Bioseguridad en El Laboratorio de Micología

 

Normas de seguridad

Núria Borrell Xavier Mesquida Pedro Alomar 

17.1. Introducción

   6      0    5    0    3      7    0    6      4    8   :    N    B    S    I     a    í   g   o    l   o   c    i    M   e    d   a   n   a   c    i   r   e   m   a   o   r   e    b    I   a    t   s    i   v   e    R    1    0    0    2    ©

El nivel de bioseguridad laboral sigue siendo una área de especial interés para el personal que tra bajaa en un lab ora  baj orator torio io de Mic rob iol ogía ogí a clí clínic nic a. El manejo y procesado de las muestras clínicas implica el aislamiento de un gran número de agentes infecciosos, muchos de los cuales, sobre todo los hongos, tienen gran facilidad para formar una sus pensión aérea a partir del medio de cultivo. En la naturaleza, la mayoría de los hongos filamentosos desarrollan estructuras que se dispersan en el aire (conidios, cuerpos fructíferos aéreos o artroconidias) y pueden permanecer en el ambiente durante  perí odos pro prolong long ados de tiem po, res resist istiend iendo o a la desecación. Entre las infecciones adquiridas en el laboratorio la infección fúngica representa el 9%, en su mayoría debida a hongos dimórficos [1]. Porcentaje no despreciable teniendo en cuenta la baja frecuencia de aislamiento de estos microorganismos. Además de estas, otras muchas infecciones fúngicas  pueden ser adquiridas en el laboratorio, constituyendo un riesgo ocupacional bien reconocido para los micólogos [2]. Sin embargo, el riesgo de adquisición de infección en los laboratorios puede verse minimizado con el empleo de un conjunto de normas de seguridad, basadas tanto en el método de procesamiento de la muestra como en el uso de un equipamiento de  protección personal. La ruta de transmisión es uno de los elementos más fáciles de considerar a la hora de establecer  unas normas de bioseguridad. La vía respiratoria y el contacto directo con piel y mucosas son las vías más comunes para la infección fúngica en el laboratorio.

17.2. Principios básicos de la segu seguridad ridad bioló biológica gica

17.2.1. Clasificación de los agentes biológicos por su grupo de riesgo

El determinante más importante en el riesgo  biológico es la patogenicidad del microorganismo microorganismo.. Cada agente infeccioso tiene asignado un grupo de riesgo en función de su virulencia (historia de infección adquirida en la comunidad), su potencial epidémico, la dosis requerida para iniciar la infección (dosis infectiva), la ruta de infección o de transmisión (tanto en el laboratorio como en la comunidad), el espectro de huéspedes susceptibles incluyendo los reservorios animales y sus vectores, la viabilidad del agente infeccioso en el entorno del laboratorio y la existencia de tratamiento [3]. Se define como agente biológico de: Grup Grupo o 1: Aquel que resulta poco proba probable ble que cause una enfermedad en el hombre. Grupo 2: Aquel q que ue puede puede causar causar una en enfermed fermedad  ad  en el hombre y puede suponer un peligro  para los trabajadores, siendo s iendo poco proba ble que se propague propag ue a la colectividad colect ividad y existiendo generalmente profilaxis y tratamiento eficaz. Grupo 3: Aquel q que ue puede puede causar causar una en enfermed fermedad  ad  en el hombre y puede suponer un peligro  para los trabajadores trabajadores,, con riesgo de que se propague a la colectividad y existiendo generalmente profilaxis y tratamiento eficaz. Grupo 4: Aquel que causand causando o enfe enfermedad rmedad grave en el hombre supone un serio peligro para los trabajadores, con muchas probabilidades que se propague a la comunidad y sin que exista generalmente una profilaxis y un tratamiento eficaz. En la Tabla 17.1 se presenta una lista de distintos hongos, clasificados en función de su riesgo de infección y su capacidad alérgica, según la normativa española 664/1997 [4]. vigente, descrita en el Real Decreto

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Tabla 17.1. Clasificación de los hongos en grupos de riesgo según el Real Decreto 664/1997 [4]. Hongo

Grupo

 Aspergillus fumigatus fumigatus Blastomyces dermatitidis (Ajellomyces dermatitidis) Candida albicans Cladophialophora bantiana (Xylohypha bantiana, Cladosporium bantianum o trichoides) Candida tropicalis Coccidioides immitis Cryptococcus neoformans var. neoformans (Filobasidiella neoformans var. neoformans) Cryptococcus neoformans var. gattii (Filobasidiella bacillispora) Emmonsia parva var. parva Emmonsia parva var. crescens Epydermophyton floccosum Fonsecaea compacta Fonsecaea pedrosoi  Histoplasma capsulatum var. capsulatum (Ajellomyces capsulatus) Histoplasma capsulatum var. duboisii  Madurella grisea Madurella mycetomatis Microsporum spp. Neotestudina rosatii  Paracoccidioides Paracoccidioi des brasiliensis

2 3 2 3 2 3 2 2 2 2 2 2 2 3 3 2 2 2 2 3

Penicillium marneffei  Scedosporium apiospermum (Pseudallescheria boidii) Scedosporium prolificans (inflatum) Sporothrix schenckii  Trichophyton rubrum Trichophyton spp.

2 2 2 2 2 2

a

a

a a a

a

a

a

a: Posibles efectos alérgicos

17.2.2. Niveles de contención

La seguridad biológica se fundamenta en tres elementos: las técnicas de laboratorio, el equipo de seguridad o barreras primarias y el diseño de la instalación o barreras secundarias [3]. El término “contención” se emplea para describir los métodos que hacen seguro el manejo de materiales infecciosos en el laboratorio, para reducir 

al mínimo la exposición del personal. Se suelen describir cuatro niveles de contención o seguridad biológica, que consiste en la combinación, en menor y mayor grado, de los tres elementos de seguridad   biológica descritos (técnicas de laboratorio, barreras  primarias y barreras secundarias secundarias). ). En el caso concreto del área de Micología las medidas descritas  paraa niv el de con ten ció n 2 son las adecua  par ade cua das das,, a excepción de aquellos casos en que se conozca la identidad de la cepa fúngica y se corresponda con un hongo dimórfico ( Bl asto as to myc es de derm rm at atit it id idis is,, Coccidioides immitis, Histoplasma capsulatum,  Paracoccidioides  Paracoccidi oides brasiliensis brasilie nsis)) o con Cladophialo phora bantiana que requerirían nivel de contención 3 (Tabla 17.1). 17.1). Todas ellas son las que se describen

 © 2   0   0  1  R  e v   s  i    t    a I    b   e r   o  a m  e r  i    c   a n  a  d   e M i    c   o l    o  g í    a I    S  B  N :   8  4   6   0  7   3   0   5   0   6 

 

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en los siguientes Apartados.

