Biologie celulara.pdf

Program postuniversitar de conversie profesională pentru cadrele didactice din mediul rural Specializarea BIOLOGIE Forma de învăţământ ID - semestrul I

BIOLOGIE CELULARĂ

Marieta COSTACHE

2005

Ministerul Educaţiei şi Cercetării Proiectul pentru Învăţământul Rural

BIOLOGIE Biologie celulară

Marieta COSTACHE

2005

© 2005

Ministerul Educaţiei şi Cercetării Proiectul pentru Învăţământul Rural Nici o parte a acestei lucrări nu poate fi reprodusă fără acordul scris al Ministerului Educaţiei şi Cercetării

Cuprins

CUPRINS GENERAL

INTRODUCERE

VI

Unitatea de învăţare 1: CELULE PROCARIOTE ŞI EUCARIOTE Cuprins unitatea 1 Introducere unitatea 1 Obiective Unitatea 1 Informaţii generale despre evaluare 1.1. Concepte generale de structură şi funcţionare 1.1.1. Compartimentarea ADN şi organismele 1.1.2. Fluxul de informaţie 1.1.3. Autoreplicarea macromoleculelor 1.1.4. Un spaţiu delimitat de o membrană

1.2. Celulele procariote 1.2.1. Organizarea celulei procariote 1.2.2. Evoluţia metabolismului bacterian 1.2.3. De la procariote la eucariote: teoria endosimbiotică

1.3. Celulele eucariote şi diferenţierea celulară 1.3.1. Celulele eucariote sunt compartimentate 1.3.2. Organismele pluricelulare: diferenţiere celulară şi reproducere

1.4. Răspunsuri şi comentarii la testele de autoevaluare 1.5. Lucrare de verificare 1 1.7. Bibliografie

pag 1 2 2 3 4 5 7 8 10 11 11 12 15 16 17 21 24 25 27

Unitatea de învăţare 2: TEHNICI DE EXPLORARE CELULARĂ Cuprins unitatea 2 Introducere unitatea 2 Obiective Unitatea 2 Informaţii generale despre evaluare 2. 1. Culturi celulare 2.1.1. Mediile de cultură 2.1.2. Tipuri de culturi

2. 2. Metode de microscopie 2.2.1. Microscopia optică 2.2.2. Microscopia de fluorescenţă

2.3. Metode de separare a componentelor celulare 2.3.1. Centrifugarea 2.3.1.1. Principiul centrifugării 2.3.1.2. Variantele centrifugării 2.3.2. Cromatografia Proiectul pentru Învaţământul Rural

28 29 29 30 31 32 33 35 35 37 40 41 41 42 45 i

Cuprins

2.3.2.1. Cromatografie pe hârtie 2.3.2.2.Cromatografia pe coloană în fază lichidă 2.3.2.3. Cromatografia lichidă de înaltă presiune 2.3.2.4 Gel filtrarea 2.3.2.5. Cromatografia pe schimbători de ioni 2.3.2.6. Cromatografia de afinitate 2.3.2.7. Cromatografia în fază gazoasă 2.3.3. Electroforeza 2.3.3.1. Principiul electroforezei 2.3.3.2. SDS-PAGE 2.3.3.3. Imunoeletrofocalizare 2.3.3.4. Electroforeza bidimensională 2.3.3.5. Purificarea şi separarea acizilor nucleici 2.3.3.6. Aplicaţii electroforeză

2.4. Tehnici de marcare 2.4. 1. Marcarea radioactivă 2.4.2. Marcarea cu anticorpi

2.5. Tehnici ADN recombinat 2.5.1. Clonare moleculară 2.5.2. Transformare de bacterii 2.5.3. Enzimele de restricţie 2.5.4. Construirea unei bănci de ADN genomic 2.5.5. Construirea unei bănci de ADNc 2.5.6. Reacţia PCR

2.6. Răspunsuri şi comentarii la testele de autoevaluare 2.7. Lucrare de verificare 2 2.8. Bibliografie

46 47 48 48 49 49 50 50 51 51 52 52 53 54 55 55 55 58 58 60 62 64 65 66 68 71 73

Unitatea de învăţare 3: Ciclul şi Diviziunea Celulară Cuprins unitatea 3 Introducere unitatea 3 Obiective Unitatea 3 Informaţii generale despre evaluare 3. 1. Ciclul Celular 3.1.1. Interfaza 3.1.2 Mitoza 3.1.3. Dinamica citoscheletului în timpul ciclului celular 3.1.3.1.Microtubulii 3.1.3.2. Filamentele de actina 3.1.3.3. Filamente intermediare 3.1.3.4. Formarea fusului mitotic

3. 2. Mecanisme biochimice de control al ciclului celular 3.2.1.Cicline 3.2.2. Punctele de control

3.3. Meioza 3.3.1. Originea gameţilor

ii

74 75 76 77 78 79 80 84 84 89 90 94 97 101 102 104 104

Proiectul pentru Învaţământul Rural

Cuprins

3.3.2. Derularea meiozei 3.3.2.1. Diviziunea reducţională (sau mitoza heterotipică) 3.3.2.2. Diviziunea ecuaţională 3.3.2.3. Comparaţie mitoză – meioză

3.4. .Îmbătrânirea celulară 3.4.1. Reorganizarea genomului nuclear - aberaţii cromozomiale 3.4.2. Scurtări ale telomerilor şi senescenţa replicativă 3.4.3. Aspecte energetice şi biochimice

3.5. Moarte şi nemurire celulară 3.5.1. Necroza 3.5.2. Apoptoza şi moartea celulară programată 3.5.3. Imortalitatea celulară – cancer 3.5.3.1. Imortalitatea celulară 3.5.3.2. Proprietăţile celulei tumorale 3.5.3.3. Mutaţiile şi imortalizarea celulelor 3.5.3.4. Virusurile ca agenţi transformanţi

3.6. Răspunsuri şi comentarii la testele de autoevaluare 3.7. Lucrare de verificare 3 3.9. Bibliografie

105 105 106 108

108 109 109 110 111 111 111 114 114 115 115 116 118 120 123

Unitatea de învăţare 4: ORGANIZAREA ŞI FUNCŢIONAREA CELULEI Cuprins unitatea 4 Introducere unitatea 4 Obiective Unitatea 4 Informaţii generale despre evaluare 4. 1. Structura membranelor 4.1.1. Arhitectura membranară 4.1.1.1. Dublul strat lipidic 4.1.1.2. Proteinele membranare 4.1.1.3. Glucidele

4. 2. Schimburile cu mediul înconjurător 4.2.1. Transporturi membranare 4.2.1.1. Transportul pasiv 4.2.1.2. Transportul activ 4.2.1.3. Menţinerea concentraţiilor ionice 4.2.1.4. Transportul nutrienţilor 4.2.1.5. Transportul cu ajutorul veziculelor

4.3. Comunicarea intercelulară 4.4. Traficul intracelular al proteinelor 4.4.1. Rolul reticulului endoplasmatic 4.4.2. Sinteza proteinelor de către ribozomii de la suprafaţa RER 4.4.3. Glicozilarea proteinelor în RE 4.4.4. Biogeneza membranelor în RER 4.4.5. Rolul aparatului Golgi 4.4.6. Trierea proteinelor Proiectul pentru Învaţământul Rural

124 125 126 127 128 128 128 132 134 135 135 137 138 139 141 142 145 147 148 149 150 150 151 153 iii

Cuprins

4.5 Mitocondrii şi cloroplaste (conversia energiei)

155 155 156 157 158 159 159 163

4.5.1. Mitocondrii 4.5.1.1. Organizarea mitocondriei 4.5.1.2. Genomul mitocondrial 4.5.1.3. Biogeneza mitocondriilor 4.5.1.4. Funcţiile mitocondriei 4.5.1.5. Producerea de ATP 4.5.2. Cloroplaste

4.6. Nucleul şi funcţiile sale 4.6.1. Învelişul nuclear 4.6.1.1. Structura şi funcţia complexului porilor nucleari 4.6.1.2. Traficul nucleu-citoplasma 4.6.2. Nucleul este un organit organizat 4.6.2.1. Cromozomii 4.6.3. Împachetarea genomului eucariot 4.6.3.1. Nucleozomii - primul nivel de organizare al cromozomului 4.6.3.2. Nivelurile structurale superioare ale cromatinei 4.6.4. Eucromatina şi heterocromatina

4.7. Răspunsuri şi comentarii la testele de autoevaluare unitatea 4 4.8. Lucrare de verificare 4 4.9. Bibliografie

166 167 169 169 171 171 176 179 182 185 187 191 193

Unitatea de învăţare 5: COMUNICARE CELULARĂ ŞI SEMNALIZARE Cuprins unitatea 5 Introducere unitatea 5 Obiective Unitatea 5 Informaţii generale despre evaluare 5.1. Moleculele implicate în semnalizare 5.1.1. Liganzi şi receptori

194 195 195 196 197 199

5.1.2. Clasificare hormoni 5.1.3. Mesageri secundari

200 202

5.2. Receptorii membranei plasmatice

204

5.2.1. Receptori cuplaţi cu proteinele G 5.2.1.1 Proteinele G

205 205

5.2.1.2. Adenilat ciclaza

208

5.2.1.3. Fosfolipaza C

209

5.2.2. Receptorii care formează canale de sodiu şi potasiu 5.2.3. Receptorii cu activitate enzimatică intrinsecă

5.3. Receptorii citoplasmici şi nucleari 5. 4. Răspunsuri şi comentarii la testele de autoevaluare 5.5. Lucrare de verificare 5 5.6. Bibliografie

iv

210 211 212 215 216 218

Proiectul pentru Învaţământul Rural

Cuprins

Unitatea de învăţare 6: DE LA CELULĂ LA ORGANISM Cuprins unitatea 6 Introducere unitatea 6 Obiective Unitatea 6 Informaţii generale despre evaluare 6.1. Adeziunea şi mobilitatea celulară 6.1.1. Caderinele 6.1.2.2. CAM din superfamilia imunoglobulinelor 6.1.3. Rolul moleculelor de adeziune în coeziunea tisulară 6.1.3.1. Joncţiunile „înguste” 6.1.3.2. Joncţiunile de ancorare şi desmozomii 6.1.3.3. Joncţiunile de comunicare („gap”) 6.1.3.4. Bazele moleculare ale mobilităţii celulare 6.1.4. Adeziunea celulă-matrice 6.1.4.1. Colagenul şi elastina 6.1.4.2. Proteoglicanii 6.1.4.3. Glicoproteinele extracelulare de adeziune

219 220 221 222 223 225 226 228 229 229 230 231

6.5. Răspunsuri şi comentarii la testele de autoevaluare 6.6. Lucrare de verificare 6 6.8. Bibliografie

232 233 235 236 238 238 243 244 244 246 248 248 249 251 251 253 256 258 262 264 267

Bibliografie minimală recomandată cursanţilor

268

6.2. Celulele primelor stadii embrionare 6.2.1. Fecundarea 6.2.2. Segmentarea şi reorganizarea celulelor embrionare

6.3. Bazele moleculare ale diferenţierii celulare 6.3.1. Organizarea tipică a unei gene eucariote 6.3.2. Promotori, stimulatori, inhibitori 6.3.3. Diferenţierea rezultă din expresia în cascada a genelor 6.3.4. Morfogeneza 6.3.5. Organogeneza

6.4. Evenimente celulare specializate 6.4.1. Celule stem 6.4.2. Celulele imunitare 6.4.3. Neuronii şi sistemul nervos 6.4.4. Celule tumorale şi cancer

Proiectul pentru Învaţământul Rural

v

Introducere

INTRODUCERE

ASPECTE GENERALE

Cursul de BIOLOGIE CELULARĂ - celula unitatea de bază a lumii vii este proiectat conform principiilor Educaţiei la Distanţă. Face parte din structura modulului de discipline de specialitate fundamentale care se adresează în principal personalului didactic care urmează cursurile Proiectului pentru Învăţământul Rural precum şi oricărei persoane care desfăşoară activităţi didactice în sistemul organizat de educaţie la distanţă. Cursul dezvoltă competenţe specifice şi. este gândit conform principiilor funcţionalităţii şi coerenţei bazându-se pe cunoştinţele aduse de alte discipline ale pachetului de specialitate (chimie, zoologie, botanică) realizând concomitent cu introducerea noilor informaţii, o integrare pe orizontală şi pe verticală a cunoştinţelor. Materialul prezentat este flexibil, accesibil, orientat spre aplicarea practică a cunoştinţelor dobândite, oferă şanse egale cursanţilor şi posibilitatea de formare şi perfecţionare profesională.

CADRU DE ORGANIZARE

Proiectul pentru învăţământul rural a apărut din necesitatea specifică de a avea un program de formare profesională în domeniul biologiei pentru cadre didactice din învăţământul preuniversitar care, desfăşurându-şi activitatea în mediul rural, sunt nevoite să predea biologia având diploma universitară din alt domeniu decât cel al ştiinţelor naturii. Cursul este util cadrelor didactice din mediul rural, atât celor care au diplomă universitară în domeniul biologie, cât şi celor care sunt calificate în alte domenii, dar urmează cursuri de formare în biologie. Modulul „Biologie celulară – celula unitatea de bază a lumii vii” are un caracter interdisciplinar, utilizează cunoştinţele asimilate la alte discipline (chimie, zoologie, botanică) şi oferă suportul de bază pentru înţelegerea altor module din cadrul disciplinei biologie (genetică şi microbiologie, biochimie, ecologie şi nu în ultimul rând biodiversitate şi evoluţionism). Cursul este astfel structurat încât oferă o imagine clară şi sintetică asupra principiilor fundamentale care guvernează organizarea structurală şi funcţionalitatea celulei ca întreg şi în contextul asamblării acesteia în organisme pluricelulare simple şi complexe. Modulul de Biologie celulară este una dintre componentele structurale ale strategiei de creare a unui program de formare în domeniul biologiei operant şi util nu doar pentru situaţii de conjunctură (ca cea existentă în prezent în învăţământul rural). Acesta îşi propune să constituie o formă de învăţământ cu o aplicabilitate mai largă. Modulul este conceput astfel încât să poată utiliza cât mai eficient facilităţile moderne de comunicare, metodele

vi

Proiectul pentru Învăţământul Rural

Introducere

de învăţare interactivă şi acordarea posibilităţilor de autoverificare şi verificare a competenţelor dobândite atât pe parcursul parcurgerii unităţilor modului cât şi la finalizarea acestuia. OBIECTIVELE MODULULUI

CONCEPŢIA CURSULUI

Obiectivele generale şi specifice ale modulului, în termenii formării de competenţe de specialitate specifice sunt: 1. Identificarea, clasificarea şi caracterizarea tipurilor celulare; 2. Înţelegerea conceptelor de origine şi evoluţie a vieţii; 3. Utilizarea conceptelor caracteristice metodelor de investigare celulară pentru înţelegerea complexităţii şi diversităţii lumii vii; 4. Investigarea fenomenelor şi proceselor caracteristice lumii vii la nivel celular; 5. Înţelegerea principiilor generale de organizare şi diviziune celulară; 6. Explicarea proceselor şi fenomenelor de îmbătrânire şi „nemurire” celulară în corelaţie cu starea de sănătate şi boală; 7. Clarificarea conceptelor de structură şi funcţionare celulară; 8. Explicarea proceselor de comunicare intra- şi intercelulară; 9. Identificarea proceselor şi structurilor responsabile de asigurarea energeticii celulare şi transferului de informaţie genetică 10. Dezvoltarea capacităţii de identificarea a principalelor molecule implicate în semnalizare la nivel celular şi intercelular; 11. Utilizarea noţiunilor privind structura şi funcţia diferitelor compartimente celulare în înţelegerea complexităţii structurale şi funcţionale a organismelor 12. Formarea capacităţii de înţelegerea a morfogenezei şi individualităţii funcţionale a organismelor ca urmare a derulării evenimentelor celulare specializate. În conformitate cu cerinţele Programului de Educaţie la Distanţă pentru Învăţământul Rural, prezentul modul este construit în formatul unui curs de educaţie prin corespondenţă şi aduce importante elemente de noutate în învăţământul biologic superior românesc. Sperăm că acest format să fie atractiv atât pentru grupul ţintă cât şi pentru universităţile care vor implementa programul. Modulul este planificat în programa analitică a semestrului I, anul I, face parte din cursurile de specialitate fundamentale şi necesită în medie 56 de ore de studiu (28 ore de studiu individual SI, 20 de ore alocate activităţii cu tutorele AT şi 8 ore alocate activităţii de control pe parcurs TC). Remarcă: intervalele de timp precizate mai sus pot fi mai lungi sau mai scurte în funcţie de bagajul de cunoştinţe anterioare ale cursantului, de cantitatea de munca alocată fiecărui subiect şi de capacitatea de efort intelectual a acestuia. Modulul „Biologie celulară – celula unitatea de bază a lumii vii” este structurat în şase unităţi de studiu (capitole) şi conţine şase lucrări de verificare care vor fi transmise pentru corectare şi comentarii tutorelui la care cursantul a fost alocat. Aceste lucrări sunt localizate la sfârşitul fiecărei unităţi împreună cu instrucţiunile după care se va realiza evaluarea dedicate fiecărui capitol. Fiecare unitate de învăţare este presărată cu un număr de teste de autoevaluare

Proiectul pentru Învăţământul Rural

vii

Introducere

care au rolul de elemente de lucru active care să asigure comunicarea bidirecţională simulată între autor şi cursant. Dimensiunile unităţilor de studiu sunt diferite ele fiind în concordanţă cu importanţa pe care încercăm să o alocăm problemelor ştiinţifice tratate şi ponderii acestora în formarea competenţelor specifice pe care dorim să le acumulaţi după parcurgerea acestui modul. Unitatea 1: Celule procariote şi eucariote îşi propune explorarea conceptele care privesc structura generală a celulelor procariote şi eucariote şi câteva din conceptele privind originea vieţii. Conţine 23 de teste de autoevaluare, 10 figuri şi şase cadre suplimentare care au rolul de a clarifica noţiunile teoretice prezentate. Unitatea 2: Tehnici de explorare celulară vă va permite familiarizarea cu principalele tehnici folosite în explorarea celulelor: culturi celulare primare, linii celulare, analiza celulelor şi subcomponentelor lor prin metode microscopice, tehnicile de separare şi purificare a componentelor celulare, principalele tehnici de marcare şi de obţinere a ADN recombinat. Cele 30 de teste de autoevaluare, patru cadre suplimentare şi 23 de figuri au rolul de vă forma o imagine cât mai bună privind complexitatea şi importanţa practică a acestor tehnici. Unitatea 3: Ciclul şi diviziunea celulară. În cadrul unităţii de studiu vă veţi putea familiariza cu principalele noţiuni privind ciclul celular şi etapele sale, mecanismele biochimice de control ale acestuia, formarea celulelor sexuale prin procesul meiozei, îmbătrânire, moarte şi imortalitatea celulară. Textul conţine inserate 38 de teste de autoevaluare, patru cadre suplimentare şi 36 de figuri vă vor ajuta la o mai bună înţelegere şi integrare a informaţiilor ştiinţifice prezentate. Unitatea 4: Organizarea şi funcţionarea celulei este capitolul cel mai complet şi complex care vă va ajuta să cunoaşteţi celula ca pe o unitate vie cu caracteristici structurale şi funcţionale proprii. De asemenea, veţi înţelege că celula este în acelaşi timp capabilă să răspundă necesităţilor organismului din care face parte fiind deosebit de receptivă la mediu. Deoarece unitatea are o importanţă aparte în înţelegerea şi asimilarea cunoştinţelor întregului modul în structura acesteia veţi găsi integrate 70 de teste de autoevaluare şi 37 de figuri, elemente foarte utile în fixarea noţiunilor teoretice. Unitatea 5: Comunicare celulară şi semnalizare vă va fi foarte utilă în înţelegerea modului în care celulele interacţionează prin intermediul diferitelor sisteme de comunicare intra- şi extracelulară. Un loc aparte este acordat moleculelor de semnalizare extracelulară care odată eliberate de celule determină răspunsuri specifice la nivelul celulelor ţintă. Unitatea este sintetic structurată şi presărată cu 20 de teste de evaluare şi 13 figuri. viii

Proiectul pentru Învăţământul Rural

Introducere

Parcurgerea şi analiza acestora vă va fi foarte utilă în înţelegerea informaţiilor ştiinţifice de actualitate prezentate. Unitatea 6: De la celulă la organism este foarte importantă pentru înţelegerea conceptelor care privesc formarea şi funcţionarea unui organism. Această unitate trece în revistă noţiunile privind interacţiile celulă-celulă şi celulă-matrice o atenţie deosebită fiind acordată bazelor moleculare ale diferenţierii celulare şi evenimentelor celulare specializate. Conţine 35 de teste de autoevaluare, 21 de figuri şi patru cadre suplimentare cu rolul de a clarifica noţiunile teoretice abordate. METODE ŞI INSTRUMENTE DE EVALUARE

MODALITĂŢI DE COMUNICARE

MODALITĂŢI DE INFORMARE SUPLIMENTARĂ

Criterii de Evaluare: nivelul de cunoaştere a conţinutului şi capacitatea de transfer şi aplicare a cunoştinţelor în contexte noi. Modalităţi de evaluare: 1. Evaluarea pe parcurs cu o pondere de 50% din nota finală se va realiză pe baza testelor de evaluare şi a comunicării cu tutorele şi cu universitatea organizatoare. Evaluarea pe parcurs a cursanţilor se va realiza prin lucrările de verificare care includ diferite combinaţii de: întrebări cu unul sau mai multe răspunsuri, răspunsuri simple la întrebări sau sub formă de eseuri. Reuşita la lucrările de verificare este asigurată în proporţie de peste 80% de parcurgerea şi rezolvarea cu responsabilitate a testelor de autoevaluare. Lucrările de verificare vor fi analizate şi comentate de către tutore şi nu vor necesita supervizarea profesorului. Ele vor avea o pondere de 40% din nota finală. Alte zece procente vor rămâne la latitudinea tutorelui din universităţile organizatoare ale programului şi vor fi folosite pentru punctarea seriozităţii cursantului şi a modului în care acesta comunică cu instructorii săi. 2. Evaluare finală cu o pondere de 50% din nota finală va consta într-un examen final scris supervizat de profesor. Aceasta va avea forma unui test final de verificare a cunoştinţelor. În educaţia la distanţă o importanţă deosebită o au sistemele de comunicare bidirecţionale între tutore şi student. Acestea trebuie selectate cu discernământ şi au ca obiectiv principal o bună comunicare şi minimizarea timpului de răspuns. Din acest motiv universităţile coordonatoare vor decide care sunt cele mai bune modalităţi de comunicare (poştă, telefon, fax, internet) care să permită o desfăşurare coerentă a activităţilor astfel încât „întâlnirile” dintre studenţi şi cadrele didactice coordonatoare să permită evaluarea periodică a progreselor realizate şi notarea acestora. Perioadele de analiză a lucrărilor de evaluare pe parcurs şi data examenului final vor fi comunicate cursanţilor încă de la începutul semestrului Fiecare unitate conţine la sfârşit bibliografia generală care a stat la baza întocmirii materialului teoretic şi a testelor de evaluare. Imaginile inserate în text au fost preluate de pe internet sau din diferite tratate şi prelucrate. În cazul celor preluate din tratate aveţi

Proiectul pentru Învăţământul Rural

ix

Introducere

sursa bibliografică trecută sub figură. O mare parte a bibliografiei este formată din adrese internet de la diferite universităţi pe care le puteţi accesa pentru a consulta documentele respective. Va rugăm să observaţi că bibliografia utilizată în redactarea informaţiei este din ultimii 10 ani. La sfârşitul modului a fost selectată o bibliografie minimală, în limba română, care vă va fi utilă în completarea cunoştinţelor. Criteriile care au stat la baza selecţionării acestor materiale bibliografice au fost: maxim 15 ani de la editare; prezenţă ISBN şi existenţa acestora materialelor în fişele de evidenţă ale Bibliotecii Centrale Universitare.

x

Proiectul pentru Învăţământul Rural

Celule procariote şi eucariote

Unitatea de învăţare 1: CELULE PROCARIOTE ŞI EUCARIOTE

Cuprins Introducere Obiective Unitatea 1 Informaţii generale despre evaluare 1.1. Concepte generale de structură şi funcţionare 1.1.1. Compartimentarea ADN şi organismele 1.1.2. Fluxul de informaţie 1.1.3. Autoreplicarea macromoleculelor 1.1.4. Un spaţiu delimitat de o membrană

1.2. Celulele procariote 1.2.1. Organizarea celulei procariote 1.2.2. Evoluţia metabolismului bacterian 1.2.3. De la procariote la eucariote: teoria endosimbiotică

1.3. Celulele eucariote şi diferenţierea celulară 1.3.1. Celulele eucariote sunt compartimentate 1.3.2. Organismele pluricelulare: diferenţiere celulară şi reproducere

1.4. Răspunsuri şi comentarii la testele de autoevaluare 1.5. Lucrare de verificare 1 1.6. Bibliografie

Proiectul pentru Învăţământ Rural

pag 2 2 3 4 5 7 8 10 11 11 12 15 16 17 21 24 25 27

1

Celule procariote şi eucariote

Introducere În cadrul acestei unităţi de studiu vei putea explora conceptele care privesc structura generală a celulelor procariote şi eucariote şi câteva din conceptele privind originea vieţii. Celula, unitatea fundamentală a lumii vii, reprezintă forma de viaţă cea mai simplă capabilă să crească independent. Aceasta foloseşte elementele din mediul său pentru a sintetiza majoritatea constituenţilor necesari diviziunii sale. Pentru a realiza aceasta sunt necesare două sisteme moleculare indispensabile: un sistem de transfer de informaţie şi un sistem de transformare de energie. Materialul este presărat cu teste de autoevaluare pe care vă recomandăm să le rezolvaţi în momentul întâlnirii acestora. La finalul capitolului sunt prezentate răspunsurile la testele de autoevaluare pe parcurs şi lucrarea de verificare 1 pe care la finalul parcurgerii unităţii o veţi trimite tutorelui.

Obiective Unitatea 1 La terminarea studiului acestei unităţi de studiu, trebuie să fiţi capabili să: 9 Prezentaţi succint şi clar componentele structurale ale celulei; 9 Identificaţi, clasificaţi şi să caracterizaţi tipurile celulare (procariote, animale şi vegetale); 9 Precizaţi conceptele generale de origine şi evoluţie a vieţii; 9 Definiţi principalele funcţii ale organitelor celulare. 9 Conştientizaţi că celulele prezintă grade diferite de complexitate în condiţiile în care au acelaşi plan de organizare; 9 Integraţi că formarea unui organism pluricelular este rezultatul unei organizări sociale în care celulele sunt corelate între ele.

2

Proiectul pentru Învăţământ Rural

Celule procariote şi eucariote

Evaluarea pe parcurs - Testele de autoevaluare (TA) ¾ Unitatea conţine în structura sa 23 de teste de autoevaluare distribuite astfel încât să asigure o bună fixare a noţiunilor prezentate. ¾ Fiecare test de evaluare se bazează pe parcurgerea şi înţelegerea materialului teoretic prezentat. ¾ Unele dintre testele de autoevaluare sunt sub formă de întrebări urmate de trei sau patru sau cinci răspunsuri posibile, fiecare indicat cu o literă în dreptul lui. Pentru a răspunde la aceste întrebări, trebuie să încercuiţi litera din dreptul răspunsului pe care îl consideraţi ca fiind corect. ¾ Alte teste vă cer să scrieţi răspunsuri scurte sau să încercuiţi răspunsul corespunzător spaţiilor libere; ¾ Există şi teste de autoevaluare care vor necesita rezolvarea unei probleme sau scrierea unor scurte eseuri prin care să exprimaţi părerea voastră asupra anumitor aspecte. ¾ Răspunsurile la testele de autoevaluare sunt prezentate la sfârşitul unităţii, înainte de lucrarea de verificare 1. Dacă nu reuşiţi să rezolvaţi cu succes testele de autoevaluare în momentul întâlnirii lor pe parcursul parcurgerii testului vă recomandăm să reluaţi parcurgerea întregului material si apoi să reveniţi asupra rezolvării testelor. Unele dintre testele de autoevaluare sunt foarte simple, răspunsul lor fiind evident în text. Alte teste necesită o bună integrare a cunoştinţelor obţinute şi parcurgerea întregii unităţi. Enunţurile testelor de autoevaluare au un rol important în fixarea cunoştinţelor şi în formarea unei imagini de ansamblu asupra materiei. Lucrări de verificare notate de tutore. Gradul de dobândire a conceptelor şi informaţiilor prezentate în această unitate de învăţare va fi cuantificat pe baza notei obţinute la Lucrarea de verificare Nr.1 care conţine 25 de probleme. Testele din lucrarea finală sunt de acelaşi tip cu testele de autoevaluare pe care le veţi rezolva pe parcursul parcurgerii materialului unităţii 1. Evaluarea răspunsurilor dumneavoastră la lucrarea de verificare 1 va fi realizată de tutore la termene stabilite de comun acord cu administraţia universităţilor care organizează formarea. Răspunsurile problemelor vor fi transmise direct universităţilor organizatoare. Lucrările de evaluare pe parcurs au o pondere de 50% din nota finală. Lucrarea de verificare 1 va reprezenta 5% din verificarea pe parcurs. Cele 25 de întrebări vor fi echivalente şi vor fi notate cu 2 puncte fiecare astfel încât pentru o lucrare corectă să puteţi acumula 50 de puncte. Materialul unităţii este presărat cu un număr de şase cadre suplimentare şi 10 figuri care au rolul să vă facă să înţelegeţi mai bine noţiunile teoretice prezentate. Acestea nu sunt opţionale. Parcurgerea materialelor din cadrele suplimentare şi analiza figurilor inserate în curs vă va ajuta la lămurirea noţiunilor complexe şi la aprofundarea anumitor subiecte. Un rezultat bun la lucrarea de verificare este clar condiţionat de parcurgerea cu responsabilitate a testelor de autoevaluare, a cadrelor şi de înţelegerea figurilor. Proiectul pentru Învăţământ Rural

3

Celule procariote şi eucariote

1.1. Concepte generale de structură şi funcţionare

Obiectivul biologiei celulare este de a înţelege derularea fluxului vieţii care pleacă de la molecule şi ajunge la organisme, trecând prin celule şi ţesuturi. Celula, unitatea fundamentală a lumii vii, reprezintă forma de viaţă cea mai simplă capabilă de autoreproducere. Aceasta foloseşte elementele din mediul său pentru a sintetiza majoritatea constituenţilor necesari diviziunii sale. Pentru a realiza aceasta sunt necesare două sisteme moleculare indispensabile: un sistem de transfer de informaţie şi un sistem de transformare de energie. Anumite entităţi biologice de tipul virusurilor pot fi total sau parţial lipsite de aceste două componente majore şi se reproduc graţie celulelor gazdă care suplinesc funcţiile care lipsesc (Cadrul 1).

TA 1.1. Care dintre următoarele afirmaţii este cea mai apropiată descriere a domeniului de studiu al biologiei celulare? a) studiul proceselor vieţii; b) studiul rocilor; c) studiul oamenilor; d) studiul biodiversităţii; e) studiul modului în care oamenii interacţionează cu mediul

Cadrul 1.1. Virusurile, paraziţi moleculari ai celulei Incapacitatea virusurilor de a produce energie face din aceştia „paraziţi intracelulari obligatorii”. Virusurile nu se auto-reproduc niciodată iar forma lor de parazitism molecular constă în introducerea într-o celulă gazdă a unei informaţii genetice noi care exploatează capacităţile metabolice ale celulei gazdă infectate pentru a reproduce materialul viral. Virionul, unitatea elementară a virusului, este compusă dintr-o parte centrală care conţine ADN sau ARN, înconjurat de o capsidă constituită din una sau mai multe varietăţi de proteine. Clasificarea virusurilor depinde în primul rând de tipul de acid nucleic (ADN sau ARN) sub formă monocatenară sau dublu-catenară şi în al doilea rând de forma capsidei (elicoidală, eicosaedrică, etc.). Se pot diferenţia virusurile bacteriene (sau bacteriofagii) care posedă un genom ADN şi virusurile celulelor eucariote al căror genom poate să fie ADN sau ARN. Virusurile ARN sau retrovirusurile, prezintă un ciclu infecţios destul de diferit de cel al virusurilor ADN. După infectarea celulei, ARN este transformat în ADN de către o transcriptază inversă virală. ADN viral neosintetizat se integrează uşor în genomul celulei şi poate să se menţină o durată nelimitată sub formă de provirus. Acesta produce prin transcripţie ARN viral care serveşte pe de o parte drept mesager pentru sinteza de proteine virale şi de genom pentru crearea de noi particule virale. Asamblaţi în citoplasmă, noile virusuri ies din celulă prin înmugurire la nivelul membranei plasmatice, cu consecinţe destul de reduse asupra funcţionării globale a celulei. Această proprietate a retrovirusurilor face din ei vectori eficace pentru introducerea de ADN străin în celulele ţintă. Aplicaţiile în terapie genică sunt actualmente foarte numeroase.

4

Proiectul pentru Învăţământ Rural

Celule procariote şi eucariote

1.1.1 Compartimentarea ADN la diferite organisme

Clasificarea organismelor se bazează pe absenţa sau prezenţa în celulă a unei membrane care individualizează nucleul, numită anvelopă nucleară. Celulele procariote, lipsite de un nucleu adevărat, includ eubacteriile şi archeobacteriile. Pe de altă parte, celulele eucariote (protiste, ciuperci, plante şi animale) posedă o anvelopă nucleară care înconjoară materialul genetic. Creşterea unei celule sau dezvoltarea unui organism folosind energia furnizată de mediu au drept corolar menţinerea organizării celulare. Aceasta se transmite de la o celulă la alta prin intermediul materialului genetic sau acidului dezoxiribonucleic (ADN) purtător şi memorie a informaţiei acumulate în cursul evoluţiei de miliarde de ani. ADN constituie punctul de start al informaţiei în celulă şi reprezintă o structură stabilă şi lineară, ideală pentru stocarea şi organizarea informaţiei. Aceasta poate să răspundă atât semnalelor din interiorul celulei cât şi celor din mediul exterior, transferul de informaţii fiind astfel reglat. În cazul cromozomului unic de la procariote, dubla elice ADN compusă din câteva milioane de perechi de baze are o formă circulară (tabelul din Figura 1.1). Genomul eucariotelor a căror mărime şi complexitate este variabilă, conţine în general mai mulţi cromozomi. În cromozomii unei celule eucariote, ADN este suprarăsucit în jurul unor proteine specifice numite histone, formând o structură compactă responsabilă de expresia ADN.

TA 1.2. Care sunt cele două clase ale procariotelor? a) eucariotele şi eubacteriile; b) archeobacteriile şi Monera; c) eubacteriile şi archeobacteriile; d) bacteriile şi Monera; TA 1.3. Care dintre următoarele structuri sunt celule procariote? a) plante; b) fungi; c) bacterii; d) animale; e) atât b cât şi c

Cadrul 1.2. NOTĂ PRIVIND DENUMIRILE BIOLOGICE Speciile organismelor vii sunt identificate prin perechi de cuvinte latine, scrise în italic, analoge cu numele de familie şi prenumele persoanelor fizice. De exemplu, pentru bacteria Escherichia coli, genul Escherichia este echivalentul numelui de familie şi este trecut primul; cel de al doilea termen coli este echivalentul prenumelui şi identifică specia particulară din genul respectiv căreia îi aparţine microorganismul . În denumirile scurte, numele genului poate fi prescurtat (E. coli) în timp ce specia trebuie specificată. Cu toate acestea putem folosi adesea pentru musculiţa de oţet denumirea de Drosophila, cu toate că ne referim de fapt la Drosophila melanogaster.

Proiectul pentru Învăţământ Rural

5

Celule procariote şi eucariote

Nume comun

VIRUSURI SV40 Bacteriofag λ Virus Herpes de tip bovin CELULE PROCARIOTE

Mărimea genomului (perechi de nucleotide) 5,2 x 103 4,8 x 104 1,4 x 105

Mărimea relativă a genomului (E. coli = 1) 1,3 x 10-3 1,2 x 10-2 3,5 x 10-2

Bacterii

0,7 x 106 1,7 x 10-1 Mycoplasma capricolum 6 2,9 x 10 7,2 x 10-1 Staphylococcus aureus 6 1 4,0 x 10 Escherichia coli 2,6 9,7 x 106 Myxococcus xantus CELULE EUCARIOTE Ciuperci 1,5 x 107 Drojdii 3,7 Saccharomyces Ciuperci 3,7 1,5 x 10 7 cerevisiae Aspergillus niger Muscă 4,5 x 10 1,8 x 108 Animale Drosophila melanogaster Şoarece 6,7 x 102 2,7 x 109 Mus musculus 9 Taur 3,2 x 10 8,0 x 102 Bos taurus 9 Om 3,4 x 10 8,5 x 102 Homo sapiens Plante Arabete 7,0 x 107 1,7 x 101 Arabidopsis thaliana 9 Porumb 3,9 x 10 9,7 x 102 Zea mays 10 Ceapă 1,8 x 10 4,5 x 103 Alium cepa Figura 1.1. Mărimea şi complexitatea genomului la câteva virusuri şi celule

TA 1.4. O bacterie cu greutatea de aproximativ 10-12 g se poate divide la fiecare 20 de minute. Dacă o singură celulă se divide cu această frecvenţă, cât timp este necesar ca masa bacteriană să fie egală cu cea a Pământului (6 x 1024 kg). Comparaţi rezultatul obţinut de dumneavoastră cu faptul că bacteriile îşi au originea acum mai bine de 3,5 miliarde de ani şi de atunci s-au divizat mereu. Explicaţi aparentul paradox. (Numărul de celule N în cultură la timpul t este dat de ecuaţia N=N0 x 2 t/G, unde N0 este numărul de celule la timpul zero, iar G este timpul unei generaţii).

TA 1.5. Una dintre distincţiile cheie dintre celulele procariote şi eucariote o reprezintă prezenţa în celule ________, care lipseşte din celule ___________ a) eucariote a unui nucleu ……..procariote b) procariote a unui nucleu în ……..eucariote c) procariote de ADN …………eucariote d) eucariote de ADN …………..procariote e) procariote a unui organit citoplasmatic ……….eucariote 6

Proiectul pentru Învăţământ Rural

Celule procariote şi eucariote

1.1.2. Fluxul de informaţie

Celule procariote şi eucariote posedă atât mecanisme comune cât şi distincte pentru reglarea expresiei genelor şi a fluxului de informaţie de la ADN la proteine (Figura 1.2). Transcrierea ADN de către ARN polimeraze constituie prima etapă comună pentru toate organismele. În urma acestui proces se formează molecule de ARN (ARN mesager - ARNm, ARN de transport - ARNt, ARN ribozomal – ARNr). În citoplasma celulelor procariote, ribozomii se fixează la moleculele de ARN mesager (ARNm) în curs de sinteză şi traduc imediat informaţia genetică în proteine. În celulele eucariote, anvelopa nucleară separă locul transcripţiei de cel al traducerii informaţiei genetice. La eucariote genele au o structură mozaicată fiind compuse din, fragmente a căror secvenţă nucleotidică va fi tradusă în proteine (exoni) şi din secvenţe care nu vor fi traduse (introni şi secvenţe repetitive). În nucleu, transcriptul primar nou sintetizat (ARNm) conţine o succesiune de exoni separaţi de introni care vor fi eliminaţi prin procesul de maturare. Moleculele de ARNm mature trec în citosol, fracţiunea solubilă a citoplasmei, unde sunt traduse. Maturarea ARNm conferă celulelor eucariote posibilitatea diversificării informaţiei genetice prin combinarea alternativă a exonilor, o operaţie extrem de importantă în dezvoltarea organismelor.

Figura 1.2. Fluxul de informaţie genetică la procariote şi eucariote

TA 1.6. Care din următoarele organisme foloseşte ADN ca material genetic? a) procariotele; b) eucariotele; c) archea; d) numai a şi c; e) a, b şi c TA 7. Care dintre următoarele caracteristici se regăsesc atât la bacterii cât şi la organismele din grupul Archea? a) citosol; b) nucleu; c) ADN; d) numai a şi c; e) a, b şi c

Proiectul pentru Învăţământ Rural

7

Celule procariote şi eucariote

Sinteza prebiotică a moleculelor organice mici - aminoacizii, 1.1.3. Autoreplicarea glucidele şi acizii graşi – a condus, în conformitate cu diferitele teorii privind originea vieţii, la un amestec molecular favorabil macromoleculelor asocierii anumitor constituenţi pentru a forma polimeri de mari dimensiuni (macromolecule) (Figura 1.3). O dată format, un polimer poate influenţa formarea altor polimeri, după exemplul polinucleotidelor care servesc drept matriţă şi care iniţiază reacţiile de polimerizare a noi polinucleotide. Astfel de mecanisme de matriţare complementară necesită prezenţa de catalizatori pentru a creşte viteza de sinteză a copiilor identice. Moleculele de ARN pot acţiona şi drept catalizatori (ribozime) iar această dualitate pare să fi furnizat chiar baza evoluţiei primelor sisteme vii. ARN posedă două proprietăţi fundamentale ale structurilor vii: una de purtătoare a informaţiei genetice, analogă genotipului, dependentă de structura nucleotidică şi, cealaltă, analogă fenotipului, definită printr-o structura tridimensională care posedă proprietăţi catalitice. Se pare că moleculele de ARN sunt mai bine adaptate stocării şi replicării informaţiei genetice decât catalizei. Pentru a a-şi asuma funcţia catalitică, polipeptidele (proteinele) compuse dintr-un număr important de aminoacizi diferiţi, adoptă diferite conformaţii tridimensionale. Structura proteinelor favorizează un mare număr de funcţii catalitice dintre care unele au contribuit la creşterea vitezei de replicare a ARN. Se pare că ADN a apărut şi s-a manifestat efectiv ca purtător al informaţiei genetice într-o etapă ulterioară apariţiei şi funcţionării ARN. Spre deosebire de ARN, acesta există sub forma unei duble elice formată din două molecule polinucleotidice complementare. ADN şi ARN sunt polinucleotide formate din unităţi mononucleotidice care au în constituţia lor grupări fosfat, structuri glucidice cu cinci atomi de carbon (riboza în ARN şi deoxiriboza în ADN), şi patru baze azotate. Trei baze azotate sunt comune ambilor acizi nucleici (adenina A, guanina G şi citozina C) iar cea de a patra este diferită: timina (T) în ADN şi uracilul (U) în ARN. Structura dublu-catenară a ADN uşurează replicarea şi autorizează procesul de reparare (catena intactă servind de matriţă model). Faptul că deoxiriboza este lipsită de o grupare hidroxil face molecula de ADN mai stabilă chimic. Putem concluziona că aceste considerente au făcut ca în timpul evoluţiei ADN să detroneze ARN în ceea ce priveşte funcţia de depozitare a informaţiei genetice.

8

Proiectul pentru Învăţământ Rural

Celule procariote şi eucariote

Figura 1.3. Simularea atmosferei primitive care a dus la apariţia vieţii pe Pământ (prelucrat după Biology, N. A. Campbell, J. B. Reece, William Barstow, Ed, International Edition, Benjamin Cummings, 6 Edition, 2002) th

Cadrul 1.3. Concepte asupra viului Cum definim viaţa? 9 Celula este unitatea structurală a viului; 9 Elementele care compun viul: carbonul, azotul, oxigenul, hidrogenul şi multe alte elemente constituie materie lipsită de viaţă; 9 Celulele prezintă grade diferite de complexitate şi au acelaşi plan de organizare; 9 Viaţa se bazează pe schimburi de energie; 9 Toate celulele pot să provină dintr-o singură celulă prin diviziune sau prin fuziune; 9 Toate celulele cresc, îmbătrânesc şi mor 9 Există o mare diversitate de celule vii şi de organisme unicelulare şi pluricelulare

Proiectul pentru Învăţământ Rural

9

Celule procariote şi eucariote

1.1.4. Un spaţiu limitat de o membrană

Atâta timp cât moleculele sunt libere să difuzeze în mediul înconjurător, replicarea materialului genetic nu se poate realiza eficient. Izolarea moleculelor favorizează interacţiunile şi accelerează capacitatea de reacţie aflată la originea celulei primitive. Moleculele amfifile compuse dintr-o regiune hidrofobă (insolubilă în apă) şi din una hidrofilă (solubilă în apă) se agregă instantaneu în mediu apos pentru a forma bistrate lipidice. Acestea formează vezicule închise care izolează de mediul exterior un spaţiu interior apos. Moleculele şi ionii conţinuţi într-un spaţiu astfel definit diferă ca natură şi concentraţie de cele din mediul exterior. Elaborarea celulei primitive sau celulei ancestrale, strămoş comun al tuturor celulelor vii actuale ar fi putut fi rezultatul evoluţiei de la o accesibilitate totală a macromoleculelor la compuşii din mediu şi izolarea lor ermetică (cadrele 1.4 şi 1.5). Pentru ca între cele două spaţii astfel definite să se stabilească schimburi a fost necesar ca anumite secvenţe peptidice hidrofobe incluse în membrană să asigure rolul de transportori. Astfel, membranele celulei ancestrale ar putea fi rezultatul aglomerării fosfolipidelor şi peptidelor membranare. Problema este care dintre fosfolipide sau peptide s-au regăsit cu o probabilitate mai mare la originea unui astfel de nivel de organizare.

Figura 1.4. Viaţa a început de la un strămoş comun „Ultimul Strămoş Universal Comun” (USUC), acum 3,5 miliarde de ani.

10

Proiectul pentru Învăţământ Rural

Celule procariote şi eucariote

1.2. Celulele procariote Archeobacterii Eubacterii

1.2.1. Organizarea celulei procariote

Unul dintre criteriile care stau la baza clasificării organismelor este absenţa sau prezenţa nucleului individualizat. Celulele procariote lipsite de un nucleu veritabil, includ eubacteriile (prezente în sol, apă şi ca organisme comensale cu celelalte organisme vii) şi archeobacteriile (din anumite „nişe” ecologice). De cealaltă parte se află celulele eucariote (protiste, ciuperci, plante şi animale) care posedă o membrană nucleară care separă materialul genetic de restul celulei (Figura 1.4). Cromozomul unic al celulelor procariote este format dintr-o moleculă de ADN dublu catenar circulară care conţine câteva milioane de perechi de baze. Bacteriile, organismele procariote cele mai simple întâlnite în toate mediile naturale, prezintă caracteristici comune. Adesea, un perete celular, format din peptidoglicani, înconjoară membrana plasmatică şi conferă celulei formă rigidă. De asemenea, este prezentă o membrană externă care posedă un număr variabil de flageli şi pili (Figura 1.5).

Figura 1.5. Structura celulei procariote (prelucrat după Biology, N. A. Campbell, J. B. th Reece, William Barstow, Ed, International Edition, Benjamin Cummings, 6 Edition, 2002)

Bacteriile au un compartiment citoplasmatic unic care conţine un nucleoid format dintr-o moleculă simplă circulară de ADN asociat cu ARN şi proteine. Pe lângă ADN, prezent în nucleoid, citoplasma majorităţii bacteriilor conţine mici molecule circulare de ADN, numite plasmide. Cel mai adesea acestea conferă celulei rezistenţă la antibiotice şi la alte toxine. În condiţii favorabile, bacteriile se multiplică rapid prin diviziune (scisiparitate). Capacitatea lor de adaptare la condiţiile de mediu şi de diviziune rapidă fac ca aceste celule să constituie suporturi excelente pentru numeroase analize biochimice şi de biologie moleculară, in vitro.

Proiectul pentru Învăţământ Rural

11

Celule procariote şi eucariote

1.2.2. Evoluţia metabolismului bacterian

Cele două grupuri de bacterii (archeobacterii şi eubacterii) se ramifică în mai multe subgrupe în funcţie de sursa de energie utilizată pentru a asigura sinteza componentelor celulare. Anumite bacterii, autotrofe, se dezvoltă în prezenţă bioxidului de carbon ca unică sursă de carbon, în timp ce altele, heterotrofe, necesită compuşi organici pentru creştere şi reproducere. În funcţie de sursele de energie şi de carbon bacteriile se pot clasifica în: - chimiotrofe care obţin energie din compuşi minerali. În această categorie se regăsesc bacteriile chimiolitotrofe care formează un subgrup restrâns care conţine microorganisme care oxidează hidrogenul (Hydrogenomonas), nitriţii (Nitrobacter), compuşii reduşi ai sulfului (Thiobacillus), amoniacul (Nitrosomonas) şi bacteriile chimiorganotrofe (entrobacterii, etc) care îşi obţin energia din compuşi organici; - fototrofe care folosesc lumina solară ca primă sursă de energie şi care se dezvoltă fie într-un mediu pur mineral (bacterii fotolitrotrofe: Thiorhodaceae bacterie sulfuroasă roşie, Chlorobacteriaceae, bacterie sulfuroasă verde), fie în prezenţă de compuşi organici; - fotoorganotrofe de tipul Athiorhodaceae, (bacterie roşie nesulfuroasă).

TA 1.8. Care dintre următoarele afirmaţii face o distincţie corectă între celulele procariote şi eucariote ce poate fi atribuită absenţei citoscheletului la procariote? a) organitele compartimentate sunt prezente numai în celulele eucariote; b) la procariote nu se observă o deplasare citoplasmatică; c) numai celulele eucariote sunt capabile de mişcare d) de obicei celulele procariote au un diametru de 10 μm sau mai mic; e) numai celulele eucariote concentrează materialul genetic într-o regiune separată de restul celulei;

12

Proiectul pentru Învăţământ Rural

Celule procariote şi eucariote

Cadrul 1.4 Evoluţia Lumii Vii (a) Toate organismele vii aparţin uneia din cele trei categorii: eubacteriile, archea şi eucariotele. Nimeni nu ştie exact cum a debutat viaţa, dar strămoşul comun al tuturor organismelor vii a existat pe Pământ încă de acum aproximativ patru miliarde de ani, la puţin timp după formarea planetei care este estimată la 4, 6 miliarde de ani. La origine primele celule, apărute probabil acum mai bine de 3,5 miliarde de ani, foloseau pentru creştere moleculele prezente în mediul lor care se presupune că era reprezentat de o „supă prebiotică”. Aceste microorganisme se consideră a sta la originea chimiorganotrofelor. Aceste heterotrofe primitive au achiziţionat progresiv capacitatea de a elibera energia din anumiţi compuşi preluaţi din mediu şi de a o folosi pentru sinteza unor macromolecule indispensabile pentru supravieţuire şi multiplicare. Caracteristicile biochimice comune ale întregii descendenţe celulare indică că microorganismele primitive posedau aproximativ o mie de gene care ulterior s-au diversificat prin duplicare şi mutaţii aleatoare ale secvenţelor. Dacă anumite gene au oferit anumite avantaje selective, ele au fost conservate la generaţiile următoare. Aceste organisme primitive, care au creat căi metabolice, au devenit din ce în ce mai independente de moleculele din mediul înconjurător. Evoluţia căilor metabolice s-a realizat prin adăugarea progresivă de noi reacţii enzimatice. De asemenea, astfel de mecanisme ar putea explica existenţa unor mari familii de proteine înrudite dar specializate cum sunt pompele şi transportorii care se regăsesc la toate organismele vii. Iniţial, datorită lipsei oxigenului de pe suprafaţa Pământului, căile metabolice cele mai vechi ar fi trebuit să fie anaerobe. De altfel, glicoliza (metabolizarea glucozei în absenţa oxigenului) ocupă un loc central între căile metabolice. Aceasta este prezentă la majoritatea celulelor şi conduce la formarea adenozintrifosfat (ATP) care serveşte ca sursă de energie direct utilizabilă. Multe dintre eubacterii şi archeobacterii (archea) trăiesc la temperaturi ridicate şi folosesc ca sursă de energie hidrogenul. Strămoşul comun, de care s-au despărţit relativ repede putea avea aceleaşi caracteristici. O perioada scurtă de timp archea au făcut parte din aceeaşi linie filogenetică cu eucariotele, fapt care se reflectă în mecanismele similare de transcripţie a ADN şi ARN cu toate că restul caracteristicilor le apropie mai mult de bacterii. Încă de la început microorganismele au dominat pământul prin numărul, varietatea speciilor şi habitatele lor. Şi în prezent eubacteriile şi archea rămân organismele cele mai abundente din apă, aer şi uscat.

Proiectul pentru Învăţământ Rural

13

Celule procariote şi eucariote

Cadrul 1. 5: Evoluţia Lumii Vii (b) Despre eucariotele primitive se cunosc puţine lucruri în afară de faptul că genomul lor putea fi la fel de străvechi ca şi cel al eubacteriilor şi al archea. Organismul eucariot contemporan cel mai primitiv este o amibă numită Pelomyxa palustris care nu posedă mitocondrii. În cursul evoluţiei eucariotele cele mai numeroase şi mai heterogene au fost protistele unicelulare microscopice. Respiraţia la primele eucariote a fost introdusă de bacterii simbiotice asemănătoare cu proteobacteriile. Ulterior cea mai mare parte a genelor bacteriene au migrat către nucleul gazdei , cu excepţia unui număr mic de gene conţinute în organitele numite mitocondrii. Eubacteriile stau la originea fotosintezei. Dezvoltarea pigmenţilor capabili să folosească energia care provenea de la lumina solară pentru „a fixa” bioxidul de carbon sau azotul şi de a elabora molecule organice complexe a reprezentat unul dintre evenimentele fundamentale ale evoluţiei. Acest eveniment s-a produs într-un stadiu destul de tardiv al evoluţiei când simbioţi de tipul cianobacteriilor au introdus fotosinteza la algele roşii, şi cea mai mare parte a genelor bacteriene au migrat către nucleul gazdei. Organizarea pluricelulară a apărut după aproximativ un miliard de ani. Analiza evoluţiei ribozomilor indică că animalele, plantele şi ciupercile provin din organisme asemănătoare algelor care s-au dezvoltat acum aproximativ 670 – 1 200 milioane de ani. Anumite fosile care au fost datate ca trăind acum 570 milioane de ani prezintă similitudini frapante cu embrionii animalelor contemporane, ceea ce sugerează că primele animale multicelulare erau de mărime mică comparabile cu larvele şi embrionii nevertebratelor contemporane. Divergenţa principalelor ramuri filogenetice ale animalelor a dus la dezvoltarea de animale macroscopice. În acest mod s+ar putea explica discordanţa între datele moleculare şi cele obţinute din analiza fosilelor care indică o divergenţă mult mai recentă a animalelor.

TA 1.9. Care sunt argumentele care susţin ipoteza că toate celulele vii au evoluat dintr-o celulă ancestrală strămoş. Închipuiţi-vă primele zile ale evoluţiei vieţii pe pământ. Credeţi că această celulă a fost singura care s-a format? TA 1.10. Formarea moleculelor complexe în condiţii prebiotice a avut loc deoarece: a) ele se formează spontan şi în prezent; b) aceste molecule sunt mai stabile decât molecule simple c) exista multă energie disponibilă pentru formarea acestor molecule; d) ele au fost formate de către organisme care folosind energia solară

14

Proiectul pentru Învăţământ Rural

Celule procariote şi eucariote

Cadrul 1.6. Escherichia coli, bacteria cea mai utilizată în laborator Escherichia coli, bacterie în formă de baton (2 μm lungime şi 1 μm diametru), comensală cu numeroase mamifere (prezentă în tractul intestinal al acestora) rămâne celula cea mai folosită în laboratoare. Ea face parte din categoria bacteriilor Gram negative care posedă un perete celular ce înconjoară membrana plasmatică şi o membrană externă. La nivelul membranei externe, există filamente numite pili care servesc la aderarea bacteriei la suprafaţa altor celule. Printre aceştia pilul sexual s-a dovedit a fi indispensabil pentru conjugare, fază în timpul căreia o parte din materialul genetic (sub formă de ADN monocatenar) se transmite de la o bacterie dotată cu un factor de fertilitate (bacterie masculă F+) la o bacterie lipsită de acest factor (bacterie femelă F-). Celula care a primit noul patrimoniu îl foloseşte pentru creşterea capacităţilor de reproducere. Datorată schimbării de material genetic se poate discuta de sexualitate bacteriană. Citoplasma E. coli conţine de la 1 la 4 molecule de ADN circular şi 15 000 la 30 000 ribozomi. În condiţii ideale de cultură, bacteria se multiplică rapid realizându-se o diviziune la fiecare 20 de minute. Datorită necesităţilor sale nutriţionale simple (apă, săruri minerale, şi o sursă de energie, de exemplu glucoză) este o bacterie uşor de cultivat. În numeroase laboratoare şi în băncile de celule sunt disponibile multe tulpini de E. coli cu caracteristici genetice diverse. E. coli reprezintă un model celular foarte utilizat în cercetările de biochimie şi biologie moleculară. Cunoştinţele acumulate asupra genomului său haploid şi metabolismului fac ca această bacterie să reprezinte una dintre .principalele unelte celulare pentru ingineria genetică.

1.2.3. De la procariote la eucariote: Teoria endosimbiotică

În mediul bogat în oxigen pe care nu îl puteau utiliza, anumite organisme anaerobe au dezvoltat o strategie de supravieţuire asociindu-se cu organismele aerobe şi trăind astfel în simbioză. Pentru moment teoria endosimbiotică constituie explicaţia cea mai plauzibilă privind originea celulelor eucariote. Mitocondriile şi cloroplastele, organite care asigură sinteza ATP în celulele eucariote, derivă dintr-un proces de endosimbioză care a implicat bacteriile aerobe şi cianobacteriile (vezi cadrele 1.4 şi 1.5). La eucariotele moderne acestea provin din mitocondriile şi cloroplastele străvechi şi se divid prin sciziparitate asemenea bacteriilor. Ele posedă propriul lor ADN şi toată maşinăria proprie sintezei proteinelor pe care le codifică. Există o omologie importantă de secvenţă nucleotidică între ADN mitocondrial şi cel al anumitor bacterii aerobe cât şi între ADN din cloroplaste şi cianobacterii.

Proiectul pentru Învăţământ Rural

15

Celule procariote şi eucariote

Teoria endosimbiotică este susţinută şi de similitudinile existente între ribozomii acestor organite şi cei ai bacteriilor dar şi prin asemănările structurale între cianobacterii şi cloroplaste (mărime, structurarea clorofilei în lamele). Deoarece cantitatea de ADN a diminuat enorm şi cea mai mare parte a proteinelor sunt codificate în prezent de genomul nuclear şi apoi importate în organite, acestea au devenit dependente de celulele gazdă (Tabelul din Figura 1.6). Caracteristici Organizare

Celule procariote Unicelulare Bacterii şi Archea

Mărime Metabolism

1-10 μm Aerob şi anaerob Oxidare dependentă de enzime din membrana plasmatică ADN circular în citoplasmă; Absenţa histonelor

ADN

ARN şi proteine

Sinteză în acelaşi compartiment

Nutriţie

Absorbţie şi fotosinteză (cianobacterii) Sciziune

Diviziune celulară Citoschelet Organite

Absenţă Puţin reprezentate sau absente

Celule eucariote Uni şi multicelulare; Celule diferenţiate care formează diverse ţesuturi protiste, ciuperci, plante, animale 5-100 μm Principal aerobe, oxidare restrânsă la compartimentul mitocondrial Complex ADN-histone, organizare în cromozomi în nucleu delimitat de către anvelopa nucleară Sinteză şi maturare de ARN în nucleu; proteine sintetizate în citoplasmă Absorbţie, ingestie şi fotosinteză (vegetale) Mitoză cu elaborarea unui fus mitotic Microtubuli, filamente de actină, etc Organite delimitate de către membrane: aparat Golgi, reticulum endoplasmic, mitocondrii, cloroplaste (vegetale) Endocitoză, exocitoză

Absenţă Mişcări intracelulare Figura 1.6. Comparaţie între principalele caracteristici ale procariotelor şi eucariotelor

1.3. Celulele eucariote şi diferenţierea celulară

16

Celulele eucariote sunt înconjurate de o membrană plasmatică. Alte membrane intracelulare delimitează compartimentele din interiorul celulei, fiecare compartiment fiind caracterizat prin structură, compoziţie biochimică şi funcţii precise (Figura 1.7).

Proiectul pentru Învăţământ Rural

Celule procariote şi eucariote

1.3.1. Celulele eucariote sunt compartimentate

Anvelopa nucleară delimitează două compartimente majore: nucleoplasma şi citoplasma. Mărimea şi complexitatea ADN din celulele eucariote au necesitat mecanisme elaborate pentru plierea sa sub o formă compactă cu ajutorul histonelor, proteine bazice care interacţionează cu ADN. Complexul fibros format, cromatina, se poate condensa şi răsuci pentru a da naştere structurilor numite cromozomi care conţin totalitatea genelor nucleare. La eucariote toată maşinăria necesară expresiei genelor se găseşte în nucleu, în timp ce la procariote, atât elementele responsabile de transcripţie cât şi de translaţie sunt prezente în citoplasmă. Cea mai mare parte a celulelor eucariote au un reticulum endoplasmatic (situs de sinteză a proteinelor şi fosfolipidelor), un aparat Golgi (organit care adăugă structuri glucidice proteinelor membranare, lizozomale şi secretoare), lizozomi (un compartiment care conţine enzime de digestie intracelulară), peroxizomi (compartimente care conţin enzimele implicate în reacţii oxidative) şi mitocondrii (structuri care convertesc în ATP energia conţinută în hrană). În tabelul din figura 1.8 sunt prezentaţi principalii constituenţi celulari şi câteva din funcţiile acestora.

Figura 1.7. Structura celulei animale (prelucrat după Molecular Cell Biology, Lodish, et all. 4th edition, 2000)

Proiectul pentru Învăţământ Rural

17

Celule procariote şi eucariote

Element celular

Descriere

Membrana Plasmatică

Bistrat lipidic de 7 nm grosime care conţine proteine interne şi periferice. Membrana care încercuieşte celula şi conţine canale şi pompe pentru trecerea ionilor şi a nutrienţilor, receptori pentru factorii de creştere, hormonii şi neurotransmiţătorii (în nervi şi muşchi). Aceste mecanisme moleculare permit transducţia stimulilor în semnale moleculare Legături punctiforme în centură între celulele asociate în filamente de actină fixate pe peretele citoplasmatic Legături punctiforme între celulele asociate în filamente intermediare pe peretele citoplasmatic Zonă localizată la nivelul regiunii de comunicare dintre două celule unde membranele plasmatice se reunesc pentru a forma canale intercelulare minuscule care permit trecerea moleculelor mici dintr-o celulă în alta Joncţiuni fine care există în spaţiul dintre două celule epiteliale „microfilamente” cu o mărime de 8 nm care constituie o reţea elastică vâscoasă în citoplasmă şi servesc drept ghid pentru deplasările generate de miozină Filamente cu o mărime de 10 nm, constituite din proteine de tip keratină care se comportă ca „tendoane” rigide în interiorul citoplasmei Polimeri tubulari formaţi din tubulină cu un diametru 25 nm, care reprezintă principalul constituent al cililor, flagelilor şi fusului mitotic. Microtubulii constituie ghidul pentru deplasarea organitelor generată de dineină şi kinezină Cilindru mic constituit din nouă triplete de microtubuli, situaţi în centrul celulei (centrozom) şi la baza cililor şi flagelilor; elementele pericentrozomale permit nuclearea şi fixarea microtubulilor Extensii cilindrice subţiri ale membranei plasmatice ranforsate în partea internă cu fascicule de filamente de actină Organite mobile care se proiectează în afara celulei şi care sunt înconjurate de membrana periplasmică; mişcările lor sunt acţionate de către o axonemă formată din nouă dublete de microtubuli, doi microtubuli distincţi şi o enzimă (dineina) care este implicată în transducţia de energie Formă de stocare a polizaharidelor Particule constituite din ARN şi proteine care sunt implicate în sinteza proteică Saci membranari aplatizaţi situaţi în mediul intracelular la care se asociază ribozomii responsabili pentru sinteza proteinelor secretate şi a proteinelor membranare care se integrează în membrană Saci membranari plaţi situaţi în spaţiul intracelular lipsit de ribozomi, care asigură sinteza lipidelor, metabolismul medicamentelor şi sechestrarea calciului Grupă de saci membranari aplatizaţi cu vezicule care asigură împachetarea proteinelor secretate şi participă la glicozilarea proteinelor Membrană dublă legată de reticulul endoplasmatic care limitează nucleul Canale de talie mare în membrana nucleară, cu dispozitive de control, care reglează trecerea proteinelor şi ARN către interiorul şi exteriorul nucleului Formă activă şi dispersată a cromatinei în interfază Cromatină condensată inactivă Situs intranuclear al sintezei şi maturării ARN ribozomal; asamblarea ribozomilor Structură sub formă de saci delimitată de o membrană impermeabilă care conţine enzime hidrolitice Structură sub formă de saci delimitată de membrană; conţin catalază şi diferite oxidaze Organit delimitat de o membrană externă netedă şi de o membrană internă crenelată care formează cripte; conţine enzime care asigură oxidarea acizilor graşi şi fosforilarea oxidativă a ADP

Joncţiuni aderente Desmozomi Joncţiuni comunicante Joncţiuni înguste Filamente de actină Filamente intermediare Microtubuli

Centrioli Microvilozităţi Cili/Flageli

Particule de glicogen Ribozomi Reticul endoplasmatic rugos Reticul endoplasmatic neted Aparatul Golgi Anvelopa nucleară Pori nucleari Eucromatina Heterocromatina Nucleol Lizozomi Peroxizomi Mitocondrie

Figura 1.8. Inventarul constituenţilor celulari la eucariote

18

Proiectul pentru Învăţământ Rural

Celule procariote şi eucariote

Compartimentarea conferă mai multe avantaje celulelor eucariote. Membranele constituie o barieră care permite fiecărui organit să păstreze un mediu ionic şi enzimatic particular. Fiecare dintre aceste medii favorizează subtipuri de reacţii biochimice vitale. Următoarele exemple ilustrează această noţiune: - Segregarea enzimelor de digestie din structura lizozomului previn distrugerea celorlalţi constituenţi celulari; - Sinteza de ATP este condiţionată prin caracterul impermeabil al membranei mitocondriale; reacţiile care eliberează energie antrenează apariţia unui gradient de protoni de o parte şi de alta a membranei, pe care enzimele membranare îl utilizează pentru a genera ATP; - Membrana nucleară delimitează un compartiment în care sinteza şi maturarea moleculelor de ARN transcrise de pe structura genelor se poate realiza înainte ca moleculele de ARNm matur să treacă în citoplasmă unde dirijează sinteza proteică; - Peretele celular este propriu celulei vegetale şi este constituit dintr-o îmbinare de fibre. Grosimea şi rigiditatea sa sunt variabile dar întotdeauna peretele este mult mai gros ca membrana plasmatică. Peretele celular compus din celuloză şi hemiceluloză constituie limita celulei vegetale (Figura 1.9).

Figura 1. 9. Structura celulei vegetale (prelucrat după Molecular Cell Biology, Lodish, et all. 4th edition, 2000)

La plante fotosinteza se realizează în cloroplaste locul producerii substanţelor energetice care poate fi comparat cu o centrală solară). Cloroplastul este şi el limitat de două membrane iar în stroma conţine ADN (Figura 1.9).

Proiectul pentru Învăţământ Rural

19

Celule procariote şi eucariote

TA 1.11. Dovezile că organismele au un strămoş comun sunt: a) acelaşi cod genetic care se regăseşte peste tot; b) toate organismele folosesc aminoacizi cu aceeaşi chiralitate; c) arborii filogenetici care se bazează pe secvenţe nucleotidice au un singur punct de origine; d) toate răspunsurile TA 1.12. Care dintre următoarele cuvinte desemnează un exemplu de organit? a) amiba; b) muşchiul; c) stomacul; d) sistemul digestiv; e) cloroplastul TA 1.13. Care din următoarele structuri nu este prezentă în celulele procariote? a) ADN; b) peretele celular; c) membrana plasmatică; d) ribozomii; e) reticulul endoplasmatic TA 1.14. Care dintre următoarele structuri nu este parte a sistemului endomembranar? a) mitocondria; b) aparatul Golgi; c) reticulul endoplasmatic rugos; d) lizozomii; e) reticulul endoplasmatic neted TA 1.15. Cele patru clase de compuşi cu carbon care se găsesc în toate organismele vii sunt: a) glucidele, lipidele, aminoacizii şi zaharurile; b) lipidele, aminoacizii, membranele şi nucleotidele; c) proteinele, lipidele, aminoacizii şi nucleotidele; d) aminoacizii, glucidele, nucleotidele şi acizii graşi

Celulele eucariote au un citoschelet. Trei tipuri de polimeri proteici: filamentele de actină, microtubulii şi filamentele intermediare, formează o matrice citoplasmatică vâscoasă şi elastică care furnizează celulei o structură cu o anumită rigiditate. Printre altele, filamentele de actină şi microtubulii servesc de ghid pentru mai multe proteine motoare care asigură mobilitatea întregii celule şi a organitelor în interiorul citoplasmei. Citoscheletul format din filamente de actină şi din microtubuli este indispensabil supravieţuirii, chiar şi la ciuperci şi la plante care posedă un perete de celuloză rigid care constituie o structură rigidă care împiedică mişcarea întregii celule. În ciuda acestei constrângeri determinată de peretele celular, aceste celule sunt dependente de existenţa citoscheletului şi a structurilor motoare care îi sunt asociate pentru a permite migrarea organitelor în interiorul citoplasmei şi segregarea cromozomului. TA 1.16. De ce este avantajos pentru celulele eucariote să dezvolte sisteme de membrane interne care să le permită importul substanţelor din exterior? TA 1.17. Care dintre următoarele organite nu sunt strâns asociate cu sistemul endomembranar? a) anvelopa nucleară; b) cloroplastul; c) aparatul Golgi (AG); d) membrana plasmatică; e) reticulul endoplasmatic (ER)

20

Proiectul pentru Învăţământ Rural

Celule procariote şi eucariote

TA 1.18. Care dintre următoarele organite este comun pentru celulele plantelor şi animalelor? a) cloroplastele; b) peretele celulozic; c) tonoplastul; d) mitocondria; e) centriolii TA 1.19. Care dintre următoarele perechi structură-funcţie sunt greşit combinate? a) nucleol; producere de ribozomi; b) lizozomi; digestie intracelulară; c) ribozomi; sinteză proteică; d) Golgi; secreţie de produşi celulari; e) microtubuli; contracţie musculară

Formarea unui organism pluricelular este rezultatul unei 1.3.2. Organismele organizări sociale în care celulele sunt corelate între ele (Figura pluricelulare: 1.10). diferenţiere celulară şi reproducere

Figura 1.10. Complexitatea organismului uman (prelucrat după Molecular Cell Biology, Lodish, et all. 4th edition, 2000)

Proiectul pentru Învăţământ Rural

21

Celule procariote şi eucariote

Eucariotele au dezvoltat un anumit număr de mecanisme pentru a asigura această funcţie. De exemplu, în urma diviziunii celulare, celulele fiice rămân legate între ele prin punţi citoplasmatice. La plantele superioare, pe lângă punţile citoplasmatice (plasmodesme), celulele sunt menţinute într-o structură rigidă de alveole constituite din celuloză (peretele celular), secretat de către celule. La animale, aderenţele dintre membranele plasmatice şi matriţele extracelulare participă la menţinerea organizării pluricelulare. În general, asocierea celulelor conduce la specializarea acestora pentru diferite funcţii (proces de diferenţiere) şi la cooperarea lor pentru a genera organisme superior organizate. În organismele pluricelulare, diferenţierea celulelor este însoţită de o mare diversitate de mărime şi formă, corelate cu funcţiile asigurate de celule (celule alungite: neuroni; celule disociate biconcave: hematiile). Astfel, celulele regrupate într-un organ adoptă morfologii variate (pavimentoase, cilindrice, etc.) adesea însoţite de diferenţieri apicale (microvilozităţi: celule epiteliale intestinale, etc.). În ţesutul conjunctiv, celulele sunt dispersate într-o matriţă extracelulară şi au formă de stea sau sunt fuziforme (condrocite, fibroblaste, etc.). Celulele epiteliale, sanguine sau germinale mascule sunt reînnoite pornind de la celule stem adulte (suşe) pe toată perioada vieţii unui individ. Spre deosebire de acestea, celulele înalt diferenţiate cum sunt neuronii şi celulele musculare au pierdut capacitatea de a se divide la fel de frecvent. Există şi cazuri intermediare, ca de exemplu celulele hepatice care nu se divid decât dacă ficatul a pierdut din masa sa normală (ablaţie parţială, hepatită). În general, la eucariotele unicelulare, mitoza constituie un mod de reproducere simplu, asexuat, care furnizează doi indivizi identici genetic cu celula parentală. Mecanismul de reproducere al animalelor şi plantelor superioare este mult mai complex. Reproducerea sexuată determină intervenţia a două celule germinale sau gameţi masculi şi femeli a căror fuziune asigură dezvoltarea unui descendent genetic diferit de cei doi părinţi. Într-un organism pluricelular se stabileşte foarte devreme o disjuncţie fundamentală între celulele germinale de care depinde propagarea speciei şi celelalte celule somatice care alcătuiesc structura organismului.

22

Proiectul pentru Învăţământ Rural

Celule procariote şi eucariote

TA 1.20. Care dintre organite sunt prioritar implicate în sinteza de acizi graşi, fosfolipide şi steroizi? a) ribozomii; b) lizozomii; c) reticulul endoplasmatic neted; d) mitocondria; e) veziculele contractile

TA 1.21. Ce nivel ierarhic de organizare reprezintă o frunză de arţar? a) ţesut; b) organ; c) organit; d) populaţie; e) organism

TA 1.22 În termenii organizării ierarhice a vieţii, o amibă reprezintă ___________ca nivel de organizare, în timp ce un câine reprezintă_______________ca nivel de organizare a) celulă şi organism ……….un organism multicelular b) numai o celulă……………un organism c) numai un organit…………o celulă şi un organism multicelular d) numai un organit………….un organism unicelular TA 1.23. care este diferenţa dintre un ţesut şi un organ? a) nivelul de organizare tisular este mult mai larg decât al organului; b) ţesutul nu este compus din celule; organul este compus din celule; c) un ţesut nu poate exista dacă nu este componentul unui organ, în timp ce un organ poate exista independent de ţesut; d) un organ include mai multe ţesuturi; e) ţesuturile nu sunt considerate ca fiind sisteme vii; organele sunt considerate ca fiind sisteme vii.

Proiectul pentru Învăţământ Rural

23

Celule procariote şi eucariote

1.4. Răspunsuri şi comentarii la testele de autoevaluare TA 1.1: a; TA 1.2: c; TA 1.3: c; TA 1.5: a; TA 1.6: e; TA 1.7: d; TA 1.8: b; TA 1.10: c; TA 1.11: d; TA 1.12: e; TA 1.13: e; TA 1.14: a; TA 1.15: d; TA 1.17: b; TA 1.18. d; TA 1.19: e; TA 1.20: c; TA 1.21: b; TA 1.22: a; TA 1.23: d TA1.4: 6x 1039 bacterii vor avea aceeaşi greutate cu Pământul 6x1039 =2t/20 în conformitate cu ecuaţia exponenţială de creştere Dacă rezolvăm ecuaţia pentru t, obţinem valoarea lui t =132 de generaţii. De la apariţia bacteriilor pe pământ (3,5 miliarde de ani) au trecut deja 5x1014 generaţii. Este clar că masa bacteriilor de pe această planetă este oricum apropiată de masa Pământului. Acesta ilustrează că creşterea exponenţială poate să apară numai timp de câteva generaţii (care reprezintă perioade de timp nesemnificative în raport cu timpul evolutiv). În orice scenariu realist, resursele de hrană devin limitate foarte rapid. Acest calcul simplu, ne demonstrează că această capacitate de diviziune rapidă în condiţiile unei cantităţi de hrană insuficientă, reprezintă numai unul dintre factorii care asigură supravieţuirea speciei. Hrana, este în general săracă (insuficientă) şi celulele bacteriene sunt printre cele mai adaptate la schimbările de mediu. TA 1.9: Există o serie de dovezi care să ateste existenţa unui strămoş comun. Analiza celulelor actuale dovedeşte un incredibil grad de similitudine la nivelul componentelor de bază care realizează procesele interne din majoritatea tipurilor celulare. De exemplu, multe căi metabolice sunt conservate de la o celulă la alta iar componentele care intră în structura acizilor nucleici şi a proteinelor sunt aceleaşi în toate celulele vii. De asemenea este demonstrată existenţa unor proteine cu rol important în celulă care au o structură aproape similară la procariote şi eucariote. Cu toate că teoretic există mai multe posibilităţi de a sintetiza proteine care pot realiza aceleaşi funcţii, există dovezi copleşitoare care ne demonstrează că cele mai importante structuri şi procese au fost inventate numai o singură dată şi apoi au devenit legi sau procese cheie în timpul evoluţiei. Totuşi, pare cu adevărat neverosimil ca prima celulă supravieţuitoare să devină fondatorul primordial al lumii celulare de astăzi. Cum evoluţia nu este un proces dirijat/direcţionat cu un scop fix/cu o finalitate sau progresie decisă anterior, este mult mai probabil să fi existat un număr mare de experienţe celulare (încercări celulare) nereuşite care să se fi multiplicat (replicat) un anumit timp şi apoi să dispară deoarece nu se puteau adapta la schimbările de mediu sau nu puteau să supravieţuiască în competiţie cu alte tipuri celulare. Deci, putem specula că strămoşul primordial celular a fost o celulă „norocoasă” care a ajuns într-un mediu relativ stabil în care a avut şansa să se multiplice şi să evolueze. TA 1.16: După ce preiau substanţele din mediu de tipul particulelor de hrană, celulele eucariote le pot reţine pentru hrănirea individuală (pentru propriul interes). Spre deosebire de eucariote, bacteriile nu deţin modalităţile de capturare a unor cantităţi (bucăţi) de hrană; acestea pot exporta substanţele utile pentru degradarea hranei (substanţelor hrănitoare) din mediu, dar produşii acestei activităţi trebuie apoi împărţiţi/distribuiţi cu alte celule din aceeaşi vecinătate.

