Biotechnologies végétales

Biotechnologies végétales et animales

Biotechnologies végétales Sommaire

I - Objectif des biotechnologies végétales!

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II - Méthodologies générales!

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II.1 - Choisir et prélever un explant végétal aseptique!

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II.2 - Introduire cet explant végétal dans un récipient + milieu de culture! 4 II.3 - Dans un environnement contrôlé!

III - Les technologies de clonage! III.1 - La micropropagation!

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III.1.a - À partir d’explants avec méristème

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II.1.b - À partir d’Explants sans méristème

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III.2 - L’embryogenèse somatique!

IV - Technologies génératrices de variabilité!

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IV.1 - Variations somaclonales!

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IV.2 - La mutagenèse!

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IV.3 - La fusion de protoplaste!

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IV.3.a - Les protoplastes

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IV.3.b - La fusion de protoplaste

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IV.4 - Le sauvetage d'embryons immatures!

V - L'haplodiploïdisation!

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V.1 - Méthodologie!

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V.I.a - Culture de gamétophyte

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V.I.b - Croisements interspécifiques

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V.I.c - Doublement du stock de chromosomique

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V.II - Exemple d'un cas particulier de l’asperge!

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VI. Production de métabolites secondaires par les cultures cellulaires végétales!

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VI.1 - Métabolites secondaires!

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VI.2 - Interet des cellules végétales!

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VI.2.a - Totipotence

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VI.2.b - Richesse génétique

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VI.3 - Méthodologie!

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VI.4 - Intérêt de produire des métabolites secondaires par ce procédé! 25 VI.5 - Augmenter encore la production!

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VI.5.a - Élicitation

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IV.5.b - Transgénèse

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VI.6 - Applications!

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VI.6.a - Production de shikonine

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VI.6.b - Bioconversion de β-méthyl digitoxine en β-méthyl digoxine par les cellules de Digitalis lanata 26 VI.6.c - Mise en évidence de nouveaux composés pharmacologiques actifs

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I - Objectif des biotechnologies végétales Créer des nouvelles variétés végétales (cultivés) Produire des molécules Produire des matériaux

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elles répondent aux besoins du consommateur et de l’agriculteur

Avant les biotechnologies végétales, on faisait de la sélection classique (1883) : Tout d’abord, on choisit les plantes qui possèdent des caractères intéressants. Ensuite, on croise les parents (A x B). On obtient une descendance très hétérogène qu’on ne peut pas exploiter. À partir de ce mélange, on autoféconde la descendance pour obtenir des lignées homozygotes (5,6 et parfois 7 autofécondations). Cette partie peut prendre parfois plusieurs années. On a maintenant l’hybride F1 qui a les caractères désirés. Avant de le commercialiser, il faut le caractériser et le multiplier Cela met en moyenne 12 à 17 ans avant de produire ce qu’on désire, les créateurs doivent être des devins. Avant la sélection classique, on pratiquait la sélection massale À l’époque, il s’agissait d’une agriculture intensive. Maintenant, on cherche une agriculture durable (qualité, protection de l’environnement...) Ce qui est à la mode c’est les alicaments, on se nourrit pour se soigner. Les consommateurs sont l’Homme, mais aussi les animaux. Les besoins des agriculteurs sont divers comme des plantes qui passent bien dans la machine ou la résistance Où interviennent les biotechechnologies végétales ? Augmenter la variabilité génétique grâce à la transgénèse (OGM), la mutagenèse, la fusion de protoplaste et la culture d’embryons immatures Gagner du temps grâce à l’haplodiploidisation, la micropropagation par bourgeonnement et l’embryogenèse somatique Meilleure caractérisation, on fait du marquage moléculaire (avant c’été de la caractérisation morphologique), pas vraiment un gain de temps, mais on décrit plus précisément les plantes et on peut les breveter Définition des biotechnologies végétales : l’ensemble des techniques qui font appel à la culture in vitro et à la biologie moléculaire et qui ont pour but de s’affranchir des limitations liées à la reproduction sexuée

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II - Méthodologies générales !

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II.1 - Choisir et prélever un explant végétal aseptique

On part de plante, non aseptique. On choisit une plante mère qui doit être le plus jeune possible et qui doit pousser dans les conditions sanitaires les meilleures possible. Plus elle est vieille et plus elle est dure à aseptiser. On la débarrasse de tous les bactéries et champignons. On utilise des solutions désinfectantes comme l’eau de javel diluée à 10 % (hypochlorite de sodium) ou de l’hypochlorite de calcium. On peut utiliser le chlorure mercurique lorsqu’on n’arrive pas à désinfecter la plante (1 pour mille). On peut faire des prétraitements à l’éthanol, un agent mouillant (tween 20, mecryl) qui permet de mieux faire entrer les désinfectants. Pour ne pas tuer la plante, il faut jouer sur la durée et la concentration. Sinon on s’attaque directement à la plante mère en s’y prenant fort en avance en utilisant des fongicides et des antibiotiques On peut partir de n’importe quel explant (feuille, explant, racine...), car les cellules de plante sont totipotentes (1 cellule végétale peut redonner une plante entière). Il faut choisir son explant selon son objectif et selon l’espèce végétale sur laquelle on travaillera

II.2 - Introduire cet explant végétal dans un récipient + milieu de culture Le milieu de culture

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☞ Les éléments essentiels,

Eau Éléments minéraux ➡ Macroéléments (g/L) : N, P, K, Ca, Mg, S (sous forme de sel) ➡ Microéléments (mg/l) : Al, Cu, Ni, Co, Mo, Mu, I (sous forme de sel). Seul le fer n’est pas fourni sous forme de sel, on le fournit sous forme chélatée, associé à un agent chélateur (Fer-EDTA)

