BIOP Desarrollo Inoculo y Cultivo Por Lote (2) (1)

PROFESOR: AUGUSTO CASTILLO CALDERÓN

INTEGRANTES Burgos Ramirez Jamir Chumpitaz Ayala Lizardo Gamarra Corman Jairo Guillen Vega Maximo Polo Laguna Jason  VIII CICLO

DESARROLLO DEL INÓCULO Y CULTIVO POR LOTES UNIVERSIDAD NACIONAL DEL SANTA E.A.P. INGENIERIA INGENIERIA AGROINDUSTRIAL AGROINDUSTRIAL

DESARROLLO DEL INOCULO Y CULTIVO CELULAR POR LOTES OBJETIVOS: 1.1. 

Objetivos Generales: Diseñar y realizar una experiencia de cultivo celular por lotes en matraces empleando una cepa de Saccharomycescerevisiae  ATCC 4126, evaluándose evaluándose el efecto de la razón razón de S0/X0 S0/X0 en la la cinética de crecimiento microbiano.

1.2.

 

Objetivos Específicos:

Diseñar y preparar el medio de cultivo.  Activación celular y desarrollo desarrollo del inóculo



Determinar la cinética de crecimiento de la biomasa.



Determinar de la cinética de consumo de la fuente de carbono.



Determinar la cinética de producción de Etanol.



Determinación del

  M 

y los rendimientos del nutriente limitante en

células y en etanol además de las respectivas productividades en células y en etanol.

METODOLOGIA EXPERIMENTAL  Antes de comenzar a trabajar el desarrollo experimental del cultivo del microorganismo, es importante siempre recalcar, cuál será la metodología experimental a utilizar, a fin de evitar problemas y/o errores experimentales, los mismos que podrían darse en: las técnicas asépticas, en la obtención de cultivos puros, en la preparación de los medios de cultivo, en las tomas de muestra, en el crecimiento crecimiento del microorganismos microorganismos y entre otros factores.

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Es necesario recordar que, cualquier medio de cultivo de levaduras debe proporcionar los requerimientos nutritivos básicos, que incluyen los siguientes: una fuente de carbono, agua, una fuente de nitrógeno, una fuente de fósforo, una fuente de azufre, y varios minerales, como el hierro y el magnesio. A este tipo de medio de cultivo se llama definido o sintético, porque se conoce exactamente su composición química. Sin embargo en el trabajo laboratorial rutinario, a menudo se emplean también medios complejos.  Por ejemplo, el extracto de levaduras y las peptonas (proteínas hidrolizadas).

Estos

materiales proporcionan una gran variedad de fuentes de carbono; nitrógeno, fosforo y azufre en forma de péptidos y aminoácidos; y una mezcla de cofactores, como por ejemplo las vitaminas. Un caldo de cultivo es un medio líquido en el que los componentes se disuelven simplemente en agua destilada. La adición de agar (un carbohidrato complejo extraído de algas marinas da lugar a un medio sólido. El agar es un agente solidificante ideal para los medios microbiológicos por sus propiedades reológicas y porque no posee ningún valor nutritivo para la inmensa mayoría de bacterias y hongos. El agar solido funde a 90  – 100°C, y se solidifica a unos 42°C.

DISEÑO DE MEDIOS DE CULTIVO  A la hora de diseñar un medio de cultivo no sólo hay que tener en cuenta los nutrientes sino también las condiciones físicas que permitan el crecimiento de los microorganismos, asimismo nos interesa cuanto de biomasa se desea producir.

-



Estado: Medio líquido



Volumen del medio: 10 – 30 % del volumen del matraz



Temperatura: 35°C



pH: 4.2 (ajustar pH con tampón citrato)



Velocidad de agitación: 150rpm en el agitador orbital (shaker)

Se utilizará como fuente de carbono y energía: 

“Sacarosa”

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 

http://es.scribd.com/doc/20375393/30/Requerimientosnutricionales

 

http://html.rincondelvago.com/fermentacion.html

COMPOSICIÓN DE MEDIOS DE MANTENCIÓN, ACTIVACIÓN Y CULTIVO PARA Saccharomycescerevisiae ATCC 4126PARA LA PRODUCCIÓN DE ETANOL



Medio Sólido de Mantención (YM sólido): Se calcularon

los

compuestos para el medio

Al 20% de 250 ml Tabla 01: Concentración de Nutrientes para el medio de mantención (50 mL)