17.3. Normas generales de seguridad biológica

   6      0    5    0    3      7    0    6      4    8   :    N    B    S    I     a    í   g   o    l   o   c    i    M   e    d   a   n   a   c    i   r   e   m   a   o   r   e    b    I   a    t   s    i   v   e    R    1    0    0    2    ©

En nuestro país, la protección de los trabajadores frente a los riesgos relacionados con la exposición a agentes biológicos está regulada por el Real Decreto (RD) 664/97 y la adaptación contenida en la Orden de 25 de marzo de 1998 [4]. Según este decreto el responsable inmediato de la Seguridad y las Condiciones de Trabajo en el Laboratorio es el  jefe del laborato labo rato rio rio.. Debe supervi sup ervi sar y mant ener  actualizado el Manual de Seguridad propio que debe ser entregado a todos los trabajadores del laboratorio. Las normas generales son comunes para las distintas áreas del laboratorio con nivel de contención 2 y de obligado cumplimiento en cualquiera de ellas [3].

Figura 17.1. Señal de peligro biológico.

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17.3.1. Medidas generales

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El acceso al laboratorio está limitado a personal autorizado. El personal del laboratorio debe implicarse en el cumplimiento de las normas de seguridad. Las puertas de acceso al laboratorio y al área de Micología debe estar debidamente marcada con la señalización internacional de riesgo biológico (Figura 17.1) y su nivel de contención biológica, que encon el caso del 2área de Micología  ponde el nivel (NST2). T ambién se También se corresseñalizarán los congeladores y refrigeradores utilizados para guardar microorganismos de riesgo de tipo 2. Las puertas y ventanas deben permanecer cerradas para mantener la adecuada contención biológica. El laboratorio estará separado del pasillo de circulación por un vestíbulo. El laboratorio debe ser aireado regularmente. El aporte de de aire nuevo nuevo será ccomo omo míni mínimo mo de 60 m3 por persona y hora. Todas las superficies de trabajo se limpiarán y desinfectarán diariamente y siempre que se produzca un derrame. Los residuos y muestras peligrosas que van a ser incinerados fuera del laboratorio deben ser transportados en contenedores cerrados, resistentes e impermeables, impermeables, siguiendo las normas específicas para cada tipo de residuo (ver más adelante). El área del laboratorio debe permanecer limpia y

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ordenada. La Unidad deberá disponer de un lavabo para el lavado de las manos que funcionará presionando con el codo o con el pie. El transporte de muestras dentro o entre laboratorios se realizará de tal manera, que en caso de caída, no se produzcan salpicaduras. Lo recomendable es hacerlo en cajas herméticas o neveras transportables. Estas deberán ser rígidas y resistentes a los golpes, disponer de materiales absorbentes en su interior y de fácil desinfección. Deberán estar rotuladas de forma oportuna y no podrán utilizarse para otros fines. Bajo ningún concepto se transportarán muestras en mano. Todo el personal debe poner especial cuidado en evitar el contacto de la piel con materiales  pote  po tenc ncia ialm lm en ente te in infe fecc ccio io sos. so s. Para Pa ra el ello lo de debe ben n usarse guantes cuando se manipulen muestras o cultivos que contengan posibles patógenos fúngicos. Los guantes siempre serán desechados antes de salir del área de trabajo. Jamás se saldrá de la misma con los guantes puestos, ni se cogerá con ellos el teléfono, las peticiones, etc. Inmediatamente después de quitarse los guantes, se realizará un lavado de manos. Se usarán gafas protectoras y mascarillas faciales si existe riesgo de salpicaduras o aerosoles. Los derrames y accidentes serán informados inmediatamente al supervisor o jefe del laboratorio y se harán constar por escrito. Está rigurosamente prohibido pipetear con la  boca. En la zona de trabajo no debe colocarse material de escritorio ni libros ya que el papel contaminado es de muy difícil esterilización. Es necesario disponer de autoclave. Las centrífugas deben ser de cierre hermético

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(sistema aerosol free) free) y con tubos de seguridad.

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17.3.2. Higiene

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El personal con el cabello largo debe llevarlo recogido. Comer, beber, fumar y aplicarse cosméticos está formalmente prohibido en el área de trabajo del laboratorio, así como el almacenamiento de comida o bebida. El personal debe lavarse las manos frecuentemente durante las actividades rutinarias, tras acabar la jornada laboral y siempre antes de abandonar el laboratorio. Se utilizará jabón antiséptico y el secado se realizará con papel. Las heridas y cortes en las manos, si se producen el laboratorio, se comunicarán al responsable de la Sección así como al supervisor, que lo registrará haciendo constar todas las circunstancias. Las heridas serán convenientemente vendadas antes de ponerse los guantes.

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17.3.3. Objetos punzantes y cortantes

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Las agujas, jeringas y bisturíes, deben ser desechados exclusivamente en contenedores especiales diseñados para este propósito. •

17.4. Técnicas de laboratorio en el ár área ea de de Micol Micolog ogía ía

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Todos los cultivos de hongos (especialmente los hongos con micelio aéreo) y muestras clínicas serán manejadas en una cabina de bioseguridad  de clase II, para evitar la contaminación del laboratorio laboratori o y del personal. Es permisible el manejo de cultivos de levaduras en la mesa de trabajo del laboratorio aunque siempre tratados como material infeccioso. Las placas con medios de cultivo para hongos deben ser selladas, para evitar su apertura accidental mediante cinta adhesiva permeable al oxígeno que no pierda esta propiedad en una estufa de incubación con ambiente húmedo (Scotch  Nº 483). En caso de utilización de medios de cultivo en tubo, estos deberán disponer de tapón de rosca de seguridad.

