIMENTOS Y BIOTECNOLOGÍA

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la mantequilla y algunos aceites vegetales como el de palma, contienen pocos nutrientes. Los azúcares, confituras y almíbares se consumen en grandes cantidades en algunos países, donde constituyen una gran parte del aporte de hidratos de carbono. La miel y el jarabe de arce están compuestos de más de un 75% de azúcar y contienen pocos nutrientes. El consumo excesivo de azúcar provoca caries.

2.9.

DIETA Y REQUERIMIENTOS NUTRICIONALES

La dieta consumida por los adultos en buen estado de nutrición varía considerablemente con las costumbres alimenticias de los distintos países. Así en los países menos desarrollados, los hidratos de carbono constituyen la principal fuente de energía, que en los países más industrializados es aportada por las grasas. De un modo general, puede considerarse como satisfactoria una dieta que contenga del orden de un 50% de hidratos de carbono, aproximadamente un 35% de grasas y entre el 10-15% de proteínas. En los países más ricos la proporción de proteínas suele ser bastante más alta. En cualquier caso, lo importante es que la dieta incluya proteínas de distinto origen, debido al diferente contenido de aminoácidos en las proteínas de origen animal y vegetal, y a la necesidad de tomar directamente elaborados los aminoácidos esenciales, que no podemos sintetizar. Las proteínas de origen animal son las más habituales en la dieta en el mundo occidental, sin embargo, son también las más caras en términos económicos y ecológicos. Aproximadamente en el espacio necesario para alimentar a un buey para alimentar a dos personas, se podría cultivar soja para alimentar a unas 60 personas. La cantidad de nutrientes recomendada viene establecida por las autoridades competentes nacionales e internacionales, para indicar las cantidades mínimas-máximas de nutrientes necesarias para llevar una dieta sana y equilibrada. Aunque estas cantidades varían de persona a persona se pueden establecer unos valores estándar en función de la edad, el sexo y sobre todo el tipo de actividad física desarrollada. La tasa metabólica basal es el costo básico de energía necesaria para vivir; esto es, la tasa de utilización de energía en condiciones de reposo. Esta energía es necesaria para mantener las funciones corporales esenciales, tales como la contracción cardiaca, respiración, y funcionamiento renal.

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BIOTECNOLOGÍA Y ALIMENTACIÓN

La tasa metabólica total de un individuo es la suma de la tasa metabólica basal más la energía consumida para realizar todas las actividades diarias. Por ejemplo, un deportista tiene una mayor tasa metabólica total que un oficinista cuyo trabajo no requiera mucha actividad física. Por ejemplo, un hombre de talla media que no realice ejercicio regular y con un trabajo sedentario gasta unas 2000 kcal/día. Si el alimento que consume diariamente también contiene unas 2000 kcal/día, se encontrará en una situación de balance energético donde la entrada de energía es igual a la salida, y el peso corporal permanecerá constante. Cuando la salida de energía es mayor que la entrada, se quema la grasa acumulada y se pierde peso. Por el contrario, las personas aumentan de peso cuando ingieren más energía en el alimento de la que gastan en la actividad diaria. En general, los especialistas en nutrición recomiendan: • comer alimentos variados • mantener el peso ideal • evitar el exceso de grasas y aceites, especialmente de grasas saturadas y colesterol • comer alimentos con suficiente almidón y fibra • evitar el exceso de azúcar y sodio • en caso de beber alcohol, hacerlo moderadamente. La ciencia de la nutrición aún está lejos de explicar en qué modo los alimentos afectan a ciertos individuos. El porqué algunas personas pueden dejar de comer en un momento determinado mientras otras viven obsesionadas con la comida, por ejemplo, es objeto de intensos estudios. Los investigadores han descubierto recientemente que poco después de la ingestión, los alimentos influyen en la liberación de importantes sustancias químicas cerebrales, y que los alimentos ricos en hidratos de carbono disparan la liberación de serotonina, la que a su vez suprime el deseo de ingerir hidratos de carbono. Es posible que este tipo de mecanismo se haya desarrollado para evitar que las personas se saturen de hidratos de carbono en lugar de procurarse proteínas, que son más difíciles de encontrar. Hasta hace poco tiempo había bastante más disponibilidad de hidratos de carbono que de proteína. Se cree que la serotonina colabora en complejas relaciones con la insulina y varios aminoácidos, en especial el triptófano, que participan en la regulación del apetito para diversos tipos de alimentos. En esta misma área de investigación, los expertos en nutrición están intentando descifrar la relación entre diabetes y obesidad y el papel que desempeñan los dulces en las personas afectadas por ellas.

ALIMENTOS Y BIOTECNOLOGÍA

2.10.

65

CONSERVACIÓN DE LOS ALIMENTOS

Los alimentos a menudo constituyen un medio de cultivo ideal para el crecimiento de microorganismos. Bacterias y hongos son generalmente los causantes de la descomposición y de la contaminación de los alimentos. Como consecuencia de esto se producen numerosas enfermedades e intoxicaciones alimentarias. Al iniciarse la agricultura y disminuir la dependencia diaria del hombre de la caza y la recolección de alimento, la necesidad de conservar los alimentos sobrantes se convirtió en un elemento esencial para la supervivencia. La utilización de la sal como conservante para la carne, y la producción de quesos y cuajadas como consecuencia de la fermentación para conservar la leche, se utilizaba en la civilización de Oriente próximo ya en el año 3000 a. de C. La producción de vinos y bebidas por fermentación de frutos, y el ahumado de carnes y pescados eran también procedimientos habituales en esas fechas. Hoy día, la conservación de alimentos tiene una enorme importancia no sólo desde el punto de vista de la salud sino también del económico, ya que la secuencia completa de la manipulación de los alimentos, desde el productor hasta el consumidor final, es cada vez más compleja y larga, y durante este tiempo se puede alterar la calidad de los alimentos. Los métodos de conservación pueden basarse en procedimientos físicos, químicos o biológicos.

2.10.1.

Métodos físicos

La conservación en frío, refrigeración y congelación, y la deshidratación, desecación y liofilización, de los alimentos son los dos métodos más empleados para evitar o cuando menos ralentizar el crecimiento de microorganismos. El tratamiento por calor, pasteurización y esterilización, el tratamiento con radiaciones, bien ionizante, como los rayos gamma, o no ionizante, como la radiación ultravioleta, y la esterilización por pulsos eléctricos son los métodos físicos más utilizados para eliminar los microorganismos contaminantes de los alimentos.

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BIOTECNOLOGÍA Y ALIMENTACIÓN

2.10.2.

Métodos químicos

Son numerosos los aditivos químicos que se añaden a los alimentos no sólo para evitar la descomposición por el crecimiento microbiano, sino también para mantener las condiciones físico-químicas y evitar la oxidación, para potenciar el sabor, para endulzar en sustitución de los azúcares naturales, etc. No se considera dentro de los aditivos aquellas sustancias que se añaden a los alimentos con el objetivo de aumentar su valor nutritivo, como por ejemplo vitaminas, ácidos omega, o minerales, tan frecuentes hoy día en los alimentos enriquecidos. La lista de aditivos químicos crece de forma espectacular, sin embargo está regulada cualitativa y cuantitativamente, y en la mayoría de los países debe figurar en el etiquetado de los alimentos. En los países de la Unión Europea, los aditivos alimentarios autorizados se designan mediante un número de código, que comienza con la letra E seguida de una cifra de tres o cuatro dígitos. La lista completa de aditivos autorizados en la Unión Europea se incluye en el Anexo. Los aditivos se encuentran hoy día en prácticamente todos los alimentos elaborados que consumimos en los países desarrollados. Son compuestos que no suelen considerarse nutrientes, pero que se añaden a los alimentos para: • ayudar en su procesamiento o fabricación • para mejorar la calidad de la conservación • para mejorar el sabor, el color, la textura, el aspecto, la estabilidad y la comodidad del consumidor. Las vitaminas, minerales y otros nutrientes añadidos para reforzar o enriquecer el alimento quedan, por lo general, excluidos de la definición de aditivos, tampoco se considera como tales a las hierbas, especias, sal, levadura o proteínas hidrolizadas para destacar el sabor. Los aditivos pueden ser naturales y sintéticos. Los primeros se pueden extraer de fuentes naturales o bien ser sintetizados en el laboratorio para dar un compuesto de las mismas características químicas que el producto natural (de ahí que también se los defina como de ‘idéntica naturaleza’). Los aditivos sintéticos son productos químicos que no existen en la naturaleza. En la mayoría de los países sólo se pueden utilizar como aditivos alimentarios los compuestos que hayan sido comprobados de modo exhaustivo hasta demostrar su seguridad y que, por consiguiente, estén incluidos en una lista de aditivos autorizados. En la eti-

ALIMENTOS Y BIOTECNOLOGÍA

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queta se debe consignar la clase de compuesto y nombre o el número de la lista autorizada, ya que todos los aditivos autorizados tienen un número y sigla identificativos. Aunque casi todos los aditivos se pueden utilizar siempre que sea necesario, algunos se limitan a determinados alimentos. Cuando las pruebas de laboratorio han determinado que las altas dosis de un aditivo tienen efectos adversos (en experimentos con animales), la cantidad a utilizar está controlada por la ley, para asegurar que el consumo total de este aditivo en todos los alimentos de una dieta diaria está dentro de un margen de seguridad. La dosis diaria aceptada suele ser una centésima parte de la dosis más alta que no tiene efecto detectable en las pruebas de laboratorio. Los compuestos en los que no se detectan efectos adversos, incluso utilizando dosis muy altas, se pueden usar sin ninguna limitación, aunque la intensidad del color y el sabor suelen restringir la cantidad empleada. Los aditivos se clasifican por su función:

Colorantes Hay toda una variedad de compuestos orgánicos, algunas sustancias químicas sintéticas y pigmentos naturales de plantas (incluida la clorofila), carotenoides y antocianinas, que se pueden añadir a los alimentos para mejorar su color. También se emplean como colorantes algunas sales minerales; las sales de calcio y hierro pueden mejorar el valor nutricional de un alimento así como su color.

Conservantes Los conservantes se utilizan para proteger los alimentos contra la proliferación de microorganismos que pueden deteriorarlos o envenenarlos, con lo cual se aumenta el periodo de vida del producto. Tales compuestos incluyen los ácidos sórbico y benzoico y sus sales, dióxido de sulfuro y sus sales, así como nitritos y nitratos utilizados en salmueras. Hay además diversos ácidos orgánicos que se producen de forma natural, como los ácidos fumárico, málico, propiónico y acético y sus sales, que se utilizan para dar sabor y para controlar la acidez de los alimentos, así como por tener una efectiva acción antimicrobiana. Otros compuestos, como el bifenilo y sus derivados, se emplean sólo en las cortezas de cítricos y otras frutas para minimizar el ataque de hongos o bacterias.

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BIOTECNOLOGÍA Y ALIMENTACIÓN

Antioxidantes Se usan para evitar que los alimentos grasos se pongan rancios y para proteger las vitaminas liposolubles (A, D, E y K) de la oxidación. Entre los antioxidantes sintéticos están los ésteres de ácido gálico, butil-hidroxitolueno y butil-hidroxianisol. Las vitaminas C y E también se pueden utilizar como antioxidantes, mejorando el valor nutricional del alimento al que se añaden. En realidad, hay ciertas evidencias de que los antioxidantes sintéticos utilizados en la fabricación de alimentos también tienen una función antioxidante útil en el cuerpo.

Reguladores de acidez El pH de un alimento es la medida de la alcalinidad o de la acidez del mismo. Nuestro sentido del gusto sólo es capaz de reconocer diferencias importantes en el pH dentro de alimentos complejos. Un producto ácido tendrá un sabor agrio, mientras que un producto alcalino tendrá un sabor amargo. Los correctores de la acidez se usan para alterar o controlar la acidez o alcalinidad de un alimento y mantenerla en un nivel adecuado, lo que es importante en términos de procesado, sabor y seguridad alimentaria. Un control inadecuado del pH puede provocar el desarrollo de bacterias no deseadas en el producto, lo que podría representar un riesgo para la salud. Por ejemplo si no se mantiene un pH inferior o igual a 4,6, en determinados alimentos puede desarrollarse el Clostridium botulinum, que produce el botulismo debido a la presencia de una toxina muy peligrosa para la salud. Algunos aditivos de este grupo también actúan como estabilizantes y otros refuerzan la acción de los antioxidantes o emulgentes. Muchos de los aditivos de este grupo son constituyentes naturales del organismo. Los ácidos y sus sales se usan para dar sabor y también para controlar el pH de los alimentos. El ácido acético (vinagre), ácido láctico (que se forma en la leche agriada o fermentada) y los ácidos fumárico, málico y propiónico, entre otros, también poseen una potente acción antimicrobiana y pueden, además, clasificarse como conservantes. Otros, como el ácido ascórbico (vitamina C), los ácidos cítrico, tartárico, fosfórico, clorhídrico y sulfúrico y sus sales, así como el dióxido de carbono y los carbonatos o bicarbonatos, se pueden utilizar como disoluciones tampones o para propósitos especiales, incluida su acción como emulgentes, antiapelmazantes o para aumentar el volumen de ciertos alimentos. Los álcalis (incluidos los hidróxidos de magnesio, calcio, potasio y sodio) se pueden utilizar para neutralizar el exceso de acidez en los alimentos.

ALIMENTOS Y BIOTECNOLOGÍA

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Emulgentes y estabilizantes Los aditivos de este grupo se emplean para que los aceites y grasas se puedan mezclar con agua y formar así emulsiones suaves (como la margarina y la mayonesa), para dar una textura cremosa y suave a los alimentos y para aumentar el periodo de duración de los productos horneados. Muchos de ellos se utilizan también para hacer jaleas. Hay una extensa gama de gomas vegetales (incluidos los alginatos, el agar-agar y la goma de algarrobo) que contribuyen de manera muy útil al consumo de polisacáridos diferentes del almidón (fibra dietética), como también lo hacen las pectinas y los diversos derivados de celulosa, muy usados. Como emulgentes se pueden citar también la lecitina y varias sales y ésteres de ácidos grasos.

Antiapelmazantes Estos agentes se usan para que algunos productos en polvo como la sal o la harina no sean compactos. Entre los antiapelmazantes se incluyen la harina de huesos (que se emplea también para enriquecer la harina con calcio), los polifosfatos, silicatos, estearatos y gluconatos.

Potenciadores del sabor En este grupo están los dulcificantes, algunos de los ácidos antes mencionados, extractos naturales de frutas e hierbas, y compuestos sintéticos que imitan los sabores naturales. Aparte de éstos, hay otros compuestos que se emplean para mejorar el sabor de los alimentos sin aportar su propio sabor, como el ácido glutámico y sus sales (sobre todo el glutamato monosódico) y los nucleótidos. Como anexo I, al final del tema, se incluye la lista de tipos de aditivos alimentarios autorizados en la UE y sus códigos.

2.10.3.

Métodos biológicos

La fermentación producida por determinados microorganismos favorece la conservación de los alimentos. Aunque en términos generales la multiplicación microbiana en un alimento puede provocar su descomposición, pero en determinados casos favorece su conservación, esto depende de los microorganismos implicados en el proceso y de las condiciones de almacenamiento del alimento.

70

BIOTECNOLOGÍA Y ALIMENTACIÓN

Durante varios miles de años la fermentación ha sido una importante forma de conservación de los alimentos. El crecimiento microbiano, tanto de poblaciones naturales como inoculadas artificialmente, causa cambios químicos, de textura, o ambos, de tal forma que el producto puede almacenarse durante un periodo de tiempo más prolongado. Aunque éste no ha sido el único motivo, ya que el proceso de fermentación a veces es utilizado para crear nuevos olores y sabores más agradables para los alimentos. En este sentido, merece la pena destacar el caso de las bacterias lácticas que se utilizan en muchos procesos fermentativos de alimentos y que actualmente han despertado bastante interés por su posible utilización como antagonistas de otros microorganismos patógenos. Las bacterias lácticas producen una serie de proteínas, de pequeño tamaño, conocidas genéricamente como bacteriocinas, que tienen un efecto antibiótico sobre muchas bacterias patógenas. La más conocida es la nisina, cuyo uso como aditivo alimentario está autorizado en numerosos países. Sin embargo, estos compuestos pierden mucha efectividad cuando se adicionan de forma exógena a los alimentos, actualmente se trata de clonar genes de distintas bacteriocinas para integrarlos en el genoma de distintas especies y cepas de interés industrial. Muchos otros alimentos contienen también sustancias antimicrobianas naturales. Las cumarinas presentes en las frutas y hortalizas presentan actividad antimicrobiana. Los huevos tienen un alto contenido de la enzima lisozima, capaz de romper la paredes celulares de las bacterias contaminantes. El tabasco y las salsa de chile rojo poseen propiedades antimicrobianas, y también muchas de las hierbas y especias que se usan con frecuencia en la condimentación de alimentos tienen interesantes propiedades antimicrobianas. Por ejemplo la salvia y el romero son dos de las especias con mayor poder antimicrobiano. También la canela, la mostaza, el orégano, el clavo y el ajo son fuente de potentes inhibidores del crecimiento microbiano.

2.11. 2.11.1.

ALIMENTACIÓN Y SALUD Enfermedades relacionadas con la alimentación

Podemos clasificarlas en dos grandes apartados: sobrealimentación y malnutrición.

ALIMENTOS Y BIOTECNOLOGÍA

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Sobrealimentación El consumo de una dieta de valor calórico superior al de las necesidades del individuo conduce al depósito de este exceso de energía en el organismo en forma de grasa. Aunque existen otros factores, metabólicos y hormonales, que hacen que esta relación sea algo más compleja. Es un hecho cierto, que no debemos olvidar, que no hay posibilidad de almacenar grasa corporal si la cantidad de energía ingresada en forma de alimentos no supera al gasto energético. La obesidad, esto es la acumulación de un exceso de grasa corporal, es una forma grave de malnutrición y constituye hoy día un problema de proporciones epidémicas en las sociedades ricas. Según un informe de la Organización Mundial de la Salud (OMS) en Estados Unidos más del 50% de la población de adultos tiene sobrepeso (33%) o son clínicamente obesos (25%). Alrededor del 20% de los niños y adolescentes de este país son obesos. En España estamos cerca, la obesidad afecta a un 24,2% de los hombres y a un 25,15% de las mujeres. Los datos más recientes de la UE indican que este problema afecta a un 15% de los jóvenes y adolescentes. El interés actual por el grave problema de la obesidad se debe, aparte de otras consideraciones, al hecho de que su presencia agrava el pronóstico de muchas enfermedades.

Malnutrición La malnutrición es un grave problema para 1/3 de la población de seres humanos del Planeta, que no sólo condiciona su supervivencia sino también la calidad y la dignidad de su vida. Se estima que la desnutrición afecta a 2.000 millones de personas, y que 800 millones sufren hambre estricta. La malnutrición puede ser debida a: • Deficiencia de calorías. • Desequilibrio nutricional. Mientras que millones de personas comen demasiado, otros seres humanos, a veces incluso conviviendo en el mismo territorio, no tienen suficiente alimento o no reciben una alimentación equilibrada. De todos los estados posibles de malnutrición debidos al consumo de dietas inadecuadas, la hiponutrición calórica, es decir, el consumo de

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BIOTECNOLOGÍA Y ALIMENTACIÓN

una dieta carente del número mínimo de calorías necesarias, es sin duda el más grave, y seguramente el problema médico y político más importante y urgente de la humanidad, ya que a él se debe el precario estado de salud en que se encuentra gran parte de la población de los países en vías de desarrollo. Aunque la dieta posea un valor calórico adecuado y cantidades suficientes de algunos nutrientes determinados, la ausencia o el simple déficit de uno de éstos puede dar lugar a una serie de enfermedades de distinta gravedad que reciben, en general, el nombre de enfermedades carenciales. Como son muchos los nutrientes esenciales son muy numerosas las enfermedades carenciales, pero las más frecuentes son las debidas a deficiencias en aminoácidos esenciales y vitaminas. De todos los nutrientes requeridos, los aminoácidos esenciales son los que con más frecuencia resultan deficientes en la alimentación debido a las dietas muy pobres en proteínas, y esto provoca que millones de personas sufran problemas de salud debido a la menor resistencia a las enfermedades sobre todo a las infecciosas, precisamente las más frecuentes en los países pobres.

2.11.2.

Enfermedades de origen alimentario

Existen dos tipos principales de enfermedades relacionadas con los alimentos: • Las infecciones alimentarias. • Las intoxicaciones alimentarias. Las infecciones alimentarias se producen como consecuencia de la ingestión de un microorganismo patógeno, bien con el alimento o con la bebida, seguida del crecimiento de los patógenos y la invasión de tejidos del cuerpo o la liberación de toxinas, o ambas situaciones a la vez. Son numerosos los microorganismos que pueden contaminar los alimentos o las bebidas y causar enfermedades de diversa gravedad, y casi todas ellas se asocian a prácticas de higiene deficiente, en alguna de las etapas de la producción o del procesamiento de los alimentos. La gastroenteritis es una enfermedad de especial preocupación que puede producirse tras un periodo de incubación de tan sólo 8 horas. La salmonelosis se produce como consecuencia de la ingestión de las bacterias Salmonella typhimurium y S. enteriditis, aunque no todas las

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especies y cepas de este microorganismo son patógenas para el hombre. Las carnes, las aves de corral y los productos lácteos son las principales fuentes de este patógeno. La infección puede provocarse por la contaminación de los trabajadores en las plantas de procesamiento de alimentos o en los restaurantes. Campylobacter jejuni es una de las causas principales de gastroenteritis aguda, se transmite a través del consumo de aves de corral poco cocinados. Determinadas cepas de Escherichia coli, bacteria habitual en nuestro organismo y normalmente no patógena, pueden causar diarrea. Es muy frecuente la diarrea del viajero causada por cepas de E. coli a las cuales la población residente está normalmente expuesta y por tanto ya ha adquirido inmunidad, pero no ocurre así con los viajeros que se exponen a ellas por vez primera. Sólo algunas cepas resultan especialmente graves, en concreto la cepa enterohemorrágica O157:H7, causa colitis hemorrágica y es motivo de especial preocupación hoy día. El crecimiento microbiano en los productos alimentarios también puede causar una intoxicación alimentaria. Las toxinas pueden estar asociadas a las células de los microorganismos o ser liberadas por ellas. Los síntomas se suelen producir poco después de la ingestión ya que no es necesario que se multipliquen los microorganismos causantes de la enfermedad. La mayoría de las cepas de Staphylococcus aureus causan enteritis debida a la liberación de toxinas extracelulares. Estas toxinas son proteínas y además son termorresistentes, por lo cual el cocinado de los alimentos no suele eliminar el peligro de los mismos. La intoxicación alimentaria por especies del género Clostridium es de las más extendidas. Son especies anaerobias, que viven y crecen en ausencia de oxígeno y que producen exotoxinas. El botulismo (del latín botolus, salchicha) es una grave intoxicación alimentaria causada por Clostridium botulinum. La toxina botulínica es una neurotoxina, que afecta al sistema neuromotor de tal forma que los músculos no se contraen en respuesta a la actividad de las neuronas motoras provocando una parálisis fláccida. Sin tratamiento adecuado, un tercio de los pacientes pueden morir en pocos días por insuficiencia respiratoria o cardiaca. La fuente más común son los alimentos enlatados, no bien esterilizados, por lo que es frecuente en las conservas caseras que no han sido suficientemente calentadas como para matar las esporas contaminantes, que son muy frecuentes en la tierra y en los sedimentos acuáticos. El Clostridium perfringens es otra especie también anaerobia que causa frecuentes intoxicaciones alimentarias y coloniza los productos cárnicos.

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También son frecuentes las intoxicaciones y los problemas de salud debido a la contaminación de los alimentos por hongos. Por ejemplo, los mohos crecen rápidamente en los granos de cereales y de maíz cuando estos productos se encuentran almacenados en condiciones de humedad. La contaminación del grano por el ascomiceto Claviceps purpura causa el ergotismo, un trastorno tóxico. Los alcaloides alucinógenos producidos por este hongo pueden provocar alteraciones del comportamiento, abortos, e incluso la muerte de quienes consumen el grano contaminado. Las aflatoxinas y las fumonixinas se producen en la mayoría de los granos y de los frutos secos, y en harinas derivadas de los mismos como consecuencia de la presencia de hongos. Son importantes cancerígenos y los niveles máximos permitidos se encuentran estrechamente establecidos y regulados para los distintos alimentos y los piensos. Además de las intoxicaciones causadas como consecuencia de la contaminación bacteriana de los alimentos, hay que tener en cuenta las intoxicaciones alimentarias provocadas por compuestos químicos presentes en los alimentos ingeridos. Éstos pueden ser naturales, como por ejemplo sería el caso de las toxinas o venenos naturales presentes en determinadas setas, que aunque catalogadas como no comestibles y peligrosas, resultan ser la causa frecuente de importantes intoxicaciones e incluso muertes todos los años. Otro apartado es el de los compuestos químicos que, aunque de forma natural no se encuentran en el alimento, aparecen como consecuencia de que se añaden o se producen en algunos de los pasos durante los procesos industriales de elaboración, conservación o cocinado de los alimentos. Los ejemplos son desgraciadamente abundantes como es el caso de las dioxinas en los pollos, o más recientemente, aunque todavía está en estudio, el de la presencia de acrilamidas en las patatas fritas industriales.

2.12.

PROBLEMAS DE LA ALIMENTACIÓN MUNDIAL

Los problemas más importantes relacionados con la alimentación de la población humana, se pueden atribuir a las siguientes causas:

2.12.1.

Escasez de alimentos

Debido al desequilibrio en la distribución mundial de recursos alimenticios, lo que genera graves deficiencias y carencias en la población

ALIMENTOS Y BIOTECNOLOGÍA

75

que se alimenta con una dieta pobre en proteínas y vitaminas, pero sobre todo el problema más grave es la falta de alimentos para una parte importante de la población humana que sobrevive, en el mejor de los casos, en una situación de desnutrición continuada.

2.12.2.

Contaminación de los alimentos

En los países ricos como consecuencia de prácticas industriales desafortunadas o, incluso en algunos casos, claramente delictivas como consecuencia de la búsqueda de rendimientos económicos máximos. En los países pobres como consecuencia de prácticas poco higiénicas en la elaboración y la distribución de alimentos.

2.12.3.

Problemas ambientales generados por la producción de alimentos

Los problemas ambientales están generados como consecuencia de la agricultura intensiva, necesaria para alimentar a la creciente población humana. Esta agricultura intensiva actual, que podríamos llamar agricultura industrial, se lleva a cabo en la mayoría de los países desarrollados y en vías de desarrollo del planeta, provoca gravísimos daños ecológicos: • La completa transformación de los habitat naturales por terrenos agrícolas provoca la pérdida de masa forestal, pulmón del planeta Tierra, y de numerosas especies vegetales y animales, lo que lleva a la disminución de la biodiversidad. • La erosión de los suelos y la desertización del paisaje y, como consecuencia, la modificación del clima. • La contaminación de la tierra y las aguas por fertilizantes y herbicidas, y el agotamiento de los recursos hídricos.

2.13.

NUEVOS ALIMENTOS Y ALIMENTOS MODIFICADOS GENÉTICAMENTE

Los grandes avances en los procesos tecnológicos, las aportaciones en investigación a nivel nutricional, y los drásticos cambios en el estilo

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BIOTECNOLOGÍA Y ALIMENTACIÓN

de vida de la sociedad han conducido al desarrollo de multitud de nuevos productos alimentarios, cada vez más demandados por los consumidores. La legislación europea establece las condiciones que regulan la comercialización y el etiquetado de los nuevos alimentos, considerando como tales a aquellos que: ❏

Consistan, contengan, o se hayan obtenido a partir de organismos genéticamente modificados, OGM.

❏

Los que siendo habituales en otras culturas se incorporan en calidad de alimentos exóticos a nuestra dieta.

❏

Los que utilicen procesos de producción no habituales o tradicionales.

El objetivo fundamental de la nueva biotecnología de alimentos es la investigación para la mejora de aquellos procesos de elaboración de productos alimenticios en los que intervengan organismos vivos, o que requieran la utilización de procesos biológicos o enzimáticos, así como la obtención de alimentos genéticamente modificados mediante técnicas de Ingeniería Genética. Podemos señalar tres grandes campos en relación con la Biotecnología de la industria alimentaria y agroalimentaria en los que se centran actualmente los mayores esfuerzos de investigación y desarrollo tecnológico. III)

Tecnología enzimática y biocatálisis.

III)

Alimentos genéticamente modificados.

III)

Técnicas para la detección de contaminantes y fraude alimentario.

2.13.1.

La tecnología enzimática y biocatálisis

El área de la tecnología enzimática y biocatálisis incluye el extenso campo de las fermentaciones para la elaboración y procesamiento de alimentos, la mejora genética de microorganismos que se utilizan en tecnología de alimentos, y la producción de proteínas, especialmente enzimas, y otros componentes tales como aditivos, de uso alimentario.

ALIMENTOS Y BIOTECNOLOGÍA

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Fermentaciones Los diversos tipos de fermentaciones en la industria de los alimentos se pueden clasificar en los siguientes tipos: ❏

Fermentaciones no alcohólicas: Panadería (fermentación por levaduras de las distintas masas panaderas) Vegetales fermentados (encurtidos en general) Ensilado (fermentación de pastos para forraje)

❏

Fermentaciones alcohólicas: Vino Cerveza Sidra Destilados Vinagre

❏

Fermentaciones cárnicas: Embutidos crudos curados (salami, chorizo, etc) Jamón serrano Productos de pescado fermentado

❏

Fermentaciones lácticas: Leches fermentadas Yogur Quesos Bebidas lácticas alcohólicas (Kefir)

❏

Fermentaciones especiales: Salsa de soja Otros productos locales como Miso, Tofu y otros

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BIOTECNOLOGÍA Y ALIMENTACIÓN

Mejora genética de microorganismos Se pretende obtener nuevas cepas recombinantes de microorganismos de utilidad en tecnología de alimentos por ingeniería genética. Levaduras y bacterias para fermentaciones y para producir determinadas enzimas y compuestos de utilidad en el procesado de alimentos

Producción de enzimas de uso alimentario Se trata de la obtención, la purificación y la utilización de enzimas para, por ejemplo, transformar el azúcar en polímeros, para eliminar por hidrólisis la lactosa de la leche para hacerla más digerible, para la obtención de vinos, espumosos, cervezas, etc.

Diseño de procesos enzimáticos Con las nuevas enzimas obtenidas, con células libres o inmovilizadas, se pueden desarrollar nuevos procesos como la extracción enzimática de principios activos vegetales, por ejemplo aceites vegetales, sin la utilización de solventes químicos.

2.13.2.

Alimentos genéticamente modificados

Entran dentro de esta categoría aquellos alimentos que consistan, contengan o se hayan obtenido a partir de organismos modificados genéticamente (OGM o GMO en inglés). Esta consideración de OGM se refiere exclusivamente a aquellos que se hayan obtenido según las nuevas técnicas de la Ingeniería Genética, ya que, como hemos señalado anteriormente, con las técnicas clásicas de mejora genética todos los cultivares y toda la ganadería han sido modificadas genéticamente a lo largo de los milenios de uso por la humanidad. Esto implica que se ha modificado el material genético del animal o de la planta del cual proviene el alimento o alguno de los ingredientes que contiene, o bien que se ha modificado el material genético de alguno de los microorganismos implicados en el proceso de elaboración del alimento. Muchas enzimas y aditivos utilizados en el procesado de alimentos se obtienen desde hace años mediante técnicas de ingeniería genética. Esto quiere decir que se obtienen a partir de bacterias o de hongos, funda-

ALIMENTOS Y BIOTECNOLOGÍA

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mentalmente, que han sido modificadas genéticamente para producir determinadas enzimas frecuentemente de origen animal. Este es el caso por ejemplo de la quimosina, una enzima empleada en la fabricación de quesos, que antiguamente se obtenía del estómago de terneros, y que hoy día se produce utilizando bacterias que llevan incorporado el gen de los terneros para producir la enzima. Es muy común, especialmente en los medios de comunicación aunque también en muchos textos de divulgación, la utilización del término alimentos transgénicos, mucho más breve, sonoro e impactante, para referirse a todos los alimentos genéticamente modificados. No es correcta su utilización como sinónimos, ya que no todos los alimentos genéticamente modificados son transgénicos. Transgénico significa que lleva incorporado un gen de otra especie diferente, por ejemplo una planta que lleva el gen de una bacteria. Un alimento genéticamente modificado (GM) puede provenir de un organismo que efectivamente lleve un transgen de otra especie, o simplemente puede provenir de un organismo al cual se le haya eliminado un gen, o se le haya modificado un gen, o se le haya añadido un gen de una cepa o de una variedad diferente, pero de la misma especie. Este es el caso, por ejemplo, de los tomates de maduración retardada, comercializados como tomates «Flavr-Savr» en los cuales se ha inactivado el gen responsable de la enzima de maduración; o el caso del maíz resistente a herbicidas, comercializado como maíz Roundup Ready GA21, que contiene un gen modificado procedente del propio maíz que lo convierte en poco sensible al herbicida glifosato.

2.13.3.

Técnicas para la detección de contaminantes y fraude alimentario

Son numerosos los nuevos métodos de análisis de los contaminantes y fraudes en alimentos basados en las nuevas tecnologías genéticas. Los biosensores son dispositivos para el análisis que contienen, al menos, un componente de naturaleza biológica. El componente biológico puede ser una enzima, un anticuerpo o un microorganismo, que son utilizados para detectar, e incluso en algunos casos cuantificar, la presencia de un determinado compuesto químico en una mezcla de sustancias. Los biosensores proporcionan una medida específica de compuestos y de contaminantes que por otros métodos tradicionales resultan difíciles de identificar.

80

BIOTECNOLOGÍA Y ALIMENTACIÓN

Son numerosas las aplicaciones en la industria de los alimentos. Por ejemplo para detectar el contenido de determinados nutrientes, como puede ser el caso de azúcares, glucosa, fructosa, lactosa, en zumos, leches, etc., o la presencia de polifenoles en aceites vegetales. Para determinar el grado de frescura en pescados por la presencia de aminas biogénicas (putrescina, cadaverina) como indicadores. Para analizar el grado de etanol en bebidas, para detectar residuos de plaguicidas o de compuestos químicos tóxicos en los alimentos. Los biosensores pueden ser utilizados en las diferentes etapas de la producción de alimentos: ❏

Control de materias primas Para detectar, por ejemplo, la presencia de residuos de pesticidas, el grado de maduración, o la adulteración con otros componentes.

❏

Control de procesos Para realizar, por ejemplo, un control microbiológico, o analizar parámetros físico-químicos en el proceso de fabricación.

❏

Control del producto comercializado Para detectar alteraciones de los constituyentes, y el fraude alimentario por la presencia de constituyentes no deseados ni etiquetados.

El fraude alimentario consiste en la venta de un alimento que no posee las características prescritas por la legislación para ese producto y marcadas en su etiqueta. El fraude alimentario puede ser de naturaleza muy diversa: que el producto tenga distinto peso al indicado, que posea ingredientes no etiquetados, o bien materia prima diferente a la indicada, o que incluya contaminantes o tóxicos. Por ejemplo, puede tratarse de la sustitución de un producto animal, vegetal o microbiano, por otro parecido pero de menor valor; la presencia de aceites de semilla vegetales en productos etiquetados como aceite puro de oliva; la venta de pescado que ha sido congelado como fresco; la presencia de antibióticos, hormonas u otras sustancias prohibidas en la carne, etc. Las técnicas de caracterización de DNA y de proteínas permiten identificar cualquier especie animal, vegetal o microbiana y, al compararlas con las bases de datos correspondientes, distinguirlas de especies similares que pueden estar presentes en alimentos procesados de forma fraudulenta. Estas técnicas también permiten, en la mayoría de los casos, la detección de organismos modificados genéticamente en los alimentos, especialmente si se trata de detectar la presencia de transgenes.

ALIMENTOS Y BIOTECNOLOGÍA

81

BIBLIOGRAFÍA CAMÁN, A. M. y REPETTO, M.: Toxicología alimentaria. Editorial Díaz de Santos. España 2006. CAMBELL-PLATT, G. (Ed.): Food Science and Technology. Wiley-Blackwell, 2009. CASTLE, D. y RIES, N. M. (Ed.): Nutrition and Genomics. Issues of ethics, law, regulation and communication. Elsevier, 2009. COULTATE, T. P.: Manual de Química y Bioquímica de los alimentos. Ed. Acribia, 2007. CUBERO, N., MONFERRER, A. y VILLALTA, J.: Los aditivos alimentarios. Editorial Mundi-Prensa Libros, España 2002. DOYLE, M. P.; BEUCHAT, L. R. y MONTEVILLE, T. J.: Food microbiology: fundamentals and frontiers. ASM Press, Washington, 1997. GARCÍA GARIBAY, M.; QUINTERO RAMÍREZ, R. y LÓPEZ MUNGUÍA, A.: Biotecnología alimentaria. Editorial Limusa, 1998. LEE B. H.: Fundamentos de tecnología alimentaria. Editorial Acribia, 2000. MACRAE, R.; ROBINSON, R. K. y SADLER, M. J.: Encyclopedia of food sience, food technology and nutrition. Academic Press, 1993. MONTVILLE, T. J. y MATTHEWS, K. R.: Microbiología de los alimentos, Introducción. Editorial Acribia, 2009. SHIBAMOTO, T. y BJELDANES, L. F.: Introduction to food toxicology. Elsevier, 2009.

Direcciones en Internet AESA Agencia Española de Seguridad Alimentaria http://www.aesa.msc.es EUFIC Consejo Europeo de Información sobre la Alimentación http://www.eufic.org FAO Food and Agriculture Organization of the United Nations http://www.fao.org NOAH New York Online Access to Health Alimentos y Nutrición http://www.noah-health.org/spanish Food safety http://www.foodsafety.gov/fsg/fsgl-es.html Foro Latinoamericano de Nutrición http://latinut.net IATA Instituto de Agroquímica y Tecnología de los Alimentos http://www.iata.csic.es

82

BIOTECNOLOGÍA Y ALIMENTACIÓN

Anexo I: Clasificación de aditivos alimentarios. Cuadro de las clases funcionales, definiciones y funciones tecnológicas Clases funcionales (para fines de etiquetado)

Definición

Subclases (funciones tecnológicas)

Colorantes

Las sustancias que dan o restituyen color a un alimento

Colorantes

Edulcorantes

Las sustancias diferentes del azúcar que confieren a un alimento un sabor dulce

Edulcorantes Edulcorantes artificiales Edulcorantes nutritivos

Conservantes/ Conservadores

Las sustancias que prolongan la vida útil de los productos alimenticios protegiéndolos frente al deterioro causado por microorganismos

Conservadores antimicrobianos Agentes antimicóticos Agentes de control de bacteriófagos Agentes quemosterilantes Maduradores del vino Agentes de esinfestación

Antioxidantes

Las sustancias que prolongan la vida útil de los productos alimenticios protegiéndolos frente al deterioro causado por la oxidación, tales como el enranciamiento de las grasas y los cambios de color

Antioxidantes Sinérgicos de antioxidantes Secuestrantes

Soportes (incluidos los disolventes soportes)

Las sustancias utilizadas para disolver, diluir, dispersar o modificar físicamente de otra manera un aditivo alimentario sin alterar su función tecnológica (y sin ejercer por sí mismos ningún efecto tecnológico) a fin de facilitar su manejo, aplicación o uso

Soportes Disolventes soportes

Acidulantes

Las sustancias que incrementan la acidez de un alimento o le confieren un sabor ácido

Acidulante

Correctores de la acidez

Las sustancias que alteran o controlan la acidez o alcalinidad de un alimento

Soluciones reguladoras Agentes reguladores Ácidos Bases Álcalis Agentes de regulación del pH

Antiaglomerantes

Las sustancias que reducen la tendencia de las partículas de un alimento a adherirse unas a otras

Agentes antiaglomerantes Agentes de secado Polvos para empolvar Agentes antiadherentes

Antiespumantes

Las sustancias que impiden o reducen la formación de espuma

Agentes antiespumantes

Agentes de carga

Las sustancias que aumentan el volumen de un alimento sin contribuir significativamente a su valor energético disponible

Incrementadores del volumen Agente de relleno

Emulgentes

Las sustancias que hacen posible la formación o el mantenimiento de una mezcla homogénea de dos o más fases no miscibles, como el aceite y el agua, en un alimento

Emulgentes Pastificantes Agentes dispersantes Agentes tensoactivos Humectantes

Sales de fundido

Las sustancias que reordenan las proteínas contenidas en el queso de manera dispersa, con lo que producen la distribución homogénea de la grasa y otros componentes

Agentes de fusión Secuestrantes

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ALIMENTOS Y BIOTECNOLOGÍA

(Continuación) Clases funcionales (para fines de etiquetado) Endurecedores

Potenciadores del sabor Espumantes Gelificantes Agentes de recubrimiento (incluidos los lubricantes) Humectantes

Almidones modificados Gases de envasado Gases propelentes Gasificantes Secuestrantes Estabilizador

Definición

Subclases (funciones tecnológicas)

Las sustancias que vuelven o mantienen los tejidos Endurecedores de frutas u hortalizas firmes o crujientes o actúan junto con agentes gelificantes para producir o reforzar un gel Las sustancias que realzan el sabor o el aroma que Potenciadores del sabor tiene un alimento Modificadores del sabor Blandadores Las sustancias que hacen posible formar o mantener Agentes de batido una dispersión homogénea de una fase gaseosa en Agentes de aireación un alimento líquido o sólido Las sustancias que dan textura a un alimento me- Agentes gelificantes diante la formación de un gel Las sustancias que, cuando se aplican en la superficie Revestimiento exterior de un alimento, confieren a éste un aspecto bri- Agentes sellantes llante o lo revisten con una capa protectora Brillo Las sustancias que impiden la desecación de los alimentos contrarrestando el efecto de un escaso contenido de humedad en la atmósfera, o que favorecen la disolución de un polvo en un medio acuoso Las sustancias obtenidas por uno o más tratamientos químicos de almidones comestibles, que pueden haber sufrido un tratamiento físico o enzimático, y pueden ser diluidos o blanqueados con ácidos o bases Los gases distintos del aire, introducidos en un envase antes, durante o después de colocar en él un producto alimenticio Los gases diferentes del aire que expulsan un alimento de un recipiente Las sustancias o combinaciones de sustancias que liberan gas y, de esa manera, aumentan el volumen de la masa Las sustancias que forman compuestos químicos con iones metálicos Las sustancias que posibilitan el mantenimiento del estado físico-químico de un alimento. Los estabilizadores incluyen las sustancias que permiten el mantenimiento de una dispersión homogénea de dos o más sustancias no miscibles en un alimento, y también incluyen las sustancias que estabilizan, retienen o intensifican un color existente en un alimento

Espesante

Las sustancias que aumentan la viscosidad de un alimento

Agente de tratamiento de las harinas

Las sustancias, distintas de los emulgentes, que se añaden a la harina o masa para mejorar su calidad de cocción

Humectantes Agentes de retención del agua Almidones modificados

Gases de envasado Propulsores Agentes fermentadores Gasificantes Secuestrantes Aglutinantes Aagentes endurecedores Agentes de regulación de la densidad Agentes de retención de humedad/agua Estabilizadores de espuma Fijadores de color Estabilizadores del color Agentes espesantes Texturizadores Agentes de soporte Blanqueadores Acondicionadores de masa Mejoradores de harinas

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BIOTECNOLOGÍA Y ALIMENTACIÓN

Anexo II: Lista de los aditivos alimentarios permitidos actualmente en la unión europea y sus números E Los aditivos están listados en grupos para su facilidad de referencia. Dichos grupos son: 1. Colorantes 2. Conservantes 3. Antioxidantes

4. Edulcorantes 5. Emulgentes, estabilizadores, espesantes y gelificantes 6. Otros

Colorantes E100 E101 E102 E104 E110 E120 E122 E123 E124 E127 E128 E129 E131 E132 E133 E140 E141

E142 E150a E150b E150c E150d E151 E153 E154 E155 E160a E160b E160c E160d E160e

Curcumina (i) Riboflavina (ii) Riboflavina-5’-fosfato Tartracina Amarillo de quinoleína Amarillo ocaso FCF, amarillo anaranjado S Cochinilla, ácido carmínico, carmines Azorrubina, carmoisina Amaranto Ponceau 4R, rojo de cochinilla A Eritrosina Rojo 2G Rojo allura AC Azul patente V lndigotina, carmín de índigo Azul brillante FCF Clorofilas y clorofilinas (i) Clorofilas (ii) Clorofilinas Complejos cúpricos de clorofilas y clorofilinas (i) Complejos cúpricos de clorofilas (ii) Complejos cúpricos de clorofilinas Verde S Caramelo natural Caramelo de sulfito caústico Caramelo amónico Caramelo de sulfito amónico Negro brillante BN, Negro PN Carbón vegetal Marrón FK Marrón HT Carotenos (i) Mezcla de carotenos (ii) Beta-caroteno Bija, bixina, norbixina, annato Extracto de pimentón, capsantina, capsorrubina Licopeno Beta-apo-8’-carotenal (C30)

E160f Ester etílico del ácido beta-apo-8’-carotenoico (C30) E161b Luteína E161g Cantaxantina E162 Rojo de remolacha, betanina E163 Antocianinas E170 Carbonatos de cálcico (i) Carbonato cálcico (ii) Carbonato ácido de calcio E171 Dióxido de titanio E172 Óxidos e hidróxidos de hierro E173 Aluminio E174 Plata E175 Oro E180 Litolrrubina BK Conservantes E200 E202 E203 E210 E211 E212 E213 E214 E215 E216 E217 E218 E219 E220 E221 E222 E223 E224 E226 E227 E228 E230 E231 E232

Ácido sórbico Sorbato potásico Sorbato cálcico Ácido benzoico Benzoato sódico Benzoato potásico Benzoato cálcico Etil p-hidroxibenzoato Etil p-hidroxibenzoato sódico Propil p-hidroxibenzoato Propil p-hidroxibenzoato sódico Metil p-hidroxibenzoato Metil p-hidroxibenzoato sódico Dióxido de azufre Sulfito sódico Sulfito ácido de sodio Metabisulfito sódico Metabisulfito potásico Sulfito cálcico Sulfito ácido de calcio Sulfito ácido de potasio Bifenilo, difenilo Ortofenil fenol Ortofenil fenol sódico

85

ALIMENTOS Y BIOTECNOLOGÍA E234 E235 E239 E242 E249 E250 E251 E252 E280 E281 E282 E283 E284 E285 E1105

Nisina Natamicina Hexametilentetramina Dimetil dicarbonato Nitrito potásico Nitrito sódico Nitrato sódico Nitrato potásico Ácido propiónico Propionato sódico Propionato cálcico Propionato potásico Ácido bórico Tetraborato sódico, bórax Lisozima

Antioxidantes E300 E301 E302 E304

E306 E307 E308 E309 E310 E311 E312 E315 E316 E320 E321

Ácido ascórbico Ascorbato sódico Ascorbato cálcico Ésteres de ácidos grasos del ácido arcórbico (i) Palmitato de ascorbilo (ii) Estearato de ascorbilo Extracto rico en tocoferoles Alfa-tocoferol Gamma-tocoferol Delta-tocoferol Galato de propilo Galato de octilo Galato de dodecilo Ácido eritórbico Eritorbato sódico Butilhidroxianisol, BHA Butilhidroxitoluol, BHT

E959 E965 E966 E967

Emulgentes, estabilizadores, espesantes y gelificantes E322 E400 E401 E402 E403 E404 E405 E406 E407 E407a E410 E412 E413 E414 E415 E416 E417 E418 E425 E432 E433 E434

Edulcorantes E435 E420 E421 E950 E951 E952 E953 E954 E957

Sorbitol y jarabe de sorbitol (i) Sorbitol (ii) Jarabe de sorbitol Manitol Acesulfamo K Aspartamo Ácido ciclámico y sus sales de sodio y calcio lsomalt Sacarina y sus sales de sodio, potasio y calcio Taumatina

Neohesperidina DC Maltitol y jarabe de maltitol (i) Maltitol (ii) Jarabe de maltitol Lactitol Xilitol

E436 E440 E442 E444 E445 E460

Lecitinas Ácido algínico Alginato sódico Alginato potásico Alginato amónico Alginato cálcico Alginato de propano-1,2-diol Agar Carragenano Algas marinas transformadas del género Eucheuma Goma garrofín, goma de semillas de algarrobo Goma guar Goma tragacanto Goma arábiga Goma xantana Goma karaya Goma tara Goma gellan Konjac (i) Goma konjac (ii) Glucomananos de konjac Monolaurato de sorbitano polioxietinelado, polisorbato 20 Monooleato de sorbitano polioxietinelado, polisorbato 80 Monopalmitato de sorbitano polioxietinelado, polisorbato 40 Monoestearato de sorbitano polioxietinelado, polisorbato 60 Triestearato de sorbitano polioxietinelado, polisorbato 65 Pectinas (i) Pectina (ii) Pectina amidada Fosfátidos de amonio Acetato isobutirato de sacarosa Ésteres glicéridos de colofonia de madera Celulosa (i) Celulosa microcristalina (ii) Celulosa en polvo

86 E461 E463 E464 E465 E466 E468 E469 E470a E470b E471 E472a E472b E472c E472d E472e E472f E473 E474 E475 E476 E477 E481 E482 E483 E491 E492 E493 E494 E495 E1103

BIOTECNOLOGÍA Y ALIMENTACIÓN Metilcelulosa Hidroxipropilcelulosa Hidroxipropilmetilcelulosa Etilmetilcelulosa Carboximetilcelulosa, carboximetilcelulosa sódica Carboximetilcelulosa sódica entrelazada Carboximetilcelulosa sódica hidrolizada enzimáticamente Sales de sodio, de potasio y de calcio de los ácidos grasos Sales magnésicas de los ácidos grasos Mono- y diglicéridos de ácidos grasos Ésteres acéticos de los mono- y diglicéridos de ácidos grasos Ésteres lácticos de los mono- y diglicéridos de ácidos grasos Ésteres cítricos de los mono- y diglicéridos de ácidos grasos Ésteres tartáricos de los mono- y diglicéridos de ácidos grasos Ésteres mono- y diacetiltartáricos de los mono- y diglicéridos de ácidos grasos Ésteres mixtos acéticos y tartáricos de los mono- y diglicéridos de ácidos grasos Sucroésteres de ácidos grasos Sucroglicéridos Ésteres poliglicéridos de ácidos grasos Polirricinoleato de poliglicerol Ésteres de propano-1,2-diol de ácidos grasos Estearoil-2-lactilato de sodio Estearoil-2-lactilato de calcio Tartrato de estearilo Monoestearato de sorbitano Triestearato de sorbitano Monolaurato de sorbitano Monooleato de sorbitano Monopalmitato de sorbitano Invertasa

E170 E260 E261 E262 E263 E270 E290 E296 E297 E325 E326 E327 E330 E331

E332 E333

E334 E335 E336 E337 E338 E339

E340 Otros Acidulantes, correctores de la acidez, antiaglomerantes, antiespumantes, agentes de carga, soportes y disolventes soportes, sales fundentes, endurecedores, potenciadores del sabor, agentes de tratamiento de la harina, espumantes, agentes de recubrimiento, humectantes, almidones modificados, gases de envasado, gases propulsores, gasificantes, y secuestrantes.

E341

E343 E350

Carbonatos de cálcico (i) Carbonato cálcico (ii) Carbonato ácido de calcio Ácido acético Acetato de potasio Acetatos de sodio (i) Acetato de sodio (ii) Diacetato de sodio Acetato de calcio Ácido láctico Dióxido de carbono Ácido málico Ácido fumárico Lactato sódico Lactato potásico Lactato cálcico Ácido cítrico Citratos de sodio (i) Citrato monosódico (ii) Citrato disódico (iii) Citrato trisódico Citratos de potasio (i) Citrato monopotásico (ii) Citrato tripotásico Citratos de calcio (i) Citrato monocálcico (ii) Citrato dicálcico (iii) Citrato tricálcico Ácido L(+)-tartárico Tartratos de sodio (i) Tartrato monosódico (ii) Tartrato disódico Tartratos de potasio (i) Tartrato monopotásico (ii) Tartrato dipotásico Tartrato doble de sodio y potasio Ácido fosfórico Fosfatos de sodio (i) Fosfato monosódico (ii) Fosfato disódico (iii) Fosfato trisódico Fosfatos de potasio (i) Fosfato monopotásico (ii) Fosfato dipotásico (iii) Fosfato tripotásico Fosfatos de calcio (i) Fosfato monocálcico (ii) Fosfato dicálcico (iii) Fosfato tricálcico Fosfatos de magnesio Malatos de sodio (i) Malato sódico (ii) Malato ácido de sodio

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ALIMENTOS Y BIOTECNOLOGÍA E351 E352

Malato potásico Malato de calcio (i) Malato cálcico (ii) Malato ácido de calcio E353 Ácido metatartárico E354 Tartrato cálcico E355 Ácido adípico E356 Adipato sódico E357 Adipato potásico E363 Ácido succínico E380 Citrato triamónico E385 Etilen-diamino-tetracetato de calcio y sodio (EDTA cálcico disódico) E422 Glicerol, glicerina E431 Estearato de polioxietileno (40) E450 Difosfatos (i) Difosfato disódico (ii) Difosfato trisódico (iii) Difosfato tetrasódico (iv) Difosfato dipotásico (v) Difosfato tetrapotásico (vi) Difosfato dicálcico (vii) Difosfato ácido de calcio E451 Trifosfatos (i) Trifosfato de pentasodio (ii) Trifosfato de pentapotasio E452 Polifosfatos (i) Polifosfato de sodio (ii) Polifosfato de potasio (iii) Polifosfato de socio y calcio (iv) Polifosfatos de calcio (v) Polifosfatos de amonio E459 Beta-ciclodextrina E479b Aceite de soja oxidado térmicamente en interacción con mono- y diglicéridos de ácidos grasos E500 Carbonatos de sodio (i) Carbonato sódico (ii) Carbonato ácido de sodio (iii) Sesquicarbonato sódico E501 Carbonatos de potasio (i) Carbonato potásico (ii) Carbonato ácido de potasio E503 Carbonatos de amonio (i) Carbonato amónico (ii) Carbonato ácido de amonio E504 Carbonatos de magnesio (i) Carbonato magnésico (ii) Carbonato ácido de magnesio E507 Ácido clorhídrico E508 Cloruro de potasio E509 Cloruro cálcico E511 Cloruro magnésico

E512 E513 E514

Cloruro de estaño Ácido sulfúrico Sulfatos de sodio (i) Sulfato sódico (ii) Sulfato ácido de sodio E515 Sulfatos de potasio (i) Sulfato potásico (ii) Sulfato ácido de potasio E516 Sulfato cálcico E517 Sulfato amónico E520 Sulfato de aluminio E521 Sulfato doble de aluminio y sodio E522 Sulfato doble de aluminio y potasio E523 Sulfato doble de aluminio y amonio E524 Hidróxido sódico E525 Hidróxido potásico E526 Hidróxido cálcico E527 Hidróxido amónico E528 Hidróxido magnésico E529 Óxido de calcio E530 Óxido de magnesio E535 Ferrocianuro sódico E536 Ferrocianuro potásico E538 Ferrocianuro cálcico E541 Fosfato ácido de sodio y aluminio E551 Dióxido de silicio E552 Silicato cálcico E553a (i) Silicato magnésico (ii) Trisilicato magnésico E553b Talco E554 Silicato de sodio y aluminio E555 Silicato de potasio y aluminio E556 Silicato de calcio y aluminio E558 Bentonita E559 Silicato de aluminio, caolín E570 Ácidos grasos E574 Ácido glucurónico E575 Glucono-delta-lactona E576 Gluconato sódico E577 Gluconato potásico E578 Gluconato cálcico E579 Gluconato ferroso E585 Lactato ferroso E620 Ácido glutámico E621 Glutamato monosódico E622 Glutamato monopotásico E623 Glutamato cálcico E624 Glutamato monoamónico E625 Glutamato magnésico E626 Ácido guanílico E627 Guanilato disódico E628 Guanilato dipotásico E629 Guanilato cálcico

88 E630 E631 E632 E633 E634 E635 E640 E650 E900 E901 E902 E903 E904 E905 E912 E914 E920 E927b E938 E939 E941 E942 E943a E943b E944 E948

BIOTECNOLOGÍA Y ALIMENTACIÓN Ácido inosínico Inosinato disódico Inosinato dipotásico Inosinato cálcico 5’-ribonucleótidos cálcicos 5’-ribonucleótidos disódicos Glicina y su sal sódica Acetato de cinc Dimetilpolisiloxano Cera de abejas blanca y amarilla Cera candelilla Cera carnauba Goma laca Cera microcristalina Ésteres del ácido montánico Cera de polietieno oxidada L-Cisteina Carbamida Argón Helio Nitrógeno Óxido nitroso Butano Isobutano Propano Oxígeno

E949 E999 E1200 E1201 E1202 E1404 E1410 E1412 E1413 E1414 E1420 E1422 E1440 E1442 E1450 E1451 E1505 E1518 E1520

Hidrógeno Extracto de quilaya Polidextrosa Polivinilpirrolidona Polivinilpolipirrolidona Almidón oxidado Fosfato de monoalmidón Fosfato de dialmidón Fosfato de dialmidón fosfatado Fosfato de dialmidón acetilado Almidón acetilado Adipato de dialmidón acetilado Hidroxipropil almidón Fosfato de hidroxipropil dialmidón Octenil succinato sódico de almidón Almidón oxidado acetilado Citrato de trietilo Triacetato de glicerilo, triacetina Propano-1,2-diol, propilenglicol

S/N

Politelenglicol 6000

Más información en: http://histolii.ugr.es/euroe/e_index.htm

Tema 3 DNA, GENES Y GENOMAS

Para comprender las aplicaciones y evaluar los avances de la nueva Biotecnología en el campo de la alimentación es fundamental tener unos conocimientos previos acerca de la organización molecular de los seres vivos y, especialmente, de la organización y expresión de su información genética. Las prácticas de esta nueva época de la Biotecnología han sufrido una profunda revolución con la utilización de las técnicas de la Ingeniería Genética. Hoy día es posible la manipulación in vitro controlada y dirigida del material genético de los organismos que van a ser protagonistas de los procesos biotecnológicos Comenzaremos analizando en este tema qué entendemos por información genética, y qué es lo que sabemos hoy día acerca del funcionamiento, la estructura molecular y la organización de los genes y los genomas.

ESQUEMA DE CONTENIDOS 3.1. 3.2. 3.3. 3.4. 3.5. 3.6. 3.7. 3.8. 3.9.

¿Qué es el material genético? ¿Qué es un gen? Estructura del DNA. La doble hélice El lenguaje de los genes El DNA se autorreplica Los errores en el DNA: las mutaciones DNA y genes Genes y cromosomas Genes y genomas

3.1.

¿QUÉ ES EL MATERIAL GENÉTICO?