NUTRIENTE

CONCENTRACIÓN (G/L)

PESO (G) PARA 50 ML

Extracto de Levadura

3

0.15

Peptona

5

0.25

Extracto de Malta

3

0.15

Agar

20

1.00

Glucosa

10

0.5

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

Medio de Activación: Al 20% de 150 ml Tabla 02: Concentración de Nutrientes para un medio de activación (30mL)

NUTRIENTE 

CONC ENTRA CIÓN  (g/L) 

PESO (gr.)  Para 30 ml* 

Sacarosa

10.0

0.3

Extracto de levadura

3.00

0.09

Peptona

5.0

0.15

MgSO  4 . 7H  2 O 

0.65

0.0195

Se debe tener un T optima= 35°C y 150rpm



Medio Fermentación:

Tabla 03: Concentración de Nutrientes para un medio de fermentación (Para un volumen de medio = 20% del volumen del matraz de 500ml) (Para una concentración final = 5 g/l) Tomamos los mayores valores obtenidos para cada nutriente:

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Fuente

Concentración (g/l)

Peso (g) Para 100 ml

C

10.72

1.072

Extracto de Levadura

-

1.8

0.18

(NH4)2SO4

N

0.255

0.0255

MgSO4.7H2O

Mg

0.24

0.024

KH2PO4

P

0.53

0.053

Soluciones de Sales Concentradas

-

10 ml/L

1ml/L

Nutriente C12H22O11

Se debe tener un pH optimo=4.2 (sino se debe ajustar con Tampón citrato)

Tabla N° 04: Solución de sales Nutriente

Concentración (g/l)

CaCl2.2H2O

1.12

ZnSO4.7H2O

0.11

FeSO4.7H2O

0.06

CuSO4.5H2O

0.05

CoCl2.6H2O

0.01

MoO3

0.0005

MnCl26H2O

0.027

NaCl

0.28

 .    L  .    C    Y   O    L   U    C   O    N    I    L    E   D   O    L    L   O   R   R    A    S    E   D   :

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CONDICIONES DE CULTIVO 

Temperatura: 35°C



Velocidad de Agitación: 150 rpm en shaker.



pH: 4.2 (ajustar pH con Tampón Citrato)

PREPARACION DE MEDIOS DE CULTIVO Preparación de los materiales para el medio de cultivo 1. Lavar y secar todos los materiales de vidrio a utilizar. 2. Luego colocarlos en la estufa en posición vertical los vasos precipitados, matraces y tubos de ensayo. 3. Las pipetas a utilizar deber ser puestas en la estufa previamente recubierta de papel aluminio. 4. Esterilizar a 121 °C por 15 minutos. 5. Pesar la sacarosa requerida y los demás fuentes de nutrientes. 6. En un matraz de 125ml diluir las sales con 5 ml de agua destilada. 7. En un matraz de 125 ml diluir la galactosa con 5 ml de agua destilada. 8. En un matraz de 125 ml diluir el extracto de levadura con 5 ml de agua destilada. 9. Colocar los matraces previamente recubierto con papel aluminio en la estufa. 10. Esterilizar a 121 °C por 15 minutos. 11. En un matraz de 1 L agregar las 3 disoluciones antes hechas. 12. Elaborar la curva de calibración para la determinación de azucares reductores por el método del DNS.

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Condiciones de Asepsia Cuando se trabaja con cultivos microbianos, la técnica aséptica se utiliza para prevenir la introducción de organismos adicionales al cultivo. Rotular el matraz con el nombre de la cepa, la fecha y el nombre

1.

del alumno o grupo. Encender el mechero Bunsen.

2.

  Sostener los matraces. Si los matraces tienen un tapón de

3.

algodón, sácalo un poco de manera que no esté muy apretado.   Flamear en el mechero Bunsen, el cual da un área de

4.

desinfección de 30 cm a la redonda. Retirar una tapa con el meñique, mientras sostienes los matraces.

5.

Nunca poner las tapas sobre la mesa.   Flamear la boca de ambos matraces para matar cualquier

6.

microorganismo presente en el aire y que pueda contaminar la parte superior durante las manipulaciones. Los matraces abiertos deben mantenerse en posición inclinada

7.

para que el riesgo de contaminación sea mínimo. 8.