En ambos casos su apertura sólo deberá hacerse en cabina de bioseguridad de clase II. En el caso de trabajar con aislamientos fúngicos dimórficos conocidos, las precauciones a seguir  son sencillas si se dispone de condiciones de nivel de contención 3. En su defecto, sellar las  placas con cinta adhesiva y reservar su apertura sólo en cabina de bioseguridad de clase II. No hacer preparaciones con cinta adhesiva para su observación microscópica, ni cultivos en porta. Lo aconsejable en este caso es separar una porción de la colonia, para su montaje en porta, en la cabina de bioseguridad de clase II. En ningún caso debe descartarse la posibilidad  que se trate de un hongo dimórfico sistémico. Por ejemplo, Coccidioides immitis es a menudo considerado hongo de crecimiento rápido no  productor de una masa micelial pigmentada; sin embargo, en algunos casos puede producir una  pigmentación  pigment ación rosada o verdos verdosa. a. Sus artroconiartroco nidias pueden estar ausentes en su crecimiento en ciertos medios de cultivo, como en aquellos que contienen cicloheximida, pero sí están presentes en otro tipo de medios de cultivo. Por otro lado, la ausencia de macroconidias características de Histoplasma de  Histoplasma capsulatum, capsulatum, tam poco debe descartar la posibilidad que se trate de este tipo de hongo, dado que pueden ser de aparición tardía (además, se cree que probablemente son las microconidias las responsables de la infección infec ción por transmisión transmisión aérea). aérea). Todo crecicrecimiento de hongo filamentoso en medio con cicloheximida con hifas estériles, especialmente si son cortas, debe ser considerado con alta capacidad infectiva hasta que no se demuestre lo contrario. El mayor problema de seguridad en el laboratorio al trabajar con hongos dimórficos no lo constituye el área de Micología, donde probablemente se trabaja siguiendo una pautas de bioseguridad adecuadas, sino las otras áreas del laboratorio se procesará misma  para estudiodonde bacteriológico. En la este casomuestra pueden seguirse dos tipos de conductas: a)Cualquier medio de cultivo que deba incubarse más de tres días debe ser sellado y no abierto sin antes inspeccionar inspeccionar la presencia de formas miceliares.  b)Ante la apertura de forma accidental de cualquier placa con la presencia de un hongo filamentoso, esta debe ser rápidamente cerrada y manipulada en una campana de bioseguridad   para su examen microscópico. La presencia o ausencia de estructuras conidiales en el momento de la exposición debe ser tenida en cuenta para poder tomar medidas médicas sobre el incidente.

El transporte de este tipo de hongos dimórficos sistémicos debe realizarse bajo las condiciones estrictas descritas para los mismos (ver más adelante), ya que los conidios infecciosos pueden formarse

 © 2   0   0  1  R  e v   s  i    t    a I    b   e r   o  a m  e r  i    c   a n  a  d   e M i    c   o l    o  g í    a I    S  B  N :   8  4   6   0  7   3   0   5   0   6 

 

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durante su transporte y constituir un riesgo para quien lo transporta o recibe el aislamiento. •

Existen microorganismos que, a pesar de ser  dimórficos, no suelen constituir un riesgo infeccioso por medio de aerosoles como es el caso de Sporothrix schenckii schenckii; ; sin embargo, es un patógeno potencial tras inoculación subcutánea o en contacto con mucosa ocular. En este caso concreto, al no constituir un riesgo infeccioso por  vía aérea, podría ser procesado en un nivel de contención 2.

También se ha sugerido que los hongos dematiáceos pueden constituir riesgo de infección  por vía respir respiratoria atoria en su forma micelial, dada su capacidad infectiva, en pacientes inmunodeprimidos tras contacto con los mismos en la naturaleza.

   6      0    5    0    3      7    0    6      4    8   :    N    B    S    I     a    í   g   o    l   o   c    i    M   e    d   a   n   a   c    i   r   e   m   a   o   r   e    b    I   a    t   s    i   v   e    R    1    0    0    2    ©

A pesar de que la mayoría de los restantes hongos oportunistas y saprofitos, no parecen constituir un riesgo de infección para el personal de laboratorio inmunocompetente, la dispersión de las conidias en el laboratorio puede producir reacciones de tipo alérgico, así como contaminación de los medios de cultivo. Por tanto para proteger al traba jado  ja dorr co como mo al re rest st o del de l trab tr abaj ajo o del de l labo la borat rat orio or io,, deben evitarse grandes exposiciones al ambiente, abriendo tan sólo los medios de cultivo positivos en cabinas de bioseguridad clase II. •

El vertido de todo material infeccioso debe realizarse en recipientes identificados como contenedores de material infeccioso, para que puedan ser decontaminados apropiadamente.

17.5. Medidas de barrera primaria

Están constituidas por los equipos de protección personal y las cabinas de seguridad biológica [3].

17.5.1. Equipos o prendas de prot protecci ección ón pers persona onall A todo el personal que trabaje en una Unidad  de Micología se aconseja respete las siguientes recomendaciones:

17.5.2. Cabinas de seguridad biológica

Son cámaras de circulación forzada que, según sus especificaciones y diseño, proporcionan diferentes niveles de protección. Es necesario distinguir entre las campanas de extracción de gases, las cabinas de flujo laminar y las cabinas de seguridad   biológica. La campana de gases o vitrina extractora de gases es un recinto ventilado que captura los humos y vapores procedentes de las manipulaciones de los  product  pro duct os químico quí mico s empl eado s en el labo rato rio rio.. Si bien constituye un equipo muy útil en la contención de riesgo químico, no ofrece protección alguna frente a riesgos biológicos. Las cabinas de flujo laminar son recintos que emplean un ventilador para forzar el paso de aire a través de un filtro HEPA ( High Effi ciency cien cy  Particulate Air )puede barriendo la superficie de trabajo. El flujo de aire ser vertical u horizontal. Estas cabinas ofrecen protección únicamente al material que se maneja en su interior, pero nunca al operador   por lo que no son recomendables para el trabajo con material biológico. Sin embargo, es un instrumento