El material genético de un organismo lleva la información que determina las propiedades de este organismo, es decir, la forma en que se desarrolla, funciona y responde al ambiente. Además, es responsable de la transferencia de esta información del organismo a su descendencia. El material genético de un organismo viene a ser como el programa para un ordenador, contiene las instrucciones sin las cuales no puede funcionar. El programa genético de un organismo es más bien un plan de acción o una pauta de reacción. Algunas instrucciones sólo serán utilizadas en determinadas circunstancias, incluso el orden en que actuarán puede ser influido por condiciones ambientales externas. Una analogía, propuesta por el Premio Nobel Salvador Luria, podría ser un programa de ordenador para jugar al ajedrez. En los seres vivos el papel o función del material genético es equipar al organismo de toda la información necesaria para participar en el juego de la vida. El material genético representa la única herencia biológica que un ser vivo recibe de sus progenitores. La herencia de los caracteres fue reconocida desde la antigüedad y utilizada de forma intuitiva por agricultores y ganaderos mucho antes de poder interpretarla. Pero es necesario distinguir entre los caracteres y los determinantes de los caracteres. Si la contribución de los progenitores no es más que una simple célula, en el caso humano un espermatozoide y un óvulo, es obvio que lo que debe transmitirse a través de las generaciones de personas, elefantes, moscas o guisantes, no pueden ser caracteres sino entidades que se encuentran en esas células progenitoras y que de alguna manera harán que los caracteres se manifiesten al crecer los organismos a partir de esta célula ini-

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BIOTECNOLOGÍA Y ALIMENTACIÓN

cial. Estas entidades, que contienen la información hereditaria, fueron denominadas genes. Se llama gen a una unidad de información, responsable de una función específica. Este concepto, en principio algo abstracto, se irá comprendiendo mejor a medida que se avance en el estudio molecular y funcional del gen. Por tanto, se heredan genes y, sin duda, se heredan las características. Pero, los genes se heredan directamente en su propia entidad como copias de los progenitores; mientras que las características no se heredan como tales, son el producto de los genes, y emergen durante el desarrollo y la vida del individuo, y en este proceso influyen circunstancias y factores ambientales. Todos los caracteres se desarrollan con la intervención de genes, pero en el desarrollo de cada individuo concurren factores genéticos y no genéticos, ambientales, que lo hacen único e irrepetible entre los de su especie.

3.2.

¿QUÉ ES UN GEN?

El término lo utilizó por primera vez Johansen, en 1909, para referirse a la entidad material responsable de cada una de las características que se heredan, aunque en esa época todavía no se sabía lo que era exactamente un gen ni cómo actuaba. Sin embargo, algunos años antes Mendel ya había establecido la existencia de los genes como responsables de los caracteres heredables. Él los llamó «factores particulados» y, después de realizar exhaustivos cruzamientos experimentales, pudo formular una serie de reglas, las famosas Leyes que publicó en 1866, que permitían predecir la probabilidad (ya que estos procesos están fuertemente influidos por sucesos aleatorios) con que se heredan determinadas características de generación en generación. Los mecanismos de la transmisión hereditaria, que permiten entender de qué forma se transmiten los genes, pudieron finalmente comprenderse, bastantes años después, cuando se estableció la relación entre genes y cromosomas y se conoció cómo se reparten los cromosomas, qué llevan los genes, en la división de las células. El descubrimiento de que los genes se encuentran en los cromosomas fue un avance importante, y permitió incluso localizar determinados genes en cromosomas concretos. Así, estudiando la mosca de la fruta, que

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DNA, GENES Y GENOMAS

tiene unos cromosomas gigantes, Morgan y su equipo de colaboradores lograron «mapear», es decir, localizar genes en posiciones concretas de los cromosomas, e incluso inducir mutaciones de forma experimental en los genes, al irradiar directamente los cromosomas. Pero a pesar de que se sabía dónde estaban los genes y se había logrado provocar cambios en ellos y, por consiguiente, en las características de las moscas, seguía sin saberse qué era exactamente un gen, es decir, cuál era su naturaleza química. El cambio cualitativo se produce cuando se descubre que la información genética se encuentra en una molécula, el DNA (Avery, McLeod y McCarthy, 1944). Desde este momento se sabe ya de qué están hechos los genes, aunque esta molécula es tan grande y compleja que resultaba demasiado difícil para los químicos del momento y se tardan algunos años en determinar su estructura molecular. Pocos años después, el desciframiento de su estructura química, la doble hélice (Watson y Crick, 1953), convirtió definitivamente a los genes en objetos químicos, cuya estructura y cuya función podría empezar a ser analizada y entendida en términos de maquinaria bioquímica. A partir de este momento vienen unos años de formidables descubrimientos en los que se establecen los cimientos de la Genética Molecular. A finales de los años 60, década dorada de la biología molecular, el gen puede ser definido en términos de unidad de información. Un gen es un fragmento de una molécula de DNA que contiene información codificada para la síntesis de una proteína. Las proteínas son las moléculas más complejas y más importantes de los seres vivos dan cuenta de todas las actividades de las células y, en definitiva, de todas las características de los organismos. El proceso de descodificación de la información de los genes no es directo, sino que hay un complejo mecanismo de transferencia de la información, con dos etapas, es decir, con una molécula intermediaria: DNA → RNA → proteína Hoy día, a medida que se profundiza en el conocimiento del gen resulta más difícil definirlo, y es prácticamente imposible hacerlo en una única frase. Aunque lo que hemos dicho no es falso, un gen es un fragmento de DNA que codifica una proteína, las cosas se han complicado a medida que se avanza en el conocimiento y esta definición dista de ser absolutamente rigurosa si se aplica a todos los casos. Estas son algunas de las puntualizaciones que es necesario tener en cuenta:

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BIOTECNOLOGÍA Y ALIMENTACIÓN

— Todas las proteínas están codificadas por genes, pero también hay genes que codifican sólo RNAs que tienen una función propia, y no pasan su información a proteínas. — Hay regiones de DNA que no codifican ni RNA ni proteínas, sino que están implicadas en la regulación de genes adyacentes (promotores, enhancers, etc.). Estas regiones se heredan y, en última instancia, la síntesis de proteínas también depende de ellos. — Hay DNAs que codifican una proteína, y otros más de una, ya que hay regiones de DNA en las que se solapa la información. — Hay regiones, dentro de los genes, que no codifican, son los intrones. Están intercalados entre las regiones codificantes que se denominan exones. — También hay grandes regiones de DNA, altamente repetitivo en su secuencia, cuya función es desconocida por el momento. — Hay genes inestables que se reorganizan y cuya estructura definitiva se establece durante el desarrollo. — Hay genes móviles, que saltan de una región a otra del genoma, e incluso genes que saltan a otros individuos. Todo esto no son nada más que algunas de las muchas excepciones o matices que hay que tener en cuenta y que han ido apareciendo a medida que vamos profundizando en nuestro conocimiento sobre los genes. La existencia de excepciones, debido a la enorme variabilidad de los seres vivos como consecuencia del continuo proceso de evolución, suele ser bastante frecuente en Biología y dificulta cuando se trata de definir algo concisamente. A medida que se van conociendo los detalles de la arquitectura de los genes y los genomas se van complicando los esquemas, relativamente sencillos, que se habían propuesto a mediados del pasado siglo, pero a la vez esto hace cada vez más apasionante el panorama de la Genética Molecular.

3.3.

ESTRUCTURA DEL DNA: LA DOBLE HÉLICE

A principios de los años cincuenta, estaba demostrado que el DNA contiene la información genética, sin embargo, aunque se sabía su composición química, en cuanto a los átomos y las moléculas que lo constituyen, se ignoraba cómo estaban organizados estos componentes. Es decir, se desconocía la estructura de esta enorme molécula y, por supuesto, no

DNA, GENES Y GENOMAS

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se tenía ni idea del modo en que estaba almacenada y se transmitía la información. Fue en el año 1953, cuando dos jóvenes investigadores, James Watson, americano de 25 años que se encontraba en Cambridge (Inglaterra) con una beca posdoctoral, y Francis Crick, de 35 años, trabajando todavía en su tesis doctoral, descubrieron la estructura del DNA. Esta estructura proporcionó importantes pistas acerca de cómo funcionaba. Watson y Crick publicaron un trabajo, de tan solo un par de páginas en la revista inglesa Nature, en el que proponían el modelo de la doble hélice para el DNA, que ha supuesto un hito en la historia de la Biología. La clave que condujo al descubrimiento de la estructura del DNA fueron los datos sobre difracción de rayos X de las moléculas de DNA proporcionados por Maurice Wilkins (que compartió con ellos el Premio Nobel en 1962) y por Rosalind Franklin (murió prematuramente poco tiempo después, en 1958). También se basaron en los datos químicos, obtenidos muchos años antes, por Erwin Chargaff. Este químico, había analizado el contenido de bases en el DNA de distintas especies, demostrando que la cantidad de adenina era siempre igual a la de timina, y la de guanina a la de citosina. El modelo propuesto por Watson y Crick ha sido ampliamente confirmado, aunque hace algunos años se descubrió que la doble hélice de DNA puede adoptar también, en determinados segmentos de la molécula y bajo determinadas condiciones, otras configuraciones alternativas (Figura 3.1). ◆

La molécula de DNA está constituida por dos largas cadenas de nucleótidos unidas entre sí formando una doble hélice. El nucleótido, que es el elemento de construcción que se repite, está constituido a su vez por: — un azúcar de cinco átomos de carbono llamado desoxirribosa — una base nitrogenada que puede ser de cuatro tipos diferentes: adenina (A), guanina (G), citosina (C) o timina (T) — un grupo fosfato.

◆

Hay, por tanto, cuatro tipos de nucleótidos distintos, que se diferencian únicamente en la base nitrogenada.

◆

Los nucleótidos se enlazan por el grupo fosfato formando larguísimas cadenas. La estructura fosfato-pentosa recorre el exterior de la hélice, mientras que las bases se sitúan hacia el interior formando un ángulo recto con el eje de la hélice. Así, las bases de ambas cadenas quedan enfrentadas en el interior de la doble hélice.

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BIOTECNOLOGÍA Y ALIMENTACIÓN

FIGURA 3.1. Estructura del DNA. Diferentes representaciones esquemáticas de la molécula de DNA: a) Un fragmento de una de las cadenas correspondientes a tres nucleótidos muestra la estructura molecular de los azúcares (desoxirribosa) y de los fosfatos, mientras que se muestra la posición de las bases por un rectángulo. b) Se representa un fragmento con las dos cadenas complementarias (correspondientes a 9 pb). Las diferentes moléculas se representan en un plano con símbolos: un pentágono para el azúcar, un círculo para el fosfato y rectángulos y cuadrados para las bases. c) Se representa la estructura tridimensional de la doble hélice. d) Modelo molecular donde los diferentes átomos se representan con bolas de distintos tamaños.

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◆

Las dos cadenas de polinucleótidos que constituyen una molécula de DNA se mantienen unidas entre sí porque se forman enlaces entre las bases nitrogenadas de ambas cadenas que están enfrentadas. Estas uniones son enlaces de hidrógeno, que es un tipo de enlace débil. Esto significa que en determinadas condiciones se pueden romper quedando separadas las dos cadenas y esto, como veremos más adelante, resulta fundamental en el proceso de transmisión de la información.

◆

La unión de las bases por enlaces, proceso conocido como «apareamiento», está condicionado químicamente de forma que la adenina (A) sólo se puede unir o aparear con la timina (T), y la guanina (G) con la citosina (C). La adenina siempre se enfrenta y se une a la timina por dos enlaces de hidrógeno, mientras que la guanina y la citosina siempre aparecen unidas por tres enlaces de hidrógeno.

◆

La estructura de un determinado DNA está definida por la ordenación o «secuencia» de las bases nitrogenadas en la cadena de polinucleótidos, precisamente en esta secuencia de bases reside la información genética del DNA. El orden o la secuencia en la que aparecen las cuatro bases a lo largo de una cadena en el DNA es, por tanto, crítico para la célula, ya que es precisamente este orden el que constituye las instrucciones del programa genético de los organismos. Conocer esta secuencia de bases, es decir, secuenciar un DNA equivale a descifrar su mensaje genético.

La estructura en doble hélice del DNA, con el apareamiento de bases limitado (solamente A con T; y G con C), implica que el orden o secuencia de bases de una de las cadenas delimita automáticamente el orden de bases de la otra, por ello se dice que las cadenas son complementarias. Una vez conocida la secuencia de bases de una de las cadenas se puede deducir, inmediatamente, la secuencia de bases de la cadena complementaria. Si una de las cadenas tiene, por ejemplo, la secuencia: ATCGCCTGG, la otra tendrá la complementaria: TAGCGGACC, para que el apareamiento de bases sea correcto. Esto también implica que en toda molécula de DNA el número de A es igual al número de T, y el de C al de G (como había demostrado Chargaff).

3.4.

EL LENGUAJE DE LOS GENES

Hay cuatro aspectos de la estructura química del DNA que son la clave para entender su capacidad para almacenar la información genética:

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BIOTECNOLOGÍA Y ALIMENTACIÓN ◆

La secuencia de bases es el lenguaje del programa en el que reside la información. La información de ésta molécula la podemos reducir a un lenguaje de cuatro letras: A, G, C, T, que corresponden a las iniciales de las cuatro bases. En la secuencia con que aparecen ordenadas estas cuatro letras se almacena la información de los genes. La secuencia de bases en el DNA puede codificar una gran cantidad de información. La capacidad informativa es enorme aunque sea un lenguaje de tan sólo cuatro letras ya que hay que sumarle la variable de la longitud. Si consideramos un gen que tuviera solamente 10 elementos, es decir, 10 nucleótidos (por tanto 10 bases), tendría 410 = 1.048.576 posibilidades de ordenación. ¡Imaginemos el número de secuencias posibles que tiene un fragmento de 1.000 nucleótidos (41.000) o de 1.000.000 nucleótidos (41.000.000)! El tamaño de un gen se expresa siempre en función del número de nucleótidos y nunca en unidades de longitud, ya que la molécula puede estar más o menos compactada. La unidad estándar es pb (par de bases). En las bacterias el tamaño del genoma es del orden de millones de pb, en vegetales y animales de miles de millones de pb.

◆

La direccionalidad de la molécula de DNA nos da la pauta de lectura de la información. La molécula de DNA tiene una dirección, impuesta por los enlaces entre los azúcares y fosfato, que da un sentido a la lectura de la información. Las dos cadenas de una doble hélice tienen sentidos opuestos (5′ a 3′ , 3′ a 5′), pero la información se «lee» solamente en un sentido, de 5′ a 3′.

◆

El apareamiento restringido de las bases es la clave para la duplicación de la información. La doble hélice de DNA debe replicarse, producir copias idénticas a sí misma para pasar la información genética que contiene. Cada una de las cadenas es un molde para producir otra cadena, que será la complementaria. En la molécula de DNA las dos cadenas están unidas por un enlace químico entre las bases. Este enlace es siempre A-T y G-C. Por esto, se dice que las bases tienen un apareamiento restringido o que son complementarias (A con T y G con C). Si una cadena tiene una secuencia de bases la otra cadena de la doble hélice viene determinada ya que debe ser necesariamente la «complementaria», por tanto, una cadena es como un molde molecular para la otra y esto es la clave para la replicación.

◆

Los cambios en la secuencia, llamados mutaciones, son la base molecular para la evolución. La estructura química del DNA es

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muy estable y en la replicación de la molécula se produce una copia exacta de la misma. Sin embargo, en la molécula se pueden producir alteraciones y durante la replicación se pueden producir errores. Aunque la frecuencia de estos sucesos es muy baja, esto da lugar a cambios en la molécula y a cambios en la información que contiene, que se denominan mutaciones. Estos cambios se producen al azar como consecuencia de diversos factores como pueden ser: radiaciones, agentes químicos, o el propio «envejecimiento» de la maquinaria celular.

3.5.

EL DNA SE AUTORREPLICA

Una de las propiedades fundamentales de las células y de los organismos en su capacidad para reproducirse. Para que cada una de las células hijas reciba una copia del material genético, el DNA debe reproducirse, es decir, hacer copias o réplicas de su molécula. Este proceso, fundamental para la transferencia de la información genética de generación en generación, se denomina replicación del DNA. El mecanismo de replicación del DNA resulta fácil de entender, al menos a grandes rasgos, ya que viene implícito en la propia estructura de la molécula. Sin embargo, los procesos detallados a nivel molecular son enormemente complejos y, todavía hoy día, están investigándose aspectos concretos que faltan por esclarecer. Cuando Watson y Crick publicaron su modelo, no se les escapó la idea de que el apareamiento específico de bases entre las dos cadenas, lo que hemos llamado complementariedad de las bases, podría constituir el fundamento del mecanismo de copia. Y así es, en efecto, como ocurre (Figura 3.2). Para la replicación, la doble hélice se separa en sus dos cadenas, por ruptura de los enlaces de hidrógeno que mantenían unidas a sus bases, y cada una de las cadenas actúa como molde que especifica el orden de las bases en la síntesis de una nueva cadena complementaria a cada una de las dos cadenas iniciales. La síntesis de las nuevas cadenas se realiza por la adición de uno en uno de los nucleótidos complementarios, que se van enlazando en una reacción catalizada por una enzima denominada DNA polimerasa. Es un proceso muy complejo en el que intervienen muchas más enzimas y proteínas reguladoras, se necesita además energía que la proporciona el

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FIGURA 3.2. Replicación del DNA. a) Esquema simplificado de la síntesis discontinua del DNA en una de las cadenas, debido a la dirección de polimerización de la DNA polimerasa. b) Se muestra en esquema del resultado final del proceso de replicación. La doble hélice se duplica y se producen dos dobles hélices, en las cuales una cadena es la «vieja» o parental que sirvió de molde, y la otra es «nueva» o recién sintetizada.

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ATP, y, por supuesto, los cuatro nucleótidos libres que se irán enlazando en el proceso de síntesis, en el orden dictado por la cadena molde. Como resultado del proceso de replicación, a partir de una molécula de DNA, se producen dos dobles hélices de DNA idénticas a la original. Cada una de ellas conserva una cadena «antigua» que correspondía a la molécula original y que ha servido de molde o modelo en el proceso, y una cadena de nueva síntesis. Este mecanismo de replicación se denomina, por ello, semiconservativo. El DNA se duplica en cada ciclo de división celular. Cada célula que va a dividirse duplica previamente su DNA, para repartir idéntico contenido a las dos células hijas. El proceso es equivalente al de fotocopiar un documento antes de repartirlo. Podemos resumir los pasos fundamentales en la replicación del DNA en los siguientes apartados: 1. En un punto determinado, las dos cadenas de la doble hélice se desenrollan y se separan, una enzima llamada helicasa va abriendo poco a poco el camino de manera que las bases de las dos cadenas ahora separadas quedan expuestas y se produce lo que se ha llamado una burbuja de replicación. 2. Cada una de las cadenas comienza a unir nucleótidos sobre los que han quedado expuestos, cuyas bases serán las complementarias. En el proceso intervienen dos moléculas de la enzima llamada DNA polimerasa, una por cada cadena, que avanzan en direcciones opuestas ya que el crecimiento de las nuevas cadenas ocurre siempre en el mismo sentido químico de 5′ a 3′, y recordemos que las cadenas tenían sentidos contrarios. Aunque lo podemos esquematizar en pasos relativamente sencillos, el proceso en la realidad es tremendamente complejo, intervienen multitud de factores y tiene importantes problemas topológicos que resolver ya que la hélice se va desenrollando y se generan problemas de torsión que hay que liberar para ello intervienen unas enzimas llamadas «topoisomerasas». Como la doble hélice se va abriendo sólo en una dirección, en la que avanza la helicasa (es como una cremallera que avanza), y, sin embargo, la replicación es simultánea en las dos hebras, las polimerasas trabajan en las dos direcciones opuestas ya que polimerizan siempre en el mismo sentido químico, una de ellas avanza en la misma dirección de apertura pero la otra, para seguir a la helicasa, tiene que ir saltando hacia atrás con lo cuál se generan fragmentos que posteriormente deben

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unirse para mantener la continuidad. Para complicar aún más las cosas, la DNA polimerasa no es capaz de iniciar la replicación (necesita algunos nucleótidos sobre los que continuar). Este problema se soluciona ya que la replicación comienza con la intervención de otra enzima: una RNA polimerasa, que sí es capaz de iniciar y sintetiza un pequeño fragmento de RNA sobre el cual continuará trabajando la DNA polimerasa, pero este cebador de RNA al final será reemplazado, y los fragmentos sueltos resultantes de cada nuevo inicio, enlazados para tener finalmente una larga cadena continua de DNA. El resultado del proceso es que partiendo de una doble hélice inicial, en la que cada una de las dos cadenas actúa como molde para la síntesis de una cadena complementaria, obtendremos dos dobles hélices iguales a la original. No vamos a detenernos a detallar como se lleva a cabo la replicación para solventar todos estos problemas que hemos querido únicamente enunciar y que hacen todavía más sorprendente el alto grado de exactitud con que finalmente se produce la réplica de ésta molécula. Sin embargo, la replicación del DNA no es un proceso perfecto, exento de errores. En parte debido a la velocidad de replicación (de 50 a 500 nucleótidos por segundo, dependiendo de las condiciones) y en parte por errores químicos espontáneos en las bases, se introducen errores que se estiman son del orden de uno por cada 10.000 pb. Pero existen mecanismos de corrección. Hay enzimas, incluida la propia polimerasa, que chequean y arreglan los fallos deslizados en el proceso, de forma que finalmente la frecuencia estimada de erratas es de tan sólo una por cada cien millones de pb en células de mamíferos ¡un récord que ya quisieran para sí las mejores editoriales del mundo! Estos errores producen cambios en la información genética que se llaman mutaciones, pero gracias a estos cambios paulatinos aparecen «nuevos» genes. Por tanto, las mutaciones que en principio representan un fallo y un inconveniente, resultan ser finalmente la causa que hace posible la evolución de los seres vivos y la aparición progresiva de nuevas formas de vida.

3.6.

LOS ERRORES EN EL DNA: MUTACIONES

Si el programa genético de los seres vivos está contenido en la molécula de DNA, la reproducción fiel de su secuencia en cada generación de

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células o de organismos constituye un requisito esencial para la preservación de las características exclusivas de esa célula u organismo. Por ello, la compleja maquinaria de la replicación actúa con mucha precisión para asegurar la fidelidad en el mecanismo de copia del material genético. Sin embargo, de vez en cuando, se producen errores en la copia. A pesar de que la propia enzima DNA polimerasa tiene capacidad para corregir errores, a veces se producen fallos en la incorporación de nucleótidos que dan lugar a mutaciones: pueden suprimirse o añadirse bases o incorporarse una incorrecta (una C en lugar de una T, por ejemplo). Un solo cambio en una base puede representar una mutación en un gen. Una vez producida la mutación en el DNA se transmitirá a las células descendientes ya que será sucesivamente copiada cada vez que se replique el DNA cuando la célula se vaya a dividir. Cuando la célula que ha sufrido la mutación es una célula reproductora o germinal (óvulo o espermatozoide) se transmitirá a las siguientes generaciones del individuo, y todas las células del descendiente portarán la mutación. Sin embargo, no todas la mutaciones se deben a fallos espontáneos durante la replicación. Existen otras causas, por ejemplo durante la división de las células, que pueden afectar a un gen o a varios genes e incluso a cromosomas enteros, que a veces se pierden y otras se duplican, cuyas consecuencias son aún más graves. Las mutaciones pueden ser provocadas por agentes denominados mutagénicos, como son las radiaciones (rayos X, partículas radiactivas, luz ultravioleta) y también por numerosas sustancias químicas que pueden romper o alterar la molécula de DNA. Todas las alteraciones del genoma se denominan mutaciones, y comprenderemos la importancia que puede tener cualquier cambio, por pequeño que sea, en la secuencia de bases del DNA cuando veamos en el tema siguiente los procesos de expresión de la información de los genes, información que está contenida en su secuencia de bases.

3.7.

DNA Y GENES

Los genes son un fragmento de DNA o, hablando con mayor precisión, una secuencia de DNA. Las moléculas de DNA son larguísimas y contienen una sucesión lineal de genes. La longitud de las moléculas de DNA y el número de genes varía dependiendo de los organismos.

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BIOTECNOLOGÍA Y ALIMENTACIÓN

En los organismos más sencillos, como las bacterias, suele haber una única molécula de DNA que contiene todos los genes del genoma, del orden de 3000 genes. Su tamaño lo expresamos en función del número de pares de nucleótidos o pares de bases en lugar de utilizar unidades de longitud, que resultarían de poca utilidad debido a que el DNA puede estar más o menos compactado. En el caso de la bacteria Escherichia coli el tamaño de la molécula de DNA es de aproximadamente 4 × 106 pares de bases (o lo que es lo mismo 4.000 Kilobases (Kb), ya que 1Kb corresponde a 1.000 pares de bases (pb)). En las células de los organismos superiores la cantidad de DNA es lógicamente muy superior, del orden de 1000 veces mayor. Por ejemplo, en el caso de una célula humana el tamaño del DNA es de unas 6 × 109 pares de bases. Está repartido en 46 cromosomas, y se estima que debe haber entre 30.000 y 50.000 genes que codifican para proteínas. No se sabe con exactitud debido a que hay mucha cantidad de DNA que, por el momento, se desconoce su función. Estas moléculas de DNA bien estiradas medirían aproximadamente unos 2 metros (en cada célula). Estas larguísimas moléculas se alojan en el núcleo de la célula cuyo diámetro es mucho menor (unos 10 micrómetros). Esto es posible porque se asocian a proteínas, que logran una ordenada y muy elevada compactación del DNA. La asociación de DNA y proteínas forma la cromatina. La gran mayoría de las proteínas que se asocian al DNA tienen una función estructural, compactando y protegiendo a la molécula de DNA . Entre estas, las más abundantes y mejor estudiadas, son las histonas. La interacción de las histonas con el DNA forma unas estructuras llamadas nucleosomas, que dan a la fibra de cromatina un aspecto arrosariado y permiten un elevado empaquetamiento del DNA. Pero asociadas al DNA también hay otras proteínas que son enzimas, que van a intervenir en las distintas funciones que realiza el DNA, como por ejemplo la DNA polimerasa que, como ya vimos, interviene en la replicación. Otras tienen una función reguladora muy importante ya que controlan el que determinadas regiones del DNA expresen o no su información genética; entre éstas se puede citar el caso de algunas hormonas que actúan a este nivel.

3.8.

GENES Y CROMOSOMAS

Cuando la célula se va a dividir, la cromatina sufre un proceso todavía mayor de condensación y empaquetamiento, dando lugar a unas estructuras visibles al microscopio óptico, los cromosomas.

DNA, GENES Y GENOMAS

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El cromosoma es el resultado del plegamiento ordenado de la fibra de cromatina, que tiene lugar cuando la célula se va a dividir. Esta alternancia de formas es lógica ya que cuando la célula se divide el material genético tiene que repartirse en dos lotes exactos para las dos células hijas, y esto es más sencillo si se encuentra compactado en unidades discretas, los cromosomas. Pero durante el período en que la célula no se divide, los genes deben estar funcionando para dirigir todas las actividades de la célula y esto se facilita si están descondensados y expuestos a la interacción con enzimas. El cromosoma es una estructura alargada de aspecto doble, formado por dos partes idénticas llamadas cromátidas, que se mantienen unidas por una región llamada centrómero. Cada cromátida contiene una larga y única molécula de DNA, una doble hélice altamente plegada por su interacción con las histonas. Las dos cromátidas de un cromosoma son idénticas porque contienen las moléculas de DNA provenientes de la replicación de un DNA parental, tal como se vio en el apartado anterior. Las dos cromátidas tienen la misma información, por tanto, el cromosoma tiene la información duplicada. El número de cromosomas es una constante característica de cada especie biológica. Así, por ejemplo, las células de la mosca Drosophila contienen 4 pares de cromosomas, las del cangrejo 127, las del perro 39, y las de la especie humana 23 pares de cromosomas. Se habla de pares de cromosomas porque en una célula los cromosomas son iguales dos a dos, es decir, están en parejas de cromosomas llamados homólogos. Cada miembro de la pareja procede de un progenitor, es decir, recibimos un cromosoma del padre y otro de la madre para cada una de las parejas de homólogos. Estos cromosomas homólogos no tienen idéntica información genética, aunque sí tienen información equivalente para los mismos caracteres. Por ejemplo, un determinado cromosoma tiene la información para el color del pelo, es decir, un gen que determina el color del pelo, y su homólogo también. Sin embargo, estos genes no tienen por qué ser idénticos. Uno de ellos puede determinar color rubio y otro color castaño. Este concepto es fundamental para entender los mecanismos que rigen la herencia de los caracteres de padres a hijos. En los cromosomas se encuentran los genes de una forma lineal y ordenada. Esto quiere decir que cada uno de los genes de una especie tiene una localización precisa y constante en alguno de los cromosomas del complemento cromosómico de esa especie. Por tanto, se pueden elaborar mapas en los que cada gen se sitúa en una región, que los genetistas llaman locus, dentro de un cromosoma determinado, que a su vez se nume-

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BIOTECNOLOGÍA Y ALIMENTACIÓN

ran para identificarlos, ya que hay «marcas» (tamaño, longitud de sus brazos, bandas, etc.) que permiten distinguir unos cromosomas de otros. Hoy día, cada vez que se aísla e identifica un nuevo gen de cualquier especie, hecho cada vez más frecuente con los proyectos de secuenciación de genomas de diversos organismos que están en marcha, se detalla su localización cromosómica. Así se cartografían los genes y se tienen mapas cada vez más completos de los cromosomas.

3.9. GENES Y GENOMAS Se denomina genoma al conjunto completo de genes de un organismo. Por ejemplo, el genoma humano está empaquetado en 23 cromosomas distintos. En realidad, tenemos 23 pares de cromosomas y, por tanto, dos series completas del genoma, una serie procede del padre y otra de la madre. Estas dos series son iguales en cuanto a que tienen los mismos genes, pero hay pequeñas y sutiles diferencias entre las versiones paterna y materna de algunos genes, por ejemplo genes de los ojos azules y castaños, que explican las diferencias que encontramos entre los individuos. Imaginemos que el genoma humano es un libro. Este libro tiene 23 capítulos llamados cromosomas. Cada capítulo tiene miles de párrafos llamados genes. Cada palabra está escrita con letras llamadas bases. Esta analogía es muy rigurosa, la única diferencia importante es que mientras los libros están escritos con palabras de longitud variable utilizando 26 letras, en los genomas todas las palabras son de tres letras y están escritas con un alfabeto de sólo cuatro letras diferentes (A, T, G, C). En el año 2001 se logró leer por primera vez nuestro propio libro de instrucciones, se obtuvo la secuencia de bases, el orden de las letras, del genoma humano que tiene un tamaño de 3,3 Gb (gigabases). Este hito en la historia de la humanidad fue el resultado del trabajo en colaboración de cientos de investigadores durante 20 años, bastantes menos de los previstos inicialmente cuando se comenzó el proyecto Genoma Humano. Un Consorcio Público e Internacional de Científicos que agrupaba a 20 laboratorios de diferentes países del mundo que habían apostado y financiado este proyecto, y una empresa privada Celera Genomics, que muchos años después de iniciada la tarea se unió con gran empuje a la misma, presentaron sus resultados, simultáneamente, en las revistas Nature (15 de febrero 2001) y Science (16 de febrero 2001), respectivamente. A medida que se avanzaba en la secuenciación el Consorcio

DNA, GENES Y GENOMAS

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Internacional siempre hizo sus datos públicos, actualmente los resultados finales y las continuas actualizaciones se encuentran accesibles libremente en la dirección http://www.nature.com/genomics/human. Estos trabajos presentaron un primer borrador del libro del Genoma Humano, quedan todavía algunas lagunas en la secuencia, o lo que es lo mismo, algunas páginas en blanco. Ahora queda por determinar con precisión la estructura gramatical del texto, los párrafos y los capítulos, es decir, acotar los genes; determinar cuántos hay, dónde empieza y termina cada uno de ellos y, lo que es más importante, comprender el significado de este ingente libro de instrucciones. El genoma humano haploide, es decir uno de los dos juegos que tenemos, tiene un tamaño total de DNA de 3,3 109 pares de bases. Para hacerse una idea de lo que esto supone, volviendo al símil del libro, hay 1000 millones de palabras en el libro del genoma, que si hubiera que leerlas en voz alta a una velocidad de una letra por segundo se tardaría un siglo en acabarlo. Además del genoma humano, son numerosos los organismos cuyo genoma ya ha sido totalmente secuenciado. La lista crece continuamente y se puede consultar en internet en el European Bioinformatics Institute http://www.ebi.ac.uk/genomes. La ingente cantidad de información que generan las secuencias que se van obteniendo, requiere de programas informáticos cada vez más potentes y sofisticados para almacenar y, sobre todo, comparar toda la información genética obtenida. Si hubo un momento, a principios del siglo XX, en que la biología se unió a la química para interpretar la vida en términos moleculares, no es menos cierto que la vida es información digital escrita en el DNA y ha llegado la hora, a principios del siglo XXI, en que la biología debe aproximarse a las técnicas de la informática y la teoría de la información. Aunque el conocimiento de cada uno de los genomas individuales tiene un gran interés por sí mismo, quizá sea de la comparación entre ellos de lo que podamos extraer una información más valiosa para poder entender las diferencias entre especies e interpretar las diferencias entre individuos. El genoma humano es el más grande de los secuenciados hasta el momento, pero no logramos el record ya que nos superan algunos anfibios y algunas plantas cuyos genomas se estima que tienen unos tamaños comprendidos entre 109 y 1011 pb. En cuanto al número de genes si parece que es el más alto, ya que con los datos actuales se calculan unos 35.000 genes

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BIOTECNOLOGÍA Y ALIMENTACIÓN

que codifican proteínas. Este número que está muy lejos de los 100000 que se pensaba en estimaciones anteriores a conocer la secuencia, y sin embargo no tan lejos de los 26.000 genes que se necesitan para hacer una planta, 18.000 para un gusano, 13.000 para una mosca, o 6.000 para la levadura de la cerveza (¡unicelular!). No obstante, las estimaciones de genes en los organismos pluricelulares secuenciados, y especialmente en humanos, son muy poco fiables todavía ya que es muy difícil delimitar dónde empiezan y dónde acaban cada uno de ellos. Además de los genes que codifican información hay una gran cantidad de DNA altamente repetitivo, sin valor codificante para proteínas, o DNA «basura» como a veces se denomina, que llega a representar casi el 50% del total del genoma humano. Se desconoce cuál es su función pero resulta muy dudoso que esté ahí para nada. El conocimiento de los genes permite descubrir las bases genéticas de muchas enfermedades. Cada vez se identifican y se mapean en los cromosomas nuevos genes mutantes relacionados con estados patológicos. Veamos, a continuación, algunos datos curiosos que los estudios comparativos de genomas han revelado. Las diferencias entre el genoma del gorila y del chimpancé son mayores que entre el chimpancé y el ser humano. Compartimos con el chimpancé un 98% del genoma, esto viene a decir que si abrimos el libro del genoma por una página cualquiera encontraríamos de promedio dos palabras diferentes de cada cien. También se han encontrado genes homólogos con las bacterias, incluso algunos sorprendentemente similares. Entre los seres humanos hay una identidad del 99,9% del genoma el restante 0,1% es responsable de la diversidad genética entre individuos, una letra de cada mil nos separa. Al analizar la distribución de genes en los cromosomas se ha comprobado que algunos son muy ricos en genes, por ejemplo el cromosoma 19, mientras que otros están más «vacíos» de genes, por ejemplo el cromosoma 13 que, a cambio, tiene mucho DNA altamente repetido. El cromosoma 2, el segundo más grande del cariotipo humano, es en realidad el resultado de la fusión de dos cromosomas de mono, esto explica que nos diferenciemos en un par de cromosomas de los simios, orangután, gorila, chimpancé, que tienen 24 parejas frente a las 23 de los humanos. No sólo hay una elevada similitud de secuencias de genes entre mamíferos sino que también se conserva su organización. El cromosoma 17

DNA, GENES Y GENOMAS

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humano, tanto en la colección de genes como en el orden lineal en que éstos se sitúan, se asemeja mucho al cromosoma 11 de ratón, y lo mismo ocurre entre el cromosoma 20 humano y el 2 de ratón. El estudio de los genomas es la herramienta más poderosa que disponemos para ir rellenando piezas en el puzzle de la evolución y, probablemente, nos ayudará a responder algunas de las viejas preguntas que la humanidad se ha planteado durante siglos.

BIBLIOGRAFÍA BERG, P. y SINGER, M.: Tratar con genes. Ediciones Omega, 1994. BROWN, T. A.: Gene cloning and DNA analysis. An introduction (6.a ed.). WileyBlackwell, 2010. KREUZER, H.: ADN recombinante y Biotecnología. Guía para estudiantes. Editorial Acribia, 2005. LEWIN, B.: Genes IX. McGraw-Hill, 2009. LODISh, H. y DARNEL, J.: Biología Celular y Molecular. Ed. Omega, 4.a edición, 2002. LUQUE, J. y HERRÁEZ, A.: Texto ilustrado de Biología Molecular e Ingeniería Genética. Ediciones Harcourt, 2001. PIERCE, B. A.: Genetics. A conceptual approach. W. H. Freeman & Co., 2003. SINGLETON, P.: Dictionary of DNA and Genome Technology (2.a ed.). Wiley-Blackwell, 2010. SINGER, M. y BERG, P.: Genes y Genomas. Ediciones Omega, 1993. SMITH, C. A. y WOOD, E. J.: Biología Molecular y Biotecnología. Editorial AddisonWesley Iberoamericana, 1998. WINK, M.: An introduction to molecular Biotechnology: fundamentals, methods and applications. Wiley-VCH, 2011.

Direcciones en Internet The MIT Biology Hypertextbook Diferentes temas de Biología con textos, imágenes y ejercicios preparados por el Massachusset Institute of Technology. http://web.mit.edu/esgbio/www/7001main.html Cold Spring Harbor Laboratory 41 temas de biología con explicaciones, gráficos, fotos y animaciones http://vector.cshl.org Genes. Benjamin Lewin Páginas electrónicas que complementan el excelente, ya clásico pero continuamente renovado, texto de genética molecular http://www.ergito.com

Tema 4 DEL GEN A LA PROTEÍNA

En este tema vamos a profundizar en el estudio del gen para conocer los procesos mediante los cuales se expresa la información genética. El objetivo es entender cómo funcionan los genes. Los genes tienen la información para hacer todas las proteínas de la célula. Las proteínas son la materia prima de la vida: las partes de la célula que no están hechas de proteínas están hechas por proteínas. Muchas de éstas proteínas funcionan como enzimas controlando las reacciones químicas que tienen lugar en la célula, por tanto, todos los procesos celulares dependen, en última instancia, de la información codificada en los genes. Conocemos ya algunas características excepcionales de la molécula de DNA, como su estructura química, su mecanismo de copia y su organización dentro del núcleo celular (Tema 3). En este tema, trataremos de responder a dos preguntas fundamentales: ¿cómo puede esta molécula contener la información genética? ¿cómo se expresa esta información?

ESQUEMA DE CONTENIDOS 4.1. 4.2. 4.3. 4.4. 4.5. 4.6. 4.7. 4.8. 4.9. 4.10.

La información genética se materializa en las proteínas Las proteínas Del gen a la proteína Un intermediario: el RNA Un diccionario molecular: el código genético Síntesis de proteínas: traducción Cambios en los genes: mutaciones Consecuencias de las mutaciones Regulación de los genes: activación y represión Arquitectura de un gen

4.1.

LA INFORMACIÓN GENÉTICA SE MATERIALIZA EN LAS PROTEÍNAS

La información genética de los organismos se encuentra almacenada en el DNA. En el tema anterior se han analizado algunas características excepcionales de esta molécula, como su estructura química, su mecanismo de copia y su organización dentro del núcleo celular. En este tema, vamos a profundizar en el estudio del gen para conocer los procesos mediante los cuales se expresa la información genética. Se trata de responder a dos preguntas: ¿cómo está codificada la información genética? ¿cómo se expresa esta información? Los genes tienen la información en forma de instrucciones para el desarrollo de todos los caracteres del organismo. Todas nuestras características, desde los rasgos más básicos de nuestra pertenencia a los «humanos», hasta los detalles únicos que nos convierten en individuos diferentes, están influenciados en mayor o menor medida por nuestros genes. Pero, ¿cómo puede una molécula ejercer su acción en todas las características de un organismo? Cuando uno piensa en caracteres se le ocurre, por ejemplo, algo tan complejo como la forma o el color de un ojo. La forma o el color de un ojo dependerá de las características del conjunto de células individuales que forman este órgano. Por tanto, la pregunta correcta en este momento es: ¿cómo determina el DNA las características de la célula? Ahora sí podemos responder a esta pregunta: el DNA tiene la información para hacer todas las proteínas de la célula. Para seguir con nuestro razonamiento, es necesario recordar que todas las enzimas son proteínas. También sabemos que todas las actividades de la célula están sujetas al control directo de enzimas. Por lo tanto,

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BIOTECNOLOGÍA Y ALIMENTACIÓN

es obvio, que si el DNA determina la estructura de las proteínas, determina las enzimas que se producen en la célula. Ya que todas las reacciones químicas se desarrollan bajo la influencia de enzimas, todos los procesos celulares están, en última instancia, dependiendo de la información del DNA. En otras palabras, controlando la producción de proteínas el DNA controla también la producción de todas las demás sustancias celulares. Las proteínas son la materia prima de la vida. Las partes de las células que no están hechas de proteínas, están hechas por proteínas. Incluso el propio mensaje genético del DNA, es producido y ensamblado con ayuda de proteínas. De modo que, resumiendo, así es como funciona el flujo de información que mueve la vida: ◆

El DNA hace DNA, con nucleótidos, la ayuda de enzimas y su propia estructura como molde.

◆

El DNA también hace RNA, que es como una copia de trabajo o un intermediario del mensaje genético.

◆

El RNA, con la ayuda de una compleja maquinaria que traduce el mensaje, elabora proteínas.

◆

Las proteínas, especialmente las enzimas, hacen todo lo demás.

La biología en éstos últimos cincuenta años, desde el descubrimiento de la molécula de DNA, ha dado un paso de gigante en el conocimiento de los genes y de su funcionamiento.

4.2.

LAS PROTEÍNAS

Son las moléculas más abundantes en las células, constituyendo aproximadamente el 50% de su peso seco. Se encuentran en todas las partes de la célula y son fundamentales para la estructura y función celular. ◆

Prácticamente todas las funciones de los seres vivos dependen de las moléculas de proteínas. Existen millones de proteínas diferentes, cada una de ellas especializada en una función, y cada una de ellas específica para un organismo. Sin embargo, todas las moléculas que llamamos proteínas tienen muchos aspectos de su estructura química en común.

DEL GEN A LA PROTEÍNA ◆

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Las proteínas son grandes y largas moléculas compuestas por la unión de otras moléculas más sencillas llamadas aminoácidos. Por lo tanto, las proteínas son polímeros, donde los aminoácidos son las unidades que se repiten. Existen 20 aminoácidos diferentes. Todos ellos tienen una parte común en sus moléculas que consiste en un grupo amino y un grupo ácido y difieren unos de otros en la estructura del resto de la molécula que podemos denominar con carácter genérico como grupo R, que puede ser muy variado.

◆

Los aminoácidos reaccionan unos con otros formando así largas cadenas con centenares de aminoácidos enlazados entre sí, esto es una proteína. Este tipo de enlaces se denomina enlace peptídico, por eso a las proteínas se les denomina también a veces como péptidos o más frecuentemente polipéptidos, aunque este término es más correcto utilizarlo para denominar proteínas muy pequeñas o para fragmentos de proteínas.

◆

Con los 20 tipos distintos de aminoácidos se construyen los millones de proteínas diferentes que existen en los seres vivos. Una proteína difiere de otra en el orden o secuencia en que están situados los distintos aminoácidos y en el número total de éstos que contiene, que puede oscilar entre decenas, en las proteínas más pequeñas a miles en las más grandes. Un cálculo sencillo nos demuestra que para una proteína de un tamaño de cien aminoácidos, relativamente pequeña, existen 10130 posibilidades de ordenación de los veinte aminoácidos, es decir, nada menos que 10130 proteínas diferentes.

◆

Lo que caracteriza a una proteína es el conjunto de aminoácidos que la forman y su ordenación relativa o secuencia. Es lo que se llama estructura primaria de la proteína. Pero hay ciertas propiedades, sobre todo de tipo biológico, para cuya interpretación se requiere conocer la conformación espacial de la proteína. Cada proteína se repliega de una forma característica adquiriendo una estructura tridimensional propia (estructuras secundaria y terciaria) que condiciona su actividad biológica. Cuando una proteína pierde su conformación espacial se dice que está desnaturalizada. Esto es lo que ocurre cuando se calienta una proteína o cuando se introduce por ejemplo en alcohol. Así, al calentar hasta cocer un huevo, la albúmina, proteína de la clara, se desnaturaliza dando una masa blanca.

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BIOTECNOLOGÍA Y ALIMENTACIÓN

Como ya hemos indicado las proteínas tienen funciones muy importantes en los seres vivos, pero, además, tienen funciones muy diversas, es decir, son moléculas muy versátiles. Algunas proteínas tienen una función contráctil, como las proteínas del músculo, actina y miosina. Otras funcionan como transportadoras, como la hemoglobina, que transporta oxígeno y dióxido de carbono en la sangre. Otras tienen función de defensa, como las inmunoglobulinas que pueden reconocer e inactivar moléculas perjudiciales o dañinas para el organismo. Otras tienen un papel estructural como el colágeno de la piel o de los tendones. Otras proteínas realizan funciones de información y alerta para la célula, se encuentran en la superficie externa de la membrana y son capaces de detectar si existen virus rondando, si hay cambios en el ambiente, etc. Pero, una de las funciones más impresionantes de las proteínas, y que puede resultar más desconocida, es su papel como aceleradores de las reacciones químicas que ocurren en los seres vivos. Las proteínas que están dedicadas a esta función se conocen con el nombre de enzimas. Una enzima puede acelerar la velocidad una reacción química del orden de cien millones de veces (108), lo que supone que una reacción que en presencia de una enzima dura un segundo, en su ausencia necesitaría tres años. En la célula tienen lugar miles de reacciones por segundo, y cada una de ellas está controlada por una enzima. La actividad de las enzimas es la clave para entender todos los procesos de la vida. La presencia de una enzima disminuye la cantidad de energía necesaria para que ocurra la reacción. Una molécula que tiene este efecto sobre una reacción se denomina en el lenguaje de la química como catalizador. Las enzimas se pueden definir como catalizadores biológicos. Como consecuencia, cuando interviene una enzima en una reacción se acelera la velocidad de la reacción. La mayoría de la reacciones procederían a velocidades imperceptibles en ausencia de enzimas, a las temperaturas normales de vida de los organismos. Las enzimas son proteínas generalmente de un peso molecular elevado, es decir grandes moléculas formadas por numerosos aminoácidos. Por el contrario, la sustancia sobre la que actúan, que se denomina sustrato, suele ser una molécula pequeña. Como ya hemos dicho, existen miles de enzimas diferentes en un organismo. Cada enzima tiene una estructura y también una función única. Las enzimas son muy específicas con respecto a la molécula sustrato y al tipo de reacción en la que van a intervenir. Prácticamente existe una enzima específica para cada una de las reacciones que tienen lugar en un ser vivo.

DEL GEN A LA PROTEÍNA

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Muchas de las sustancias que se conocen vulgarmente como «venenos» actúan como inhibidores de la actividad de enzimas. Si estas enzimas actúan en reacciones vitales para la célula ésta muere. El efecto mortal del cianuro, de las sales de plomo, del mercurio, etc., es debido a que interaccionan con enzimas bloqueando su actividad. Algunas enzimas necesitan para poder funcionar la presencia de otras sustancias químicas que pueden ser iones o bien pequeñas moléculas orgánicas. Muchas de las sustancias que conocemos con el nombre genérico de vitaminas tienen esta función. Por ejemplo, muchas vitaminas del grupo B (la B1, B2, B6, B12) actúan como coenzimas de determinadas enzimas.

4.3.

DEL GEN A LA PROTEÍNA

El problema al que nos enfrentamos es el siguiente: ¿cómo es posible que la secuencia de bases del DNA dirija la formación de una proteína que, como acabamos de comentar, está constituida por una secuencia específica de aminoácidos? Este proceso es todavía mucho más complejo de lo que pueda parecer a simple vista. De hecho, la transferencia de la información genética del DNA a las proteínas es el proceso bioquímico más complejo, más importante y más exquisitamente regulado de todos los que ocurren en la célula. Aunque todavía quedan muchos aspectos por conocer, las etapas básicas de este proceso fueron desveladas en tan sólo una década (19551965), debido al trabajo de multitud de científicos que concentraron sus esfuerzos de una forma coordinada en este campo. Sus hipótesis, experimentos y razonamientos, son demasiado complicados y extensos como para detallarlos aquí. Por lo tanto, nos vamos a limitar a conocer la imagen final que emergió de todas estas investigaciones. ◆

La idea básica es que el orden de aminoácidos de una proteína está dictado por el orden de las bases de un fragmento de DNA, es decir, de un gen. Este proceso no es directo. Sabemos que el DNA se encuentra siempre en el núcleo de la célula, y la síntesis de proteínas tiene lugar fuera del núcleo, en los ribosomas ubicados en el citoplasma. Por lo tanto, podemos concluir que debe existir una molécula intermediaria que actúe de «mensajero», llevando las instrucciones

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BIOTECNOLOGÍA Y ALIMENTACIÓN

para la síntesis de proteínas desde el DNA del núcleo hasta los ribosomas del citoplasma, y esta molécula es el ácido ribonucleico: RNA. ◆

En el proceso de expresión de la información genética, tenemos, por tanto, dos etapas: DNA → RNA → proteínas La primera etapa, el paso de la información del DNA al RNA se denomina transcripción. La segunda etapa, el paso de la información del RNA a la proteína, se denomina traducción. Vamos a estudiar estos procesos con algún detalle.

4.4.

UN INTERMEDIARIO: EL RNA

El RNA es un ácido nucleico cuya estructura química es bastante parecida a la del DNA. Esta semejanza no es accidental ya que en la síntesis del RNA el DNA actúa como molde o modelo. ◆

El RNA es la copia complementaria de un fragmento de DNA.

Antes de estudiar cuál es el mecanismo por el que se realiza esta copia, conviene recordar la estructura del RNA y sus diferencias con el DNA. El RNA está formado, también, por cuatro tipos de nucleótidos que se unen formando largas cadenas, en las que el azúcar y el fosfato forman el esqueleto sobre el cual sobresalen las bases. Las diferencias con respecto al DNA son: 1. El azúcar en el RNA es la ribosa, ligeramente diferente a la desoxirribosa del DNA. 2. Una de las bases nitrogenadas es también diferente, en el RNA el uracilo (U) reemplaza a la timina (T). 3. El RNA es una cadena sencilla, mientras que el DNA es una doble hélice. 4. Las moléculas de RNA son mucho más pequeñas que las de DNA puesto que, como ya hemos indicado, son la copia de un fragmento de DNA.

DEL GEN A LA PROTEÍNA ◆

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El proceso de síntesis de RNA, que utiliza como molde un fragmento de una cadena de DNA, se denomina transcripción.

El mecanismo es el siguiente: la doble hélice de DNA se abre, precisamente en la región que va a ser copiada. Es decir, las cadenas complementarias se separan por ruptura de los enlaces entre las bases que las mantenían unidas. Una de las cadenas de DNA sirve de molde para el alineamiento de los nucleótidos del RNA, de tal forma, que las bases del RNA que se sintetiza son complementarias a las de la cadena de DNA que se copia. De tal modo que, una G será copiada por una C, una C por una G, una T por una A, una A por una U (recuerde que el uracilo reemplaza a la timina). En el proceso de unión de los nucleótidos interviene una enzima: la RNA polimerasa. Al final del proceso la cadena de RNA queda libre y el DNA se cierra de nuevo por apareamiento de sus cadenas complementarias (Figura 4.1).

FIGURA 4.1. Proceso de transcripción. Se esquematizan las distintas etapas del proceso de transcripción de un gen o síntesis de RNA. En este proceso el molde es un segmento de una de las cadenas de DNA del gen.

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BIOTECNOLOGÍA Y ALIMENTACIÓN

De esta forma, las instrucciones genéticas copiadas o transcritas al RNA están listas para salir al citoplasma. El DNA, por tanto, es la «copia maestra» de la información genética, que permanece en «reserva» dentro del núcleo. El RNA, en cambio, es la copia de «trabajo» de la información genética. ◆

El RNA que lleva las instrucciones para la síntesis de proteínas se denomina RNA mensajero (m-RNA).

Hay otros tipos de RNA que, aunque también son copiados del DNA, no codifican proteínas. Estos tienen otras funciones muy importantes también en la síntesis de proteínas: ◆

El RNA ribosómico (r-RNA) constituye el ribosoma que es el lugar de la célula donde se realiza la síntesis de proteínas.

◆

El RNA de transferencia (t-RNA) actúa como transportador de los aminoácidos. Durante la síntesis de proteínas cada aminoácido es llevado al ribosoma por su propio RNA de transferencia.

Haciendo un símil, en la construcción de una proteína el m-RNA sería el plano del arquitecto, el r-RNA sería el terreno sobre el cual se construye, y el t-RNA representaría a los operarios que llevan los ladrillos (aminoácidos) y los colocan según está especificado en el plano para «construir» finalmente una proteína.

4.5.

UN DICCIONARIO MOLECULAR: EL CÓDIGO GENÉTICO

La secuencia de nucleótidos en la molécula de DNA viene a ser un alfabeto molecular de cuatro señales, las cuatro bases distintas que tiene esta molécula (T, A, C, G). Cuando la información del DNA pasa al RNA en la transcripción (transcribir: escribir en otra parte), el alfabeto sigue siendo de cuatro bases (U, A, C, G). Sólo hay una pequeña diferencia, una U sustituye a la T. Pero, para pasar esta información a las proteínas en la traducción (traducir: escribir en otro idioma) nos enfrentamos a un verdadero problema «lingüístico». El alfabeto molecular de las proteínas contiene 20 señales distintas, hay 20 aminoácidos diferentes que constituyen las proteínas. Un símil sería la traducción del morse (dos signos, el punto y la raya) al castellano (28 signos). Evidentemente, cada letra del alfabeto castellano tiene que estar representada por más de un signo del alfabeto morse, y conociendo la clave es posible descifrar los mensajes enviados en morse.

121

DEL GEN A LA PROTEÍNA

Del mismo modo, cada aminoácido está representado por más de una base. Después de muchas investigaciones, se logró establecer las correspondencias. ◆

Cada grupo de tres nucleótidos, que se llama un codón, constituye una palabra en el lenguaje de los ácidos nucleicos, y esta palabra es traducida por un aminoácido.

◆

El código genético constituye las reglas de correspondencia entre los codones y los aminoácidos. Viene a ser, por tanto, un diccionario molecular. El establecer la relación entre codones y aminoácidos requirió mucho ingenio y un enorme trabajo experimental; en 1965 se terminó de descifrar el código genético (Figura 4.2).

PRIMERA BASE

U

C

A

G

SEGUNDA BASE

U

C

A

G

fenilalanina fenilalanina leucina leucina leucina leucina leucina leucina isoleucina isoleucina isoleucina metionina valina valina valina valina

serina serina serina serina prolina prolina prolina prolina treonina treonina treonina treonina alanina alanina alanina alanina

tirosina tirosina FIN FIN histidina histidina glutamina glutamina asparagina asparagina lisina lisina aspártico aspártico glutámico glutámico

cisteína cisteína FIN triptófano arginina arginina arginina arginina serina serina arginina arginina glicocola glicocola glicocola glicocola

TERCERA BASE U C A G U C A G U C A G U C A G

FIGURA 4.2. Tabla con el código genético. Cada tres bases, triplete o codón, del RNA tiene un significado para la síntesis de proteínas. En la figura se representa todas las combinaciones. Por ejemplo UUU = fenilalanina, CUC = Leucina.

122 ◆

BIOTECNOLOGÍA Y ALIMENTACIÓN

Este código es universal, es el mismo para todos los seres vivos, desde las bacterias hasta el hombre. Es decir, la interpretación de los codones por aminoácidos es igual en todas las células, todas «leen» de la misma manera los genes. De los 64 codones posibles (43), que corresponden a las combinaciones posibles de cuatro elementos tomados de tres en tres, 61 representan aminoácidos, aunque sólo hay 20 aminoácidos diferentes, los otros tres son señales de terminación.

◆

Hay más de un codón por cada aminoácido por tanto hay sinónimos en el código genético. Algunos aminoácidos están especificados por más de un codón. Los tres restantes representan señales de terminación. Aunque no hay señal específica de iniciación, la mayoría de las proteínas se inician en el aminoácido metionina, luego su codón AUG viene a ser una señal de iniciación.

4.6.

SÍNTESIS DE PROTEÍNAS: TRADUCCIÓN

La síntesis de proteínas se inicia cuando un determinado m-RNA, que tiene el mensaje de un determinado gen, se une a un ribosoma. Ahora debe comenzar a leerse el mensaje desde el primer codón hasta que aparezca una señal de stop. ¿Cómo ocurre esto? Evidentemente, una solución bastante sencilla sería que cada aminoácido «reconociera» su codón e interaccionara con él. De esta forma, se irían alineando los aminoácidos sobre el m-RNA y sólo faltaría que se unieran por enlaces. Sin embargo, no ocurre así. Los aminoácidos no son capaces de reconocer ni de interaccionar con sus codones correspondientes. Afortunadamente, existe una molécula que hace de intermediaria: el RNA de transferencia. Cada aminoácido es llevado hasta el ribosoma por su propio t-RNA. Cada t-RNA tiene dos extremos, uno que reconoce y se une a su aminoácido particular, y el otro que tiene tres bases complementarias al codón correspondiente a dicho aminoácido. Estas tres bases del t-RNA se denominan anticodón. El reconocimiento y la unión del codón y el anticodón tiene lugar, como ya hemos dicho en otras ocasiones, por formación de enlaces de hidrógeno entre las bases complementarias. Este proceso asegura que el aminoácido se inserte en el sitio apropiado. La unión de cada aminoácido con su t-RNA correspondiente es un proceso regulado por una enzima específica; la exactitud de esta unión es crucial, ya que si un t-RNA se une a un aminoácido que no le corresponde, éste va a ser insertado en el sitio

DEL GEN A LA PROTEÍNA

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que correspondería al aminoácido original, por consiguiente la proteína resultante llevaría un «error». Las etapas de la síntesis de proteínas pueden resumirse en ocho pasos: 1. El m-RNA se une al ribosoma. 2. El primer codón del m-RNA reacciona con el complejo [t-RNA1 + aa1] correspondiente, que generalmente suele ser el [t-RNA + metionina] ya que el primer codón suele ser AUG. 3. A continuación, el segundo codón reacciona a su vez con su respectivo [t-RNA2 + aa2]. 4. Los dos aminoácidos, situados muy próximos, reaccionan formando un enlace, quedando unidos los dos primeros aminoácidos {aa1 – aa2}. 5. El t-RNA1 del primer aminoácido queda libre y sale del ribosoma dispuesto para ser reutilizado, para «cargar» su aminoácido correspondiente de nuevo. 6. El tercer codón queda expuesto y reacciona con su correspondiente [t-RNA3 + aa3]. De nuevo se forma un enlace, dando como resultado la cadena {aa1 – aa2 – aa3}, quedando libre el t-RNA2. 7. El proceso continúa y del mismo modo se van «leyendo» los sucesivos codones por sus correspondientes t-RNAs, y la cadena peptídica va creciendo. 8. Finalmente, al llegar a un codón de terminación se libera la cadena de aminoácidos. Una vez finalizada la síntesis de una proteína, el m-RNA queda libre y puede ser leído de nuevo, es decir, puede ser reutilizado. De hecho, es muy frecuente que antes de que finalice una proteína ya esté comenzando otra, con lo cual, una misma molécula de m-RNA está siendo utilizada por varios ribosomas simultáneamente. Finalmente, el m-RNA es degradado. La vida de los distintos RNAs mensajeros es muy variable, pudiendo oscilar entre minutos y días. La síntesis de proteínas es un proceso que requiere energía, que es obtenida por las células en la degradación de las moléculas nutrientes. Esta energía es utilizada para la formación de los enlaces peptídicos entre los aminoácidos, para la unión de los aminoácidos con sus respectivos t-RNAs, y para el movimiento del ribosoma a lo largo del m-RNA. Las células obtienen energía en reacciones químicas en las que degradan las moléculas aportadas por los alimentos.