Source de carbone (saccharose, glucose) (la lumière est peu disponible en culture in vitro puisqu’on travail sur de petits explants, la photosynthèse n’est pas optimale c’est pourquoi on met une source de carbone)

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Vitamines (mg/l) (la plupart du groupe B) #

☞ Les éléments facultatifs : (ils ne sont pas moins importants) Régulateurs de croissance (= hormones végétales) ➡ Les auxines (AIA) Le rapport auxine/cytokines est important dans la croissance et l’orientation de la morphogénèse : ! - A/C > 1 rhizogénèse ! - A/C < 1 caulogénèse ! - A/C= 1 callogénèse (prolifération indéfinie de cellules)

➡ Les cytokinines (BAP ou BA) ➡ Acide gibbéréllique (AG3) Provoque l’allongement cellulaire, croissance des entre-noeuds ➡ Acide abscissique (ABA) Elle empêche la germination précoce des embryons ➡ Éthylène hormone liée à celui des auxines, soit inhibitrices ou activatrices selon les cas. Il faut contrôler la taille et le mode de fermeture des récipients

Agar (4 à 8 g/l) donne un support à la plante pour éviter qu’elle coule dans le milieu de culture Stérilisation du milieu de culture par autoclave à 121  °C pendant 20 minutes ou par filtration pour ne pas dégrader certaines molécules (0,2 micromètre)

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II.3 - Dans un environnement contrôlé

On place la culture dans un environnement contrôlé : La lumière : importance sur la morphogénèse en fonction de la quantité et de la qualité de la lumière. Si l’on ajoute plus de bleu, on accentue la collogénèse, si l’on ajoute plus de rouge, on accentue la rhyzogénèse. De manière générale on met de la lumière blanche, mais certaines lumières blanches ont plus de bleu ou plus de rouge. On peut aussi jouer sur la photopériode. Plante de jour long 16 : 8. Plante de jours courts 8 : 16 La température : la thermopériode qui va être de l’ordre de 24 °C le jour et 20 °C la nuit. Certaines manipulations exigent des chocs thermiques (haplodiploidisation) choc à 35 °C ou 4 °C Les échanges gazeux : se font à travers la fermeture des capuchonnages

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III - Les technologies de clonage !

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III.1 - La micropropagation

4 étapes principales : Phase 1 : prélèvement et aseptisation de l’explant Phase 2 : multiplication Phase 3 : développement = enracinement Phase 4 : acclimatation Explants avec méristèmes : ➡ Culture de fragments nodaux ou apex # # ou ➡ Culture de méristèmes isolés Explants sans méristèmes !

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III.1.a - À partir d’explants avec méristème

Culture de fragments nodaux ou apex : On met le fragment nodal dans un milieu de culture et en fonction de l’espèce végétale et du milieu de culture, ce fragment se développera de 2 façons différentes : ➥ Si le milieu est pauvre en cytokinine, le bourgeon axillaire va se développer et donner une nouvelle tige et engendrer à son tour d’autres bourgeons axillaires (qu’on appelle tigelle). On peut reprélever et remultiplier ces fragments à l’infini. Il y aura enracinement en même temps que le développement de la tige, on a la phase 2 et 3 qui se déroule en même temps ➥ Si le milieu est riche en cytokinine. Le bourgeon axillaire se développe, mais tous les bourgeons axillaires vont aussi pousser, on aura un développement en touffe. Les cytokinines vont inhiber la dominance apicale. Il n’y aura pas d’enracinement. Pour l’enraciner, on va devoir transférer des petites tiges découpées dans un milieu riche en auxine et pauvre en cytokinine Avec cette technique, si 10 fragments nodaux à J0 ➠ J30 (10 tigelles donc 100 fragments nodaux) ➠ J60 ➠ J90... cela peut atteindre des millions de plantes en 1 an

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Culture de méristèmes isolés : ➥ Elle apporte quelque chose de supplémentaire, permet d’éradiquer certaines maladies liées aux virus (pas des traitements phytosanitaires). Dans le dôme méristématique, il y a des cellules indifférenciées à l’intérieur. Le méristème est très peu contaminé. Le virus n’a pas le temps de se développer, car il utilise les mêmes molécules que les cellules méristématiques et que les cellules méristèmatique se développent plus rapidement que les virus. On peut ajouter de la thermothérapie, on fait un choc thermique « qui simule la fièvre » pour éliminer le virus ➥ Certaines plantes sont récalcitrantes à la culture de fragments nodaux, c’est le cas des plantes ligneuses (arbres), car les tiges et les pétioles sont lignifiés. Le problème est dû à la lignification qui empêche la culture in vitro. Avec la culture de méristèmes isolés, il y aura une rejuvénilisation de la plante, elle va devenir herbacée et va pouvoir se développer ➥ Les orchidées sont très difficiles à développer en culture. Mais le méristème mis en culture va former à sa base une structure globulaire qu’on appelle un peudoprotocorme et qui ressemble à un protocorme lorsqu’on fait germer des graines d’orchidées. Ce protocorme à la capacité de se multiplier et peut donner une plante entière !