24

Proiectul pentru Învăţământ Rural

Celule procariote şi eucariote

1.5. Lucrare de verificare 1 1.1. Care dintre următoarele componente este prezent în celulele procariote? a) mitocondria; b) ribozomii; c) anvelopa nucleară; d) cloroplastele; e) reticulul endoplasmatic 1.2. Care dintre următoarele afirmaţii fac o distincţie corectă între celulele procariote şi eucariote care poate fi atribuită absenţei citoscheletului la procariote? a) organitele compartimentate sunt prezente numai în celulele eucariote; b) la procariote nu se observă o deplasare citoplasmatică; c) numai celulele eucariote sunt capabile de mişcare; d) de obicei celulele procariote au un diametru de 10 μm sau mai mic; e) numai celulele eucariote concentrează materialul genetic într-o regiune separată de restul celulei; 1.3. Care sunt principalele componente din structura ADN? a) proteinele; b) glucidele şi lipidele; c) 20 de aminoacizi; d) 26 nucleotide; e) patru nucleotide 1.4. Menţinerea unui mediu intern relativ stabil se referă la: a) taxonomie; b) selecţie naturală; c) evoluţie; d) teorie celulară; e) homeostazie 1.5. Care dintre următoarele afirmaţii furnizează dovezi privind existenţa unui strămoş comun al tuturor organismelor vii? a) folosirea ubiquitară a catalizei de către sistemele vii; b) universalitatea codului genetic; c) structura nucleului; d) structura cililor; e) structura cloroplastelor 1.6. Care dintre următoarele sunt celule procariote? a) plante; b) fungi; c) bacterii; d) animale; e) atât B cât şi C 1.7. Care din următoarele structuri nu este prezentă în celulele procariote? a) ADN; b) peretele celular; c) membrana plasmatică; d) ribozomii; e) reticulul endoplasmatic 1.8. Care dintre următoarele structuri nu conţine ribozomi funcţionali? a) o celulă procariotă; b) o mitocondrie de la plante; c) un cloroplast; d) o mitocondrie animală; e) un nucleol 1.9. Care dintre organite sunt în principal implicate în sinteza de acizi graşi, fosfolipide şi steroizi? a) ribozomii; b) lizozomii; c) reticulul endoplasmatic neted; d) mitocondria; e) veziculele contractile 1.10. Care structură reprezintă situsul sintezei proteinelor care pot fi exportate din celulă? a) reticulul endoplasmatic rugos; b) lizozomii; c) plasmodesma; d) veziculele Golgi; e) joncţiunile înguste 1.11. Cărei structuri îi veţi asimila funcţia de secreţie care determină, de exemplu, formarea unui nou perete celular la plante? a) reticulul endoplasmatic neted; b) lizozomii; c) plasmodesma; d) veziculele Golgi; e) joncţiunile înguste 1.12. Care dintre următoarele afirmaţii nu sunt împerecheate corect? a) nucleol - ARN ribozomal; b) nucleu-replicarea ADN; c) lizozomi – sinteză proteică; d) membrană celulară - bistrat lipidic; e) citoschelet – microtubuli 1.13. Care dintre următoarele componente celulare nu este direct implicată în sinteză sau secreţie? a) ribozomii; b) reticulul endoplasmatic rugos; c) corpii Golgi; d) reticulul endoplasmatic neted; e) lizozomii 1.14. Din următoarele afirmaţii care este comună pentru mitocondrii şi cloroplaste? a) se produce ATP; b) este prezent ADN; c) sunt prezenţi ribozomi; d) numai b şi c sunt corecte; e) a, b şi c sunt corecte Proiectul pentru Învăţământ Rural

25

Celule procariote şi eucariote

1.15. Organitele care conţin ADN sunt: a) ribozomi; b) mitocondrii; c) cloroplaste; d) numai b şi c sunt corecte; e) a, b şi c sunt corecte 1.16. O celulă secretoare animală şi celulele fotosintetice dintr-o frunză sunt similare în multe puncte de vedere cu excepţia: a) ambele au aparate Golgi; b) ambele au mitocondrii; c) ambele au proteine de transport pentru transportul activ al ionilor; d) ambele au cloroplaste; e) ambele au o membrană celulară 1.17. Care dintre următoarele structuri sunt capabile să convertească energia luminoasă în energie chimică? a) cloroplastele; b) mitocondriile; c) leucoplastele; d) peroxizomii; e) corpii Golgi Pentru următoarele întrebări, folosiţi o literă care să aducă în corespondenţă structura cu propriul său tip celular. Alegeţi categoria cea mai largă. Fiecare răspuns poate fi folosit odată, de mai multe ori sau niciodată. A. o trăsătură pentru toate celulele B. se găsesc numai în celulele procariote C. se găsesc numai în celulele eucariote D. se găsesc numai în celulele plantelor E. se găsesc numai în celulele animale 1.18. Membrana plasmatică 1.19. Tonoplastul 1.20. Nucleoidul Referiţi-vă la următorii cinci termeni pentru a răspunde la următoarele întrebări. Alegeţi cel mai adecvat termen pentru fiecare fază. Fiecare termen poate fi folosit o dată, de mai multe ori sau niciodată. A. lizozomii B. tonoplaştii C. mitocondria D. aparatul Golgi E. peroxizomii 1.21. Secretă multe polizaharide 1.22. Conţine enzime hidrolitice 1.23. Ajută la reciclarea materialului organic celular 1.24. Unul dintre principalii transformatori celulari de energie 1.25. Membranele care înconjoară cloroplastul provin: a) numai de la strămoşul procariot al cloroplastelor; b) de la strămoşul procariot (membrana internă) şi de la gazda eucariotă (membrana externă); c) de la strămoşul procariot (membrana externă) şi de la gazda eucariotă (membrana internă); d) numai de la strămoşul eucariot.

26

Proiectul pentru Învăţământ Rural

Celule procariote şi eucariote

1.6. Bibliografie unitatea 1 1. Biologie cellulaire, Jean Michel Petit, Abderrahman Maftah, Raymond Julien, Masson,, Paris 1997, Chapitre 1: Cellules de procaryotes et d’eucaryotes 2. Cell Biology, Thomas D. Pollard, William C. Earnshaw, Elsevier, 2004 3. http://www.geniebio.ac-aix-marseille.fr/- Ressources Multimédia en Biochimie Génie Biologique; Biotechnologies 4. http://www.bio.umontreal.ca/cours/Bio-1154/evolution.htm, Biologie cellulaire I 5. http://www.boskitos.com/fac/biocel/ Biologie Cellulaire PCEM1 6. http://www.web-books.com/MoBio/Free/Contents.htm, Molecular Biology Web Book Contents 7. http://www.snv.jussieu.fr/bmedia/sommaires/bc.htm, Biologie Cellulaire 8. http://schwann.free.fr/biocell03.html, Cours de Biologie Cellulaire 9. Biologie moléculaire, Abderrahman Maftah, Raymond Julien, Masson, Paris 1996 10. Biologie Moléculaire et Cellulaire, Exercices et corriges, Nathan Université, 1994 11. Biochimie, génétique, Biologie moléculaire, J Etienne, 3eme édition, Masson, 1996 12: Biologie cellulaire, Thomas D. Pollard, William C. Earnshaw, edition francaise, Elsevier, 2004, Chapitre 1: Principes généraux de l’organisation de la cellule 13, The Cell a Molecular Approach, Geoffrey M. Cooper, Robert E. Hausman, third edition, ASM Press, 2004, Chapter 1: An overview of cells and cell research 14. Biologie Cellulaire et Moléculaire, concepts et expériences, Gerald Karp, De Boeck Université, 1998, Chapitre 1: Introduction à l’étude de la biologie cellulaire 15. Essential Cell Biology, An introduction to the Molecular Biology of the Cell, International Student edition, B. Alberts, D. Bray, A. Johnson, J. Lewis, M. Raff, K. Roberts, P. Walter, Garland Publishing Inc, 2004, Chapter 1: Introduction to Cells. 16. Biology, N. A. Campbell, J. B. Reece, William Barstow, Editor, International Edition, Benjamin Cummings, sixth Edition, 2002, Chapter 7: A tour of the Cell 17. Test Bank For Biology, N. A. Campbell, J. B. Reece, William Barstow, Editor, , Benjamin Cummings, sixth Edition, 2002, Chapter 7: A tour of the Cell 18. Molecular Biology of the Cell, A problems approach, J. Wilson, T. Hunt, Garland Science, Forth edition, 2002 20. www.ustboniface.mb.ca, Bienvenue à la page d'accueil pour le cours Biologie 21. Molecular Cell Biology, Lodish, Berck, Zypousky, Matsudaira, Baltimore, Darnell, 4th edition, 2000, Freeman and Company, Chapter 1: Life Begins with Cells 22. www.med.univ-angers.fr, Licence de Biologie Cellulaire. 23. web-books.com, Molecular Biology Web Book Contents 24. http://www.cu.lu/labext/rcms/cppe/cellfr.html, CPPE Module S2: Biologie cellulaire 25. http://www.cbc.umn.edu/~mwd/courses.html, Course/Tutorial on Cell Biology 26. http://web.mit.edu/esgbio/www/7001main.html, Hypertextbook Cell Biology 27. http://www.univ-ag.fr/, Cours de Biologie cellulaire 28. www.emc.maricopa.edu/faculty/farabee/BIOBK/BioBookCHEM1.html, On-Line Biology Book: 29. http://www.infobiogen.fr/deambulum/index.php, DEAMBULUM - Cours en biologie : Biologie cellulaire

Proiectul pentru Învăţământ Rural

27

Tehnici de explorare celulară

Unitatea de învăţare 2 TEHNICI DE EXPLORARE CELULARĂ pag

Cuprins Introducere Obiective Unitatea 2 Informaţii generale despre evaluare 2. 1. Culturi celulare 2.1.1. Mediile de cultură 2.1.2. Tipuri de culturi

2. 2. Metode de microscopie 2.2.1. Microscopia optică 2.2.2. Microscopia de fluorescenţă

2.3. Metode de separare a componentelor celulare 2.3.1. Centrifugarea 2.3.1.1. Principiul centrifugării 2.3.1.2. Variantele centrifugării 2.3.1.3.Centrifugarea în gradient de densitate 2.3.2. Cromatografia 2.3.2.1. Cromatografie pe hârtie 2.3.2.2.Cromatografia pe coloană în fază lichidă 2.3.2.3. Cromatografia lichidă de înaltă presiune 2.3.2.4 Gel filtrarea 2.3.2.5. Cromatografia pe schimbători de ioni 2.3.2.6. Cromatografia de afinitate 2.3.2.7. Cromatografia în fază gazoasă 2.3.3. Electroforeza 2.3.3.1. Principiul electroforezei 2.3.3.2. SDS-PAGE 2.3.3.3. Imunoelectrofocalizare 2.3.3.4. Electroforeza bidimensională 2.3.3.5. Purificarea şi separarea acizilor nucleici 2.3.3.6. Aplicaţii electroforeză

2.4. Tehnici de marcare 2.4. 1. Marcarea radioactivă 2.4.2. Marcarea cu anticorpi

2.5. Tehnici ADN recombinat 2.5.1. Clonare moleculară 2.5.2. Transformare de bacterii 2.5.3. Enzimele de restricţie 2.5.4. Construirea unei bănci de ADN genomic 2.5.5. Construirea unei bănci de ADNc 2.5.6. Reacţia PCR

2.6. Răspunsuri şi comentarii la testele de autoevaluare 2.7. Lucrare de verificare 2 2.9. Bibliografie 28

28 29 29 30 31 32 33 35 35 37 40 41 41 42 44 45 46 47 48 48 49 49 50 50 51 51 52 52 53 54 55 55 55 58 58 60 62 64 65 66 68 71 73

Proiectul pentru Învăţământul Rural

Tehnici de explorare celulară

Introducere În cadrul acestei unităţi de studiu vă veţi putea familiariza cu principalele tehnici folosite în explorarea celulelor. Acestea vizează: realizarea de culturi celulare primare sau cultivarea de linii celulare cu anumite caracteristici şi analiza celulelor si subcomponentelor lor prin metode microscopice. Un loc important îl ocupă tehnicile de separare şi purificare a componentelor celulare în scopul caracterizării cât mai exacte a acestora. Sunt trecute în revistă principalele tehnici de marcare şi nu în ultimul rând sunt prezentate principiile şi aplicaţiile unora dintre cele mai moderne tehnici de obţinere a ADN recombinat. Materialul este presărat cu teste de autoevaluare pe care vă recomandăm să le rezolvaţi pe măsură ce parcurgeţi materialul teoretic. Acestea au rolul de a vă confirma/infirma înţelegerea noţiunilor prezentate şi reprezintă o modalitate utilă de autoverificare a cunoştinţelor indispensabilă rezolvării testelor din lucrarea de verificare nr. 2. La finalul capitolului sunt prezentate răspunsurile la testele de autoevaluare pe parcurs şi lucrarea de verificare pe care la finalul parcurgerii unităţii o veţi trimite tutorelui.

Obiective Unitatea 2 Obiective generale ¾ Utilizarea conceptelor caracteristice metodelor de investigare celulară pentru înţelegerea complexităţii şi diversităţii lumii vii; ¾ Înţelegerea investigării fenomenelor şi proceselor caracteristice lumii vii la nivel celular.

Obiective specifice La terminarea studiului acestei unităţi trebuie să fiţi capabili să: 9 înţelegeţi diferenţa între culturi celulare primare şi linii; 9 prezentaţi succint şi clar principalele tehnici microscopice, principiile şi aplicaţiile acestora; 9 faceţi diferenţa între diferitele tehnici de separare a componentelor celulare; 9 definiţi principiile principalelor tehnici de separare şi să puteţi enumera unele dintre aplicaţiile lor; 9 precizaţi care sunt principalele tehnici folosite în tehnologia ADN recombinat şi să recunoaşteţi aplicaţiile acestora,

Proiectul pentru Învăţământ Rural

29

Tehnici de explorare celulară

Evaluarea pe parcurs - Testele de autoevaluare (TA) ¾ Unitatea conţine în structura sa 31 teste de autoevaluare distribuite astfel încât să asigure o fixare eficientă a noţiunilor prezentate. ¾ Fiecare test de evaluare se bazează pe parcurgerea şi înţelegerea materialului teoretic prezentat. ¾ Unele dintre testele de autoevaluare sunt întrebări urmate de trei sau patru sau cinci răspunsuri posibile, fiecare indicat cu o literă în dreptul lui. Pentru a răspunde la aceste întrebări, trebuie să încercuiţi litera din dreptul răspunsului pe care îl consideraţi ca fiind corect. ¾ Alte teste vă vor cere să scrieţi răspunsuri scurte sau să încercuiţi răspunsul corespunzător spaţiilor libere; ¾ Există şi teste de autoevaluare care vor necesita rezolvarea unei probleme sau scrierea unor scurte eseuri prin care să exprimaţi părerea voastră asupra anumitor aspecte. ¾ Răspunsurile la testele de autoevaluare sunt prezentate la sfârşitul unităţii, înainte de lucrarea de verificare 2. Dacă nu reuşiţi să rezolvaţi cu succes testele de autoevaluare în momentul întâlnirii lor pe parcursul parcurgerii textului vă recomandăm să reluaţi parcurgerea întregului material si apoi să reveniţi asupra rezolvării testelor. Unele dintre teste sunt simple şi direct corelate cu textul parcurs, răspunsul lor fiind evident în timp ce altele necesită o bună integrare a cunoştinţelor obţinute şi parcurgerea întregii unităţi. De asemenea, enunţurile testelor au rolul lor în fixarea cunoştinţelor şi în formarea unei viziuni de ansamblu asupra informaţiei prezentate. Lucrări de verificare notate de tutore. Gradul de dobândire a cunoştinţelor privind conceptele prezentate în această unitate de învăţare va fi cuantificat pe baza notei obţinute la Lucrarea de verificare Nr.2 care conţine 20 de probleme. Testele din lucrarea finală sunt de acelaşi tip cu testele de autoevaluarea din unitatea 2. Evaluarea răspunsurilor dumneavoastră la lucrarea de verificare 2 va fi realizată de tutore la termene stabilite de comun acord cu administraţia universităţilor care organizează formarea. Răspunsurile problemelor vor fi transmise direct universităţilor organizatoare. Evaluarea pe parcurs are o pondere de 50% din nota finală. Lucrarea de verificare 2 va reprezenta 4% din verificarea pe parcurs. Cele 20 de întrebări vor fi echivalente şi vor fi notate cu 2 puncte fiecare, astfel încât pentru o lucrare corectă să puteţi acumula 40 de puncte. Materialul prezentat conţine patru cadre suplimentare şi 23 de figuri care prezintă informaţii menite să întregească sau să clarifice noţiunile prezentate. Acestea nu sunt opţionale deoarece vă vor ajuta la lămurirea noţiunilor teoretice prezentate. Un rezultat bun la lucrarea de verificare este clar condiţionat de parcurgerea cu responsabilitate a testelor de autoevaluare, a cadrelor şi de înţelegerea figurilor. 30

Proiectul pentru Învăţământul Rural

Tehnici de explorare celulară

2.1. Culturi celulare

În ultimele decenii au fost posibile descoperiri fundamentale în domeniul biologiei organismelor graţie tehnicilor de culturi celulare atât procariote cât şi eucariote. Dacă bacteriile şi drojdiile cresc rapid pe medii simple, celulele provenind de la eucariote superioare (de exemplu, celulele de mamifere) în cultură nu îşi conservă capacitatea de a se multiplica decât dacă mediul de cultură aduce un anumit aport de elemente nutritive şi factori de creştere (Cadrul 2.1). Culturile de celule (sau de ţesuturi) îşi au originile în secolul 19 când oamenii au început să examineze în detaliu ţesuturile şi organele organismelor în recipiente de sticlă. Deşi, termenul in vitro înseamnă literal “în sticlă”, în prezent majoritatea culturilor celulare se realizează în sau pe plastic şi pe alte tipuri de materiale (Cadrul 2.2). Prima încercare, încununată de succes, de a cultiva celule izolate din organismul vertebratelor a fost realizată în anul 1907 de către Ross Harrison, care era interesat în diferenţierea neuronilor. Alexis Carrel, 1912, a cultivat celule în diferite condiţii şi a constatat că în condiţiile în care mediul este corespunzător şi schimbat cu regularitate, celulele pot creşte în cultură o perioadă îndelungată de timp. În prezent, culturile celulare îşi propun să reproducă in vitro condiţiile existente in vivo pentru a permite celulelor “normale” (netumorale) să crească în cultură. Sunt cultivate în laborator celule dintr-un număr mare de organisme şi ţesuturi din diferite surse pentru scopuri foarte diferite: - studiul propriu-zis al sistemelor celulare (proliferare, condiţii de creştere, evoluţia ciclului celular, controlul creşterii celulelor tumorale şi modularea expresiei genice); - în domeniul biologiei dezvoltării pentru a realiza studii de dezvoltare şi diferenţiere; - obţinerea de plante şi animale transgenice; - studii de citogenetică şi genetică moleculară; - studii de citotoxicitate pentru diferite medicamente şi substanţe xenobiotice (agenţi poluanţi); După separarea celulelor din ţesuturi, există 2 modalităţi de bază prin care acestea pot fi cultivate: - într-o cultură de masă, când în recipientul de cultură este adăugat un număr relativ mare de celule, care colonizează fundul recipientului şi formează un strat de celule relativ uniform generând un monostrat. - într-o cultură clonală, când un număr relativ mic de celule este introdus în recipientul de cultură şi se fixează de substrat la o anumită distanţă una de cealaltă. În acest caz, proliferarea celulelor determină formarea de colonii individuale sau clone celulare, ale căror membri sunt derivaţi din aceeaşi celulă iniţială.

Proiectul pentru Învăţământ Rural

31

Tehnici de explorare celulară

2.1.1. Mediile de cultură

Alegerea mediului de cultură diferă în funcţie de scopurile urmărite. Majoritatea mediilor de cultură sunt constituite dintr-un amestec de molecule cu masă moleculară mică (Cadrul 2.1). Aportul de proteine şi de factori de creştere şi de adeziune se realizează, în general, prin adăugarea de ser (10-20%). Cel mai folosit este SFV (serul fetal de viţel) la care se adaugă uneori molecule mult mai specifice în funcţie de tipul culturii realizate: - insulină care stimulează proliferarea celor mai multe tipuri celulare in vivo şi care acţionează sinergic cu numeroşi hormoni; - factori de creştere: factorul de creştere epidermic (EGF Epidermal Growth Factor), factorul de creştere fibroblastic (FGF Fibroblastic Growth Factor), factorul de creştere derivat din plachete (PDGF – Platelet Derived Growth Factor), factorul de creştere nervos (NGF - Nervous Growth Factor); - proteine de tipul transferinei care asigură transportul fierului şi al albuminei implicată în fixarea şi transportul acizilor graşi; - factori de adeziune, fibronectină, colagen, care asigură fixarea celulelor de flaconul de cultură. Majoritatea mediilor folosite uzual sunt disponibile comercial sub formă de pudră sau lichidă.

Cadrul 2.1.Compoziţia mediului de cultură pentru celulele de mamifere Aminoacizi Vitamine Săruri Alte anorganice componente Arginină Asparagină Acid aspartic Cisteină Acid glutamic Glutamină Glicină Histidină Hidroxiprolină Leucină Lizină Metionină Fenilalanină Prolină Serină Treonină Triptofan Tirozină

32

Biotină Colină Pantotenat Acid folic Nicotinamidă Piridoxal Riboflavină Vitamina B12 Tiamină

Ca(NO3)2 KCl MgSO4 NaCl NaHCO3 Na2HPO4

Glucoză HEPES Roşu fenol Penicilină Streptomicină

Concentraţia aminoacizilor variază de la 0,1 la 0,2 mM; vitaminele nu depăşesc 1μM. Cele două antibiotice, penicilină şi streptomicină, împiedică creşterea eventualelor bacterii contaminante. Roşu fenol serveşte de indicator de pH. Culturile se realizează în flacoane de sticlă sau din plastic speciale care permit ataşarea celulelor. Flacoanele sunt menţinute la 370C într-o atmosferă care conţine, în general, 5% CO2.

Proiectul pentru Învăţământul Rural

Tehnici de explorare celulară

2.1.2. Tipuri de culturi

După disocierea dintr-un ţesut prin tratament mecanic sau prin hidroliză enzimatică menajată (de exemplu cu tripsină), celulele aduse în suspensie pot să supravieţuiască în cultură. Dacă celulele provin direct dintr-un ţesut cultura se numeşte primară. În general, celulele sunt selectate din cultura primară şi plasate în alte recipiente pentru a obţine culturi secundare. În cursul pasajelor succesive (timp de mai multe săptămâni), celulele continuă să exprime proprietăţile specifice ţesutului lor de origine. De exemplu, celulele care provin din muşchiul scheletic embrionar formează fibre musculare gigantice care păstrează capacitatea de contractare; celulele nervoase stabilesc sinapse între ele. Astfel de fenomene nu pot fi studiate decât în cultură. Cu toate acestea durata de viaţă a celulelor rămâne limitată. Celulele din piele, în principal fibroblastele nu se pot divide mai mult de cinzeci de ori înainte de a muri. În prezent, lista celulelor care pot fi crescute în cultură este extrem de largă şi include elemente ale ţesuturilor conjunctive (fibroblaste, osteoblaste, condrocite), celule musculare, celule epiteliale de la nivelul ficatului, plămânului, pielii, sânului, rinichiului, etc.; celule nervoase, endocrine, melanocite, celule tumorale, etc. Identificarea unor markeri specifici unui anumit tip celular face posibilă determinarea tipului de ţesut şi liniei din care au derivat aceste celule. Celulele care provin din tumori canceroase sunt nemuritoare şi se propagă nedefinit ducând la constituirea de linii celulare. Cea mai cunoscută linie (celule HeLa) provine din carcinom uterin (Helene Lacks) şi este perpetuată în laboratoare din 1952. Celulele normale după transformare cu virusuri sau agenţi tumorigeni devin nemuritoare. Liniile celulare prezintă următoarele avantaje: - manifestă viteze mari de creştere la densităţi celulare mari; - prezintă necesităţi mici pentru ser; - sunt capabile de creştere în suspensie sau pe suprafaţă; - pot fi menţinute cu uşurinţă în medii simple. Principalele lor dezavantaje sunt reprezentate de o instabilitate cromozomială mai mare, divergenţa cu fenotipul donor şi pierderea markerilor specifici ţesutului. În prezent, numărul mare de linii celulare constituie un material folosit cu predilecţie pentru înţelegerea mecanismelor de sinteză a constituenţilor celulari şi reglarea expresiei acestora în diferite procese fiziologice şi fiziopatologice. Pentru analiză se folosesc tehnici de microscopie, de identificare in situ şi studii moleculare.

Proiectul pentru Învăţământ Rural

33

Tehnici de explorare celulară

Cadru 2.2. In Vivo, in Vitro, in Silico In vivo şi in vitro, aceste două locuţiuni latine, prima semnificând „în organismul viu” şi a doua „în sticlă”, sunt folosite pentru a desemna condiţiile în care se derulează experimentele biologice. Dacă termenul in vitro este fără ambiguitate deoarece se referă la experienţele care se realizează în afara organismului viu, în general în tuburi de experienţă, termenul in vivo se referă la reacţiile fiziologice observabile în organismul viu. Se consideră că acesta se foloseşte abuziv când este folosit pentru celule în cultură scoase din contextul organismului. Acestor locuţiuni li se adaugă acum termenul „in silico” care desemnează „cipurile” pe bază de siliciu care sunt utilizate pentru calculatoarele moderne. De fapt, astăzi este dificil de conceput cercetarea fără sprijinul informatic. Fără capacitatea de analiză şi stocare a mijloacelor informatice nu ar fi posibilă memorizarea miilor de secvenţe de ADN cunoscute şi nici compararea acestora cu informaţiile stocate în băncile de date într-un interval de câteva minute. Informatica nu intervine numai în stocarea informaţiei genetice ci se dovedeşte la fel de indispensabilă ca unealtă în modelizarea moleculară şi în analiza structurilor tridimensionale. Studiul interacţiilor moleculă-moleculă (de exemplu: ligand-receptor) graţie modelării asistată de calculator constituie astăzi baza concepţiei noilor medicamente.

TA 2.1. Prezentaţi succint folosind între 50 şi 100 de cuvinte principalele scopuri pentru care sunt folosite culturile de celule.

TA 2.2. Care dintre afirmaţiile de mai jos privind avantajele utilizării liniilor celulare sunt false: a) manifestă viteze mari de creştere la densităţi celulare mari; - b) prezintă necesităţi mici pentru ser; - c) prezintă instabilitate cromozomială mai mare; - d) sunt capabile de creştere în suspensie; - e) pot fi menţinute cu uşurinţă în medii simple. - TA 2.3. Care dintre următoarele afirmaţii privind compoziţia mediilor de cultură pentru celulele eucariote sunt adevărate: - a) aminoacizi; - b) antibiotice; - c) nucleotide purinice şi pirimidinice; - d) ser fetal de viţel; - e) acizi graşi esenţiali TA 2.4. Comentaţi într-un scurt eseu de maxim 100 de cuvinte termenii: in vivo, in vitro şi in silico.

34

Proiectul pentru Învăţământul Rural

Tehnici de explorare celulară

2.2. Metode de microscopie

Din cauză mărimii reduse a obiectului de studiu, biologia celulară depinde, mult mai mult decât alte domenii ale biologiei, de punerea la punct de noi aparate şi tehnologii. Vizualizarea la microscop este posibilă graţie proprietăţilor favorabile ale spectrului electromagnetic: 1) Lungimea de undă a luminii vizibile permite vizualizarea celulelor întregi în timp ce lungimile de undă ale electronilor permit vizualizarea asamblării macromoleculelor şi organitelor celulare. 2) Lentilele de sticlă permit focalizarea luminii vizibile în timp ce lentilele electromagnetice focalizează electronii. Limita de rezoluţie, adică capacitatea de a distinge două puncte diferite, este direct corelată cu lungimea de undă a luminii. În general, limita puterii de rezoluţie în lumină vizibilă cu lentile de sticlă este situată în jur de 0,2 μm. Pentru moment razele X cu lungime de undă scurtă nu permit vizualizarea, deoarece nu există tehnici adecvate de focalizare, dar analiza de difracţie prin cristale moleculare constituie până în prezent principala tehnică de determinare a structurii atomice a macromoleculelor celulare. Microscopul asigură două funcţii: i) mărirea imaginii unui eşantion pentru a o face vizibilă cu ochiul liber sau cu o cameră. Cu toţii ştim că o lentilă permite mărirea unei imagini; ii) realizarea unui contrast care permite evidenţierea detaliilor imaginii mărite este o altă proprietate la fel de importantă a microscopiei.

2.2.1. Microscopia optică

Microscopia optică (sau fotonică) a relevat biologilor că celulele, sub formă de agregate, intră în constituţia ţesuturilor vegetale şi animale. Această descoperire pe care a făcut-o Van Leeuwenhoek în 1964, a stat la originea teoriei celulare a lui Schwann (1835) şi la dezvoltarea extraordinară a tehnicilor de microscopie în biologie. Aspecte generale Microscopia optică foloseşte devierea unui flux (ondulatoriu) de fotoni prin două sisteme convergente (lentile), obiectivul şi ocularul, pentru a forma o imagine mărită a obiectului studiat (Figura 2.1a). Calitatea imaginii depinde de puterea de separare numită şi rezoluţia microscopului. Aceasta se calculează folosind formula: d =0,61 x λ/n x sin α unde d corespunde distanţei minime care separă cele două obiective. Puterea de separare se poate ameliora diminuând lungimea de undă λ, crescând indicele de refracţie n al mediului situat între lamelă şi obiectiv şi crescând unghiul α reprezentat de înclinaţia cea mai mare a razelor care penetrează în obiectiv în raport cu axa optică a microscopului (Figura 2.1 b).

Proiectul pentru Învăţământ Rural

35

Tehnici de explorare celulară

Figura 2.1. Structura microscopului optic

Microscopia optică clasică este pe fond clar, adică eşantionul este iluminat de o lumină albă omogenă. Cea mai mare parte a celulelor nu absorb într-un interval relativ îngust al spectrului vizibil (λ cuprinsă între 400 şi 700 nm), astfel încât contrastul este foarte slab în urma unei iluminări pe fond clar. Limita de rezoluţie este de 0,2μm, de 500 de ori mai mare decât a ochiului uman. Totuşi cele mai mici structuri biologice observabile cu acest tip de microscop sunt bacteriile sau organitele celulare (mitocondriile, cloroplastele) a căror mărime este de aproximativ 0,5μm. Din acest motiv sunt folosite tehnici de colorare care permit creşterea absorbţiei luminii şi contrastul. Eşantioanele trebuie să fie relativ subţiri, de ordinul a 1 μm, deoarece coloraţia nu permite vizualizarea de ţesuturi groase. Secţiunile realizate pentru studii histologice sau anatomopatologice se obţin fixând celulele printr-un tratament chimic înainte de includerea acestora în parafină sau răşină şi decuparea eşantionului cu un microton (aparat care permite decuparea eşantionului în secţiuni foarte subţiri). Secţiunile astfel obţinute sunt tratate cu diferiţi coloranţi. Observarea celulelor vii necesită alte tehnici de contrast. Acestea sunt toate utile şi pentru studiul celulelor fixate. Microscopul cu contrast de fază permite obţinerea contrastului utilizând interferenţa dintre lumina difuzată de către eşantion şi o rază luminoasă de referinţă decalată. Variaţiile de grosime sau indice de refracţie (viteza de propagare a luminii) sunt vizibile chiar dacă eşantionul absoarbe puţin sau deloc lumina. TA 2.5. Prezentaţi trei modalităţi de mărire a rezoluţiei unui microscop;

TA 2.6. Credeţi că eşantioanele vizualizate pe lamă pot fi identice cu cele vii?

36

Proiectul pentru Învăţământul Rural

Tehnici de explorare celulară

Microscopia pe fond negru şi sub lumină polarizată este folosită în situaţii specifice în biologie. La examenul pe fond negru, eşantionul este luminat în funcţie de un unghi oblic, astfel încât numai lumina reflectată de eşantion să fie recuperată la nivelul obiectivului. De fapt într-o cameră întunecată putem vedea uşor particulele de praf într-o fază luminoasă. Contrastul furnizat permite vizualizarea microtubulilor izolaţi pe fond negru. Cu această tehnică pot fi observate numai structuri foarte simple. Microscopia în lumină polarizată permite obţinerea unei imagini strălucitoare pe un fond închis la culoare. 2.2.2.Microscopia de fluorescenţă

Acest tip de microscopie necesită prezenţa unui colorant sau unei proteine fluorescente în eşantion. Această tehnică este foarte sensibilă şi permite vizualizarea individuală a coloranţilor sau a proteinelor fluorescente. Absorbţia unui foton de către o moleculă fluorescentă antrenează excitarea unui electron către o stare energetică mai înaltă. Câteva nanosecunde mai târziu, molecula emite un foton cu o lungime de undă mai mare (de energie mai scăzută) când electronul revine la starea sa iniţială (Figura 2.2). Anumite molecule, numite flourocromi absorb fotonii la o anumită lungime de undă (excitaţie) pentru a emite apoi lumina la o altă lungime de undă (emisie) superioară celei de excitaţie. De exemplu, colorantul fluorescent rodamina, absoarbe lumină verde cu lungime de undă scurtă şi emite lumină roşie cu o lungime de undă mai mare. Microscoapele de fluorescenţă folosesc filtre şi oglinzi dicroice de reflecţie selectivă pentru a asigura: iluminarea eşantioanele fluorescente la lungimea de undă corespunzătoare excitaţiei şi vizualizarea luminii emise cu lungime de undă mai mare. Filtrele de emisie elimină lumina de excitaţie reflectată de către eşantion, astfel încât regiunile fluorescente ale eşantionul să apară luminoase. Pentru a deveni fluorescente, moleculele purificate (lipide, proteine sau acizi nucleici) pot fi marcate cu un colorant fluorescent şi injectate într-o celulă vie unde se vor orienta către localizarea lor naturală. Molecule marcate fluorescent pot fi utilizate pentru localizarea unei ţinte într-o celulă fixată şi permeabilizată. O posibilitate interesantă este folosirea acestei tehnici pentru a putea identifica molecule în celule fixate. În aceste cazuri colorantul fluorescent poate fi legat la un anticorp care recunoaşte specific molecula ţintă. O altă modalitate o reprezintă marcarea unui oligonucleotid cu un colorant fluorescent şi folosirea acestuia drept sondă pentru secvenţe complementare de acizi nucleici în celule fixate.

Proiectul pentru Învăţământ Rural

37

Tehnici de explorare celulară

Figura 2.2. Schema structurii microscopului de fluorescenţă

Microscopia confocală reprezintă o altă tehnică care permite obţinerea de imagini pentru eşantioane fluorescente. În locul iluminării cu o rază luminoasă, eşantionul este excitat de către o rază laser focalizată îngust pe cele trei dimensiuni x, y, z ale spaţiului. Lumina care nu vine direct din punctul de focalizare este eliminată cu ajutorul unui dispozitiv. Fascicolul laser de excitaţie baleiază eşantionul şi lumina emisă de fiecare punct este colectată. Imaginile de fluorescenţă sunt reconstituite de calculator. O serie de imagini confocale obţinute din planuri diferite permit o reconstituire tridimensională a eşantionului. Cu o lungime de undă cuprinsă între 1 şi 10-3 nm, electronii, 2.2.3. Microscopia spre deosebire de fotoni, coboară limita de separare la nivel de electronică angstrom (0,1 nm). Într-un microscop electronic, sursa luminoasă este un filament constituit cel mai adesea din tungsten, care încălzit la o temperatură ridicată, emite în vid electroni la vârful unei coloane cilindrice. Acceleraţi de o mare diferenţă de potenţial, aceşti electroni formează un fascicul care este canalizat de către o serie de condensatori. Imaginea se obţine în două moduri: Microscopia Electronică de Transmisie (MET) – prin transmisia de electroni prin eşantion; Microscopia Electronică de Baleiaj (MEB) – prin reflexia electronilor de către eşantion.

38

Proiectul pentru Învăţământul Rural

Tehnici de explorare celulară

Prepararea eşantionului pentru microscopie electronică Deoarece eşantioanele sunt plasate sub vid se elimină posibilitatea observării de celule vii hidratate. Celulele şi ţesuturile sunt mai întâi fixate în glutaraldehidă care creează punţi între proteinele vecine şi apoi tratate cu tetraoxid osmium pentru a stabiliza membranele. Slaba putere de penetrare a electronilor face necesară tăierea de secţiuni foarte fine de 50 la 100 nm. Pentru a obţine astfel de secţiuni, eşantioanele au fost în prealabil deshidratate şi incluse într-o răşină care se polimerizează şi formează un bloc care înconjoară preparatul. Contrastul în microscopie electronică depinde de numărul atomic al elementului. Cu cât acesta este mai mare cu atât electronii sunt mai dispersaţi şi creşte contrastul. Deoarece moleculele biologice sunt constituite majoritar din elemente cu numere atomice scăzute (carbon, azot, hidrogen, oxigen, etc.), este necesară tratarea secţiunilor cu săruri ale metalelor grele (uraniu, osmiu, plumb) în scopul revelării mai bune a constituenţilor celulari. Observarea spaţiului intramembranar se realizează după o criofactură şi un criodecapaj. Microscopia electronică de transmisie (MET) Limita sa de rezoluţie este la nivel de nanometru şi este de 100 de ori mai mare decât cea a microscopului fotonic. Profunzimea câmpului este slabă (grosimea tranşei spaţiului în care toate punctele eşantionului furnizează o imagine netă). Observaţiile tridimensionale sunt dificile chiar dacă se folosesc foarte multe serii de secţiuni seriate (Figura 2.3). Prin analiza succesivă a secţiunilor se realizează reconstituirea structurilor tridimensionale.

Figura 2.3. Principiul MET: a) pregătirea probelor; b) principiul general al MET şi structura schematică a microscopului

Proiectul pentru Învăţământ Rural

39

Tehnici de explorare celulară

Microscopia electronică de baleiaj (MEB) Preparatul este baleiat cu un fascicul convergent de electroni. Când aceştia lovesc obiectul analizat, electronii sunt emişi sau difuzaţi de către suprafaţa obiectului. Unghiul de impact cu suprafaţa variază şi imaginea, reconstituită pe ecran, se compune din zone strălucitoare şi sumbre care îi dau un aspect tridimensional. Profunzimea câmpului în MEB este considerabilă, totuşi rezoluţia sa se limitează la 10 nm. TA 2.7. Sub forma unui eseu de maxim 200 de cuvinte discutaţi avantajele şi dezavantajele relative ale microscopiei optice şi electronice.

TA. 2.8. Cum puteţi mai bine vizualiza : a) o celulă vie din piele; b) o mitocondrie de drojdie; c) o bacterie; d) un microtubul

2.3. Metode de separare a componentelor celulare

În momentul descoperirii unei noi molecule, nu ştim nimic despre aceasta. Biologul nu dispune de nici o informaţie asupra naturii sale, masa moleculară şi concentraţia fiind necunoscute. Caracterizarea completă a acesteia este dificilă deoarece celula conţine mii de molecule, majoritatea acestora într-o proporţie foarte scăzută. Moleculele care se află într-o concentraţie mai mare sunt bine studiate de mult timp şi pe măsură ce cunoştinţele evoluează, substanţele pe care trebuie să le analizăm sunt într-o concentraţie mai mică în preparatele studiate. Din acest motiv a fost necesară punerea la punct a unor tehnici din ce în ce mai performante care să conducă la concentrarea eşantioanelor la valori compatibile cu studiile propuse având drept unic ghid efectul biologic. În alte cazuri, biologul este obligat să concentreze o moleculă cunoscută în scopul dozării cât mai precise a acesteia. În acest sens există tehnici de concentrare care permit dozarea mai multor eşantioane, având în acelaşi timp un factor de concentrare suficient de reproductibil pentru ca rezultatul să fie semnificativ. În biologie tehnicile de separare şi de concentrare pot fi grupate în două categorii: i) cele care se bazează pe proprietăţile fizico-chimice ale moleculei (densitate, masă moleculară, sarcină electrică, pH); ii) cele care se bazează pe proprietăţile biologice (recunoaştere antigen/anticorp sau enzimă/substrat). Toate aceste tehnici sunt performante şi au principii de bază foarte simple. În schimb, realizarea tehnică este adesea foarte delicată datorită constrângerilor impuse de materialul biologic.

TA 2.9. Care sunt criteriile după care pot fi clasificate tehnicile de separare a componentelor celulare

40

Proiectul pentru Învăţământul Rural

Tehnici de explorare celulară

2.3.1. Centrifugarea

2.3.1.1. Principiul centrifugării

Orice corp suspendat într-un lichid suporta acţiunea a două forţe: forţa gravitaţională (greutatea sa) care îl orientează în jos şi forţa lui Arhimede care îl dirijează în sus. În funcţie de densitatea sa, superioară sau inferioară mediului, forţa rezultantă va fi dirijată în sus sau în jos şi corpul va urca sau va coborî în lichid. Acest fenomen se numeşte sedimentare. Macromoleculele biologice sunt şi ele supuse acestei reguli. De exemplu, celulele roşii dintr-un tub în care am prelevat sânge cad la fundul acestuia. Celulele albe, mai puţin dense formează un strat fin la partea superioară. Dacă timpul de aşteptare este mai lung moleculele se vor repartiza în trei grupe: i) cele care se vor poziţiona pe fund; ii) cele care vor urca către suprafaţă; iii) cele care vor continua să rămână în soluţie. În concluzie, dacă modulăm corect densitatea mediul este posibilă purificarea unei molecule. Acest fenomen este de durată şi necesită aproximativ o oră în cazul sângelui unde celulele sunt destul de mari. Cea mai mare parte a moleculelor biologice sunt mult mai mici iar sedimentarea naturală necesită mult mai mult timp: mai multe săptămâni, ani sau secole. Dacă acceleraţia gravitaţională ar fi mai mare, de exemplu 100 G, lucrurile ar fi foarte diferite: cele două forţe şi rezultanta lor ar fi mult mai importante şi moleculele ar sedimenta mult mai rapid. Deoarece nu ştim să acţionăm asupra acceleraţiei gravitaţionale care la nivelul pământului rămâne 1 G (9,81m/s2), trebuie să folosim o altă acceleraţie. Toţi ne-am jucat măcar odată în viaţă cu o greutate fixată la capătul unei sfori şi am putut constata că de la o anumită viteză forţa dominantă nu mai este greutatea ci forţa centrifugă. Această forţă a putut fi exploatată în biologie. Un aparat special numit centrifugă realizează separarea preparatelor biologice la viteze de mii sau sute de mii de rotaţii pe minut, producând acceleraţii de mai multe mii de G asupra moleculei de purificat. Astfel, sedimentarea se produce în câteva ore în loc de mai mulţi ani. Din acest punct de vedere, centrifugarea este o tehnică foarte rezolutivă. În momentul de faţă o serie de centrifugi mici (numite centrifugi de masă) sunt aparate de separare curente în laboratoarele de biologie, asemenea frigiderelor în gospodărie. Altele mai mari şi mai rapide, numite ultracentrifugi, fac parte din aparatele grele care sunt cumpărate şi exploatate în comun de mai multe laboratoare. O centrifugă este constituită dintr-un ax care poartă un rotor special, ansamblul fiind antrenat de către un motor foarte puternic. Rotorul conţine lăcaşuri, situate simetric de o parte şi de alta a axei, în care pot fi introduse tuburi care conţin preparatele biologice de separat. Ansamblul este închis într-o cuvă etanşă în timpul rotirii din motive de securitate.

Proiectul pentru Învăţământ Rural

41

Tehnici de explorare celulară

În timpul utilizării centrifugii şi mai ales a ultracentrifugii se ridică două probleme: dezechilibrul rotorului şi degajarea de căldură. Prima problemă are o importanţă majoră pentru utilizator deoarece un dezechilibru de 1g de o parte şi de alta a rotorului se traduce printr-un echivalent de 100kg asupra axului la o viteză de 100 000 G. O asemenea dereglare determină ruperea rotorului şi decolarea acestuia cu o viteză şi o forţă foarte mare. La o astfel de viteză nici măcar pereţii de beton ai laboratorului nu reprezintă o piedică. Toţi biologii din vechea generaţie au trăit sau au auzit vorbindu-se de astfel de accidente. În prezent, această problemă este mai puţin critică deoarece materialele sunt de o calitate mult mai bună şi există sisteme de securitate care împiedică ultracentrifuga să accelereze dacă este detectat un astfel de dezechilibru. Cu toate acestea cea mai bună protecţie o reprezintă echilibrarea cu grijă a tuburilor pereche. Cea de a doua problemă este şi mai jenantă deoarece la viteza de rotaţie a centrifugilor şi ultracentrifugilor, frecarea aerului de rotor produce o încălzire importantă iar moleculele biologice sunt foarte sensibile la căldură. O primă măsură este răcirea rotorului, majoritatea centrifugilor fiind echipate cu astfel de sisteme. Totuşi, la 50 000 sau 100 000 de rotaţii pe minut această măsură nu este suficientă. Soluţia pentru a reduce forţele de frecare este de a realiza învârtirea rotorului în vid. Ultracentrifugile sunt echipate cu pompe de vid extrem de performante. Centrifugarea reprezintă una dintre puţinele tehnici prin care se pot separa cantităţi mari de material putând fi utilizate şi în sistem industrial. Exemplul cel mai cunoscut îl reprezintă sterilizarea laptelui care reprezintă o centrifugare moderată care sedimentează bacteriile, substanţele din compoziţia laptelui fiind mult mai uşoare nu sunt afectate. TA 2.10. Care este forţa responsabilă de realizarea separării prin centrifugare şi cum acţionează ea?

TA 2.11. Care sunt problemele care apar în timpul centrifugării şi care sunt soluţiile tehnice folosite pentru rezolvarea lor?

2.3.1.2. Variantele centrifugării

42

La începutul centrifugării, amestecul care conţine substanţele care trebuie separate este depus la suprafaţa lichidului. În cursul centrifugării, moleculele coboară în funcţie de densitatea lor. Viteza de sedimentare este exprimată printr-o unitate independentă de densitatea mediului numită Svedberg (S). Cu cât valoarea în Sverdberg este mai mare, cu atât molecula va ajunge Proiectul pentru Învăţământul Rural

Tehnici de explorare celulară

mai repede pe fundul tubului. La sfârşitul centrifugării, tubul conţine două faze distincte: un depozit mai mult sau mai puţin solid la fundul tubului care corespunde moleculelor care au reuşit să se depună şi care se numeşte sediment, şi o fază lichidă care conţine toate moleculele care nu au atins fundul tubului şi care formează supernatantul. După caz, moleculele de separat sunt în sediment, în supernatant sau distribuite între cele două. În ultimul caz considerăm că parametrii centrifugării nu au fost bine aleşi. Pornind de la aceste criterii simple, biologii au dezvoltat mai multe variante ale centrifugării (Figura 2.4). O bună purificare a diferitelor organite se poate realiza într-o singură etapă dacă centrifugarea se realizează în gradient de densitate. Molecula care urmează a fi purificată nu este neapărat nici cea mai densă şi nici cea mai puţin densă. De asemenea, se poate dori obţinerea unui profil de sedimentare, adică studierea concentraţiei în molecule în funcţie de coeficientul de sedimentare. Biologii au reuşit să imagineze şi să fabrice medii cu densităţi variabile care se repartizează diferenţiat formând un gradient de densitate în tubul de separare.

Figura 2.4. Principiile centrifugării Proiectul pentru Învăţământ Rural

43

Tehnici de explorare celulară

Densitatea mediului variază descrescător şi continuu de la 2.3.1.3.Centrifugare partea inferioară la cea superioară a tubului. La sfârşitul a în gradient de centrifugării, moleculele vor fi repartizate în benzi în funcţie de densitate densitatea lor. Această tehnică poate fi considerată o extrapolare a celei descrisă mai sus, dar în realitate finalitatea este foarte diferită. Tehnica îşi propune obţinerea unui profil al densităţii moleculelor dintr-o soluţie şi nu serveşte numai la separarea moleculelor pe care dorim să le studiem. De exemplu, centrifugarea în gradient de densitate permite separarea variantelor aceleiaşi proteine. Conţinutul tubului se repartizează cu ajutorul unui colector de fracţii în mai multe eprubete care nu conţin decât o formă a moleculei. Acestea pot fi identificate separat. Dacă se cunoaşte coeficientul de sedimentare al fiecărei molecule se poate trasa un profil de densitate al moleculelor. Acest profil reprezintă cantitatea de molecule în funcţie de fracţie (deci şi de densitate). Se pot obţine mai multe picuri. Dacă un astfel de pic corespunde unei molecule (de exemplu o enzimă) aceasta poate fi măsurată separat şi se poate calcula proporţia fiecărui component în totalitatea amestecului.

Figura 2.5. Centrifugarea în gradient de sucroză a organitelor celulare

TA 2.12. Este posibilă separarea prin sedimentare a unor particule foarte mici folosind centrifugarea diferenţială în gradient de densitate. Dacă da, explicaţi principiul tehnicii

44

Proiectul pentru Învăţământul Rural

Tehnici de explorare celulară

2.3.2.Cromatografia

Această tehnică permite separarea de molecule în soluţie (fază mobilă) graţie interacţiilor lor cu un suport (faza staţionară) în funcţie de diferite criterii: absorbţie, afinităţi chimice, sarcini electrice, masă moleculară, etc. Cromatografia ca şi centrifugarea este o tehnică cu un principiu extrem de simplu dar care prin perfecţionare a devenit o modalitate de separare foarte performantă. De exemplu, cromatografele sunt utilizate actualmente pentru detectarea poluanţilor în laboratoarele specializate. Cu toate acestea fiecare dintre noi poate realiza o cromatografie la el acasă cu materiale simple. Faceţi o pată de cerneală cu un stilou pe o bucată de hârtie şi apoi lăsaţi să cadă o picătură de apă. Constituenţii cernelii vor difuza, formând cercuri concentrice în jurul petei iniţiale. Primele cromatografii imaginate acum un secol nu erau cu mult mai complicate şi totuşi sunt folosite şi astăzi. Substanţa ai cărei constituenţi dorim să îi izolăm este antrenată de un fluid care circulă într-un mediu poros care va încetini componentele substanţei. În funcţie de interacţiile care există între fiecare dintre constituenţi şi fluid pe de o parte şi între aceştia şi mediul poros pe de altă parte, aceştia vor fi antrenaţi mai repede sau mai încet. Astfel, constituenţii substanţei se vor separa unii de alţii. Pentru detectarea diferitelor componente există două posibilităţi: repartizarea pe ansamblul mediului (de exemplu o foaie de hârtie) şi revelarea tuturor prin colorarea specifică substanţei de interes (Figura 2.6). În exemplul de mai sus mediul este foaia de hârtie, fluidul este apa şi substanţa de separat este cerneala. În funcţie de suport şi de mediul lichid care asigură realizarea separării există mai multe tipuri de cromatografie: i) cromatografia pe hârtie, cea mai simplă; ii) filtrarea pe gel care realizează separarea moleculelor în funcţie de mărimea lor; iii) cromatografia de schimb ionic care foloseşte drept suport răşini schimbătoare de ioni; iv) cromatografia de afinitate care exploatează înalta specificitate a interacţiilor legăturilor biologice; v) cromatografie pe coloană în fază lichidă - HPLC (High Performance Liquid Chromatography) variantă a acesteia, una dintre metodele cele mai eficace de separare a moleculelor; vi) cromatografia pe coloană în fază gazoasă care este cea care permite separarea celor mai mici cantităţi de materie.

Proiectul pentru Învăţământ Rural

45

Tehnici de explorare celulară

2.3.2.1. Cromatografie pe hârtie

Această tehnică este cea mai simplă. Benzi de hârtie de filtru sunt menţinute vertical, baza fiind înmuiată într-un solvent care este în general apă. Substanţa de separat este depusă la baza benzii de hârtie chiar deasupra suprafeţei lichidului. Lichidul va urca de-a lungul benzii de hârtie prin capilaritate, va antrena cu el fiecare substanţă cu o viteză diferită. Un trasor, moleculă colorată foarte solubilă în solvent va migra cu aproximativ aceeaşi viteză cu acesta şi va permite urmărirea progresiei frontului. Când înaintarea este terminată banda de hârtie va fi tratată global cu revelatori specifici. Moleculele detectate vor apărea sub forma de pete colorate (spoturi) repartizate între punctul de plecare şi frontul de migrare al trasorului. Pentru o anumită moleculă, acelaşi solvent şi acelaşi suport de hârtie, raportul distanţă de migrare/front de migrare al trasorului este constantă ceea ce permite identificarea unei substanţe. După fotografiere pentru conservarea rezultatului, banda poate fi decupată pentru a recupera spoturile şi a solubiliza moleculele pe care le conţine pentru analiza şi dozare. Teoretic, tehnica se poate realiza pe orice tip de hârtie dar pentru a asigura reproductibilitatea rezultatelor furnizorii fabrică astăzi hârtii speciale cu porii perfect calibraţi şi chiar materiale care nu au nimic în comun cu hârtia. Figura 2.6. Cromatografie pe hârtie. a) principiul separării; b) evidenţierea spoturilor separate

46

Proiectul pentru Învăţământul Rural

Tehnici de explorare celulară

2.3.2.2. Cromatografia pe coloană în fază lichidă

În acest tip de cromatografie, substanţa poroasă este formată din bile mici conţinute într-o coloană, lichidul intrând printr-o extremitate şi ieşind prin cealaltă. Aici, solventul este deplasat activ cu ajutorul unei pompe. Principala diferenţă este că moleculele care se vor deplasa diferit prin coloană şi vor avea o anumită întârziere în migrare vor ieşi din coloană în momente diferite. Un detector plasat la ieşire va decela trecerea fiecărei substanţe. Detectorul se bazează pe proprietăţile fizice ale moleculei de detectat, cum ar fi de exemplu rezistivitatea, daca particulele sunt încărcate, sau fluorescenţa la iradierea cu lumină ultravioletă. Calibrarea perfectă a detectorului va permite identificarea moleculei şi determinarea concentraţiei acesteia. De asemenea compusul va putea fi recuperat în urma colectării fluxului de ieşire sub formă de fracţii. Această variantă de cromatografie este mai complexă dar mai performantă. Dacă se variază materialele conţinute în coloană şi condiţiile de separare obţinem diferite variante ale metodei.

Figura 2.7. Cromatografie în fază lichidă

TA 2.13. Care sunt principalele tipuri de tehnici de separare cromatografică;

TA 2.14. Care dintre următoarele criterii de separare cromatografică sunt greşite: a) absorbţia pe suport; b) capacitatea de a forma legături covalente; c) afinităţi chimice; d) sarcini electrice, e) masă moleculară.

Proiectul pentru Învăţământ Rural

47

Tehnici de explorare celulară

2.3.2.3. Cromatografia lichidă de înaltă presiune (HPLC, High Pressure Liquid Chromatography)

În această variantă, interiorul coloanei este supus unei presiuni importante. Diferiţii constituenţi vor fi separaţi mult mai eficace permiţând lucrul cu coloane mai mici. În timp ce o coloană standard poate să fie între 20 cm şi 1 metru înălţime, o separare HPLC se poate realiza pe coloane de 5 cm cu aceeaşi eficacitate. Tehnica permite folosirea unei cantităţi reduse de mediu poros, de fază lichidă şi deci de substanţe de separat. Toate variantele de coloane descrise în variantele anterioare pot fi aplicate în tehnica HPLC. Astăzi printr-o modificare de limbaj, acronimul HPLC şi-a schimbat semnificaţia în „High Performance Liquid Chromatography” sau cromatografie lichidă de mare performanţă (Figura 2.8).

Figura 2.8. Principiul HPLC

2.3.2.4 Gel filtrarea

Diverse coloane cromatografice Gel filtrarea sau cromatografia de excluziune reprezintă o separare în funcţie de mărimea particulelor. Variind diametrul bilelor utilizate pentru separare se pot încetini moleculele mari în timp ce cele mici vor trece printre bile şi vor migra mai rapid. Invers, dacă folosim bile poroase moleculele mici vor penetra în acestea şi vor fi întârziate în timp ce moleculele care nu intră în bile trec direct şi mult mai repede (Figura 2.9).

Figura 2.9. Principiul gel filtrării

48

Proiectul pentru Învăţământul Rural

Tehnici de explorare celulară

Cromatografia pe schimbători de ioni reprezintă o tehnică 2.3.2.5. de separare în funcţie de sarcină care foloseşte ca suport răşini Cromatografia pe schimbători de ioni schimbătoare de anioni sau cationi. Dacă folosim bile încărcate, cu sarcini negative (schimbători de cationi) sau cu sarcini pozitive (schimbători de anioni) moleculele (de exemplu proteine) care poartă sarcini opuse se vor fixa în timp ce celelalte vor migra. Când toate moleculele sunt fixate, se creşte progresiv forţa ionică a solventului, moleculele se separă de bile unele după altele, fiecare în funcţie de propria forţă ionică, şi vor trece prin faţa detectorului (Figura 2.10). Această variantă cromatografică ca şi gel filtrarea nu este suficientă pentru a obţine un preparat înalt purificat.

Figura 2.10. Cromatografie pe schimbători de ioni

2.3.2.6. Cromatografia de afinitate

Cromatografia de afinitate exploatează specificitatea deosebită a interacţiilor biologice. Grefarea prin legături covalente a unui ligand la suprafaţa unei matrice inerte (suport) permite purificarea unei proteine dintrun amestec. De exemplu, interacţia enzimă-substrat în care substratul serveşte de ligand favorizează purificarea enzimei care recunoaşte substratul la nivelul situsului său catalitic. De asemenea, anticorpii specifici pot servi drept liganzi pentru a reţine pe o coloană proteina faţă de care au fost produşi. În toate cazurile, după eluarea celorlalte molecule, proteinele fixate sunt detaşate schimbând eluantul astfel încât să rupă interacţiile proteină-ligand (Figura 2.11). Prin această tehnică bazată pe specificitatea de recunoaştere, factorul de purificare poate atinge 10 000 la o singură trecere prin coloană.

TA 2.15. Analizaţi comparativ principiile următoarelor tipuri de cromatografie: gel filtrare, cromatografia pe schimbători de ioni şi cromatografia de afinitate. Care dintre aceste consideraţi că este mai eficientă.

Proiectul pentru Învăţământ Rural

49

Tehnici de explorare celulară

Figura 2.11. Cromatografia de afinitate

2.3.2.7. Cromatografia în fază gazoasă

Este un tip de cromatografie pe coloană, dar în acest caz fluidul este înlocuit de gaz. Substanţa de analizat este evaporată. Fluidul gazos o va antrena pe coloană care va întârzia diferiţii constituenţi gazoşi. La ieşirea de pe coloană aceşti constituenţi vor putea fi detectaţi prin diferite tehnici: spectrometrie de masă, spectrometrie, ionizare, etc. Această modalitate de separare permite detectarea substanţelor sub formă de urme. Este o tehnică folosită mai mult în mineralogie decât în biologie.

2.3.3. Electroforeza

Asemenea tehnicilor descrise anterior, electroforeza permite o separare a moleculelor pe baza unei proprietăţi fizice, în acest caz sarcina electrică. Principiul constă în dispunerea soluţiei care conţine moleculele de separat pe un gel preparat în soluţie apoasă şi aplicarea unei diferenţe de potenţial între anod şi catod. Ionii pozitivi se vor deplasa către catod iar ionii negativi către anod, moleculele neutre nefiind supuse deplasării. Această tehnică este cu atât mai importantă cu cât asigură realizarea de separări foarte fine ale diferitelor molecule şi este destul de uşor de realizat. De asemenea, prin modul său de operare tehnica permite tratarea simultană a mai multor eşantioane pe acelaşi gel şi în aceleaşi condiţii experimentale. Datorită calităţilor tehnica este curent folosită de laboratoarele cercetare, de analize medicale dar şi pentru a doza proteinele sanguine.

50

Proiectul pentru Învăţământul Rural

Tehnici de explorare celulară

2.3.3.1. Principiul electroforezei

Mediul de migrare este constituit în general dintr-un gel apos (agaroză sau poliacrilamidă) turnat pe o placă orizontală sau între două plăci de sticlă dispuse vertical. Capetele gelului vin în contact cu lichidul conductor care face legătura între catod şi anod. Eşantioanele de separat sunt aplicate într-o serie de godeuri practicate în gel. Ele sunt combinate cu un colorant ale cărui proprietăţi sunt astfel alese încât să migreze mai rapid decât componentele amestecului pentru a permite supravegherea migrării moleculelor de separat care sunt, în general, invizibile în această etapă. Când migrarea este terminată, gelul este colorat cu bromură de etidium (pentru evidenţierea acizilor nucleici) sau uscat şi relevat cu diferiţi agenţi de colorare (în cazul separării proteinelor). Fiecare moleculă separată apare sub forma unei benzi perpendiculare pe direcţia de migrare şi a cărei grosime depinde de concentraţie.

Figura 2.12. Principiul electroforezei

2.3.3.2. SDS PAGE

Diferitele variante de electroforeză Tehnica electroforetică în gel de acrilamidă PAGE (în engleză Poly Acrilamide Gel Electrophoresis) a găsit numeroase aplicaţii: electroforeza unidimensională SDS-PAGE utilă pentru a separa proteinele în funcţie de masa lor moleculară, izoelectrofocalizarea, electroforeza bidimensională, etc. Varianta cea mai răspândită este SDS - PAGE, folosită pentru separarea proteinelor în funcţie de masa lor moleculară. Proteinele sunt denaturate şi saturate cu detergentul SDS (SodiumDodecyl Sulfate) încărcându-se negativ deoarece sarcinile detergentului acoperă complet sarcinile proprii proteinelor. Viteza de migrare a ansamblului proteine denaturate/SDS va depinde numai de lungimea catenei proteice. Dacă nu ar exista suportul de gel toate moleculele ar migra cu aceeaşi viteză. Prezenţa gelului încetineşte proteinele mari, ele repartizându-se de-a lungul traseului în funcţie de masa lor moleculară.

Proiectul pentru Învăţământ Rural

51

Tehnici de explorare celulară

2.3.3.3. Imunoelectrofocalizare

2.3.3.4. Electroforeza bidimensională

Imunoelectrofocalizarea (IEF) reprezintă o variantă a gel electroforezei care presupune impunerea unui gradient de pH în gelul de separare. Suportul electroforetic este compus dintr-un gel de poliacrialmidă saturat cu o soluţie de amfoliţi. Moleculele polianionice şi policationice dacă sunt plasate într-un câmp electric se separă şi formează un gradient continuu dependent de sarcina lor. Proteinele native sunt supuse acţiunii câmpului electric şi vor migra în funcţie de sarcina electrică (pKa) care variază în funcţie de pH. Moleculele supuse unei electroforeze bidimensionale (pe o direcţie IEF şi pe alta SDS-PAGE) vor fi separate mult mai bine.

Gelul reprezintă un mediu solid care poate fi manipulat fiind posibilă aplicarea mai multor tehnici succesive de electroforeză pentru a obţine electroforeze bidimensionale. În cazul separărilor bidimensionale, eşantionul este depus într-un singur godeu şi este aplicată prima variantă de separare. Când migrarea în prima direcţie este terminată, poziţia gelului se schimbă şi se realizează o migrare perpendiculară pe prima folosind o a doua tehnică. Moleculele separate în funcţie de cele două criterii se repartizează într-un sistem de două coordonate ceea ce permite o rezoluţie mai bună. În general, în cursul primei etape separarea moleculelor se realizează într-un gel îngust în funcţie de sarcina lor electrică (IEF). Într-o a doua etapă gelul îngust este depus la capătul altui gel şi se realizează o separare de tip SDS-PAGE. Cele două criterii independente, sarcină şi mărime, fac ca această tehnică să fie cu adevărat rezolutivă. Astfel, pe un singur gel pot fi separate până la 2000 de polipeptide diferite, ceea ce corespunde numărului de proteine diferite dintr-o bacterie. Evidenţierea proteinelor separate (spoturilor) se realizează cel mai bine prin colorare cu AgNO3 (Figura 2.13).

Figura 2.13. Electroforeza bidimensională

52

Proiectul pentru Învăţământul Rural

Tehnici de explorare celulară

Etapele urmărite în purificarea acizilor nucleici sunt diferite 2.3.3.5. Purificarea şi separarea acizilor de cele utilizate pentru proteine, acestea fiind reflectate în diferenţele structurale fundamentale dintre cele două tipuri de nucleici macromolecule. Pentru purificarea ADN prima etapa o reprezintă omogenizarea celulelor şi izolarea nucleelor din care se extrage ADN. Mediul de extracţie conţine detergenţi utilizaţi pentru liza nucleelor, eliberarea materialului genetic şi inhibarea activităţii nucleazelor. Următoarele etape de purificare au drept principiu separarea ADN şi ARN de produşii care îl contaminează (ARN sau ADN şi proteine). După deproteinizare cu fenol şi cu fenol/cloroform suspensia este separata prin centrifugare în doua faze. Faza apoasă care conţine acizii nucleici este precipitată din soluţie cu etanol rece. ADN este rulat pe o bagheta de sticlă pe măsură ce precipită la interfaţa între alcool şi soluţia salina, în timp ce ARN precipită pe fundul recipientului. După aceasta purificare iniţială, ADN este rehidratat şi tratat cu ribonucleaza pentru a elimina ARN contaminant şi este reprecipitat cu etanol. În general, ARN este purificat în acelaşi mod utilizând deoxiribonuclează care degradează ADN în etapele finale de purificare. Separarea ADN prin electroforeza în gel Electroforeza în gel este folosită în aceeaşi măsură şi pentru separarea acizilor nucleici, care diferă prin greutatea lor moleculara (numărul de nucleotide). În general, moleculele mici de ADN sau ARN (de câteva sute de nucleotide) sunt separate prin electroforeza în gel de poliacrilamidă. Deoarece moleculele mai mari traversează dificil reţeaua de poliacrilamidă sunt separate în gel de agaroză, mai poros. Concentraţiile gelurilor de agaroză sunt variabile în funcţie de mărimea fragmentelor de separat. Separarea acizilor nucleici prin electroforeza se bazează pe acelaşi principiu ca şi separarea proteinelor prin SDS-PAGE. Spre deosebire de proteine, toţi acizi nucleici, indiferent de lungimea lor, au densitate de sarcină negativă constantă care determină capacitatea lor de a migra în câmp electric. Cu cât greutatea moleculară ADN sau ARN este mai mare, cu atât este încetinită migrarea lor. Sensibilitatea separării electroforetice în poliacrilamidă este data de faptul că pot fi separate molecule de ADN sau ARN care diferă numai printr-o singură nucleotidă. Aceasta proprietate a stat la originea migrării produşilor de secvenţializare ADN. În figura 2.14 este prezentat principiul separării acizilor nucleici în gel. Toate fragmentele de ADN separate în gel pot fi localizate prin colorare cu bromură de etidiu, care se intercalează la nivelul dublei elice şi prezintă fluorescenţă portocalie sub lumină UV

Proiectul pentru Învăţământ Rural

53

Tehnici de explorare celulară

Figura 2.14. Electroforeza ADN

2.3.3.6. Aplicaţii electroforeză

Separarea electroforetică este utilă atât pentru simpla identificare a proteinelor şi acizilor nucleici cât şi pentru realizarea de amprente ale acestora pe suport de nitroceluloză sau nailon. Pentru acizii nucleici tehnicile de transfer sunt numite Southern blot pentru ADN şi Northern blot pentru ARN. În cazul proteinelor tehnica poartă numele de Western blot. În cazul acizilor nucleici, după separarea electroforetică în gel de agaroză, şi identificarea benzilor cu bromură de etidium se poate realiza hibridizarea moleculară cu ajutorul unor sonde (ADN, ARN sau ADNc) marcate radioactiv, fluorescent sau chemiluminescent. Identificarea proteinelor la sfârşitul electroforezei se realizează prin colorare (albastru de Coomasie, nitrat de argint) sau prin autoradiografie pentru proteinele sintetizate în prezenţă de aminoacizi radioactivi. Combinarea celor două permite identificarea în ansamblul proteinelor colorate a celor care sunt nou sintetizate şi deci radiomarcate ca răspuns la o eventuală stimulare celulară. Totuşi, o astfel de abordare necesită transferul prin capilaritate al proteinelor pe un suport solid (filtru de nitroceluloză) care apoi permite realizarea autoradiografiei. În cazul tehnici Western blot evidenţierea proteinelor se realizează cu anticorpi specifici după transferul lor pe membrane.

TA 2.16. Se presupune că o proteină ubiquitară este prezentă în mitocondrie, cloroplaste şi nuclei. Ce experienţă puteţi realiza pentru a testa această ipoteză? Descrieţi experienţele în termenii tehnici necesari?

TA 2.17 Electroforeza în gel de agaroză separă moleculele ADN pe baza: a) secvenţei nucleotidice din capătul coeziv; b) secvenţei lor nucleotidice; c) cantităţii de adenină, în corelaţie cu cea de timină; d) cantităţii de adenină, în corelaţie cu cea de guanina; e) lungimii lor. TA 2.18. Moleculele mici de ADN şi ARN sunt separate mai bine pe: a) gel de agaroză; b) gel de poliacrilamidă; c) pe membrane de hârtie; d) prin SDSPAGE; e) prin gel filtrare 54

Proiectul pentru Învăţământul Rural

Tehnici de explorare celulară

2.4. Tehnici de marcare

2.4.1. Marcare radioactivă

Proprietăţile intrinseci (fizico-chimice) ale macromoleculelor pot fi folosite pentru detectarea lor. Metodele cele mai sensibile, capabile să reveleze cu o mare specificitate un număr mic de molecule (plecând de la 1000 la un ordin de concentraţie de 1012 M), necesită folosirea de radioelemente şi/sau de anticorpi. Aplicarea radioactivităţii Moleculele radioactive permit urmărirea cvasitotalităţii proceselor celulare şi localizarea acestora. Experienţele constau în furnizarea unui precursor sub forma de macromolecule radioactive (Tabelul din Figura 2.15) celulelor pentru ca acesta să poată fi diferenţiat de precursorul endogen. Cele două forme ale precursorului sunt incorporate nediferenţiat în macromolecule. Pentru a urmări în timp evoluţia în celulă a precursorului radioactiv acesta este introdus în celulă pentru un timp scurt (puls). Modalitatea de abordare favorizează localizarea moleculelor nou sintetizate, care se realizează după fixare şi colorarea celulelor pentru observare microscopică. Preparatele sunt apoi acoperite de o emulsie fotografică. Radiaţiile emise de către radioizotopi acţionează asupra bromurii de argint conţinută în emulsia fotografică şi formează puncte negre de argint după developarea autoradiografiei. Suprapunerea fotografiilor obţinute în microscopie înainte şi după autoradiografie permite localizarea macromoleculelor în celulă. De exemplu, marcarea cu uridină 3H, precursor al ARN, evidenţiază că sinteza acestui acid nucleic se realizează în nucleu, înainte de trecerea rapidă în citoplasmă. Izotop 3

H C 32 P 35 S 14

Timp de înjumătăţire 12,3 ani 5570 ani 14 zile 87 zile

Precursori radioactivi Aminoacizi, nucleotide, glucide Aminoacizi, nucleotide, glucide nucleotide Nucleotide, metionină

Figura 2.15. Izotopi utilizaţi curent în biologie

Marcarea cu anticorpi Anticorpii, proteine ale sistemului imunitar, există sub forma a milioane de forme diferite determinate în principal de variabilitatea situsului de recunoaştere a antigenului care provoacă sinteza lor. Fiecare anticorp posedă o singură specificitate antigenică care îi conferă o valoare inestimabilă pentru localizarea unei molecule precise în celulă. Cuplarea anticorpilor cu molecule fluorescente (microscopie de fluorescenţă) sau cu particule dense în electroni (sfere de aur coloidal pentru microscopia electronică) va favoriza reperarea antigenului în celulă. Când numărul de antigene prezente în celulă este destul de important este suficientă o marcare directă, în timp ce o concentraţie scăzută de antigen necesită o marcare indirectă care să determine creşterea sensibilităţii detectării. Proiectul pentru Învăţământ Rural 55 2.4.2. Marcarea cu anticorpi

Tehnici de explorare celulară

Există şi alte metode de identificare cum ar fi cuplarea unei enzime cu un anticorp (test imunoenzimatic). În prezenţa substratului enzimei fiecare situs catalitic va transforma mii de molecule permiţând detectarea unei cantităţi infinitezimale de antigen. Metoda cea mai simplă de obţinere de anticorpi constă în efectuarea de injecţii repetate cu un antigen unui animal (iepure, capră, şoarece, etc.). Totuşi, diferite limfocite B vor reacţiona şi vor produce anticorpi diferiţi. Serul prelevat de la animal va conţine un amestec eterogen de anticorpi (anticorpi policlonali) orientaţi către diferitele părţi (epitopi) ale moleculei injectate. Specificitatea acestora poate avea de suferit (acelaşi epitop poate fi purtat de antigene distincte). Deoarece izolarea acestora este un proces foarte dificil se utilizează alternativa producerii de anticorpi monoclonali (Cadru 2.3). Tehnicile de marcare cu anticorpi sau cu radioizotopi necesită observarea celulelor la microscop, ceea ce limitează cantitatea de celule analizate. O altă tehnologie, citometria în flux, creşte considerabil posibilităţile deoarece autorizează analiza şi trierea unitară a unui număr mare de celule (Cadrul 2.3).

Cadrul 2.3. Producerea de anticorpi monoclonali Pentru a palia eterogenitatea anticorpilor secretaţi în ser de către numeroasele limfocite stimulate (clone) de către antigen, Milstei şi Kohler au pus la punct o tehnică destinată producerii de anticorpi pornind de la o singură clonă de limfocite B. După imunizarea unui animal cu antigenul ales, sunt prelevate limfocite din splină. Deoarece aceste celule nu supravieţuiesc în cultură, ele sunt fuzionate cu plasmocite mielomatoase (celule ale liniei limfocitare devenite nemuritoare datorită malignizării). Celulele hibride, astfel obţinute (sau hibridomele) posedă informaţia genetică pentru sinteza anticorpilor monoclonali adusă în sistem de limfocitele B şi capacitatea de proliferare continuă (nemurirea) conferită de celulele tumorale. Graţie folosirii unui mediu selectiv, numai celulele hibride sunt capabile să crească şi să formeze numeroase colonii (clone). Fiecare clonă secretă un anticorp particular orientat către unul dintre numeroşii epitopi ai antigenului ales. Analiza supernatantelor de cultură permite selecţionarea clonelor producătoare ai anticorpilor doriţi (adică orientaţi numai faţă de unul dintre epitopii antigenului). Anticorpii pot fi produşi apoi în cantităţi mult mai mari prin cultura repetată a hibridomelor (Figura 2.16).

56

Proiectul pentru Învăţământul Rural

Tehnici de explorare celulară

Figura 2.16. Principiul producerii de anticorpi monoclonali

Cadrul 2.4. Citometrie în flux Această metodă permite analiza într-un timp foarte scurt a unui număr de parametrii fizici caracteristici unei celule. Celulele în suspensie, antrenate de un flux de lichid, trec prin faţa unui fascicul laser. Această trecere prin faţa unei surse luminoase permite măsurarea: i) mărimii celulei şi refringenţei sale (conţinutul în granule citoplasmatice) graţie difuziei luminii; ii) emisiei de lumină de către flourocromii fixaţi de o celulă în cursul unei incubări prealabile. Alternativele metodologice oferite de această tehnică sunt nenumărate. Pot fi analizate celule vii, bacterii şi organite izolate (mitocondrii). Marea diversitate a fluorocromilor face din citometria în flux o modalitate de analiză semi-cantitativă a constituenţilor celulari şi a funcţiei acestora. Prin utilizarea unui substrat artificial cuplat cu un fluorofor a fost posibilă măsurarea activităţii enzimatice în celulă fără a o distruge. Viteza de analiză, aproximativ 1000 celule pe secundă, autorizează achiziţia de date despre un număr mare de celule şi evidenţierea evenimentelor rare (1/1000). Celulele care intră în această categorie pot fi triate şi colectate şi apoi eventual repuse în cultură. Toate domeniile biologiei folosesc citometrie în flux. La început principala sa utilizare a fost pentru studiul ciclului celular. Astăzi există numeroase aplicaţii în domeniul medical: tiparea celulelor prealabilă transplantului de organe; prognosticul de supravieţuire în SIDA (inversarea raportului limfocitelor T4 şi T8), ajutor în diagnosticul cancerului, etc.

Proiectul pentru Învăţământ Rural

57

Tehnici de explorare celulară

2.5. Tehnici ADN recombinat

2.5.1.Clonare moleculară

Clonarea ADN este o tehnica destinată producerii de cantităţii mari dintr-o moleculă de ADN specifică. Segmentul care trebuie sa fie clonat este întâi introdus într-un vector ADN care serveşte drept vehicul de transport într-o celula gazdă adaptată, cum este bacteria E. coli. Vectorul conţine secvenţe care permit replicarea sa în celula gazdă. Tipuri de vectori Plasmidele şi fagemidele, care se dezvoltă în bacterii, sunt utilizate foarte mult pentru manipularea fragmentelor de gene aparţinând oricărui organism. O plasmidă este o moleculă de ADN dublu catenară circulară, extra-cromozomială capabilă să se replice, independent de cromozomul bacterian, într-o celulă, şi care poate fi transferată într-o altă celulă. Plasmidele sunt molecule mici (de 3 la 10 kpb). Cele folosite în ingineria genetică au fost foarte mult modificate şi conţin o origine de replicare, unul sau mai multe gene care conferă rezistenţă la antibiotice (factori de selecţie) şi un situs de policlonare. Un situs de policlonare reprezintă o secvenţă de ADN care este constituită dintr-o succesiune de secvenţe recunoscute şi care pot fi decupate de diferite enzime de restricţie. În plasmide pot fi clonate fragmente de pană la 5 kb (Figura 2.17a). Fragmentele mai mari vor fi greu acceptate în astfel de plasmide. Fagemide (tip Bluescript) sunt molecule, hibride obţinute prin combinarea unei plasmide cu un fag. Acestea sunt molecule de ADN dublu catenare, circulare, care pot fi obţinute sub formă monocatenară în anumite condiţii. Ele posedă o origine de replicare, cel puţin o genă de rezistenţă la un antibiotic, un situs de policlonare şi o secvenţă care provine de la fagul M13 şi permite obţinerea formei monocatenare. În general, promotori ai ARN polimerazei sunt introduşi în amonte sau în aval de situsul de policlonare, pentru a putea produce molecule de ARN prin transcripţie „in vitro”. În aceşti vectori pot fi introduse fragmente de ADN de până la 10 kb. Bacteriofagii şi cosmidele sunt folosite ca vectori de clonare, la fel ca plasmidele, mai ales pentru realizarea de bănci de ADN genomic şi ADNc. Aceştia pot integra fragmente cu o talie mai mare decât plasmidele. Un bacteriofag este un virus bacterian. Cel mai folosit este bacteriofagul λ care are aproximativ 50 kb (Figura 2.17b). ADN său bicatenar linear posedă extremităţi coezive (secvenţele cos) care permit circularizarea acestuia în urma infecţiei. ADN fagic este împachetat într-o carcasă proteică. În urma infecţiei unei bacterii, particula fagică foloseşte maşinăria enzimatică a bacteriei pentru multiplicare şi produce particule fagice identice care la rândul lor infectează alte celule.

58

Proiectul pentru Învăţământul Rural

Tehnici de explorare celulară

Avantajul unui vector fagic faţă de un vector plasmidial este că pot fi clonate fragmente mai mari de ADN (în medie 20 kb). Cosmidele sunt vectori hibrizi de mărime mică având caracteristicile unei plasmide (origine de replicare, gene de selecţie) şi ale unui bacteriofag λ (secvenţe cos, necesare pentru încapsidarea ADN în particule fagice). Fragmentele de ADN exogen sunt introduse în cosmide între două situsuri cos. Acestea pot avea o mărime de aproximativ 35 - 45 kb. În bacterie, cosmida se replică ca o plasmidă, deoarece ea nu mai posedă genele fagului necesare producerii de noi particule fagice. Vectorul de clonare este decupat cu ajutorul unei enzime de restricţie care recunoaşte un situs unic (în general plasat la nivelul situsului de policlonare). ADN exogen din organismul donor este şi el digerat cu aceeaşi enzimă de restricţie. Fragmentele obţinute posedă şi la capete părţi ale secvenţei ADN recunoscută de către enzima de restricţie. Integrarea fragmentului în vector se va realiza dacă aceste două componente sunt aduse împreună în prezenţa unei ligaze capabilă să catalizeze formarea unei legături covalente. între capete. Plasmida nou obţinută circulară este numită recombinată deoarece a integrat insertul. În cazul genomului viral se înlocuieşte o regiune din structură cu fragmentul de ADN străin.

Figura 2.17. Exemple de vectori de clonare; a) plasmidă; b) fag lambda

Proiectul pentru Învăţământ Rural

59

Tehnici de explorare celulară

După clonarea fragmentelor de ADN într-un vector, acesta 2.5.2. Transformare trebuie integrat într-un microorganism în scopul amplificării, de bacterii purificării sau exprimării genei pe care o conţine. Aceasta integrare se face prin transformare genetică. Principiul constă în integrarea într-o celulă bacteriană (în general E. Coli) sau eucariotă (de exemplu drojdii) a vectorilor recombinaţi. Când un vector recombinat este integrat prin transformare genetică într-o celulă nouă, acesta este capabil să se replice autonom. În acest fel el multiplică şi fragmentul de ADN pe care îl conţine integrat la nivelul situsului de policlonare, permiţând amplificarea fragmentului în cantitate mare (Figura 2.18). Pentru a facilita intrarea moleculelor de ADN prin peretele şi membrana plasmatică, bacteriile aflate în fază exponenţială de creştere sunt „fragilizate” (de ex printr-un tratament cu CaCl2 la 40C). Bacteriile astfel preparate, numite bacterii competente, sunt puse în contact cu soluţia de plasmidă care trebuie integrată. Membrana plasmatică este permeabilizată temporar (formare tranzitorie de micropori) prin şoc termic sau electric. Procesul de integrare a unei molecule de ADN recombinat în bacterii se numeşte transformare. Ulterior, bacteriile sunt cultivate pe un mediu cu geloză care conţine factorul de selecţie (de obicei antibioticul) corespunzător genei de rezistenţă conţinută de către plasmidă. Prin aplicarea acestui agent selectiv, se vor dezvolta numai bacteriile care au integrat plasmida. Astfel, plasmida recombinată se va multiplica în celulă, amplificând în acest mod şi secvenţa clonată.