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4.7.

BIOTECNOLOGÍA Y ALIMENTACIÓN

CAMBIOS EN LOS GENES: MUTACIONES

Una de las características esenciales del material genético es su estabilidad. Como ya vimos en el tema anterior, en el proceso de replicación del DNA se trata de obtener copias idénticas que se transmiten inalteradas de generación en generación. Sin embargo, como vimos no siempre ocurre así, y a veces se producen errores. La herencia es un proceso conservador, pero no completamente. Ocasionalmente, aparecen «mutaciones», de tal forma, que las células hijas difieren de sus progenitoras en la secuencia del DNA o en la cantidad de DNA. También pueden ocurrir alteraciones en los cromosomas llamadas mutaciones cromosómicas, que afectan al número o a la estructura de los cromosomas y, por tanto, a todos los genes contenidos en estos cromosomas. Las mutaciones en un gen suponen cambios moleculares que afectan a uno o a varios nucleótidos de un gen. Estos cambios pueden ser de varios tipos: — Sustitución de un nucleótido por otro. — Pérdida de uno o varios nucleótidos. — Adición de uno o más nucleótidos. Un cambio en un gen, es decir, en la secuencia de nucleótidos de un fragmento de DNA dará como resultado, en la gran mayoría de los casos, un producto génico alterado, es decir, una proteína alterada en algún aminoácido. El resultado de una mutación suele ser el cambio de un aminoácido por otro, y esto afectará en mayor o menor grado a la función de la proteína, según si el aminoácido estaba en una región activa o no. El efecto de una mutación puede ser enorme, si la pérdida de un nucleótido hace que se modifiquen todos los codones sucesivos, produciéndose como consecuencia una proteína muy distinta a la original, y generalmente no funcional. Las mutaciones ocurren con una frecuencia baja y de una forma espontánea y al azar. Es decir, no se puede predecir cuántos ni cuáles serán los genes que van a modificarse ni cuando ocurrirá. Aparte de las mutaciones que se producen de forma espontánea por errores en la replicación, también pueden estar provocadas por agentes químicos, se conocen muchos en la actualidad y cada vez se descubren más, o por agentes físicos como las radiaciones.

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DEL GEN A LA PROTEÍNA

Es casi inevitable, la tendencia a asociar la palabra mutación con algo perjudicial y negativo. Desgraciadamente, son muchos los casos de mutaciones en la especie humana que tienen como consecuencia estados claramente patológicos. Sin embargo, no siempre es así, en algunas ocasiones el gen mutado puede dar lugar a un producto más efectivo que supone una importante ventaja para el organismo que lo lleva. Esta es la parte positiva, las mutaciones suponen una fuente de variabilidad para la evolución de las especies, es decir, son la causa de que aparezcan nuevas propiedades en los organismos, son la causa de la aparición de nuevas especies.

4.8.

CONSECUENCIAS DE LAS MUTACIONES

El efecto primario de la mutación de un gen es un cambio en la proteína, bien sea enzimática o no, por él especificada. Este cambio puede afectar a uno o a muchos aminoácidos de la proteína, produciendo modificaciones en su estructura y llegando incluso a provocar la pérdida de función de la proteína. Los efectos fisiológicos y anatómicos de ligeras alteraciones en la estructura de las proteínas pueden tener diversas consecuencias para el organismo. Consideremos algunos ejemplos; en primer lugar tenemos el caso del albinismo. Esta situación es debida a la falta de un pigmento oscuro de la piel llamado melanina. En la producción de melanina interviene una enzima llamada tirosinasa que actúa sobre el aminoácido tirosina:

gen normal tirosinasa

codifica la enzima cataliza la producción de

tirosinasa melanina

Los individuos albinos tienen el gen mutante que produce una forma inactiva de la tirosinasa, de ahí la falta de melanina en sus células epiteliales. Veamos, en segundo lugar, el efecto de una mutación en un gen que produce una proteína que no tiene carácter enzimático. Este es el caso, por ejemplo, de la anemia falciforme. Esta situación es producida por una mutación en el gen que codifica la proteína de la sangre hemoglobina, encargada de transportar oxígeno a todas las células del cuerpo.

126

BIOTECNOLOGÍA Y ALIMENTACIÓN

Estudios químicos han demostrado que la hemoglobina de los individuos con anemia falciforme difiere únicamente en un aminoácido de la hemoglobina normal. Sin embargo, este cambio hace que la hemoglobina mutante adquiera una conformación especial muy distinta de la hemoglobina normal, de tal forma, que hasta la propia célula que la contiene, el glóbulo rojo, adquiere una forma anormal de hoz o media luna (de ahí el nombre de falciforme) distinta de la forma de disco de las células normales. Estas células tienen una vida más corta y además se apelotonan en los vasos sanguíneos produciendo una situación de anemia, debida a la escasez de oxígeno en la sangre, que puede llegar a ser mortal, ya que origina debilidad, escaso desarrollo, problemas renales, reumatismo, y puede ocasionar parálisis. Hoy día se conocen unas 150 clases diferentes de hemoglobinas mutantes en los seres humanos; dependiendo del tipo de cambio, la función fisiológica de la hemoglobina se verá más o menos afectada en cada caso. Del mismo modo, todas las proteínas de la célula están sujetas a cambios mutacionales, que van a afectar de diferente modo al funcionamiento del organismo. Sólo algunos de estos cambios serán ventajosos, mientras que el resto serán perjudiciales para el organismo.

4.9.

REGULACIÓN DE LOS GENES: ACTIVACIÓN Y REPRESIÓN

Cualquier tipo de célula que estudiemos, bien sea procariota o eucariota, es decir de bacterias o de organismos superiores, tiene información para sintetizar miles y miles de proteínas diferentes. Sin embargo, sólo una fracción de esta información se utiliza en un momento dado. No existe ninguna célula que sintetice simultáneamente todas las proteínas que tiene codificadas en su DNA. Es decir, no hay ninguna célula que tenga todos sus genes activos a la vez. Por lo tanto, la expresión de los genes debe de estar regulada. Decimos que un gen se expresa cuando se transcribe y se traduce a una proteína. Hay mecanismos muy precisos, que comienzan a conocerse en la actualidad, que explican los procesos de regulación de la actividad de los genes. Un claro ejemplo de regulación de la expresión génica lo tenemos en los organismos pluricelulares. Las células de los organismos pluricelulares se diferencian para realizar funciones especializadas y difieren tre-

DEL GEN A LA PROTEÍNA

127

mendamente unas de otras en su contenido enzimático y en general en las proteínas que sintetizan. Esto no es debido a que tengan diferentes genes, ya que todas las células de un individuo tienen la misma información en su DNA puesto que proceden todas de la misma célula huevo, sino a que expresan diferentes genes. Entender cómo funciona la regulación génica constituye uno de los retos más apasionantes de la biología molecular actual. Todos los complejos procesos que tienen lugar durante el desarrollo de los organismos a partir de la célula huevo, así como los procesos de transformación de células normales en cancerosas, podrán llegar a ser explicados en función de diferencias en la expresión génica. Sin duda, uno de los procesos más importantes, más económicos para la célula y mejor conocido hoy día es el control directo de la transcripción, es decir, la activación o inactivación de los genes. En las bacterias, mucho más estudiadas por su sencillez, se sabe que existen regiones reguladoras situadas delante de cada gen. La región reguladora se denomina promotor del gen, y es una zona del DNA que interacciona con proteínas específicas que son capaces de activar o inactivar las transcripción de un gen determinado. Incluso, hay regiones reguladoras que controlan toda una batería de genes relacionados. Por ejemplo, genes cuyos productos van a participar en una determinada ruta de reacciones para producir una determinada sustancia, así se activan de una forma mucho más económica y eficaz, todos a la vez cuando se requiere su producto, o se inactivan todos cuando ese producto no es necesario. En las células de los organismos superiores, eucariotas, también existen regiones reguladoras de los genes o promotores. Sin embargo, el conocimiento que se tiene hoy en día de los mecanismos de regulación en células eucariotas es todavía muy fragmentario y el panorama es demasiado complejo para vislumbrar un modelo de regulación generalizado que nos permita comprender las exquisitas y sofisticadas redes de regulación de genes que suponen la «construcción» de un organismo pluricelular. El promotor de un gen se encuentra por delante de la región codificante que será transcrita, mientras que en la región final del gen se localizan señales de terminación que hacen que la transcripción finalice y se desprenda la RNA polimerasa del DNA. A medida que la RNA polimerasa avanza, el RNA recién sintetizado se desprende y queda como colgando mientras que la doble hélice de DNA se vuelve a cerrar. La comparación de las secuencias de nucleótidos de los promotores de distintos

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BIOTECNOLOGÍA Y ALIMENTACIÓN

genes ha revelado que existen pequeñas regiones consistentemente similares entre todos ellos, y se deduce que deben constituir señales para la unión de la RNA polimerasa. Una de estas secuencias importantes está formada por 6 pares de bases, cuya secuencia consenso es TATAAT, por eso se denomina normalmente como la caja TATA, y se localiza unos nucleótidos antes (–10 en procariotas, –25 en eucariotas) del que marca el inicio de la transcripción que por convención se numera como el +1. Otras secuencias que parecen comunes a diversos promotores aparecen todavía más alejadas del inicio, como la secuencia CAAT aproximadamente a –75, aunque puede funcionar mucho más alejada, y la secuencia llamada GC (en realidad GGGCGG) que se suele encontrar en más de una copia y a distancias mayores y variables. Todo ésto nos indica la complejidad de las regiones reguladoras que se encuentran por delante de los genes, a lo cual hay que unir otras regiones, en algunos casos muy alejadas, e incluso a veces, por detrás del gen que influyen en su transcripción y que reciben el nombre de enhancer o activador. Además, existen gran cantidad de proteínas que desde fuera, es decir, ajenas al propio gen, regulan también su expresión. Son los denominados factores de transcripción, los cuales generalmente uniéndose a la propia RNA polimerasa o bien uniéndose a la cromatina, actúan como activadores de transcripción haciendo más eficiente el proceso. También hay proteínas que actúan como represoras impidiendo la transcripción de determinados genes en determinados momentos; además, la propia topología del DNA es un factor importante a la hora de decidir qué genes se transcriben y cuáles quedan inactivos. Las secuencias de DNA que sirven como señales para detener el proceso se denominan terminadoras y marcan el final del gen. Generalmente contienen secuencias repetidas pero inversas que permiten que se formen lazos u horquillas de manera que constituyen un impedimento físico para que la RNA polimerasa pueda continuar y, de esta forma, el RNA se libera y la polimerasa se desprende del molde de DNA finalizando el proceso. La terminación, al igual que la iniciación, es una etapa regulable.

4.10.

ARQUITECTURA DE LOS GENES DE EUCARIOTAS. INTRONES Y EXONES

Como ya hemos dicho, una gran parte del DNA —especialmente en los organismos más complejos y evolucionados, no ocurre así en las bacterias— no tiene significado, es decir, no codifica para proteínas. Pero lo

DEL GEN A LA PROTEÍNA

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más sorprendente fue cuando, a mediados de los años 70, se descubrió que incluso dentro de los genes había segmentos sin valor informativo interrumpiendo la secuencia codificante de un gen. Es como si en el texto de un libro hubiese intercalado de manera aleatoria frases e incluso párrafos completos sin ningún significado. La mayoría de los genes en las células eucariotas, que son las células de los organismos superiores, tienen regiones funcionales que codifican y que reciben el nombre de exones y, entremedias, regiones que interrumpen a las anteriores llamadas intrones, a veces una, y frecuentemente varias, incluso puede llegar a haber decenas de ellas. Cuando el gen se transcribe para dar un RNA lo hace de forma continua todo él. Pero, posteriormente, el RNA debe sufrir un procesamiento llamado splicing, cuya traducción al español sería corte y empalme. Primero se cortan y eliminan los intrones, quedando sólo los exones que deben unirse entre ellos para dar la molécula continua y definitiva que será el RNA funcional. Este proceso es obviamente muy complejo y debe realizarse con una precisión absoluta, ya que eliminar un nucleótido de más o de menos modificaría toda la lectura de la información para la proteína.

BIBLIOGRAFÍA BERG, P. y SINGER, M.: Tratar con genes. Ediciones Omega, 1994. BROWN, T. A.: Gene cloning and DNA analysis. An introduction (6.a ed.). WilleyBlackwell, 2010. KREUZER, H.: ADN recombinante y Biotecnología. Guía para estudiantes. Editorial Acribia, 2005. LEWIN, B.: Genes XI. McGaw-Hill, 2009. LODISH, H. y DARNELL, J.: Biología Celular y Molecular. Ed. Omega, 4.a edición, 2002. LUQUE, J. y HERRÁEZ, A.: Texto ilustrado de Biología Molecular e Ingeniería Genética. Ediciones Harcourt, 2001. PIERCE, B. A.: Genetics. A conceptual approach. W. H. Freeman & Co., 2003. SINGER, M. y BERG, P.: Genes y Genomas. Ediciones Omega, 1993. SINGLETON, P.: Dictionary of DNA and Genome Technology (2.a ed.). Willey-Blackwell, 2010. WINK, M.: An introduction to molecular Biotechnology: fundamentals, methods and applications. Wiley-VCH, 2011.

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BIOTECNOLOGÍA Y ALIMENTACIÓN

Direcciones en Internet The MIT Biology Hypertextbook Diferentes temas de Biología con textos, imágenes y ejercicios preparados por el Massachusset Institute of Technology. http://web.mit.edu/esgbio/www/7001main.html Cold Spring Harbor Laboratory 41 temas de biología con explicaciones, gráficos, fotos y animaciones http://vector.cshl.org Genes. Benjamin Lewin Páginas electrónicas que complementan el excelente texto de genética molecular http://www.ergito.com Proteínas Algunas páginas gratuitas del texto: Protein Structure and function: From Secquence to Consequence. G. A. Petsko, D. Ringe. http://www.new-science-press.com/browse/protein

Tema 5 INGENIERÍA GENÉTICA

La biología en los últimos cincuenta años ha dado un paso de gigante en el conocimiento de los genes y su funcionamiento. Esta explosión de nuevos conocimientos y el ritmo vertiginoso al cual avanzan sus aplicaciones ha sido posible gracias a la tecnología del DNA recombinante, llamada también Ingeniería Genética. La Ingeniería Genética también ha tenido importantes aplicaciones prácticas en el campo de la Biotecnología. En este tema, trataremos de esbozar sus principios para poder entender las importantes y revolucionarias consecuencias de esta nueva tecnología. Las herramientas de la ingeniería genética consisten, fundamentalmente, en una serie de enzimas para cortar el DNA, unos vectores para transportar genes y un conjunto de técnicas para caracterizar el DNA. La tecnología del DNA recombinante permite manipular el material genético y crear nuevas combinaciones de genes no existentes en la naturaleza, al mezclar genes procedentes de especies diferentes.

ESQUEMA DE CONTENIDOS 5.1. 5.2. 5.3. 5.4. 5.5. 5.6.

5.7. 5.8.

5.9. 5.10. 5.11. 5.12. 5.13. 5.14.

La ingeniería genética Algunas aplicaciones de la ingeniería genética Las herramientas y las técnicas para manipular los genes Enzimas de restricción Otras enzimas Vectores 5.6.1. Plásmidos 5.6.2. Virus bacteriófagos 5.6.3. Cósmidos 5.6.4. Otros vectores Introducción de genes en células hospedadoras Células hospedadoras 5.8.1. Las bacterias como hospedadoras 5.8.2. Las levaduras como hospedadoras de genes 5.8.3. Levaduras más utilizadas en ingeniería genética 5.8.4. Procesos de transformación en levaduras 5.8.5. Vectores específicos de levaduras 5.8.6. Células vegetales y células animales Técnicas para trabajar con genes Electroforesis Hibridación con sondas Secuenciación del DNA Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) Biochips

5.1.

LA INGENIERÍA GENÉTICA

Nos referimos a la ingeniería genética como un conjunto de técnicas y de estrategias que permiten obtener, de forma experimental en el laboratorio, nuevas combinaciones de material hereditario que no se encuentran en la naturaleza, en definitiva permiten la manipulación «a la carta» de los genes. Clonar un gen quiere decir obtener gran cantidad de copias del mismo. Constituye uno de los objetivos básicos de la ingeniería genética ya que representa el primer paso para cualquier estudio de un gen o para iniciar un proceso de «manipulación» posterior. Así, podremos disponer de muchas copias de un gen en concreto para secuenciarlo, mutarlo, estudiar su regulación, obtener y caracterizar su producto, etc. Anteriormente a las técnicas de clonación era prácticamente imposible aislar un gen concreto en cantidades suficientes para su estudio, debido a la pequeñísima proporción que representa un gen particular dentro de la complejidad de, por ejemplo, el genoma humano (menos de una millonésima parte). Las técnicas de clonación de DNA permiten aislar fragmentos de DNA procedentes de un organismo complejo y mantenerlos, reproducirlos (para obtener muchas copias o clones) y expresarlos (para obtener mucha cantidad de su producto proteico) en sistemas sencillos como son las bacterias. Las bacterias han sido las primeras hospedadoras de genes eucariotas y las primeras en las que estos genes se han expresado, obteniendo así, por ejemplo, proteínas humanas en su interior. Hoy día, se utilizan también otras células, levaduras, vegetales y animales (incluidas las humanas) como hospedadoras de genes foráneos.

134

BIOTECNOLOGÍA Y ALIMENTACIÓN

No podemos detenernos aquí para analizar con detalle toda esta compleja tecnología cuyos avances han conducido a una verdadera explosión de aplicaciones: industriales, agrícolas, farmacéuticas y médicas, y cuyo impacto social e implicaciones éticas sobrepasan con mucho a cualquier otra tecnología desarrollada por el hombre hasta hoy día. Solamente trataremos de señalar algunos pasos fundamentales necesarios en un experimento de clonación:

5.1.1.

Cortar un gen y separarlo del resto del genoma

La ingeniería genética comienza a desarrollarse a principios de los años setenta coincidiendo con el descubrimiento de las enzimas de restricción. Estas enzimas, de origen bacteriano, cortan el DNA por un sitio específico o diana y permiten volver a unir, posteriormente, fragmentos de DNA de muy distinto origen, siempre que hayan sido cortados con la misma enzima y compartan la misma diana. Hoy hay comercializadas más de 100 enzimas de restricción diferentes, con distintas secuencias o dianas de corte, que permiten elegir la más adecuada según el gen concreto a clonar. Son como unas tijeras moleculares muy específicas, representan una herramienta clave para la ingeniería genética.

5.1.2.

Unir el gen a un vector que lo transporte al interior de una célula hospedadora

Una vez cortado y aislado el gen en cuestión, es necesario unirlo a un DNA vector que lo transporte al interior de la célula bacteriana. Este DNA vector, previamente cortado con la misma enzima de restricción, se une al gen a clonar por la zona de las dianas comunes, y se pegan los fragmentos con la ayuda de unas enzimas llamadas ligasas, que actúan como un pegamento molecular. Como vectores se utilizan normalmente bien plásmidos o bien virus que infectan bacterias. Los plásmidos son fragmentos de DNA que penetran en las bacterias y se reproducen con una elevada tasa, frecuentemente llevan genes que determinan resistencias a antibióticos, lo cual resulta muy ventajoso para la bacteria y también muy útil para «marcar» aquellas bacterias que incorporaron el combinado (gen+plásmido). Los virus bacteriófagos son también buenos vectores ya que literalmente inyectan su DNA hacia el interior de la bacteria. La inserción de una pieza de DNA (el gen a clonar) ajena al virus no altera su capacidad

INGENIERÍA GENÉTICA

135

para introducirse ni la capacidad de replicarse posteriormente en el interior de la bacteria.

5.1.3.

Introducir el gen en la bacteria y establecer un clon o linaje de bacterias que lo reproduzcan y, en su caso, obtener el producto del gen

El DNA de los plásmidos o el de los virus, que transporta el gen a clonar, penetra fácilmente, en determinadas condiciones, en el interior de las bacterias, donde se reproduce a elevadísimas velocidades si las bacterias se encuentran en un medio rico en nutrientes. En cuestión de horas se consigue una elevada amplificación del gen, y se habrá obtenido un clon o linaje de bacterias que puede seguir reproduciendo de forma ilimitada, siempre que se pongan en condiciones de alimento y temperatura adecuadas, el gen de interés. Habremos establecido «artificialmente» una fábrica «natural» de genes, que se puede congelar para parar su reproducción, y posteriormente volver a crecer en el momento deseado. Una vez «clonado» el gen, los pasos a seguir dependen de los objetivos concretos que se persigan. Si se pretende estudiar el gen, hay que aislarlo de nuevo, volviendo a cortarlo con la misma enzima de restricción y separándolo del DNA bacteriano con técnicas adecuadas. Pero ahora tendremos cantidades elevadas y suficientes para secuenciarlo, analizar su estructura, mutarlo, introducirlo en otros sistemas celulares, etc. También podremos, si el vector al cual lo hemos unido llevaba regiones reguladoras que permitan que se active y exprese en la bacteria, caracterizar la proteína por él codificada o bien obtener esta proteína en cantidades industriales. Éstas son de forma muy esquemática, y sin entrar en detalles muy críticos y laboriosos, las etapas básicas de la clonación de genes en bacterias. Se pueden introducir genes en distintos tipos de células por medio de un vector adecuado. Por ejemplo, para hacer terapia génica se requiere desarrollar estrategias específicas para lograr introducir un gen de forma estable y activa en determinadas células humanas. Para ello, se recurre a virus muy específicos que infecten esas células en concreto, pero a su vez modificados para que no produzcan enfermedades víricas. Para obtener una nueva variante de una planta con genes «nuevos» de interés agronómico, hay que lograr incorporar el gen o genes en cuestión en células vegetales, en la línea germinal reproductora, de ahí obtener plántulas y lograr su propagación estable. Como hemos indicado anteriormente cada objetivo especial requiere el diseño de estrategias específicas.

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BIOTECNOLOGÍA Y ALIMENTACIÓN

Otra forma de obtener grandes cantidades de un gen, que no requiere la utilización de vectores ni de bacterias, es la técnica de la PCR (reacción en cadena de la polimerasa). Esta técnica ha supuesto una auténtica revolución en el estudio DNA, especialmente útil cuando se dispone de cantidades mínimas y limitadas del mismo (análisis policial y forense, estudio de fósiles y momias, diagnóstico prenatal, etc.). La PCR permite amplificar determinadas piezas de DNA partiendo de cantidades mínimas y en una mezcla de moléculas. Es una técnica verdaderamente ingeniosa que se basa en ciclos de replicación en los que se amplifica exponencialmente el número de copias obtenido. Sin embargo, se requiere tener alguna información previa de la secuencia de pequeños fragmentos en los extremos del DNA que se desea amplificar.

5.2.

ALGUNAS APLICACIONES DE LA INGENIERÍA GENÉTICA

Además del enorme potencial que ha supuesto la ingeniería genética para avanzar en el conocimiento básico del funcionamiento íntimo de los seres vivos en todas las ramas de la Biología, ha representado una verdadera revolución por sus aplicaciones en numerosos campos como la industria química, farmacéutica y alimentaria, la agricultura y la ganadería, y la medicina. Sus aplicaciones en estos campos son tan extensas y crecen tan rápidamente que resulta difícil abarcarlas en unas pocas líneas. Una de las primeras y más fructíferas aplicaciones fue la de convertir a las bacterias en productores masivos de proteínas de interés, proteínas que anteriormente eran únicamente producidas en pequeñas cantidades por organismos superiores. Por ejemplo, la insulina, una hormona proteica necesaria para el tratamiento de la diabetes, fue uno de los productos pioneros, comercializado en 1982, obtenido a partir del gen clonado en bacterias de la insulina humana. Anteriormente, esta hormona era aislada a partir de páncreas de cerdos, por su mayor semejanza con la insulina humana, para ello se necesitaban miles de animales para obtener unos pocos microgramos y, además, complejos procesos de purificación posterior para hacerla activa. Hoy día, bacterias, levaduras y hongos son «factorías» en las que se obtienen multitud de productos de interés farmacológico, hormonas, interferones, factores de coagulación sanguínea, antibióticos, vacunas modificadas, etc. Algunos microorganismos que ya eran empleados en la industria se han «enriquecido» con genes nuevos o genes modificados para acelerar la

INGENIERÍA GENÉTICA

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producción de cerveza, simplificar la elaboración de alcoholes, etc., en definitiva para mejorar la rentabilidad industrial. El uso de microorganismos modificados genéticamente para eliminar sustancias contaminantes del ambiente es otra de las aplicaciones de inmediato y esperanzador futuro. Introduciendo genes que codifican enzimas capaces de degradar determinadas sustancias de desecho de procesos industriales se pueden «crear» organismos con múltiples capacidades para degradar residuos altamente contaminantes y tóxicos vertidos actualmente al medio ambiente. Las plantas pueden ser también modificadas genéticamente para mejorar su rendimiento agrícola, y de hecho hay ya gran cantidad de plantas comercializadas a las que se les ha introducido en su genoma genes que las hacen resistentes a plagas de insectos, a infecciones por virus, a condiciones climáticas extremas, e incluso que mejoran su contenido nutritivo. La obtención de animales transgénicos, a los cuales se les ha introducido en su genoma un gen foráneo ajeno a su especie, constituye quizás uno de los campos más llamativos y espectaculares aunque también más complejos y delicados, no sólo por sus dificultades técnicas sino por las implicaciones éticas y la alarma social que lógicamente despierta. Esta modificación genética supone que un gen clonado, que puede pertenecer incluso a una especie muy alejada, es introducido en una célula germinal o en un embrión muy temprano, de forma que al desarrollarse el nuevo individuo éste porte en todas sus células y de forma estable, es decir heredable por su descendencia, ese gen foráneo que ha su vez debe expresarse correctamente, es decir en las células apropiadas y en su debido momento. Todos estos condicionantes hacen tremendamente difícil y de muy escaso éxito, todavía, estas investigaciones. Uno de los primeros éxitos fue la obtención de ratones transgénicos de tamaño gigante ya que portaban el gen humano de la hormona del crecimiento. Hoy día, se investiga en la obtención de animales transgénicos para utilizarlos como modelo experimental para estudiar enfermedades humanas como el Alzheimer o la fibrosis quística. También se han obtenido animales transgénicos en vacas, ovejas, cabras, cerdos, aves y peces, con el objetivo de introducir genes que mejoren su rendimiento ganadero. Otra aplicación sería la utilización de la glándula mamaria de vacas, ovejas o cabras como «fabrica biológica» para producir determinadas proteínas, mediante genes clonados en estos tejidos, que luego serían obtenidas en grandes cantidades en la leche de estos animales. La ingeniería genética también proporciona una nueva forma de diagnosticar enfermedades hereditarias. Hoy día se utilizan como

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BIOTECNOLOGÍA Y ALIMENTACIÓN

prueba de diagnóstico sondas de genes clonados y marcadores genéticos muy fiables para una lista cada vez más amplia de enfermedades genéticas. Estas técnicas junto con la amniocentesis hacen cada vez más frecuente el diagnóstico prenatal de muchas enfermedades hereditarias graves en individuos de riesgo. Finalmente uno de los campos que mayores expectativas despierta es el de la terapia génica, que supone la capacidad no sólo de diagnosticar sino de corregir enfermedades debidas a causas genéticas en los seres humanos. En el caso de una enfermedad debida a la presencia de un único gen defectuoso, es teóricamente posible reemplazar o al menos suplementar la función de ese gen defectuoso por uno normal y funcional. Este tipo de tratamiento se puede aplicar a las células somáticas de una persona enferma en las cuales falla un determinado gen, aislando estas células, modificándolas genéticamente con el gen correcto y volviendo a implantarlas para que ahora funcionen adecuadamente dentro del organismo. Así se está comenzando a aplicar en algunos casos muy concretos, como por ejemplo en la inmunodeficiencia severa (ADA), que se ha tratado con éxito aislando células de la médula ósea, modificándolas con el gen adecuado y volviéndolas a implantar. El futuro está en el desarrollo de vectores que lleven directamente el gen a sustituir justamente al tejido o al órgano del cuerpo en donde es requerida su función. Más lejana, y por supuesto a discutir con profundidad y a regular con gran precisión, se encuentra la posibilidad de terapia génica en células sexuales, ya que supone modificar de forma estable afectando a toda la descendencia y, por tanto, al patrimonio genético de las generaciones futuras.

5.3.

LAS HERRAMIENTAS Y LAS TÉCNICAS DE LA INGENIERÍA GENÉTICA

El desarrollo de la ingeniería genética ha dependido, fundamentalmente, del descubrimiento de una serie de enzimas que actúan sobre los ácidos nucleicos y que son las verdaderas «herramientas» para esta ingeniería. Nuestra capacidad para manipular los genes fuera de las células depende, en última instancia, de la disponibilidad de enzimas específicas con las que podamos cortar, modificar y unir las moléculas de DNA de manera controlada en el laboratorio. También son fundamentales algunas técnicas utilizadas de forma rutinaria en el laboratorio como son la electroforesis, la hibridación con sondas específicas, la secuenciación del DNA, la reacción en cadena de la

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polimerasa (PCR) y los microchips para el estudio comparativo de secuencias y la expresión diferencial de genes.

5.4.

ENZIMAS DE RESTRICCIÓN

De todas las enzimas utilizadas en la manipulación de genes las enzimas de restricción, o más precisamente denominadas nucleasas de restricción, tienen una importancia extraordinaria ya que constituyen una herramienta de gran precisión imprescindible para fragmentar el DNA por sitios fijos. Las enzimas de restricción son endonucleasas que reconocen dianas específicas en el DNA, es decir que cortan el DNA cada vez que encuentran una determinada secuencia de bases que es específica para cada una de éstas enzimas. Hoy día están identificadas más de 100 enzimas de restricción distintas, cada una de ellas con una secuencia específica y diferente de corte, llamada secuencia de reconocimiento o diana, que suele tener entre 4 y 10 bases. Son una herramienta imprescindible para la ingeniería genética, que podríamos equiparar a unas «tijeras moleculares» de una especificidad y precisión extraordinarias. Son nucleasas porque cortan el DNA pero, a diferencia de otras nucleasas no lo degradan sino que producen fragmentos. El número de fragmentos dependerá de las veces que se encuentre la secuencia de reconocimiento en una molécula de DNA. Estas enzimas permiten, por tanto, cortar las largas moléculas de DNA cromosómico en fragmentos más cortos y de manera específica, controlada y reproducible. Las enzimas de restricción se encuentran en las bacterias. Diferentes especies y cepas de bacterias tienen diferentes enzimas de restricción. Hoy día se sabe que estas enzimas son utilizadas por las bacterias como mecanismo de defensa frente a la invasión de virus bacteriófagos. La bacteria se protege del ataque de éstas enzimas a su propio DNA modificándolo, generalmente por metilación de las bases de forma que las dianas quedan inactivadas y las enzimas sólo actuarán sobre el DNA de los bacteriófagos intrusos. Es interesante resaltar que estas enzimas fueron descubiertas en los años 50, al detectarse que algunas cepas de bacterias eran inmunes a la infección vírica, por tanto, había un fenómeno de restricción controlada al crecimiento de fagos por parte de la célula hospedadora. Las circuns-

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tancias de su descubrimiento, que en absoluto tenían relación con la importancia práctica que han adquirido posteriormente, es un ejemplo más de cómo la investigación básica, cuyo único objetivo es el conocimiento, en este caso el estudio de distintas cepas de bacterias y sus fagos invasores, sin ningún interés práctico en su momento, ha llevado a uno de los descubrimientos de mayor importancia en Biología en cuanto a su aplicación y rentabilidad. Por el descubrimiento pionero de estas enzimas Arber, Smith y Nathans recibieron el Premio Nobel en 1978. Las enzimas de restricción se suelen nombrar con las iniciales de la bacteria de la que se aísla, seguida de alguna inicial de la cepa o número si existiera más de una. Así por ejemplo, la EcoRI procede de Escherichia coli cepa RY 13, y la Bam H I procede de las bacteria Bacillus amyloliquefaciens H. Hay varios cientos de enzimas de restricción identificadas que se agrupan como sistemas de tipo I, II y III, según sus características moleculares. Las de tipo II son las más utilizadas en ingeniería genética, cortan el DNA en el mismo lugar de reconocimiento, y son las mejor estudiadas. La secuencia diana suele ser capicúa o palindrómica, esto quiere decir que la lectura 5′ → 3′ de la secuencia de una de las hebras es idéntica a la hebra complementaria leída también en la dirección 5′ → 3′. La mayoría de las enzimas de éste grupo producen cortes quebrados, es decir, en bases no enfrentadas. Esto origina extremos monocatenarios que se han llamado cohesivos o pegajosos, ya que son capaces de unirse y aparear con otros fragmentos de DNA generados por la misma enzima, ya que serán complementarios. En otras enzimas el corte es liso, en bases enfrentadas, dejando, por tanto, extremos romos (Figura 5.1).

5.5.

OTRAS ENZIMAS

En el interior de las células, es decir «in vivo», la degradación y la síntesis de ácidos nucleicos son procesos cruciales rigurosamente controlados que tienen lugar debido a la acción de enzimas específicas. Desde los años 50 se han ido identificando muchas de estas enzimas que han permitido conocer cada vez con mayor exactitud la estructura y el funcionamiento de los genes. Estas enzimas, aisladas, purificadas y, hoy día, disponibles comercialmente, han permitido el enorme desarrollo de las técnicas de DNA recombinante. No existen métodos químicos que tengan la selectividad y la precisión de los métodos enzimáticos. Las enzimas implicadas en la síntesis de ácidos nucleicos reciben el nombre genérico de polimerasas (DNA polimerasas y RNA polimerasas),

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FIGURA 5.1. Ejemplos de algunas endonucleasas de restricción y sus secuencias de reconocimiento y corte en el DNA. Las enzimas de restricción que se indican tienen secuencias de reconocimiento palindrómicas y generan extremos cohesivos (EcoRI por ejemplo) o extremos romos (HaeIII).

en general requieren una cadena «molde» y sintetizan una molécula complementaria. Estas enzimas son ubicuas, se encuentran en todos los organismos, ya que son imprescindibles para todas las células vivas. Sin embargo, a nivel comercial se extraen generalmente de bacterias e incluso algunas de ellas, con características muy especiales y útiles en ingeniería genética, son exclusivas de ciertos tipos de bacterias. Este es el caso de la Taq DNA polimerasa, una enzima de la bacteria Thermus aquaticus, que trabaja a una temperatura óptima de 75-80 °C, mientras que la DNA polimerasa de E. coli trabaja a 37 °C. La Taq DNA polimerasa se utiliza para

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producir cadenas de DNA por la técnica de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). La transcriptasa inversa es una enzima típica de los retrovirus, es una polimerasa que sintetiza una cadena de DNA pero tomando como molde una cadena de RNA. Es muy utilizada en ingeniería genética, ya que a partir de un RNA mensajero (mRNA) aislado se puede producir una cadena de DNA complementario (cDNA), que posteriormente se puede clonar en una bacteria para obtener multitud de copias. También se utiliza para construir las denominadas bibliotecas de cDNA que contienen todos los genes que expresa una determinada clase de células, ya que se copian todos los mRNAs que están siendo transcritos por una determinada célula obviando por tanto los genes inactivos (que no se transcriben) en ese tipo de células. Inicialmente todas estas enzimas se extraían directamente de determinados tipos de las bacterias o de los virus que las producían, pero hoy día se obtienen para su comercialización por ingeniería genética. En general las polimerasas permiten sintetizar un DNA o un RNA in vitro, sin embargo es más frecuente su utilización simplemente para «marcar» un determinado DNA o RNA bien con nucleótidos radiactivos o modificados químicamente con sustancias que posteriormente van a permitir su detección bien porque emitan color, fluorescencia, etc. Así, es frecuente utilizar una combinación de una endonucleasa que haga roturas o mellas en un DNA y una polimerasa que sintetice y rellene estos huecos con nucleótidos que ponemos en la solución «marcados» (con 32P, 3H, fluoresceína, etc.). De este modo lograremos tener un DNA marcado que posteriormente se puede utilizar a su vez como sonda para identificar un gen. La transferasa terminal es una polimerasa que no necesita molde ya que añade nucleótidos a los extremos 3′ de las cadenas de DNA. Es muy útil ya que no solo permite «marcar» moléculas añadiéndoles una cola de nucleótidos modificados química o radiactivamente, de forma equivalente a como hemos indicado anteriormente, sino que además permite unir por complementariedad dos fragmentos de DNA diferentes. Para ello, se añaden colas de nucleótidos complementarios, por ejemplo, a un DNA se añade una cola de poli-A mientras que a otro DNA se le añade una cola de poli-T. Posteriormente, la mezcla de ambos fragmentos de DNA permitirá su unión por complementariedad, después para «pegar» estos dos DNAs, se debe formar un enlace fosfodiester con unas enzimas específicas que se denominan ligasas. Las ligasas son muy útiles en cualquier experimento de ingeniería genética que requiera unir covalentemente dos moléculas de DNA, a veces de distinto origen.

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Otras enzimas de interés son las fosfatasas y las quinasas; las primeras eliminan el fosfato del extremo 5′ terminal de un ácido nucleico, mientras que las quinasas realizan la acción contraria que es incorporar un fosfato al extremo 5′.

5.6.

VECTORES

Para la clonación de un gen es fundamental disponer de vehículos que transporten el DNA de interés de una célula a otras. Estos vehículos genéticos llamados vectores son igualmente moléculas de DNA con capacidad de replicarse por sí mismos y que poseen regiones que no son esenciales para su multiplicación, en esas zonas es donde pueden insertarse fragmentos de DNA exógeno. En general, el DNA del vector se separa fácilmente del DNA de la célula hospedadora, obteniéndose así cantidades considerables del vector y por tanto del DNA exógeno insertado en él. Los vectores más comúnmente usados en ingeniería genética son algunos plásmidos de bacterias y virus bacterianos denominados bacteriófagos.

5.6.1.

Plásmidos

Los plásmidos se descubrieron como consecuencia de la utilización de antibióticos para el tratamiento de enfermedades infecciosas. Se había observado que algunas cepas de bacterias patógenas sensibles a un determinado antibiótico podían volverse de repente resistentes al mismo. Las investigaciones demostraron que la resistencia al medicamento era un carácter genético localizado en los plásmidos, moléculas de DNA que se replican de forma independiente del cromosoma bacteriano y se transfieren durante los contactos célula a célula, que ocurren con frecuencia en bacterias y se denominan conjugación, de esta forma se transmite la resistencia al antibiótico de bacterias resistentes a bacterias sensibles que se transforman en resistentes. Uno de los primeros plásmidos que se identificó fue el Factor F de la bacteria Escherichia coli. Este plásmido es un pequeño fragmento de DNA que contiene unos 25 genes, muchos de los cuales controlan la formación de los pili, la estructura proteica responsable de la transferencia de DNA de una célula a otra durante la conjugación. Otros plásmidos naturales contienen genes de resistencia a uno o más antibióticos, se denominan plásmidos de resistencia o plásmidos R.

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BIOTECNOLOGÍA Y ALIMENTACIÓN

Todos ellos son moléculas de DNA de doble cadena y circulares, que están presentes en algunas bacterias como elementos extracromosómicos. Son de tamaño variable y su presencia no es indispensable para las células, aunque suele conferirle alguna ventaja, como la de resistencia a algún antibiótico determinado, la producción de antibióticos, la degradación de compuestos orgánicos complejos, la producción de toxinas, etc. La replicación del DNA del plásmido puede estar acoplada a la del DNA cromosómico de la célula hospedadora (control estricto), o puede ser totalmente independiente (control relajado). En este último caso la célula hospedadora contiene múltiples copias del DNA del plásmido. Un plásmido óptimo para ser utilizado como vector en ingeniería genética es aquel que reúne las siguientes características: — Tiene un control relajado de replicación, es decir, que existe en cada célula en un número de copias elevado (de más de diez a varios cientos). — Confiere a la célula hospedadora alguna ventaja, por ejemplo resistencia a antibióticos, lo que permite identificar fácilmente las bacterias que contienen el plásmido, ya que cuando éstas se cultivan en un medio que contenga el antibiótico, sólo sobrevivirán y prosperarán aquellas, que lleven el gen de resistencia al antibiótico, y por tanto, aquellas que contienen el plásmido correspondiente. — Posee secuencias de DNA que pueden ser sustituidas por fragmentos de DNA exógeno sin que dicha sustitución afecte a sus características de replicación. — Posee un amplio espectro de secuencias de reconocimiento para enzimas de restricción, ya que la mayoría de los experimentos de clonaje requieren el empleo de estas enzimas para abrir el DNA del plásmido. Las dianas de restricción se encuentran en el plásmido de tal manera que la inserción del DNA exógeno en cualquiera de ellos exprese un marcador fenotípico útil para su selección. — Es deseable además, por razones de seguridad, que no sean movilizables por conjugación, para que la célula receptora no lo pierda, ni sea adquirido por otras bacterias. Para ello los plásmidos que se utilizan en el laboratorio se han manipulado genéticamente para que pierdan la capacidad de transmitirse de unas bacterias a otras. — Es preferible que sean de pequeño tamaño, pues así son más estables y resistentes a la manipulaciones que necesariamente se deben realizar en el tubo de ensayo.

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Un plásmido comúnmente muy usado es el pBR322, derivado de un plásmido natural de E. coli, modificado artificialmente por ingeniería genética. Contiene elementos necesarios para su replicación, el gen que confiere resistencia al antibiótico ampicilina, y el gen que confiere resistencia al antibiótico tetraciclina (Figura 5.2). La inserción de un fragmento de DNA exógeno en el plásmido pBR322 requiere: a) abrir este plásmido con una enzima de restricción, b) cortar el DNA foráneo con la misma enzima, c) mezclar en un tubo de ensayo ambos DNAs (los extremos de DNA del plásmido y del fragmento de DNA a

FIGURA 5.2. Esquema de la estructura del plásmido pBR322. Se muestra la localización de las dianas para las enzimas de restricción que cortan sólo una vez a este plásmido. Los números indican la posición de la base que corresponde al nucleótido en posición 5’ de cada una de las dianas de reconocimiento. Las flechas dentro del círculo muestran la dirección de la transcripción de los genes de resistencia a ampicilina y tetraciclina, y la dirección de replicación del DNA.

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insertar son complementarios, de tal forma que se aparean y permanecen unidos por los puentes de hidrógeno que se establecen entre las bases complementarias), d) la presencia en el tubo de ensayo de la enzima ligasa sellará covalentemente la unión de los dos fragmentos (plásmido y DNA exógeno). Se obtiene así una molécula continua de DNA recombinante que está formada por el DNA del vector más el DNA exógeno. Según el objetivo del estudio a realizar se emplean distintos tipos de plásmidos, cada uno de ellos conservan las características generales que se han descrito más arriba. Los plásmidos de clonación se usan cuando se quiere clonar un fragmento de DNA para obtener grandes cantidades de dicho fragmento. Los plásmidos de expresión se emplean cuando se desea obtener el producto génico del fragmento de DNA que se ha fusionado al plásmido, es decir, la proteína codificada por ese fragmento exógeno. Estos plásmidos llevan una serie de señales en el DNA que hacen posible la trascripción y traducción del gen foráneo, o lo que es lo mismo, la obtención de la proteína correspondiente. Otros vectores, los plásmidos testigo, se han diseñado con el objetivo de reconocer secuencias específicas de DNA, como promotores, señales de terminación de la transcripción o de la traducción, etc. En este caso los plásmidos llevan genes indicadores o reporteros es decir, genes que expresan un fenotipo fácilmente identificable o medible, como luminiscencia o una actividad enzimática fácil de detectar. Por último, nos referimos a los plásmidos mixtos, también llamados vectores lanzadera, poseen secuencias que permiten su multiplicación en células de dos especies diferentes. En este caso deben contener las secuencias que dirigen la replicación (origen de replicación) en E. coli, lo que permite su clonación en este microorganismo, y secuencias propias que permitan su multiplicación y expresión en células eucariotas, en levaduras o células animales o vegetales.

5.6.2.

Virus bacteriófagos

Algunos virus bacteriófagos pueden transportar genes de una bacteria a otra, y se puede aprovechar esta propiedad para utilizar los fagos como vectores de clonación, el más utilizado es el fago lambda. El genoma del fago λ es un DNA de doble cadena, con un tamaño de aproximadamente 50 kb, que se extrae de la cápsida viral como una mo-

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lécula circular, debido a la existencia en sus extremos 5′ de 12 nucleótidos protuberantes de cadena sencilla, complementarios en secuencia (extremos cohesivos, o secuencias cos) cuyo apareamiento permite la circularización de la molécula. Estos extremos son esenciales para el empaquetamiento del DNA dentro de la cápsida viral. Si consideramos el DNA del fago como una molécula lineal, los genes requeridos para la síntesis de las proteínas estructurales del virus están localizados en la parte izquierda de la molécula, mientras que los genes requeridos para la replicación están confinados en la parte derecha, junto a los genes implicados en la lisis de la bacteria hospedadora. En la parte central se encuentran los genes que controlan funciones como recombinación o lisogenización que no son esenciales para el crecimiento lítico del fago. La dispensabilidad de la región central ha sido utilizada para reemplazar el DNA correspondiente de esta zona, por fragmentos exógenos de DNA que se pretenden clonar. Estos fragmentos de DNA, una vez que se unen al DNA del fago, pueden ser introducidos en la cápsida viral mediante un sistema de empaquetamiento in vitro. Se obtiene de esta manera un virus infeccioso portador de fragmentos exógenos de DNA. Por manipulación genética se han delecionado del fago λ original sus fragmentos dispensables y se han añadido secuencias de reconocimiento para enzimas de restricción, se ha conseguido aumentar su capacidad para recibir grandes fragmentos de DNA exógeno. Así, los vectores λ que actualmente se comercializan tienen capacidad para insertar fragmentos de DNA de hasta 24 Kb, que corresponde al tamaño total de la región no esencial de este fago.

5.6.3.

Cósmidos

Otro tipo de vectores son los cósmidos pueden considerarse una mezcla de un plásmido y del fago λ. Estos vectores poseen una molécula de DNA formada artificialmente, mediante manipulación génica, por los siguientes componentes: 1) genes que confieren resistencia a antibióticos, 2) el origen de replicación de un plásmido, 3) los extremos cohesivos de DNA del fago λ (cos) y 4) secuencias de restricción donde puedan unirse los fragmentos de DNA exógeno que se pretenden clonar. En realidad los cósmidos se construyen a partir de plásmidos que contengan DNA clonado ligando la región cos de lambda al DNA del plásmido. El plásmido modificado puede entonces ser empaquetado in vi-

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BIOTECNOLOGÍA Y ALIMENTACIÓN

tro dentro de los viriones de lambda como se ha descrito anteriormente y las partículas de fago pueden ser utilizadas para infectar células de E. coli. Los sitios cos se requieren para el empaquetamiento del DNA dentro de viriones de lambda. La ventaja principal de estos vectores artificiales es que pueden, siendo de un tamaño tan pequeño como de 5 kb, portar fragmentos de DNA exógeno de hasta 45 kb, capacidad muy superior a la de otros vectores naturales. Estos vectores han sido útiles especialmente en la clonación de genes de cromosomas eucarióticos, que generalmente están constituidos por fragmentos de DNA muy grandes. Otra ventaja de los cósmidos es que el DNA puede ser almacenado en partículas de fago en lugar de plásmidos. Las partículas de fago son mucho más estables que el DNA desnudo y pueden mantenerse funcionales durante mayores periodos de tiempo.

5.6.4.

Otros vectores

El bacteriófago M13 de E. coli con DNA de cadena sencilla se ha utilizado para clonar y secuenciar fragmentos de DNA, pero deben ser de menos de 1 Kb de longitud. Existen otros muchos vectores específicos para Bacillus subtilis, bacteria también muy utilizada en ingeniería genética. Cada vector en origen es específico del hospedador que invade, de forma que un vector de E. coli no puede transformar una bacteria de otra especie. Sin embargo, existen vectores de amplio espectro que se pueden utilizar para trabajar con diferentes especies de bacterias hospedadoras. Otros vectores son específicos para células eucariotas. Así hay vectores para células de levaduras, para células de mamífero, y para células de vegetales.

5.7.

INTRODUCCIÓN EN LA CÉLULA HOSPEDADORA

El proceso de obtención de DNA recombinante como se ha descrito en el apartado anterior se realiza en el tubo de ensayo, sin embargo para obtener numerosas copias del mismo es necesario introducir el plásmido recombinante en una bacteria o célula, permitir que se multiplique por el proceso de replicación del DNA utilizando toda la

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FIGURA 5.3. Obtención de DNA recombinante. Inserción de un fragmento de DNA en un plásmido e introducción del plásmido recombinante en una célula bacteriana. Las bacterias que contienen el plásmido se seleccionan haciéndolas crecer en un medio que contenga un antibiótico. Sólo sobrevivirán las bacterias portadoras del plásmido.

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maquinaria bioquímica de la célula hospedadora. La introducción del plásmido recombinante en la célula hospedadora recibe el nombre de transformación, es un proceso sencillo, existen varios métodos según se trate de bacterias o células eucarióticas. En el caso de introducirlo en bacterias, éstas simplemente se tratarán con una solución de cloruro de calcio que produce pequeños poros en la pared celular por los que penetra el DNA con bastante eficiencia, las bacterias así tratadas y preparadas para recibir un DNA se denominan competentes (Figura 5.3). Otros métodos consisten en tratar a las células bacterianas con un corto pulso eléctrico (electroporación) que producen el mismo efecto, abrir poros en la membrana. La introducción de plásmidos recombinantes en células eucarióticas requiere métodos específicos, aunque persigue el mismo objetivo de hacer permeables las membranas para facilitar la entrada de un DNA externo.

5.8.

CÉLULAS HOSPEDADORAS

Las bacterias han sido las primeras células utilizadas como hospedadoras para el clonaje de genes y las primeras en las que estos genes recombinantes se han expresado. En la actualidad, aunque no son las únicas, siguen ocupando un papel muy importante en el clonaje de genes procedentes de otros organismos.

5.8.1.

Las bacterias como hospedadoras

La introducción en la célula bacteriana de una secuencia eucariótica de DNA de tamaño hasta de aproximadamente 10 Kb no altera la replicación y viabilidad de la bacteria, por lo que se sigue utilizando este hospedador para obtener muchas copias de un gen. Por otro lado su cultivo es fácil, rápido y económico. Sin embargo, las bacterias tienen el inconveniente de no poseer la maquinaria bioquímica para llevar a cabo las reacciones específicas para la eliminación de los intrones de los mRNAs codificados por la mayoría de los genes eucarióticos. Tampoco son capaces de realizar las modificaciones postraduccionales necesarias que requieren algunas proteínas eucarióticas para ser funcionales. Algunos de estos inconvenientes se resuelven clonando los cDNA de los genes correspondientes y de este modo se obvia la eliminación del intrón, ya que el cDNA se produce a partir de un RNA maduro del cual ya se habían eliminado los intrones. Sin embargo, las modificaciones postraduccionales

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de las proteínas como fosforilaciones, glicosilaciones, acetilaciones, etc.; son difíciles de realizar en bacterias por lo que las proteínas producidas en ellas, carecerán de estas modificaciones y por lo tanto no serán funcionales. A pesar de esto, existen muchos ejemplos de genes de distintas especies clonados y expresados en bacterias y generalmente el primer paso para la clonación de cualquier fragmento de DNA eucariótico en organismos superiores, levaduras, animales o vegetales, pasa por insertar ese fragmento en plásmidos de bacterias. La gran mayoría de los experimentos de clonación se han hecho empleando E. coli como hospedador utilizando plásmidos y fagos de esta misma bacteria como vectores. Las propiedades genéticas y fisiológicas de este microorganismo se conocían con mucho detalle y se disponía de muchos mutantes bien caracterizados mucho antes de la llegada de la tecnología del DNA recombinante. Aunque la especie E. coli presenta peligros para la producción a gran escala de productos derivados del DNA clonado, porque se encuentra en el tracto intestinal humano y es potencialmente patógeno, se han desarrollado cepas mutantes de E. coli en las que se ha eliminado este problema de tal forma que son incapaces de sobrevivir fuera de las condiciones del laboratorio, limitando la posibilidad de infección de los que trabajan con ellas y de los demás seres vivos. Casi todas las cepas utilizadas actualmente derivan de la clásica cepa de laboratorio E. coli K12 con distintas mutaciones bien caracterizadas que facilitan el proceso de clonación y selección. Por ejemplo: la cepa HB101 contiene mutaciones que inactivan la endonucleasa de restricción endógena minimizando la degradación del DNA recombinante que se introduce en ellas; la cepa DH1, además es muy eficaz en la captación de vectores plasmídicos. Bacillus subtilis es otra bacteria que también es utilizada con frecuencia como hospedadora. B. subtilis no es potencialmente patógeno, no produce endotoxinas y secreta proteínas al medio. Aunque las técnicas para clonar en B. subtilis no se ha desarrollado tanto como las de E. coli se disponen de plásmidos y fagos para la clonación. Este microorganismo presenta el inconveniente de que sus plásmidos son inestables y se pierden después de algunas generaciones. Sin embargo presenta la ventaja frente a E. coli que secreta las proteínas clonadas al medio extracelular facilitando así su purificación; E. coli, como es gram negativa, retiene las proteínas extracelulares en el

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BIOTECNOLOGÍA Y ALIMENTACIÓN

espacio periplásmico haciendo el aislamiento y purificación un poco más complicado. En todo caso, para las aplicaciones en la industria alimentaria es necesario utilizar hospedadores de grado alimentario, como por ejemplo las bacterias ácido lácticas tan frecuentes en las fermentaciones industriales de alimentos, o como la levadura Saccharomyces.

5.8.2.

Las levaduras como hospedadoras de genes

Las levaduras son organismos eucariotas unicelulares que comparten muchas de las ventajas que tienen las bacterias para la ingeniería genética; son fáciles de cultivar y tienen un ciclo celular corto, por lo que son una alternativa en la producción a escala industrial de proteínas de interés. Pero además, como son células eucarióticas, presentan una serie de ventajas con respecto a las bacterias si lo que se quiere expresar es un gen eucariótico cuyo producto final ha de sufrir algunas modificaciones postraduccionales que no se realizan en las células procariotas de las bacterias. Las levaduras, además, permiten la clonación de fragmentos de gran tamaño (100-500 kb), esto facilita la posibilidad de clonar un gen completo que posea muchos intrones o un grupo de genes adyacentes en el genoma de un organismo dado, y facilitan el estudio de grupos de genes interrelacionados. A pesar de que pueden reproducirse sexualmente, normalmente se reproducen por gemación, que es un tipo de reproducción asexual. En medio líquido crecen en suspensión como células aisladas, pero en soporte sólido producen colonias, de forma análoga a E. coli. En las condiciones usuales de crecimiento en el laboratorio se cultivan como células haploides que poseen un tiempo de duplicación de 1,5 a 2,5 horas. Esto significa que pueden obtenerse grandes cantidades de levadura de forma barata y en un tiempo relativamente corto.

5.8.3.

Levaduras más utilizadas en ingeniería genética

La más utilizada, sin duda, es Saccharomyces cerevisiae; sin embargo recientemente se han comenzado a utilizar otras especies de levaduras que muestran algunas ventajas que se comentarán a continuación.

INGENIERÍA GENÉTICA

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Saccharomyces cerevisiae Es la levadura utilizada para la elaboración de vinos, cerveza y pan desde hace miles de años, es la mejor conocida a nivel genético y de la que se disponen numerosas estirpes y mutantes metabólicos y de ciclo celular cartografiados genéticamente de gran utilidad para la experimentación. Es un organismo unicelular de forma elíptica rodeado por una pared celular externa. Las células haploides contienen 16 cromosomas, en la actualidad se conoce la secuencia de nucleótidos de todos ellos, por lo que S. cerevisiae se ha convertido en el primer eucariota cuyo genoma ha sido completamente secuenciado. La información de tales secuencias es muy útil para estudios genéticos y para aplicar las técnicas de manipulación genética. El tamaño total del genoma es de 12 × 106 pares de bases, es decir, aproximadamente sólo tres veces el de E. coli. La mayor parte de las cepas contienen un plásmido denominado círculo de 2 μm. Se trata de una molécula de DNA circular de 6.318 pares de bases que replica hasta alcanzar un elevado número de copias (cerca de 30). Este plásmido natural, el círculo de 2 μm, se ha modificado artificialmente y se utiliza como vector para introducir genes en levaduras.

Pichia pastoris Otra levadura que está teniendo cada vez más interés en la producción de proteínas heterólogas es Pichia pastoris ya que produce grandes cantidades de la enzima alcohol deshidrogenasa, la expresión de esta enzima está regulada de modo que sólo se sintetiza cuando la levadura crece en presencia de metanol como única fuente de carbono. Esto se debe a que el gen que codifica para esa proteína posee un promotor muy fuerte inducible por metanol. Cuando por ingeniería genética se coloca un gen heterólogo detrás del promotor del gen alcohol deshidrogenasa y se hace crecer a la levadura en un medio que contenga metanol se obtienen grandes cantidades de la proteína codificada por el gen clonado. Se ha empleado P. pastoris para la producción del antígeno S utilizado como vacuna de la hepatitis B.

Kluyveromyces lactis Es otra levadura que se ha utilizado para la producción de interleucina y de albúmina de suero humano, porque es una productora más eficaz que S. cerevisiae.

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5.8.4.

BIOTECNOLOGÍA Y ALIMENTACIÓN

Procesos de transformación en levaduras

La rígida pared de polisacáridos que rodea la membrana celular de la levadura impide la entrada de moléculas de DNA. Para que el DNA libre pueda entrar es necesario abrir poros o eliminar esa pared. Hay varios métodos para introducir un DNA exógeno en células de levaduras, el más usado consiste en permeabilizar las células incubándolas en acetato de litio. La adición de polietilen glicol y un choque térmico aumenta la captación de DNA. Con este método se consiguen de 105-106 transformantes por μg de DNA. Algunas estirpes de levaduras son muy reacias a ser transformadas por este método entonces se utiliza la electroporación como procedimiento alternativo, que consiste en someter a las células a pequeñas corrientes eléctricas que abren poros en las membranas permitiendo la entrada de DNA. Un tercer procedimiento consiste en degradar la rígida pared celular que rodea la membrana celular de la levadura mediante el tratamiento con enzimas específicas. Las células «desnudas» sin pared celular se llaman esferoplastos y son capaces de captar el DNA después de ser convenientemente tratadas con Ca2Cl. Los esferoplastos regeneran la pared cuando se incuban posteriormente en un nutriente especial. La selección de los transformantes, es decir, la selección de las levaduras que han captado el DNA exógeno, es sencilla ya que se conocen muchas cepas mutantes auxotrofas y en el vector siempre se incluye el gen salvaje para complementar el gen defectuoso de la cepa hospedadora. Algunos marcadores usados son el gen HIS3 que codifica para una enzima que interviene en la síntesis de histidina, el TRP5 que codifica para la triptófano sintetasa, LEU2 que interviene en la síntesis de leucina, URA3 que interviene en la síntesis de nucleótidos. Todos estos marcadores pueden ser seleccionados fácilmente en levaduras.