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II.1.b - À partir d’Explants sans méristème

Développement direct (= bourgeonnement adventif)  : on prélève n’importe quel matériel végétal (feuille, pétiole...). On part alors de cellules différenciées contrairement aux méristèmes. Il faut alors provoquer la dédifférenciation. On a besoin d’hormones végétales pour se faire. Lorsqu’on met un explant de feuille dans un milieu de culture, on observe directement sur la feuille des petits bourgeons qu’on transfert sur un autre milieu de culture et ainsi de suite... Développement indirect sur l’explant d’un cal  : pour obtenir une différenciation, on transfert le cal dans un autre milieu de culture sur lequel se développera des petits bourgeons (bourgeons néoformés). On peut passer aussi le cal en milieu liquide pour obtenir une suspension cellulaire, les cellules se séparent les unes des autres pour se multiplier plus rapidement. On les utiliser pour produire des molécules d’intérêts

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III.2 - L’embryogenèse somatique

Lorsque qu'on met en culture un explant végétal notamment sur un milieu qui renferme beaucoup d'auxines, il arrive qu'on observe sur les explants des petites structures qui ressemble à des embryons : on les appels des embryons somatiques. Il ressemble à des embryons zygotiques du point de vue morphologique, mais ils sont génétiquement très différents Les embryons somatiques seront identiques à la plante mère tandis que les embryons zygotiques seront toujours différents des 2 parents

Origine : ➥ Unicellulaire ➠ sans cals ➠ développement direct ➥ Pluricellulaire ➠ cals ➠ développement indirect

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La croissance des embryons somatique est très rapide, il n'y a pas de phase de développement, mais elle n'est limitée qu'à un certain nombre d'espèces Les stimuli pour déclencher l’embryogenèse somatique : - Auxines : 2-4-D - Choc thermique (35 °C pendant une semaine chez la chicorée) - Une blessure -

Changement de pression osmotique Changement de source de sucre

C'est un stress qui déclenche généralement l'embryogenèse somatique 2 phases de cultures : - Phase d'induction - Phase d'expression Certains chercheurs les ont utilisés pour faire des semences artificielles :

En réalité, ils voulaient refaire une graine. Mais le problème c'est que chez l'embryon zygotique, il n'y a pas de dessiccation, ni de dormance. Ces plantes germent quand elles en ont envie et pas quand l'agriculteur en a besoin La phase d'acclimatation : Une fois que les plantules sont bien implantées et bien développées, il faut les sortir de l'in vitro. Ce n’est pas si simple. In vitro les plantes sont soumises à un microenvironnement optimal pour la multiplication, mais pas pour le développement In vitro  : faible luminosité, asepsie, milieu avec beaucoup de sucre (développement hétérotrophe), humidité relative importante

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L’efficacité photosynthétique : les plantes sont pauvres en chlorophylle puisqu'on les a nourris avec du sucre, la rubisco est totalement inactivée. Elles ne sont donc pas capables de faire de la photosynthèse. Les feuilles se détériorent. En général, ce sont les nouvelles feuilles produitent qui seront capables de faire la photosynthèse L’évapotranspiration : stomates non fonctionnels, car l’humidité est élevée. La cuticule à une composition chimique différente de celle qui se développe en milieu naturel. Elle possède plus de composés perméables, donc à l'air libre, elle se dessèche rapidement L’asepsie  : terrain idéal pour tous les champignons, bactérie... car la plante n’a pas l'habitude de se défendre Racines : capacité d'absorption très faible, car elle est dans un milieu très moue, Pour régler les problèmes : L’évapotranspiration : on brumise en permanence pendant 24 heures en espacent de plus en plus, on transfert la plante en miniserre et progressivement on ouvre le couvercle L’asepsie  : il faut contrôler l'humidité et la température pour éviter la pousse des champignons L’efficacité photosynthétique : travailler avec le maximum de lumière Les racines  : on utilise un substrat très léger et aéré (tourbe + perlite ou terreau + sable) pour que les racines se développent plus facilement

IV - Technologies génératrices de variabilité 1 - Variations somaclonales 2 - Mutagénèse 3 - Fusion de protoplastes 4 - Les croisements interspécifiques 5 - La transgénèse (cf cours transgenèse)

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IV.1 - Variations somaclonales

Ce n’est pas une technologie proprement dite. C'est une propriété qui arrive de temps à autre et qu'on va utiliser. Quand on fait de la micropropagation et qu’on génère des plantes par culture in vitro, il arrive que des plantes soient différentes de la plante mère, elles présentent des modifications plus ou moins importantes. Ces modifications seront plus importantes si on passe par du bourgeonnement adventif (bourgeon sans méristème) ou par la néoformation de bourgeon (quand on passe par un cal) contrairement aux bourgeons axillaires, car le phénomène de dédifférenciation induit de la variabilité génétique. Les modifications plus important aussi dans des milieux riches en hormonent

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Les modifications les plus courantes qu'on observe sont souvent indésirables : - Déficience chlorophyllienne -

Modifications de l'haploïdie (4n, 6n, chromosomes surnuméraires)

☞ On élimine bien sûr ces plantes Exemple du palmier à huile : Multiplication par embryogenèse somatique, mais il est très lent à se développer, car c'est un ligneux. En faisant de la variation somaclonale, ils se sont rendu compte qu'il y avait beaucoup d'anomalies florales. Les anthères devenaient des carpelles donc, elle ne faisait pas de graine donc pas d'huile S’il y a un effet bénéfique stable, on peut l'exploiter comme un nouveau caractère : Exemple du Pelargonium → clone qui a un aspect des feuilles différent (velours et panaché) assez beau (velvet rose) → maintenant commercialisé Exemple chez le fraisier → culture d'anthères → 10 % plantes tolérantes au mildiou Les variations somaclonales sont décrites pour la première fois par Larkin et Scowcroft en 1971. Elles ne suivent pas les lois classiques de l'hérédité. On a soit une transmission à 100 % ou à 0 %. Ce sont des variations liées à l'épigénie L'épigénie  : mécanisme qui contrôle l'expression des gènes. Elles sont dues à des méthylations de l'ADN ou à des transposons Plus l'explant mis en culture est petit, plus l'explant sera différencié. Plus la phase de multiplication est longue et plus il y aura de variations. Une cellule isolée ne reçoit plus les mêmes signaux que dans la plante entière, c’est ce qui explique le nombre plus élevé de mutations in vitro que dans la nature

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IV.2 - La mutagenèse

Il s’agit d’un phénomène naturel. In vitro, on essaye de l'induire pour créer de nouveaux caractères Quand le phénomène est naturel, la fréquence est de 10-6 pour le génome nucléaire et 10-8 pour le génome cytoplasmique. On sera donc obligé de regarder des millions de plantes et parmi les plantes observées, le caractère voulu ne sera peut-être pas présent

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Pour accélérer le processus, on procède de 2 manières : #

➡ Agents mutagènes → pour induire de la variabilité # puis ➡ Pression de sélection → pour arriver au caractère souhaiter

In vitro, on fait de la mutagenèse induite : -

Agents chimiques (EMS, acridine orange...)

