biotecnologia v14
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Manual de biot biotecn ecno ologí logía a Coordinadoras: Claudia Segal Kischinevzky y Beatriz Rodarte Murguía
Departamento de Biología Celular Facultad Facultad de Ciencias, UNAM
Autores en orden alfabético: alfabético:
Luisa Alba Lois, Roberto Coria Ortega, Édgar Dantán González, María Isabel de la Cruz Laina, Juan Luis Chávez Pacheco, María Eugenia Muñiz Díaz de León, Ángela Victoria Forero Forero, Angélica González Oliver, Alejandra Abigaíl González Valdez, Laura Kawasaki Watanabe, Suri Martínez Yee, Beatriz Rodarte Murguía, Bibiana Rodríguez Ponce, María Isabel Saad Villegas, Claudia Andrea Segal Kischinevzky, Alfonso José Vilchis Peluyera, Beatriz Zúñiga Ruiz.
Apoyado por PAPIME PAPIME PE202707 “Hacia una enseñanza actual de la Biotecnología” 2011
Manual de biotecnología 1a edición, 2011 Universidad Nacional Autónoma de México Facultad de Ciencias ISBN Impreso y hecho en México
Contenido
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Práctica 1.
Fermentación alcohólica por Saccharomyces cerevisiae Introducción Objetivo general Objetivos específcos Material y equipo Metodología Resultados Bibliograía
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Práctica 2.
Inteligencia tecnológica competitiva Introducción Objetivo general Objetivos específcos Material y equipo Metodología Resultados Bibliograía
17
Práctica 3.
Transormación de levadura y ensayo de doble híbrido Introducción Objetivo general Objetivos específcos Material y equipo Metodología Resultados Cuestionario Bibliograía Mapas de los plásmidos empleados en la práctica
21
Práctica 4.
Extracción de dna e identifcación del sexo en humanos: su importancia en las ciencias antropológicas y orenses Introducción Objetivo general Material y equipo Metodología Resultados Agradecimientos Bibliograía
27
Práctica 5. 6
Sesión de bioinormática Objetivos Metodología Discusión de resultados Bibliograía
33
Práctica 6.
Análisis de la actividad de catalasas Introducción Objetivo general Objetivo específco Material y equipo Metodología Resultados Agradecimientos Bibliograía
43
Práctica 7.
Síntesis de celulosa bacteriana para aplicaciones biotecnológicas, utilizando Gluconacetobacter xylinum Introducción Objetivo general Objetivos específcos Material y equipo Metodología Resultados Agradecimientos Bibliograía
47
Práctica 8.
Emulsifcación de diesel, gasolina y aceite de maíz por Pseudomonas aeruginosa y Serratia marcenses Introducción Objetivo Material y equipo Metodología Resultados Bibliograía
51
Práctica 9.
Metabolismo secundario Introducción Objetivos Material y equipo Metodología Resultados Discusión Bibliograía
55 7
Práctica 10.
Degradación de compuestos xenobióticos a través de actividades enzimáticas Introducción Objetivo general Objetivos específcos Primera parte. Monitoreo de la actividad de lacasas en hongos tolerantes al petróleo Material y equipo Resultados Segunda parte. Actividad enzimática Material y equipo Resultados Bibliograía Cultivo de tejidos vegetales. Introducción
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65
Práctica 11.
Fitorremediación con helechos Introducción Objetivo general Objetivos específcos Material y equipo Metodología Resultados Discusión Bibliograía
67
Práctica 12.
Inducción y desarrollo de embriones somáticos de zanahoria Introducción Objetivo general Objetivos específcos Material y equipo Metodología Parte I. Germinación de semillas in vitro Parte II. Inducción de callo embriogénico Parte III. Embriogénesis Resultados Análisis Bibliograía
73
8
Práctica 13.
Organogénesis somática de Nicotiana glauca Introducción Objetivo general Objetivos específcos Material y equipo Metodología Parte I. Germinación de semillas in vitro Parte II. Cultivo in vitro Parte III. Inducción de brotes Parte I. Rizogénesis Resultados Análisis Bibliograía
79
Práctica 14.
Identifcación de organismos genéticamente modifcados 85 Introducción Objetivo Material y equipo Metodología Módulo I. Extracción de dna Módulo II. Amplifcación de dna Módulo III. Electrooresis en geles de agarosa Resultados Bibliograía Anexo
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Práctica 1
Fermentación alcohólica por Saccharomyces cerevisiae Introducción El vino
El vino es un producto de la ermentación alcohólica que llevan a cabo las levaduras a partir del zumo de rutas y otros materiales ricos en azúcar. Los actores que determinan la calidad de un vino son el clima, el suelo, la variedad de uva empleada y el proceso de ermentación. Las levaduras implicadas en la ermentación del vino suelen ser de dos tipos: las llamadas levaduras silvestres, que se encuentran presentes en las uvas, y las levaduras de vino cultivadas, como Saccharomyces cerevisiae, que se añaden al mosto para iniciar la ermentación. Los azúcares que contiene el mosto de la uva se convierten en alcohol (etanol), con desprendimiento de CO2 como subproducto. El grado de etanol presente en el vino se encuentra entre 6 y 13° Gay Lussac (gl) y hasta 20 ° gl en licores. Además contiene sustancias orgánicas como los ácidos tartárico, málico, succínico, etc., en concentraciones de 4-7 g/L de vino, así como sustancias albuminoides, gomas, sales minerales y agua. Microora natural de la uva
Las uvas están compuestas por el hollejo (cáscara), semillas y pulpa. Sobre la superfcie de las uvas habitan levaduras y bacterias aerobias estrictas. Las levaduras que predominan en la superfcie de las uvas maduras son Saccharomyces cerevisiae y Hanseniaspora spp. En las uvas maduras se encuentran como microora bacterias lácticas como Leuconostoc oenus, Lactobacillus spp, Pediococus parvulus, entre otras. Otros microorganismos presentes son las bacterias acéticas, como Acetobacter aceti y Gluconobacter spp. Cinética de la fermentación alcohólica
Durante la ermentación alcohólica del mosto de la uva, las levaduras que participan en el proceso atraviesan tres ases: 1.
Multiplicación. En dos días las cuentas totales (medida directa de la división celular) y las viables alcanzan 10 7 células por mililitro.
2.
Fermentación. Las cuentas totales se incrementan todavía más y después permanecen constantes. Las cuentas viables alcanzan casi la misma concentración máxima de las totales, pero muestran una ase estacionaria muy corta debido principalmente a la alta de nutrientes, así como a que el etanol ejerce un eecto tóxico y a una alteración de la permeabilidad de la membrana celular.
9
3.
Fase de declinación. La concentración de las levaduras totales no varía mucho, pero las cuentas viables disminuyen rápidamente a 105 células/ml, ya que al morir las levaduras se presenta un enómeno de hidrólisis de la pared celular (autólisis) por su propia lisozima. Gracias a este proceso, el mosto es enriquecido con vitaminas, aminoácidos y lípidos que estimulan el desarrollo de las bacterias lácticas.
La cinética de consumo de los azúcares va a depender de la cepa de levadura utilizada, de la temperatura del proceso, de que no exista sustrato limitante y de la concentración de etanol que se genera. Bioquímica de la fermentación alcohólica
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La primera parte del metabolismo de los azúcares ocurre en presencia o en ausencia de oxígeno, siguiendo las rutas de Embden-Meyerho-Parnas (glucólisis) o la de Warburg-Dickens (pentosas-osato). Ambas vías uncionan simultáneamente, pero satisacen dierentes exigencias: la glucosa diosato se encarga de la síntesis de energía y la ructosa monoosato de la creación de precursores para la síntesis celular y del nadph necesario.
Objetivo general
Introducir al estudiante en el conocimiento de la biotecnología de las ermentaciones tradicionales.
Objetivos específcos • • • •
Familiarizar al estudiante con el manejo de algunas técnicas microbiológicas. Identifcar las rutas metabólicas principales asociadas al proceso de ermentación alcohólica. Determinar el grado alcohólico de las muestras y la concentración de azúcares reductores presentes al inicio y al fnal de la ermentación alcohólica. Reconocer en la elaboración del vino un proceso biotecnológico de gran impacto en la industria y en constante transormación
Material y equipo Parte I Material
Equipo
* 2 kg de uvas (verdes o rojas) * 1 garraón de plástico c/tapa de 5 litros * 1 botella de vidrio c/tapa de 500 ml * 1 botella de vidrio c/tapa de 1,000 ml 1 asa de siembra metálica 1 mechero * 6 gasas grandes
Licuadora Autoclave Incubadora con agitación Rerigerador Campana de ujo laminar 1 mechero
* 100 gr de algodón, hilo y tijeras * 1 L cloro comercial *Material que deberán traer los alumnos
Parte II Material
Equipo
Botella con el inóculo Botella con el macerado de uvas * 1 rasco Gerber
Rerigerador
*Material que deberán traer los alumnos
Parte III Material
Equipo
2 botellas para centríuga de 500 ml
Centríuga de banco
1 alcoholímetro
Balanza de 2 platos
1 matraz Erlenmeyer de 1,000 ml
Rerigerador
1 jarra para jugo 1 baño de hielo 1 vaso de precipitados de 500 ml 1 colador de cocina * 1 rasco Gerber * 1 metro de manta de cielo * Garraón con el ermentado de uvas *Material que deberán traer los alumnos
Parte IV Material
Equipo
10 tubos de ensayo de 5 ml 1 gradilla 1 micropipeta de 1,000 µl Puntas para micropipeta 1 vaso de precipitados de 50 ml 1 vaso de precipitados de 100 ml 2 celdas para espectrootómetro 1 piceta 1 cronómetro
órtex Espectrootómetro Baño maría Potenciómetro
Reactivos
Muestra inicial (tomada en la parte II) ino centriugado Glucosa DNS
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Metodología Parte I. Maceración e inóculo del medio de cultivo (preparación del mosto) 1. Lavar y moler 2 kg de uvas en la licuadora hasta obtener una pasta. 2. Colocar 250 ml de las uvas maceradas en una botella de 500 ml (inóculo). 3. Colocar el resto de la pasta en una botella de 1,000 ml, procurando no exceder ¾ del nivel de la botella, reservar los matraces obtenidos. 4. Esterilizar ambas botellas en autoclave —de 115 a 120 oC— por 10 minutos. 5. Dejar enriar a temperatura ambiente. 6. En el matraz de inóculo, aplicar tres veces con un asa de siembra Saccharomyces cerevisiae en condiciones de esterilidad. 7. Incubar a 37 oC por tres días u ocho días a temperatura ambiente. 8. Almacenar la botella de 1,000 ml a 4 °C hasta su utilización. 9. Esterilizar el garraón, lavándolo con abundante agua y cloro concentrado, dejarlo secar y almacenarlo hasta su utilización. 12 1 a c i t c á r p | a í g o l o n c e t o i b e d l a u n a M
Parte II. Inoculación e incubación 1. Se depositan en el garraón de plástico los 250 ml de inóculo cultivado y la pasta de uva restante (botella de 1,000 ml), agitando manualmente hasta su homogeneización. Tomar una muestra de 5 ml que se utilizará en la parte I como muestra inicial (mantener a 4 °C, en el rasco Gerber hasta su utilización). 2. Incubar a 29 °C (los estudiantes se llevan el garraón a casa, manteniéndolo en un sitio resco en el que que no reciba luz directa) para no desviar la ermentación de los azúcares hacia la producción de ácido acético. 3. Agitar dos o tres veces al día (oxigenación) y liberar el CO2 ormado girando levemente la tapa del recipiente para permitir la salida del gas. Se estima que la primera y segunda parte pueden llevarse a cabo al principio del semestre, mientras las partes III y IV se hacen al fnal para permitir una buena ermentación.
Parte III. Obtención del producto por centrifugación 1. Filtrar el producto en una jarra, —con manta de cielo y colador —, hasta separar los componentes de la uva del líquido. 2. Mantener en río (—baño de hielo—) el producto hasta el momento de la centriugación. 3. Colocar el producto en botellas para centríuga y balancearlas. Centriugar a 8 Krpm durante una hora. 4. erter el sobrenadante en un matraz de 1,000 ml, limpio y previamente desinectado con cloro concentrado. 5. Eliminar las células del microorganismo que se depositaron en el ondo de la botella (pastilla). 6. olver a centriugar todo el sobrenadante una vez más. Tomar una muestra de 5 mL que se utilizará en la parte I como muestra fnal (mantener a 4 °C en un rasco Gerber). 7. Determinar la concentración de alcohol en grados gl con ayuda de un alcoholímetro. a. Calibrar el alcoholímetro sumergiéndolo suavemente en agua; esta medida se toma como 0 °gl. b. Sumergir suavemente el alcoholímetro en el vino, tomar la medida que indique la escala.
Parte IV. Determinación de la concentración de azúcares reductores. 1. Determinar el pH de las muestras inicial y fnal (por duplicado). 2. Preparar, para todo el grupo, 30 ml de una solución de dns al 0.5% y 30 ml de solución de glucosa estándar (1.5 mg/ml). 3. Marcar los tubos de ensaye y agregarles las soluciones como se muestra en la siguiente tabla: Tubo
Sol. de glucosa (ml)
Agua (ml)
Muestra inicial (ml)
Muestra nal (ml)
DNS (ml)
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 -
1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 -
0.5 0.5 -
0.5 0.5
0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
Tubo
Concentración de glucosa (mg/ml)
1 2 3 4 5 6
0.0 0.3 0.6 0.9 1.2 1.5
Tabla de concentraciones de glucosa para la curva estándar.
4. 5. 6. 7. 8.
Agitar todos los tubos en vórtex -de 30 a 60 segundos aproximadamente. Incubar los tubos tapados durante cinco minutos a baño María. Sacar los tubos del baño y agregar 5 ml de agua destilada. Agitar nuevamente en órtex. Leer la absorbancia en el espectrootómetro a 540 nm.
Resultados 1.
pH de las muestras inicial y fnal: Muestra
TI1 TI2 TF1 TF2
pH
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2.
Construcción de una curva patrón de glucosa: Tubo
Absorbancia (nm)
Concentración de glucosa
1 2 3 4 5 6
0.0 0.3 0.6 0.9 1.2 1.5
Curva patró d glucsa
14 1 a c i t c á r p | a í g o l o n c e t o i b e d l a u n a M
) m n ( a i c n a b r o s b A
Cctració d glucsa (mg/ml)
3.
Linealizar la curva anterior por regresión lineal y obtener la pendiente (m) y la ordenada al origen (b), de acuerdo a la ecuación de la recta:
y = mx + b Donde: x es la concentración de glucosa y es la absorbancia 4.
Obtener las lecturas de la absorbancia de las muestras (por duplicado). Muestra
Absorbancia (nm)
TI1 TI2 TF1 TF2
5.
Sustituir en la ecuación de la recta resultante de la regresión lineal, los datos de absorbancia de las muestras.
x
y b =
m
Donde: x es la concentración de glucosa y la absorbancia m pendiente (obtenida en el paso 3) b ordenada al origen (obtenida en el paso 3) Tiempo
Absorbancia (nm)
Concentración de glucosa (mg/ml)
TI1 TI2 TF1 TF2
6.
Registrar la concentración de alcohol en el producto (resultado de la determinación con el alcoholímetro).
Bibliografía
Madigan, M.T. J.M. Martinko, y J. Parker (2003) Brock. Biología de los microorganismos. 10a ed. Prentice Hall, Madrid. Reyes, D.A. H.L. Escalilla, y C.J.R. erde, (1992) Elaboración de los vinos de mesa, vol. I, uam Iztapalapa, México.
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Práctica 2
Inteligencia tecnológica competitiva Introducción El primer paso en cualquier proyecto de investigación, básica o aplicada es buscar inormación publicada acerca del tema. Contar con inormación sufciente del área tecnológica en la que se pretende incursionar, que incluya tanto uentes bibliográfcas como patentes publicadas y datos económicos y comerciales, resulta indispensable para desarrollar proyectos exitosos, técnicamente actibles y con un alto impacto social y económico. Esto es importante para los grupos de investigación de universidades e institutos, públicos y privados, pero resulta de especial relevancia para las empresas. Las nuevas disposiciones legales en materia de propiedad intelectual en México y en el entorno mundial que cada vez resulta más competitivo, obligan a las empresas mexicanas a observar atentamente el entorno tecnológico en el cual se insertan. La inormación tecnológica es actualmente condición indispensable del éxito en cualquier proceso relacionado con los sistemas productivos: investigación, planifcación industrial, desarrollo, abricación, comercialización y gestión. Se sabe que, incluso, existe una uerte correlación entre el nivel de desarrollo tecnológico de los países y la capacidad de sus estructuras productivas para acceder a la inormación y utilizarla libremente. La inteligencia tecnológica competitiva establece una excelente base para administrar y desarrollar proyectos tecnológicos, porque permite identifcar oportunidades y ventajas competitivas, elegir las tecnologías adecuadas y responder de orma oportuna y acertada a los cambios del entorno. Para acceder a inormación estratégica de un área tecnológica es indispensable utilizar uentes de inormación electrónica, porque cada año aparecen publicados cientos de miles de artículos científcos en miles de revistas especializadas. La mayor parte de los artículos publicados son del área médica, en segundo lugar están las publicaciones químicas, en tercero las de biología, en cuarto las del área ísica y después los artículos relacionados con las ciencias sociales. Para tener una idea certera de lo que ocurre en el mundo alrededor de un objetivo particular, es importante hacer una búsqueda sistemática y rigurosa que considere tanto la inormación científca, como las patentes y la inormación comercial del sector tecnológico de interés. En los últimos años el proceso de diseño de las nuevas tecnologías ha visto incrementada su complejidad y su difcultad. Se hace así más necesario en cada momento disponer de un buen sistema de seguimiento de las tendencias del progreso tecnológico, tanto en la investigación aplicada como en el resto de las actividades del proceso de innovación. La inormación de patentes puede ser una herramienta muy efcaz, no sólo para el seguimiento, sino para la
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previsión y la planifcación del proceso de desarrollo tecnológico, así como en la realización de investigaciones económicas, científcas y tecnológicas con dierentes propósitos. El monitoreo y el análisis sistemático de la inormación permite construir el mapa completo del área tecnológica de interés. Se identifca cuál es la oerta tecnológica global y dentro de ella, cuáles son las tecnologías emergentes, las maduras y las que están por entrar al mercado; a quién pertenecen esas tecnologías, cuál es su tendencia de desarrollo y el posible impacto a nivel nacional e internacional de cada una de ellas. Con esta inormación es posible determinar cuáles son las tecnologías estratégicas para el grupo con el fn de diseñar programas de investigación y desarrollo, así como localizar socios potenciales para establecer alianzas tecnológicas en el nivel nacional e internacional; o bien, se puede identifcar posibles licenciatarios de tecnología o tecnologías de libre acceso.
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Objetivo general Hacer una búsqueda sistemática de artículos científcos y de patentes, en torno a un tema de investigación biotecnológico, en bases de datos especializadas
Objetivos específcos • • • • •
Detectar a los mejores proveedores de bases de datos relacionados con el tema. Identifcar las bases de datos más adecuadas para la búsqueda. Encontrar las palabras clave idóneas. Aprender a recuperar las listas bibliográfcas y los artículos específcos. Aprender a recuperar patentes de las bases públicas de Internet.
Material y equipo Equipo
Material (individual)
Computadora con acceso a Internet conectada a la * Unidad de memoria USB red unam * Un tema de investigación biotecnológico lo sufcientemente preciso *Material que deberán traer los alumnos
Metodología La práctica se llevará a cabo en un aula de cómputo en dos sesiones de tres horas. En la primera sesión se realizará una búsqueda de uentes bibliográfcas, en la segunda, se eectuará una búsqueda de patentes. Los alumnos podrán hacer búsquedas individuales o ormar equipos de dos integrantes. La inormación obtenida será utilizada para determinar el estado del arte de un tema biotecnológico particular elegido libremente o sugerido por los proesores.