Recomendaciones para la protección del personal de laboratorio:

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No se recomienda el uso de lentillas durante el trabajo en el laboratorio. Los guantes constituyen la medida de barrera más empleada para la protección de manos: - Las manos deben lavar lavarse se obligat obligatoriamente oriamente al quitarse llos os guantes. - Sólo deben emplearse para protección protección contra riesgos riesgos biológicos y físic físicos os (calor o frío), pero no par para a otras tareas (manejar volantes, teléfono, abrir puertas, etc.). La mascarilla sólo tiene utilidad para protección frente a polvo (partículas), aerosoles, aerosoles, gases y vapores químicos. La bata o pijama como vestuario de protección personal: - No debe salir fuera de su su lugar de uso (cafeter (cafetería, ía, calle, etc.). etc.). - Nunca deben ser la lavados vados fuera fuera del recinto hospitalario. - No es aconsejable el empleo de ropa d de e calle que aumente la superficie c corporal orporal expues expuesta ta (pantalones cortos, cortos, sandalias, etc.).

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útil en las denominadas “zonas limpias” como pueden ser las destinadas a vertido vertido de medios de cultivo, cultivo,  preparación de reactivos que deban ser estériles, etc. Las cabinas de seguridad biológica (CSB) son recintos ventilados diseñados para limitar al máximo riesgo infecciosos. del personal del laboratorio expuesto aelagentes Especialmente porque muchas de las actividades realizadas en el laboratorio implican la formación de aerosoles. Estos equipo equiposs tiene como objetivo principal principal proporproporcionar una zona de trabajo que minimice la probabilidad que una partícula transportada por el aire tienda a escapar hacia el exterior de la cabina  pudiendo  pudien do contami contaminar nar al operario operar io y la zona que le rodea. Además, algunas de ellas, ofrecen protección al material que se manipula. Las CSB disponen de dos sistemas que impiden la salida de contaminación: las barreras de aire y los filtros. La barrera de aire se crea permitiendo que este fluya en una sola dirección y a una velocidad constante dando lugar a una verdadera “cortina” de aire, sin turbulencias, que se conoce como flujo de aire laminar. Los filtros tienenen como atrapar las partículas contenidas este finalidad  flujo de aire. Los que se emplean habitualmente son los filtros HEPA, que retiene con una eficacia del 99,9%  partículas de hasta 0,3 micras de diámetro. Existen tres tipos de CSB: Clase I, Clase II y Clase III. A continuación se describen sus principales principales características, a excepción de las de Clase III, ya que estas no son necesarias en el área de Micología.

CSB Clase I

Son cámaras cerradas con una abertura al frente para permitir el acceso de los brazos del operador. El aire penetra por este frontal, atraviesa la zona de trabajo y todo él sale al exterior a través de un filtro HEPA. La velocidad de flujo del aire es de unos 4,4 m/s. Son apropiadas para manipular agentes biológicos de los grupos 1, 2 y 3. La mayor desventaja que presentan es que no proporcionan  protección al material con el que se trabaja, no evitando que este se pueda contaminar. Por lo tanto se desaconseja su uso para el trabajo en el área de Micología. CSB Clase II

Se diferencian de las anteriores porque, además de ofrecer protección al operario y a su entorno, ofrecen protección al producto frente a la contaminación. La superficie de trabajo está bañada  por aire limpio que ha atravesado un filtro HEPA (Figura 17.2) 2).. La salida de aire se produce a través (Figura 17. de otro filtro HEPA. Son válidas para el manejo de agentes biológicos de los grupos 1, 2 y 3, entre los que incluyen los hongos y por tanto las recomendadas para el laboratorio de Micología. Existen varios tipos de cabinas de Clase II según sus características

Figura 17.2. Cabina de seguridad biológica de clase II A.

de construcción, flujo de aire y sistema de extracción. Clase II-A: Expulsa Expulsa el aire ffiltrad iltrado o al laboratori laboratorio oo  puede ser conducido fuera de él y recircula en un 70%. Clase II-B1: Expulsa el aire filtrado al exterior del laboratorio y recircula el 30%.

Instalación de la CSB:

1. Debe situar situarse se lo más más lejo lejos s posi posible ble de las las re rejill jillas as de aire acondicionado, campanas de gases, puertas y zonas de mucho tránsito de personal, que puedan interferir en el flujo laminar. 2. Las ventanas ventanas del del laborato laboratorio rio deben permanecer  permanecer  siempre cerradas. 3. Debe existi existirr al men menos os 0,3 m entre la salida salida de a aire ire de la cabina y el techo del laboratorio. 4. Se instalar instalará á sobr sobre e una superf superficie icie sóli sólida da y nunca nunca móvil. Si es posible, en un recinto cerrado de acceso restringido.

 © 2   0   0  1  R  e v   s  i    t    a I    b   e r   o  a m  e r  i    c   a n  a  d   e M i    c   o l    o  g í    a I    S  B  N :   8  4   6   0  7   3   0   5   0   6 

 

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Al iniciar el trabajo:

Al finalizar el trabajo:

1. Pone Ponerr en march marcha a la cabina cabina duran durante te 1515-30 30 min min..

1. Limp Limpiar iar el e exter xterior ior del del material material q que ue se ha haya ya con contataminado.

2. Comp Comprobar robar que el manóm manómetro etro situa situado do en la parte parte superior del frontal se estabilice e indique la presión adecuada. 3. Enc Encend ender er la lluz uz fluor fluoresc escent ente. e. 4. Limp Limpiar iar la superfici superficie e de tra trabajo bajo con con un compues compuesto to yodado como la povidona yodada (Betadine‚ Topionic‚ etc.) y enjuagar posteriormente para retirar los restos de yodo. 5. Ante Antes s y despué después s de tr trabaj abajar ar en una C CSB SB de debe be realizarse lavado de manos y brazos. 6. Se ac aconse onseja ja em emplear plear bata d de e mang manga a lar larga ga y guantes de látex para minimizar el desplazamiento de la flora bacteriana cutánea hacia el interior  del área de trabajo y proteger las manos y los brazos del operario de toda contaminación.    6      0    5    0    3      7    0    6    4      8   :    N    B    S    I     a    í   g   o    l   o   c    i    M   e    d   a   n   a   c    i   r   e   m   a   o   r   e    b    I   a    t   s    i   v   e    R    1    0    0    2    ©