Figura 2.18. Clonarea unui fragment de ADN şi obţinerea bacteriilor transformate

60

Proiectul pentru Învăţământul Rural

Tehnici de explorare celulară

Dacă o bacterie este transformată cu ajutorul unei plasmide ea se dezvoltă pe un mediu cu geloză pentru a forma o colonie. Fiecare colonie corespunde unui ansamblu de bacterii identice, care provin din diviziunea unei singure celule. Menţinerea plasmidei într-o bacterie recombinată este asigurată de presiunea selectivă exercitată de prezenta factorului de selecţie în mediul de cultură (Figura 2.18). Dacă se realizează clonarea într-un bacteriofag pe mediul de cultură tapisat cu bacterii se vor obţine plaje de liză. Fiecare plajă conţine milioane de particule de fag purtând o singura copie a aceluiaşi fragment de ADN eucariot. Când este atins nivelul de amplificare dorit, celulele sunt recoltate, ADN este extras şi ADN plasmidial recombinat este uşor separat de cromozomul bacterian mult mai mare. Plasmidele recombinate izolate pot fi tratate cu enzima de restricţie utilizată pentru producerea lor şi pot fi eliberate segmentele ADN clonate de restul de ADN, care a servit drept vector. Un avantaj important al clonării îl constituie faptul că se produce o cantitate mare de ADN particular şi că este posibilă separarea de fragmente diferite plecând de la acelaşi amestec. Pentru a detecta prezenţa unei secvenţe de ADN particulare se analizează („screening”) toate plăcile de cultură care conţin coloniile bacteriene (sau plajele de fagi) combinând tehnica de obţinere a replicilor şi hibridizarea in situ. De pe aceeaşi placă de cultură se pot obţine mai multe replici care conservă intactă poziţia coloniilor bacteriene în toate plăcile. Una din replici este apoi utilizată pentru a localiza secvenţa ADN de interes (Figura 2.19). Aceasta tehnică necesită liza celulelor şi fixarea ADN la suprafaţa unui filtru. O sondă ADN marcată este folosită pentru detectarea secvenţei de interes. Hibrizii marcaţi sunt localizaţi prin autoradiografie. Este posibilă selecţionarea reprezentanţilor viabili corespunzători clonelor sau plajelor de liză identificate şi cultivarea bacteriilor sau fagilor selecţionaţi. În acest mod se realizează izolarea în stare pură şi în cantitate mare a fragmentului de ADN dorit. TA 2.19. Plasmidele sunt importante în biotehnologie moleculară, deoarece ele sunt: a) un vehicul pentru inserarea de ADN recombinat în bacterie; b) situsuri de recunoaştere pe catenele ADN recombinat; c) suprafeţe pentru sinteza proteică în recombinaţii eucariotici; d) suprafeţe pentru procesele respiratorii la bacterii; e) provirusuri incorporate în ADN gazdă

Proiectul pentru Învăţământ Rural

61

Tehnici de explorare celulară

Figura 2.19. Identificarea coloniilor şi plajelor de liză care conţin fragmente de ADN recombinat de interes

2.5.3. Enzimele de Enzimele de restricţie sunt endonucleaze care scindează restricţie ADN dublu catenar într-un mod definit şi reproductibil la nivelul unor situsuri specifice, indiferent de originea sa. Ele au permis înlăturarea principalului obstacol tehnologic privind manipularea ADN, deoarece pot reduce într-o maniera reproductibilă, un genom întreg la o serie de fragmente caracteristice pentru o specie dată. În acest fel genele sau părţi ale genelor devin entităţi fizice izolabile. Enzimele din această categorie sunt responsabile pentru fenomenul de restricţie de unde şi numele lor. TA 2.20. Care este sursa principala de enzime de restricţie? a) celulele care recunosc componentele „self” ; b) tehnologia ADN recombinant; c) virusurile; d) celulele din stratul epitelial; e) bacteriile Fenomenul de restricţie: multiplicarea bacteriofagilor în bacterii în mii de exemplare duce la liza acesteia. Există situaţii în care procesul nu se produce fiind imposibilă multiplicarea bacteriofagului.

62

Proiectul pentru Învăţământul Rural

Tehnici de explorare celulară

Una dintre explicaţiile acestui comportament bizar este procesul de restricţie care presupune distrugerea ADN fagic imediat după intrarea sa în bacterie de către un sistem de protecţie format din enzimele de restricţie. Bacteriile rezistente la infecţia cu virus au capacitatea de a metila propriul ADN la nivelul unor adenine sau citozine pentru a-l proteja de acţiunea enzimelor de restricţie. Cele mai utilizate sunt enzimele de restricţie de tip II care recunosc situsuri de restricţie specifice de 4, 6 sau 8 perechi de baze. Secvenţele recunoscute sunt întotdeauna palindromice. Aceasta înseamnă că secvenţa este identică la nivelul celor doua catene când se citeşte în sensul 5’-3’. Deci, fragmentarea se efectuează pe cele două catene la nivelul aceluiaşi situs. Enzimele de restricţie de tip II pot da naştere la două tipuri de fragmente: i) cu capete drepte, egale, în situaţia în care enzima scindează exact la acelaşi nivel pe cele două catene ADN; ii) cu capete coezive sau colante, când tăierea la nivelul celor două catene se face decalat.

Figura 2.20. Tipuri de tăieturi

TA 2.21. Cum îşi protejează o celula bacteriană ADN propriu de enzimele de restricţie? a) prin adăugarea de grupări metil la adenină şi citozină; b) utilizând ADN ligaza pentru a fixa ADN bacterian într-un cerc închis; c) adăugând histone pentru a proteja ADN dublu catenar; d) prin formarea capetelor coezive “sticky ends” ale ADN bacterian pentru a împiedica enzima de la ataşare; e) prin adăugarea de legături fosfodiesterice covalente la ADN bacterian. TA 2.22. Ce este un vector de clonare? a) enzima care rupe ADN în fragmente de restricţie; b) o sondă ADN utilizată pentru a localiza o gena particulară în genom; c) un agent, ca de exemplu - un plasmid, utilizat pentru a transfera ADN dintr-o soluţie in vitro întro celula viabilă; d) aparatul de laborator utilizat pentru a clona gene; e) capăt coeziv al unui fragment ADN. TA 2.23. Procesul prin care o bacterie preia un plasmid dintr-o soluţie din mediu se numeşte: a) transformare; b) transcripţie; c) tranziţie; d) transducţie; e) translaţie Proiectul pentru Învăţământ Rural

63

Tehnici de explorare celulară

2.5.4. Construirea unei bănci de ADN genomic

Obţinerea unei bănci de ADN genomic este necesară pentru caracterizarea unei secvenţe genomice particulare pentru stabilirea unei hărţi fizice a unui genom sau pentru secvenţializarea unor regiuni sau a întregului genom. O bancă de ADN genomic reprezintă un ansamblu de vectori recombinaţi fiecare conţinând un fragment diferit din genomul speciei studiate. Principiul constă în: i) izolarea ADN genomic de la specia de interes; ii) digerarea ADN cu o enzimă de restricţie care permite obţinerea de fragmente de restricţie de mărime compatibilă cu vectorul ales; iii) clonarea fragmentelor într-un vector de clonare; iv) integrarea vectorilor recombinaţi în microorganisme în scopul multiplicării acestora (Figura 2.21). De exemplu, vectorii fagici sunt mult mai bine adaptaţi clonării unei secvenţe genomice particulare în timp ce cosmidele şi vectorii YAC (Yeast Artificial Chromosomes) sunt aleşi în scopul caracterizării genomului. Banca obţinută este constituită din milioane de clone recombinate. Deoarece ADN genomic este identic în toate celulele aceluiaşi individ, provenienţa tisulară a acestuia nu are importanţă.

Figura 2.21: Schema simplificată a realizării unei bănci genomice

TA 2.24. Fragmentele ADN specifice ale unei bănci genomice sunt conţinute în: a) plasmide recombinate în bacterii; b) ADN viral recombinat; c) Cromozomi eukariotici; d) a şi b; e) a, b şi c.

64

Proiectul pentru Învăţământul Rural

Tehnici de explorare celulară

Populaţiile de ARNm prezente într-un anumit ţesut sunt 2.5.5. Construirea unei bănci de ADNc caracteristice pentru acesta. Manipularea ARNm este un proces foarte delicat (cantitate mică, sensibilitate la nucleaze) şi este necesară transformarea moleculelor de ARNm în ADN dublu catenar uşor de manipulat şi adaptat tehnicilor de clonare în vectori bacterieni. O bancă de ADNc (ADN complementar) este reprezentativă pentru populaţiile de ARNm prezente într-un anumit ţesut şi unui stadiu determinat al dezvoltării acestuia. O bancă de ADNc poate fi considerată ca o „fotografie instantanee” a populaţiilor de ARNm reprezentate. Construirea unei bănci de ADNc necesită următoarele etape: i) purificarea ARNm poliadenilat aparţinând organului (prin cromatografie de afinitate pe coloane de poliT); ii) copierea acestor molecule de ARNm sub formă de ADN monocatenar complementar sub acţiunea unei revers-transcriptaze inverse; iii) eliminarea specifică a ARNm prin tratament cu ribonuclează H sau hidroxid de sodiu; iv) sinteza celui de al doilea braţ de ADN prin acţiunea unei ADN polimeraze; v) legarea de oligonucleotide (adaptori) pentru a crea situsuri de restricţie; vi) clonarea într-un vector (plasmidă sau fag); vii) integrarea vectorilor recombinaţi într-o bacterie (Figura 2.22). Vectorii de clonare folosiţi pentru construirea unei bănci de ADNc sunt plasmide sau fagi.

Figura 2.22: Schema etapelor realizării unei bănci de ADNc (ARNm)

TA 2.25. Prima etapă în prelucrarea moleculelor de ARNm pentru construirea unei bănci de ADNc se realizează utilizănd: a) ARN polimeraza pentru a transcrie gena; b) o enzima de restrictie pentru a rupe gena în segmente mai scurte; c) reverstranscriptaza pentru a obţine ADN complementar monocatenar; d) ADN polimeraza pentru obţine produsul polipeptidic; e) ADN ligaza pentru a uni fragmentele de ADN care codifica pentru un polipeptid particular.

Proiectul pentru Învăţământ Rural

65

Tehnici de explorare celulară

2.5.6. Reacţia PCR

Reacţia PCR (Polymerase Chain Reaction) este o tehnică folosită pentru amplificarea directă a unor secvenţe de ADN ale căror extremităţi 3’ şi 5’ sunt cunoscute. Amplificarea se realizează prin repetarea reacţiilor de alungire (sinteză) în prezenţa unei ADN polimeraze şi a unor oligonucleotide specifice (primeri) Descoperirea bacteriilor termofile care produc ADN polimeraze termostabile a făcut posibilă automatizarea procesului şi dezvoltarea explozivă a aplicaţiilor acestei tehnici. Principiul de amplificare in vitro se bazează pe repetarea a trei etape: i) denaturarea celor două catene de ADN la temperatură ridicată (în jur de 950C) pentru a obţine molecule de ADN monocatenare; ii) hibridizarea oligonucleotidelor (primerilor) complementare pentru o secvenţă de ADN monocatenară ţintă (temperatura între 400C - 650C pentru hibridizarea corectă a primerului); iii) reacţia de alungire (sinteză) realizată de către o ADN polimerază termostabilă (Taq polimeraza) plecând de la primeri (temperatură optimă de 720C) (Figura 2.23). Produşii obţinuţi în urma acestui prim ciclu sunt din nou denaturaţi prin încălzire şi un nou ciclu compus din aceleaşi faze se repetă. Fiecare catenă nou sintetizată reprezintă o nouă matriţă pentru polimerază. La fiecare ciclu, numărul de copii ale fragmentului de ADN se dublează creşterea numărului produşilor de reacţie fiind exponenţială. Numărul optim de cicluri este de 3035. Tehnică de PCR a revoluţionat literalmente cercetările în biologia moleculară şi are numeroase aplicaţii atât în clonarea şi studiul expresiei genelor cât şi în cercetarea polimorfismului genetic.

Figura 2.23. Prezentare schematică a principiului reacţiei PCR şi verificare produşilor prin electroforeză

66

Proiectul pentru Învăţământul Rural

Tehnici de explorare celulară

Aplicaţiile tehnicii PCR sunt multiple: i) pentru identificarea mutaţiilor prezente în ADN de la eucariote (mutaţii sau deleţii responsabile de apariţia deficienţelor congenitale, cancer, etc.; ii) clonarea unor gene specifice; iii) amplificarea de fragmente de ADN genomic rare; iv) taxonomie şi filogenie moleculară; v) depistarea maladiilor genetice: diagnostic prenatal de anemie falciformă, fenilcetonurie, beta-talasemii, maladii genetice legate de sex; vi) obţinerea de sonde utilizate pentru stabilirea de amprente genetice (minisateliţi); vii) depistarea agenţilor patogenivirali: HIV, virusul hepatitei B, leucemiei ATL, papiloma virusuri genitale implicate în apariţia de cancere; viii) depistarea infecţiilor bacteriene: micobacterii (Micobacterium tuberculosis), paraziţi ca toxploasmele; ix) depistarea oncogenelor implicate în numeroase tipuri de cancer; x) corelarea maladiilor autoimune cu tiparea HLA şi cu diabetul insulino-dependent; xi) analiza ADN din diferite fosile; TA 2.26. Reacţia de polimerizare în lanţ (PCR) este importanta deoarece permite: a) inserarea genelor eucariote în plasmide procariote; b) încorporează gene în virusuri; c) formează ADN din transcripţi ARN; d) formează multe copii ale unui segment ADN ţintă; e) inserează secvenţe reglatoare în genele eucariote. TA 2.27. Reacţia de polimerizare în lanţ (PCR) poate fi utilizată pentru a amplifica ADN din următoarele structuri: a) o fosilă; b) o celulă fetală; c) un virus; d) b şi c; e) a, b şi c. Utilizaţi următoarele posibilităţi pentru a răspunde la întrebările de mai jos. Fiecare alegere poate fi făcută o dată, mai mult decât o dată, sau deloc. A) enzime de restricţie B) ADN ligaza C) Revers-transcriptaza D) ARN polimeraza E) ADN polimeraza TA 2. 28. Care enzima fixează permanent împreună fragmentele ADN care au capete coezive complementare ? TA 2.29. Care enzima este folosita pentru a forma ADN complementar (ADNc) din ARNm? TA 2.30. Care enzima este utilizata pentru a forma copii multiple de gene prin PCR? TA 2.31. Care enzime scindează moleculele de ADN la situsuri specifice? Proiectul pentru Învăţământ Rural

67

Tehnici de explorare celulară

2.6. Răspunsuri şi comentarii la testele de autoevaluare R TA 2.1.Sunt cultivate în laborator celulele dintr-un număr mare de organisme şi ţesuturi din diferite surse pentru scopuri foarte diferite: - studiul propriu-zis al sistemelor celulare (proliferare, condiţii de creştere, evoluţia ciclului celular, controlul creşterii celulelor tumorale şi modularea expresiei genice); - în domeniul biologiei dezvoltării pentru a realiza studii de dezvoltare şi diferenţiere; - obţinerea de plante şi animale transgenice; - studii de citogenetică şi genetică moleculară; - studii de citotoxicitate pentru diferite medicamente şi substanţe xenobiotice (agenţi poluanţi); R TA 2.4: In vivo şi in vitro, aceste două locuţiuni latine, prima semnificând „în organismul viu” şi a doua „în sticlă”, sunt folosite pentru a desemna condiţiile în care se derulează experimentele biologice. Deşi, termenul in vitro înseamnă literal “în sticlă”, în prezent majoritatea culturilor celulare se realizează în sau pe plastic. În prezent, culturile celulare îşi propun să reproducă in vitro condiţiile existente in vivo pentru a permite celulelor “normale” şi tumorale să crească în cultură. Dacă termenul in vitro este fără ambiguitate deoarece se referă la experienţele care se realizează în afara organismului viu, în general în tuburi de experienţă, termenul in vivo se referă la reacţiile fiziologice observabile în organismul viu. Se consideră că acesta se foloseşte abuziv când este folosit pentru celule în cultură scoase din contextul organismului. Acestor locuţiuni li se adaugă acum termenul „in silico” care desemnează „cipurile” pe bază de siliciu care sunt utilizate pentru calculatoarele moderne. R TA 2.5. Limita de rezoluţie, adică capacitatea de a distinge două puncte diferite, este direct corelată cu lungimea de undă a luminii. Limita puterii de rezoluţie în lumină vizibilă cu lentile de sticlă este situată, în general în jur de 0,2 μm. Puterea de separare (de rezoluţie) se poate ameliora diminuând lungimea de undă λ, crescând indicele de refracţie n al mediului situat între lamelă şi obiectiv şi crescând unghiul α reprezentat de înclinaţia cea mai mare a razelor care penetrează în obiectiv în raport cu axa optică a microscopului R TA 2.6. Da dacă eşantionul este destul de subţire. Dacă trebuie să observăm un eşantion gros este necesară prelucrarea prin fixare şi tratarea cu coloranţi specifici R TA 2.7. Microscopia optică este mult mai uşor de folosit şi necesită instrumente mult mai simple. Pot fi rezolvate (identificate) uşor obiectele cu o mărime de 1 μm; limitele cele mai scăzute (joase) de rezoluţie sunt de 0,2 μm care reprezintă limita teoretică impusă de lungimea de undă a luminii vizibile. Lumina vizibilă nu distruge şi trece uşor prin apă, făcând posibilă observarea celulelor vii. Microscopia electronică este mult mai complicată atât în ceea ce priveşte prepararea probei (care trebuie să fie extrem de subţire şi bine întinsă, colorată cu metale grele electrono-dense şi complet deshidratată) dar şi în ceea ce priveşte natura instrumentului. Celulele nu se pot observa vii. Rezoluţia microscopiei electronice este mult mai mare, astfel încât pot fi uşor rezolvate/vizualizate obiecte de aproximativ 10 nm. Pentru a evidenţia orice detaliu structural, microtubulii, mitocondria şi bacteriile este recomandată utilizarea (analizarea prin) microscopiei electronice. Totuşi, este posibil ca aceste structuri să fie colorate şi cu coloranţi specifici şi apoi să se determine localizarea prin microscopie optică. R TA 2.8: i) o celulă vie din piele se vizualizează mai bine prin microscopie optică; ii) o mitocondrie de drojdie prin microscopie optică; iii) o bacterie prin microscopie optică; iv) un microtubul prin microscopie pe fond întunecat

68

Proiectul pentru Învăţământul Rural

Tehnici de explorare celulară

R TA 2.9. În biologie tehnicile de separare şi de concentrare pot fi grupate în funcţie de i) proprietăţile fizico-chimice ale moleculei (densitate, masă moleculară, sarcină electrică, pH); ii) de proprietăţile biologice (recunoaştere antigen/anticorp sau enzimă/substrat). R TA 2.10. Forţa responsabilă de realizarea separării prin centrifugare şi ultracentrifugare este forţa centrifugă. Un aparat special numit centrifugă realizează separarea preparatelor biologice la viteze de mii sau sute de mii de rotaţii pe secundă, producând acceleraţii de mai multe mii de G asupra moleculei de purificat. Sedimentarea se produce astfel în câteva ore în loc de mai mulţi ani. R TA 2.11. În timpul utilizării centrifugii şi mai ales a ultracentrifugii se ridică două probleme: dezechilibrul rotorului şi degajarea de căldură. Dezechilibrul este rezolvat prin folosirea de materiale şi tehnici performante care permit echilibrarea foarte bună rotorului. De asemenea automatizarea permite detectarea oricărui dezechilibru şi oprirea centrifugii în timp util. Cea de a doua problemă este şi mai jenantă deoarece sunt separate molecule biologice foarte sensibile la căldură. O primă măsură a fost echiparea centrifugilor şi ultracentrifugilor, cu sisteme de răcire a rotorului şi cu pompe de vid extrem de performante. R TA 2.12. Da este posibilă separarea. În cazul acestei tehnici de ultracentrifugare densitatea mediului variază descrescător şi continuu de la partea inferioară la cea superioară a tubului. La sfârşitul centrifugării, moleculele vor fi repartizate în benzi în funcţie de densitatea lor. R TA 2.13. În funcţie de suport şi de mediul lichid care asigură realizarea separării există mai multe tipuri de cromatografie: i) cromatografia pe hârtie, cea mai simplă; ii) filtrarea pe gel care realizează separarea moleculelor în funcţie de mărimea lor; iii) cromatografia de schimb ionic care foloseşte drept suport răşini schimbătoare de ioni; iv) cromatografia de afinitate care exploatează înalta specificitate a interacţiilor legăturilor biologice; v) cromatografie pe coloană în fază lichidă - HPLC variantă a acesteia, una dintre metodele cele mai eficace de separare a moleculelor; vi) cromatografia pe coloană în fază gazoasă permite separarea celor mai mici cantităţi de materie R TA 2.14. b R TA 2.15. Gel filtrarea sau cromatografia de excluziune reprezintă o separare în funcţie de mărimea particulelor. Variind diametrul bilelor utilizate pentru separare se pot încetini moleculele mari în timp ce cele mici vor trece printre bile şi vor migra mai rapid. Invers, dacă folosim bile poroase moleculele mici vor penetra în acestea şi vor fi întârziate în timp ce moleculele care nu intră în bile trec direct şi mult mai repede. Cromatografia pe schimbători de ioni reprezintă o separare în funcţie de sarcină care foloseşte ca suport răşini schimbătoare de anioni sau cationi. Dacă folosim bile încărcate, cu sarcini negative (schimbători de cationi) sau cu sarcini pozitive (schimbători de anioni) moleculele (de exemplu proteine) care poartă sarcini opuse se vor fixa în timp ce restul vor migra. Când toate moleculele vor fi fixate, se creşte progresiv forţa ionică a solventului, moleculele se vor separa de bile unele după altele, fiecare în funcţie de propria forţă ionică, şi vor trece prin faţa detectorului Cromatografia de afinitate exploatează specificitatea deosebită a interacţiilor biologice. Grefarea prin legături covalente a unui ligand la suprafaţa unei matrice inerte (suport) permite purificarea unei proteine dintr-un amestec. Interacţia enzimă-substrat în Proiectul pentru Învăţământ Rural

69

Tehnici de explorare celulară

care substratul serveşte de ligand favorizează purificarea enzimei care recunoaşte substratul la nivelul situsului său catalitic. De asemenea, anticorpii specifici pot servi drept liganzi pentru a reţine pe o coloană proteina faţă de care au fost produşi. În toate cazurile, după reluarea celorlalte molecule, proteinele fixate sunt detaşate schimbând eluantul astfel încât să rupă interacţiile proteină-ligand. Cea mai eficientă este cromatografia de afinitate deoarece se bazează pe specificitatea de recunoaştere iar factorul de purificare poate atinge 10 000 la o singură trecere prin coloană. R TA 2.16. Se propune realizarea unui eseu care va fi prezentat tutorelui R TA 2.2: c; R TA 2.3: a, b şi d; R TA 2.17. e; R TA 2.18. b; R TA 2.19: a; R TA 2.20: e; R TA 2.21: a; R TA 2.22: c; R TA 23: a; R TA 24: d; R TA 25: c; R TA 2.26: d; R TA 2.27: e; R TA 2.28: b; R TA 2.29: c; R TA 2.30: e; R TA 2.31: a.

70

Proiectul pentru Învăţământul Rural

Tehnici de explorare celulară

2.7. Lucrare de verificare 2 V 2.1. Liniile celulare prezintă o serie de proprietăţi care le conferă avantaje de cultivare. Care dintre afirmaţiile de mai jos sunt false: a) manifestă viteze mari de creştere la densităţi celulare mari; b) prezintă necesităţi mici pentru ser; c) prezintă instabilitate cromozomială mai mare; d) sunt capabile de creştere în suspensie; e) pot fi menţinute cu uşurinţă în medii simple. - V 2.2. Mediile folosite pentru culturile de celule eucariote sunt mai complexe decât cele pentru procariote şi conţin: a) aminoacizi; b) factori de creştere specifici; c) nucleotide purinice şi pirimidinice; d) ser fetal de viţel; e) acizi graşi esenţiali. Care dintre următoarele afirmaţii sunt adevărate? V 2.3. Care sunt principalele aplicaţii ale culturilor de celule şi ţesuturi. V 2.4. Prezentaţi principale avantaje ale utilizării tehnicilor microscopice şi discutaţi comparativ principiile microscopiei de fluorescenţă şi electronică. V 2.5. Care sunt tehnicile microscopice cele mai adaptate obţinerii unei rezoluţii mai bune pentru a vizualiza: a) o celulă vie; b) o mitocondrie de drojdie; c) o bacterie; d) un microtubul; V 2.6. Ultracentrifugarea este o tehnică foarte eficientă care permite o foarte bună separare a particulelor de mărime mică deoarece: a) aparatele folosite sunt performante; b) particulele se pot încălzi în timpul separării; c) posibilitatea folosirii unui gradient de densitate în tuburi; d) aparatele sunt prevăzute cu sisteme de vid care permit o separare în funcţie de sarcină; e) orice particulă sedimentează în timp sub acţiunea forţei de gravitaţie. V 2.7. Prezentaţi principiul separărilor folosind forţa centrifugă şi soluţiile tehnice utilizate pentru a obţine rezultate cât mai bune. V 2.8. Analizaţi comparativ principiile următoarelor tipuri de cromatografie: gel filtrare, cromatografia pe schimbători de ioni şi cromatografia de afinitate. Care dintre aceste consideraţi că este mai eficientă? V 2.9. Care sunt tehnicile experimentale pe care le veţi folosi pentru a separa cu succes o proteină care este prezentă în mai multe compartimente celulare. Credeţi că este posibilă o purificare avansată a acesteia? A Dacă da, faceţi o schemă a principalelor etape care trebuie parcurse. V 2.10, Electroforeza SDS-PAGE separă proteinele pe baza: a) secvenţei de aminoacizi din capătul amino terminal; b) proporţiei de aminoacizi hidrofobi; c) sarcinii electrice a întregii molecule; d) capacităţii de a forma structuri secundare şi terţiare caracteristică proteinelor; e) masei moleculare. V 2.11. Moleculele mari de ADN sunt separate mai bine pe: a) gel de agaroză; b) gel de poliacrilamidă; c) pe membrane de hârtie; d) prin SDS-PAGE; e) prin cromatografie de afinitate V 2.12. Putem realiza un experiment de clonare dacă avem la dispoziţie: a) separaţi toţi cromozomii unei celule; b) plasmide; c) secvenţe nucleotidice necodificate; d) bacterii; e) b şi d V 2.13. Care dintre enzimele de mai jos a fost utilizata pentru a produce molecula din figura alăturată? a) ligaza; b) transcriptaza; c) o enzima de restricţie; d) ARN polimeraza; e) ADN polimeraza

Proiectul pentru Învăţământ Rural

71

Tehnici de explorare celulară

V 2.14. Se presupune că încercaţi să clonaţi o gena într-o plasmidă şi un coleg vă oferă un preparat de ADN tăiat cu enzima de restricţie X. Gena pe care doriţi să o inseraţi posedă la capete situsuri de clivare cu enzima de restricţie Y. În laborator aveţi o plasmidă care posedă un singur situs pentru Y, dar nu şi pentru X. Care va fi strategia pe care o veţi alege pentru a rezolva problema: a) inseraţi fragmentele tăiate în plasmidă cu direct X, fără clivarea plasmidei; b) tăiaţi plasmida cu enzima de restricţie X şi inseraţi în plasmidă fragmentele tăiate cu Y; c) tăiaţi din nou ADN cu enzima de restricţie Y şi inseraţi aceste fragmente în plasmida tăiată cu aceiaşi enzimă; d) clivaţi plasmida de două ori cu enzima de restricţie Y şi legaţi două fragmente la capetele fragmentelor de ADN uman tăiat cu enzima de restricţie X; e) clivaţi plasmida cu enzima X şi apoi inseraţi gena în plasmidă V 2.15. Care dintre enzimele enumerate de mai jos sunt necesare pentru a produce ADN recombinat? a) endonucleaza şi transcriptaza; b) enzime de restricţie şi ligaza; c) polimeraza şi ligaza; d) transcriptaza şi ligaza; e) ADN polimeraza şi topoizomeraza. V 2.16. Ce este un vector de clonare? a) enzima care rupe ADN în fragmente de restricţie; b) o sonda ADN utilizată pentru a localiza o gena particulară în genom; c) un agent, de exemplu - o plasmidă, utilizată pentru a transfera ADN dintr-o soluţie in vitro într-o celulă viabilă; d) aparatul de laborator utilizat pentru a clona gene; e) capăt coeziv al unui fragment ADN Utilizaţi informaţiile următoare pentru a răspunde la întrebările de mai jos. O gena eucariotă are capete coezive produse de către endonucleaza de restricţie EcoRI. Gena este adăugată unui amestec care conţine EcoRI şi o plasmidă bacteriană care poarta două gene, una pentru rezistenţă la ampicilina şi alta pentru tetraciclina. Plasmidul are un situs de recunoaştere a EcoRI localizat în gena rezistenta la tetraciclina. Amestecul este incubat timp de câteva ore şi apoi este adăugat mediu de creştere bacterian. Bacteriile vor fi lăsate sa crească peste noapte şi apoi sunt însămânţate pe o placă Petri utilizând o tehnica care produce colonii izolate. Probe prelevate din aceste colonii sunt apoi crescute în medii diferite: mediu nutritiv plus ampicilină; mediu nutritiv plus tetraciclină, mediu nutritiv cu ampicilină şi tetraciclină, mediu nutritiv fără antibiotice. V 2.17. Bacteria care conţine plasmida obţinută prin clonare moleculară va creste în: a) numai mediu nutritiv; b) numai mediu nutritiv cu tetraciclină; c) numai mediu nutritiv cu tetraciclină şi ampicilină; d) mediu nutritiv şi mediu nutritiv cu tetraciclină şi ampicilină; e) mediu nutritiv şi mediu nutritiv cu ampicilină; V 2.18. Bacteria care conţine plasmida, dar nu gena eucariotă, va creşte în: a) mediu nutritiv cu ampicilină dar nu în mediu nutritiv cu tetraciclină şi ampicilină; b) mediu nutritiv care conţine antibiotice; c) mediu nutritiv cu tetraciclină dar nu conţine ampicilina; d) toate cele patru tipuri medii e) mediu nutritiv care nu conţine antibiotice V 2.19. De ce a fost inserată gena în plasmidă înainte de a fi pusă în amestec cu bacteria ? a) plasmida acţionează ca un vector pentru a introduce gena în bacterie; b) plasmida conţine regiuni de control necesare pentru replicarea genică; c) gena eucariotă conţine introni care trebuie îndepărtaţi din plasmidă; d) numai a şi b sunt corecte; e) a, b şi c sunt corecte V 2.20. În care mediu va creşte bacteria care nu preia nici o plasmidă? a) numai mediu nutritiv; b mediu nutritiv şi mediu nutritiv cu tetraciclină; c) mediu nutritiv şi mediu nutritiv cu ampicilină; d) mediu nutritiv cu tetraciclină şi cel cu ampicilină; e) toate patru mediile 72

Proiectul pentru Învăţământul Rural

Tehnici de explorare celulară

2.8. Bibliografie 1. Biologie cellulaire, Jean Michel Petit, Abderrahman Maftah, Raymond Julien, Masson, Paris 1997, Chapitre 2: Méthodes d’exploration de la cellule 2. Cell Biology, Thomas D. Pollard, William C. Earnshaw, Elsevier, 2004 3. http://www.geniebio.ac-aix-marseille.fr/- Ressources Multimédia en Biochimie Génie Biologique; Biotechnologies 4. http://www.bio.umontreal.ca/cours/Bio-1154/evolution.htm, Biologie cellulaire I 5. http://www.boskitos.com/fac/biocel/ Biologie Cellulaire PCEM1 6. http://www.web-books.com/MoBio/Free/Contents.htm, Molecular Biology Web Book Contents 7. http://www.snv.jussieu.fr/bmedia/sommaires/bc.htm, Biologie Cellulaire 8. http://schwann.free.fr/biocell03.html, Cours de Biologie Cellulaire 9. Biologie moléculaire, Abderrahman Maftah, Raymond Julien, Masson, Paris 1996 10. Biologie Moléculaire et Cellulaire, Exercices et corriges, Nathan Université, 1994 11. Biochimie, génétique, Biologie moléculaire, J Etienne, 3eme édition, Masson, 1996 12: Biologie cellulaire, Thomas D. Pollard, William C. Earnshaw, edition francaise, Elsevier, 2004, Chapitre 5: Techniques de recherche 13, The Cell a Molecular Approach, Geoffrey M. Cooper, Robert E. Hausman, third edition, ASM Press, 2004, Chapter 1: An overview of cells and cell research 14. Biologie Cellulaire et Moléculaire, concepts et expériences, Gerald Karp, De Boeck Université, 1998, Chapitre 17 : Techniques de biologie cellulaire et moleculaire 15. Essential Cell Biology, An introduction to the Molecular Biology of the Cell, International Student edition, B. Alberts, D. Bray, A. Johnson, J. Lewis, M. Raff, K. Roberts, P. Walter, Garland Publishing Inc, 2004, Chapter 1: Introduction to Cells. 16. Biology, N. A. Campbell, J. B. Reece, William Barstow, Editor, International Edition, Benjamin Cummings, sixth Edition, 2002, Chapter 20: DNA technology and Genomics 17. Test Bank For Biology, N. A. Campbell, J. B. Reece, William Barstow, Editor, , Benjamin Cummings, sixth Edition, 2002, Chapter 20: DNA technology and Genomics 18. Molecular Biology of the Cell, A problems approach, J. Wilson, T. Hunt, Garland Science, Forth edition, 2002 19. http://www.snv.jussieu.fr/bmedia/lafont/sommaires/bc.htm, Méthodes physiques de séparation et d’analyse et méthodes de dosage des biomolécules 20. www.ustboniface.mb.ca, Bienvenue à la page d'accueil pour le cours Biologie 21. Molecular Cell Biology, Lodish, Berck, Zypousky, Matsudaira, Baltimore, Darnell, 4th edition, 2000, Freeman and Company, Chapter 1: Life Begins with Cells 22. www.med.univ-angers.fr, Licence de Biologie Cellulaire. 23. web-books.com, Molecular Biology Web Book Contents 24. http://www.cu.lu/labext/rcms/cppe/cellfr.html, CPPE Module S2: Biologie cellulaire 25. http://www.cbc.umn.edu/~mwd/courses.html, Course/Tutorial on Cell Biology 26. http://web.mit.edu/esgbio/www/7001main.html, Hypertextbook Cell Biology 27. http://www.univ-ag.fr/, Cours de Biologie cellulaire 28. www.emc.maricopa.edu/faculty/farabee/BIOBK/BioBookCHEM1.html, On-Line Biology Book: 29. http://www.infobiogen.fr/deambulum/index.php, DEAMBULUM - Cours en biologie : Biologie cellulaire Proiectul pentru Învăţământ Rural

73

Ciclul şi diviziunea celulară

Unitatea de învăţare 3 Ciclul şi Diviziunea Celulară

Cuprins Introducere Obiective Unitatea 3 Informaţii generale despre evaluare 3. 1. Ciclul celular 3.1.1. Interfaza 3.1.2 Mitoza 3.1.3. Dinamica citoscheletului în timpul ciclului celular 3.1.3.1.Microtubulii 3.1.3.2. Filamentele de actina 3.1.3.3. Filamente intermediare 3.1.3.4. Formarea fusului mitotic

3. 2. Mecanisme biochimice de control al ciclului celular 3.2.1.Cicline 3.2.2. Punctele de control

3.3. Meioza 3.3.1. Originea gameţilor 3.3.2. Derularea meiozei 3.3.2.1. Diviziunea reducţională (sau mitoza heterotipică) 3.3.2.2. Diviziunea ecuaţională 3.3.2.3. Comparaţie mitoză – meioză

3.4. .Îmbătrânirea celulară 3.4.1. Reorganizarea genomului nuclear - aberaţii cromozomiale 3.4.2. Scurtări ale telomerilor şi senescenţa replicativă 3.4.3. Aspecte energetice şi biochimice

3.5. Moarte şi nemurire celulară 3.5.1. Necroza 3.5.2. Apoptoza şi moartea celulară programată 3.5.3. Imortalitatea celulară – cancer 3.5.3.1. Imortalitatea celulară 3.5.3.2. Proprietăţile celulei tumorale 3.5.3.3. Mutaţiile şi imortalizarea celulelor 3.5.3.4. Virusurile ca agenţi transformanţi

3.6. Răspunsuri şi comentarii la testele de autoevaluare 3.7. Lucrare de verificare 3 3.8. Bibliografie

74

pag 74 75 76 77 78 79 80 84 84 89 90 94 97 101 102 104 104 105 105 106 108 108 109 109 110 111 111 111 114 114 115 115 116 118 120 123

Proiectul pentru Învăţământul Rural

Ciclul şi diviziunea celulară

Introducere În cadrul acestei unităţi de studiu vă veţi putea familiariza cu principalele noţiuni privind ciclul celular şi etapele sale, mecanismele biochimice de control ale acestuia, formarea celulelor sexuale în urma meiozei, îmbătrânirea celulară, moarte şi imortalitate celulară. Ciclul celular reprezintă totalitatea modificărilor pe care le suferă celulele în decursul vieţii şi care poartă responsabilitatea diviziunii şi multiplicării celulare. Diviziunea celulară este rezultanta cariochinezei (diviziunea mitotica a nucleului) dirijată de fusul mitotic şi a citocinezei (diviziunea citoplasmei) datorată inelului contractil. Aceste două entităţi, fusul mitotic şi inelul contractil sunt rezultatul unui rearanjament al citoscheletului care conferă celulei interfazice arhitectura sa internă. Răspunsul celulei la un stimul exterior converge cel mai adesea către parametrii de reglare ai ciclului celular. Punctele de control ale ciclului celular au fost considerate etape în care toate evenimentele specifice ale fazei precedente trebuiesc îndeplinite. Reproducerea sexuată necesită fuziunea a doi gameţi proveniţi de la cei doi părinţi. Mecanismul fuziunii celor doi gameţi, şi deci a nucleelor lor, duce în timpul fecundării la o nouă celula diploidă. Acest lucru este posibil doar dacă gameţii, contrar celulelor somatice cu 2n cromozomi, sunt haploizi şi conţin n cromozomi. În timpul elaborării gameţilor, gametogeneza, celulele stem germinale diploide suferă o diviziune reducţională, meioza, proprie celulelor reproducătoare. În timpul meiozei are loc doar o duplicare a ADN după care celula se angajează în două diviziuni succesive. Îmbătrânirea biologică este un proces fundamental care se observă la aproape toate fiinţele vii. Este caracterizat printr-o deteriorare progresivă a sistemelor biologice, conducând la creşterea mortalităţii care este corelată cu înaintarea în vârstă. Înţelegerea mecanismelor senescenţei este de interes particular, pentru că are implicaţii largi atât pentru om ca individ cât si pentru societate. Multiplicarea celulelor este reglată cu grijă ca răspuns la nevoile specifice ale corpului. La animalele tinere, multiplicarea celulară este mai crescută decât moartea celulară, astfel încât animalele tinere cresc în mărime. La adulţi procesul de formare şi de moarte celulară este echilibrat pentru a produce o stare staţionară. Ocazional, controalele perfecte care reglează multiplicarea celulară sunt dereglate. Celula în care apare această dereglare începe să crească şi se divide întrun mod neregulat, fără a ţine seamă de necesităţile organismului. Descendenţii unei celule care moştenesc o capacitate de proliferare crescută, fără a răspunde procesului de reglare, duc la formarea unei clone de celule capabile să se multiplice la infinit. În final, aceste celule nedorite pot forma o masă de celulară numită tumoră.

Proiectul pentru Învăţământul Rural

75

Ciclul şi diviziunea celulară

Obiective Unitatea 3

Obiective generale ¾ Înţelegerea principiilor generale de organizare şi diviziune celulară; ¾ Explicarea proceselor şi fenomenelor de îmbătrânire şi „imortalitate” celulară în corelaţie cu starea de sănătate şi boală

Obiective specifice La terminarea studiului acestei unităţi de studiu, trebuie să fiţi capabili să: ƒ

Identificaţi:

i) etapele de control ale ciclului celular şi să puteţi recunoaşte actorii implicaţi în acestea; ii) funcţiile celulare care necesită intervenţia directă a citoscheletului; iii) asemănările şi deosebirile dintre mitoză şi meioză; iv) aspectele genetice şi biochimie ale procesului de îmbătrânire; v) modalităţile de evoluţie a proceselor de apoptoză şi proliferare celulară. ƒ

Cunoaşteţi:

i) etapele ciclului celular cu identificarea modificărilor pe care le suferă celula pe parcursul derulării acestuia; ii) proteinele citoscheletului şi modul lor de asamblare în filamente şi tubuli (fenomenul de polimerizare/depolimerizare şi dinamismul filamentelor de actină şi microtubuli); iii) proteinele motrice şi modul lor de interacţie cu actina şi tubulina; iv) etapele meiozei şi rezultatele acestora; v) modificările care apar în organizarea celulară în timpul îmbătrânirii; vi) modificările care apar în organizarea celulară în timpul apoptozei şi procesului de proliferare tumorală.

76

Proiectul pentru Învăţământul Rural

Ciclul şi diviziunea celulară

Evaluarea pe parcurs - Testele de autoevaluare (TA) ¾ Unitatea conţine în structura sa 38 de teste de autoevaluare distribuite astfel încât să asigure o bună fixare a noţiunilor prezentate. ¾ Fiecare test de evaluare se bazează pe parcurgerea şi înţelegerea materialului teoretic prezentat. ¾ Unele dintre testele de autoevaluarea sunt întrebări urmate de trei sau patru sau cinci răspunsuri posibile, fiecare indicat cu o literă în dreptul lui. Pentru a răspunde la aceste întrebări, trebuie să încercuiţi litera din dreptul răspunsului pe care îl consideraţi ca fiind corect. ¾ Alte teste vă cer să scrieţi răspunsuri scurte sau să încercuiţi răspunsul corespunzător spaţiilor libere; ¾ Există şi teste de autoevaluare care vor necesita rezolvarea unei probleme sau scrierea unor scurte eseuri prin care să exprimaţi părerea voastră asupra anumitor aspecte. ¾ Răspunsurile şi comentariile la testele de autoevaluare sunt prezentate la sfârşitul unităţii, înainte de lucrarea de verificare 3. Lucrări de verificare notate de tutore Gradul de dobândire a conceptelor şi procedurilor prezentate în această unitate de învăţare va fi cuantificat pe baza notei obţinute la Lucrarea de verificare Nr.3 care conţine 30 de probleme. Testele din lucrarea finală sunt de acelaşi tip ca şi testele de autoevaluare pe care le veţi rezolva pe parcursul parcurgerii materialului unităţii 3. Evaluarea răspunsurilor dumneavoastră la lucrarea de verificare 3 va fi realizată de tutore la termenul stabilit de comun acord cu administraţia universităţilor care organizează formarea. Răspunsurile problemelor vor fi transmise direct universităţilor organizatoare. Evaluarea pe parcurs are o pondere de 50% din nota finală. Lucrarea de verificare 3 va reprezenta 6% din verificarea pe parcurs. Cele 30 de întrebări sunt echivalente şi vor fi notate cu 2 puncte fiecare, astfel încât pentru o lucrare corectă să puteţi acumula 60 de puncte. Materialul conţine patru cadre suplimentare şi 36 de figuri care prezintă informaţii menite să întregească sau să clarifice noţiunile prezentate. Acestea nu sunt opţionale. Un rezultat bun la lucrarea de verificare este clar condiţionat de parcurgerea cu responsabilitate a testelor de autoevaluare, a cadrelor şi de înţelegerea figurilor. Dacă nu reuşiţi să rezolvaţi cu succes testele de autoevaluare în momentul întâlnirii lor pe parcursul parcurgerii testului vă recomandăm să reluaţi întregul material si apoi să reveniţi asupra rezolvării testelor. Unele dintre testele de autoevaluare sunt foarte simple şi direct corelate cu textul parcurs, răspunsul lor fiind evident în text. O serie de teste necesită o bună integrare a cunoştinţelor obţinute şi necesită parcurgerea întregii unităţi. Enunţurile testelor au şi ele rolul lor în fixarea cunoştinţelor şi în formarea unei viziuni de ansamblu asupra materiei.

Proiectul pentru Învăţământul Rural

77

Ciclul şi diviziunea celulară

3. 1. Ciclul Celular

Axioma lui Rudolf Virchow „orice celulă provine dintr-o celulă” ilustrează conceptul de multiplicare celulară prin diviziune. Observaţia microscopică relevă existenţa fazei M sau mitozei care precede diviziunea în două a unei celule. În cursul mitozei, cromozomii se condensează şi se aliniază la ecuatorul celulei. De ce se divide o celulă? Mitoza asigură îndeplinirea mai multor fenomene: i) dezvoltarea embrionară; ii) creşterea generală a organismelor, de la naştere până la stadiul adult; iii) creşterea continuă a anumitor organisme şi/sau organe (arborii, părul, dinţii la rumegătoare, unghiile, etc.); iv) reînnoirea celulelor moarte (celulele cutanate, hematiile, etc.); v) asigură cicatrizarea diferitelor răni; vi) conservă identitatea celulară în timpul dezvoltării şi reînnoirii celulelor din aceleaşi organe, ţesuturi, etc.; vii) apariţia dereglărilor de proliferare la nivelul celulelor somatice de tip cancer. Ce declanşează mecanismul ? Diferite ipoteze: i) un factor ereditar de mărime: fiecare tip celular are o talie ereditară care, o data atinsă şi depăşită, provoacă diviziunea; ii) raportul nucleu/citoplasmă: nucleul nu ar putea controla eficient decât o cantitate limitată de citoplasmă; reducerea la jumătate a volumului de citoplasma ar restabili un control eficient aducând raportul în favoarea nucleului care este întotdeauna neschimbat ca număr de cromozomi; iii) raportul membrană/citoplasmă: suprafaţa membranei citoplasmatice nu ar putea asigura schimburi eficace decât pentru o cantitate limitata de citoplasma; reducerea la jumătate a citoplasmei ar aduce raportul în favoarea membranei citoplasmatice; iv) existenţa semnalelor citoplasmatice: s-a demonstrat că un nucleu, care se divide normal într-un anumit tip celular, transplantat în altă citoplasma nu se mai divide. Descrierea fenomenului – Fazele ciclului celular Filmarea celulelor în diviziune arată că mitoza şi citocineza reprezintă un ansamblu de modificări continue. Din motive didactice care să permită înţelegerea fenomenului şi reţinerea evenimentelor esenţiale, acesta este subdivizat: i) o fază preparatoare, interfază, care este şi o fază de repaus care reprezintă 90% din ciclul celular, invizibilă în microscopie optică şi a cărei durată variază între 10 şi 24 de ore la mamifere;

78

Proiectul pentru Învăţământul Rural

Ciclul şi diviziunea celulară

ii) faza de diviziune, formată din patru etape funcţionale, vizibile la microscopul optic: profaza, metafaza, anafaza şi telofaza, cu o durată de aproximativ o oră. În timpul acesteia nucleul şi citoplasma vor fi divizate, procesele respective fiind numite cariochineză şi citocineză. În esenţă studiul mitozei este axat pe cariochineză şi în cadrul acesteia pe modificările suferite de cromozomi. 3.1.1. Interfaza

Mult timp s-a considerat că în celulele aflate în această fază nu se întâmplă nimic. Analiza cantităţii de ADN în celulele cu o rată de diviziune crescută a demonstrat că acesta se dublează rapid înainte de fazele vizibile. Procesul este asigurat de enzima ADN polimeraza care copiază catenele parentale matriţă şi sintetizează, pe baza de complementaritate (adenina - timina şi citozina guanina) două catene noi omologe. La sfârşitul interfazei, nucleul, care conţine unul sau mai mulţi nucleoli, este bine definit şi înconjurat de un înveliş nuclear. Centrozomul, unic, este replicat şi microtubulii pornesc din centrozom într-o structură stelată numită aster. Analitic interfaza se subdivide în trei perioade distincte: ƒ a) faza G1 (gap = interval) care se întinde între faza M şi începutul fazei de sinteza a ADN. Durata sa variază de la câteva ore la câteva zile. Condiţionează durata ciclului celular şi constituie o perioadă critică. Celulele care nu pot trece de aceasta etapă intră în stare quiescentă, faza G0. În faza G1 are loc activarea tuturor elementelor necesare sintezei ADN, graţie unui proces de transcripţie susţinut; ƒ b) faza S în timpul căreia conţinutul ADN al unei celule trece de la 2n (2n cromozomi, fiecare cu o cromatidă pe cromozom) la 4n (2n cromozomi rămâne, fiecare cu două cromatide identice). Duplicarea cromatinei depinde de starea sa de condensare. Eucromatina, care corespunde regiunilor de ADN frecvent transcrise sub formă de ARN, este duplicată prima în timp ce heterocromatina (corespunzătoare regiunilor represate) este duplicată tardiv; ƒ c) faza G2, în general foarte scurtă, se caracterizează printro creştere mare a volumului celular. Celulele embrionare precoce posedă toate elementele necesare unei sinteze rapide de ADN şi diviziunii. În acest caz, interfaza se reduce la faza S, şi determină diminuarea dimensiunilor celulei în timpul numeroaselor diviziuni caracteristice acestui stadiu de dezvoltare (Figura 3.1)

Proiectul pentru Învăţământul Rural

79

Ciclul şi diviziunea celulară

ƒ

TA 3.1. Ce este ciclul celular? Care sunt etapele acestuia ?

ƒ

Figura 3.1. Etapele ciclului celular cu evidenţierea interfazei şi mitozei

3.1.2 Mitoza

Mitoza nu se poate derula decât dacă cromatina se condensează în entităţi distincte (cromozomii) destinate să asigure o bună repartiţie a materialului genetic între cele două celule fiice. Repartiţia se realizează în urma activării fusului mitotic indispensabil segregării şi în paralel cu condensarea cromozomilor. Succesiunea etapelor mitozei este următoarea: a) Profaza este o fază de organizare. Membrana citoplasmatică îşi modifică permeabilitatea şi schimburile cu exteriorul sunt diminuate. În nucleu, nucleolii se deplasează la periferie şi dispar. Fibrele de cromatină se condensează în spirală. Există trei nivele de condensare care conduc la formarea de cromozomi vizibili la microscopul fotonic. Fiecare cromozom duplicat are două cromatide identice reunite printr-un centromer. În citoplasma, se formează fusul de diviziune compus din microtubuli şi proteine care se dispun între cei doi centrozomi. Centrozomii se îndepărtează unul de celalalt şi microtubulii formează un fus care înconjoară nucleul plecând de la o poziţie polară (Figura 3.2). b) Metafaza este un punct cheie al mitozei. Începutul său, pro-metafaza, se caracterizează printr-o ruptură bruscă a învelişului nuclear. În acest stadiu, cromozomii devin accesibili unei clase de microtubuli ai fusului mitotic (microtubuli kinetocorieni) care se leagă la cromozomi la nivelul kinetocorilor (structuri specializate de la nivelul centromerilor care ghidează migrarea cromozomilor). În următoarea etapă învelişul nuclear este distrus în întregime; lamina nucleară este dezorganizată şi centrozomii se poziţionează la polii celulei. Cromozomii formează placa metafazică în urma alinierii pe placa ecuatorială, situată la distanţă egală de cei doi poli ai fusului. Se stabileşte un echilibru între cele două cromatide ale cromozomului menţinute şi orientate către polii opuşi ai fusului mitotic.

80

Proiectul pentru Învăţământul Rural

Ciclul şi diviziunea celulară

Figura 3.2 Etapele profazei: 1,2- profaza, debut: cromozomii se individualizează. Centrozomul a fost duplicat la sfârşitul interfazei; 3,4 - profaza, continuare: cromozomii se subţiază şi se curbează. Fiecare cromozom este constituit din două cromatide unite la nivelul centromerilor kinetocorieni. Cromozomii sunt foarte scurţi şi subţiri. Centrozomii se vor separa. Cei doi centrozomi şi microtubulii constituie astere care migrează către polii celulei. Cele două astere se poziţionează la polii opuşi. Microtubulii constituie fusul dispus între cei doi centrozomi ; 5,6 - Profaza, sfârşit: membrana nucleară dispare. Cromozomii nu mai sunt în nucleu, dar sunt prinşi într-o structura care pregăteşte dispunerea ecuatorială.

Figura 3.3: Metafaza toţi cromozomii sunt plasaţi la ecuatorul fusului şi constituie placa ecuatorială. Nu mai exista semnale inhibitoare.

c) Anafaza nu durează decât câteva minute şi începe când centromerul dedublat al fiecărui cromozom se separă în două, eliberând astfel cromatidele surori. Fiecare cromatidă devine din acest moment un cromozom întreg, condus de fus către polii celulei. Cromozomii sunt atraşi către poli ca urmare a contracţiei microtubulilor. Mitocondriile se concentrează la nivelul plăcii ecuatoriale iar polii se îndepărtează unul de altul. TA 3.2. Câte nivele de condensare fac posibilă vizualizarea cromozomilor metafazici la microscopul optic.

Proiectul pentru Învăţământul Rural

81

Ciclul şi diviziunea celulară Figura 3.4: Anafaza: toţi kinetocorii se separă. Microtubulii ataşaţi kinetocorilor se depolimerizează şi cromozomii urcă spre poli; cromatidele individualizate ajung la poli urcând de-a lungul microtubulilor. Un cerc de fibre contractile (acto-miozina) apare în jurul celulei în plan ecuatorial.

d) Telofaza marchează sfârşitul mitozei (telos = fin). Microtubulii polari alungesc celula şi la poli se formează noii nuclei. Cele două noi învelişuri nucleare se constituie din învelişul nuclear al celulei mamă şi regiuni din membrana reticulului endoplasmatic. Reapar nucleolii, fiecare cromozom îşi pierde organizarea spaţială compactă şi reia forma cromatinei iniţiale. Mitocondriile, ca şi celelalte organite sunt redistribuite. Mitoza, adică diviziunea unui nucleu în două nuclee identice genetic, s-a terminat. Citocineza (diviziunea citoplasmei) este deja bine conturată deoarece cele două celule fiice se vor individualiza la puţin timp după mitoză. e) Citocineza începe la sfârşitul anafazei cu formarea unei linii de diviziune prin invaginarea membranei la ecuatorul membranei celulare, perpendicular pe axul longitudinal al fusului mitotic. Diviziunea în două celule fiice se realizează graţie elaborării unui inel contractil, compus dintr-un fascicul de filamente de actină şi miozină, asociate pe faţa internă a membranei plasmatice. O dată cu invaginarea liniei, are loc o pierdere progresivă a filamentelor la nivelul inelului contractil până se ajunge la un punct strâns între cele două celule fiice. Procesul se încheie cu ruperea acestui punct când celula pare să sufere o întindere centripetă care separă complet celule fiice. În celulele vegetale, care au un perete celulozic, citocineza apare ca un mecanism centrifug. O structura dublă, numită placă celulară se constituie în timpul telofazei la ecuatorul celulei mamă, plecând de la centru şi fuzionând cu peretele celulei-mamă astfel încât cele două celule vegetale noi sunt formate (Figura 3.5). TA 3.3. Toate afirmaţiile de mai jos sunt adevărate, cu excepţia: a) mitoza produce noi nuclei cu exact aceiaşi înzestrare cromozomială ca şi nuclei parentali; b) mitoza poate avea loc fără citocineză; c) mitoza şi citocineza sunt necesare pentru reproducerea asexuată; d) toate celulele provin dintr-o celula preexistentă; e) fusurile mitotice în celulele procariote sunt compuse din microtubuli

82

Proiectul pentru Învăţământul Rural

Ciclul şi diviziunea celulară

Figura 3.5: Telofaza-citocineză. 1. fibrele se contractă. 2. anvelopa nucleară se reformează; 3. Realizează un sfincter care restrânge diametrul celulei la nivel ecuatorial; 4. Celula se împarte progresiv în două. Membrana nucleară se reconstituie în jurul fiecărui set de cromozomi. Cromozomii se decondensează progresiv.

TA 3.4. Centromerul este o regiune în care: a) cromatidele sunt ataşate una cu alta; b) cromozomii metafazici devin aliniaţi; c) cromozomii sunt grupaţi în timpul telofazei; d) nucleul este localizat anterior mitozei; e) se formează noi microtubuli TA 3.5. Toate afirmaţiile de mai jos privind evenimentele din timpul prometafazei mitozei sunt adevărate, cu excepţia: a) centriolii se deplasează către polii opuşi; b) nucleolul nu mai poate fi observat; c) învelişul nuclear dispare; d) cromozomii sunt duplicaţi; e) fusul de diviziune este organizat TA 3.6. De obicei, dar nu întotdeauna, citocineza urmează mitoza. Daca o celulă termina mitoza, dar nu citocineza, care va fi rezultatul? a) o celulă cu un singur nucleu mare; b) o celulă cu concentraţii mari de actină şi miozină; c) o celulă cu doi nuclei mici anormali; d) o celulă cu doi nuclei; e) o celulă cu doi nuclei, dar cu jumătate din cantitatea de ADN TA 3.7. Cum reprezintă diviziunea celulară un liant între om şi primele celule eucariote? TA 3.8. Fuziunea celulelor în G1 şi S nu dă aceleaşi rezultate ca fuziunea celulelor în G2 şi S. Care este diferenţa şi cum se explică? TA 3.9. In timpul cărei faze (căror faze) ale mitozei vom întâlni cromozomi compuşi din două cromatide? a) de la interfaza până la anafază; b) de la G1 a interfazei până la metafază; c) de la metafază până la telofază; d) de la anafază până la telofază; e) de la G2 a interfazei până la metafază

Proiectul pentru Învăţământul Rural

83

Ciclul şi diviziunea celulară

3.1.3. Dinamica citoscheletului în timpul ciclului celular

Diviziunea celulară este rezultanta cariochinezei (diviziunea mitotică a nucleului) dirijată de fusul mitotic şi citocinezei (diviziunea citoplasmei) datorată inelului contractil. Aceste două entităţi, fusul mitotic şi inelul contractil sunt rezultatul unui rearanjament al citoscheletului care conferă celulei interfazice arhitectura sa internă. Citoscheletul Citoscheletul formează o reţea complexă de filamente şi tubuli care se întinde în toată citoplasma. Faţă de scheletul osos care este rigid, citoscheletul este o structură foarte dinamică care se reorganizează continuu în timpul diferitelor evenimente celulare (migrare, diviziune, etc.). Toate elementele citoscheletului (filamente de actina, intermediare şi microtubuli) sunt structuri proteice alungite care rezulta prin polimerizare de structuri monomere. Trei tipuri principale de structuri proteice constituie citoscheletul: filamentele de actină (microfilamente), filamentele intermediare, microtubulii (Figura 3.6 ). Acestea conferă forma celulei şi forţele necesare migrării, constituind un real un suport, proprietate importantă mai ales pentru celula animală care nu prezintă perete extern. Această reţea la care se ataşează organitele serveşte şi ca mijloc de transport.

Figura 3.6: Componentele citoscheletului: 1. Microtubulii constituie o “reţea” cu centrul situat la nivelul centrozomului; 2. Filamentele intermediare constituie o reţea poziţionată sub membrana nucleară internă şi care ocupă întreg spaţiul citoplasmatic constituind lamina; 3. Microfilamentele de actină constituie o reţea localizată în principal sub suprafaţa celulară.

3.1.3.1.Microtubulii

84

Microtubulii sunt bine reprezentaţi în celulele eucariote, şi mai ales în celulele nervoase unde reprezintă 10-20% din proteinele totale (Figura 3.7). Microtubulii sunt formaţi din molecule de tubulina, heterodimeri rezultaţi prin asocierea a două polipeptide globulare, α-tubulină şi β-tubulină. Un microtubul este o structură cilindrică, goală în interior, constituită din 13 protofilamente. Protofilamentele sunt compuse dintr-o alternanţă de subunităţi de α şi β-tubulină, asamblate cu aceeaşi polaritate (Figura 3.8).

Proiectul pentru Învăţământul Rural

Ciclul şi diviziunea celulară

Fiecare dimer rezultă din asocierea α- şi β-tubulinei. Există diverse forme de tubulină: 6 forme α-tubulină şi 6 forme β-tubulină. Au mai fost caracterizate forme de γ, δ şi ε-tubuline care se găsesc în structurile centriolare. α şi β-tubulina leagă GTP. La α-tubulină GTP este prins în interior şi nu poate fi schimbat, în timp ce GTP legat cu β-tubulina este expus la suprafaţa şi poate fi schimbat (Figura 3.8).

Figura 3.7. Localizarea celulară a citoscheletului (celule neuronale) (prelucrat după http://www.cbc.umn.edu/~mwd/courses.html)

Figura 3.8: Componentele microtubulilor (prelucrat după Molecular Cell Biology, Lodish, et all. 4th edition, 2000)

Proiectul pentru Învăţământul Rural

85

Ciclul şi diviziunea celulară

Asamblarea microtubulilor Microtubulii rezultaţi prin asamblarea paralelă a protofilamentelor sunt structuri polare cu o extremitate (+) capabilă de creştere rapidă şi o extremitate (-) care tinde să disocieze dacă nu este stabilizată. Stabilizarea extremităţilor (-) se efectuează graţie ancorării în centrozom, situat în proximitatea nucleului. Extremitatea (+) este acum liberă să-şi crească dimensiunile prin adăugarea tubulinei (Figura 3.9). Aceste structuri sunt extrem de labile şi într-o celulă funcţiile microtubulilor depind în parte de aceasta stabilitate. Un alcaloid de tipul colchicinei împiedică polimerizarea microtubulilor (este utilizată pentru a bloca celulele în diviziune în metafaza), în timp ce taxolul îi stabilizează. Extremitatea cu creştere rapida (plus) este liberă, în timp ce extremitatea minus este, cel mai adesea, prinsă în centrozom. Centrozomul este un complex proteic organizat în jurul a două structuri numite centrioli. Centriolii conţin mai multe forme de tubulină (α, β, γ, δ şi ε). În general, centrozomul se găseşte aproape de nucleu şi numele său provine de la faptul că reprezintă aproximativ centrul celular. Plecând de la centrozom se adăugă dimerii de tubulina (alpha şi beta) încărcaţi cu GTP (alfa la polul minus şi beta la polul plus) şi se elaborează protofilamente, care se asamblează unele cu altele lateral, formând straturi. Acestea se pliază progresiv pentru a forma microtubulul, cilindric şi rigid (Figura 3.9).

Figura 3.9: Asamblarea microtubulilor (prelucrat după Molecular Cell Biology, Lodish, et all. 4th edition, 2000)

TA 3.10. Taxolul este un medicament anticanceros extras din tisa (Texus sp). În celulele animale, el distruge formarea microtubulilor prin legarea la aceştia şi accelerarea asamblării lor din tubulină. Surprinzător, acesta stopează mitoza. În concluzie, taxolul afectează: a) fibrele fusului mitotic de diviziune; b) anafaza; c) formarea de centrioli; d) asamblarea cromatidei; e) faza S a ciclului celular

86

Proiectul pentru Învăţământul Rural

Ciclul şi diviziunea celulară

Cadru 3.1: Evenimentele ciclului celular depind de proteinele motrice asociate microtubulilor Două familii de proteine motrice interacţionează cu microtubulii. Kinezinele care se deplasează spre extremitatea plus şi dineinele care se deplasează spre extremitatea minus (direcţia centrozomului) (Figura 3.10). Proteinele asociate cu microtubulii (MAP - Microtubule Associated Proteins) îi stabilizează şi intervin în interacţiile lor cu alţi compuşi celulari. Aceste proteine sunt la rândul lor asociate cu alte proteine. Kinezina este asociată cu o catenă proteică uşoară care îi permite fixarea şi transportul organitelor celulare. Dineina este cuprinsă într-un complex proteic constituit din şase catene intermediare. Acest complex permite şi el fixarea organitelor. Proteinele motrice utilizează energia derivată din hidroliza repetată a ATP pentru a se deplasa pe microtubul. Aceste proteine sunt compuse din două catene grele, fiecare având un cap globular care leagă ATP şi o coadă constituita dintr-o suită de domenii sub formă de bastonaş. Capul se leagă la microtubul şi are activitate ATP-azică (de hidroliză a ATP). Acesta reprezintă partea motrice, în timp ce coada, la care se asociază catene uşoare, interacţionează cu constituenţii celulari al căror transport specific îl asigură (Figura 3.10).

Figura 3.10: Proteine motrice care interacţionează cu microtubulii (prelucrat după http://www.cbc.umn.edu/~mwd/courses.html)

TA 11. De ce credeţi că este posibil să cunoaştem mai bine dinamica microtubulilor injectaţi cu tubulina fluorescentă decât cu tubulina marcată radioactiv? Va puteţi imagina o întrebare pentru care răspunsul să fie pozitiv pentru utilizare tubulinei marcata radioactiv?

Proiectul pentru Învăţământul Rural

87

Ciclul şi diviziunea celulară

Funcţiile microtubulilor: i) deplasarea organitelor pe microtubuli: dimerii de dineină şi kinezină se pot ataşa cu ajutorul cozii la structuri intracelulare cum sunt neurofilamentele, reticulul endoplasmatic, aparatul Golgi, membrana citoplasmatică, cromozomii (kinetocori) şi veziculele de secreţie. Interacţia cu microtubulii prin cap permite deplasarea acestor structuri celulare. Kinezina asigură transportul către extremitatea plus a microtubulului, transport care se realizează anterograd (de la corp către ramificaţiile terminale). Dineina va asigura transportul către extremitatea minus, transport retrograd (Figura 3.10); ii) mişcarea cililor: flexiunea fasciculelor de microtubuli permite mişcarea cililor şi flagelilor. La suprafaţa epiteliului respirator (bronhii şi trahee), regiunile cu cili se ondulează coordonat, permiţând deplasarea unidirecţională (către exterior) a mucusului bronhic. Mişcarea este un fenomen activ, apărut dintr-o recuperare pasivă, în care cilul revine la poziţia iniţială. Mişcarea unui cil se produce prin flexiunea părţii centrale, axonema (Figura 3.11 ).

Figura 3.11. Mişcarea cililor şi http://www.cbc.umn.edu/~mwd/courses.html)

axonema

(prelucrat

după

Axonema este constituită dintr-o armătură de microtubuli aranjaţi în nouă dublete periferice care înconjoară un dublet central. Fiecare dublet periferic este format prin asamblarea a doi microtubuli care pun în comun trei protofilamente. În fiecare dublet un microtubul este asociat cu dineină. Dineina interacţionează cu dubletul adiacent pentru a determina o mişcare de alunecare a unui dublet pe altul. Dineina ciliară are un domeniu motor care hidrolizează ATP pentru a se deplasa pe microtubul către extremitatea minus.

88

Proiectul pentru Învăţământul Rural

Ciclul şi diviziunea celulară

3.1.3.2. Filamentele Actina În numeroase celule animale este proteina cea mai de actina abundentă (cel puţin 5% din masa proteică totală). Filamentele de actina formează structuri dinamice care sunt mai mult sau mai puţin stabile prin asociere cu alte proteine. De exemplu, formele stabilizate se găsesc în microvili şi celulele musculare. Actina este o proteină care leagă ATP şi are doi poli: unul pozitiv şi unul negativ (Figura 3.12). S-au identificat trei clase de actine: a) α-actina în celulele musculare (striate şi netede); b) β-actina (patru forme); c) γ-actina. Ultimele două clase se găsesc în celulele ne-musculare. Diversitatea moleculară dintre diferitele tipuri de actină este foarte mică acestea având peste 90% identitate de secvenţă. Proteinele de legătură cu rol important în polimerizare şi stabilizarea filamentelor de actina pot permite cuplarea filamentelor între ele şi iniţierea mişcării.

Figura 3.12. Microfilamentele de actină (prelucrat după http://www.infobiogen.fr /deambulum/index.php)

Polimerizarea actinei Actina polimerizează (în prezenţa ATP) într-o elice strânsă de 5-9 nm diametru, formând un filament flexibil şi polar. (Figura 3.12 ). Microfilamentele sau actina F (7nm în diametru) rezultă din polimerizarea actinei G, cea mai abundentă dintre proteinele citoscheletice în numeroase celule eucariote. Filamentele de actină polimerizează ca microtubulii şi prezintă o extremitate (+) cu creştere rapidă şi o extremitate (-) stabilă. Pe faţa internă a membranei plasmatice actina se leagă la proteine specifice şi conferă celulei un suport mecanic necesar executării mişcărilor celulare. În celulele musculare scheletice, filamentele de actină pot forma structuri stabile.

Proiectul pentru Învăţământul Rural

89

Ciclul şi diviziunea celulară

Rol în citocineză La sfârşitul mitozei, după ce cromozomii s-au separat graţie microtubulilor (telofaza), filamentele de actina formează la periferia celulei şi perpendicular pe axul fusului mitotic un fascicul contractil numit inel contractil. Când inelul se contractă, el separă celula mama în două celule fiice (citocineză). 3.1.3.3. Filamente intermediare

Filamentele intermediare sunt polimeri proteici rezistenţi şi durabili cu un diametru de 10 nm, prezenţi în citoplasma majorităţii celulelor. Se numesc intermediare pentru ca diametrul lor aparent este cuprins între cel al filamentelor de actină (microfilamente) şi microtubuli. În majoritatea celulelor, o reţea extensivă de filamente intermediare înconjoară nucleul şi se întinde până la periferia celulei. Sunt legate şi cu desmozomii şi hemidesmozomii (Figura 3.13). Polimerizarea filamentelor intermediare Faţă de actină şi tubulină, care sunt proteine globulare, tipurile proteice din constituţia filamentelor intermediare sunt molecule fibroase foarte alungite. Secvenţa lor în aminoacizi favorizează formarea dimerilor superrăsuciţi (Figura 3.13). În timpul asamblării, doi dimeri foarte răsuciţi se asociază antiparalel pentru a forma o subunitate tetrameră numită protofilament (3 nm în diametru). Tetramerii se alătură unui filament intermediar în curs de alungire şi opt astfel de protofilamente formează filamentul intermediar cu diametrul de 10 nm (Figura 3.13). Componentele filamentelor intermediare se găsesc rar în stare liberă (monomeri). Procesul de asamblare sau disociere filamentului este un proces lent care poate avea loc într-un interval de câteva minute, în timp ce actina şi tubulina necesită pentru asociere numai câteva secunde.

Figura 3.13. Structura filamentelor intermediare http://www.infobiogen.fr/deambulum/index.php)

90

(prelucrat

după

Proiectul pentru Învăţământul Rural

Ciclul şi diviziunea celulară

Componentele filamentelor intermediare Faţă de genele actinei şi tubulinei, bine conservate în evoluţie, genele care codifică filamentele intermediare sunt diverse şi grupate într-o familie de aproximativ 50 de membrii formând şase clase diferite (Tabelul din figura 3.14). Clasa 1 2 3

4 5 6

Nume

Număr de gene 18 18 1

GM kDa

Asociere cu

40-65 51-86 53

clasa 2 clasa 1 homopolimer

Expresie predominanta în celule epiteliale Celule epiteliale Celule musculare

1

50

homopolimer

celule gliale

1 1 1

57 190 54

Homopolimer clasa 3 homo sau hetero

Neuroni Celule musculare Fibroblaste

3

70-200

L, M sau H

neuroni

1

55

homopolimer

lamina

4

62-72

homopolimer

Nestina

1

230

homopolimer

neuroni embrionari Toate clasele (nucleu) neuroni embrionari, miocite

keratina acidă keratina bazica desmina GFAP Glial Fibrillary Acidic Protein periferina sinemina vimentina neurofilament L, M şi H alpha-internexina

Figura 3.14. Componentele filamentului intermediar

Rol în ciclul şi diviziunea celulară - Susţinerea învelişului nuclear Reţeaua de filamente intermediare, polimeri ai laminei, care dublează faţa internă a învelişului nuclear, formează lamina nucleară. Aceasta susţine învelişul nuclear şi dă nucleului o formă stabilă, în general, globulară. În timpul mitozei, lamina nucleară se dezorganizează datorita fosforilării componentelor (de către un complex kinazic ciclinaB/Cdk1). Dezintegrarea sa permite intrarea în acţiune a unui alt tip de elemente citoscheletice, microtubulii, care participă la formarea fusului şi separarea cromozomilor (Figura 3.15 ). Foarte stabile în celulă, filamentele intermediare au un rol structural şi sunt frecvent asociate cu microtubulii. Proteinele din constituţia lor sunt toate molecule fibroase cu un domeniu central cilindric. Aceste proteine formează homo- sau heterodimeri care se asamblează elicoidal. Expresia genică depinde de ţesut, şi de aceea aceste proteine sunt divizate în mai multe clase: i) vimentina în celule endoteliale, vase sanguine şi fibroblaste; ii) desmina în celule musculare; iii) keratina în piele şi fanere (păr, unghii, etc.) unde este majoritară; iv) filamente gliale în neuroni şi astrocite.

Proiectul pentru Învăţământul Rural

91

Ciclul şi diviziunea celulară

Figura 3.15 : Filamente intermediare (lamina) în nucleu (prelucrat după http://www.infobiogen.fr/deambulum/index.php)

Cadru 3.3. O organizare particulară a citosheletului se observă în celula musculară Celulele musculare sunt celule în care citoscheletul este foarte bine elaborat şi în care actina reprezintă 20% din masa proteică totală. Muşchiul este modelul cel mai bine studiat al mobilităţii bazate pe actină. Exista două tipuri de muşchi: striat, cum sunt muşchii scheletici şi cardiac, şi neted, larg răspândit în organism la nivelul vaselor, tubului digestiv, uterului şi bronhiilor. Muşchiul scheletic este constituit din celule gigant, miocitele, (lungi de câţiva centimetri pentru că rezultă prin fuziunea a mii de mioblaste în cursul dezvoltării). În fiecare celulă, citoscheletul are numeroase unităţi identice numite miofibrile (Figura 3.16). Fiecare miofibrilă este constituită dintr-o juxtapunere liniară de sarcomere, de aproximativ 3 μm, unite prin discurile Z. Filamentele intermediare, constituite din desmină (proteina de 53 kDa), înconjoară miofibrilele la nivelul discurilor Z şi face miofibrilele solidare unele cu altele şi cu membrana celulară (gigant). În acest mod se realizează alinierea sarcomerelor (subunităţi ale miofibrilelor) care conferă muşchiului scheletic aspectul sau caracteristic striat în microscopie optică (Figura 3.17). În muşchiul scheletic, filamentele de actină sunt asociate cu filamentele de miozina. Miozinele sunt o familie de proteine care convertesc energia ATP pentru a-şi schimba conformaţia pentru a se deplasa prin alunecare în lungul filamentelor de actină. Miozina II, moleculă prezentă în muşchi, formează oligomeri de filamente subţiri care, asociate cu filamentele de actina, constituie structura numită sarcomer care constituie o subunitate a miofibrilei. Aceasta formează o structura cilindrică de 1-2 μm diametru, adesea de lungime egală cu celula (Figurile 3.17 şi 3.18). Contracţia este rezultatul alunecării capetelor miozinei în urma hidrolizei ATP. S-a calculat ca o molecula de ATP permite o deplasare de 11nm. Viteza acestei deplasări atinge 4 μm/s şi forţa dezvoltată este de aproximativ 3-4 pN.

92

Proiectul pentru Învăţământul Rural

Ciclul şi diviziunea celulară

Diversitatea filamentelor intermediare serveşte la identificarea celulelor şi, în cazul unei celule tumorale, la determinarea originii tisulare a tumorii. Laminele nucleare sunt filamente intermediare întâlnite în toate celulele unde formează o reţea (lamina) care aderă pe faţa internă a învelişului nuclear. Această structură dinamica se dezasamblează rapid la începutul mitozei şi se reorganizează la sfârşitul acestei faze.

Figura

3.16.

Organizarea

muşchiului

striat

(prelucrat

după

http://www.infobiogen.fr/deambulum/index.php)

Figura 3.17. Sarcomerul ca unitate de contracţie (prelucrat după Biology, N. A. Campbell, J. B. Reece, William Barstow, Ed, International Edition, Benjamin Cummings, 6th Edition, 2002)

TA 3.12. Descrieţi structura sarcomerului unei microfibrile a muşchiului scheletic şi modificările care se produc în timpul contracţiei sale.

Proiectul pentru Învăţământul Rural

93

Ciclul şi diviziunea celulară

TA 3.13. Două familii de proteine motrice interacţionează cu microtubulii: a) kinezinele; b) ciclinele; c) dineinele; d) albuminele; e) a şi c sunt adevărate TA 3.14. Cum definiţi citoscheletul şi care sunt componentele sale principale TA 3.15. Descrieţi trei funcţii diferite ale microtubulilor şi trei funcţii ale filamentelor de actina. TA 3.16. Comparaţi structura unui microtubul complet asamblat, a unui filament de actina si a unui filament intermediar TA 3.17. Comparaţi rolurile kinezinei şi dineinei citoplasmatice în mişcarea cililor.

3.1.3.4. Formarea fusului mitotic

94

În cea mai mare parte a celulelor, asterii se organizează în jurul centrozomilor, care constau într-o pereche de centrioli şi materialul pericentriolar asociat acestora. Fiecare aster acţionează ca un veritabil centru organizator de microtubuli sau MTOC (pentru MicroTubule Organizing Center) Înainte de sfârşitul profazei, fusul mitotic este constituit din doi asteri legaţi prin câţiva microtubuli interpolări. În profaza tardivă, timpul de înjumătăţire al unui microtubul scade brusc de la 5 minute la 15 secunde, iar numărul de microtubuli ce pornesc din centrozom creşte considerabil. Astfel se explică de ce începutul fazei M este marcat de trecerea rapidă a microtubulilor interfazici relativ lungi şi puţin numeroşi la un număr mare de microtubuli mici care înconjoară fiecare centrozom şi participă la elaborarea fusului mitotic. Pentru a discuta asamblarea fusului mitotic este necesară descrierea organizării sale. Fusul mitotic metafazic matur este o structură cu simetrie bilaterală în centrul căreia sunt localizaţi cromozomii flancaţi de aranjamente formate din microtubuli care iradiază spre poli. Structura fusului este determinată prin acţiunea a aproximativ şapte tipuri deferite de kinezine şi a dineinei citoplasmatice. Adesea, aceste proteine motrice au funcţii diferite. Deci, fusul este o structură foarte dinamică a cărui morfologie se modifică permanent. Fusul mitotic este constituit din trei clase de microtubuli: i) microtubuli polari care interacţionează între ei la centrul fusului şi asigură apoi îndepărtarea polilor la fiecare extremitate a fusului; ii) microtubuli kinetocorieni, purtători ai cromozomilor; iii) microtubuli interpolari sau astrali situaţi la exteriorul fusului şi a căror răspândire din centrozom menţine organizarea intracelulară în mitoză şi orientează forţele necesare separării polilor. Proiectul pentru Învăţământul Rural

Ciclul şi diviziunea celulară

TA 3.18. Identificaţi principalele modalităţi de modificare a microtubulilor TA 3.19. Care sunt principalele tipuri de care constituie fusul mitotic? Placa metafazică, structură tipică aparent imobilă, rezultă dintr-un proces de asamblare complex a cărui stabilitate este asigurată printr-un schimb continuu de subunităţi de tubulina cu tubulina liberă din celulă. Legăturile între microtubulii polari şi celelalte structuri cum sunt kinetocorii şi centrozomii se realizează prin intermediul proteinelor motrice microtubulare (Figura 3.18).

Figura 3.18. Formarea fusului mitotic (prelucrat după Biology, N. A. Campbell, J. B. Reece, William Barstow, Ed, International Edition, Benjamin Cummings, 6th Edition, 2002)

Cu toate că lungimea medie a microtubulilor kinetocorieni este aproximativ constantă în cursul metafazei, microtubulii se modifică continuu prin trei modalităţi: i) adăugare constantă de noi subunităţi de tubulină (aproximativ 10 unităţi pe secundă) la nivelul extremităţii plus prin care sunt ataşaţi de kinetocori; ii) un număr echivalent de subunităţi de tubulină se disociază lent la extremitatea minus de la nivelul polilor fusului. Deci, subunităţile de tubulină migrează permanent de-a lungul microtubulilor kinetocorieni, de la kinbetocori la poli. iii) toţi microtubulii ataşaţi la fiecare kinetocor îşi modifică lungimea în mod coordonat în urma oscilaţiilor cromozomiale. Segregarea cromozomilor între cele două celule fiice este un proces foarte precis. Pentru a atinge acest nivel de precizie, majoritatea celulelor întârzie intrarea lor în anafază până când toţi cromozomii au o orientare bipolară. Acesta reprezintă punctul de control al metafazei la nivelul căruia se detectează dacă alinierea cromozomilor şi asamblarea fusului au fost corect realizate în timpul metafazei. Proiectul pentru Învăţământul Rural

95

Ciclul şi diviziunea celulară

Remodelarea microtubulilor în anafază Începutul anafazei care corespunde separării cromatidelor surori este unul dintre evenimentele cele mai impresionante din întreg ciclul celular. Cromatidele surori se orientează către polii fusului (anafaza A) şi apoi polii se separă (anafaza B). De asemenea, anafaza este faza în care fusul mitotic activează cortexul celular pentru prepararea citocinezei. Deci, anafaza este dominată de mişcarea ordonată a cromatidelor surori către polii opuşi ai fusului, care rezultă din acţiunea combinată a proteinelor motoare şi din modificările de lungime ale microtubulilor (Figura 3.20). Mişcarea cromozomilor către polii opuşi rezultă din două mecanisme independente. Primul se desfăşoară în anafaza A, şi îşi are originea în micşorarea microtubulilor kinetocorieni a căror depolimerizare la nivelul kinetocorilor se efectuează cu viteză mare. Al doilea mecanism se observă în anafaza B şi corespunde separării polilor prin creşterea distanţei de separare. Are loc o polimerizare la nivelul extremităţilor distale ale microtubulilor polari, şi o alunecare către poli ajutată de proteinele motrice din familia kinezinei. Microtubulii astrali se alungesc în toate direcţiile plecând de la poli în timpul anafazei B. În asocierea cu proteinele motrice, ca dineina, generează o forţă care permite separarea polilor fusului (Figura 3.19).