Primera sesión: búsqueda de fuentes bibliográcas 1. La búsqueda bibliográfca se realiza en la página de la Dirección General de Bibliotecas de la UNAM: 2. En donde dice colecciones, selecciona: Bases de datos. 3. Aparece un buscador que localiza las bases de datos disponibles por tema. La búsqueda en esta sección se hace en español. Dependiendo del tema particular, pueden utilizarse palabras clave como: biología, biotecnología o medicina. 4. Aparece una lista de bases de datos, con los temas particulares que cada base inclu ye y las empresas proveedoras del servicio. 5. Se selecciona un proveedor. 6. Se seleccionan bases de datos individuales que pueden resultar útiles para la búsqueda 7. Se hace una búsqueda en la base seleccionada utilizando palabras clave en inglés. Se anota el número de publicaciones encontradas en la base de datos. 8. Se localizan otras bases de datos útiles, se realiza la búsqueda con las mismas palabras clave y se comparan resultados. 9. Se realiza una búsqueda simultánea en las bases de datos que tienen el mayor número de citas, utilizando palabras clave en inglés. 10. La búsqueda se acota si es necesario (a los últimos años, buscando las palabras clave sólo en el título o localizando sólo revisiones) hasta obtener un número manejable de citas (entre 150 y 200). 11. Las citas se revisan y se seleccionan las que resultan pertinentes. 12. Las citas seleccionadas se guardan en la unidad usb. 13. Se pide al buscador que cree la lista de la bibliograía consultada y se guarda en la unidad Usb. 14. Se regresa a la página de las citas seleccionadas y se obtienen los artículos completos que se encuentran disponibles en ormato pdf. 15. Los artículos completos se guardan en la unidad Usb. Segunda sesión: búsqueda de patentes 1. Ingresar a la ofcina de patentes europea: (http://ep.espacenet.com/quickSearch?locale=en_EP) 2. Se realiza una búsqueda con palabras clave (en inglés) localizadas en título y abstract. 3. Se seleccionan de la lista las patentes de Internet. 4. Los datos generales de la patente se copian y se pegan en un archivo de Microsot Word.
Resultados El alumno debe entregar: 1. La historia de la búsqueda. a. Una lista de las bases de datos consultadas. b. Las palabras clave utilizadas y el número de reerencias obtenidas. c. La estrategia para acotar la inormación. 2. 3. 4. 5.
Una lista de las bases de datos más adecuadas para la búsqueda. Un archivo electrónico con la lista de reerencias bibliográfcas y los artículos recuperados. Un documento impreso con la bibliograía de los artículos encontrados. Un archivo electrónico con la inormación bibliográfca de las patentes recuperadas.
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Bibliografía
Cruz, E, P. Escorsa, R. Maspons, G. Izquierdo e I. Ortiz (2003), La detección de las tecnologías emergentes: El caso de los biomateriales, Seminario ALTEC 2003 Código ES.03.145. Zhu, D. y A. Porter. (2002) “Automated extraction and visualization o inormation or technological intelligence and orecasting”, Technological orecasting & social change 69: 495–506. Las patentes como uente de inormación tecnológica , Ofcina Española de Patentes y Marcas,
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Práctica 3
Transormación de levadura y ensayo de doble híbrido Introducción El sistema de doble híbrido en levadura se desarrolló con la idea de identifcar genes que codifcan para proteínas que se asocian ísicamente con una proteína dada in vivo. En contraste con los métodos bioquímicos que detectan interacciones proteína-proteína, el sistema de doble híbrido se basa en un ensayo genético en donde la interacción entre dos proteínas se mide por la reconstitución de un activador transcripcional uncional en la levadura. Aun desconociendo específcamente dónde y cómo actúa una proteína particular, es posible encontrar las proteínas con las que interactúa y potencialmente utilizar esta inormación para conocer más sobre la posible unción de dicha proteína. En este sistema se construye una usión con el dominio de unión a dna proporcionado por el represor LexA de Escherichia coli y se expresa en un plásmido que contiene el marcador selectivo His3 (plásmido “carnada”). Por otra parte, se construye una usión con el dominio de activación de la transcripción B42 (“acid blob”) que se expresa en un plásmido que contiene el marcador Trp1. Cuando las proteínas usionadas interactúan, se reconstituye el actor transcripcional y se activa la transcripción ya sea del reportero LexAoperador-lacZ (localizado en un tercer plásmido) o bien, de LexAoperador-Leu2 (localizado río arriba del gen cromosómico Leu2 en la cepa EGY48). La mayoría de las proteínas pueden utilizarse de manera exitosa en el sistema del doble híbrido; sin embargo, antes de intentar buscar posibles proteínas que interactúen con la proteína de interés (“carnada”), es recomendable establecer si ésta es adecuada para el proceso. El sistema del doble híbrido tiene restricciones que impiden que algunas proteínas uncionen adecuadamente, por ejemplo, aquellas que tienen dominios transmembranales podrían tener difcultades al momento de la translocación al núcleo, o bien, puede ser que no se genere el plegamiento adecuado de la proteína.
Objetivo general El alumno aprenderá a utilizar el sistema de doble híbrido en la levadura Saccharomyces cerevisiae como una herramienta para el análisis de posibles interacciones entre proteínas.
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Objetivos específcos • •
El alumno aprenderá a transormar a la levadura S. cerevisiae. El alumno podrá discriminar si dos proteínas interactúan o no mediante el ensayo genético del doble híbrido.
Material y equipo
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Material
Equipo
1 mechero Puntas estériles blancas, azules y amarillas 3 tubos eppendor estériles de 1.5 ml Agua destilada, estéril * 1 masking tape * 1 encendedor * 1 marcador indeleble * 1 asa de vidrio o 3 pipetas pasteur de tallo largo * Cajas petri estériles * Palillos de dientes estériles Hielo Tubos para centríuga, estériles
órtex Incubadora a 30°C Incubadora a 42°C Microcentríuga Micropipetas de 1,000 ml, 200 ml y 20 ml Espectrootómetro Centríuga Termomixer
Reactivos elaborados previamente por el profesor
Medio YPD Medio SD + Leu Medio SGal + Leu + XGal Medio SGal + rafnosa Solución PEG/acetato de litio/TE DMSO * Material que deberán traer los alumnos.
Material biológico:
150 ml de células competentes de Saccharomyces cerevisiae EGY48 150 ml de DNA de esperma de salmón (10 mg/ml) Plásmidos:
• • • •
1 mg de pEG202+Gpa1 500 ng de pJG4-5+Ste4 500ng de pJG4-5+endoquitinasa 1 mg de pSH18-34
Cepas, plásmidos, soluciones y medios. 1. Saccharomyces cerevisiae EGY48 (Mat α ,trp1, his3, ura3,6, LexAop-Leu2)
2.
Los tres plásmidos empleados son multicopia, contienen orígenes de replicación de E. coli (pBR ori) y de levadura (2 m) y tienen el marcador selectivo AmpR para bacterias.
a.
El plásmido pEG202 contiene el promotor de la alcohol deshidrogenasa ( Adh1) y se utiliza para la expresión de las proteínas usionadas a LexA. El sitio múltiple de clonación se localiza río arriba del terminador Adh1 y el marcador selectivo para levadura es His3 (fgura A). b. El plásmido pJG4-5 contiene el promotor inducible Gal1 y los sitios únicos EcoRI y XhoI para obtener una usión con la secuencia de localización nuclear de S40 (NLS), el dominio B42 (activador de la transcripción) y la etiqueta de hemaglutinina (HA). El marcador selectivo es Trp1 (fgura B). c. El plásmido pSH18-34 contiene un sitio de unión a LexA seguido del gen reportero lacZ de E. coli. Ura3 es el marcador selectivo para levadura.
Metodología Parte I. Protocolo para transformar levadura 1. Inocular 5 ml de YPD con la cepa EGY48 de Saccharomyces cerevisiae y dejarlo creciendo toda la noche a 30°C y 250 rpm (proesor). 2. Al día siguiente, inocular 30 ml de YPD nuevo con aproximadamente 1 ml del cultivo de la noche anterior. Medir la densidad óptica (do) inicial a 600 nm. Incubar a la misma temperatura y rpm. 3. Medir la do y sacar el cultivo cuando llegue a una do (600 nm) de 0.5-0.6 (aproximadamente 1 x 10 7 células/ml). 4. Centriugar 5 min a 2 500 rpm, eliminar el sobrenadante y agregar un volumen igual de agua destilada estéril. Resuspender en el vórtex. 5. olver a centriugar igual que en 4. Eliminar el sobrenadante y resuspender el botón en 1 ml de agua. Resuspender en el vórtex y pasar las células a un tubo de 1.5 ml estéril. 6. Centriugar en la microuga 5 seg a máxima velocidad. 7. Eliminar el sobrenadante y resuspender el botón en 1 ml de TE/acetato de litio 1X (preparado resco a partir de TE 10X y acetato de litio 10X) 8. Centriugar igual que en el paso 6, eliminar el sobrenadante y resuspender las células en 300 ml de TE/acetato de litio. 9. En un tubo eppendor limpio, colocar 50 ml de células y agregar 50 mg de dna de esperma de salmón sonicado y hervido. Repetir el proceso con otros dos tubos. Marcar los tubos con números (1, 2 y 3). 10. Preparar los tubos de la siguiente manera: Tubo 1: agregar 500 ng del plásmido pEG202+Gpa1, 500 ng de pJG4-5+Ste4 y 500 ng
de pSH18-34. Tubo 2: agregar 500 ng de pEG202+Gpa1, 500 ng de pJG4-5 + endoquitinasa y 500 ng de pSH18. Tubo 3: no agregar plásmidos. 11. Agregar 300 ml de PEG40%/Litio/TE (preparado resco con 1 vol de TE 10X, 1 vol de acetato de litio 10X y 8 vol de PEG4000 al 50%). 12. Mezclar en el vórtex e incubar 30 min a 30°C 13. Agregar 40 ml de DMSO, mezclar en el vórtex 14. Dar un choque de calor a 42°C por 15 min. Meter en hielo. 15. Centriugar durante 5 segundos, eliminar el sobrenadante y resuspender el botón en 100 ml de agua con ayuda del vórtex.
23 3 a c i t c á r p | o d i r b í h e l b o d e d o y a s n e y a r u d a v e l e d n ó i c a m r o f s n a r T
16. Plaquear las células de cada tubo en medio SD+leucina e incubar a 30°C por dos días. Transcurrido este tiempo, debe observarse el crecimiento de las colonias.
Parte II. Ensayo de doble híbrido 1. Una vez que hayan crecido las colonias de levaduras transormadas, sembrar 5 o 6 colonias de las cajas 1 y 2 en medio SGal + leucina pH 7.0, en el cual previamente se plaquearon 50 ml de X-Gal. Para sembrar las transormantes se emplean palillos planos estériles, tomando una sola colonia cada vez. 2. Incubar la caja a 30°C por 2 días.
Resultados 1. 24 3 a c i t c á r p | a í g o l o n c e t o i b e d l a u n a M
2.
Transormación de levadura: anotar y explicar por qué hubo crecimiento o no en cada una de las tres cajas. Doble híbrido: anotar si las transormantes obtenidas generaron un color azul o no en el medio SGal + X-Gal + leucina. ¿Cómo interpretas los resultados obtenidos?
Plásmidos utilizados
Crecimiento en medio SD + Leu
Coloración en medio SGal + Leu (pH7) + XGal
pEG202 + GpaI pJG4-5 + Ste4 pSH18-34 pEG202 + GpaI pJG4-5 + endoquitinasa pSH18-34 Sin plásmidos
Cuestionario 1. 2. 3. 4. 5.
¿Por qué crees que es importante sembrar las transormantes en un medio que sólo contiene leucina? ¿Cuáles son las dierencias entre un medio selectivo y un medio completo? ¿Qué crees que hubiera pasado si hubieras sembrado tus transormantes en un medio completo? ¿En qué consiste el ensayo de doble híbrido y para qué sirve? Menciona un ejemplo. ¿Cuál es la unción del gen reportero lacZ ? ¿Para qué sirve el compuesto X-Gal? ¿Qué pasaría si olvidaras adicionar este compuesto a tus cajas de SGal + Leu?
Bibliografía
Adams, A., D.E. Gottschling, C.A. Kaiser y T. Stearns, (1997), Methods in yeast genetics, Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual. Fields, S. y O. Song (1989), “A novel genetic system to detect protein-protein interactions”, Nature 340: 245-246. Fields, S. y R. Sternglanz (1994), “The two-hybrid system: an assay or protein-protein interactions”, Trends in Genetics 10: 286-292. Guthrie, C. y G.R. Fink (1991), “Guide to yeast genetics and molecular biology”, Methods in Enzymology, vol. 194. Sambrook, J., E.F. Fritsch y T. Maniatis (1989), Molecular cloning. A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press.
Mapas de los plásmidos empleados en la práctica Figura A. pEG202: plásmido para la usión a LexA.
25 3 a c i t c á r p | o d i r b í h e l b o d e d o y a s n e y a r u d a v e l e d n ó i c a m r o f s n a r T
Figura B. pJG4-5: plásmido para la usión al dominio de activación de la transcripción.
26 3 a c i t c á r p | a í g o l o n c e t o i b e d l a u n a M
Fusion cassette B42 domain
NLS
HA Tag
EcoRI
XhoI
ATG GGT GCT CCT CCA AAA AAG AAG … CCC GAA TTC GGC CGA CTC GAG AAG CTT … M
G
A
P
P
K
K
K
…
P
E
F
G
R
L
E
K
L
…
Figura C. Plásmido pSH18-34: plásmido con el gen reportero lacZ.
Práctica 4
Extracción de dna e identifcación del sexo en humanos: su importancia en las ciencias antropológicas y orenses Introducción En el campo de las ciencias sociales, la antropología estudia el origen del hombre. Esta disciplina integra los descubrimientos de otras ciencias, como la sociología, la economía, la historia, la psicología y la biología. La antropología ha sido subdividida en áreas especializadas entre las que está la antropología ísica o biológica, que estudia la evolución y biología de las poblaciones humanas. Tradicionalmente, antes del nacimiento de un bebé se tiene la expectativa de cuál será su sexo. La identifcación del género es importante en muchos aspectos biológicos y sociales en la vida de una persona. Por otra parte, uno de los primeros registros que se realiza en excavaciones arqueológicas es la identifcación del sexo en restos humanos; este dato es undamental para reconstruir el contexto arqueológico con la fnalidad de entender a) aspectos culturales en las poblaciones antiguas, por ejemplo, la participación del hombre y la mujer en las sociedades prehistóricas, la interpretación de arteactos y arte prehistóricos, la selección de víctimas en casos de inanticidio, etc., y b) la historia evolutiva humana relacionada con demograía, relaciones de parentesco entre individuos recuperados del mismo entierro, etcétera. Distintos métodos morológicos permiten identifcar el sexo en restos de esqueletos humanos de adultos. Para este análisis la pelvis es considerada el hueso ideal, ya que permite identifcar el sexo con un índice de certeza de aproximadamente 95%. Sin embargo, la identifcación mediante análisis morométrico resulta incierta o imprecisa en restos óseos de niños y preadolescentes debido a la ausencia de dimorfsmo sexual, o en restos incompletos de adolescentes y adultos. En estos casos el método molecular, basado en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), es la herramienta idónea para la identifcación del sexo en los restos óseos incompletos. Esta identifcación por análisis molecular también es utilizada con recuencia en antropología orense. La amelogenina es una proteína del esmalte dental. En los humanos hay dos genes que la codifcan, éstos se localizan en los cromosomas Y y X y ueron secuenciados en su totalidad en 1991. Existen varias técnicas de PCR que se basan en la amplifcación de la amelogenina para identifcar el sexo, las cuales uncionan adecuadamente en muestras orenses, individuos modernos y restos arqueológicos. Así, recientemente el grupo de investigación en antropología molecular del laboratorio de bioquímica de la Facultad de Ciencias de la unam, propuso un método que se basa en la amplifcación del intrón 1 del gen de la amelogenina para identifcar el sexo en restos óseos humanos. El método utiliza dos primers específcos para las secuencias de los alelos de la amelogenina en los cromosomas Y y X y un primer común a ambos alelos; el tamaño de los productos de amplifcación es dierente en los dos alelos. El sexo masculino se identifca por la presencia del producto que proviene del cromosoma Y , mientras que el emenino se identifca por su ausencia. Las reacciones de amplifcación por PCR ueron optimizadas
27
y establecidas con dna humano moderno, por lo que este método unciona adecuadamente para analizar dna contemporáneo y antiguo. Los productos de PCR son detectados directamente en electrooresis en gel de agarosa y/o poliacrilamida.
Objetivo general Identifcar el sexo en los alumnos que cursan la materia de biotecnología con la fnalidad de que aprendan tres metodologías básicas en el área de la biología molecular.
Objetivos específcos 28 4 a c i t c á r p | a í g o l o n c e t o i b e d l a u n a M
1. 2.
3.
Con el método de extracción de dna el alumno conocerá las características requeridas para obtener y manipular la muestra biológica de mucosa bucal y adquirirá la capacidad para extraer dna de ésta. Con el método de PCR el alumno amplifcará las regiones específcas del gen de la amelogenina de los cromosomas X y Y para identifcar el sexo en humanos, lo cual le permitirá entrenarse en una técnica ampliamente utilizada en la antropología molecular y la biología. Con la técnica de electrooresis en gel de agarosa el alumno aprenderá a visualizar el extracto de dna y los productos de amplifcación de PCR. También aprenderá a cuantifcar dna por comparación con un marcador de tamaño molecular. La electrooresis en gel es una herramienta que se realiza de manera rutinaria en la investigación científca.
Material y equipo Material
Equipo
Tubos de 1.5 ml y de PCR de 0.2 ml Hisopos estériles
Baño a 56°C órtex Baño a ebullición Microuga Cámara de electrooresis
Micropipetas de 0.2–1ml y de 0.05 - 0.1 ml
Soluciones
1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12.
PBS 20X 200ml de cloro al 30% Solución de lisis Primers (200 ng c/u) dNTPs (200 mM) Buer c/MgCl2 (1X) Agua inyectable Taq DNA polimerasa (1U) GelRed Agarosa TAE 50X Marcador de peso molecular para DNA
Metodología La práctica se lleva a cabo en tres módulos: I) Extracción de dna de las muestras II) Amplifcación del dna III) Electrooresis en geles de agarosa
MÓDULO I. Extracción de dna Obtención de células
1. 2. 3.
Hacer un raspado de mucosa bucal con un hisopo de algodón estéril, raspar 30 veces la parte interna de cada mejilla para obtener las células. Colocar el hisopo en un tubo de 1.5 ml, añadir 1 ml de buer PBS, enjuagar el hisopo en el ondo y contra las paredes del tubo. Colocar el hisopo en una solución de cloro (blanqueador para ropa) al 30% para descartarlo.
Extracción de dna
• Transerir las células/PBS a tubos de 1.5 ml y centriugar a 14 000 rpm durante 1 min. • Descartar el sobrenadante y resuspender en 150 µL de solución de lisis. Resuspender con cuidado utilizando la micropipeta. • Incubar a 56°C x 15 minutos. • Enriar a temperatura ambiente por 30 segundos. • Agitar durante 15 segundos. • Calentar en baño a ebullición por 10 minutos. • Enriar a temperatura ambiente por 2 minutos. • Agitar vigorosamente por 2 minutos. • Centriugar a 14 000 rpm durante 2 minutos • Obtener el sobrenadante y transerirlo a un tubo limpio de 1.5 ml. • Guardar en hielo o a –20 0C. isualizar y cuantifcar de manera aproximada en un gel de agarosa 1%/TAE
MÓDULO II. Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) 1. 2.
Marcar tubos de pared delgada de 0.2 o 0.5 ml de acuerdo con el termociclador que se utilizará. Poner en cada tubo:
Reactivo
Agua Amortiguador 10X MgCl2 25 mM dNTP´s 1.25 mM BSA 2.5 µg/l Primer COM 5 µM Primer XSP 5 µM 5 µM Primer YSP
Mezcla de reacción
Concentración nal
cbp 2.5 µl 2.5 µl 2.0 µl 0.5 µl 1.0 µl 0.5 µl 0.5 µl
ajustar a 25 µl 1X 2.5 mM 0.1 mM 1.25 µg/µl 0.2 µM 0.1 µM 0.1 µM
29 4 a c i t c á r p | s e s n e r o f y s a c i g ó l o p o r t n a s a i c n e i c s a l n e a i c n a t r o p m i u s : s o n a m u h n e o x e s l e d n ó i c a c i t n e d i e n d a e d n ó i c c a r t x E
10 - 20ng Taq dna polimerasa
1 - 3 µl
dna
3. 4.