Sembrar en el matraz estéril el inoculo.

9.

De nuevo flamea las bocas de los matraces y tápalos de nuevo.  Asegúrate de mezclar muy bien el inoculo en los matraces que contienen el caldo sembrado.  Flamea los tapones antes de que los coloques en los matraces.

10.

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CONFECCIÓN DE LOS CAPACHOS



Se corta el papel aluminio en forma cuadrada, de tal manera que pueda ser suficientemente grande como para cubrir el molde el cual se desea confeccionar.



Luego el papel aluminio que se ha cortado se coloca encima del molde y se empieza a dar forma de éste.



Luego de haberse realizado el moldeado se procede a sacar del molde.



Posteriormente de haber realizado el procedimiento anterior, ya no se puede manipular directamente, sino que debe hacerse por medio de pinzas.

CONFECCIÓN DEL TAPÓN PARA MATRACES



Para confeccionar este tapón se cortará un pedazo de gasa, el cual debe de ser doble para obtener una buena consistencia del tapón.



Luego este pedazo de seda es colocado perpendicularmente en la boca del matraz.



Después se hundirá con algodón hasta que cubra todo el cuello del matraz, pero este llenado deberá ser a presión para que no deje entrar mucho aire, sólo el necesario para el microorganismo



Luego de haber culminado se realizarán los nudos respectivos para sujetar el algodón y así impedir su caída, pero también servirá para poder manipular los matraces a través de estos nudos.

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ESTERILIZACIÓN DE PIPETAS



Se lavan las pipetas con cuidado y se dejan secar por un lapso de tiempo.



Después se colocará algodón la boquilla de la pipeta, cuidando de no presionarse mucho ya que cumplirá la función de un filtro.



Luego de haber realizado este procedimiento se agrupan las pipetas y al mismo tiempo envolverlas con papel aluminio, tratando de cubrir todas las pipetas y marcando la sección en donde está colocado el filtro de la pipeta para que así al manipularlas no se contaminen.



Se introducirán las pipetas a la estufa a 120 C por 2 horas.



Pasado este tiempo se sacarán de la estufa, pero cuidando de no desenvolver las pipetas, para evitar su contaminación.

Preparación del medio de mantención, según la tabla Nº1 para el cultivo de Saccharomycescerevisiae   ATCC 4126, para la producción de etanol. 

Se inicia teniendo en cuenta la referencia de composición de medios de cultivo de mantención para

Saccharomycescerevisiae

 ATCC 4126 

Luego de acuerdo a la tabla Nº 1 anterior se pesan las cantidades requeridas de cada compuesto, con mucho cuidado, con la ayuda de la balanza analítica.



Medir en un vaso de precipitados cierta cantidad de agua destilada para diluir todos los compuestos pesados anteriormente.



Continuar agregando agua destilada hasta llegar a los 50 ml que se requiere.



Calentar con el mechero Bunsen la mezcla disuelta en el matraz; agitando constantemente con la ayuda de una varilla de vidrio, hasta la aparición de la primera burbuja, a partir de lo cual se controla de 1 a 2 minutos. LABORATORIO DE BIOPROCESOS

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Preparar 6 tubos de ensayo con tapa, y en caliente adicionar 7ml de



la mezcla a cada tubo con la ayuda de una pipeta de 10 ml, e inmediatamente taparlos. Colocar los tubos en un vaso de precipitado, y llevarlos a la olla a



presión, previamente aflojar las tapas, para evitar el rompimiento de tubos. Calentar hasta que la temperatura alcance los 121ºC (hasta la



primera burbuja) y a partir de ello controlar de 15 a 20 minutos, finalizando la esterilización. Ajustar las tapas de los tubos estando estos aun dentro de la olla,



luego colocarlos en posición inclinada y dejarlos a temperatura ambiente.

Preparación del medio de activación, según los la tabla Nº2 para el cultivo de Saccharomycescerevisiae   ATCC 4126, para la producción de etanol. 

Pesar los componentes descritos en la tabla Nº2



Se esterilizan por separado el extracto de levadura y extracto de malta en un tubo de ensayo (hasta 5 ml con agua destilada),la glucosa en un matraz de 125 ml (con 15ml de agua destilada); esto para evitar la reacción entre estos dos componentes; y por último las sales (tabla 04) en otro tubo de ensayo (hasta 5 ml). Se completa en total un volumen de 25ml.