5.8.5.

Vectores específicos para levaduras

En ingeniería genética de levaduras se utilizan distintos vectores según el objetivo final del experimento de clonación. Éstos pueden ser vectores de integración, autónomos y basados en el plásmido de 2 μm.

Vectores de integración Los vectores de integración son moléculas híbridas que contienen un plásmido procariótico, es decir, de bacterias, y secuencias de DNA de

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levadura. La región de origen procariótica permite el crecimiento de estos vectores en E. coli y por tanto la preparación de grandes cantidades del vector en esta bacteria. Las secuencias de levadura permiten la integración en el genoma de la levadura por recombinación homóloga. Estos vectores no son capaces de replicarse autónomamente en la levadura hospedadora, por lo que la única vía de supervivencia es la integración en el genoma por recombinación homóloga. Tienen la desventaja de que el gen clonado e introducido en el vector sólo se encuentra en una copia por célula.

Vectores autónomos Son vectores que se pueden replicar libremente sin necesidad de integración en el genoma de la levadura. Hay fundamentalmente dos tipos de vectores autónomos, los basados en componentes cromosómicos, y los derivados de círculo de 2 μm. Los primeros son vectores artificiales construidos con diferentes secuencias cromosómicas, según los elementos cromosómicos que contengan reciben distintas denominaciones: 1. Plásmidos con secuencias de replicación autónoma (ARS). Son moléculas de DNA circular que contienen secuencias de replicación autónoma (ARS, según las iniciales en inglés), estas secuencias se descubrieron de forma casual en distintas regiones del DNA genómico de levadura, su función es la de iniciar la replicación del DNA de los cromosomas. Los ARS se aislaron por ingeniería genética y se unieron a plásmidos de origen bacteriano. Por tanto, suelen ser vectores mixtos que se replican tanto en E. coli como en levaduras. Suelen ser muy inestables, sólo permanecen en la célula si llevan un gen marcador que sea imprescindible para la supervivencia de la levadura. Por ejemplo: si el plásmido ARS lleva el gen TRP5, este se puede mantener en células mutantes trp5– (incapaces de sintetizar triptófano) creciendo en un medio sin triptófano. En ausencia de esta presión selectiva el plásmido se pierde rápidamente. 2. Plásmidos con ARS y centrómeros. Son plásmidos ARS a los que se les ha añadido además secuencias centroméricas, por lo que son más estables al facilitar su distribución durante la mitosis de la célula. 3. Cromosomas artificiales (YAC = yeast artificial chromosome). Son vectores con secuencias de replicación autónoma y centrómeros a

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BIOTECNOLOGÍA Y ALIMENTACIÓN

los que se ha añadido telómeros en los extremos por lo que también se les denomina minicromosomas. Son los vectores que permiten clonar los fragmentos de DNA más grandes, de hasta 500 kb. Se emplean preferentemente para elaborar genotecas o bibliotecas de genomas muy grandes como el humano o para mantener, en una sola unidad, genes de gran longitud por tener numerosos intrones (Figura 5.4).

Vectores basados en el círculo de 2 μm S. cerevisiae posee un plásmido natural de 2 μm de longitud, que no confiere a la célula ninguna característica especial. Es estable y se comporta como un minicromosma circular. Es nuclear y su replicación está regulada por el mismo control genético que la replicación de los cromosomas. Su presencia no es esencial para la levadura. Las cepas que lo poseen se denominan cir+ y las que carecen de él, ciro. Este plásmido tiene un tamaño de 6,3 kb, pero se ha manipulado considerablemente variando sus dimensiones y contenido. Las versiones manipuladas tienen el origen de replicación y la resistencia a ampicilina del plásmido bacteriano pBR322 para amplificarlo en E. coli, marcadores como LEU2 para seleccionar las levaduras transformadas y las dianas de restricción Hind III y Bam HI para el clonaje de secuencias de DNA exógeno. La eficiencia de transformación es muy alta, obteniéndose entre 10.000 y 100.000 transformantes por μg de DNA. Hasta aquí hemos dado un repaso a los vectores específicos de levadura utilizados para clonar secuencias de DNA heterólogo, pero si lo que se pretende es expresar un gen en levaduras, es decir que esa secuencia de DNA se transcriba y se traduzca en una proteína funcional, es necesario utilizar vectores de expresión de levaduras. La mayoría de ellos son derivados del círculo de 2 μm, pero tienen promotores inducibles de levaduras, y secuencias de terminación de la transcripción cerca de la secuencia codificante para que los transcritos largos sean más estables.

5.8.6.

Células vegetales y células animales

Las células vegetales y animales son también posibles receptoras de genes heterólogos o de otras especies, pero nos referiremos a ellas en los temas dedicados a las plantas y animales transgénicos.

INGENIERÍA GENÉTICA

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FIGURA 5.4. Clonación en cromosomas artificiales de levadura (YAC). Clonación de fragmentos de DNA humano en cromosomas artificiales de levadura (YAC) que incluyen secuencias centroméricas (CEN), teloméricas (TEL), secuencias de replicación autónoma (A), un origen de replicación reconocible en E. coli que permite su multiplicación en esta bacteria (ORI) y dianas de restricción (EcoRI, BamH1).

158

5.9.

BIOTECNOLOGÍA Y ALIMENTACIÓN

TÉCNICAS PARA TRABAJAR CON GENES

A continuación comentaremos, brevemente, los fundamentos y las aplicaciones de algunas de las técnicas más usuales para trabajar con genes, o con fragmentos de DNA, que hoy día se utilizan prácticamente de forma rutinaria en la mayoría de los laboratorios de Biología Molecular: electroforesis, hibridación con sondas de ácidos nucleicos, secuenciación, PCR y microchips.

5.10.

ELECTROFORESIS

La electroforesis es una técnica que permite la separación de macromoléculas que tienen una carga eléctrica y que por tanto se moverán cuando se sometan a un campo eléctrico, obviamente en la dirección fijada por el signo de su carga eléctrica. Los fragmentos de DNA generados, por ejemplo, por la digestión con una enzima de restricción pueden separarse unos de otros por la técnica, relativamente sencilla, de electroforesis en gel. Las moléculas de DNA se separaran en función de su tamaño cuando se las hace atravesar, impulsadas por un campo eléctrico, la matriz o retícula del gel, que impone una resistencia por fricción que dependerá del tamaño y complejidad de la molécula.

El gel se hace con agarosa, un polisacárido que se utiliza también para elaborar las placas de agar en las cuales se crecen las bacterias, o bien con poliacrilamida, un polímero sintético. El gel se sumerge en una solución tampón y la muestra que contiene el DNA, también disuelto en una solución tamponada, se coloca o se «carga» en un extremo del gel sobre una muesca o «pocillo», a continuación se aplica una corriente eléctrica, que hace que las moléculas cargadas negativamente (por sus grupos

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fosfato) comiencen a moverse y se desplacen a través del gel hacia el electrodo positivo. En función de la concentración del gel, que condiciona el mayor o menor tamaño de la retícula, del pH y del tipo de tampón que se utiliza, y naturalmente del tiempo y de la corriente aplicada se pueden seleccionar las condiciones y la resolución de la separación. En cualquier caso, la matriz o el poro del gel retarda el movimiento de los fragmentos de DNA en función de su tamaño, de modo que cuanto más pequeño, encontrará menor resistencia, y avanzará más rápidamente hacia el extremo positivo del gel. Una vez finalizada la electroforesis, el gel se tiñe con un colorante que revele la posición de las moléculas; es frecuente utilizar bromuro de etidio un colorante que se fija al DNA y es fluorescente, de forma que permite ver la posición o las bandas de DNA iluminando el gel con luz ultravioleta. Si en un carril paralelo a la muestras se cargan moléculas de tamaños conocidos se pueden utilizar como patrón para realizar una estimación de los tamaños de los fragmentos detectados. Esta técnica también se puede utilizar para purificar y aislar moléculas de DNA; la porción del gel o la banda que contiene el fragmento de interés se corta y se recupera el DNA al eluirlo, ahora aislado de otros fragmentos y por tanto purificado. La técnica de electroforesis es de una enorme utilidad ya que permite obtener bastante información sobre las características de una muestra de DNA.

— Si la muestra es homogénea (carril 2 de la figura) sólo dará una banda, y podremos deducir su tamaño (que normalmente se expresa en pares de bases, bp) si disponemos de un patrón de DNAs de tamaños conocidos. Además, es posible recuperarla del gel por elución, en forma bastante pura, ya que estará libre de pequeñas moléculas del tipo de nucleótidos o fragmentos muy pequeños que se hubieran producido por ejemplo, por degradación inespe-

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cífica, o que fueran contaminantes de una reacción o manipulación anterior. También es posible caracterizarla posteriormente con la ayuda de sondas específicas por medio de hibridación, como veremos en el apartado siguiente. — Si la muestra es una mezcla (carril 1 en la figura) de distintos tipos de DNAs, de distintos orígenes, o distintos genes, o distintos fragmentos, siempre que existan diferencias de tamaños obtendremos bandas discretas, que podremos identificar por su tamaño, aislar y, si disponemos de sondas específicas, caracterizar, como más adelante veremos, por hibridación con sondas específicas. — Si la muestra es muy compleja (carril 3 en la figura), por ejemplo, una muestra de la totalidad del DNA humano tratada con la enzima de restricción EcoRI que tiene multitud de sitios de corte en el genoma humano y que por tanto genera una cantidad inmensa de fragmentos, lo que vamos a observar al teñir el gel, es una mancha continua de arriba a abajo del gel en lugar de bandas discretas, esto significa que tenemos fragmentos prácticamente de todos los tamaños, y resulta imposible encontrar, identificar o aislar directamente el de interés. Pero aún en este caso, la utilización posterior de una sonda específica y la hibridación, nos va a revelar la posición de un determinado gen o fragmento entre la enorme colección generada y así, cortando la zona y eluyendo su contenido, separarlo del resto.

5.11.

HIBRIDACIÓN CON SONDAS

En el apartado anterior, hemos hablado de la electroforesis como una de las técnicas más comúnmente utilizadas para la separación de DNAs. Pero para la identificación posterior de un determinado fragmento o gen es necesario disponer de alguna sonda ya conocida. Una sonda es un DNA aislado, purificado y ya identificado (también puede ser un RNA) que nos va a permitir identificar un DNA homólogo entre otros muchos desconocidos, o bien que nos va a permitir identificar un DNA de interés aunque totalmente «desconocido» pero que suponemos que tiene una cierta homología con el que utilizamos como sonda (por ejemplo, por ser un gen equivalente en una especie próxima). Este reconocimiento entre DNAs homólogos o que tienen una cierta homología se basa en el proceso de hibridación de ácidos nucleicos. Cuando un DNA se somete a temperaturas elevadas (normalmente >80 °C) o a tratamientos con álcalis, se produce una rotura de los puentes

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de hidrógeno y como consecuencia una separación de las dos cadenas de la doble hélice, proceso que se conoce como desnaturalización del DNA. En determinadas condiciones y volviendo a bajar la temperatura se produce de nuevo una reasociación o renaturalización de las cadenas complementarias. Este proceso de apareamiento también puede ocurrir entre DNAs heterólogos pero que tengan pequeñas regiones con homología de secuencia y también entre un RNA y su cadena de DNA complementaria. Este es el proceso que se conoce como hibridación de ácidos nucleicos y que es la base de la utilización de sondas para la identificación de DNAs. La utilización de sondas para la identificación de fragmentos de

FIGURA 5.5a. Esquema de la técnica de Southern Blot y detección de fragmentos de DNA con sondas específicas marcadas.

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FIGURA 5.5b. Caracterización de un gen clonado. El método de transferencia de DNA (DNA blotting) se utiliza para caracterizar el DNA clonado, para localizar el fragmento de DNA que contiene el gen de interés dentro de una mezcla de muchos fragmentos.

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DNA o de genes se basa en la hibridación de regiones con bases complementarias. Se pueden variar las condiciones de hibridación de forma que ésta puede tener lugar aunque dos genes sólo tengan algunas regiones de homología, ésta es la base para identificar genes de especies diferentes que conserven cierto grado de homología. Una vez que los fragmentos de DNA han sido separados mediante electroforesis, es necesario transferirlos a un soporte sólido antes de la hibridación, ya que ésta no se puede realizar directamente en el gel. Normalmente se transfieren por capilaridad a un papel especial de nitrocelulosa o de nylon, donde los ácidos nucleicos quedan fuertemente adheridos, de ésta forma en el papel tendremos una réplica del gel. Este procedimiento de transferencia del DNA del gel al papel se conoce, en la jerga científica, con el nombre de Southern Blot. De forma equivalente se realiza con RNAs, Northern Blot, e incluso la técnica es utilizada también en el caso de proteínas, Western Blot, aunque en este caso los procesos son diferentes y la identificación posterior suele estar basada en detección por medio de anticuerpos específicos (Figura 5.5a y b). Las sondas que se utilizan para identificar un determinado fragmento o banda deben estar «marcadas», y el procedimiento más común es que tengan nucleótidos con elementos radiactivos como por ejemplo 32P o 32 S. Hoy día se utilizan sistemas alternativos a la radiactividad basados en la presencia de nucleótidos modificados químicamente, de forma que posteriormente a la hibridación podamos revelar, esto es, localizar visualmente las bandas positivas donde tuvo lugar la hibridación. Los procesos de revelado dependen del tipo de marcado químico que lleve la sonda, puede ser por ejemplo, una molécula fluorescente que emite a una determinada longitud de onda, o algún tipo de sustancia que puede ser detectada por un anticuerpo específico. La hibridación con sondas también permite localizar fragmentos de DNA o genes dentro de las células, y localizar su posición en los cromosomas, ésta es la técnica denominada «hibridación in situ».

5.12.

SECUENCIACIÓN DE DNA

La variabilidad de las moléculas de DNA radica en la ordenación y la cadencia de los cuatro nucleótidos que forman su molécula, esto es su secuencia. La secuencia explica las diferencias entre genes que van a dirigir caracteres o funciones muy diferentes. Incluso pequeños cambios en la secuencia permiten la existencia de formas alélicas de un mismo gen

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que van a dar formas alternativas de un mismo carácter o función. Diferencias mínimas en las secuencias, incluso de una única base, puede representar cambios importantes en el producto de un gen y por tanto en la función del mismo. Hoy día podemos conocer la secuencia de cualquier DNA siempre que se disponga de una cantidad suficiente para realizar las reacciones de secuenciación. La secuenciación de DNA es un proceso que se lleva a cabo en la mayoría de los laboratorios de forma rutinaria y con frecuencia en aparatos de secuenciación automática. Existen básicamente tres métodos de secuenciación: 1. El llamado método químico que propusieron Maxan y Gilbert en 1977, basado en marcar los extremos del DNA con nucleótidos radiactivos, marcados en sus extremos fosfato (P32), y en ir fragmentando secuencialmente con reacciones químicas específicas para cada una de las cuatro bases. 2. El método enzimático ideado por Sanger en 1981, uno de los más usados en la actualidad, se basa en la síntesis de una cadena complementaria a la que se quiere secuenciar, y en la utilización de didesoxinucleótidos trifosfato que al carecer de grupos OH, tanto en el carbono 2′ como en el 3′ de la desoxirribosa, impiden la polimerización posterior parando la síntesis de la cadena. Se parte de cuatro alícuotas o mezclas de reacción independientes y se trabaja en paralelo en cuatro viales diferentes. Cada uno de ellos contiene la DNA polimerasa, generalmente se utiliza la Klenow o la secuenasa, los cuatro desoxinucleótidos (dATP, dGTP, dCTP, dTTP) marcados, generalmente radiactivos aunque hoy día suelen utilizarse otros métodos de marcado alternativos, y en cada uno de los viales se incluye un único didesoxinucleótido diferente que al incorporarse a la cadena en síntesis parará la reacción debido a que el didesoxi no posee el extremo 3´OH libre sobre el cual debe continuar la polimerización. Así, en cada uno de los viales se sintetizarán cadenas incompletas, ya que la síntesis parará al llegar a una posición en la que se incorpore el nucleótido didesoxi correspondiente. En cada uno de los tubos o viales tendremos una colección de fragmentos de distintos tamaños, tantos como lugares de la base didesoxi correspondiente existan en la secuencia. Al separar mediante electroforesis, en un único gel pero en cuatro carriles diferentes, los fragmentos generados en cada uno de los cuatro viales, podremos ir leyendo de abajo hacia arriba la secuencia de bases por la longitud creciente de los fragmentos en cada uno de los cuatro carriles (Figura 5.6).

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FIGURA 5.6. Secuenciación de DNA. Uno de los métodos para determinar la secuencia de bases de un fragmento de DNA implica la síntesis de la cadena complementaria utilizando la DNA polimerasa, didesoxinucleótidos trifosfato y radioisótopos. El procedimiento se basa en la incorporación al azar de los nucleótidos teniendo en cuenta que cuando se incorpora un didesoxi la cadena se para ya que no puede seguir polimerizando. Se realizan cuatro reacciones en paralelo y en cada una de ellas hay la cadena molde a copiar (que se desea saber su secuencia), la DNA polimerasa, los cuatro nucleótidos trifosfato radiactivos y uno de los didesoxinuleótidos. Los productos de síntesis de cada uno de los cuatro tubos se separan en función de su tamaño en una electroforesis en gel, cargan en cada uno de los cuatro carriles paralelos el contenido de cada uno de los cuatro tubos en los que se ha llevado a cabo las reacciones de polimerización. El gel se «lee» de abajo hacia arriba y nos dará la secuencia de la cadena complementaria a la que se usó como molde.

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3. En el método de secuenciación automática, realizado en un aparato secuenciador, el fundamento es el mismo del anterior, sólo que después de hacer la electroforesis no es necesario el revelado de película para detectar los distintos fragmentos generados, ya que se emplean nucleótidos marcados con 4 fluorocromos diferentes, uno para cada base (generalmente fluoresceína, NDB, rodamina y rojo de Texas), y éstos son detectados por un láser que identifica los fluorocromos correspondientes. Los resultados son procesados por un ordenador que suministra la secuencia. Del orden de 1.000 bases pueden ser identificadas por éste procedimiento. El problema para secuenciar fragmentos grandes del tamaño de genes es que hay que recurrir a trocearlos en tamaños que puedan ser secuenciados con fiabilidad, y posteriormente solapar el puzzle de fragmentos hasta alcanzar la secuencia completa del gen (Figura 5.7).

FIGURA 5.7. Resultados de la secuenciación automática de un fragmento de DNA. Cada pico corresponde a una base, las bases se distinguen por colores, A: verde, C: azul, T: rojo y G: negro.

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La secuenciación de genomas completos avanza a pasos de gigante, desde que en 1997 se obtuvo la primera secuencia completa del genoma de un organismo eucariota, la levadura S. cerevisiae, hasta la secuenciación del genoma humano anunciada en febrero de 2001, ha transcurrido mucho menos tiempo de lo que los pronósticos más optimistas habían vaticinado. Las bases químicas y enzimáticas son las mismas que se han comentado para fragmentos de DNA, pero el mayor problema que hay que enfrentar en la secuenciación de genomas es el manejo y la ordenación de inmensas cantidades de datos (letras) que hay que «leer» recurriendo a programas informáticos cada vez más sofisticados. Sin embargo, el verdadero reto para los años venideros es «entender» lo que «leemos» en el libro de los genomas que al fin hemos logrado abrir.

5.13.

REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR)

La reacción en cadena de la polimerasa, conocida por sus iniciales PCR (del ingles: Polymerase Chain Reaction), es una ingeniosa técnica que permite obtener en pocas horas millones de copias de cualquier fragmento de DNA en un tubo de ensayo, es decir «in vitro». Éste método de amplificar DNA fue ingeniado por Kary Mullis (1985), que recibió por ello el Premio Nobel en 1993, y desarrollado por numerosos científicos que trabajaban con él en la empresa Cetus Corporation. Ésta técnica ha revolucionado el trabajo en los laboratorios ya que hace innecesario, en muchos casos, recurrir a células para clonar un gen o un fragmento de DNA, proceso más complejo y tedioso, para tener muchas copias del mismo. Con esta técnica se logra la clonación acelular de moléculas de DNA, sin intervención de células, solamente con enzimas en un tubo de ensayo. Pero sobre todo hay que resaltar que tiene una enorme versatilidad y que son muchísimas las aplicaciones prácticas de la PCR que han ido surgiendo tanto en investigación básica como aplicada. Esta técnica mimetiza el proceso de replicación del DNA, tal y como ocurre «in vivo» en el interior de la célula, pero en un tubo de ensayo y utilizando una DNA polimerasa muy especial: la Taq DNA polimerasa, de la cual ya hemos hablado al principio del tema. Esta enzima procede de una bacteria llamada Thermus aquaticus que vive en las fuentes termales del parque nacional de Yelowstone en USA, y que es capaz de funcionar a una temperatura óptima de 75°C. Además del DNA molde que se desea amplificar y de la enzima Taq que hará el trabajo, se necesitan dos oligonucleótidos complementarios a los extremos del DNA molde que actuarán como cebadores o «primers», para que la polimerasa Taq sin-

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tetice el fragmento de DNA comprendido entre ambos oligonucleótidos flanqueantes, su papel es por lo tanto de iniciadores y a la vez delimitarán el fragmento a amplificar. La estrategia de la técnica se basa en producir modificaciones bruscas pero muy controladas de la temperatura, de manera que primero se eleva para provocar la separación de las dos cadenas de DNA para que se puedan replicar, a continuación se baja para favorecer el apareamiento de cada hebra con los oligonucleótidos complementarios, que harán de cebadores o primers para iniciar la replicación, por último se modifica de nuevo para favorecer la replicación, y esto se repite cíclicamente. El proceso se realiza en un pequeño vial donde se añaden todos los elementos necesarios: el DNA a amplificar, los cuatro nucleótidos trifosfato en grandes cantidades (dATP, dGTP, dTTP, dCTP), así como la Taq DNA polimerasa (termorresistente) y los «primers», pequeñas secuencias de unos pocos nucleótidos complementarios a los extremos 3′ del DNA a amplificar que actuarán como iniciadores de la replicación (Figura 5.8).

FIGURA 5.8. Esquema de las etapas fundamentales de la reacción de PCR.

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La reacción ocurre en tres etapas: en primer lugar, se eleva la temperatura hasta los 95 °C durante unos 30 segundos, para provocar la desnaturalización o separación de la doble hélice en las dos cadenas por rotura de los enlaces de hidrógeno y consiguiente desapareamiento de las bases complementarias. A continuación, se enfría el vial hasta 55 °C durante unos 20 segundos, a esta temperatura se favorece el apareamiento de los «primers» con sus bases complementarias que encuentran en el DNA de la muestra. Finalmente, se sube de nuevo hasta los 72 °C, ésta es una temperatura óptima para que la Taq polimerasa comience a replicar, incorporando nucleótidos sobre los primers sintetizando una copia completa y exacta de la cadena molde comprendida entre los dos primers. Este proceso se repite varias veces. Cada ciclo, con sus tres etapas: separación de las cadenas, apareamiento de los primers, y síntesis de la cadena complementaria, ocurre en el mismo vial y dura menos de dos minutos. Al final del ciclo la pieza de DNA ha sido duplicada. El ciclo se repite entre 30 y 50 veces y en cada nuevo ciclo, las nuevas cadenas recién sintetizadas en el anterior actuarán también como moldes, provocando una amplificación exponencial del DNA. Así, después de 30 ciclos, tendremos un millón de copias de una única molécula de DNA inicial. Hoy día, todo el proceso se realiza en un aparato específico denominado Termociclador que lleva un microprocesador para programar los cambios de temperatura y el número de ciclos deseado. Los tiempos y las temperaturas son variables que dependen de las características del DNA a replicar, y son función del contenido de bases y complejidad de la secuencia (Figura 5.9). En cierto modo esta técnica sustituye a la clonación, ya que permite amplificar un DNA, con la ventaja de que se puede partir de una cantidad ínfima de DNA, incluso aunque el DNA disponible sea el contenido en una única célula. Sin embargo, es necesario conocer las secuencias de los extremos del fragmento que se desea amplificar para diseñar los primers. Este es un requisito que en cierto modo limita el uso de esta técnica, pero hoy día se dispone de estrategias para poder proceder a amplificar incluso en el caso de que se trate de secuencias desconocidas. La PCR tiene una utilidad extraordinaria para aplicaciones forenses y policiales, para analizar DNA de fósiles y restos arqueológicos, etc., es decir, situaciones en las que se parte de cantidades tan mínimas de DNA que harían imposible su amplificación mediante el clonaje en bacterias. Por ejemplo, son suficientes 2 microlitros de sangre, menos de uno de semen, 20 de saliva o bien un único pelo con raíz, para extraer el DNA necesario (50 nanogramos aproximadamente) para amplificar por PCR y con sondas específicas ser capaces de inculpar o exculpar a un sospechoso.

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FIGURA 5.9. Reacción en cadena de la polimerasa. La PCR permite amplificar un determinado fragmento de DNA siempre que se disponga de pequeñas secuencias complementarias correspondientes a los extremos, estas secuencias actúan como cebadores para la síntesis. El proceso se inicia con la separación de la doble cadena inicial por desnaturalización mediante calor (1), sigue el emparejamiento de los cebadores (2) y a continuación la síntesis de las cadenas complementarias (3). El ciclo vuelve a iniciarse, se separan o desnaturalizan dos dobles hélices y ahora cada una de las cuatro cadenas hace de molde. En el siguiente ciclo habrá cuatro dobles hélices, por lo tanto ocho cadenas actuarán como moldes para síntesis. En el siguiente dieciséis, y así sucesivamente.

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Con respecto a las aplicaciones en arqueología hoy se puede considerar que se ha abierto una nueva especialidad la arqueología molecular, donde a partir de pequeñas muestras de un fósil, de las que se puede obtener suficiente DNA para amplificar, se puede tener una información exhaustiva de los genes para poder caracterizar, comparar y datar los genomas de los fósiles que de otra forma no seríamos capaces de obtener. La PCR se utiliza hoy día también exhaustivamente a nivel clínico, para la detección de enfermedades víricas (como por ejemplo el SIDA), de cánceres humanos determinando en este caso la posible existencia de oncogenes específicos que controlan el crecimiento celular y cuya alteración se asocia a determinadas formas de cáncer, también se aplica para determinar el tipo de genes de histocompatibilidad. En todos estos casos se parte de primers muy específicos que corresponden a los extremos del DNA cuya existencia queremos comprobar, por ejemplo el del virus del SIDA, de forma que si se logra la amplificación es que efectivamente el paciente tenía en sus células al menos alguna copia del virus o del gen en cuestión. Hoy día se han desarrollado variaciones muy interesantes de ésta técnica. Por ejemplo, la RT-PCR o retro-PCR que consiste en una amplificación de moléculas de RNA como paso previo para obtener un cDNA. El proceso se realiza en una sola operación utilizando simultáneamente, junto a los demás elementos necesarios para la PCR, una transcriptasa inversa. Actualmente se ha descubierto una DNA polimerasa de Thermus thermophilus, bacteria termorresistente, que tiene la particularidad de tener también actividad retrotranscriptasa. La PCR-inversa permite amplificar secuencias desconocidas vecinas o contiguas a una secuencia conocida. Se basa en obtener círculos de DNA como paso intermedio para posteriormente romperlos dejando la secuencia ya conocida en ambos extremos de la desconocida, y poder partir de los primers de la secuencia ya conocida para amplificar la desconocida. La PCR-asimétrica permite generar un gran número de moléculas de DNA pero de cadena sencilla de una de ellas, lo cual es muy útil ya que pueden ser utilizadas directamente para secuenciar. La PCR-in situ se lleva a cabo directamente en las células provenientes de tejidos o de cultivos y fijadas a un portaobjetos. Éstos se colocan en aparatos termocicladores especiales y para la reacción se utiliza alguno de los nucleotidos trifosfato «marcado» (con radiactividad, con fluorocromos

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o con otras moléculas que permitan su posterior detección por anticuerpos) de forma que se puede detectar posteriormente en los cromosomas y al microscopio el lugar donde ocurrió la amplificación, mediante hibridación «in situ» de las secuencias amplificadas.

5.14.

BIOCHIPS

A principios de los años noventa, se desarrolló una nueva tecnología denominada de los biochips. En ella confluyen la microelectrónica y la biología molecular junto con la química combinatoria, la informática y el tratamiento de señales. El chip de DNA (gene-chip o genome-chip) permite analizar en pocas horas los constituyentes de una mezcla compleja que contenga miles de secuencias diferentes de DNAs o de RNAs. Esta tecnología, que a veces se denomina también como DNA microarrays, tiene numerosas aplicaciones prácticas. Así es posible descubrir rápidamente mutaciones, saber con exactitud qué genes expresa una célula, determinar qué genes responden a un determinado tratamiento, o asegurarnos si un paciente tiene genes de un virus patógeno o de una bacteria infecciosa, o bien si tiene genes que están implicados en una determinada enfermedad hereditaria o con una base genética. Por ejemplo, para saber si una persona está infectada por un determinado virus sólo es necesario disponer de un minúsculo chip comercial que contendrá las secuencias de miles de virus patógenos y al aplicar una pequeña muestra se sangre del paciente, pocas horas después el ordenador nos dará la información precisa sobre la presencia o ausencia de alguno de éstos virus en el paciente en cuestión. Esta tecnología requiere el conocimiento previo de los genomas y por tanto su desarrollo depende de la existencia de bases de datos de secuencias de los diferentes organismos, cada vez más completas como consecuencia del apoyo económico a los proyectos de investigación y de secuenciación de genomas. El principio de esta tecnología explota la reacción de hibridación de los ácidos nucleicos que ya hemos comentado en diversos apartados de este tema y que está también en la base de otras muchas técnicas que hemos descrito someramente con anterioridad. Esta reacción de hibridación tiene su fundamento en que dos cadenas de DNA, o una de DNA y una de RNA o incluso dos de RNA, que tengan bases complementarias aparearán, es decir, se unirán por enlaces de hidrógeno y quedarán pegadas (algo equivalente a lo que ocurre con las dos caras de un VelcroR).

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La estrategia consiste en que podemos identificar un fragmento de DNA «desconocido» poniéndolo en presencia de miles de fragmentos de DNA de secuencia conocida que estarán fijos y localizados con total precisión en un microsoporte, de manera que aquél con el que hibride será su homólogo complementario. De la misma forma se pueden analizar simultáneamente miles de fragmentos de DNA. Las etapas, de forma esquemática, son las siguientes: Construcción del chip: El soporte puede ser de silicio, vidrio o un polímero, que se graba para formar una red densa y regular de miles de microsuperficies. La superficie útil total suele ser inferior a 1 cm2. Síntesis y localización de sondas: En cada una de las miles de microsuperficies se debe implantar una sonda de DNA de cadena simple y de secuencia conocida, con una localización determinada y precisa. Este es el paso más delicado y crucial donde entran en juego las más sofisticadas tecnologías desarrolladas por las empresas que compiten en la investigación y comercialización de esta tecnología puntera. Básicamente existen dos métodos alternativos: sintetizar las sondas de DNA directamente sobre el microchip o bien fijar en sitios definidos del chip sondas de oligonucleótidos previamente obtenidas en sintetizadores de DNA. En el primer método, utilizado por Affymetrix la empresa pionera en esta tecnología, la construcción de las sondas se hace por depósitos sucesivos de los cuatro nucleótidos (A, T, G, C). La fijación al soporte se realiza a través de grupos químicos fotolábiles y la ayuda de una máscara cuya geometría se hace variar a voluntad, de forma que al iluminar selectivamente las microsuperficies del chip, los grupos fotolábiles no protegidos reaccionan con el nucleótido correspondiente. Así la adicción de cada nuevo nucleótido requiere de diversos pasos, durante los cuales se modula la forma de la máscara. Las sondas sintetizadas no pueden tener longitudes largas, el número de bases está muy limitado ya que el proceso es muy complejo y se irían acumulando errores no deseables en la secuencias que se deben ajustar con precisión. El otro método consiste en el direccionamiento de los oligonucleótidos ya sintetizados, por medio de un multiplexado electrónico y su fijación a microelectrodos de oro. El depósito de las sondas sobre éstos se basa en una reacción electroquímica. Este trabajo lo realiza un robot. Cada chip puede contener de decenas a cientos de miles de cadenas de DNA distintas (sondas) fijadas en lugares precisos.

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Reacción de la muestra con las sondas: Cualquiera que sea el proceso utilizado para la construcción del DNA chip, la función de las sondas en él fijadas consiste en reconocer secuencias de DNA o de RNA de una mezcla compleja obtenida de una muestra biológica. Para ello es necesario ajustar las condiciones: el medio adecuado, el tiempo y la temperatura, para que se produzca la reacción de hibridación en aquel lugar o lugares donde se encuentren secuencias complementarias, si las hubiera. A continuación, se procede a un lavado exhaustivo para eliminar del chip aquellas secuencias de la muestra que no hubieran hibridado con ninguna sonda del chip. Detección: Finalmente no queda más que detectar y localizar los lugares donde se encuentran los productos de hibridación. La detección se hace por fluorescencia y la localización mediante escáner. El procesado de los datos se obtiene mediante complejos programas bioinformáticos en el ordenador. Actualmente existe una dura competencia y una guerra de patentes de nuevas tecnologías para la fabricación, diseño y comercialización de biochips. Como es lógico el futuro de esta tecnología, cuyo mercado potencial es inmenso, depende asimismo del avance en el conocimiento de la secuencia de los genomas para la disponibilidad de nuevas sondas, cuestión que lleva asociado también el problema legal y ético de las patentes de genes. Las aplicaciones de los DNA chip son revolucionarias en multitud de campos como el biomédico, farmacológico, agroalimentario, y en general constituye un elemento de enorme utilidad para la investigación genómica y para detectar con precisión los perfiles de expresión de los genes (Figura 5.10). Por poner sólo algún ejemplo, en el campo del análisis clínico se pueden desarrollar DNA chips para la detección de patógenos, virus y bacterias, en la sangre, las vías respiratorias y genitales. En el campo de la genética médica para la detección de genes tumorales, oncogenes y oncosupresores mutados; para el diagnóstico de enfermedades genéticas causantes de graves patologías hereditarias. En el campo agroalimentario para la detección de agentes infecciosos en muestras alimentarias (Salmonella, Listeria, Legionella, etc.), y para detección de fraude alimentario. Asimismo, en la misma línea pueden ser utilizados para la detección de patógenos en las aguas, en el aire, o en las cadenas de fabricación de productos farmaceúticos.

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FIGURA 5.10. Esquema experimental del estudio de expresión génica diferencial en dos tipos celulares mediante la técnica de DNA chips.

BIBLIOGRAFÍA BROWN, T. A.: Gane cloning and DNA analysis. An introduction (6.a ed.). WilleyBlackwell, 2010. CORTÉS, E. y MORCILLO, G.: Ingeniería genética: manipulación de genes y genomas. Colección Educación Permanente, UNED, 2002. IZQUIERDO ROJO, M.: Ingeniería genética y transferencia génica. Ediciones Pirámide, 1999. LUQUE, J. y HERRÁEZ, A.: Texto ilustrado de Biología Molecular e Ingeniería Genética. Ediciones Harcourt, 2001. PERERA, J., TORMO, A. y GARCÍA, J. L.: Ingeniería genética. Editorial Síntesis, 2002. PRIMROSE, S. B. y TWYMAN, R. M.: Principles of gene manipulation and genomics. Willey-Blackwell, 2006.

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Direcciones en Internet Cloning genes. The MIT Biology hipertextbook http://web.mit.edu/esgbio/www/rdna/cloning.html PCR site http://sunsite.berkeley.edu/pcr PCR manual http://www.roche-applied-science.com/PROD_INF/MANUALS/pcr_man/ start.html DNA micoarrays http://www.gene-chips.com http://www.bio.davidson.edu/courses/genomics/chip/chip.html

Tema 6 MICROOORGANISMOS Y ALIMENTOS FERMENTADOS

Uno de los campos más importantes de la Biotecnología de alimentos es la producción de alimentos fermentados. La fermentación de los alimentos producida por microorganismos, fundamentalmente bacterias y levaduras, ha sido utilizada por la humanidad desde hace miles de años como una importante forma de conservar y de obtener nuevos olores y sabores más agradables para los alimentos. En este tema se analizarán los distintos tipos de fermentaciones y algunos ejemplos de los alimentos y bebidas obtenidas por fermentación. Las aplicaciones de la ingeniería genética en la mejora de los procesos de fermentación de alimentos, inciden tanto en la obtención de las enzimas utilizadas en estos procesos, a partir de microorganismos modificados genéticamente, como en la modificación genética de los propios microorganismos que participan directamente y son responsables de las fermentaciones.

ESQUEMA DE CONTENIDOS 6.1. 6.2. 6.3. 6.4. 6.5. 6.6. 6.7. 6.8. 6.9.

6.10. 6.11. 6.12. 6.13. 6.14.

Microbiología de los alimentos fermentados Producción de pan Mejora de la levadura panadera por ingeniería genética Producción de vinos y cavas Levaduras vínicas transgénicas La producción de cerveza Levaduras cerveceras modificadas genéticamente Producción de bebidas alcohólicas destiladas Productos lácteos 6.9.1. El yogur y las leches fermentadas 6.9.2. Los quesos Biotecnología de las bacterias lácticas Fermentaciones cárnicas Fermentación de vegetales Los microorganismos como productores de enzimas Los microorganismos como alimento

6.1.

MICROBIOLOGÍA DE LOS ALIMENTOS FERMENTADOS

Durante miles de años la fermentación ha sido un proceso muy importante para la elaboración de alimentos. El crecimiento de microorganismos, bien sea de poblaciones naturales o inoculadas, provoca cambios químicos y de textura, creando nuevos olores y sabores más agradables para los alimentos. La fermentación ha sido también muy importante para la conservación de los alimentos, de tal forma que el producto final puede almacenarse durante un periodo de tiempo más prolongado. Sin embargo, hace tan sólo unas décadas que conocemos a los verdaderos protagonistas de estos procesos; son, fundamentalmente, las bacterias lácticas y las levaduras. Las bacterias que participan en la mayoría de estos procesos de transformación de los alimentos pertenecen a los géneros: Bifidobacterium, Lactococcus, Lactobacillus, Leuconostoc y Pediococcus. Las levaduras generalmente pertenecen al género Saccharomyces. La producción de un alimento fermentado es un proceso en el que un determinado sustrato de la materia prima, pudiendo ser ésta de origen animal o vegetal, sufre una transformación como consecuencia de las reacciones químicas del metabolismo de las células bacterianas o de las levaduras que crecen en él. Básicamente hay dos tipos de reacciones metabólicas responsables de estos procesos de transformación de los alimentos: la fermentación alcohólica, llevada a cabo por las levaduras del género Saccharomyces y la fermentación láctica producida por las bacterias lácticas.

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BIOTECNOLOGÍA Y ALIMENTACIÓN

❏

En la fermentación alcohólica se produce etanol y gas carbónico a partir de un azúcar. Diferentes azúcares pueden ser utilizados como sustrato. Ejemplos de fermentación alcohólica son la producción de vino o de la cerveza, donde los azúcares de la uva o del grano de cereales se transforman en etanol, o el de la producción de pan donde se produce el gas que hincha la masa.

❏

En la fermentación láctica, las bacterias lácticas aprovechan la lactosa, que es el azúcar más abundante en la leche, y producen el ácido láctico.

Antiguamente, cuando se desconocía la base biológica de los procesos de fermentación, los microorganismos responsables de las fermentaciones, o bien estaban de forma natural presentes en la materia prima, por ejemplo en la piel de la uva, o bien se inoculaban para iniciar el proceso, para lo cual se guardaba un resto de un proceso anterior, por ejemplo la madre del vinagre o de yogur. En cualquier caso, el desconocimiento de los microorganismos responsables de la transformación, hacía que los procesos de producción de alimentos fueran muy variables, unas veces salían bien y otras mal. La cantidad y la calidad del producto final dependía mucho del producto de partida o de la calidad del inóculo. Posteriormente cuando se descubrió el secreto de las fermentaciones, gracias a los trabajos de Pasteur, y se estableció que los microorganismos eran los actores de estos procesos, se identificaron las distintas especies que participaban en cada uno de ellos, y se logró un mayor control y reproducibilidad de los procesos de producción, ya que los microorganismos se añadían, de forma controlada, y libres de contaminantes. Junto a la floreciente industrialización de alimentos fermentados nacieron las compañías productoras de fermentos, así es como de forma no muy adecuada ya que es equívoca, se llamaba a los microorganismos responsables de las fermentaciones. Desde entonces se ha investigado con gran interés en la obtención de microorganismos mejorados en su metabolismo, y se han comercializado numerosas cepas más eficientes y rentables. La ingeniería genética ha permitido, precisamente en este campo de las fermentaciones, avances muy notables, ya que los microorganismos son mucho más fáciles de manipular para producir mejoras genéticas que las células de animales y vegetales, levantando, además, muchos menos recelos a nivel social. Actualmente son muchos los procesos industriales de producción de alimentos fermentados en los que participan bacterias y levaduras que han sido modificadas genéticamente mediante técnicas tradicionales de mutación y selección, pero aún no se ha aprobado el uso de organismos

MICROORGANISMOS Y ALIMENTOS FERMENTADOS

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transgénicos para estos procesos. Sin embargo, algunas de las enzimas comerciales que se utilizan como aditivos en algunos de estos procesos se obtienen a partir de microorganismos transgénicos. A continuación describiremos, brevemente, algunas características de los distintos tipos de alimentos fermentados, para, posteriormente comentar algunas mejoras logradas mediante la utilización de microorganismos genéticamente modificados (MGM).

6.2.

PRODUCCIÓN DE PAN

El pan es uno de los alimentos consumidos por el ser humano de mayor antigüedad. Los habitantes del Antiguo Egipto (3000 a. de C.) conocían este proceso. La utilización de levaduras para subir la masa del pan aparece representada en pinturas, y se ha desenterrado una panadería en la zona de la pirámide de Gizeh que se calcula suministraba pan a unas 30.000 personas. En el museo Británico hay muestras de pan que datan del año 2100 a. de C. En la antigua Roma, hacia el año 100 antes de nuestra era, la comercialización de este alimento era importante existiendo 250 panaderías. Para la producción de pan se parte de harina molida de trigo o de centeno. En el proceso intervienen un par de enzimas denominadas proteasas y amilasas (α y β), presentes en la masa húmeda, que liberan los azúcares sencillos, maltosa y sacarosa, de los azúcares complejos, almidón, presentes en las semillas del cereal y que serán utilizados como alimento para el crecimiento de las levaduras. A continuación se añade la cepa panadera de la levadura Saccharomyces cerevisiae, que crece y se multiplica alimentándose de los azúcares del grano. Este proceso se lleva a cabo, inicialmente, en condiciones aeróbicas, es decir en presencia de oxígeno, esto conduce a una máxima producción de CO2, gas carbónico, con una mínima producción de alcohol. Después sigue una etapa anaeróbica. El CO2 producido por la levadura hace subir la masa, y produce la suave textura de la miga, el resto de los productos de la fermentación contribuyen a su sabor. Durante la cocción se inactiva la levadura y se pierde el alcohol y el agua de la masa. Habitualmente los panaderos añaden suficiente levadura como para que el pan suba en 2 horas, cuanto más tiempo tarde más posibilidades hay de que crezcan otros microorganismos, bacterias y hongos contaminantes, haciendo el producto de peor calidad.

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BIOTECNOLOGÍA Y ALIMENTACIÓN

Utilizando mezclas más complejas de microorganismos se elaboran panes especiales, como las masas agrias. La levadura Saccharomyces exiguus junto con una especie de la bacteria Lactobacillus producen el característico sabor y aroma ácido de estos panes.

6.3.

MEJORA DE LA LEVADURA PANADERA POR INGENIERÍA GENÉTICA

La cepa panadera de la levadura Saccharomyces cerevisiae se produce a nivel industrial y se comercializa como levadura seca, en polvo, para su utilización en la industria de la panificación. Se producen y comercializan anualmente cerca de 2 millones de toneladas de este microorganismo. Las levaduras que actualmente se utilizan en las panaderías no son las mismas que se encuentran en la naturaleza. Al igual que las plantas cultivadas y los animales domésticos, las levaduras también han sido objeto de una selección genética y un desarrollo de las cepas. Así se han obtenido cepas que combinan unas potentes propiedades de fermentación de la masa con un aroma óptimo, junto con un alto rendimiento en la producción industrial. A pesar de la adecuación de las cepas panaderas tras años de selección y mejora por los métodos clásicos, la importancia económica de este proceso hace que se siga investigando activamente ya que son numerosas las características de la levadura y de los procesos de panificación que se pueden mejorar con el nuevo abordaje que permiten las técnicas de la ingeniería genética. Veamos algunos ejemplos. a)

Mejora de la producción de levadura para panificación

La producción de levadura se lleva a cabo en grandes tanques, a partir de un inóculo inicial que se hace crecer para obtener grandes cantidades de la levadura para su posterior comercialización. Para abaratar el proceso se utiliza como sustrato, o alimento para el crecimiento de las levaduras, melazas que son un subproducto de la industria azucarera. Las melazas son ricas todavía en azúcares, fundamentalmente sacarosa y rafinosa. El primero es utilizado por la levadura pero no así el segundo, ya que la levadura panadera carece de las enzimas necesarias para su metabolización. La enzima α-galactosidasa, capaz de romper la rafinosa, sí está presente en otras cepas de levadura que no son precisamente la panadera. Por ingeniería genética se ha logrado clonar el gen para esta enzima, procedente de otras variedades de levaduras e introducirlo en las cepas industriales panaderas. Estas cepas transgénicas son capaces de uti-

MICROORGANISMOS Y ALIMENTOS FERMENTADOS

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lizar con gran eficiencia las melazas, creciendo mejor y optimizando el rendimiento de su producción. La compañía finlandesa Alko, y un grupo de investigación de la Universidad de Sevilla, de forma independiente, han logrado levaduras transgénicas capaces de utilizar la rafinosa de las melazas. b)

Mejora de los procesos de panificación

Cuando la levadura se inocula en la harina para iniciar la fermentación comienza a crecer metabolizando los azúcares sencillos de la harina, como la sacarosa, la glucosa y la fructosa, para finalmente cuando éstos se agotan comenzar a utilizar la maltosa que proviene de la degradación del almidón, muy abundante en el grano. Cuanto más rápido consume la maltosa antes se produce el pan, por lo que sería óptimo que utilizara la maltosa desde el principio. La levadura necesita dos enzimas para degradar la maltosa y poderla aprovechar, pero los genes que codifican estas dos enzimas están reprimidos mientras en el medio haya otros azúcares más sencillos que puedan utilizar. La compañía holandesa Gist-Brocades ha producido una cepa modificada genéticamente, la levadura MAL. En esta cepa se han modificado los promotores, es decir las regiones responsables de la regulación de los genes que codifican las enzimas para la utilización de maltosa, de forma que las producen haya o no otros azúcares en el medio. El resultado es que metabolizan la maltosa desde el principio, aumentando la capacidad fermentativa y la producción de gas (CO2), y reduciendo el tiempo de panificación. Esta levadura MAL fue el primer microorganismo genéticamente modificado (OGM) para la producción de alimentos que obtuvo el permiso para su comercialización en Europa. Para favorecer la rotura del almidón de la harina y la producción de maltosa, a la masa se le añade de forma externa la enzima amilasa, ya que confiar en las propias enzimas endógenas de la harina hacen muy lento el proceso, y la levadura carece de ella. Esta enzima se extrae de otros microorganismos y una vez purificada se comercializa en forma de polvo, pero provoca importantes alergias e irritaciones en los trabajadores del sector originando frecuentes problemas de salud laboral. El grupo de Biotecnología de Alimentos del IATA del CSIC ha obtenido una levadura transgénica, que lleva el gen que codifica la amilasa de un hongo Aspergillus oryzae. Esta levadura produce la enzima amilasa, que degrada el almidón, evitando la adición de la enzima exógena, y produce un pan de excelentes características.

184

6.4.

BIOTECNOLOGÍA Y ALIMENTACIÓN

PRODUCCIÓN DE VINOS Y CAVAS

Las bebidas alcohólicas fermentadas se producen en todo el mundo a partir de los jugos de diversos frutos que contienen abundantes azúcares sencillos, de fácil utilización, como alimento para las levaduras. Se piensa que es el proceso de fermentación de alimentos más antiguo de todos los utilizados por el hombre, su descubrimiento se remonta a los orígenes de la humanidad. Para la producción de vino se utiliza el jugo de la uva o mosto, que se obtiene por prensado. Pueden elaborarse vinos a partir de los microorganismos naturales que se encuentran en la piel de las uvas, como se hacía en la antigüedad, o bien tratar el mosto con dióxido de azufre, para eliminarlos, y añadir la cepa deseada de forma controlada para iniciar el proceso. Tras la inoculación de Saccharomyces cerevisae o S. ellipsoideus, se deja fermentar el jugo de 3 a 10 días a temperaturas que oscilan entre los 20 y los 28 °C. Dependiendo de la tolerancia alcohólica de la cepa utilizada, el producto final de la fermentación puede contener entre 10 y 18% de alcohol. La clarificación y el desarrollo del sabor tienen lugar durante el proceso de envejecimiento, durante el cual se produce una fermentación final y se acumulan los compuestos saborizantes y los que dan el bouqué o aroma del vino (Figura 6.1). Todas las uvas producen jugos blancos, para elaborar vino tinto con uvas rojas, se deja la piel o el hollejo en contacto con el mosto para que libere los taninos responsables del color de la piel. Los niveles elevados de azúcar en el mosto hacen que el alcohol se acumule y se inhiba la fermentación antes de haberse consumido todo el azúcar produciendo vinos más dulces. El crecimiento microbiano durante la fermentación hace que se acumulen sedimentos, que se eliminan durante el proceso denominado trasiego. Pueden utilizarse muchas variaciones en el procesamiento posterior del vino. El vino puede destilarse después para fabricar un vino quemado o brandy. El jerez es un vino «encabezado», que contiene más alcohol, resultado de añadirle coñac durante la producción, cuyo sabor especial se logra exponiéndolo al aire, de forma que las levaduras puedan crecer en superficie. El jerez seco se logra dejando que la levadura se desarrolle plenamente, y el dulce parando el proceso.

MICROORGANISMOS Y ALIMENTOS FERMENTADOS

FIGURA 6.1. Proceso de elaboración de vino. Ilustración de Ramón González. Curso de Verano de la UNED. Ávila, 2002.

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BIOTECNOLOGÍA Y ALIMENTACIÓN

Pueden añadirse los microorganismos Acetobacter y Gluconobacter para que oxiden el etanol a ácido acético y obtener el vinagre de vino. Los cavas se producen a partir de un vino base al que se añade sacarosa y de nuevo levaduras para inducir una segunda fermentación en la propia botella, a la que sigue un proceso de envejecimiento (de alrededor de 9 a 12 meses) durante el cual tiene lugar la autolisis y la sedimentación de los restos de células de las levaduras. Al final del proceso se lleva a cabo el degüello o eliminación de las levaduras. La autolisis produce la liberación de componentes celulares al exterior que contribuye a la calidad de la espuma y flavor de estos vinos espumosos.

6.5.

LEVADURAS VÍNICAS TRANSGÉNICAS

De todos es conocido que las características de un vino difieren considerablemente de una zona geográfica a otra, de ahí las denominaciones de origen que distinguen unos vinos de otros. El clima, el tipo de suelo, la clase de uva pero también la levadura utilizada son algunas de las variables que condicionan las distintas zonas vinícolas. Uno de los problemas es la obtención de vinos con baja acidez, especialmente frecuente en las regiones cálidas. Se han desarrollado distintas levaduras transgénicas para solventar este problema. En el Instituto Nacional de Investigaciones Agronómicas de Montpellier se ha obtenido una cepa transgénica de levadura vínica que lleva un gen de la bacteria Lactococcus lactis de forma que la nueva levadura es capaz de realizar a la vez la fermentación alcohólica y la fermentación manoláctica. La acumulación de ácido láctico acidifica el vino sin detrimento de sus características organolépticas. El problema contrario es la elevada acidez que tiene algunos vinos tintos de determinadas regiones. Esto es debido a la acumulación de ácido málico que la levadura no es capaz de metabolizar. Durante años y para solventar este problema se ha añadido a los vinos acabados algunas bacterias lácticas como Lactobacillus, Leuconostoc o Oenococcus oeni que realizan la fermentación maloláctica, tienen una enzima capaz de descarboxilar el ácido málico que pasa a láctico y disminuye considerablemente el grado de acidez. Una colaboración de científicos de las Universidades de Sudáfrica, Burdeos en Francia y Canada han desarrollado una cepa de levadura vínica transgénica que lleva el gen de Lactococcus lactis que codifica para la enzima descarboxilasa, y puede realizar este proceso. Sin

MICROORGANISMOS Y ALIMENTOS FERMENTADOS

187

embargo, se comprobó que el málico presente en el mosto no entraba al interior de la levadura, su membrana era impermeable a este compuesto que la levadura normalmente no puede utilizar. Una pariente próxima, la levadura denominada Schizosaccharomyces pombe si tiene una proteína de membrana que transporta el málico a su interior. Se clonó el gen que la codifica y se añadió a la cepa de levadura vínica transgénica. Esta nueva levadura doblemente transgénica, con dos genes exógenos, es capaz de descarboxilar y eliminar el ácido málico del mosto. Uno de los campos más prometedores es el de la mejora de las características organolépticas, el sabor y el aroma de los vinos, que dependen de multitud de compuestos químicos muchos de ellos todavía desconocidos. El aroma de un vino es el resultado de la interacción de unos 500 compuestos volátiles distintos. Uno de los aromas más apreciados es el afrutado que depende de una serie de compuestos del grupo de los terpenos. Existen una serie de preparados comerciales de enzimas, extraídas de hongos filamentosos, que se añaden a los vinos para aumentar estos compuestos liberándolos del grano de la uva. Un grupo de científicos del IATA de Valencia ha obtenido diferentes cepas de levaduras vínicas transgénicas que contienen en su genoma genes de los hongos filamentosos Aspergillus y Trichoderma que codifican algunas de estas enzimas, logrando un aumento significativo de este apreciado aroma. Otros objetivos interesantes que se tratan de abordar es conseguir cepas modificadas que eviten la aparición en el vino de la sustancia cancerígena etil-carbamato, que permitan reducir los problemas de turbidez causados por proteínas, o que eviten las paradas de fermentación que ocasionalmente se producen.

6.6.

LA PRODUCCIÓN DE CERVEZA

Los antiguos sumerios producían cerveza, unos 6.000 años a. de C., siguiendo, en esencia, los mismos métodos que utilizan hoy día las compañías cerveceras. En la producción de cervezas se utilizan granos de cereales como la cebada, el trigo y el arroz. Los granos de cereales son ricos en materiales de reserva, como almidón y otros polímeros complejos que, para poder ser utilizados como alimento por las levaduras, deben ser hidrolizados a azúcares más sencillos. Para transformar los hidratos de carbono complejos del grano en sustratos fermentables se requieren una serie de pro-

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BIOTECNOLOGÍA Y ALIMENTACIÓN

cesos de preparación hasta obtener una masa líquida que sea utilizable por las levaduras. El primer paso es el malteado, que consiste en hinchar el grano suministrando determinadas condiciones de temperatura y de humedad de manera que comience a germinar, de forma que las propias enzimas (amilasas) presentes en las semillas inicien el proceso de degradar el almidón. Este proceso hay que pararlo a tiempo para evitar la total germinación del grano, por lo que se tuesta o se hierve para que se inactiven las enzimas. Después del secado y la molienda, se mezcla con agua y se pasa a una cuba donde se realiza una actividad enzimática adicional para completar la degradación del almidón hasta obtener dextrinas y maltosa, es el proceso de sacarificación. A continuación, el mosto de malta obtenido se calienta y se le añade lúpulo, obtenido a partir de las flores femeninas de la planta trepadora Humulus lupulis, que originalmente se añadía para inhibir a los microorganismos descomponedores que contaminan el mosto. Es una planta de la familia de las Canabinaceas, a la cual pertenece el Cannabis sativa, de la que se obtiene la marihuana y el hachís. El lúpulo contiene unas resinas y aceites esenciales que proporcionan el sabor ligeramente amargo y característico de la cerveza y contribuye también a la clarificación del mosto. El calentamiento inactiva las enzimas hidrolíticas del mosto y, finalmente, puede ser inoculado con la cepa de levadura deseada para iniciar la fermentación. La mayoría de las cervezas se fermentan con la levadura Saccharomyces carlsbergensis, que sedimentan en el fondo de la cuba de fermentación, y requiere de 7 a 12 días de fermentación produciendo una cerveza con un pH de 4,2. La producción de pequeñas cantidades de ácido acético y de glicerol contribuye al sabor de la cerveza. Con las levaduras de superficie Saccharomyces cerevisiae se obtiene la cerveza tipo ale con un pH más bajo de aproximadamente 3,8. Las cervezas recién fermentadas o verdes se almacenan para dejarlas envejecer, lager. La cerveza puede esterilizarse haciéndola pasar por filtros o pasteurizarse a 60 °C, al embotellarla suele añadirse CO2. En las distintas regiones se producen diferentes tipos de cervezas con ingredientes y técnicas de elaboración especiales. En algunos sitios de Sudamérica y Oriente Medio la técnica tradicional empleaba saliva humana, que contiene muchas enzimas hidrolíticas, para convertir el almidón del grano en azúcares sencillos utiliza-

MICROORGANISMOS Y ALIMENTOS FERMENTADOS

189

bles por la levadura. Así, una técnica de elaboración de los indígenas de Sudamérica pasa por masticar el grano de maíz, que se escupía al recipiente donde posteriormente sufría una fermentación espontánea.

6.7.