1U
Agregar una gota de aceite mineral en caso de que el tipo de termociclador lo requiera. Colocar los tubos en el termociclador y programar:
Desnaturalización inicial: 94°C por 5 minutos 40 ciclos
{
94°C por 30 segundos 57 °C por 30 segundos 72 °C por 1 minuto
Extensión fnal: 72 °C por 7 minutos Guardar a 4 °C 30 4 a c i t c á r p | a í g o l o n c e t o i b e d l a u n a M
MÓDULO III. Electroforesis en gel de agarosa Preparación del gel de agarosa 1. a) Para dnA genómico (agarosa al 1%):
Pesar 0.3 gr de agarosa y agregar 30 ml de buer TAE 1X. 1.
b) Para productos de PCR (agarosa al 2.5%):
Pesar 0.75 gr de agarosa y agregar 30 ml de buer TAE 1X. 2. Calentar la agarosa en un horno de microondas por aproximadamente 1 minuto hasta que se disuelva completamente. Evitar que hierva, para lo cual se detendrá el horno cada vez que sea necesario. 3. Enriar la agarosa aproximadamente a 50 °C. 4. En una superfcie plana nivelada colocar la base acrílica que soportará el gel y colocar el peine para hacer los pozos 5. aciar la solución de agarosa evitando la ormación de burbujas. 6. Dejar el gel solidifcando a temperatura ambiente por aproximadamente 30 minutos. El gel polimerizado tiene una apariencia opaca. Preparación de la cámara de electrooresis y las muestras (extracto de PCR)
1. 2. 3.
dnA
y los productos de
Colocar el gel dentro de la cámara de electrooresis. Añadir TAE 1X hasta cubrir completamente el gel. Preparar las muestras de la siguiente orma: a) Tomar 5 µl de la muestra y depositarla en un cuadrito de Paraflm, agregar 1µl de GelRed para monitorear la movilidad electroorética y para visualizar en U. Siempre se debe usar una punta de micropipeta nueva para cada tubo, de esta manera se evita la contaminación. b) Colocar cuidadosamente ~6 µl de muestra en cada pozo utilizando la micropipeta de 10 µl. Poner todas las muestras deseadas de igual manera. Incluir en el gel una muestra del marcador de tamaño molecular. c) Conectar la cámara de electrooresis, el cable y la uente de poder. Unir los electrodos positivos (rojos) y por separado los negativos (negros) entre la cámara, el cable y la uente de poder.
d) e) )
Encender la uente de poder y seleccionar el voltaje en 100 voltios. Cuando el equipo unciona correctamente se producen burbujas que son visibles. Las muestras de DNA deben dirigirse hacia el electrodo positivo. Desplazar las muestras tres cuartos del tamaño del gel. Apagar la cámara de electrooresis para detener el desplazamiento de las muestras.
Resultados Visualización del dna
• •
El extracto de dna y los productos de PCR en el gel de agarosa se observarán con una lámpara de luz U o sobre un transiluminador. El tamaño de los ragmentos amplifcados es de 192 pb en el cromosoma X y de 158 pb para el cromosoma Y. Tomar un registro otográfco del gel con una cámara digital.
Agradecimientos Se agradece al Dr. Alonso Torre-Blanco del Laboratorio de Bioquímica de la Facultad de Ciencias por su participación. Este método ue diseñado como parte de un proyecto apoyado por papiit, unam y por el CONACyT.
Bibliografía
De la Cruz, I., A. González-Oliver, B.M. Kemp, J.A. Román, D.G. Smith, y A. Torre-Blanco (2008), “Sex identifcation o children sacrifced to the ancient Aztec rain gods in Tlatelolco”, Current Anthropology 49: 519-526. Brown, K.A. (2001), “Identiying the sex o human remains by ancient DNA analysis”, Ancient Biomolecules 3:215-225. Jurmain, R., L. Kilgore, W. Trevathan y H. Nelson (2003), Introduction to physical anthropology, 9 ed., Thomson, Wadsworth, Canada, 522 p.
31 4 a c i t c á r p | s e s n e r o f y s a c i g ó l o p o r t n a s a i c n e i c s a l n e a i c n a t r o p m i u s : s o n a m u h n e o x e s l e d n ó i c a c i t n e d i e n d a e d n ó i c c a r t x E
Práctica 5
Sesión de Bioinormática Bases de datos y herramientas bioinormáticas ¿Qué es la bioinormática? La bioinormática es el campo científco que integra a la biología, las ciencias computacionales y la tecnología de la inormación en una disciplina única. Al inicio de la “revolución genómica” la bioinormática se entendió como la creación y mantenimiento de bases de datos en las cuales se guardara inormación biológica tales como secuencias de nucleótidos (genes, secuencias reguladoras, etc.) y de aminoácidos (proteínas). Conorme estas bases de datos ueron creciendo, ue necesario desarrollar nuevas interases entre los remitentes de secuencias y los usuarios de tales bases. De esta manera, las bases de datos iniciales –Pir (Protein Inormation Resource) y GenBank– ueron ampliando sus recursos inormáticos para incluir programas de búsqueda y comparación de secuencias de nucleótidos y aminoácidos, traducción de secuencias de nucleótidos a aminoácidos o búsqueda de señales estructurales o uncionales en las secuencias. Así, para el resguardo y análisis de las bases de datos de dna, a principios de 1980 se crea el Centro Nacional de Inormación Biotecnológica (Ncbi, por sus siglas en inglés), dependiente de los institutos nacionales de salud en Bethesda, Maryland, Estados Unidos, la Biblioteca de Datos del Laboratorio Europeo de Biología Molecular (E mbl) y el Banco de Datos de dna en Japón (DDBJ). Por su parte, las secuencias de proteínas ueron depositadas en la base de datos Pir y, más recientemente, en la base de datos Protein DataBank (Pdb). Como se mencionó anteriormente, todas estas bases de datos cuentan con recursos bioinormáticos muy amplios con los cuales se pueden llevar a cabo múltiples análisis de las secuencias. Con el desarrollo de la Red Internacional –internet–, todas estas bases de datos han sido puestas a disposición de todo el público de manera gratuita a través de dierentes páginas Web.
¿Qué es el ncbi? Establecido en 1988 como un recurso computacional para el manejo de inormación en biología molecular, el Centro Nacional de Inormación Biotecnológica ( ncbi) crea bases de datos públicas de dna, conduce investigación en biología computacional, desarrolla herramientas de sotware para análisis de datos genómicos y disemina inormación biomédica para investigación básica y clínica. Además de Ncbi y sus Bases de Datos asociadas (http://www.ncbi.nlm.nih.gov), existen otras Bases de Datos tales como embl/Ebi del Laboratorio Europeo de Biología Molecular (http://www.ebi.ac.uk/embl), el dna Databank de Japón (ddbj; http://www.ddbj.nig.ac.jp) y Ensembl, que es un proyecto conjunto del embl/ebi y el Instituto Sanger de Inglaterra (http:// www.ensembl.org). Todas estas bases de datos cuentan con múltiples recursos bioinormáticos para la recuperación, comparación y análisis de secuencias de nucleótidos y proteínas.
33
Objetivos • •
Presentar al alumno los conceptos básicos y las herramientas computacionales en el campo de la bioinormática. Formalizar lo anterior mediante un ejemplo de búsqueda, recuperación y análisis de secuencias de genes y proteínas.
Metodología 1. Recuperación de secuencias
En esta sesión de bioinormática se accederá a la base de datos del ncbi, se hará una búsqueda de una secuencia determinada y se utilizarán algunas de las herramientas computacionales que el ncbi pone a disposición de la comunidad académica mundial. 34 4 a c i t c á r p | a í g o l o n c e t o i b e d l a u n a M
Nota: Las bases de datos no sólo incrementan constantemente sus contenidos, sino que
también varía el diseño de las páginas, sin embargo, siempre será posible llevar a cabo el ejercicio propuesto, mediante una búsqueda cuidadosa en toda la página. Para recuperar una secuencia de un gen o una proteína, la nomenclatura aceptada en las bases de datos señala lo siguiente: •
•
Se puede buscar la secuencia del gen o de la proteína señalando las tres primeras letras del nombre o identifcador en inglés; de esta manera, si se pretende recuperar la secuencia del gen de la insulina teclear Ins, mientras que para una deshidrogenasa teclear Deh. Si el identifcador de la proteína cuenta con dos o más palabras, teclear las iniciales de dichas palabras; así, para recuperar la secuencia de la Heat Shock Protein teclear Hsp.
Nota: Se pueden utilizar indistintamente mayúsculas y minúsculas en la escritura del
identifcador. Para entrar en la base de datos del ncbi teclear la siguiente dirección: y aparecerá la página de presentación del sitio:
Como se muestra, la página contiene el localizador Search (búsqueda) y una ventana en la que aparecen diversas bases de datos; al seleccionar Nucleotides (nucleótidos) se está escogiendo una base de datos específca y en la ventana del localizador escribir el nombre del gen que se desea recuperar; en este caso, el del gen codifcante de la proteína de choque térmico Hsp10. El programa de búsqueda generará un reporte de todas las entradas que existen en la base de datos en las que aparece el registro Hsp10: This search in Gene shows 164 results, including: hsp10 ( Arthroderma benhamiae CBS 112371): mitochondrial heat shock protein Hsp10 HSP10 ( Bifdobacterium bifdum PRL2010): 10 kDa chaperonin GROES hsp10 Hsp10hsp10 ( Salmo salar ): heat shock protein 10
Por otra parte, si se quiere restringir la búsqueda al gen que codifca a la proteína H sp10 humana, habrá que escribir H sp10 human. De esta manera el programa de búsqueda recuperará la secuencia deseada: This search in Gene shows 4 results, including: HSPE1 (Homo sapiens): heat shock 10kDa protein 1 (chaperonin 10) HSPD1 (Homo sapiens): heat shock 60kDa protein 1 (chaperonin) Hspd1 (Mus musculus): heat shock protein 1 (chaperonin)
Al seleccionar la primera entrada de la lista de secuencias correspondiente a Hsp10 human se obtendrán muchos descriptores. Explóralos y busca en el apartado de regiones genómicas, transcritos y productos, en donde dice GenBank, para obtener la secuencia genómica de nucleótidos del gen Hsp10 a partir de la Base de Datos Genbank: ORIGIN 1 acccgcgcag ggtgtgctag cgcgctcagc cctctccggc cggcttagtc tagttcccgg 61 gcctcgctcg gttccagaac tttccagaaa atgccgcgct ccctacggct caagggtcaa 121 atcgcgtcat ttccgggagg ggacgaaggg gtagttcttt cacctcggct gggcgcctag 181 aaaagcctag aaacagctcc ttttttcttc cgcctccgag tcttcgcgtc agcgtcctgc 241 gcagggccct tggggcgaat cgcggtgcgc gtcggggcga ccgccctccc tccctgggag 301 gggcgagggg gctagcggcg accgctgggg cgagcgcgcc tgcgcgctgg gtgatttttt 361 cacgtgtcgc cagggccgga ctgcgagtct ctttgcggcg ctacactaga gcagagtacg 421 agtctgaggc ggagggagta atggtgagtc ccgcgtggcc ccgaggcctg caggcccggg 481 cctgtctgag gcgtacgggg atccctgacg cccctctttt gttgggctgg gcgggaggga 541 ttggtggcca ctcagtgacc agcgcccgat ggcaccttgg agcggcaagg cccgcccgac 601 ccttttctcc cccagggctc tttgcacgcg cgtgtgctgc cggtgtgtaa ggcagggggg 661 cgagaacccg ggcgcacgcg cagcgtctca cctgcttctg cagggccttt gtggatgtgt 721 aatatcttgg gtaaaaatca tggtgccagg cagggagctt gacccagcgt ttcctgaaaa 781 tttctggaaa aacctgaaga aggaaaacat ttgaccttgg aataaactaa ggttgacctt 841 aaagctggtc tggttgctca ccggaggagc gacaacgacc cctaacagac gtaaggaatc 901 gggaattaaa cttggaatat tggttagtac attcaaatgc gcttccttaa cgaataagct 961 gaggtttggt gttaactttc aaagccaaaa cgtgttgaga tgtatagcac ggtggcgttg 1021 cctgttgata atgtgattac atttagtttt tgtttcaaaa catttctctt cctacaggca 1081 ggacaagcgt ttagaaagtt tcttccactc tttgaccgag tattggttga aaggagtgct 1141 gctgaaactg taaccaaagg aggcattatg cttccagaaa aatctcaagg aaaagtattg 1201 caagcaacag tagtcgctgt tggatcgggt tctaaaggaa aggtaaatgg gagctgcagt 1261 ggaactattt tttatagtgt gcagtggagg gaaaagaagt aattctggag tattaaaagt 1321 cgcttattaa gtagagttta tgtcgttttc aagatcatta actgctttgg ttctaatctg 1381 tttcttaaag ggaaatgact aatataaagt tgcttatttt atatgaccaa tgctatgatg 1441 cttattttat gtgatagttt cagagtatta aaaattgtcc tcaataggcc gggtgcggtg
35 5 a c i t c á r p | s a c i t á m r o f n i o i b s a t n e i m a r r e h y s o t a d e d s e s a B . a c i t á m r o f n i o i B e d n ó i s e S
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36
2521 aagactttgg ggagtggaca cttagctgca gtccctttcc ccaaatctgt tctttggagg
4 a c i t c á r p | a í g o l o n c e t o i b e d l a u n a M
2581 gaacaaaaca atcacaagag tatgttctaa atccaaaaaa actttaaatt tttgtatgtt 2641 gaaagaagga aaatatgacc atttgtatat ggcattttct gggtgctggc tactgttgca 2701 ggtttatttc atatagttga taagttatgt taatatttaa cagttataaa gttagcttta 2761 gttaactaaa gttagctttt ccagaatatt ttcttgaact tttacgttgg agtcaggttt 2821 tagtttaagc cactgtgtat tatttcaaag tgtaactaca gtggtatttt tgagtgaaga 2881 tctgtaattc tagtatgagt cgtatcactt agccacgaaa tatattttta atataattgg 2941 atttgagtga ccatgtttca ttagttgtag tgatttaaaa gttaactgtt tatgttgggt 3001 gaactagata tctttgctaa taaacatcct tcctttttta agggtggaga gattcaacca 3061 gttagcgtga aagttggaga taaagttctt ctcccagaat atggaggcac caaagtagtt 3121 ctagatgaca aggtgtgtaa acttaataat tctaaaaaga agtcagatat ttgcaattag 3181 ttgtcttaac taatggtttt tttcacttgc aggattattt cctatttaga gatggtgaca 3241 ttcttggaaa gtacgtagac tgaaataagt cactattgaa atggcatcaa catgatgctg 3301 cccattccac tgaagttctg aaatctttcg tcatgtaaat aatttccata tttctctttt 3361 ataataaact aatgataact aatgacatcc agtgtctcca aaattgtttc cttgtactga 3421 tataaacact tccaaataaa aatatgtaaa tgagtggtta atcttta //
Como se puede observar, la secuencia contiene una numeración que acilita la búsqueda de una subsecuencia particular. De igual orma se puede recuperar, dando clic en transcript , la secuencia del rna mensajero del gen, y en este caso, la secuencia “ NM_002157.2” recuperada solamente muestra los exones que conorman el rna mensajero maduro: /gene=”HSPE1”
HSPE1/RNAm
ORIGIN 1 acccgcgcag ggtgtgctag cgcgctcagc cctctccggc cggcttagtc tagttcccgg 61 gcctcgctcg gttccagaac tttccagaaa atgccgcgct ccctacggct caagggtcaa 121 atcgcgtcat ttccgggagg ggacgaaggg gtagttcttt cacctcggct gggcgcctag 181 aaaagcctag aaacagctcc ttttttcttc cgcctccgag tcttcgcgtc agcgtcctgc 241 gcagggccct tggggcgaat cgcggtgcgc gtcggggcga ccgccctccc tccctgggag 301 gggcgagggg gctagcggcg accgctgggg cgagcgcgcc tgcgcgctgg gtgatttttt 361 cacgtgtcgc cagggccgga ctgcgagtct ctttgcggcg ctacactaga gcagagtacg 421 agtctgaggc ggagggagta atggcaggac aagcgtttag aaagtttctt ccactctttg 481 accgagtatt ggttgaaagg agtgctgctg aaactgtaac caaaggaggc attatgcttc 541 cagaaaaatc tcaaggaaaa gtattgcaag caacagtagt cgctgttgga tcgggttcta 601 aaggaaaggg tggagagatt caaccagtta gcgtgaaagt tggagataaa gttcttctcc 661 cagaatatgg aggcaccaaa gtagttctag atgacaagga ttatttccta tttagagatg 721 gtgacattct tggaaagtac gtagactgaa ataagtcact attgaaatgg catcaacatg 781 atgctgccca ttccactgaa gttctgaaat ctttcgtcat gtaaataatt tccatatttc
841 tcttttataa taaactaatg ataactaatg acatccagtg tctccaaaat tgtttccttg 901 tactgatata aacacttcca aataaaaata tgtaaatgag tggttaatct ttaaaaaaaa 961 aaaaa //
Con la secuencia del gen, ya sea en orma de secuencia completa con intrones o en la orma de rna mensajero, se iniciará una búsqueda de secuencias relacionadas en otros genomas, con la fnalidad de explorar el grado de divergencia de ambas secuencias o de comparar la presencia de inserciones o deleciones de nucleótidos a lo largo de la evolución de ambas secuencias a partir de un ancestro común. Para esto el N cbi cuenta con un programa de comparación de secuencias denominado blast (Basic Local Alignment Search Tool o Herramienta Básica de Búsqueda por Alineamiento Local). Este algoritmo está basado en la comparación de similitudes de nucleótidos o aminoácidos entre secciones cortas (locales) de la secuencia de búsqueda (query ) y cada una de las secuencias de la base de datos; para proteínas, la longitud de las secuencias comparadas es de tres aminoácidos y para nucleótidos la longitud mínima es de 11. Cuando el algoritmo encuentra regiones idénticas o similares, amplía la búsqueda en regiones contiguas, extendiendo el alineamiento hasta que ya no encuentre identidades o similitudes y evaluando el grado de sustituciones o de inserciones y deleciones de nucleótidos o aminoácidos entre las secuencias. Al seleccionar en la página de entrada la opción blast, aparecerá una ventana con la siguiente inormación:
En esta página se selecciona nucleotide blast para realizar la búsqueda con una secuencia de nucleótidos. Aparecerá una ventana en la que se inserta la secuencia del mR na obtenida anteriormente. Más abajo, en selección de programa, conviene seleccionar blastn (somewhat similar sequences [blast n]) para permitir una búsqueda amplia. Entre los parámetros opcionales más importantes del algoritmo fguran: Expect threshold: Número de secuencias que pueden ser encontradas al azar (alor de Expect con elevada signifcación estadística: 0.000001 = (1 x 10-6)). Word Size: La longitud de la secuencia que comienza el alineamiento entre secuencias relacionadas.