Esterilizar a 121ºC por 15 minutos



Previamente a la esterilización utilizar ajustar el pH a 4.2 de la solución de que contiene glucosa.



Mezclar todo en un matraz el mismo matraz de 125ml, en un ambiente aséptico (según los pasos indicados).

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Preparación del medio de fermentación, según la tabla Nº3 para el cultivo de Saccharomycescerevisiae   ATCC 4126, para la producción de etanol. Pesar los componentes descritos en la tabla Nº 3 Disolver completamente cada compuesto con agua destilada Regular el pH de la solución de sacarosa 4.2 Esterilizar las diluciones por separado. Terminada la esterilización dejar enfriar y guardar en refrigeración hasta su posterior uso.

Regulación de pH en Sustrato En los medios de cultivo es deseable mantener un pH relativamente constante durante el crecimiento microbiano, y esto se consigue mejor con el uso de sustancias reguladoras (sustancias tampón). Estas son sales de ácidos o bases débiles que toman o liberan iones hidrogeno a medida que cambia la concentración de hidrogeniones del medio, y de este modo mantienen constante la concentración de hidrogeniones. Existen cientos de sustancias tampón en potencia, pero siempre es esencial tener la seguridad de que esta sustancia no tiene un efecto directo sobre el organismo.  Aunque los microorganismos se encuentran en hábitats de un amplio margen de pH, el del interior de sus células está probablemente cerca de la neutralidad. En un ambiente ácido, el organismo puede un pH próximo al neutral o bien no permitiendo la entrada de iones H + o bien expulsándolos de modo activo tan rápidamente como entran. Probablemente la pared celular desempeña también algún papel para mantener fuera los hidrogeniones. Cada organismo tiene un margen de pH dentro del cual es posible su crecimiento, y generalmente tiene también un pH óptimo bien definido. Los mismos organismos, a través de sus actividades, alteran el valor del pH de sus ambientes.

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CULTIVO DEL MICROORGANISMO Inoculación de m.o. Su crecimiento del m.o es: Es el incremento ordenado de todos los componentes de la célula viva, arribando a la duplicación de todas las estructuras, orgánulos y componentes celulares, así como la biogénesis

de

mitocondrias

y

cromoplastos

cuando

ciertos

microorganismos se ven súbitamente expuestos a las condiciones en que dichos orgánulos son esenciales. En la mayoría de los organismos unicelulares, la reproducción es consecuencia del crecimiento y lleva al incremento en el número de individuos de la población, mientras que en los pluricelulares el crecimiento conduce al aumento del tamaño del organismo. La

  muestra una curva general del crecimiento de un figura 

microorganismo unicelular.

Después de la inoculación de una porción de medio con unas pocas células, transcurre un período de tiempo (fase de latencia) antes de que se establezca una velocidad constante de crecimiento, debido a que el microorganismo tiene una intensa actividad metabólica para adaptarse al nuevo medio de cultivo antes de poder duplicarse. Cuando el cultivo alcanzó una velocidad constante de crecimiento se dice que está en la fase exponencial debido a que el número de células se puede expresar como función de 2 n, donde n es el número de ciclos de duplicación experimentado por la población. LABORATORIO DE BIOPROCESOS

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En condiciones ideales el tiempo de generación de las bacterias puede ser de 20 minutos, de esta forma una única célula producirá 2.097.152 bacterias al cabo de 7 horas. Finalmente el cultivo entra en la fase estacionaria del crecimiento, en la que permanece constante el número de células. Esta fase puede durar mucho tiempo, por ejemplo décadas en el caso de las bacterias endosporuladas, pero siempre será seguida, más temprano o más tarde, por la fase de muerte.



RESIEMBRA CELULAR (SOLIDO - SÓLIDO )



Para la resiembra se siguen las técnicas de asepsia y colocando bajo mechero con lo que se mantendrá un ambiente estéril.



El asa bacteriológica se somete al fuego del mechero hasta alcanzar el rojo vivo.



Se debe dejar enfriar por unos segundos, del tubo de ensayo que contiene las células desarrolladas en medio sólido, se extrae una azada, se flamea el tubo para cerrarlo.



El procedimiento de resiembra se hace en los tubos de ensayos preparados con medio sólido (con agar).