Figura 3.19. Remodelarea microtubulilor în anafază(prelucrat după Molecular Cell Biology, Lodish, et all. 4th edition, 2000)

96

Proiectul pentru Învăţământul Rural

Ciclul şi diviziunea celulară

3.2. Mecanisme biochimice de control al ciclului celular

La sfârşitul anilor 80 a devenit clar că procesele moleculare care reglează cele două evenimente cheie ale ciclului celular: replicarea cromozomilor şi segregarea celulară sunt fundamental similare în toate celulele eucariote. Tehnicile de biochimie, genetică şi biologie moleculară au fost folosite pentru studiul diferitelor aspecte ale ciclului celular la eucariote. Acestea au scos în evidenţă că replicarea celulară este primordial controlată de realizarea corectă a replicării ADN şi mitozei. Controlul suprem al acestor evenimente îl au mai multe protein kinaze heterodimere mici care sunt compuse dintr-o subunitate reglatoare (ciclina) şi o subunitate catalitică (cdk - kinaza dependentă de ciclină). Aceste kinaze reglează activităţile mai multor proteine implicate în replicarea ADN şi în mitoză asigurând fosforilarea la nivelul unor situsuri specifice. Procesul are drept rezultat activarea unor proteine şi inhibarea altora astfel încât să se realizeze coordonarea activităţilor. Răspunsul celulei la un stimul exterior converge cel mai adesea către parametrii de reglare ai ciclului celular. În condiţii normale, rolul complexelor ciclină/cdk este esenţial pentru înţelegerea comportamentului celular. Importanţa acestei căi de semnalizare este mai bine înţeleasă când constatăm că dezvoltarea tumorală se explică adesea prin dereglare a unor căi de semnalizare esenţiale. Ciclul celular se articulează în jurul a patru faze cu durată inegală (Figura 3.20). În cea mai mare parte a timpului, celula se află în faza G1; în cursul fazei S se realizează replicarea ADN; se trece apoi în faza G2 şi apoi se realizează mitoza. Faza G1 este cea mai lungă şi o putem defini ca o fază control în care celula se asigură că mediul său îi permite să se dividă. Această etapă este extrem de controlată. Un anumit control se manifestă şi în faza G2 unde celula se asigură că replicarea ADN s-a realizat corect.

Figura 3.20. Prezentare sintetică a fazelor ciclul celular (prelucrat după Molecular Cell Biology, Lodish, et all. 4th edition, 2000)

Proiectul pentru Învăţământul Rural

97

Ciclul şi diviziunea celulară

Concentraţiile ciclinelor, subunităţile reglatoare ale protein kinazelor heterodimere care controlează evenimentele ciclului celular, cresc şi descresc pe durata derulării acestuia. Subunităţile catalitice (kinazele ciclin dependente – în engleză CiclynDependent Kinases CDKs) nu prezintă activitate kinazică dacă nu sunt asociate cu diferite cicline. Ciclinele asociate determină care dintre proteine vor fi fosforilate de către un anumit complex ciclinăCDK. În figura 3.21 este evidenţiat rolul celor trei clase majore de complexe cicline-CDK care controlează trecerea prin ciclul celular: fazele G1 şi S şi complexele cicline-CDK mitotice. Când celulele sunt stimulate să se replice complexele cicline-CDK din faza G1 sunt primele exprimate. Acestea pregătesc celula pentru faza S prin activarea factorilor de transcripţie care promovează transcripţia genelor care codifică enzimele necesare sintezei ADN şi genelor care codifică ciclinele şi kinazele ciclin dependente din faza S. Activitatea complexelor cicline-CDK din faza S este iniţial controlată de inhibitori. Mai târziu, în faza G1, complexele cicline-CDK ale fazei G1 induc degradarea inhibitorilor din faza S prin fosforilarea acestora şi prin stimularea cuplării lor cu ubicuitină determinată de către un complex multiproteic. Degradarea inhibitorilor poliubicuitinati din faza S de către proteazom eliberează complexele cicline-CDK ale fazei S. Odată activate, acestea fosforilează situsurile reglatoare ale proteinelor care sunt implicate în replicarea ADN, care se asamblează la nivelul originilor de replicare în timpul G1. Fosforilarea acestor proteine iniţiază replicarea ADN şi are rolul de a împiedica reasamblarea de noi complexe de pre-replicare. Din cauza acestei inhibiţii, fiecare cromozom este replicat numai o dată în timpul trecerii prin ciclul celular asigurându-se menţinerea numărului corect de cromozomi în celulele fiice. Complexele cicline-CDK mitotice sunt sintetizate în timpul fazelor S şi G2, dar activităţile lor sunt ţinute sub control prin fosforilare la nivelul situsurilor inhibitoare până ce sinteza ADN este completă. O dată activate prin defosforilarea situsurilor inhibitoare, complexele cicline-CDK mitotice fosforilează mai multe proteine care promovează condensarea cromozomilor, retragerea anvelopei nucleare, asamblarea aparatului fusului mitotic şi alinierea cromozomilor condensaţi la nivelul plăcii metafazice. În timpul mitozei complexul de promovare a anafazei APC, (în engleză Anaphase Promoting Complex), care conţine multe subunităţi de ubicuitin ligază, poliubicuitinează proteinele reglatoare cheie marcându-le pentru degradarea proteozomală. Un substrat important al APC este securina, o proteină care inhibă degradarea proteinelor care asigură legarea cromatidelor surori.

98

Proiectul pentru Învăţământul Rural

Ciclul şi diviziunea celulară

Figura 3.21. Reglarea ciclului celular (prelucrat după http://www.infobiogen.fr/deambulum/index.php)

Poliubicuitinarea securinei de către APC este iniţiată în timp ce kinetocorii (asamblaţi la nivelul centromerilor tuturor cromozomilor) se ataşează la microtubulii fusului determinând aranjarea cromozomilor în placa metafazică. După ce cromozomii sunt aliniaţi APC poliubicuitinează securina determinând degradarea sa proteozomală şi în consecinţă degradarea proteinelor care conectează cromatidele surori. Această secvenţă de evenimente iniţiază anafaza determinând cromatidele surori să segrege către polii opuşi ai fusului mitotic. În anafaza târzie, tot APC poliubicuitinează şi promovează degradarea ciclinelor mitotice. Procesul este inhibat până ce cromozomii care segregă ajung la locurile lor în celula în diviziune. Degradarea ciclinelor mitotice conduce la inactivarea activităţii protein kinazice a CDK. Descreşterea activităţii acestora permite protein-fosfatazelor active constitutiv să înlăture grupările fosfat care au fost adăugate de către complexele cicline-CDK mitotice unor proteine specifice. Ca rezultat, cromozomii deja separaţi decondensează, anvelopa nucleară se reface în jurul nucleelor nou formate, aparatul Golgi se reasamblează în timpul telofazei şi citoplasma se divide în timpul citocinezei conducând la formarea celor două celule fiice. Proiectul pentru Învăţământul Rural

99

Ciclul şi diviziunea celulară

La începutul fazei G1 a noului ciclu, fosfatazele defosforilează proteinele care formează complexele de prereplicare. Aceste proteine au fost fosforilate de către complexele cicline-CDK din faza S anterioară şi au fost păstrate în această stare, în timpul mitozei, de către complexele cicline-CDK mitotice. Ca urmarea a defosforilării din G1 se vor reasambla noi complexe de pre-replicare la nivelul originilor de replicare pentru viitoarea fază S. Fosforilarea APC de către complexele cicline-CDK către sfârşitul G1 inactivează complexul permiţând acumularea ciclinelor specifice fazei S şi mitozei necesare ciclului următor. Trecerea prin trei etape critice de tranziţie: G1/S, metafază/anafază, anafază/telofază şi citocineză este ireversibilă deoarece aceste tranziţii sunt reglate dirijate de către proteine reglatorii care sunt degradate. Prin urmare, celulele sunt obligate să traverseze ciclul celular într-o singură direcţie. În organismele superioare, controlul ciclului celular este realizat în primul rând prin reglarea sintezei şi activităţii complexelor cicline-CDK. Factorii de creştere extracelulari funcţionează drept mitogeni, inducând sinteza complexelor ciclineCDK din G1. Activitatea acestora şi a altor complexe cicline-CDK este reglată prin fosforilarea la nivelul diferitelor situsuri inhibitoare şi activatoare din subunitatea catalitică. Dacă mitogenii au acţionat o perioadă suficientă de timp, ciclul celular continuă către mitoză chiar dacă aceştia sunt înlăturaţi. Punctul de la finalul fazei G1 în care trecerea prin ciclul celular devine independentă de acţiunea mitogenilor este numit „punct de restricţie” (Figura 3.21). TA 3.20. Celulele care sunt într-o etapă în care nu se divid sunt în faza: a) G0; b) G2; c) G1; d) S; e) M Întrebările de mai jos se referă la 5 afirmaţii, legate de ciclul celular. Pentru fiecare fraza sau propoziţie, selectaţi răspunsul (marcat prin litere mai jos) cel mai adecvat. Fiecare răspuns poate fi folosit o dată, de mai multe ori sau deloc. a) G0 ; b) G1; c) S; d) G2; e) M TA 3.21. Aici se află “punctul de restricţie” TA 3.22. Celulele musculare şi nervoase sunt în această fază. TA 3.23. Este cea mai scurtă fază a ciclului celular. TA 3.24. ADN este replicat în această fază a ciclului celular. TA 3.25. Ciclinele sunt degradate la sfârşitul acestei faze. TA 3.26. Care este denumirea enzimelor care controlează activitatile altor proteine prin fosforilare? a) ATP-aze; b) kinaze; c) cicline; d) cromatina; e) protein kinaze

100

Proiectul pentru Învăţământul Rural

Ciclul şi diviziunea celulară

3.2.1. Ciclinele

Ciclinele conţin cel puţin două domenii funcţionale. Primul, întâlnit la toate clasele de cicline, este „cyclin box”, regiune conservată de 100 aminoacizi care asigura două funcţii: i) recunoaşte şi favorizează legarea ciclinei la kinaza CDK corespunzătoare; variaţiile de secvenţa în această regiune responsabilă de recunoaşterea unei cicline particulare, permite clasificarea ciclinelor în sub-familii; ii) activează domeniul catalitic (kinazic) al proteinei CDK. Al doilea domeniu prezent doar la ciclinele de tip A şi B, localizat în regiunea N terminală a proteinei, corespunde unei regiuni numita „destruction box”. Aceasta regiune conţine un motiv din aminoacizi bine conservaţi (secvenţa consens RALGDIGN) urmat de o regiune bogată în lizină cu un situs de recunoaştere pentru legarea mai multor molecule de ubiquitina (proteina mică termostabilă de 76 aminoacizi). Astfel modificată, ciclina va fi degradată de un complex multienzimatic, numit proteazom. În tabelul din figura 3.22 sunt prezentate pentru exemplificare câteva cicline şi kinaze dependente de cicline implicate în reglarea ciclului celular la diferite organisme cdk S. pombe cdc2 S.cerevisiae cdc28

Mamifere Cdk2 Cdk4 Cdk3 Cdc2 (Cdk1)

Cicline asociate

Fazele ciclului celular implicate

Cdc13

G2 >M

Cln1, Cln2, Cln6 Clb5, Clb6 Clb1, Clb2,Clb3, Clb4 CiclinaD1, D2, D3 CiclinaE Ciclina A CiclinaD1, D2, D3 CiclinaD1, D2,D3 CiclinaA CiclinaB

G1 >S S G2 >M

G1 G1->S S G1 G1 G2->M Metafaza>Anafaza

Figura 3.22. Kinaze dependente de cicline (cdk) la drojdii şi în celule de mamifere

Proiectul pentru Învăţământul Rural

101

Ciclul şi diviziunea celulară

3.2.2. Punctele de control

102

Mecanisme de supraveghere a ciclului celular Mecanismele specifice de supraveghere detectează erorile şi induc blocarea ciclului celular la puncte cheie de tranziţie. Astfel, în celulele de mamifere, arestarea ciclului în faza G1 consecutivă unei alterări a ADN este controlată de genele ATM (gena care prin dereglare provoacă ataxie telangiectazică) şi p53 (gena supresoare tumorală esenţială în controlul integrităţii ADN). Debutul anafazei este întârziat dacă în celulă cromozomii nu sunt toţi perfect aliniaţi pe fusul mitotic. Punctele de control ale ciclului celular au fost considerate etape în care toate evenimentele specifice ale fazei precedente trebuiesc îndeplinite. Aceste puncte de control pot fi şi puncte de oprire, blocând tranziţia către faza următoare. Intrarea în mitoză depinde de starea de fosforilare a complexului MPF (în engleză Maturation Promoting Factor sau Mitosis Promoting Factor). Fosfatazele şi kinazele care controlează procesul sunt şi ele supuse unei reglări care funcţionează după acelaşi principiu. Factorii de creştere sunt necesari pentru stimularea proliferării. Legarea unui factor de creştere la receptorul său membranar iniţiază o cascadă de evenimente (transducerea semnalului) care stimulează celula să îndeplinească faza G1 şi să se angajeze în faza S. Factorii de creştere induc transcripţia a numeroase gene, dintre care cele precoce codifică factori de transcriere. Astfel, o familie de factori, numiţi E2F, este necesară pentru transcrierea unor gene care codifică numeroase proteine implicate în sinteza deoxiribonucleotidelor şi ADN în timpul tranziţiei G2/S. Diferitele tranziţii G1/S, S/G2, G2/M depind de protein kinaze, asociate cu ciclinele lor şi/sau fosfataze. Etapele cheie ale ciclului celular evită „catastrofe genetice” care ar putea surveni dacă celula depăşeşte inopinat un punct de control. De exemplu, dacă anafaza începe înainte ca toţi cromozomii să se fixeze la microtubulii kinetocorieni, vor fi celule fiice în care anumiţi cromozomi vor lipsi şi/sau cu cromozomi supranumerari. Când acest proces, numit non-disjuncţie, se produce în timpul diviziunilor care generează gameţi femeli şi masculi, pot apărea trisomii care au drept consecinţe anomalii de dezvoltare şi retardare mentală. Punctele de control permit evitarea numeroaselor erori ca: i) replicarea parţială a ADN înainte de intrarea în mitoză; ii) defecte de asamblare a fusului mitotic care antrenează o distribuţie incorectă a cromozomilor; iii) anomalii la nivelul structurii ADN care ar putea genera mutanţi care scapă de controlul proliferării (carcinogeneza) (Figura 3.23).

Proiectul pentru Învăţământul Rural

Ciclul şi diviziunea celulară

Figura 3.23. Mecanismul de supraveghere a ciclului celular(prelucrat după Biology, N. A. Campbell, J. B. Reece, William Barstow, Ed, International Edition, Benjamin Cummings, 6th Edition, 2002)

Cadru 3.4. Puncte de control şi starea cromozomilor Kinazele CDK şi apariţia lor succesivă nu este suficientă pentru a explica mecanismele de reglare şi ordinea fazelor ciclului celular. Starea substratelor, proteice asociate cu cromatina, este responsabilă de duplicarea ADN sau de separarea cromozomilor. Iniţierea sintezei ADN sub controlul CDK în faza S nu are loc decât dacă se formează în prealabil un complex de pre-replicare (pre-RC) la originea duplicării cromatinei. Acest complex include diverse tipuri proteice: i) proteinele complexului ORC (Origin Recognition Complex); ii) o proteină instabilă, cdc6p; iii) un al doilea complex proteic compus din proteine din familia MCM (MiniChromosome Maintenance) Un cromozom bine pregătit va fi duplicat. În timpul fazei G1, se sintetizează cdc6p care se fixează la cromatină la nivelul complexului ORC, întotdeauna prezent. Proteinele MCM pot interacţiona acum cu cromatina în apropierea ORC-cdc6p. Acest ansamblu constituie pre-RC. În timpul tranziţiei G1/S, complexele ciclinaB-CDK (S-CDK) şi cdc7-Dbf4 (DDK) elimină proteinele cdc6p şi MCM. Aceasta declanşează sinteza ADN şi împiedică formarea unui nou pre-RC. La sfârşitul duplicării, cromatidele surori rămân asociate. Graţie inactivării CDK implicate în formarea fusului mitotic, în faza M, cromozomii se pot alinia şi forma placa metafazică. M-CDK activează complexul APC (Anaphase Promoting Complex) care favorizează disocierea cromatidelor surori şi facilitează migrarea către poli.

Proiectul pentru Învăţământul Rural

103

Ciclul şi diviziunea celulară

TA 3.27. Separarea cromatidelor în timpul mitozei este determinată de: a) semnale interne originare de la centromer; b) activarea de proteine care ţin laolaltă cromatidele surori; c) apariţia de cicline în apropierea kinetocorului; d) activarea unui complex de promovare-anafazic (APC anaphase-promoting complex); e) eliberarea unui factor de creştere derivat din aparatul Golgi TA 3.28. Proteinele care sunt implicate în reglarea ciclului celular şi care prezintă fluctuaţii ale concentraţiei în timpul ciclului celular sunt numite: a) ATP-aze; b) kinetocori; c) centrioli; d) pompe protonice; e) cicline TA 3.29. Într-o celulă este indusă o mutaţie al cărui rezultat este încetarea producerii unei protein kinaze normale în faza M. Care vor fi urmatoarele consecinţe imediate ale acestei mutaţii: a) celula va intra prematur in anafaza; b) celula nu va părăsi niciodată metafaza; c) celula nu va intra niciodata în metafază; d) celula nu va intra niciodată în profază; e) celula va suferi o mitoza normala, dar nu va mai intra în faza urmatoare G1.

3.3. Meioza

Reproducerea sexuată necesită fuziunea a doi gameţi proveniţi de la cei doi părinţi. Mecanismul fuziunii celor doi gameţi, şi deci a nucleelor lor, duce în timpul fecundării la o nouă celulă diploidă. Acest lucru este posibil doar dacă gameţii, contrar celulelor somatice cu 2n cromozomi, sunt haploizi şi conţin doar n cromozomi. În timpul elaborării gameţilor, gametogeneză, celulele stem germinale diploide suferă o diviziune reducţională, meioză, proprie celulelor reproducătoare. În timpul meiozei are loc doar o duplicare a ADN după care celula se angajează în două diviziuni succesive.

3.3.1. Originea gameţilor

Meioza este o formă de diviziune celulară care nu priveşte decât celulele sexuale. Se ştie că fiecare individ începe viaţa sub forma unei singure celule, oul (sau zigotul) care reprezintă rezultatul fuziunii a două celule (un ovul şi un spermatozoid). Celulele noastre posedă 46 de cromozomi, celulele părinţilor noştri la fel şi noi suntem rezultatul fuziunii unei celule provenite de la fiecare dintre ei. Deci, este clar că spermatozoidul şi ovulul nu posedă 46 de cromozomi. Indiferent dacă este vorba de o celulă animală sau vegetală, meioza prezintă o constanţă remarcabilă de la o specie la alta. De asemenea, comportamentul cromozomilor în timpul meiozei este acelaşi la cele două sexe. În acelaşi timp, fenomenele citoplasmatice variază de la un sex la altul. În continuare vom discuta elementele comune meiozei indiferent dacă este vorba de o celulă masculă sau femelă, vegetală sau animală.

104

Proiectul pentru Învăţământul Rural

Ciclul şi diviziunea celulară

Celulele sexuale sunt totipotente şi dotate cu individualitate deoarece ele sunt singurele care pot să se separe de organism şi să supravieţuiască liber. Ele formează un ţesut particular, germinal, prin opoziţie cu cel somatic care formează restul organismului. 3.3.2. Derularea meiozei

Meioza (de la grecescul meion = mai mic) nu are loc decât la nivelul celulelor reproducătoare (ovogonii şi spermatogonii) şi constă în două diviziuni celulare succesive: i) prima sau mitoza reducătoare constă într-o reducere a cromatinei de la 2n la n; ii) a doua este mitoza ecuaţională. Pentru fiecare dintre cele două diviziuni succesive ale meiozei distingem o: profază, metafază, anafază; telofază. În text şi în schemele prezentate vom folosi simbolul I pentru a desemna prima diviziune şi simbolul II pentru cea de a doua.

3.3.2.1. Diviziunea reducţională (sau mitoza heterotipică)

Profaza I: cromozomii se individualizează în filamente. Puţin mai târziu, cromozomii omologi se cuplează şi se îngroaşă. Cromozomii fiecărei perechi se plasează unul lângă altul, la nivelul centromerilor, ca şi cum ar dori să formeze un singur cromozom. Nucleolii şi membrana nucleară se estompează; cromozomii se fisurează longitudinal în două cromatide (formate în urma duplicării ADN în timpul interfazei). Cromatidele rămân ataşate între ele prin intermediul centromerilor. Fiecare pereche de cromozomi omologi devine în acest stadiu o tetradă formată din 4 cromatide. Cromatidele aceleiaşi tetrade se răsucesc una în jurul celeilalte ducând la tetrade din ce în ce mai îndesate (scurtate). După formarea tetradelor, atracţia dintre cromozomii omologi se diminuează şi ei au tendinţa de a se separa. În acel moment, la anumite nivele se observă încrucişări între cele 4 filamente (cromatide), punctele de încrucişare fiind numite „chiasme” Chiasmele sunt manifestările perceptibile ale schimburilor între cromatidele de origine maternă şi paternă. Aceste schimburi nu prezintă importanţă dacă stocul de gene (sau factori ereditari) este identic la cei doi părinţi (linii pure). Totuşi, acestea sunt extrem de importante în cazul încrucişărilor între varietăţi diferite. Deci, „crossing-over”-ul (sau încălecarea) permite apariţia de noi asortări ale genelor pe cromozomi. Către sfârşitul profazei I, intrarea în joc a unor forţe de torsiune provoacă ruperea chiasmelor care par să se deplaseze către extremitatea cromatidelor.

Proiectul pentru Învăţământul Rural

105

Ciclul şi diviziunea celulară

Metafaza I este marcată prin apariţia unui fus acromatic. Tetradele se regrupează la nivelul plăcii ecuatoriale astfel încât centromerii lor se situează de o parte şi de alta a planului ecuatorial. În fiecare tetradă, cele două centromere tind să se respingă, îndepărtând unul de altul cei doi cromozomi (constituit fiecare din două cromatide) Anafaza I: insistăm asupra faptului că în nici un moment centromerii nu se clivează astfel încât cei doi cromozomi ai fiecărei perechi se separă fără a se divide pentru a trece în una sau alta din cele două celule fiice, indiferent de originea paternă sau maternă. Fiecare din cele două celule fiice nu primeşte decât jumătate din numărul diploid de cromozomi 2n. În fiecare celulă, o pereche este reprezentată prin unul dintre cromozomii omologi, dar aceştia nu sunt asemănători calitativ cu cei ai celulei iniţiale din cauza schimburilor de material genetic care s-au produs între cromatide în timpul profazei I. Telofaza I: cele două loturi de n cromozomi fisuraţi ajunşi la cei doi poli ai celulei rămân individualizaţi fără a fi despiralizaţi. După o fază de aşteptare, mai scurtă sau mai lungă, celulele intră în cea de a doua diviziune (Figura 3.24).

Figura 3.24. Etapele meiozei (prelucrat după http://www.infobiogen.fr/deambulum/index.php)

3.3.2.2. Diviziunea ecuaţională

Această a doua diviziune meiotică nu prezintă nici un caracter particular. În timpul anafazei II, în urma diviziunii centromerilor, cele două cromatide surori se separă, se orientează în direcţia polilor şi se individualizează în cromozomi. Din fiecare din cele două celule se formează alte două celule, evident haploide. Profaza II: este foarte rapidă deoarece cromozomii nu au dispărut în cursul telofazei I. Fusul de diviziune se reformează.

106

Proiectul pentru Învăţământul Rural

Ciclul şi diviziunea celulară

Metafaza II: cromozomii (n) se dispun la nivelul plăcii ecuatoriale şi fiecare centromer începe să se dividă. Anafaza II: diviziunea centromerilor împarte în două cromatidele surori care se deplasează în direcţia polilor şi se individualizează în cromozomi. Telofaza II: cele două celule (cu n cromozomi) se divid prin constricţie centrală. Cromozomii se despiralizează şi membrana nucleară şi nucleolul se reformează (Figura 3.24). TA 3.30. Care este termenul care poate fi folosit pentru celula care conţine 22 perechi de autozomi şi doi cromozomi X? a) o celulă ou nefertilizată; b) o celulă spermatică; c) o celulă somatică masculă; d) o celulă somatică femelă; e) atât a, cât şi D sunt corecte. TA 3.31. Care dintre următoarele afirmaţii sunt false? a) la om, fiecare din cei 22 autozomi maternali au un cromozom paternal omolog; b) la om, a 23-a pereche, cromozomii sexului, determină dacă persoana este femelă (XX) sau mascul (XY); c) seturile haploide (n), unice de cromozomi din ovul şi spermă se unesc în timpul fertilizării, formând o singură celulă zigot diploidă (2n); d) la maturitate sexuală, ovarele si testiculele produc gameţi diploizi prin meioză; e) ciclurile de viaţă sexuală diferă în timpul meiozei în legătură cu fertilizarea TA 3.32. Fazele meiozei care produc cele mai multe variaţii determinate de crossing-over şi sortare independentă sunt: a) profaza I şi telofaza II; b) profaza II şi anafaza II; c) metafaza I şi telofaza II; d) anafaza I şi profaza II; e) profaza I şi anafaza I TA 3.33. Cromozomii recombinaţi sunt rezultatul: a) procesului de crossing-over; b) factori de mediu ca de exemplu radiaţiile şi substanţele chimice cancerigene; c) mutaţii; d) separarea de cromozomi omologi în metafaza I din meioză; e) împerecherea incorectă de nucleotide ADN TA 3.34. Care dintre următoarele evenimente au loc la sfârşitul meiozei I? a) cromozomii omologi sunt separaţi; b) numărul cromozomilor este conservat; c) cromatidele surori sunt separate; d) sunt formate patru celule fiice; e) celulele spermatice se prelungesc pentru a forma un cap si o prelungire (coadă) f) TA 3.35. Care dintre următoarele afirmaţii despre procesul meiozei este adevărată? a) rezultă două celule diploide; b) rezultă patru celule diploide; c) rezultă patru celule haploide; d) rezultă patru autozomi; e) rezultă patru chiasme;

Proiectul pentru Învăţământul Rural

107

Ciclul şi diviziunea celulară

3.3.2.3. Comparaţie Dacă în urma mitozei o celula somatică diploidă duce la mitoză - meioză obţinerea a două celule fiice diploide care conservă acelaşi patrimoniu genetic, meioza, care vizează doar celulele diploide germinale, dă naştere la patru celule al căror genom poate diferi major contribuind astfel la diversitatea mare a indivizilor aceleiaşi specii (Figura 3.25).

Figura 3.25. Comparaţie mitoză-meioză http://www.infobiogen.fr/deambulum/index.php)

(prelucrat

după

3.4. Îmbătrânirea Îmbătrânirea biologică este un proces fundamental care se observă la aproape toate fiinţele vii. Este caracterizat printr-o celulară

deteriorare progresivă a sistemelor biologice, conducând la creşterea mortalităţii, creştere corelată cu vârsta. Înţelegerea mecanismelor senescenţei prezintă un interes particular, pentru că are implicaţii largi atât pentru om ca individ cât şi pentru societate. Mai clar, înţelegerea mecanismelor care conduc la senescenţa umană va oferi strategii noi pentru lupta împotriva bolilor severe care sunt legate de îmbătrânire (diferite tipuri de cancer, maladia Alzheimer, boli cardiovasculare) şi se poate aştepta o creştere semnificativă a calităţii vieţii la vârste înaintate. Cu toate că importanţa cercetărilor este evidentă, este uimitor cât de puţin se cunoaşte despre bazele îmbătrânirii. În acest moment, nu este clar dacă este vorba de un singur mecanism conservat evolutiv, prin care toate sistemele biologice îmbătrânesc, sau dacă există câte un mecanism unic pentru specii diferite. În orice caz, pe lângă aspectele cunoscute, este clar că există o componentă genetică a senescenţei, şi este de asemenea clar că schimbările dependente de vârsta ale informaţiei genetice joacă un rol important.

108

Proiectul pentru Învăţământul Rural

Ciclul şi diviziunea celulară

Procesele care conduc la acumularea de alterări în structura ADN, acumulări care s-a observat că sunt corelate cu vârsta şi sunt dependente de doi factori majori: rata cu care se petrec aceste alterări şi capacitatea sistemelor biologice de a le repara. În plus, au fost identificate câteva tipuri clare de modificări. Unele alterări sunt nespecifice şi se petrec în mod aleator. Alte schimbări sunt rezultatul activităţii diferenţiale a anumitor secvenţe nucleotidice (gene care sunt activate odată cu înaintarea în vârstă, elemente genetice mobile). De asemenea, schimbările în structura ADN pot fi subtile, având loc la nivelul nucleotidelor, sau pot include regiuni mai mari ale informaţiei genetice.

3.4.1. Reorganizarea genomului nuclear aberaţii cromozomiale

Printre reorganizările mari ale genomului nuclear, care se ştie că se petrec în diferite sisteme biologice, s-a raportat o modificare a numărului cromozomilor legată de vârstă. Pe lângă aceste modificări s-au identificat şi anormalităţi structurale ale cromozomilor, care se accentuează odată cu înaintarea în vârsta. De exemplu, în celulele somatice de la pacienţi cu sindromul Werner (un model de îmbătrânire accelerată) s-a evidenţiat o incidenţă ridicată a translocaţiilor, deleţiilor şi inversiunilor. Aceste date sugerează că o creştere a ratei mutaţiilor somatice, joacă un rol important în acest sindrom. Pe lângă aceste schimbări cromozomiale generale, reorganizări ale regiunii ADNr, o regiune a genomului nuclear care constă din gene repetate ARN4r, a fost evidenţiată ca reprezentând o regiune în care se petrec schimbări în structura cromozomului legate de vârstă.

3.4.2. Scurtări ale telomerilor şi senescenţa replicativă

Celulele somatice ale vertebratelor au o capacitate limitată de proliferare. Acest fenomen, denumit senescenţa replicativă, este controlat de un mecanism molecular de numărare (ceas molecular) care s-a sugerat a fi legat de un tip specific de reorganizare a ADN care se petrece la capetele cromozomilor, numite telomeri. În timpul proliferării celulare, cromozomii sunt replicaţi de către ADN polimeraza convenţională, o enzima care este dependentă de un primer ARN pentru a iniţia replicarea. După îndepărtarea primerului, noua catenă ADN formată este scurtată la capătul 5’. Acest proces este repetat la fiecare ciclu celular şi este considerat a fi responsabil pentru reducere în timp a capacităţii de proliferare. Capacitatea de proliferare scade dacă celulele sunt prelevate de la indivizi mai bătrâni. Deci, există un stadiu de la care celula pierde natural capacitatea de a se divide şi îi creşte probabilitatea de a intra în faza G0.

Proiectul pentru Învăţământul Rural

109

Ciclul şi diviziunea celulară

Acesta este procesul de senescenţă celulară prin analogie cu îmbătrânirea întregului organism. Au fost emise numeroase ipoteze care încearcă să explice senescenţa celulară. Unele sugerează că acumularea mutaţiilor aleatorii defavorabile alterează posibilitatea reproducerii unui patrimoniu genetic corect. Prin limitarea numărului de diviziuni, celula va fi protejată de consecinţele transmiterii unui număr prea mare de erori. Comportamentul telomerilor în diviziune poate furniza o altă explicaţie a instalării senescenţei. Secvenţele repetitive de ADN de la extremitatea fiecărui cromozom (telomerii) sunt replicate de către telomerază o enzimă specifică pentru realizarea acestui proces. În timpul diviziunilor succesive se observă o scurtare a telomerilor datorată absenţei telomerazei din celulele somatice, în timp ce aceasta este prezentă în celulele germinale. Reducerea progresivă a numărului de motive repetitive ar putea fi cauza opririi progresive a diviziunilor. Numărul diviziunilor celulare este oarecum predefinit de numărul secvenţelor repetitive telomerice. 3.4.3. Aspecte energetice şi biochimice

Metabolismul celular, şi mai ales respiraţia mitocondrială sunt principala sursă de oxigen activ sub forma de radicali superoxid care vor forma radicali hidroxilaţi. În celulă există mecanisme de apărare faţă de formarea unor astfel de molecule. Ele includ enzime ca superoxid dismutaza, catalaza, glutation reductaza, dar şi molecule antioxidante (vitamina E, quinone, vitamina C, etc.). În procesul îmbătrânirii celulare şi în lipsa mecanismelor de apărare, radicalii hidroxilaţi se acumulează în celulă, interacţionează cu numeroşi constituenţi celulari şi sunt responsabili de leziuni oxidative, în principal la nivelul lipidelor membranare, proteinelor şi ADN. Îmbătrânirea este asociată cu disfuncţiile mitocondriale care apar în diferite ţesuturi şi care contribuie la degenerescenţa acestora şi la etiologia bolilor degenerative care apar odată cu înaintarea în vârstă. Mitocondriile sunt cei mai mari generatori de Specii Reactive de Oxigen (ROS) în celulă. Una din primele ţinte ale acestor radicali este mitocondria, unde ADN este alterat ireversibil. Majoritatea studiilor care asociază îmbătrânirea cu disfuncţiile mitocondriale sunt orientate către enzimele implicate în fosforilarea oxidativă şi asupra modificărilor pe care le suferă Alterarea lipidelor membranare duce la diminuarea capacităţii mitocondriei de a sintetiza ATP. Aceste modificări au drept consecinţă moartea celulară.

110

Proiectul pentru Învăţământul Rural

Ciclul şi diviziunea celulară

3.5. Moarte şi nemurire celulară

Activitatea vitala a celulei are la bază o multitudine de procese fizice şi chimice care au ca substrat, în cea mai mare parte, materie organica formată din compuşi de carbon şi procese care se desfăşoară în mediul intern al celulei (o soluţie apoasă concentrată de substanţe chimice). Întreruperea sau perturbarea proceselor respective poate duce uneori la dispariţia funcţiilor vitale, respectiv la moartea celulară. Se cunoaşte de mai mult timp faptul că moartea celulară atât a celulei ca organism unicelular cât şi ca element dintr-un organism pluricelular, poate surveni accidental prin acţiunea distructivă asupra celulei a numeroşi factori sau agenţi externi (fizici, chimici, biologici) . Moartea celulară are două origini distincte: necroza celulară, adesea datorată intervenţiei factorilor de mediu şi apoptoza şi/sau moarte celulară programată de origine genetică

3.5.1. Necroza

Necroza apare ca urmare a acţiunii brutale a unor stimuli externi sau interni cuprinzând neselectiv o serie de celule aflate sub acţiunea acestora. Necroza poate fi datorată acţiunii a numeroşi factori cum ar fi: atacul complementului, hipoxia peste anumite limite, toxine, infecţii virale litice, hipo- sau hipertermia, ca şi numeroşi alţi agenţi fizici sau chimici. Dacă necroza apare ca răspuns celular la acţiunea unor agenţi patogeni aceasta este urmată de regulă de un răspuns inflamator. Scăderea nivelului ATP reprezintă precursorul modificărilor morfologice care apar în cursul necrozei. Aici are loc o degradare a fosfolipidelor şi o rupere a proteinelor care formează citoscheletul, cu activarea fosfolipazelor şi a proteazelor care sunt activate prin creşterea calciului citosolic. Stimulii care declanşează necroza cresc permeabilitatea membranelor plasmatice atât prin alterarea structurii acestora (complement, liză virală) cât şi printr-o insuficienţă a pompelor membranare cationice (Figura 3.26).

3.5.2. Apoptoza şi moartea celulară programată

Dacă necroza vizează un grup de celule contigue, situate la nivelul situsului supus stresului, moartea celulară programată afectează celule izolate şi permite eliminarea silenţioasă prin fagocitoză a corpilor celulari indezirabili sau deveniţi inutili. Un astfel de proces intervine în timpul dezvoltării embrionare şi fetale unde contribuie la morfogeneza sau în eliminarea limfocitelor B şi T. În afara celor două funcţii, ea constituie un sistem eficace de apărare. Prin autodistrugere, celula infectată de un virus îl împiedică pe acesta să se replice şi să infecteze celulele vecine.

Proiectul pentru Învăţământul Rural

111

Ciclul şi diviziunea celulară

Este de aşteptat că dereglarea programului de moarte celulară să aibă consecinţe nefaste pentru organism. Procesul este reprimat în diferite forme de cancer, maladii autoimune, maladii virale şi este activat în cazul SIDA şi în anumite maladii neurodegenerative. Reglarea apoptozei este la fel de complexă ca şi cea a ciclului celular. Majoritatea semnalelor inhibitoare ale apoptozei stimulează proliferarea celulară. Conceptul de apoptoză înglobează două aspecte: i) primul se referă la faptul că celula îşi poate întrerupe funcţiile vitale, murind în absenţa unor factori externi; ii) al doilea se referă la faptul că pentru a-şi întrerupe funcţiile vitale celula dispune de mecanisme proprii (cu consum de energie) biologice şi biochimice, relativ specifice. Activarea mecanismelor prin care se realizează apoptoza duce la modificări celulare caracteristice, care se pot observa prin tehnici uzuale de microscopie optică, fluorescentă sau tehnici imunohistochimice. Aceste modificări morfologice sunt net diferite de cele din cursul morţii celulare datorate unor agenţi externi, respectiv ai necrozei şi cuprind: condensarea citoplasmei, fragmentarea ADN, depozitarea cromatinei în partea internă a membranei nucleare, formarea de vezicule care conţin părţi de nucleu şi organite celulare intacte şi, în final, formarea de corpi apoptotici care vor fi fagocitaţi (Figura 3.26). Cel mai tipic exemplu de apoptoza poate fi observat la organismele pluricelulare în cursul dezvoltării embrionare, unde datorită dezvoltării rapide o serie de celule trebuie distruse înainte ca ciclul lor de viaţă să se încheie, pentru a face loc altor celule şi a da organului respectiv forma şi volumul corespunzătoare. Existenţa unor mecanisme celulare proprii de autodistrugere celulară presupune existenţa unor gene care să declanşeze şi să coordoneze aceste procese. Astfel, se consideră că fiecare celulă posedă programe genetice pentru autodistrugere. Aşa a apărut termenul de moarte celulară programată similar celui de apoptoză . O caracteristică importantă a apoptozei este faptul că celulele moarte prin acest proces sunt eliminate rapid prin recunoaşterea şi ingestia lor de către celulele specializate în fagocitoză (sau chiar celule învecinate) fără să existe alterări ale celulelor vecine şi fără să existe reacţii inflamatorii. În acest mod sunt eliminate celulele nedorite dintr-un ţesut sau celulele care au suferit alterări structurale ireparabile. Astfel, apoptoza apare ca un mecanism de menţinere a dinamicii celulare într-un ţesut prin faptul că apoptoza este un proces antagonist mitozei.

112

Proiectul pentru Învăţământul Rural

Ciclul şi diviziunea celulară

Există practic o balanţa mitoză/apoptoză într-un ţesut sau organism pluricelular care în condiţii normale duce la o dezvoltare sau funcţionalitate normală a acestora. Astfel, creşterea tisulară ca şi numărul de celule dintr-un ţesut depind de raportul mitoză/apoptoză. Cercetări actuale au evidenţiat că ionii de calciu, ceramidele şi metabolismul oxidativ au rol cheie în declanşarea apoptozei. Pe lângă diversitatea de semnale, există şi un anumit număr de gene, înalt conservate evolutiv , care reglează apoptoza. Gena bcl-2 (B Cell Lymphoma-2) asigură supravieţuirea celulei. Proteina Bcl-2 formează cu proteina Bax (Bcl-2 associated x protein) un heterodimer. Controlul apoptozei depinde de raportul concentraţiilor celor două. Proteina Bcl-2 previne modificările datorate radicalilor liberi. Un exces de Bcl-2 protejează contra apoptozei, în timp ce un exces de Bax favorizează procesul. Celula poate răspunde la semnalele morţii celulare după un model de tip „reostat” în funcţie de capacitatea de a asambla heterodimeri Bcl2/Bax antiapoptotici sau homodimeri Bax/Bax favorabili apoptozei.

Figura 3.26. Comparaţie apoptoză - necroză

Proiectul pentru Învăţământul Rural

113

Ciclul şi diviziunea celulară

3.5.3. Imortalitatea celulară - cancer

Multiplicarea celulelor este reglată cu grijă ca răspuns la nevoile specifice ale corpului. La animalele tinere, multiplicarea celulară este mai crescută decât moartea celulară, astfel încât animalele tinere cresc în mărime. La adulţi procesul de formare şi de moarte celulară este echilibrat pentru a produce o stare staţionară (de echilibru). Ocazional, controalele perfecte care reglează multiplicarea celulară sunt dereglate. Celula în care apare această dereglare începe să crească şi se divide într-un mod neregulat, fără a ţine seamă de necesităţile viitoare a le corpului pentru acest tip celular. Dacă o astfel de celulă prezintă descendenţi care moştenesc capacitatea de proliferare celulară fără a răspunde procesului de reglare, rezultatul este o clonă de celule capabile să se multiplice la infinit. În final, aceste celule nedorite pot forma o masă celulară numită tumoră. Unele tumori sunt benigne şi nu au consecinţe foarte grave asupra sănătăţii organismului decât dacă sunt foarte mari. Altele, în schimb, tind să se disperseze în organism şi pot cauza boli de tipul cancerului. Toate tipurile de cancer sunt provocate de anomalii la nivelul secvenţelor genelor. Cancerul este cauzat de mutaţii, dar există două diferenţe cheie între cancer şi celelalte boli genetice. În primul rând, cancerul este, în principal, determinat de mutaţii la nivelul celulelor somatice, în timp ce alte boli genetice sunt determinate de mutaţii la nivelul celulelor germinale. Cu toate acestea, unii indivizi moştenesc diferite mutaţii genetice care îi predispun la dezvoltarea anumitor tipuri de cancer. În al doilea rând, un anumit cancer nu este rezultatul unei singure mutaţii ci mai degrabă al acumulării câtorva modificări (de la trei la 20 de mutaţii), în funcţie de tipul de cancer. Acestea trebuie să afecteze mai ales genele care în mod normal sunt implicate în reglarea multiplicării celulare. Au fost identificate peste 30 gene supresoare tumorale şi mai mult de 100 oncogene dominante

În general, celulele puse în contact cu un virus, cu agenţi 3.5.3.1. Imortalitatea chimici care complexează ADN sau chiar iradiate cu raze UV, sunt celulară transformate. Celulele astfel tratate şi apoi injectate la animale, sunt capabile să formeze tumori. Procesul se numeşte transformare malignă. Celulele transformate diferă de linia parentală. De exemplu, alterările pot proveni de la integrarea unor gene virale în genomul celular. Alte modificări cum sunt pierderea controlului creşterii, modificări morfologice, interacţii celulă-celulă, modificarea expresiei genice, etc., pot fi corelate sau rămân independente.

114

Proiectul pentru Învăţământul Rural

Ciclul şi diviziunea celulară

3.5.3.2. Proprietăţile Capacitatea de diviziune nedefinită (nemurire) poate fi rezultatul numeroaselor modificări ale exigenţelor celulare: celulei tumorale i) o diminuare a necesarului de factori de creştere. În anumite cazuri celulele devin apte să producă proprii lor factori de creştere şi receptorii corespunzători. Această situaţie duce la instalarea unei autostimulări (stimulare autocrină) favorabilă proliferării; ii) pierderea capacităţii de oprire a creşterii şi intrarea în quiescenţă; iii) pierderea necesitaţii de ancorare; iv) schimbări morfologice: celula are tendinţa să se rotunjească şi să diminueze interacţiile sau aderenţa cu celulele înconjurătoare; v) pierderea inhibiţiei de contact: în mod normal, dacă celulele în diviziune intră în contact unele cu altele se opresc din migrare pentru a evita astfel suprapunerea. În ţesuturile normale, celulele stabilesc între ele joncţiuni gap şi încetează mişcarea. Celulele tumorale pierd aceasta inhibiţie a mişcării datorată contactului şi se întrepătrund unele cu altele stabilind foarte puţine contacte între ele Ultimele trei caracteristici fac ca celulele să fie mai mobile, independente şi capabile să colonizeze alte ţesuturi pentru a forma metastaze. Toate aceste modificări comportamentale ale celulei vizează fie activităţile citoplasmatice, fie activităţile de la suprafaţa celulei. Totuşi, punctul de plecare în carcinogeneza (formarea tumorilor) rezulta din modificările proteinelor codificate de genomul nuclear. Diferenţele dintre celulele normale şi tumorale provin din defecte ale transcripţiei anumitor gene şi/sau o stabilitate crescută a transcripţilor lor. Concentraţia anumitor molecule de ARNm creşte, în timp ce a altora scade. Totuşi, numai 3% din mesagerii prezenţi în celula canceroasă sunt specifici acestei celule. 3.5.3.3. Mutaţiile şi imortalizarea celulelor

Adesea, expresia uneia sau a două gene mutante poate fi suficientă pentru transformarea unei celule. Se numeşte oncogenă o genă al cărei produs proteic este capabil să transforme o celulă în cultură sau să inducă proliferare malignă (cancer) la un individ. Majoritatea oncogenelor cunoscute provin din gene celulare normale, numite proto-oncogene datorită capacităţii lor de a genera oncogene. Acestea au rolul de a asigura funcţii importante în celula normală. Dacă sunt modificate ca urmare a prin inducerii unor mutaţii discrete pot fi responsabile de instalarea nemuririi celulare. Oncogenele sunt implicate în reglarea ciclului celular, şi de aceea produşii lor modificaţi determină celula sa scape de controlul ciclului.

Proiectul pentru Învăţământul Rural

115

Ciclul şi diviziunea celulară

Anomaliile cromozomiale sunt şi ele responsabile de oncogeneză. Astfel, celula umana normală conţine 23 de perechi de cromozomi, uşor de recunoscut graţie structurii lor specifice. Celulele canceroase sunt adesea aneuploide, adică au un număr anormal de cromozomi, inferior sau superior de 2n. Adesea, se pot observa translocări cromozomiale datorate fuziunii elementelor aparţinând la doi cromozomi diferiţi. Este cazul cromozomului Philadelphia care corespunde fuziunii cromozomului 9 majoritar cu o mica regiune din cromozomul 22, şi reciproc fuziunea cromozomului 22 aproape în totalitate cu un fragment scurt din cromozomul 9. Pacienţii cu un astfel de cariotip suferă de o formă de leucemie acută.

3.5.3.4. Virusurile ca agenţi transformanţi

116

În funcţie de genom (ADN sau ARN) se cunosc două tipuri de virusuri. Dacă genomul viral se integrează în genomul celulei gazdă infectată şi se transmite într-un mod stabil celulelor fiice, discutăm de un proces de transformare celulară. Celula devine canceroasa dacă modificările genetice datorate integrării ADN viral duc la achiziţionarea capacităţii de proliferare nedefinită (imortalizare). Mecanismul integrării este diferit în cazul virusurilor ADN şi ARN Virusurile ADN responsabile de tumori conţin oncogene care sunt agenţi transformanţi ai celulelor, prin intermediul produşilor lor, oncoproteinele. Acestea sunt indispensabile multiplicării virusului şi trebuie să fie sintetizate de celula gazdă. Sintetizând enzimele necesare replicării ADN viral, celula stimulează replicarea propriului ADN şi în consecinţă diviziunea sa. Dacă infectează o celula normal quiescentă, virusul o determină să se dividă şi poate determina producerea unei tumori. Virusurile ARN conţin oncogene derivate din genele celulare care au fost capturate şi apoi încorporate în genomul gazdei printrun proces stabil numit transducţie genetică. Aceste gene celulare se numesc proto-oncogene şi prin capturare dau naştere genelor virale. Didactic, pentru a face distincţie între forma celulară şi virală a acestor gene, se utilizează prefixele „c” şi „v” urmate de numele genei. Astfel, o genă responsabilă pentru formarea unei tumori la pui, se numeşte c-src la animal şi v-src la virusul responsabil de inducerea tumorii. Gena v-src care se integrează aleatoriu în genomul gazdei, în anumite celule se poate integra în gena c-src. Perturbarea expresiei acesteia poate conferi celulei infectate un avantaj proliferativ care o poate determina să se multiplice mai rapid şi să formeze tumori.

Proiectul pentru Învăţământul Rural

Ciclul şi diviziunea celulară

TA 3.36. Cercetările în domeniul cancerului au arătat că celulele canceroase: a) transforma celulele normale prin alterarea genelor implicate în controlul mitozei; b) întotdeauna se dezvoltă într-o tumoră; c) conţin mai mult decât numărul normal de cromozomi; d) sunt incapabile sa finalizeze ciclul celular, după faza S; e) intră şi ies din faza G0 de trei ori înainte de a se divide.

TA 3.37. Care dintre următoarele afirmaţii este adevărată în ceea ce priveşte celulele canceroase? a) nu manifestă o inhibiţie dependentă de densitate când cresc în cultură; b) când încetează să se mai dividă, procesul se produce în etape întâmplătoare ale ciclului celular; c) au scăpat de sub controlul ciclului celular; d) b şi c sunt adevărate; e) a, b şi c sunt adevărate

TA 3.38. Vinblastina este un medicament chimioterapeutic standard utilizat pentru a trata cancerul. Din moment ce interferă cu asamblarea microtubulilor, eficacitatea sa trebuie sa fie corelată cu: a) distrugerea formării fusului mitotic de diviziune; b) inhibarea fosforilării proteinei de reglare; c) suprimarea producerii de ciclina; d) denaturarea miozinei si inhibarea formării clivării; e) inhibarea sintezei ADN

TA 3.38. Una dintre diferenţele dintre o celulă canceroasă şi una normală este evidenţiat prin faptul că: a) celula canceroasă este incapabilă să sintetizeze ADN; b) ciclul celular al celulei canceroase este întrerupt în faza S; c) celulele canceroase continuă să se dividă chiar daca au ajuns la confluenţă; d) celulele canceroase nu pot funcţiona corespunzător deoarece ele suferă de inhibiţie dependentă de densitate; e) celulele canceroase sunt întotdeauna în faza M a ciclului celular.

Proiectul pentru Învăţământul Rural

117

Ciclul şi diviziunea celulară

3.6. Răspunsuri şi comentarii la testele de autoevaluare R TA 3.1. Ciclul celular reprezintă totalitatea modificărilor pe care le suferă celulele în decursul vieţii şi care este responsabil de multiplicarea celulară. Fazele sunt: o fază preparatoare, interfază, care este şi o fază de repaus care reprezintă 90% din ciclul celular, invizibilă în microscopie optică şi a cărei durată variază între 10 şi 24 de ore la mamifere; faza de diviziune, formată din patru subunităţi funcţionale şi vizibile la microscopul optic: profaza, metafaza, anafaza şi telofaza, cu o durată de aproximativ o oră. În timpul acestui fenomen, nucleul şi citoplasma vor fi divizate, R TA 3.2. Exista 3 nivele de condensare care conduc la formarea de cromozomi vizibili la microscopul fotonic. R TA 3.3. e; R TA 3.4. a; R TA 3.5. d; R TA 3.6: d; R TA 3.7: Cele două moduri principale de reproducere – asexuată şi sexuată – necesită diviziunea celulară. Orice catenă ADN a unui organism provine, prin mitoză sau meioză, din catenele ADN parentale. R TA 3.8. O celula în faza G2 nu a fost activată pentru a iniţia sinteza ADN pentru ca şi-a duplicat deja ADN şi nu va reîncepe imediat. O unitate de replicare nu poate trece decât printr-un ciclu de replicare în timpul aceluiaşi ciclu celular. R TA 3.9. e; R TA 3.10: a; R TA 3.11: Modificările de fluorescenţă pot fi urmărite observând o celula vie la microscop, în timp ce, pentru localizarea radioactivităţii, celula trebuie omorâtă. Radioactivitatea este mai bună pentru măsurări cantitative, ca viteza de sinteză a tubulinei sau incorporarea sa în microtubuli într-un timp scurt. R TA 3.12. vezi cadru 3. 3 pagina 93; R TA 3.13: e R TA 3.14. Citoscheletul reprezintă o reţea complexă de filamente şi tubuli care se întinde în toată citoplasma. Este o structura foarte dinamica care se reorganizează continuu în timpul diferitelor evenimente celulare (migrare, diviziune, etc.). Citoscheletul este constituit din trei tipuri principale de structuri proteice: filamentele de actină (microfilamente), filamentele intermediare, microtubulii . R TA 3.15. Funcţiile microtubulilor: i) deplasarea organitelor pe microtubuli (RE, aparat Golgi, membrana citoplasmatică, vezicule de secreţie); ii) deplasarea cromozomilor (kinetocori); iii) mişcarea cililor şi flagelilor; Funcţiile filamentelor de actină: i) rol în stabilitate celulară - formează structuri dinamice mai mult sau mai puţin stabile prin asociere cu alte proteine (microvili şi celulele musculare); ii) rol în mişcare şi în iniţierea mişcării; iii) formarea inelului contractil de la sfârşitul mitozei care asigură separarea celulelor fiice (citokineză). R TA 3.16. Se va realiza un eseu de maxim 300 de cuvinte care va fi prezentat tutorelui R TA 3.17. Kinezina asigură transportul către extremitatea plus a microtubulului, transport anterograd (de la corpul celular către ramificaţiile terminale). Dineina asigură transportul către extremitatea minus, transport retrograd. În fiecare dublet un microtubul este asociat cu dineina. Dineina interacţionează cu dubletul adiacent pentru a determina o mişcare de alunecare a unui dublet pe altul. Dineina ciliară are un domeniu motor care hidrolizează ATP pentru a se deplasa pe microtubul către extremitatea minus. R TA 3.17. prin trei modalităţi: a) adăugare constantă de noi subunităţi de tubulină la nivelul extremităţii plus prin care sunt ataşaţi de kinetocori; b) disocierea lentă a unui număr de subunităţi de tubulină de la extremitatea minus a polilor fusului; subunităţile de tubulină migrează permanent de-a lungul microtubulilor kinetocorieni. c) toţi microtubulii ataşaţi la fiecare kinetocor îşi modifică lungimea în mod coordonat în urma oscilaţiilor cromozomiale. 118

Proiectul pentru Învăţământul Rural

Ciclul şi diviziunea celulară

R TA 3.18. Fusul mitotic este constituit din trei clase de microtubuli: a) Microtubuli polari care interacţionează între ei la centrul fusului şi asigură apoi îndepărtarea polilor la fiecare extremitate a fusului; b) Microtubuli kinetocorieni, purtători ai cromozomilor; c) Microtubuli interpolari sau astrali situaţi la exteriorul fusului şi a căror răspândire din centrozom menţine organizarea intracelulară în mitoză şi orientează forţele necesare separării polilor. R TA 3.20. a; R TA 3.21: b; R TA 3.22: a; R TA 3.23: e; R TA 3.24: c; R TA 3.25: e; R TA 3.26: b; R TA 3.27: d; R TA 3.28: e; R TA 3.29: e; R TA 3.30: d; R TA 3.31: d; R TA 3.32: e; R TA 3.33: a; R TA 3.34: a; R TA 3.35: c; R TA 3.36: a; R TA 3.37: e; R TA 3.38: a; R TA 3.38: c;

Proiectul pentru Învăţământul Rural

119

Ciclul şi diviziunea celulară

3.7. Lucrare de verificare 3 V. 3.1. Precizaţi câteva funcţii generale ale citoscheletului. V. 3.2. Comparaţi structura unui microtubul complet asamblat, unui filament de actina şi a unui filament intermediar. V. 3.3. Enumeraţi diferitele tipuri de proteine care se leagă la actina şi precizaţi funcţia fiecăreia. V. 3.4. Definiţi mitoza Următoarele întrebări se refera la următorii termeni. Fiecare termen poate fi folosit o data, de mai multe ori sau deloc. a) telofaza; b) anafaza; c) prometafaza; d) metafaza; e) profaza V. 3.5. Doi centrozomi sunt aranjaţi la polii opuşi ai celulei V. 3.6.Centriolii încep sa se deplaseze de o parte într-o celulă animală V. 3.7. Este una dintre cele mai lungi etape ale mitozei V. 3.8. Centromerii necuplaţi, cromatidele surori separate şi cei doi noi cromozomi se deplasează la polii opuşi ai celulei V. 3.9. Definiţi metafaza V. 3.10. În momentul definitivării metafazei din mitoză, o celula cu 92 de cromatide va produce doi nuclei care conţin un număr de cromozomi? a) 12; b) 16; c) 23; d) 46; e) 92 V. 3.11. Faza S poate fi delimitată prin: a) contorizarea numărului de celule; b) determinarea cantităţii de ADN la începutul şi sfârşitul acesteia; c) sinteza versus distrugerea proteinei S; d) sinteza cromozomului S; e) stoparea G1 V. 3.12. Unde se poziţionează microtubulii fusului de diviziune în timpul mitozei, atât în celulele plantelor cât şi în celulele animale? a) centromer; b) centrozom; c) centriol; d) cromatida; e) kinetocor V. 3.13. În timpul mitozei au loc următoarele evenimente, cu excepţia: a) condensarea cromozomilor; b) necuplarea cromatidelor la centromer; c) formarea fusului de diviziune; d) sinteza ADN; e) dispariţia nucleolului V. 3.14. Dacă într-o celulă sunt 20 de centromeri, câţi cromozomi există acolo: a) 10; b) 20; c) 30; d) 40; e) 80 V. 3.15. Dacă analizăm comparativ celulele fiice la sfârşitul mitozei şi citocinezei cu celula parentală în momentul în care se află în faza G1 a ciclului celular constatăm că: a) celulele fiice au jumătate din cantitatea de citoplasma şi jumătate din cantitatea de ADN; b) celulele fiice au jumătate din numărul de cromozomi şi jumătate din cantitatea de ADN; c) celulele fiice au acelaşi număr de cromozomi şi jumătate din cantitatea de ADN; d) celulele fiice au acelaşi număr de cromozomi şi aceiaşi cantitate de ADN; e) celulele fiice au acelaşi număr de cromozomi şi de două ori mai mult ADN V. 3.16. Care dintre următoarele afirmaţii despre cromozomul bacterian nu este adevărată? a) este constituit dintr-o singură moleculă de ADN circular; b) replicarea ADN începe la originea replicării; c) centromerii săi sunt necuplaţi în timpul replicării; d) este foarte împachetat în interiorul celulei; e) are gene care controlează fuziunea binară.

120

Proiectul pentru Învăţământul Rural

Ciclul şi diviziunea celulară

V. 3.17.Modificarea ritmică a concentraţiei ciclinei în ciclul celular este determinată de: a) o creştere a sintezei, odată ce punctul de restricţie este depăşit; b) cascada de creştere a sintezei odată ce proteina sa este fosforilată de Cdk; c) rata modificată a citoplasmei din genom; d) distrugerea sa de către o enzima fosforilată; e) legarea PDGF la receptori pe suprafaţa celulară V 3.18. Identificaţi denumirea enzimelor care controlează activităţile altor proteine prin fosforilarea acestora? a) ATP-aze; b) kinaze; c) cicline; d) cromatina; e)protein fosfataze V. 3.19. Sunteţi de acord să admitem că centrozomul are rol important pentru a determina viteza de alungire sau scurtare a microtubulilor într-o celula animală? De ce? V. 3.20. O grupare de celule este testată pentru conţinutul său în ADN imediat după mitoză şi se determină o medie de 8 picograme de ADN per nucleu. La sfârşitul fazei S, toate celulele vor avea …….picograme şi la sfârşitul fazei G2……..picograme. a) 8…8; b) 8…16; c) 16…8; d) 16…16; e)12…16. V. 3.20. Absenţa ………….. va avea drept rezultat formarea unei singure celule cu doi nuclei: a) interfazei; b) profazei; c) anafazei; d) prometafazei; e) citocinezei V 3.21. O celula sanguina roşie (eritrocit) are timpul de înjumătăţire de 120 de zile. Dacă un adult de vârsta medie are 5 L (5.000 cm3) de sânge şi fiecare milimetru cubic conţine 5 milioane eritrocite, câte noi celule pot fi produse la fiecare secundă pentru a înlocui întreaga populaţie de eritrocite? a) 30.000; b) 2.400; c) 2.400.000; d) 18.000; e) 30.000.000 V. 3.22. În timpul cărei faze a meiozei are loc crossing-over-ul? a) profaza I; b) anafaza I; c) telofaza I; d) profaza II; e) metafaza II În continuare vor fi utilizate următoarele afirmaţii cheie pentru a răspunde următoarelor întrebări. Fiecare răspuns poate fi folosit o dată, de mai multe ori sau deloc. a) Afirmaţia este valabila numai pentru mitoză; b) Afirmaţia este valabila numai pentru meioza I; c) Afirmaţia este valabila numai pentru meioza II; d) Afirmaţia este valabila pentru mitoza şi meioza I; e) Afirmaţia este valabila pentru mitoza şi meioza II. V.3.23. Aceasta are loc când o celula se divide pentru a forma doi nuclei care genetic sunt identici V. 3. 24. Au loc procese de crossing-over şi sinapse cromozomiale omologe V. 3.25. Centromerii sunt necuplaţi şi cromatidele sunt separate unele de altele. V. 3.26. Are loc sortarea independenta a cromozomilor. V. 3.27. Evenimentele care au loc în timpul acestui proces cauzează majoritatea recombinărilor genetice V. 3.28. Procesul (este) sau procesele sunt precedate de replicarea ADN V. 3.29. Care dintre următoarele procese au loc numai în meioza dacă comparăm profaza I din meioză cu profaza din mitoză?

Proiectul pentru Învăţământul Rural

121

Ciclul şi diviziunea celulară

a) condensarea cromozomilor; b) formarea tetradelor; c) dezasamblarea învelişului nuclear; d) formarea unui fus de diviziune; e) fiecare cromozom este alcătuit din două cromatide. V. 3.30. Meioza II este similară mitozei prin faptul că: a) are loc formarea de sinapse la nivelul cromozomilor omologi; b) ADN se replică înainte de diviziune; c) celulele fiice sunt diploide; d) cromatidele surori se separă în timpul anafazei; e) numărul cromozomilor este redus.

122

Proiectul pentru Învăţământul Rural

Ciclul şi diviziunea celulară

3.8. Bibliografie 1. Biologie cellulaire, Jean Michel Petit, Abderrahman Maftah, Raymond Julien, Masson,, Paris 1997, Chapitre 3: Cycle et division de la cellule 2. Cell Biology, Thomas D. Pollard, William C. Earnshaw, Elsevier, 2004 3. http://www.geniebio.ac-aix-marseille.fr/- Ressources Multimédia en Biochimie Génie Biologique; Biotechnologies 4. http://www.bio.umontreal.ca/cours/Bio-1154/evolution.htm, Biologie cellulaire I 5. http://www.boskitos.com/fac/biocel/ Biologie Cellulaire PCEM1 6. http://www.web-books.com/MoBio/Free/Contents.htm, Molecular Biology Web Book Contents 7. http://www.snv.jussieu.fr/bmedia/sommaires/bc.htm, Biologie Cellulaire 8. http://schwann.free.fr/biocell03.html, Cours de Biologie Cellulaire 9. Biologie moléculaire, Abderrahman Maftah, Raymond Julien, Masson, Paris 1996 10. Biologie Moléculaire et Cellulaire, Exercices et corriges, Nathan Université, 1994 11. Biochimie, génétique, Biologie moléculaire, J Etienne, 3eme édition, Masson, 1996 12: Biologie cellulaire, Thomas D. Pollard, William C. Earnshaw, edition francaise, Elsevier, 2004, Chapitres 43-48: Cycle cellulaire 13, The Cell a Molecular Approach, Geoffrey M. Cooper, Robert E. Hausman, third edition, ASM Press, 2004, Chapter 14: The cell cycle 14. Biologie Cellulaire et Moléculaire, concepts et expériences, Gerald Karp, De Boeck Université, 1998, Chapitre 14 : La reproduction cellulaire 15. Essential Cell Biology, An introduction to the Molecular Biology of the Cell, International Student edition, B. Alberts, D. Bray, A. Johnson, J. Lewis, M. Raff, K. Roberts, P. Walter, Garland Publishing Inc, 2004, Chapter 17: Cell division 16. Biology, N. A. Campbell, J. B. Reece, William Barstow, Editor, International Edition, Benjamin Cummings, sixth Edition, 2002, Chapter 12 and 13: The cell cycle; Meiosis and sexual Life cycles 17. Test Bank For Biology, N. A. Campbell, J. B. Reece, William Barstow, Editor, , Benjamin Cummings, sixth Edition, 2002, Chapter 12 and 13: The cell cycle; Meiosis and sexual Life cycles 18. Molecular Biology of the Cell, A problems approach, J. Wilson, T. Hunt, Garland Science, 4th edition, 2002 19. http://www.snv.jussieu.fr/bmedia/lafont/sommaires/bc.htm, Méthodes physiques de séparation et d’analyse et méthodes de dosage des biomolécules 20. www.ustboniface.mb.ca, Bienvenue à la page d'accueil pour le cours Biologie 21. Molecular Cell Biology, Lodish, Berck, Zypousky, Matsudaira, Baltimore, Darnell, 4th edition, 2000, Freeman and Company, Chapter 22: Cell Birth, Lineage and Death 22. www.med.univ-angers.fr, Licence de Biologie Cellulaire. 23. web-books.com, Molecular Biology Web Book Contents 24. http://www.cu.lu/labext/rcms/cppe/cellfr.html, CPPE Module S2: Biologie cellulaire 25. http://www.cbc.umn.edu/~mwd/courses.html, Course/Tutorial on Cell Biology 26. http://web.mit.edu/esgbio/www/7001main.html, Hypertextbook Cell Biology 27. http://www.univ-ag.fr/, Cours de Biologie cellulaire 28. www.emc.maricopa.edu/faculty/farabee/BIOBK/BioBookCHEM1.html, On-Line Biology Book: 29. http://www.infobiogen.fr/deambulum/index.php, DEAMBULUM - Cours en biologie : Biologie cellulaire, Cycle cellulaire

Proiectul pentru Învăţământul Rural

123

Organizarea şi funcţionarea celulei

Unitatea de învăţare 4: ORGANIZAREA ŞI FUNCŢIONAREA CELULEI pag Cuprins Introducere Obiective Unitatea 4 Informaţii generale despre evaluare

4. 1. Structura membranelor 4.1.1. Arhitectura membranară 4.1.1.1. Dublul strat lipidic 4.1.1.2. Proteinele membranare 4.1.1.3. Glucidele

4. 2. Schimburile cu mediul înconjurător 4.2.1. Transporturi membranare 4.2.1.1. Transportul pasiv 4.2.1.2. Transportul activ 4.2.1.3. Menţinerea concentraţiilor ionice 4.2.1.4. Transportul nutrienţilor 4.2.1.5. Transportul cu ajutorul veziculelor

4.3. Comunicarea intercelulară 4.4. Traficul intracelular al proteinelor 4.4.1. Rolul reticulului endoplasmatic 4.4.2. Sinteza proteinelor de către ribozomii de la suprafaţa RER 4.4.3. Glicozilarea proteinelor în RE 4.4.4. Biogeneza membranelor în RER 4.4.5. Rolul aparatului Golgi 4.4.6. Trierea proteinelor

4.5 Mitocondrii şi cloroplaste (conversia energiei) 4.5.1. Mitocondrii 4.5.1.1. Organizarea mitocondriei 4.5.1.2. Genomul mitocondrial 4.5.1.3. Biogeneza mitocondriilor 4.5.1.4. Funcţiile mitocondriei 4.5.1.5. Producerea de ATP 4.5.2. Cloroplaste

4.6. Nucleul şi funcţiile sale 4.6.1. Învelişul nuclear 4.6.1.1. Structura şi funcţia complexului porilor nucleari 4.6.1.2. Traficul nucleu-citoplasma 4.6.2. Nucleul este un organit organizat 4.6.2.1. Cromozomii 4.6.3. Împachetarea genomului eucariot 4.6.3.1. Nucleozomii - primul nivel de organizare al cromozomului 4.6.3.2. Nivelurile structurale superioare ale cromatinei 4.6.4. Eucromatina şi heterocromatina

4.7. Răspunsuri şi comentarii la testele de autoevaluare unitatea 4 4.8. Lucrare de verificare 4 4.9. Bibliografie 124

124 125 126 127 128 128 128 132 134 135 135 137 138 139 141 142 145 147 148 149 150 150 151 153 155 155 156 157 158 159 159 163 166 167 169 169 171 171 176 179 182 185 187 191 193

Proiectul pentru Învăţământ Rural

Organizarea şi funcţionarea celulei

Introducere ™ Celula este o unitate vie cu viaţă proprie, care are propria homeostazie (biochimie), dar în acelaşi timp trebuie să răspundă la necesităţile organismului, adică să fie receptivă la mediu. ™ Celula are un diametru de 5-100 μm şi conţine aproximativ un miliard de molecule proteice, constituind aprox. 60% din masa uscată. Se crede că există aproximativ 10 000 de tipuri diferite de proteine într-o celulă. Pentru o bună funcţionare, celulele au individualizat procesele biochimice din citoplasmă, o parte din acestea dezvoltându-se în organitele celulare. ™ Organitele au propria lor anatomie funcţională şi procese biochimice. După funcţia lor principală, organitele intervin în procese de sinteză sau degradare metabolică. Această distincţie arbitrară arată dinamismul metabolismului celular. Constituenţii sunt supuşi unei reînnoiri permanente care permite celulei să răspundă mai bine solicitărilor fiziologice: Pentru sinteza: • Nucleul, localizarea şi replicarea informaţiei genetice (ADN), sinteza ARNm, ARNt şi ARNr (ultimul fiind sintetizat într-o structura nucleară distinctă, nucleolul) • Mitocondria, metabolismul oxigenului şi sinteza ATP (sursă de energie) şi NAD(P)H (potenţial reducător); • Reticulul endoplasmatic, sinteza (glico)proteinelor (RE rugos) şi lipidelor (RE neted); • Aparatul Golgi, maturarea (glico)proteinelor şi formarea veziculelor de secreţie. Pentru degradare: • • •

Endozomul, reciclarea membranelor şi proteinelor de suprafaţă; Lizozomii, degradarea proteinelor, lipidelor şi polizaharidelor; Peroxizomii, detoxifierea moleculelor potenţial periculoase.

Pentru structură: • Citoscheletul, forma celulei, contracţie, mişcare, diviziune celulară. În general, toate celulele au aceleaşi organite, dar în funcţie de rolul lor în organism (specializare), sunt mai mult sau mai puţin dezvoltate.

Proiectul pentru Învăţământ Rural

125

Organizarea şi funcţionarea celulei

Obiective Unitatea 4 Obiective generale ¾ Clarificarea conceptelor de structură şi funcţionare celulară; ¾ Explicarea proceselor de comunicare intra- şi intercelulară; ¾ Identificarea proceselor şi structurilor responsabile asigurarea energeticii celulare şi transferului de informaţie genetică

de

Obiective specifice: La terminarea studiului acestei unităţi trebuie să fiţi capabili să: ƒ

Identificaţi:

i) elementele structurale ale membranelor; ii) modalităţile de comunicare intercelulară; iii) organitele implicate în traficul intracelular al proteinelor; iv) organitele implicate în conversia de energie; v) modalităţile de transmitere a informaţiei genetice. ƒ

Cunoaşteţi:

i) arhitectura membranară şi diferitele modalităţi de transport bidirecţional al metaboliţilor prin membrane; ii) tipurile de schimburi care se realizează între celulă şi mediu; iii) structura şi organizarea organitelor implicate în biosinteza elementelor celulare structurale şi funcţionale; iv) structura şi organizarea mitocondriilor şi cloroplastelor; v) organizarea şi funcţionarea nucleului; vi) compactarea materialului genetic şi nivelurile de organizarea ale acestuia.

126

Proiectul pentru Învăţământ Rural

Organizarea şi funcţionarea celulei

Evaluarea pe parcurs - Testele de autoevaluare (TA) ¾ Unitatea conţine în structura sa 70 de teste de autoevaluare distribuite astfel încât să asigure o bună fixare a noţiunilor prezentate. ¾ Fiecare test de evaluare se bazează pe parcurgerea şi înţelegerea materialului teoretic prezentat. ¾ Unele dintre testele de autoevaluare sunt întrebări urmate de trei sau patru sau cinci răspunsuri posibile, fiecare indicat cu o literă în dreptul lui. Pentru a răspunde la aceste întrebări, trebuie să încercuiţi litera din dreptul răspunsului pe care îl consideraţi ca fiind corect. ¾ Alte teste vă cer să scrieţi răspunsuri scurte sau să încercuiţi răspunsul corespunzător spaţiilor libere; ¾ Există şi teste de autoevaluare care vor necesita rezolvarea unei probleme sau scrierea unor scurte eseuri prin care să vă exprimaţi părerea asupra anumitor aspecte. ¾ Răspunsurile la testele de autoevaluare sunt prezentate la sfârşitul unităţii, înainte de lucrarea de verificare 4. Dacă nu reuşiţi să rezolvaţi cu succes testele de autoevaluare în momentul întâlnirii lor pe parcursul parcurgerii testului vă recomandăm să reluaţi întregul material şi apoi să reveniţi asupra rezolvării testelor. Unele dintre testele de autoevaluare sunt foarte simple şi direct corelate cu textul parcurs, răspunsul lor fiind evident. Alte teste necesită o bună integrare a cunoştinţelor obţinute şi necesită parcurgerea întregii unităţi. Enunţurile testelor au şi ele rolul lor în fixarea cunoştinţelor şi în formarea unei viziuni de ansamblu asupra materiei. Lucrări de verificare notate de tutore. Gradul de înţelegere a conceptelor şi noţiunilor prezentate în această unitate de învăţare va fi cuantificat pe baza notei obţinute la Lucrarea de verificare Nr.4 care conţine 25 de probleme. Evaluarea răspunsurilor dumneavoastră la lucrarea de verificare 4 va fi realizată de tutore la termenul stabilit de comun acord cu administraţia universităţilor care organizează formarea. Răspunsurile problemelor vor fi transmise direct universităţilor organizatoare. Evaluarea pe parcurs are o pondere de 50% din nota finală. Lucrarea de verificare 4 va reprezenta 10% din verificarea pe parcurs. Cele 25 de întrebări sunt echivalente şi vor fi notate cu 4 puncte fiecare, astfel încât pentru o lucrare corectă să puteţi acumula 100 de puncte. Testele din lucrarea finală sunt de acelaşi tip cu testele de autoevaluarea pe care le veţi rezolva pe parcursul parcurgerii materialului unităţii 4. Materialul conţine 37 de figuri care prezintă informaţii menite să întregească şi să clarifice noţiunile prezentate. Un rezultat bun la lucrarea de verificare este clar condiţionat de parcurgerea cu responsabilitate a testelor de autoevaluare şi de înţelegerea figurilor. Proiectul pentru Învăţământ Rural

127

Organizarea şi funcţionarea celulei

4. 1. Structura membranelor

4.1.1. Arhitectura membranară

Membranele înconjoară celula şi organitele. Ele asigură mai multe funcţii: i) separare; ii) schimb molecular între compartimente; iii) recunoaşterea compuşilor biologici şi a altor celule. Multitudinea acestor funcţii ne face să înţelegem variabilitatea compoziţiei membranelor. Constituite în esenţă dintr-un bistrat fosfolipidic, membranele biologice conţin o mare diversitate de proteine care le conferă specificitate. Raportul „proteine/lipide” este corelat cu activitatea membranelor. De exemplu el este 3,2 pentru membrana mitocondrială internă care este sediul fosforilării oxidative şi 1,1 pentru membrana externă a aceluiaşi organit. În structura membranei, lipidele şi proteinele membranare constituie un „mozaic fluid” în care diferitele componente moleculare se deplasează şi sunt permanent reînnoite.

Lipidele reprezintă aproximativ 50% din masa membranară. 4.1.1.1. Dublul strat Trei tipuri principale de lipide intră în compoziţia unei membrane: lipidic fosfolipidele, cele mai abundente, colesterolul şi glicolipidele. Toate aceste molecule sunt amfifile fiind caracterizate de prezenţa unui domeniu hidrofil şi a unuia hidrofob. Caracterul amfifil le conferă proprietatea de agregare pentru a forma spontan fie micele, fie vezicule lamelare în dublu strat. În membranele biologice, lipidele sunt organizate în strat dublu şi prin aranjarea lor dau fluiditate membranei. Fluiditatea depinde de mai mulţi parametri şi este diminuată de: i) scăderea temperaturii; ii) prezenţa lipidelor care conţin acizi graşi cu catena scurtă; iii) absenţa legăturilor duble în catenele acizilor graşi; iv) cantitate mare de colesterol. Lipidele formează un strat dublu (5-6 nm grosime) relativ impermeabil la trecerea celor mai multe molecule hidrosolubile (proteine, hormoni, ioni) (Figura 4.1). Membrana este o bariera eficace, dar poate fi străbătută uşor de moleculele hidrofobe ca alcooli, steroizi şi anestezice generale. Moleculele mici de tipul glucozei sau adrenalinei au nevoie de un timp considerabil pentru a trece. Proprietăţile unui dublu strat lipidic artificial fără proteine sunt prezentate în figura 4.1. Structura de dublu strat se datorează proprietăţilor amfifile ale moleculelor lipidice. Acestea posedă o extremitate hidrofilă (polară) şi una hidrofobă (apolară) (Figura 4.2).

128

Proiectul pentru Învăţământ Rural

Organizarea şi funcţionarea celulei

Figura 4.1. Proprietăţile unui dublu strat lipidic artificial fără proteine

(prelucrat după

http://www.infobiogen.fr/deambulum/index.php)

Există o mare variabilitate a lipidelor membranare. Cele mai abundente sunt fosfolipidele compuse dintr-un cap polar care conţine o grupare fosfat şi două braţe hidrocarbonate formate din acizi graşi. Într-un mediu apos, capetele polare se orientează către exterior şi braţele apolare către interiorul membranei. Dublul strat lipidic este fluid datorită dublei mobilităţi: laterală şi de rotaţie, a lipidelor (Figura 4.2).

Figura 4.2. Structura unui lipid amfifil (fosfolipid) (prelucrat după http://www.infobiogen.fr/deambulum/index.php)

Proiectul pentru Învăţământ Rural

129

Organizarea şi funcţionarea celulei

Schimbul de lipide între cele două straturi este redus (mişcări verticale sau flip-flop), ceea ce permite o distribuţie asimetrică a diferitelor lipide şi astfel conferă funcţii diferite straturilor membranare orientate către exterior sau către citosol. De exemplu, în membrana hematiilor umane toate lipidele care conţin colină, fosfatidilcolină, sfingomielină şi glicolipidele se găsesc la exterior, în timp ce, pentru cea mai mare parte, fosfatidiletanolamina şi fosfatidilserina sunt prezente în interior. Întrun mediu apos, lipidele membranare pot adopta alte două configuraţii: miceliu sau asocierea cu o proteină. Asimetria unei membrane are semnificaţie fiziologică deoarece bulversarea ei are mai multe consecinţe ca, de exemplu, recunoaşterea eritrocitului de către macrofag şi eliminarea sa din circulaţia sangvină. Lipidele sunt sintetizate în RE neted şi aici este stabilită şi asimetria straturilor. Asimetria lipidică este importantă pe plan funcţional, mai ales în localizarea proteinelor asociate membranei şi care intervin în transmiterea semnalelor. Anumite molecule lipidice, numite glicolipide sunt glicozilate (Figura 4.3). Resturile glucidice de tipul galactozei, glucozei şi mai ales acidul sialic sunt adăugate în aparatul Golgi. Glicolipidele sunt mereu asociate cu stratul extern şi aparţin glicocalixului. Glicocalixul este zona periferică celulară bogată în glucide. Deoarece resturile glucidice legate cu proteinele sunt adesea implicate în interacţiile celulei cu mediul, este posibil ca glicolipidele să aibă un rol analog. TA 4.1. Care este compoziţia chimică şi structura membranei plasmatice? TA 4.2. Următoarele molecule sunt parte a membranei celulare cu excepţia: a) lipidelor; b) acizilor nucleici; c) proteinelor; d) grupărilor fosfat; e) steroizilor. TA 4.3. Prezenţa colesterolului în membrana plasmatică a unor animale: a) permite membranei să stea fluidă mai uşor când temperatura celulei scade; b) permite animalelor să îndepărteze atomii de hidrogen din fosfolipidele saturate; c) permite animalelor să adauge atomi de hidrogen la fosfolipidele nesaturate; d) face membrana mai puţin flexibilă, astfel încât poate susţine o presiune mai mare în cadrul celulei; e) face ca animalele să fie mult mai susceptibile la boli ale sistemului circulator.