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Filter: Elimina secuencias con baja complejidad composicional, por ejemplo:
AAAAAAAAAA….., TATATATATAT…., AGAGAGAGAG…. Pulsar la tecla blast, con lo cual el programa buscará en la bases de datos las secuencias que muestren identidad total o parcial, según se mencionó antes. El resultado de la búsqueda aparecerá en el siguiente ormato:
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Las barras horizontales indican las secuencias con mayor índice de similitud con la secuencia de búsqueda, expresado esto como el valor de Score (puntuación), que va en decremento desde la línea superior a la inerior en unción de los valores de puntuación señalados: < 40 hasta > 200. Al colocar el cursor sobre una línea determinada aparecerá en la pantalla la secuencia correspondiente. Si en vez de hacer el Blast contra todos los genomas, se selecciona en la ventana previa sólo la base de datos de humano, se puede obtener una visión cromosómica de las ubicaciones de las secuencias obtenidas con la opción Human genome view y el programa desplegará una pantalla mostrando las ubicaciones de las secuencias recuperadas por cromosoma, tal como se observa en la siguiente ventana:
Chromosome view hsp10 human
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2. Comparación de secuencias
La base de datos del ncbi también da la opción de llevar a cabo búsquedas de secuencias relacionadas con la de interés en muy diversos genomas totalmente secuenciados, tanto procariontes como eucariontes, lo que permite hacer comparaciones evolutivas y construir relaciones flogenéticas entre diversos organismos. Un ejemplo de lo anterior lo representa la recuperación de la secuencia homóloga del gen de Hsp10 humano en el genoma del chimpancé; en la pantalla siguiente se muestra el ormato de la ventana confgurada en la opción Blast (Blast Home), listando una pequeña muestra de los genomas secuenciados hasta la echa con la opción Blast Assembled ReSeq Genomes: BLAST Assembled Genomes Choose species genome to search or list all Genomic BLAST databases Human Mouse Rat Arabidopsis thaliana Oryza sativa Bos taurus Danio rerio Drosophila melanogaster Gallus gallus Pan troglodytes Microbes Apis mellifera
También con la opción list all Genomic Blast databases se tendrá acceso a las bases de datos de todos los genomas secuenciados hasta la echa. Si se selecciona el genoma del chimpancé ( Pan troglodytes) para buscar en él la secuencia del gen de interés, -Hsp10-, y se repite el procedimiento anterior de copiar y pegar la secuencia
5 a c i t c á r p | s a c i t á m r o f n i o i b s a t n e i m a r r e h y s o t a d e d s e s a B . a c i t á m r o f n i o i B e d n ó i s e S
de Hsp10 en el cuadro en blanco de la pantalla Blast y se pulsa la opción Begin Search (comenzar la búsqueda), el programa dará por resultado un alineamiento pareado entre la secuencia del gen de Hsp10 humano y las secuencias homólogas de Hsp10 en el genoma del chimpancé. La primera entrada corresponde al gen tal como se muestra en el siguiente recuadro:
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Se puede observar que el programa indica el porcentaje de identidad registrado entre las dos secuencias –en este caso de 93%–, el valor de Expect, probabilidad de alineamientos al azar entre dos secuencias no relacionadas, que en este caso es del orden de 1 x 10 -6 y en donde no hay línea, las sustituciones que han ocurrido en estas proteínas desde el tiempo de divergencia entre las dos especies. Para el caso de recuperar y comparar secuencias de aminoácidos, un recurso bioinormático muy útil es UniProt, el cual es una base de datos combinada de tres depositorios internacionales de secuencias de proteínas, PIR, SwissProt y TrEMBL; el sitio Web es . Al entrar a la base de datos de UniProt y teclear el comando Hsp10 human en la casilla de búsqueda (QUERY), se obtendrá el siguiente resultado:
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La primera entrada corresponde a la proteína de humano. Al dar un “clic” en esa entrada se obtiene toda la inormación disponible sobre dicha proteina, incluyendo la secu encia de aminoácidos:
Esta secuencia corresponde a la de 102 aminoácidos de Hsp10; una vez recuperada, la secuencia se copia en ormato FASTA y se lleva a cabo una nueva búsqueda de su secuencia homóloga en diversos organismos, de manera similar a como se realizó con la secuencia del gen. La base de datos de UniProt también cuenta con el recurso bioinormático del blast, así que se puede conducir una búsqueda entre secuencias de proteínas utilizando el algoritmo blast. El programa realiza búsquedas de similitud entre proteínas de todos los organismos que están en las bases de datos. En el siguiente ejemplo, la búsqueda mediante blast produjo los alineamientos entre las secuencias de H sp10 humana y Hsp10 de diversas especies, saliendo primero los de mamíero; se muestra el ejemplo del alineamiento de la secuencia de H sp10 humana con la secuencia de Hsp10 de cerdo, Q6WSP6:
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En este ejemplo, el programa blast recuperó y alineó las secuencias de Hsp10 humana y Hsp10 de cerdo (Sus scroa) que muestran una identidad de 100%.
Discusión de resultados Puntos a discutir: a) b) c) d)
Explicar cuál es el método de búsqueda del algoritmo blast. Analizar, desde el punto de vista estadístico, por qué se deben fltrar las secuencias de baja complejidad. Señalar cuál es el signifcado estadístico del valor de Expect en el programa bioinormático Blast. Discutir el impacto de la bioinormática en la biología.
Los alumnos presentarán un inorme sobre el desarrollo de la sesión que incluya la discusión de los incisos a), b), c), y d).
Bibliografía Burks, C., et al. (1990), “GenBanK: Current status and uture directions”, Methods in enzimology
vol. 183, R. Doolittle (ed.), Molecular Evolution: Computer Analysis o Protein and Nucleic Acid Sequences, Academic Press, Inc. Collado, J. y A. Medrano (2003), “La biología computacional antes, durante y después de los genomas”, Fronteras de la biología en los inicios del siglo X xi. Módulo 1: Genómica, proteómica y bioinormática. Bolívar F. (coord.), El Colegio Nacional, México. Collins, J. y A. Coulson (1990), “Signifcance o protein sequence similaritie”, Methods in Enzimology vol. 183, R. Doolittle (ed.), Molecular Evolution: Computer Analysis o Proteinand Nucleic Acid Sequences, Academic Press, Inc. Dolittle, R. (1990), “Searching through sequence databases”, Methods in Enzimology vol. 183, R. Doolittle (ed.), Molecular Evolution: Computer Analysis o Protein and Nucleic Acid Sequences, Academic Press, Inc. Mount, D. (2004), Bioinormatics. Sequence and genome análisis, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Second Edition, N.Y.
Práctica 6
Análisis de la actividad de catalasas
43
Introducción El oxígeno es una molécula altamente reactiva que se reduce parcialmente dando lugar a diversos agentes químicamente reactivos conocidos como especies reactivas de oxígeno (Ros, por sus siglas en inglés). Estas ormas de oxígeno son altamente dañinas para los componentes celulares, incluyendo a los ácidos nucleicos, los lípidos y las proteínas. Además de estas moléculas muy reactivas, tanto el peróxido de hidrógeno (H 2O2) como el anión superóxido (O 2-), son incluidos también como ros, ya que llevan a la producción de más especies reactivas, particularmente en presencia de iones metálicos. Las R os se pueden generar endógenamente en las células como consecuencia de los procesos metabólicos. También se orman por la exposición de las células a agentes ionizantes, radiación y recicladores redox presentes en el medio y por la exposición a metales pesados. Así, todos los organismos aeróbicos están expuestos continuamente al ataque de agentes oxidantes a través de estos mecanismos. El estrés oxidativo ocurre cuando la concentración de estos oxidantes se incrementa por encima de la capacidad amortiguadora antioxidante de la célula. Dada la ubicuidad de las Ros no es sorprendente que todos los organismos hayan desarrollado medios para proteger a sus componentes celulares contra estos oxidantes altamente reactivos. Para deenderse contra estas especies reactivas de oxígeno las células contienen enzimas antioxidantes, como la superóxido dismutasa, las catalasas y varias peroxidasas, además de que también producen moléculas antioxidantes como el ascorbato, el tocoerol y el glutatión. Las catalasas son un sistema de enzimas hemoproteicas cuyo papel es la detoxifcación de los metabolitos de oxígeno generados en los diversos procesos celulares: 2 H2O2
O2 + 2 H2O
La ingeniería genética es la técnica que se utiliza con el fn de cambiar alguna o algunas características del código genético. Estos cambios pueden consistir en retirar, modifcar o agregar genes al dna de un organismo. Al modifcar esta inormación, la ingeniería genética cambia el tipo o cantidad de proteínas que puede producir un organismo, con lo cual hace posible que éste elabore sustancias nuevas o desempeñe unciones distintas. En esta práctica se utilizarán dos cepas que han sido genéticamente manipuladas y su cepa parental, con el fn de que mediante un experimento muy sencillo los estudiantes puedan apreciar la dierencia en la expresión genética entre una cepa silvestre y cepas genéticamente alteradas, además de que comprendan y analicen tanto el poder como los alcances y limitaciones de la manipulación genética.
Objetivo general Identifcar cómo a través de la ingeniería genética se puede alterar la expresión genética de los organismos.
Objetivo específco Determinar la actividad de catalasa en cepas bacterianas usando un ensayo de liberación de oxígeno.
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Material y equipo Material
Círculos de 3 cm de diámetro de papel fltro 2 vasos de precipitados de 250 ml 1 pipeta de 5 ml 1 pipeta de 10 ml 1 probeta de 1 00 ml 1 probeta de 1,000 ml 2 tubos de cultivo de vidrio estériles Tubos eppendor de 1.5 ml Tubos para centríuga Baño de hielo Pinza para papel fltro
Equipo
órtex Perlas de vidrio para romper Centríuga Incubadora con agitación Cronómetro Cámara de video Reactivos
Triptona a Extracto de levadura a NaCl Agua destilada a KCl a Na2HPO4 a KH2PO4 a NaOH a Ampicilina(50 mg/ml) Hielo * Peróxido de hidrógeno (agua oxigenada, H2O2) a
* Material que deberán traer los alumnos a Reactivos para preparar medios de cultivo. La elaboración de los medios de cultivo está en el anexo.
Material biológico: cepas de Rhizobium etli
CFN42, cepa silvestre, contiene cromosoma y 6 plásmidos CFNX186/katG (Derivada de la CFN42, mutante del plásmido p42 complementada para actividad de catalasa ++) CFNX186/katG (Derivada de la CFN42, mutante del pásmido p42, catalasa –)
Metodología 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8.
Inocular las tres cepas (silvestre, catalasa- y catalasa+) cada una por separado en tubos de cultivo que contengan 3 ml de PY con 10 ml de ampicilina 50 mg/ml. Incubar a 37 0C con agitación constante (250 rpm) durante 12 hrs. Centriugar los cultivos tres minutos a 13,000 g. Resuspender las pastillas en 200 µl de PBS, añadir perlas de vidrio cubriendo hasta ¾ del líquido y romper 5 intervalos de 1 min por uno de reposo en el vórtex. Centriugar a 13,000 g por cinco minutos y trasladar los sobrenadantes a un tubo nuevo. En este momento preparar 400 ml de una solución al 1% de H202 en agua destilada y distribuir 200 ml en tres vasos de precipitados de vidrio. Empapar los círculos de papel fltro con el sobrenadante de cada cepa, tener cuidado de marcar antes con lápiz cada uno de los círculos. Tener lista la cámara y el cronómetro. Cada uno de los círculos mojados se toman con las pinzas por una orilla y se colocan en la solución de H 2O2 depositándolos hasta al ondo del vaso. Se observa durante cinco minutos.
Resultados 1. 2. 3. 4. 5.
De acuerdo con los resultados, discutir los siguientes puntos: ¿En qué vaso se ormaron más burbujas? ¿En cuál vaso no se ormaron? ¿Por qué? ¿Por qué se orman estas burbujas? ¿Las burbujas se generarían de la misma orma con otro reactivo? ¿Qué aplicaciones potenciales tiene una cepa con gran actividad de catalasa?
Agradecimientos Se agradece al Dr. Alejandro García de los Santos del Centro de Ciencias Genómicas por permitirnos utilizar sus cepas.
Bibliografía
Díaz, A. (2003), La estructura de las catalasas, REB 22 (2): 76-84. Luque, J. y A. Herráez (2001), Biología molecular e ingeniería genética, Harcourt.
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Práctica 7
Síntesis de celulosa bacteriana Gluconacetobacter xylinum de Gluconacetobacter para para aplicaciones biotecnológicas 47
Introducción La celulosa es el polímero de mayor abundancia natural, conormado por una larga cadena lineal de moléculas de D-glucopiranosa enlazadas mediante los carbonos C1 y C4 (enlace ß14, ver fgura).
Estructura lineal de la celulosa.
Diversas especies dentro de los géneros Acetobacter, Acetobacter, Achromobacter, Agrobacterium, Escherichia, Pseudomonas, Rhizobium, Salmonella, Sarcina, Zoogloea y Gluconacetobacter producen celulosa, siendo G. xylinum la bacteria que tiene la mayor capacidad de síntesis. Al estudiar la ermentación de vinagre se observó que se ormaba una masa gelatinosa sobre la superfcie del medio de d e cultivo a la que se denominó “madre del vinagre”. Análisis posteriores determinaron que la masa estaba compuesta por celulosa y que la bacteria Bacterium aceti era el organismo responsable de su producción. Posteriormente, la bacteria ue reerida como Acetobacterium xylinum ó Bacterium xylinodes; el nombre derivó a Acetobacter xylinum y fnalmente la denominación actual de esta bacteria es Gluconacetobacter xylinum. G. xylinum es un miembro de la amilia Acetobactereaceae; es una bacteria Gram negativa con orma de bacilo cuyo tamaño varía entre 0.6 – 0.8 µm x 1.0 – 1.4 µm. Es un microorganismo aerobio estricto, con metabolismo respiratorio que oxida en orma incompleta azúcares y alcoholes —ermentación oxigénica—. oxigénica—. Su hábitat natural son rutas y vegetales en proceso de descomposición. En cultivo estático, la bacteria secreta microfbrillas de celulosa, las cuales en el exterior se ensamblan ormando una nata gruesa o “película”. “película”. Se ha propuesto que la celulosa permite a las células alcanzar la superfcie del medio de cultivo, donde existe mayor disponibilidad de O2 para su crecimiento. crecimiento.
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La película de celulosa posee unciones de vital importancia para G. xylinum: aumenta su capacidad para colonizar sustratos, evita la desecación y protege a la bacteria contra la radiación ultravioleta. La celulosa producida por G. xylinum tiene alta pureza y una estructura similar a la de la celulosa vegetal. La estructura de la celulosa depende de las condiciones de cultivo: en condiciones de cultivo estático se genera una “película” en la interase aire/líquido mientras que en cultivo agitado se orman gránulos irregulares, cadenas fbrosas o ramifcadas de c elulosa. El mecanismo de síntesis de celulosa bacteriana le confere una pureza superior a la de la celulosa vegetal y posee características peculiares: alto grado de cristalización, alta resistencia a la presión, elasticidad y durabilidad, elevada absorción de agua y mayor área superfcial que la que presenta la celulosa vegetal. Además, es inerte metabólicamente, no es tóxica ni provoca reacción alérgica al contacto, propiedades de particular importancia para fnes biomédicos y cosméticos. G. xylinum no lleva a cabo glucólisis (carece de la enzima osoructocinasa-1), pero en cambio a partir de triosas osato realiza gluconeogénesis; la ruta de las pentosas osato y el ciclo de Krebs son las vías anfbólicas más activas en la bacteria. Mediante estas vías se produce la celulosa tanto a partir de la poza de hexosas osato (glucosa, (glucosa, ructosa, manosa) como por síntesis a través de la vía gluconeogénica. La síntesis de celulosa es un proceso costoso debido a los requerimientos de energía y uente de carbono; sin embargo, la película permite a G. xylinum situarse cerca de la superfcie del medio y obtener así un mayor acceso a los nutrientes y sobre todo al a l oxígeno, indispensable para la síntesis de atp. Aplicaciones biotecnológicas
La celulosa bacteriana (cb) generada por G. xylinum tiene cualidades únicas que no están presentes en la celulosa vegetal: es un producto de alta pureza que no posee lignina ni ningún otro material común en la celulosa de otras uentes. La celulosa nativa exhibe un alto grado de hidroflicidad, puede retener una cantidad de agua aproximada a 600 veces su peso seco, se ha demostrado que el 99% de la cb es agua. La Cb es permeable a gases, tiene una alta uerza tensil y resistencia a la presión; es inerte iner te metabólicamente y no tiene propiedades alergénicas; estas últimas características le permiten una variedad de aplicaciones en la indu stria cosmética, armacéutica y biomédica (ver cuadro). Industria
Aplicaciones
Turística Textil Papel Alimentos Refnería Maqu Maquil ilad ador oraa Tecno ecnollogía ogía Inve Invest stig igac ació ión n
Ropa deportiva, equipo para acampar. Material de alta absorción acuosa. Restauración de documentos, papel de alta calidad. Adit ditivo de alimentos, emulsifca fcante, fbra dietética. Material para la absorción de aceites. Compo ompone nent ntee de de par parte tess y rea reacc ccio ione ness par para aut autos os,, avi avion ones es,, etc etc.. Diar iarag agma mass de alta lta sensi ensibi bili lida dad d en mic micróon óonos os y audí audíonos onos.. Inmo Inmovi vililiza zaci ción ón de prot proteí eína nass y célu célula lass, res resin inas as para para crom cromat atog ogra raí ía. a. Fabricación de piel artifcial en terapia de quemaduras. Componente en implantes dentales.
Médica
Aplicaciones industriales de la celulosa de origen bacteriano.
Objetivo general Que el alumno obtenga celulosa de origen bacteriano de alta pureza.
Objetivos específcos • •
Demostrar las aplicaciones biotecnológicas industriales de los productos del metabolismo bacteriano. Que el alumno compare las ventajas y desventajas de la producción de la celulosa bacteriana vs la celulosa vegetal.
Material y equipo
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Material
Equipo
200 ml de medio BEGG 1 matraz Erlenmeyer de 500 ml Pipeta serológica de 5 ml * Caja Petri (estéril)
Potenciómetro Balanza analítica Horno (opcional) Campana de ujo laminar
Pinza (estéril) * Recipiente para colocar la película de celulosa en NaOH 1 bisturí (con navaja estéril) 50 ml de NaOH 0.5 M * Algodón y gasas para elaborar un tapón
Papel aluminio
*Material que deberán traer los alumnos.
Metodología Inocular G. xylinum —cultivada por el proesor durante una semana anterior a la echa de la práctica a una temperatura ~ 30°C. Para inocular se utilizará un ragmento de la película de celulosa ormada en el cultivo estático, ya que G. xylinum crece en la matriz de la película de celulosa en estas condiciones. Para hacer más ácil la inoculación de G. xylinum, se sugiere que en condiciones de esterilidad (campana de ujo laminar o cerca del mechero) se coloque, con la ayuda de unas pinzas, la película de celulosa ormada en una caja de Petri vacía y una sola persona corte cinco ragmentos con el bisturí; cada equipo inoculará su respectivo matraz con un ragmento de celulosa. Dejar los matraces en reposo a temperatura ambiente durante una o dos semanas (es importante no mover estos matraces para evitar que la película de celulosa se hunda).
7 a c i t c á r p | s a c i g ó l o n c e t o i b s e n o i c a c i l p a a r a p m u n i l y x r e t c a b o t e c a n o c u l G e d a n a i r e t c a b a s o l u l e c e d s i s e t n í S
Resultados Transcurrido el tiempo, se obtiene la película de celulosa. Determinar el peso húmedo y el pH fnal del medio de cultivo. La película de celulosa se coloca en NaOH O.5 M por 30 min. a 100 °C, con el fn de blanquearla; posteriormente, se lava con abundante agua y se deja secar a temperatura ambiente para determinar su peso seco. De no contar con un horno se puede dejar en la sosa a temperatura ambiente por varios días. El alumno reportará el rendimiento de celulosa tanto en peso húmedo como seco. También debe reportar, con base en este rendimiento, cuál es el porcentaje de humedad que retiene la película de celulosa.
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Agradecimientos Se agradece al Dr. José Edgardo Escamilla Marván, investigador del Instituto de Fisiología Celular de la unam por la donación de la cepa de Gluconacetobacter xylinum IFO 13693.
Bibliografía
Brown, A.J. (1886), “On acetic erment which orms cellulose” J. Chem. Soc. 49: 432-439. Englehardt, J. (1995), “Sources, industrial derivatives, and commercial applications o cellulose”, Carbohydr. Eur , 12: 514. Ross, P., R. Mayer y M. Benziman (1991), “Cellulose biosynthesis and unction in bacteria”, Microbiol 55: 35-58. Yamanaka, S. y K. Watanabe (1994), Applications o bacterial cellulose in cellulosic polymers, Chapter 11, Gilbert, R. (ed.), Hanser Publishers Inc, Cincinnati, OH. Yamanaka, S. y K. Watanabe, N. Kitamura y M. Iguchi (1989), “The structure and mechanical properties o sheets prepared rom bacterial cellulose”, J. Mater. Sci. 24: 3141-3145.
