Biohemija skripta predavanja

UNIVERZITET U TUZLI MEDICINSKI FAKULTET 2013,2014 godina

1.BIOENERGETIKA

24.02.2014

Sad u suštini da vidimo prvo neke osnovne principe iz bioenergetike. Organizam čini jedno svojstvo da mogu preuzeti energiju iz okoline i da je mogu transformisati u drugi oblik. Živi organizmi imaju sposobnost da ekstrahuju energiju iz okoline i da je u suštini transformiraju to znači da je prevedu u onaj oblik u kojem se ona može koristiti za različite vrste rada u živom organizmu. Neživa materija nema tu sposobnost. Od onog kontrakcije mišića od onog kretanja na ćelijskom na nivou, za biosintezu bioloških makromolekula i drugih manjih bioloških molekula, za transport jona, dakle za sve one

procese koji zahtjevaju utrošak energije. Dakle živi organizam, uključujući u čovječiji može uzeti energiju i može je preoblikovati i u suštini to je ono što ćemo mi shvatiti kroz ove izučavanje metabolizma. Sad ćemo se vratiti samo da se podsjetimo na prvi zakon termodinamike, što kaže da ukupna energija sistema i njegove okoline jesu konstanta. Energija se ne moze niti stvoriti niti uništiti niti stvoriti ona može samo da promijeni svoj oblik. I drugi zakon termodinamike tvrdi da se procesi mogu odvijati spontano samo ako je zbir promjene energije sistema promjene entropije i promjene entropije okoline veći od nule, dakle sve ide uvijek prema stanju sve veće entropije, mada gledamo biosintetske procese, stvaranje zive materije to su oni procesi koji doprinose sniženju entropije i imamo one procese razgradnje koji ce doprijeniti povišenju entropije. I kada učimo u suštini biohemiju onda gledamo koji je to vazan biohemijski termodinamicki parametar koji ce govoriit o spoontanosti hemijske reakcije, to je promjena slobodne energije ∆G. Za nas su uvijek važne promjene slobodne enerrgije kad tumačimo metabolićke puteve i reakcije koje se obavljaju u reakcijama metaboličkih puteva. Promjena slobodne energije reakcije razlika je u slobodnim energijama produkata i slobodne energije reaktanata. I delta g zavisi samo od slobodne energije produkata i reaktanata, ono u suštini ne zavisi od molekulskog mehanizma kojim će se izvršiti transformacija a to je način na koji će raktanti biti prevedeni u produkte. Delta g govori kako je početno stanje i finalno stanje u reakciji. Promjena slobodne energije ne ogovri o molekulskom mehanizmu kojim će se neki reaktanti prevesi u produkte. Ako to pogledamo ovdje kao primjer imate sagorijavanje glukoze in vitro. Ako glukoza sagorijeva ići će ugljikovi atomi će se oksidirati u CO2 i nastat će finalno h2o. To je in vitro. Ako gledamo in vivo to je oksidacija glukoze koja počinje procesom glikolize to je metabolički put koji se odvija u više stupnjeva, neki od tih stupnjeva su u suštini reakcije oksidacije kada se finalno glukoza prevede do piruvata pa ide do oksidativne dekarboksilacije prevede u ACoA i on dalje ide u citratni ciklus i kada se nastavljaju reducirani koenzimi oksidiraju u mitohondrijskom lancu za prenos eletkrona pa nastaje voda i dobije energija za sintezu ATP onda u suštini in vivo glukoza će se prevesti u CO2 i do h2o, ali cijelim nizom enzimski kataliziranih reakcija, ali u ovom slučaju promjena slobodne energije je jednaka, ali bez obzira da li se odvija in vitro ili in vivio. Reakcija će se odvijati spontano sad samo ako je promjena slobodne energije negativna. To znači ako u suštini produkti reakcije imaju niži sadrzaj slobodne energije od reaktanata. I takve reakcije su onda egzergone reakcije, ali odvija se i drugi tip reakcija to su one reakcije u kojima iz reaktanata nastaju produkti koji imaju veći sadrzaj slobodne energije i da bi se takve reakcije odvijale njima je potrebno dopremiti energiju i onda se one nazivaju endergonim reakcijama. Ako je promjena slobodne energije jednaka nuli onda je sistem u ravnotezi, tj da je reakcija dostigla ravnotzeno stanje. Sad u suštini pogledat ćemo reakciju u kojoj su reaktanti A plus b, daje proizvode c plus d i daju izraz za promjenu slobodne energije koji govori o spontanosti reakcije čemu je jednak – promjena slobodne energije za ovu reakciju jednaka promjeni standardne slobodne energije RLTN kroz umnozak koncentracije produkata puta kroz umnozak konc. reaktanata, i ovo je u suštini za vas veoma vazan izraz. ( formula ) ∆G0 – šta znači? To je promjena standardne slobodne energije. R je gasna kons. T je apsolutna temp koja je data u kelvinima i ovo koncentracija c d a b to su molarne konc. ili reaktiviteti reaktanata i produkata. Sad kada pogledamo ovaj izraz promjena slobodne energije zavisi od dvije stvari – od hemijske prirode reaktanata i produkata, i tu hemijsku