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Agents physiques (UV, rayon X, Rayon Ɣ)

Pour avoir un maximum de chance, on fait de la mutagenèse sur des cellules isolées et indifférenciées (suspension cellulaire, culture de protoplastes, culture de cals) La méthodologie : On cultive un explant végétal sur un milieu riche en 2,4-D ou riche en régulateur de croissance → développement d'un cal → transfert dans un milieu liquide → suspension cellulaire On repique plusieurs fois la suspension cellulaire pour la multiplier à l'infini et afin que toutes les cellules soient isolées et bien en contacte avec le milieu de culture → idéale pour la mutagenèse induite On fait agir un agent mutagène de quelques minutes à quelques heures, on multiplie ces cellules → étalement dans un milieu de culture gélosé sur boite de pétri. Elles vont former des petits cals qu'on repique sur des milieux de multiplication + un agent sélectif (en fonction de ce que l'on veut obtenir → résistance au sel par exemple). En général, tous les cals vont se nécroser sauf quelques-uns (dépends de la chance qu'on a). Régénération à partir des cals survivants (souches variantes) pour obtenir une plante qui sera soumise à analyse parce qu'il n'est pas obligatoire que la résistance soit transmise à toute la plante. On fait alors une analyse génétique pour savoir si la résistance sera transmise à la descendance Les applications : FAO dit qu'il y a 2025 variétés cultivées issues de la mutagenèse, mais en réalité il y en a beaucoup plus, c'est une technologie non considérée comme OGM ✤

Sélection de plantes tolérantes à des stress abiotiques : 1) Tolérance au gel : espèces cultivées dans des régions tempérées. Élévation de la teneur en solutés dans la vacuole pour éviter que l'eau ne gèle et fasse éclater la cellule. Pour la mutagenèse induite, on fais soit des cultures gélives ou milieu + 12 sur 27

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analogue de la proline (agent sélectif), car dans la résistance à des stress, la proline augmente toujours dans les vacuoles (on prend donc le problème à l'envers) ☞ Van Swaarj (1986) culture pomme de terre avec hydroxyproline 2) Tolérance aux basses températures (pas tout à fait comme le gel)  : c’est le cas pour les plantes tropicales et concernent tous les pays tropicaux et nos plantes d'appartement. Permets d'augmenter les surfaces de cultures dans les pays tropicaux, altitude élevée. Pour les plantes d'appartement, cela permet à l'horticulteur de faire des économies d'énergies lorsqu'il fait pousser ses plantes. Cette résistance est due à aussi du à l'augmentation de solutés dans la vacuole, mais également au maintien de la fluidité membranaire

3) Tolérance à la sécheresse (ou stress hydrique)  : elle s’exprime aussi par une augmentation de solutés dans la vacuole. On utilise soit l'hydroxyproline ou un agent osmotique (PEG ou mannitol) 4) Tolérance à la salinité : très recherché dans les régions côtières afin d’augmenter les surfaces de culture. On cultive dans un milieu de culture contenant du NaCl. C'est surtout le sodium qui est toxique en entrant dans la plante. Le sodium crée un choc hyperosmotique qui provoque un déficit en eau. La plante va synthétiser des osmoprotecteurs ou de la proline pour réguler l'homéostasie du sodium cytosolique ➞ activation de transporteurs de sodium sur la membrane de la vacuole ou sur la membrane plasmique 5) Tolérance à l'aluminium  : l’aluminium se trouve dans tout les sols et est toxique pour les plantes ➞ absorbées au niveau des racines ➞ nécrose du méristème ➞ croissance racinaire arrêtée. Dans la plupart des sols, il n'est pas gênant, car il n’est pas toujours absorbé puisqu’il se trouve sous différentes formes. Par contre dans les sols acides, il va être solubilisé et ingéré par la plante (les sols acides représentent 40 % des sols cultivables). Ceci est dû à la pollution ➞ pluie acide. Chez arabidopis thaliana, il existe un facteur At ATR qui lorsqu’il est muté provoque une tolérance à l'aluminium. Ce facteur permet d’arrêter les fonctions lorsqu’il y a une anomalie dans l'ADN donc quand il est muté il permet de laisser se faire la croissance. Cette tolérance est dure à obtenir, car ces mécanismes sont différents pour chaque plante

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Sélection de plantes résistantes aux maladies : ๏ Champignons : fusariose, septoriose chez le blé, rhizomanie chez la betterave ๏ Bactéries ๏ Nématodes ๏ Virus

Pour créer ces résistances, on peut procéder de plusieurs manières : ➡ Soit on cultive les cellules en présence du pathogène, mais en mettant un système de culture dans lequel le pathogène n'envahira pas toutes les cultures ☞ on fait donc une culture en bicouche ➡ Culture + extrait brut de la culture de champignon ➡ Culture + toxines purifiées ➡ Culture + analogue de la toxine (feu bactérien, pseudomonas tabacci, méthionine sulfonide)

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La résistance aux molécules organiques :