Práctica 8
Emulsifcación de diesel, gasolina y aceite de maíz por Pseudomonas aeruginosa y Serratia marcenses Introducción Los ramnolípidos son moléculas tensoactivas que actúan como biosuractantes. La unción principal de los biosuractantes es permitir a los microorganismos crecer en sustratos inmiscibles en agua a través de la reducción de la tensión superfcial. Los ramnolípidos están ormados por una molécula hidroóbica que generalmente es un dímero de ácido ß-hidroxidecanoico y una parte hidroílica constituida por una (monorramnolípido) o dos (dirramnolípido), moléculas de ramnosa. En particular, los ramnolípidos producidos por P. aeruginosa han sido estudiados para su aplicación en distintas áreas, que incluyen la detoxifcación de suelos contaminados con petróleo, la eliminación de metales tóxicos de suelos, recuperación terciaria de petróleo, protección contra plagas, así como en la industria cosmética y armacéutica. Son también una uente importante de L-ramnosa, que es usada en química fna y como materia prima para la síntesis de compuestos orgánicos. Pseudomonas aeruginosa es una bacteria ambiental que puede prolierar en diversos hábitats, incluyendo agua, suelo y plantas. Esta bacteria secreta numerosos compuestos que se encuentran involucrados en el éxito de colonizar dierentes ambientes. Dentro del género Pseudomonas, solo P. uorescens (viscocina) y P. aeruginosa tienen la capacidad de producir biosuractantes llamados ramnolípidos. Los actores de virulencia son expresados de una manera coordinada a altas densidades celulares por un mecanismo llamado respuesta sensora de quórum (Qs). Aunque la unción fsiológica de los ramnolípidos en P. aeruginosa no ha sido completamente establecida, se les ha considerado como actores de virulencia y antimicrobianos y se les ha implicado en el establecimiento de la estructura y en la disgregación de las biopelículas, así como en la movilidad tipo “swarming” de esta bacteria. La síntesis de ramnolípidos se lleva a cabo por la ramnosiltranerasa I (Rt 1), codifcada por el operón rhlAB; rhlA produce el dímero de ácidos grasos (HAAs), el papel de RhlB es el de transerir una molécula de dTDP-L-ramnosaal dímero de HAAs. La ramnosiltranerasa II (Rt 2), toma una segunda molécula de dTDP-L-ramnosa. La producción de ramnolípidos por P. aeruginosa depende de actores nutricionales y medioambientales, como la limitación de nitrógeno, el pH, y la temperatura. La biosíntesis de ramnolípidos ocurre durante la ase exponencial tardía y la ase estacionaria de crecimiento, bajo condiciones de limitación de nitrógeno o de osatos.
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Objetivo Evaluar la emulsifcación del diesel y del aceite de maíz por las cepas Pseudomonas aeruginosa, Serratia marcenses y Escherichia coli.
Material y equipo
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Material
Equipo
4 matraces Erlenmeyer de 125 ml Tubos para centríuga 1 gradilla 12 tubos con tapa de 15 ml Pipetas de 10 ml * Papel periódico * Regla
Incubadora a 30 °C Incubadora a 37 °C Centríuga órtex Reactivos Medio PPGAS Medio PG Tritón X-100 *10 ml de gasolina *10 ml de diesel *10 ml de aceite de maíz
*Material que deberán traer los alumnos
Metodología Obtención de los biosurfactantes producidos por las cepas Pseudomonas aeruginosa y Serratia
marcenses. 1. Inocular, en un matraz Erlenmeyer de 125 ml con 50 ml de medio PPGAS, una colonia resca de la cepa Pseudomonas aeruginosa y en otro matraz con el mismo medio inocular una colonia de Escherichia coli, e incubar ambos matraces a 37 °C con agitación de 200 rpm durante 24 horas. Al mismo tiempo, inocular en otro matraz Erlenmeyer de 125 ml con 50 ml de medio PG, una colonia resca de la cepa Serratia marcenses, e incubar a 30 °C con agitación de 200 rpm durante 24 horas. 2. Transerir los cultivos crecidos a tubos para centríuga. Centriugar a 4 000 rpm por diez minutos y guardar el sobrenadante (uente de biosuractantes) a 4 °C. 3. Esterilizar los paquetes celulares para desecharlos. Prueba de emulsicación.
1. 2.
Cubrir la mesa de trabajo con papel periódico antes de comenzar. Poner 3 ml de diesel a c/u de los tres tubos de ensaye, 3 ml de gasolina a c/u de los otros tres tubos, 3 ml de aceite de maíz a c/u de los tres tubos y a un último se le colocan 3 ml de tritón, que será utilizado como blanco de reacción. Los tubos deben etiquetarse de la siguiente manera: PaD (por P. aeruginosa Diesel, y así los demás tubos), PaG, PaA, PaT, SmD, SmG, SmA, SmT, EcD, EcG,EcA y EcT. Agregar 2 ml del sobrenadante de cada cepa a evaluar; los que están marcados con Pa corresponden al sobrenadante de Pseudomonas aeruginosa, mientras que los que llevan las letras Sm corresponden a la cepa de Serratia marcenses y los que van etiquetados con
las letras Ec corresponden al sobrenadante de Escherichia coli, de acuerdo con la siguiente tabla:
PaD PaG PaA PaT SmD SmG SmA SmT EcD EcG EcA EcT
3.
Diesel
Gasolina
Aceite de maíz
Tritón
Sobrenadante P. aeruginosa
Sobrenadante S.marcenses
Sobrenadante E.coli
3 ml 3 ml 3 ml -
3 ml 3 ml 3 ml -
3 ml 3 ml 3 ml -
3 ml 3 ml 3 ml
2 ml 2 ml 2 ml 2 ml -
2 ml 2 ml 2 ml 2 ml -
2 ml 2 ml 2 ml 2 ml
Agitar en el vórtex cada tubo a velocidad máxima durante dos minutos y dejar reposar 30 minutos, hasta que se orme una nata blanca que es el indicador de emulsifcación.
Resultados Cada equipo deberá determinar los mililitros de nata que se orman en cada tubo y obtener el porcentaje de emulsifcación, con base en la siguiente apreciación: si la nata blanca que se orma es de 5 ml y existe una sola ase, el porcentaje de emulsifcación es del 100%; en caso de que la nata ormada sea de menor volumen y coexistan dos ases se deberá hacer una relación con una regla de proporciones. Anotar el porcentaje (%) de emulsifcación en la siguiente tabla: Diesel
Gasolina
Aceite de maíz
Tritón X-100
P. aeruginosa S. marcenses E. coli
En el pizarrón se anotarán los resultados de todos los equipos y con éstos se obtendrá el promedio y la desviación estándar de cada muestra.
53 8 a c i t c á r p | s e s n e c r a m a i t a r r e S y a s o n i g u r e a s a n o m o d u e s P r o p z í a m e d e t i e c a y a n i l o s a g , l e s e i d e d n ó i c a c i s l u m E
Bibliografía
De Kievit, T.R., R. Gillis, S. Marx, C. Brown y B.H. Iglewski (2001), “Quorum-sensing genes in Pseudomonas aeruginosa bioflms: their role and their expression patterns”, Appl. Environ. Microbiol. 67: 1865-1873. Maier, R.M. y G. Soberón-Chávez (2000), “Pseudomonas aeruginosa rhamnolipids: biosynthesis and potential applications”, Appl. Microbiol. Biotechnol. 54:625-633. Medina, G., K. Juárez, B. alderrama y G. Soberón-Chávez (2003), “Mechanism o Pseudomonas aeruginosa RhlR transcriptional regulation o the rhlAB promoter”, J. Bacteriol 185: 59765983. Medina, G., K. Juárez y G. Soberón-Chávez (2003), “The Pseudomonas aeruginosa rhlAB operon is not expressed during the logarithmic phase o growth even in the presence o its activator RhlR and the autoinducer N-butyryl-homoserinelactone”, J. Bacteriol. 185: 377-380. Soberón-Chávez, G., F. Lépine y E. Déziel (2005), “Production o rhamnolipids by Pseudomonas aeruginosa”, Appl. Microbiol. Biotechnol. 68:718-725. 54 8 a c i t c á r p | a í g o l o n c e t o i b e d l a u n a M
Práctica 9
Metabolismo secundario
Introducción A medida que en las plantas se generan los compuestos primarios como son los aminoácidos, proteínas, carbohidratos, lípidos, ácidos nucleicos, ácidos carboxílicos, a través de las mismas o similares vías de biosíntesis, de manera paralela, se originan también otro tipo de compuestos que de acuerdo con sus características particulares y específcas se denominan compuestos o metabolitos secundarios. Las vías están interrelacionadas con el metabolismo primario; éste provee un cierto número de pequeñas moléculas que son empleadas como precursores de todas las vías metabólicas secundarias importantes. Existen tres precursores principales: 1.
El ácido shikímico, precursor de muchos compuestos aromáticos, incluyendo los aminoácidos aromáticos, los ácidos cinámicos y ciertos polienoles. 2. Los aminoácidos que dan origen a los alcaloides y a los antibióticos peptídicos inclu yendo las penicilinas y las cealosporinas. 3. El acetato, precursor de los poliacetilenos, las prostaglandinas, antibióticos macrocíclicos, polienoles e isoprenoides.
Entre los numerosos grupos de metabolitos secundarios producidos por una planta se encuentran los alcaloides, terpenos, glucósidos, avonoides, enoles, etc., por mencionar los principales y más comunes. Estos compuestos pueden o no encontrarse en un determinado vegetal; por su abundancia o ausencia, proporcionan a la planta características químicas útiles para su sobrevivencia, su clasifcación botánica y su aprovechamiento por parte del hombre, y como principios activos que pueden presentar alguna actividad biológica para un gran número de organismos, aún de dierentes reinos. Las pruebas específcas para la determinación de grupos de metabolitos secundarios se llevan a cabo con un extracto de planta y a través de las técnicas colorimétricas y de precipitación reportadas por Domínguez. Se identifca cualitativamente la presencia o ausencia de cada uno de los grupos según el cambio de coloración o la precipitación: • • • •
Terpenos: se determinan mediante la prueba de Libermann-Burchard. Alcaloides: se determinan mediante la prueba de Draguendor. Flavonoides: se determinan mediante la prueba de Shinoda. Glucósidos: se determinan mediante la prueba de Mölish.
55
Objetivos • •
Que el alumno determine, a través de pruebas químicas preliminares la presencia de grupos de metabolitos secundarios en el extracto hexánico de hoja de planta. Determinar el eecto del extracto de la planta sobre el crecimiento de Escherichia coli.
Material y equipo Parte I
56 9 a c i t c á r p | a í g o l o n c e t o i b e d l a u n a M
Material
Equipo
* 2 rascos Gerber
* Alcohol de curación (para elaborar el extracto)
3 goteros 1 espátula 1 vaso de precipitados de 500 ml 4 pipetas serológicas de 5 ml 5 tubos de ensaye Espátula 1 vaso de precipitados de 500 ml para el baño de agua – hielo
órtex Propipeta Cloroormo Ácido clorhídrico Draguendor Ácido sulúrico Metanol Mölish Liebermann-Burchard iruta de Mg
Material biológico
*a Extracto de planta *Material que deberán traer los alumnos
Parte II Material
Equipo
* 3 cajas de Petri Perlas estériles para espatular Sensi-discos o papel fltro (1 cm diámetro) Pinzas * Regla o ernier
Mechero Campana de ujo laminar Incubadora a 37 oC
Material biológico
Cepa de Escherichia coli GM2163, cultivada en LB entre 8-24 horas previo a la práctica *a Extracto de planta
Reactivos
Agar nutritivo ioleta de genciana Hexano
a
Preparación del extracto:
Una semana antes de llevar a cabo la práctica, colocar clavo entero (especia), hasta aproximadamente ¼ de volumen de un rasco de Gerber limpio y cubrir hasta la mitad del rasco con etanol al 70%; tapar y dejar macerar. El día anterior a que se lleve a cabo la práctica, tomar ~ 10 ml del extracto líquido y transerir a otro rasco Gerber limpio. Dejar destapado para evaporar el etanol. Una vez reducido el volumen, tapar y llevar ambos rascos a la clase.
Metodología Esta práctica se lleva a cabo en dos partes, en la primera se determinarán los grupos de metabolitos secundarios del extracto de la planta y en la segunda parte se determinará la actividad biológica del extracto mediante un ensayo biológico con bacterias. 57
Parte I. Determinación de los grupos de metabolitos secundarios 1. Se prepara una solución madre del extracto y se toma 1 ml colocándolo en un tubo de ensaye, procedimiento que se repite para cada una de las pruebas (5 tubos de ensaye). 2. Se agrega el reactivo que corresponde a cada grupo: Tubo 1. Control. Sólo se agrega 1ml del extracto. Tubo 2. Terpenos. El extracto se disuelve en 1 ml de cloroormo concentrado, se agita un minuto y se deja reposar, si se llegaran a ormar dos ases se retira la superior. A la ase inerior se le agrega 1 ml de reactivo de Libermann-Burchard. Se considera positiva la prueba si se observa un cambio de coloración al azul-verdoso o rojo-naranja. Tubo 3. Alcaloides. Al mililitro de extracto se le añade una gota de ácido clorhídrico concentrado y dos gotas del reactivo Draguendor. La prueba se considera positiva si se observa un precipitado de color naranja-marrón. Tubo 4. Flavonoides. Se le agrega al extracto un trocito de viruta de magnesio (2–4 mm) y dos gotas de ácido clorhídrico concentrado, si se observa un cambio de coloración hacia el verde o naranja la prueba se considerará positiva. Tubo 5. Glucósidos. A 1 ml de extracto se le agrega 1 ml de metanol; después, se le agregan dos gotas de Mölish. Se coloca el tubo en un baño agua–hielo y se añade 1 ml de H2SO4 concentrado dejando que éste se deslice por las paredes del tubo de ensaye ormando así una interase. Se toma lectura de la coloración del anillo ormado en la interase, se considera la prueba positiva si se observa un color violeta. 3. Observar y anotar la presencia o ausencia de los grupos uncionales, de acuerdo al viraje o precipitado según la prueba. Parte II. Determinación de la actividad biológica de un extracto de planta 1. Preparar agar nutritivo: Pesar 2.0 g de agar nutritivo y suspender en 90 ml de agua purifcada. Calentar agitando suavemente hasta su completa disolución y esterilizar en autoclave a 121 0C a 15 lb de presión por 15 minutos. Dejar enriar a 45 – 50 0C. 2. aciar ~25 ml del medio en cada una de tres cajas Petri y dejar solidifcar. 3. Distribuir, con perlas estériles, 0.2 ml de cultivo líquido de Escherichia coli GM2163. 4. Impregnar los discos de papel fltro con cuatro dierentes cantidades del extracto del rasco 1 (20, 40, 60 y 80 ml) y uno más que será el control positivo, que se impregnará con 20 ml de violeta de genciana. Realizar el ensayo por triplicado. 5. Dejar secar los discos por aproximadamente 10 min antes de colocarlos en la caja, para que se evapore el solvente.
9 a c i t c á r p | o i r a d n u c e s o m s i l o b a t e M
6.
Distribuir los cinco discos por caja, separándolos de manera que se alejen lo más posible entre ellos y del borde de la caja (ver fgura).
Distribución de los discos
58 9 a c i t c á r p | a í g o l o n c e t o i b e d l a u n a M
7. 8.
9.
Incubar las cajas por 24 horas a 37 °C. Observar las cajas a las 18 y a las 24 horas y determinar si hubo actividad bacteriostática, esto es, presencia de un halo de inhibición alrededor de los fltros, con una densidad celular menor que la presentada en el resto de la caja, asumiendo que esto se debe a la inhibición parcial del crecimiento bacteriano; o bien bactericida, inhibición total de crecimiento bacteriano alrededor del disco, observado como un halo transparente. Medir con una regla o ernier el diámetro de los halos
Resultados Para las pruebas colorimétricas y de precipitación, completar la tabla siguiente y asignar valores (+), (++), (+++) y (++++) según la intensidad de la reacción y (-) para aquéllas en las que no se observa reacción. Grupo químico
Intensidad
Terpenos Alcaloides Glucósidos Flavonoides
Para el ensayo con E. coli, elaborar una tabla como la indicada abajo, en donde se especifque el diámetro de los halos, indicando con un asterisco (*) los que tuvieron actividad bactericida. Caja
1 2 3 4 5
20µl
40 µl
60 µl
80 µl
Grafcar el promedio de los halos por la cantidad de extracto en una gráfca de línea: ) m m ( o l a h l e d o r t e m á i D
20
40
60
80
extracto (µl) 59
Discusión 1. 2. 3.
De acuerdo con los resultados obtenidos en las pruebas colorimétricas y de precipitación, analizar los valores asignados (+) según la intensidad de la reacción y determinar la abundancia de los grupos de metabolitos secundarios. Para el bioensayo con E. coli, analizar en la tabla si presenta o no halo de inhibición en cada una de las concentraciones y de qué tipo principalmente (bacteriostático o bactericida). En la gráfca, al observar la media del diámetro de los halos de inhibición, analizar si la actividad biológica (bacteriostática o bactericida) depende de la cantidad de extracto.
Bibliografía
Anaya, L. A. L. (2003), Ecología química, Instituto de Ecología, unam/ Plaza y aldés, México. Domínguez, X. A. (1988), Métodos de investigación otoquímica, Limusa, México. Romeo, J. T. (2004), Secondary metabolism in model systems, Elsevier, Amsterdam. Hui, Y. H. (2008), Food drying science and technology: microbiology, chemistry applications, Lancaster Pennsylvania.
9 a c i t c á r p | o i r a d n u c e s o m s i l o b a t e M
Práctica 10
Degradación de compuestos xenobióticos a través de actividades enzimáticas Introducción La biorremediación es el proceso que se ocupa de la utilización de sistemas biológicos para degradar compuestos tóxicos, contaminantes y sustancias de importancia ambiental (denominados genéricamente compuestos xenobióticos) en suelos, aguas y aire, generando compuestos de menor o ningún impacto ambiental, o bien aislando la sustancia tóxica. Algunas de estas degradaciones o cambios ocurren usualmente en la naturaleza —entonces se denomina “atenuación natural”— sin embargo, la velocidad de tales cambios es baja. Mediante una adecuada manipulación, los sistemas biológicos pueden ser optimizados para aumentar la velocidad de cambio o degradación para que puedan ser usados en sitios con una elevada concentración de contaminantes. Una gran variedad de contaminantes pueden ser eliminados por biorremediación: pesticidas, herbicidas, petróleo y sus hidrocarburos derivados, gasolinas y metales pesados, entre otros. Entre los sistemas más interesantes para la biorremediación se encuentran los hongos ligninolíticos. Estos organismos degradan la madera a través de un conjunto de enzimas oxidasas poco específcas que pueden usar como sustrato un sinnúmero de compuestos xenobióticos. Entre estas enzimas, las lacasas han sido más estudiadas ya que son enzimas robustas y con un amplio rango de sustratos. Las lacasas pertenecen al grupo de las enol oxidasas y contienen cuatro átomos de cobre en su sitio activo que son los que llevan a cabo las reacciones de óxido reducción. En esta práctica se harán ensayos destinados a demostrar la importancia de las lacasas en la capacidad de crecimiento de diversos hongos ligninolíticos, así como su determinación por métodos colorimétricos.
Objetivo general Determinar la actividad enzimática de lacasas y relacionarla con su unción como agentes de biorremediación.
Objetivos específcos • •
Determinar el crecimiento de diversas cepas de hongos ligninolíticos en presencia de petróleo. Determinar la actividad de lacasa de los hongos crecidos en el inciso anterior.