LEVADURAS CERVECERAS MODIFICADAS GENÉTICAMENTE

La producción de cerveza es un proceso muy desarrollado tecnológicamente, ya que las compañías cerveceras se han caracterizado por un alto grado de innovación. Sin embargo, siguen existiendo diversos problemas que la nueva Biotecnología está tratando de resolver. Uno de los procesos más costosos es el filtrado que se debe realizar al final del proceso de fabricación para eliminar unos polimeros lineales de glucosa, denominados β-glucanos, que provienen del grano de cebada y que la levadura no es capaz de eliminar. Se puede evitar añadiendo a los fermentadores una enzima, β-glucanasa, que rompe estos polímeros, y que se extrae para su comercialización a partir de un hongo filamentoso, pero estos preparados no son muy homogéneos y suelen contener impurezas. Se han diseñado levaduras cerveceras transgénicas que contienen el gen que codifica para esta enzima. Un equipo de científicos finlandeses ha tomado el gen del hongo Trichoderma reesei, mientras que un equipo de biotecnólogos del IATA y del Centro de Biología Molecular del CSIC, han diseñado una levadura equivalente pero con el gen que proviene del hongo Trichoderma longibrachiatum. En ambos casos, las levaduras transgénicas son capaces de secretar la enzima β-glucanasa al mosto, produciendo una cerveza libre de β-glucanos, y con las mismas características organolépticas que la cerveza convencional. Otro problema tecnológico en la producción de cervezas es la acumulación de diacetilo al final de la fermentación, lo que confiere a la cerveza un sabor dulce. Es un compuesto volátil por lo cuál para eliminarlo se debe mantener la cerveza entre dos y seis semanas, la guarda, en los tanques de fermentación. Así se volatiliza este producto, pero supone una pérdida considerable de eficiencia ya que los fermentadores quedan bloqueados para su uso en una nueva producción. La acumulación de diacetilo se produce por una reacción espontánea de descarboxilación del α-acetolactato. Algunas bacterias tienen una enzima capaz de convertir el α-acetolactato en acetoína, un compuesto que no afecta para nada al sabor de la cerveza. Diversos grupos científicos de la Universidad de Berlín, de la compañía cervecera japonesa Kirin y del Instituto VTT de

190

BIOTECNOLOGÍA Y ALIMENTACIÓN

Finlandia, han diseñado distintas cepas de levaduras cerveceras transgénicas que llevan en su genoma genes que provienen de las bacterias Acetobacter aceti (utilizada para la producción de vinagre) o de Enterobacter aerogenes. Estos genes codifican enzimas capaces de transformar el α-acetolactato en acetoína, con lo cual estas levaduras producen una excelente cerveza libre de diacetilo sin necesidad de la práctica de la guarda. Pero no todos los esfuerzos se centran en resolver problemas técnicos, gran parte de las investigaciones se dirigen también a la búsqueda de productos de mayor calidad organoléptica. Por ejemplo, investigadores de la compañía cervecera Carlsberg han diseñado una levadura capaz de acumular sulfito. Esta levadura ha sido modificada genéticamente de forma que se le ha eliminado el gen que codifica le enzima sulfito reductasa. La cerveza producida con esta levadura tiene mayores niveles de sulfito que le confiere un sabor y un aroma mucho más apreciado. Otro de los aspectos que tiene un gran interés comercial por las ventajas dietéticas que conlleva es la producción de cervezas bajas en calorías. La cerveza es una bebida que engorda, porque tiene un alto nivel energético, debido a que contiene todavía muchas dextrinas y otros hidratos de carbono derivados del almidón que no fueron consumidos por las levaduras durante el proceso de fermentación. Como venimos comentando para otros casos, la solución a este problema es relativamente sencilla. Se compran enzimas que se añaden a los tanques de fermentación, y hacen la labor que no realizan las levaduras, degradan estos compuestos y se obtienen cervezas bajas en calorías. Pero lo que no es tan sencillo, es la comercialización de preparados enzimáticos, extraídos de otros microorganismos, que se encuentren altamente purificados, generalmente contienen impurezas ya que las enzimas por ser muy similares unas a otras estructuralmente, son muy difíciles de purificar a no ser que se empleen métodos que implican una elevada inversión económica, lo cuál sólo es rentable para los preparados farmacológicos. Mucho más «limpio», seguro y económico resulta cuando a la levadura se le incorpora un gen que produce única y exclusivamente la enzima deseada. Así, las compañías cerveceras inglesas Bass y BRL han comercializado distintas cepas de levaduras transgénicas, una de ellas porta un gen de otra levadura Saccharomyces diastaticus, pariente próximo de la cervecera, o bien de un hongo filamentoso. Estos genes producen una enzima denominada glucoamilasa, que degradando los compuestos residuales altos en energía, producen una cerveza indistinguible de la tradicional pero baja en calorías.

191

MICROORGANISMOS Y ALIMENTOS FERMENTADOS

6.8.

PRODUCCIÓN DE BEBIDAS ALCOHÓLICAS DESTILADAS

Los alcoholes destilados se elaboran mediante una extensión de los procesos de fermentación. El líquido fermentado se cuece y los compuestos volátiles se condensan, de forma que se obtiene un producto con un contenido alcohólico mucho más elevado. Las diferentes bebidas alcohólicas se obtienen todas por fermentación y destilado posterior, pero difieren en las materias primas de partida, que serán utilizadas como alimento en el proceso de fermentación por las diferentes cepas y variedades de levaduras responsables del proceso. El whisky se elabora a partir de granos de centeno (debe contener al menos un 51%), mientras que el bourbon, variante americana del whisky, se elabora a partir de maíz (al menos un 51%). El whisky escocés de malta se compone principalmente de cebada, y se elabora inoculando Lactobacillus delbrueckii en el mosto de malta. Esta bacteria produce una fermentación homoláctica, capaz de reducir el pH a 3,8 en unas 10 horas. Muchas de estas bebidas contienen agentes saborizantes específicos que les confieren su peculiaridad. Así, por ejemplo, la ginebra es como el vodka, pero se le añaden bayas de enebro que le confieren un sabor único. En la Tabla 6.1 se recogen las principales bebidas alcohólicas y la materia prima a partir de la cuál se realiza la fermentación. TABLA 6.1 Bebidas alcohólicas

Materia prima

Cerveza

Cebada

Vino

Uva

Sidra

Manzana

Sake

Arroz

Whisky escoces

Cebada

Whisky irlandes

Cebada, trigo, arroz

Whisky de arroz

Arroz

Bourbon

Maíz

Ron

Caña de azúcar

Vodka

Patatas

Ginebra

Maíz, arroz

Tequila

Cactus

192

6.9.

BIOTECNOLOGÍA Y ALIMENTACIÓN

PRODUCTOS LÁCTEOS

Existen multitud de productos alimenticios obtenidos de la leche por fermentación, con aromas, sabores y texturas muy diferentes dependiendo del microorganismo utilizado y de las condiciones de la fermentación. Todos se basan en el mismo proceso que es una fermentación láctica en la que frecuentemente intervienen bacterias de los géneros Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc y Streptococcus. Las bacterias se alimentan del azúcar de la leche, la lactosa, y la metabolizan produciendo como resultado ácido láctico. La producción de ácido láctico, debido al crecimiento microbiano, produce una bajada del pH y, como consecuencia una desnaturalización de las proteínas, especialmente la caseína, muy abundantes en la leche. Las proteínas desnaturalizadas precipitan, provocando la coagulación de la leche y la formación del cuajo.

6.9.1.

El yogur y las leches fermentadas

El yogur se produce a partir de la leche por un cultivo iniciador especial en el que principalmente hay dos tipos de bacterias en proporción 1:1, Streptococcus thermophilus y Lactobacillus bulgaricus. Estos dos tipos de microorganismos crecen a la vez, el primero produce ácido, mientras que los componentes del aroma son producidos por los Lactobacillus. El yogur recién preparado contiene 109 bacterias por gramo. La crema agria, el kefir, que además de las bacterias del yogur lleva levaduras Saccharomyces, la mantequilla, y otros muchos productos son obtenidos con distintas mezclas de bacterias y con leches de distintos orígenes, vaca, cabra, oveja. Las leches fermentadas pueden tener efectos beneficiosos para la salud, ya que muchos de los microorganismos de los productos lácteos estabilizan la flora intestinal de microorganismos, reducen la intolerancia a la lactosa, disminuyen el colesterol sérico, y algunos tienen compuestos con efectos antitumorales. En concreto, a los Lactobacillus acidophilus y a las especies del género Bifidobacterium, que hoy día se añaden a numerosos derivados lácteos, se les atribuyen muchas propiedades beneficiosas para la salud.

MICROORGANISMOS Y ALIMENTOS FERMENTADOS

6.9.2.

193

Los quesos

Se cree que la producción de queso se desarrolló hace unos ocho mil años. No se puede hablar de queso sino de quesos, ya que en todo el mundo se producen unas 2.000 variedades diferentes, aunque representan unos 20 tipos de quesos, bastante diferentes entre sí. Con frecuencia los quesos se clasifican en función de la textura o la dureza, como quesos blandos (por ejemplo, requesón, queso de Burgos, Brie), quesos semiblandos (azules, Roquefort, Muenster), duros (Manchego, Cheddar, Gouda, Emmental) y muy duros (Parmesano). Todos los tipos de quesos se deben a la fermentación láctica inicial de la leche, que puede ser de distintos orígenes, vaca, oveja, cabra, búfala y mezclas, que provoca la formación del coágulo. La renina o quimosina, una enzima obtenida antiguamente del estómago de los terneros aunque hoy día se comercializa la obtenida por ingeniería genética, también se ha usado tradicionalmente para favorecer la formación del coágulo. Una vez que éste se ha formado, se calienta y se exprime para eliminar la parte acuosa de la leche o suero. Después de salarlo se somete a un proceso de maduración posterior con otros microorganismos, que generalmente son distintos géneros de hongos. Por ejemplo, el Penicillium roqueforti, del roquefort; el Penicillium camemberti, del Camembert y el Brie. Este proceso es el que confiere la textura, el sabor y el aroma característico de los distintos tipos de quesos. La dureza final del queso depende en parte de la duración del proceso de maduración. Los quesos blandos se dejan madurar entre 1 a 5 meses, los duros requieren de 12 a 16 meses de maduración. En los quesos suizos, Emmental, Gruyere, la producción de gas por Propionibacterium provoca la formación de los ojos o agujeros, típicos de estos quesos.

6.10.

BIOTECNOLOGÍA DE LAS BACTERIAS LÁCTICAS

Un grave problema para las industrias de derivados lácteos y que ocasiona serios trastornos son las paradas de fermentación que ocurren accidentalmente. Dado el alto precio de la materia prima, la leche, y las cantidades que se procesan en las grandes industrias queseras, que pueden llegar a los 500.000 litros al día, un accidente de este tipo hace que se pierda la leche y ocasiona perdidas económicas elevadas. Diversos factores pueden contribuir a que se produzcan paradas en el proceso de fermentación. La presencia de inhibidores naturales en la leche,

194

BIOTECNOLOGÍA Y ALIMENTACIÓN

como por ejemplo la nisina producida por determinadas bacterias; la presencia de antibióticos que matan a las bacterias como consecuencia de tratamientos previos de infecciones en las ubres de las vacas; y, la presencia de virus que atacan a las bacterias responsables de la fermentación láctica. Estos virus especializados en atacar bacterias se conocen con el nombre de bacteriófagos. Este es uno de los factores sobre los que más se investiga para tratar de evitar la parada de fermentación. El problema es complejo, ya que hay muchos tipos de bacteriófagos y son muy específicos para cada una de las cepas bacterianas. Pero también hay cepas resistentes al ataque. Se trata de conocer los mecanismos de resistencia y de obtener cepas modificadas genéticamente para conferir resistencia, pero el problema es que los bacteriófagos mutan y cambian muy rápidamente. Un grupo de científicos de la Universidad de Carolina del Norte ha obtenido Lactobacillus resistentes a un determinado fago, ya que porta en su genoma una copia antisentido de parte del genoma del virus que logra inactivarlo. El metabolismo de la lactosa se inicia en los lactococos con el transporte de este azúcar al interior de la bacteria y su posterior fosforilación. Los genes que codifican las enzimas implicadas en estos dos procesos se encuentran en un plásmido conjugativo, lo que conlleva a una gran inestabilidad de estos genes. Uno de los avances biotecnológicos más importantes en este campo ha sido la estabilización de la fermentación de la lactosa en las cepas industriales por integración de estos genes en el cromosoma bacteriano. También se trata de mejorar la calidad de los productos lácteos. Una de las vías que se aborda es la de estabilizar determinados genes de las bacterias lácticas implicados en la producción de compuestos relacionados con el aroma y el sabor. Las bacterias lácticas tienen algunas enzimas denominadas genéricamente proteasas, que actúan sobre las proteínas de la leche liberando compuestos que contribuyen al aroma y al sabor. Pero estas enzimas están codificadas por genes que se localizan en plásmidos, moléculas de DNA extracromosómicas que se pierden con relativa facilidad, con lo que estos genes son muy inestables. Se han conseguido algunas cepas modificadas genéticamente de forma que portan estos genes en el cromosoma bacteriano haciendo que sean mucho más estables, y aseguran la degradación de la caseína a lo largo de todo el proceso de fermentación. Otro de los problemas que se trata de solventar es una situación inversa a la que comentamos en la producción de cerveza donde la acumulación de diacetilo no es deseable, y para ello se han obtenido levaduras transgénicas capaces de eliminarlo. En el caso de la mantequilla es precisamente la presencia de diacetilo lo que le confiere su aroma carac-

MICROORGANISMOS Y ALIMENTOS FERMENTADOS

195

terístico, sin embargo las bacterias lácticas, a diferencia de las levaduras tienen enzimas capaces de eliminarlo. Se han obtenido cepas modificadas genéticamente a las que les ha sido eliminado el gen que codifica la enzima que destruye este compuesto.

6.11.

FERMENTACIONES CÁRNICAS

Las carnes también pueden ser sometidas a un proceso de fermentación por microorganismos para la fabricación de embutidos fermentados como las salchichas, salami, chorizo de pamplona, etc. Los microbios más utilizados como cultivos iniciadores para la industria cárnica son las bacterias lácticas, las micrococáceas, los mohos y las levaduras. Las bacterias lácticas son actualmente el grupo más utilizado en las fermentaciones cárnicas, y pertenecen, fundamentalmente, a los géneros Lactobacillus y Pediococcus. Determinadas cepas específicas se comercializan en forma de cultivos congelados o liofilizados para su uso en la fabricación de embutidos y se inoculan en el momento del picado-amasado. Es frecuente la inoculación en profundidad con cultivos mixtos que incluyen también micrococaceas, fundamentalmente de los géneros Micrococcus y Staphylococcus. Los mohos son microorganismos que suelen desarrollarse de forma espontánea en la superficie de la carne y elaborados cárnicos, generalmente forman micelios, tapices de células encadenadas que no se separan totalmente al dividirse, y se denominan flor del embutido. Sin embargo, no se pueden emplear en embutidos ahumados ya que el humo tiene compuestos antimicrobianos que impiden su crecimiento. Los mohos se comercializan como liofilizados o como concentrados líquidos de esporas. Los embutidos suelen inocularse después de la embutición y los perniles de jamón para el secado. La inoculación es superficial mediante inmersión del producto en una suspensión de esporas del moho en agua o bien usando un nebulizador. Algunas cepas utilizadas son Penicillium nalgiovense, Penicillium candidum o roquefortii. Los cultivos iniciadores cárnicos realizan la fermentación homoláctica, produciendo solamente ácido láctico a partir de los azúcares sencillos presentes en la carne. La acumulación de ácido láctico disminuye el pH de los embutidos y esto inhibe el crecimiento de otros microorganismos, por tanto, tiene un efecto bioprotector ya que impide el crecimiento de

196

BIOTECNOLOGÍA Y ALIMENTACIÓN

patógenos mejorando la calidad sanitaria del producto. El ácido láctico confiere su sabor característico y agradable al producto, y provoca, además, una ligera desnaturalización de las proteínas de la carne, lo que conlleva a su insolubilización que se traduce en una ligazón de la masa y un aumento de la firmeza al corte. El pH ligeramente ácido, provocado por el láctico, disminuye la capacidad de retención de agua y favorece el secado. Por tanto, el proceso fermentativo es fundamental para la calidad sensorial del producto. Los microorganismos de la fermentación cárnica también contribuyen a la formación del color de los embutidos, aunque éste es un proceso complejo en el que intervienen muchas sustancias. La principal es la mioglobina, que es una proteína unida al grupo hemo, principal responsable del color rojo de la carne. En los procesos de curación de los embutidos y jamones, esta proteína se desnaturaliza y origina el miocromógeno de color rojo oscuro característico de éstos. Los nitratos y los nitritos son ingredientes de curado que se añaden, en el caso de los embutidos fermentados, en la elaboración de la masa junto con los cultivos iniciadores de la fermentación. Durante el proceso fermentativo, las bacterias lácticas que tienen la enzima nitrito reductasa son capaces de oxidar los nitritos a nitratos, proceso que mejora notablemente la formación de color estable. Los microbios utilizados en las fermentaciones cárnicas de embutidos tienen cierta actividad proteolítica, lo que aumenta la digestibilidad de las proteínas cárnicas mejorando, por tanto, su calidad nutritiva. También tienen lipasas que liberan los ácidos grasos de las grasa de la carne durante el proceso fermentativo. Los ácidos grasos libres contribuyen al aroma y al sabor de los embutidos y jamones. La investigación en el campo de las fermentaciones cárnicas se centra, fundamentalmente, en la obtención de microorganismos transgénicos que incorporen en su genoma diversas actividades metabólicas de interés para fomentar la calidad de los productos, lo cual actualmente sólo es posible preparando cultivos iniciadores de la fermentación mixtos, es decir que incluyen una gran variedad de cepas lo que fomenta la variabilidad de los procesos y dificulta su control.

6.12.

PRODUCTOS VEGETALES FERMENTADOS

Es posible fermentar muchos productos vegetales dando como resultado alimentos con unas características organolépticas muy peculiares

MICROORGANISMOS Y ALIMENTOS FERMENTADOS

197

que los hacen muy apreciados. Algunos son consumidos actualmente en todo el mundo, como las aceitunas de mesa, los encurtidos de pepinillos, el chucrut, la salsa de soja, etc., y otros son muy específicos de algunas culturas africanas y de oriente, como el kenkey de maíz (Ghana y Nigeria), el miso de habas de soja (Japón), el peujeum de tapioca (Indonesia). La obtención de estos alimentos depende del desarrollo de microorganismos en las salmueras de fermentación, y, generalmente, se trata de bacterias lácticas, muy frecuentemente la especie Lactobacillus plantarum que en su desarrollo produce una fermentación láctica de la materia prima vegetal. El Lactobacillus plantarun se puede desarrollar de forma natural en las salmueras de fermentación, como tradicionalmente se hacía en la producción de este tipo de alimentos, y actualmente se sigue haciendo en las culturas más primitivas, poco industrializadas. Sin embargo, es bien sabido que todos los procesos de fermentación que dependen del desarrollo de microorganismos de forma natural están sometidos a grandes variabilidades e incluso a fracasos en la producción, debido al escaso desarrollo del microorganismo de interés o a la contaminación por competidores indeseables que arruinan el producto. Hoy en día este tipo de problemas se evita con la utilización de cultivos iniciadores que se inoculan al medio de fermentación, generalmente una salmuera, y además, en los procesos industriales se destruyen previamente los microorganismos naturales. El método tradicional de fermentar en salmueras tiene una gran importancia, que hoy podemos entender, ya que una concentración de 2,2 a 5% de cloruro sódico impide el crecimiento de bacterias gram negativas que podrían contaminar y arruinar el producto y, sin embargo, favorece el crecimiento de las bacterias del ácido láctico que son muy halófilas. En los encurtidos se añaden también diversas plantas aromáticas que contribuyen a las características sensoriales del producto final. Los cultivos iniciadores dependen de la materia prima inicial y del producto final de que se trate. Por ejemplo, para la obtención de la col ácida es necesario que los cultivos iniciadores sean heterofermentativos, mientras que, por ejemplo, para las aceitunas de mesa conviene que sean homofermentativos. Sin embargo, en muchos casos el papel predominante de los procesos fermentativos de diferentes tipos de vegetales lo lleva a cabo una misma especie de bacteria láctica. Tal es el caso de las aceitunas, zanahorias, pepinillos, alcaparras y alcaparrones, cuya fermentación se debe a la especie Lactobacillus plantarum. Uno de los campos donde se investiga actualmente es en el de la obtención de cepas de L. plantarum productoras de bacteriocinas. Las bac-

198

BIOTECNOLOGÍA Y ALIMENTACIÓN

teriocinas son proteínas de pequeño tamaño, producidas por diversas especies de bacterias, y que tienen la capacidad de inhibir el crecimiento de otras cepas de bacterias relacionadas filogenéticamente con la productora. Son un mecanismo de defensa de las bacterias frente a posibles competidores. Estas proteínas no son inmunogénicas y, además, se destruyen con gran facilidad por las enzimas presentes en el tracto intestinal humano. Por lo tanto, su utilización en los alimentos no reporta ningún peligro y, sin embargo, proporcionan importantes ventajas para los procesos fermentativos en la producción y conservación de alimentos fermentados, evitando el crecimiento de competidores y patógenos. El grupo de Biotecnología de Alimentos del Instituto de la Grasa del CSIC en Sevilla, dispone de varias patentes de cepas productoras de bacteriocinas para la fermentación de distintos vegetales, entre otros aceitunas estilo español o sevillanas. Otra de las aplicaciones interesantes de las bacteriocinas producidas por las bacterias lácticas es su utilización como conservantes naturales de alimentos envasados.

6.13.

MICROORGANISMOS PRODUCTORES DE ENZIMAS PARA LA INDUSTRIA ALIMENTARIA

La industria alimentaria actual requiere de multitud de compuestos para la transformación de los alimentos, especialmente enzimas, pero también se utilizan edulcorantes, potenciadores del sabor, aromas, vitaminas, hormonas, espesantes, etc., y multitud de aditivos que se extraen a partir de microorganismos. Los microorganismos son los productores de enzimas más eficientes y, hoy día, muchas de estas enzimas se extraen de microorganismos modificados genéticamente (GMO) que resultan todavía mucho más eficientes y, además, los productos obtenidos suelen ser mucho más seguros ya que se encuentran libres de contaminantes. Como comentamos anteriormente la extracción y, sobre todo, la purificación de enzimas es un proceso muy difícil y laborioso, que se hace mucho más eficiente cuando se selecciona un microorganismo, se modifica y se dirige hacia la producción masiva de determinada enzima. Una de las empresas biotecnológicas que produce y suministra enzimas alimentarias es la danesa Novo-Nordisk que utiliza, fundamentalmente, la bacteria Bacillus subtilis y el hongo Aspergillus oryzae como fuentes de las mismas, disponiendo de distintas cepas MG especializadas en la producción de los distintos compuestos que esta empresa comercializa.

199

MICROORGANISMOS Y ALIMENTOS FERMENTADOS

En la Tabla 6.2 se muestran algunas enzimas, que se extraen de microorganismos y se comercializan para su uso en la industria. TABLA 6.2 Industria

Enzimas

Cerveza y vino

Amilasas, glucanasas, pectinasa, xilanasas

Almidón

Amilasas, glioamilasas, pulanasa, glucosa-isomerasa

Zumos de frutas y hortalizas

Pectinasas, celulasas, arabinasas, glucosa oxidasa

Panes y pastas

Amilasas, glucanasas, xilanasas, proteasas, glucoxidasas

Carnes y embutidos

Proteasas, peptidasas, glucosa- oxidasa

Productos lácteos

Proteasas, quimosina, lactasa, lipasa

Según datos de los fabricantes de enzimas casi el 80% son obtenidas a partir de microorganismos modificados genéticamente. En la Tabla 6.3 se indica el porcentaje de enzimas procedentes de microorganismos modificados genéticamente en diversos sectores de aplicación. TABLA 6.3 Sector

1985

1994

2000

Detergentes

0

80%

95%

Producción de almidón

0

95%

95%

Panadería

0

20%

50%

Aceites y grasas

0

10%

100%

Piensos

0

30%

90%

Por ejemplo, en Estados Unidos más del 70% de los quesos se elaboran con cuajo obtenido de microorganismos GMO. El cuajo, que contiene una enzima llamada quimosina, es un agente fundamental para cuajar la leche en la elaboración de quesos. Tradicionalmente, el cuajo se obtenía del estómago de las terneras, de la parte denominada cuajar. Hoy día el gen de ternera que codifica esta enzima quimosina está clonado en diversas especies de bacterias y levaduras, que la producen con gran eficiencia. Se encuentran en el mercado distintos preparados de este producto, que no se diferencian en nada, igual estructura molecular de la proteína y la

200

BIOTECNOLOGÍA Y ALIMENTACIÓN

misma actividad enzimática que el obtenido de las terneras, con los nombres comerciales de: Chy-Max elaborado por la bacteria Escherichia coli, Maxiren elaborado por la levadura Kluyveromyces lactis, y Chymogen elaborado por el hongo filamentoso Aspergillus níger. La única diferencia radica en el contenido y la pureza de la enzima activa. Mientras en el cuajo natural obtenido de las terneras contiene del 4 al 8% de principio activo y el resto está compuesto de impurezas (proteínas y residuos) del estómago de las terneras, en los preparados comerciales obtenidos de GMOs hay de un 70 a un 80% de enzima activa, el resto son sales y, en pequeñísima proporción alguna proteína de los microorganismos. La demanda mundial, que se estima en unas 50 toneladas de enzima del cuajo al año, requeriría el sacrificio de unos 70 millones de terneros. Aunque, lógicamente, los terneros no se sacrifican exclusivamente para esto, sin embargo, el procesamiento de los estómagos, que requiere extraer los estómagos, congelarlos, transportarlos a las fábricas, y todos los pasos posteriores de extracción y purificación de la enzima tiene unos elevados costes, no sólo económicos sino también ecológicos (energía, agua, productos químicos, etc.), mientras que la alternativa de los microorganismos es muchísimo más respetuosa con el medio ambiente y más barata. Prácticamente todos los alimentos que consumimos en las países desarrollados están procesados o transformados, en mayor o menor grado, por la industria alimentaria antes de llegar al consumidor. Incluso las frutas frescas son tratadas con ceras y compuestos que favorecen que se mantengan por más tiempo inalterables al ataque de los hongos, son pulidas para hacerlas más atractivas, envasadas, enlatadas como conservas, etc. Todos los campos pueden beneficiarse de los nuevos abordajes y los nuevos productos que se pueden obtener mediante las nuevas técnicas de la ingeniería genética en microorganismos. Por ejemplo, la empresa Novozymes ha desarrollado una gama de enzimas denominadas Peelzym que contiene cuatro pectinasas para favorecer el pelado de las frutas en las fábricas de conservas de frutas y de zumos. El pelado de grandes cantidades de frutas y hortalizas en las fábricas requiere mucha mano de obra y tratamientos con vapor y sosa cáustica caliente para descomponer la membrana.

6.14.

LOS MICROORGANISMOS COMO ALIMENTO

Además de sus acciones como agentes de la fermentación de diversos alimentos, los microorganismos pueden utilizarse en sí mismos como fuente de alimento.

MICROORGANISMOS Y ALIMENTOS FERMENTADOS

201

Diversos microorganismos: bacterias, levaduras, hongos y algas son utilizados directamente como fuente de alimento para el ser humano. Los concentrados de levaduras y los concentrados de algas unicelulares son actualmente utilizados como suplemento de nutrientes, y también se comercializan extractos de proteínas de los mismos, denominándose entonces extractos SCP (single cell proteins). Uno de los suplementos microbianos más populares es la cianobacteria Spirulina, tradicionalmente usada como fuente de alimento en África, en la actualidad se vende en las tiendas de alimentación «sana», en forma de pastel seco o en polvo. También los hongos han sido tradicionalmente un alimento muy apreciado. Los champiñones (Agaricus bisporus) son uno de los hongos de mayor importancia utilizados directamente como fuente de alimento, y, actualmente, se cultivan de forma industrial. El cultivo del champiñón se realiza en grandes cuevas y requiere una cuidadosa preparación del medio, generalmente un abono vegetal cuidadosamente elaborado y esterilizado al vapor, y un meticuloso control de las condiciones ambientales.

BIBLIOGRAFÍA BOURGEOIS, C. M. y LARPENT, J. P.: Microbiología alimentaria. Fermentaciones alimentarias. Editorial Acribia, 1995. CARRASCOSA, A. V.: Los microbios que comemos. Editorial CSIC-Catarata, 2011. GARCÍA GARIBAY, M.; QUINTERO RAMÍREZ, R. y LÓPEZ MUNGUÍA, A.: Biotecnología alimentaria. Editorial Limusa, 1998. LEE, B. H.: Fundamentos de Biotecnología de los alimentos. Editorial Acribia, 2000. WARD, O. P.: Biotecnología de la fermentación. Principios, procesos y productos. Editorial Acribia, 1991.

Direcciones en Internet Europa Biotechnology http://europa.eu.int/comm/biotechnology/ BBC. GM foods http://www.bbc.co.uk/science/genes/gm_genie/index.shtml EUFIC European Food Information Council http://www.eufic.org/sp/food/pag/food35/food351.htm Saccharomyces Genome database http://genome-www.stanford.edu/Saccharomyces

202

BIOTECNOLOGÍA Y ALIMENTACIÓN

El genoma de Oenococcus oeni, bacteria usada en producción de vinos http://www.bio.com/newsfeatures/newsfeatures_features.jhtml?action=view& contentItem=87107143&Page=1 Producción de enzimas alimentarias de Novozymes http://www.biotimes.com

Tema 7 MICROORGANISMOS GENÉTICAMENTE MODIFICADOS Su aplicación en los alimentos y sus potenciales efectos sobre la salud y nutrición del hombre

La biotecnología de los alimentos se ha entendido tradicionalmente como el empleo de determinados microorganismos, como levaduras, hongos, y algunas bacterias en procesos industriales que tenían como fin la obtención de alimentos. Durante mucho tiempo el objetivo principal fue la mejora de las características de los cultivos iniciadores de la fermentación, para obtener microorganismos con buenas características reproductivas y rápido crecimiento en los medios de cultivo utilizados. Pero muchas de las iniciativas para mejorar las propiedades industriales de los microorganismos están limitadas por la escasez de conocimientos previos sobre los detalles de los mecanismos que regulan el metabolismo de los organismos implicados. En este campo la puesta en marcha de programas que tienen como objetivo el estudio del genoma de microorganismos, tradicionalmente usados en alimentos, permitirá avanzar en los múltiples objetivos planteados para mejorar las características industriales de los microorganismos. Los microorganismos (bacterias, levaduras, hongos filamentosos) se pueden usar en la producción de los alimentos como parte integral de varios preparados fermentados, para la producción de aditivos, o para producir compuestos que contribuyen al procesado de los alimentos: ácidos orgánicos, potenciadores del sabor, enzimas alimentarias, etc. En los alimentos fermentados los microorganismos pueden permanecer en el propio alimento pero pueden estar muertos, inactivados o viables. Cuando se usan microorganismos genéticamente modificados (MGM) estas alternativas pueden tener distintas implicaciones desde el punto de vista de la seguridad. Debido a la plasticidad de los genomas microbianos y los mecanismos de intercambio genético que pueden ocurrir, la

contaminación genética es un tema que debe ser debidamente controlado y estudiado. En este capítulo nos referiremos al empleo e impacto de los MGM sobre la nutrición humana teniendo en cuenta sus numerosos usos actuales y potenciales en un futuro.

ESQUEMA DE CONTENIDOS 7.1. Aplicación de la tecnología transgénica a los microorganismos empleados en la alimentación 7.1.1. Cultivos iniciadores bacterianos 7.1.2. Levaduras y hongos filamentosos 7.2. Microorganismos genéticamente modificados viables en los alimentos 7.3. Enzimas alimentarias de origen microbiano producidas por MGM 7.4. Otros componentes de los alimentos producidos por MGM 7.4.1. Aromas 7.4.2. Aditivos alimentarios 7.4.3. Ácidos orgánicos 7.5. Consecuencias e impacto del uso de los MGMs en alimentos 7.5.1. Interacciones con la microflora humana 7.5.2. Transferencia génica entre microorganismos asociados al intestino y asociados a los alimentos 7.5.3. El caso concreto del triptófano 7.6. Aspectos reguladores 7.6.1. Métodos de evaluación de la seguridad de los MGMs de alimentos 7.6.2. MGMs viables en los alimentos 7.6.3. Contención genética 7.6.4. Enzimas de alimentos 7.6.5. Sabores, aditivos y otros ingredientes de los alimentos 7.7. Lagunas en el conocimiento de los microorganismos 7.7.1. Alimentos fermentados 7.7.2. Las interacciones con la microflora del anfitrión 7.8. Conclusiones

7.1.

7.1.1.

APLICACIÓN DE LA TECNOLOGÍA TRANSGÉNICA A LOS MICROORGANISMOS EMPLEADOS EN LA ALIMENTACIÓN Cultivos iniciadores bacterianos

Los alimentos fermentados representan una de las tecnologías más antiguas para mejorar la conservación, calidad, seguridad y valor nutricional de los alimentos. Aunque muchas de las fermentaciones que se llevan a cabo en los países desarrollados utilizan cultivos iniciadores, con propiedades conocidas y predecibles, en muchos casos, especialmente en elaboraciones caseras o artesanas, se producen por fermentación espontánea, por inoculación con materias de fermentaciones previas o cultivos iniciadores poco caracterizados y de composición desconocida. Tradicionalmente, las bacterias de cultivos iniciadores para la obtención de productos específicos se han seleccionado de entre las variantes naturales y mutantes espontáneos. Actualmente los estudios genéticos y de biología molecular realizados y el desarrollo de las técnicas de ingeniería genética disponibles, varían enormemente de un grupo a otro de microorganismos utilizados en alimentos. Muchas de las investigaciones se han centrado en las bacterias ácido lácticas especialmente del género Lactococcus donde ya en los años 70 del siglo pasado se detectaron plásmidos implicados en varias rutas metabólicas de interés industrial como: la fermentación láctica, actividad proteolítica (de crucial interés en la maduración del queso), producción de aroma, resistencia a fagos, producción de exopolisacáridos, modificación de los sistemas de restricción, etc. Estos estudios han culminado con la secuenciación total del genoma de Lactococcus lactis IL 403 en 2001 y posteriormente de otras bacterias lácticas de interés en la industria alimentaria.

206

BIOTECNOLOGÍA Y ALIMENTACIÓN

Las posibilidades para la modificación genética de Lactococcus comenzaron con el desarrollo de las técnicas de transformación, primero mediante la transformación de protoplastos (células bacterianas desprovistas de pared celular para permitir la entrada del DNA exógeno), y después con la electroporación. Esta técnica ha resultado la más eficaz y la elegida para transformar también otras especies de bacterias ácido lácticas como Streptococcus thermophilus, Lactobacillus plantarum e incluso cepas importantes industrialmente pero pobremente transformables como Lb. delbrueckii subesp. bulgaricus. Concomitante con la introducción de los métodos de transformación se han desarrollado vectores de clonación. La primera generación de vectores se basaron en plásmidos de Lactococcus en los cuales se incorporaron genes marcadores de resistencia a antibióticos. Posteriormente se han desarrollado vectores de integración homóloga, aquellos que permiten la integración dirigida a un punto concreto del cromosoma bacteriano. Ya que los marcadores de resistencia a antibióticos se han considerado inaceptables en cualquier aplicación alimentaria se han ideado varios sistemas de clonación de grado alimentario, a menudo combinado con el uso de orígenes de replicación de huésped restringido que impiden la propagación de los plásmidos manipulados. La selección puede estar basada en la resistencia a bacterocinas, en la presencia de timidilato sintetasa, en componentes del sistema proteolítico (X- prolildipeptidil sintetasa) o en sistemas de componentes múltiples que producen la inestabilidad del marcador selectivo en ausencia de selección. Los plásmidos de expresión incluyen promotores específicos de bacterias ácido lácticas y secuencias señal implicadas en las vías de secreción bacteriana para producir eficientemente proteínas homólogas y heterólogas en Lactococcus y Lactobacillus. En comparación con las bacterias ácido lácticas hay pocos estudios genéticos en otras bacterias implicadas en alimentos. Pero ya se han descrito sistemas de transformación y vectores para propionibacterias y brevibacterias, y se han realizado algunos estudios en bifidobacterias.

7.1.2.

Levaduras y hongos filamentosos

Saccharomyces cerevisiae es probablemente el eucariota que mejor se conoce genética y bioquímicamente. Fue el primer eucariota sobre el

MICROORGANISMOS GENÉTICAMENTE MODIFICADOS...

207

que se aplicó la tecnología del DNA recombinante, y su genoma completo se conoce desde 1996. Los vectores y los marcadores de selección en levaduras difieren en muchos aspectos respecto a aquellos empleados en bacterias. Los vectores están basados en el plásmido de 2 micras; son vectores que llevan regiones de procariotas para facilitar su manipulación, pero llevan el origen de replicación de levaduras, la región centromérica de cromosomas por lo que son reconocidos por las fibras mitóticas durante la división celular, asegurando el reparto preciso de los mismos en las células hijas. Los cromosomas artificiales de levaduras también contienen secuencias teloméricas y pueden linearizarse después del evento de clonación. Los cromosomas artificiales o YAC proporcionan un medio útil para clonar insertos de DNA de gran longitud. Los marcadores de selección típicos son mutaciones supresoras, o complementan auxotrofías en el huésped (p. ej. URA3 para la síntesis defectiva de uracilo) o están basados en la presencia del gen CUP1 que confiere resistencia al cobre. Estos marcadores son menos problemáticos desde el punto de vista de la seguridad que los genes bacterianos de resistencia a antibióticos. Sin embargo, muchos vectores de levaduras son vectores mixtos E. coli-levaduras, que contienen un origen de replicación procariota y un gen de resistencia a antibióticos, permitiendo la selección en un fondo bacteriano. En hongos filamentosos, aunque hay vectores disponibles, las eficiencias de transformación son generalmente bajas y los resultados de las construcciones genéticas suponen la integración del vector en el genoma del huésped.

7.2.

MICROORGANISMOS GENÉTICAMENTE MODIFICADOS VIABLES EN LOS ALIMENTOS

Aunque la ingeniería genética podría aplicarse a un amplio número de bacterias utilizadas para la obtención en alimentos fermentados tradicionales la introducción de los MGMs no se ha materializado. Una de las razones argumentadas, al menos en Europa, ha sido la incertidumbre ante la reacción de los consumidores reacios a la introducción de alimentos transgénicos en el mercado. Además, muchos de los cultivos iniciadores empleados para la obtención de alimentos fermentados contienen muchas especies y cepas y el aroma y textura final del alimento están basados en procesos que son controlados por muchos genes, cuyas funciones son prácticamente desconocidas. En

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BIOTECNOLOGÍA Y ALIMENTACIÓN

consecuencia, la modificación de la actividad de un único en gen, en una cepa concreta, raramente tendría el efecto deseado durante el proceso de fermentación. Sin embargo, las investigaciones en este área continúan, y por ejemplo la que persiguen el control y detección de eventuales contaminantes y patógenos que pueden invadir los alimentos durante el proceso de fabricación y comercialización es una de las más avanzadas. En bacterias ácido lácticas, probablemente el grupo mejor caracterizado genéticamente entre las bacterias utilizadas en alimentos, el objetivo ha sido la elucidación de aspectos básicos de su fisiología y metabolismo, tales como los sistemas proteolíticos, el metabolismo de la lactosa, o la mejora de las propiedades organolécticas y aceleración de la maduración del queso, usando cepas autolíticas o mediante el uso de la ingeniería genética para estabilizar la producción de diacetilo (aroma a mantequilla) o mejorar el sabor del yogur desviando la formación de piruvato hacia la síntesis de alanina. Las bacterias probióticas pueden ser genéticamente modificadas para aumentar sus propiedades saludables. El éxito en el tratamiento de la colitis administrando un Lactococcus modificado genéticamente para producir IL10 da idea de las aplicaciones potenciales en humanos. La interleuquina IL-10 (una citoquina) ha mostrado en ensayos clínicos resultados prometedores para el tratamiento de la enfermedad IBD (vientre inflamado). Usando como modelo ratones, se ha demostrado que la dosis terapéutica de IL-10 se puede reducir a la mitad si se administra la bacteria genéticamente modificada que segrega la citoquina, reduciendo así la cantidad de sustancias en la que va disuelto el medicamento que puede causar efectos secundarios perjudiciales. Otros ejemplos de las aplicaciones terapéuticas de las bacterias lácticas recombinantes han demostrado, en modelos animales, que son excelentes para administrar in situ proteínas beneficiosas para la salud, que de otra manera serían degradadas por el aparato digestivo. El desarrollo de vacunas orales basadas en alimentos conteniendo microorganismos genéticamente modificados es otra aplicación que se encuentra en el límite entre la medicina y la alimentación. Podemos concluir que el uso de bacterias modificadas genéticamente en alimentos no es todavía una realidad. Hay propuestas para su uso, para mejorar aspectos tecnológicos y sensoriales de los alimentos o introducir propiedades específicas que persiguen mejorar sus características para hacerlos más saludables más que aumentar su calidad nutricional.

MICROORGANISMOS GENÉTICAMENTE MODIFICADOS...

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Aunque algunas levaduras modificadas genéticamente fueron aprobadas por algunas administraciones europeas hace más de 10 años no se han introducido todavía en el mercado. Las modificaciones genéticas introducidas en levaduras tienen por objeto permitir que éstas crezcan sobre un amplio rango de sustratos, tales como almidón, lactosa o xilosa, otras propuestas pretenden la mejora del aroma. Las modificaciones de las levaduras cerveceras se han enfocado para introducir nuevas actividades enzimáticas, como glucoamilasas y beta-glucanasas que permitirían modificar las propiedades de floculación y optimizar el desarrollo del aroma en cervezas Como sabemos Saccharomyces cerevisiae se emplea para la transformación de harina en pan, la cebada en cerveza o el mosto de la uva en vino. La fermentación alcohólica produce etanol y carbónico a partir del azúcar. En el caso de la cerveza o el vino, la levadura transforma los azúcares de mosto en alcohol, y en el pan produce el gas que hincha la masa panaria y produce la miga, el etanol que se produce durante la fermentación del pan se evapora durante el horneado. La mejora genética de esta levadura por ingeniería genética persigue varios objetivos, por un lado, obtener mayor rendimiento en la producción industrial de la propia levadura que posteriormente se comercializa y se vende a las industrias cerveceras, bodegas e industrias panaderas. Y por otro lado, mejorar la levadura para obtener mayores rendimientos en el proceso fermentativo que va a dar lugar al producto alimentario. Las industrias productoras de levadura suelen utilizar melazas, un subproducto de las fábricas de azúcar, rico en sacarosa y rafinosa. La levadura, es incapaz de utilizar rafinosa, para ello necesitaría poseer una enzima denominada alfa-galactosidasa que rompe la rafinosa en azúcares más sencillos que la levadura sí puede metabolizar. Por ingeniería genética se ha introducido el gen que codifica esta enzima en las cepas industriales, obteniéndose un mejor aprovechamiento del sustrato y disponiéndose así de una levadura más barata. Igualmente se han desarrollado cepas en las que se ha introducido el gen de la beta-galactosidasa, que pueden crecer en el suero de quesería (rico en lactosa), un importante subproducto de las industrias del queso y altamente contaminante y que crea verdaderos problemas para su eliminación. Para producir pan basta añadir a la harina de trigo o centeno unas pocas enzimas (proteasas y amilasas) y la levadura panadera para que lleve a cabo la fermentación. Se han construido cepas de levadura de panadería capaces de producir las enzimas que habitualmente se añaden al proceso de panificación. Este procedimiento muestra numerosas ventajas:

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BIOTECNOLOGÍA Y ALIMENTACIÓN

1) únicamente se produce la enzima o enzimas deseadas, evitando la presencia en la masa de actividades no deseadas, porque las enzimas que se comercializan suelen llevar trazas de otras actividades enzimáticas contaminantes; 2) la levadura misma es capaz de producir la función del aditivo comercial, con la consiguiente reducción del coste del producto final, y 3) la producción enzimática se desarrolla en la masa, con lo que se reduce la presencia en forma de polvo de estas enzimas, las cuales son causa frecuente de alergias dérmicas y bronquiales a los trabajadores de la industria panadera. Las mejoras realizadas sobre las levaduras cerveceras son por ejemplo la introducción del gen que codifica la enzima beta-glucanasa que rompe los beta-glucanos del grano de cebada. Los beta-glucanos producen problemas de colmatación durante proceso de filtración, último paso para obtener el producto final. La utilización de la levadura recombinante es nuevamente una alternativa al uso de enzimas exógenas que pueden contener actividades no deseables. Se ha desarrollado también una levadura que produce una cerveza con bajo contenido calórico. La cerveza engorda porque la gran cantidad de dextrina y almidón que están presentes en el mosto de la cebada y que no son metabolizados por la levadura cervecera permanecen en el producto final. Se ha diseñado una cepa cervecera transgénica que porta el gen de la glucoamilasa que rompe el almidón y las dextrinas produciendo azúcares más sencillos que son asimilados por la levadura, produciendo una cerveza con menos calorías. En la industria del vino también se han conseguido ya resultados encaminados a aumentar la calidad del vino, por ejemplo es muy apreciado en los vinos el aroma afrutado, a ello contribuye la hidrólisis de ciertos compuestos contenidos en el grano de uva, y para aumentar esos compuestos se añaden ciertas enzimas comerciales al proceso de vinificación. Una alternativa es introducir por ingeniería genética los genes, generalmente de hongos, que codifican esas enzimas en la levadura vínica.

7.3.

ENZIMAS ALIMENTARIAS DE ORIGEN MICROBIANO PRODUCIDAS POR MGM

La producción de enzimas para uso alimentario representa probablemente la principal y más común de las aplicaciones de los microorganismos genéticamente modificados hasta ahora. Actualmente se dispone

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de al menos 30 diferentes enzimas para la obtención de alimentos que son producidas por MGM. La modificación génica ofrece la posibilidad de incrementar el rendimiento en la producción de la enzima deseada ya por la introducción de múltiples copias del gen correspondiente en el organismo productor o por influir sobre las secuencias reguladoras del mismo. El objetivo general es introducir el gen codificante de la enzima de interés en organismos eficientes y seguros. Hay muchos ejemplos de enzimas recombinantes producidas de esta manera y de aplicación en alimentos, entre ellas hay varias que degradan polisacáridos y carbohidratos (amilasas, glucanasas, pectinasas, liasas, esterasas, hemicelulasas, glucosa isomerasa, oxidasas, etc.), que degradan proteínas (proteasas, peptidasas) y que degradan lípidos (lipasas). Algunas especies del género Bacillus son una buena fuente de enzimas estables, como alfa-amilasas y glucosa isomerasa, para su uso en la industria de los alimentos. Otros organismos productores incluyen otras bacterias (Streptomyces), levaduras y hongos filamentosos (Aspergillus, Trichoderma) en muchos casos los genes no son de origen microbiano, como la quimosina del estómago de ternera, producido en Aspergillus niger o Kluyveromyces lactis. La mayoría de las enzimas se usan durante la elaboración de alimento y no como aditivos, por lo que estas enzimas se degradan o se eliminan del producto final. Una excepción es una enzima que tiene posibles aplicaciones tanto como potenciador del aroma y como aditivo, la ciclomaltodextrina glicosiltransferasa que se usa para la degradación de las ciclodextrinas que se emplean para la estabilización de sustancias volátiles (ej. aromas y especias), la modificación de las propiedades (como la reducción del sabor amargo, el enmascaramiento de olores desagradables) y la absorción selectiva que permite, por ejemplo, la eliminación del colesterol de los huevos o la mantequilla. Podemos concluir que en la producción de enzimas industriales se emplea la fermentación microbiana, utilizando materias primas agrícolas para cultivar los microorganismos en los tanques de fermentación. Luego las enzimas se extraen del caldo de fermentación y se purifican. Las técnicas de la ingeniería genética se aplican para aumentar el rendimiento de las enzimas y para permitir su producción en organismos apropiados para la fermentación. Gracias a las técnicas de ingeniería genética se disponen actualmente de un gran número de enzimas comerciales. Sin esta técnica la producción de las mismas dependería de microorganismos silvestres que tienen un bajo rendimiento de producción y requieren mayores cantidades de materias primas, agua y energía. El

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producto final, las enzimas que son comercializadas no contienen MGMs ya que éstos se separan de los productos acabados durante el proceso de purificación.

7.4. 7.4.1.

OTROS COMPONENTES DE LOS ALIMENTOS PRODUCIDOS POR MGM Aromas

Los aromas son mezclas complejas de ingredientes individuales. Son a menudo compuestos naturales de los alimentos y pueden ser producidos por medios físicos o por síntesis química o más recientemente por biotecnología, mediante fermentación o extracción por enzimolisis de células y tejidos modificados o no, genéticamente. Los sistemas fermentativos que emplean microorganismos no modificados constituyen la fuente fundamental para la obtención de aromas como: ácidos grasos, metil-cetonas, compuestos carbonilos, lactonas y ésteres. Una gran variedad de bacterias, levaduras y hongos se han identificado como microorganismos útiles para la producción de aromas. La aplicación de la ingeniería genética en los microorganismos implicados puede facilitar el desarrollo de nuevos sistemas útiles en la producción industrial. Los microorganismos que se usan tradicionalmente en biotecnología de alimentos poseen el reconocimiento de ser «seguros» (GRAS, Generallly Recognized As Safe) y éstos son los candidatos preferidos para la modificación génica. Se han investigado intensamente las rutas metabólicas del metabolismo secundario de esos organismos en sustratos naturales. Los cultivos iniciadores de productos lácteos forman carbonilos, ácidos grasos y aminoácidos mediante las rutas glicolítica, lipolítica y proteolítica. La modificación genética en estas especies tiene como objetivo el incremento de la producción de aromas no volátiles constituidos por aminoácidos, nucleótidos y proteínas de sabor dulce.

7.4.2.

Aditivos alimentarios

Ácidos orgánicos En la tecnología de los alimentos, los ácidos orgánicos producidos por fermentaciones microbianas constituyen uno de los compuestos más importantes. Los ácidos orgánicos se emplean como ingredientes o como

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precursores de otros ingredientes en los alimentos preparados. El ácido orgánico mayoritariamente producido, usado en mayor volumen y con una función primordial, es el ácido cítrico. El ácido cítrico es un producto químico muy común e importante que se fabrica mediante fermentación industrial. Como ingrediente alimentario tiene un estatus no restringido y es GRAS. A. niger es el hongo utilizado normalmente para su producción a gran escala. Algunas especies de Candida también se usan pero con menor frecuencia. Muchas de las estirpes de A. niger han sido seleccionadas por su alta productividad y adaptabilidad a los fermentadores industriales. Sin embargo, las cepas modificadas genéticamente de A. niger muestran una sobreproducción de las enzimas claves para la formación del ácido cítrico que elevan el rendimiento de producción de 20 a 30 veces respecto a las cepas salvajes. El ácido láctico se emplea en muchos alimentos y en otras aplicaciones (p. ej., en medicamentos). Las cepas ácido lácticas que se usan en las fermentaciones industriales son generalmente Lactobacillus delbrueckii. Durante mucho tiempo se han seleccionado mutantes espontáneos de Lactobacillus que mostraban un mayor rendimiento en la producción de este ácido. Las cepas de Lactobacillus de uso industrial se han considerado no transformables y por tanto durante mucho tiempo se estimó que no se podían modificar genéticamente, pero actualmente se han descrito procedimientos para su modificación génica.

Aminoácidos Los aminoácidos producidos industrialmente se emplean como aditivos alimentarios, como medicamentos y cosméticos, o como materiales de partida en la industria química. Los aminoácidos se han usado tradicionalmente en alimentación animal y humana como aditivos. Pero también ha ido creciendo la producción de aminoácidos de grado farmacéutico para su uso por vía parenteral o intravenosa. Las proteínas de plantas tienen un importante mercado, pero a menudo son deficientes en aminoácidos esenciales como la L-lisina, L-metionina, L-treonina, o Ltriptófano. Estos aminoácidos son sintetizados por microorganismos a partir de precursores derivados de carbohidratos. A excepción de algunos microorganismos que segregan ácido glutámico, las estirpes salvajes normalmente no producen grandes cantidades de aminoácidos. Por esto, es necesario, modificar el metabolismo de la célula o la regulación del metabolismo de los microorganismos para lograr la

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sobreproducción de esos aminoácidos. Actualmente los microorganismos usados para producir aminoácidos por fermentación, pertenecen mayoritariamente al grupo de corinebacterias como Corynebacterium glutamicum que es el organismo que produce industrialmente el ácido glutámico. Las estrategias para aislar estirpes sobreproductoras de aminoácidos se basaron inicialmente en el cribado de aislados naturales que ya producían cantidades apreciables de tales metabolitos. Más tarde, para mejorar el rendimiento se aislaron y seleccionaron microorganismos mutantes, normalmente producidos mediante mutágenos químicos. Hasta ahora, muchos de los estudios genéticos se han enfocado en aislar y caracterizar los mutantes superproductores, con el objetivo de desarrollar cepas que produzcan altos niveles de los aminoácidos de interés. También las técnicas de ingeniería genética se han introducido en el campo de la fermentación de aminoácidos. Los tres aminoácidos aromáticos (triptofano, fenilalanina, y tirosina) se producen por fermentación microbiana pero a menudo con bajo rendimiento. La producción de L-triptófano por fermentación directa de glucosa se lleva a cabo normalmente en Escherichia coli, Bacillus subtilis o cepas de Corynebacterium. En estos microorganismos se conoce bien tanto la ruta de síntesis de este aminoácido así como los mecanismos implicados en su regulación. La lisina está presente en la mayoría de las proteínas de las plantas pero en muy baja concentración. Se usa principalmente como un aditivo alimentario. El mercado mundial para la lisina es tal que se ha convertido en uno de los aminoácidos más importantes económicamente. Actualmente, la producción industrial de lisina se lleva a cabo por fermentación microbiana, y se obtienen altos niveles utilizando cepas superproductoras modificadas genéticamente. Las especies del género Corynebacterium y Brevibacterium son las más eficaces para la producción de lisina.

7.5. 7.5.1.

CONSECUENCIAS E IMPACTO DEL USO DE LOS MGM EN ALIMENTOS Interacciones con la microflora humana

Muchas de las eventuales aplicaciones de los MGMs en alimentos podrían conducir a una situación en la cual MGMs viables podrían ser

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consumidos en cantidades considerables por los seres humanos. Esto hace necesario la consideración de las posibles interacciones entre el MGMs y la microflora humana endógena. Cada ser humano abriga una comunidad microbiana numerosa asociada a la piel y a las mucosas. Las principales interacciones entre los microorganismos asociados a los alimentos y la microflora endógena tiene lugar en el tracto gastrointestinal, donde los microorganismos alcanzan los números más elevados. Para evaluar estas interacciones veamos primero el papel fisiológico de la microflora y de su importancia para el hombre. La microflora gastrointestinal humana se estima que está formada por hasta 400 especies distintas, muchas de las cuales son difíciles o imposibles de cultivar rutinariamente. El número y las especies varían enormemente en diversas localizaciones intestinales. Debido a su bajo pH, el estómago está normalmente casi desprovisto de microorganismos residentes. La presencia de los ácidos biliares y los tiempos relativamente rápidos del tránsito mantienen el número de bacterias bajo en el intestino delgado. En el colon, las densidades bacterianas alcanzan hasta 1012 células bacterianas por el gramo del contenido del lumen; las levaduras u otros hongos representan normalmente sólo una fracción no significativa del montante total de microorganismos. Los géneros bacterianos principales, que alcanzan densidades de 1010 o más, son Bacteroides, Bifidobacterium, y Eubacterium, mientras que el número de individuos de los grupos tales como Lactobacillus, Enterococcus y Enterobacteriaceae es varios órdenes de la magnitud más bajo. Las actividades metabólicas asociadas con la microflora son aparentemente significativas pero muy difíciles de estudiar o de estimar. La actividad sacarolítica de la microflora del colon da lugar a la formación de ácidos grasos de cadena corta, como el butirato, el acetato y el propionato, contribuyendo al metabolismo del huésped. Las bacterias intestinales pueden modificar compuestos endógenos y xenobióticos ingeridos. Los ácidos biliares y sus derivados pueden ser modificados a ácidos biliares secundarios. Las beta-glucuronidasas, beta-glucosidasas microbianas, nitrorreductasas pueden incluso modificar xenobióticos a derivados más tóxicos. Algunos de los productos metabólicos finales de bajo peso molecular de los microorganismos, como el amoníaco, el sulfuro del hidrógeno, indoles y compuestos fenólicos, pueden tener efectos dañinos. El aparato gastrointestinal se asocia con el sistema inmune, hay células linfoides distribuidas a lo largo del intestino. Este sistema asegura tolerancia a los microbios indígenas y a los alimentos comunes y lo protege normalmente contra patógenos. La posibilidad de que los mi-

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croorganismos (ya sean MGMs o convencionales) asociados con los alimentos fermentados puedan influir en la microflora intestinal dependerá de su capacidad para sobrevivir en el aparato digestivo y de colonizarlo. Esta posibilidad dependerá de diferentes factores, tales como las condiciones ácidas en el estómago, la presencia de los ácidos biliares, las condiciones anaerobias y la temperatura del cuerpo humano, que eficientemente evitan el asentamiento de muchos tipos de microorganismos pero, algunas bacterias asociadas a los alimentos con metabolismo fermentativo podrían sobrevivir y, teóricamente, incluso prosperar en la zona intestinal. Hasta ahora no se han realizado ensayos en humanos para estudiar la potencial colonización de MGMs. Los estudios se ha centrado en diversas cepas probióticas comunes, para comprobar su supervivencia en el intestino y los efectos fisiológicos de estas cepas, estudios que son requeridos durante el proceso de documentación y control para considerar a los alimentos que los contienen como alimentos funcionales. Se ha demostrado la colonización del intestino humano por varias estirpes probióticas como Lactobacillus rhamnosus GG, Lactobacillus salivarius UCC118, Lactobacillus lactis casei F19, Bifidobacterium lactis Bb12 y Bifidobacterium infantis UCC35624. Aunque, en algunos casos, la cepa administrada se ha detectado en las heces varias semanas después del cese de la administración, la colonización en la mayoría de los casos es, al parecer, transitoria; el microorganismo desaparece gradualmente después de interrumpir la alimentación del mismo. Se ha sugerido el término «persistencia» más que colonización, para describir este tipo de comportamiento. Los estudios con microorganismos probióticos han proporcionado evidencias de que un microorganismo exógeno puede modificar las funciones de la microflora intestinal y de sus interacciones con el huésped. Los efectos observados incluyen el alivio de los síntomas de la mala absorción de la lactosa, la prevención y alivio de diversos tipos de diarrea, la modificación de actividades enzimáticas fecales, y las disminuciones de la mutagenicidad fecal. La presencia de probióticos también afecta a las funciones inmunológicas, aumentado la producción de los anticuerpos IgM y de IgA en los individuos tratados con vacunas, o afectados por infecciones virales o bacterianas. Es significativo el hecho de que estos efectos se observan con bacterias que representan realmente una minoría entre la microflora intestinal. Esto indica que el número de bacterias no es necesariamente el factor decisivo en la determinación de su actividad fisiológica. Incluso la viabilidad de las estirpes no parece ser un requisito previo para observar los efectos asociados a los probióticos.

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7.5.2.