2

prirodu odrazva delta g nula, drugo od cega zavisi promjena slobodne energije za neku reakciju – od konc. reaktanata i produkata i taj faktor odrazva drugi dio izraza to je RTLN, umnožak koncentracije produkata sa umnoskom konc. reaktanata. I ono što će govoriti da li će neka hemijska reakcija ici spontano ili ne to je ∆G a ne ∆G0. Da vidimo sta je ∆G0? To je promjena slobodne energije reakcije u standarnim uslovima. Šta su oni? To su 25°c koji se iskazuju u kelvinima (298 °K), zatim to su jednomolarne početne konc reaktanata i produkata, ako u suštini neki gas sudjeluje u reakicji standarni uslov podrazumijeva parcijalni pritisak od 101,3 KPa. Ako u reakciji sudjeluju H+ joni standarni uslovi znace da je konc njih jednomolarna a to znaci da je pH nula. Ako gledamo konc. vode na jednom litru, to su jednomolarne konc, a jedan litar sadrzi 55,5 mola vode pa to je jedna konst. vrijednost. Kada gledamo ∆G0 to je promjena slobodne energije za neku reakciju pod standarnim uslovima. Gledajte sta je vazno – imamo i rekatante i produkte u istim koncentracijama i sad u sutini reakcija ce se odvijati od stanja vise ka stanju nize slobodne energije dok se ne uspostavi ravnotezno stanje. Za one reakcije u kojima reaktanti imaju visi sadrzaj slobodne energije od produkata ravnoteza je pomjerena na stranu produkata. Ako imamo reakciji gdje reaktanti imaju nizi sadzraz energije od produkata onda ce reakcija biti pomjerena u lijevo na stranu reaktanata. Delta g nula i konst. ravnoteze su u tijesnoj vezi. Ako je poznata delta g nula mozemo izracunati konst. ravnotezu. U bihemiji in vivo nije pH nula, sve je u pH neutralnoj sredini pa su biohemijske transformacije slobodne energije definisane kod konc h + jona sa 10 na -7, kod pH 7 i onda su ove promjene stand. slobodne energije koje vaze u zivim sistema oznacene sa ∆G0'. I imamo isti slučaj 25 c (298 °K), jednomolarne poćetne koncentracije produkata i reaktanata ako sudjeluje neki gas pp gasa je 101,3 KPa, konc. H+ je 10 na -7 za razliku od ovoga kako inace hemicari i fizicari uzimaju stand uslove, sad u sustini ako u reakcijama u kojima sudjeluje ATP potrebno je prisustvo Mg jona pa ti standarni uslovi ukljucuju i jednomolarnu konc. Mg jona ( moze biti i manganov jon). ∆G0' je promjena standarnde energije i ima karakterističnu vrijednost za datu reakciju koja se ne mijenja. ∆G0' je razlika izmedju sadrzaja slobodne energije produkata i reaktanata pod standarnim uslovima. Promjena standarne slobodne energije je konst. i ima karakteristicnu vrijednost za reakciju koja se odvija i to vazi i za delta g nula i za delta g nula prim kod ph 7. Ako je delta g nula negativno produkti sadrze manje energije od reaktanata i reakcije je spontana pri standarnim uslovima, sve hemijske reakcije imaju tendenciju da se odvijaju u smijeru koji vodi snjizenju slobodne energije. Pozitivna vrijednost delta g nula prim znaci da produkti reakcije sadrze vise slobodne energije od reaktanata i da ako se otpocne od jednomlarnih konc. svih komponenti u smjesi ova reakcije ce imati tendeciju odvijanja u suprotnom smjeru, ravnoteza bi bila na strani reaktanata. Kriterijum spontanosti odvijanja biohemijske reakcije je ustvari promjena slobodne energije a ne slobodne standarnde slobodne energije. Sta se desava u hem reakcija koje se odvijaju u metabolickim putevima? U sustini kod podesavanja koncentraicja promjena slobodne energije moze biti negativna i reakcija se moze odvijati. (formula RTLN kroz...) – kada je reakcija u ravnotezi onda vise nema pokretacke sile u bilo kojem stanju znaci izjednacavaju se brzine reakcije u jednom i drugom smjeru, i onda gledamo sljedece. Izraz ce se promijeniti u stanju ravnoteze u sljedece. ∆G0 je u stanju ravnoteze pa je jednako ∆G0' + RTLN kroz umnozak konc produkata sa umnoskom konc reaktanata. Sad ako ovo prebacimo preko znaka jednakosti slijedi izraz da delta g nula prim jednako je minu RTLN kroz umosak konc. produkata sa konc.