61
Parte I. Monitoreo de la actividad de lacasas en hongos tolerantes a petróleo Material y equipo
62 0 1 a c i t c á r p | a í g o l o n c e t o i b e d l a u n a M
Material
Reactivos
1 mechero 2 vasos de precipitados de 1,000 ml 1 probeta de 1,000 ml 3 matraces Erlenmeyer de 1,000 ml Bisturí * 24 cajas Petri de 45 mm de diámetro * Frasco de vidrio de boca ancha de 500 ml (previamente esterilizado) (de caé Oro) * Papel aluminio
Petróleo crudo Maya K2HPO4 MgSO4•7H2O Lecitina de soya KCl Agar ABTS (2,2’-azinobis 3 etilbenzotiazolina-6-ácido sulónico) Carbonato de calcio * Jugo 8
Equipo
Autoclave Incubadora Cámara otográfca Balanza
*Material que deberán traer los alumnos Material biológico
Cepa de hongo resistente a petróleo Cepa de hongo no resistente a petróleo
Metodología Preparación del medio V8 + petróleo crudo Maya y crecimiento de hongos 1.
En un vaso de precipitados preparar como se enlista a continuación: Reactivo
Por litro de volumen nal
Jugo 8 CaCo 3 Agar
180 ml 2.0 g 20 g
Composición del medio V8
2. 3.
Aorar a 1,000 ml y dividir en dos matraces con 500 ml c/u. A uno de ellos se le agrega lecitina de soya (0.25% p/v). Esterilizar ambos matraces durante 15-20 min a una temperatura de 120 °C y 1 atm de presión. Al salir de la autoclave y mientras sigue caliente el medio que contiene lecitina de soya, se vacía en el rasco de vidrio de boca ancha y se agrega 20 g de petróleo crudo Maya, para una concentración fnal de 200 000 partes por millón (ppm). Agitar vigorosamente hasta alcanzar un mezclado homogéneo.
4. 5. 6.
Se vacían ~ 10 ml de medio con petróleo en cada caja Petri (45 mm de diámetro) y lo mismo del medio sin petróleo. Los micelios de los dos tipos de hongos se siembran tomando un ragmento de 4×4 mm de la caja original, inoculando por triplicado en las cajas 8 con y sin petróleo bajo condiciones de esterilidad. Los hongos se dejan crecer 30 días a temperatura ambiente y se observa el resultado.
Nota: Para llevar a cabo la segunda parte se utilizarán los hongos tolerantes y no tolerantes
cultivados en medio 8 de esta primera parte de la práctica.
Resultados
La cepa del hongo tolerante a petróleo deberá crecer de manera similar a la condición control, mientras que el crecimiento de la cepa no tolerante se notará aectado. 63
Anotar las observaciones, teniendo en cuenta los siguientes puntos: 1. ¿Qué mecanismos son los responsables de comportamientos dierentes en los hongos bajo estas condiciones? 2. ¿Qué eectos tendrá el petróleo en los organismos vivos?
Parte II. Actividad enzimática Los hongos cuentan con diversas enzimas extracelulares que les permiten degradar ciertos compuestos, entre estas enzimas se encuentran las lacasas, que están involucradas en la transormación de una amplia variedad de compuestos enólicos. Con base en esto se pretende probar la capacidad ligninolítica de estos h ongos a través de un ensayo colorimétrico, en donde un sustrato es oxidado (cambiará el color del sustrato como indicador) en presencia de la enzima lacasa.
Material y equipo
1.Preparación del medio mineral 20X + ABTS [1mM] modifcado de Olsson, 2001.
Composición del medio mineral 20X (stock 1 L): Reactivo
Por litro de volumen nal
K2HPO4
2g
MgSO4·7H2O
2g
KCl
2g
En un vaso de precipitados, preparar: Reactivo
Stock medio mineral 20X ABTS [1mM] Agar
Por litro de volumen nal
50 ml 0.5487 g 20 g
0 1 a c i t c á r p | s a c i t á m i z n e s e d a d i v i t c a e d s é v a r t a s o c i t ó i b o n e x s o t s e u p m o c e d n ó i c a d a r g e D
Nota: Este medio es sólo para la determinación de actividad, la abundancia del hongo no es
relevante. 2.
3.
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Aorar a 1 litro con agua destilada. Transerir a un matraz Erlenmeyer y esterilizar durante 15–20 min. a una temperatura de 120 oC y 1 atm de presión. aciar 10 ml de medio en cada caja Petri (45 mm de diámetro). Colocar a 4 oC en oscuridad (envolver con papel aluminio). Se toman micelios de los hongos ya crecidos en las cajas con medio 8 y se cortan en cuadros de 1 cm2; se inoculan en el medio mineral 20X + ABTS [1mM]. Se incuban durante una semana a 28 oC. en ausencia de luz, cubriendo las cajas con papel aluminio. El ensayo se lleva a cabo por triplicado.
Resultados El ABTS oxidado por la lacasa se vuelve visible cuando el medio cambia la coloración a verde o azul oscuro, por lo que la cepa del hongo tolerante a petróleo deberá hidrolizar al ABTS, mientras que la cepa no tolerante no tendrá reacción alguna. De acuerdo con lo observado, responder: 1. ¿Qué relación tiene el ABTS con el petróleo? 2. ¿Por qué cambia de color el ABTS en presencia de la lacasa?
Bibliografía
Baldrian P. (2006), “Fungal laccases - occurrence and properties”, FEMS Microbiol 30: 215-242. Field, J.A., E. De Jong, G. Feijoo-Costa, y J.A.M. De Bont (1993), “Screening or ligninolytic ungi applicable to the biodegradation o xenobiotics”. Trends Biotechnol 11: 44-49. Rojas-Avelizapa, N., E. Olvera-Barrera y L. Fernández-Linares (2005), “Feasibility study o bioremediation o a drilling-waste-polluted soil: Stimulation o microbial activities and hydrocarbon removal”. Journal o environmental science and health, Part A, Toxic/hazardous substances & environmental engineering 40: 2189-2201. Margesin, R., A. Zimmerbauer y F. Schinner (2000), “Monitoring o bioremediation by soil biological activities”, Chemosphere 40: 339-346.
Cultivo de tejidos vegetales Se conoce como cultivo de células vegetales a una serie de técnicas encaminadas a conseguir la reproducción de células, tejidos u órganos de una planta bajo condiciones controladas y asépticas. Mediante el empleo de estas estrategias se puede reproducir una gran cantidad de plantas completas, en poco tiempo y espacio, a partir de pequeñas porciones de una sola planta. La reproducción de plantas in vitro puede darse por dos rutas: organogénesis y embrio génesis somática. En la organogénesis las plantas se reproducen por ormación secuencial de órganos vegetales. Primero tallo y hojas y después raíces. La embriogénesis somática involucra la ormación de pequeñas semillas, llamadas embriones bipolares (porque tiene la capacidad de dar origen a raíces y tallos), que pueden germinar y ormar plantas completas. Solo excepcionalmente es posible reproducir a una especie por las dos rutas, por lo general, una de estas técnicas de propagación in vitro es la elegida porque es más efciente que la otra, o incluso porque es la única que produce plantas completas y értiles. Pueden iniciarse cultivos a partir de hojas, tallos o raíces de plantas crecidas en suelo, pero los mejores resultados en los cultivos de tejidos vegetales se obtienen cuando se emplean como explantes tejidos de plantas que han sido germinadas in vitro en condiciones estériles. Esto ocurre porque los tratamientos de desinección pueden ser más severos en semillas que en órganos de las plantas, ya que las primeras cuentan con una o varias cubiertas que protegen a las células meristemáticas del eecto de los agentes antisépticos.
66 1 1 a c i t c á r p | a í g o l o n c e t o i b e d l a u n a M
Práctica 11
Fitorremediación con helechos
Introducción La polución de ambientes naturales con metales pesados es un problema muy complejo que ha llevado a la búsqueda de estrategias menos costosas y más eectivas que las utilizadas hasta ahora para su control. La eliminación biológica de contaminantes de los ambientes naturales es sin lugar a duda la mejor alternativa disponible. Los contaminantes orgánicos como el petróleo, aguas residuales, agrícolas y pesticidas son generalmente susceptibles a ser d egradados por microorganismos; pero los contaminantes inorgánicos como los metales pesados, nitratos, cianuros y los isótopos radioactivos son más diíciles de tratar. Una posibilidad muy promisoria de biorremediación para elementos tóxicos se encuentra en el empleo de especies vegetales para remover contaminantes de los ecosistemas. La ftorremediación es una tecnología emergente que utiliza a plantas y a los microorganismos asociados a la rizósera para remover, transormar o contener sustancias contaminantes localizadas en suelos, sedimentos, acuíeros, cuerpos de agua superfciales e incluso en la atmósera. Las plantas son el grupo biológico con las más altas capacidades biosintéticas de la tierra, por lo cual pueden transormar y mineralizar una amplia variedad de complejos orgánicos. En el caso de los contaminantes orgánicos, la meta de la ftorremediación es la mineralización de las sustancias hasta componentes no tóxicos (ftodegradación o ftotransormación). Los contaminantes elementales, que incluyen metales tóxicos y radio nucleótidos, son esencialmente inmutables a la acción enzimática. Las plantas sin embargo pueden secuestrarlos y almacenarlos en sus tejidos (ftoextracción y ftoacumulación). La eliminación biológica de contaminantes ambientales se lleva a cabo generalmente por organismos que han logrado adaptarse a las condiciones particulares del sitio a tratar. Las plantas silvestres que crecen en sitios contaminados con metales pesados pueden ser una uente muy importante de posibilidades para la biorremediación. Uno de los grupos biológicos más resistentes a la presencia de contaminantes elementales son los helechos. Pteridium aquilinum (L.) Kuhn es un helecho silvestre ampliamente distribuido en todo el mundo. Es una especie heliófla, pionera, que tiene propiedades alelopáticas, ungicidas, antibacterianas y cancerígenas. Esta planta se encuentra como especie dominante en zonas perturbadas o con una alta concentración de cromo -el cromo hexavalente es un agente mutagénico y altamente cancerígeno que tiene eectos adversos para la salud humana y animal, lo cual sugiere su gran potencial como especie útil para la ftorremediación de suelos contaminados.
67
Objetivo general Determinar la tolerancia a cromo I de los gametoftos de Pteridium aquilinum.
Objetivos específcos 1. 2. 3.
Probar el eecto de dierentes concentraciones de cromo I sobre la germinación de esporas de Pteridium aquilinum. Determinar cuál es el eecto del cromo I sobre el desarrollo de gametoftos y su maduración. Probar el eecto del cromo sobre el desarrollo de esporoftos.
68 1 1 a c i t c á r p | a í g o l o n c e t o i b e d l a u n a M
Material y equipo Material
Equipo
órtex Micropipeta de 1,000 µl Mechero 10 tapas para rascos Gerber Puntas para micropipetas de 1,000 µL estériles Microtubos de 2 ml estériles Papel fltro estéril Embudo de cristal estéril 6 fltros Millipore con membrana de 0.22 µm estériles * 1 paquete de cajas Petri de 10 cm de diámetro estériles * 1 espátula delgada * 10 rascos Gerber grandes * Papel aluminio * 2 pinzas largas estériles * Un rasco de vidrio con algodón
Autoclave Microcentríuga Potenciómetro Balanza analítica Campana de ujo laminar Incubadora de vegetales Microscopio estereoscópico Cámara digital Reactivos
Medio MS Sacarosa Agar Dicromato de potasio Alcohol etílico * Cloro
* Un rollo de plástico Paraflm o Plastipack
* Material que deberán traer los alumnos. Material biológico Esporas de Pteridium aquilinum
Metodología Los experimentos se llevarán a cabo empleando un medio de cultivo ms (Murashige y Skoog) modifcado —se emplea solo la mitad de la concentración de macronutrientes— (ver anexo). Se ajustará el pH del medio a 5.7 con HCl y KOH 1N y se esterilizará en autoclave durante 20
minutos a 120 0C. El medio de cultivo se deja enriar. Cuando llegue a 55 o 60 0C se agregarán dierentes concentraciones de dicromato de potasio (0, 25, 50, 100, 150, 200 µm) esterilizado por fltración con membranas Millipore de 0.22 µm (cada equipo probará uno de los tratamientos). Germinación de esporas in vitro
1. 2.
Se colocan 90 mg de esporas en un microtubo de 2 ml que contiene 1.5 ml de una solución de hipoclorito de sodio al 0.3%. El tubo se agita vigorosamente durante dos minutos en un agitador órtex.
Nota: Es importante que la solución de hipoclorito de sodio se prepare en el momento en
que va a usarse y que las esporas no permanezcan en la solución un tiempo mayor al indicado. 3.
Se centriuga el tubo en microcentríuga durante un minuto a 14 000 rpm.
Nota: Antes de centriugar debe tenerse listo un tubo con 1.5 ml de agua para equilibrar
la centríuga. A partir de este punto el procedimiento se realiza en condiciones estériles. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10.
Se vierte el sobrenadante con las esporas suspendidas, en un papel fltro estéril colocado en un embudo de vidrio. Las esporas que se encuentran adheridas al papel fltro se enjuagan tres veces con 5 ml de agua destilada estéril. El papel fltro se coloca en una caja de Petri estéril. Las esporas se resuspenden en 10 ml de agua destilada. Se inoculan 250 µl de suspensión de esporas de P. aquilinum, en cajas de Petri de 10 cm de diámetro con 25 ml de medio de cultivo semisólido. Los bordes de las cajas se sellan usando un rollo de plástico (Paraflm o Plastipack). Las cajas se mantendrán en una cámara de incubación a 25 ºC, en oto-periodo de 16 horas luz 8 oscuridad, bajo lámparas uorescentes.
Inducción de formación de esporotos
11.
Después de 21 días de sembradas las esporas, los gametoftos se transplantan a rascos Gerber con el mismo medio utilizado en la germinación, los gametoftos se riegan con 1 ml de agua destilada cada semana hasta la aparición de los esporoftos
La respuesta se evaluará a los 7, 14, 21 y 56 días después de la siembra, por el porcentaje de germinación de las esporas y la capacidad de desarrollar gametoftos y esporoftos. Los resultados de todos los equipos se reunirán y el reporte de la práctica se h ará con el resultado de todos los experimentos. Para determinar el porcentaje de germinación de las esporas y el desarrollo protálico, se observan los cultivos en un microscopio estereoscópico (a 320 aumentos) y se toman cuatro otograías de dierentes campos (de cada caja Petri), a los 7, 14 y 21 días después de la siembra. Se considera que una espora ha germinado cuando aparece la célula rizoidal (ver fgura). A los 56 días después de la siembra se determina en cuáles de los tratamientos se desarrollaron esporoftos.
69 1 1 a c i t c á r p | s o h c e l e h n o c n ó i c a i d e m e r r o t i F
70 1 1 a c i t c á r p | a í g o l o n c e t o i b e d l a u n a M
Espora trilete (a). Germinación tipo Vittaria, dos a cinco días (b). Filamentos cortos de cuatro a seis células, seis días (c). Gametofto espatulado, ocho días (d). Gametofto cordiorme, desnudo, con simetría bilateral y meristemo apical, 11 días (e). Gametofto masculino con anteridios en la superfcie ventral de la lámina, entre los rizoides, 13 días (). Acercamiento de los anteridios (g). Morología del anteridio, mostrando la célula basal, la célula media y la célula opercular (h). Gametofto emenino con los arquegonios cerca de la muesca, 17 días (i). Cuello del arquegonio con cuatro células (j). Gametofto monoico, 21 días (k). Gametoftos dioicos con dimorfsmo sexual marcado: masculinos (♂), pequeños con alas poco desarrolladas, emeninos (♀) de talla mayor con alas amplias (l). an= anteridio, ar= arquegonio, cb= célula basal, cm= célula media, co= célula opercular, cr= célula rizoidal, cu= cuello, es= espora, f= flamento, me= meristemo, mu= muesca, ri= rizoide.
Resultados Tabla 1. Eecto de dierentes concentraciones de cromo I sobre la germinación de esporas de P. aquilinum Tratamiento *
Porcentaje de germinación (siete días)
Caja 1
Caja 2
Caja 3
Caja 4
Caja 5
Promedio
Control Cromo I 25 µM Cromo I 50 µM Cromo I 100 µM Cromo I 150 µM Cromo I 200 µM 71
Tratamiento *
Porcentaje de germinación (14 días)
Caja 1
Caja 2
Caja 3
Caja 4
Caja 5
Promedio
Control Cromo I 25 µM Cromo I 50 µM Cromo I 100 µM Cromo I 150 µM Cromo I 200 µM
Tabla 2. Evaluación del desarrollo protálico de los gametoftos de P. aquilinum por tratamien-
to *(Cromo I 25 µM) Tratamiento *
Porcentaje (14 días)
Caja 1
Caja 2
Caja 3
Caja 4
Caja 5
Promedio
Caja 5
Promedio
Gametofto flamentoso Gametofto laminar Gametofto maduro Tratamiento *
Porcentaje (21 días)
Caja 1 Gametofto flamentoso Gametofto laminar Gametofto maduro * Cada equipo reporta sólo sus resultados
Caja 2
Caja 3
Caja 4
1 1 a c i t c á r p | s o h c e l e h n o c n ó i c a i d e m e r r o t i F
Tabla 3. Eecto de dierentes concentraciones de cromo I sobre el desarrollo protálico de los gametoftos de P. aquilinum. Etapa
Porcentaje (14 días)
0 µM
25 µM
50 µM
100 µM
150 µM
200 µM
150 µM
200 µM
Gametofto flamentoso Gametofto laminar Gametofto maduro Etapa
Porcentaje (21 días)
0 µM
72 1 1 a c i t c á r p | a í g o l o n c e t o i b e d l a u n a M
25 µM
50 µM
100 µM
Gametofto flamentoso Gametofto laminar Gametofto maduro
Discusión Temas que se sugieren para el análisis: 1. ¿Cuál es la ventaja de la ftorremediación sobre otros métodos de limpieza de sitios contaminados? 2. ¿Cuáles son las condiciones más importantes que pueden inuir en el proceso de germinación de las esporas? 3. ¿Cuál es la condición indispensable para que los anterozoides realicen la ecundación de las ooseras? 4. Comparar los resultados obtenidos y los reportados en la literatura con otras especies vegetales. 5. ¿Pteridium aquilinum es una especie prometedora para la ftorremediación de suelos contaminados con metales pesados? 6. ¿Cuál es la ase haploide y cuál la diploide en el ciclo de vida de los helechos? 7. ¿Cuál es la ventaja que puede tener hacer selección de organismos haploides en un sistema de mejoramiento genético de esta especie?
Bibliografía
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Práctica 12
Inducción y desarrollo de embriones somáticos de zanahoria
Introducción Durante la embriogénesis somática las células en cultivo experimentan un proceso de desarrollo similar al que ocurre en las plantas cuando se orman las semillas. El desarrollo de un embrión tanto in vivo como in vitro está codifcado por los mismos genes. La embriogénesis somática es un proceso complejo regulado por tres programas genéticos que se prenden de orma secuenciada y son los responsables de la ormación de tejido competente para la embriogénesis, del desarrollo y la maduración de los embriones. La obtención de un embrión maduro, értil y bien desarrollado depende de que estos programas se enciendan en el momento adecuado. Generalmente, la producción de embriones somáticos se divide en tres etapas: En la primera, conocida como inducción, se induce el desarrollo de un tejido embriogénico. Sometidas a los estímulos adecuados, las células meristemáticas suelen dar dos tipos de respuestas: a) se multiplican y generan una masa desorganizada de células que recibe el nombre de callo embriogénico (porque tiene capacidad potencial de generar embriones), o bien, b) se dividen para ormar directamente embriones. Cuando se obtiene callo embriogénico es necesario estimular el desarrollo de los embriones. Durante la etapa de desarrollo, el callo embriogénico se transplanta a un nuevo medio de cultivo, donde se estimula a los cúmulos de células potencialmente embriogénicos para que experimenten un proceso completo de desarrollo y ormen embriones. En ocasiones se somete a los embriones a un proceso de maduración. Durante este proceso se almacenan en los cotiledones sustancias de reserva y el embrión pierde paulatinamente humedad. La maduración de los embriones mejora la efciencia de germinación y es muy conveniente cuando los embriones no están destinados a producir de inmediato plantas completas, también hay semillas sintéticas que emplean otros propágulos: brotes (tallos con algunas hojas) o raíces, los cuales pueden generar después de uno o varios pasos de cultivo in vitro plantas completas. Pero la mayor parte de las veces, las plantas se generan directamente por germinación de embriones sin madurar. Como los requerimientos de cultivo de estas tres etapas son distintos, se ocupan en las dierentes etapas, medios de cultivo dierentes. El principal modelo de estudio de la embriogénesis somática es la zanahoria. Esta posibilidad tecnológica se descubrió precisamente en esta especie. Steward, en 1958 y Reinert en 1959, observaron que las células de zanahoria crecidas en un cultivo de callos en suspensión, tenían la capacidad de ormar unidades estructurales discretas, con una orma de desarrollo similar a la que presentan los embriones cigóticos. Si estos embriones se ponían en condiciones adecuadas, germinaban y producían plantas completas. Ellos llamaron a estos propágulos embriones somáticos.