Antibiotique → laboratoire → (fusion de protoplastes → sélection des produits de fusion sur milieu + antibiotique) Différents mécanismes mis en jeu (résistance) : - Mutation de la cible de l'herbicide (enzyme) : les plantes sauvages vont devenir -

résistantes à cet herbicide Amplification de la cible de l'herbicide  : l'enzyme sera exprimé en plus grande quantité et l'enzyme ne sera plus capable d'agir Mécanisme d'amplification de la capacité de détoxification de la molécule activé (herbicide) Mécanisme de séquestration de l'herbicide  : Le Paraquat est très toxique pour l'Homme

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La surproduction d'acide aminé : ✓ Intérêt pour l'alimentation humaine  : ll existe des acides aminés essentiels que l'Homme ne peut pas fabriquer (Lys, Met, Trh, Ileu, Val, Leu, Trp, Phe). On doit donc aller les chercher dans l'alimentation - Céréals ➞ pauvre en lysine, thr et Trp - Légumineuse (Fabacées) ➞ elles synthétisent Lys Th Trp mais sont -

déficientes en Met et Cys Quinoa (chénopodiacées) ➞ possède tous les acides aminés essentiels

✓ Technique : culture de cellule + analogue d'acide aminé (agent sélectif) Un acide aminé est capable d'inhiber sa propre synthèse. L'analogue sera incorporé dans les protéines (qui conduira à des protéines modifiées) qui seront létales pour la plante sauf si elle est mutée. Donc si la première enzyme de la chaine de biosynthèse n'est plus réprimée grâce à la mutation, on pourra alors créer en masse des acides aminés ✓ Application : Augmentation de la lysine dans les céréales (analogue de la lysine ➞ aminoéthylcystéine). On a essayé chez l'orge et le maïs, mais la lysine n'augmentait pas dans les graines ➞ c'est une expression tissu spécifique ✓ Intérêt pour la tolérance au stress (augmentation de la proline, cf pages 11 et 12) Résistances aux UV (car inhibiteur de la photosynthèse) ➞ ils ont travaillé sur la betterave ➞ donne de très bon résultats Tolérance aux températures très élevées ➞ travail sur le blé ➞ capable de résister à des températures de 48 °C Plante qui soit capable de se développer dans un milieu pauvre en phosphate pour une meilleure efficacité d'absorption ➞ tomate ➞ les acides organiques solubilisent les phosphates du sol qui les rends beaucoup plus absorbable

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IV.3 - La fusion de protoplaste

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IV.3.a - Les protoplastes

Protoplaste : c'est une cellule sans paroi (composition pecto-cellulosique) La paroi est une barrière à l'introduction de matériels génétiques ou à la fusion cellulaire. On utilise des cellulases et des pectinases (extraites à partir de champignons) pour dégrader la paroi. On les place ensuite dans une solution hypertonique afin d’éviter la lyse 15 sur 27

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de la vacuole en turgescence. On utilise pour cela le mannitol ou le sorbitol, car ils ne sont pas métabolisés par les plantes. On peut utiliser aussi des solutions salines (KCl). La cellule rentrera en plasmolyse, on peut désormais obtenir des protoplastes À partir de quel matériel végétal, obtient-on des protoplastes ? ✓ Matériel végétal le plus jeune possible, car ils ont des capacités de régénération importante (cellules embryogènes ou à l'état méristématique) ✓ Matériel végétal le plus aseptique possible ➞ sur de jeunes germinations déjà cultivées in vitro ou des suspensions cellulaires ✓ Feuille, racine, des cals, embryon... Il faut juste que les protoplastes soient capables de se diviser et de régénérer des plantes. Parfois il est nécessaire d'effectuer des prétraitements qui favorisent la division cellulaire ➞ conditions d'éclairement variable. On place alors les tissus végétaux dans une solution enzymatique + agent osmotique (= solution de macération) qu'on laisse agir pendant plusieurs heures. On filtre sur des petits tamis pour enlever les gros débris. On élimine les enzymes à l'aide de lavage (3 centrifugations successives avec un milieu de lavage qui renferme un agent osmotique). Une fois lavé, on peut mettre les protoplastes en culture à forte densité 10 000 à 500 000 protoplastes/ml ➞ induits la division cellulaire. Le protoplaste est une cellule ronde avec un plasmalemme, un cytoplasme et un noyau. Les premiers signes que l’on observe lorsque’on met la cellule en culture, c'est une structure ovalisée parce qu'elle reforme sa paroi pecto-cellulosique. Lorsqu'elle reforme sa paroi, la cellule va se dédifférencier. Le petit noyau va grossir et se centraliser, le cytoplasme va se densifier et la vacuole va se résorber en une multitude de petites vacuoles. La cellule va ensuite se diviser puisqu'elle possède sa paroi. On obtient alors un microcal qu'on fait grossir en cals ➞ on induit le bourgeonnement ➞ enracinement ➞ acclimatation des plantes Au début, on travail sur un milieu riche en minéraux, ensuite on ajoute des hormones (A/C = 1) et au fur et à mesure, on diminue la concentration en agent osmotique, car les cellules n'en ont plus besoin, car elles ont reformé leurs paroi pecto-cellulosique ✦ Propriétés des protoplastes : -

Pas de paroi pecto-cellulosique Capables de régénérer Cultiver en grand nombre

★ Ces propriétés servent : -

Micropropagation 16 sur 27

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Mutagenèse Fusion de protoplaste

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Transgenèse (par éléctroporation)

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IV.3.b - La fusion de protoplaste

Méthodologie :