La azada se realiza en el tubo desde adentro hacia fuera.



Se llevan a la incubadora a 35 º C durante 48 horas. Luego se refrigera para parar el crecimiento.



ACTIVACIÓN CELULAR Y DESARROLLO DEL INÓCULO Se tuvo el lugar bien desinfectado, se colocaron los mecheros se prosigue de la siguiente manera:



Para la inoculación partimos con la cepa incubada en medio sólido Saccharomycescerevisiae ATCC 4126

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

Se toma una azada y se inocula en el matraz con los 25 ml del medio de activación



Tapamos el tubo con un tapón de gasa y algodón.



Llevamos al Shaker a 200 rpm, Tº = 30 ºC y un t = 10 hasta alcanzar un desarrollo celular suficiente, evidenciado por el incremento en la turbidez del medio.



El procedimiento de inoculación se hará por duplicado es decir 2 azadas.



INOCULACIÓN AL MEDIO DE FERMENTACION



Inocular los 25 ml de caldo (medio rico de activación + biomasa) a un matraz de 500ml conteniendo el medio definido para fermentacioón. A partir de este paso se determinará la cinética de crecimiento de la biomasa.



Inmediatamente después, se extrae una muestra de 5 ml del caldo y medir X0 y S0 con D.O.



Se toman las medidas de asepsia en la zona de trabajo y el encendido del mechero.



La toma de muestras se inicia desde la dilución del medio de activación en el medio de fermentación.



Estas se realizaran cada hora y media para la primera muestra y posteriormente cada hora de la siguiente manera: 

Se extrae 5 mL del medio de cultivo, 3 mL se le agrega al tubo del espectrofotómetro y el resto se le agrego al tubo de centrifugado.

 

Se mide su absorbancia a una determinada log. de onda (640nm)y pH; luego se devuelve al tubo de centrifugado para completar los 5 ml y se centrifuga a la máxima velocidad por 20 minutos; el sobrenadante se vierte a los viales y se guarda en el refrigerador con el fin de después determinar el consumo de sustrato.

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CRECIMIENTO CELULAR: CINETICA CULTIVO CELULAR POR LOTES Plan de Muestreos y Registro de Datos

Grupo: __________________________________ Día: ___ /___ / ___ Microorganismo: ___________________________ Fuente Carbono: ____________________________

Nombre Nª

HORA

TIEMPO

Abs.(640

del

nm)

alumno

Observaciones

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

DETERMINACIÓN DE LOS RENDIMIENTOS DEL NUTRIENTE LIMITANTE EN CÉLULAS. Fuente de carbono y energía: SACAROSA (C 12 H22 O11), M= 342 g YX/S = % de C en el nutriente / % de C en la célula % de C en el nutriente = 12(12) x 100 / 342 = 42.11 % % de C en la célula = 45 % YX/S = (42.11/45) x 0.5 (este factor por ser aireado) YX/S = 0.95 x 0.5 = 0.47 g/g



DETERMINACIÓN DE AZÚCARES REDUCTORES: MÉTODO DEL DNS (ÁCIDO DINITROSALICÍLICO) La preparación del reactivo DNS se requiere de lo siguiente: 

10 g/l de ácido 3,5 dinitrosalicílico (DNS)



200 ml/l de NaOH 2N



300 g/l de tartrato de sodio y potasio tetrahidratado

Para la preparación de este reactivo, se disuelve el tartrato en aproximadamente 500 o 600 ml de agua, paralelamente se disuelve el ácido DNS. Ambas soluciones se mezclan en un matraz aforado de 1 litro y se agita hasta la completa disolución de todos los componentes, para posteriormente aforar hasta un litro. Se precisa realizar los siguientes pasos para el análisis de la muestra: 1. Se añade un volumen del reactivo DNS a un volumen de muestra a analizar. 2. Se mantiene la mezcla en un baño de agua a ebullición durante 5 minutos para luego dejar enfriar.

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 .    L  .    C    Y   O    L   U    C   O    N    I    L    E   D   O    L    L   O   R   R    A    S    E   D   :

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3. Se añaden 10 volúmenes de agua destilada. 4. Se lee la absorbancia a 540 nm, utilizando agua como blanco. 5. La concentración se obtiene interceptando la medida de absorbancia en la curva de calibrado. 6. La curva de calibrado para el azúcar se obtiene a partir de muestras de concentración conocida y analizadas según este procedimiento.



DETERMINACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN CELULAR POR D.O

El método se basa en el aumento de la turbidez del medio, al incrementarse la concentración de microorganismos, esto puede ser detectado fácilmente por espectrofotometría a 640 nm. Para ésta determinación es necesario que previamente se elabore una curva de calibrado, para lo cual las concentraciones de microorganismos en el medio son determinadas por peso seco de acuerdo al siguiente procedimiento: 1. Se toman 4 muestras de volumen conocido, y se centrifuga a 1200 rpm. Durante 15 - 20 minutos. 2. Se elimina el sobrenadante y se resuspende el centrifugado con tampón citrato (aprox. 3ml) 3. Se vuelve a centrifugar en las mismas condiciones a fin de eliminar

restos

de

sustrato

que

pudieran

alterar

la

determinación. 4. Se añade un poco de agua destilada (agua que se evapora posteriormente) para redisolver todo el precipitado y se seca en la estufa a 80 ºC hasta peso constante. (24horas)

 .    L  .    C    Y   O    L   U    C   O    N    I    L    E   D   O    L    L   O   R   R    A    S    E   D   :

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

DETERMINACIÓN DE ETANOL POR CROMATOGRAFÍA DE GASES. A. REACTIVOS Y SOLUCIONES  Etanol

 Propanol

B. PROCEDIMIENTO 

Preparación de 50 ml de solución patrón de Etanol a 6 g/L. Concentración de solución patron etanol = 6 g/l Volumen solución patrón etanol a 6 g/L = 50 ml Volumen solución etanol 99.7 % = 0.3809 ml



Preparación de 50 ml de solución patrón de Propanol a 4 g/L Concentración de solución patrón propanol = 4 g/l Volumen solución patrón etanol a 4 g/L = 50 ml Volumen solución etanol 99.5 % = 0.2487 ml

Estándar interno Análisis Cromatográfico 1. 2.

3. 4. 5.

 .    L  . Instalar una columna capilar RTX-20 utilizando férulas de    C    Y grafito para asegurar conexiones herméticas.   O    L   U Encender el cromatógrafo de gases, abrir la válvula a media    C   O    N luna del gas portador (helio, aire e hidrógeno) y regular    I    L    E cuidadosamente su flujo.   D   O Ajustar las condiciones cromatográficas.    L    L Abrir las válvulas de los otros gases, primero el aire y luego  O   Rel   R    A hidrógeno.    S    E   D Con una solución de jabón o detergente, verificar fugas de   :

gases en todas las conexiones. 6. Encender el detector y obtener una línea de base estable.

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Tº inicial del horno

55ºC.

Tº final del horno

120ºC.

Tiempo inicial

3min.

Tiempo final

2min

Velocidad de calentamiento 10 ºC/min.(RATE =rampa) Tº inyector

200ºC

Volumen de inyeccion

1µl.

Modo de inyección

Split

Radio Split

300

Velocidad lineal

32.9 cm/seg

Condiciones Cromatografícas Luego de establecidas las condiciones cromatográficas, se procede determinación de los parámetros en estudio.

 .    L  .    C a la    Y   O    L   U    C   O    N    I    L    E   D   O    L    L   O   R   R    A    S    E   D   :    o     l    u    t     í    p    a    C

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MATERIALES, INSTRUMENTOS Y REACTIVOS Material Biológico: Cepa de Saccharomycescerevisiae  ATCC 4126 





PREPARACIÓN DE SÓLIDO DE MANTENCIÓN: Materiales y Equipos: 

Balanza analítica



Matraz Erlenmeyer de 250 ml.



Mechero Bunsen

 

Gradilla



6 Tubos de ensayo con tapas.

 

Centrifuga.



Pipeta de 10 ml.



Vaso de precipitado.



Cocina a gas



Olla a presión.



Varilla de vidrio

 

Guantes.

 

Espátula

Reactivos y nutrientes: 

Agua destilada.



Extracto de levadura.

 

Peptona.



Extracto de malta

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 .    L  .    C    Y   O    L   U    C   O    N    I    L    E   D   O    L    L   O   R   R    A    S    E   D   :

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 



PREPARACIÓN DE MEDIO DE ACTIVACIÓN: 





Agar.