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Transferencia génica entre microorganismos asociados al intestino y asociados a los alimentos

Las levaduras del género Saccharomyces son hongos perfectos, con un ciclo sexual completo; son por lo tanto capaces de llevar a cabo un intercambio genético mediante fecundación. Sin embargo, muchas otras levaduras (Candida) y los hongos filamentosos presentes en alimentos fermentados son imperfectos, carecen de fase sexual en el ciclo vital; cabría pensar que su capacidad para realizar un eventual intercambio genético, por lo tanto, es limitada. Sin embargo, se conocen desde hace tiempo los mecanismos de transferencia de genes en bacterias: la transducción (transferencia mediada por fagos de una célula infectada a otra), la transformación (captación directa de DNA de la solución a través de la pared de célula) y la conjugación (la transferencia de la DNA de la bacteria donante a la receptora mediada por el contacto de célula a célula). Todos estos mecanismos podrían estar implicados en el intercambio genético entre microbios asociados a los alimentos y microorganismos intestinales. En bacterias ácido lácticas, la transducción y la conjugación ocurren con frecuencia, mientras que la transformación natural es poco frecuente, excepto en estreptococos. No hay estudios sobre transferencia génica en otros grupos bacterianos relacionados con los alimentos. La conjugación, incluyendo la conjugación interespecífica e intergéneros, podría, ser un mecanismo importante de transferencia de genes entre las cepas asociadas a alimentos y las intestinales. Se han descrito casos bien documentados de la transferencia conjugativa de plásmidos de amplio espectro de huéspedes y de elementos transponibles entre enterococos, lactobacilos, lactococos y Listeria, en algunos de estos estudios se han realizado experiencias en animales in vivo. Los elementos transponibles y conjugativos parecen ser muy comunes en Bacteroides y Clostridium. Hay evidencias de que la transferencia de los determinantes de la resistencia a antibióticos puede ocurrir tanto dentro del género Bacteroides, como entre Bacteroides y otros géneros intestinales. Las estirpes de streptococos son bacterias en las cuales la transformación ocurre naturalmente. Ha sido posible transformar un estreptococo oral, Streptococcus gordoni, con DNA plasmídico disuelto en saliva humana. Aunque la frecuencia de transformación en condiciones intestinales es actualmente difícil de estimar, se ha detectado la transformación experimental de Escherichia coli y Bacillus subtilis en diversas ma-

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trices de alimentos, indicando que podría ocurrir un flujo de genes entre los microorganismos asociados a los alimentos y varios contaminantes sin relación. En conclusión, parece que la comunidad microbiana intestinal comparte un conjunto considerable de genes, probable y principalmente por mecanismos de transferencia génica mediada por conjugación. Por ello, los microorganismos asociados a alimentos podrían interaccionar de forma continua con la microflora intestinal, y esto debe ser considerado a la hora de evaluar la seguridad del eventual uso de MGM en los alimentos.

7.5.3.

El caso concreto del triptófano

El triptófano es un aminoácido natural, utilizado desde hace más de 20 años en suplementos dietéticos y alimentos infantiles, así como en el tratamiento de ciertos trastornos entre los que se incluyen la depresión, la obesidad y el insomnio. A finales de 1989 se produjo un brote repentino de un síndrome debilitante en Estados Unidos que causó varias docenas de muertes y efectos en otras cinco mil personas. Esta enfermedad se asoció al consumo de triptófano. Como primera medida la FDA (Food and Drug Administration) retiró el fármaco y comenzó a investigar la causa del síndrome. Las pruebas apuntaban a una contaminación en el triptófano producido por el fabricante japonés Showa Denko. El triptófano se fabrica a escala industrial mediante un proceso de fermentación, seguido por varias etapas de purificación. Entre diciembre de 1988 y junio de 1989 los técnicos de esta empresa cambiaron su proceso de fabricación. Introdujeron una nueva cepa bacteriana genéticamente modificada y alteraron sus procedimientos de purificación. Saltándose parcialmente una etapa de filtrado de impurezas. Con posterioridad fueron detectadas casi sesenta impurezas diversas en el triptófano fabricado. Dos de las cuales son las principales sospechosas de ser las causantes del síndrome. El triptófano de otros fabricantes está libre de impurezas y continúa siendo utilizado en todo el mundo tanto en suplementos dietéticos como en investigación clínica. El caso del triptófano contaminado suscitó gran preocupación, cómo era posible que una compañía farmacéutica de primer orden pudiera cambiar arbitrariamente sus protocolos y no detectara la presencia de numerosos contaminantes en su «nuevo» producto. Las normas de la FDA en aquellos momentos establecían que el

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porcentaje mínimo del contenido del producto etiquetado fuera del 98,5% y el triptófano de la compañía japonesa era puro en un 99,6%, pero el sistema de control no examinaba de qué está compuesto el resto del fármaco (el 0,4% restante). Este caso sirvió para que los detractores de la utilización de la ingeniería genética aumentaran sus argumentos en contra del uso de los OMG aunque la causa del síndrome fuera un fallo y falta de control en los protocolos de purificación. Pero en todo caso este ejemplo nos sirve para considerar que aunque los riesgos que suponen la aplicación de MGMs en alimentos son teóricos ya que no se han utilizado hasta ahora, hay que tener en cuenta los riesgos involuntarios e imprevistos que puedan afectar a la salud humana. El caso del triptófano demuestra la necesidad de nuevos controles para verificar la seguridad de los productos siempre que haya habido un cambio importante en las condiciones de la fabricación, incluyendo la introducción de la tecnología transgénica. La evaluación debe hacerse caso por caso, aplicando los estudios necesarios y apropiados, teniendo en cuenta la naturaleza y el uso previsto del producto.

7.6.

ASPECTOS REGULADORES

La regulación sobre el etiquetado y trazabilidad de los OMGs y los productos derivados de OMG fueron aprobados en el 2003 (Reglamento 1883/03 de 22 de septiembre de 2003). La Unión Europea, con el fin de proteger la salud humana y el medio ambiente, regula las actividades con organismos modificados genéticamente mediante dos Directivas básicas: Directiva 2009/41, relativa a la utilización confinada de microorganismos modificados genéticamente y la Directiva 2001/18/CE, sobre liberación intencional en el medio ambiente de organismos modificados genéticamente.

7.6.1.

Métodos de evaluación de la seguridad de los MGMs de alimentos

Hasta ahora tenemos escasa experiencia sobre la evaluación toxicológica de alimentos complejos y estirpes microbianas individuales. Por lo tanto el concepto de la equivalencia substancial (véase Capítulo 11) ha sido introducido por la Organización Mundial de la Salud y la Organiza-

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BIOTECNOLOGÍA Y ALIMENTACIÓN

ción para la Agricultura y Alimentación (OMS y FAO) para facilitar, prevenir y analizar la seguridad de los nuevos alimentos. Si un nuevo alimento o componente del alimento resulta ser substancialmente equivalente a un alimento o a un componente existente en un alimento, puede ser tratado de manera semejante respecto a su seguridad. La evaluación toxicológica debe centrarse en aquellos aspectos en los cuales el nuevo alimento o el componente del alimento difiera claramente del tradicional. Las conclusiones de la OMS/FAO sobre la seguridad de los alimentos derivados de MGMs, son que se debe realizar una evaluación individual de riesgos y que no puede comercializarse un MGMs para su uso alimentario sin una evaluación de riesgos favorable llevada a cabo caso por caso.

7.6.2.

MGMs viables en los alimentos

Se han de tener en cuenta el grado y la implicación de la modificación genética del MGMs del alimento que lo hace diferente desde el punto de vista de la equivalencia substancial y en estos casos se requieren unos análisis más rigurosos para evaluar su seguridad. Nos podemos encontrar distintos tipos de MGMs: — La cepa del MGM contiene sólo DNA de la misma especie o de otra cercana. Por ejemplo, una cepa de un microorganismo iniciador en la industria de lácteos se podría transformar con un plásmido natural de una cepa relacionada, que tenga una característica funcional ventajosa, por ejemplo, la resistencia a fagos; la nueva cepa sería más útil para su uso industrial. Aquí la equivalencia substancial de la cepa que resulta es obvia, y los riesgos se pueden comparar a los de cualquier otra cepa iniciadora con funciones similares. — El MGM se ha manipulado para cambiar, cualitativa o cuantitativamente, los productos metabólicos finales presentes en un alimento. En este caso el establecimiento de la seguridad es más complejo, se tendrían que evaluar tanto la seguridad de los metabolitos como los posibles efectos que los cambios metabólicos puedan causar. Incluso cuando las rutas metabólicas que se han modificado experimentalmente sean bien conocidas y estén bien caracterizadas, el caso polémico de la producción de triptófano por un MGM (véase arriba) demuestra que los efectos involuntarios no deben ser pasados por alto.

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— Se han introducido nuevas enzimas o nuevas proteínas. En estos casos las características y las cantidades de las proteínas nuevas son, naturalmente, de crucial importancia. Las proteínas procedentes de alimentos conocidos como seguros y en las cantidades similares a de las convencionales no deben presentar un problema particular, mientras que las proteínas sin una historia previa para su uso como alimento, o derivadas de fuentes que se saben pueden causar problemas en algunos grupos de consumidores, necesitan una atención especial. La alergenicidad es uno de los riesgos que se deben evaluar, según los principios diseñados por la FAO y la OMS. En la mayoría de los casos la evaluación toxicológica de las proteínas purificadas sería suficiente, aunque si las nuevas actividades enzimáticas modifican la matriz del alimento, estos cambios deberían ser evaluados con mayor atención. — Las características fisiológicas del organismo han cambiado de manera que afecta a su potencial colonización. En teoría, por ejemplo, cambiar el pH o la termotolerancia de una estirpe, puede conducir a mejorar la supervivencia en el aparato gastrointestinal, y ello puede suponer cambios en la composición y las funciones de la microflora intestinal. Tales situaciones son difíciles de predecir, y los modelos gastrointestinales, las experiencias con animales y los ensayos humanos serían requeridos probablemente para la evaluación de la seguridad. — El MGM procede de una especie sin historia en su uso alimentario o de una especie con estirpes patógenas conocidas. En este caso la no-patogenicidad y la no-toxicogenicidad del organismo se deben verificar por separado, además de evaluar la seguridad de la modificación genética concreta.

7.6.3.

Los aspectos de la contención genética

A tenor de lo mencionado anteriormente una de las preocupaciones por el uso de MGM viables asociados a alimentos es la contención de la modificación genética, puesto que estos organismos, en la mayoría de los casos, son consumidos vivos, y algunos podrían sobrevivir en el tracto intestinal. La conjugación entre diferentes bacterias puede ocurrir en el intestino, entre los microorganismos asociados a alimentos, especialmente entre bacterias ácido lácticas, hay varias especies y estirpes en las cuales se conocen plásmidos conjugativos, factores de sexualidad y transposones. Es pues razonable asumir que la probabilidad de conjugación de-

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BIOTECNOLOGÍA Y ALIMENTACIÓN

penda del parentesco del MGM con la microflora intestinal y del tiempo de permanencia en el aparato gastrointestinal. La posibilidad de conjugación intergenérica en el intestino no puede ser descartada, después las observaciones en Bacteroides citadas anteriormente. Se han realizado algunos experimentos con animales que fueron alimentados con DNA del bacteriófago M13 o del gen de la proteína verde GFP que se mezclaron con la matriz del alimento suministrado a los animales. Se observó que fragmentos de este DNA pueden pasar a la sangre del animal y desde allí son fagocitados por diferentes células del sistema inmunitario debido a las funciones de defensa que tienen dichas células. El significado de este fenómeno natural con respecto a la seguridad del organismo receptor es difícil de interpretar, ya que muchos alimentos contienen inevitablemente grandes cantidades de DNA de bacterias, plantas y animales y el hombre está acostumbrado a utilizar este DNA como alimento. De hecho, otros experimentos han demostrado que en ratones alimentados con hojas de soja se detecta el gen del Rubisco (gen presente en todas los vegetales, que codifica la proteína más abundante e importante del planeta pues permite la fijación del CO2 durante la fotosíntesis) en las células del sistema inmunitario. En cualquier caso hay que señalar que no se ha detectado la expresión de estos genes administrados por vía oral en las células del animal y tampoco se ha detectado que el DNA de los alimentos llegue a las células de la línea germinal. Aunque poco probable es posible que un transgén de un MGM pueda ser introducido en una bacteria intestinal. Las consecuencias para la salud de tales intercambios genéticos dependen de la naturaleza del gen. El uso de marcadores de resistencia a antibióticos, que se podrían transferir entre bacterias del intestino y patógenos potenciales, ha sido muy discutido en debates sobre el uso de organismos genéticamente modificados. Y mucho antes que se discutiera el uso de estos marcadores en plantas modificadas genéticamente ya estaba claro que su uso en MGMs no era admisible. Por ello se desarrollaron vectores de categoría alimentaria que no contienen genes de resistencia a antibióticos que serían los utilizados en alimentos. En todo caso, la legislación actual indica que la aprobación del uso de un Microorganismo Genéticamente Modificado y la evaluación de su seguridad debe hacerse caso por caso.

7.6.4.

Enzimas de alimentos

El punto de partida para la evaluación de la seguridad de las enzimas de los alimentos es el establecimiento de la no patogenicidad y de

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la no toxigenicidad del organismo que la produce. El ensayo real para comprobar la seguridad de la enzima, si el organismo productor es un hongo, se basa principalmente en comprobar la toxicidad sobre un animal que la toma por vía oral y la comprobación de la ausencia total de micotoxinas.

7.6.5.

Saborizantes, aditivos y otros ingredientes de los alimentos

En la mayoría de los casos los saborizantes, aditivos y otros ingredientes del alimento no contienen ni el organismo productor, ni DNA modificado. Por lo tanto, los principios generales que rigen la evaluación de la seguridad de los compuestos químicos que se añaden a los alimentos se podían aplicar a estas sustancias. Sin embargo, hay que tener en cuenta la posibilidad de contaminantes involuntarios resultantes del organismo o del proceso de la producción (recuérdese el caso del triptófano).

7.7.

7.7.1.

LAGUNAS EN EL CONOCIMIENTO DE LOS MICROORGANISMOS Alimentos fermentados

El adecuado empleo de MGMs en fermentaciones para la obtención de alimentos está obstaculizado por la falta de conocimientos sobre la influencia de genes específicos en el proceso de fermentación. Estas lagunas son particularmente acusadas en características complejas como el aroma, la maduración y la textura, que a menudo también dependen de factores ambientales. Por eso, está en discusión si la tecnología transgénica es la metodología óptima para mejorar muchos procesos tradicionales o si en muchos casos, la selección convencional de la estirpe y el ajuste de condiciones del proceso podrían ser los métodos de elección, como hasta ahora. Sin embargo, los MGM podrían tener un papel muy importante en la producción de nuevos alimentos fermentados con mayor valor nutritivo, y con propiedades más saludables. Esta línea de investigación es muy atractiva y está en el punto de mira para el diseño y el desarrollo de productos futuros. Sin embargo, en estas áreas hay muchas incertidumbres, sobre todo relacionadas con la seguridad y control de estos alimentos.

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7.7.2.

BIOTECNOLOGÍA Y ALIMENTACIÓN

Las interacciones con la microflora del anfitrión

Las interacciones de MGMs con la microflora endógena y las actividades fisiológicas asociadas son cruciales a la hora de evaluar sus eventuales ventajas y sus potenciales peligros. Las funciones que la microflora humana ejerce sobre la salud y la enfermedad del hombre todavía no son bien conocidos. Estas interacciones se están evaluando actualmente por expertos a petición de la OMS y la FAO y por lo tanto también se evalúa la seguridad de los alimentos derivados de MGMs.

7.8.

CONCLUSIONES

La fermentación de alimentos es una práctica antigua pero de gran valor actual. La introducción de MGMs podría mejorar los procesos existentes y posibilitar la producción de nuevos productos con mejoras desde el punto de vista nutricional dentro de unos márgenes de seguridad. El grado de seguridad de cualquier MGM utilizado en el futuro debe ser riguroso, como el de cualquier otro nuevo alimento, reconociendo que en ningún caso se pueden eliminar absolutamente todos los riesgos. Los riesgos o peligros se deben comparar con los que se acepten para los alimentos convencionales, y deben ser sopesados ante las ventajas previstas. La evaluación de la seguridad de los aditivos alimenticios producidos por MGMs debe seguir las mismas pautas y prácticas que se aplican a los productos convencionales. Sin embargo, se debería hacer un énfasis especial en la eliminación de contaminantes cada vez que se modifica un organismo o un proceso de la producción, ya sea por técnicas de DNA recombinante o por métodos de mutagénesis convencionales.

BIBLIOGRAFÍA DANIEL, C.; ROUSSEL, Y.; KLEEREBEZEM, M. y POT, B: Recombinant lactic acid bacteria as mucosal biotherapeutic agents. Trent in Biotechology 29 (10): 499-508 (2011). HAMMOND, J. R.: «Genetically modified brewing yeasts for the 21st century. Progress to date», Yeast 11, 1613–1627 (1995). MOLLET, B.: «Genetically improved starter strains: opportunities for the dairy industry», International Dairy Journal 9, 11-15 (1999). OSTERGAARD, S., OLSSON, L., NIELSEN, J.: «Metabolic Engineering of Saccharomyces cerevisiae», Microbiology and Molecular Biology Reviews 64, 30-50 (2000).

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WRIGHT, A., BRUCE, A.: «Genetically modified microorganisms», Trends in Food Science & Technology 14, 264-276 (2003).

Direcciones de Internet Agencia Española de Seguridad Alimentaria http://www.aesan.mspsi.gob.es/ Directiva 2009/41/CE de Parlamento Europeo de 6 de mayo de 2009, relativa a la utilización confinada de microorganismos modificados genéticamente http://eurolex.europa.eu/LexUriServ/LexUriServ.do?uri=CELEX:32009L00441: ES:NOT Documento de la FAO y WHO sobre Seguridad de alimentos derivados de Microorganismos genéticamente modificados http://www.who.int/foodsafety/publicatons/biotech/es_sept2001/en/index.html Departamento de Biotecnología del Instituto de Agroquímica y Tecnología de Alimentos (CSIC). El objetivo del departamento es la obtención de alimentos más seguros, de mayor calidad y más sanos a través de los estudios sobre microorganismos y los bioprocesos alimentarios en los que éstos participan. En esta página encontrará enlaces a las distintas líneas de trabajo y trabajos publicados. http://www.iata.csic.es/IATA/dbio/ Lista de los organismos que se han secuenciado por completo http://www.genome.jp/kegg/catalog/org_list.html

Tema 8 LA BIOTECNOLOGÍA EN LA AGRICULTURA: PLANTAS TRANSGÉNICAS

Los vegetales constituyen el componente nutricional más importante para la humanidad y son la fuente de multitud de materias primas. Por este motivo la investigación en el campo de la ingeniería genética de plantas recibe una gran atención en los organismos públicos, pero también, debido a su enorme interés comercial, ha recibido un fuerte impulso por parte de las grandes multinacionales del sector agroalimentario. Esto, unido a la menor dificultad que presenta la modificación genética de las plantas con respecto a los animales, ha hecho que en tan sólo dos décadas se haya avanzado de una forma espectacular en este campo. Hoy día, se cultivan una gran variedad de especies vegetales de interés agrícola y comercial modificadas genéticamente (plantas GM llamadas también plantas transgénicas) y la extensión de estos cultivos en el mundo crece de forma exponencial. Actualmente se encuentran en el mercado una gran variedad de productos alimentarios procedentes de estos cultivos. En este tema se analizan las estrategias y las técnicas que se utilizan, así como los problemas específicos que se plantean a la hora de lograr la modificación genética de plantas. Se presentan las diversas aplicaciones que las plantas GM pueden proporcionar, y se analizan con detalle algunos ejemplos de plantas modificadas genéticamente relacionadas con el campo de la alimentación.

ESQUEMA DE CONTENIDOS 8.1. 8.2. 8.3. 8.4. 8.5.

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8.12.

8.13.

Importancia de las plantas para la alimentación Unas bases de Botánica La modificación genética de las plantas Un poco de Historia Estrategias para la modificación genética de plantas 8.5.1. Cultivos de células vegetales 8.5.2. Transformación de las células vegetales 8.5.3. Diseño de la construcciones génicas Transferencia de genes con vectores específicos de plantas 8.6.1. El plásmido Ti 8.6.2. El plásmido Ri 8.6.3. Vectores víricos Trasferencia directa de genes Expresión de genes exógenos en células vegetales 8.8.1. Regiones reguladoras 8.8.2. Genes marcadores Algunas aplicaciones de la ingeniería genética en plantas Mejora de las propiedades de los cultivos 8.10.1. Aumento de la eficiencia del metabolismo 8.10.2. Aumento del valor nutritivo 8.10.3. Maduración controlada de frutos y flores 8.10.4. Resistencia a condiciones ambientales extremas Mejora del rendimiento.Cultivos resistentes a plagas, enfermedades y herbicidas 8.11.1. Resistencia a plagas de insectos 8.11.2. Resistencia a enfermedades víricas 8.11.3. Resistencia a hongos y bacterias 8.11.4. Resistencia a herbicidas Las plantas como factorías 8.12.1. Producción de fármacos 8.12.2. Producción de plásticos biodegradables Descontaminación ambiental

8.1.

IMPORTANCIA DE LAS PLANTAS PARA LA ALIMENTACIÓN

Las plantas han estado muy vinculadas con el desarrollo de la civilización humana. Desde tiempos prehistóricos los seres humanos consumieron frutos y semillas como alimento y pronto comenzaron a cultivar y recolectar aquellas que tenían mejores cualidades. Las semillas desde el punto de vista nutritivo son un almacen muy concentrado de proteínas, aceites, carbohidratos y vitaminas, ya que estos compuestos son necesarios para la germinación y el desarrollo de la planta. Asimismo, tienen una gran ventaja sobre otro tipo de alimentos que, generalmente, resultan muy perecederos. Las semillas son fáciles de almacenar y pueden conservarse durante largos periodos de tiempo si se las mantiene secas, de tal modo que son de los pocos alimentos que pueden ser guardados en tiempos de abundancia para aprovecharlos en épocas de escasez. Pocos alimentos tienen esta doble ventaja. Todos los seres vivos del planeta dependen para su alimentación de las plantas, tampoco en esto los seres humanos hemos sido muy originales. Las únicas formas de vida en la Tierra que no dependen de las plantas para su existencia son algunas pocas especies de procariotas y protistas autótrofos. Para el resto de los seres vivos las plantas son indispensables ya que la energía de la luz solar entra a la biosfera a través de los cloroplastos de las plantas, y el carbono y otros elementos fundamentales para la vida como el nitrógeno y el azufre se incorporan a los ecosistemas como moléculas orgánicas gracias a que son asimilados por las plantas. Los seres vivos que no comen plantas se alimentan de otros que si las comieron. Las plantas están en la base de las cadenas alimentarias.

230

BIOTECNOLOGÍA Y ALIMENTACIÓN

La domesticación de algunas plantas para su uso como alimento, que puede considerarse la biotecnología más antigua, constituye un largo y paciente proceso que se inició hace miles de años y continúa en la actualidad. Durante este largo periodo siempre se ha buscado lo mismo: «mejorar», desde el punto de vista humano, las propiedades de estas plantas; lograr que tengan buenas y agradables condiciones nutritivas, que tengan un mayor rendimiento, y que tengan características que favorezcan su cultivo y faciliten su recolección. El resultado de este proceso de domesticación, con profundas consecuencias evolutivas, es la «creación» de diversas variedades cuyo único objetivo es servir a las necesidades humanas, y cuya supervivencia está prácticamente limitada a su cultivo y su mantenimiento sería imposible sin los cuidados del hombre. No obstante, las cosechas a su vez han dependido de multitud de factores externos a las propias plantas domesticadas cuyas condiciones la humanidad no ha podido controlar, como la climatología y las plagas que han arruinado, y siguen haciéndolo todavía en porcentajes muy importantes, los rendimientos de los cultivos. Se estima que alrededor de unas 80.000 especies de plantas son comestibles, de las cuales los humanos únicamente cultivamos 300, aunque sólo 12 de ellas podemos considerar que son esenciales para la alimentación de la humanidad, y tan sólo 3, arroz, maíz y trigo, pueden ser consideradas como la base de la alimentación mundial. Además de su importancia alimenticia, las plantas han representado para la humanidad una fuente fundamental para la obtención de muchos otros compuestos: fibras vegetales para el vestido y la construcción, productos farmacéuticos, tintes, cosméticos, etc.

8.2.

UNAS BASES DE BOTÁNICA

La mayor parte de las plantas que el ser humano cultiva y explota, así como las semillas y frutos que consume proceden de las plantas que los botánicos denominan ANGIOSPERMAS, que son las plantas con flores, aunque también son comestibles las semillas de algunas GIMNOSPERMAS o plantas sin flores, como es el caso de los piñones del pino. Las plantas con flores son fundamentales para nuestra supervivencia como especie. Todos los cultivos importantes que nos proporcionan alimento como los cereales: trigo, arroz, maíz y cebada; las plantas leñosas, de las cuales obtenemos madera, como el roble, el castaño, el cerezo; las que nos proporcionan fibras como el algodón y el lino; y otros muchos

LA BIOTECNOLOGÍA EN LA AGRICULTURA: PLANTAS TRANSGÉNICAS

231

productos como el caucho, el tabaco, el café, el chocolate, los aceites aromáticos para los perfumes, y los miles de medicamentos como la digitalina y la codeína, por poner solamente algunos ejemplos, son obtenidos de plantas que pertenecen al grupo de las Angiospermas. Las Angiospermas son actualmente las plantas con más éxito y sus más de 235.000 especies dominan el planeta, aunque no siempre en la historia de la Tierra fue así ya que su aparición es muy reciente, unos 180 millones de años según el registro paleontológico. Comenzaron a ser muy abundantes hace unos 120 millones de años, coincidiendo con el declive de los dinosaurios. Se han adaptado a todos los ambientes y presentan una amplia variedad de formas y tamaños: las pequeñas plantas herbáceas de los pastos y praderas con diminutas flores, las plantas con grandes y llamativas flores y los gigantescos árboles de los bosques. Las Angiospermas son plantas vasculares que se reproducen de manera sexual, mediante un proceso de doble fecundación único entre los seres vivos, formando flores y frutos que las distinguen de todas las otras plantas. El fruto protege la semilla en desarrollo y a menudo ayuda a su dispersión. La flor y el fruto representan mecanismos por los cuales los animales son atraídos para participar en la estrategia reproductora de este tipo de plantas, y probablemente evolucionaron como un pago a los animales por los servicios prestados en el transporte de las semillas. Dentro de las Angiospermas se distinguen dos clases: las monocotiledóneas, que son generalmente plantas herbáceas con hojas largas y estrechas, con nerviaciones paralelas, entre las que se incluyen los pastos, los lirios, la cebolla, las palmeras, y los cereales cuyas semillas son fundamentales para el alimento de la humanidad como son el trigo, el arroz y el maíz; y las dicotiledóneas que son más diversas e incluyen muchas más especies (al menos 180.000), entre las que podemos citar, por ejemplo, el roble, los girasoles, los cactus, los arándanos, el tomate.

8.3.

LA MODIFICACIÓN GENÉTICA DE LAS PLANTAS

La manipulación genética de las plantas no es, estrictamente hablando, una novedad. El hombre ha modificado durante miles y miles de años el contenido genético de multitud de plantas de interés agrícola, en un proceso de domesticación largo y acumulativo, basado en cruces, incluso entre especies diferentes, y en la selección posterior de semillas, con unas prácticas que con el tiempo se fueron haciendo cada vez más sofisticadas. A pesar de que estos métodos eran lentos e inciertos, jugando el

232

BIOTECNOLOGÍA Y ALIMENTACIÓN

azar un papel bastante importante, se han logrado obtener especies vegetales que en poco se parecen a las originarias silvestres de las cuales derivaron tras siglos de paciente labor agrícola. Las nuevas tecnologías de ingeniería genética no han hecho sino acelerar la velocidad de este proceso y, sobre todo, afinar en la selección de caracteres, ya que permiten elegir genes en vez de mezclar genomas completos, pero tienen esencialmente el mismo fundamento y objetivo. Sin embargo, una diferencia sustancial es que los métodos de mejora clásica de plantas estaban limitados por la variabilidad genética, que podía ser suministrada únicamente por especies que se cruzaran entre sí, es decir, por especies próximas. El gran potencial, y a la vez el riesgo, de la ingeniería genética reside en que se han roto estos límites, desapareciendo las barreras para elegir y transferir genes entre especies e incluso entre taxones, lo que proporciona un amplio rango de posibilidades para suministrar el fenotipo deseado a un organismo. La ingeniería genética de plantas tienen un enorme potencial de aplicaciones y, al menos, tres factores importantes confluyen para explicar los impresionantes avances alcanzados en este campo: • Enormes intereses económicos y, por tanto, una elevada financiación destinada a la investigación para la mejora en la producción de frutos y semillas de interés para la alimentación humana y ganadera, con mejores cualidades y mayor rendimiento. Además del interés que tiene la obtención de nuevas variedades destinadas a condiciones ambientales adversas (salinidad, temperaturas elevadas) o para su cultivo en terrenos hasta ahora considerados no fértiles. Por otra parte, la creación de nuevas variedades de flores y plantas de interés ornamental es también un campo de enorme futuro comercial. A nivel industrial, las plantas son también una importante fuente de materias primas. Productos como el almidón y el azúcar tienen gran importancia para las industrias relacionadas con la alimentación, pero también con la energía. El etanol, obtenido por fermentación de la caña de azúcar se utiliza en mezcla con petroleo como combustible en los coches en Brasil. Productos como el algodón, el lino, etc., son la base de la industria textil. Así mismo, las plantas son la fuente de multitud de compuestos químicos para la industria farmacéutica, cosmética, de aditivos alimentarios, etc.

LA BIOTECNOLOGÍA EN LA AGRICULTURA: PLANTAS TRANSGÉNICAS

233

• Menor dificultad para obtener plantas transgénicas. La producción de plantas transgénicas es, al menos en teoría, mucho más sencilla que la de animales transgénicos. Las plantas tienen una gran capacidad regenerativa. En muchos casos, una sola célula manipulada genéticamente puede dar origen a la producción de una nueva variedad. Muchas células vegetales son «totipotentes», esto es, capaces de multiplicarse, diferenciarse y acabar formando plantas completas y fértiles. Esto representa una gran ventaja con respecto a la obtención de animales transgénicos, ya que se pueden obtener plantas genotípicamente alteradas a partir de una única célula transformada. Además, la larga historia de la agricultura ha proporcionado un profundo conocimiento de la genética de las plantas cultivadas y se dispone de una enorme variedad de líneas portadoras de mutaciones que hoy pueden ser explotadas a nivel molecular. La capacidad de autofecundación de muchas plantas y la producción de una numerosa progenie hace que sea más fácil encontrar mutaciones y recombinaciones poco frecuentes y obtener homocigotos. • Menor rechazo social que la manipulación genética en animales. Los experimentos de manipulación genética en plantas despiertan, en general, un menor rechazo y tienen una mayor flexibilidad legislativa que los realizados en animales en todos los paises del mundo. Sin embargo, hay que resaltar el importante rechazo social que se ha generado en los países de la Comunidad Europea a los cultivos agrícolas con semillas modificadas genéticamente. En la UE inicialmente se aprobaron 18 OGM, la mayoría de los cuales correspondían a cultivos de plantas relacionadas con la alimentación, este número se ha multiplicado en los últimos años (lista completa de transgénicos autorizados en la UE (http://ec.europa.eu/food/dyna/ gm_register/index_en-cfm) ha pesar de que se han establecido normas muy exigentes para su comercialización, en comparación con otros países de América y Asia. En contrapartida a estas ventajas, algunos sistemas vegetales presentan también una serie de inconvenientes que están frenando el desarrollo de su manipulación genética: • Muchas plantas presentan un genoma muy grande, con frecuencia debido a su poliploidía, lo que dificulta mucho la experimentación genética, pues el carácter introducido puede quedar diluido en el fondo genético natural y no manifestarse fenotípicamente.

234

BIOTECNOLOGÍA Y ALIMENTACIÓN

• A pesar de que muchas plantas se pueden regenerar a partir de una única célula manipulada genéticamente y se espera que sean un clon de esta célula, a menudo se producen células heterogéneas debido a una variación somatoclonal, frecuente en plantas, lo que crea graves problemas para esta experimentación. • Finalmente, hay que decir que las plantas monocotiledoneas, precisamente las que tienen un mayor interés desde el punto de vista de la alimentación, resultan muy difíciles de transformar, aunque el desarrollo de los métodos de biobalística para introducir los genes exógenos está consiguiendo bastantes éxitos.

8.4.

UN POCO DE HISTORIA

El asentamiento de los pueblos nómadas permitió que los primeros labradores de la tierra comenzaran a elegir y cultivar ciertas plantas para alimentarse y supuso el inicio de la civilización humana. Desde entonces los agricultores han sido profundos conocedores de la genética empírica y han acumulado conocimientos prácticos que han transmitido durante generaciones. La selección practicada ha permitido «crear» multitud de especies nuevas para uso y consumo de la humanidad. A lo largo del siglo XX se produjo un cambio drástico en la agricultura, pasando de la artesanía genética, practicado durante milenios, a la ingeniería genética. Algunas fechas que marcan hitos en el siglo bién para la agricultura son las siguientes:

XX

revolucionario tam-

1910 Los botánicos europeos comienzan a aplicar las leyes de Mendel para la mejora de plantas agrícolas; es el comienzo de la selección y mejora clásicas con base científica. 1950 Se obtiene la primera generación de plantas procedentes de un cultivo in vitro. 1968 Se inicia la Revolución Verde, se introducen las semillas híbridas en los países del Tercer Mundo. Comienza la comercialización de las semillas, y la introducción de productos industriales en la agricultura: herbicidas, pesticidas, abonos químicos. En pocos años se logra un incremento drástico en la producción agrícola y en el rendimiento de las cosechas, imprescindible para alimentar a la creciente población humana.

LA BIOTECNOLOGÍA EN LA AGRICULTURA: PLANTAS TRANSGÉNICAS

235

1973 Primer OGM. Los investigadores logran aislar genes e introducirlos en un genoma ajeno, se obtiene la primera bacteria Escherichia coli transgénica que representa el inicio de la Ingeniería Genética. 1983 Primera planta GM. Se obtiene la primera planta transgénica, una planta de tabaco con el gen de la resistencia al antibiótico kanamicina, lograda por un equipo de científicos de la multinacional agroalimentaria Monsanto. 1986 Primer OGM en el campo. Se emplea «Frostban» un spray que contenía bacterias modificadas genéticamente, a las que se les había eliminado un gen y como consecuencia estas bacterias no nucleaban los cristales de hielo sobre las hojas y así aumentaban la resistencia de la planta a las heladas. Se pulverizan sobre cultivos de fresas para protegerlos del daño provocado por las heladas en los campos de Brentwood (California). 1994 Primer OGM en el mercado. Se pone a la venta en USA el tomate FLAVR SAVR, modificado genéticamente de forma que tiene una maduración retardada, producido por la empresa Calgene. 1996 Se cultivan en Estados Unidos las primeras variedades de maíz y soja transgénicos. 1998 Se autoriza en Europa una variedad de maíz Bt. 2000 Se conoce el genoma completo de la planta Arabidopsis thaliana que se emplea como organismo modelo en experimentación vegetal. Se obtiene el arroz dorado desarrollado para producir β-caroteno para paliar las carencias de vitamina A en la población. 2002 Se completa la secuenciación del arroz. 2005 18 países en el mundo cultivan plantas transgénicas. 2009 25 países cultivan plantas transgénicas. 2010 Se descifra el genoma del tomate. Se cultiva en Estados Unidos maíz modificado genéticamente que incorpora 8 genes diferentes que le confieren protección contra insectos aéreos, contra insectos subterráneos y tolerancia a dos tipos diferentes de herbicidas.

236

8.5.

BIOTECNOLOGÍA Y ALIMENTACIÓN

ESTRATEGIAS PARA LA MODIFICACIÓN GENÉTICA DE PLANTAS

En términos generales, la modificación del genoma de una planta se puede plantear desde dos estrategias alternativas: ❏

Adición génica. Se pretende que la planta adquiera una nueva característica o propiedad para lo cual hay que añadir nuevos genes. Puede tratarse de añadir un gen, o más de uno, y puede proceder de otra variedad de la misma planta cultivada, de otra especie de planta silvestre o cultivada que tenga la característica que se quiere incorporar, o incluso el gen puede proceder de especies muy alejadas filogenéticamente como bacterias, levaduras o animales.

❏

Supresión génica. Se trata de eliminar alguna característica o propiedad no deseada, para lo cual hay que eliminar la acción del gen o los genes de la propia planta responsables de la misma. Generalmente no se trata de quitar físicamente el gen del genoma sino que la modificación genética persigue inactivar el producto del gen para impedir, retardar o ralentizar su acción. Aunque hay distintas estrategias la que ha dado mejores resultados es la de introducir en el genoma de la planta un gen que sea el inverso complementario, lo que se ha demominado un gen antisentido, de tal forma que cuando se transcribe el RNA, al tener la misma secuencia pero complementaria al del gen normal, hibridará y lo inactivará. De hecho esta tecnología se empleó en el tomate de maduración retardada, el primer alimento GM que fue aprobado para su comercialización.

Aunque las dos estrategias están siendo utilizadas, está claro que la segunda tiene unas aplicaciones más limitadas, las características no deseables que se tratan de eliminar son siempre limitadas, mientras que las nuevas características que se pueden incorporar a una planta sólo tienen el límite teórico de los genes disponibles para ellas. Las células vegetales son totipotentes esto significa que, si se proporcionan las condiciones físicas y nutricionales adecuadas, cualquier célula vegetal puede regenerar el fenotipo del organismo completo y diferenciado del cual derivó originariamente. Por este motivo, y a diferencia de lo que ocurre con los animales, resulta relativamente sencillo modificar las células vegetales aisladas introduciendo el gen o los genes de interés que van a conferir la nueva característica o eliminar la no deseable, y luego a partir de estas células se puede regenerar la planta GM completa.

LA BIOTECNOLOGÍA EN LA AGRICULTURA: PLANTAS TRANSGÉNICAS

237

En cualquiera de las dos estrategias comentadas, los pasos fundamentales que hay que tener en cuenta a la hora de plantear la modificación genética de una determinada especie vegetal son: ❏

Disponer de células en cultivo de la especie para transformar

❏

Diseñar y obtener la construcción génica que se va a utilizar

❏

Disponer de un método adecuado para transferir la construcción génica al interior del núcleo de la célula, una vez allí es necesario que se integre y que se exprese, de forma que sea estable

❏

Cultivar posteriormente las células transformadas y lograr regenerar la planta completa.

8.5.1.

Cultivos de células vegetales

Para obtener buenos cultivos de células vegetales se debe partir de pequeñas piezas de tejido denominadas explantes capaces de una rápida proliferación, como por ejemplo del ápice de raíz, de yemas o bien de semillas en germinación, todas estas regiones contienen células que se encuentran continuamente en ciclo de división. El explante se lava con un desinfectante, agua oxigenada o hipoclorito, para eliminar microorganismos, y se deja crecer en un medio nutritivo, donde dependiendo de la especie puede llegar a formar una masa indiferenciada de células denominada callo, que puede propagarse indefinidamente por divisiones en un medio nutricional adecuado suplementado con fitohormonas. El medio de cultivo suele contener sacarosa como fuente de carbono; una fuente de nitrógeno orgánico, por ejemplo aminoácidos, o inorgánico, como nitratos; sales inorgánicas, metales (Cu, Zn, Co y otros), vitaminas y hormonas vegetales (auxinas, giberelinas, citoquinas) reguladoras del crecimiento. Si una pieza de callo joven se transfiere a un medio de cultivo líquido y se agita, la masa celular se disgrega y se produce una suspensión de células que puede cultivarse indefinidamente, o bien puede sembrarse en un medio sólido en el que las células crecen, se dividen y forman callos de forma análoga a las colonias de bacterias. Esta forma de cultivo in vitro de tejidos es muy frecuente para conservar ciertas variedades de vegetales en los llamados bancos de germoplasma. En un momento dado, el estado de indiferenciación de estas células en cultivo puede alterarse, modificando el tipo y la concentración de fitohormonas en el medio, e inducir la diferenciación de raíces, tallos,

238

BIOTECNOLOGÍA Y ALIMENTACIÓN

etc., que permitirán regenerar una planta completa. Este proceso se denomina organogénesis y requiere unas condiciones específicas para cada especie. La capacidad con que una especie supera este proceso es clave para el desarrollo de plantas GM, y es una etapa bastante complicada experimentalmente en el caso de los cereales, a excepción del arroz y de algunas variedades de maíz.

8.5.2.

Transformación de las células vegetales

Las células vegetales tienen alrededor de la membrana plasmática una fuerte pared de celulosa, que supone un verdadero obstáculo físico para la entrada de genes. Para salvar este problema se pueden seguir varias estrategias, o bien liberar a la célula de esta barrera física, o bien diseñar sistemas que dirijan el DNA al interior de la célula incluso en presencia de la pared. Entre estos últimos se encuentran los métodos denominados de biobalística, que se comentarán en el apartado 8.7, o los de infección con bacterias y virus. Para la transformación se suelen utilizar «protoplastos», que son células vegetales a las que se les ha eliminado la pared celular por medio de tratamiento enzimático con celulasa y pectinasa. Se suelen emplear células de hoja, que son fáciles de dispersar y regeneran muy bien la planta completa. También son muy utilizados los protoplastos haploides de polen, ya que pueden regenerar plantas haploides que resultan de gran utilidad para analizar mutantes. La facilidad con que los protoplastos regeneran la planta completa es muy variable y depende de las especies. Los protoplastos al estar desprovistos de la pared externa facilitan la penetración de moléculas de DNA y por tanto son células más fáciles de transformar. Posteriormente, el protoplasto puede regenerar la pared celular en un medio sólido con los nutrientes y señales adecuadas, en un proceso que dura entre cinco y diez días, tras lo cual la célula comienza a dividirse y puede formar callos e incluso regenerar la planta completa. Otro sistema alternativo muy utilizado es la transformación de discos de hoja. Se recortan pequeños discos, de algunos milímetros de diámetro, de una hoja. Las células de su borde pueden ser fácilmente transfectadas por el plásmido de la bacteria Agrobacterium que hace de vector de genes, como veremos más adelante, y además, estas células tienen una gran capacidad regenerativa, si se transfieren a medios que estimulan la capaciad la diferenciación celular, son capaces de regenerar la planta completa, en un proceso que dura en total de 4 a 7 semanas. Resulta más

LA BIOTECNOLOGÍA EN LA AGRICULTURA: PLANTAS TRANSGÉNICAS

239

rápida que la regenaración a partir de protoplastos y es un sistema muy utilizado actualmente especialmente con las dicotiledoneas.

8.5.3.

Diseño de las construcciones génicas

En cualquier caso, bien se trabaje con células en cultivo o con protoplastos, para modificar genéticamente una planta se requiere introducir genes exógenos en el interior del núcleo de una célula vegetal y para ello hay que recurrir a vectores que transporten el gen o los genes, o bien utilizar técnicas que permitan la introducción directa del transgen. Previamente, es necesario diseñar la construcción de DNA adecuada que contenga el gen o genes de interés, pero también algunos elementos necesarios para asegurar su correcta expresión. Estos son las regiones reguladoras y el promotor del gen que permitirán que el gen sea activo y que lo sea en el momento y en el lugar correcto, es decir, que la proteína o proteínas se sinteticen en las células del tejido donde debe hacerlo. Además, suele ser muy útil introducir en la construcción otros genes que llamaremos marcadores de selección, que también se suelen denominar reporteros, que permitirán confirmar que se ha producido la integración. Generalmente se trata de algún gen de resistencia a antibióticos, que permitirá seleccionar fácilmente las células transformadas por su supervivencia en un medio de cultivo que contenga el antibiótico. La presencia de genes de resistencia a antibióticos en las plantas transgénicas representa uno de los puntos más criticados por los detractores de los cultivos con semillas transgénicas. Se ha investigado mucho en este campo y actualmente hay estrategias que permiten trabajar con otro tipo de marcadores e incluso se diseñan construcciones con marcadores que tras una primera etapa que facilitan la detección y selección son posteriormente eliminados. Estas cuestiones se tratarán con más detalle en el apartado 8.8.2.

8.6. 8.6.1.

TRANSFERENCIA DE GENES CON VECTORES ESPECÍFICOS DE PLANTAS El plásmido Ti

Uno de los métodos más utilizados para transformar células de plantas consiste en utilizar como vector para los genes foráneos el plásmido Ti (tumor-inducing) de la bacteria Agrobacterium tumefaciens. Ésta

240

BIOTECNOLOGÍA Y ALIMENTACIÓN

bacteria gram negativa es muy abundante en el suelo, y es capaz de infectar de forma natural a una gran variedad de especies diferentes del grupo de las dicotiledóneas, provocando la aparición de tumores llamados de agalla en corona. La bacteria penetra, a través de cualquier herida reciente en la epidermis de la planta, y se adhiere a la pared externa de una célula. Desde aquí, es capaz de transferir fragmentos del plásmido Ti, que se encuentra normalmente en el interior de estas bacterias, hasta el núcleo de la célula vegetal. La célula vegetal que ha adquirido el plásmido se convierte en una célula tumoral, creciendo de manera independiente y no regulada, y se dedica a sintetizar unos aminoácidos especiales, las opinas, y otros compuestos única y exclusivamente para alimentar a la bacteria. El plásmido Ti tiene un tamaño muy grande, es un DNA circular de unas 200Kb. Sin embargo, al interior de la célula vegetal sólo penetra un fragmento de este plásmido, llamado T-DNA (DNA transferido), que tiene un tamaño de entre 12 y 24 Kb, dependiendo de la cepa bacteriana. Esta región tiene una serie de características muy interesantes: — Una vez en el interior de la célula, el T-DNA no permanece como un plásmido independiente sino que se integra en uno de los cromosomas de la planta. Ésta es una característica muy interesante ya que gracias a ello todas las células descendientes, formadas por división de esa célula, portarán el DNA plasmídico debido a que se transmite con los propios cromosomas, produciéndose una transformación estable e irreversible de las células de la planta afectada. — Este T-DNA resulta por tanto un vector natural idóneo ya que en él se pueden introducir genes foráneos de interés y utilizar este sistema para la manipulación genética de las plantas dicotiledóneas, que son las que de forma natural son infectadas por la bacteria. — El T-DNA lleva una serie de genes, algunos de los cuales codifican para enzimas que intervienen en la síntesis de opinas. Éstas son unas moléculas derivadas de aminoácidos, sintetizadas por acción de las enzimas que la bacteria introduce en la planta utilizando los propios aminoácidos y otras moléculas de la planta, y que, sin embargo, son utilizados como nutrientes por la bacteria. Es decir, la infección de las células con el plásmido de la bacteria hace que estas células se pongan a trabajar para la bacteria de forma que suministran nutrientes para las propias bacterias.

LA BIOTECNOLOGÍA EN LA AGRICULTURA: PLANTAS TRANSGÉNICAS

241

Conviene reconocer que la humilde bacteria del suelo Agrobacterium ha logrado desarrollar todo un sistema de ingeniería genética de plantas para ponerlas a producir sustancias en su propio beneficio, algunos millones de años antes que el Homo sapiens fuera capaz de hacerlo. Además, como hemos dicho la infección provoca una proliferación desordenada de las células de la planta, debido a que el T-DNA lleva también un grupo de genes que codifican enzimas para la síntesis de hormonas vegetales, cuya superproducción induce una proliferación desordenada produciéndose un tumor, conocido como agalla de la corona. Hoy día se explota este sistema para introducir genes nuevos en plantas, pero para ello previamente es necesario realizar una serie de manipulaciones para modificar el propio plásmido Ti y hacerlo más adecuado. En la versión comercial que se utiliza se han eliminado los genes oncogénicos responsables del crecimiento tumoral de las células de la planta, y también se han eliminado los genes responsables de la producción de opinas. Sin embargo, se suele dejar la región del promotor de estos genes de opinas junto a la cual se añade el gen de interés, de este modo se asegura la expresión del gen foráneo introducido a la planta. También es necesario incorporar genes marcadores para identificar y seleccionar las células vegetales transformadas. El promotor de las opinas es útil para expresar genes de forma constitutiva, es decir, genes que van a estar permanentemente activos produciendo su producto. Sin embargo, en la práctica a veces se requiere que los genes que se introducen se expresen únicamente en determinadas células de la planta, por ejemplo en semillas, o en determinados momentos del desarrollo. Esto complica bastante las cosas y hace necesario el uso de promotores específicos de la planta o al menos promotores que se puedan controlar por factores específicos y así lograr regular la expresión del gen.

8.6.2.

El plásmido Ri

Otro vector específico es el plásmido Ri (root inducing) de la bacteria Agrobacterium ryzobium, cuya utilización sigue básicamente el mismo proceso que acabamos de comentar para el Ti. Este plásmido cuando infecta una planta produce raíz de cabello, o aparición de múltiples raíces por una proliferación desordenada de las células de la raíz.

242

8.6.3.

BIOTECNOLOGÍA Y ALIMENTACIÓN

Vectores víricos

También algunos virus de plantas pueden ser utilizados como vectores de genes foráneos. Si son adecuadamente manipulados son capaces de transportar un DNA como pasajero al interior de la célula vegetal. Los mayores avances se han logrado con geminivirus y caulimovirus, dentro de estos últimos, especialmente utilizado ha sido el virus del mosaico de la coliflor. También los virus con genoma de RNA que son muy abundantes en el mundo vegetal están siendo utilizados como vectores de genes, los más frecuentes son los del mosaico de la cebada y el virus del mosaico del tabaco.

8.7.

TRANSFERENCIA DIRECTA DE GENES

Debido a que el sistema de Agrobacterium no es eficaz en las plantas monocotiledoneas, precisamente las de mayor interés agrícola como los cereales, se han tratado de desarrollar alternativas para introducir DNA en las células vegetales basadas en métodos físicos. Algunas células vegetales pueden ser transformadas directamente, por transfección de fragmentos de DNA añadidos al medio de cultivo, aunque, en general, la eficiencia de la transformación directa es bastante baja. Hoy día se trata de mejorarla utilizando diversas técnicas que favorecen la penetración del DNA foráneo. Algunas de estas técnicas son: ❏

Permeabilización de membranas — La electroporación, que consiste en la apertura de poros en la membrana por tratamiento con impulsos eléctricos controlados. Utilizando campos de entre 200 y 600 V/cm se consigue transferir DNA a células de arroz y de maíz con rendimientos bastante buenos. — La permeabilización química, por ejemplo con etilen glicol. — La permeabilización con ultrasonidos. — También se utilizan liposomas para transportar DNA al interior de las células.

❏

Biobalística

Otras técnicas más sofisticadas son las conocidas como biobalística que incluyen el uso de «pistolas génicas». Estas técnicas se basan en la utilización de microesferas de metales, como oro o tungsteno, de 0,4 a

LA BIOTECNOLOGÍA EN LA AGRICULTURA: PLANTAS TRANSGÉNICAS

243

4 μm de diametro, recubiertas del DNA que se desea introducir que es precipitado sobre ellas con cloruro cálcico, y que se disparan sobre las células, o bien el uso de microproyectiles que llevan dentro gotitas del DNA a transfectar en solución. El mecanismo de disparo se basa en una pistola especial que lanza las partículas a más de 400m/s sobre las células de forma que penetran sin destruir la membrana, todo el sistema funciona en un vacío moderado para evitar el rozamiento con el aire, condiciones que las células vegetales soportan durante uno o dos minutos. Tras el bombardeo, las células son colocadas en condiciones adecuadas para crecer y regenerar la planta.

8.8. 8.8.1.

EXPRESIÓN DE GENES EXÓGENOS EN CELULAS VEGETALES Regiones reguladoras

Las cosas no son generalmente tan sencillas y, con frecuencia, los genes introducidos en las plantas, sea cual sea el procedimiento que empleemos para ello, plantean problemas de expresión y de mantenimiento en las células, resultando que su presencia y actividad es sólo transitoria. Otras dificultades adicionales surgen cuando el producto del gen foráneo introducido, es decir la proteína, es rápidamente degradada por los sistemas enzimáticos de la planta, o bien, por el contrario, cuando el compuesto que interesa no puede ser correctamente producido al faltar enzimas o proteínas adecuadas para su procesamiento, empaquetamiento final, etc. Está claro que los problemas de la ingeniería genética para obtener plantas modificadas genéticamente no finalizan al encontrar un vector o un sistema adecuado para introducir un gen foráneo más bien, por el contrario, se puede decir que es cuando verdaderamente comienzan. En este punto los avances en el conocimiento de la genética molecular básica de las plantas, la regulación de la expresión de los genes y el desarrollo, son los cimientos sobre los que crece y puede progresar la ingeniería genética aplicada de plantas. La expresión constitutiva o continuada de los genes incorporados a plantas se consigue cuando se colocan en los vectores junto a regiones reguladoras como por ejemplo los promotores de opinas, de los que habla-

244

BIOTECNOLOGÍA Y ALIMENTACIÓN

FIGURA 8.1. Esquema de la construcción de un plásmido para la inserción de genes foráneos en plantas.

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mos anteriormente. Pero muchas veces puede resultar más interesante que el gen o los genes exógenos insertados no se expresen hasta que sean activados específicamente, para lo cual se colocan frente a promotores regulables no constitutivos, que por ejemplo se activen únicamente en determinado momento del desarrollo o únicamente en cierto tejido. Para ello se utilizan promotores como por ejemplo el de la subunidad pequeña de la enzima rubisco (ribulosa difosfato carboxilasa del ciclo de Calvin) que se activa solamente en los tejidos fotosintéticos, como las hojas; o bien promotores que se activan únicamente en las flores o en la raíz. También son muy interesantes los promotores que se activan en determinadas situaciones de estrés, como es el caso de los promotores de los genes que codifican las proteínas de choque térmico (genes HS ó heat shock). El uso de estas señales permite controlar con mayor o menor precisión la expresión de los genes foráneos incorporados. La búsqueda de promotores específicos de tejidos tiene una enorme importancia para el desarrollo de plantas transgénicas más específicas y seguras. Por ejemplo, plantas que expresen sólo un insecticida que lleven incorporado en aquellos tejidos de la planta que son atacados por el insecto o el patógeno, permaneciendo sin expresarse en aquellos que son comercializados como alimento, por ejemplo frutos y semillas. Muchas veces el gen o los genes incorporados no son activos a pesar de haber diseñado una construcción con los reguladores adecuados. Y es que las plantas disponen de mecanismos protectores contra la invasión de DNA ajeno. Uno de estos es la metilación del DNA extraño integrado en el cromosoma, lo cual impide su transcripción y por tanto su expresión. Otras veces, se produce una inactivación de toda la cromatina alrededor de la región donde se encuentra el gen intruso lo que provoca el mismo resultado. Algunas plantas disponen de un mecanismo más sofisticado conocido como cosupresión, que consiste en que se bloquean secuencias que sean de algún modo semejantes a otras endógenas. Todo esto hace que lograr el éxito en este tipo de experimentación sea bastante más difícil y complejo de lo que a primera vista podría parecer. El estudio y el conocimiento básico de la genética de plantas son fundamentales para avanzar con nuevas estrategias.

8.8.2.

Genes marcadores

La identificación de las células vegetales que han incorporado un determinado gen exógeno, es decir que han sido efectivamente transformadas, es factible mediante el uso simultáneo de algún otro gen que codifi-

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BIOTECNOLOGÍA Y ALIMENTACIÓN

que para alguna actividad fácilmente detectable y que se inserta junto con el de interés actuando de testigo, por lo que se suele llamar gen marcador o reportero. Uno de los más empleados en vegetales es el gen GUS, procedente de la bacteria E. coli que codifica para la glucuronidasa. Esta actividad enzimática sobre un compuesto coloreado se puede valorar histoquímicamente. Otro gen marcador muy utilizado es el de la luciferasa una enzima que en presencia de ATP degrada la luciferina emitiendo luz y que por tanto puede valorarse con ayuda de un luminómetro o de una placa o película fotográfica sensible a la luz. Quizá los marcadores más ampliamente utilizados son los genes de resistencia a antibióticos procedentes de bacterias, que permiten no sólo identificar a las células transformadas sino también seleccionarlas separándolas del resto de células que no han incorporado DNA exógeno en un medio con el antibiótico, ya que sólo éstas sobrevivirán. La mayoría de los vectores que se utilizan llevan una copia del gen bacteriano de resistencia a la kanamicina (kanR) o a la neomicina (nptII). A pesar de que, hasta el momento, ninguna de las proteínas de los genes utilizados como marcadores ha demostrado ser nociva para la salud humana o animal, los genes marcadores han sido el blanco de muchas de las críticas a las plantas transgénicas. Se argumenta que podrían tener efectos tóxicos, alergógenos, o provocar un aumento de la resistencia a antibióticos o transferir esta resistencia a otras especies. Actualmente se emplean distintos métodos para obtener plantas transgénicas libres de genes marcadores. La idea es utilizar el marcador solamente en las primeras etapas para identificar y seleccionar las células transformadas, y posteriormente eliminarlo antes de obtener la planta transgénica. Para ello la estrategia es que el gen que se desea clonar en la planta y el gen marcador se localicen en sitios diferentes del genoma de la planta receptora, en cromosomas distintos, para que tras unos cuantos cruces iniciales dirigidos se pueda perder el marcador por segregación cromosómica. Otra estrategia es que el marcador vaya incluido en el interior de una secuencia transponible móvil, que favorece su eliminación posterior. En esta línea se está utilizando el gen cre procedente del bacteriofago P1, que codifica para una enzima que cataliza la escisión de fragmentos de DNA flanqueados por una secuencia de reconocimiento de 35bp. La estrategia consiste en utilizar el gen marcador de resistencia flanqueado por estas secuencias de reconocimiento de 35bp, e incluir también el gen cre. Una vez en el interior de la célula vegetal transformada, el producto del gen cre cataliza la escisión del gen de resistencia al antibiótico. También se puede lograr por cruzamientos dirigidos la eliminación posterior del propio gen cre, clonado en un vector distinto y por

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tanto integrado en otro cromosoma diferente del gen de interés. En definitiva, hoy día existen estrategias cada vez más sofisticadas que permiten evitar la presencia de secuencias distintas a la del gen de interés que se desea clonar en la planta. Aunque en las plantas transgénicas de primera generación que fueron comercializadas se utilizaron marcadores de resistencia a antibióticos, actualmente se dispone de protocolos eficaces que evitan la presencia de genes marcadores no deseables en las plantas transgénicas, eliminando de este modo uno de los argumentos importantes en contra de las mismas.

8.9.

ALGUNAS APLICACIONES DE LA INGENIERÍA GENÉTICA EN PLANTAS

El principal objetivo de la modificación genética de las plantas comestibles es lograr un material biológico capaz de dar respuesta a los problemas tradicionales de la agricultura, como la pérdida de cosechas por agentes patógenos, plagas y malas hierbas al dotar a las propias plantas cultivadas con genes de defensa frente a estos enemigos naturales que actualmente son combatidos por el agricultor con armas químicas. Pero también es interesante destacar que por medio de la ingeniería genética se pueden abordar aspectos totalmente nuevos, como la mejora de las propiedades nutritivas y se pueden plantear utilidades no ensayadas hasta ahora en la explotación por el hombre de las plantas cultivadas. Así, junto a la mejora de las resistencias, la calidad del producto y de sus características agronómicas, aspectos que se venían aplicando por los métodos tradicionales, aparecen nuevas posibilidades de difícil o imposible abordaje por las técnicas de mejora convencional o incluso totalmente inéditas, como la producción de vacunas, anticuerpos y otros fármacos en las frutas y semillas comestibles, la obtención de productos de interés industrial, como por ejemplo plásticos, y la recuperación por las plantas de cultivo de suelos contaminados.

8.10. 8.10.1.