Les protoplastes sont tous chargés négativement et ne se touche pas, il faut donc 2 étapes pour la faire de la fusion de protoplaste : - Accolement - Fusion ✓ Accolement : - Méthode chimique : le plus utilisé est le PEG (polyéthylèneglycol), il faut une bonne durée d'action et une bonne concentration. On utilise aussi des dextran, du nitrate de Na et des sulfates de dextran -

Méthode électrique  : courant alternatif de haute fréquence, les protoplastes se transformeront en dipôle et se placerons en petite chainette

✓ Fusion avec accolement chimique : elle sera induite par le calcium qui augmente le nombre de pores ✓ Fusion avec accolement électrique : courant continu avec des impulsions ➞ taille et nombre des pores On effectue après la fusion des lavages pour éliminer le calcium et le PEG qui sont très toxiques ✤

Après la fusion, culture des protoplastes : -

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Milieu liquide Milieu semi-solide (gel d'agarose à basse température) : On coupe les morceaux de gélose contenant les protoplastes qu'on remet dans un milieu liquide ➞ intérêt : les protoplastes se divise que quand ils ont une paroi (l'Agar joue se rôle de tissu) Milieu solide : on dépose la suspension de protoplastes liquide sur la gélose. Le liquide va être incorporé dans la gélose et les protoplastes se deposeront sur la 17 sur 27

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surface de la gélose. Certaines cultures ont besoin d’une culture nourricière = cellules en division active ✤

Sélection des produits de fusion : ✓ Résistance à un antibiotique : seul l'hétérocaryon résistera si on met le milieu a 2 antibiotiques ✓ Sous microscope : on va chercher manuellement les hétérocaryons, mais il faut partir de 2 types de cellules différents ➞ l’inconvénient c’est qu’il s’agit de cultures à faible densité ➞ milieu difficile à mettre en place

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Caractéristiques des hétérocaryons (réparti en 3 catégories différentes) : ✓ Espèces très proches phylogénétiquement : dans ce cas, on observe une fusion des noyaux (4n) qu'on appel hybride somatique. Les mitochondries fusionnent et provoquent des remaniements des génomes mitochondriaux ➞ aucune conséquence, car ce sont des espèces très proches. Pour les chloroplastes ➞ un lot est éliminé, cela se fait aléatoirement, libre à nous de choisir le lot qui nous intéresse Intérêt : - Création variétale - Restaurer la fertilité ✓ Espèces peu éloignées phylogénétiquement  : il y a aussi fusion des noyaux, mais apres les premières divisions, on a une élimination progressive d'un certain nombre de chromosomes d'une des deux espèces (2n chromosomes + X chromosomes de l'autre espèce) on appel cela des hybrides asymétriques. Il y a aussi une fusion des génomes mitochondriaux, mais les remaniements peuvent créer de la stérilité mâle cytoplasmique Interet  : On peut transférer quelques chromosomes d'une espèce (transfert de gène) pour des espèces non compatibles sexuellement ✓ Espèce très éloignée phylogénétiquement  : il n’y a pas de fusion des noyaux,. Ce sont des plantes à 2n chromosomes, on appelle cela des cybrides car il y a quand même des recombinaisons. Les remaniements des génomes mitochondriaux permettent de créer delà stérilité male cytoplasmique. Les chloroplastes d'un lot sont éliminés et permettent parfois de pallier à la déficience chlorophyllienne ou la résistance a un antibiotique

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IV.4 - Le sauvetage d'embryons immatures

Embryons immatures = embryons issus de croisements interspécifiques, car incompatibilité sexuelle (pas de graine), mais il y a quand même un embryon qui se développe et donc par culture in vitro on essayera de faire du sauvetage Rôle de l'albumen ➞ lors de la fécondation, il y a une double fécondation : ➥ 1 spermatozoïde va féconder l'oosphère (2n zygote) ➥ 1 spermatozoïde fécondera les 2 noyaux polaires (n+n) ➞ l'albumen (3n) 2 espèces différentes : ➥ L'embryon ➞ 1 génome maternel + 1 génome paternel ➥ L'albumen ➞ 2 génomes maternels + 1 génome paternel ☞ D’un point de vue génétique ➞ peut être très diffèrent et empêcher la reproduction sexuée. In vitro, on excise donc l'embryon de la graine ➞ mise en culture dans un milieu adapté. Pour allonger la durée de vie de l'embryon ➞ traitement sur les fleurs ➞ pulvérisation de 2,4 D ➞ blé, maïs. Avant le stade torpille, il est très dur de sauver les embryons ✤

Les besoins nutritifs de l'embryon (dépends de l'âge de l'embryon) : La culture se fait sur un milieu solide ➞ stade cotylédonaire ➞ même besoin qu'une plantule. Avant le stade cotylédonaire, les besoins sont totalement différents ➞ a une nitrate réductase non fonctionnelle, on lui fourni donc des ions ammoniums et de l'azote organique. On cultive donc avec une osmolarité importante. Le fer est toxique donc on le diminue, mais on augmente le calcium (permets la survie) et le potassium (permets la croissance). Du point de vue régulateur de croissance, on peut observer une germination précoce qui peut être empêchée par des hormones (ABA et l'AG3). L'osmolarité élevé au départ va devenir toxique très vite. On effectue alors beaucoup de repiquage. Ce milieu adapté aux embryons immatures est le milieu de Norstog Intérêt : permets de gagner du temps au cours de croisements Les graines ont souvent besoin d'une période de maturation et de dormance pour arriver à la germination. Chez le tournesol, il faut 1 an pour faire une génération de plantes, avec le sauvetage d'embryon, on ne met plus que 80 jours

V - L'haplodiploïdisation 19 sur 27

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Le but est d'obtenir des plantes haploïdes à partir de plantes diploïdes (hétérozygotes). Ensuite, on double le stock chromosomique pour obtenir des plantes homozygotes Il est plus facile de faire la mutagenèse sur des plantes haploïdes, car toutes les mutations s'expriment ➞ mutations homozygotes