3

reaktanata. To je konstanta hemijske ravnotezi. Onda dobijemo najvazniji izraz to je da je promjena slobodne standarne energije jednaka je minus RTLN od konst. ravnoteze hem. reakcije i taj izraz direknto povezuje promjenu standarne slobodne energije sa konstantnom ravnoteze za datu reakciju. Sad sta se desava u metabolizmu, da bismo vidjeli u metaboluzmu se desava sljedece. Psotoje u metabolizmu reakcije koje su termo dinamicki favorizovane, to su one cija je promjena slobodne energije negativna. I postoje reakcije koje su termodinamicki nefavorizovane i to su one endergone koje traze dopremanje energije. Sta se desava u sutini? kako jedna reakcija koja je termodinamicki nefavorizovana moze da se ipak odvija spontano – to je ako je vezana sa nekom termodinamicki favorizovanom ili egzergonom reakcijom. Znaci ako imamo u metbolickim putevima ili uopste termodinamicki nefavorizovane endergone reakcije njihovo odvijanje omogućava se kako? Tako sto se kuplovane ili vezane sa nekom termodinamicki favorizovanom reakcijom – egzergonom. Kada pogledamo prvo taj slucaj tu imam da se neki reaktant a prevodi u produkte c i d i promjena slobodne slobodne energije je +21 KJ po molu, sta to znaci? To znaci da je ova reakcija endergona i da d i c imaju veci sadrzaj energije od a. I ovo je termodinamicki nefavorizovana reakcija. Sta je moze porkenuti? moze je pokrenuti ako je vezana sa nekom egzergonom reakcijom u kojoj se B jedan od proizvoda ove prve reakcije prevodi u sljedecoj reakciju koja je egzergona i ∆G0' = -34 KJ/mol. Ako pogledamo produkt prve reakcije on je reaktant u drugoj reakciji i zbirna reakcija je da ce se a prevesti u d + c. Kakva je promjena slobodne energije ukupno u ova dva stupnja? Jednostavno se sabire. Delta g nula prve reakcije 21 + delta g nula druge reakcije -34 = -13 KJ/mol. U sustini reakcija ce se odvijati transformacija a u c+d, promjene slobodne energije se sabiru kod svih stupnjeva. Jednostavan primjer je reakcija glukoze i sl. drugi bioloski spojevi se moraju prevesti u spojeve koji imaju veci sadrzaj slobodne energije. Da bi glukoza isla u bilo koje metabolicke puteve mora u sustini u aktiviranom obliku. Jedan od nacina je za neke metabolicke puteve je da se fosforilira u glukoza 6 fosfat. Ako imamo samu reakciju glukoza plus anorganski fosfat pa da nastane glukoza 6 fosfat ona je endergona reakcija. Zasto? Zato sto glukoza 6 fosfat ima veci sadrzaj slobodne energije od nefosforilisane glukoze. Ali u sustini kako se glukoza moze prevesti u glukoza 6 fosfat? Ako je vezana sa jednom egzergonom reakcijom a to je reakcija u kojoj ce se ATP cijepati na ADP i anorganski P. Pri tome se cijepa jedna fosfoanhidrinska veza u ATP. Ako pogledamo ova reakcija cijpanaj te veze je visoko egzergona i iznosi 30,5 KJ/mol. Ako pogledamo dvije reakcije anorganski P i anorgansi P se iskoristavaju a voda i voda se ponistavaju i imamo reakciju ATP + glukoza dat ce ADP + glukoza 6 fosfat. I u sustini promjena standarnde slobodne energije iznosi za prvu reakciju 13,8 KJ/molu za drugu -30,5 a ukupno je 16,7 KJ/mol. Ukupna reakcija cijepanja veze u ATP ce pokretati nastajanje glukoza 6 fosfata. Kako se to in vivo desava? Ako imamo glukoza + ATP + glukoza 6 fosfat + ADP – kako ce se to odvijati? Tacno je kad ATP predje u ADP da se cijepala jedna anhidridna veza, ali reakcija je isla prenosom fosfatne skupine sa ATP na glukozu, a enzimi koji kataliziraju prenos fosfatne skupine sa ATP na neki supstrat nazivaju se kinaze. Kinaze spadaju u transferaze. One kataliziraju prenos terminalne fosfatne skupine sa ATP na glukozu, nastaje ADP i fosforilirani oblik glukoze.