2. Vaci Vaciar ar la CSB CSB por c compl ompleto eto de c cualqu ualquier ier materi material. al. 3. Limp Limpiar iar y decont decontamin aminar ar la superf superficie icie d de e trab trabajo ajo con un jabón desinfectante y después con un compuesto yodado (povidona yodada). La limpieza tiene por objeto eliminar la suciedad que se halle adherida a la superficie (que sirve de soporte a los microorganismos) y la materia orgánica, contribuyendo de forma decisiva a la eficacia de la decontaminación posterior con el yodóforo.  A fin de evitar la coloración residual de los compuestos yodóforos en las superficies, estas deben enjuagarse con agua. 4. Dejar en mar marcha cha la la CSB durante durante un tiemp tiempo o pruprudencial (10-15 min). 5. Cer Cerra rarr la aper apertur tura a front frontal. al. 6. La lu luz z ultraviol ultravioleta, eta, p presen resente te en algun algunas as CSB, CSB, tiene poco poder de penetración por lo que su capacidad decontaminante es muy limitada, además de constituir una fuente de accidentes por 

Durante la manipulación: 1. Coloc Colocar ar tod todo o el m materi aterial al a u utiliz tilizar ar en la zona zona de trabajo antes de empezar, situando el material contaminado en un extremo de la superficie de trabajo y el no contaminado en el extremo opuesto de la misma. 2. Se re recomi comienda enda traba trabajar jar a u unos nos 55-10 10 cm por por enc enciima de la superficie y alejado de los bordes de la misma, procurando no obstruir las rejillas de aire con materiales o residuos. 3. Una v e ez z el t rrabaj abaj o hay a c comenz omenzado ado y sea sea imprescindible la introducción de un nuevo material, se recomienda esperar de 5 a 10 min antes de reiniciar la tarea. Ello permite la estabilización del flujo del aire. Debe recordarse que cuanto más material se introduzca en la CSB, la probabilidad de provocar turbulencias de aire se incrementa. 4. Evit Evitar ar al má máximo ximo las las corrien corrientes tes de ai aire re ambi ambientaentales provenientes de puertas o ventanas abiertas, movimientos de personas, sistemas de ventilación del laboratorio, etc. que perturben el flujo establecido en el interior de la CSB. Así mismo, deberían evitarse movimientos bruscos dentro de la CSB, con movimientos de brazos y manos lentos para impedir la formación de corrientes de aire que alteren el flujo laminar. 5. Debe e evitar vitarse se el emple empleo o de me mecher cheros os Bu Bunsen, nsen, cuya llama crea turbulencias en el flujo, además de dañar potencialmente el filtro HEPA. Cuando se precise el empleo de asas o espátula micológica de nícrom o platino es aconsejable el incinerador eléctrico o bien el empleo de asas desechables. 6. Si se pr produc oduce e un ver vertido tido acci accident dental al de mat materia eriall biológico se recogerá inmediatamente, decontaminando la superficie de trabajo y todo el material que en ese momento exista dentro de la CSB. 7. No s se e empleará empleará nunca una C CSB SB c cuando uando esté sonando alguna de sus alarmas.

exposición, por lo que debería evitarse su empleo. 7. Nunca se de debe be ut utiliz ilizar ar la CBS c como omo a almac lmacén én transitorio de equipo o material de laboratorio para evitar el acúmulo de polvo. 8. Evit Evitar ar int introdu roducir cir en la CSB mater materiale iales s que emitan emitan partículas con facilidad, como algodón, papel, madera, cartón, lápices, etc.

Mantenimiento: 1. Sema Semanalm nalmente ente co convie nviene ne lev levantar antar la superfic superficie ie de trabajo para limpiar y decontaminar por debajo de ella. 2. Seman Semanalment almente, e, con con un paño mojado, mojado, se limpi limpiaarán todas las superficies exteriores con objeto de eliminar el polvo acumulado. 3. Mens Mensualm ualmente ente se revisará revisará e ell estado estado de la las s vál válvuvulas interiores con que vaya equipada. 4. Anua Anualment lmente e se certifi certificará cará p por or una entida entidad d cual cualifiificada. 5. Se llllevar evará á a cabo cabo una desinf desinfecci ección ón complet completa a en las siguientes situaciones: a. En caso de que s se e haya producido producido un vertido vertido importante b. Ante Antes s de cualquier cualquier repar reparación ación c. Antes de iniciar los contr controles oles periódicos periódicos d. Siempre que se cambie el el programa de trabajo e. Cuando se substituyan los filtr filtros os HEPA f. Cuand Cuando o se cambie cambie de lugar, lugar, incluso incluso s sii el cambio cambio es dentro del mismo laboratorio. 6. res La des desinfe cción n comp completa leta personal se se real realizar izará á con v vapoapode infecció formaldehído por debidamente entrenado y equipado con prendas de protección adecuadas.

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Clase II-B2: Expulsa el aire filtrado al exterior del laboratorio y no recircula. Clase II-B3: Expulsa el aire filtrado al exterior del laboratorio y recircula el 70%. Hasta el momento, no existe en España ninguna legislación relativa a los requisitos que deban cumplir las CSB. La práctica más habitual consiste en exigir a los proveedores correspondientes la declaración de conformidad, bien con la norma británica BS 3928 o con la estadounidense NSF 49. Las recomendaciones generales son las siguientes:

Tabla 17.2. Propiedades de algunos desinfectantes sobre microorganismos fúngicos [5]. Tipo de desinfectante

Grado de acción desinfectante

Fenólicos Hipocloritos  Alcoholes Formaldehídos Glutaraldehídos Yodóforos  Amonios cuaternarios cuaternarios

+++ + +++ +++ +++ +

+++ buena; ++ media; + débil; - ninguna

Mesa de trabajo o poyata de laboratorio:

•

•

La limpieza debe ser diaria al finalizar el trabajo o cuando se produzca un derramamiento. Para ello puede emplearse hipoclorito al 0,5%, que se consigue diluyendo la lejía estándar al 1% con agua.