Materiales y Equipos: 

Balanza analítica



2 Matraz de 125 ml.



Una probeta de 100ml

 

Micropipeta

 

Estufa

 

Algodón

 

Gasa



Varilla de vidrio

 

Espátula

Reactivos y nutrientes:  

Glucosa



Extracto de levadura



Solución de sales



Agua destilada

 

Alcohol

PREPARACIÓN DE MEDIO DE FERMENTACIÓN: 

Materiales y Equipos: 

Matraz de 1 L



2 Matraces de 125 ml.



Varilla de vidrio

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 .    L  .    C    Y   O    L   U    C   O    N    I    L    E   D   O    L    L   O   R   R    A    S    E   D   :

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



Balanza analítica



Gasa y algodón



Olla a presión

Reactivos y nutrientes:   Glucosa





(NH4)2SO4



KH2PO4

  MgSO4.7H2O





Extracto de Levadura



Agua destilada

  Alcohol





INOCULACIÓN AL MEDIO DE ACTIVACIÓN: 

Materiales y equipos 

Matraz de 125 ml.

 

Algodón

 

Gasa



Agua destilada



Aza bacteriológica

 

Shaker



Mechero Bunsen, trípode y rejilla

 .    L  .    C    Y   O    L   U    C   O    N    I    L    E   D   O    L    L   O   R   R    A    S    E   D   :

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CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES Y/O TAREAS DESARROLLO DEL INOCULO Y CULTIVO CELULAR POR LOTES DE  ATCC 4126 Saccharomycescerevisiae  DÍA 30/09/13

ACTIVIDAD 

Presentación del pre-informe.



Esterilización de material de vidrio



Preparación de medio de mantención,

03/10/13

agar nutriente, esterilizar y refrigerar. 

Preparación Tampón pH 4.2



Resembrado de células en el medio de mantención agar sólido

10/10/13



Preparación de reactivos DNS.



Obtención de las curvas de calibrado de azúcares reductores DNS (Glucosa y Sacarosa).Obtención de la curva de calibrado Etanol, cromatógrafo de gases.

16/10/13 17/10/13



Preparar capachos (6unid.) Secarlos.



Obtención de la curva de calibrado de Biomasa.



23/10/13

Preparación y esterilización del medio rico líquido para inoculo y fermentación.



Preparar material de vidrio estéril.



Inoculación de medios y seguimiento de

24/10/13

la cinética de crecimiento microbiano. 

Análisis DNS y alcohol.

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 .    L  .    C    Y   O    L   U    C   O    N    I    L    E   D   O    L    L   O   R   R    A    S    E   D   :

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

30/10/13

Presentación del informe final y sustentación.

PROGRAMACION DE CINETICA CULTIVO CELULAR POR LOTES DIA miércoles 10/10/13  ACTIVIDAD

HORARIO INICIO

TERMINO

7:30 a.m.

8:00 a.m.

8:00 a.m.

8:20 a.m.

8:20 a.m.

11:20 a.m.

11:20 a.m.

11:40 a.m.

11:40 a.m.

7:40 p.m.

Preparación de materiales para la inoculación en medio de activación y el medio rico para la cinética de fermentación. Inoculación con aza bacteriológica desde la cepa en agar a medio rico de activación. Tiempo de referencia para la activación del inóculo en el medio de activación. Inoculación de medios para cinética (fermentación) Seguimiento de la cinética por cada hora ( programación y registro de datos)

REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS  

http://www.microbiologia.com.ar/bacteriologia/fisiologia.php?Mostrar=q uimicos



QUINTEROS

RAMIREZ

Rodolfo,

Ingeniería

Bioquímica.http://www.laboratoriosmicrokit.com/docs/..%5Cmanual%5 CKits-C.pdf.  

http://www.monografias.com/trabajos15/lactobacilos/lactobacilos.shtml



THOMAS D. BROCK, Biología de los Microorganismos

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 .    L  .    C    Y   O    L   U    C   O    N    I    L    E   D   O    L    L   O   R   R    A    S    E   D   :

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 

http://es.scribd.com/doc/14173118/4-Esterilizacion-y-Preparacion-deMedios-de-Cultivo

 

http://www.ecologia.unam.mx/laboratorios/evolucionmolecular/images/fi le/ClaseProcariontes/Alejandra/Pr%C3%A1ctica%201%20T%C3%A9c nica%20as%C3%A9ptica.pdf