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V.1 - Méthodologie

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V.I.a - Culture de gamétophyte

✓ Si on fait de la culture de gamétophyte male ➞ androgenèse ✓Si on fait de la culture de gamétophyte femelle ➞ gynogenèse ✦ Androgenèse Le gamétophyte male = grain de pollen ➞ très peu de cellules et très différencié. On essaye donc de trouver des cellules plus jeune encore ➞ anthères Les grains de pollen sont issus des cellules mères de l'anthère qui en subissant la méiose donnent naissance aux tétrades qui se séparent les unes des autres pour donner les microspores. Les microspores se divisent par mitose et donnent les grains de pollen. Le stade microspore est idéal pour faire de la culture ✓ Culture d'anthère immature Les grains de pollen se développent dans les anthères, il va falloir faire de la culture d’anthère immature ➞ plus facile à prélever Détermination des critères morphologiques de la plante qui permette de mettre en culture des anthères qui soit au stade microspore : - Taille du bouton -

Rapport entre la taille des pétales sur la taille des sépales Taille des anthères

Mise en culture en osmolarité élevée : - Développement direct  : les microspores se divisent pour donner des embryons haploïdes (Tabac) - Développent indirect : les microspores se divisent pour donner ➞ cal ➞ embryon haploïde (blé, riz) Inconvénient  : la paroi de l'anthère est diploïde, elle peut régénérer des embryons somatiques diploïdes 20 sur 27

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✓ Culture de microspores isolées Anthères immatures ➞ broyage léger dans un milieu en osmolarité élevé. Les microspores se retrouvent à la surface du milieu. On aura des microspores en milieu liquide qui se développeront en embryon haploïde ✓ Culture de protoplastes de grain de pollen Le grain de pollen est recouvert par une paroi qui est difficile à digérer (intine et exine). Lorsque l’on digère cette paroi, on peut faire de la culture de grains de pollen, mais cela reste une technique peu utilisée Inconvénient de l’androgenèse  : elle aboutit parfois à la formation d'embryons et de plantes albinos. Chez certaines espèces : ➡ 100 % albinos ➡ Nombre variable d'albinos ➡ 0 % d'albinos On ne peut pas le savoir avant d'avoir fait la manipulation. Ce phénomène serait dû aux chloroplastes qui se trouve au niveau des gamètes mâles et qui ne serait plus fonctionnel. Des études ont montré que le génome chloroplastique était tronqué ✦

Gynogenèse Il y a moins de cellules haploïdes, c'est pourquoi on utilise l'androgenèse en premier. Il s’agit d’une culture de gamétophyte femelle Le gamétophyte femelle = sac embryonnaire qui contient 8 noyaux haploïdes ✓ Culture d'ovaires (Cucurbitacées) : On peut avoir un développement direct ou indirect comme pour l’androgenèse. Dans tous les cas, on obtient toujours des plantes chlorophylliennes !

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V.I.b - Croisements interspécifiques

Certains croisements vont conduire à l'élimination d'un lot de chromosome (paternels). Il reste donc un embryon haploïde qui se développe : ➥ Dans certains cas on récupère des graines haploïdes directement sur la plante ➥ Dans d’autres cas, il a tendance à avorter, on fait alors du sauvetage d'embryon pour régénérer une plante haploïde 21 sur 27

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Dans les 2 cas ➞ croisements interspécifiques et la culture de gamétophytes, ➞ on doit faire un prétraitement de la plante mère : ➥ Culture de gamétophytes : - Froid : 4 °C pendant 1 heure par jour - Solution hypertonique (+ mannitol) - Ou les 2 : froid + solution hypertonique ➞ stress ➥ Croisements interspécifiques  : pulvérisation ou injection de 2-4D, cela facilite la fécondation et la survie de l'embryon !

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V.I.c - Doublement du stock de chromosomique

๏ Spontané : cela arrive très fréquemment sans que l’on ne sache pourquoi ➞ pratique ๏ Provoqué : ➥ Agents antimitotiques (colchicine, orysaline) La colchicine bloque la formation du fuseau achromatique donc les chromosomes ne peuvent pas se séparer à l'anaphase. Il n'agit que sur les cellules qui sont en mitose. Donc si on vaporise sur la plante, on obtient une mosaïque de cellules haploïde et diploïde que l’on appelle chimère. Il faut donc passer par une étape de multiplication soit par la reproduction sexuée ou par la multiplication végétative pour obtenir un organisme complètement diploïde ➥ Fusion de protoplastes : cellules haploïdes : n+n ➞ 2n

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V.II - Exemple d'un cas particulier de l’asperge

L’asperge est une plante dioïque, il y a des plantes mâles (Mm) et des plantes femelles (mm). Lorsqu'on fait de la culture d'asperge, les plantes les plus productives sont les Mm donc si on fait des croisements de Mm x mm, on aura seulement 1/4 de plantes performantes. Les sélectionneurs ont donc fait de l'haplodiploïdisation avec de la culture d'anthères

Les MM (supermale) n'existent pas dans la nature, mais

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quand on les croise avec une plante mm, on obtient 100 % de Mm performant donc c'est une belle utilisation de l'haplodiploïdisation

VI. Production de métabolites secondaires par les cultures cellulaires végétales !

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VI.1 - Métabolites secondaires

Dans les végétaux, différents types de métabolisme : ➥ Métabolisme primaire : survie de la plante (cycle du carbone, de l'azote...) ➥ Métabolisme secondaire : -

Mécanisme de défense face à l'environnement Mécanisme d'interaction avec l'environnement Métabolites en assez faible quantité (1 % du poids sec de la plante)