Cabina de bioseguridad:

•

•

Debe procederse a su limpieza con compuesto detergente líquido y papel para realizar el arrastre de materia orgánica que pueda existir.  A continuación puede emplearse compuestos de yodo de alta eficacia frente a los elementos fúngicos. Dada su acción colorante y corrosiva sobre los metales, es preferible usar los derivados yodóforos como la povidona yodada (polivinil-pirrolidona) (polivinilpirrolidona) diluida al 2%, que es de acción inmediata. A los pocos minutos es recomendable enjuagar con agua para eliminar la coloración rresidual. esidual. Es preferible no uti utilizar lizar etanol al 70% para eliminar llos os restos de yodo dado que en las CSB en las que recircule el aire se desaconseja su uso por su volatilidad.

Estufas:

•

•

Se procederá a su limpieza y desinfección mediante detergente líquido y posterior aplicación de povidona yodada al 2%. En este caso, para eliminar la coloración residual del yodóforo puede emplearse etanol al 70%. En aquellos casos en que se observe un incremento de las contaminaciones en los medios de cultivo por hongos ambientales, especialmente  Aspergillus spp., puede procederse, tras la limpieza y desinfección ya comentada, a la aplicación de un compuesto fenólico en dilución acuosa a niveles de entre 400 y 1300 ppm (fenol en una dilución 1:1000). A diferencia de los compuestos yodados, este compuesto tiene un efecto residual prolongado.

Derrame accidental:

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•

•

Cubrir con un papel de filtro la zona afecta. Ello permite delimitar con claridad la extensión de superficie afecta por  el derrame. Verter encima del área afecta, con cuidado, hipoclorito a una concentración superior que la empleada para limpieza (lejía casera diluida al 1:10). Dejar actuar 20 min. También puede emplearse compuestos de yodo. Con guantes retirar los desechos en un contenedor para material infeccioso. Enjuagar para evitar coloración residual.

 © 2   0   0  1  R  e v   s  i    t    a I    b   e r   o  a m  e r  i    c   a n  a  d   e M i    c   o l    o  g í    a I    S  B  N :   8  4   6   0  7   3   0   5   0   6 

 

Normas de seguridad

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17.6. Agentes desinfectantes

En la Tabla 17.2 se describen las propiedades de algunos desinfectantes frente a los microorganismos fúngicos [5,6]. Basándose en ello, los de mayor utilidad en el área de Micología son los siguientes:

Hipoclorito sódico

Los desinfectantes que contienen hipoclorito sódico (lejía) son potentes agentes oxidantes que liberan Cl2 (gas cloro). La exposición al cloro produce irritación de mucosas incluida la del tracto res pirato  pir atorio rio sup eri erior or y piel. pie l. Debe emplear emp lear se bata bat a y guantes resistentes. Compuestos cuaternarios

17.7. Normas de protección frente a productos químicos    6      0    5    0    3      7    0    6    4      8   :    N    B    S    I     a    í   g   o    l   o   c    i    M   e    d   a   n   a   c    i   r   e   m   a   o   r   e    b    I   a    t   s    i   v   e    R    1    0    0    2    ©

Incorporados a múltiples soluciones desinfectantes, son generalmente menos cáusticos que otros desinfectantes. Sin embargo, debe tenerse cuidado con su manipulación ya que es conocida su capacidad para irritar la piel y producir alergias.

Una forma rápida y fiable para identificar el riesgo de una sustancia o preparado químico es su

Formaldehído y glutaraldehído

etiqueta. En ella, el fabricante o proveedor, de acuerdo con la legislación existente, debe identificar  las sustancias peligrosas que lo componen e informar de los riesgos (frases R) y los consejos de prudencia (frases S). Además, junto al producto, debe adjuntarse la ficha de datos de seguridad en la que se amplía la información y se detallan los riesgos de su utilización y las medidas de seguridad a adoptar  [7].

Son puede compuestos altamente tóxicos. El formaldehído estar presente en el laboratorio en forma gaseosa, líquida (solución de formalina) o sólida (paraformaldehído). Puede producir, tras exposición aguda, irritaciones oculares y del tracto respiratorio superior; y tras exposición crónica, dermatitis, alergias cutáneas y respiratorias. Se sospecha además de su poder carcinogénico en humanos. Ambos compuestos deben ser sólo manipulados en campana de gases y con protectores de ojos impermeables.

La exposición a los compuestos químicos  puede producir efectos agudos o crónicos y la aparición de enfermedades. Estos efectos son función directa de la toxicidad del agente químico, la dosis absorbida y la vía de entrada al organismo: por  inhalación, dérmica (mucosas y piel intacta), digestiva o percutánea. El correcto almacenamiento de los compuestos químicos constituye la primera medida de actuación, separando aquellas familias de productos incompatibles. Se separarán ácidos de bases, oxidantes de inflamables, sustancias cancerígenas, etc. Los envases más pesados así como los ácidos y las  bases fuertes se colocarán en los estantes inferiores. Los productos peroxidables (éter etílico, éter isopro pílico, etc.) pueden pr provocar ovocar detonaciones por contacto con el aire o incluso por choque o fricción, por  ello no es aconsejable almacenarlos una vez abiertos más de 6 meses, a no ser que contengan un inhibidor eficaz. Entre los compuestos más empleados en el área de Micología figuran:

17.7.1. Agentes desinfectantes

17.7.2. Colorantes Son utilizados en la mayoría de casos en cantidades muy pequeñas. Sin embargo, deben tomarse  precauciones para evitar su exposición especialmente a los derivados de la acridina, como el naranja de acridina, que son carcinogénicos. El bromuro de etidio es un poderoso mutágeno de efecto acumulativo utilizado en técnicas de biología molecular. Debe evitarse estrictamente el contacto con estas sustancias mediante el empleo de guantes.