 ANEXOS DISEÑO DEL MEDIO DE ACTIVACIÓN Y DE FERMENTACIÓN 

Rendimiento: Fermentación aeróbica

º

Y   X S 

 X  



 S

%Elem ento en nutriente %Elemento en biom asa

 ... (1)

 f 

Para fuente de carbono, fermentación aeróbica: f =0.5 Para otra fuente,

f =1

Donde: º

Y   X S 

%Elemento en nutriente %Elemento en biomasa  X  

º

Y   X S 

 S

 f …

(2)

… (3)

De (3):   X 

º

|

Y   X S 



 S f   S i 



… (4)

De (4): Si Sf 

 0.

Entonces; S i  g L 

 X 

Y º  X 



S

n … (5)

 .    L  .    C    Y   O    L   U    C   O    N    I    L    E   D   O    L    L   O   R   R    A    S    E   D   :

   o     l    u    t     í    p    a    C

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Para fuente de carbono, Para otra fuente,

n

n

=1.5

=1

Nota: El nutriente limitante en esta investigación se considerará a la fuente de carbono que en este caso es la Sacarosa.

FUENTE

ELEMENTO

% NUTRIENTE

Yx/s

S (G/L)

C S

% CELULA 45 0.25

42 13.01

0.56 52

10.72 0.12

S° (G/L) 16.080 0.173

SACAROSA MgSO4.7H2O MgSO4.7H2O

Mg

0.4

9.87

24.7

0.24

0.365

(NH4)2SO4 lim.

N

9

21.21

2.4

0.255

2.547

KH2PO4

K

0.5

28.73

57.5

0.10

0.157

KH2PO4

P

2

22.79

11.4

0.53

0.790

PARA LA SACAROSA: %C nutriente = 42.11%; %C. en biomasa= 45%

º

Y   X C 



 X   S 

Y º X C  



%C .ennutrient e %C .enbiomasa

42.11% 45%

 0.5

 g   g 

 0.6  0.56

 .    L  .    C    Y   O    L   U    C   O    N    I    L    E   D   O    L    L   O   R   R    A    S    E   D   :

   o     l    u    t     í    p    a    C

PARA KH2PO4:

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Y º X  P  

 X   S 



% P .ennutrient e % P .enbiomasa

% P .ennutrient e 

Y º  X  P 



22.794%

31 100 136

 g   g 

 1  11.395

2%

39  100

% K .ennutrient e 

Y º  X  K 



28.676% 0.5%

 22.79%

1  57.5

136

 28.73%

 g   g 

PARA (NH4)2SO4:

º

Y   X  N 



% N .ennutrient e % N .enbiomasa

% N .ennutrient e 

º

Y   X  N 



21.21% 9%

1  2.4

14  2 132

 100  21.21%

 .    L  .    C    Y   O    L   U    C   O    N    I    L    E   D   O    L    L   O   R   R    A    S    E   D   :

 g   g 

PARA MgSO4.7H2O:

Y º  X  S 

% Mg .ennutrient e 

24 246



% Mg .ennutrient e % Mg .enbiomasa

100  9.87%

Y º X  Mg 



9.7561% 0.4%

1  24.7

 g   g 

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   o     l    u    t     í    p    a    C

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%S .ennutrient e 

32 246

100  13.01%

º

Y   X  S 



13.0081% 0.25%

1  52

 g   g 

REFERENCIAS DE COMPOSICION DE MEDIOS DE MANTENCION,  ACTIVACION Y CULTIVO DE SACCHAROMYCES CEREVISIAE

MEDIO

Solidos de mantención (YM solido)

NUTRIENTE

CONCENTRACION (g/L)

Extracto de levadura

3

Peptona

5

Extracto de malta

3

 Agar

20

Glucosa

10

Glucosa

Activación

Extracto de levadura

10

Extracto de malta

3

Solución de sales

5 5 ml/L

T 35ºC, 200 rpm Sacarosa

Fermentación

Extracto de levadura

1.8

(NH4)2SO4 kH2PO4

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 .    L  .    C    Y   O    L   U    C   O    N    I    L    E   D   O    L    L   O   R   R    A    S    E   D   :

   o     l    u    t     í    p    a    C