130

Proiectul pentru Învăţământ Rural

Organizarea şi funcţionarea celulei

Figura 4.3. Structura glicolipidelor (prelucrat după http://www.infobiogen.fr/deambulum/index.php)

Colesterolul este un lipid structural distinct. Are rol particular în membrană, făcând-o mai puţin deformabilă (mai rigidă) şi diminuează permeabilitatea moleculelor mici hidrosolubile

Figura 4.4. Structura colesterolului (prelucrat după http://www.infobiogen.fr/deambulum/ind ex.php)

TA 4.4. Una dintre functiile colesterolului în membranele celulelor animale este de a: a) facilita transportul de ioni; b) stoca energia; c) menţine fluiditatea membranară; d) difuza accelarat; e) fosforila ADP

Proiectul pentru Învăţământ Rural

131

Organizarea şi funcţionarea celulei

4.1.1.2. Proteinele Cu toate că structura de baza a membranei plasmatice este membranare determinată de dublul strat lipidic, majoritatea funcţiilor specifice le au proteinele. În consecinţa, între diferitele tipuri celulare, cantitatea şi tipurile de proteine din membrana plasmatică sunt extrem de variabile. Există diferenţe structurale şi funcţionale şi între membrana plasmatică şi membranele intracelulare ale organitelor. Proteinele membranare se împart în două clase: i) proteine intrinseci sau integrale (70% din proteinele membranare) care se afundă în dublul strat lipidic. Au caracter amfifil şi posedă una sau mai multe regiuni care interacţionează cu lanţurile hidrocarbonate ale lipidelor membranare. Regiunile lor hidrofobe sunt compuse din aminoacizi cu catene laterale apolare. Aceste regiuni traversează membrana sub forma de α-helix sau βsheet; ii) proteine extrinseci sau periferice, nu sunt ancorate în partea hidrofobă a membranei, dar sunt menţinute prin legături necovalente pe una din feţele membranei (Figura 4.5).

Figura 4.5. Structura membranei plasmatice cu evidenţierea diferitelor tipuri de proteine (prelucrat după http://www.infobiogen.fr/deambulum/index.php)

TA 4.5. În acord cu modelul membranar care dintre următoarele componente ale membranei unei celule animale va prezenta o expunere directă pe suprafaţa extracelulară: a) fosfolipide; b) proteine periferice; c) glucide membranare; d) a şi c; e) a, b şi c

132

Proiectul pentru Învăţământ Rural

Organizarea şi funcţionarea celulei

Difuzia proteinelor şi lipidelor este limitată la domenii particulare ale membranei. De exemplu, în celulele epiteliale ale intestinului şi tubulilor renali, anumite tipuri de proteine membranare sunt prezente doar la polul apical al celulei, în timp ce alte proteine sunt localizate doar la nivelul suprafeţelor laterală şi bazală. În aceste regiuni membranare, compoziţia lipidică diferă mai ales la nivelul stratului extern. Segregarea constituenţilor membranari şi menţinerea se realizează graţie barierelor formate de joncţiunile intercelulare înguste. Totuşi, celulele au mijloace pentru a limita difuzia proteinelor în domeniile specifice ale membranei, generând astfel o polaritate celulară funcţională. Există trei mijloace de a restrânge mobilitatea proteinelor specifice membranei plasmatice: i) legarea proteinelor membranare la citoschelet sau alte proteine intracelulare; ii) legarea proteinelor membranare la complexe proteice extracelulare (celule adiacente sau matrice); iii) asamblarea proteinelor membranare în complexe macromoleculare de exemplu, subunităţi ale receptorilor) Fenomenul de polarizare funcţională este bine ilustrat de celulele epiteliale în care s-a identificat un pol apical, un pol bazal şi două feţe laterale. Anumite proteine sunt strict localizate pe partea apicală (transportorii Na/glucoza), altele se găsesc lateral (ocludinele joncţiunilor înguste) şi altele la polul bazal (integrine, Figura 4.6).

Figura 4.6. Polarizarea funcţională a proteinelor în celulele epitelială .

(prelucrat

după http://www.cbc.umn.edu/~mwd/courses.html)

TA 4.6. Ce tipuri de molecule trec cel mai uşor printr-o membrană celulară: a) mari şi hidrofobe; b) mici şi hidrofobe; c) molecule polare mari; d) molecule ionice; e) monozaharide, de tipul glucozei

Proiectul pentru Învăţământ Rural

133

Organizarea şi funcţionarea celulei

Funcţiile principalelor proteine membranare sunt : i) schimb selectiv de materie (transportori membranari, canale ionice şi proteine implicate în exocitoză şi endocitoză); ii) aderenţa la matricea extracelulară şi la celulele adiacente (integrine şi caderine); iii) conexiune cu citoscheletul (vinculina asociată cu integrinele şi membrana plasmatică; iv) recepţia semnalelor extracelulare (receptori ai factorului de creştere EGF – Epithelial Growth Factor); v) transducerea semnalului prin molecule efectoare (proteina G); vi) suport pentru activitatea enzimatică. TA 4.7. În acord cu modelul de mozaic fluid al membranelor celulare, care dintre următoarele afirmaţii despre fosfolipidele membranare este adevarată? a) se pot mişca lateral de-a lungul suprafeţei membranei; b) pot executa mişcarea de flip-flop dintr-o parte în alta a membranei. c) există într-un bistrat neîntrerupt, cu proteinele membranare restricţionate la suprafaţa membranei; d) sunt libere să se deplaseze din membrană şi să se dizolve în soluţiile din împrejurimi; d) au prelungiri hidrofilice în interiorul membranei

4.1.1.3. Glucidele

Glucidele sunt prezente pe faţa externă a membranei plasmatice, legate covalent, sub formă de catene oligozaharidice, la proteinele membranare (glicoproteine) şi lipide (glicolipide). Monozaharidele constituente (galactoza, N-acetilglucozamina, fucoza, acid sialic) sunt legate între ele prin diferite legături ozidice în α sau β, ceea ce creşte diversitatea şi specificitatea oligozaharidelor. Glicoproteinele şi glicolipidele se găsesc întotdeauna în jumătatea externă a dublului strat lipidic şi aparţin glicocalixului. Aceasta zonă pericelulară bogată în glucide are rol în procesul de recunoaştere celulară şi protejează celula de agresiunea mecanică (flux sangvin), chimică (aciditatea gastrică) şi enzimatică (proteaze).

TA 4.8. Care dintre urmatoarele substanţe ar putea să se deplaseze mult mai rapid în cadrul bistratului lipidic al unei membrane plasmatice? a) CO2; b) un aminoacid; c) glucoza; d) K+; e) amidon.

134

Proiectul pentru Învăţământ Rural

Organizarea şi funcţionarea celulei

Caracterul hidrofob al dublului strat lipidic permite celulei să 4.2. Schimburile menţină concentraţiile diferiţilor soluţi de o parte şi de alta a cu mediul extern

membranei, adică între citoplasma şi mediul extracelular în fiecare compartiment celular (mitocondrie, lizozom, RE, etc.). Separarea compartimentelor definite de membrană nu trebuie să fie totală şi schimburile moleculare sunt necesare vieţii celulare. Astfel, celulele au dezvoltat sisteme de transport ionic şi al macromoleculelor cu ajutorul proteinelor membranare: transportori, pompe sau canale. Celulele au nevoie de aceste proteine membranare de transport pentru: i) aport de metaboliţi; ii) eliminarea deşeurilor metabolice; iii) menţinerea concentraţiilor ionice.

4.2.1. Transporturi membranare

Pasajul moleculelor prin membrană implică lipidele şi proteinele. Cu ajutorul lipozomilor (vezicule lipidice artificiale), s-a demonstrat că orice moleculă poate difuza printr-o membrană şi că mărimea şi coeficientul de partiţie (solubilitatea în lipide/solubilitatea în apă) condiţionează viteza de difuzie. O substanţă va traversa mai uşor o membrană cu cât diferenţa de concentraţie de o parte şi de alta va fi importantă (gradient de concentraţie). În general, molecula se deplasează din compartimentul cu concentraţie mai mare către cel cu concentraţie mai mică. Pentru moleculele insolubile în lipide, transportul se realizează graţie proteinelor transmembranare, proteinelor purtătoare sau permeazelor specifice unei molecule sau familii de molecule cu structură apropiată. Transportul poate fi de tip uniport, implică doar un solut, vehiculat de pe o parte pe alta a membranei. Poate exista şi un cotransport de tip simport (transportul a doi soluţi în acelaşi sens) sau de tip antiport (transportul a doi soluţi în sens opus). Dacă solutul nu este încărcat, transportul său depinde doar de gradientul de concentraţie. Dacă solutul are o sarcina netă, transportul său depinde de gradientul de concentraţie şi de diferenţa de potenţial electric al membranei. Aceste două componente constituie gradientul electrochimic contra căruia trebuie să se deplaseze solutul. Celulele dispun de proteine, capabile să realizeze un astfel de transport, numit activ, prin consum de energie furnizată de ATP.

TA 4.9. Care dintre urmatoarele afirmaţii descrie o caracteristică a unei proteine carrier dintr-o membrană plasmatică? a) este o proteină membranară periferică; b) expune o specificitate pentru un tip particular de molecula; c) necesită energie pentru a funcţiona; d) lucrează împotriva difuziei; e) are aminoacizi hidrofobi puţini sau deloc.

Proiectul pentru Învăţământ Rural

135

Organizarea şi funcţionarea celulei

Traversarea membranei prin difuzie simplă Nu intervin proteine membranare. Este limitată la gaze (N2, O2, CO2, NO), molecule lipofile (hormoni steroizi şi tiroidieni, uree, etanol, etc.) şi în anumite limite apă (Figura 4.7). Transport membranar cu proteine de transport Difuzia printr-un transportor creşte viteza şi selectivitatea transportului în raport cu difuzia simplă. Transportorul pentru glucoza (permează GLUT1) ilustrează bine cele două aspecte. Dacă se compară difuzia pasivă cu cea facilitată, se observă o diferenţă clară de eficacitate a transportului membranar.

Figura 4.7. Comparaţie între difuzia pasivă şi transportul facilitat

(prelucrat după

http://www.cbc.umn.edu/~mwd/courses.html)

Difuzia printr-un transportor permite transportul soluţilor împotriva gradientului chimic (concentraţie) şi electric (diferenţa de potenţial membranar). Transportul realizat contra gradientului electric sau chimic consumă energie şi este un transport activ. Permite menţinerea concentraţiilor diferiţilor soluţi de o parte şi de alta a membranei (Figura 4.7). TA 4.10. Dintre activităţile de mai jos una singură nu necesită energie ATP:

a) deplasarea O2 în celulă; b) sinteza proteică; c) deplasarea ionilor Na+ în afara celulei; d) flux citoplasmatic; e) exocitoza.

136

Proiectul pentru Învăţământ Rural

Organizarea şi funcţionarea celulei

4.2.1.1. Transportul pasiv

Există trei clase principale de proteine membranare de transport: i) canale, pori care permit mişcarea pasivă a ionilor (canale ionice) sau molecule mici (apa, glucide, aminoacizi, nucleotide) cu o capacitate de 107-108 molecule/s. ii) pompe, cu o capacitate de transport activ de aproximativ 2 3 10 -10 ioni/s. Sunt proteine care hidrolizează ATP, deci ATP-aze. Procesul este un transport «activ primar». iii) transportori care asigură o trecere pasivă (uniport) sau activă (simport şi antiport) cu o capacitate de transport de 102-104 molecule/s. Transportul activ necesită apariţia prealabilă a unui gradient ionic (controlat de către o pompă) şi se mai numeşte transport activ secundar. Se realizează graţie canalelor proteice, care lasă să treacă liber solutul prin difuzie simplă, sau permeazelor care fixează un solut şi îl transportă prin membrană. Acest ultim proces, numit difuzie facilitată, necesită schimbări conformaţionale ale transportorului. În timp ce difuzia este condiţionată doar de diferenţa de concentraţie a unui solut de o parte şi de alta a membranei, transportul facilitat depinde, în plus, de numărul de transportori, şi deci de gradul lor de saturaţie (Figura 4.8).

Figura 4.8. Transportul facilitat al glucidelor în funcţie de concentraţie

(prelucrat

după http://www.cbc.umn.edu/~mwd/courses.html)

TA 4.11. Care dintre urmatoarele afirmatii despre difuzie este corectă? a) este foarte rapidă la distanţe mari; b) necesită un consum energetic pentru celulă; c) este un proces pasiv în care moleculele se deplasează dintr-o regiune de concentraţie mare într-o regiune de concentraţie mică; d) este un proces activ în care moleculele se deplasează dintr-o regiune de concentratie mică într-o regiune de concentraţie mare; e) necesită proteine integrale în membrana celulară.

Proiectul pentru Învăţământ Rural

137

Organizarea şi funcţionarea celulei

4.2.1.2. Transportul activ

Transportorii acţionează ca pompe pentru a antrena soluţii contra gradientului lor electrochimic. Energia necesară transportului activ poate fi furnizată: i) direct de la ATP, cum este cazul pompei de Na+-K+ în cazul transportului activ primar; ii) graţie energiei rezultate din gradientul ionic stabilit de transportul activ primar ca în cazul schimbului glucoza - Na. Există mai multe ATP-aze care cuplează utilizarea ATP cu transportul activ al diverşilor ioni. În principal, ele sunt localizate în membrana plasmatică, membrana internă mitocondrială şi membrana lizozomală. Transportorii şi pompele Transportorii şi pompele sunt adesea formaţi din mai multe subunităţi proteice dintre care unele traversează membrana de mai multe ori. Pasajul necesită o schimbare majoră a configuraţiei proteinelor. Dacă se realizează trecerea unei singur tip de moleculă transportul este de tip uniport (Figura 4.9) În general, transportul activ funcţionează cu ajutorul unui gradient ionic. În sistemele cotransport, transferul unui solut depinde de transferul simultan al unui solut secundar. În funcţie de direcţia de deplasarea a celor doi soluţi se disting următoarele tipuri de transport: i) simport când cei doi soluţi merg în aceeaşi direcţie; ii) antiport, dacă direcţiile de deplasare a soluţilor sunt opuse (Figura 4.9).

Figura 4.9. Tipuri de sisteme transport (prelucrat după http://www.cbc.umn.edu/~mwd/courses.html)

138

Proiectul pentru Învăţământ Rural

Organizarea şi funcţionarea celulei

4.2.1.3. Menţinerea concentraţiilor ionice

Na+/K+ ATP-aze sau pompe Na+/K+ Concentraţia de K+ este de 10 - 20 de ori mai mare în interiorul celulelor decât la exterior, în timp ce pentru Na+ este invers. Aceste diferenţe sunt determinate şi menţinute de o ATPaza din membrana plasmatică care se comportă ca o pompă care expulzează activ 3 ioni Na+ către exterior şi importă 2 ioni K+ în interior (Figura 4.10). Na+/K+ ATP-aza este electrogenică şi implicată în producerea unui potenţial electric membranar deoarece diminuează concentraţia intracelulară de ioni pozitivi. Transportul de Na+ şi K+ este strâns cuplat cu hidroliza ATP pentru transferul celor doi ioni contra gradientului lor electrochimic (transport activ primar) (Figura 4.10). Gradientul de Na+/K+ generat de o parte şi de alta a membranei este esenţial pentru funcţionarea celulei şi este implicat în diverse funcţii: i) reglarea pH; ii) reglarea volumului celular; iii) transportul nutrienţilor de tip glucoză şi aminoacizii; iv) transmiterea semnalelor în sistemul nervos (potenţial de acţiune)

Figura 4.10. Pompa de Na+/K+ (prelucrat după http://www.cbc.umn.edu/~mwd/courses.html)

Proiectul pentru Învăţământ Rural

139

Organizarea şi funcţionarea celulei

Cadru 4.1. Diferenţa de potenţial membranar Diferenţa de potenţial transmembranar al unei celule animale este aproximativ – 70 mV, faţa citoplasmatică fiind încărcată negativ în raport cu cea externă. Potenţialul de membrana este rezultatul mişcărilor ionice transmembranare. Mişcările sunt consecinţa unei distribuţii inegale de o parte şi de alta a membranei a ionilor şi macromoleculelor încărcate (glucide, complexe, nucleotide şi proteine) (Figura 4.11). Ca2+ ATP-aza sau pompa Ca2+ Celulele animale menţin concentraţii intracelulare foarte mici de Ca2+. Ionii de calciu sunt implicaţi în căile de semnalizare ale contracţiei musculare, exocitoză şi activarea diverselor tipuri celulare ca răspuns la un stimul exterior. Ca2+ ATP-azele sunt situate în membrana plasmatică, dar şi în membrana RE (reticul sarcoplasmic pentru celulele musculare unde Ca2+ ATP-azele reprezintă 90% din proteinele membranare). În interiorul RE, concentraţia Ca2+ liber este tamponată de calcireticulina, o proteina care fixează 20 de ioni Ca2+ pe fiecare moleculă. În ce priveşte structura/funcţia, această ATP-ază seamănă mult cu Na+/K+ ATPaza, cu specificaţia că este selectivă la calciu. Pompele sunt definite ca proteine de transport care utilizează hidroliza ATP ca sursă de energie. Este posibil ca transportorii să transfere solutul suferind o modificare a conformaţiei reversibilă care expune alternativ situsul de legare al solutului pe o faţa a membranei şi apoi pe cealaltă (Figura 4.10).

Figura 4.11. Comparaţie transport pasiv şi transport activ (prelucrat după http://www.cbc.umn.edu/~mwd/courses.html)

140

Proiectul pentru Învăţământ Rural

Organizarea şi funcţionarea celulei

4.2.1.4. Transportul nutrienţilor

Transportul glucozei Celula poate transporta glucoza în două moduri: i) un transport activ efectuat prin simportul Na+- glucoză. Acest transportor este abundent în epiteliul tubului digestiv şi tubulii renali şi utilizează puternicul gradient transmembranar al Na+ pentru a permite intrarea specifică a glucozei în celulă în raport de o moleculă de glucoza pentru un ion Na+; ii) un transport pasiv uniport efectuat de permeazele pentru glucide (GLUT-1 la GLUT-5). GLUT-2 poate transporta fructoza şi galactoza, nu doar glucoza, iar GLUT-5 transportă specific fructoza. Aceste două tipuri de transportori ai glucozei se asociază în funcţia fiziologică de transport a glucozei prin epiteliul tubului digestiv: glucoza intestinală este transportată activ în interiorul enterocitelor de către transportorii Na+-glucoza (simport) localizaţi în regiunea apicală a membranei. Creşterea concentraţiei intracelulare de glucoză determină ieşirea ei la polul bazal graţie unei permeaze specifică pentru glucoza (GLUT-1). Localizarea selectivă a celor două tipuri de transportori, la cei doi poli membranari ai enterocitelor, este esenţială transportului orientat şi constituie un excelent exemplu de polaritate structurală şi funcţională a celulei.

TA 4.12. Cum ilustrează Na+-K+ ATP-aza faptul că membrana plasmatică are două feţe? TA 4.13. Care este rolul gradientului de Na+/K+ generat de o parte şi de alta a membranei de către acţiunea Na+-K+ ATP-azei? TA 4.14. Dacă ar trebui să injectaţi într-un axon gigant de calmar o soluţie 0,1M de NaCl şi 0,1M de KCl, ionii Na+ şi K+ fiind marcaţi radioactiv, care dintre aceşti ioni marcaţi v-aţi aştepta să apară cel mai rapid în apa din mediu, dacă axonul ar fi în repaus? Dar când neuronul este stimulat să producă un anumit număr de potenţiale de acţiune? TA 4.15. Dacă, canalele de Na+ s-ar putea redeschide imediat după închiderea lor în timpul unui potenţial de acţiune, care ar fi consecinţa pentru conducerea unui influx? TA 4.16. Glucoza difuzează încet prin bistraturile fosfolipidice artificiale. , Totuşi, celulele care căptuşesc intestinul subţire deplasează rapid cantităţi mari de glucoză din alimentele bogate în glucoză în citoplasma lor deficitară în glucoză. Utilizând această informaţie, indicaţi care mecanism de transport este mult mai probabil să funcţioneze în celulele intestinale? a) difuzia simplă; b) fagocitoza; c) pompe de transport activ; d) exocitoza; e) difuzia facilitată TA 4.17. Transportul de potasiu într-o celula animală sau în afara ei, necesită: a) concentraţii celulare mici de sodiu; b) concentraţii celulare mari de potasiu; c) o sursa de energie (ATP) sau un gradient de protoni; d) glucoza pentru legarea sau eliberarea ionilor; e) hormoni ai plantelor inseraţi în membrana celulară.

Proiectul pentru Învăţământ Rural

141

Organizarea şi funcţionarea celulei

Transportorii aminoacizilor În enterocite, trecerea aminoacizilor prin membrana plasmatică utilizează un simport funcţionând pe baza unui gradient de sodiu. Este exemplul transportorului Na+/L-leucina. Transportorii ABC Aceşti transportori constituie o mare familie de ATP-aze (cam 500 de membri) cu localizare ubiquitară şi transportă aminoacizi, glucide, polizaharide, acizi graşi, peptide şi ioni. Transportul este susţinut de hidroliza ATP. TA 4.18. Pompa de sodiu-potasiu este numită pompă electrogenică, deoarece: a) pompează cantităţi egale de Na+ şi K+ prin membrană; b) pompează ioni de hidrogen în celulă; c) contribuie la potenţialul membranar; d) ionizează sodiu şi potasiu; e) pompează ioni de hidrogen în celulă. TA 4.19. Co-transportul proteic care permite ca două substanţe diferite să traverseze o membrana în aceeaşi direcţie este: a) de obicei un uniport; b) de obicei un biport; c) de obicei asociat cu o pompă de protoni; d) insensibil la temperatură; e) de obicei asociat cu un antiport. TA 4.20. Care dintre urmatoarele procese le includ pe toate celelalte? a) osmoza; b) difuzia unui solut printr-o membrană; c) difuzia facilitată; d) transport pasiv; e) transportul unui ion în funcţie de gradientul său electrochimic.

Transportorii transmembranari nu pot vehicula 4.2.1.5. Transportul macromolecule de tipul proteinelor, sau particule ca bacteriile sau cu ajutorul resturile celulare. Mecanismele folosite de celula implică formarea veziculelor de vezicule. Transportul către citoplasma se numeşte endocitoză, în timp ce transportul de la citoplasmă către mediul extracelular se numeşte exocitoză. În interiorul celulei, un flux de vezicule permite transportul macromoleculelor între diferite compartimente. Pornind de la fiecare organit, mecanisme specifice permit împachetarea selectivă, în vezicule, a proteinelor şi lipidelor destinate altui compartiment. O ipoteză adevărată ar fi că vezicula de transport posedă la suprafaţa sa două categorii de proteine: i) una capabilă să recunoască moleculele transportate de veziculă; ii) cealaltă pentru recunoaşterea organitului ţintă. Formarea veziculei este asigurată prin asamblarea clatrinei. Procesul se numeşte endocitoză dependentă de clatrină şi presupune organizarea acestei proteine sub forma unei reţele poliedrice.

142

Proiectul pentru Învăţământ Rural

Organizarea şi funcţionarea celulei

Endocitoza Desemnează formarea veziculelor prin includerea membranei plasmatice care înconjoară o particulă sau lichid extracelular. Se disting trei forme de endocitoză care diferă prin mărimea veziculelor şi specificitatea pentru moleculele transportate (Figura 4.12). Pinocitoza, cu vezicule care nu depăşesc 150 nm în diametru, înglobează lichid extracelular şi eventual molecule mici. Fagocitoza corespunde mecanismelor de ingestie a microorganismelor şi resturilor celulare, graţie veziculelor de mărime mare, peste 250 nm, fagozomii. La vertebrate, ea se limitează la celule specializate cum sunt granulocitele şi macrofagele. Endocitoza mediată de receptori este un proces specific. Intervin proteine membranare care recunosc şi fixează liganzii determinaţi specific. Legăturile ligand-receptor induc o regrupare localizată a complexului şi formarea unei invaginări a membranei tapetată pe faţa sa citoplasmatică cu proteine fibroase care formează o manta în jurul veziculei. Cele mai bine caracterizate dintre proteinele mantalei sunt clatrina şi adaptina. După interacţiile dintre receptori şi adaptine, clatrinele se fixează progresiv la adaptine. Rearanjamentele între clatrina şi adaptine duc la deformarea membranei şi la formarea ulterioară a unei vezicule acoperită de o manta de clatrină. Vezicula pierde rapid proteinele din manta şi migrează către destinaţia sa. Un astfel de mecanism de endocitoză este cunoscut pentru internalizarea colesterolului sub forma lipoproteinelor de densitate mică, LDL, şi pentru transferul fierului fixat de transferină. Pentru că endocitoza este un proces permanent şi induce dispariţia receptorilor de la suprafaţa membranei, o reciclare a receptorilor este realizată de vezicule neîncărcate permiţând compensarea pierderii de componente de pe suprafaţa membranară provocată de endocitoză. Exocitoza Veziculele de transport conduc către membrana plasmatică a celulelor eucariote molecule care, după natura lor, sunt fie integrate în membrană pentru a asigura reînnoirea, fie sunt eliberate în mediul extracelular (hormoni, enzime, nutrienţi, deşeuri celulare, etc.). Modificările structurale şi trierea proteinelor înainte de ieşirea lor se efectuează în aparatul Golgi. Faza de migrare care conduce vezicula către membrana, este sub dependenţa microfilamentelor citoscheletului şi microtubulilor. Membranele se unesc prin fuziunea stratului extern al veziculei cu stratul intern al membranei plasmatice. O deplasare laterală a proteinelor intramembranare din zona de fuziune provoacă deschiderea veziculei şi excreţia. Exocitoza necesită prezenţa ATP şi Ca2+ (Figura 4.12).

Proiectul pentru Învăţământ Rural

143

Organizarea şi funcţionarea celulei

Figura 4.12. Transport cu ajutorul veziculelor şi sinteză de proteine (prelucrat după http://www.cbc.umn.edu/~mwd/courses.html)

Se disting două căi de exocitoză: i) calea constitutivă care funcţionează în toate celulele. Veziculele de transport duc în mod continuu moleculele nou sintetizate către membrana plasmatică (Figura 4.12); ii) calea reglată care funcţionează în celulele specializate doar ca răspuns la un stimul, de exemplu un mesager chimic care se fixează la suprafaţa membranei plasmatice. TA 4.21. Care sunt mecanismele prin care se pot vehicula macromolecule de tipul proteinelor, sau particule ca bacteriile sau resturile celulare; TA 4.22. Descrieţi procesul de endocitoză mediat de receptori; TA 4.23. Unele dintre următoarele proteine sunt implicate în transportul cu ajutorul veziculelor: a) receptorii nucleari; b) clatrina; c) albuminele; d) adaptinele; e) b şi d. TA 4.24. Definiţi principalele două căi de exocitoză

144

Proiectul pentru Învăţământ Rural

Organizarea şi funcţionarea celulei

4.3. Comunicarea intercelulară

Comunicarea între celule se face prin intermediul diferenţierilor morfologice ale membranei plasmatice sau pe calea semnalelor. Diferenţierile morfologice cresc suprafaţa membranei şi permit celulei să mărească schimburile cu mediul exterior şi să stabilească joncţiuni cu alte celule. Creşterea suprafeţei La nivelul polului apical, celulele dezvoltă evaginări tubulare sau microvilozităţi. O parte din acestea sunt foarte distanţate unele de altele, de formă neregulată şi de dimensiuni inegale. Altele sunt sub forma unei margini în perie, platou striat (enterocite, tubi proximali renali), sau stereocili (epiteliu epididimar). Numărul lor foarte crescut, până la 3000 în enterocite în ileon, măreşte de peste 1000 de ori suprafaţa de schimb. Forma microvilozităţilor este dată de microfilamentele de actină, în număr de 10 - 50, grupate în fascicule rigide şi menţinute împreună de către proteine (vilina şi fimbrina). O proteină de legare şi calmodulina participă la ataşarea fasciculului de membrana plasmatica. La nivelul polului bazal, membrana plasmatică a celulelor epiteliale (tubul distal al nefronului), implicată în transportul activ al substanţelor, prezintă invaginări mai mult sau mai puţin importante în citoplasmă. Ele delimitează compartimente în care mitocondriile asigură sinteza ATP necesară transportului activ. Joncţiuni intercelulare Într-un ţesut, celulele nu sunt în contact pe toată suprafaţa membranară. Ele sunt separate de un spaţiu intercelular care conţine o reţea de macromolecule (colagen, fibronectină, etc.) care constituie matricea extracelulară. Contactele între două celule vecine sunt asigurate de diverse joncţiuni. Joncţiunile etanşe sau impermeabile (tight) corespund regiunilor unde membranele plasmatice îşi unesc straturile externe. Servesc ca bariere, blocând trecerea moleculelor în spaţiul intercelular şi împiedică difuzia laterală a proteinelor în afara ariei lor funcţionale. Joncţiunile de ancorare sunt joncţiuni foarte solide frecvente în ţesuturile supuse la tensiuni mecanice puternice (muşchiul cardiac, de exemplu). Ele asociază elementele citoscheletice a două celule vecine şi contribuie la regruparea celulelor care formează o unitate structurală. Joncţiunile de ancorare includ joncţiunile de aderenţa, desmozomii şi hemidesmozomii. Joncţiunile de comunicare (gap) sunt cele mai răspândite. Ele asigură pasajul moleculelor mici hidrosolubile (ioni, aminoacizi, AMPc, etc.) între două celule adiacente (Figura 4.13). Canalele se stabilesc graţie proteinelor transmembranare, conexinele, care se asociază în hexameri şi formează o structură numită conexon.

Proiectul pentru Învăţământ Rural

145

Organizarea şi funcţionarea celulei

Conexonii prezenţi în membranele a două celule vecine se plasează vis-a vis, se unesc între ei şi formează o joncţiune străbătută de un por care leagă citoplasmele celor două celule contigue (Figura 4.13). Prin aceste canale celulele schimbă ioni şi metaboliţi. Joncţiunile „gap” oscilează între o stare deschisă şi una închisă, dar mecanismele care controlează mişcările nu sunt încă elucidate.

Figura 4.13. Joncţiunile de comunicare („gap”) (prelucrat după http://www.cbc.umn.edu/~mwd/courses.html)

TA 4.25. Ionii pot circula direct dinspre citoplasma unei celule animale către citoplasma unei celule adiacente: a) plasmodesma; b) filamente intermediare; c) joncţiunile de ocluzie; d) desmozomii; e) joncţiunile gap.

TA 4.26. Enumeraţi tipurile de joncţiuni implicate în procesul de comunicare intercelulară;

146

Proiectul pentru Învăţământ Rural

Organizarea şi funcţionarea celulei

4.4. Traficul intracelular al proteinelor

Toate celulele sintetizează proteine diverse al căror destin este variabil: i) anumite proteine vor rămâne în membrana plasmatică sau în membranele interne; ii) altele merg în lumenul unor organite; iii) altele sunt destinate secreţiei. Tehnicile de marcare şi de revelare a proteinelor (autoradiografie) au arătat că proteinele circulă prin mai multe compartimente celulare înainte să ajungă la destinaţia finală. De exemplu, o proteină destinată secreţiei îşi va începe destinul în nucleul celulei graţie transcrierii unei gene în ARNm. Proteina va fi sintetizată în citoplasmă, la nivelul RER, şi apoi transferată în lumenul acestui compartiment. Ulterior va fi împachetată într-o veziculă care o transportă către compartimentele succesive ale aparatului Golgi (Figura 4.14). Unele proteine sunt reţinute înaintea etapei de eliberare pentru a fi descărcate în exteriorul celulei prin exocitoză.

Figura 4.14. Structura aparatului Golgi şi a reticulului endoplasmatic (prelucrat după http://www.cbc.umn.edu/~mwd/courses.html)

Reticulul endoplasmatic (RE), aparatul Golgi (AG), endozomii, lizozomii şi veziculele de secreţie comunică între ele, dar şi cu exteriorul celulei (prin endocitoză şi exocitoză). Deci, conţinutul lor poate fi disimulat în mediul extracelular. Putem considera că trecerea unei proteine din citosol către lumenul sistemului vezicular este echivalentă cu o ieşire din celulă. Astfel, în afară de procesele de proteosinteza, membrana de la nivelul reticulului endoplasmatic rugos (RER) are rolul de a determină destinaţia unei proteine. Transportorul prezent în membrana RE se numeşte canal de translocare a proteinelor. Canalul este constituit din mai multe proteine transmembranare care formează un por care permite trecerea catenei proteice în curs de sinteză, de la ribozom către lumenul RER. Porul poate funcţiona şi în direcţie opusă (transport retrograd) în momentul eliminării proteinelor nou sintetizate dar cu defecte. Proiectul pentru Învăţământ Rural

147

Organizarea şi funcţionarea celulei

4.4.1. Rolul reticulului endoplasmatic

RE este un ansamblu de membrane interne care participă la numeroase procese biochimice vitale. Intervine mai ales în biosinteza şi maturarea post-traductională a diverselor proteine destinate diferitelor compartimente celulare (membrana plasmatica, lizozomală) sau secreţiei. Întinderea acestui sistem membranar este variabilă în funcţie de tipul celular. Este abundent mai ales în celulele cu sinteză crescută şi secreţie de proteine şi glicoproteine. RE este de două tipuri: rugos, când sunt prezenţi ribozomi pe suprafaţa sa (RER) sau neted (REN). RER este lipsit de ribozomi în diferite puncte care stau la originea veziculelor de transport a proteinelor către alte destinaţii, veziculele de tranziţie (Figura 4.15). În general, RER se găseşte în jurul nucleului, membrana sa este o prelungire a membranei nucleare externe, în timp ce REN este adesea mai îndepărtat de nucleu. REN participă la sinteza lipidelor şi mai ales la reacţii de detoxifiere al căror scop este de a transforma medicamentele şi alte substanţe toxice în produşi netoxici. REN conţine pompe de calciu care transportă şi concentrează calciul. Aceasta rezervă este, în parte, eliberată în citosol ca răspuns la semnalele externe.

Figura 4.15. Maturarea post-traducţională a diferitelor proteine în RER şi AG (prelucrat după http://www.cbc.umn.edu/~mwd/courses.html)

TA 4.27. Citaţi organitele care compun calea de biosinteză şi cele din calea de endocitoză. TA 4.28. Care sunt principalele diferenţe morfologice între RER şi REN? Dar principalele diferenţe funcţionale? TA 4.29. Care este destinaţia proteinelor sintetizate de celule.

148

Proiectul pentru Învăţământ Rural

Organizarea şi funcţionarea celulei

4.4.2. Sinteza Moleculele de ARNm matur produse în nucleu ajung în proteinelor de către citosol trecând prin porii nucleari. Ele sunt traduse în proteine graţie ribozomilor şi numeroaselor proteine asociate acestora . Cu toate ribozomii de la că din punct de vedere structural sunt identici, anumiţi ribozomii suprafaţa RER sunt liberi în timp ce alţii sunt ataşaţi de reticul. La nivelul ribozomilor ataşaţi de RER sunt sintetizate proteinele destinate lizozomilor şi secreţiei, ca şi proteinele integrale ale membranelor biologice. Natura ARNm determină locul traducerii: fie în citosol, fie în reticul. Locul traducerii ARNm este determinat de o secvenţa nucleotidică care codifică o peptidă semnal, situată între codonul start al traducerii (AUG) şi secvenţa proteinei mature. Peptida semnal este indispensabilă pentru transferul ribozomilor liberi angajaţi în traducere către membrana reticulului. Aceasta peptidă este ulterior eliminată de o enzimă specifică. Sunt cunoscute mai multe zeci de secvenţe semnal ale proteinelor. Ele conţin între 13 şi 36 de aminoacizi, din care: i) unul sau câţiva aminoacizi încărcaţi pozitiv la extremitatea N-terminală; ii) o secvenţă de 10 - 15 resturi hidrofobe; iii) o mică secvenţă de aminoacizi polari cu catenă laterală scurtă. Proteinele care urmează a fi secretate încep să fie traduse de ribozomii liberi. După ce peptida semnal, situată la extremitatea N-terminală a pre-proteinei, este sintetizată, ea este recunoscută de o ribonucleoproteină care interacţionează cu peptida semnal şi cu ribozomul pentru a opri traducerea. Complexul format migrează către membrana RE unde, în prezenta GTP, recunoaşte şi interacţionează cu un receptor. Ribozomul se ataşează la translocon, structură care devine situsul de translocare în lumenul RE a proteinei în curs de sinteză. Traducerea se reia şi peptida semnal poate să difuzeze prin membrană pentru a fi excizată şi degradată în lumenul RE de către o enzima specifică numită semnal peptidaza. Proteina în curs de sinteză continuă să intre în membrană menţinând mereu ribozomul la suprafaţa RE. În afară de excizia secvenţei semnal, proteina poate suferi şi alte modificări post-translaţionale, de exemplu glicozilare. Când traducerea este terminată, proteina este eliberată în lumenul RE, unde va rămâne până la transferul către veziculele de transport (Figura 4.15). Transportul proteinei prin membrana este co-traducţional pentru că se face în cursul sintezei proteinei. Translocarea proteinelor prin membrana RE necesită prezenţa tranzitorie a unui por. Ribozomul care asigură traducerea proteinei pare să se ataşeze foarte puternic la situsul membranar al translocării astfel încât menţine caracterul impermeabil al membranei. TA 4.30. Sub forma unui eseu de maxim 300 de cuvinte, descrieţi etapele dintre momentul în care un ribozom se ataşează la un ARNm care codifică o proteină de secreţie şi momentul în care proteina părăseşte RER.

Proiectul pentru Învăţământ Rural

149

Organizarea şi funcţionarea celulei

4.4.3. Glicozilarea proteinelor în RE

În lumenul RER, proteinele încep să sufere modificări posttraducţionale care se manifestă prin eliminarea peptidei semnal şi formarea punţilor disulfurice. Majoritatea proteinelor care tranzitează RE sunt glicoproteine (proteine cuplate cu glucide). Anumite glucide sunt adăugate proteinei în RE, în timp ce altele în aparatul Golgi. Glicozilarea din RE nu este selectivă. Are loc prin adăugarea unui oligozaharid de 14 resturi glucidice la gruparea amino a unui rest de asparagină (Asn) din tripeptida Asn-X-Ser/Thr. Oligozaharidul, constituit din glucoză, manoză şi Nacetilglucozamină, este iniţial purtat de o moleculă lipidică din membrană numită dolicol pirofosfat (Figura 4.16). Transferul oligozaharidului este realizat de o clasă de enzime, numite glicoziltransferaze, localizate pe faţa luminală a membranei RE. Figura 4.16. Glicozilarea proteinelor în RE (prelucrat după Molecular Cell Biology, Lodish, et all. 4th edition, 2000)

4.4.4. Biogeneza membranelor în RER

150

Reînnoirea membranelor necesită şi sinteza de noi molecule lipidice. La eucariote, fosfolipidele, cu excepţia a două lipide mitocondriale, sunt sintetizate şi integrate în membrana RE. Sinteza se face în mai multe etape catalizate de enzime membranare. Lipidele sunt apoi distribuite endomembranelor şi membranei plasmatice pe calea transportului vezicular.

Proiectul pentru Învăţământ Rural

Organizarea şi funcţionarea celulei

4.4.5. Rolul aparatului Golgi

Aparatul Golgi este un alt sistem endomembranar cu rol central în elaborarea numeroaselor proteine şi trierea lor în funcţie de destinaţia finală. Se prezintă sub forma unei reţele sau saci arcuiţi care constituie dictiozomii. Fiecare dictiozom prezintă o fata convexă, de formare sau cis, în relaţie topografică strânsă cu RER, şi o faţă concavă, de maturare, sau faţa trans. Ansamblul dictiozomilor unei celule constituie aparatul Golgi (Figurile 4.14 şi 4.15) Proteinele concentrate în RER suferă un proces de glicozilare nespecifică. Motivul glicozidic specific este adăugat în aparatul Golgi. Transformările finale ale glicozilării depind de destinaţia proteinelor. Proteinele lizozomale suferă doar modificări minore, în timp ce proteinele de secreţie suferă transformări complexe şi variate. Din catena oligozaharidică achiziţionată în RER sunt eliminate unele resturi glucidice, în timp ce altele sunt adăugate într-o ordine minuţios aleasă. Fiecare adăugare sau eliminare furnizează un produs care va fi substratul specific al unei alte enzime care va produce o alta modificare. Astfel se obţin mai multe oligozaharide. Ele sunt subdivizate în doua tipuri diferite: i) oligozaharide bogate în manoză provenite din mărirea catenei achiziţionată în RE sub acţiunea glucozidazelor şi manozidazelor din Golgi. Oligozaharidele complexe rezultă din eliminarea glucozei şi manozei şi înlocuirea lor cu alte resturi glucidice al căror număr şi natură determină diversitatea glicoproteinelor. Adăugarea secvenţială a acestor resturi este determinată de natura enzimelor numite glicoziltransferaze şi localizarea lor în dictiozomi (Figura 4.17). În principiu, reînnoirea membranelor golgiene se face graţie transferului de proteine şi lipide de la RE. Transferul se realizează pe calea veziculelor netede către partea cea mai apropiată a feţei de formare. Într-o etapă ulterioară, alte vezicule transferă o parte a materialului către regiuni din ce în ce mai apropiate de faţa de maturare.

TA 4.31. Microzomii sunt vezicule membranare sferice care prezintă pe suprafaţa lor ribozomi. În cursul unei centrifugări în gradient de densitate ele nu sedimentează decât în ultimele faze ale preparării sub acţiunea unor forţe centrifuge foarte mari. Aceştia nu pot fi observaţi în imagini de microscopie electronică. Care este părerea dumneavoastră despre provenienţa lor ? TA 4.32. Prin ce diferă procesele de glicozilare din complexul Golgi şi RER TA 4.33. De ce grupările glucidice ale glicoproteinelor sunt întotdeauna expuse la suprafaţa celulei. TA 4.34. Alegeţi formularea care caracterizează corect legarea ribozomilor: a) ribozomii legaţi sunt închişi în propria lor membrana; b) ribozomii legaţi sunt diferiţi structural de ribozomii liberi; c) ribozomii legaţi sintetizează în general proteinele membranare şi proteinele secretorii; d) cea mai comuna localizare pentru ribozomii legaţi este suprafaţa citoplasmatică a membranei plasmatice; e) ribozomii legaţi sunt concentraţi în spaţiul dintre cisternele RER. Proiectul pentru Învăţământ Rural

151

Organizarea şi funcţionarea celulei

Figura 4.17. Glicozilarea proteinelor în AG (prelucrat după Biology, N. A. Campbell, J. B. Reece, William Barstow, Ed, International Edition, Benjamin Cummings, 6 Edition, 2002) th

152

Proiectul pentru Învăţământ Rural

Organizarea şi funcţionarea celulei

4.4.6. Trierea proteinelor

Trierea proteinelor destinate mediului extracelular sau organitelor intracelulare este una din funcţiile aparatului Golgi. Se realizează prin veziculele care se formează de pe faţa de maturare a dictiozomilor. Aceste vezicule au pe faţa lor luminală receptori pentru recunoaşterea proteinelor de transportat şi pe fata externă proteine pentru ghidarea către destinaţia lor (Figura 4.18)

Figura 4.18. Eliberarea proteinelor destinate mediului extracelular (prelucrat după http://www.cbc.umn.edu/~mwd/courses.html)

Lizozomii sunt organite intracelulare care conţin enzime care provoacă liza (fosfataze, proteaze, lipaze, glicozidaze, nucleaze, etc.). Acestea sunt hidrolaze acide capabile să degradeze toate tipurile de macromolecule. Echipamentul enzimatic le permite lizozomilor să asigure numeroase funcţii, mai ales digestia produşilor nutritivi ingeraţi de celulă. Prezenţi în celule specializate ca macrofagele, ei participă la apărarea faţă de microorganismele străine (Figura 4.19). Impermeabilitatea membranei lizozomale protejează celula faţă de propriile sale enzime. Enzimele lizozomale sunt glicozilate şi sunt elaborate după un proces similar altor glicoproteine. În cursul sintezei lor de către ribozomi, secvenţele peptidice sunt transferate în RER unde vor suferi primele glicozilări. După migrarea în Golgi cis, ele achiziţionează specificitatea glucidică. Mai întâi are loc îndepărtarea resturilor terminale, mai ales glucoza, apoi fosforilarea unuia sau mai multor resturi de manoză prin două reacţii succesive: legarea N-acetilglucozaminei fosfat la C6 din manoză şi eliminarea grupării N-acetilglucozamină de către o fosfodiesterază.

Proiectul pentru Învăţământ Rural

153

Organizarea şi funcţionarea celulei

Manoza-6-fosfat astfel formată este caracteristică proteinelor lizozomale. Proteinele lizozomale sunt apoi transferate în compartimentul trans. Graţie markerului lor, manoză-6-fosfat, ele se fixează la receptorii situaţi pe faţa luminală a cavităţilor golgiene. Una din etapele cheie ale transportului proteinelor lizozomale, pornind de la Golgi, este separarea de toate celelalte proteine şi segregarea lor în vezicule de transport (Figura 4.19). Astfel veziculele care conţin numai enzime lizozomale se detaşează de aparatul Golgi. Acestea sunt acoperite de clatrină. pH acid al veziculelor de transport al proteinelor lizozomale favorizează separarea proteinelor lizozomale de receptorii lor. O etapă de defosforilare a resturilor de manoză este efectuată adesea pentru prevenirea unei eventuale reasocieri a proteinelor cu receptorii lor. Veziculele de transport pierd învelişurile de clatrina şi vor constitui două compartimente esenţiale: unul va recicla receptorii liberi şi altul, care conţine proteinele lizozomale, va fuziona cu lizozomii.

Figura 4.19. Interconectarea RER, AG şi lizozomi cu evidenţierea proceselor de transport vezicular şi fagocitoză (prelucrat după Biology, N. A. Campbell, J. B. Reece, William Barstow, Ed, International Edition, Benjamin Cummings, 6 Edition, 2002) th

TA 4.35. Credeţi că membranele Golgi situate pe faţa cisternelor se aseamănă mai mult cu partea extracelulară a membranei plasmatice sau cu partea citoplasmatică? De ce? TA 4.36. Care sunt rolurile reticulului endoplasmatic neted (REN)

154

Proiectul pentru Învăţământ Rural

Organizarea şi funcţionarea celulei

4.5. Conversia energiei: mitocondrii şi cloroplaste

În această subunitate ne vom focaliza asupra mitocondriei şi cloroplastului pentru a studia morfologia, membranele şi rolul lor primordial în producţia de ATP necesar derulării funcţiilor celulare (furnizor universal de energie). Pentru producerea ATP de către mitocondrie este necesară o aprovizionare susţinută cu metaboliţi de tipul glucozei şi acizilor graşi. Metaboliţii vor fi convertiţi în NADH şi FADH2 (plus CO2) în procese ca glicoliza, β-oxidarea şi ciclul acizilor tricarboxilici (ciclul Krebs), pentru a alimenta în final catena respiratorie şi a determina producerea de ATP. Procesele se desfăşoară la nivelul unor situsuri bine definite şi trecerea metaboliţilor de la un situs la altul este asigurată de numeroşi transportori. Pe lângă rolul de producător de energie, mitocondria intervine şi în sinteza steroizilor, moarte celulară programată (apoptoză) şi homeostazia celulară a calciului.

Informaţii suplimentare despre producerea de energie vă poate furniza cursul opţional „Introducere în Biochimie”

4.5.1. Mitocondrii

Mitocondria a luat naştere prin fuziunea (acum câteva miliarde de ani) a două bacterii, o archeobacterie anaerobă (gazdă) şi o protobacterie aerobă (simbiontă) pentru a da un eucariot primitiv din care au derivat toate eucariotele actuale. O astfel de ipoteză despre originea mitocondriei a fost sugerată în urma evidenţierii, în 1963, a diferenţelor între ADN mitocondrial (ADNmt de 16 kb la mamifere) şi ADN nuclear. Cuvântul mitocondrie derivă din grecescul mitos, “filament”, şi chondros, “sămânţă” datorită aspectului acestui organit în microscopie (optică şi electronică). De exemplu, în celulele care elaborează hormoni steroidieni (corticosuprarenale şi gonade) mitocondriile sunt filamentoase, în timp ce în hepatocite (ficat) sunt granulare. Mitocondriile au un diametru de aproximativ 1 μm. Celulele conţin numeroase mitocondrii (în hepatocitul de şobolan aproximativ 1000). Mitocondriile nu sunt organite statice. Ele se scindează sau pot fuziona, aceste procese explicând polimorfismul evidenţiat în aceeaşi celulă (Figura 4.20).

TA 4.37. Ce moleculă importantă pentru celulă este produsă în urma intrării metaboliţilor în ciclului acizilor tricarboxilici (Ciclul Krebs) şi funcţionarea catenei respiratoare.

Proiectul pentru Învăţământ Rural

155

Organizarea şi funcţionarea celulei

Figura 4.20. Forma şi structura mitocondriei (prelucrat după http://www.infobiogen.fr/deambulum/index.php)

4.5.1.1. Organizarea Mitocondria este delimitată de un înveliş format din două mitocondriei membrane: membrana externă şi membrana internă (Figura 4.20). Sunt foarte diferite în compoziţie şi funcţii. Membrana internă delimitează spaţiul matricial. Membrana externă este permeabilă pentru orice moleculă de 5 KDa sau mai puţin datorită porinelor. De asemenea conţine şi translocaze, transportori proteici, implicaţi în importul proteinelor (exemplu, translocaza membranei externe, TOM). Membrana internă se repliază pentru a forma numeroase criste şi are drept consecinţă creşterea suprafeţei totale. Cristele au diferite forme: tubulare, saculare, laminare şi triunghiulare, pot coexista în aceeaşi mitocondrie şi pot evolua în timp. Baza unei criste este adesea constituită dintr-o structură tubulară îngustă numită tubul de joncţiune al crestei care stabileşte o comunicare între spaţial interior al cristei şi spaţiul intermembranar periferic al mitocondriei (Figura 4.20). Compoziţia lipidică a membranei interne este particulară deoarece conţine majoritar fosfatidilcolină şi cardiolipină. În această membrană se găseşte catena respiratorie a transportorilor de electroni, ATP sintaza şi numeroşi transportori care asigura pasajul elementelor ca: piruvat, acizi graşi, ATP, ADP şi AMP, compuşi necesari producerii ATP. Membrana interna conţine şi translocaze (Translocaze ale membranei interne, TIM), implicate în importul de proteine (Figura 4.21). TIM şi TOM nu sunt tratate în aceasta lucrare.

156

Proiectul pentru Învăţământ Rural

Organizarea şi funcţionarea celulei

Figura 4.21. Compartimentele mitocondriale şi principalii lor constituenţi

(prelucrat

după http://www.infobiogen.fr/deambulum/index.php)

În spaţiul matricial se află un amestec foarte concentrat de numeroase enzime necesare oxidării piruvatului, acizilor graşi şi ciclului acidului citric. De asemenea, conţine mai multe copii identice de ADN (genom mitocondrial) şi proteine necesare transcrierii sale şi apoi traducerii ARNm în proteine. Proteosinteza mitocondrială este relativ restrânsă fiind sintetizate aproximativ 13 proteine, marea majoritate a proteinelor mitocondriale (în jur de 300 proteine diferite) fiind importate din citoplasmă.

4.5.1.2. Genomul mitocondrial

ADN mitocondrial este o moleculă bicatenară circulară. Este un ADN bogat în citozină şi guanină, adesea prezent în mai multe copii în aceeaşi mitocondrie. La om, mărimea materialului genetic este de 16569 pb, secvenţa nucleotidică fiind cunoscută în totalitate. Codifică ARNr, ARNt şi câteva proteine. În mitocondriile umane au fost descoperite 37 de gene din care 22 codifică pentru ARNt, 2 codifică ARNr şi 13 codifică subunităţile polipeptidice care intră în constituţia proteinelor catenei respiratorii mitocondriale. Astfel citocrom C oxidaza (complexul IV din catena respiratorie) este constituit din 7 subunităţi, din care 3 de origine mitocondrială. ATP-aza are 9 catene polipeptidice din care 2 de origine mitocondrială. Aproximativ 5-10% din proteinele mitocondriale sunt sintetizate in situ. Altele sunt codificate de genomul nuclear şi sintetizate în citosol. Astfel, cele două genomuri, mitocondrial şi nuclear, intervin pentru biosinteza proteinelor mitocondriale active. Codul genetic utilizat de mitocondrie, în timpul traducerii, este diferit de codul genetic universal (Tabelul din Figura 4.22). Codonul de iniţiere codifică pentru N-formil metionina, ca la bacterii.

Proiectul pentru Învăţământ Rural

157

Organizarea şi funcţionarea celulei

Codon

Cod universal

Cod mitocondrial la mamifere

Cod mitocondrial la plante

UGA AGA, AGG AUA CUA

STOP Arg Ile Leu

Trp STOP Met Leu (Trp la drojdii)

STOP Arg Ile Leu

Figura 4.22. Câteva diferenţe între codul genetic universal şi codurile genetice mitocondriale, la mamifere şi plante

TA 4.38. Care sunt cele două proprietăţi ale membranei mitocondriale interne care permit realizarea unei activităţi metabolice crescute? TA 4.39. Care este originea primară a ADN din mitocondriile voastre: maternă sau paternă? Reflectaţi asupra eventualelor consecinţe ereditare ale unei anomalii în mitocondriile unuia dintre părinţi. TA 4.40. Dacă ţinem seama de faptul că mitocondriile nu au aceeaşi capacitate agresivă de autoliză ca lizozomii, care ar putea fi semnificaţia unei structuri membranare atât de complexe. De asemenea, reticulul endoplasmatic şi membrana plasmatică au o crescută capacitate potenţială de a găzdui enzimele pe care le regăsim în membranele mitocondriale. TA 4.41. În conformitate cu regulile generale ale sintezei proteice, sinteza proteinelor citosolice necesită un minim de 30 tipuri molecule de ARNt. Cum se descurcă mitocondria umană pentru a traduce moleculele de ARNm mitocondriale cu numai 22 de specii de ARNt? TA 4.42. Care dintre următoarele caracteristici sunt comune atât mitocondriilor cât şi cloroplastelor? a) producerea de ATP; b) prezenţa ADN; c) prezenţa ribozomilor; d) numai b şi c sunt corecte; e) a, b şi c sunt corecte.

4.5.1.3. Biogeneza mitocondriilor

158

Într-o celulă, mitocondriile sunt reînnoite adesea pentru a compensa eliminarea mitocondriilor mai bătrâne de către lizozomi, fenomen cunoscut sub numele de autofagie. Noile mitocondrii derivă din mitocondriile preexistente prin diviziune. Materialul genetic este duplicat şi se sintetizează noi constituenţi (proteine şi lipide). Numai câteva proteine sunt sintetizate graţie informaţiei genetice mitocondriale. Restul sintezei proteice are loc în citosol prin expresia genelor nucleare. Proteinele mitocondriale sintetizate în citosol sunt produse sub forma de precursori având o secvenţă peptidică adiţională, peptida semnal, situată la extremitatea N-terminală care le permite recunoaşterea şi direcţionarea către mitocondrie. Peptida semnal are 15-30 aminoacizi majoritar hidroxilaţi.

Proiectul pentru Învăţământ Rural

Organizarea şi funcţionarea celulei

Proteinele mitocondriale sunt importate în stare ne pliată. Ele recunosc receptori situaţi în membrana externă şi integrează compartimentul final al destinaţiei lor (membrana externă sau internă, spaţiul intermembranar sau matricea) prin transfer posttraducţional. Cu excepţia proteinelor membranei externe, toate celelalte transporturi de proteine consuma energie. Integrarea în diferite compartimente mitocondriale se face la nivelul regiunilor de contact între membrana externă şi internă, numite situsuri de adeziune. În timpul transportului, proteinele pierd secvenţa semnal datorită intervenţiei unei semnal peptidaze specifice. Lipidele sunt importate din RER de către mitocondrie graţie proteinelor de transfer. În mitocondrie este sintetizat numai cardiolipidul numit difosfatidilglicerol care se obţine prin conversia precursorului său, fosfatidilglicerolul. 4.5.1.4. Funcţiile mitocondriei

Mitocondriile au mai multe funcţii: i) producerea ATP şi NADH; ii) sinteza de hormoni steroizi; iii) turnover-ul monoaminelor (neurotransmiţători); iv) sechestrarea Ca 2+; v) moartea celulară programată (apoptoză) prin eliberarea citocromului c în citoplasma; vi) furnizarea de energie la nou născuţi.

4.5.1.5. Producerea

ATP - furnizor universal de energie Mitocondriile constituie “centrala energetică” a celulei. Le putem considera şi organitele în care energia conţinută în legăturile moleculare ale metaboliţilor proveniţi din alimentele ingerate, este convertită în ATP. În subunităţile alocate “transportului membranar” şi “citoscheletului” s-a evocat rolul capital al ATP a cărei hidroliza în ADP şi Pi (HPO42)- este necesară unui număr mare de procese celulare cum sunt: i) transportul activ de ioni prin membrană (ATP-aze); ii) deplasarea proteinelor motoare şi polimerizarea filamentelor de actină; iii) rol esenţial în producerea altor nucleotide şi în derularea numeroaselor procese metabolice; iv) intervenţia în reglarea cascadelor de semnalizare intracelulară. Pentru a estima importanţa acestor procese se poate spune că în fiecare zi un adult utilizează (şi reciclează) o cantitate de ATP echivalentă cu 75% din greutatea sa. Se estimează că, în repaus, o treime această energie este utilizată pentru funcţionarea pompelor membranare ca Na+/K+ ATP-aza. În repaus, organele cele mai consumatoare sunt inima şi ficatul. Un procent mic din energia celulară provine din glicoliză. Pentru o molecula de glucoza, glicoliza produce 2 molecule de ATP, în citosol, în absenţa oxigenului.

ATP

Proiectul pentru Învăţământ Rural

159

Organizarea şi funcţionarea celulei

În mitocondrii, în prezenţa oxigenului se obţin 36 de molecule de ATP. Energia moleculei de ATP este conţinută în legăturile macroergice dintre fosfaţii β şi γ şi furnizează 7,3 kcal/mol (Figura 4.23). Într-o celulă, proteinele, glucidele şi lipidele, provenite din alimente, participă la producerea de energie în mitocondrii. În citosol, au loc primele etape ale degradării lor în unităţi glucidice, aminoacizi şi acizi graşi care stau la originea producerii unei molecule strategice numită acid piruvic. Ulterior este generat un produs comun prin transformarea tuturor monomerilor precursori în acetil coenzima A (acetil CoA), o molecula care ocupă un rol central în producerea de energie în mitocondrie. Acetil-CoA este obţinută prin două căi majore: i) decarboxilarea acidului piruvic în prezenţa coenzimei A şi NAD+ (Niacinamid Adenin Dinucleotid oxidat) graţie, acţiunii complexului enzimatic al piruvat dehidrogenazei; ii) oxidarea acizilor graşi după un ciclu de reacţii cunoscut sub numele de ciclul Lynen.

Figura 4.23. Molecula de ATP

În matricea mitocondrială, acetil-CoA suferă o serie de transformări, prin decarboxilare şi dehidrogenare enzimatică în prezenţa de coenzime oxido-reducătoare, definind ciclul acidului citric sau ciclul Krebs. Derularea completă a unui ciclu conduce la reducerea coenzimelor NAD+ şi FAD (Flavin Adenin Dinucleotid forma oxidată): NAD+ + 2H+ + 2e- -> NADH + H+ FAD + 2H+ + 2e- -> FADH2 Coenzimele reduse (NADH şi FADH2) se reoxidează cedând electronii transportorilor membranei interne mitocondriale organizaţi în complexe polipeptidice şi regrupaţi sub numele de catena respiratorie. Este un ansamblu de proteine în care are loc transferul de electroni, într-o ordine precisă, cu eliberare de energie la fiecare etapă de trecere între doi transportori consecutivi (Figura 4.24).

160

Proiectul pentru Învăţământ Rural

Organizarea şi funcţionarea celulei

Complexul I, NADH dehidrogenaza, conţine peste 25 de polipeptide. Situsul de legare al NADH este orientat către matrice. Acceptorul final al acestui complex este ubiquinona oxidată (UQ) care se reduce la ubiquinol după reacţia următoare: NADH + H+ + UQ -> NAD+ + UQH2 Complexul II, succinat dehidrogenaza, este constituit din cel puţin 4 polipeptide. Transferă electronii de la succinat la ubiquinonă prin intermediul FAD. Complexul III, ubiquinol-citocrom c oxidoreductaza, este compus din 10 subunităţi. Ubiquinolul produs de complexele I şi II difuzează în membrane până la complexul III căruia îi va ceda electronii pentru a ajunge în forma sa oxidată. Transferul de electroni duce la reducerea citocromului c. Ultimul complex care conduce electronii până la oxigen este complexul IV, citocrom c oxidaza. El transferă electronii acceptorului final, oxigenul, care se reduce la apă. Energia furnizată prin transferul de electroni este utilizată pentru expulzarea protonilor prin membrana internă şi creează un gradient electrochimic de protoni, numit forţă motrice protonică. Faţa matricială a membranei devine încărcată negativ, în timp ce faţa citosolică are o sarcină netă pozitivă. ATP sintetaza (ATP-aza) sau complexul V, numit şi complexul F0-F1 utilizează un gradient electrochimic de protoni pentru a cataliza reacţia de fosforilare a ADP în ATP. Conform teoriei chimiosmotice acestea sunt reacţii cuplate trecerii inverse a protonilor prin ATP sintetaza. Fosforilarea este oxidativă pentru că este cuplată cu reacţiile de oxidare ale transportorilor catenei respiratoare. Energia electrochimică poate fi utilizată pentru a îndeplini alte procese celulare. Transportul fosfatului şi ADP utilizează gradientul electrochimic de protoni ca sursa de energie. TA 4.43. Care dintre următoarele procese care se desfăşoară în celulele eucariote are loc atât în prezenţa cât şi în absenţa O2? a) transportul de electroni; b) glicoliza; c) ciclul Krebs; d) fosforilarea oxidativă; e) fermentaţia; TA 4.44. Din care proces procură respiraţia celulară cea mai mare parte a energiei chimice? a) fosforilarea la nivel de substrat; b) formarea lactatului din piruvat; c) transformarea oxigenului în ATP, d) transferul electronilor de la moleculele organice la oxigen; e) generarea de bioxid de carbon şi oxigen în lanţul transportor de electroni; TA 4.45. Credeţi că importul de substanţe cum sunt ADP sau Pi ar putea duce la scăderea forţei protono-motrice? De ce?

Proiectul pentru Învăţământ Rural

161

Organizarea şi funcţionarea celulei

.

i Figura 4.24 Componentele catenei respiratorii

TA 4.46. Care dintre următorii metaboliţi intermediari intră în ciclul Krebs şi se formează, parţial, prin îndepărtarea CO2 dintr-o moleculă de acid piruvic? a) lactat; b) gliceraldehid-fosfat; c) oxaloacetat; d) acetil-CoA; e) acid citric TA 4.47. Unul dintre procesele metabolice de mai jos este cel mai intim asociat cu membranele intracelulare: a) fosforilarea la nivel de substrat; b) fosforilarea oxidativă; c) ciclul Krebs; d) glicoliza; e) fermentaţia alcoolică; TA 4.48. În timpul respiraţiei aerobe, gradientul de protoni mitocondrial va fi generat de ________________ şi folosit în primul rând pentru _________: a) catena transportoare de electroni… ATP; b) catena transportoare de electroni….fosforilarea la nivel de substrat c) glicoliza……producerea de H2O; d) fermentarea…….reducerea NAD e) difuzia protonilor…..sinteza ATP; TA 4.49. Când ionii de hidrogen sunt pompaţi din matricea mitocondrială prin membrana internă în spaţiul intermembranar, rezultatul este: a) formarea ATP; b) reducerea NAD+; c) restaurarea echilibrului Na+/K+ de o parte şi de alta a membranei; d) crearea unui gradient de protoni; e) scăderea pH în matricea mitocondrială TA 4.50. Care dintre următoarele afirmaţii fac o distincţie clară între glicoliză şi respiraţia celulară: a) numai respiraţia oxidează glucoza; b) NADH este oxidat de către catena transportoare de electroni numai în procesul respirator; c) glicoliza, dar nu şi respiraţia, reprezintă un exemplu de cale catabolică; d) fosforilarea la nivel de substrat este un proces unic caracteristic glicolizei; e) NAD+ funcţionează ca agent oxidant numai în procesul respirator.

162

Proiectul pentru Învăţământ Rural

Organizarea şi funcţionarea celulei

4.5.2. Cloroplaste

În celulele eucariote fotosintetice, energia celulară poate să provină şi din activitatea cloroplastelor. Sunt organite delimitate, ca şi mitocondriile, de doua membrane (externă şi internă). În stroma internă, structuri membranare în formă de saci, numiţi tilacoizi, sunt ancorate şi formează agregate. Membrana tilacoidă are echipamentul enzimatic responsabil de transferul electronilor dinspre stroma către lumenul tilacoid. O ATP sintetază, numita CF0-CF1 ATP-aza, este prezentă în membrană şi cuplează returul protonilor către stromă cu sinteza de ATP (Figura 4.25).

Figura 4.25. Structura cloroplastelor

În cursul fotosintezei se produc numeroase reacţii, clasificate în două categorii: A. Reacţii de transfer de electronii, numite şi reacţii la lumină. Energia luminoasă activează un electron al unui fotosistem în care participă clorofila. Electronul este transmis unei catene de transport de electroni din membrana tilacoidă. Principiul de transfer este similar celui din catena respiratoare mitocondrială. Duce la conversia NADP+ (Niacinamid Adenin Dinucleotid Fosfat forma oxidată) în NADPH (Niacinamid Adenin Dinucleotid Fosfat forma redusă). Acest proces pompează protoni prin membrana tilacoidă creând un gradient electrochimic de protoni. Această forţă protonomotrice este responsabilă de sinteza ATP, în stromă, de către ATP sintetaza, CF0-CF1-ATP-aza; B. Reacţii de fixare ale carbonului, numite şi reacţii la întuneric. În cursul acestor reacţii, ATP şi NADPH, produşi cu ocazia transferului de electroni, servesc ca sursa de energie şi agent reducător pentru a favoriza, printr-un mecanism ciclic, transformarea CO2 în glucide. TA 4.51. ATP sintaza constă în două complexe formate din mai multe subunităţi: Fo şi F1. Unde este localizat fiecare dintre acestea în mitocondrii şi în cloroplaste şi care este funcţia lor;

Proiectul pentru Învăţământ Rural

163

Organizarea şi funcţionarea celulei

4.5.2.1. Transferul de electroni

În cursul fotosintezei producerea ATP şi NADPH utilizează lumina solară ca energie iniţială. Când o moleculă de clorofilă este excitată de către un foton, un electron este deplasat de pe un orbital molecular pe altul cu energie mai mare. O astfel de moleculă excitată este instabilă şi va avea tendinţa să revină la starea iniţială cedând un electron cu energie mare unei alte molecule „acceptoare de electroni”. În acelaşi timp va preleva un electron cu energie scăzută de la o alta moleculă „donoare de electroni” cum este apa. Cele două fotosisteme (PSII şi PSI) funcţionează simultan pentru a produce ATP şi NADPH utilizând energie luminoasă. Fosforilarea ADP la ATP se numeşte fotofosforilare. Fotosistemul II (PSII) ia electroni de la apă pentru a umple golurile create de lumină (fotoni) într-o moleculă de clorofila din centrul reactiv P680 (centru care are o molecula de clorofila ce absoarbe lumina la 680 nm). Electronii cu energie mare din P680 excitat sunt recuperaţi de moleculele de quinona care îi transmit unei pompe de protoni, complexul b6f. Acest complex transporta protonii în lumenul tilacoid şi creează un gradient electrochimic care favorizează sinteza ATP de către ATP sintetaza. Fotosistemul I acceptă electronul pentru a umple golul lăsat în propria molecula de clorofilă din centrul reactiv P700 excitat de către alţi fotoni. Fiecare electron care intră în fotosistemul I este adus la un nivel de energie foarte crescut care îi permite să fie transmis ferredoxinei, şi apoi NADP+ pentru a produce NADPH (Figura 4.25). Fotofosforilarea este neciclică când cele două fotosisteme sunt implicate în transferul unui electron de la apă la NADP+. Cloroplastele anumitor specii vegetale pot face să funcţioneze fotosistemul I în mod ciclic, fotofosforilare ciclică. Electronii cu energie mare proveniţi din ferredoxină sunt cedaţi complexului b6-f în locul NADP+ şi deci reciclaţi în fotosistemul I. Rezultatul acestui mod de funcţionare este acumularea de protoni în lumenul tilacoid şi în consecinţă disponibilitatea energiei necesare sintezei ATP. Fotofosforilarea neciclică utilizează cele două fotosisteme şi produce oxigen, ATP şi NADPH, în timp ce fotofosforilarea ciclică utilizează doar fotosistemul I şi generează ATP fără a forma nici NADPH, nici oxigen.

TA 4.52. În celulele plantelor, ATP se formează ca răspuns la expunerea lor la lumină. Este implicată o catenă transportoare de electroni localizată în: a) membranele tilacoide ale cloroplastelor; b) stroma cloroplastelor; c) membrana internă a mitocondriei; d) matricea mitocondriei; e) citoplasmă. TA 4.53. Care este funcţia principală a reacţiilor de lumină ale fotosintezei? a) să producă o formă a glucozei bogată în energie pornind de la CO2 şi apă; b) să producă ATP şi NADPH; c) pentru a produce NADPH folosit în respiraţie; d) să transforme energia chimică în gliceraldehdifosfat; e) să folosească ATP în sinteza glucozei.

164

Proiectul pentru Învăţământ Rural

Organizarea şi funcţionarea celulei

Figura 4.25. Complexele transferului de electroni din membrana cloroplastului(prelucrat după Biology, N. A. Campbell, et all, Ed, International Edition, Benjamin Cummings, 6 Ed, 2002) th

4.5.2.2. Fixarea carbonului

4.5.2.3. Genomul cloroplastului

Reacţia principală de fixare a carbonului este cea dintre CO2 provenit din atmosferă, ribulozo 1,5-bifosfat şi apă cu formare a două molecule de 3-fosfoglicerat. Reacţia este catalizată în stromă de către o enzima abundentă, ribulozo bifosfat carboxilaza. Producerea de ribulozo 1,5-bifosfat necesită o serie de reacţii care consumă NADPH şi ATP. În ciclul de fixare a carbonului (ciclul Calvin-Benson), 3 molecule de ATP şi 2 molecule de NADPH sunt consumate pentru fiecare moleculă de CO2 transformată. În stromă, acest ciclu duce la formarea de gliceraldehid-3-fosfat. Acesta se va acumula în stromă sau va fi exportat în citosol pentru a fi transformat într-un dizaharid numit zaharoză, care reprezintă principala formă de transport a glucidelor în celulele vegetale. Este un ADN circular, cu mărime de 120-200 kpb. Codifică molecule de ARNr, 30 molecule de ARNt, aproximativ 20 de proteine ribozomale cloroplastice, subunităţi ale ARN polimerazei, mai multe proteine ale fotosistemelor I şi II, subunităţi ale ATP sintetazei şi subunitatea mare a ribulozo difosfat carboxilazei. Ca şi mitocondria, cloroplastul nu este niciodată sintetizat de novo. Provine mereu din cloroplaste preexistente. Multe subunităţi proteice sunt produse în citosol (sunt proteine codificate de genomul nuclear) şi importate în diferite compartimente cloroplastice.

TA 4.54, Care dintre următorii produşi ai reacţiilor de lumină din fotosinteză sunt utilizaţi în ciclul Calvin? a) CO2 şi glucoza; b) H2O şi O2; c) ADP, Pi şi NADP+; d) Electronii şi H+; e) ATP şi NADPH Proiectul pentru Învăţământ Rural

165

Organizarea şi funcţionarea celulei

4.6. Nucleul şi funcţiile sale

În ciuda diferenţelor evidente de formă şi de funcţie, diferitele tipuri celulare care compun un organism multicelular, fie că este vorba de o ciupercă sau de un mamifer, conţin un lot complet de gene. Văzută din exterior o celulă din constituţia unui cartilaj şi un neuron nu se aseamănă deloc. Cu toate acestea cele două tipuri celulare conţin acelaşi complement de gene. Informaţia genetică, înmagazinată în structura moleculelor de ADN (acid deoxiribonucleic), prezentă într-o celulă eucariotă specializată, se poate compara cu o carte care conţine toate indicaţiile necesare construcţiei unei clădiri cu utilităţi multiple. În cursul realizării construcţiei, sunt probabil necesare toate planurile dar numai o mică parte a informaţiei va trebui consultată în timpul activităţii de construcţie a unui etaj sau a unei singure camere. Această abordare este adevărată şi pentru un ovul fecundat, care conţine ansamblul instrucţiunilor genetice, şi care este fidel replicat, informaţia fiind distribuită tuturor celulelor organismului în dezvoltare. În consecinţă, celulele poartă mult mai multă informaţie genetică decât pot utiliza vreodată. Acestea posedă mecanisme care le permit să exprime informaţia genetică, în mod selectiv, urmând numai instrucţiunile care privesc numai o singură celulă într-un moment particular al existenţei acesteia. În acest subcapitol, o să analizăm modalităţile care le permit celulelor eucariote să structureze totalitatea materialului genetic pe care îl conţin, în condiţiile controlului coordonat al expresiei genelor menite să asigure numai sinteza anumitor proteine. Mai întâi vom descrie structura şi proprietăţile nucleului celulei eucariote, care conţine majoritatea informaţiei genetice şi mecanismele de reglare a acesteia. Nucleul conţine cea mai mare parte a materialului genetic (ADN) al unei celule, o mică parte fiind conţinută în mitocondrii şi cloroplaste. Astfel, acesta condiţionează sinteza tuturor tipurilor de ARN: ARNm care va fi tradus în proteine, ARNr care intră în constituţia ribozomilor şi ARNt, indispensabil pentru biosinteza proteinelor. În ciuda importanţei sale pentru stocarea şi utilizarea informaţiei genetice, nucleul celulei eucariote posedă o morfologie destul de comună (Figura 4.25). Conţinutul nuclear reprezintă o masă vâscoasă amorfă de materie închisă într-un înveliş nuclear complex. În nucleul unei celule tipice, în interfază, se evidenţiază: i) cromozomii, prezenţi sub forma unor fibre nucleoproteice foarte alungite, cromatina; ii) matricea nucleară care este formată dintr-o reţea fibrilară care conţine proteine; iii) unul sau mai mulţi nucleoli, structuri amorfe, opace în microscopie electronică care sunt sediul sintezei ARN ribozomal şi al asamblării ribozomilor; iv) nucleoplasma, substanţă lichidă care conţine toate componentele şi elementele nucleului eucariot

166

Proiectul pentru Învăţământ Rural

Organizarea şi funcţionarea celulei

În figura 4.26 sunt ilustrate schematic diferitele elemente ale nucleului eucariot.

Figura 4.26. Structura nucleului celulei eucariote (prelucrat

după Biology, N. A. th Campbell, J. B. Reece, William Barstow, Ed, International Edition, Benjamin Cummings, 6 Edition,

2002)

În general, celula eucariotă conţine un singur nucleu, cu excepţia anumitor celule ca eritrocitele umane care îl pierd în cursul diferenţierii lor sau ca hepatocitele şi osteoclastele care sunt plurinucleare. Nucleul, frecvent sferic, poate avea o forma similară cu cea a celulei: alungită pentru celulele fuziforme, discoidală în celulele pavimentoase. Poziţia sa geometrică centrală şi mărimea variază şi este caracteristică unui tip celular. 4.6.1. Învelişul nuclear

În opoziţie cu termenul de membrană nucleară, învelişul nuclear desemnează structura complexă care se află la frontiera dintre nucleul şi citoplasma unei celule eucariote. Într-o celulă, separarea materialului genetic şi a citoplasmei care îl înconjoară este poate caracteristica cea mai importantă care distinge eucariotele de procariote. Apariţia învelişului nuclear este cu siguranţă un punct de reper în evoluţia biologică. Învelişul nuclear constă în mai multe elemente distincte (Figura 4.26).

Proiectul pentru Învăţământ Rural

167

Organizarea şi funcţionarea celulei

Continuitatea învelişului care delimitează nucleul este asigurată de două membrane concentrice separate de un spaţiu intermembranar de 10 la 50 nm. Cele două membrane sunt fuzionate din loc în loc şi formează pori circulari care sunt compuşi dintr-un ansamblu complex de proteine. Densitatea porilor nucleari variază de la aproximativ 2 la 4 pe μm2 în învelişul nuclear al eritrocitelor de pasăre, relativ inactiv din punct de vedere metabolic, la mai mult de 60 μm2 în cel al ovocitelor care se pregătesc să răspundă nevoilor viitoare ale dezvoltării embrionare. O celulă de mamifere, de mărime medie, posedă aproximativ 3 000 de pori nucleari. Membrana externă este în general presărată cu ribozomi şi adesea în continuitate cu membrana reticulului endoplasmatic (Figura 4.26). Suprafaţa internă a învelişului nuclear este bordată de o plasă fibrilară densă, numită lamina nucleară. În anumite celule, cum este ovocitul de amfibian, această lamină formează un strat destul de continuu, în timp ce în altele pare mult mai fragmentată. Considerăm că lamina nucleară reprezintă un suport structural pentru învelişul nuclear şi serveşte la fixarea fibrelor de cromatină la periferia nucleului (Figura 4.26). Fibrilele laminei nucleare au un diametru de aproximativ 10 nm şi sunt compuse din polipeptide numite lamine, care aparţin aceleiaşi superfamilii de polipeptide care compun filamentele intermediare ale citoscheletului. Ca şi pentru componentele intermediare ale citoplasmei, integritatea laminei nucleare este controlată de către procesul de fosforilare/defosforilare. Dezasamblarea laminei nucleare, înainte de mitoză, este indusă de către fosforilarea laminelor de către o kinază specifică.

TA 4.55. Care sunt principalele elemente ale nucleului unei celule eucariote care pot fi evidenţiate prin tehnici microscopice? TA 4.56. Enumeraţi principalele trei roluri ale ADN. TA 4.57. Care sunt cele două roluri pe care laminele le au în structura şi funcţia nucleului TA 4.58. Care dintre următoarele perechi este greşită? a) nucleol – RNA ribozomal; b) nucleu –cromozomi; d) lizozomi – sinteza proteică; d) membrana celulara – bistrat lipidic; e) citoschelet – microtubuli TA 4.59. Sub forma unui eseu de maxim 200 de cuvinte discutaţi diferenţa majoră care există între o celulă procariotă şi una eucariotă din punctul de vedere al structurării informaţiei genetice. TA 4.60. Noţiunea de înveliş nuclear desemnează: a) membrana internă; b) structura complexă care se află la frontiera dintre nucleul şi citoplasma unei celule eucariote; c) membrana externă pe suprafaţă căreia există pori; d) spaţiul intermembranar nuclear; e) totalitatea fibrelor de cromatină. 168

Proiectul pentru Învăţământ Rural

Organizarea şi funcţionarea celulei

Învelişul nuclear este o barieră care separă două din cele 4.6.1.1. Structura şi funcţia complexului mai importante compartimente ale celulei, nucleul şi citoplasma, porii fiind porţi în această barieră. Contrar membranei plasmatice, porilor nucleari care împiedică trecerea macromoleculelor între citoplasmă şi spaţiul extracelular, anvelopa nucleară este un centru activ pentru ARN şi proteinele care se deplasează în cele două sensuri, între compartimentele pe care aceasta le separă. Replicarea şi transcripţia materialului genetic, în nucleu, necesită participarea unui mare număr de proteine care se sintetizează în citoplasmă şi sunt transportate prin învelişul nuclear. Invers, moleculele de ARNm, ARNt şi subunităţile ribozomilor care sunt fabricate în nucleu trebuie să fie transportate prin membrana nucleară, în sens invers. Anumite elemente, cum sunt moleculele ARNsn (ARN „small nuclear”), se deplasează în cele două direcţii. Ele sunt sintetizate în nucleu, se asamblează în particule ribonucleoproteice (RNP), în citoplasmă, şi sunt reimportate în nucleu unde intervin în maturarea ARNm. Acest trafic intens se realizează prin porii nucleari. Ţinând seama că particule materiale, de talia subunităţilor ribozomale, pot să treacă prin porii nucleari, putem presupune că aceştia sunt canale deschise dar, de fapt, este exact contrar. Porii nucleari conţin un aparat complex, în formă de coş, numit Complexul Porului Nuclear (CPN) care obturează porul ca un dop şi care se reliefează în afară în citoplasmă şi în nucleoplasmă. Structura CPN este prezentată în modelul schematic din figura 4.27. CPN este un enorm complex molecular cu simetrie octogonală care se estimează că are în structură 100 la 200 polipeptide. Masa CPN este cam de 30 ori mai mare decât masa unui ribozom. Structura moleculară a complexului CPN a fost determinată de-a lungul timpului graţie tehnicilor de microscopie electronică şi de analiză de imagini din ce în ce mai performante. Dacă sunt injectate soluţii, ale moleculelor cu masă moleculară mică, în citoplasma unei celule acestea pot penetra rapid în porii nucleari prin simplă difuzie. Experimentul sugerează că aceste substanţe sunt capabile să treacă printre fantele existente între razele coşului. 4.6.1.2. Traficul nucleu-citoplasmă

Capacitatea moleculelor mai mari (proteine şi nucleoproteine) de a trece din citoplasmă în nucleu depinde de sediul lor obişnuit de rezidenţă, în nucleu sau în afara acestuia. De exemplu, dacă o proteină citoplasmatică, cum este albumina serică bovină, este marcată radioactiv şi injectată în citoplasmă, ea are tendinţa de a rămâne acolo. Din contră, dacă injectarea este realizată cu o proteină cu localizare nucleară, nucleoplasmina, proteina marcată va fi regăsită imediat în nucleu.