4

Sad u suštini da objasnimo na koji nacin se odvija tok slobodne energije u bioloskom sistemu. Mislim onaj spoj preko kojega se u biološkom sistemima odvija tok slobodne enegije je ATP. Ako se vratimo na prethodnu reakciju tu imamo tok slobodne energije od glukoze do glukoza 6 fosfata. To je jedan najjednostavniji primjer gdje je preko ATP se odvijao tok slobodne energije. Sta je prvo ATP? To je nukleotid sastavljen iz adenina na koji je glikozidno vezana riboza i na ribozu je vezana trifosfatna jedinica. In vivo funkcionalan atp ima uvijek uvijek vezan neki kovaletni jon to je MG ili Mn. Zato se pri standardnim uslovima uzima i jednomolarna koncentracija tih jona. Sad ako pogledamo ovaj spoj koje tipove veze imamo? Fosfat je vezan na 5' oh skupinu riboze esterskom vezom. A druge dvije veze u trifosfatnoj jedinici su fosfoanhidridne veze. Anhidridne veze nastaju kada kiselinske skupine se vezu uz izdvajanje vode i te anhidridne veze se nazivaju energijom bogate veze. Ako se hidrolitički cijepaju veze onda se oslobađa energija i imaju visoko negativne promjene standarne slobodne energije, znaci oslobodit ce se slobodna energija ako se te veze cijepaju zato se i nazivaju energijom bogate veze. Sad ako pogledamo ATP ako se sa atp odcjepljuje terminalni fosfat nastaje ADP plus anorganski fosfat, cijepat ce se fosfoanh. veza. Ako se ATP cijepa na AMP i anorganski difosfat ( koji se naziva pirofosfatom) cijepa se prva fosfoanhidrinska veza. Ono sto moramo odmah zapamtiti ako nastaje pirofosfat – to su dva fosfata vezana fosfoanhidrinskom vezom i cijepanjem ove veze oslobadja se energija. Sad da vidimo u suštini ATP energijom bogata molekula i njegova trifosfatna jedinica sadrzi dvije fosfoanhidrinske veze i sad imamo promjene stand. slobodnih energija kod ph 7 za cijepanje ATP hidrolicitko otcjepljenje anorganskog fosfata kada ce nastati , ADP i anorganski fosfat ∆G0' je -30,5 KJ/mol. Ako imamo drugi slucaj da se ATP cijepa na AMP i anorganski difosfat ili pirofosfat cijepat ce se prva fosfoanhidrinska veza i promjena s. slobodne energije iznosi -45,6 KJ/mol. Ako gledamo samu promjenu slobodne energije sa hidrolizu ATP u ćelijama u kojima koncentracije ATP i anorganskog fosfata nisu jednomolarne onda promjena slobodne energije za cijepanje ovih veza je jos negativnija i kazemo jos egzergonija reakcija. Imamo drugi izraz to je onaj RTLN umnozak koncentracije produkata i reaktanata u standardnim uslovima , a sada se dodaju koncentracije, tada slobodna energija reakcije ATP, ADP, AMP, anorganskog difosfata jos negativnija. Kreće se u rasponu od -50 do -65 KJ/mol. Kako to izgleda u djecijim eritrocitima. Konc. ATP je 2,5 mmola, ako izrazavamo u molarnim koncentracijama to je 2,5 x 10 na -3 mola, a ADP iznosi 0,25 mmola ili 0,25 x 10 na -3 mola ili 2,5 x 10 na -4 mola, anorganskog P 1,65 mmola. Sada u sustini gledamo ∆g=∆g0 – 30 500 KJ/mol ... RTLN x umnozak konc. produkata/umnozak konc. reaktanata, kada se izracunamo imamo -51 KJ/mol. Zasto?Zato sto na promjenu slobodne energije cijepanja ATP na ADP i anorganski fosfat uticu koncentraicje produkata i reaktanata ove reakcije. Dakle jos su negativnije i jos su egzergonije te reakcije. Sada vidimo sljedece. Koja je u sustini strukturna kada govorimo o ATP onda govorimo o spoju koji ima visok fosforilirajuci potencijal. ( Slajd prepisati! ) To znaci da ATP ima visok potencijal da preda svoju fosfatnu skupinu nekoj drugoj molekuli koja ce se fosforilirati. Sada se pitamo sta je strukturna osnova u strukturi ATP zbog koje on ima visok fosforilirajuci efekat? I to je sada prvi faktor je elektrostatska odbijanja ovih negativnih naboja u trifosfatnoj jedinici, u trifosfatnoj jedini kod fiziološkog pH nalaze se 4 negativna naboja – ti negativni naboji nalaze se na malim rastojanjima i izmedju njih postoje visoka elektrostatska odbijanja. Ako dodje do