MEJORA DE LAS PROPIEDADES DE LOS CULTIVOS Aumento de la eficiencia del metabolismo de las plantas

La fotosíntesis es uno de los procesos realizados por las plantas de mayor transcendencia para el conjunto de la vida en el planeta. Es el paso

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fundamental para la obtención de materia orgánica a partir del CO2 atmosférico y de producción de O2, de los cuales depende el resto de los seres vivos del Planeta. Uno de los objetivos primordiales es, por tanto, conseguir por ingeniería genética plantas aún más eficientes en la realización de este proceso. La fijación del nitrógeno es otro proceso crucial para el metabolismo de las plantas. La mayoría de las plantas cultivadas requieren grandes cantidades de nitrógeno para su crecimiento, que es aportado por los fertilizantes químicos que se añaden al terreno. Solamente algunas plantas de la familia de las leguminosas son capaces de convertir el nitrógeno atmosférico en compuestos nitrogenados. En este proceso interviene la bacteria Rhizobium, que infecta las raíces, formando nódulos donde se aloja, y gracias a un complejo proceso en el cual intervienen al menos 17 genes de la bacteria (genes nif) se produce la fijación del nitrógeno. Uno de los objetivos prioritarios en este campo es convertir por ingeniería genética plantas no leguminosas en fijadoras de nitrógeno.

8.10.2.

Aumento del valor nutritivo

Otro de los objetivos que se persigue en la actualidad es elevar el valor nutritivo, o bien modificar el contenido en determinados elementos, como por ejemplo aminoácidos esenciales o bien de vitaminas, en algunas plantas cuyas semillas, frutos o raíces son utilizadas para la alimentación humana o animal. Las proteínas que se almacenan en las semillas con frecuencia tienen un valor nutritivo limitado debido a la carencia de alguno de los aminoácidos esenciales para el organismo humano. Una importante mejora es la incorporación de algunos de estos aminoácidos esenciales en la proteína, y así se ha ensayado con el gen de la faseolina, la proteína que se acumula en las habas. La modificación de la secuencia codificadora de esta proteína ha permitido la síntesis de nuevas variedades a las que se les ha incorporado algunos aminoacidos esenciales en la región C-terminal, sin que afecte a la localización y a la funcionalifdad de esta proteína. Otra alternativa es aumentar el contenido de aminoácidos esenciales en forma libre en la semilla. Se ha conseguido en semillas de soja a las que se les ha modificado una enzima de la ruta biosintética del aminoácido lisina. Esta enzima está regulada negativamente por el producto final, pero ha sido sustituida por el gen que codifica la misma enzima en la bacteria

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E. coli, de tal forma que esta enzima bacteriana escapa a la regulación y sigue funcionando a pesar de que se acumule la lisina, lográndose una producción de este aminoácido 100 veces superior a la normal en las semillas transgénicas. La soja se usa para harinas de alimentacion animal a las que tradicionalmente se les suplementa con lisina y otros nutrientes. Los ácidos grasos son el componente mayoritario de los aceites vegetales, aproximadamente un 75% procede de las semillas de soja, palma, colza y girasol, y la gran mayoría se dedican al consumo humano. Uno de los objetivos es modificar el grado de insaturación de estos aceites para hacerlos más saludables. En el caso de la colza se dispone actualmente de distintas variedades modificadas genéticamente, productoras de semillas con diferente composición de ácidos grasos, que ya están siendo cultivadas en el campo. Las vitaminas representan una de las carencias nutricionales más graves en los paises subdesarrollados. Un ejemplo muy aireado en los medios de comunicación, ha sido la obtención del arroz dorado (golden rice) que expresa β–caroteno, un precursor de la vitamina A que se acumula en el endospermo del grano. Esta variedad transgénica puede contribuir a paliar de forma notable las enfermedades relacionadas con la carencia de vitamina A en los países donde este problema es endémico debido a la dieta pobre y poco variada.

8.10.3.

Maduración controlada de frutos y flores

La maduración del fruto es un proceso natural que forma parte del envejecimiento del vegetal, pero supone un problema bastante grave desde el punto de vista comercial ya que el proceso de maduración puede ser bastante rápido comparado con los largos plazos de la comercialización agrícola actual y además el fruto maduro sufre importantes deterioros en su manipulación, lo que acarrea importantes pérdidas y hace que actualmente se recolecte mucho antes de lo que sería el punto óptimo para su consumo, pero esto provoca que no desarrollen todo su sabor y aroma. Durante la maduración se activan ciertos genes como los que codifican las enzimas celulasa y poligalacturonasa, que degradan las paredes de las células y provocan el ablandamiento del fruto. La inhibición de estos genes puede producir un retraso en la maduración. Esta fue la estrategia que se siguió para la obtención de la primera planta GM que se comercializó. La compañía Calgene, utilizó la tecnología denominada antisentido, que ya hemos comentado para inactivar el gen de la poligalacturo-

250

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nasa lo que resultaba en una reducción del 90% en la actividad de esta enzima y un retraso considerable en la maduración, que permite recolectar la fruta de la planta con todo su aroma, color y sabor, y es posible todavía su comercialización sin que se estropee en este periodo. Se han aislado otros genes relacionados con el proceso de maduración, que se activan por un aumento de la producción de etileno, verdadera hormona de la maduración, y de la actividad respiratoria de las células. Uno de estos genes es la enzima ACCS (aminociclopropano,1-carboxi sintetasa) fundamental en la síntesis de etileno. Una de las estrategias que se han utilizado ha sido clonar un gen bacteriano que produce una enzima que degrada la ACCS. Este procedimiento se ha utilizado para la obtención de tomates transgénicos que tienen una inhibición del 90% en la producción de etileno y cuya maduración se retrasa hasta tres meses. De este modo los tomates se recogen de la planta y se maduran por tratamiento externo con etileno, conservando el mismo color, textura, aroma y sabor que los madurados en la propia mata. Del mismo modo, hoy día se trata de obtener flores ornamentales que tarden en marchitarse. Se ha ensayado con claveles modificados genéticamente, portadores de un gen antisentido para bloquear la síntesis de etileno.

8.10.4.

Tolerancia a condiciones ambientales extremas

Las plantas están sometidas a cambios drásticos de temperatura, de niveles de agua y de salinidad en el suelo. Debido a su inmovilidad las plantas no pueden escapar de estas situaciones de estrés que provocan la pérdida de importantes cosechas. Para resistir a estas condiciones extremas, determinadas plantas han desarrollado diferentes mecanismos que pueden ser aprovechados para la mejora de plantas agrícolas. Hoy día, se han caracterizado algunos genes implicados en la tolerancia de determinadas plantas a situaciones extremas de temperatura, aridez, salinidad, etc., y se pretende su utilización para modificar cultivos de interés agrícola. La salinización de los suelos es uno de los principales factores limitantes de la producción agrícola a nivel mundial, y es un problema derivado fundamentalmente de la práctica del regadio. Se calcula que una superficie de más de 80 millones de hectáreas está afectada por severos problemas de salinidad, y que cada año se añaden 5 millones de hectáreas más. Algunas de estas tierras han quedado fuera del uso agrícola o sólo pueden utilizarse para el cultivo de especies tolerantes.

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Algunas plantas viven en ambientes sometidos a periodos de largas sequías y alta salinidad. Para sobrevivir estas plantas sintetizan unas moléculas denominadas genéricamente osmoprotectores, que facilitan la retención de agua y protegen y estabilizan a las macromoléculas celulares frente a concentraciones iónicas elevadas. Estos osmoprotectores son pequeñas moléculas de determinados azúcares, alcoholes, y sales de amonio cuaternario como la betaína. La betaína es sintetizada por las plantas y también por algunas bacterias. El gen betA de Escherichia coli ha sido utilizado para obtener plantas transgénicas de tabaco que resultan ser hasta un 80% más resistentes a altas concentraciones salinas que la planta no transgénica. En la misma línea se han conseguido plantas transgénicas de tomate y de colza que producen cosechas normales en condiciones de riego con agua con una salinidad del 33%, mientras que la mayoría de las especies agrícolas no soportan riegos por encima del 8% de salinidad. La tecnología está basada en la inserción de un gen que codifica para una proteína llamada antiportadora de sodio, que es capaz de transportar y almacenar la sal en las vacuolas de las células, mientras que los frutos y las semillas no contienen vacuolas salinas. Además de algunos genes «osmoprotectores» que producen resistencia a salinidad y a la deshidratación del suelo, también se han caracterizado genes de enzimas que producen dobles enlaces en ácidos grasos de la membrana de las células lo que conduce a una mayor resistencia a las heladas por parte de la planta. Sin embargo, el mayor problema reside en lograr una adecuada regulación de estos genes una vez introducidos en la planta ya que se requiere su expresión limitada a situaciones de emergencia, debido a que su expresión constitutiva, esto es continuada, conllevaría efectos secundarios no deseados.

8.11.

8.11.1.

MEJORA DEL RENDIMIENTO. CULTIVOS RESISTENTES A PLAGAS, ENFERMEDADES Y HERBICIDAS Resistencia a plagas de insectos

La resistencia de los cultivos agrícolas a insectos dañinos es una característica de enorme importancia económica, debido al elevado coste en productos y mano de obra que supone la administración periódica de insecticidas. Pero también hay que tener en cuenta que estos procesos tie-

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nen una gran trascendencia ecológica debido a la contaminación ambiental que se produce con el uso masivo de insecticidas químicos. Los insecticidas químicos que se utilizan masivamente en toda la agricultura mundial no son selectivos, esto quiere decir que eliminan no sólo los insectos dañinos sino multitud de otros insectos beneficiosos. Además, los insecticidas químicos se acumulan en los ecosistemas, en los distintos escalones de las cadenas alimentarias, provocando a largo plazo importantes efectos perjudiciales en la fauna. Todos los vegetales poseen, en mayor o menor medida, sistemas que les confieren cierta resistencia a insectos, mediada por metabolitos secundarios nocivos para estos últimos. Hoy día, sin embargo, se han caracterizado numerosos genes bacterianos cuyo producto proteico confiere resistencia frente a determinadas plagas específicas de insectos. Esta característica se ha explotado a nivel comercial y algunos de estos genes bacterianos se han introducido en plantas de interés agrícola y algunas de estas plantas transgénicas se encuentran actualmente en el mercado. Éste es el caso de la toxina Bt de la bacteria Bacillus thuringiensis. Hoy día se han logrado numerosas plantas transgénicas Bt que expresan el gen de la toxina, una proteína llamada Bt, que les confiere una eficaz resistencia frente a determinadas plagas de insectos. Estas bacterias, cuando son ingeridas por el insecto, producen una proteína Bt que causa la muerte de éste. El proceso forma parte del ciclo vital natural de la bacteria. Distintas cepas de estas bacterias producen variantes de la proteína que afectan de manera muy específica a distintos insectos. Hoy día se conocen más de 50 proteínas «insecticidas Bt», cuyos genes están identificados y secuenciados, y se están utilizando como medio bastante específico para el control de plagas de procesionaria, oruga de la mariposa del tabaco y del algodón, del escarabajo de la patata, etc. Las patatas resistentes a plagas fueron el primer cultivo genéticamente modificado con el gen Bt que recibió, en 1995, la aprobación en Estados Unidos para su comercialización. Hoy día, hay comercializadas variedades de tomates, tabaco, maíz, algodón y patatas que llevan insertado el gen Bt para producir resistencia a diversas plagas de insectos. Aunque este método parece más eficaz y seguro para las personas y los animales que la utilización masiva de plaguicidas químicos, una de las objeciones más sólidas que se plantean a estas biotecnologías es que el uso extensivo de Bt no hará sino acelerar el desarrollo de resistencias por parte de los insectos. Hay datos que apuntan en ésta línea, debido a que

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diversas especies de insectos han desarrollado ya resistencia al Bt. La realidad es que este insecticida biológico lleva ya muchos años, cerca de 40, mucho antes de que se desarrollaran las variedades de plantas transgénicas, utilizandose de forma externa en fumigaciones masivas sobre los campos de cultivo. En la actualidad se está trabajando en la búsqueda de promotores específicos que permitan regular la expresión de estos transgenes Bt, de manera que se expresen únicamente en aquellos tejidos, por ejemplo hojas, que son devorados por los insectos, evitando su expresión masiva en toda la planta y de esta forma se lograría un control más preciso de las plagas específicas de la planta evitando la exterminación de otros insectos. En cualquier caso es importante resaltar, en primer lugar, el alto grado de especificidad de las toxinas producidas por las diferentes estirpes de Bacillus thurigiensis sobre diferentes especies de insectos, que no tiene comparación con ninguno de los insecticidas químicos tradicionalmente utilizados en la agricultura moderna intensiva. Y, en segundo lugar, hay que resaltar la ausencia de toxicidad de estas proteínas endotoxinas para los mamíferos.

8.11.2.

Resistencia a infecciones víricas

Las mayores pérdidas económicas en las cosechas de grano se deben a las infecciones por virus. Hoy día se trabaja intensamente en este campo y se siguen distintas estrategias para lograr este objetivo. Una de las de mayor éxito es la producción de plantas transgénicas que expresen una proteína de la cubierta vírica. Se trata de una inmunización de la planta. Aunque no se conocen bien los mecanismos moleculares de esta resistencia, se sabe que la superproducción, de forma constitutiva, de esta proteína de la cápsida reduce significativamente la infección posterior por virus. Hoy día se dispone ya de plantas de cultivo extensivo resistentes a más de un virus por este procedimiento, ya que la expresión de la proteína de la cubierta de un virus protege a la planta contra la infección de un amplio espectro de virus no relacionados. También se está intentando el uso de sustancias antivirales producidas por plantas. Se han aislado algunos de estos genes y se han trasferido a las plantas de cultivo, estos primeros resultados parecen prometedores. Un ejemplo es la incorporación de la resistencia al virus del amarilleo y enanismo de curcubiataceas. Este virus causa importantes pérdidas económicas en los cultivos de sandía, melón y pepino. No existía ningún

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método para generar resistencia contra este virus. En el Centro de Edafología y Biología Aplicada del Segura (CEBAS), un organismo del CSIC, se ha aislado el gen que confiere resistencia al virus de una variedad de melón alejada filogenéticamente de los melones normalmente cultivados y se han obtenido variedades transgénicas resistentes.

8.11.3.

Resistencia a hongos y bacterias

Las infecciones por hongos son muy frecuentes en las plantas y provocan grandes pérdidas de las cosechas en todo el mundo. Tan sólo un hongo que ataca al arroz en la zona del sudeste asiático se estima que causa pérdidas de más de 5000 millones de dólares al año. Para luchar contra estos hongos fitopatógenos se emplean productos químicos peligrosos para la salud humana y animal y, debido a que se acumulan, son muy dañinos para el medio ambiente. Algunas plantas disponen de defensas contra estos agentes patógenos mediante la producción de unas proteínas conocidas genéricamente como proteínas relacionadas con patogénesis (PR), que son enzimas del tipo de glucanasas, quitinasas e inhibidores de proteasas. Por ingeniería genética se han logrado introducir los genes y expresar algunas de estas proteínas en arroz y tabaco transgénicos, consiguiendo cultivos resistentes. Las infecciones por bacterias son también muy dañinas para los cultivos, y la situación es más problemática ya que no se han identificado genes de resistencia a bacterias que puedan ser incorporados a los cultivos. Sólo la bacteria del suelo Erwinia carotovora que es patógena para la patata provoca pérdidas anuales de más de 100 millones de dólares. Se han logrado algunos resultados prometedores con la patata transgénica que incorpora el gen de la lisozima del virus bacteriófago T4, puesto que la lisozima puede actuar tanto en bacterias gram positivas como gram negativas, se intenta extrapolar esta estrategia a otros casos.

8.11.4.

Resistencia a herbicidas

Otro de las campos que tiene una gran importancia económica, por los elevados costes de material y mano de obra que representa en la agricultura es el empleo de herbicidas, que a su vez tienen también un grave impacto ambiental. Alrededor de un 10% de la producción agrícola mundial se pierde a causa de las malas hierbas, a pesar del uso extensivo de nuevos y cada vez

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más potentes herbicidas; hoy se emplean más de 100 diferentes, generalmente dañinos para el medio ambiente. La utilización de herbicidas, tan extendida en la actualidad, tiene además el grave inconveniente de que no son selectivos, por lo que su acción es generalizada eliminando malas hierbas pero afectando también al rendimiento de los cultivos. Los herbicidas más utilizados son de amplio espectro, como el glifosato (de nombre comercial «Round up») y el fosfinotricín (de nombre comercial «Basta»). La producción de plantas transgénicas resistentes a herbicidas es relativamente sencilla debido a que se conocen las dianas de acción de los herbicidas y, generalmente, corresponden a una única enzima, con lo cual un único gen es responsable de conferir resistencia. En esta línea se están utilizando básicamente tres estrategias diferentes: 1. Sobreproducir la enzima afectada por el herbicida. Se trata de lograr plantas que tengan una amplificación del gen de la enzima diana del herbicida, esto es plantas con varias copias del gen, lo cual conlleva a una superexpresión de la enzima y confiere una mayor resistencia de la planta al herbicida en cuestión. 2. Obtener plantas a las que se les ha introducido un gen mutante para la enzima diana del herbicida que producirán una proteína que es herbicida-resistente y por tanto serán resistentes al herbicida en cuestion. Se ha empleado en el caso del glifosato; este herbicida inhibe una enzima de la ruta de síntesis de aminoácidos aromáticos. Esta enzima se encuentra en plantas y también en bacterias. A partir de una cepa de E. coli que resultaba ser resistente a este compuesto se aisló el gen que codifica esta enzima, y se ha introducido en genomas de plantas logrando que éstas expresaran la enzima resistente de E. coli en suficiente cantidad como para reemplazar a la enzima vegetal inhibida. Así se han logrado plantas transgénicas de patata, tabaco, tomate, petunia y algodón resistentes a los efectos del glifosato. 3. Diseñar plantas transgénicas a las que se les ha incorporado un gen para una proteína que a su vez sea capaz de degradar o inactivar el herbicida en cuestion. La inactivación del herbicida se ha logrado en varios casos. Por ejemplo, con el herbicida glufosinato (fosfinotricina) que inhibe la síntesis del aminoácido glutamina, pero cuya acción es anulada por la enzima fosfinotricina acetil-transferasa codificada por el gen bar de la bacteria Streptomyces hygros-

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copicus. Se han logrado plantas transgénicas a las que se les ha añadido este gen de Streptomyces que las hace resistentes a este herbicida en más de 20 especies diferentes de plantas. Todas estas opciones se han desarrollado con éxito y se dispone de numerosas variedades con resistencias a los herbicidas más importantes. En la actualidad se comercializan varios productos como la soja, el maíz, el tabaco, la colza, y el algodón que son resistentes a herbicidas.

8.12.

LAS PLANTAS COMO FACTORÍAS

A pesar de que hoy por hoy siguen siendo las células de los microorganismos, como las bacterias y las levaduras, las principales «factorías» utilizadas por la bioingeniería para la producción compuestos (alimentarios, farmacéuticos, cosméticos, etc.) cada vez adquiere mayor relevancia la posibilidad de utilizar las plantas transgénicas como alternativa a los grandes biorreactores que se emplean para la producción de proteínas sintetizadas por bacterias recombinantes. La idea de diseñar plantas transgénicas capaces de producir proteínas y otros compuestos de alto valor comercial para sustituir a los tanques de bacterias en las empresas es muy atractiva. Las plantas son fáciles y baratas de cultivar, producen una gran biomasa, son relativamente sencillas de manipular genéticamente y una vez transformadas son bastante más estables que los microorganismos con plásmidos recombinantes que, con frecuencia, se pierden durante una fermentación prolongada. Además, tienen importantes ventajas, debido a que son células eucariotas a la hora del procesamiento y modificación de proteínas, muchas veces irrealizable en las células bacterianas. El grave inconveniente radica en la mayor dificultad que presenta el proceso de extracción y purificación del producto sintetizado. Dedicaremos solamente unas líneas a dos aspectos como son la producción de fármacos y la obtención de polímeros biodegradables, que aunque no están directamente relacionados con la alimentación humana, sí pueden tener una incidencia importante como veremos (frutas-vacuna, alimentos-medicina, aditivos, conservantes, envases, etc.) en el mundo de la industria alimentaria.

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8.12.1.

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Producción de fármacos

Las plantas constituyen una fuente abundante de medicamentos naturales. Queda todavía un enorme campo por explorar ya que ha sido analizado únicamente el potencial farmacéutico de aproximadamente el 10% de las especies del Planeta. Un ejemplo reciente y muy importante de fármaco derivado de una planta es el taxol, utilizado para el tratamiento de diversos tipos de tumores. Se obtiene de la corteza del tejo del Pacífico, un árbol escaso y de lento crecimiento, por lo que el proceso de extracción es caro, lento y muy laborioso. Aunque se puede obtener por síntesis química el proceso no es comercialmente viable. El método más eficiente en este caso y en general para producir grandes cantidades de fármacos de plantas es a través de la manipulación genética de las mismas. Uno de los campos donde se está trabajando con bastante interés es el de la obtención de plantas transgénicas que produzcan anticuerpos. Se han obtenido ya plantas de tabaco que sintetizan complejos anticuerpos monoclonales funcionalmente activos. Ya hay bastantes productos terapéuticos producidos por plantas que incluyen proteínas para el diagnóstico, (además de anticuerpos, enzimas como la avidina poducida en maíz) para el tratamiento de diversas enfermedades (factor VII para hemofílicos, insulina para diabéticos, estimuladores y supresores del sistema inmune, interleuquinas, interferones, factores de crecimiento) o biopolímeros y adhesivos para uso quirúrgico. Pero aún mayores expectativas despierta la posibilidad de lograr la inmunización activa a través de la ingesta de plantas transgénicas que produzcan vacunas, es decir, plantas que produzcan alguna proteína de bacterias o de virus que sea capaz de desatar una respuesta inmunológica por parte del organismo que la ingiera y de esta forma provocar la inmunidad frente al patógeno. Esto permitiría que el simple hecho de administrar una fruta «modificada genéticamente» proporcionaría inmunidad frente a un virus, equivalente a la que se obtiene a través de costosas y no siempre factibles campañas de vacunación, especialmente difíciles de llevar a cabo en los países menos desarrollados. En los últimos años un gran número de antígenos se han producido en plantas y se ha demostrado su eficacia en modelos animales. Las plantas transgénicas puede que devuelvan el protagonismo que siempre tuvieron las plantas para la humanidad en este campo de la salud

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y que, sólo recientemente, había sido sustituido por la síntesis química de medicamentos.

8.12.2.

Producción de plásticos biodegradables

Otro ejemplo de enorme interés potencial es el uso de las plantas para producir plásticos biodegradables y, en general, para producir biopolímeros de interés industrial. Las plantas producen diversos tipos de polímeros, siendo los más abundantes la celulosa, que es biodegradable pero no digerible por el hombre, y el almidón, que es la principal fuente de calorías de la dieta humana. La bacteria Alcaligenes eutrophus produce como polímero de reserva polihidroxibutirato (PHB) y otros polihidroxialcanoatos (PHA) que están siendo utilizados como materia prima para la fabricación de envases y utensilios de plástico biodegradable. La producción de plantas transgénicas de Arabidopsis, como especie modelo experimental, que incorporan los genes bacterianos para la síntesis de PHAs, confiere a estas plantas no sólo la capacidad para sintetizar estos productos sino de acumularlos en los tejidos de reserva. Esto parece que no tiene efectos perjudiciales para la planta y además hace que la recolección sea más fácil. La soja, la colza y el girasol serían especies agrícolas de gran interés en este campo ya que sus semillas tienen gran cantidad de aceites, que estando en las mismas rutas metabólicas podrían bloquearse hacia la síntesis de estos polímeros. En la planta de algodón, se ha logrado incorporar los PHAs a las propias fibras celulósicas, lo que permitirá obtener un material textil con nuevas propiedades.

8.13.

DESCONTAMINACIÓN AMBIENTAL

Ciertas plantas pueden ser utilizadas para regenerar suelos contaminados, proceso que es conocido como «fitorremediación». El uso de plantas transgénicas para este fin, aunque muy incipiente, tiene algunos resultados espectaculares. Se han producido ciertas plantas transgénicas que contienen el gen que codifica una enzima que transforma el ión mercúrico y que tendrán una enorme utilidad en la recuperación de suelos contaminados por mercurio.

LA BIOTECNOLOGÍA EN LA AGRICULTURA: PLANTAS TRANSGÉNICAS

259

También se han obtenido plantas transgénicas que expresan enzimas capaces de degradar compuestos orgánicos nitrogenados y clorados (por ejemplo: nitroglicerina, cloroformo). Todas estas plantas aunque todavía están a nivel experimental, son una esperanza para la regeneración de terrenos contaminados por vertidos industriales.

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Direcciones de Internet European Food Information Council. EUFIC Es una organización independiente que ofrece información sobre calidad y seguridad alimentaria. Sus páginas contienen bastantes artículos sobre plantas modificadas genéticamente y alimentos biotecnológicos. Accesible en español. http://www.eufic.org/sp/tech/food.htm

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International Food Information Council Foundation. IFIC Ofrece información sobre biotecnología de plantas y alimentación, sobre todo artículos relacionados con la seguridad y la legislación. Algunos en español. http://www.ific.org/food/biotechnology.vtml Monsanto. Páginas en español de una de las grandes multinacionales agrícolas implicadas en la investigación y comercialización de semillas transgénicas. Contiene información actualizada sobre nuevos productos, legislación, debates e informaciones relacionadas con el tema de plantas transgénicas agrícolas. http://www.monsanto.es FAO. Foro electrónico para Biotecnología auspiciado por la Food and Agriculture Organization de las Naciones Unidas. Conferencias, noticias y glosario sobre Biotecnología e Ingeniería Genética. http://fao.org/biotech/forum.htm Transgenic plants and world agriculture. Documento sobre aplicaciones, beneficios y riesgos de la agricultura transgénica elaborado conjuntamente por las siguientes sociedades científicas: Royal Society of London, U.S.A. National Academic of Sciences, Brazilian Academy of Sciences, Chinese Academy of Sciences, Indian Academy of Sciences, Mexican Acedemy of Sciences y la Third World Academy of Sciences. http://www.nap.edu/catalog/9889.html Golden Rice Project Página del Proyecto Arroz Dorado. http://www.goldenrice.org/index.html Asociación Española de Bioempresas, asociaciones, fundaciones, universidades, centros tecnológicos y de investigación que desarrollan sus actividades de manera directa o indirecta en relación con la biotecnología en España. http://www.asebio.com/es/index.cfm Fundación Antama Una organización que tiene como finalidad la promoción y realización de actividades que contribuyan a dar a conocer a la sociedad el desarrollo de las nuevas tecnologías aplicadas a la agricultura, el medio ambiente y la alimentación. http://fundacion-antama.org/ En el siguiente enlace está disponible el documento «Leyenda negra de los transgénicos» http://fundacion-antama.org/wp-content/uploads(/2009/12/00-La-leyenda-negra-editada.pdf

Tema 9 ANIMALES TRANSGÉNICOS

La biotecnología se ha utilizado para mejorar la eficiencia productiva no sólo de microorganismos y vegetales, como hemos estudiado en temas anteriores, también para mejorar la producción de animales de granja. En este capítulo se abordará la modificación génica de organismos completos, pluricelulares, animales. Esto requiere una aproximación conceptual y experimentalmente distinta y más compleja, aparte de tener implicaciones éticas, sociales y ecológicas mucho más profundas. Es aquí donde el término «ingeniería genética» adquiere mayor espectacularidad. La Biología, una ciencia cuyo objetivo es conocer cómo están hechos y cómo funcionan los seres vivos, sirve de base para una tecnología capaz de diseñar y producir organismos con cambios genéticos permanentes y heredables. Desde el punto de vista de la investigación básica, la introducción de un gen foráneo en un organismo puede tener únicamente la finalidad de estudiar este gen: conocer su función, cómo está regulado, cuál es su comportamiento, en qué células se expresa y en qué momento del desarrollo, etc. Algunas de estas cuestiones se podrían analizar en células en cultivo, pero para otras es necesario recurrir al organismo completo. Una de las estrategias más utilizadas es «construir» organismos con distintas versiones del gen. Esto permite identificar las secuencias claves para su control y, de ésta forma aumentar su expresión o, por el contrario, anularla totalmente. Así, comparando las distintas situaciones podremos deducir el papel que desempeña el producto del gen en el desarrollo. El 90% de los animales genéticamente modificados se obtienen para llevar a cabo investigación básica o aplicada. Alternativamente, la modificación génica de organismos superiores puede perseguir una mejora genética. En este caso el fin sería mejorar su pro-

ductividad, o bien «diseñar animales» con el objetivo de utilizarlos como biorreactores para la obtención de proteínas de interés. La obtención de animales transgénicos se ha logrado pero dado que son organismos más complejos el desarrollo de los mismos está más atrasado que el de vegetales transgénicos.

ESQUEMA DE CONTENIDOS 9.1. Métodos de transferencia de genes para la obtención de animales transgénicos 9.1.1. Microinyección de DNA en ovocitos o microinyección pronuclear 9.1.2. Otros métodos 9.1.3. Obtención de quimeras transgénicas por manipulación de embriones 9.2. Expresión de genes exógenos en animales transgénicos 9.3. Clonación del patrimonio genético de un organismo 9.3.1. Individuos clónicos. 9.3.2. Métodos de clonación 9.3.3. Historia de la clonación 9.4. Aplicaciones de los animales transgénicos 9.4.1. Animales transgénicos en la industria cárnica: incremento de la producción 9.4.2. Mejora de razas con una mayor resistencia a las enfermedades 9.4.3. Modificación de la calidad de la leche 9.4.4. Producción de lana de oveja 9.4.5. Granjas farmacéuticas 9.4.6. Animales transgénicos como modelo para estudiar algunas enfermedades humanas 9.4.7. Xenotransplantes 9.5. Producción de peces transgénicos 9.5.1. Aumento del crecimiento: Mediante la sobreexpresión de la hormona del crecimiento 9.5.2. Mejora de la tolerancia al frío y resistencia a las heladas 9.5.3. Resistencia a las enfermedades 9.5.4. Alteración del metabolismo 9.5.5. Esterilidad 9.5.6. Peces productores de fármacos 9.6. Beneficios y Riesgos 9.6.1. Factores económicos y aceptación pública

9.1.

MÉTODOS DE TRANSFERENCIA DE GENES PARA LA OBTENCIÓN DE ANIMALES TRANSGÉNICOS

Se pueden distinguir dos vías para la modificación genética de organismos pluricelulares: una, es cambiar un gen en un tipo determinado de células, esto significa modificar únicamente algunas células del cuerpo (somáticas), sin afectar a las células reproductoras y por tanto el nuevo gen no será transmitido a la descendencia posterior de este individuo. Otra es modificar las células reproductoras (germinales). Los organismos que llevan genes foráneos o ajenos, introducidos experimentalmente, y que son capaces de transmitirlos a las generaciones sucesivas reciben el nombre de transgénicos. El gen introducido, que puede incluso provenir de una especie muy alejada evolutivamente, se conoce como un transgén. El desarrollo de las técnicas que han hecho posible la obtención de animales transgénicos se debe fundamentalmente al avance experimentado por las tecnologías de manipulación de embriones, en parte impulsado por el interés en las técnicas de reproducción «in vitro», y, naturalmente, al desarrollo experimentado por la ingeniería genética que ha permitido el aislamiento y la manipulación del DNA y, por tanto, la posibilidad de disponer de genes para realizar la transgénesis. El primer paso para la obtención de un animal transgénico consiste en la preparación del transgén, es decir, del fragmento de DNA que va a ser insertado en el genoma del organismo que se va a modificar. Este es un paso crucial y muy complejo y que, sin duda, va a condicionar el éxito del experimento de transgénesis. Aunque en principio no existen limitaciones sobre la procedencia del transgén, es necesario diseñar cuidadosamente las secuencias reguladoras que se van a incluir junto al mismo y que permitirán la expresión del transgen en el lugar y momento del de-

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sarrollo adecuados. Estas secuencias reguladoras deben ser funcionales en el organismo en que se van a introducir, y pueden ser promotores específicos de tejido o bien promotores ubicuos que presenten un amplio rango de expresión. Además del transgén y sus secuencias reguladoras, también suelen introducirse genes marcadores que permitan la identificación de los transgénicos de una forma sencilla. Entre los marcadores más utilizados se encuentran algunos genes de resistencia a antibioticos, el gen de la proteína verde fluorescente (GFP), el de la luciferasa de la luciérnaga, y el de la β-galactosidasa. Todos estos genes marcadores permiten la detección de su expresión de forma sencilla y rápida. Una vez que se ha diseñado y obtenido la construcción génica que lleva el transgén es necesario su transferencia al interior de la célula que posteriormente se multiplicará y dará lugar al organismo completo que denominaremos transgénico. Para ello se han utilizado con éxito diversos métodos. Fundamentalmente hay dos métodos para producir animales transgénicos: (1) inyeccón de secuencias de DNA exógeno en el pronúcleo de cigotos recién fertilizados. Esto permite que el DNA se integre en los cromosomas y posteriormente se expresará tanto en los tejidos somáticos como en las células sexuales; (2) el otro método es la transferencia nuclear o clonación. Otros métodos incluyen: — La transferencia de DNA mediada por retrovirus y lentivirus. — La inyección de DNA exógeno en la cavidad de los embriones en estado de blastocisto. — La transferencia vía esperma expuesto a DNA exógeno durante la fertilización in vitro. — El uso de liposomas, electroporación, o biovalística para que el esperma, óvulos o embriones adquieran el DNA exógeno. — La transferencia nuclear somática o inyección de DNA en testículos para producir células madres de la espermatogénesis transgénicas.

9.1.1.

Microinyección de DNA en ovocitos o microinyección pronuclear

La microinyección de DNA a huevos fertilizados es el método más usado para la obtención de animales transgénicos. Consiste en la intro-

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ducción del DNA lineal con el gen o genes que se desean transferir en uno de los dos pronúcleos del huevo recién fertilizado. Los primeros experimentos de organismos transgénicos fueron realizados con algunos de los animales clásicos de laboratorio como Xenopus, Drosophila y ratón. El enorme tamaño de los ovocitos del sapo africano (Xenopus laevis), que alcanzan casi 2 cm y que además se desarrollan fuera del cuerpo materno, facilita enormemente todos los procesos de manipulación y han sido por ello muy utilizados, sobre todo en las etapas iniciales de esta experimentación. La mosca del vinagre (Drosophila melanogaster) es muy utilizada en la experimentación de transgénesis, pero en este caso debido al profundo conocimiento de la genética y de los procesos del desarrollo que hoy día se tiene en esta especie. Además, la transferencia génica está facilitada por la existencia de unos transposones, llamados «elementos P» , que se utilizan como vectores naturales de genes y que se integran al azar en el genoma de la célula embrionaria hospedadora. El ratón (Mus musculus) ha sido sin duda uno de los organismos favoritos en los experimentos de transgénesis. Siendo un mamífero y, por tanto, considerando que la experimentación sería más fácilmente aplicable a otros mamíferos, es, sin embargo, muy manejable en el laboratorio y muy conocido a nivel genético. Esto facilita toda la base previa a la obtención de transgénicos, ya que se conocen numerosas mutaciones muchas de ellas fácilmente identificables a simple vista e incluso se dispone de cepas comercializadas de muchas de ellas, lo cual simplifica la identificación y confirmación posterior de los individuos transgénicos. El primer mamífero transgénico se obtuvo en 1982. Era un ratón que portaba varias copias de un gen de la hormona de crecimiento humana y el ratón portador como consecuencia de la expresión del gen exógeno alcanzó un tamaño mucho mayor que los ratones normales. Resumimos los pasos esenciales para la obtención de ratones transgénicos que son, en esencia, aplicables a otros mamíferos (Figura 9.1). — Uno de los requisitos previos necesarios para llevar a cabo estos experimentos es tener suficiente número de huevos fertilizados para realizar la microinyección del DNA exógeno. Estos se obtienen provocando una superovulación en las hembras mediante inyección con hormonas sexuales (con hormona folículo-estimulante a ratones hembras, jóvenes y vírgenes, y con hormona lutei-

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FIGURA 9.1. Obtención de un ratón transgénico por microinyección de los óvulos. Tomado de animales transgénicos, documentos de la EIBE.

nizante), y después se aparean con machos fértiles. Al día siguiente, las hembras que presentan el tapón vaginal, prueba de que se aparearon, son sacrificadas y por disección de los tubos de Falopio se extraen unos 20-30 ovocitos fertilizados por hembra tratada. Los ovocitos se mantienen en un microincubador (con CO2 y a 37 °C) hasta la microinyección. — Bajo el microscopio y con ayuda de unas micropipetas controladas por un micromanipulador, el DNA en solución se inyecta en

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los ovocitos uno a uno. El ovocito se sujeta con la punta de una micropipeta que realiza una ligera succión para inmovilizarlo, y se inyecta con una microaguja, que tiene un diámetro de aproximadamente 1 μm y que contiene una solución con el DNA a una concentración aproximada de 1 μg/ml. Esta microaguja debe atravesar la zona pelúcida y penetrar la membrana nuclear de uno de los pronúcleos, sin tocar el nucleolo ni dañar ninguna estructura. — Los ovocitos que se considere que han sido inyectados correctamente, se vuelven a poner en el incubador y se dejan una noche hasta que alcanzan el estado de dos células. Esto permite seleccionar los huevos que no han sido dañados durante la inyección y que son todavía viables, ya que continúan el proceso de divisiones. — Posteriormente, estos embriones seleccionados en el estado de dos células, son reimplantados en el oviducto de hembras pseudopreñadas. Estas hembras han sido apareadas previamente con ratones vasectomizados o infértiles. — Cuando el embarazo llega a término correctamente, la progenie debe ser analizada para comprobar los individuos efectivamente transgénicos. Este análisis se facilita si el transgén produce un efecto fenotípico visible (color de piel, color de ojos, tamaño). En caso contrario, su presencia debe ser verificada a nivel molecular. Se analiza el DNA genómico, aislado de una pequeña biopsia de la cola o de una muestra de sangre, por PCR o bien con una sonda del gen por análisis de fragmentos de DNA en «southern» (ver Figura 5.5a y 5.5b). Si el DNA exógeno inyectado se incorpora al genoma antes de la primera división, el transgén estará presente en todas las células, incluidas las germinales, y tendremos un ratón transgénico. Con este organismo se puede, con una estrategia de cruzamientos adecuada y debido a que el transgén sigue una herencia mendeliana, obtener una línea transgénica estable y, eventualmente, con el gen en homocigosis (las dos copias paterna y materna del transgén). Sin embargo, si la integración del transgén en los cromosomas se retrasa y ocurre después de la primera división celular, se obtendrá una quimera transgénica. Un individuo con líneas celulares que lo han incorporado y serán transgénicas y otras que no. Evidentemente si la línea germinal no incorporó el transgén no se podrá establecer una línea transgénica a partir de este individuo, pero en el caso positivo se podrá recuperar en la descendencia, haciendo los cruzamientos adecuados.

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Aunque el ratón sigue siendo uno de los animales más utilizados como modelo experimental de transgénesis, hoy día también se dispone de los protocolos para la obtención de transgénicos en otras especies de laboratorio como el conejo, la rata y, lo que es más importante, en animales de gran interés comercial como la vaca, el cerdo, la cabra y la oveja, pollo y peces como salmón, trucha, carpa, dorada. Aunque el proceso es básicamente el mismo, los detalles relacionados con los tratamientos hormonales, la superovulación, los tiempos de incubación, incluso la morfología y visualización de los pronúcleos en los ovocitos, son aspectos que varían lógicamente de una especie a otra. La microinyección de ovocitos es un método muy utilizado a nivel experimental pero tiene muchos inconvenientes, sobre todo a la hora de trabajar con animales de interés comercial, debido a que el rendimiento de todo el proceso es muy bajo, ya que hay daños en la microinyección, en la reimplantación, etc., se necesita disponer de un número muy elevado de óvulos, y esto no es siempre posible en todos los animales, ni siquiera induciendo la superovulación. El procedimiento es muy lento, ya que es necesario inyectar uno a uno, y se precisa de una gran experiencia para realizarlo. En muchos casos el huevo fertilizado es muy difícil de manipular, ya que los pronúcleos son difícilmente visibles.

9.1.2.

Otros métodos

Hoy día, se investiga en la búsqueda de nuevos métodos y una de las vías más prometedoras es la incorporación directa de genes exógenos en el espermatozoide. En los años 70 se publicó que cuando los espermatozoides se incubaban en un medio con DNA, estos podían incorporarse al espermatozoide como si éste resultara permeable al DNA. Aunque fue en su momento un trabajo muy controvertido, ya que no pudo ser reproducido en ninguno de los numerosos laboratorios que lo intentaron, finalmente se han superado las dificultades técnicas y resulta una vía mucho más «natural», que evita tener que recurrir a manipular e inyectar embriones, ya que los espermatozoides actuarían como vectores de transgenes hacia el óvulo. Ya hay trabajos que confirman que el esperma de muchas especies de ganado, aves de corral y peces puede usarse para introducir transgenes en el genoma de estos animales pero la eficiencia varía mucho de una especie a otra (80% de eficiencia en cerdos y muy baja eficiencia en cabras). Del mismo modo se investiga la posibilidad de que el óvulo sea capaz de incorporar genes exógenos tomados directamente del medio exterior.

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9.1.3.

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Obtención de quimeras transgénicas por manipulación de embriones

Un método alternativo a la microinyección de DNA en ovocitos fertilizados es la introducción de DNA exógeno en células troncales embrionarias mediante la manipulación del blastocisto. Este método consta básicamente de los siguientes pasos: — Se aíslan unas cuantas células de embriones muy jóvenes en estado de blastocisto. Estas son células todavía no diferenciadas (totipotentes). Estas células se cultivan en placa en presencia de inhibidores de la diferenciación y se les introduce el DNA exógeno. Esto se puede realizar por diferentes medios físicos, químicos o biológicos, es decir, directamente por microinyección, por electroporación o por transfección con virus. — Estas células manipuladas genéticamente se reinsertan de nuevo en un blastocisto, y este se reimplanta en una hembra pseudopreñada, por tratamiento hormonal y cópula con machos estériles o vasectomizados. Este método, por principio, producirá siempre quimeras transgénicas, ya que solamente las células derivadas de las células manipuladas y transplantadas llevarán al transgén. Sin embargo, si las células de la línea germinal lo incorporaron se obtendrán trasgénicos en la siguiente generación. Esta técnica tiene algunas ventajas importantes sobre la técnica de microinyección de DNA en huevos fertilizados. El DNA puede llevar unas secuencias que favorezcan, que una vez en el interior del núcleo receptor, se recombine exactamente con secuencias homólogas. Además, existen «marcadores», cuya expresión depende de una inserción «correcta», que permiten diferenciar y, por tanto, seleccionar aquellas células en las que haya habido una incorporación correcta del gen y desechar aquellas en las que la integración haya sido al azar, en otro lugar del genoma. Naturalmente la reimplantación posterior sólo se hará con aquellas células que lleven el transgén y en la posición deseada. Esta selección previa, que no es posible hacer con los embriones directamente inyectados, asegura, por tanto, el resultado de la transgénesis. Hoy día, se investiga en esta línea buscando vectores, diseñando marcadores y estrategias de inserción cada vez más precisas. Actualmente, tras 20 años de experiencia desde que esta tecnología se puso en marcha se disponen de métodos para dirigir el DNA a sitios es-

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pecíficos del genoma y evitar mutaciones indeseables o la inactivación de genes endógenos esenciales para la supervivencia del animal. El tamaño del DNA tampoco supone ahora una limitación porque es posible insertar microcromosomas estables.

9.2.

EXPRESIÓN DE GENES EXÓGENOS EN ANIMALES TRANSGÉNICOS

Uno de los pasos cruciales para el éxito en experimentos de transgénesis es el diseño de la construcción génica a utilizar. La expresión correcta del transgén, es decir, en el tejido específico y en el momento adecuado del desarrollo, requiere que se incorporen a la construcción absolutamente todas las regiones reguladoras que flanquean al gen. Pero aún así, esto no es siempre suficiente para asegurar su expresión correcta. El transgén se integra al azar en el genoma receptor y a menudo en forma de concatémeros cabeza-cola, es decir, numerosas copias consecutivas. La expresión del transgén a veces no es proporcional al número de copias, incluso puede ser muy baja a pesar de haberse integrado un elevado número de copias. Esto es debido a que la expresión génica en eucariotas se ve afectada por las secuencias adyacentes al sitio de integración del gen foráneo. Por ejemplo, puede ocurrir que el gen quede integrado en una región cromosómica que esté totalmente reprimida. Por contrapartida, la expresión de un trasngén puede ser en algunos casos tan elevada que produzca en el organismo receptor alteraciones fenotípicas totalmente inesperadas. También hay que tener en cuenta que el transgén podría integrarse dentro de un gen endógeno interrumpiendo su secuencia e inactivando totalmente su función. Como consecuencia, se obtendría un fenotipo totalmente inesperado. A pesar de todos estos problemas y de todas las precauciones que requieren el diseño y la evaluación de experimentos de transgénesis es, sin duda, una poderosísima herramienta con una amplia gama de aplicaciones que van desde la propia investigación de la función de los genes, la terapia génica estable y heredable, el diseño de organismos con función de biorreactores, hasta la mejora de animales de interés agropecuario, en los que nos centraremos más adelante.

ANIMALES TRANSGÉNICOS

9.3.

271

CLONACIÓN DEL PATRIMONIO GENÉTICO DE UN ORGANISMO. INDIVIDUOS CLÓNICOS

Un paso más en la manipulación genética es la clonación de genomas completos que dará lugar a individuos genéticamente iguales. Ya no se trata de introducir un gen o unos pocos genes con sus secuencias reguladoras, ahora el objetivo es introducir todo el genoma de un individuo en una célula reproductora, a la cual previamente se le habrá eliminado el núcleo con su propio material genético. De esta forma se obtiene un individuo genéticamente idéntico al donador, lo que se llama un clon. La clonación es un fenómeno ampliamente extendido en la naturaleza. Es un proceso muy frecuente en los organismos más primitivos, y mucho más raro a medida que se avanza en la escala evolutiva. Las bacterias se dividen originando, si no hay mutación o procesos de transferencia de genes, clones de la célula inicial. Las plantas se reproducen asexualmente produciendo clones de la planta original. También los animales que se reproducen de forma «asexual» producen individuos genéticamente iguales al progenitor y por tanto clones del mismo. Incluso en los organismos más complejos y evolutivamente más avanzados, incluidos los seres humanos, se produce de forma natural, aunque excepcionalmente, la clonación. Es el caso de los «gemelos monocigóticos», que proceden de un único ovocito fecundado por un espermatozoide, que se divide accidentalmente en dos embriones en estadios muy tempranos, que son viables y se desarrollan como dos individuos gemelos, siempre del mismo sexo e incluidos en el mismo saco vitelino. Lo que es importante resaltar, ya que muchas veces se olvida en los debates sobre clonación y frecuentemente se desconoce, es que «individuos genéticamente iguales no significa necesariamente que sean fenotípicamente idénticos». Todos los factores ambientales, físicos y químicos, la alimentación (en cantidad y en calidad), las condiciones de desarrollo prenatal, el nacimiento, el aprendizaje, la educación, etc., configuran al individuo y dan un formato único y difícilmente repetible a la información contenida en la célula inicial.

9.3.1.

Métodos de clonación

La clonación de individuos puede conseguirse básicamente de dos maneras: por división del embrión y por trasplante nuclear. La división del embrión en estadios muy tempranos puede dar lugar a dos embriones que se desarrollan correctamente a término dando lugar a

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dos individuos genéticamente iguales. Este tipo de experimentación, que imita a la naturaleza en la formación de gemelos univitelinos, se realizó ya con éxito en los primeros años del siglo XX. El fin en esos momentos no era la clonación, sino la investigación sobre el desarrollo embrionario, en una época en que ni siquiera se sospechaba cuál era la naturaleza del material hereditario. Aunque los experimentos de clonación no hayan saltado prácticamente a la prensa, y por tanto al debate social, hasta la creación de la mundialmente famosa oveja Dolly (1997), sí han sido, sin embargo, un tema para la literatura y la ciencia ficción desde muchos años antes de llegar a ser una realidad.

9.3.2.

Historia de la clonación

En 1902, Hans Spemann, un científico interesado en los procesos del desarrollo embrionario, creó experimentalmente los primeros clones de individuos. Logró partir un embrión de salamandra de manera que indujo la formación de dos clones gemelos, utilizando un cabello para estrangular en dos un embrión temprano. Años más tarde, en 1928, logró también la primera transferencia de un núcleo de embrión a una célula enucleada también embrionaria, que posteriormente desarrolló un clon del embrión donante del núcleo. Posteriormente, cuando en 1938 publicó todos sus experimentos y su conocimiento sobre «El desarrollo embrionario y su inducción», predijo la posibilidad de realizar este tipo de experimentos con células diferenciadas de adulto, algo que él no logró y de lo cual la existencia de Dolly, y su progenie, dan sobrada cuenta. Son muchos los experimentos realizados desde entonces en esta línea para obtener individuos clónicos, a partir de la transferencia de núcleos a ovocitos fertilizados y enucleados experimentalmente, y, sin embargo, pocos los éxitos obtenidos. Más aún, muchos de los trabajos publicados en este campo dando cuenta de resultados positivos, han sido al poco tiempo cuestionados, y en algunos casos los escándalos sobre su falta de veracidad han hecho saltar las «alarmas científicas». Haciendo un poco de historia señalaremos algunos de los momentos cruciales para llegar al día de hoy con los famosos clones con nombre propio: Dolly, Polly y ANDi. En 1952, Briggs y King lograron clonar ranas usando un método de transferencia de núcleos. Transfirieron el núcleo de una célula de la blástula, que es un estadio del embrión en el cual está formado por una masa de entre 8-16 células, a un huevo fertilizado al que previamente ha-

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273

bían eliminado el núcleo. Sin embargo, cuando intentaron transferir núcleos de células en estadios más avanzados del embrión, los renacuajos crecieron anormalmente, de forma que concluyeron que era imposible clonar a partir de células adultas. Sin embargo, al poco tiempo, en 1958, Steward logró obtener una planta adulta a partir de células adultas totalmente diferenciadas de zanahoria. Esto demostraba que no era imposible la vuelta atrás de un núcleo de una célula totalmente diferenciada. Este núcleo tenía todos los genes y en una marcha atrás podía de nuevo reprogramarse para dar una planta adulta de zanahoria. El avance más importante en éste terreno fue el realizado por J. Gurdon y su equipo en Inglaterra (1975), que trabajaban con Xenopus un anfibio que tiene oocitos muy grandes, incluso visibles a simple vista. Demostraron que podían obtener clones utilizando el núcleo extraído de una célula que provenía de la piel del anfibio. Este núcleo era posteriormente inyectado en el huevo, al cual previamente se le había inactivado el núcleo mediante radiación ultravioleta. El científico danés Steen Willadsen, en la Universidad de Cambridge, consiguió clonar mamíferos, corderos (1980) y caballos (1984), con el método de división de embriones jóvenes. Este método está limitado al número de células en que se puede dividir un embrión joven, y depende de la capacidad de las células embrionarias para regenerar embriones completos. Esto último es una característica que depende de la especie, y es notable el caso del conejo que es capaz de regenerar un embrión viable incluso cuando se destruyen 7 de las 8 células de un embrión en estadio 8. Después de que algunos autores publicasen intentos de clonación y de que posteriormente fueran seriamente cuestionados, en 1984 se logra la clonación de un mamífero. El científico danés Steen Willadsen consiguió clonar una oveja, con el método de transferencia del núcleo de una célula de un embrión a un huevo no fertilizado, que posteriormente se trató para inducir la división «engañandolo» como si hubiera sido fertilizado. Posteriormente, el mismo Willadsen y otros científicos (First, Prather, Eyestone, 1986), lograron clonar otros mamíferos. Incluso utilizaron núcleos procedentes de embriones que ya cumplían una semana, es decir, relativamente diferenciados. En 1995, el grupo que trabajaba en el hoy famoso Instituto Roslin de Escocia, dirigidos por Ian Wilmut y Keith Campbell, logran clonar dos ovejas, Megan y Morag, a partir de células diferenciadas de embriones.

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Sin embargo, es en 1997 cuando estos investigadores saltan a la fama y su obra es el animal con nombre propio más famoso, y sin duda más fotografiado, de la historia: Dolly. Dolly nació en julio de 1996, y es el primer organismo clonado a partir de una célula adulta totalmente diferenciada. La célula que donaba el núcleo era una célula de ubre de oveja, que se mantuvo en cultivo y en unas condiciones de ayuno que la hicieron entrar en un periodo llamado G0 que es algo así como durmiente. Esto, que lo habían aprendido tras largos de años de experimentación previa, parece que es el paso crucial para el éxito del experimento. Esta situación mimetiza algo equivalente a lo que ocurre cuando el núcleo del espermatozoide entra en el ovocito. Hay un periodo parecido al G0 en el que los dos núcleos se «sincronizan» antes de fundirse en uno. Después, la célula de ubre se aproxima a un ovocito previamente enucleado y, por medio de una corriente eléctrica, se induce la fusión de las dos células y se activa el inicio del desarrollo embrionario. De las 277 células de ubre con las que se intentó sólo 29 llegaron a producir embriones, y únicamente una llegó a completar el desarrollo embrionario para dar lugar a Dolly. El anuncio de éste experimento en febrero de 1997 produjo una auténtica revolución en la comunidad científica que hasta este momento consideraba que no era posible la clonación a partir de células adultas totalmente diferenciadas; y una auténtica consternación social que desencadenó un debate público sobre la ética y el futuro de la clonación humana. Poco tiempo después, PPL Therapeutics, patrocinador de las investigaciones de Wilmut y Campbell, obtenía los derechos sobre la patente de éste método de clonación. En julio de 1997, Wilmut y Campbell producen a Polly a partir del núcleo de una célula epitelial a la cual se le ha incorporado además un gen humano. Este anuncio sorprende a la comunidad científica, fundamentalmente por la rapidez inesperada con la que progresa ésta tecnología. En marzo de 1997, en respuesta a un amplio y profundo debate sobre la ética de la clonación, el presidente Clinton impone una moratoria de cinco años para todos los experimentos de clonación con humanos, sean financiados con fondos federales o particulares. En julio de 1998, un grupo de investigadores de la universidad de Hawai, dirigidos por Yanagimachi y Wakayama, anuncian que han obtenido 50 ratones de células adultas (desde octubre de 1997) y que obteniendo clones de clones tienen ya tres generaciones de ratones genéticamente

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275

iguales. El ratón estaba considerado como uno de los organismos más difíciles de clonar. La técnica, que ya está patentada por Probio America Inc., conocida como técnica de Honolulu, es ligeramente diferente y ha demostrado ser más efectiva ya que tienen éxito en 1 de cada 100, frente a casi 1/300 conseguidos con la técnica de Rosslin. En enero de 2000, el equipo del Centro de Investigación de Primates de Oregon (USA) obtuvo el primer mono clónico «Tetra» logrado por división del embrión. Un año más tarde, en enero de 2001, se anunció el nacimiento de ANDi el primer primate modificado genéticamente. Se trata de un mono Rhesus transgénico que lleva el gen de la proteína verde fluorescente (GFP), procedente de una medusa, y que se expresa en algunas de sus células. Fue el único resultado positivo de 224 intentos en los que óvulos de mono Rhesus eran infectados por un retrovirus, previamente modificado para no ser infeccioso, que actuaba como vector para transportar el gen fluorescente, que debía incorporarse de esta forma a los cromosomas de los óvulos. Posteriormente, los óvulos se fertilizaban «in vitro» mediante inyección intracelular de espermatozoides, y tras algunas divisiones los embriones eran implantados en hembras, distintas a las donantes de los óvulos, para llevar a término la gestación. Los primates transgénicos tienen un gran potencial, como modelos animales más cercanos al hombre que los ratones, para el estudio de enfermedades humanas. Actualmente tiene interés el desarrollo de técnicas eficaces de clonación de animales de granja para perpetuar las caracerísticas beneficiosas de un determinado ejemplar que ha demostrado ya adulto la utilidad de las mismas. De igual modo, también es de interés la clonación de animales transgénicos ya que una vez obtenido el animal transgénico capaz de producir una característica determinada es deseable conseguir un rebaño de animales que contengan la misma característica. Por reproducción cruzada sería un trabajo costoso y largo en el tiempo, pero si se consigue directamente un rebaño de clones se alcanzaría el resultado deseado en poco tiempo y de forma eficaz.

9.4.

APLICACIONES DE LOS ANIMALES TRANSGÉNICOS

La capacidad de modificar el genoma a partir de la introducción, inactivación o reemplazamiento de genes en un animal ofrece posibilida-

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BIOTECNOLOGÍA Y ALIMENTACIÓN

des sin precedentes tanto a nivel de investigación, los animales transgénicos se pueden utilizar para estudiar el funcionamiento de los genes y los mecanismos que gobiernan o controlan las funciones biológicas; como a nivel productivo, en este sentido, en la actualidad la investigación en transgénesis aplicada a la producción animal se enfoca en los siguientes aspectos: — Mejora de los caracteres productivos. La mejora genética mediante transgénesis debe ser considerada como una estrategia complementaria a los métodos de reproducción y mejoramiento genético aplicados tradicionalmente, ya que éstos logran progresos constantes en el tiempo. Dentro de este punto los objetivos que se persiguen son conseguir una mayor producción muscular, mejorar la composición de la canal, mejorar la producción y composición de la leche, aumentar el ritmo de crecimiento, mejorar el rendimiento reproductivo, mejorar la utilización de los piensos, mejorar la producción y composición de la leche. — Mejora de razas para disponer de animales con una mayor resistencia a las enfermedades. — Obtener animales transgénicos como modelo para estudiar algunas enfermedades humanas. — Producir animales transgénicos como biorreactores para la síntesis de proteínas de alto valor añadido (proteínas terapéuticas). — Disponer de animales útiles para la producción de células, tejidos u órganos válidos para transplantes: Xenotransplantes.

9.4.1.