Proiectul pentru Învăţământ Rural

169

Organizarea şi funcţionarea celulei

Figura 4.27. Structura porului nuclear (prelucrat după Biology, N. A. Campbell, J. th

B. Reece, William Barstow, Ed, International Edition, Benjamin Cummings, 6 Edition, 2002)

Importul proteinelor în nucleu trece prin mai multe etape: i) proteina care trebuie importată se cuplează cu un receptor pentru SLN (Semnal de Localizare Nucleară) care pare a fi localizat la suprafaţa filamentelor depărtate de inelul extern al porului către citoplasmă; ii) interacţia între proteina nucleară şi receptorul pentru SLN permite acostarea proteinei pe faţa citoplasmatică a complexului porului nuclear prin formarea unui complex de transport; iii) deplasarea complexului de transport prin por necesită energie eliberată din hidroliza ATP. Aceasta implică o modificare a conformaţiei transportorului, structură mare în formă de dop (inel intern) situată în centrul complexului porului nuclear (Figura 4.27). Modificarea de conformaţie deschide un canal în centrul transportorului şi permite moleculelor situate în proximitatea acestuia să pătrundă în nucleoplasmă. După acelaşi principiu, substanţele care trec din nucleu în citoplasmă declanşează, probabil, deschiderea transportorului în sens invers. Un por nuclear individual este capabil să importe proteine şi să exporte ARN şi ribonucleoproteine. Acest transport bidirecţional poate fi vizualizat prin microscopie electronică. De asemenea, tendinţa de acumulare în unul dintre cele două compartimente celulare a unor proteine purtătoare de semnale de localizare în citoplasmă sau în nucleu poate fi vizualizată prin microscopie de fluorescenţă sau confocală.

170

Proiectul pentru Învăţământ Rural

Organizarea şi funcţionarea celulei

4.6.2. Nucleul este un organit organizat

Specialiştii în biologie celulară se bazează mult pe studiile biochimice pentru a înţelege activităţile nucleului. Cu toate că acestea furnizează un număr mare de informaţii, distrug toate structurile moleculare organizate care pot exista în nucleu şi dau impresia că acesta nu este decât un „sac” de elemente repartizate la întâmplare. În acelaşi timp, o serie de studii de microscopie ne fac să realizăm că nucleul este în realitate un compartiment foarte organizat. De exemplu, fibrele de cromatină, care compun un cromozom interfazic, nu sunt dispersate în tot nucleul, cum am putea crede, ele sunt concentrate într-un domeniu specific care nu se suprapune deloc cu domeniile altor cromozomi. Interacţiunile între extremităţile cromozomilor şi anvelopa nucleară reprezintă un alt mod de organizare a cromozomilor în nucleu. Această asociere este evidentă mai ales în meioză, când cromozomii pot să se îndepărteze de anvelopa nucleară şi să formeze un „buchet”. De mai bine de treizeci de ani se ştie că ARN ribozomal este sintetizat în nucleol, dar se consideră că celelalte molecule de ARN, şi mai ales ARNm se asamblează în tot nucleul. Cercetările ultimilor zece ani au demonstrat clar că moleculele de ARNm sunt sintetizate într-un număr limitat de situsuri discrete situate în întregul nucleu. Dacă sunt identificate cu ajutorul unor sonde marcate fluorescent, situsurile de sinteză şi de maturare a moleculelor de pre-ARNm apar sub forma unor „pete” strălucitoare în nucleoplasma nemarcată. Fiecare din cele 20 la 50 de pete observate într-un anumit nucleu reprezintă situsul sintezei mai multor molecule de ARNm diferite. Diferitele elemente ale nucleului sunt organizate în acest compartiment printr-o reţea interactivă complexă de filamente care compun matricea nucleară.

4.6.2.1. Cromozomii

Matricea nucleară nu este numai un schelet care menţine forma nucleului sau un eşafodaj pe care se organizează buclele de cromatină; ea serveşte şi de fixare pentru mecanismele care intervin în diferite activităţi ale nucleului, cum sunt transcripţia, maturarea ARN şi replicarea. De exemplu, dacă celulele sunt incubate în prezenţă de precursori radioactivi ai ARN sau ADN în timpul unei scurte perioade, găsim că aproape toţi acizii nucleici sintetizaţi sunt asociaţi fibrilelor matricei nucleare. Cromozomii se individualizează structural la începutul mitozei şi „par să dispară” din nou la sfârşitul acesteia. Aceştia sunt constituiţi dintr-un complex de ADN şi proteine numit cromatină. Cromatina există în diverse stări în diferite faze ale ciclului celular. Cromozomii sunt mult mai scurţi decât lungimea moleculelor de ADN pe care le conţin.

Proiectul pentru Învăţământ Rural

171

Organizarea şi funcţionarea celulei

În medie, un cromozom uman conţine o moleculă de ADN de aproximativ 5 cm. Compactarea acestui material genetic, în structura cromozomului, presupune existenţa unui sistem organizat de împachetare care să permită totuşi funcţionarea genomului şi exprimarea genelor. Observate la microscopul electronic, cea mai mare parte a organitelor intracelulare prezintă o structură care ne oferă informaţii interesante despre funcţia lor. Totuşi, micrografiile electronice ale preparatelor fine ale nucleului oferă destul de puţine informaţii privind natura cromozomilor în interfază. În această etapă, cromozomii sunt mult mai puţin vizibili deoarece cromatina se află într-o stare mai relaxată (Figura 4.28).

Figura 4.28. Micrografii electronice care prezintă starea cromatinei în interfază (a) şi în mitoză (b) (prelucrat după Molecular Cell Biology Lodish H., et. al., 2000)

Structura cromozomului mitotic Dispersarea cromatinei în celulele în interfază face mult mai uşoară replicarea şi transcripţia ADN. Din contră, cromatina celulelor mitotice este sub forma cea mai condensată, care uşurează „livrarea” unui pachet intact de ADN fiecărei celule fiice. Cromozomii mitotici sunt foarte utili, atât pentru biologi cât şi pentru medici, deoarece ei conţin un lot complet de material genetic celular şi pot fi puşi în evidenţă prin tehnici simple (Figura 4.28 b). Când un cromozom se condensează în timpul profazei mitotice, el adoptă o formă distinctă şi constantă determinată, în principal, de lungimea moleculei de ADN şi de poziţia centromerului. Se pot evidenţia cromozomii mitotici ai unei celule în diviziune prin tehnica descrisă în figura 4.29. În această tehnică, celulele sunt sparte după oprirea diviziunii celulare în mitoză în urma folosirii colchicinei. Cromozomii mitotici sunt fixaţi la suprafaţa unei lame unde ocupă o suprafaţă foarte mică şi coloraţi cu diferite tipuri de reactivi (Tabelul din figura 4.30). De exemplu, tehnica în care se realizează o proteoliză limitată şi colorarea cu reactiv Giemsa poartă numele de “bandare G”. Prin aceasta se evidenţiază prin benzi închise la culoare regiunile bogate în AT şi prin benzi pale cele bogate în GC

172

Proiectul pentru Învăţământ Rural

Organizarea şi funcţionarea celulei

După fotografiere cromozomii individuali sunt decupaţi şi aranjaţi în perechi. Se realizează un cariotip în care cromozomii omologi sunt dispuşi în ordinea descrescătoare a mărimii aşa cum se prezintă în figura 4.29b. Celulele somatice de la om conţin 46 cromozomi care pot fi grupaţi în 22 de perechi omologe şi cromozomii sexuali care sunt XX la femei şi XY la bărbaţi. Studiul cariotipului este o tehnică de bază pentru citogeneticieni. Cu colorantul Giemsa se obţin între 400 şi 800 benzi pentru un set haploid de cromozomi. Preparatele de cromozomi mitotici sunt curent realizate pornind de la culturi de celule sanguine pentru a identifica indivizii purtători de anomalii cromozomale. Există posibilitatea determinării cromozomilor suplimentari, absenţa lor sau o serie de alte modificări vizibile la microscopul optic. Braţul scurt al cromozomului este desemnat cu litera p („petit”), iar braţul lung cu litera q (următoarea literă din alfabet). În tehnicile de bandare, fiecare braţ al cromozomului este împărţit în două sau mai multe regiuni prin benzi mari. Regiunile sunt numerotate cu 1, 2, 3 pornind de la centromeri către capete. Fiecare regiune este divizată în benzi şi subdiviziuni ale benzilor. De exemplu, Xp21.2 se referă la segmentul cromozomial localizat pe braţul scurt al cromozomului X, în regiunea 2, banda 1 şi subbanda 2. Centromerii Se poate remarca că toţi cromozomii reprezentaţi în figurile 4.28 şi 4.29 posedă o regiune unde suprafaţa lor exterioară este net răscroită. Această scobitură care este vizibilă foarte bine în figura 4.28 b reprezintă centromerul cromozomului. Poziţia centromerului este variabilă, împărţind cromozomul (cromatida) în două regiuni inegale. În general, centromerii conţin heterocromatină constitutivă. Centromerii cromozomilor umani conţin secvenţe lungi de aproximativ 170 nucleotide (ADN satelit α) dispuse în tandem şi repetate de la 2 000 la 30 000 ori pentru fiecare centromer. ADN centromeric fixează proteine specifice, printre care şi cele care servesc drept situs de fixare a microtubulilor în procesul de separare a cromozomilor în timpul diviziunii mitotice. Centromerii împart fiecare cromatidă în două cromatide inegale numite braţe. Telomerii Cele două extremităţi ale moleculei de ADN, de la nivelul fiecărui cromozom, posedă segmente particulare de secvenţe repetitive numite telomeri, care formează un „coif” la fiecare capăt. La om telomerii posedă motivul repetitiv TTAGGG/AATCCC care se repetă de o mie de ori şi permite replicarea normală a capetelor cromozomilor (Figura 4.31a). Contrar celor mai multe tipuri de secvenţe repetitive, care variază mult între specii, chiar dacă ele sunt înrudite şi apropiate evolutiv, în cazul telomerilor de la om şi de la marea majoritate a vertebratele studiate până în prezent, găsim aceeaşi secvenţă telomerică. Proiectul pentru Învăţământ Rural

173

Organizarea şi funcţionarea celulei

La alte organisme, cum sunt protozoarele şi drojdiile, telomerii au secvenţe diferite. Totuşi, asemeni situaţiei de la vertebrate, una dintre catene este întotdeauna bogată în resturi de guanozină iar complementara sa în resturi de citozină. Catena bogată în G este orientată în sensul 5’-3’ către extremitatea cromozomului şi depăşeşte cu 12 la 15 nucleotide extremitatea catenei bogată în C. Datorită existenţei acestui dezechilibru catena bogată în G formează o coadă scurtă, monocatenară, la cele două extremităţi ale cromozomului. Această dispoziţie persistă de la o generaţie celulară la alta datorită unei enzime speciale, telomeraza, care poate adăuga noi unităţi repetitive la extremitatea 3’ a catenei bogate în G (Figura 4.31 b).

Figura 4.29 Cariotipul cromozomilor mitotici de la om: a) tehnică folosită pentru obţinerea de preparate de cromozomi mitotici din leucocitele sângelui periferic; b) cariotip uman (prelucrat după Biology, N. A. Campbell, J. B. Reece, William Barstow, Ed, International Edition, Benjamin Cummings, 6 Edition, 2002) th

174

Proiectul pentru Învăţământ Rural

Organizarea şi funcţionarea celulei Tehnică Bandarea G

Procedeu Proteoliză limitată, colorare Giemsa

Tipul benzilor Benzi întunecate bogate în AT; Benzi pale bogate în GC Bandarea R Denaturare prin căldură, Benzi întunecate bogate în colorare Giemsa GC Benzi pale bogate în AT Bandare Q Colorare cu quinacrină Benzi întunecate bogate în AT Benzi pale bogate în GC Bandare C Denaturare cu hidroxid Evidenţierea de benzi de bariu, colorare întunecate de Giemsa heterocromatină Figura 4.30. Tehnici de colorare folosite pentru bandarea cromozomilor

Telomeraza, ale cărei proprietăţi au fost bine studiate de către Elisabeth Blackburn şi colegii săi de la Universitatea din California, San Francisco, este o transcriptază inversă care asamblează fragmente de ADN folosind o catenă ARN drept matriţă. Este o enzimă foarte neobişnuită deoarece fragmentul de ARN care serveşte drept model (matriţă) face parte din structură. Telomerii au roluri importante în celulă : i) sunt necesari replicării complete a cromozomului; ii) protejează cromozomii de nucleaze şi de alte influenţe destabilizatoare; iii) împiedică fuziunea dintre extremităţile cromozomilor în procesele de recombinare; iv) facilitează interacţiile dintre extremităţile cromozomilor şi anvelopa nucleară în anumite tipuri celulare. De asemenea, telomerii şi activitatea telomerazei par să fie unii dintre principalii actori implicaţi în procesul de îmbătrânire. Celulele normale, în cultură, nu sunt capabile să se dividă decât de un număr limitat de ori înainte de a da semne de „îmbătrânire” şi de a muri în final. Telomerii se scurtează deoarece cea mai mare parte a celulelor umane par să fie lipsite de telomeraze. Contrar celulelor normale, celulele canceroase nu încetează să crească în cultură şi devin „nemuritoare”. Unul dintre factorii care ar putea contribui la imortalizarea celulelor maligne este reactivarea telomerazei, care conservă lungimea telomerilor de-a lungul generaţiilor. De fapt, cercetările realizate în acest sens au demonstrat clar că celulele canceroase posedă o activitate telomerazică care nu poate fi evidenţiată în celulele normale. Această descoperire a declanşat stimularea cercetărilor privind inhibitorii specifici ai acestei enzime în speranţa că aceştia vor avea efect benefic în tratamentul anumitor tipuri de cancer.

Proiectul pentru Învăţământ Rural

175

Organizarea şi funcţionarea celulei

Figura 4.31. Completarea capetelor ADN de către telomerază: a) procesul de replicare şi evidenţierea formării capetelor incomplete ale cromozomilor pentru catena întârziată; b) mecanismul de acţiune al telomerazei cu evidenţierea motivelor repetitive de la capetele cromozomilor (prelucrat după Biology, N. A. Campbell, J. B. Reece, William Barstow, Ed, International Edition, Benjamin Cummings, 6 Edition, 2002) th

TA 4.61. Credeţi că un cromozom poate avea mai mulţi centromeri? TA 4.62. La ce servesc telomerii? TA 4.63. Ce este un cariotip? a) fenotipul unui individ; b) genotipul unui individ; c) o combinaţie unică de cromozomi întâlniţi într-un gamet; d) un sistem de clasificare al acizilor nucleici; e) o dispunere a cromozomilor omologi într-o celulă organizată în relaţie cu numărul, mărimea şi tipul lor. TA 4.64. O celula eucariotă care pierde telomeraza va: a) avea o mare probabilitate de a deveni canceroasa; b) produce fragmente Okazaki; c) avea o replicare întârziată; d) suferi o reducere a lungimii cromozomilor; e) fi foarte sensibilă la lumina solară. După cum am arătat mai sus, o celulă umană normală 4.6.3. Împachetarea conţine aproximativ 6 miliarde de perechi de baze repartizate între genomului eucariot 46 de cromozomi (cantitatea prezentă în numărul diploid de cromozomi ne-replicaţi). Fiecare cromozom conţine o singură moleculă continuă de ADN. Deoarece fiecare pereche de baze ocupă aproximativ 0,34 nm, 6 miliarde de perechi de baze corespund unei molecule lungi de 2 metri. De asemenea, în celulă, ADN este hidratat cu cantităţi importante de apă (aproximativ 6 molecule de apă pentru fiecare pereche de baze), care şi acestea duc la creşterea volumului. 176

Proiectul pentru Învăţământ Rural

Organizarea şi funcţionarea celulei

Problema cheie a fost identificarea modalităţilor prin care este posibilă localizarea a 2m de ADN hidratat într-un nucleu al cărui diametru nu depăşeşte 10 μm, asigurând în acelaşi timp, accesul proteinelor şi enzimelor implicate în procesele de reglare. O altă problemă, la fel de importantă, se referă la modul în care molecula de ADN, dintr-un cromozom, este organizată pentru a nu se înnoda cu moleculele altor cromozomi. Răspunsurile la toate aceste probleme îl găsim în modul remarcabil de împachetare al moleculei de ADN. Se cunoaşte de mult timp că fibrele care formează cromatina, şi intră în structura cromozomilor, sunt formate din ADN în asociere cu proteine. Proteinele din structura cromatinei sunt împărţite în două grupe principale: histonele şi proteinele cromozomiale nehistonice. Histonele reprezintă o colecţie de mici proteine bazice bine definite, în timp ce proteinele nehistonice sunt compuse dintr-un număr mare de proteine diferite cu rol structural, enzimatic şi reglator. Cromatina mai conţine şi un procentaj scăzut de ARN compus, în principal, din catene de ARNhn („heterogen nuclear”) în diferite stadii de maturare şi din ARNsn („small nuclear”) care intervine în procesul de maturare („splicing”) al ARNm. În celulele eucariote, unitatea de bază a organizării cromatinei este nucleozomul. Acesta reprezintă o entitate în care 146 pb sunt răsucite în două ture de super-elice stângă în jurul unui octamer de histone care conţine câte două exemplare din moleculele H2A, H2B, H3 şi H4. Nucleozomii sunt organizaţi în filamente de 10 nm în diametru prin interacţiuni cu histona H1, care se legă la ADN care intră şi iese din nucleozom. Un al treilea nivel de organizare este obţinut prin răsucirea unui filament de 10 nm într-o elice care conţine 6 nucleotide pe tur, cu formarea unui solenoid cu un diametru de 30 nm. Structuri mai complexe ale cromatinei sunt realizate prin condensarea filamentelor de 30 nm, dar detaliile privind aceste structuri sunt mai puţin cunoscute (Figura 5.15). Microscopia electronică a furnizat dovezi decisive privind organizarea cromatinei în regiuni, bucle şi domenii distincte de 30 la 300 kpb, fixate fiecare pe o matrice bogată în proteine. Fiecare buclă pare să aibă doar o singură origine de replicare şi să se comporte ca o unitate de replicare. Buclele, sunt unităţi de suprarăsucire independente, structura topologică a fiecăreia fiind independentă de starea celorlalte. Se pare că acest lucru este posibil datorită fixării extremităţilor buclelor în matrice. Cu toate că fiecare buclă conţine mai multe unităţi de transcripţie, activitatea întregii regiuni poate fi coordonată pentru a fi reprimată sau potenţial activată (Figura 4.32).

Proiectul pentru Învăţământ Rural

177

Organizarea şi funcţionarea celulei

TA 4.65. Într-un nucleozom, ADN este spiralat în jurul: a) moleculelor polimerazice; b) ribozomilor; c) histonelor; d) nucleolului; e) ADN satelit. TA 4.66. Făcând apel şi la cunoştinţele dobândite în urma parcurgerii unităţilor 1 şi 4 realizaţi un eseu privind consecinţele compactării materialului genetic în evoluţia lumii vii

Figura 4.32. Schema generală a organizării cromatinei cu evidenţierea principalelor nivele cunoscute de organizare (prelucrat după Biology, N. A. Campbell, J. B. Reece, William Barstow, Ed, International Edition, Benjamin Cummings, 6 Edition, 2002) th

178

Proiectul pentru Învăţământ Rural

Organizarea şi funcţionarea celulei

4.6.3.1. Nucleozomii Împachetarea precisă a ADN de la eucariote depinde de - primul nivel de histone, grup remarcabil de proteine bazice care se împarte în cinci organizare al subgrupe, în principal în funcţie de conţinutul lor în lizină şi arginină cromozomului care reprezintă aproximativ ¼ din totalul aminoacizilor (Tabelul din Figura 4.33). La pH fiziologic, aceste proteine sunt încărcate pozitiv. Aminoacizii bazici din structură suferă modificări posttraducţionale (acetilare, metilare, fosforilare) reversibile enzimatic. Studiile comparative de secvenţă şi de structură tridimensională au condus la divizarea familiei histonelor în două grupuri: H2A, H2B, H3 şi H4 pe de o parte şi H1 pe de altă parte. Această eterogenitate este subliniată şi de poziţia lor în nucleozom. De fapt, histonele H4 şi H3, şi într-un grad mai mic H2A şi H2B, sunt proteine foarte conservate evolutiv. Exemplul cel mai frapant este al histonei H4 de la bovine şi de la mazăre, care au acelaşi număr de aminoacizi (102) şi ale căror secvenţe primare nu diferă decât prin doi aminoacizi: o lizină în locul unei arginine şi o leucină în locul unei valine. Aceste diferenţe minore sunt prezente în condiţiile în care divergenţa dintre animal şi plantă s-a produs acum un miliard de ani. Structura histonei H1 este mult mai variabilă de la o specie la alta. Această conservare extremă sugerează că toţi aminoacizii au un rol bine definit în funcţionarea proteinei. Structura terţiară a histonelor din primul grup demonstrează existenţa a două domenii: un domeniu central globular, hidrofob şi un domeniu N-terminal, hidrofil, încărcat pozitiv şi flexibil. Histona H1, mai lungă, posedă un al treilea domeniu la nivelul capătului Cterminal, hidrofil şi flexibil. La începutul anilor 1970, s-a putut observa că în urma tratamentului cromatinei, cu nucleaze nespecifice, cea mai mare parte a ADN era transformată în fragmente de aproximativ 200 perechi de baze sau în multipli ai acestora. Din contră, acelaşi tratament aplicat moleculelor de ADN „nud” determină obţinerea unei populaţii de fragmente de mărimi aleatoare. Această descoperire i-a făcut pe cercetători să considere că fragmentele uniforme de ADN cromozomial erau protejate de atac enzimatic probabil prin asocierea lor periodică cu o proteină.

Histone H1 H2A H2B H3 H4

Nr. aminoacizi

Masa kDa

% Arg

% Lys

215 129 125 135 102

23,0 14,0 13,8 15,3 11,3

1 9 6 13 14

29 11 16 10 11

PUE* (10-6 ani) 8 60 60 330 600

Figura 4.33. Caracteristicile histonelor din timus de vacă * PUE = Perioadă unitară de evoluţie: durată de timp necesară pentru o schimbare cu 1% a secvenţei de aminoacizi a unei proteine după separarea a două specii

Proiectul pentru Învăţământ Rural

179

Organizarea şi funcţionarea celulei

În 1974, Roger Kornberg, de la Universitatea Harvard, a propus un nou tip de structură secundară pentru cromatină bazându-se pe rezultatele digestiei cu nucleaze asupra cromatinei din diferite surse. Astăzi, se cunoaşte că nucleozomii conţin o particulă care constituie nucleul nucleozomului, compus din 146 perechi de baze de ADN suprarăsucit, care face aproape două spire în jurul unui miez proteic central care conţine 8 molecule din patru histone: H2A, H2B, H3 şi H4 (Figura 4.34d). Particulele de nucleozomi sunt unite unele de altele printr-un segment de ADN de legătură, de lungime variabilă (aproximativ 60 de perechi de baze). ADN din structura unui nucleozom şi din braţul de legătură reprezintă aproximativ 200 de perechi de baze, ceea ce corespunde valorii fragmentelor găsite în cursul primelor experienţe cu nucleaze (Figura 4.33a şi b). Nucleele nucleozomilor, care au un diametru de aproximativ 10 nm, şi ADN de legătură, cu un diametru de 2 nm, apar pe micrografiile electronice asemeni „unui şirag de mătănii” (Figura 4.34). Pentru fiecare nucleozom, o moleculă de histonă H1 este poziţionată în exteriorul nucleului fiind asociată la cele două extremităţi ale ADN care intră şi ies de pe suprafaţa complexului proteic. (Figura 4.34d). Dacă se realizează eliminarea selectivă a moleculelor de histone H1, printr-un tratament al fibrelor cu soluţii saline de concentraţie scăzută, cromatina capătă un aspect mult mai dezorganizat. În general, resturile de aminoacizi bazici ale histonelor nucleului sunt grupate la extremităţile moleculei, restul structurii păstrând un caracter relativ hidrofob. Această separare convine perfect organizării nucleozomului. Regiunile neîncărcate şi hidrofobe ale histonelor ocupă centrul particulei şi favorizează agregarea într-un nucleu strâns. Porţiunile polare, bazice, ale moleculelor din nucleu formează cozi flexibile orientate către exteriorul particulei, unde resturile încărcate pozitiv pot stabili interacţii ionice cu grupările fosfat negative din structura scheletului ADN. Cu toate că, molecula de ADN este strâns asociată nucleului format din histone prin suprafaţa internă a fibrei elicoidale, suprafaţa sa externă rămâne expusă şi poate interacţiona cu moleculele de reglare. Studii de cristalografie cu raze X au demonstrat că resturile încărcate pozitiv sunt reunite sub formă de perechi la suprafaţa octamerului histonic. Situsurile pereche formează un fel de spirală pe drumul pe care se presupune că îl urmează elicea ADN care înconjoară nucleul nucleozomului. Acestea servesc drept „puncte de fixare” pentru cele două catene ale helixului. Dacă pentru spiralizarea a 200 de perechi de baze de ADN sunt necesare aproximativ nouă molecule de histone, o celulă umană care conţine 6 miliarde de perechi de baze de ADN, poate conţine aproximativ 300 milioane de histone necesare împachetării primare a materialului genetic.

180

Proiectul pentru Învăţământ Rural

Organizarea şi funcţionarea celulei

Astfel se explică, necesitatea unui număr mare de exemplare de gene care codifică pentru histone în celulele care se divid rapid

Figura 4.34: Structura şi dimensiunile nucleozomilor: a) sedimentarea nucleozomilor în gradient de sucroză duce la obţinerea unei serii de picuri care corespund formelor monomere, dimere, trimere, etc., ale nucleozomilor; b) ADN extras din fracţiile individuale este supus electroforezei împreună cu un martor ADN digerat cu nucleaze; c) micrografie electronică a cromatinei eliberată dintrun nucleu al unei celule de Drosophila. Se observă că fibrele de cromatină sunt formate din nucleozomi conectaţi între ei prin segmente scurte de ADN; d) schemă care demonstrează structura unei particule nucleozomale cu o moleculă de histonă H1 asociată; e) electroforeză în SDS a unui amestec de histone H3 şi H4 din timus de viţel. Se observă toate benzile corespunzătoare componentelor tetramerului (H3)2(H4)2 (prelucrat după Lewin B., Genes VII,2000).

Proiectul pentru Învăţământ Rural

181

Organizarea şi funcţionarea celulei

4.6.3.2. Nivelurile structurale superioare ale cromatinei

Cel mai redus nivel de organizare al cromatinei îl reprezintă răsucirea moleculei de ADN în jurul inimii nucleozomului şi are un diametru de 10 nm. Totuşi, cromatina nu se găseşte în celulă sub această formă relativ răsucită de „şirag de mătănii”. Micrografiile electronice ale secţiunilor de nucleu relevă un număr de pete minuscule cu un diametru de aproximativ 30 nm care reprezintă secţiuni transversale la nivelul fibrelor de cromatină. Dacă se separă cromatina din nucleu, în prezenţa ionilor divalenţi, se observă prezenţa unor filamente de aceeaşi grosime (Figura 4.35). Structura acestui filament de 30 nm rămâne încă un subiect discutabil. În figura 4.35 este prezentat modelul solenoid de suprarăsucire a filamentului subţire al nucleozomilor (10 nm) pentru a forma un filament de ordin superior, mai gros. Se presupune că, fibrele condensate se formează prin împachetarea nucleozomilor într-o structură spiralată (aranjament solenoid) care conţine şase nucleozomi pentru fiecare tur de răsucire. Acest nivel suplimentar de organizare al cromatinei creşte de şase ori raportul de condensare. Filamentul de 30 nm este conservat prin interacţiunea între moleculele de histonă H1 ale nucleozomilor vecini (Figura 4.35b). Dacă sunt extrase selectiv moleculele H1, filamentele groase de cromatină se derulează şi se transformă în „mărgele” (mătănii) mai subţiri şi mai înguste. Readăugarea histonei H1 restabileşte structura de ordin superior. Studii recente de microscopie electronică sugerează că fibrele de 30 nm sunt mai puţin uniforme decât modelul solenoid imaginat. Cromatina condensată poate fi de fapt foarte dinamică fiind formată din structuri parţial depliate care se pot replia rapid în structuri solenoide ocazionale. Cromatina din regiunile cromozomiale care nu sunt transcrise frecvent este predominant în forma condensată de 30 nm, în timp ce regiunile transcrise activ se consideră că adoptă forma relaxată de „şirag de mătănii” (Figura 4.35a)

TA 4.67. Care dintre următoarele afirmaţii reprezintă succesiunea corectă a nivelurilor de organizare? a) nucleozom, fibre de cromatină de 30-nm, domenii buclate; b) domeniul buclă, 30-nm fibre de cromatină, nucleozom; c) domeniul buclă, nucleozom, 30nm fibre de cromatină; d) nucleozom, domeniul bucla, 30-nm fibre de cromatină; e) 30-nm fibre de cromatină, nucleozom, domeniu buclă TA 4.68. Nucleozomii sunt organizaţi în filamente de _____în diametru prin interacţiuni cu _____ a) 80 nm/ histona H4; b) 10 nm/histona H1; c) 30 nm/ histona H2; d) 300 /cicline; e) 15 nm/polimeraze

182

Proiectul pentru Învăţământ Rural

Organizarea şi funcţionarea celulei

Următoarea etapă de condensare a ADN în nucleu o reprezintă organizarea filamentelor de 30 nm într-o serie de bucle mari suprarăsucite. Se estimează că fiecare buclă conţine între 10 şi 150 kilobaze ADN. Se pare că acestea sunt fixate la baza cu proteine specifice printre care şi o topoizomerază de tip II care intervine pentru a controla gradul de spiralizare al ADN la nivelul buclei. Topoizomeraza eliberează moleculele de ADN dacă o buclă se încurcă. Buclele de ADN ar putea împărţi genomul în „domenii”, fiecare conţinând un lot mic de gene care sunt exprimate printr-un mecanism comun de reglare.

Figura 4.35. Modelul solenoid de organizare a fibrelor de cromatină condensată de 30 nm: a) micrografia şi modul de organizare a nucleozomilor din structură; b) micrografie prezentând fibrele de 30 nm şi modelul de împachetare solenoid cu caracteristicile sale structurale (prelucrat după Molecular Cell Biology, Lodish, et all. 4th edition, 2000)

Normal, buclele de cromatină sunt etalate la interiorul nucleului şi nu sunt vizibile, dar prezenţa lor poate fi evidenţiată în anumite circumstanţe. De exemplu, dacă tratăm cromozomii mitotici izolaţi cu reactivi care extrag histonele, putem observa că ADN eliberat de histone se pliază sub formă de bucle plecând de la eşafodaj proteic, format din proteine nehistonice (Figura 4.32). Micrografia electronică din figura 4.36b evidenţiază buclele lungi de ADN ancorate la un schelet cromozomial compus din proteine nehistonice obţinut prin îndepărtarea histonelor din structura cromozomilor din celule HeLa, în metafază.

Proiectul pentru Învăţământ Rural

183

Organizarea şi funcţionarea celulei

Acest eşafodaj flexibil are forma cromozomului metafazic şi persistă chiar şi atunci când ADN este digerat cu nucleaze (Figura 4.32c). O serie de experimente de hibridizare „in situ”, realizate pe celule umane în interfază, utilizând diferite sonde fluorescente, au dus la imaginarea modelului prezentat în figura 4.36a. Astfel, s-a evidenţiat că o serie de sonde (A la H) care recunoşteau secvenţe situate la milioane de perechi de baze distanţă, în structura ADN linear, erau poziţionate foarte aproape unele de altele în structura cromozomului interfazic. Se consideră că apropierea dintre aceste situsuri este posibilă datorită asocierii lor la scheletul cromozomului.

Figura 4.36. Nivelurile structurale superioare ale cromatinei: a) model de structurare a buclelor fibrelor de cromatină de 30 nm imaginat în urma experienţelor de hibridare in situ cu sonde (A la H) situate la distanţe variabile pe ADN liniar; b) micrografie electronică a unui cromozom metafazic din celule HeLa, lipsit de histone ca urmare a unui tratament moderat cu detergenţi (prelucrat după Molecular Cell Biology, Lodish, et all. 4th edition, 2000).

Cromozomul mitotic reprezintă etapă ultimă de condensare a cromatinei (Figurile 4.28 şi 4.32d). De obicei, un μm de cromozom mitotic conţine un cm de ADN. Această condensare, realizată ca urmare a unui proces încă puţin cunoscut, este însoţită de fosforilarea practic a tuturor moleculelor de histone H1 la nivelul celor cinci resturi de serină din moleculă. O imagine generală a diferitelor niveluri de organizare ale cromatinei de la filamentele nucleozomale până la cromozomii mitotici este prezentată în figura 4.32.

TA 4.69. Compactarea cromozomilor observată în mitoză este datorată: a) spiralizării ADN în jurul histonelor; b) răsucirii cromatinei; c) domeniilor bucla; d) răsucirii, buclării şi împachetării ADN; e) unităţilor repetitive ADN în tandem.

184

Proiectul pentru Învăţământ Rural

Organizarea şi funcţionarea celulei

4.6.4. Eucromatina şi heterocromatina

După terminarea mitozei, cea mai mare parte a cromatinei care compune cromozomii mitotici foarte condensaţi se dispersează şi revine la starea sa interfazică difuză. Totuşi, în cea mai mare parte a celulelor, aproximativ 10% din materialul cromozomial îşi păstrează forma condensată compactă pe tot parcursul interfazei, cromatina condensată putând fi evidenţiată la periferia nucleului. Termenul de heterocromatină desemnează cromatina care rămâne condensată în timpul interfazei pentru a o distinge de eucromatina care desemnează starea dispersată. Cercetările din ultimii ani demonstrează clar posibilitatea trecerii reversibile dintr-o formă în alta, această clasificare fiind mai degrabă didactică. Numeroase gene de la eucariotele multicelulare nu sunt exprimate decât în anumite momente ale dezvoltării şi/sau în anumite ţesuturi. În consecinţă, celulele trebuie să posede modalităţi eficace pentru a reprima expresia tuturor genelor care nu sunt caracteristice unui anumit tip de celulă într-o anumită etapă a dezvoltării sale. Represia unor blocuri mari de gene, prin limitarea disponibilităţii factoriilor de transcripţie, este un mecanism destul de puţin probabil pentru o astfel de reglare. Este general admis că această represie este rezultatul sechestrării genelor „silenţioase” în complexe de cromatină superior structurate care le fac inaccesibile maşinăriei de transcripţie. În absenţa informaţiei privind organizarea acestei structuri a cromatinei, este imposibil de descris starea de tranziţie care separă cromatinele reprimate şi exprimate. Genele de menţinere, exprimate în permanenţă în toate celulele sunt replicate în prima jumătate a fazei S. În acelaşi context, genele neexprimate tind să fie replicate mai târziu. De asemenea, replicarea genelor este precoce în ţesuturile în care ele sunt exprimate şi târzie în ţesuturile în care acestea sunt „silenţioase". De exemplu, la mamifere cromozomul X inactiv este replicat după cromozomul X activ. Aceste corelaţii sugerează că replicarea precoce creează o stare mai accesibilă maşinăriei de transcripţie crescând eficienţa fixării factorilor de transcripţie. Heterocromatina poate fi divizată în două categorii: constitutivă şi facultativă, în funcţie de permanenţa stării condensate. Heterocromatina constitutivă rămâne condensată tot timpul şi reprezintă regiunile din structura ADN care rămân silenţioase permanent. În celulele de mamifere, cea mai mare parte a heterocromatinei constitutive se găseşte în apropierea centromerului tuturor cromozomilor şi în alte câteva regiuni particulare, cum este braţul distal al cromozomului Y la masculi. La multe plante, extremităţile cromozomului (telomerii) sunt şi ele formate din heterocromatină constitutivă.

Proiectul pentru Învăţământ Rural

185

Organizarea şi funcţionarea celulei

În principal, ADN din structura heterocromatinei constitutive este format din secvenţe înalt repetitive şi se presupune că este lipsit de gene care codifică pentru proteine. Se consideră că, heterocromatina conţine elemente a căror influenţă se face simţită la o anumită distanţă şi poate afecta starea fiziologică a genelor învecinate. Astfel, dacă unele gene active, care şi-au schimbat poziţia ca urmare a unei transpoziţii sau a unei translocări, se află poziţionate în apropierea heterocromatinei, ele prezintă tendinţa de a deveni inactive. Contrar formei constitutive, heterocromatina facultativă este inactivată specific în cursul anumitor stadii de viaţă ale organismului. Un exemplu tipic de heterocromatină facultativă este furnizat de inactivarea unui cromozom X în celulele femele de la mamifere. Celulele mascule au un mic cromozom Y şi un cromozom X mult mai mare. Cromozomii X şi Y au puţine gene în comun astfel încât bărbaţii nu posedă decât un exemplar al genelor situate pe cromozomii sexuali. Deşi, celulele de la femele conţin doi cromozomi X, unul singur este funcţional în procesul de transcripţie. Celălalt cromozom rămâne condensat sub forma unei mase de heterocromatină (Figura 4.37) numit corpuscul Barr, după numele cercetătorului care l-a descoperit în anul 1949. Se consideră că, producerea corpusculului Barr este un mecanism normal, graţie căruia celulele femele şi mascule dispun de acelaşi număr de cromozomi X activi şi sintetizează cantităţi echivalente de produşi codificaţi de genele situate pe cromozomul X.

Figura 4.37: Evidenţierea heterocromatinei: a) micrografie electronică a unei celule stem din măduva spinării. Regiunile închise de la periferia nucleului şi din afara nucleolului reprezintă heterocromatină; b) prezenţa cromozomului X inactivat sub forma corpusculului Barr într-o celulă de femeie (prelucrat după Molecular Cell Biology, Lodish, et all. 4th edition, 2000)

.

TA 4.70. Cromozomii X şi Y sunt numiţi cromozomi sexuali, deoarece: a) numărul cromozomilor Y determina sexul unui individ; b) femelele au cromozomi X şi masculii cromozomi Y; c) aceştia sunt prezenţi numai când celulele suferă meioza; d) genele localizate pe aceşti cromozomi joacă un rol în determinarea sexului unui individ; e) aceştia sunt formaţi numai ca rezultat al fertilizării.

186

Proiectul pentru Învăţământ Rural

Organizarea şi funcţionarea celulei

4.7. Răspunsuri şi comentarii la testele de autoevaluare unitatea 4 R TA 4.1. Membrana plasmatică este constituită dintr-un dublu strat lipidic (40 la 70%) format în principal din fosfolipide şi colesterol. Numeroase proteine (aproximativ 30%) sunt ancorate în membrană. La suprafaţa externă a membranei plasmatice, pe structura proteinelor sunt ancorate grupări glucidice. Membrana simetrică este asimetrică. R TA 4.2: b; R TA 4.3:a; R TA 4.4: c; R TA 4.5: d; R TA 4.6: b; R TA 4.7: a; R TA 4.8: a ; R TA 4.9: b; RTA 4.10: a; RTA 4.11: c; RTA 4.12. Concentraţia de K+ este de 10-20 de ori mai mare în interiorul celulelor decât la exterior, în timp ce pentru Na+ este invers. Aceste diferenţe sunt determinate şi menţinute de o ATP-ază din membrana plasmatică care se comportă ca o pompă care expulzează activ 3 ioni Na+ către exterior şi importă 2 ioni K+ către interior; RTA 4.13. Na+/K+ ATP-aza este electrogenică şi implicată în producerea unui potenţial electric membranar deoarece diminuează concentraţia intracelulară de ioni pozitivi. Transportul de Na+ şi K+ este strâns cuplat cu hidroliza ATP pentru transferul celor doi ioni contra gradientului lor electrochimic (transport activ primar). Gradientul de Na+/K+ generat de o parte şi de alta a membranei este esenţial pentru funcţionarea celulei şi este implicat în diverse funcţii: i) reglarea pH; ii) reglarea volumului celular; iii) transportul nutrienţilor de tip glucoză şi aminoacizi; iv) transmiterea semnalelor în sistemul nervos (potenţial de acţiune); RTA 4.14. Ar fi de aşteptat ca cei doi ioni să iasă în mediu când axonul este în repaus; K+ va difuza prin canalele de ieşire, în timp ce Na+ va fi pompat prin transport activ. Declanşarea unui potenţial de acţiune va fi însoţită de o ieşire a K+ în faza de repolarizare. RTA 4.15. De exemplu, potenţialele de acţiune ar putea merge în ambele direcţii în lungul axonului. R TA 4.16: e; R TA 4.17: c; R TA 4.18: c; RTA 4.19:c; R TA 4.20: d; R TA 4.21. Transportorii transmembranari nu pot vehicula macromolecule de tipul proteinelor, sau particule ca bacteriile sau resturile celulare. Mecanismele folosite de celulă implică formarea veziculelor. Transportul către citoplasmă se numeşte endocitoza, în timp ce transportul către mediul extracelular se numeşte exocitoza. În interiorul celulei, un flux de vezicule permite transportul macromoleculelor între diferite compartimente. R TA 4.22. Endocitoza mediată prin receptori este un proces specific. Intervin proteine membranare care recunosc şi fixează liganzii specificii. Legăturile ligand-receptor induc o regrupare localizată a complexului şi formarea unei invaginări a membranei tapetată pe faţa sa citoplasmatică cu proteine fibroase care formează o manta în jurul veziculei. R TA 4.23: e; R TA 4.24: Se disting două căi de exocitoză: i) calea constitutivă care funcţionează în toate celulele. Veziculele de transport duc în mod continuu moleculele nou sintetizate către membrana plasmatică; ii) calea reglată care funcţionează în celulele specializate doar ca răspuns la un stimul, de exemplu un mesager chimic care se fixează la suprafaţa membranei plasmatice. R TA 4.25: e; R TA 4.26: Joncţiuni intercelulare implicate în comunicarea intercelulară sunt: joncţiunile etanşe sau impermeabile, Joncţiunile de ancorare şi . Joncţiunile de comunicare (gap). R TA 4.27: În calea biosintetică sunt implicate reticulul endoplasmatic (RE) şi aparatul Golgi (AG). Reticulul endoplasmatic (RE), aparatul Golgi (AG), endozomii, lizozomii şi veziculele de secreţie comunică între ele, dar şi cu exteriorul celulei (prin endocitoză şi exocitoză). Conţinutul lor poate fi deci disimulat în mediul extracelular. Trecerea unei proteine din citosol către lumenul sistemului vezicular este echivalentă cu o ieşire din celulă. Astfel, în afară de procesele de proteosinteză, destinaţia extracelulară Proiectul pentru Învăţământ Rural

187

Organizarea şi funcţionarea celulei

este determinată de trecerea prin membrana la nivelul reticulului endoplasmatic rugos (RER). R TA 4.28: RE este un ansamblu de membrane interne care participă la numeroase procese biochimice vitale. Întinderea acestui sistem membranar este variabilă în funcţie de tipul celular. Este abundent mai ales în celulele cu sinteză puternică şi secreţie de proteine şi glicoproteine. RE poate fi de două tipuri. Este fie rugos, când sunt prezenţi ribozomi pe suprafaţa sa (RER), fie neted (REN). RER se găseşte, în general, în jurul nucleului, membrana sa este o prelungire a membranei nucleare externe, în timp ce REN este adesea mai îndepărtat de nucleu. RER intervine mai ales în biosinteza şi maturarea posttraductională a diverselor proteine destinate diferitelor compartimente celulare (membrana plasmatică, lizozomală) sau secreţiei. REN participă la sinteza lipidelor şi mai ales la reacţii de detoxifiere al căror scop este de a transforma medicamentele şi alte substanţe toxice în produşi netoxici. REN conţine pompe de calciu care transportă şi concentrează calciul. Aceasta rezervă este, în parte, eliberată în citosol ca răspuns la un semnal exterior. R TA 4.29: Proteinele sintetizate de celule pot avea următoarele destinaţii: a) unele proteine merg în membrana plasmatică sau în membranele interne; ii) altele sunt distribuite în lumenul unor organite; iii) altele sunt destinate secreţiei. R TA 4.30. Moleculele de ARNm mature produse în nucleu ajung în citosol trecând prin porii nucleari şi sunt traduse în proteine graţie ribozomilor şi proteinelor asociate. Natura ARNm determină locul traducerii: fie în citosol, fie în reticul. O secvenţa nucleotidică, care codifică o peptidă semnal, între codonul start al traducerii (AUG) şi secvenţa proteinei mature, determină locul traducerii ARNm. Peptida semnal este indispensabilă pentru transferul ribozomilor liberi angajaţi în traducere către membrana reticulului. Aceasta peptidă este ulterior eliminată de o enzima specifică. Proteinele de secreţie încep sa fie traduse de ribozomii liberi. După ce peptida semnal, situată la extremitatea N-terminală a pre-proteinei, este sintetizată, ea este recunoscută de o ribonucleoproteină care interacţionează cu peptida semnal şi cu ribozomul, şi opreşte traducerea. Complexul migrează către membrana RE unde recunoaşte şi interacţionează, cu un receptor în prezenţa GTP. Ribozomul se ataşează la translocon, care devine situsul de translocare în lumenul RE a proteinei în curs de sinteză. Traducerea se reia şi peptida semnal poate să difuzeze prin membrana unde va fi excizată şi degradată în lumenul RE de către o enzima specifică, semnal peptidaza. Proteina în curs de sinteză continuă să intre în membrană, ceea ce menţine mereu ribozomul la suprafaţa RE. În afară de excizia secvenţei semnal, proteina poate suferi şi alte modificări, de exemplu glicozilare. Când traducerea este terminată, proteina este eliberată în lumenul RE, unde va rămâne până la transferul de către veziculele de transport. Transportul proteinei prin membrana este cotraducţional pentru că se face în cursul sintezei proteinei. R TA 4.31: Acestea sunt fragmente de reticul endoplasmatic rugos, adică bucăţi de bistrat lipidic împreună cu ribozomii ataşaţi de aceştia care se transformă în vezicule sferice. Aceasta se produce în timpul omogenizării realizată pentru a prepara eşantioanele şi datorită faptului că bistraturile lipidice au tendinţa de a se resuda spontan. R TA 4.32: Procesul de glicozilare care are loc în RER este nespecific în timp ce în aparatul Golgi se adaugă un motiv glicozidic specific. Din catena oligozaharidică achiziţionată în RER sunt eliminate unele resturi glucidice, în timp ce altele sunt adăugate într-o ordine bine determinată. R TA 4.33. Grupările glucidice sunt adăugate în interiorul lumenului reticulului endoplasmatic şi aparatului Golgi, care sunt topologic echivalente cu exteriorul celulei. R TA 4.34: c; 188

Proiectul pentru Învăţământ Rural

Organizarea şi funcţionarea celulei

R TA 4.35. Cu partea extracelulară. Partea Golgi orientată către cisterne devine faţa internă a veziculelor de secreţie şi, după exocitoză, devine faţa externă a membranei plasmatice. R TA 4.36. REN concentrează calciul formând rezerve de calciu intracelular. În celulele endocrine ale gonadelor şi cortexului suprarenal participă la sinteza steroizilor. În celulele ficatului, participă la detoxifierea barbituricelor şi a etanolului. De asemenea este implicat în sinteza anumitor proteine. R TA 4.37. Este produs compusul macroergic numit acid adenozin trifosforic (ATP). R TA 4.38. Aria suprafeţei membranei mitocondriale interne este mare datorită formării de criste. De asemenea, conţinutul proteic al membranei este neobişnuit de mare (> 70%) şi include numeroase enzime şi transportori de electroni. R TA 4.39. a) mama; b) dacă există o anomalie într-o genă mitocondrială, întreaga descendenţă a femelei purtătoare va purta acest defect. Un exemplu îl pot constitui anumite forme de mitocondriopatii. R TA 4.40. De fapt bacteriile nu posedă mitocondrii dar anumite tipuri prezintă invaginări membranare în citoplasmă mai mult sau mai puţin complexe. Funcţia acestora este similară cu a membranei interne mitocondriale. Motivul pentru care mitocondriile se disting de alte structuri membranare din celulele eucariote se poate considera că ţine de originea evolutivă: ele au putut fi iniţial simbionţi intracelulari; separarea spaţială a funcţiilor permite un control mai avantajos (în termenii selecţiei naturale) al diferitelor procese metabolice. R TA 4.41. Proteosinteza mitocondrială este relativ restrânsă fiind sintetizate aproximativ 13 proteine, marea majoritate a proteinelor mitocondriale (în jur de 300 proteine diferite) fiind importate din citoplasmă. Aproximativ 5-10% din proteinele mitocondriale sunt sintetizate in situ. Altele sunt codificate de genomul nuclear şi sintetizate în citosol. Astfel, cele două genoame, mitocondrial şi nuclear, intervin pentru biosinteza proteinelor mitocondriale active. R TA 4.42: e; R TA 4.43:b; R TA 4.44: d; R TA 4.46: d; R TA 4.47: b; R TA 4.48:a; R TA 4.45. Da, deoarece acesta se realizează fie cu ajutorul diferenţei de potenţial (în cazul schimburilor ADP-ATP), fie cu al gradientului protonic (în cazul importului de Pi). R TA 4.49: d; R TA 4.50: b; R TA 4.51: Fo traversează membrana mitocondrială şi membrana tilacoidă a cloroplastului, F1 reprezintă tulpina şi partea inferioară care se extinde de la Fo la matricea mitocondriei şi în stroma cloroplastelor. Complexul Fo furnizează canalul prin care protonii se vor întoarce către matriţă sau stromă. Cuplarea mecanică prin intermediul tulpinii coordonează o rotaţie în interiorul complexului F1 ceea ce determină sinteza ATP. R TA 4.52:a; R TA 4.53:b; R TA 4.54: e; R TA 4.55: În nucleul unei celule eucariote tipice, în interfază, se evidenţiază: a) cromozomii, prezenţi sub forma unor fibre nucleoproteice foarte alungite, cromatina; b) matricea nucleară care este formată dintr-o reţea fibrilară care conţine proteine; c) unul sau mai mulţi nucleoli, structuri amorfe; d) nucleoplasma, substanţă lichidă care conţine toate componentele şi elementele nucleului eucariot. R TA 4.56. Cele mai importante roluri ale ADN sunt: a) codificare şi stocarea informaţiei genetice; b) autoreplicare şi ereditate; c) expresia mesajului genetic şi sinteza de proteine; R TA 4.57. Lamina nucleară reprezintă un suport structural pentru învelişul nuclear şi serveşte la fixarea fibrelor de cromatină la periferia nucleului. Lamina nucleară se dezasamblează şi se asamblează pe parcursul ciclului celular (vezi unitatea 3) R TA 4.58:c; R TA 4.59: vezi unitatea 1; R TA 4.60: b; R TA 4.63: e; R TA 4.64: d; R TA 4.61: Centromerii împart fiecare cromatidă în două cromatide inegale numite braţe. În general, centromerii conţin heterocromatină constitutivă. Proiectul pentru Învăţământ Rural

189

Organizarea şi funcţionarea celulei

R TA 4.62: Telomerii au roluri importante în celulă: a) sunt necesari replicării complete a cromozomului; b) protejează cromozomii de nucleaze şi de alte influenţe destabilizatoare; c) împiedică fuziunea dintre extremităţile cromozomilor în procesele de recombinare; d) facilitează interacţiile dintre extremităţile cromozomilor şi anvelopa nucleară în anumite tipuri celulare. De asemenea, telomerii şi activitatea telomerazei par să fie unii dintre principalii actori implicaţi în procesul de îmbătrânire. R TA 4.65: c; R TA 4.66: eseu de maxim 300 de cuvinte; R TA 4.67: a; R TA 4.68:b; R TA 4.69: d; R TA 4.70: d;

190

Proiectul pentru Învăţământ Rural

Organizarea şi funcţionarea celulei

4.8. Lucrare de verificare 4 V 4.1. Enumeraţi funcţiile membranelor importante pentru viaţa unei celule eucariote. V 4.2. Descrieţi structura şi proprietăţile unui bistrat lipidic. V 4.3. Descrieţi asimetria membranei plasmatice în relaţie cu componentele sale majore: proteine, lipide şi glucide. V 4.4. De ce este importantă fluiditatea membranară pentru o celulă? V 4.5. Cum pot avea cele doua feţe ale bistratului lipidic o sarcină ionică diferită? V 4.6. Cum sunt proteinele aranjate într-o membrană? Care este diferenţa între o proteină transmembranară şi o proteină periferică: V 4.7. Comparaţi şi arătaţi diferenţele între cele patru căi fundamentale diferite pe care le poate urma o substanţă pentru a traversa membrana plasmatică. V 4.8. Descrieţi două căi care utilizează energie pentru a deplasa ioni şi soluţi contra unui gradient de concentraţie. V 4.9. Care dintre următoarele direcţii este calea cea mai probabilă pentru drumul unei vezicule în sistemul endomembranar? a) Golgi →lizozomi→RE→membrana plasmatică; b) tonoplast →membrana plasmatică→înveliş nuclear→RE neted; c) înveliş nuclear→lizozomi→Golgi→membrana plasmatică; d) RE rugos→vezicule→Golgi→membrana plasmatică; e) RE→cloroplaste→mitocondrie→membrana plasmatică. V 4.10. În celulele animale, enzimele hidrolitice sunt „împachetate” pentru a preveni distrugerea generală a componentelor celulare. Care dintre următoarele organite sunt implicate în această compartimentare? a) cloroplast; b) lizozom; c) vacuola centrală; d) peroxizom; e) glioxizom V 4. 11. Care sunt rolurile reticulului endoplasmatic? V 4.12. Care dintre următoarele structuri nu este un componentă a sistemului endomembranar? a) reticulul endoplasmatic; b) vezicule de transport; c) mitocondria; d) învelişul nuclear; e) aparatul Golgi. V 4.13. Care tip celular ar putea asigura cea mai bună oportunitate de a studia lizozomii? a) celulele musculare; b) celulele nervoase; c) celule albe fagocitare; d) celulele frunzelor unei plante; e) celulele bacteriene. V 4.14. Unde este localizată ATP sintaza într-o celula vegetală? a) membrana tilacoidă; b) membrana plasmatică; c) membrana mitocondrială internă; d) A şi C; e) A, B şi C V 4.15. Care dintre următoarele afirmaţii descriu cel mai bine relaţiile dintre fotosinteza şi respiraţie? a) respiraţia este opusul căii biochimice a fotosintezei; b) fotosinteza stochează energia în molecule organice complexe, în timp ce respiraţia le eliberează; c) Fotosinteza are loc numai la plante, în timp ce respiraţia are loc numai la animale; d) moleculele de ATP sunt produse în fotosinteză şi utilizate în respiraţie; e) Respiraţia este un proces anabolic, iar fotosinteza un proces catabolic. V 4.16. Care dintre următoarele perechi este greşită? a) nucleol – ARN ribozomal; b) nucleu – replicarea ADN; c) lizozomi – sinteza proteica; d) membrana celulara – bistrat lipidic; e) citoschelet – microtubuli V 4.17. În ce etapă a mitozei sunt fotografiaţi cromozomii pentru prepararea unui cariotip ? a) profaza; b) metafaza; c) anafaza; d) telofaza; e) interfaza V 4.18. O celula eucariotă care pierde telomeraza va: Proiectul pentru Învăţământ Rural

191

Organizarea şi funcţionarea celulei

a) fi incapabilă de a prelua ADN din mediu de cultură; b) fi incapabilă de a identifica şi corecta nucleotidele greşite în catenele de ADN fiice; c) expune o reducere graduală a lungimi cromozomiale cu fiecare ciclu de replicare; d) are un potenţial crescut de a deveni canceroasă; e) încorporează o nucleotidă externă pentru fiecare fragment Okazaki adăugat. V 4.19. Ce se poate întâmpla dacă o celulă este incapabilă să producă proteine histonice: a) acolo va fi o cantitate crescută de ADN “satelit” produs în timpul centrifugării; b) ADN celular nu poate fi împachetat în nucleii săi; c) fibrele fusului de diviziune nu se vor forma în timpul profazei; d) amplificarea altor gene proteice va compensa scăderea cantităţii proteice în celulă; e) pseudogenele vor fi transcrise pentru a compensa scăderea cantităţii proteice în celulă. V 4.20. Care este diferenţa dintre un centromer şi un kinetocor V 4.21. Multe organisme eucariote au un genom mai mare decât o necesită complexitatea sa. Cum explicaţi acest paradox? V 4.22. Dacă numărul haploid de cromozomi la om este 23 şi cantitatea haploidă de ADN este 1C, caţi cromozomi există în următoarele stadii: metafaza mitotică, profaza I şi anafaza I a meiozei, profaza II şi anafaza II a meiozei? Câte cromatide există în fiecare dintre aceste stadii? Dar cantitatea de ADN? V 4.23. Unitatea de bază a condensării cromatinei este: a) fibra de cromatină de 30 nm b) niveluri succesive de ADN suprarăsucit; c) mai multe filamente suprarăsucite; d) nucleozomul, entitate structurală în care ADN este răsucit în jurul unui octamer de histone; e) domeniul buclat. V 4.24. Care din următoarele afirmaţii este adevărată? a) heterocromatina este compusă din ADN, în timp ce eucromatina este formată din ADN şi ARN; b) heterocromatina şi eucromatina sunt întâlnite în nucleu; c) heterocromatina este formată din cromatină înalt condensată, în timp ce eucromatina este reprezentată din cromatină mai puţin compactă; d) eucromatina nu este transcrisă, în timp ce heterocromatina este transcrisă; e) numai eucromatina este vizibilă la microscopul optic. V 4.25. care sunt consecinţele compactării materialului genetic pentru evoluţia lumii vii?

192

Proiectul pentru Învăţământ Rural

Organizarea şi funcţionarea celulei

4.9. Bibliografie 1. Biologie cellulaire, Jean Michel Petit, Abderrahman Maftah, Raymond Julien, Masson, Paris 1997, Chapitre 4:Membrane et fonctionnement de la cellule 2. Cell Biology, Thomas D. Pollard, William C. Earnshaw, Elsevier, 2004 3. http://www.geniebio.ac-aix-marseille.fr/- Ressources Multimédia en Biochimie Génie Biologique; Biotechnologies 4. http://www.bio.umontreal.ca/cours/Bio-1154/evolution.htm, Biologie cellulaire I 5. http://www.boskitos.com/fac/biocel/ Biologie Cellulaire PCEM1 6. http://www.web-books.com/MoBio/Free/Contents.htm, Molecular Biology Web Book Contents 7. http://www.snv.jussieu.fr/bmedia/sommaires/bc.htm, Biologie Cellulaire 8. http://schwann.free.fr/biocell03.html, Cours de Biologie Cellulaire 9. Biologie moléculaire, Abderrahman Maftah, Raymond Julien, Masson, Paris 1996 10. Biologie Moléculaire et Cellulaire, Exercices et corriges, Nathan Université, 1994 11. Biochimie, génétique, Biologie moléculaire, J Etienne, 3eme édition, Masson, 1996 12: Biologie cellulaire, Thomas D. Pollard, William C. Earnshaw, edition francaise, Elsevier, 2004, Chapitres 17-24: Biogenèse, échanges et fonctions des systèmes membranaires cellulaires 13, The Cell a Molecular Approach, Geoffrey M. Cooper, Robert E. Hausman, third edition, ASM Press, 2004, Part III: Cell structure and function 14. Biologie Cellulaire et Moléculaire, concepts et expériences, Gerald Karp, De Boeck Université, 1998, Chapitre 8: Les systèmes membranaires du cytoplasme: structure, fonction et circulation dans les membranes 15. Essential Cell Biology, An introduction to the Molecular Biology of the Cell, International Student edition, B. Alberts, D. Bray, A. Johnson, J. Lewis, M. Raff, K. Roberts, P. Walter, Garland Publishing Inc, 2004, Chapter 11, 12,13, 14: Membrane structure, transport, energy generation in mitochondria and chloroplast, intracellular compartments and transport 16. Biology, N. A. Campbell, J. B. Reece, William Barstow, Editor, International Edition, Benjamin Cummings, sixth Edition, 2002, Chapter 8,9: Membrane structure and function; Cellular respiration: Harvesting Chemical Energy 17. Test Bank For Biology, N. A. Campbell, J. B. Reece, William Barstow, Editor, , Benjamin Cummings, sixth Edition, 2002, Chapter 8,9: Membrane structure and function; Cellular respiration: Harvesting Chemical Energy 18. Molecular Biology of the Cell, A problems approach, J. Wilson, T. Hunt, Garland Science, Forth edition, 2002 19. http://www.snv.jussieu.fr/bmedia/lafont/sommaires/bc.htm, Méthodes physiques de séparation et d’analyse et méthodes de dosage des biomolécules 20. www.ustboniface.mb.ca, Bienvenue à la page d'accueil pour le cours Biologie 21. Molecular Cell Biology, Lodish, Berck, Zypousky, Matsudaira, Baltimore, Darnell, 4th ed, 2000, Freeman and Company, Chapter 5: Biomembranes and Cell Architecture 22. www.med.univ-angers.fr, Licence de Biologie Cellulaire. 23. web-books.com, Molecular Biology Web Book Contents 24. http://www.cu.lu/labext/rcms/cppe/cellfr.html, CPPE Module S2: Biologie cellulaire 25. http://www.cbc.umn.edu/~mwd/courses.html, Course/Tutorial on Cell Biology 26. http://web.mit.edu/esgbio/www/7001main.html, Hypertextbook Cell Biology 27. http://www.univ-ag.fr/, Cours de Biologie cellulaire 28. www.emc.maricopa.edu/faculty/farabee/BIOBK/BioBook, On-Line Biology Book: 29. http://www.infobiogen.fr/deambulum/index.php, DEAMBULUM - Cours en biologie : Biologie cellulaire, Cycle cellulaire Proiectul pentru Învăţământ Rural

193

Comunicare celulară şi semnalizare

Unitatea de învăţare 5: COMUNICARE CELULARĂ ŞI SEMNALIZARE pag

Cuprins Introducere Obiective Unitatea 1 Informaţii generale despre evaluare 5.1. Moleculele implicate în semnalizare 5.1.1. Liganzi şi receptori 5.1.2. Clasificare hormoni 5.1.3. Mesageri secundari

5.2. Receptorii membranei plasmatice 5.2.1. Receptori cuplaţi cu proteinele G 5.2.1.1 Proteinele G 5.2.1.2. Adenilat ciclaza 5.2.1.3. Fosfolipaza C 5.2.2. Receptorii care formează canale de sodiu şi potasiu 5.2.3. Receptorii cu activitate enzimatică intrinsecă

5.3. Receptorii citoplasmici şi nucleari 5. 4. Răspunsuri şi comentarii la testele de autoevaluare 5.5. Lucrare de verificare 5 5.6. Bibliografie

194

194 195 195 196 197 199 200 202 204 205 205 208 209 210 211 212 215 216 218

Proiectul pentru Învăţământ Rural

Comunicare celulară şi semnalizare

Introducere În acestei unităţi este examinat modul în care celulele comunică prin intermediul moleculelor de semnalizarea extracelulară. Aceste substanţe sunt sintetizate, eliberate de către celule semnalizatoare şi produc un răspuns specific doar la nivelul celulelor ţintă care prezintă receptori pentru moleculele de semnalizare. Un număr mare de substanţe chimice, inclusiv molecule mici (derivaţi ai aminoacizilor, acetilcoline, etc), peptide şi proteine sunt utilizate în acest tip de comunicare celulăcelulă. Produşii extracelulari sintetizaţi de către celulele de semnalizare pot difuza la distanţă sau pot fi transportaţi în sânge, permiţând celulelor să comunice chiar dacă ele se află la distanţe mai mari. Capitolul începe cu o discuţie generală privind moleculele de semnalizare, receptorii de suprafaţă celulară şi rolul moleculelor intracelulare în transducerea semnalului, adică procesul de convertire a semnalelor extracelulare în răspunsuri celulare. Ulterior sunt examinate detaliile privind unele căi de traducere a semnalului, căi implicate în reglarea diferitelor aspecte ale metabolismului, funcţiei şi dezvoltării celulare. Anumite semnale generează modificări la nivelul expresiei genice, morfologiei celulare şi mişcării celulei prin modelarea activităţii diferiţilor factori de transcriere, prin afectarea diferitelor contacte între celule şi între celule şi matrixul extracelular, şi prin remodelarea citoscheletului.

Obiective Unitatea 5 Obiective generale ¾ Dezvoltarea capacităţii de identificarea a principalelor molecule implicate în semnalizare la nivel celular şi intercelular ¾ Înţelegerea noţiunii de receptor celular

Obiective specifice La terminarea studiului acestei unităţi de studiu, trebuie să fiţi capabili să: 9 Cunoaşteţi tipurile de molecule implicate în semnalizare; 9 Identificaţi tipurile de semnalizare şi să caracterizaţi tipurile de mesageri implicate în realizarea fiecăruia (hormoni, mesageri secundari, etc.) 9 Diferenţiaţi noţiunile de ligand şi receptor 9 Identificaţi, clasificaţi şi caracterizaţi tipurile de receptori (receptori din membrana plasmatică şi receptori citoplasmatici şi nucleari)

Proiectul pentru Învăţământ Rural

195

Comunicare celulară şi semnalizare

Evaluarea pe parcurs - Testele de autoevaluare (TA) ¾ Unitatea conţine în structura sa 20 de teste de autoevaluare distribuite astfel încât să asigure o bună fixare a noţiunilor prezentate. ¾ Fiecare test de evaluare se bazează pe parcurgerea şi înţelegerea materialului teoretic prezentat. ¾ Unele dintre testele de autoevaluare sunt întrebări urmate de trei sau patru sau cinci răspunsuri posibile, fiecare indicat cu o literă în dreptul lui. Pentru a răspunde la aceste întrebări, trebuie să încercuiţi litera din dreptul răspunsului pe care îl consideraţi ca fiind corect. ¾ Alte teste vă cer să scrieţi răspunsuri scurte sau să încercuiţi răspunsul corespunzător spaţiilor libere; ¾ Există şi teste de autoevaluare care vor necesita rezolvarea unei probleme sau scrierea unor scurte eseuri prin care să exprimaţi părerea voastră asupra anumitor aspecte. ¾ Răspunsurile la testele de autoevaluare sunt prezentate la sfârşitul unităţii, înainte de lucrarea de verificare 5. Dacă nu reuşiţi să rezolvaţi cu succes testele de autoevaluare în momentul întâlnirii lor pe parcursul parcurgerii testului vă recomandăm să reluaţi întregul material si apoi să reveniţi asupra rezolvării testelor. Unele dintre testele de autoevaluare sunt foarte simple şi direct corelate cu textul parcurs, răspunsul lor fiind evident. Alte teste necesită o bună integrare a cunoştinţelor obţinute şi necesită parcurgerea întregii unităţi. Enunţurile testelor au şi ele rolul lor în fixarea cunoştinţelor şi în formarea unei viziuni de ansamblu asupra materiei. Lucrări de verificare notate de tutore. Gradul de dobândire a conceptelor şi procedurilor prezentate în această unitate de învăţare va fi cuantificat pe baza notei obţinute la Lucrarea de verificare Nr.5 care conţine 20 de probleme. Testele din lucrarea finală sunt de acelaşi tip ca şi testele de autoevaluare pe care le veţi rezolva pe parcursul parcurgerii materialului unităţii 5. Evaluarea răspunsurilor dumneavoastră la lucrarea de verificare 5 va fi realizată de tutore la termenul stabilit de comun acord cu administraţia universităţilor care organizează formarea. Răspunsurile problemelor vor fi transmise direct universităţilor organizatoare. Evaluarea pe parcurs are o pondere de 50% din nota finală. Lucrarea de verificare 5 va reprezenta 5% din verificarea pe parcurs. Cele 20 de întrebări sunt echivalente şi vor fi notat cu 2,5 puncte fiecare, astfel încât pentru o lucrare corectă să puteţi acumula 50 de puncte Materialul conţine 2 cadre suplimentare şi 13 figuri care nu sunt opţionale şi prezintă informaţii menite să întregească sau să clarifice noţiunile ştiinţifice prezentate. Un rezultat bun la lucrarea de verificare este clar condiţionat de parcurgerea cu responsabilitate a testelor de autoevaluare, cadrelor şi de înţelegerea figurilor.

196

Proiectul pentru Învăţământ Rural

Comunicare celulară şi semnalizare

5.1. Moleculele implicate în semnalizare

Nici o celulă nu supravieţuieşte izolată. În toate organismele multicelulare supravieţuirea depinde de o complexă reţea de comunicare intercelulară, care coordonează creşterea, diferenţierea şi metabolismul numărului mare de celule din diferitele ţesuturi şi organe. Comunicarea fizică este asigurată de către membranele plasmatice adiacente sub forma diverselor joncţiuni. Cu ajutorul lor, celulele fac schimburi diverse de molecule, adoptă forme bine definite şi menţin coeziunea tisulară. Celulele comunică mai ales prin molecule extracelulare, de semnalizare. Aceste molecule specifice sunt produse de celule specializate şi după eliberarea lor recunosc şi se fixează la celulele ţintă unde induc un răspuns precis. Comunicarea celulară prin semnalizare are mai multe etape: i) sinteza şi eliberarea de către celulele secretoare a moleculelor semnal; ii) transportul semnalului până la celula ţintă; iii) recunoaşterea şi fixarea semnalului la un receptor al celulei ţintă; iv) transmiterea semnalului de către receptor la efectorii citoplasmatici şi uneori nucleari; v) oprirea semnalului şi răspunsului celular la semnal. În multe microorganisme eucariote (drojdii, mucegaiuri şi protozoare), o serie de molecule secretate coordonează agregarea organismelor unicelulare pentru împerechere sexuală sau diferenţiere în anumite condiţii de mediu. Substanţele chimice eliberate de un organism, care pot influenţa comportamentul sau expresia genică a altor organisme aparţinând aceleiaşi specii se numesc feromoni. La animale şi plante sunt mult mai importante moleculele de semnalizare extracelulară, care controlează procesele metabolice de la nivelul celulelor, creşterea ţesuturilor, sinteza şi secreţia proteinelor, şi compoziţia fluidelor intra- şi extracelulare. Această unitate tratează în special semnalizarea celulă-celulă, în cazul eucariotelor unicelulare precum şi la o varietate de eucariote superioare, în special mamifere. Transmiterea semnalelor este îndeplinită între o celulă secretoare şi una receptoare, distanţa între ele fiind foarte variabilă. Se disting următoarele tipuri de semnalizare: ƒ Semnalizarea endocrină. La animale, celulele endocrine, specializate, care constituie o glandă, secretă hormoni, transportaţi pe cale sangvină până la celulele ţintă (Figura 5.1a). ƒ Semnalizarea paracrină. Celulele secretă mediatori chimici, atât de repede degradaţi sau captaţi încât raza lor de acţiune se limitează numai la celulele învecinate. Cel mai cunoscut exemplu este cel al transmiterii influxului nervos de către neurotransmiţători între două celule nervoase sau între o celula nervoasă şi o celulă musculară (Figura 5.1b).

Proiectul pentru Învăţământ Rural

197

Comunicare celulară şi semnalizare

ƒ Semnalizarea autocrină. Moleculele sintetizate şi eliberate de către celulă acţionează chiar pe receptorii săi (Figura 5.1c). Astfel acţionează o serie de factori de creştere. Acest tip de semnalizare se întâlneşte mai ales la celule tumorale, deoarece în multe dintre ele are loc o supraproducţie şi eliberare a factorilor de creştere care stimulează proliferarea neadecvată şi necontrolată atât a lor cât şi a celulelor netumorale adiacente. Acest proces poate conduce la formarea masei tumorale.

Figura 5.1. Tipuri de semnalizare (prelucrat după Molecular Cell Biology, Lodish, et all. 4th edition, 2000)

Cadru 5.1. De reţinut 1. Anumite molecule de semnalizare pot acţiona după mai multe tipuri de semnalizare în acelaşi timp; 2. Unele molecule nu sunt eliberate de celulele producătoare. Ele acţionează de la nivelul membranei plasmatice, unde sunt prezente, printr-un contact direct între celule; 3. Datorită variabilităţii chimice a moleculelor de semnalizare se foloseşte termenul de ligand. TA 5.1. Care sunt etapele comunicării celulare prin semnalizare? TA 5.2. Semnalizarea paracrină: a) implică celule secretoare care acţionează asupra celulelor din proximitatea lor prin eliberarea unor mediatori chimici eliberaţi în fluidul extracelular; b) necesită celule nervoase care să elibereze neurotransmiţători în interiorul sinapselor; c) apare numai la celule de drojdii paracrine; d) s-a evidenţiat la plante dar nu şi la animale; implică factorii de complementare care se ataşează la celulele ţintă determinând producerea de noi celule paracrine. TA 5.3. Care sunt principalele modalităţi cunoscute de transmitere a semnalelor?

198

Proiectul pentru Învăţământ Rural

Comunicare celulară şi semnalizare

5.1.1. Liganzi şi receptori

Unii compuşi pot acţiona prin 2 sau chiar 3 tipuri de semnalizare celulă-celulă (Figura 5.1d). O serie de derivaţi ai aminoacizilor, precum epinefrina, funcţionează atât ca neurotransmiţători (semnalizare paracrină), cât şi ca hormoni sistemici (semnalizare endocrină). Unii hormoni proteici, precum factorul de creştere epidermic (Epidermal Growth Factor – EGF), sunt sintetizaţi ca parte extracelulară a unei proteine de membrană; EGF membranar se poate lega şi trimite semnalul la o celulă adiacentă prin contact direct. Dacă se realizează proteoliza şi eliberarea lui EGF secretat, acesta poate acţiona asupra celulelor aflate la distanţă, prin intermediul semnalizării endocrine. Liganzii pot fi proteine, peptide, molecule mici derivate de la aminoacizi sau hormoni lipofili cum sunt steroizii. Ligandul poate fi hidrofob, capabil să traverseze membrana plasmatică şi să recunoască ţinte moleculare citoplasmatice sau receptori. Liganzii hidrofili acţionează numai prin interacţie cu receptorii membranei plasmatice. Răspunsul celular la un semnal extern depinde de fixarea ligandului la receptorul membranar sau nuclear al celulei ţintă. Receptorul membranar are trei domenii: extern, transmembranar şi citoplasmatic. Fixarea ligandului la partea externă induce o schimbare de conformaţie care se propagă prin domeniul transmembranar până la domeniul intern citoplasmatic unde va fi catalizată o cascadă de reacţii care determină obţinerea unui răspuns celular la semnal şi care poartă numele de transducerea semnalului. Acelaşi ligand poate provoca răspunsuri diferite dacă se leagă la receptori diferiţi din aceeaşi familie. Astfel, acetilcolina creşte contracţia celulei musculare striate, scade contracţia celulei miocardice şi antrenează secreţia enzimelor digestive din celulele pancreatice. Invers, doi liganzi diferiţi care interacţionează cu receptori diferiţi pot declanşa acelaşi răspuns. Adrenalina şi glucagonul prin fixarea la receptorii lor hepatici induc degradarea glicogenului la glucoza. Aceasta demonstrează ca răspunsul celular la un semnal este definit nu doar de interacţia ligand-receptor, dar şi de efectorul care va fi modificat la final. Fiecare tip celular posedă propriile caracteristici de combinare ligand-receptor care definesc gradul de sensibilitate, şi deci răspunsul. Uneori ligandul are numai funcţia de a se fixa la receptor, şi de a-şi modifica conformaţia astfel încât să îşi manifeste prezenţa intracelular. Localizarea receptorilor depinde de natura ligandului. Când ligandul este hidrofil (hormoni peptidici), receptorul este o proteină din membrana plasmatică. Dacă este hidrofob (hormoni steroizi) difuzează prin membrana plasmatica şi acţionează pe receptori localizaţi

Proiectul pentru Învăţământ Rural

199

Comunicare celulară şi semnalizare

Majoritatea hormonilor intră în una din cele trei mari 5.1.2. Clasificare categorii: i) molecule lipofile de dimensiuni mici, care difuzează prin hormoni membrana plasmatică şi interacţionează cu receptorii intracelulari; ii) molecule hidrofile; iii) molecule lipofile, care se leagă la receptorii suprafeţei celulare (Figura 5.2). Recent s-a demonstrat că oxidul nitric este un reglator cheie ce controlează multe răspunsuri celulare. Hormoni lipofili cu receptori intracelulari. Mulţi hormoni solubili în lipide difuzează prin membrana plasmatică şi interacţionează cu receptori de la nivelul citosolului sau nucleului. Complexele hormon-receptor care rezultă se leagă la regiunile de control ale transcripţiei afectând astfel expresia anumitor gene (Figura 5.2a). Hormonii de acest tip includ: steroizii (cortizol, progesteron, estradiol şi testosteron), tiroxina şi acidul retinoic.

Figura 5.2. Clasificarea hormonilor în funcţie de solubilitate şi de localizarea receptorilor (prelucrat după Molecular Cell Biology, Lodish, et all. 4th edition, 2000)

TA 5.4. O moleculă mică care se leagă specific la una mai mare poate fi definită ca: a) transductor de semnal; b) ligand; c) polimer; d) compus implicat în semnalizarea hormonală; e) marcator al terminării recepţiei unui semnal.

200

Proiectul pentru Învăţământ Rural

Comunicare celulară şi semnalizare

Toţi steroizi sunt sintetizaţi pornind de la colesterol şi au schelet chimic similar. După ce trec de membrana plasmatică hormonii steroizi interacţionează cu receptorii intracelulari, formând complexe care pot creşte sau descreşte rata de transcriere a anumitor gene prin intermediul activării factorilor de transcripţie. De asemenea, aceste complexe receptor-hormon steroid pot afecta şi stabilitatea anumitor molecule de ARNm. Steroizii îşi păstrează acţiunea timp de ore sau zile şi influenţează creşterea şi diferenţierea anumitor ţesuturi. La mamifere estrogenii stimulează creşterea peretelui uterin în procesul de pregătire pentru implantarea embrionului. Tiroxina (tetraiodotironina) şi triiodotironina – principalii compuşi iodaţi ai organismului – sunt formaţi la nivelul tiroidei în urma proteolizei intracelulare a tirogobulinei proteice iodate şi ulterior sunt eliberaţi imediat în sânge. Aceşti doi hormoni tiroidieni stimulează expresia multor enzime citosolice, care catalizează catabolismul glucozei, grăsimilor şi proteinelor, de asemenea creşte expresia enzimelor mitocondriale, care catalizează fosforilarea oxidativă. Retinoizii sunt lipide poliizoprenoidice, derivate de la retinol (vitamina A). Ei prezintă o serie de funcţii reglatorii în diverse procese celulare. Retinoizii reglează proliferarea, diferenţierea şi moartea celulară şi au numeroase aplicaţii clinice. În timpul dezvoltării, retinoizii acţionează ca mediatori locali ai interacţiei celulă-celulă. Hormonii solubili în apă cu receptori de suprafaţă celulară. Deoarece moleculele solubile în apă nu pot difuza prin membrana plasmatică, ele se leagă la receptorii de suprafaţă celulară. Această clasă mare de compuşi este formată din două grupuri: 1) hormoni peptidici, precum insulina, factori de creştere şi glucagon, care au dimensiuni de la câţiva aminoacizi până la structuri proteice mai complicate; 2) molecule de dimensiuni mici încărcate cu sarcină electrică, precum epinefrina şi histamina, derivaţi din aminoacizi şi care funcţionează ca hormoni şi neurotransmiţători. Mulţi hormoni solubili în apă induc o modificare în activitatea uneia sau mai multor enzime prezente le nivelul celulei ţintă. În acest caz efectele hormonilor legaţi la suprafaţă sunt de obicei imediate, însă persistă pentru o perioadă scurtă de timp. Aceste semnale pot induce modificări ale expresiei genice, care pot persista pentru câteva ore sau zile. În alte cazuri, de exemplu diferenţierea celulară, moleculele de semnalizare solubile în apă pot determina modificări ireversibile. Hormoni lipofili cu receptori de suprafaţă celulară. Printre aceştia se numără şi prostaglandinele. Există cel puţin 16 prostaglandine diferite, care sunt clasificate în 9 clase distincte, denumite de la PGA la PGI.