73 2 1 a c i t c á r p | a i r o h a n a z e d s o c i t á m o s s e n o i r b m e e d o l l o r r a s e d y n ó i c c u d n I
Objetivo general Obtener embriones somáticos de zanahoria.
Objetivos específcos • • • •
Germinar semillas de zanahoria en condiciones estériles. Probar el eecto de dierentes concentraciones de 2,4-D sobre la inducción de callo embriogénico de zanahoria. Determinar cuál es el mejor explante para la inducción de callos embriogénicos de zanahoria. Probar el eecto de la concentración de sacarosa y la uente de nitrógeno en el desarrollo de embriones somáticos de zanahorias.
74 2 1 a c i t c á r p | a í g o l o n c e t o i b e d l a u n a M
Material y equipo Material
Equipo
1 espátula estéril 30 tapas para rascos Gerber Pinzas largas estériles 2 mecheros 2 mallas de acero inoxidable estériles *1 paquete de cajas Petri estériles *12 rascos Gerber grandes de boca ancha (125 ml) *Mango para bisturí del no. 4
Autoclave Potenciómetro Balanza analítica Incubadora de vegetales Campana de ujo laminar
*5 hojas para bisturí estériles del no. 21 o 22 *Papel aluminio *Una caja de cartón *Un rollo de plástico Paraflm o Plastipack Material biológico Semillas de zanahoria
Reactivos
Medio MS 2, 4-D (2, 4 ácido dicloroenoxiacético) Alcohol etílico al 70% Agar Sacarosa L-glutamina Cloro al 30% HCl 1N KOH 1N
*Material que deberán traer los alumnos
Metodología Los experimentos se llevarán a cabo empleando el medio de cultivo básico ms (ver anexo), al que se le agregarán distintas concentraciones de hormonas de crecimiento en los dierentes experimentos eectuados. En todos los casos se ajustará el pH del medio a 5.7 con HCl y KOH 1N y se esterilizará en autoclave durante 20 minutos a 120 oC.
El proceso de inducción de embriogénesis somática se eectuará en tres etapas: germinación in vitro de semillas, inducción de callo embriogénico y embriogénesis.
PARTE I. Germinación de semillas in vitro Desinfección de semillas
1. 2. 3. 4.
Las semillas se colocan en una solución jabonosa ligera (una pizca de cualquier detergente) y se agitan durante un minuto para eliminar basura y polvo. Se colocan en un colador de acero inoxidable y se enjuagan con agua corriente hasta que se elimine el detergente por completo. Se bañan con alcohol al 70% para eliminar aceites, grasas y ceras Se sumergen en una solución al 30% de hipoclorito de sodio (a partir de la solución comercial). Las semillas se mantienen en la solución de cloro durante 20 minutos en agitación constante. Es muy importante que las semillas no permanezcan más tiempo en la solución.
5. 6. 7.
En la campana de ujo laminar, se remueve la solución con ayuda de un colador de acero inoxidable estéril. Las semillas se enjuagan tres veces con agua destilada estéril. Las semillas quedan listas para ser sembradas en el medio de cultivo.
Cultivo in vitro
Se emplearán rascos de 125 ml con 25 ml de medio de cultivo básico ms semisólido (ver anexo) adicionado con 30 g de agar y 8 g de sacarosa. 1. El rasco se destapa y la tapa se coloca hacia arriba cerca del mechero 2. Con ayuda de las pinzas se colocan cinco semillas en cada rasco (cada equipo sembrará cinco rascos). Nota: Las pinzas, después de usarse, se colocan en un rasco con alcohol (al rasco que con-
tiene alcohol se le pone un poco de algodón en el ondo para que no se conunda con los rascos de agua). Antes de volver a usar las pinzas, se amean y cuando el alcohol remanente se apaga, se sumergen en un rasco con agua destilada estéril para que se enríen. 3. 4. 5. 6.
Se toma la tapa con las pinzas, se pasa rápidamente por la ama y se tapa el rasco con las semillas. Los bordes de las tapas se sellan usando un rollo de plástico (Paraflm o Plastipack). Los rascos se mantendrán en una cámara de incubación a 25 °C en oto-periodo de 16 h luz/8 h oscuridad, bajo lámparas uorescentes. Después de seis semanas de cultivo las plantas están listas para utilizarse como explantes.
PARTE II. Inducción de callo embriogénico 1. 2. 3.
Se probarán tres tratamientos para la inducción de callo embriogénico: Medio semisólido ms (ver anexo) con 1, 1.5 y 2 mg/L de 2,4-D. En todos los casos se colocarán cinco explantes en caja Petri con 25 ml de medio. Se ocuparán porciones de tallos, raíces y hojas (de plantas germinadas in vitro de dos meses de edad) como explantes. Se harán cinco repeticiones por tratamiento. Las cajas se mantendrán a 25 °C bajo condiciones de oscuridad (cada equipo probará uno de los tratamientos).
75 2 1 a c i t c á r p | a i r o h a n a z e d s o c i t á m o s s e n o i r b m e e d o l l o r r a s e d y n ó i c c u d n I
4.
La respuesta se evaluará después de cinco semanas de tratamiento por la presencia de callo embriogénico y la recuencia de respuesta. Los resultados de todos los equipos se reunirán y el reporte de la práctica se hará con el resultado de todos los experimentos.
PARTE III. Embriogénesis 1.
2. 3. 76 2 1 a c i t c á r p | a í g o l o n c e t o i b e d l a u n a M
Se probarán cuatro tratamientos para el desarrollo de embriones somáticos de zanahoria: Medio ms con 3% de sacarosa, medio ms con 6% de sacarosa, medio ms con 3% de sacarosa y 750 mg/L de L-glutamina y medio ms con 6% de sacarosa y 750 mg/L de L-glutamina (cada equipo probará uno de los tratamientos). En cajas de Petri con 25 ml de medio nutritivo se colocarán cuatro porciones de callo (del mejor callo obtenido en la etapa de inducción, se harán tres repeticiones por tratamiento). Las cajas se mantendrán en las condiciones antes descritas durante cuatro semanas, el resultado se evaluará por la presencia de embriones somáticos en estado cotiledonario. Los resultados de todos los equipos se reunirán y el reporte de la práctica se hará con el resultado de todos los experimentos.
Resultados Germinación de semillas Día Frasco
2
4
6
8
10
1 2 3 4 5 Promedio DS Germinación Germinación (%)
s a d a n i m r e g s a l l i m e s e d . o N
Días Gráca de velocidad de germinación
12
14
16
Inducción de callo embriogénico* Presencia de callo embriogénico por explante** Frasco
1 mg/L de 2,4-D
1.5 mg/L de 2,4-D
2.0 mg/L de 2,4-D
1 2 3 4 5 Total % de respuesta por explante * La evaluación se hace a las cinco semanas de tratamiento ** Las tablas deben tener los resultados de todos los equipos 77
Desarrollo de embriones somáticos* Número de brotes por explante** Frasco
3% de sacarosa
6% de sacarosa
3% de sacarosa 750 mg/L de glutamina
6% de sacarosa 750 mg/L de glutamina
1 2 3 4 5 No. de brotes por tratamiento * La evaluación se hace a las cuatro semanas de tratamiento Las tablas deben tener los resultados de todos los equipos ** Se emplearán como explante los mejores callos obtenidos en la etapa anterior
Análisis 1. 2. 3. 4. 5.
¿A qué se llama células totipotenciales? ¿Qué son los meristemos? ¿Cuáles son los actores que determinan la inducción de un cultivo embriogénico? ¿Qué características debe tener un tejido que se usa como explante para embriogénesis somática? ¿Cuáles son los actores más importantes durante el desarrollo de embriones somáticos?
2 1 a c i t c á r p | a i r o h a n a z e d s o c i t á m o s s e n o i r b m e e d o l l o r r a s e d y n ó i c c u d n I
Bibliografía
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Práctica 13
Organogénesis somática de Nicotiana glauca
Introducción La organogénesis somática ha resultado ser una herramienta muy valiosa para la propagación comercial de cultivos industriales, plantas ornamentales y hortalizas. Las condiciones de organogénesis son variables para cada especie vegetal. El enoque empírico que ha sido extensamente usado en estudios in vitro de organogénesis ha mostrado que el proceso depende principalmente de tres actores, la elección del explante, el medio de cultivo y el control del ambiente ísico. La manipulación de estos actores lleva a la inducción del desarrollo organizado. En general es mejor utilizar explantes jóvenes con crecimiento activo y con meristemos abundantes. Las hojas y los nudos de los tallos suelen dar muy buenos resultados. Cuando los explantes se colocan en un medio de cultivo con ciertas hormonas vegetales, generalmente citocininas (solas o en combinación con una proporción mucho menor de auxinas), los brotes axiales emergen y orman un agrupamiento de brotes. Una vez que estos brotes se desarrollan pueden subdividirse en grupos más pequeños o brotes individuales que pueden a su vez cultivarse en medio resco con auxinas, para inducir la ormación de raíces. Los explantes de hoja de tabaco (Nicotiana tabacum L.) pueden ormar brotes o raíces directamente, dependiendo de las ftohormonas presentes en el medio. La organogénesis de novo inicia a partir de células en división activa localizadas en los centros meristemáticos de las plantas, células que generan primordios que fnalmente ormarán brotes y raíces. El proceso de organogénesis ocurre en dierentes etapas que incluyen: la adquisición de competencia, la inducción o determinación de una ruta morogenética particular y la dierenciación morológica y el desarrollo. La determinación se completa cuando el tejido es capaz de continuar su programa de desarrollo en ausencia de reguladores de crecimiento exógenos. Recientemente se ha encontrado que los explantes de hojas de tabaco requieren permanecer de cuatro a seis días en el medio de cultivo para que se determine la ormación de brotes y sólo requieren un día en el medio de cultivo para que se determine la ormación de raíces. Nicotiana glauca es una planta perteneciente a la amilia Solanaceae con una amplia distribución en México y el mundo. Es una especie con rápido crecimiento y alta producción de biomasa que produce alcaloides repelentes de herbívoros. Esta planta se comporta como pionera en ecosistemas perturbados y resiste concentraciones elevadas de diversos contaminantes. Existen varios estudios que reportan su capacidad de retener en sus tejidos altas concentraciones de Pb, Zn, Cd y Co. Por estas características, N. glauca es considerada un modelo ideal para llevar a cabo estudios de ftorremediación. Por tratarse de una especie silvestre, su empleo en biorremediación de suelos contaminados depende en gran medida del desarrollo de un protocolo efciente de reproducción para la especie.
79 3 1 a c i t c á r p | a c u a l g a n a i t o c i n e d a c i t á m o s s i s e n é g o n a g r O
Objetivo general Obtener plantas completas a partir de cultivos in vitro de Nicotiana glauca por organogénesis somática
Objetivos específcos 1. 2. 3.
Probar el eecto de dierentes concentraciones de bencil aminopurina (Bap) en combinación con ácido natalenoacético (Ana) sobre la inducción de brotes adventicios de tabaco. Determinar cuál es el mejor explante para la inducción de brotes. Probar el eecto de la composición del medio de cultivo en la rizogénesis de los brotes obtenidos.
80 3 1 a c i t c á r p | a í g o l o n c e t o i b e d l a u n a M
Material y equipo Material
Equipo
2 mecheros 30 tapas para rascos Gerber Tubos eppendor de 1.5 ml 1 espátula estéril Pinzas largas estériles 1 jeringa hipodérmica estéril *1 paquete de cajas Petri estériles de 10 cm de diámetro
Autoclave Potenciómetro Balanza analítica Incubadora de vegetales Campana de ujo laminar
*15 rascos Gerber grandes de boca ancha *Papel aluminio *Algodón *Mango para bisturí del número 4 *5 hojas para bisturí estériles del no. 21 o 22 *Un rollo de plástico Paraflm o Plastipack Material biológico
Semillas de N. glauca
Reactivos
Sales del medio ms Sacarosa Agar Ana Bap Alcohol etílico 70% HCl 1N KOH 1N Cloro 30%
*Material que deberán traer los alumnos
Metodología Los experimentos se realizarán empleando el medio de cultivo básico ms (Murashige y Skoog, al que se le agregarán distintas concentraciones de hormonas de crecimiento en los dierentes experimentos eectuados. En todos los casos se ajustará el pH del medio a 5.7 con HCl y KOH 1N y se esterilizará en autoclave durante 20 minutos a 120 0C. El proceso de inducción de organogénesis somática se eectuará en tres etapas: germinación in vitro de semillas, inducción de brotes y rizogénesis.
Parte I. Germinación de semillas in vitro Desinfección de semillas
• • • • •
Las semillas se colocan en un microtubo de 1.5 ml con una solución jabonosa ligera (una pizca de cualquier detergente) y se agitan durante un minuto para eliminar basura y polvo. Con ayuda de una jeringa hipodérmica se retira la solución jabonosa (cuidando no succionar las semillas, que deben permanecer en el ondo). Se enjuagan las semillas con agua corriente empleando una jeringa hipodérmica, hasta eliminar el detergente por completo. Se bañan con alcohol al 70% durante un minuto para eliminar aceites, grasas y ceras. Se adiciona a las semillas una solución al 30% de hipoclorito de sodio (a partir de la solución comercial) que debe prepararse en ese momento y se mantienen en la solución de cloro durante 20 minutos en agitación constante. Es muy importante que las semillas no permanezcan más tiempo en la solución.
• • • •
En la campana de ujo laminar se remueve la solución con ayuda de una jeringa hipodérmica estéril. Empleando la jeringa estéril, se enjuagan las semillas tres veces con agua destilada estéril. Las semillas quedan listas para ser sembradas en el medio de cultivo. Deben sembrarse las semillas inmediatamente en los rascos con medio de cultivo.
Parte II. Cultivo in vitro Se emplearán rascos Gerber de 125 ml con 25 ml de medio de cultivo básico Murashige y Skoog (1962) semisólido, adicionado con 30 g de agar y 8 g de sacarosa. • •
El rasco se destapa y la tapa se coloca hacia arriba cerca del mechero. Con ayuda de unas pinzas y una espátula delgada estériles, se colocarán entre 10 y 15 semillas en cada rasco (cada equipo sembrará 5 rascos).
Nota: Las pinzas y la espátula después de usarse se colocan en un rasco con alcohol (al
rasco que contiene alcohol se le pone un poco de algodón en el ondo para que no se conunda con los rascos de agua). Antes de volverse a usar, las pinzas y la espátula se amean, cuando el alcohol remanente se apaga, se sumergen en un rasco con agua destilada estéril para que se enríen. • • • •
Se toma la tapa con las pinzas, se pasa rápidamente por la ama y se tapa el rasco con las semillas. Los bordes de las tapas se sellan usando un rollo de plástico (Paraflm o Plastipack). Los rascos se mantendrán en una cámara de incubación a 25 oC, en oto-periodo de 16 h luz 8 h oscuridad, bajo lámparas uorescentes. Después de 6 semanas de cultivo las plantas estarán listas para utilizarse como explantes.
81 3 1 a c i t c á r p | a c u a l g a n a i t o c i n e d a c i t á m o s s i s e n é g o n a g r O
Parte III. Inducción de brotes Se probarán seis tratamientos (uno por equipo) para la inducción de brotes en hojas y raíces de N. glauca: Tratamiento
1 2 3 4 5 6 82 3 1 a c i t c á r p | a í g o l o n c e t o i b e d l a u n a M
bap
ana
(mg/L)
(mg/L)
0.5 1.0 2.0 0.5 1.0 2.0
0.0 0.0 0.0 0.1 0.1 0.1
Se emplearán como explantes hojas y raíces provenientes de plantas germinadas in vitro de dos meses de edad. Cada equipo sembrará cinco rascos con raíces y cinco rascos con hojas. Los experimentos se evaluarán después de cinco semanas de tratamiento por la recuencia de respuesta y el número de brotes obtenidos por explante. Los reportes de las prácticas deben contener los resultados de los experimentos eectuados por todos los equipos.
Parte IV. Rizogénesis Para la inducción de raíces en los brotes obtenidos se probará el eecto de la osmolaridad del medio de cultivo sobre el desarrollo de raíces. Se utilizarán como medio de inducción: el medio ms completo, el medio ms con la mitad de los macronutrientes y el medio ms con un cuarto de los macronutrientes. Los brotes más desarrollados obtenidos en la etapa anterior se emplearán como explantes. Se sembrarán tres brotes por rasco, cinco rascos por tratamiento (un tratamiento por equipo). La respuesta se evaluará después de cuatro semanas de tratamiento por la recuencia de respuesta y la biomasa resca promedio de las raíces obtenidas.
Resultados Inducción de brotes de N. glauca*
Tratamiento**
% de respuesta
Número de brotes por explante***
Número de brotes por tratamiento
Grado de desarrollo de los embriones
1 2 3 4 5 6 * La respuesta se evaluará después de cinco semanas de tratamiento ** Se incluirán los resultados de todos los equipos *** El resultado debe incluir desviación estándar. Los valores deberán estar seguidos por letras (a-d). Los valores con la misma letra indicarán que no hay dierencia signifcativa entre tratamientos a nivel P= 0.05 de acuerdo con la prueba de Tukey.
Enraizamiento de los brotes*
Tratamiento**
% de respuesta
Biomasa promedio de raíz ***
Biomasa de raíces por tratamiento
1 2 3 * La respuesta se evaluará después de cuatro semanas de tratamiento ** Se incluirán los resultados de todos los equipos *** El resultado debe incluir desviación estándar. Los valores deberán estar seguidos por letras (a-d). Los valores con la misma letra indicarán que no hay dierencia signifcativa entre tratamientos a nivel P= 0.05 de acuerdo con la prueba de Tukey.
83
Análisis 1. 2. 3. 4. 5.
¿Cuál es el papel de las hormonas de crecimiento en la inducción de brotes? ¿Cómo se comporta la planta en respuesta a las ftohormonas utilizadas? Observaciones en relación con la efciencia del proceso de micropropagación generado. Comparar los resultados de esta planta con los procesos de micropropagación de plantas del mismo género ¿Cuál puede ser la utilidad de contar con un protocolo efciente de micropropagación para el proceso de domesticación de la especie?
Bibliografía
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3 1 a c i t c á r p | a c u a l g a n a i t o c i n e d a c i t á m o s s i s e n é g o n a g r O
Práctica 14
Identifcación de organismos genéticamente modifcados
Introducción
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Los jitomates, semillas de soya y granos de maíz ueron los primeros organismos genéticamente modifcados en ser aprobados en Estados Unidos en los años noventa. A partir de entonces la biotecnología de alimentos continúa creciendo rápidamente. La introducción de genes específcos a través de la biotecnología puede proveer de ciertas ventajas. Como ejemplo, una planta genéticamente modifcada se protege a sí misma contra parásitos después de la introducción de un gen para la producción de una endotoxina capaz de destruirlos. Las plantas también pueden ser modifcadas para inhibir la expresión de genes específcos que están involucrados en la maduración de la ruta. Existen varios procedimientos biotecnológicos que pueden ser usados para la ingeniería genética de plantas. Como ejemplo podemos mencionar el uso de pistolas genéticas, la introducción de genes mediante el plásmido Ti y la tecnología antisentido.
Objetivo Los alumnos podrán identifcar la presencia de transgenes en muestras vegetales adquiridas comercialmente.
Material y equipo Material
Equipo
20 Tubos eppendor de 1.5 ml limpios y estériles por equipo Baño María a 65 oC por grupo Licuadora o mortero por grupo Micropipetas por equipo
Centríuga por grupo
1 mechero por equipo *100 g de soya *Material que deberán traer los alumnos. La idea es que traigan soya adquirida en distintos sitios: mercados, supermercados, tiendas orgánicas, pueblos, etcétera.