Animales transgénicos en la industria cárnica: incremento de la producción

La transferencia de genes se viene realizando con el fin de mejorar las razas de animales domésticos (cerdos, ganado vacuno, ovino y caprino, aves de corral). El objetivo final sería lograr animales que consumieran menos, que presentaran una mejor conformación y suministraran carnes más pobres en grasas. El interés de los ganaderos por la tecnología de los animales transgénicos comenzó a raíz de la publicación en 1982, de uno de los primeros experimentos con ratones transgénicos, en el que los ratones a los que se les había introducido el gen de la hormona de crecimiento crecían hasta alcanzar el doble de tamaño que sus semejantes normales. Siguiendo este ejemplo, los primeros intentos de mejorar las características de ani-

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males de matadero consistieron en expresar en cerdos y ovejas la hormona de crecimiento humana o la bovina. Los trabajos realizados entre 1985 y 1990 demostraron que en algunos de estos animales la hormona se producía en grandes cantidades, en parte debido a que el transgén se había integrado en múltiples copias y en parte porque el gen de la hormona del crecimiento se combinó con un promotor muy potente. Si bien en los inicios de esta tecnología los animales que expresaban la hormona de crecimiento presentaban problemas graves de salud, la continuación de estos estudios ha aportado nuevos conocimientos sobre los mecanismos de los genes que están implicados en el control del crecimiento (factores de crecimiento, receptores del factor de crecimiento, moduladores del crecimiento). Ovejas y cerdos transgénicos han permitido investigar el crecimiento postnatal de los mamíferos. En la actualidad hay estudios que demuestran que el estado de salud y fertilidad de los animales transgénicos es comparable al de los animales no transgénicos. Un descubrimiento reciente ha vuelto a despertar el interés por esta tecnología aplicada a la producción cárnica. Se ha sugerido que la gran cantidad de masa muscular observada en razas como la asturiana de los Valles se debe a la perdida de un gen concreto. La proteína producida por ese gen es un factor que controla la proliferación de las células musculares. En estas razas, la ausencia de este factor permite que los músculos se desarrollen mucho más de lo habitual. De hecho los ratones transgénicos en los que se ha eliminado el gen equivalente son mucho más grandes que los ratones control. En teoría sería posible obtener nuevas razas de vacas «supermusculosas» mediante la tecnología transgénica. En este caso no se trata de la expresión de un gen nuevo, sino de inactivar un gen, por ejemplo utilizando la tecnología del RNA antisentido. Este abordaje experimental tiene más posibilidades de éxito que los experimentos previos con la hormona del crecimiento ya que en este caso se conocen razas de vacas con una modificación genética similar que son perfectamente viables y comercialmente útiles. Otro objetivo de la manipulación de la canal consiste en alterar la composición de su grasa y colesterol. Al alterar el metabolismo o la capacidad de absorción de colesterol y/o ácidos grasos, las grasas contenidas en las carnes, huevos o quesos podría disminuir. También existe la posibilidad de introducir grasas beneficiosas como los ácidos omega 3 en animales de granja, o la adición de receptores de

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LDL u hormonas como la leptina que disminuirían el nivel de colesterol y la grasa en los productos cárnicos. Otra vía que se ha propuesto para mejorar la producción ganadera consiste en hacer que los animales aprovechen mejor los alimentos que ingieren modificando la eficiencia alimentara o el apetito. El aumento de la absorción de nutrientes se puede lograr alterando el perfil de enzimas en el tracto digestivo. La alimentación de la mayor parte de los animales de granja es rica en fibras vegetales como celulosa o hemicelulosas que son difícilmente digeribles para los mamíferos, ya que carecen de las enzimas necesarias. Esta limitación la superan los rumiantes gracias a los microorganismos del rumen que sí disponen de dichas enzimas. En cuanto a los no rumiantes, ya se han obtenido ratones capaces de secretar en su intestino delgado celulasa o hemicelulasa, mediante la expresión en las células del páncreas de los genes bacterianos correspondientes. Imitando esta estrategia sería posible, en principio, ampliar la capacidad digestiva de los animales para utilizar alimentos de origen vegetal, de bajo costo. Pero se puede abordar este problema mediante una táctica alternativa. El rumen es un órgano en el que tiene lugar la digestión de la celulosa y de otras fibras vegetales en los rumiantes gracias a la acción de poblaciones especializadas de bacterias, hongos y protozoos. La modificación genética, para mejorar la capacidad digestiva del animal, de estas bacterias sería experimentalmente bastante más sencilla que la modificación de los mamíferos, estas bacterias una vez modificadas en el laboratorio serían inoculadas en el tubo digestivo del animal y se podría evaluar más rápidamente la eficacia de la modificación génica. En este campo podemos destacar dos líneas de investigación, la mejora de la capacidad digestiva y la neutralización de sustancias tóxicas. En el primer caso se trata de incrementar la capacidad de algunas de las bacterias presentes naturalmente en el rumen para digerir la celulosa, esto se consigue mediante la introducción en una de estas bacterias de varias copias del gen que codifica para la celulasa de otro organismo celulolítico que no está normalmente presente en el rumen. Como ejemplo podemos citar una cepa de la bacteria Ruminococcus albus que expresa el gen de una celulasa de la bacteria del suelo Streptomyces rochei, en este caso la bacteria recombinante produce mucha más cantidad de celulasa que la bacteria original. En el segundo caso, los animales que se alimentan sobre pastos naturales se enfrentan a una serie de compuestos tóxicos producidos por algunas plantas, hongos o la actividad humana. El fluoroacetato producido

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por diversos árboles y arbustos de Australia, África y Centroamérica es un ejemplo de este problema. La estrategia en este caso consiste en transferir a las bacterias del rumen los genes que permiten neutralizar estos compuestos a partir de otras bacterias que son capaces de hacerlo. Así se han obtenido cepas de la bacteria Butyrivibrio fibrisolvens, una bacteria del rumen, que produce la enzima fluoroacetato deshalogenasa. Los síntomas de envenenamiento con fluoroacetato son mucho menos graves en las ovejas inoculadas con esta bacteria que en las ovejas normales. Otro desarrollo es la expresión de fitasa y xilanasa en la saliva de los cerdos transgénicos que disminuye la contaminación ambiental al reducir el fósforo en las heces.

9.4.2.

Mejora de razas con una mayor resistencia a las enfermedades

Uno de los aspectos más interesantes para la producción de animales de granja transgénicos es la posibilidad de aumentar la resistencia a enfermedades que son la causa de grandes pérdidas en las explotaciones ganaderas. Así se están obteniendo pollos resistentes a la coccidiosis o cerdas capaces de vacunar a sus lechones durante la lactancia, frente al virus de la gastroenteritis porcina trasmisible. A raíz de la crisis de las «vacas locas» en 1996 se despertó una gran inquietud en la opinión pública sobre la calidad sanitaria de la carne de vacuno, en esta ocasión se describieron varios casos de un síndrome neurológico irreversible en pacientes que se habían contagiado al consumir carne o vísceras de animales aquejados de encefalitis esponjiforme. El desarrollo de la enfermedad está relacionada con la presencia de un gen propio del animal (que se halla tanto en individuos sanos como enfermos). Stanley Prusiner (premio Nobel en 1997) propuso por primera vez la hipótesis del prión para explicar este grupo de encefalopatías. En sus experimentos obtuvo un ratón mutante deficiente en el gen celular que codifica para la proteína priónica PrP. Este ratón, que no parecía manifestar anormalidades importantes debidas a la ausencia del gen PrP, era resistente a la infección con extractos patogénicos de la variante priónica. Posteriormente, diversos grupos de investigación obtuvieron ratones transgénicos carentes de su propio gen PrP endógeno, que manifestaron también resistencia a la infección y no presentaron ningún defecto visible. Igualmente sería posible obtener vacas y ovejas transgénicas carentes del gen PrP lo que reduciría el riesgo de transmisión de la enfermedad al

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BIOTECNOLOGÍA Y ALIMENTACIÓN

hombre y evitarían las pérdidas económicas debidas al sacrificio de animales enfermos.

9.4.3.

Modificación de la calidad de la leche

Existen varias propuestas para aplicar la tecnología de los animales transgénicos a la producción de leche destinada al desarrollo de las crías del ganado. Los objetivos serían: — Mejorar su calidad nutricional, los principales nutrientes de la leche son: proteínas grasas y lactosa, al elevar cualquiera de estos componentes podemos influir en el crecimiento y salud de las crías en desarrollo. Esto tiene importancia en explotaciones de cerdos, la producción de leche para el crecimiento de los lechones durante la lactancia es un factor limitante. Un aumento de los nutrientes en la leche materna supone un acortamiento en el número de días necesarios para que los lechones alcancen el peso necesario para su comercialización. — Estimular la producción, mediante la inducción de hormonas adecuadas, factores de crecimiento, sustancias bioactivas que han demostrado que tomadas en la leche por las crías tienen funciones importantes en el desarrollo y maduración del intestino, sistema inmune y órganos endocrinos. — Mejorar la salud animal, mediante la producción de anticuerpos, lisozima u otros antimicrobianos en la glándula mamaria. Otras propiedades de la leche que pueden ser modificadas afectan a la producción de leche modificada para el consumo humano: — Reducir los niveles de lactosa o cambiar la composición proteica de la leche para hacerla más adecuada a individuos con intolerancia a la lactosa o que presenten reacciones alérgicas. La posibilidad de reducir la lactosa en la leche por la expresión transgénica de lactasa en la glándula mamaria ya ha sido demostrada. Aunque también hay otras alternativas mediante métodos no transgénicos para limitar el efecto de la intolerancia a la lactosa, como es el tratamiento posterior de la leche que es más económico. La modificación de la leche para alterar la composición y componentes proteicos tiene por objetivo hacer la leche más digestiva y reducir el riesgo de respuestas alérgicas, se trata de hacer una leche más «huma-

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na». La beta-lactoglobulina está presente en la leche vaca pero no en la leche humana y aproximadamente el 10% de los consumidores desarrollan una respuesta alérgica a esta proteína. Eliminar la proteína mediante transgénesis podría beneficiar a esos consumidores. Otras modificaciones en la composición de la leche tienen también como objetivo obtener leches infantiles más adecuadas, más parecidas a la leche materna, este logro sería muy beneficioso para el alimento de bebés prematuros. — Alterar la composición de la leche con el objeto de producir un aumento en la secreción de proteínas del tipo de las caseínas para mejorar la elaboración y rendimiento de quesos a nivel industrial. Por modificación génica se pueden variar las propiedades de la β-caseína y κ-caseína. Aumentado la concentración de la β-caseína en la leche se podría recudir el tiempo requerido para la coagulación y la expulsión del suero de la leche obteniéndose un cuajo más firme. Los cambios en otras propiedades físicas podrían dar lugar a productos lácteos con características mejoradas como por ejemplo mejor sabor en los quesos bajos en grasa.

9.4.4.

Producción de lana y fibras

El control de calidad, color, rendimiento e incluso facilitar el esquilado de la lana ha sido un área de enfoque para la manipulación transgénica del ganado. Se ha tratado de incrementar hormonalmente la producción de lana mediante la expresión en las células productoras del gen de la hormona IGF1. También se ha tratado de incrementar la cantidad de cisteína disponible para producir queratina (proteína del pelo), mediante la expresión en la oveja de genes bacterianos para la síntesis de este aminoácido (la cisteína es el componente mayoritario de estas proteínas). También se ha tratado de mejorar la finura, longitud y rizado de la lana y el pelo de cabra mediante el aumento en la producción de queratina de tipo II (una de las proteínas mayoritarias de la lana, junto con la queratina de tipo I). Un nuevo enfoque es obtener fibras en la leche de cabra con propiedades similares a la fibra de la seda de las arañas que presentan caracte-

282

BIOTECNOLOGÍA Y ALIMENTACIÓN

rísticas de elasticidad y resistencia que podrían ser utilizadas potencialmente para la fabricación hilos para suturas médicas, chalecos antibalas, etc.

9.4.5.

Granjas farmacéuticas

La aplicación más espectacular de la tecnología de los transgénicos en el campo de la biomedicina es sin duda la producción de proteínas humanas de interés terapéutico en la leche de vacas y ovejas. Hasta la aparición de la ingeniería genética, las proteínas humanas como la insulina y la hormona del crecimiento, necesarias para tratar la diabetes y otras enfermedades, debían aislarse de animales o de cadáveres humanos. En muchos casos estas proteínas eran difíciles de obtener en cantidades suficientes para garantizar el tratamiento prolongado de los enfermos. En otros casos, las fuentes tradicionales presentan problemas más graves, como el riesgo de contaminación con virus u otros agentes patógenos, piénsese en los casos de SIDA que se dieron entre los hemofílicos durante los años 80, por el uso de factores de coagulación procedentes de lotes de sangre contaminada. La tecnología del DNA recombinante ofreció la oportunidad de introducir genes humanos en bacterias y en otros microorganismos para convertirlos en factorías vivas de insulina y de otras proteínas humanas. La tecnología del DNA recombinante ofreció la oportunidad de introducir genes humanos en bacterias y en otros microorganismos para convertirlos en factorías vivas de insulina y de otras proteínas humanas. La producción de proteínas humanas en la leche de animales de granja presenta varias ventajas. Por un lado se reducen los riesgos de transmisión de enfermedades humanas, además, es más fácil conseguir proteínas idénticas a las humanas a partir de mamíferos que de microorganismos (las bacterias carecen de la maquinaria enzimática necesaria para llevar a cabo los procesos post-traducionales que las proteínas humanas requieren), el procedimiento de purificación de la proteínas es mucho más sencillo desde la leche que desde un tejido humano o animal, y la leche se puede producir en grandes cantidades durante periodos prolongados de tiempo. Para conseguir un animal que secrete una determinada proteína humana en la leche hay que obtener un animal transgénico en el que se haya introducido el gen de interés junto con un promotor de un gen que sea muy activo en la glándula mamaria, por ejemplo el de la caseína, o la

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lactoglobulina. De esta manera se han obtenido vacas, ovejas, cerdas o conejas cuya leche contiene proteínas humanas de uso terapéutico. Con estas técnicas se ha conseguido que la leche de hembras transgénicas contenga proteínas terapéuticas humanas como el factor IX de la coagulación de la sangre, antitripsina, proteína C, factor VIII de coagulación, antitrombina II, etc, que pueden ser fácilmente separadas de las restantes proteínas propias del animal (Tabla 9.1). TABLA 9.1 Proteína humana Factor IX Factor VIII α-1-antitripsina t-PA (activador de plaminógeno) Lactoferrina Interleuquina-2 Proteína C Antitrombina III IGF-1 (Factor de crecimiento de tipo insulina) beta-NGF (Factor de crecimiento nervioso) Hemoglobina

Uso actual o propuesto Tratamiento de la hemofilia B Tratamiento de la hemofilia A Tratamiento del efisema pulmonar Anticoagulante (Tratamiento post infarto) Antibacteriano Terapia del cáncer Anticoagulante Anticoagulante En procesos infamatorios y autoinmunes En afecciones del sistema nervioso Transfusiones

Además conviene señalar que el animal transgénico, en este caso, no se ve perjudicado durante el desarrollo porque el gen humano sólo se expresa en las células de las glándulas mamarias debido al regulador específico al que se ha asociado (promotor) y por tanto, en las restantes células del animal no se sintetiza la proteína humana al estar silenciado el gen humano. Varios productos derivados de las glándulas mamarias de cabras y ovejas transgénicas han progresado a ensayos clínicos avanzados. Los ensayos de fase III para la antitrombina III (ATIII, registrado con el nombre comercial ATryn de GTC Biotherapeutics) producida en la glándula mamaria de cabras tansgénicas se han completado, y el producto recombinante ha sido aprobado como medicamento por la Agencia Europea del Medicamento en agosto de 2009, y en los Estados Unidos por la FDA en febrero de 2009. Esta proteína es el primer producto de un animal de granja transgénico en ser aceptado como medicamento. ATryn está registrado para el tratamiento de pacientes resistentes a he-

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parina sometidos a operaciones de baypass cardiopulmonar. Esta empresa también ha expresado al menos once proteínas trangénicas. La enzima α-glucosidasa (de Pharming BV), declarado medicamento huérfano (categoría en la que se incluyen medicamentos no desarrollados generalmente por la industria farmacéutica por razones financieras, ya que van destinados a un reducido grupo de pacientes) ha sido utilizado con éxito para el tratamiento de la enfermedad de Pompe. Del mismo modo el inhibidor C1 (de Pharming BV) producido por conejos transgénicos ha completado los ensayos en fase III, para el tratamiento de angioedema hereditario. Otra aplicación es la producción de antídotos (como la butirilcolinesterasa) contra compuestos organofosforados que se utilizan como insecticidas en agricultura y guerra química. Un nuevo desarrollo muy interesante es la producción de animales que llevan la secuencia completa del loci humano correspondiente a la cadena ligera y pesada de las inmunoglobulinas. La utilización de gallinas transgénicas como biorreactores para la síntesis de proteínas terapéuticas en la yema o clara de huevo tiene ventajas sobre los sistemas de expresión de mamíferos dado que se pueden obtener un conjunto de animales mayor en menos tiempo, disminuyendo el coste asociado a la cría de los mismos. En este caso utilizando el promotor de la ovoalbunina se han obtenido anticuerpos o interferón humano.

9.4.6.

Animales transgénicos como modelo para estudiar algunas enfermedades humanas

Una de la aplicaciones más comunes de los ratones transgénicos en biomedicina es usarlos como modelo para estudiar algunas enfermedades humanas de origen genético. Por un lado, se pueden identificar genes del ratón cuya perdida da lugar a síntomas similares a una enfermedad; por otro lado, cuando se conoce cuál es el gen afectado se pueden obtener ratones sin el gen equivalente para experimentar sobre los tratamientos posibles. Sin embargo la fisiología, la anatomía, la patología, la organización del genoma, el peso corporal, de cerdos ovejas o vacas son más parecidos a los humanos, los animales domésticos representan modelos biomédicos más apropiados que los roedores. Los animales de granja imitan a las enfermedades humanas tales como la artiosclerosis, la

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285

diabetes no insulina-dependiente, la fibrosis quística, el cáncer y los trastornos neurodegenerativos.

9.4.7.

Xenotransplantes

Desde que en los años 60 se realizó el primer transplante de corazón con éxito por el Dr. Bernard, la posibilidad de utilizar xenotransplantes (transplantes de órganos entre animales de diferentes especies o entre animales y el hombre) para paliar la falta de donantes de órganos, ha atraído a científicos y cirujanos. Por su tamaño y metabolismo el cerdo es uno de los candidatos ideales como donante de órganos para el hombre. Sin embargo, las células porcinas presentan en su superficie ciertos azúcares que les hacen ser identificados rápidamente como extraños por nuestro sistema inmunitario, de tal modo que el órgano transplantado puede ser totalmente inactivado, a veces en cuestión de minutos. Diversos centros de investigación están tratando de obtener cerdos transgénicos cuyos órganos no den lugar a este tipo de rechazo. Una estrategia consiste en evitar que el cerdo produzca los azúcares que desencadenan la reacción, eliminado los genes necesarios para producirlos o incorporando algunas enzimas que eliminen estos azúcares. Otra estrategia consiste en hacer que las células del cerdo produzcan una o varias proteínas típicamente humanas cuya función es impedir que el sistema inmunitario las reconozca como extrañas, y actúe sobre los tejidos que las presentan. Ya se han obtenido resultados prometedores en transplantes de estos órganos de cerdos modificados a primates, pero todavía queda un largo camino hasta que esta tecnología se pueda aplicar en transplantes a seres humanos. Algunos ejemplos de esta tecnología son los babuinos transplantados con corazones de cerdo y la supervivencia de hasta tres meses de babuinos transplantados con riñones de cerdos que no expresan el gen alfa gal (alfa1,3-galctosiltranferasa). Sin embargo uno de los problemas que se plantean a la hora del uso de los xenotransplantes es la transmisión de virus porcinos a los pacientes humanos; aun cuando el riesgo de es bajo se han planteado métodos para inhibir la transmisión del patógeno utilizando RNA de interferencia (RNAi).

9.5.

PRODUCCIÓN DE PECES TRANSGÉNICOS

El objetivo de los piscicultores es el mismo que el de la mayoría de ganaderos o campesinos: producir animales más saludables, y del modo más rápido y eficiente posible.

286

BIOTECNOLOGÍA Y ALIMENTACIÓN

Quizás porque los peces son los vertebrados más primitivos, el público es más favorable a la modificación de los peces que a la de aves y mamíferos. El método más común de introducir transgenes en peces es por microinyección de un huevo fertilizado. Otros métodos de introducción como electroporación, pistola génica y liposomas también se han utilizado pero son menos fiables que la microinyección. Los objetivos de los experimentos realizados para producir peces genéticamente modificados incluyen los siguientes: — Estudiar la regulación de genes específicos con el fin directo o indirecto de obtener un beneficio en acuicultura. — Mejorar el crecimiento. — Mejorar la tolerancia al frío y resistencia a la congelación. — Mejorar la resistencia a enfermedades. — Alterar el metabolismo, con objeto de reducir los requerimientos de la dieta. — Obtener de peces estériles. — Utilizar los peces como biofactorías para la producción de productos farmacéuticos. La regulación génica es un aspecto que se ha estudiado cuidadosamente, con el objetivo de determinar cuándo y dónde se expresan los genes exógenos durante el desarrollo. Para ello, un método común es, por ejemplo, combinar un promotor de un gen concreto con un gen reportero que emite fluorescencia y así hacer el seguimiento de la migración de las células germinales a lo largo del desarrollo. Otros trabajos implican el aislamiento y análisis de secuencias enhancer y elementos reguladores que permitan la expresión de los genes de interés en tejidos adecuados o ante estímulos concretos para ser usados después en construcciones génicas para la producción de líneas mejoradas de peces GM. Los transgénicos requieren el uso de promotores específicos de tejido, tales como los que se expresan en el hígado (el gen anti-heladas) o promotores ubicuos tales como los de la beta-actina o histonas de peces que promueven la expresión del gen exógeno en todas las células del organismo.

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9.5.1.

287

Aumento del crecimiento: Mediante la sobreexpresión de la hormona del crecimiento

La mejora del crecimiento es sin duda el rasgo que más rápidamente se ha aplicado en la manipulación génica de peces, y en donde muchos laboratorios han tenido éxitos espectaculares. Al contrario de lo que ocurre en animales de granja no se observan los serios efectos secundarios de la sobreproducción de la hormona de crecimiento. En los primeros ensayos se utilizaron genes de la hormona de crecimiento de mamíferos, pero más recientemente son genes de especies de peces los que se usan exclusivamente. Los promotores elegidos para expresar el gen de la hormona de crecimiento, a menudo, son específicos de tejido. Los estudios realizados demuestran que se puede aumentar el tamaño de varias especies hasta siete veces y lo importante es que este crecimiento exagerado no modifica las características organolécticas (al paladar), ni provoca defectos anatómicos o anormalidades en el pescado.

9.5.2.

Mejora de la tolerancia al frío y resistencia a las heladas

En términos comerciales este aspecto es más significativo que el anterior. La intolerancia al frío en el caso de las carpas conduce a severas pérdidas durante algunos inviernos en China al norte del Río Yangtse. Igualmente la tilapia, que es esencialmente una especie de aguas templadas, puede suponer grandes pérdidas en inviernos fríos en Israel. La sobreexplotación de los bancos de pesca del Atlántico Norte desde hace décadas ha hecho que muchas localidades pesqueras de Canadá se dediquen a la cría de salmón y halibut en piscifactorías, pero se enfrentan al reto de proteger a sus peces cautivos, especialmente a los más jóvenes, del frío. La resistencia a las heladas es una característica de ciertas especies de pescado del Ártico y Antártico, (como la platija del Ártico) en las que incluso en aguas de mar por debajo de los 0 °C, la sangre no se congela debido a la liberación desde el hígado de proteínas que inhiben la formación de cristales en el plasma sanguíneo. El salmón atlántico normalmente no produce la proteína «antihelada» y se producen grandes pérdidas en inviernos muy fríos. Existe un gran interés en aplicar la tecnología transgénica para tratar de lograr especies tolerantes y resistentes de carpa o de salmón atlántico.

288

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Los avances en la tolerancia al frío están en fase de estudio todavía. Se han introducido en peces mediante ingeniería genética copias extras del gen delta-9-desaturasa, con el fin de que fueran más tolerantes a las bajas temperaturas, ya que se esperaba que si la conformación molecular de los lípidos fuera alterada produciría una mayor fluidez de la membrana. Se ha demostrado que el producto enzimático de este gen logra la tolerancia al frío en carpas, y otros peces de aguas templadas. En el salmón atlántico se ha expresado el transgén antiheladas (del pez Pseudopleuronectes americanus) pero desafortunadamente el nivel de la proteína producida en el salmón fue insuficiente para disminuir el punto de congelación de la sangre. Puede que utilizando promotores más fuertes o incrementando el número de copias del gen el objetivo se logre. Por el momento ningún pescado de uso en alimentación se ha logrado que sea tolerante al frío o las heladas.

9.5.3.

Resistencia a las enfermedades

Uno de los problemas más graves, que ocasiona numerosas pérdidas en acuicultura es el desarrollo de infecciones, ya que el agua supone un medio muy adecuado para la transmisión de enfermedades y los peces a menudo se encuentran almacenados en altas densidades en las piscifactorías. Hay dos ejemplos que ilustran la aplicación de la tecnología de transgénicos para evitar enfermedades en peces. La producción de salmón atlántico transgénico con cDNA de lisozima de trucha de arco iris. La lisozima de trucha de arco iris se ha demostrado que tiene propiedades antimicrobianas contra un rango amplio de bacterias gram negativas como Vibrio, Aeromonas y Yersinia, que son patógenos conocidos de peces. Otra línea de trabajo implica la producción de peces que expresen cecropina. Las cecropinas son proteínas antimicrobianas producidas por algunos insectos.

9.5.4.

Alteración del metabolismo

Un serio problema para la producción intensiva de trucha y salmón es que son especies carnívoras, se alimentan de peces capturados en el mar

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289

y el mantenimiento de estas piscifactorías supone una sobreexplotación de los recursos marinos que pueden afectar al equilibrio ecológico y producir un empobrecimiento de la fauna marina. Reconociendo este problema, algunos investigadores están investigando la posibilidad de alterar el metabolismo digestivo de las especies de salmón para permitir que utilicen en su dieta carbohidratos de plantas que normalmente digieren muy ineficazmente. Se está intentando que expresen genes como el transportador de glucosa y hexoquinasa. Si esos experimentos tuvieran éxito, podría ser un medio para mejorar las consecuencias ambientales que este tipo de acuicultura produce en la actualidad.

9.5.5.

Esterilidad

La producción y uso de peces estériles ofrece algunos beneficios en acuicultura. — Mejora el metabolismo del pez y aumenta la cantidad de músculo comestible. — Reduce drásticamente el impacto ambiental negativo de los peces GM en la eventual liberación o escape de estos animales al medio exterior. Inducir la esterilidad en peces no necesita manipulación genética. Ya hay modos para producir peces triploides mediante tratamiento de choque térmico o presión a huevos fertilizados. Aunque los peces triploides son sustancialmente estériles hay dos problemas. Algunos diploides pueden encontrarse entre los triploides y algunos machos triploides producen cierta cantidad de esperma viable. La aplicación de la tecnología transgénica en este campo tiene por objetivo la inactivación de los genes responsables del desarrollo de gónadas. Los genes que producen las gonadotropinas y la hormona liberadora de gonadotropinas pueden ser silenciados utilizando la tecnología «antisentido». Cuando las secuencias «antisentido» son expresadas producen un RNA que es complementario al RNA mensajero de los genes de interés y así impiden su traducción en proteínas.

290

9.5.6.

BIOTECNOLOGÍA Y ALIMENTACIÓN

Peces productores de fármacos

Con los mismos objetivos que se han comentado para las granjas farmacéuticas, se ha logrado la producción del factor VII humano en tilapia. También se ha conseguido a nivel experimental la producción de peces con alta cantidad en vitaminas y ácidos grasos poliinsaturados. Está claro que el consumo de estos peces como alimentos tendría beneficios adicionales para la salud humana.

9.6.

BENEFICIOS Y RIESGOS

La tecnología de los animales transgénicos para el consumo como alimento es todavía experimental, aunque con el tiempo es posible que lleguen a ser viables comercialmente. En todo caso, hay que sopesar los posibles riesgos y beneficios de esta aplicación de la biotecnología. Aquí sólo se recogen algunos de ellos:

9.6.1.

Beneficios

— Especificidad: Los caracteres deseables pueden ser elegidos con mayor exactitud y los efectos no deseables evitados al mínimo. — Rapidez: Los caracteres deseados pueden ser obtenidos en una sola generación, mientras que se requieren numerosas generaciones utilizando los métodos tradicionales de cruzamiento y selección. — Flexibilidad: Pueden introducirse en los animales transgénicos características de especies distintas que jamás se podrían conseguir por los métodos de selección artificial. — Economía: Pueden introducirse caracteres para que los animales modificados necesiten menos aportes alimenticios y tratamientos sanitarios. Consideraremos a continuación algunos ejemplos en que la transgénesis podría aportar beneficios concretos.

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291

Para el medio ambiente: el caso de los cerdos transgénicos que expresan fitasa En los países desarrollados la contaminación causada por excrementos de algunos animales no rumiantes (cerdos, gallinas) constituye un grave problema. Estos desechos contienen altas cantidades de fósforo fítico que se incorpora al medio ambiente en forma de fosfatos que contaminan las aguas terrestres. Los cerdos que expresan el gen de la fitasa excretan una cantidad considerablemente menor de fosfatos que los animales control y requieren mucha menos cantidad de fosfato en su dieta, suponiendo un claro beneficio para el medio ambiente.

Para la salud de los animales: resistencia a las enfermedades Este logro supondría una reducción del uso de drogas, una mayor longevidad y bienestar animales. Aunque esto último podría provocar la aparición de nuevos patógenos que resultaran más nocivos para los animales no modificados genéticamente. La expresión de lisostafina en la glándula mamaria y presente en la leche de vaca induce protección contra la mastitis en vacas y también reduce el riesgo de infecciones de S. aureus en humanos. La expresión de lactoferrina, un antibacteriano natural presente en la leche humana, puede proteger a los niños contra la proliferación bacteriana en el tracto intestinal.

9.6.2.

Riesgos

— Salud animal: La inserción de un transgén puede afectar a la expresión de otros y como consecuencia afectar al funcionamiento del animal. — Transferencia de virus: Éste es un riesgo particular en el desarrollo de animales creados como donadores para xenotransplantes. En algunos trabajos científicos se ha descrito que en los cultivos de células, como las utilizadas en la trasferencia nuclear, se ha detectado contaminación por varios tipos de virus. El riesgo de infección por retrovirus endógenos porcinos en los órganos de cerdo utilizados en xenotransplantes, es muy significativo. — Inserción de DNA foráneo puede tener efectos epigenéticos. Por ejemplo: la inserción de DNA en líneas celulares de hámster a

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veces tiene efectos sobre la metilación de secuencias. Esos cambios suponen la activación de secuencias retrovirales endógenas, normalmente silenciadas por metilación. — Diseminación involuntaria del transgén a la población no modificada mediante reproducción cruzada. Los riesgos de diseminación de los transgenes fuera de las poblaciones controladas son bajos para el ganado y las aves de corral. La posibilidad de propagación y supervivencia de estos animales es muy limitada comparada con los riegos de propagación de las plantas y peces modificados genéticamente.

9.6.3.

Factores económicos y aceptación pública

El factor económico es el principal determinante para que un alimento de origen animal GM sea considerado para la producción. Actualmente los métodos disponibles para la obtención de transgénicos son caros e ineficaces, por lo que el coste de la aplicación de la transgénesis a la cría de ganado vacuno es prohibitivo, aunque en la industria de la cría de aves de corral, aún con un coste muy elevado, la introducción de modificaciones genéticas tiene más posibilidades. Hay una gran preocupación pública por el uso de la ingeniería genética en animales que incluyen tanto la manipulación misma como temas relacionados con el bienestar de los animales. Sin embargo, la aplicación de la tecnología transgénica en relación al desarrollo de productos farmacéuticos para la salud humana, por ejemplo proteínas farmacéuticas, es considerada mucho más aceptable que las modificaciones relacionadas con la producción de alimentos.

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ANIMALES TRANSGÉNICOS

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Tema 10 TÉCNICAS MOLECULARES APLICADAS AL ANÁLISIS DE ALIMENTOS Y DETECCIÓN DE FRAUDES ALIMENTARIOS

A lo largo del proceso de elaboración de alimentos y en el momento de su comercialización se realizan distintos análisis y controles con el fin de garantizar la seguridad y calidad de los productos que llegan al consumidor. En este capítulo nos referiremos a tres tipos de análisis: 1. A los controles que se realizan para la detección de microorganismos patógenos en alimentos con el fin de evitar infecciones e intoxicaciones de origen alimentario. 2. A los métodos para la identificación de especies, sobre todo en aquellos alimentos de origen animal cuyas características anatómicas esenciales se han perdido durante el procesado del alimento. Estos controles son necesarios para identificar falsos etiquetados y detectar mezclas fraudulentas. 3. A los controles para la identificación de alimentos transgénicos. Con la entrada en el mercado europeo de los alimentos transgénicos, y la exigencia legal de un etiquetado preciso de los mismos deben de existir unos sistemas de control y análisis adecuados. Vamos a estudiar en este tema cómo se pueden aplicar las técnicas de Biología Molecular para detectar microorganismos patógenos en los alimentos, para la identificación de especies en alimentos procesados y, en la identificación de alimentos elaborados con plantas transgénicas.

ESQUEMA DE CONTENIDOS 10.1. Microorganismos patógenos en alimentos 10.2. Métodos de detección de microorganismos patógenos en alimentos 10.3. Aplicación de las técnicas de Biología molecular para la identificación de patógenos en alimentos 10.4. Técnicas basadas en la hibridación con sondas de DNA 10.4.1. Hibridación en colonia 10.4.2. Southern-Blot 10.5. Reacción en Cadena de la Polimerasa 10.5.1. Amplificación de secuencias de RNA por retrotranscripción y PCR (RT-PCR) 10.5.2. PCR anidada 10.6. Identificación de especies en los alimentos procesados 10.6.1. PCR-RFLP 10.6.2. PCR-SSCP 10.7. Identificación de alimentos preparados con plantas transgénicas 10.7.1. Detección de las secuencias reguladoras del transgén 10.7.2. Detección de los genes marcadores 10.7.3. Detección del gen foráneo 10.8. DNA-chips o Microarrays

10.1.

MICROORGANISMOS PATÓGENOS EN ALIMENTOS

Una faceta importante de la seguridad alimentaria es la necesidad de detectar rápidamente los patógenos en alimentos con el fin de evitar brotes que puedan afectar a los consumidores. Existen dos tipos de enfermedades relacionadas con los alimentos: las intoxicaciones alimentarias y las infecciones alimentarias. Las primeras producen síntomas poco después de la ingestión de los alimentos, ya que no es necesario que se multipliquen los microorganismos causantes de la enfermedad. Las toxinas generadas en el alimento pueden estar asociadas a las células microbianas o pueden ser liberadas de ellas. Las infecciones alimentarias conllevan la ingestión del patógeno, seguida del crecimiento del mismo por invasión de tejidos, liberación de toxinas o ambos. Entre los microorganismos patógenos que causan las infecciones alimentarias e intoxicaciones más graves, o que producen una mayor alarma social y de los que se han descrito métodos basados en las técnicas de biología molecular para su detección rápida y segura se encuentran: — Clostridium botulinum. Es una bacteria anaerobia que provoca una enfermedad neuroparalítica grave, produce una parálisis muscular inducida por una toxina que bloquea la liberación de la acetilcolina de las neuronas motoras impidiendo la contracción de los músculos. Puede llegar incluso a ser mortal. Existen distintos tipos de Clostridium botulinum que producen distintas variedades de neurotoxinas, se requiere la rápida identificación del tipo de neu-

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rotoxina responsable para el inicio inmediato de un tratamiento adecuado. Aunque actualmente la intoxicación botulínica tiene una incidencia baja en los países desarrollados, la popularización de ciertos sistemas de conservación de alimentos, como el envasado al vacío representa un nuevo riesgo potencial al botulismo. — Clostridium perfringens. Puede causar graves intoxicaciones alimentarias, produce una enterotoxina que provoca una gastroenteritis que puede ser muy grave y desencadenar diarreas hemorrágicas, pero los casos mortales son raros. La enfermedad está especialmente asociada al consumo productos cárnicos contaminados. — Staphyloccocus aureus. Produce la intoxicación alimentaria más común. Este organismo produce varias enterotoxinas que secreta al medio circundante o alimento, si se come el alimento que contiene la toxina, en el plazo de 6 horas se observan serias reacciones que incluyen náuseas, vómitos y diarreas. Se han identificado seis tipos de enterotoxinas de S. aureus: A, B, C1, C2, D, y E. La enterotoxina A es la que más frecuentemente está asociada a los brotes de intoxicación alimentaria estafilocócica. Su presencia en los alimentos indica casi siempre una manipulación incorrecta del producto, debido generalmente a prácticas higiénicas inadecuadas. — Listeria monocytogenes. Su incidencia es baja, pero produce la más alta tasa de mortalidad (30% de los casos) en los países desarrollados. Puede contaminar la carne, ciertos derivados como los patés se han visto involucrados en brotes de listeriosis y se considera un alimento de alto riesgo que deberían evitar las mujeres embarazadas. Este patógeno también es transmitido por productos lácteos. — Las cepas enterohemorrágicas del serogrupo O157 H7 de Escherichia coli producen colitis hemorrágica aguda con secuelas graves. — Salmonella y Campylobacter. Son los principales agentes responsables de los episodios diarreicos esporádicos en los países desarrollados. — Campylobacter. Es un bacilo curvado, Gram negativo, se encuentra en carnes crudas o insuficientemente cocinadas, sobre todo de pollo, pavo y otras aves de corral. El adecuado lavado de las aves

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antes de cocinarlas (y de algunos utensilios que han estado en contacto con ellas) y el cocinado meticuloso de la carne eliminan la posibilidad de una infección con Campylobacter. — Salmonella ssp. Produce una infección alimentaria cuyos síntomas aparecen cuando el patógeno se multiplica en el intestino (por lo cual los síntomas sólo aparecen varios días después de haber comido el alimento contaminado). Los síntomas incluyen la aparición repentina de dolor de cabeza, escalofríos, vómitos y diarrea, seguidos de fiebre que dura unos cuantos días. Las infecciones alimentarias por Salmonella con frecuencia van asociadas a productos fabricados con huevos crudos, tales como la mayonesa, los pasteles con crema, los merengues, las empanadadas, etc. — La incidencia de infecciones provocadas por Yersinia enterocolitica ha crecido en los últimos años, pero sólo algunos serotipos están asociados a la enfermedad. La diferenciación de cepas patógenas y no patógenas es muy difícil por los métodos tradicionales de análisis. Se considera que los cerdos son los portadores y la fuente principal de la infección humana. También los virus son responsables del 4% de los casos confirmados de infecciones alimentarias en países desarrollados. Las intoxicaciones víricas de origen alimentario están asociados a la ingestión de agua o de alimentos que por su naturaleza pueden haber tenido contacto con aguas residuales y posteriormente se suelen consumir crudos: mariscos, frutas, verduras, hortalizas.

10.2.

MÉTODOS DE DETECCIÓN DE MICROORGANISMOS PATÓGENOS

Los métodos tradicionales de detección de microorganismos patógenos en los alimentos se basan en procedimientos microbiológicos de aislamiento y métodos bioquímicos de identificación que son de uso rutinario en los laboratorios de análisis de alimentos. Estos métodos requieren generalmente varias fases: • El homogeneizado del alimento, ya que éste puede presentar distintas texturas más o menos sólidas (no es lo mismo una muestra de leche que un trozo de carne o de queso). Si el alimento es sólido se requiere un homogeneizado mecánico en un medio inerte, como puede ser una solución salina.

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• Casi siempre se requiere una etapa de enriquecimiento en un medio nutritivo, no selectivo, para permitir que aquellos patógenos que se encuentran contaminando un alimento, incluso si están presentes en un número muy bajo, se desarrollen y sea posible su detección posterior. • A continuación se requiere la siembra o la incubación de la muestra del alimento en medio selectivo sólido que va a permitir el crecimiento, en colonias aisladas, de familias o géneros de microorganismos patógenos que nos interesa detectar, e inhiben el crecimiento de la microflora normal y no patógena. • La identificación de esos microorganismos aislados debe ser confirmada posteriormente por análisis microscópicos, bioquímicos, basados en actividades enzimáticas características de cada tipo de microorganismo o por análisis inmunológicos, basados en el reconocimiento por parte de anticuerpos específicos de los antígenos específicos de los distintos patógenos. Estas técnicas son muy importantes y se han utilizado y se utilizan para la identificación de bacterias patógenas en alimentos. Sin embargo: — Son lentos, ya que requieren en algunos casos hasta dos o tres semanas de trabajo para la confirmación de la existencia de un patógeno sospechoso. — Son costosos, en el sentido de que los medios selectivos y los reactivos que se emplean son caros. — Pero lo más grave es que en muchas ocasiones carecen de sensibilidad o especificidad. Así, en los países desarrollados se estima que más del 60% de las infecciones alimentarias reconocidas nunca se llega a conocer el agente causante. Entre los factores que explican esta baja tasa de confirmación se incluyen: • La ausencia de muestras adecuadas, cuando se reconoce la existencia de un brote. • La existencia de una población reducida del patógeno responsable en el alimento y generalmente formando parte de una microflora muy compleja. Por tanto el patógeno en baja concentración es muy difícil de aislar.

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• La imposibilidad de crecer e identificar ciertos microorganismos, tales como virus o Campylobacter, en el laboratorio. En los últimos años, el extraordinario auge experimentado por la biología molecular ha conducido al desarrollo de técnicas genéticas que permiten la identificación rápida de microorganismos específicos, sin la necesidad de su aislamiento en cultivos puros, eliminando algunas de las limitaciones apuntadas anteriormente.

10.3.

APLICACIÓN DE LAS TÉCNICAS DE BIOLOGÍA MOLECULAR PARA LA IDENTIFICACIÓN DE PATÓGENOS EN ALIMENTOS

Las técnicas de biología molecular aplicadas a la detección de patógenos en alimentos consisten básicamente en el análisis del DNA de los microorganismos que contaminan un alimento. Como ya sabemos el DNA es una macromolécula que contiene la información genética de un organismo y está presente en virus, bacterias y organismos superiores. Algunas secuencias de nucleótidos que forman la molécula de DNA son únicas y propias para cada especie. Si disponemos de los métodos adecuados para identificar secuencias de DNA concretas podremos identificar la especie a la pertenece ese DNA, e incluso podemos distinguir poblaciones o cepas de una especie dada. Las técnicas de biología molecular, en los últimos años se han ido simplificando y automatizando y permiten obtener el resultado del análisis en poco tiempo. En algunos casos, incluso, no requieren el aislamiento de los microorganismos sospechosos en cultivos puros. Por otra parte, son muy sensibles, es decir, son capaces de detectar la presencia de un microorganismo concreto aunque éste se encuentre en el alimento en muy baja concentración. Por tanto, las técnicas de biología molecular aplicadas al análisis de alimentos para detectar microorganismos patógenos se basan en la posibilidad de identificar secuencias de DNA de un determinado microorganismo patógeno en un alimento. Si detectamos una secuencia de DNA específica de un patógeno en una muestra de alimento nos indica que el alimento está contaminado con el microorganismo correspondiente.

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Básicamente para analizar o identificar un DNA determinado se utilizan en Biología molecular dos tipos de técnicas: unas basadas en la hibridación con sondas específicas, y, otras, en la amplificación de secuencias específicas del DNA.

10.4.

TÉCNICAS BASADAS EN LA HIBRIDACIÓN CON SONDAS DE DNA

Como ya sabemos la estructura de doble hélice del DNA confiere a esta molécula una serie de propiedades físico-químicas particulares que son las que se aprovechan para su análisis. Sabemos que en la doble hélice de DNA las dos cadenas de nucleótidos se mantienen unidas mediante puentes de hidrógeno que se establecen entre las bases nitrogenadas complementarias. Sin embargo, estos enlaces son relativamente débiles y se pueden romper en determinadas condiciones, por ejemplo, mediante una elevación de temperatura se separan las dos cadenas de la molécula de DNA. Este proceso se conoce como desnaturalización del DNA. Igualmente se puede restablecer la estructura de doble hélice al volver a las condiciones de temperatura apropiadas, este fenómeno se conoce como renaturalización del DNA. Si en presencia de la molécula de DNA desnaturalizada se añaden fragmentos cortos de DNA monocatenario que contengan secuencias complementarias a una de las cadenas del DNA desnaturalizado, en el momento de la renaturalización se va a producir una unión entre el DNA original y el añadido, es decir, se va a producir una molécula híbrida, este fenómeno se conoce como hibridación del DNA. El fragmento de DNA monocatenario añadido generalmente está marcado de manera que permite su identificación, por eso se conoce como sonda, y nos permite detectar si se han formado híbridos entre la sonda y el DNA de la muestra (Figura 10.1). Tradicionalmente la sonda se suele marcar con isótopos radiactivos pero cada vez es más frecuente el uso de sondas marcadas no radiactivamente, uniéndolas a diversos compuestos enzimáticos, cromógenos, luminiscentes o fluorescentes que hacen posible su rápida detección y no suponen ningún riesgo para el personal que realiza el análisis. Lo importante de esta técnica, por tanto, es el disponer de sondas para detectar la presencia de una molécula de DNA de un determinado microorganismo patógeno.

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FIGURA 10.1. Hibridación con sondas de DNA. La sonda se une por complementariedad de sus bases al DNA desnaturalizado de la muestra.

Evidentemente para que una sonda sea útil es necesario que detecte solamente un microorganismo específicamente. Es decir, que hibride con una secuencia de DNA característica y presente solamente en este microorganismo, y por tanto, que no detecte otros patógenos. Dado que existe cierto grado de homología entre distintas especies, lo que nos interesa identificar son secuencias que únicamente se encuentren en un determinado patógeno. Las secuencias de DNA específicas, propias de cada patógeno pueden ser varias, pero aquí vamos a considerar dos: • Las secuencias de los genes que codifican las toxinas específicas de ciertos patógenos • Determinadas regiones de los genes que codifican para el RNA ribosómico.

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FIGURA 10.2. Estructura de los genes que codifican el RNA ribosómico en bacterias.

Se utilizan sondas, es decir secuencias de DNA monocatenario que van a hibridar con el gen de la verotoxina para detectar cepas enterotoxigénicas de E. coli, sondas que hibridan con el gen de la Enterotoxina B para detectar S. aureus, sondas que hibridan con el gen de la hemolisina para detectar Listeria, el gen de la neurotoxina A para detectar C. botulinum o el gen de la toxina del cólera para detectar V. cholerae. Otro tipo de sondas que se pueden utilizar son las que hibridan con ciertas regiones de los genes que codifican el RNA ribosómico. Las secuencias de estos genes son muy conocidas en muchas especies de bacterias, pues se han utilizado para establecer el parentesco o la divergencia filogenética en especies bacterianas. Los genes del RNA ribosómico se encuentran en el genoma de la bacteria repetidos en tándem en un número muy elevado, esta característica hace que la señal de la sonda aumente. Si bien la secuencia del DNA ribosómico es muy parecida en distintas especies, en las regiones intergénicas se han acumulado muchas mutaciones a lo largo de la evolución, son precisamente estas regiones las que se van a utilizar para diferenciar unas especies de otras. (Ver Figura 10.2). Hasta ahora hemos visto el fundamento de la hibridación con sondas específicas pero ¿cómo se puede aplicar al análisis de los alimentos? Fundamentalmente mediante hibridación en colonia y Southern-blot.

10.4.1.

Hibridación en colonia

Este es el procedimiento más sencillo. En este caso, después de homogeneizar el alimento se siembra una muestra en un medio nutritivo sólido, en una placa Petri, sobre la que crecerán las bacterias que contaminan el alimento en colonias más o menos aisladas. Estas se transfieren a un soporte sólido, una membrana de nitrocelulosa o nylon. Después de un tratamiento alcalino para lisar las células y desnaturalizar el DNA, esta

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FIGURA 10.3. Hibridación en colonia con sondas específicas para identificar patógenos en un alimento

membrana con el DNA inmovilizado y desnaturalizado se pone en contacto con la sonda. Si la sonda encuentra un DNA complementario formará híbridos, marcando las colonias de los microorganismos patógenos que se encuentran contaminando el alimento analizado (ver Figura 10.3).

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Veamos un ejemplo: Se contaminó artificialmente una muestra de carne con Clostridum perfringens, y se detectó este patógeno con una sonda específica contra el gen de la enterotoxina marcada con digoxigenina. En los controles, donde habían sido aisladas colonias de los microorganismos que constituyen la flora normal de la carne no se detecta ninguna señal de hibridación. (Ver figura 10.4 del Appl.Emvironm. Microbiol. (1995) 61, 807). Otras formas de aplicar la técnica de hibridación no requieren el aislamiento de los microorganismos en colonias pero sí la extracción del DNA total del alimento, y por tanto también del material genético, el DNA, de los microorganismos que lo contaminan. Extracción del DNA: En este caso después de homogeneizar el alimento es preciso un tratamiento con detergentes iónicos como el SDS, para lisar las bacterias, un tratamiento con proteinasa K, una enzima que romperá las proteínas, y la extracción de las mismas y otros componentes celulares con disolventes orgánicos (tratamiento con fenol). El DNA una vez purificado puede ser identificado mediante Southern-blot.

10.4.2.

Southern blot

La técnica de Southern blot es compleja, se requiere la extracción del DNA total que se encuentra en una muestra del alimento y tratamiento posterior del DNA aislado con enzimas de restricción. Las enzimas de restricción, como hemos estudiado en un tema anterior, son unas endonu-

FIGURA 10.4. Hibridación en colonia para detectar Clostridium perfringens. Sonda: gen de la enterotoxina marcada con digoxigenina. a) Señal positiva de colonias aisladas de carne contaminada. b) No se detecta señal en muestras tomadas de carne no contaminada.

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cleasas que cortan o fragmentan el DNA por secuencias específicas. Como el DNA de cada organismo presenta una secuencia propia, los tamaños de los fragmentos obtenidos tras el tratamiento con una determinada enzima de restricción serán distintos para cada especie. Esta técnica requiere separar electroforécticamente los fragmentos de DNA obtenidos, en geles de agarosa o poliacrilamida. Estos fragmentos se van a separar por su tamaño en un campo eléctrico. Los más pequeños emigran más rápidamente hacia el polo positivo y los mayores quedarán más cerca del polo negativo. Una vez separados los fragmentos, se transfieren a una membrana o soporte sólido, y se procede a la hibridación con la sonda específica, que detectará un patrón de bandas que será específico para cada patógeno. (Ver Figuras 5.5a y 5.5b). Este método es mucho más complejo que el señalado anteriormente, y aunque se usa frecuentemente en los laboratorios de investigación, se emplea con menos frecuencia para la detección de patógenos en alimentos por el gran número de pasos intermedios que hay que realizar para obtener el resultado final.

10.5.

REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR)

Otro tipo de estrategia para detectar patógenos en un alimento se basa en la amplificación de secuencias específicas del DNA. Es lo que se conoce por PCR o reacción en cadena de la polimerasa. Veamos primero en qué consiste esta técnica. La PCR se basa en la repetición cíclica de tres etapas: En una primera etapa, se desnaturaliza el DNA presente en la muestra (y por tanto, si está presente el DNA del patógeno) esta desnaturalización separa las dos cadenas sencillas que forman la doble hélice del DNA. Esto se consigue aplicando temperaturas superiores a 90 °C. En la segunda etapa se unen específicamente los cebadores. Son oligonuleótidos sintéticos, es decir, fragmentos de DNA de cadena sencilla, con una secuencia de nucleótidos conocida, y complementaria al DNA que se pretende amplificar; en este caso, una secuencia específica del DNA del patógeno. Se deben emplear dos cebadores que tras unirse cada uno a una cadena diferente limitarán la secuencia diana que se pretende amplificar. La temperatura a la que se efectúa la unión de los cebadores al DNA desnaturalizado es crítica para controlar la especificidad de la reacción y depende exclusivamente de la composición de las bases nitrogenadas de los cebadores.

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Existen programas informáticos para calcular la temperatura de unión de los cebadores al DNA diana, que dependerá del número de bases que contenga el fragmento sintetizado y el tipo de bases presentes. En la tercera etapa se produce la extensión enzimática de los cebadores mediante una DNA polimerasa, enzima que inicia la polimerización del DNA tras reconocer la unión de los cebadores a las cadenas de DNA de la muestra y permite la unión de los nucleótidos complementarios a la cadena de DNA que está utilizando como molde. Después del primer ciclo se obtiene como resultado la duplicación de la secuencia del DNA diana delimitada por la pareja de cebadores específicos. En el siguiente ciclo la nueva copia de DNA servirá de molde para amplificar el DNA diana, así la cantidad de DNA generado se incrementará exponencialmente. Las figuras 5.8 y 5.9 resumen el proceso. En presencia de todos los ingredientes para la reacción: el DNA extraído de la muestra de alimento, los cebadores, los dNTP, que son los distintos nucleótidos necesarios para llevar a cabo la polimerización del DNA diana, y la DNA polimerasa, todos mezclados en un pequeño tubo de ensayo, se inicia el proceso con la desnaturalización del DNA, la posterior hibridación de los cebadores en las regiones complementarias y la polimerización del DNA, obteniéndose dos copias del DNA diana; en el siguiente ciclo, se obtendrán cuatro copias, y en el siguiente, 8, en el siguiente, 16 y así, sucesivamente. De este modo un proceso de amplificación típico de entre 20 y 40 ciclos amplificará más de un millón de veces, como mínimo, el número de copias del fragmento diana de DNA que exista en la muestra original. Los fragmentos amplificados o amplicones se detectan fácilmente mediante electroforesis en geles de agarosa y tinción con bromuro de etidio. El bromuro de etidio es una sustancia fluorescente que se intercala entre los pares de bases adyacentes de DNA, posibilitando su visualización cuando se ilumina con luz ultravioleta. (Ver figura 10.5). La técnica de PCR está desplazando a las demás técnicas que hemos comentado anteriormente. Las claves de tal éxito son, en primer lugar, la creciente disponibilidad de cebadores específicos posibilitada gracias, en parte, a los avances en la secuenciación de ácidos nucleicos, que han permitido conocer secuencias de un número considerable de genes microbianos y por otra parte, al de-

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FIGURA 10.5. Esquema de las etapas para la visualización de los resultados obtenidos después de una amplificación de secuencias específicas mediante PCR en geles de agarosa y tinción con bromuro de etidio.

sarrollo de equipos y reactivos para la síntesis rápida y barata de oligonucleótidos. Por otro lado, el uso de una DNA polimerasa termorresistente, inicialmente cuando este procedimiento fue descrito por primera vez se empleaba una enzima de E. coli, que se desnaturalizaba cuando se sometía a 90 °C, durante la primera etapa de cada ciclo y por lo tanto, había que reponerla al inicio de cada fase de polimerización, impidiendo la automatización del proceso. Ahora se usa una enzima termorresistente: la Taq polimerasa, aislada de un microorganismo Thermus aquaticus, cuyo medio natural son las aguas termales y geíseres, y por lo tanto posee una DNA polimerasa que resiste temperaturas por encima de los 90 °C requeridos durante la fase de desnaturalización. La temperatura óptima a la que actúa la Taq polimerasa se sitúa en torno a los 72 °C. Otro factor clave en el éxito de la PCR ha sido el desarrollo de aparatos que automatizan el proceso, los termocicladores, que de forma automática y de manera muy exacta y precisa, repiten los distintos ciclos de temperatura que se necesitan para la reacción en cadena de la polimerasa.

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Actualmente existen empresas que comercializan, además de estos termocicladores, los ingredientes necesarios (la Taq polimerasa y los dNTPs), de manera que el personal técnico que debe realizar el análisis sólo debe añadir en un tubo de ensayo una pequeña muestra de DNA extraído de la muestra del alimento y los cebadores específicos, y al cabo de pocas horas, obtener el resultado. ¿Qué tipo de DNA se amplifica para realizar la detección de microorganismos patógenos en muestras de alimentos mediante esta técnica de PCR? Como en el caso de las técnicas de hibridación, los genes o secuencias que son específicos de estos microorganismos, como son los genes determinantes de la producción de toxinas y las secuencias diferenciales del DNA ribosómico. En este caso también la ventaja que tiene el uso del DNA ribosómico como DNA diana es su alto número de copias que multiplicará la señal obtenida. Por todo lo dicho hasta ahora, la técnica de PCR presenta numerosas ventajas: — Por su alta sensibilidad y especificidad, es capaz de detectar un microorganismo patógeno en una muestra, aunque éste se encuentre en baja concentración. — Es un procedimiento bastante más rápido que otros basados en técnicas moleculares que hemos comentado antes y, desde luego, mucho más rápido que los métodos tradicionales. — Es un método bastante sencillo de aplicar. — Presenta un alto grado de automatización lo que permite el análisis de un gran número de muestras a la vez. La técnica de la PCR es tan sensible que detecta bacterias incluso muertas, esto es así porque el DNA está presente tanto en células vivas como en las células no viables y por tanto la PCR puede detectar organismos en ambos estados. Esta propiedad es importante cuando se pretende detectar microorganismos como Clostridium botulinum o Staphylococcus aureus, capaces de producir toxinas termorresistentes, la detección de tales bacterias aún cuando hayan sido destruidas por tratamientos térmicos, significa que podrían haber contaminado el alimento y haber sintetizado las toxinas previamente y por tanto, indican un riesgo potencial para los consumidores. Además la detección de ciertos microorganismos, independientemente de su estado, puede indicar una mani-

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pulación poco higiénica de los alimentos, por lo que su consumo puede suponer cierto riesgo. Sin embargo, en ocasiones, es necesario detectar exclusivamente microorganismos viables, para ello se pueden seguir dos estrategias. La primera consiste en la toma de dos muestras del alimento sospechoso con un intervalo de varias horas entre ambas. Si los microorganismos están vivos, se estarán multiplicando, por lo que el resultado de la segunda PCR debe presentar una mayor cantidad de DNA amplificado, debido al incremento del número de células y, por tanto, de DNAs diana para amplificar. Alternativamente, se puede analizar la presencia de RNA mediante una modalidad especial de PCR, que persigue la amplificación una secuencia de RNA específico.

10.5.1.

Amplificación de secuencias de RNA por retrotranscripción y PCR (RT-PCR)

En este caso, lo que se detecta es el RNA mensajero de los microorganismos; esta molécula, el RNA, es muy inestable, desaparece a los pocos minutos de la muerte celular y únicamente está presente en células viables. La RT-PCR es una modalidad de PCR que requiere en primer lugar hacer una extracción del RNA total de la muestra de alimento, a continuación el RNA presente se transforma en DNA complementario

FIGURA 10.6. Esquema de la amplificación de RNA por RT-PCR.

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(cDNA), de manera similar a como lo hacen los virus RNA para su replicación (usando una enzima específica, la transcriptasa inversa). El cDNA se utiliza como molde en una PCR clásica (Ver figura 10.6). Tras realizar la PCR y visualizar los resultados, la presencia de amplicones del tamaño esperado se considera frecuentemente como prueba evidente de un resultado positivo. Sin embargo, para obtener una certeza absoluta, la identidad del fragmento amplificado debería ser confirmada mediante otras técnicas. Por ejemplo, mediante la digestión con enzimas de restricción, mediante secuenciación o mediante hibridación con una sonda específica, pero esta confirmación retrasaría la obtención de los resultados. Una alternativa para comprobar que los amplicones obtenidos corresponden a la presencia de un DNA diana del patógeno que se sospecha está presente en el alimento, es realizar lo que se denomina PCR anidada.

10.5.2.

PCR anidada

La PCR anidada, o en nido, consiste en realizar dos amplificaciones sucesivas. En la primera se emplea una pareja de cebadores para amplificar un fragmento concreto de DNA del patógeno sospechoso, y a continuación se toma una pequeña muestra del DNA recién amplificado, como DNA molde para realizar una segunda PCR. En la segunda, se usa otra pareja de cebadores complementarios a secuencias internas del producto de la PCR obtenido durante la primera amplificación. Si se obtienen amplicones del tamaño esperado tras la segunda PCR, se confirmará el primer resultado ya que los segundos amplicones sólo se obtendrán si se amplificó el fragmento correcto durante la primera reacción, ignorándose los posibles falsos amplicones generados en la misma. (Ver figura 10.7). Los investigadores del Instituto de Acuicultura, de la Universidad de Santiago de Compostela han desarrollado este método para detectar Salmonella senftenberg en las ostras crudas, utilizando como cebadores secuencias específicas del gen invA de Salmonella que es imprescindible para invasión en las células epiteliales. La aplicación del método de PCR anidada en combinación con 3,5 h de pre-enriquecimiento en agua de peptona es capaz de detectar hasta menos de 0,1 UFC/ml (