Proiectul pentru Învăţământ Rural

201

Comunicare celulară şi semnalizare

Prostaglandinele fac parte dintr-o familie mare de hormoni cu 20 de atomi de carbon, numiţi eicosanoide. Pe lângă prostaglandine această familie include şi prostacicline, tromboxani şi leucotriene. Eicosanoidele sunt sintetizate dintr-un precursor comun, care este acidul arahidonic. Multe prostaglandine acţionează ca mediatori ai semnalizării autocrine sau paracrine şi sunt degradate în apropierea situsului lor de sinteză. Ele modulează răspunsurile diferiţilor hormoni şi pot avea efecte profunde asupra multor procese celulare. Anumite prostaglandine determină agregarea plachetelor sangvine şi aderarea lor la pereţii vaselor de sânge. Deoarece plachetele au un rol foarte important în formarea cheagului de sânge, prostaglandinele influenţează evoluţia bolilor vasculare şi vindecarea rănilor. Aspirina inhibă ireversibil sinteza acestor molecule. Alte prostaglandine iniţiază contracţia celulelor musculare netede; ele se acumulează la nivelul uterului în perioada de naştere a copilului, având un rol important în inducerea contracţiilor uterine. Studiile recente demonstrează că o familie de steroizi vegetali, numiţi brassinosteroizi reglează multe aspecte ale dezvoltării. Aceşti compuşi lipofili acţionează prin intermediul receptorilor de suprafaţă celulară, asemănător prostaglandinelor. 5.1.3. Mesageri secundari

202

Interacţia ligand-receptor induce producerea de molecule intracelulare care transportă mesajul până la efectorul final. Legarea liganzilor la mulţi dintre receptorii de suprafaţă celulară duce la creşterea sau descreşterea pe termen scurt a concentraţiei moleculelor de semnalizare intracelulare, denumite mesageri secundari: AMPc (Adenozin monofosfat ciclic), GMPc (Guanozin monofosfat ciclic), 1,2 diacil glicerol (DAG), inozitol 1,4,5 trifosfat (IP3) şi ionii de calciu (Figura 5.3). Concentraţia variabilă a uneia sau a mai multor componente de acest tip afectează rapid sau/şi puternic (pozitiv sau negativ) funcţionarea proteinelor ţintă. Moleculele hidrofile produc efecte foarte rapide pentru că acţionează prin modificarea activităţii uneia sau mai multor enzime preexistente. Liganzii hidrofobi au răspunsuri celulare mai lente pentru ca au drept ţintă expresia unei gene şi deci producerea unei proteine. De asemenea, modifică funcţii celulare cum sunt secreţia de proteine sau proliferarea şi diferenţierea celulară. În transducerea semnalului, receptorul de suprafaţă se comportă ca amplificator de semnal. O singura moleculă de ligand fixată produce sute de molecule de mesageri intracelulari. Funcţiile metabolice controlate de mesagerii secundari induşi de hormoni includ preluarea şi utilizarea glucozei, stocarea şi mobilizarea grăsimilor şi secreţia produşilor celulari.

Proiectul pentru Învăţământ Rural

Comunicare celulară şi semnalizare

Aceste molecule intracelulare pot controla proliferarea, diferenţierea şi supravieţuirea celulelor, în special prin reglarea transcrierii genelor specifice. Îndepărtarea (sau degradarea) ligandului sau mesagerului secundar sau inactivarea receptorului de legare a ligandului poate determina terminarea răspunsului celular ca urmare a unui semnal extracelular.

Figura 5.3. Mesageri secundari receptorilor (prelucrat

după Molecular Cell Biology,

Lodish, et all. 4th edition, 2000)

TA 5.5. Testosteronul funcţionează în interiorul unei celule prin: a) activând un receptor semnal care activează proteinele care formează canale ionice; b) legându-se la o proteină receptoare care intră în nucleu şi activează gene specifice; c) acţionând ca un receptor de semnal steroid care activează proteinele care formează canale ionice; d) devenind mesager secundar care inhibă adenilat ciclaza; e) coordonând o cascadă de fosforilare care determină creşterea metabolismului colesterolului. TA 5.6. De obicei procesul de transducere a semnalului începe în momentul în care: a) un semnal chimic este eliberat de o celulă alfa; b) o moleculă semnal modifică un receptor proteic într-un anume mod; c) celulele ţintă se divid; d) al treilea stagiu de semnalizare celulară este realizat; e) hormonul este eliberat din glandă în sânge. TA 5.7. Care dintre următorii compuşi este utilizat ca mesager secundar: a) ionii de calciu; b) AMPc; c) oxidul de azot; d) a şi b) e) a, b şi c. TA 5.8. Factorii de transcripţie: a) reglează sinteza ADN la răspuns la un semnal; b) transcriu ATP în AMPc; c) iniţiază răspunsul epinefrinei în celulele animale; d) controlează care gene vor fi transcrise în molecule de ARNm; e) sunt necesari pentru reglarea procesului de sinteză a proteinelor în citoplasmă. TA 5.9. Majoritatea moleculelor semnal: a) se leagă la situsuri specifice ale receptorilor proteici membranari; b) sunt solubili în apă; c) sunt capabili să treacă prin membrana plasmatică prin transport activ; d) a şi b; e) a, b şi c.

Proiectul pentru Învăţământ Rural

203

Comunicare celulară şi semnalizare

5.2. Receptorii membranei plasmatice

Mecanismele de transducere a semnalului sunt clasificate în patru categorii în funcţie de receptorii membranari. Anumiţi receptori sunt cuplaţi cu proteinele G, unii formează canale ionice şi alţii posedă activitate enzimatică intrinsecă. Legarea ligandului la unii dintre aceşti receptori determină formarea mesagerului secundar, în timp ce legarea ligandului la alţi receptori nu implică acest fenomen. Prin convenţie aceşti receptori au fost împărţiţi în patru clase: i) receptori cuplaţi cu proteine G: în urma legării ligandului este activată o proteină G, care la rândul ei activează sau inhibă o enzimă care generează un anumit mesager secundar sau modulează un canal ionic, determinând o modificare a potenţialului de membrană. Exemplu: receptorii pentru epinefrină, serotonină sau glucagon; ii) receptori canal ionic: legarea ligandului induce modificarea conformaţională a receptorului, determinând intrarea în celulă a diferiţilor ioni; rezultatul acestui flux afectează potenţialul electric de-a lungul membranei celulare. Exemplu: receptorul acetilcolinei de la nivelul joncţiunii nerv – muşchi; iii) receptorii legaţi cu tirozin kinaze: acestora le lipseşte activitatea catalitică intrinsecă, dar legarea ligandului stimulează formarea unui receptor dimer, care ulterior interacţionează şi activează una sau mai multe protein-tirozin kinaze citosolice. În această categorie intră receptorii multor citochine, a interferonilor sau ai factorilor de creştere. iv) receptori cu activitate enzimatică intrinsecă: o serie de tipuri de receptori prezintă activitate catalitică intrinsecă, care este activată în urma legării ligandului. De exemplu, unii receptori activaţi catalizează conversia GTP la GMPc, alţi acţionează ca protein fosfataze, îndepărtând grupările fosfat de la nivelul resturilor de fosfotirozină ale substratelor proteice şi astfel, modificându-le activitatea. Aici se încadrează receptorii pentru insulină şi pentru unii factori de creştere. În majoritatea cazurilor ligandul se leagă sub formă de dimer determinând dimerizarea receptorului şi activarea funcţiei sale kinazice. Aceşti receptori – adesea numiţi receptori serin/treonin kinazici sau receptori tirozin kinazici – îşi autofosforilează resturile de aminoacizi din domeniul citosolic şi de asemenea, pot fosforila diferite substrate proteice.

TA 5.10. Mecanismele de semnalizare folosite de către hormonii steroizi şi receptorii care formează canale ionice sunt ambele foarte simple şi au puţine componente. Pot acestea să determine amplificarea semnalului iniţial. Dacă da, daţi răspunsul sub forma unui eseu de maxim 100 de cuvinte.

204

Proiectul pentru Învăţământ Rural

Comunicare celulară şi semnalizare

5.2.1. Receptori cuplaţi cu proteinele G

Interacţia liganzilor cu anumiţi receptori de la suprafaţa celulei activează proteine de transducere a semnalului, proteine G, care la rândul lor activează enzime care produc mesageri secundari. Mai mulţi receptori diferiţi transmit semnalul prin intermediul proteinelor G (Figura 5.4). Aceşti receptori au caracteristici comune: i) 7domenii transmembranare organizate în α-helix; ii) o extremitate N-terminală extracelulară şi una C-terminală intracelulară; iii) o buclă intracelulară reprezentată de segmentele transmembranare 5 şi 6 care interacţionează cu proteinele G.

Figura 5.4. Receptori cuplaţi cu proteinele G (prelucrat

după Molecular Cell Biology,

Lodish, et all. 4th edition, 2000)

5.2.1.1 Proteinele G

Proteinele G (Guanine nucleotide-binding proteins) sunt proteine care pot să lege GDP şi GTP şi GTP-aze capabile să degradeze GTP la GDP. Această proprietate le conferă capacitatea de a regla diverse procese ca sinteza proteică, asamblarea citoscheletului şi transducerea semnalelor. Proteinele G implicate în transducerea semnalului au o subunitate α (Gα), care fixează GDP sau GTP, şi alte două subunităţi Gβ şi Gγ ale căror funcţii sunt mai puţin cunoscute. Activarea unui receptor, prin legarea unui ligand specific, provoacă eliberarea GDP, fixarea GTP şi disocierea subunităţii Gα-GTP de celelalte. Gα-GTP se separă de receptor şi se va fixa şi activa alte proteine responsabile de producerea mesagerilor secundari. Legarea GTP este efemeră, GTP este rapid hidrolizat la GDP care inactivează subunitatea Gα-GTP. Aceasta se va reforma cu subunităţile β şi γ din proteina G iniţială asociată cu receptorul cu şapte domenii transmembranare (Figura 5.5). Proteinele G au rol important în amplificarea semnalului. Un singur complex ligand-receptor produce mai multe zeci de Gα-GTP. Celelalte reacţii în cascada participă în grade diferite la amplificarea semnalului transmis de un receptor. Proteinele G sunt puternic implicate şi în terminarea semnalului care trebuie să se producă când concentraţia ligandului scade. Când subunitatea Gα fixează GTP, este favorizată disocierea ligand-receptor. Gα-GTP nu fixează GTP decât dacă receptorul a fixat ligandul.

Proiectul pentru Învăţământ Rural

205

Comunicare celulară şi semnalizare

Orice diminuare a concentraţiei ligandului va avea drept consecinţă diminuarea transducţiei semnalului (Figura 5.6).

Figura 5.5. Subunităţile proteinelor G şi activarea acestora(prelucrat după http://www.cbc.umn.edu/~mwd/courses.html)

Figura 5.6. Sistemul proteinelor G prelucrat după http://www.cbc.umn.edu/~mwd/courses.html

TA 5.11. Receptorii cuplaţi cu proteinele G, activează aceste proteine prin reducerea puterii de legare a GDP, care este apoi înlocuită cu GTP, care este prezent în citosol în concentraţii mult mai mari decât GDP. Ce consecinţe poate avea o mutaţie la nivelul subunităţii alfa a proteinelor G care are drept efect reducerea drastică a afinităţii pentru GDP fără efecte asupra celei faţă de GTP?

206

Proiectul pentru Învăţământ Rural

Comunicare celulară şi semnalizare

Cadru 5.2. AMPc, mesager secundar Adenozin 3’,5’ monofosfat ciclic (AMPc) este una din moleculele utilizate ca mesageri secundari în transducerea semnalelor. Ea rezultă din transformarea poziţiei 3’ a ribozei din a doua legatură ester fosfat a ATP de către o enzima membranară, adenilat ciclaza (Figura 5.7). Domeniul catalitic al acestei enzime este citosolic. El devine funcţional prin cuplarea cu subunitatea α a proteinei G, activată prin legarea GTP (Gα-GTP). O singură moleculă de Gα-GTP cuplată cu adenilat ciclaza duce la sinteza a numeroase molecule de AMPc.

AMPc se poate lega la proteine specifice şi le activează funcţia de fosforilare (kinazele). De exemplu, protein kinaza A (protein kinaza dependentă de AMPc) este activată alosteric prin legarea AMPc. Fixarea AMPc pe cele două subunităţi de reglare ale enzimei duce le eliberarea celor două subunităţi catalitice, care devin astfel active. Enzima devine acum capabilă să fosforileze alte proteine cum este cazul cascadei de metabolizare a glicogenului la glucoză (Figura 5.8). AMPc are o durată scurtă de viaţă, este rapid degradat de o fosfodiesterază la AMP (Adenozin monofosfat), moleculă care nu este mesager secundar. Degradarea rapidă a AMPc asigură o terminare rapidă a transducerii semnalului când ligandul nu mai este fixat pe receptorul său (Figura 5.7).

TA 5.12. Explicaţi de ce AMPc trebuie să fie degradat rapid într-o celulă pentru a permite o semnalizare rapidă? TA 5.13. Receptorii membranari care fosforilează anumiţi aminoacizi specifici din propria structură şi din proteine substrat sunt: a) receptori care nu sunt prezenţi la om; b) receptori tirozin-kinazici; c) o clasă de receptori de semnalizare GTP-G; d) asociaţi cu diferite boli provocate de bacterii la oameni; e) importanţi pentru factorii de conjugare la drojdii care conţin aminoacizi. TA 5.14. Amplificarea unui semnal chimic apare în momentul în care: a) un receptor din membrana plasmatică activează diferite molecule de proteine G pe toată durata legării unei molecule semnal la acesta; b) moleculele de AMPc activează o moleculă de protein kinază înainte de a fi transformat în AMP; c) activităţile fosforilazice şi fosfatazice sunt echilibrate; d) numeroşi ioni de calciu trec prin canalul format în urma legării ligandului; e) a şi d sunt adevărate.

Proiectul pentru Învăţământ Rural

207

Comunicare celulară şi semnalizare

5.2.1.2. Adenilat ciclaza

În unul din mecanismele de transducere a semnalului, complexul receptor-ligand activează, prin intermediul proteinei G, o adenilat ciclază care formează mesagerul secundar AMPc pornind de la ATP. Acesta activează în cascadă mai multe alte proteine şi produce răspunsul celular la ligand. Acţiunea AMPc se face prin intermediul protein kinazelor care modifică, la rândul lor, activitatea a numeroase alte enzime, prin fosforilare. Fosforilarea proteinelor se face în cascadă, fiecare etapă fiind asigurată de produsul etapei precedente. Finalul semnalului este asigurat de o fosfodiesterază care converteşte AMPc în AMP. Anumite celule modulează efectul semnalului prin secreţia AMPc în mediul extracelular. Un exemplu îl constituie adrenalina care se fixează la receptorul său hepatic şi induce o degradare a glicogenului la glucoză (Figura 5.8). În alte ţesuturi, interacţia adrenalină-receptor provoacă răspunsuri celulare ca: creşterea contracţiei celulelor miocardice şi relaxarea celulelor musculare netede. Toate aceste răspunsuri au o origine comună şi anume creşterea concentraţiei intracelulare de AMPc.

Figura 5.8. Cascada de degradare a glicogenului indusă de proteine G, adenilat ciclaza şi AMPc (prelucrat după Molecular Cell Biology, Lodish, et all. 4th ed., 2000)

TA 5.15. Enzima glicogen fosforilaza este direct activată de: a) AMPc; b) GTP; c) IP3; d) ionii de calciu; e) protein kinaze.

208

Proiectul pentru Învăţământ Rural

Comunicare celulară şi semnalizare

5.2.1.3. Fosfolipaza C

Alt mecanism de transducere a semnalului are loc prin intermediul receptorilor cuplaţi cu fosfolipaza C şi proteine G. Interacţia ligand-receptor activează proteina G, care la rândul ei activează o enzimă membranară, fosfolipaza C. Enzima hidrolizează un fosfolipid, fosfatidilinozitol 4,5 bifosfat (PIP2) în doi mesageri secundari, DAG, membranar, şi IP3 (Inozitol trifosfat), citosolic. Acesta difuzează în citoplasmă şi se fixează la receptorul său de pe suprafaţa membranei RE. Receptorul este o proteina cu care odată cu fixarea ligandului, IP3, se organizează într-un canal de calciu. Calciul astfel eliberat din RE contribuie la creşterea concentraţiei sale citosolice. Această modificare are ca efect o intrare masivă a calciului extracelular prin numeroase canale ale membranei plasmatice. Fenomenul este numit intrarea calciului capacitiv (Figura 5.9). Oprirea eliberării calciului în citoplasma este asigurată de o hidroliză rapidă şi masivă de IP3 în inozitol 1,4 bifosfat. Calciul citosolic se fixează la o proteină mică, calmodulina şi prelungeşte, sub această formă, semnalul prin modificarea activităţii a numeroase enzime. Creşterea concentraţiei de calciu provoacă secreţia insulinei din celulele pancreatice, contracţia celulelor musculare striate şi degradarea glicogenului în celulele hepatice DAG, provenit din hidroliza PIP2, activează o familie de kinaze numită protein kinaze C (PKC). Aceste proteine, citosolice, se ataşează pe faţa citoplasmatică a membranei când concentraţia calciului intracelular creşte. În contact cu DAG, prezent permanent în membrană, este posibilă activarea PKC. Proteinele active fosforilează numeroase alte proteine ducând la răspunsuri celulare variate.

Figura 5.9. Mecanism de transducere a semnalului prin proteine G, fosfolipaza C, calciu şi AMPc (prelucrat după Molecular Cell Biology, Lodish, et all. 4th ed., 2000

Proiectul pentru Învăţământ Rural

209

Comunicare celulară şi semnalizare

5.2.2. Receptorii care formează canale de sodiu şi potasiu

Exemplul cel mai cunoscut este cel al receptorului acetilcolinei de la nivelul sinapsei (joncţiune între doi neuroni). Este un canal ionic cu 5 subunităţi proteice, fiecare cu 4 domenii transmembranare. Când un semnal electric de la neuronul presinaptic ajunge la sinapsă, el induce eliberarea unui neurotransmiţător, acetilcolina (Figura 5.10). Fixarea acetilcolinei la receptorul post-sinaptic produce modificări conformaţionale ale acestuia care se comportă acum ca un canal ionic care permite afluxul rapid de sodiu în celulă, ceea ce depolarizează membrana. Depolarizarea iniţiază un semnal electric, potenţial de acţiune, care va fi propagat rapid până la sinapsa următoare unde fenomenul se va repeta.

Figura 5.10. Receptorul acetilcolinei de la nivelul sinapsei

(prelucrat după

http://www.infobiogen.fr/deambulum/index.php)

TA 5.16. De ce credeţi că celulele utilizează rezervele de calciu intracelular chiar dacă concentraţia calciului extracelular este nelimitată?

TA 5.17: Care dintre următoarele afirmaţii sunt corecte? Explicaţi răspunsul dumneavoastră. a) moleculele semnal de acetilcolină au efecte diferite pe diferite tipuri celulare într-un organism animal şi se leagă la diferiţi receptori din diferite tipuri celulare; b) după eliberare din celulă acetilcolina are o durată de viaţă mare deoarece trebuie să ajungă la celule ţintă din întreg organismul; c) IP3 este produs direct din PIP2, inozitol fosfolipidul din care este derivat, fără adăugarea unei alte grupări fosfat; d) calmodulina reglează concentraţia intracelulară a Ca2+;

210

Proiectul pentru Învăţământ Rural

Comunicare celulară şi semnalizare

Toţi receptorii din această categorie au un situs extracelular 5.2.3. Receptorii cu pentru legarea unui ligand, un singur domeniu transmembranar αactivitate helix, şi un domeniu citosolic, de mărime variabilă, cu activitate enzimatică enzimatică intrinsecă stimulată de fixarea ligandului. Receptorii intrinsecă factorilor de creştere au un domeniu citoplasmatic cu funcţie protein tirozin kinazică specific. Fixarea ligandului la domeniul extracelular duce la dimerizare. Domeniul catalitic al fiecărui monomer va fosforila resturi de tirozina particulare din domeniul citosolic al celuilalt monomer, autofosforilare. Fosfotirozinele receptorului activat au rol primordial în transducerea semnalului către efectorii citoplasmatici (Figura 5.11). Anumiţi receptori sunt deja sub forma dimeră, dar nu se autofosforilează decât după legarea ligandului. O dată fosforilat, receptorul este capabil să fosforileze, la rândul lui, proteine cheie din metabolismul celular. ANP (ANP = Atrial Natriuretic Peptide), un hormon care controlează volumul sangvin, are un receptor al cărui domeniu citoplasmatic are activitate guanilat ciclazică. Acesta hidrolizează GTP la GMPc imediat după fixarea ligandului. Anumiţi receptori au un domeniu catalitic cu activitate fosfatazică specifică iar alţii sunt protein kinaze specifice pentru resturile Serină/Treonină (Ser/Thr).

Figura 5.11. Transducerea semnalului prin intermediul activităţii tirozin kinazice a receptorului (prelucrat după http://www.infobiogen.fr/deambulum/index.php)

Proiectul pentru Învăţământ Rural

211

Comunicare celulară şi semnalizare

5.3. Receptorii citoplasmatici şi nucleari

O serie de răspunsuri celulare induse de către hormoni rezultă din efectele acestora asupra expresiei genelor. Hormonii steroizi se leagă la receptorii intracelulari şi constituie cel mai simplu exemplu de reglare a expresiei genice de către hormoni extracelulari. O serie de hormoni solubili în apă, factori de creştere şi neurotransmiţători, se leagă la receptorii de suprafaţă celulară şi determină de asemenea schimbări pe termen lung ale comportamentului celular ceea ce presupune în mod clar modificări ale expresiei genice. Mecanismele prin care legarea unui ligand la receptorul suprafeţei celulare induce modificări ale expresiei genice au fost studiate folosind o serie de sisteme model. În cele mai multe din cazuri asocierea ligandului cu receptorul său stimulează protein kinaze care fosforilează, direct sau indirect, resturile de serină, treonină sau tirozină de la nivelul anumitor factori de transcriere. Cele mai utilizate abordări experimentale în studiul acestor căi de semnalizare constau în identificarea genei a cărei expresie este indusă (sau represată), elucidarea secvenţelor ADN reglatoare care acţionează în cis la nivelul genei respective şi identificarea şi clonarea proteinelor înrudite care se leagă specific la aceste secvenţe de ADN. O cale de semnalizare (suprafaţă celulară-nucleu) elucidată prin această abordare o reprezintă legarea interferonului γ la receptorii săi de la suprafaţa celulară. Aceasta induce activarea unei protein tirozin-kinaze citosolice, JAK (din engleză „Just Another Kinase”). JAK activată fosforilează Stat1, un membru al familiei STAT de factori de transcriere (din engleză „signal transducers and activators of transcription”). Ca urmare a fosforilării, Stat 1 dimerizează şi este translocat la nivelul genelor ţintă din nucleu. În mod similar, factorii de transcriere citosolici Smad (mobili) sunt activaţi de către receptori Ser/Thr kinazici care leagă factori de creştere ce aparţin superfamiliei TGFβ (din engleză Transforming Growth Factor β). În alte cazuri, cum sunt căile MAP kinazelor (protein kinaze activate de mitogene), kinaze citosolice activate şi translocate în nucleu modifică direct factorii de transcriere. Kinazele citosolice activate reglează stabilitatea şi localizarea subcelulară a factorilor de transcriere. Cel mai cunoscut exemplu este cel al steroizilor, hormoni care se fixează direct la receptori proteici citoplasmatici. Datorită caracterului hidrofob, aceste molecule sunt adesea transportate de la un ţesut la altul de către proteinele serice. În contact cu celula ţintă, hormonul difuzează prin membrana plasmatică pentru a se fixa la receptorul nuclear.

212

Proiectul pentru Învăţământ Rural

Comunicare celulară şi semnalizare

Complexul ligand-receptor migrează către o regiune specifică a ADN, controlează transcripţia şi reglează expresia uneia sau mai multor gene. Capacitatea genelor de a răspunde la un semnal este asigurată de secvenţe scurte din structura ADN numite HRE (HRE, Hormone Response Elements).

Figura 5.12. Mecanisme de transducţie a semnalului prin intermediul liganzilor hidrofobi (prelucrat după http://www.infobiogen.fr/deambulum/index.php)

Compararea secvenţei în aminoacizi a receptorilor mai multor hormoni care acţionează prin intermediul HRE relevă existenţa unor regiuni peptidice înalt conservate. De exemplu, unele dintre aceste regiuni au o structură particulară cu 8 cisteine (8 Cys) care definesc situsuri de legare pentru Zinc, formând structuri particulare numite „degete Zn” (în engleză „Zn fingers”). Asupra expresiei genelor pot să acţioneze chiar şi liganzii care recunosc receptori de la suprafaţa celulei. AMPc, mesager secundar produs de activarea adenilat ciclazei, activează, prin protein kinaza A, anumite gene graţie secvenţelor ADN numite CRE (AMPc Response Elements) care sunt situsuri de fixare ale factorilor transcripţionali. CREB corelează semnalizarea prin AMPc cu transcrierea În celulele mamiferelor, o creştere a nivelului citosolic de AMPc stimulează expresia mai multor gene. De exemplu, o concentraţie crescută de AMPc induce producerea somatostatinei, o peptidă care inhibă eliberarea diferiţilor hormoni în anumite celule endocrine şi a unui număr de enzime implicate în convertirea compuşilor cu trei atomi de carbon în glucoză (gluconeogeneză) la nivelul celulelor hepatice. Toate genele reglate de AMPc conţin o secvenţă ADN care acţionează în cis, numită element de răspuns la AMPc („cAMP-response element” – CRE). La această secvenţă se leagă forma fosforilată a factorului de transcriere numit CREB („CRE binding protein”).

Proiectul pentru Învăţământ Rural

213

Comunicare celulară şi semnalizare

Legarea diferiţilor neurotransmiţători şi hormoni la receptorii cuplaţi cu proteina G activează adenilat ciclaza, ceea ce conduce la creşterea nivelului de AMPc şi activarea ulterioară a subunităţii catalitice a protein kinazei dependente de AMPc (cAPK). Subunitatea catalitică va fi translocată la nivelul nucleului, unde va fosforila proteine CREB în poziţia serina-133. Proteina CREB fosforilată se leagă la genele ţintă care conţin elementul CRE şi interacţionează şi cu un coactivator, numit CBP/P300. Acesta leagă proteina CREB de factorii de transcriere bazali, şi permit stimularea transcrierii (Figura 5.13).

Figura 5.13. CREB corelează semnalizarea prin AMPc cu transcrierea

TA 5.18. Activarea receptorilor tirozin kinazici este caracterizată de: a) agregare şi fosforilare; b) legarea IP3; c) formarea calmodulinei; d) hidroliza GTP; e) modificarea conformaţiei proteinelor canal. TA 5.19. Moleculele semnal liposolubile, cum este hormonul numit testosteron, traversează membrana tuturor celulelor dar afectează numai activitatea celulelor ţintă deoarece: a) numai celulele ţintă reţin fragmente adecvate de ADN; b) receptorii intracelulari sunt prezenţi numai în celulele ţintă; c) majorităţii celulelor le lipseşte cromozomul Y necesar procesului; d) numai celulele ţintă posedă enzime citosolice care realizează transducerea testosteronului; e) numai celulele ţintă sun capabile ca sub acţiunea testosteronului să iniţieze cascada de fosforilare care conduce la activarea factorilor de transcripţie. TA 5.20. Care dintre următoarele afirmaţii privind receptorii citoplasmatici şi nucleari este falsă: a) hormonii steroizi se leagă la receptorii intracelulari şi constituie cel mai simplu exemplu de reglare a expresiei genice de către hormoni extracelulari; b) asocierea ligandului cu receptorul său stimulează protein kinaze care fosforilează, direct sau indirect, resturile de serină, treonină sau tirozină de la nivelul anumitor factori de transcriere; c) fixarea acetilcolinei la receptorul postsinaptic produce modificări conformaţionale care determină deschiderea unui canal ionic care permite afluxul rapid de sodiu în celulă şi depolarizează membrana; d) AMPc activează, prin protein kinaza A, anumite gene datorită prezenţei secvenţelor CRE din structura ADN, care sunt situsuri de fixare ale factorilor transcripţionali.

214

Proiectul pentru Învăţământ Rural

Comunicare celulară şi semnalizare

5. Răspunsuri şi comentarii la testele de autoevaluare R TA 5.1. Comunicarea celulară prin semnalizare are următoarele etape principale: i) sinteza şi eliberarea de către celulele secretoare a moleculelor semnal; ii) transportul semnalului până la celula ţintă; iii) recunoaşterea şi fixarea semnalului la un receptor al celulei ţintă; iv) transmiterea semnalului de către receptor la efectorii citoplasmatici şi uneori nucleari; v) oprirea semnalului şi răspunsului celular la semnal. R TA 5.2: a); R TA 5.3. Principalele modalităţi de semnalizare sunt: endocrină, paracrină şi autocrină R TA 5.5: b; R TA 5.6:b; R TA 5.7: d; R TA 5.8: d; R TA 5.9: d; R TA 5.10. În cazul receptorului pentru steroizi, se formează un complex steroidreceptor care se leagă la ADN şi activează transcripţia. În acest caz nu poate fi vorba de amplificare între legarea ligandului şi activarea transcripţiei. Activarea se produce mai târziu deoarece în urma transcripţiei se vor forma mai multe copii de ARNm care fiecare este tradusă în proteine. Pentru receptorii care formează canale ionice, un singur canal ionic permite pătrunderea a mii de ioni în timpul deschiderii sale. Este etapă de amplificare în acest tip de sistem de semnalizare. R TA 5.11. O proteină G mutantă va putea fi aproape constitutiv activată (permanent activată) deoarece GDP disociază spontan şi permite GTP să se lege chiar şi în absenţa unui receptor cuplat cu proteine G activat. RTA 5.12. Rapida scindare a AMPc menţine nivele scăzute ale acestui compus. Cu cât nivelul AMPc este mai scăzut, cu atât creşte activitatea adenilat ciclazei care produce noi molecule de AMPc şi implicit transmiterea semnalului este mai rapidă. R TA 5.13: b; R TA 5.14: a; R TA 5.15: e; R TA 5.16. Să ne reamintim că membrana plasmatică reprezintă numai o mică suprafaţă în comparaţie cu suprafaţa membranelor organitelor celulare. Reticulul endoplasmatic este mult mai abundent şi bine reprezentat în întreaga celulă sub forma unei reţele membranare. Această distribuţie permite eliberarea omogenă a ionilor de calciu în celulă. Procesul este important deoarece eliberarea rapidă a ionilor de calciu din citosol de către pompele de calciu, împiedică difuzia calciului pe distanţe semnificative în citosol. R TA 5.17: a) adevărat. De exemplu, acetilcolina descreşte bătăile inimii prin legarea la receptorii celulari cuplaţi cu proteinele G din structura muşchiului cardiac şi stimulează contracţiile celulelor muşchiului scheletic prin legarea la un receptor pentru acetilcolină diferit, care determină deschiderea unor canale ionice; b) fals. Acetilcolina are o durată de viaţă foarte scurtă şi îşi exercită efectele local. Este adevărat că consecinţele prelungirii duratei sale de viaţă sunt dezastruoase. Compuşii care inhibă enzima acetilcolin – esteraza, care în mod normal scindează acetilcolina la nivelul sinapselor nerv-muşchi sunt extrem de toxici; c) adevărat: PIP2 conţine trei grupări fosfat iar IP3 este generat printr-o simplă reacţie de hidroliză; d) fals. Calmodulina sesizează dar nu reglează nivelele intracelulare de Ca2+. R TA 5.18: a; R TA 5.19: b; R TA 5.20: c.

Proiectul pentru Învăţământ Rural

215

Comunicare celulară şi semnalizare

5.5. Lucrare de verificare 5 V 5.1. Cum diferă modalităţile de semnalizare paracrină de semnalizarea endocrină? V 5.2. Cum diferă semnalizarea prin molecule semnal hidrofobe de tipul hormonilor steroizi de semnalizarea prin molecule semnal hidrofile de tipul hormonilor proteici? V 5.3. Explicaţi cum creşterea AMPc în celule poate activa expresia genică. V 5.4. Ce se poate întâmpla cu celulele ţintă dintr-un organism animal care sunt lipsite de receptori pentru substanţele reglatoare locale: a) pot compensa deficienţa prin primirea de nutrienţi prin intermediul unui factor; b) pot dezvolta în schimb răspunsuri normale la neurotransmiţători; c) se pot divide dar nu vor ajunge niciodată la mărimea normală; d) ne putem aştepta să nu se multiplice ca răspuns la factorii de creştere eliberaţi de celelalte celule înconjurătoare; e) hormonii nu vor fi capabili să interacţioneze cu celulele ţintă. V 5.5. Din perspectiva celulelor care primesc mesajul, cele trei stadii ale semnalizării sunt: a) paracrin, local şi sinaptic; b) recepţionarea semnalului, transducerea semnalului şi răspunsul celular; c) recepţionarea semnalului, dezintegrarea nucleului, şi generarea de noi celule; d) alfa, beta şi gama; e) recepţionarea semnalului, răspunsul celular, şi diviziunea celulară V 5.6. Receptorii de tip canal ionic: a) sunt importanţi în sistemul nervos; b) determină schimbări ale concentraţiilor celulare de sodiu şi calciu; c) se deschid şi se închid ca răspuns la un semnal chimic; d) a şi b sunt corecte; e) a, b şi c sunt corecte. V. 5.7. Care dintre următoarele sisteme semnal folosesc receptorii legaţi cu proteine G? a) epinefrina; b) neurotransmiţătorii; c) adrenalina; d) a şi c; e) a, b şi c. V. 5.8. Sistemul de semnalizare al unei celule animale lipsite de capacitatea de a produce GTP: a) nu va fi capabil să activeze şi să inactiveze proteinele G de pe faţa citoplasmatică a membranei plasmatice; b) poate activa numai sistemul epinefrinei; c) a fost descoperit de către Sutherland, care a câştigat premiul Nobel pentru această cercetare; d) va fi capabil să realizeze recepţia şi transducţia dar nu va putea răspunde la semnal. V 5.9. Denumirea generală a unei enzime care transferă grupări fosfat de pe ATP pe o proteină este: a) fosforilază; b) fosfatază; c) protein kinază; d) ATP-ază; e) protează V 5.10. Receptorii de pe membrana plasmatică pentru factorii de creştere sunt cel mai adesea: a) canale ionice determinate de fixarea ligandului; b) receptori cuplaţi cu proteine G; c) AMPc; d) receptori tirozin-kinazici; e) neurotransmiţători. V. 5.11. În general, un semnal transmis prin intermediul fosforilării unor serii de proteine: a) determină modificări conformaţionale pentru fiecare dintre aceste proteine; b) necesită legarea unui hormon la un receptor citosolic; c) nu poate să se producă la drojdii deoarece acestora le lipsesc protein-fosfatazele; d) au întotdeauna drept rezultat activarea enzimelor din celula ţintă; e) permit celulelor ţintă să îşi modifice forma şi în consecinţă şi activitatea. V. 5.12. Calea de transducere a semnalului care la animale foloseşte epinefrină: a) implică activarea scindării glicogenului în celulele ficatului şi ale muşchilor scheletici; b) este un exemplu clasic al semnalizării sinaptice; c) este un exemplu clasic al 216

Proiectul pentru Învăţământ Rural

Comunicare celulară şi semnalizare

semnalizării paracrine; d) operează independent de receptorii hormonali în celulele ţintă; e) nici una dintre aceste afirmaţii nu este caracteristică sistemului epinefrinei. V. 5.13. Care dintre următorii compuşi nu este considerat un mesager secundar? a) AMPc; b) GTP; c) ionii de calciu; d) diacilglicerolul; e) inozitoltrifosfatul. V 5.14. Toate afirmaţiile de mai jos sunt adevărate cu excepţia: a) semnalizarea celulară a fost un eveniment timpuriu în evoluţia vieţii; b) majoritatea receptorilor de semnalizare sunt legaţi de membrana externă a anvelopei nucleare; c) fosforilarea proteinelor este un mecanism major al transducţiei semnalului; d) ca răspuns la un semnal, celula îşi poate altera activităţile prin modificări la nivelul activităţii citosolice sau a transcripţiei ARN. V 5.15. Proteinele G sunt activate când ________ se ataşează la ele. a) AMPc; b) ATP; c) GDP; d) protein kinaza; e) GTP. V 5.16. ATP este transformat în AMPc sub directa acţiune a: a) protein kinazei; b) proteinei G; c) fosfolipazei C; d) moleculelor receptor tirozinkinazice; e) adenilat ciclazei. V 5.17. La ce tip de receptor, legarea unei molecule semnal determină o modificare a potenţialului membranar: a) receptorul tirozin-kinazic; b) receptorii cuplaţi cu proteinele G; c) dimerul tirozinkinazic fosforilat; d) receptori care formează canale ionice la cuplarea cu ligandul; receptorii intracelulari. V. 5.18. Care dintre următoarele afirmaţii privind receptorii cu activitate enzimatică intrinsecă este falsă: a) toţi receptorii din această categorie au un situs extracelular pentru legarea unui ligand, un singur domeniu transmembranar α-helix, şi un domeniu citosolic, de mărime variabilă, cu activitate enzimatică intrinsecă stimulată de fixarea ligandului; b) fixarea acetilcolinei la receptorul post-sinaptic produce modificări conformaţionale care determină deschiderea unui canal ionic care permite afluxul rapid de sodiu în celulă şi depolarizează membrana; c) fixarea ligandului la domeniul extracelular duce la dimerizare; d) prin procesul de autofosforilare, domeniul catalitic al fiecărui monomer va fosforila resturi de tirozină particulare din domeniul citosolic al celuilalt monomer; e) anumiţi receptori au un domeniu catalitic cu activitate fosfatazică specifică iar alţii sunt protein kinaze specifice pentru resturile Serină/Treonină (Ser/Thr). V. 5.19. Care dintre următoarele afirmaţii privind receptorii citoplasmatici şi nucleari este adevărată: a) receptorii membranari şi intracelulari sunt prezenţi numai pe şi în celulele ţintă; b) hormonii steroizi se leagă la receptorii intracelulari şi constituie cel mai simplu exemplu de reglare a expresiei genice; c) numai în celulele ţintă hormonii de tipul testosteronului iniţiază cascade de fosforilare care determină activarea factorilor de transcripţie; d) în contact cu celula ţintă, hormonul difuzează prin membrana plasmatică pentru a se fixa la receptor nuclear; e) a, b şi d sunt corecte. V 5.20. Cascadele de fosforilare care implică participarea unei serii de protein kinaze sunt necesare pentru transducerea semnalului deoarece: a) sunt specie specifici; b) conduc întotdeauna la acelaşi răspuns celular; c) amplifică semnalul iniţial de mai multe ori; d) determină efecte deosebite asupra fosfatazelor; e) numărul de molecule folosite este mic şi fix.

Proiectul pentru Învăţământ Rural

217

Comunicare celulară şi semnalizare

5.6. Bibliografie 1. Biologie cellulaire, Jean Michel Petit, Abderrahman Maftah, Raymond Julien, Masson, Paris 1997, Chapitre 5: Communication cellulaire et signaux 2. Cell Biology, Thomas D. Pollard, William C. Earnshaw, Elsevier, 2004 3. http://www.geniebio.ac-aix-marseille.fr/- Ressources Multimédia en Biochimie Génie Biologique; Biotechnologies 4. http://www.bio.umontreal.ca/cours/Bio-1154/evolution.htm, Biologie cellulaire I 5. http://www.boskitos.com/fac/biocel/ Biologie Cellulaire PCEM1 6. http://www.web-books.com/MoBio/Free/Contents.htm, Molecular Biology Web Book Contents 7. http://www.snv.jussieu.fr/bmedia/sommaires/bc.htm, Biologie Cellulaire 8. http://schwann.free.fr/biocell03.html, Cours de Biologie Cellulaire 9. Biologie moléculaire, Abderrahman Maftah, Raymond Julien, Masson, Paris 1996 10. Biologie Moléculaire et Cellulaire, Exercices et corriges, Nathan Université, 1994 11. Biochimie, génétique, Biologie moléculaire, J Etienne, 3eme édition, Masson, 1996 12: Biologie cellulaire, Thomas D. Pollard, William C. Earnshaw, edition francaise, Elsevier, 2004, Chapitre 25, 26, 27, 28, 29: Reception et transduction des informations environnementales 13, The Cell a Molecular Approach, Geoffrey M. Cooper, Robert E. Hausman, third edition, ASM Press, 2004, Chapter 13: Cell Signaling 14. Biologie Cellulaire et Moléculaire, concepts et expériences, Gerald Karp, De Boeck Université, 1998, Chapitre 15 : La transmission cellulaire : communication entre les cellules et leur environnment 15. Essential Cell Biology, An introduction to the Molecular Biology of the Cell, International Student edition, B. Alberts, D. Bray, A. Johnson, J. Lewis, M. Raff, K. Roberts, P. Walter, Garland Publishing Inc, 2004, Chapter 15: Cell communication. 16. Biology, N. A. Campbell, J. B. Reece, William Barstow, Editor, International Edition, Benjamin Cummings, sixth Edition, 2002, Chapter 11: Cell communication 17. Test Bank For Biology, N. A. Campbell, J. B. Reece, William Barstow, Editor, , Benjamin Cummings, sixth Edition, 2002, Chapter 11: Cell communication 18. Molecular Biology of the Cell, A problems approach, J. Wilson, T. Hunt, Garland Science, Forth edition, 2002 20. www.ustboniface.mb.ca, Bienvenue à la page d'accueil pour le cours Biologie 21. Molecular Cell Biology, Lodish, Berck, Zypousky, Matsudaira, Baltimore, Darnell, 4th ed, 2000, Freeman and Company, Chapter 13: Signaling at the Cell Surface 22. www.med.univ-angers.fr, Licence de Biologie Cellulaire. 23. web-books.com, Molecular Biology Web Book Contents 24. http://www.cu.lu/labext/rcms/cppe/cellfr.html, CPPE Module S2: Biologie cellulaire 25. http://www.cbc.umn.edu/~mwd/courses.html, Course/Tutorial on Cell Biology 26. http://web.mit.edu/esgbio/www/7001main.html, Hypertextbook Cell Biology 27. http://www.univ-ag.fr/, Cours de Biologie cellulaire 28. www.emc.maricopa.edu/faculty/farabee/BIOBK/BioBookCHEM1.html, On-Line Biology Book: 29. http://www.infobiogen.fr/deambulum/index.php, DEAMBULUM - Cours en biologie : Biologie cellulaire 30. www.med.univ-angers.fr, Licence de Biologie Cellulaire Signalisation Intracellulaire et Adressage des Protéines

218

Proiectul pentru Învăţământ Rural

De la celulă la organism

Unitatea de învăţare 6: DE LA CELULĂ LA ORGANISM

6. 7. Bibliografie

pag 219 220 221 222 223 226 227 228 229 229 230 231 231 233 235 235 238 238 243 244 244 246 248 248 249 251 251 253 256 258 262 264 267

BIBLIOGRAFIE MINIMALĂ

268

Cuprins Introducere Obiective Unitatea 6 Informaţii generale despre evaluare 6.1. Adeziunea şi mobilitatea celulară 6.1.1. Caderinele 6.1.2.2. CAM din superfamilia imunoglobulinelor 6.1.3. Rolul moleculelor de adeziune în coeziunea tisulară 6.1.3.1. Joncţiunile „înguste” 6.1.3.2. Joncţiunile de ancorare şi desmozomii 6.1.3.3. Joncţiunile de comunicare („gap”) 6.1.3.4. Bazele moleculare ale mobilităţii celulare 6.1.4. Adeziune celulă-matrice 6.1.4.1. Colagenul şi elastina 6.1.4.2. Proteoglicanii 6.1.4.3. Glicoproteinele extracelulare de adeziune

6.2. Celulele primelor stadii embrionare 6.2.1. Fecundarea 6.2.2. Segmentarea şi reorganizarea celulelor embrionare

6.3. Bazele moleculare ale diferenţierii celulare 6.3.1. Organizarea tipică a unei gene eucariote 6.3.2. Promotori, stimulatori, inhibitori 6.3.3. Diferenţierea rezultă din expresia în cascada a genelor 6.3.4. Morfogeneza 6.3.5. Organogeneza

6.4. Evenimente celulare specializate 6.4.1. Celule stem 6.4.2. Celulele imunitare 6.4.3. Neuronii şi sistemul nervos 6.4.4. Celule tumorale şi cancer 6.5. Răspunsuri şi comentarii la testele de autoevaluare 6.6. Lucrare de verificare 6

Proiectul pentru Învăţământ Rural

219

De la celulă la organism

Introducere În cadrul acestui unităţi de studiu vei putea explora conceptele care privesc întelegerea formării unui organism şi definirea procesului de dezvoltare. Prin mitoze succesive, toate celulele unui organism sunt formate dintr-o celula unică, adesea numită ou sau zigot, rezultată din fuziunea (fecundarea) a două celule specializate, gameţii, produşi de cei doi părinţi. Se formează un embrion, care trece prin diferite stadii de dezvoltare şi care după naştere se dezvoltă şi este supus unor procese de modificare permanente care nu se opresc decât la moartea organismului. Diversitatea şi complexitatea morfologică a plantelor şi animalelelor sunt exemple ale faptului că organismul ca întreg este mai important decât suma părţilor individuale. Formarea diferitelor tipuri celulare ale unui organism constituie diferenţierea şi mecanismele care conduc celulele la organizarea lor pentru a da naştere ţesuturilor şi organelor se numesc morfogeneză şi creştere. Aceste procese asigură funcţiile majore ale tuturor organismelor vii, şi permit la maturitate reproducerea noilor indivizi ai speciei. Această unitate de studiu stabileşte şi clarifică noţiunile privind interacţia celula-mediu, şi trece în revistă moleculele de aderenţă implicate în interacţiile celulă-celulă, celulă-matrice extracelulară şi componentele matricei extracelulare. De asemenea sunt descrise celulele primelor stadii embrionare, diferenţele care există între linia somatică şi cea germinală cu accent pe bazele moleculare ale diferenţierii celulare. O atenţie deosebită se acordă şi evenimentelor celulare specializate care determină formarea celulelor imunitare şi ale sistemului nervos. Unitatea se încheie cu prezentarea câtorva aspecte interesante privind procesele de tumorigeneză.

220

Proiectul pentru Învăţământ Rural

De la celulă la organism

Obiective Unitatea 6

Obiective generale ¾ Utilizarea noţiunilor privind structura şi funcţia diferitelor compartimente celulare în înţelegerea complexităţii structurale şi funcţionale a organismelor; ¾ Formarea capacităţii de înţelegere a morfogenezei individuale pe baza conceptelor diferenţierii celulare; ¾ Înţelegerea individualităţii funcţionale a organismelor ca urmare a derulării evenimentelor celulare specializate;

Obiective specifice La terminarea studiului acestei unităţi de studiu, trebuie să fiţi capabili să: 9 Identificaţi moleculele implicate în procesele de adeziune şi mobilitate celulară; 9 Cunoaşteţi importanţa interacţiilor celulă-celulă şi celulă-matrice în: i) migrarea celulelor imunitare; ii) cursul asamblării ţesuturilor; iii) în menţinerea integrităţii tisulare. 9 Utilizaţi cunoştinţele privind bazele moleculare ale diferenţierii celulare pentru înţelegerea proceselor de morfogeneză şi organogeneză. 9 Integraţi importanţa evenimentelor celulare specializate pentru funcţionarea normală a organismelor şi pentru interacţiile acestora cu mediul înconjurător

Proiectul pentru Învăţământ Rural

221

De la celulă la organism

Evaluarea pe parcurs - Testele de autoevaluare (TA) ¾ Unitatea conţine în structura sa 35 de teste de autoevaluare distribuite astfel încât să asigure o bună fixare a noţiunilor prezentate. ¾ Fiecare test de evaluare se bazează pe parcurgerea şi înţelegerea materialului teoretic prezentat. ¾ Unele dintre testele de autoevaluare sunt întrebări urmate de trei sau patru sau cinci răspunsuri posibile, fiecare indicat cu o literă în dreptul lui. Pentru a răspunde la aceste întrebări, trebuie să încercuiţi litera din dreptul răspunsului pe care îl consideraţi ca fiind corect. ¾ Alte teste vă cer să scrieţi răspunsuri scurte sau să încercuiţi răspunsul corespunzător spaţiilor libere; ¾ Există şi teste de autoevaluare care vor necesita rezolvarea unei probleme sau scrierea unor scurte eseuri prin care să exprimaţi părerea voastră asupra anumitor aspecte. ¾ Răspunsurile la testele de autoevaluare sunt prezentate la sfârşitul unităţii, înainte de lucrarea de verificare 6. Dacă nu reuşiţi să rezolvaţi cu succes testele de autoevaluare în momentul întâlnirii lor pe parcursul parcurgerii testului vă recomandăm să reluaţi întregul material si apoi să reveniţi asupra rezolvării testelor. Unele dintre testele de autoevaluare sunt foarte simple şi direct corelate cu textul parcurs, răspunsul lor fiind evident. Alte teste necesită o bună integrare a cunoştinţelor obţinute şi necesită parcurgerea întregii unităţi. Enunţurile testelor au şi ele rolul lor în fixarea cunoştinţelor şi în formarea unei viziuni de ansamblu asupra materiei. Lucrări de verificare notate de tutore. Gradul de de înţelegere a conceptelor şi noţiunilor prezentate în această unitate de învăţare va fi cuantificat pe baza notei obţinute la Lucrarea de verificare Nr.6 care conţine 40 de probleme. Testele din lucrarea finală sunt de acelaşi tip cu testele de autoevaluarea pe care le veţi rezolva pe parcursul parcurgerii materialului unităţii 6. Evaluarea răspunsurilor dumneavoastră la lucrarea de verificare 6 va fi realizată de tutore la termenul stabilit de comun acord cu administraţia universităţilor care organizează formarea. Răspunsurile problemelor vor fi transmise direct universităţilor organizatoare. Evaluarea pe parcurs are o pondere de 50% din nota finală. Lucrarea de verificare 6 va reprezenta 10% din verificarea pe parcurs. Cele 40 de întrebări sunt echivalente şi vor fi notate cu 2,5 puncte fiecare, astfel încât pentru o lucrare corectă să puteţi acumula 100 de puncte. Materialul conţine patru cadre suplimentare şi 21 de figuri care nu sunt opţionale şi prezintă informaţii menite să întregească sau să clarifice noţiunile ştiinţifice prezentate. Un rezultat bun la lucrarea de verificare este clar condiţionat de parcurgerea cu responsabilitate a testelor de autoevaluare, a cadrelor şi de înţelegerea figurilor.

222

Proiectul pentru Învăţământ Rural

De la celulă la organism

Majoritatea celulele animalelor pluricelulare sunt organizate 6.1. Adeziunea şi în structuri cooperative numite ţesuturi, care la rândul lor se mobilitatea asociază în diverse combinaţii în unităţi funcţionale de dimensiuni celulară mari numite organe.

Frecvent, celule aparţinând unui anumit tip celular se agregă şi formează un ţesut, pentru a coopera în îndeplinirea unei funcţii comune: muşchii se contractă; ţesutul nervos conduce un impuls electric; ţesutul xilem în plante transportă apă. Diferite ţesuturi se pot organiza în formarea unui organ în scopul realizării unor funcţii specifice. De exemplu, muşchii, valvele şi vasele sangvine ale inimii funcţionează corelat pentru a pompa sângele prin organism. Funcţiile coordonate ale multor tipuri de celule din ţesuturi, cât şi a multiplelor ţesuturi specializate, permit organismului să: i) funcţioneze ca un tot unitar; ii) se mişte; iii) metabolizeze hrana; iv) se reproducă; v) desfăşoare alte activităţi esenţiale. Diversitatea şi complexitatea morfologică a plantelor şi animalelor sunt exemple ale faptului că organismul ca întreg este mai important decât suma părţilor individuale. De exemplu, la plante, organizarea rădăcină – tulpină - frunze le permite obţinerea simultană de energie (de la lumina solară) şi carbon (din CO2), din aerul atmosferic, apă şi din nutrienţii din sol. Proprietăţile mecanice distincte ale oaselor tari, încheieturilor flexibile, şi ale muşchilor contractili permit vertebratelor să se mişte eficient şi să prezinte dimensiuni substanţiale. Straturi de celule epiteliale ataşate foarte compact, pot acţiona ca bariere reglabile, cu permeabilitate selectivă, care permit generarea unor compartimente distincte chimic şi funcţional în structura unui organism (exemplu stomacul, circuitul sangvin). Din acest motiv, într-un organism se pot desfăşura simultan funcţii complementare cum sunt digestia şi sinteza. De asemenea, compartimentalizarea permite o reglare mai sofisticată a diverselor funcţii biologice. În multe privinţe, rolul ţesuturilor complexe şi al organelor într-un organism, este analog cu cel al organitelor şi al membranelor într-o celulă individuală. Asamblarea ţesuturilor distincte şi organizarea lor în organe este determinată de interacţii moleculare, la nivel celular, şi nu ar fi posibile fără expresia, reglată temporal şi spaţial, a unui panel larg de molecule de adeziune. De obicei, celulele ţesuturilor sunt în contact cu o reţea complexă de macromolecule extracelulare secretate: matricea extracelulară. Moleculele de adeziune sunt proteine membranare specializate cărora li se datorează aceste interacţii. Ele au rol foarte important în dezvoltarea şi integrarea anatomică a ţesuturilor.

Proiectul pentru Învăţământ Rural

223

De la celulă la organism

Această subunitate de învăţare se ocupă de definirea interacţiilor celulă-mediu şi prezintă moleculele de adeziune implicate în conexiunile celulă-celulă şi celulă-matrice extracelulară. De asemenea sunt descrise unele dintre componentele matricei extracelulare. Celulele dintr-un ţesut pot adera direct una de cealaltă (adeziune celulă-celulă) prin intermediul unor proteine membranare specializate numite molecule de adeziune celulară (CAMs – Celular Adhesion Molecules), care adesea se organizează sun forma unor joncţiuni celulare specializate (Figura 6.1). Celulele din ţesuturile animale aderă indirect (adeziune celula-matrix) şi la componente ale matrixului extracelular prin intermediul unor receptori de adeziune din membrana plasmatică. Aceste două tipuri de interacţii mediază agregarea şi organizarea celulelor în ţesuturi distincte şi susţin transferul bidirecţional al informaţiei între exteriorul şi interiorul celulei.

Figura 6.1. Model de adeziune celulă-celulă (prelucrat după Molecular Cell Biology, Lodish, et all. 4th edition, 2000)

O parte a moleculelor CAM pot fi clasificate în patru mari familii: caderinele, superfamilia imunoglobulinelor (Ig), integrinele, şi selectinele. În figura 6.2 este prezentată structura schematica a unora dintre moleculele CAM. Ele sunt formate prin îmbinarea mai multor domenii distincte, unele dintre aceste domenii aparţinând mai multor tipuri de CAM. O caracteristică a unora dintre aceste proteine sunt domeniile „repetate” deoarece se găsesc în mai multe exemplare în aceeaşi moleculă. Unele din aceste molecule sunt responsabile de specificitatea de legare caracteristică anumitor proteine. Mai există şi alte tipuri de proteine implicate în procesul de adeziune celulară în anumite ţesuturi dar care nu aparţin nici unei clase majore de CAM. 224

Proiectul pentru Învăţământ Rural

De la celulă la organism

Figura 6.2. Familii majore de molecule de adeziune celulară (CAM) şi receptori de adeziune (prelucrat după Biology, N. A. Campbell, J. B. Reece, William Barstow, Ed, International Edition, Benjamin Cummings, 6

th

Edition, 2002)

Moleculele de adeziune pot fi considerate un fel de receptori, adică proteine transmembranare capabile să fixeze un ligand. În general, liganzii care interacţionează cu moleculele de adeziune sunt insolubili. Prin intermediul domeniilor extracelulare, moleculele CAM mediază interacţii de adeziune între celule de acelaşi tip (adeziune homotipică) sau între celule diferite (adeziune heterotipică). O moleculă CAM poate să se lege de acelaşi tip de moleculă aparţinând unei celule adiacente (interacţie homofilică), sau se poate lega de o altă clasă de molecule CAM (interacţie heterofilică). Moleculele CAM pot fi localizate la nivelul regiunilor membranei plasmatice care vin în contact cu alte celule, sau pot fi comasate în regiuni discrete numite joncţiuni celulare. De asemenea, adeziunile celulă-celulă pot fi strânse şi de durată sau slabe şi temporare. De exemplu, adeziunile dintre celulele nervoase din măduva spinării sau dintre celulele hepatice implicate în metabolism sunt foarte strânse. În contrast, între celulele sistemului imunitar din sânge se pot manifesta doar interacţii slabe şi de scurtă durată, permiţând alunecarea şi trecerea acestora prin peretele vaselor de sânge, în timpul unui răspuns imun. TA 6.1. Celulele intră în constituţia ţesuturilor şi ţesuturile intră în constituţia: a) organelor; b) membranelor; c) sisteme de organe; d) organite; e) organisme.

Proiectul pentru Învăţământ Rural

225

De la celulă la organism

6.1.1. Caderinele

Caderinele sunt molecule cheie în procesul de adeziune şi semnalizare celulară, şi joacă un rol critic în diferenţierea tisulară. Sunt glicoproteine care leagă calciul şi asigură o separare spaţială a celulelor dând formă organismului. Există mai multe tipuri de caderine. Unele dintre acestea asigură joncţiunile de aderenţă şi situsurile punctiforme de contact dintre celulele bogate în molecule de aderenţă. La mamifere, se disting trei tipuri majore de caderine: i) caderina epitelială (E-caderina); ii) caderina placentara (P-caderina); iii) caderina neurală (N-caderina) (Tabelul din figura 6.3). Celulele care posedă aceleaşi caderine pot adera unele la altele, dar nu încrucişat. Caderinele au rol important în recunoaşterea selectivă a celulelor embrionare şi stabilesc polaritatea lor celulară. Sunt molecule de adeziune a căror catena peptidică traversează membrana o singura dată. Molecula unei caderine are trei părţi. În regiunea proximală (capătul amino al proteinei) are un situs de legare homofilică adică recunoaşte un situs identic al unei alte caderine care asigura contactul între celule (Figura 6.2). Domeniul transmembranar este continuat cu cel terminal citoplasmatic care interacţionează cu alte tipuri de proteine (cateninele) care asigură joncţiunea între reţeaua citoplasmatică a microfilamentelor de actina. În interiorul celulei, caderinele sunt conectate cu citoscheletul prin doi intermediari: β-catenina şi dimerul de α-actină. Fixarea la citoschelet consolidează legarea celula-celulă. Molecula Distribuţie celulară predominantă Caderina E Preimplantare embrionară, ţesut ne-neural Caderina P Trofoblast Caderina N Sistem nervos, cardiac, muşchi scheletic, retină Figura 6.3. Localizarea moleculelor de caderine majore în ţesuturile mamiferelor

Caderinele „clasice” E, P, N sunt cele mai larg exprimate, în special în diferenţierea timpurie. Straturi de celule epiteliale polarizate, asemănătoare celor care căptuşesc intestinul subţire şi tubulii renali, conţin E-caderina pe suprafaţa lor laterală. Deşi E-caderina este concentrată în joncţiunile aderente, ea este prezentă pe toată suprafaţa laterală se asociază cu membranele celulelor adiacente. Creierul exprimă cel mai mare numar de caderine, probabil datorită nevoii de a forma numeroase contacte specifice celulă-celulă necesare stabilirii reţelei complexe de conexiuni.

226

Proiectul pentru Învăţământ Rural

De la celulă la organism

6.1.2.2. CAM din superfamilia imunoglobulinelor

Moleculele de adeziune stau la baza proceselor care permit circulaţia celulelor sistemului imunitar în ansamblul organelor. Fenomenul de inflamaţie localizată la locul lezării sau infecţiei atrage celulele imunitare competente (monocite, limfocite şi granulocite) necesare declanşării reparaţiei tisulare şi luptei contra agenţilor patogeni. La nivelul situsului inflamat, leucocitele părăsesc circulaţia sangvină şi se infiltrează în ţesutul inflamat. Acest proces debutează cu o legare slabă între leucocite şi celulele endoteliale vasculare, legare în care intervin selectinele (Eşi P-selectine) şi motive glucidice cu rol de liganzi (Figura 6.2). În situaţii normale, această interacţie slabă, combinată cu fluxul sangvin, determină o mişcare de rostogolire a leucocitelor la suprafaţa endoteliului. La locul inflamaţiei, celulele endoteliale eliberează chemokine. Aceste molecule au rolul de a imobiliza leucocitele care se rostogolesc şi favorizează trecerea lor prin endoteliu. De asemenea, sunt activate şi integrinele (Figura 6.2), alte molecule de aderenţă prezente la suprafaţa leucocitelor. Integrinele activate se fixează pe alte molecule de adeziune (I-CAM) puternic exprimate pe endoteliu la situsul inflamaţiei şi provoacă o imobilizare totală a leucocitelor. Prin modificarea formei acestea migrează către ţesuturi trecând prin celulele endoteliale. Ajunse în ţesut, leucocitele asigură două roluri: 1) reconstrucţia ţesutului vătămat; 2) eliminarea agenţilor patogeni în caz de leziune aseptică. Acumularea leucocitelor este rezultatul a două fenomene: i) supraexprimarea selectinelor şi I-CAM pe celulele endoteliale; ii) eliberarea chemokinelor de către aceste celule doar la nivelul situsului inflamat. Integrinele formează o mare familie de molecule de aderenţă. Se găsesc sub forma de heterodimeri compuşi din subunităţi alfa şi beta care prezintă mai multe tipuri susceptibile de a forma diverse combinaţii. Pe leucocite, dar mai ales pe plachetele circulante din sânge, integrinele se găsesc în stare inactivă (nu sunt recunoscute de ligand). Activarea lor ar necesită prezenţa chemokinelor. În cazul celulelor asamblate în ţesut, integrinele sunt mereu într-o stare activă şi permit o bună ancorare celulară.

TA 6.2. Caderinele au rol important în: a) asigurarea funcţionalităţii celulare prin transport de ioni; b) recunoaşterea selectivă a celulelor embrionare şi stabilirea polarităţii lor celulare; c) derularea ciclului celular; d) în asigurarea energiei vitale; e) activarea chemokinelor.

Proiectul pentru Învăţământ Rural

227

De la celulă la organism

6.1.3. Rolul moleculelor de adeziune în coeziunea tisulară

Structura tisulară este activ susţinută de afinitatea dintre celule. Moleculele de adeziune formează baza acestei afinităţi specifice. Ţesutul conjunctiv şi cel epitelial reprezintă două extreme în care matricea şi sistemele de adeziune intercelulară au roluri structurale complet diferite. În ţesuturile conjunctive, matricea extracelulară este abundentă şi suportă cea mai mare parte a tensiunilor la care sunt supuse ţesuturile. Interacţiile între celule sunt limitate. În epiteliile care căptuşesc toate cavităţile şi suprafeţele externe ale corpului, celule sunt strâns asociate în straturi. Matricea extracelulară este puţin abundentă, formând un strat fin, membrana bazală, subiacentă celulelor. Cea mai mare parte a tensiunilor este suportată de către celule. Graţie joncţiunilor celulare specializate, epiteliul şi endoteliul sunt suficient de rezistente pentru a constitui o barieră capabilă să separe două compartimente.

TA 6.3. Sub forma unui eseu de 200 de cuvinte realizaţi o prezentare succintă a moleculelor de adeziune celulară prezentate în curs trecând în revistă principalele roluri ale acestora. TA 6.4. Care sunt moleculele care sunt eliberate la locul inflamaţiei de către celulele endoteliale: a) integrinele; b) caderinele; c) chemokinele; d) selectinele; e) imunoglobulinele. TA 6.5. Câte tipuri majore de caderine există la mamifere şi care sunt rolurile acestora. Joncţiunile intercelulare ale celulelor epiteliale pot fi clasificate în trei grupuri (după ultrastructură şi funcţie): i) joncţiunile „înguste” sau dense („zonula occludens”) capabile să limiteze permeabilitatea epiteliului (sau endoteliului); ii) joncţiunile de ancorare sau aderente („zonula adherens”) şi desmozomii, care permit ataşarea mecanică a celulelor între ele; iii) joncţiunile de comunicare sau „joncţiuni gap”, care permit pasajul semnalelor chimice sau electrice între celule. Dintre cele trei tipuri de joncţiuni prezente în celulele epiteliale, două participa la adeziunea celulă-celulă, şi a treia la adeziunea celulă-matrice. Joncţiunile aderente, care conectează membranele laterale ale celulelor epiteliale adiacente, sunt localizate aproape de suprafaţa apicală, imediat sub joncţiunile dense. O centură circumferenţiară de filamente de actină şi miozină, în complex cu joncţiunile aderente, funcţionează ca un cablu de tensiune care controlează forma celulei.

228

Proiectul pentru Învăţământ Rural

De la celulă la organism

6.1.3.1. Joncţiunile „înguste

6.1.3.2. Joncţiunile de ancorare şi desmozomii

Etanşeitatea epiteliului şi endoteliului este asigurată de joncţiunile „înguste” sau „etanşe” (în engleză „tight”). Ele realizează o apropiere strânsă şi localizată a membranelor celor două celule vecine care limitează considerabil trecerea soluţilor prin spaţiul intercelular (barieră paracelulară). Această barieră obligă solutul să tranziteze stratul celular prin intermediul transportorilor membranari selectivi (transport transcelular). Joncţiunile nu sunt în totalitate etanşe. În funcţie de tipul de ţesut, anumiţi soluţi pot sau nu să o traverseze. Joncţiunile se formează datorită interacţiilor homofile care implică participarea mai multor molecule de adeziune. Numeroasele posibilităţi de combinare ale acestor molecule pot explica diferenţele de permeabilitate ale joncţiunilor „înguste” din diferite ţesuturi. Joncţiunile de ancorare sau aderente permit grupurilor de celule să acţioneze ca unităţi structurale solide în asociere cu elementele citoscheletului la nivelul anumitor celule. La nivelul joncţiunilor de aderare sau „zonula adherens” sunt situsuri de legare pentru filamentele de actina. Desmozomii sunt situsuri de legare pentru filamentele intermediare (de exemplu keratina din celulele epiteliale). Cele două tipuri de joncţiuni sunt conectate cu citoscheletul şi formează centura de aderenţă circumferenţiară în stratul epitelial (Figura 6.4). Principalele molecule CAM din joncţiunile de ancorare şi dezmozomi aparţin familiei caderinelor. La vertebrate şi nevertebrate această familie care cuprinde mai mult de 100 de membri, conţine cel puţin şase subfamilii. Celulele epiteliale şi alte tipuri, precum celule musculare netede, sunt legate strâns împreună prin intermediul desmozomilor punctiformi. Hemidesmozomii, poziţionaţi de obicei pe faţa bazală a celulelor epiteliale, ancorează epiteliul la componentele matricei extracelulare adiacente. Forma şi rigiditatea celulei dar şi întregului epiteliu sunt conferite de mănunchiuri de filamente intermediare, dispuse paralel cu suprafaţa celulară sau care străpung şi interconectează desmozomii punctiformi şi hemidesmozomii. Aceste joncţiuni sunt foarte importante în menţinerea integrităţii epiteliului pielii.

Cadru 6.2. Importanţa complexelor de joncţiune conectate cu citoscheletul În tumorile epiteliale, caderinele îşi pierd funcţia şi, celulele care nu mai conţin joncţiuni intercelulare solide, sunt mai sensibile la semnalele de proliferare (formarea de polipi) şi devin susceptibile la migrare şi deci invadează mai uşor alte ţesuturi (procese metastatice).

Proiectul pentru Învăţământ Rural

229

De la celulă la organism

Figura 6.4. Joncţiunile de ancorare şi desmozomii (prelucrat după http://www.cbc.umn.edu/~mwd/courses.html)

6.1.3.3. Joncţiunile de comunicare („gap”)

În unele regiuni intercelulare membranele plasmatice sunt conectate punctiform prin canale de comunicare realizate prin cuplarea fizică a mai multor celule. Pot trece ioni şi molecule mici de tipul metaboliţilor (glucide, aminoacizi, nucleotide). Joncţiunile de acest tip sunt importante pentru comunicarea intercelulară. Celulele din ţesuturi excitabile, cum este muşchiul cardiac, sunt cuplate printr-un flux rapid de ioni care traversează joncţiunile şi care asigură un răspuns rapid şi sincron la stimuli. Joncţiunile de comunicare sunt esenţiale şi pentru hrănirea celulelor situate la distanţă de vasele de sânge cum sunt cele din cristalin şi din os.

Figura

6.5.

Joncţiuni

de

comunicare

(prelucrat

după

http://www.cbc.umn.edu/~mwd/courses.html)

De asemenea, canalele de comunicare sunt importante în dezvoltare şi diferenţiere. Capacitatea numai a anumitor celule de a forma joncţiuni de comunicare între ele şi nu cu alte celule duce la formarea ansamblurilor celulare cu proprietăţi fiziologice omogene. Această proprietate este importantă în coordonarea dezvoltării embrionului. 230

Proiectul pentru Învăţământ Rural

De la celulă la organism

6.1.3.4. Bazele moleculare ale mobilităţii celulare

În timpul formării embrionului, diversele rearanjamente celulare urmează mecanisme de migrare care pun în joc fenomene fizico-chimice bazate pe existenţa gradientului de concentraţie al moleculelor active şi ionilor. Celulele pot percepe o moleculă de interes prin difuzie şi se pot deplasa către regiunea unde aceasta prezintă un maxim de concentraţie (chimiotactism). Dacă molecula de interes este ataşată la o matrice pe care se deplasează celula, aceasta folosind molecula ca punct de ancorare, atunci sensul deplasării va fi orientat de către concentraţia de suprafaţă. Prin existenţa gradientului de ioni se creează diferenţe de potenţial care generează curenţi electrici. La rândul lor aceştia orientează deplasările celulare. Topografia “terenului” pe care migrează celulele, ghidează şi ea mişcarea prin formarea prelungirilor celulare care asigură contactele de aderenţă care propulsează celula înainte printr-un proces de ataşare/detaşare. Dacă se stabileşte contactul cu o altă celulă, din aceeaşi linie, se produce o oprire a mişcării, cel puţin în direcţia urmată (inhibiţie de contact). Când contactul se stabileşte în toate direcţiile, se observă o oprire completă.

TA 6.6. Câte tipuri de joncţiuni pot fi evidenţiate la nivelul celulelor epiteliale? Descrieţi pe scurt rolul fiecărui tip în funcţionarea celulară.

6.1.4. Adeziune celulă-matrice

Spaţiul extracelular conţine un amestec complex de macromolecule care constituie matricea extracelulară. Anumite celule sunt specializate în producerea matricei extracelulare. De exemplu, fibroblastele sunt implicate în construcţia ţesuturilor conjunctive, condroblastele elaborează cartilajul hialin, osteoblastele produc osul şi sinoviocitele sunt responsabile de producerea lichidului sinovial în articulaţii. La animale matricea extracelulară susţine organizarea celulelor în ţesuturi şi coordonează funcţiile lor celulare, prin activarea căilor de semnalizare care controlează creşterea celulară, proliferarea şi expresia genică. Multe din funcţiile matricei necesită receptori de adeziune transmembranară, care se leagă direct de componentele complexului matricial şi care interacţionează şi cu citoscheletul prin intermediul proteinelor adaptor. Principala clasă de receptori de adeziune care mediază adeziunea celulă-matrice sunt integrinele. În anumite ţesuturi non-epiteliale există şi alte tipuri de molecule care, de asemenea, funcţionează ca receptori de adeziune importanţi. Matricea extracelulară este compusă dintr-un ansamblu de polizaharide şi proteine.

Proiectul pentru Învăţământ Rural

231

De la celulă la organism

Polizaharidele sunt glicozaminoglicani (GAG) conectaţi cu o proteină pentru a forma proteoglicani. În structura proteică a matricei se disting următoarele componente: i) o prima grupă, constituită din colagen şi elastină, responsabile esenţial de structura matricei; ii) o a doua grupă, mai puţin abundentă , constituită din fibronectină şi laminină. Aceasta este implicată mai ales în organizarea structurii şi adeziunea celulă-matrice. Constituenţii se asamblează într-o reţea, membrana bazală, care poate fi laxă, reticulată (ca o plasă), dacă e bogată în colagen, sau suficient de densă, cu aspectul unui film continuu, dacă este bogată în glicoproteine de aderenţă. La animale, epiteliul şi majoritatea grupurilor organizate de celule sunt susţinute sau înconjurate de lamina bazală care este organizată diferit în funcţie de ţesut. În epiteliul columnar sau alt tip (epiteliul intestinal, piele), lamina bazală este un fundament pe care stă doar o faţă a suprafeţei celulelor. În alte tipuri tisulare, cum ar fi muşchi sau ţesutul adipos, lamina bazală înconjoară fiecare celulă. Lamina bazală joacă un rol important în regenerarea ţesuturilor deteriorate cât şi în dezvoltarea embrionară. De exemplu, lamina bazală ajută aderarea celulelor embrionare în embrionii timpurii (embrioni de patru pana la opt celule). Astfel, lamina bazală este importantă pentru: i) organizarea celulelor în ţesuturi; ii) procesul de reparare tisulară; iii) ghidarea migrării celulelor în timpul formării ţesuturilor (Figura 6.6).

Figura 6.6. Lamina bazală este structurată diferit în diferite ţesuturi (prelucrat după Molecular Cell Biology, Lodish, et all. 4th edition, 2000)

232

Proiectul pentru Învăţământ Rural

De la celulă la organism

6.1.4.1. Colagenul şi elastina

Colagenul Toate tipurile de colagen reprezintă o familie de glicoproteine bogate în glicină şi prolină, organizate în fibrile. Reprezintă aproximativ 50% din proteinele organismului şi sunt prezente, în principal, în matricea pielii, tendoane, oase şi vase sangvine. Colagenul este proteina structurală majoră care formează armăturile, conferind rezistenţă tendoanelor, pielii şi organelor interne. În oase şi dinţi, colagenul formează un material structural împreună cu sărurile minerale (calciu si fosfat). Deşi diferă prin anumite caracteristici structurale cât şi prin distribuţie tisulară, toate tipurile de colagen sunt proteine trimere formate din trei lanţuri polipeptidice, numite lanţuri alfa. Toate cele trei lanţuri alfa pot fi identice (homotrimer) sau diferite (heterotrimer). O moleculă trimeră de colagen conţine unul sau mai multe segmente trimere, fiecare cu o structură similară de elice triplă (Figura 6.7). Fiecare catena reprezentată de un lanţ alfa, este răsucită într-un helix de stânga, iar trei astfel de catene reprezentate de trei lanţuri alfa sunt răsucite împreună pentru a forma un triplu helix de dreapta. Proprietăţile care individualizează fiecare tip de colagen se referă, în principal, la diferenţe privind: i) numărul şi lungimea segmentelor triplu helicale; ii) segmentele care flanchează sau întrerup segmentele triplu helicale, şi duc la formarea altor tipuri de structuri tridimensionale; iii) modificările covalente ale lanţurilor alfa (ex. hidroxilare, glicozilare, oxidare, cross-linking).

Figura 6.7. Unitatea structurală de bază a colagenului este tripla elice (prelucrat după Molecular Cell Biology, Lodish, et all. 4th edition, 2000)

Proiectul pentru Învăţământ Rural

233

De la celulă la organism

Fibrele de colagen fac membranele bazale solidare cu ţesutul conjunctiv subiacent. În matricea cartilajului, colagenul este prezent (cu acidul hialuronic şi condroitin sulfat) şi are rolul de a asigura rezistenţa la forţele de tensiune care se exercită în articulaţii. Elastina Buna funcţionare a pielii, vaselor sangvine, plămânilor şi tendoanelor, este strâns legată de elasticitatea lor, pe lângă rezistenţa la tensiune. Elasticitatea este asigurată de o reţea de fibre elastice din matricea extracelulară. Principalele componente ale fibrelor elastice sunt elastina şi fibrilina. Elastina este o proteină foarte hidrofobă. Fibrele sale sunt compuse esenţial din segmente scurte care se asociază prin punţi de lizina la nivelul domeniului elicoidal al proteinei bogat în acest aminoacid. TA 6.7. Care dintre următoarele afirmaţii se corelează mai bine cu prezentarea ţesuturilor conjunctive? Un ţesut conjunctiv conţine: a) o matrice extracelulară care conţine fibre; b) un material suport de tipul condroitin-sulfatului; c) celule de origine epitelială; d) relativ puţine celule şi o cantitate mare de matrice extracelulară; e) atât a cât şi b.

6.1.4.2. Proteoglicanii

Sunt glicoproteine mai particulare în care partea glucidică depăşeşte cantitativ partea proteică. Proteoglicanii sunt un subset de glicoproteine, şi conţin lanţuri de polizarahide specializate, legate covalent, numite glicozaminoglicani (GAG), care sunt reprezentate de polimeri lineari, lungi formaţi din dizaharide specifice repetitive. Astfel fiecare lanţ GAG prezintă mai multe sarcini negative. GAG sunt clasificate în mai multe tipuri majore, în funcţie de natura unităţii repetitive dizaharidice: heparan sulfat, condroitin sulfat, dermatan sulfat, keratan sulfat şi hialuronan. Heparină, forma hipersulfatată a heparan sulfatului, produsă în principal de mastocite, joacă un rol esenţial în reacţiile alergice. De asemenea, este utilizată în medicină ca anticoagulant, datorită capacităţii acesteia de a scinda antitrombina III, un inhibitor natural al coagulării. Biosinteza proteoglicanilor: cu excepţia hialuronanului, majoritatea GAG se găsesc în mod natural în compoziţia proteoglicanilor. Asemănător altor glicoproteine transmembranare, proteinele centrale din proteoglicani sunt sintetizate în reticulul endoplasmatic. Lanţurile de GAG sunt asamblate, pe miezul proteic, în aparatul Golgi.

234

Proiectul pentru Învăţământ Rural

De la celulă la organism

Diversitatea proteoglicanilor. Proteoglicanii constituie un grup remarcabil de molecule, abundente în matricea extracelulară a tuturor ţesuturilor, dar sunt exprimaţi şi la nivelul suprafeţei celulare. Secvenţa şi lungimea miezului proteic al proteoglicanilor variază considerabil, iar numărul lanţurilor GAG ataşate variază de la un număr redus la peste o sută. Chiar mai mult, un miez proteic poate fi legat la două tipuri diferite de lanţuri GAG (exemplu, heparan sulfat şi condroitin sulfat), generând un proteoglican hibrid. Astfel, greutatea moleculară şi sarcina electrică a unei populaţii de proteoglicani poate fi exprimată doar ca o medie deoarece compoziţia şi secvenţa moleculelor individuale poate varia considerabil. Un rol special al proteoglicanilor este să fixeze anumite citokine (factori de creştere implicaţi în mitoză) şi, prin concentrare locală, să favorizeze interacţiile cu receptorii celulelor ţintă. Astfel, GAG au rol esenţial în migrarea celulară în timpul morfogenezei şi cicatrizării tisulare. În cazul unei răni, după coagularea sângelui, primul produs care intră în leziune este acidul hialuronic. Acesta formează un schelet care va servi ca suport pentru leucocite şi fibroblaste în reconstruirea unui ţesut nou. TA 6.8. În componenţa matricei extracelulare se disting următoarele componente proteice: a) colagen şi elastina, responsabile de structura matricei; b) fibronectină şi laminină implicate în organizarea structurii şi adeziunea celulămatrice; c) albumine şi globuline; d) a şi b; e) b şi c.

6.1.4.3. Glicoproteinele extracelulare de adeziune

Sunt molecule mari cu rol important in aranjamentul spaţial al celulelor. Se disting fibronectina şi laminina. Fibronectina este una din moleculele de baza în adeziunea şi mobilitatea celulară care contribuie la organizarea matricei extracelulare. Fibronectina, constituită din două subunităţi α şi β reunite printr-o punte disulfurică, formează o reţea fibrilară care conectează celulele la colagen şi proteoglicani. După sinteză, proteina este eliberată în mediul extracelular sub formă globulară solubilă. Contactul cu integrinele liniarizează molecula, care se poate asocia, cu omologii săi şi cu alţi compuşi ai matricei extracelulare. Fibronectina are rol important în ghidarea celulelor în migrarea embrionară la vertebrate în toate stadiile embriogenezei. La adult, fibronectina are rol central în procesele de cicatrizare.