17.8. Gestión de residuos

17.8.1. Gestión de residuos infecciosos

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Normas de seguridad

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Residuos líquidos La mayoría de laboratorios someten a los residuos líquidos a un tratamiento de esterilización  por autoclave.

Residuos sólidos Sus formas más frecuentes de tratamiento son la incineración y la esterilización por autoclave. En el primer caso deben depositarse en recipientes rígidos que serán transportados de forma regulada  por empresas autorizadas para su incineración. Sin embargo, la esterilización por autoclave es la manera más común de tratar este tipo de residuos en el  propio laboratorio. Debe tenerse en cuenta que los  programas  progr amas para materiales materi ales limpios limpio s no sirve sirven n para los desechos, siendo recomendable prolongar el tiempo y aumentar la presión del proceso de autoclavado en estos casos. La utilización de indicadores químicos y biológicos (suspensiones de esporas de  Bacillus) no es suficiente para el control de la eficacia del proceso. Algunos autores recomiendan no utilizarlas para evitar una falsa seguridad. Alternativamente, consideran más apropiado el control riguroso sistemático de cada proceso (registro de presión y temperatura) y un mantenimiento apro piado del autoclave.

Objetos punzantes y cortantes Dado que constituyen un claro riesgo de inoculación accidental deben depositarse en recipientes específicos que sean resistentes a la punción y con cierre seguro. Una vez llenos, se depositan en los recipientes rígidos utilizados para los residuos sólidos.

17.8.2. Gestión de residuos químicos Ante todo se debería disponer de una lista que identificara todos aquellos residuos peligrosos que sean susceptibles de atención, incluidos aquellos que formen parte de reactivos comerciales. En general general pueden elimi eliminarse narse despu después és de un sencillo tratamiento en el propio laboratorio. Cuando no es posible debe consultarse a las autoridades locales  para su vertido controlado. Se recomienda disponer  de material absorbente inerte específico para productos químicos. En algunos casos concretos se procederá de la manera siguiente:

Ácidos inorgánicos Salvo roturas accidentales, no suele ser frecuente tener que eliminar ácidos concentrados (HCl,

HNO3, H2SO4, etc.), aunque sí soluciones diluidas de los mismos. Como norma general no debe eliminarse directamente aquellas soluciones cuya concentración sea superior a 1N. Los ácidos más concentrados se diluyen en agua al 1:5 (especial  precaución con el ácido sulfúrico), se neutralizan a  pH 6,8 con sol uci ones one s de hid róx ido sód ico y se vuelven a diluir al 1:10 en agua para poder ser eliminados por el desagüe. Las soluciones más diluidas se neutralizan con sosa y se diluyen en agua antes de eliminarse.

Bases inorgánicas, sales básicas y diluciones diluc iones básicas básicas Su gestión es parecida a la aplicada en los ácidos. Las bases y sales básicas se neutralizan con ácido sulfúrico diluido. Si son muy concentradas, se diluyen previamente en agua al 1:5. Una vez neutralizadas, se vuelven a diluir en agua (1:10) y se eliminan.

Fenoles El fenol y sus derivados son irritantes y tóxicos. No deben eliminarse a través de los desagües, ni tan siquiera diluidos. El procesamiento de destrucción química no está al alcance de la mayoría de laboratorios. Lo más aconsejable es separarlos en recipientes específicos y transferirlos a un gestor  autorizado de residuos.

Azida sódica Está presente en muchos reactivos comerciales como conservante. Nunca debe eliminarse directamente por desagües de plomo dado que forma derivados altamente explosivos. Es un tóxico muy  potente y agente mutágeno. Es conveniente contactar con las autoridades locales autorizadas para conocer las normas específicas, ya que la destrucción química con nitrito sódico no resulta práctica en la mayoría de laboratorios.

Aldehídos, cetonas y disolventes orgánicos El formaldehído es el residuo generado en el laboratorio más común dentro de este grupo. No debe ser eliminado directamente por el desagüe. Conviene almacenarlo en recipientes seguros para  poderlo eliminar de manera controlada. La L a destrucción con permanganato potásico es compleja. La eliminación controlada también es aconsejable para los diversos disolventes orgánicos (acetona,etc.). cloroformo, xileno y otros derivados bencénicos,

 © 2   0   0  1  R  e v   s  i    t    a I    b   e r   o  a m  e r  i    c   a n  a  d   e M i    c   o l    o  g í    a I    S  B  N :   8  4   6   0  7   3   0   5   0   6 

 

Normas de seguridad

Bromuro de etidio

Es un mutágeno poderoso de efecto acumulativo utilizado en técnicas de biología molecular. Deben seguirse de forma estricta los procedimientos de manipulación que eviten su contacto (guantes, etc.). geles teñidos de etidio no debenLos eliminarse como con una bromuro basura convencional, sino a través de los sistemas de eliminación de mutágenos y citostáticos propios del centro hospitalario. Las soluciones tampón de electroforesis que contienen bromuro de etidio tampoco deben eliminarse por los desagües. Deberían tratarse con carbón activo (100 mg por cada 100 ml de solución), filtrar  la solución formada a través de un filtro de papel y depositarlo todo en el cubo de eliminación de citostáticos. Las superficies pueden decontaminarse aplicando una papilla de carbón activo que se dejará actuar durante un tiempo, depositándose posteriormente en el cubo de eliminación de citostáticos.    6      0    5    0    3      7    0    6    4      8   :    N    B    S    I     a    í   g   o    l   o   c    i    M   e    d   a   n   a   c    i   r   e   m   a   o   r   e    b    I   a    t   s    i   v   e    R    1    0    0    2    ©

los desagües. Se recomienda efectuar las tinciones en cubetas que drenen sobre botellas o bidones que se entregarán, una vez llenos, al gestor de residuos autorizado. Estas medidas deben ser seguidas de manera rigurosa en el caso de la tinción de auramina. El naranja de acridina es también un compuesto mutágeno, por lo que se recomienda almacenarlo en recipientes separados.

Metales pesados, mercurio y compuestos organomercuriales

La rotura de termómetros y manómetros  puede ser una causa de exposición al mercurio. Se recomienda recoger los restos más visibles y depositarlos en un recipiente cerrado. Los menos visibles  pueden recogerse con ayuda de polvo absorbente o azufre y guardar el conjunto en otro envase. Los residuos deben ser almacenados y eliminados de forma controlada.