Reactivos por grupo
1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9.
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50 ml de amortiguador de extracción CTAB pH 8.0 (CTAB 20 g/l, NaCl 1.4 M, Tris 1 M y Na2 EDTA 0.02 M). 50 ml de amortiguador de precipitación CTAB (CTAB 5 g/l y NaCl 0.04 M) 50 ml de NaCl 1.2 M 50 ml de solución fsiológica salina (NaCl 0.9%) 1 ml de proteinasa K (20 mg/ml) o pronasa (50 mg/ml) 50 ml de cloroormo 50 ml de isopropanol 50 ml de etanol al 75% 10 ml de agua estéril
Metodología Esta práctica se realiza en tres módulos: I) Extracción de dna de las muestras. II) Amplifcación del dna. III) Electrooresis en geles de agarosa.
MÓDULO I. Extracción de dna Extracción de dna usando ctab (bromuro de hexadeciltrimetilamonio)
1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15.
En una licuadora se trituran 100 g de muestra con 25 ml de solución fsiológica salina, el homogenizado servirá para todo el grupo. En un tubo eppendor de 1.5 ml se colocan de 50-300 mg de muestra (1 tubo por alumno) Agregar 1.0 ml de amortiguador de extracción CTAB precalentado a 65 °C, agitar e incubar por 30 min. Adicionar 10 µl de proteinasa K (20 mg/ml), incubar a 55 oC por 30 min. Centriugar a 14 000 rpm por 10 min. El sobrenadante se transfere un tubo nuevo y limpio. Agregar un volumen de cloroormo, mezclar y centriugar a 14 000 rpm por 15 min. Tomar la ase acuosa superior y transerirla a un tubo nuevo y limpio. Agregar 2 volúmenes del amortiguador de precipitación CTAB, incubar a temperatura ambiente por 60 min. Posteriormente centriugar a 14 000 rpm por 15 min. El sobrenadante se descarta y el dna precipitado se disuelve en 350 µl de NaCl 1.2 M. Adicionar 350 µl de cloroormo, mezclar y centriugar a 14 000 rpm por 10 min. Transerir la ase superior a un tubo nuevo y limpio. Agregar 600 µl de isopropanol, mezclar suavemente e incubar 20 min a temperatura ambiente. Centriugar a 14 000 rpm por 15 min, descartar el sobrenadante. Adicionar 500 µl de etanol al 75%, mezclar con vórtex por 2 min. Centriugar a 14 000 rpm por 2 min, descartar el sobrenadante. Secar la pastilla en el mechero y posteriormente resuspender en agua estéril (aproximadamente 100 µl).
La pureza y concentración del dna puede calcularse de la siguiente manera: 1. Hacer una dilución 1:100 de la muestra obtenida y medir la DO a 260 y 280 nm. La pureza se estima sacando la siguiente proporción: DO 260/DO280. La concentración se calcula de acuerdo con la siguiente ormula: 1.0 de DO 260 = 50mg/µl para dna de doble cadena.
Módulo II. Amplicación del dna La producción de plantas genéticamente modifcadas se lleva a cabo mediante la inserción selectiva de genes oráneos de interés dentro de su genoma. El proceso mediante el cual se realiza la construcción requiere el corte y empalme de dierentes elementos para ormar una unidad genéticamente uncional. La modifcación generalmente incluye dos elementos regulatorios, un promotor y un terminador, así como un gen que confere una ventaja. Dos de los elementos regulatorios más utilizados son el promotor para una elevada expresión constitutiva en tejidos de plantas, CaM-35, aislado del gen 35S del virus del mosaico de la colior y el terminador Nos aislado del gene de la nopalina sintasa (nopaline synthase) de Agrobacterium tumeaciens, el cual da la señal de terminación de la transcripción y dirige la poliadenilación. Estos dos elementos pueden estar juntos o separados. Al inicio de los años ochenta, Chua y colaboradores en la Universidad de Rockeeller aislaron el promotor responsable de la transcripción del genoma completo del virus del mosaico de la colior (CaM, por cauliower mosaic virus). El promotor ue nombrado CaM 35S o promotor 35S por su coefciente de sedimentación. El promotor 35S es un promotor constitutivo muy uerte, ya que provoca altos niveles expresión de genes en plantas dicotiledóneas, aunque es menos eectivo en plantas monocotiledóneas, especialmente en cereales. La discrepancia se debe probablemente a la dierencia en la cantidad y/o cualidad de los actores de regulación.
Metodología Mezcla de reacción: 1. olumen total 25 µl 2. 2.5 µl de amortiguador de reacción (10X) 3. 50 pmol de cada primer 4. 2.5 U de Taq dna polimerasa 5. X µl de agua libre de nucleasas estéril 6. 1-5 µl de dna 7. 2.5 µl dNTP´s 2 mM. Es conveniente que el proesor haga un stock para todo el grupo con el fn de optimizar el uso de los reactivos. La cantidad de reacciones de PCR será determinada por el proesor, ya que no se pueden realizar para todo el grupo debido al elevado costo de los reactivos. Oligonucleótidos utilizados para la amplicación Promotor CaMV 35S
CaM 35SF CaM 35SR Tamaño esperado del amplicón: 196 pb
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Terminador NOS
NOSF NOSR Tamaño esperado del amplicón: 180 pb Programa de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
Desnaturalización Desnaturalización Alineamiento Extensión Extensión fnal Número de ciclos
94 °C, 5 min. 94 °C, 30 seg. 54 °C, 30 seg. 72 °C, 30 seg. 72 °C, 7 min. 30 ciclos
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Módulo III. Electroforesis en geles de agarosa La electrooresis es un proceso que se utiliza para separar macromoléculas en una solución. Muchas moléculas biológicamente importantes (aminoácidos, péptidos, proteínas, nucleótidos, ácidos nucleicos) poseen grupos ionizables y existen en solución como especies cargadas, bien como cationes, o bien como aniones. La electrooresis permite separar moléculas de dna al ser sometidas a un campo eléctrico, ya que son atraídas hacia el polo opuesto a su carga neta. Hay dos uerzas de acción opuesta que determinan la velocidad de la partícula. Primero, la uerza eléctrica atrae el dna hacia el electrodo y la intensidad de la atracción es directamente proporcional a la carga. Segundo, la uerza de rozamiento se opone a la migración y su intensidad depende del tamaño y la orma de la partícula. La electrooresis permite además, hacer una aproximación de la cantidad de dna que se obtiene después de un proceso de extracción. También se utiliza para visualizar el resultado de procesos como la restricción y PCR. Reactivos
Amortiguador TAE 50X GelRed Agarosa
Metodología Preparación del gel de agarosa
1. 2.
Determinar la concentración y el volumen de gel que se necesita. Si el dna tiene un tamaño desconocido se debe utilizar un gel de agarosa al 1.0% (1g/100 ml). Preparar el gel al porcentaje de agarosa deseado según se indica en el siguiente ejemplo.
Ejemplo 1: preparar 30 ml de agarosa al 1.0% (1g/100 ml). Hay que determinar qué canti-
dad de agarosa se necesita para preparar 30 ml: (30 ml)(1 g/100 ml) = (X g)
Se despeja la ecuación para la X. El resultado en este caso es 0.3 g 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9.
Pesar la cantidad de agarosa que se necesita (ejemplo 1 = 0.3 g) y transerir a un matraz Erlenmeyer. Añadir el volumen deseado de solución amortiguadora Tris acetato EDTA (TAE) 1X (ejemplo 1 = 30 ml). Calentar en un horno de microondas hasta que se disuelva la agarosa totalmente (aproximadamente un minuto), pausando el horno cada vez que sea necesario para impedir que hierva. Enriar la agarosa hasta unos 50 °C. Colocar el molde para hacer los pozos en la charola que soporta el gel. Para que el gel quede de un espesor uniorme la charola debe estar en una superfcie plana nivelada. aciar la solución de agarosa en la charola evitando la ormación de burbujas. Si se orman burbujas, se pueden remover usando una punta para micropipeta. Dejar que el gel se solidifque a temperatura ambiente (aproximadamente 30 minutos). El gel sólido tiene una apariencia opaca.
Preparación de la cámara y de las muestras
1. 2. 3.
4. 5. 6.
7. 8.
Colocar el gel dentro de la cámara de electrooresis. Añadir sufciente TAE 1X para cubrir completamente el gel (aproximadamente 0.5 cm) Las muestras se preparan de la siguiente orma: Tomar 5 µl de la muestra y depositarla en un cuadrito de Paraflm, agregar 1ml de GelRed para monitorear la movilidad electroorética. Siempre se debe de usar una punta de micropipeta nueva para cada tubo, de esta manera se evita la contaminación. Cargar cuidadosamente ~ 6 µl de muestra por pozo utilizando una micropipeta. Cargar todas las muestras deseadas de igual manera. Incluir en el gel una muestra de un marcador de peso molecular. Conectar el equipo de electrooresis. Unir los electrodos positivos (rojos) y negativos (negros) a las terminales correspondientes. Encender el equipo, seleccionar el voltaje deseado (aproximadamente 100 voltios). Si el equipo está uncionando bien, entonces se podrán observar burbujas saliendo de los electrodos. Conviene asegurarse de que las muestras están corriendo en la dirección correcta, hacia el electrodo positivo. Correr la electrooresis hasta que las muestras se hayan movido aproximadamente entre la mitad y tres cuartos de la charola. Apagar el equipo.
Resultados Visualización del dna
• •
Colocar el gel en una lámpara de luz U o transiluminador Fotografar el gel usando una cámara digital.
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Bibliografía
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Anexo
Práctica 1. Fermentación alcohólica por Saccharomyces cerevisiae Saccharomyces cerevisiae se mantendrá sembrada en cajas de medio rico (YPD) y se utilizará
para el inóculo una caja con no más de una semana de haber sido sembrada. YPD
Y (extracto de levadura) P (peptona de caseína) D (glucosa) Agar
1% 2% 2% 2%
DNS
(Miller, 1959) Hidróxido de Na Ácido 3,5- dinitrosalicílico Tartrato de Na y K Fenol Metabilsulfto de Na
1.40 % 0.75 % 21.60 % 0.54 % 0.59 %
Práctica 3. Transformación de levadura y ensayo de doble híbrido
Preparar por grupo: Medio YPD (g/L) (5 matraces con 30 ml c /u para el grupo): Extracto de levadura 10 g, peptona
20 g, dextrosa (glucosa) 20 g. Cajas de SD + Leu (3 por equipo): Base nitrogenada para levaduras, sin aminoácidos (YNB) 0.67 %, glucosa 2 %, leucina 20 mg/L, agar 2%. Cajas de SGal + Leu, pH 7.0 (1 por equipo): YNB 0.67%, galactosa 2%, leucina 20 mg/L, ajustar el pH a 7.0, agar 2%. Cajas SGal + ranosa al 1% sin leucina (1 por equipo): YNB 0.67%, rafnosa 1%, agar 2%. TE 10X, pH 8.0 (10 ml para el grupo): Tris 100 mM, EDTA 10 mM. Acetato de litio 10X (10 ml para el grupo): Preparar una solución 1 M de acetato de litio, pH 7.5. PEG 50%: Disolver 25 g de PEG 3350 en 50 ml de agua y esterilizarlo. X-Gal: solución al 2% en N,N-dimetilormamida (guardar a -20 °C). dna de esperma de salmón: Solución de trabajo 10 mg/ml, preparado según Sambrook et al., 1989. Práctica 4.
Extracción de dna e identifcación del sexo en humanos: su importancia en las ciencias antropológicas y orenses PBS 20X (0.2 M PBS, pH 7.2):
Na2HPO4 (anhidro)
21.8 g
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NaH2PO4 (anhidro) NaCl Agua destilada Ajustar pH a 7.2 Guardar a temperatura temperatura ambiente
6.4 g 180 g 1,000 ml
Solución de Lisis:
Tris-HCl 1 M, pH 7.5 1 ml EDTA EDTA 500 mM 2 ml NaCl 5 M 1 ml SDS 20% (p/v) 10 ml Agua libre de nucleasas cbp 100 ml Esterilizar y almacenar a temperatura temperatura ambiente. TAE 50X (1L): 94 o x e n A | a í g o l o n c e t o i b e d l a u n a M
Tris base Ácido acético EDTA EDTA 0.5 M, pH 8.0
242 g 57.1 ml 100 ml
EDTA 500 mM, pH 8.0:
EDTA EDTA (sal de sodio) 18.61 g Ajustar a pH 8.0 con lentejas de NaOH. Aorar a 100 ml, esterilizar y almacenar a temperatura ambiente Proteinasa K o Pronasa (20 mg/ml) mg/ml)
Proteinasa K o pronasa 100 mg Agua estéril 5 ml Almacenar a -20 °C en alícuotas de 400 µl Acetato de sodio 3 M pH 5.2 (100 ml)
Acetato de sodio trihidratado 40.8 g Ajustar el pH a 5.2 con ácido acético glacial. Ajustar el volumen a 100 ml con agua destilada. Esterilizar con autoclave y almacenar a temperatura ambiente Práctica 6. Análisis de la actividad actividad de catalasas d e precipitados, preparar como se enlista a continuación: Preparación de medio PY, en un vaso de Reactivo
Peptona de caseína Extracto de levadura
Por litro de volumen nal
5g 3g
Esterilizar en autoclave 20 minutos a 120 0C y 1 atm de presión. Después, añadir 10 ml de CaCl 2 0.7 M.
Preparación de PBS 10X: en un vaso de precipitados preparar como se enlista a continuación: Reactivo
Por litro de volumen nal
KCl NaCl Na2HPO4.2H2O KH2PO4
2g 80 g 14.4 g 2.4 g
Ajustar el pH a 7.4 con NaOH
Práctica 7. Síntesis de celulosa bacteriana para aplicaciones biotecnológicas, utilizando Gluconacetobacter
xylinum 95
Preparar 200 ml (por equipo) de medio de cultivo BEGG (g/L): Glucosa* 40, extracto de levadura 5, glutamato de sodio 10, KH2PO4, 13.6, MgSO4.7H2O 0.5, etanol** al 1.4% (v/v) pH 6.0. NaOH 0.5 M 50 mL (por equipo): 1 g de hidróxido de sodio, aorar a 50 mL con H 2O * La glucosa se esteriliza por separado y se añade posteriormente al medio para evitar que el grupo amino de las proteínas del extracto de levadura reaccionen con la glucosa. ** El etanol se añade después de la esterilización y una vez que el medio se encuentre a una temperatura ≤ 30 °C para evitar su volatilización. volatilización.
Práctica 8. Emulsicación de diesel, gasolina y aceite de maíz por Pseudomonas aeruginosa y Serratia mar-
censes. Medio MS 100 ml (por equipo), para preparar 1 L: Cloruro de amonio 20 mM Cloruro de potasio 20 mM Tris - HCl 120 mM Peptona 1% Dextrosa (20%) 0.5% Sulato de magnesio (1.0 M) 1.6 mM
1.068 g 1.492 g 18.912 g 10g 26ml 1.6ml
Pesar y disolver los reactivos excepto la dextrosa y el sulato de magnesio en 200 ml de H 2O desionizada, ajustar el pH a 7.4 y aorar a 975 ml. Esterilizar durante 20 minutos. Stock de Dextrosa al 20%, 100 ml Dextrosa 20% 20g Pesar y disolver en 85 ml de H2O desionizada y aorar a 100ml. Esterilizar durante 20 minutos. Sulato de magnesio 1.0 M 12.32g Pesar y disolver en 50 ml de H2O desionizada. Esterilizar por fltración.
o x e n A | a í g o l o n c e t o i b e d l a u n a M
Antes de usar el medio PPGAS, se añaden 26 ml de glucosa al 20% y 1.6 ml de sulfato de magnesio. MEDIO PG (50 ml por equipo), para preparar 1,000 ml:
Bacto peptona Glicerol Ajustar pH a 7.2 Aorar a 1 L Esterilizar 20 minutos
5g 10 ml
Práctica 9. Metabolismo secundario
Preparación de reactivos: 96 o x e n A | a í g o l o n c e t o i b e d l a u n a M
cloroorLiebermann-Burchard (1 ml por equipo) . Mezclar 1 ml de anhídrido acético y 5 ml de cloroormo a 4 °C (en baño de agua-hielo), añadir una gota de ácido sulúrico concentrado. Draggendorff (2 gotas por equipo) . Preparar por separado dos soluciones: Solución A.- mezclar 10 ml de ácido acético y 40 ml de agua y agregar 0.85 g de nitrato nitrato de bismuto básico. Solución B.- Disolver 20 g de yoduro de potasio en 50 ml de agua. Mezclar la solución A con la solución B y guardar en un rasco ámbar. Mölish (2 gotas por equipo). Pesar 0.5 g de α-natol y disolver en 10 ml de etanol. Práctica 11. Fitorremediación Fitorremediación con helechos Práctica 12. Inducción y desarrollo de embriones somáticos de zanahoria Práctica 13. Organogénesis somática de Nicotiana glauca
Estas tres prácticas contemplan el manejo de cultivos vegetales, por lo que se utilizará el medio Murashige y Skoog, Ms, modifcado. Medio Ms modicado:
Preparar soluciones stock. Las soluciones stock se preparan por separado para evitar que se precipiten: S t oc k
Componente
gramos/litro
10X (g/L)
1 macros
(NH4)NO3 KNO3 MgSO4× 7H2O KH2PO4
1.65 1.9 0.37 0.17
16.5 19 3.7 1.7 20X (g/L)
2
CaCl2
0.44
44
3 micros
MnSO4× H2O ZnSO4× 7H2O H3BO3 KI NA2MoO4• 2H2O CuSO4•5H2O CoCl2 • 6H2O
0.01689 0.0086 0.0062 0.00083 0.00025 0.000025 0.000025
1.352 0.688 0.496 0.020 0.020 0.002 0.002
4*
FeSO4•7H2O Na2•EDTA
0.0278 0.0373
2.224 2.984
5 vitaminas
Tiamina•HCl Ác. nicotínico Piridoxina•HCl
0.0001 0.0005 0.0005
0.008 0.040 0.040
6 7
Inositol Glicina
0.10 0.002
8.0 0.160
Sacarosa
30
*Pesar y disolver el ferro y el EDTA por separado. Calentar el EDTA sin ebullir hasta que se disuelva y luego mezclar con el ferro, debe quedar una solución color ámbar (amarillenta).
Preparar 1 L de stock 1(10X). Elaborar 200 ml de c/u de los stock 20X restantes. Todas las soluciones deben conservarse en rerigerador, de preerencia juntas en un recipiente de plástico. Preparación del medio M s, 1 L: Poner 500 ml de agua destilada en un vaso de precipitados
y en agitación constante, se agregan 100 ml del stock 1 y de manera secuencial 10 ml de cada uno de los demás stocks. Al fnal se agrega la sacarosa necesaria y cuando se haya disuelto por completo, se añade agua destilada hasta llegar a 950 ml y ajustar el pH de la solución a 5.7 con HCl ó KOH 1N. Finalmente se aora el medio nutritivo a un litro. Para que los alumnos prueben los distintos tratamientos, se llevan a cabo los siguientes pasos durante la práctica con el grupo:
Cuando el medio nutritivo va a vaciarse a cajas Petri: se vierte en un matraz Erlenmeyer de 2L (es importante que el volumen del matraz sea mucho mayor que el del medio) y se le agrega el agar (8 g por litro) directamente. El medio se esteriliza en autoclave durante 20 minutos a 120 oC. Se deja que el medio enríe hasta alcanzar alrededor de 60 0C y se vacía en cajas Petri estériles en una campana de ujo laminar. Cuando el medio va a vaciarse en rascos de 125 ml (Gerber), se disuelve con agar en una parrilla con agitación hasta que se torna claro y transparente (generalmente cuando llega al punto de ebullición). Se vacían 25 ml del medio de cultivo a cada rasco. Los rascos con el medio se esterilizan en autoclave durante 20 minutos a 120 oC. Es importante dejar que la autoclave se enríe lentamente para evitar que las tapas de los rascos se boten por cambios bruscos de presión. <
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