Proiectul pentru Învăţământ Rural

235

De la celulă la organism

Laminina este constituentul esenţial al membranelor bazale. Este responsabilă de densitatea membranei bazale (formarea unui film). Ca şi fibronectina, conectează celulele la colagen şi proteoglicani şi are rol în asamblarea matricelor, adeziune şi mobilitate. Receptorii celulari de adeziune sunt prezenţi în membrana plasmatică a celulelor şi asigură fixarea celulei la componentele matricei extracelulare. Cei mai cunoscuţi sunt receptorii pentru fibronectina şi glicoziltransferazele. Receptorii fibronectinei fixează la exterior fibronectina şi în interior se leagă la proteinele citoscheletice, realizând un fel de punte între cele două tipuri de reţele moleculare. Sunt numiţi şi integrine datorită capacităţii lor de a forma legături între matricea extracelulară şi citoschelet. Fiecare moleculă de integrină are două subunităţi α şi β care se combină diferit pentru a se lega, cu afinităţi variabile, la colagen, laminină şi fibronectină. Cuplarea integrinelor cu liganzii lor este dependentă de cationii bivalenţi extracelulari (Mn2+ sau Ca2+). Glicoziltransferazele: sunt enzime prezente pe membrana plasmatică ca urmare a unui proces de export care implică RE şi mai ales aparatul Golgi. Aceste enzime ancorate în membranele golgiene au situsul catalitic orientat către lumenul aparatului Golgi. Sunt implicate în transferul glucidelor activate (UDP-glucoza, GDPfucoza, CMP-acid sialic, etc.) pe proteine în curs de modificare post-translaţională (viitoare glicoproteine). Ulterior, acestea pot fi apoi exportate prin exocitoza veziculelor golgiene la suprafaţa celulei, unde sunt implicate în procesele de recunoaştere celulară şi adeziune la matricea extracelulară. Prin proteoliză, pot fi detaşate de membrană şi eliberate în mediu unde se comportă ca lectine (proteine care recunosc situsuri glucidice). S-a constatat că adăugarea glucidelor activate în primele stadii de dezvoltare ar putea perturba profund embriogeneza normală. De asemenea, studiile au arătat că celulele care se deplasează lasă în urmă substrate glicozilate, dovadă a rolului glicoziltransferazelor în mobilitatea celulară. Traficul limfocitelor circulante prin organism, depozitarea lor ganglionară sau extravazarea către focarele de infecţie sunt alt exemplu al rolului glicoziltransferazelor (în acest caz, fucoziltransferaze) în adeziunea şi mobilitatea celulară.

236

Proiectul pentru Învăţământ Rural

De la celulă la organism

Un alt aspect al adeziunii şi mobilităţii celulare, este rolul enzimelor numite metaloproteinaze de degradare a matricelor. Aceste proteaze (colagenaze, gelatinaze, stromelizine, etc.) sunt secretate de celule şi acţionează direct asupra componenţilor matricei extracelulare pe care o degradează parţial. Astfel, se creează pasaje pentru înaintarea celulelor în mişcare, sau detaşează părţi ale ţesuturilor devenite inutile. În cursul dezvoltării, genele acestor enzime şi inhibitorilor lor sunt activate ciclic, ceea ce asigură un control permanent al formării şi degradării matricelor extracelulare.

TA 6.9. Ce tipuri de compuşi secretă fibroblastele? a) grăsimi; b) condroitin sulfaţi; c) fluide interstiţiale; d) fosfat de calciu pentru oase; e) proteine pentru structurarea ţesutului conjunctiv. TA 6.10. Pentru care tip de ţesut animal poate fi caracteristică descrierea de „stratificat columnar”? a) conjunctiv; b) muşchi striat; c) nervos; d) epitelial; e) osos. TA 6.11. Care dintre următoarele fibre sunt responsabile pentru rezistenţa structurală a tendoanelor? a) fibrele de elastină; b) fibrele de fibrină; c) fibrele de colagen; d) fibrele reticulare; e) fibrele fusului de diviziune. TA 6.12. Dacă vă trageţi de lobul urechii acesta nu va suferi alungire deoarece în structura sa sunt prezente: a) fibre de colagen; b) fibre de elastină; c) fibre reticulare; d) ţesut adipos; e) proteine fibroase de tipul keratinei. TA 6.13. Anumite joncţiuni intercelulare au forma unor centuri, în timp ce altele implică zone limitate. Care este relaţia între aceste două tipuri de dispunere celulară şi funcţiile acestor joncţiuni. TA 6.14. Prin ce se aseamănă din punct de vedere structural matricele extracelulare din structura ţesuturilor animale şi din peretele celular al plantelor? TA 6.15. Evidenţiaţi diferenţele care există între rolul colagenului, proteoglicanilor şi fibronectinei în spaţiul extracelular. TA 6.16. Realizaţi un eseu privind modalităţile prin care o proteină de la suprafaţa celulei poate fi implicată în adeziunea dintre celule şi în transmiterea de semnale intermembranare. Puteţi utiliza şi materiale de documentare suplimentare cursului.

Proiectul pentru Învăţământ Rural

237

De la celulă la organism

6.2. Celulele primelor stadii embrionare

Studiul celulei şi cunoaşterea procesului de dezvoltare sunt esenţiale pentru înţelegerea formării unui organism. Prin mitoze succesive, toate celulele unui organism provin dintr-o celula unică, adesea numită ou sau zigot, rezultată din fuziunea (fecundarea) a două celule specializate, gameţii, produşi de cei doi părinţi. Se formează un embrion, care trece prin diferite stadii de dezvoltare şi care, după naştere, se dezvoltă şi este supus unor procese de modificare permanente care nu se opresc decât la moartea organismului. Formarea diferitelor tipuri celulare ale unui organism constituie procesul de diferenţiere iar mecanismele care conduc celulele la organizare în ţesuturi şi organe se numesc morfogeneză şi creştere. Aceste procese asigură o funcţie majoră pentru orice organism viu, aceea de a permite la maturitate reproducerea noilor indivizi ai speciei. Acest lucru este posibil pentru că în noul organism se izolează o linie celulară particulară care stă la originea gameţilor, linie germinală, diferită de toate celelalte linii celulare, care stau la originea ţesuturilor şi organelor, desemnate colectiv prin termenul de linie somatică. Este vorba de o diferenţiere celulară majoră în dezvoltarea organismului. Procesul se realizează foarte timpuriu, de la primele diviziuni embrionare ale organismului şi este rezultatul a trei faze care urmează fecundării: 1) faza de segmentare: plecând de la zigot se formează, prin diviziuni succesive, primele celule embrionare, blastomere, organizate într-o psuedosferă, blastula, care, adesea, are o cavitate internă sau blastocel; 2) faza de gastrulare: prin rearanjamente şi mişcări diverse, blastomerele se organizează în trei regiuni, foiţele germinative sau ţesuturile primordiale: ectoderm, mezoderm şi endoderm. 3) organogeneza: prin interacţii celulare complexe şi noi rearanjamente se formează diversele organe.

6.2.1. Fecundarea

Prin fuziunea a doi gameţi, mascul şi femel, fecundarea asigură combinarea genelor parentale şi formarea unui nou organism. Se disting următoarele etape: i) stabilirea contactului între cele două celule (ovul şi spermatozoid); ii) pătrunderea spermatozoidului în ovul (ovocit); iii) fuziunea celor două cromatide; iv) stimularea metabolismului zigotului, prealabilă dezvoltării

TA 6.17. Dintre următoarele caracteristici una este unică pentru organismele animale: a) gastrularea; b) structura multicelulară; c) reproducerea sexuală; d) sperma flagelată; e) nutriţia heterotrofă.

238

Proiectul pentru Învăţământ Rural

De la celulă la organism

Spermatogeneza, producerea de celule spermale este un proces continuu şi prolific care are loc în masculul adult. Spermatogeneza apare în tubulii seminiferi din testicule. În figura 6.8 este descris procesul în detaliu. Celulele stem care dau naştere la spermă, spermatogoniile, sunt localizate la periferia fiecărui tubul seminifer. Dezvoltarea celulelor spermale se deplasează către lumenul tubulului unde suferă meioză şi diferenţiere. Cele patru celule rezultate din meioză se transformă în celule mature spermale (Figura 6.8).

Figura 6.8. Spermatogeneza (prelucrat

după Biology, N. A. Campbell, J. B. Reece, William

Barstow, Ed, International Edition, Benjamin Cummings, 6

th

Edition, 2002)

Spermatozoidul posedă un nucleu cu n cromozomi, un sistem de locomoţie care asigură deplasarea celulei (flagel) şi o vezicula acrozomială care conţine enzime litice (proteaze şi glicozidaze) care digeră învelişul extern al ovocitului. Citoplasma sa redusă la extrem conţine încă mitocondrii care asigură producerea energiei necesare deplasării (Figura 6.9). Partea motrice a flagelului, axonema este compusă din microtubuli constituiţi din filamente de tubulină. Acestea sunt aranjate în nouă dublete de microtubuli periferici plus două centrale şi legate între ele printr-o proteină de tip histonă H1 (nexina).

Proiectul pentru Învăţământ Rural

239

De la celulă la organism

O alta proteină, ataşată dubletelor, dineina, este capabilă să convertească energia chimică a ATP în energie mecanică pentru deplasare.

Figura 6.9. Structura unei celule spermatice umane (prelucrat după Biology, th N. A. Campbell, J. B. Reece, William Barstow, Ed, International Edition, Benjamin Cummings, 6 Edition, 2002)

Ovogeneza reprezintă dezvoltarea ovocitelor mature, care sunt celule ou nefertilizate. Procesul de dezvoltare are loc în ovar (Figura 6.10). În timpul dezvoltării embrionului femel, celulele stem dau naştere unui număr mare de ovule care intră în meioză, dar procesul se opreşte în profaza I. Celulele în acest stadiu se numesc ovocite primare, care rămân în stare staţionară în interiorul foliculelor mici până la pubertate când sunt reactivate de către hormoni. FSH (pentru „Follicle stimulating hormone”) stimulează periodic un folicul să crească şi să determine ovocitele primare să definitiveze meioza I şi să pornească meioza II. Meioza se opreşte din nou dând naştere ovocitelor secundare care sunt eliberate în timpul ovulaţiei. La oameni, penetrarea celulei ou de către spermatozoid determină completarea meiozei, ovogeneza fiind completă numai în acest moment. Între ovogeneză şi spermatogeneză există următoarele diferenţe majore: i) în timpul diviziunii meiotice a ovogenezei, citocineza este inegală, cu aproape toată citoplasma monopolizată de o singură celulă fiică, ovocitul secundar. Această celulă mare va da naştere ovulului; produşii meiozei, celule mai mici numite corpi polari degenerează. Aceasta contrastează cu spermatogeneza, când toţi cei patru produşi ai meiozei se dezvoltă în spermatozoizi maturi (Figura 6.10); ii) în timp ce, celulele din care se formează sperma continuă să se dividă prin mitoză în timpul vieţii masculului, nu la fel se întâmplă şi în cazul ovogenezei femele. La naştere un ovar conţine deja toate ovocitele primare pe care le va poseda acel organism;

240

Proiectul pentru Învăţământ Rural

De la celulă la organism

iii) ovogeneza prezintă perioade lungi de „aşteptare” în timp ce spermatogeneza, care produce sperma matură din celule precursoare, este un proces continuu.

Figura 6.10. Etapele ovogenezei (prelucrat

după Biology, N. A. Campbell, J. B.

Reece, William Barstow, Ed, International Edition, Benjamin Cummings, 6

th

Edition, 2002)

Ovulul este mult mai mare decât spermatozoidul (aproximativ de 10000 de ori) pentru că îşi conservă citoplasma unde păstrează, în rezervă, toţi constituenţii necesari primelor stadii de dezvoltare, chiar dacă (ca şi spermatozoidul) are doar n cromozomi, ca urmare a reducerii cromatinei în meioză II. La vertebrate acest proces intervine după intrarea spermatozoidului în ovul (Figura 6.10). În jurul membranei plasmatice se găsesc învelişuri protectoare: membrana sau zona pellucida (ZP) la mamifere şi câteodată celule hrănitoare (celule cumulus). TA 6.18. La animale, celulele somatice rezultă în urma mitozei şi _________ rezultă în urma meiozei. a) gameţii; b) clonele; c) zigoţii; d) sporii; e) celulele diploide

Proiectul pentru Învăţământ Rural

241

De la celulă la organism

Uniunea celor două celule La mamifere, pentru eliberarea genomului său haploid, spermatozoidul trebuie să depăşească o primă barieră, celulele hrănitoare, apoi să se ataşeze şi să depăşească cele două bariere proprii ovulului: zona pellucida (ZP) şi membrana plasmatică. Pentru acest proces sunt necesare şase etape (Figura 6.11): 1) ataşarea acrozomului la ZP; 2) producerea reacţiei acrozomiale, care presupune o exocitoză prin fuziunea membranelor acrozomului şi spermatozoidului cu eliberarea conţinutului enzimatic pentru a asigura penetrarea ZP; 3) penetrarea ZP; 4) ataşarea de membrana ovulului; 5) fuziunea cu membrana ovulului. 6) aceste ultime etape activează ovulul către dezvoltare şi îl fac refractar la orice altă nouă intrare a unui spermatozoid.

Figura 6.11. Etapele unirii spermatozoidului cu ovulul (prelucrat după Biology, N. A. Campbell, J. B. Reece, William Barstow, Ed, International Edition, Benjamin Cummings, 6

th

Edition, 2002)

Adeziunea la zona pellucida: este specie specifică, şi rezultă din acţiunea unei glicoproteine numită ZP3, care este recunoscută de proteine specifice ale spermatozoidului. Trei proteine ale spermatozoidului sunt candidate pentru a realiza această interacţie cu ZP3. Această cuplare a uneia sau mai multor proteine la ZP3 activează o cale de semnalizare care controlează intrarea calciului, indispensabilă reacţiei acrozomiale. TA 6.19. Enumeraţi etapele necesare procesului de unire a ovulului cu spermatozoidul

242

Proiectul pentru Învăţământ Rural

De la celulă la organism

Reacţia acrozomială: este obligatorie pentru transformarea spermatozoidului într-o celulă aptă să fuzioneze. În afară de eliberarea enzimelor litice indispensabile penetrării zonei pellucida de către spermatozoid, reacţia acrozomială remodelează suprafaţa spermatozoidului, proteinele membranare îşi modifică aranjarea şi activitatea astfel încât să menţină aderenţa şi să favorizeze fuziunea. Această reacţie este caracterizată de intrarea masivă a calciului extracelular în celulă. Mecanismele exacte ale semnalizării care provoacă şi acompaniază intrarea sunt numeroase şi pentru moment ipotetice. Fuziunea gameţilor: la mamifere, mai multe proteine de la suprafaţa spermatozoidului sunt implicate în fixarea şi fuziunea la membrana plasmatică a ovulului. Cel mai bine este caracterizat complexul numit fertilina. Aceasta se fixează la o integrină a membranei plasmatice şi, asemeni fixării la zona pellucida, la proces vor participa proteine adiţionale transmembranare cu un domeniu metaloproteinazic care să asigure fixarea şi fuziunea cu membrana plasmatică. În final, fuziunea spermatozoidului cu ovulul provoacă emiterea unui semnal care activează dezvoltarea. Se observă: i) o creşterea a calciului intracelular; ii) o exocitoză a granulelor corticale, urmarea meiozei, oprită în ovulul nefecundat; iii) mobilizarea ARNm materni prezenţi în citoplasmă; iv) demararea unui ciclu celular mitotic. Prin schimbarea rapidă a potenţialului electric membranar, ovulul fecundat blochează toate posibilităţile de polispermie. Acest blocaj este urmat de o exocitoză a granulelor corticale care, prin eliberarea diverselor enzime, provoacă o modificare a spermatozoizilor şi îi face inapţi de funcţionare.

6.2.2. Segmentarea şi reorganizarea celulelor embrionare

Dezvoltarea începe cu segmentarea, o suită de diviziuni mitotice, graţie cărora citoplasma ovulului se divide într-un număr mare de celule, mai mici şi nucleate, numite blastomere. Nu există fază de creştere celulară între diviziuni, astfel încât, embrionul care se formează treptat, are o talie care evoluează puţin. La majoritatea speciilor animale (cu excepţia mamiferelor), aceste prime stadii sunt dirijate de proteine şi ARNm produşi de celulele hrănitoare şi acumulaţi în ovocit, în timp ce genele din nucleul zigotic rămân silenţioase. În cursul segmentării, raportul volumelor citoplasmei şi nucleului se reduce până în momentul în care genele zigotice încep să fie transcrise. Blastomerele devin capabile de deplasare şi reorganizarea celulelor poate începe. Au fost descrise numeroase tipuri de segmentare cu planuri de diviziune paralele, perpendiculare sau chiar oblice la ariciul de mare, moluşte şi batracieni.

Proiectul pentru Învăţământ Rural

243

De la celulă la organism

În numeroase cazuri celulele adoptă aranjarea cea mai stabilă termodinamic. La mamifere, se observa un fenomen unic numit compactare care le diferenţiază de alte animale. Blastomerele în stadiu de opt celule se strâng puternic una lângă alta, suprafeţele de contact se intersectează iar celulele externe izolează progresiv celulele interne care vor forma un agregat celular şi o cavitate, numită blastocel. Formarea a trei ţesuturi primordiale: ectoderm, mezoderm, endoderm este rezultatul unei organizări spectaculare a celulelor embrionare care achiziţionează noi poziţii pentru a defini planul unui organism cu mai multe straturi celulare. Celule din interiorul embrionului formează endodermul şi mezodermul iar cele care rămân la exterior vor forma ectodermul care va da naştere la piele şi sistemul nervos. Deci, cele trei foiţe primordiale ectoderm (extern), mezoderm (intermediar) şi endoderm (intern) vor lua naştere în cursul acestei faze, numită gastrulare. Toate aceste rezulta în urma combinării mai multor tipuri de mişcări celulare: epibolie (mişcare coordonată de încercuire), invaginare (pătrunderea unei regiuni celulare în alta), involuţie (mişcare celulară către interior totul rămânând ataşat la faţa internă a celulelor externe), ingresiune (migrări individuale către interior), delaminare (separarea foiţelor celulare). Cu toate că genomii lor sunt identici (provenind toţi prin 6.3. Bazele mitoza zigotului), celulele somatice se diferenţiază în cursul moleculare ale diferenţierii celulare dezvoltării sub acţiunea genelor particulare, a căror stimulare (care duce la formarea de proteine diferite) exercită un control diferenţial la mai multe niveluri: i) alegerea genelor transcrise; ii) traficul şi localizarea ARNm; iii) intervalul de timp care se stabileşte pentru fiecare ARNm între formarea şi traducerea sa în proteine (stocare temporară); iv) prin modificarea (degradarea) proteinelor, singurele care acţionează efectiv în celulă 6.3.1. Organizarea tipică a unei gene eucariote

244

Mărimea şi complexitatea genomilor la eucariote este formidabilă. Secvenţa nucleotidică a unei gene şi a segmentelor care o flanchează nu ne furnizează informaţii privind: i) modul de acţiune al genei; ii) modului de reglare a expresiei sale în timpul dezvoltării şi diferenţierii celulare şi nici în cazul adaptării la modificările de mediu; iii) modul în care expresia genelor este coordonată pentru a asigura echilibrul fiziologic caracteristic al celulelor şi organismelor sănătoase; iv) cum apariţia unui produs al genei sau variaţia vitezei de expresie a unei gene pot afecta funcţionarea normală sau pot determina maladii.

Proiectul pentru Învăţământ Rural

De la celulă la organism

Chiar înainte de cunoaşterea structurii genelor eucariote şi procariote, se ştia că sistemele genetice procariote şi eucariote posedă proprietăţi fundamentale comune. În cele două cazuri materialul genetic este ADN, replicarea este semiconservativă, fluxul de informaţie genetică este direcţionat de la ADN către ARN şi proteine şi codul genetic este universal. Pare rezonabil să considerăm că organismele eucariote, mai ales cele multicelulare, conţin mai multe gene decât procariotele şi că posedă mecanisme de control suplimentare care permit reglarea proceselor de dezvoltare pentru a realiza integrarea diferitelor lor funcţiuni. Faţă de procariote, la eucariote, între regiunile de ADN care codifică proteinele (exoni) se găsesc secvenţe intercalare (introni) fără semnificaţie pentru proteina finală (Figura 6.12). Din această structură întreruptă a genei (gene mozaic) decurg modalităţi particulare de expresie (transcriere, traducere şi reglarea tuturor acestor procese). În figura 6.12 se realizează o prezentare comparativă a structurii unităţilor de transcripţie ale genelor procariote si eucariote: a) Operonul Trp la E. Coli conţine 5 gene (A-E) care codifică enzime necesare sintezei triptofanului. Regiunea de control este localizată lângă situsul de iniţiere a transcripţiei întregului operon, care conduce la formarea unui ARNm policistronic. O mutaţie în interiorul regiunii de control a transcripţiei (a) poate preveni expresia tuturor proteinelor codificate de operonul trp. În contrast, o mutaţie în una dintre genele operonului afectează, în general, numai una din proteinele operonului; b) O unitate de transcripţie simplă de la eucariote include o regiune care codifică o proteină începând de la capătul 5’ către coada poli(A) 3’, având asociate regiuni de control. Secvenţele intronice situate între exoni sunt înlăturate în timpul maturării transcriptului primar, nefiind prezenţi în ARNm monocistronic matur. Mutaţii la nivelul regiunii de control a transcripţiei pot reduce sau împiedica transcripţia, reducând sau eliminând sinteza proteinei codificate. O mutaţie la nivelul regiunii exonice (c) poate determina obţinerea unei proteine anormale cu activitate scăzută. O mutaţie în interiorul unui intron poate determina inducerea unui nou site de “splicing” care să determine obţinerea unei proteine nefuncţionale. La eucariote maturarea unui transcript ARNm implică şi procesul de adăugarea a unei guanine la capătului 5’ şi a unei cozi poli A variabilă (200-300 nucleotide) la capătul 3’. TA 7.20.Procesarea unui transcript ARN implică: a) înlăturarea intronilor şi sudarea împreună a exonilor; b) înlăturarea exonilor şi sudarea împreună a intronilor; c) adăugarea unei guanine „cap” şi a cozii poli A; d) ataşarea intronilor la ARN ribozomal; e) atât a cât şi c.

Proiectul pentru Învăţământ Rural

245

De la celulă la organism

Figura 6.12. Comparaţie între structura genelor procariote şi eucariote (prelucrat după Molecular Cell Biology, Lodish, et all. 4th edition, 2000)

6.3.2. Promotori, stimulatori, inhibitori

Analizele de structură şi funcţie ale genelor eucariote au evidenţiat că acestea diferă puternic de genele procariote în complexitatea secvenţelor scurte (motive) responsabile de reglarea transcripţiei Genele procariote prezintă trei tipuri de motive: i) secvenţele care determină debutul transcripţiei (E. Coli promotorii sunt definiţi prin două regiuni prezente la 10 şi 35 pb în amonte de situsul de iniţiere a transcripţiei); ii) elementele care marchează terminarea genei sau a unui grup de gene şi favorizează terminarea transcripţiei; iii) secvenţe de ADN adiacente sau suprapuse în raport cu promotorii, care sunt recunoscute de efectori specifici cum sunt represorii, activatorii şi terminatorii care modulează transcripţia. Secvenţele de reglare specifică depind de interacţiunile pe care le au cu proteinele specifice şi pot influenţa expresia secvenţelor codante învecinate. La eucariote se evidenţiază: i) secvenţele reglatoare cu localizări variabile care sunt situate la distanţe variabile şi au orientări diverse în raport cu situsul de demarare şi de oprire a transcripţiei;

246

Proiectul pentru Învăţământ Rural

De la celulă la organism

ii) trei polimeraze diferite, I, II şi III care transcriu trei clase de gene distincte fiecare asociată cu semnale specifice de control a transcripţiei şi terminării acesteia; Secvenţele reglatoare sunt o suită complexă de motive de ADN relativ scurte. Fiecare motiv reprezintă situsul de fixare al unei proteine specifice, de exemplu un factor de transcripţie. Funcţia unui promotor este adesea determinantă pentru desemnarea genei transcrise, a celulelor în care are loc procesul şi momentul precis al dezvoltării când va avea loc transcrierea. Promotorul nu se reduce doar la secvenţa de ADN unde se va fixa ARN polimeraza, ci conţine şi alte regiuni amplificatoare sau inhibitoare. Aceste elemente oligonucleotidice specifice fixează proteine specifice (DNA binding proteins) prin interacţii care implică motive peptidice particulare

Cadru 6.3 Reglarea transcripţiei la procariote Reglarea transcripţiei fiecărei gene reflectă cooperarea particulară (asortarea) şi aranjamentul anumitor motive, prezenţa factorilor de transcripţie adecvaţi şi modul în care aceşti factori influenţează iniţierea transcripţiei. Fixarea mai multor factori de transcripţie în regiunea de reglare facilitează fie asamblarea ARN polimerazei într-un complex de transcripţie, fie activarea acestui complex, fie ambele. O caracteristică extraordinară a acestor mecanisme o reprezintă universalitatea lor. Remarcabil este faptul că mecanisme cu origini foarte diverse (drojdii, Drosofila, celule de mamifere) sunt interschimbabile ceea ce dovedeşte o conservare evolutivă certă a acestor structuri. Mecanismul de terminare a transcripţiei este diferit pentru cele trei ADN polimeraze. Motivele interacţionează cu proteine adecvate, factorii de terminare. Reglarea terminării este consecinţa aranjamentului motivelor ADN şi formarea unui ansamblu multiproteic care facilitează terminarea şi modificarea extremităţii ARN. Expresia anumitor gene este afectată de schimbări epigenetice care alterează capacitatea unei gene de a se exprima fără a fi afectată secvenţa sa nucleotidică. O formă de modificare epigenetică identificată este asociată cu gradul de metilare a citozinelor la nivelul secvenţelor 5’-CG care flanchează regiunea 5’ a unei gene: a) creşterea metilării este corelată cu o reducere sau chiar cu o absenţă a expresiei genei sau genelor vecine; b) reducerea metilării se traduce printr-o expresie crescută. Modificările de structură intrinsecă a cromatinei (acetilare, fosforilare) pot influenţa nivelul expresiei genelor apropiate. Nivel crescut de expresie există numai în regiunile «decondensate» ale cromatinei.

Proiectul pentru Învăţământ Rural

247

De la celulă la organism

Adesea, proteinele reglatoare sau factori de transcripţie au 6.3.3. Diferenţierea rezultă din expresia roluri esenţiale în definirea teritoriilor celulare care formează embrionul şi viitorul organism adult. Genele care se exprimă în cascadă a furnizează şi factorii de transcripţie care controlează expresia în genelor aval a celorlalte gene (expresia genelor care acţionează ulterior). Primele sunt gene reglatoare, iar cele situate cel mai în aval sunt gene efectoare. O astfel de cascadă genică este tipică diferenţierii celulare. Cu cât procesul este mai avansat cu atât diferenţierea unei celule embrionare, la origine totipotentă, este mai înaintată. Aceasta se transformă într-o celulă specializată, specifică unui ţesut particular, evoluţia fiind considerată ireversibilă. Excepţie fac doar celulele tumorale care par să aibă capacitatea de a se dediferenţia şi de a forma noi tumori care se pot localiza în ţesuturi foarte variate, deja diferenţiate.

6.3.4. Morfogeneza

Morfogeneza are drept rezultat stabilirea identităţii unei celule în organism. Procesul de morfogeneză este numit gastrulaţie şi reprezintă o rearanjare dramatică a celulelor blastulei. Gastrulaţia diferă în detaliu de la un grup de animale la altul, dar un set comun de modificări celulare coordonează acest rearanjament spaţial întrun embrion. Mecanismele celulare generale sunt reprezentate de modificări ale formei şi mobilităţii celulare, ale capacităţii de aderare celulă-celulă şi celulă-matrice extracelulară. În urma gastrulaţiei are loc diferenţierea a trei straturi celulare embrionare numite şi straturi germinale embrionare: ectoderm, endoderm şi mezoderm. Fiecare dintre aceste sunt precursori ai diferitelor ţesuturi şi organe ale organismului adult. De exemplu, sistemul nervos şi epiderma derivă din ectoderm, tractul digestiv şi organele asociate din endoderm iar ţesuturile şi organele de tipul muşchilor, rinichiul, inima şi stratul intern al pielii (derma) se dezvoltă din mezoderm. Pe măsură ce diviziunile celulare progresează şi apar noi celule în cursul dezvoltării, acestea vor fi „informate” asupra poziţiei lor în embrion si asupra modului în care se vor diferenţia într-un anumit tip celular. Responsabilitatea acestui proces o poartă existenţa unui gradient de substanţe morfogenetice (morfogeni) care difuzează din locul unde sunt produse stabilind o gamă continuă de concentraţii până la locul unde vor dispărea prin degradare. Celulele posedă «captatori» ai măsurii concentraţiilor, reprezentaţi de secvenţele de ADN (promotori, stimulatori, inhibitori) care leagă proteinele cu activitate morfogenă cu afinităţi variabile. Astfel, se realizează o interpretare a gradientului în funcţie de poziţia în embrion.

248

Proiectul pentru Învăţământ Rural

De la celulă la organism

Intersectarea diferitelor gradiente de morfogeni duce, în dezvoltarea timpurie a embrionului, la definirea unor regiuni celulare delimitate care sunt “invitate” să se diferenţieze în ţesutul sau organul adecvat. Expresia în cascadă a genelor reglatoare capabile să răspundă acestor gradienţi şi a genelor efectoare are drept rezultat stabilirea unei forme în care fiecare celulă embrionară îşi achiziţionează progresiv o identitate, şi în final se defineşte destinul său în organismul adult. Diferenţierea unei celule în organism este rezultanta poziţionării sale spaţio-temporale. 6.3.5. Organogeneza

Diferitele regiuni ale celor trei straturi germinale se dezvoltă în organe rudimentare în timpul procesului de organogeneză (Tabelul din Figura 6.13). Trei tipuri de modificări morfogenetice: plieri, sciziuni şi condensări celulare sunt primele dovezi ale formării noilor organe. De exemplu, primele organe care iau naştere la broaşte şi alte cordate sunt tubul neural şi notocordul, structura scheletică caracteristică tuturor embrionilor de la cordate (Figura 6.14). Strat germinativ

Organe şi ţesuturi în organismul adult

Ectoderm

Epiderma pielii şi derivaţii săi (glandele din piele, unghiile), epiteliile care căptuşesc gura şi rectul; receptorii senzitivi din epidermă; cornea şi cristalinul ochiului; sistemul nervos; medula adrenalei; emailul dinţilor; epiteliul glandelor pituitară şi pineală

Epiteliul care căptuşeşte: tractul digestiv (cu excepţia gurii şi rectului); sistemul respirator; ficatul; pancreasul; tiroida; paratiroidele; timusul; ureterele; vezica urinară şi sistemul reproducător Notocordul; sistemul scheletic; sistemul Mezoderm muscular; sistemele circulator şi limfatic; sistemul reproducător (exceptând celulele germinale care încep să se diferenţieze în timpul scindării); derma din piele; cortexul adrenal Figura 6.13. Organele şi ţesuturile care derivă din cele trei straturi germinale la vertebrate

Endoderm

În timpul gestaţiei de la om, organogeneza se produce în primul trimestru de viaţă al embrionului. Odată ce organogeneza progresează, morfogeneza şi diferenţierea celulară continuă să îmbunătăţească structura organelor care iau naştere din cele trei straturi germinale (Figura 6.14). În mod unic, la embrionii vertebratelor se dezvoltă o bandă de celule numită creastă neurală, de-a lungul limitei la care tubul neural iese din ectoderm. Celulele crestei neurale migrează ulterior în diferite regiuni ale embrionului formând celulele pigmentare ale pielii, unele din oasele şi muşchii craniului, dinţii, glandele medulare şi adrenale şi componentele periferice ale sistemului nervos.

Proiectul pentru Învăţământ Rural

249

De la celulă la organism

Dezvoltarea embrionară la broaşte conduce la un stadiu larvar. Mai târziu, în urma procesului de metamorfoză această formă se transformă în organismul adult (Figura 6.14).

Figura 6.14. Stadiile dezvoltării la broască cu evidenţierea principalelor etape: gametogeneză, fertilizare, clivare, gastrulaţie, organogeneză, maturare şi creştere şi adultul matur sexual (prelucrat după http://www.infobiogen.fr/deambulum/index.php)

TA 6.21. În urma gastrulaţiei are loc diferenţierea a trei straturi celulare embrionare numite şi straturi germinale embrionare. Ţesutul nervos şi epiderma derivă din: a) endoderm; b) ectoderm; c) mezoderm; d) direct din ovul; e) a şi b sunt adevărate. TA 6.22. Care dintre următoarele afirmaţii privind mecanismele de control în organismele eucariote este adevărată: a) metilarea ADN poate determina inactivarea parţială sau totală a cromozomilor; b) influenţele inductive ale citoplasmei pot acţiona prin modificarea produsului genelor particulare; c) genele eucariote sunt organizate sub forma unor operoni mari; d) transcripţia activă a genelor este un proces caracteristic regiunilor de heterocromatină nucleară; e) cromozomii în perie sunt regiuni active pentru sinteza ARNt TA 6.23. Reglarea genelor atât la procariote cât şi la eucariote se realizează prin controlul procesului de: a) translaţie; b) suprarăsucirea histonelor; c) transcripţia; d) diferenţierea celulară; e) eliminarea intronilor şi sudarea exonilor

250

Proiectul pentru Învăţământ Rural

De la celulă la organism

6.4. Evenimente celulare specializate

6.4.1. Celule stem

Anumite celule au durata de viaţa la fel de lungă ca şi organismul din care fac parte. Altele se înnoiesc constant plecând de la celule stem. O celulă stem poate forma alte celule stem sau poate da o descendenţa de celule noi diferenţiate. Există celule stem practic în toate ţesuturile, dar sunt mai uşor de studiat în sânge. O celulă stem este o celulă embrionară, fetală sau adultă care are, în anumite condiţii, capacitatea de a se auto-reproduce pentru lungi perioade de timp sau, în cazul celulelor stem adulte, pentru întreaga viaţă a organismului. Acestea pot duce la formarea unor celule specializate care fac parte din ţesuturile şi organele corpului. Celulele stem pluripotente. O celulă stem pluripotentă are capacitatea de a da noi tipuri celulare care se dezvoltă din cele trei foiţe germinale (mezoderm, endoderm şi ectoderm) din care iau naştere toate celulele corpului. Singura sursă cunoscută de celule stem umane pluripotente este cultura de celule stem izolată din embrioni timpurii şi din ţesut fetal care a fost diferenţiat pentru a forma gonadele. Celulele stem embrionare. O celulă stem embrionară este derivată dintr-un grup de celule numită masă internă celulară, care este o parte din embrionul timpuriu de 4 - 5 zile numit blastocist. Odată prelevate din blastocist celulele masei celulare interne pot fi cultivate sub formă de celule stem embrionare. Aceste celule stem embrionare nu sunt embrioni. De fapt, studiile au evidenţiat că celulele nu se transformă în embrioni, deoarece în laborator, condiţiile în care se dezvoltă sunt diferite de cele în care se dezvoltă embrionii. Celulele germinale embrionare. O celulă germinală embrionară este derivată din ţesut fetal. Specific, acestea sunt izolate din celule germinale primordiale izolate din creasta gonadală a fetuşilor de 5-10 săptămâni. Mai târziu în dezvoltare, creasta gonadală dezvoltă testiculele şi ovarele iar celulele germinale primordiale vor da naştere ovulelor şi spermei. Celulele stem embrionare şi celulele germinale embrionare sunt pluripotente, dar nu sunt identice din punct de vedere al proprietăţilor şi caracteristicilor. Diferenţierea este procesul prin care o celulă nespecializată (cum este o celulă stem) devine specializată în una sau mai multe celule care întră în constituţia corpului. În timpul diferenţierii, anumite gene sunt activate şi altele devin inactive după o modalitate de reglare intrinsecă. Drept rezultat, o celulă diferenţiată dezvoltă structuri specifice şi realizează anumite funcţii. În laborator, o celulă stem poate fi manipulată pentru a deveni un tip celular specializat sau parţial specializat (ex, muşchi cardiac, nerv sau celulă pancreatică).

Proiectul pentru Învăţământ Rural

251

De la celulă la organism

Celulele stem adulte: reprezintă celulele nediferenţiate (nespecializate) care apar într-un ţesut diferenţiat (specializat), care se autoreînoieşte, şi devin specializate pentru a forma toate tipurile de celule care aparţin ţesutului din care face parte. Celulele stem adulte sunt capabile să realizeze copii identice cu ele însele de-a lungul întregii vieţi a organismului. Această proprietate se numeşte “auto-reînoire”. De obicei, celulele stem adulte se divid pentru a genera celule progenitoare sau precursoare care apoi se diferenţiază şi “dezvoltă” trăsături caracteristice şi funcţii specializate, cum ar fi contracţia celulei musculare sau semnalizarea nervoasă celulară (Figura 6.15). Sursele de celule stem adulte sunt reprezentate de măduva osoasă, sângele, corneea şi retina, creierul, muşchiul scheletic, pulpa dintelui, ficatul, pielea şi pancreasul.

Figura 6.15. Plasticitatea celulelor stem adulte la om (prelucrat după Biology, N. A. th Campbell, J. B. Reece, William Barstow, Ed, International Edition, Benjamin Cummings, 6 Edition, 2002)

TA 6.24. Încercaţi să analizaţi comparativ caracteristicile tuturor tipurilor de celulele stem prezentate mai sus. Prezintă acestea aceeaşi localizare în organism?

252

Proiectul pentru Învăţământ Rural

De la celulă la organism

6.4.2. Celulele imunitare

Globulele albe specializate, leucocitele, sunt responsabile de răspunsurile imune specifice induse de întâlnirea diferitelor antigene (bacterii, virusuri, ciuperci, macromolecule). Sunt celule mici rotunde care pot părăsi circulaţia sangvină prin extravazare şi intră în sistemul limfatic constituit din ganglioni conectaţi prin vase limfatice. Există două tipuri de limfocite, celulele B şi T. Celulele B sintetizează anticorpii, iar celulele T sunt responsabile pentru imunitatea mediată celular. În acest ultim caz, la suprafaţa celulelor se găsesc proteine membranare, receptorii celulelor T, analogi imunoglobulinelor care interacţionează cu antigenele. Celulele B şi T provin din precursori comuni, celule stem din măduva osoasă (Figura 6.16). Celulele T migrează rapid în timus, şi apoi, când cele două tipuri celulare au atins un stadiu avansat de diferenţiere, migrează din măduva osoasă şi timus către organele limfoide secundare (amigdale, pancreas, plăci Peyer, ţesut particular din intestin).

Figura 6.16. Dezvoltarea limfocitelor (prelucrat după Biology, N. A. Campbell, J. B. Reece, William Barstow, Ed, International Edition, Benjamin Cummings, 6 ed, 2002) th

În afară de limfocite, există şi alte tipuri celulare implicate în răspunsul imun: macrofage, monocite, celule Langerhans. Macrofagele asigură o funcţie esenţială deoarece, prin endocitoză, acumulează antigenele, le digeră şi le poziţionează la suprafaţa propriilor celule. Această operaţie de prezentare a materialelor ingerate este indispensabilă pentru recunoaşterea antigenelor de către limfocite şi pentru reacţia acestora.

Proiectul pentru Învăţământ Rural

253

De la celulă la organism

Caracteristica fundamentală a celulelor răspunsului imun provine din faptul ca fiecare limfocit B produce molecule de anticorpi (imunoglobuline) cu o singura specificitate şi fiecare celula T are un singur tip de receptor. Înainte de diferenţierea limfocitelor B în plasmocite (celule care secretă anticorpi), anticorpii sunt ataşaţi la suprafaţa celulară, unde servesc ca receptori pentru antigene, ca şi în celulele T. Fixarea antigenului la imunoglobulina de suprafaţă, acompaniată de interacţii celulare cooperative, declanşează un proces intracelular (transducerea semnalului) a cărui consecinţa este proliferarea şi maturarea celulelor B. Numeroase plasmocite, care secretă anticorpi cu aceeaşi specificitate cu imunoglobulina purtată la început de limfocitul B imatur, vor fi activate. Anticorpii secretaţi se vor complexa cu antigenele străine şi ansamblul va fi fagocitat şi eliminat de diverse celule specializate, cum sunt macrofagele (Figura 6.17). Ca răspuns la prezenţa unui antigen, este selecţionată o celula B, care va constitui o clona printr-o proliferare preferenţială. Această selecţie clonală se aplica şi celulelor T. Ea ţine cont şi de memoria imunitară. La prima întâlnire cu antigenul, răspunsul este lent pentru că un număr mic de celule posedă anticorpul potrivit. La următoarea întâlnire cu acelaşi antigen, răspunsul este mult mai rapid şi mai intens. Celulele T şi B „cunosc” deja antigenul care este stimulat şi gata de divizare. Sunt celule cu memorie care se diferenţiază pentru a produce celule B şi T funcţionale. La un om există aprox. 106-108 tipuri limfocitare specifice, susceptibile să constituie sau constituie deja clone (1-106 celule), ceea ce pentru corpul uman reprezintă aproximativ 1012 celule B şi T.

Figura 6.17. Producerea de anticorpi – rezultatul cooperării celulare (prelucrat după Biology, N. A. Campbell, J. B. Reece, William Barstow, Ed, International Edition, Benjamin Cummings, 6 ed, 2002) th

TA 6.25. Care dintre următoarele afirmaţii privind celulele T şi B sunt adevărate: a) produc celule efectoare faţă de patogeni specifici; b) sunt produse de celule stem şi de măduva osoasă; c) pot să atace şi să distrugă patogenii care invadează organismul; d) atât a cât şi b; e) a, b şi c sunt adevărate.

254

Proiectul pentru Învăţământ Rural

De la celulă la organism

Cadru 6. 4. Producerea de anticorpi – rezultatul cooperării celulare Răspunsul imun mobilizează o reţea de celule, după un mecanism foarte complex. Se disting mai multe etape. Celulele accesorii (macrofagele) sechestrează antigenul, îl ingerează şi apoi îl pregătesc pentru expunerea la suprafaţă. Aici sunt recunoscute un tip particular de celule T care posedă receptori pentru antigen (celule particulare Th sau „helper” sau auxiliare pentru a le distinge de celelalte celule T care atacă direct antigenul). Celulele T „văd” antigenul la suprafaţa celulelor ţintă doar dacă recunosc simultan şi alte proteine normale la suprafaţa celulei. Aceşti determinanţi antigenici normali sunt proteine ale complexului major de histocompatibilitate (CMH). La om, acest sistem de proteine poartă numele de sistemul HLA, şi este implicat în discriminare structurilor proprii (sau „self”) de structurile străine (sau „non – self”). Astfel activată, celula T va stimula o celula B care posedă un anticorp de suprafaţă capabil să recunoască acelaşi antigen. Celula B prezintă antigenul la suprafaţă folosindu-se de proteinele CMH. Comunicarea între celulele B şi T se face prin intermediul unor factori de creştere, citokinele. Citokinele, clasă de proteine din care fac parte şi interleukinele, stimulează diviziunea şi acţionează prin legarea la receptorii membranari specifici. Fixarea antigenului la receptorii celulari produce activarea căilor de semnalizare intracelulare caracterizate de cascade de reacţii, în care mecanismele de fosforilare şi defosforilare, ca şi ionii de calciu, au roluri cruciale. Cele două procese activatoare, antigen-receptor şi citokinele împreună cu receptorii lor, sunt conectate şi acţionează unul asupra celuilalt pentru a stimula, în final, multiplicarea celulelor T şi B (Figura 6.17). Exista mai multe tipuri de celule T: i) Celule T citotoxice (Tc) care atacă direct antigenul străin distrugând celula care îl poartă, dacă de exemplu celula este infectată de un virus. Sunt responsabile de rejecţia grefelor între indivizi. Au aceleaşi funcţii ca şi anticorpii secretaţi de celulele B, numai că aici anticorpii rămân ataşaţi la suprafaţa celulelor T; ii) Celule T helper (Th) care ajută celulele B să se diferenţieze în plasmocite. Ajută la maturarea celulelor T citotoxice; iii) Celule T supresoare (Ts) care blochează răspunsurile celulelor T şi B. Toate proteinele descrise mai sus (anticorpi, anumiţi receptori de suprafaţă, proteinele sistemului HLA) sunt proteine multimere (constituite din mai multe lanţuri polipeptidice) ale căror gene sunt asamblate prin procese de recombinare. Nici o genă care codifică pentru anticorpi nu este moştenită ca atare. Diversitatea atât de mare a anticorpilor poate fi explicată prin asamblarea genelor responsabile pentru producerea răspunsului imun în celulele somatice ale organismului pornind de la numeroase fragmente de ADN.

Proiectul pentru Învăţământ Rural

255

De la celulă la organism

6.4.3. Neuronii şi sistemul nervos

Celulele stem ale sistemului nervos central (SNC) trebuie să se poată diferenţia în neuroni şi celule suport (astrocite şi oligodendrocite). Trebuie să fie capabile să se reînnoiască înainte de a furniza un număr de celule adecvate pentru constituirea creierului. Au fost identificate celule stem prezente şi în creierul matur. Pot fi cultivate şi pot prolifera. Totul începe în embrionul foarte tânăr, când stratul plat de celule ectodermice se transformă într-un tub neural de la care se formează creierul şi măduva spinării. Aici se diferenţiază celulele neuroepiteliale care dau naştere la diferite tipuri de neuroni (Figura 6.18) şi celule suport (celule gliale). În partea cea mai dorsală a tubului neural se formează celulele crestei neurale. Ele migrează pe distanţe lungi şi formează un număr impresionant de tipuri celulare diferenţiate printre care se găsesc neuronii şi celulele gliale ale sistemului nervos senzorial, simpatic si parasimpatic (Figura 6.18).

Figura 6.18. Tipuri de neuroni şi regiunile specializate ale acestora ((prelucrat după Molecular Cell Biology, Lodish, et all. 4th ed., 2000)

Creierul uman are 1011 neuroni asociaţi cu peste 1012 celule gliale suport. În aceste două categorii există o foarte mare varietate. Prelungirile fine, dendritele, sunt utilizate de neuron pentru a capta impulsurile electrice. În primul an după naştere, fiecare neuron al cortexului stabileşte aproximativ 105 conexiuni (sinapse) cu alţi neuroni. Se dezvolta axonul, extensie a corpului celular care poate atinge 1m pentru un neuron senzorial periferic. Aceasta extensie se formează dintr-o regiune de creştere graţie filopodelor, un fel de organite senzoriale care se întind şi se retrag prin alungirea microtubulilor şi schimbarea formei microfilamentelor.

256

Proiectul pentru Învăţământ Rural

De la celulă la organism

Oligodendrocite (tip particular de celule gliale) se rulează la intervale regulate în jurul axonului şi formează o membrană (teaca de mielină) bogată într-o proteina bazică caracteristică (Figura 6.18). În sistemul nervos periferic, celulele gliale care sunt responsabile de mielinizare se numesc celule Schwann. Teaca de mielină, adevărat izolator electric este esenţială în funcţionarea neuronului. În final, axonul se specializează în secretarea unui neurotransmiţător specific care poate fi acetilcolina (neuroni colinergici), epinefrina, norepinefrina (neuroni adrenergici), octopamina, serotonina, acidul γ-aminobutiric, dopamina (neuroni dopaminergici), etc. Pentru a se matura, un neuron suferă o diferenţiere structurală şi o specializare moleculară. TA 6.26. Complexul major de histocompatibilitate (CMH) este important în: a) distincţia dintre celulele „self” şi „nonself”; b) recunoaşterea paraziţilor patogeni; c) identificarea paraziţilor bacterieni; d) identificarea celulelor anormale; e) atât a cât şi d sunt corecte. TA 6.27. Care dintre următoarele afirmaţii este un exemplu de „feedback” pozitiv pentru sistemul imun: a) celulele cu memorie proliferează şi produc anticorpi; b) celulele citotoxice eliberează substanţe care atrag macrofagele; c) celulele eliberează citokine care la rândul lor le stimulează diviziunea şi eliberarea unei cantităţi şi mai mari de citokine; d) antigenele mari cu mulţi determinanţi antigenici repetitivi pot stimula celulele B fără ajutorul celulelor T; e) atât a cât şi b sunt exemple de „feedback” pozitiv în sistemul imun. TA 6.28. Dacă măduva spinării unei persoane este distrusă de radiaţii, care dintre următoarele tipuri de celule nu va fi produs? a) celule B; b) celule T; c) eritrocite; d) neutrofile; e) nu vor fi produse toate tipurile prezentate la punctele a-d. TA 6.29. Neuronii se formează ca urmare a diferenţierii: a) celulelor din măduva spinării; b) celulelor stem ale sistemului nervos; c) celulelor gliale; d) liniei albe de celule ale sângelui; e) celulelor suport (astrocite şi oligodendrocite). TA 6.30. Teaca de mielină sintetizată de celulele Schwann are un rol important în: a) structurarea sistemului nervos; b) proliferarea acestui tip celular; c) funcţionarea neuronului deoarece are rol de izolator electric; d) diferenţierea dendritelor; e) a şi d sunt adevărate. TA 6.31. Analizaţi comparativ componentele neuronilor prezentaţi în figura 6.18. Prezentaţi concluzia la care aţi ajuns.

Proiectul pentru Învăţământ Rural

257

De la celulă la organism

6.4.4. Celule tumorale şi cancer

Orice dereglare în coordonarea celulară este catastrofală. Creşterea şi multiplicarea dezordonată a unei singure celule care competiţionează cu vecinii săi pentru spaţiu şi nutrienţi va determina dezorganizarea şi eventual distrugerea întregului organism. Termenul utilizat pentru a descrie această stare este cancer O tumoră se poate forma atunci când o celulă încetează să mai respecte instrucţiunile celulelor vecine si organismului întreg, şi urmează cicluri de diviziune neregulate pentru reînnoire şi reparare. O astfel de proliferare necontrolată apare în cazul tumorilor benigne. Celulele din structura acestora conservă capacitatea de a constitui o structură tisulară apropiată de cea normală şi respectă frontierele ţesutului sau organului. Apariţia unui cancer adevărat, sau tumoră malignă, corespunde unei devieri mai accentuate a celulei proliferante, caracterizată de invazia ţesuturilor vecine. Adesea, la celulele tumorale apare capacitatea de migrare, prin circulaţia limfatică şi sangvină, care duce la formarea metastazelor, la situsuri mai mult sau mai puţin distanţate de tumora iniţială (Figura 6.19). Celulele tumorale invazive, care pot migra dintr-o tumoră iniţială, au un comportament asemănător unor celule embrionare responsabile de morfogeneza ţesuturilor.

Figura 6.19. Cancerul este o dereglare a organizării celulare. a) structura normală a unui vas de sânge; b), o singură clonă celulară a pierdut capacitatea de coordonare a creşterii celulei înconjurătoare şi a început să competiţioneze pentru spaţiu; (c) expansiunea continuă a clonei a determinat ieşirea sa în afara vasului distrugând membrana bazală (invazie); d) transport prin vasele limfatice în sânge şi instalarea în alte organe a căror structură o pot distruge (metastază).

258

Proiectul pentru Învăţământ Rural

De la celulă la organism

Celulele normale, în cultură, necesită factori de creştere exogeni pentru a prolifera şi au o viaţă limitată înainte de senescenţă şi moarte. Ele manifestă fenomenul de inhibiţie de contact. Odată ce suprafaţa de cultură a fost acoperită cu un monostrat proliferarea lor încetează. În contrast, celulele canceroase în cultură au următoarele caracteristici: i) reducerea necesarului de factori de creştere; ii) pierderea inhibiţiei de contact, astfel încât celulele au tendinţa de suprapunere şi de formare de aglomerări; iii) capacitate de diviziune nedefinită, deci sunt nemuritoare; iv) au o creştere care nu necesită ancorare (fixare), demonstrată de obicei prin capacitatea de creştere în agar moale (Figura 6.20).

Figura 6.20. Celule normale şi tumorale în cultură

Dovada bazei genetice a cancerului este furnizată de trei tipuri de observaţii: 1) carcinogenii determină mutaţii la nivelul ADN; 2) tumorile posedă anomalii cromozomiale specifice (pierdere sau câştigare de cromozomi, translocaţii sau amplificări); 3) anumite tipuri de cancer manifestă o predispoziţie de dezvoltare moştenită. Studiile de genetică moleculară au demonstrat corelaţii între fenomenul mutaţional şi cancer identificând genele ţintă ale mutaţiilor care sunt implicate în transformarea malignă. Aceste gene pot fi împărţite în două clase operaţionale: oncogene şi gene supresoare tumorale (tumor suppresor genes). Oncogenele sunt predominant componente ale căilor care activează diviziunea celulară ca răspuns la stimularea factorilor de creştere. Transformarea malignă poate fi o consecinţă a mutaţiilor care determină o creştere a activităţii lor de expresie („gain of function mutations”). Funcţiile acestor efectori pozitivi sunt în contrast cu activitatea celei de a doua clase, genele supresoare tumorale. Mutaţiile care inactivează genele supresoare tumorale („loss of function mutations”) sunt în mod normal evidenţiate în probele tumorale prelevate de la om. Rolul acestor gene este de a codifica proteine care împiedică proliferarea, în unele cazuri prin interacţie directă cu membrii familiei oncogenelor.

Proiectul pentru Învăţământ Rural

259

De la celulă la organism

Descoperirea că anumite virusuri induc tumori când sunt injectate la animale a simplificat ideea de cancer. Virusurile tumorigene (ADN sau ARN de tip adenovirusuri, papilomavirusuri şi SV40) au elemente genetice discrete, oncogene, care le conferă capacitatea de a transforma celulele şi care sunt echivalente structural cu proto-oncogenele umane. Oncogenele codifică proteine, adesea numite oncoproteine, cu roluri în ciclul de multiplicare al virusului. În urma infecţiei, virusurile obligă celula să replice propriul ADN şi o determină să se dividă fără încetare până formează o tumoră. O caracteristică fundamentală a cancerului este ca diviziunea unei celule canceroase da naştere la doua celule fiice cu aceleaşi proprietăţi. Studiile epidemiologice demonstrează că la oameni şi animalele de laborator cancerele apar după parcurgerea unui număr de etape. Sunt necesare patru sau cinci evenimente mutaţionale înainte ca celula să devină complet malignă. Astfel, o mutaţie primară se produce şi face celula să crească mai repede decât vecinele sale, sau să trăiască mai mult decât durata sa de viaţă normală. Astfel, rezultă o populaţie, sau o clonă, care multiplică mutaţia. Unele celule din clona ajunsă la maturitate au o şansă semnificativă să suporte o a doua mutaţie, care să le confere mai departe avantaje în creştere şi supravieţuire. Celula purtătoare a două modificări (double hit) se va dezvolta mult mai repede ca prima clonă. În acest fel, o tumoră poate acumula continuu, cu trecerea timpului, un număr din ce în ce mai mare de mutaţii care stimulează creşterea (Figura 6.21).

Figura 6.21. Dezvoltarea tumorală determinată de mutaţii somatice secvenţiale şi de o creştere a proliferării celulare

260

Proiectul pentru Învăţământ Rural

De la celulă la organism

Deci într-o celulă normală exista gene capabile să modifice celula şi să omoare organismul întreg, perturbând considerabil creşterea celulară. Majoritatea proto-oncogenelor codifică proteine care intervin în căile de transducere a semnalelor transmise de la exteriorul celulei către echipamentul de reglare. Versiunea oncogenică (virală) a acestor proteine este capabilă să transmită un ordin de creştere sau diviziune chiar dacă acesta nu a fost dat. Proto-oncogenele pot codifica factori de creştere sau receptorii lor. Câţiva dintre ei sunt factori transcripţionali. Genele celulare normale supresoare de tumori inhibă creşterea şi multiplicarea celulară şi se mai numesc şi antioncogene. Dacă suferă mutaţii, ele pierd funcţia supresivă. Exemplul cel mai cunoscut este cel al proteinei p53 care este considerată „gardianul genomilor” şi care conţine mutaţii în peste 50% din cazurile de cancer. În aceste situaţii anti-oncogenele mutate devin veritabile oncogene. TA 6.32. Care dintre următoarele afirmaţii privind proto-oncogenele este falsă: a) codifică pentru proteine asociate cu creşterea celulară; b) sunt similare cu oncogenele prezente în retrovirusuri; c) sunt produse de către mutaţii în celulele somatice induse de către substanţe carcinogene; d) sunt implicate în producerea proteinelor pentru adeziunea celulară; e) sunt gene care codifică pentru proteine implicate în diviziunea celulară TA 6.33. Incidenţa cancerului creşte dramatic cu înaintarea în vârstă deoarece: a) este foarte probabil ca proteina Ras să devină hiperactivă după vârsta de şaizeci de ani; b) proteozomii devin mult mai activi cu vârsta; c) cu cât îmbătrânim cu atât inhibitorii diviziunii celulare funcţionează mai încet; d) cu cât trăim mai mult cu atât acumulăm mai multe mutaţii; e) genele supresoare tumorale nu mai sunt capabile să repare ADN modificat; TA 6.34. Care dintre următoarele evenimente sunt necesare pentru producerea unei celule maligne: a) activarea unei oncogene într-o celulă; inactivarea unei gene supresoare tumorale într-o celulă; b) prezenţa substanţelor mutagene în mediul de viaţă al celulelor; c) prezenţa retrovirusurilor în celulă; d) atât a cât şi b sunt necesare. TA 6.35. Leucemia care reprezintă o formă de cancer care apare ca urmare a mutaţiilor care determină o excesivă producţie de celule albe prezintă o declanşare mult mai timpurie decât alte forme de cancer. Daţi o explicaţie pentru acest fenomen.

Proiectul pentru Învăţământ Rural

261

De la celulă la organism

6.5. Răspunsuri şi comentarii la testele de autoevaluare R TA 6.1: a; R TA 6.2: b; R TA 6.4: c; R TA 6.7:d; R TA 6.8:d; R TA 6.9: e; R TA 6.10: d; R TA 6.3: În adeziunea celulară sunt implicate proteine membranare specializate numite molecule de adeziune celulară (CAMs – Celular Adhesion Molecules). Celulele din ţesuturile animale aderă indirect (adeziune celula-matrix) şi de componente ale matricei extracelular prin intermediul unor receptori de adeziune din membrana plasmatică. Aceste două tipuri de interacţii nu mediază doar agregarea şi organizarea celulelor în ţesuturi distincte dar de asemenea susţin transferul bidirecţional al informaţiei între exteriorul şi interiorul celulei. O parte a moleculelor CAM pot fi clasificate în patru mari familii: caderinele, superfamilia imunoglobulinelor (Ig), integrinele, şi selectinele. Unele din aceste molecule conferă specificitatea de legare care caracterizează o anumita proteină. Există şi alte tipuri de proteine, care nu aparţin nici unei clase majore de CAM şi care sunt implicate în procesul de adeziune celulară în anumite ţesuturi. Moleculele de aderenţa pot fi considerate un fel de receptori, adică proteine transmembranare capabile să fixeze un ligand. Caderinele sunt molecule cheie în procesul de adeziune şi semnalizare celulară, şi joacă un rol critic în diferenţierea tisulară. Moleculele de aderenţă stau la baza proceselor care permit circulaţia celulelor sistemului imunitar în ansamblul organelor. R TA 6.5: La mamifere, se disting trei tipuri majore de caderine: i) caderina epiteliala (E-caderina); ii) caderina placentara (P-caderina); iii) caderina neurală (Ncaderina). Caderinele au rol important în recunoaşterea selectivă a celulelor embrionare şi stabilesc polaritatea lor celulară. Sunt molecule de aderenţa a căror catena peptidică traversează membrana o singura dată. R TA 6.6: Dacă nu reuşiţi să răspundeţi la o primă încercare va rugăm să aprofundaţi informaţiile de la paginile 231 la 233 R TA 6.11: c); R TA 6.12: b; R TA 6.17: a; R TA 6.18: a; R TA 6.21: b; R TA 6.13. La nivelul joncţiunilor etanşe, contactul între celule este circular, fiind vorba de o apropiere compactă de forma unui şnur; acesta împiedică trecerea soluţilor între celule. Joncţiunile care nu sunt continue lasă posibilitatea apariţiei unor deschideri între celule. Dezmozomii şi joncţiunile lacunare, permit aderenţa dar şi comunicarea între celule. R TA 6.14. Ambele conţin structuri fibroase pentru a rezista la forţele de tracţiune şi o matrice amorfă care le permite să reziste la compresie. R TA 6.15. Dacă nu reuşiţi să răspundeţi din prima încercare va rugăm să aprofundaţi informaţiile de la paginile 235 la 238. R TA 6.16. Dacă aveţi dificultăţi în realizarea eseului vă rog să consultaţi materiale suplimentare şi să revedeţi informaţiile de la paginile 238 şi 239. R TA 6.19: Pentru unirea spermatozoidului cu ovulul sunt necesare următoarele etape: i) ataşarea acrozomului la Zonei Pelucida (ZP); ii) producerea reacţiei acrozomiale; iii) care presupune o exocitoză prin fuziunea membranelor acrozomului şi spermatozoidului cu eliberarea conţinutului enzimatic, ceea ce asigura penetrarea ZP; iv) ataşarea; v) fuziunea cu membrana ovulului; vi) aceste ultime etape activează ovulul către dezvoltare şi îl fac refractar la orice altă nouă intrare a unui spermatozoid. R TA 7.20: e; Dacă aveţi probleme în înţelegerea procesului analizaţi cu atenţie figura 6.12. R TA 6.22: a; R TA 6.23: c; R TA 6.25: d; R TA 6.26: e; RTA 6.27: c; R TA 6.29: b; R TA 6.24. Informaţiile sunt prezentate în subcapitolul 6.41. Deoarece este un subiect amplu şi cu real impact ştiinţific vă recomandăm şi consultarea unor materiale bibliografice suplimentare. 262

Proiectul pentru Învăţământ Rural

De la celulă la organism

R TA 6.30: c; RTA 6.31. Test cu posibilitate de comentariu liber a figurii analizate; R TA 6.32: c; R TA 6.33:d; R TA 6.34:e; R TA 6.35. Celulele albe ale sângelui circulă în întreg organismul şi migrează în interiorul şi exteriorul ţesuturilor pentru a apăra organismul împotriva infecţiilor. Deci, acestea sunt în mod natural invazive. Odată ce o mutaţie s-a produs în sistemul de control normal al producerii acestor celule, nu mai este nevoie de mutaţii suplimentare care să confere celulelor capacitatea de a se dispersa în întreg organismul. În acest fel numărul de mutaţii necesare pentru apariţia leucemiei este mult mai redus decât în cazul altor tipuri de cancer.

Proiectul pentru Învăţământ Rural

263

De la celulă la organism

6.6. Lucrare de verificare 6 V 6.1. Ce sunt caderinele, câte tipuri există la mamifere şi care sunt rolurile lor. V 6.2. Enumeraţi tipurile de joncţiuni prezente la nivelul celulelor epiteliale? Şi descrieţi rolul acestora în funcţionarea celulară. V 6.3. Joncţiunile „Gap” sunt structuri dinamice care, asemenea canalelor ionice convenţionale, pot fi deschise şi închise: ele pot fi închise prin modificări conformaţionale reversibile care se produc ca urmare a modificărilor celulare. Permeabilitatea joncţiunilor „gap” descreşte în secunde, de exemplu când concentraţia de calciu intracelular creşte. Speculaţi de ce o astfel de formă de reglare poate fi importantă pentru „sănătatea” unui ţesut. V 6.4. Prin intermediul schimbului de ioni, joncţiunile „gap” realizează cuplarea metabolică şi electrică dintre celule. Având această informaţiei aţi putea explica de ce neuronii comunică în primul rând prin sinapse şi secundar prin joncţiuni „gap”. V 6.5. Gelatina este în principal formată din colagen, care este responsabil de remarcabilă putere de extensie a ţesutului conjunctiv. Gelatina este principalul ingredient din jeleu. Aşa cum probabil ştiţi când consumăm jeleu de fructe, acesta nu prezintă nici o putere de extensie. De ce? V 6.6. Proteoglicanii sunt: a) lipoproteine; b) proteine plasmatice; c) glicoproteine; d) proteine nucleare; e) keratine V 6.7. Proteoglicanii se caracterizează printr-o abundenţă de sarcini negative la nivelul grupărilor glucidice din structura lor. Ar fi diferite proprietăţile acestor compuşi dacă sarcinile negative nu ar fi aşa de abundente? V 6.8. Din grupul glicoproteinelor extracelulare de aderenţă fac parte: a) fibronectina; b) colagenul; c) laminina; d) keratina; e) a şi c V 6.9. Cartilajul este un exemplu de ţesut: a) conjunctiv; b) reproductiv; c) nervos; d) epitelial; e) adipos. V 6.10. Care dintre următoarele celule sunt diploide? a) spermatiile; b) spermatogoniile; c) celulele spermatice mature; d) numai a şi b; a, b şi c. V 6.11. O celulă umană care conţine 22 autozomi şi un cromozom Y este: a) o celulă somatică masculină; b) un zigot; c) o celulă somatică feminină; d) o celulă spermatică; e) un ovul V 6.12. La animalele vertebrate, spermatogeneza şi ovogeneza diferă prin: a) oogeneza se declanşează la începutul maturităţii sexuale; b) oogeneza produce patru celule haploide, în timp ce spermatogeneza produce numai un spermatozoid funcţional; c) oogeneza produce numai un ovul funcţional, în timp ce spermatogeneza produce patru spermatozoizi funcţionali; d) spermatogeneza începe înainte de naştere; e) spermatogeneza nu este completă până când apare fertilizarea. V 6.13. Care parte a spermatozoidului intră pentru prima dată în contact cu membrana plasmatică a ovulului? a) membrana plasmatica anterioară; b) membrana plasmatică posterioară; c) membrana acrozomală anterioară; d) membrana acrozomală posterioară; e) membrana de fertilizare. V 6.14. Ce nume este dat procesului care reface numărul diploid de cromozomi? a) fertilizare; b) reproducere asexuată; c) meioză; d) mitoză; e) ciclu celular

264

Proiectul pentru Învăţământ Rural

De la celulă la organism

V 6.15. Care secvenţă de dezvoltare este corectă? a) clivare, blastulă, gastrulă şi morulă; b) clivare, gastrulă, morulă şi blastulă; c) clivare, morulă, blastulă şi gastrulă; d) gastrulă; morulă, blastulă şi clivare; e) morulă, clivare, gastrulă şi blastulă. V 6.16. La vertebrate, după gastrulaţie distribuţia secvenţei ţesuturilor de la exterior la interior este următoarea: a) endoderm, ectoderm, mezoderm; b) mezoderm, endoderm, ectoderm; c) ectoderm, mezoderm, endoderm; d) ectoderm, endoderm, mezoderm; e) endoderm, mezoderm, ectoderm. V 6.17. În timpul gestaţiei umane, organogeneza apare: a) în primul trimestru; b) în al doilea trimestru; c) în al treilea trimestru; d) în timp ce embrionul este în oviduct; e) în timpul stadiului de blastocit. V 6.18. Ce desemnăm prin termenul de „transcript primar” în cazul genelor eucariote: a) ARNhn; b) ARNt; c) ARNr; d) ARNm; e) ADN. V 6.19. Odată transcris ARNm de la eucariote suferă, în majoritatea cazurilor; modificări care includ: a) eliminarea intronilor; b) fuziunea în forme circulare numite plasmide; c) legarea la molecule de histone; d) legarea la ribozomi; e) fuziunea cu alte molecule nou transcrise. V 6.20. ARN polimeraza se leagă la următoarele secvenţe din structura ADN : a) atenuator; b) activator; c) operon; d) promotor. V 6.21. Care dintre următoarele afirmaţii defineşte controlul transcripţional al expresiei genice? a) ARNm este stocat în citoplasmă şi necesită un semnal de control pentru a iniţia translaţia; b) ARNm există un anumit timp înainte de a fi degradat; c) există o amplificare genică în cazul ARNr; d) procesarea ARN apare înainte ca ARNm să fie eliberat din nucleu; e) factorii transcripţionali se leagă la regiunile activatoare şi promotoare. V 6.22. Prima dovadă a diferenţierii este: a) diviziunea celulară; b) sinteza de ARNm necesar producerii de proteine specifice pentru un anumit tip de ţesut; c) determinarea sintezei; d) modificări în mărimea şi forma celulei; e) modificări rezultate din inducere. V 6.23. „ Specializarea în structură şi funcţie” este o definiţie a: a) morfogenezei; b) dezvoltării; c) inducerii; d) diferenţierii; e) formarea modelului. V 6.24. Care dintre următoarele procese este implicat în dezvoltarea embrionară: a) diviziunea celulară; b) diferenţierea celulară; c) morfogeneza; d) a şi b; e) a, b şi c. V 6.25. În timpul vieţii au loc în corpul omenesc aproximativ 1016 diviziuni celulare, în timp ce corpul unui adult conţine aproximativ 1013 la 1014 celule. De ce este acest număr diferit? V 6.26. Ce este o celulă stem? V 6.27. Dacă discutăm despre apărarea împotriva invadatorilor patogeni la mamifere, toate sistemele descrise mai jos sunt considerate nespecifice cu excepţia: a) sistemului imun; b) pielea; c) membranele mucoase; d) răspunsul inflamator; e) proteinele antimicrobiene. V 6.28. Ce sunt antigenele? a) proteine prezente în sânge care determină celulele de sânge străine să se aglutineze; b) proteinele din structura membranelor celulelor B; c) proteinele care constau în două lanţuri polipeptidice uşoare şi două lanţuri grele; d) macromolecule care determină sinteza de anticorpi; e) atât a cât şi c sunt corecte. V 6.29. Imunitatea mediată celular este principala funcţie a: a) celulelor T; b) celulelor B; c) eritrocitelor; d) celulelor complementului; e) celulelor citotoxice. Proiectul pentru Învăţământ Rural

265

De la celulă la organism

V 6.30. Ce sunt plasmocitele sau celulele plasmatice? a) forme imature ale celulelor T; b) celule care produc puţini anticorpi; c) celule efectoare ale imunităţii umorale; d) celule care sunt responsabile de memoria imunologică; e) celule care sunt responsabile pentru fagocitoza organismelor străine. V 6.31. Care dintre aceste celule secretă anticorpi? a) celulele T helper; b) macrofagele; c) celulele bacteriene; d) celulele plasmatice; e) celulele T citotoxice. V 6.32. Ce atrag celulele T helper către macrofage? a) limfotoxinele; b) anticorpii; c) interferonii; d) interleukinele; e) antigenele V 6.33. Care dintre următoarele afirmaţii descrie cel mai bine diferenţa dintre modul în care celulele B şi celulele T citotoxice răspund la invadatori? a) celulele B conferă imunitate activă; celulele T conferă imunitate pasivă; b) celulele B omoară virusurile direct; celulele T citotoxice omoară celulele infectate cu virus; c) celulele B secretă anticorpi împotriva virusurilor; celulele T citotoxice omoară celulele infectate cu virus; d) celulele B realizează imunitatea mediată celular; celulele T citotoxice asigură imunitatea mediată umoral; e) celulele B răspund prima dată când invadatorii sunt prezenţi; celulele T citotoxice răspund în etapele ulterioare. V 6.34. Unitatea funcţională a ţesutului nervos este: a) corpul celular; b) neuronul; c) axonul; d) dendrita; e) creierul V 6.35. Neuronii comunică prin joncţiuni numite: a) joncţiuni înguste; b) desmozomi; c) joncţiuni „gap”; d) sinapse; e) discuri intercalare. V 6.36. Ce este cancerul şi cum diferă acesta de o tumoră benignă? V 6.37. Adenovirusurile, papilomavirusurile şi SV40 acţionează toate asupra aceloraşi gene sau produşi genici pentru a induce transformări. Care sunt acestea? V 6.38. Toate celulele noastre conţin proto-oncogene, care se pot transforma în oncogene care determină apariţia cancerului. Care dintre următoarele afirmaţii reprezintă cea mai bună explicaţie pentru prezenţa acestor „potenţiale bombe” în celulele noastre? a) proto-oncogenele provin din infecţiile virale; b) proto-oncogenele sunt în mod normal implicate în reglarea procesului de diviziune celulară; c) proto-oncogenele sunt „deşeu” genetic; d) proto-oncogenele sunt versiuni mutante ale genelor normale; e) celulele produc proto-oncogene ca rezultat al procesului de îmbătrânire. V 6.39. Fumătorii înrăiţi sau muncitorii care lucrează în medii industriale poluate cu cancerigeni chimici care induc mutaţii la nivelul ADN pot dezvolta cancere caracteristice obiceiurilor lor sau ocupaţiei după 10, 20 sau chiar mai mulţi ani după expunere. Sugeraţi o explicaţie pentru acest interval lung. V 6.40. Care dintre următoarele afirmaţii privind proto-oncogenele este falsă: a) codifică pentru proteine asociate cu creşterea celulară; b) sunt similare cu oncogenele evidenţiate la retrovirusuri; c) sunt produse prin mutaţii somatice induse de substanţe carcinogene; d) sunt implicate în producerea de proteine pentru adeziunea celulară; e) sunt gene care codifică pentru proteine implicate în diviziunea celulară.

266

Proiectul pentru Învăţământ Rural

De la celulă la organism

6.7. Bibliografie 1. Biologie cellulaire, Jean Michel Petit, Abderrahman Maftah, Raymond Julien, Masson, Paris 1997, Chapitre 6: De la cellule a l’organisme 2. Cell Biology, Thomas D. Pollard, William C. Earnshaw, Elsevier, 2004 3. http://www.geniebio.ac-aix-marseille.fr/- Ressources Multimédia en Biochimie Génie Biologique; Biotechnologies 4. http://www.bio.umontreal.ca/cours/Bio-1154/evolution.htm, Biologie cellulaire I 5. http://www.boskitos.com/fac/biocel/ Biologie Cellulaire PCEM1 6. http://www.web-books.com/MoBio/Free/Contents.htm, Molecular Biology Web Book Contents 7. http://www.snv.jussieu.fr/bmedia/sommaires/bc.htm, Biologie Cellulaire 8. http://schwann.free.fr/biocell03.html, Cours de Biologie Cellulaire 9. Biologie moléculaire, Abderrahman Maftah, Raymond Julien, Masson, Paris 1996 10. Biologie Moléculaire et Cellulaire, Exercices et corriges, Nathan Université, 1994 11. Biochimie, génétique, Biologie moléculaire, J Etienne, 3eme édition, Masson, 1996 12: Biologie cellulaire, Thomas D. Pollard, William C. Earnshaw, edition francaise, Elsevier, 2004, Chapitre 30, 31, 32, 33, 34: Interactions cellulaires et matrice extracellulaire 13, The Cell a Molecular Approach, Geoffrey M. Cooper, Robert E. Hausman, third edition, ASM Press, 2004, Chapter 15: Cancer 14. Biologie Cellulaire et Moléculaire, concepts et expériences, Gerald Karp, De Boeck Université, 1998, Chapitre 16 : Le cancer 15. Essential Cell Biology, An introduction to the Molecular Biology of the Cell, International Student edition, B. Alberts, D. Bray, A. Johnson, J. Lewis, M. Raff, K. Roberts, P. Walter, Garland Publishing Inc, 2004, Chapter 19: Tissues 16. Biology, N. A. Campbell, J. B. Reece, William Barstow, Editor, International Edition, Benjamin Cummings, sixth Edition, 2002, Chapter 34, 40, 43, 47, 48 17. Test Bank For Biology, N. A. Campbell, J. B. Reece, William Barstow, Editor, , Benjamin Cummings, sixth Edition, 2002, Chapter 34, 40, 43, 47, 48 18. Molecular Biology of the Cell, A problems approach, J. Wilson, T. Hunt, Garland Science, Forth edition, 2002 20. www.ustboniface.mb.ca, Bienvenue à la page d'accueil pour le cours Biologie 21. Molecular Biology, Lodish, Chapter 6: Integrating Cells into Tissues 22. www.med.univ-angers.fr, Licence de Biologie Cellulaire. 23. web-books.com, Molecular Biology Web Book Contents 24. http://www.cu.lu/labext/rcms/cppe/cellfr.html, CPPE Module S2: Biologie cellulaire 25. http://www.cbc.umn.edu/~mwd/courses.html, Course/Tutorial on Cell Biology 26. http://web.mit.edu/esgbio/www/7001main.html, Hypertextbook Cell Biology 27. http://www.univ-ag.fr/, Cours de Biologie cellulaire 28. www.emc.maricopa.edu/faculty/farabee/BIOBK/BioBookCHEM1.html, On-Line Biology Book: 29. http://www.infobiogen.fr/deambulum/index.php, DEAMBULUM - Cours en biologie : Biologie cellulaire

Proiectul pentru Învăţământ Rural

267

De la celulă la organism

Bibliografie minimală recomandată cursanţilor Cantar Liliana, Radu Dana, Bereneant Ana, Pivoda Carmen-Ana, Citologie si biologie celulara, Editura Universitatii Aurel Vlaicu, Arad, 2002, ISBN 973-9361-95-1 Costache Marieta, Anca Dinschiotu, Metode de analiză Biochimică, Vol I, Electroforeza, , ed. Ars Docendi, 2004, ISBN 973-558-137-X, Costache Marieta, Anca Dinischiotu, Biochimie Generală, vol II, Acizi nucleici: Structură şi organizare Ed. Ars Docendi, 2004, ,ISBN 973-558-134-5; 973-558-135-3 Cotruţ Constantin, Manual de lucrări practice de biologie celulară, Chişinău, Editura Tehnica, 1994, ISBN 5-85268-314-0 Cotruţ Carmen Elena, Cotruţ Constantin, Ionescu Cezar Radu, Cell and molecular biology, Apollonia, Iaşi, 1998, ISBN 973-9333-00-1, Crăciun Constantin, Florea Adrian, Dragoş Nicolae, Introduction to cell and molecular biology, Cluj University Press, 1999, ISBN 973-9354-91-2 Cruce Mihai, Mixich Francisc, Zaharia Cornelia, Citoscheletul şi motilitatea celulară, Aius Craiova, Colecţia Hipocrate, 1998, ISBN 973-9251-56-0, Cruce Mihai, Biologie celulară şi moleculară, Aius Craiova, Colecţia Hipocrate, 1999, ISBN 973-9251-87-0, Dinischiotu Anca, Marieta Costache, Biochimie Generala, vol I, Proteine, Glucide şi Lipide, , Ed. Ars Docendi, 2004, ISBN 973-558-134-5; 973-558-133-7, Dumitrescu Gabi, Biologie celulara, Mirton Cantar Liliana, Radu Dana, Bereneant Ana, Pivoda Carmen-Ana, Citologie si biologie celulara, Editura Universităţii Aurel Vlaicu, Arad, 2002, ISBN 973-9361-95-1 Gherman Ion, Teste şi sinteze de biologie celulara şi moleculară, All, Seria Medicina umană, Bucureşti, 1995, ISBN 973-571-045-5 Moldoveanu Elena, Popescu L.M., Apoptoza - Mecanisme moleculare, Editura Universitară Carol Davila, Bucureşti, 1999, ISBN 973-98145-4-7 Neacşu Ion, Cimpeanu Cristian Sorin, Biologie celulară-lucrări practice, 1999, Editura Universitatii Al. I. Cuza, Iaşi Nechifor Marina, Biologie şi Patologie celulară, vol 1, 2002, Ars Docendi, Bucureşti, ISBN 973-558-036-5 Puiu Liliana, Voiculet Nicolae, Biologia moleculară a celulei, 1997, All Educaţional Bucureşti, ISBN 973-571-198-2 Reut-Dirlea Auruta, Citologie şi biologie celulară, 2000, Solness Timişoara, curs universitar, ISBN 973-8145-21-X, Sincai Mariana, Biologie Celulară, Mirton Timişoara, 1998, curs universitar, ISBN 973-578-617-6 Teuşan Vasile, Biologie celulară animală, Editura Ion Ionescu de la Brad, Iaşi, 2000, ISBN 973-8014-20-4, Verdeş Doina, Muntean Ioana, Belengeanu Alina, Tosici Aftina, Biologie celulară şi Moleculară, Eurobit Timişoara, 1997, curs universitar, ISBN 973-585-254-3 Verdeş Doina, Mitocondria, Mirton Timişoara, 2000, curs universitar, ISBN 973-585036-2, Zamfirescu Stela, Biologie celulară şi moleculară, Ovidius University Press, Constanţa 1999, ISBN 973-9367-73-9

268

Proiectul pentru Învăţământ Rural