Colorantes

Recomendaciones para la manipulación de residuos:

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•

17.9. Normas de seguridad en el almacenamient cena miento, o, transporte transporte y envío de material biológico

Los recipientes para desechar los residuos de riesgo en el área de trabajo deben ser rígidos, de volumen inferior a 60 l, impermeables y resistentes a ácidos y álcalis, álcalis, de cierre herméti hermético co y homologados para ser incinerados. El almacenamiento y transporte deberá hacerse en condiciones seguras. Deben existir zonas acotadas para su almacenamiento intermedio especialmente si los residuos son de riesgo, no superando en ningún caso las 24 h una vez se ha cerrado.

17.9.1. Almacenamiento

El material infeccioso debe almacenarse en zonas de acceso restringido para minimizar la posi bilidad de contaminación del personal y del ambiente.

Para los residuos no específicos se utilizarán bolsas de color diferenciadas. En el caso de objetos cortantes o punzantes deberán utilizarse recipientes rígidos resistentes a la perforación cuyo volumen no supere los 2 l.

 No deberían ser eliminados directamente por 

El sistema básico de embalaje estará compuesto por:

1. Recipie Recipiente nte primari primario o a prueba de filtracio filtraciones, nes, etiquetado, que contenga la muestra. El recipiente debe envolverse con material absorbente. 2. Recipi Recipiente ente s secunda ecundario rio a prueba prueba de filtraciones filtraciones,, que encierra y protege el recipiente primario. En él se pueden colocar varios recipientes primarios, colocando suficiente material absorbente para evitar choques entre ellos. Los formularios, cartas y otras informaciones de identificación de la muestra deben colocarse pegados con cinta adhesiva en el exterior de este recipiente. 3. Reci Recipien piente te extern externo o de envío envío donde donde se coloca coloca el recipiente secundario para protegerlo de elementos externos como daño físico y agua.

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17-11

 

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Normas de seguridad

17.9.2. Transporte y envío

 No existen regulaciones ni recomendaciones específicas para el transporte seguro de microorganismos patógenos. Sin embargo, si ampliamos la definición y los consideramos como “sustancias infecciosas”, hay varios documentos internacionales

relacionados con el tema, como los de la Unión Postal Universal (UPU), la Organización Internacional de Aviación (OIAC) y la Asociación Internacional de Transporte Aéreo (IATA). Estas directivas y, en general, todos los documentos internacionales relacionados están  basadoss en texto único común: Recomendacion  basado Recomen daciones es del Comité de Expertos de las Naciones Unidas para el transporte de artículos peligrosos. Estas recomendaciones clasifican las mercancías infecciosas en varias clases, dos de las cuales están relacionadas con los microorganismos  patógenos: clase 6.2 (sustancias infecciosas) y clase 9 (sustancias peligrosas misceláneas y artículos). Los embalajes para transporte aéreo (Figuraa 17. (Figur 17.3) 3) presentan  presentan algunas diferencias respecto 17.4),, ya a los transportados por vía terrestre (Figura 17.4) que deben asegurar la protección frente a presiones muy altas (Carburos Metálicos, Embalajes y Mercancias Peligrosas, Esdesla, Sarstedt). En los vuelos internacionales está estrictamente prohibido que los pasajeros transporten sustancias infecciosas.

Figura 17.3. Sistema de embalaje para transporte aéreo de material biológico.

17.10. Normas de seguridad en caso de accid accidente ente

17.10.1. Riesgos no biológicos

Químicos

Figura 17.4. Sistema de embalaje para transporte terrestre de material biológico.

Pueden deberse a inhalación accidental por  no usar cámara de gases, a deglución por pipetear  indebidamente o por contacto (salpicaduras de ácidos, álcalis, sustancias tóxicas o cancerígenas). En este último caso la ducha de seguridad puede ser  de ayuda y, en cualquier caso, se debe acudir al Servicio de Urgencias. Resulta de gran utilidad consultar la ficha de seguridad del producto causante del accidente y las notas técnicas que se encuentran disponibles en las páginas web del Ministerio de Trabajo y Asuntos Sociales [7,8].

Físicos, eléctricos y fuego

Los accidentes físicos más frecuentes son las heridas causadas por objetos punzantes o cortantes y las quemaduras por vapor de autoclave. En los casos que no puedan solucionarse con las medidas de primeros auxilios se acudirá al Servicio de Urgencias. En los accidentes eléctricos jamás se intentará apartar al afectado de la fuente eléctrica con

 © 2   0   0  1  R  e v   s  i    t    a I    b   e r   o  a m  e r  i    c   a n  a  d   e M i    c   o l    o  g í    a I    S  B  N :   8  4   6   0  7   3   0   5   0   6 

 

Normas de seguridad

las manos, sino sino a través de un objeto objeto no conduc conductor, tor,  pro cedi end endo o previa pre viamen mente te al cor corte te del sum inistr ini str o eléctrico.

17-13

su sofocación sin extintor, dado que la salida de CO2 a alta presión puede producir salpicaduras del líquido inflamable que está ardiendo.

En caso de fuego su extinción se llevará acabo mediante extintores de CO2. Si se tratara de

17.10.2. Riesgos biológicos

líquidos que ardieran en su superficie, se procurará

Tabla 17.3. Infecciones fúngicas adquiridas en el laboratorio [9].

Hongo

   6      0    5    0    3      7    0    6    4      8   :    N    B    S    I     a    í   g   o    l   o   c    i    M   e    d   a   n   a   c    i   r   e   m   a   o   r   e    b    I   a    t   s    i   v   e    R    1    0    0    2    ©

Blastomyces dermatidis Coccidioides immitis Cryptococcus neoformans Histoplasma capsulatum Penicillium marneffei 

Inhalación

Inoculación transcutánea

X X

X X X X X

X X

Sporothrix D ermatofitoschenckii  s

X

Piel

Conjuntiva

Contacto con animal infectado

X

X

X

Referencias 1.

2. 3.

4.

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