Le métabolisme secondaire dépend du stade physiologique et du stade de développement de la plante. Ces métabolites sont stockés dans des tissus (souvent dans la vacuole) 100  000 métabolites secondaires ont été découverts, mais seulement la moitié ont été décrites On peut les classer en 3 classes : - Les terpénoïdes : menthole (menthe) cannabinoïdes (cannabis) - Les alcaloïdes : morphine (extraite du pavot) - Les phénylpropanoïdes : estragol On peut les utiliser : - Pharmacologie : taxol, vinblastine - Agroalimentaire : bétacyanine pour colorer les aliments, le menthol pour le gout - Chimie : cosmétologie 1/4 des médicaments pharmacologiques sont d'origines végétales : - Utilisation directe : vinblastine, vincristine - Utilisation indirectement (on fait de l'hémisynthèse)  : une molécule légèrement modifiée comme la bodophyllotoxine (antiviral) - Synthèse presque complète : on utilise le squelette de la molécule puis on vient greffer des groupements dessus comme les stéroïdes (contraceptifs)

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VI.2 - Interet des cellules végétales

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VI.2.a - Totipotence

Lorsqu'on met des cellules en cultures, il n'y a plus de signaux qui proviennent de la plante, ce qui modifie l'expression des gènes qui conduit : - À une production plus importante de molécules - À une production de nouveaux métaboliques !

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VI.2.b - Richesse génétique

Le génome des végétaux est aussi grand que celui des animaux, mais dans les cellules végétales, il y a plus de séquences non codantes qui permettent l'expression d’autres gènes

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VI.3 - Méthodologie

1) Choix de la plante 2) Obtenir des cals sur gélose 3) Tri des cals pour obtenir des souches Souches ➞ culture de cals dont les cellules sont : - De même origine phénotypique -

De morphologies identiques De caractéristiques physiologiques semblables Dépourvu de capacité de régénération Cultivé en condition identique

4) Passage en milieu liquide agité (stabilisation des suspensions) 5) Sélection d'une suspension en haut rendement 6) Production en bioréacteur ➞ dépendante de : - La physiologie de la cellule végétale - Métabolites non excrétés -

Cellules végétales qui ont une croissance lente (3 semaines, 1 mois) Cellules végétales plus volumineuses que les bactéries

☞ Les types de bioréacteurs : ➡ À ailette (pas adaptée) ➡ Au lift : circulation d'air pour l'oxygénation du milieu

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Quand une cellule se divise, elle ne produit pas tout de suite des métabolismes. Il faut d'abord créer de la biomasse et ensuite elles synthétiseront des métabolites. Pour cette synthèse, il suffit d'immobiliser les cellules dans des gels dextran pour simuler un tissu L'excrétion des métabolites a été réalisée grâce : - Changement de pH : il suffit de diminuer le pH du milieu extérieur pour que les métabolites se dirigent vers l'extérieur de la cellule au lieu de se diriger vers la vacuole (vacuole pH 5) Agents perméabilisant

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VI.4 - Intérêt de produire des métabolites secondaires par ce procédé La culture en bioréacteur permet : ✓ Une indépendance par rapport au : - Climat - Saison ✓ ✓ ✓ ✓ ✓

Une élimination des aléas géopolitique Maitrise totale de la production D’éliminer les actions néfastes sur l'environnement (écologie) D’éliminer les aléas dus aux récoltes L’absence de résidus de substances phytosanitaire

L'inconvénient : cela coute très cher donc autant faire de la culture classique, mais on peut améliorer la culture en bioréacteur en augmentant encore la production

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VI.5 - Augmenter encore la production

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VI.5.a - Élicitation

Éliciteurs : substances introduites dans le milieu de culture afin d'augmenter la production des métabolites secondaires Éliciteurs : -

Molécules extraites de champignons Ultra Violet Ions (Cu, Cd)

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L’éliciteur a pour but de créer des stress et généralement la plante synthétise du méthylejasmonate (qui peut être aussi un éliciteurs, mais endogène cette fois-ci) !

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IV.5.b - Transgénèse

On fait des cultures de plantes transformées, on modifie les métabolismes au niveau des facteurs de transcription pour augmenter la production des métabolites

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VI.6 - Applications

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VI.6.a - Production de shikonine

La shikonine provient des cellules de Lithospermum erythorhizon et est utilisée en médecine chinoise depuis très longtemps. C'est un cicatrisant très efficace (pharmacologique) et l’on s’en sert comme rouge à lèvres (cosmétologie) On l'extrait de racines âgées de 5 à 7 ans dans lesquelles on trouve une concentration de 1 à 2 % de shikonine donc a dû faire de la culture en bioréacteur : Culture de 11 jours + 14 jours - 11 jours pour la production de biomasse - 14 jours pour la production de métabolite Le rendement est supérieur à la culture traditionnelle VI.6.b - Bioconversion de β-méthyl digitoxine en β-méthyl digoxine par les cellules de Digitalis lanata Ce sont des médicaments cardiotoniques À l'état naturel, la plante est capable de produire les 2, mais la digoxine est plus intéressante pour la production de médicaments Il suffit de faire une 12-β-hydroxylation, les cellules arrivent très bien à faire cette conversion en réacteur de 20 litres VI.6.c - Mise en évidence de nouveaux composés pharmacologiques actifs Étude faite sur Picralima nitida ➞ apocynacée africaine On réalise des suspensions cellulaires ➞ extraits ➞ tests biologiques (test de liaison compétitive avec la naloxone tritiée sur des récepteurs d'opiacés à partir de cerveau de rats) 26 sur 27

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Découverte de 2 molécules : -

Péricin  : jamais décrite, mais elle a une activité 3 fois plus importante que la codéine Péricalcine

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