5

otcjepljenja ove fosfoanhidridne veze pa ATP predje u ADP i anorganski fosfat te elektrostatske repulzije se smanjuju. Drugo sto doprinosi tom visokom fosforilirajucem potencijalu je to sto ovaj anorganski fosfat se stabilizara uspostavljanjem rezonantnih struktura koje su u osnovi veoma slicne. Pri tim rezonantim strukturama svaka od veza izmedju atoma fosfora u oskigena u fosfatu ima podjednako izrazen karatker dvostruke veze i ovaj h+ jon nije permanentno ili fiksno vezan za bilo koji od ovih atoma oksigena u samom fosfatu. Svi ovi rezonantni oblici nisu moguci ako se on nalazi u trifosfatnoj jedinici. Drugo ako dodje do odcjepljenja anorganskog fosfata onda ova skupina sa ADP ce jako brzo disocirati i otpustit ce H+ jon u sredinu gdje je konc. h+ jona niska a to je 10 na -7 molarna kod fizioloskog pH. I u suštini sljedeće to su solvatacijska svojstva. Na trifosfatne jedinice se veze na polarne skupine, hidratacijski plastovi. Solvatacijska svojstva su veca u ADP i anorganskom fosfatu nego u samom ATP. To su one strukturne osobine zbog kojih ima visok fosforilirajuci potencijal. Ako imamo ATP u vodenoj otopini – inace ima visok potencijal da preda fosfatnu grupu i on je termodinamicki nestabilan ali u vodenoj otopini on je veoma stabilan ( hemijski govoreći on je kineticki stabilan – to znaci da reakcija hidrolize otcjepljena fosfatne skupine nece odvijati ili ce se odvijati toliko sporo da ne mozemo registrovati ). Sa kojom velicinom je to vezano – sa energijom aktivacija za neku hemijsku reakciju. On je termodinamicki nestabilan, lako bi predao fosfatnu skupini ali je u otopini je stabilan zbog visoke energije aktivacije za hidrolitičko cijepanje anhidrinske veze – ona iznosi 200-400 KJ/mol i kazemo da je taj spoj termodinamicki nestabilan,a kineticki stabilan. Potrebno je da reakciju kataliziraju enzimi koji ce kada se vezu sa supstratom sniziti energiju aktivacije. Ti enzimi su kinaze i spadaju u transferaze.

ATP obezbjedjuje energiju prenosom grupe a ne jednostavno hidrolizom – to moramo znati! Hemijska svojstva ATP su kljucna za njegovu ulogu u metabolizmu i mada je u vodenoj sredini termodinamicki nestabilan i dobar donor fosfatne skupine on je kineticki stabilan. U čemu ćemo mjeriti taj fosforilirajuci efekat koji ima ATP – to se izrazava u promjeni standardne slobodne energije pri hidrolitičkom cijepanju anhidridne veze u ATP-u. Jednostavno taj fosforilirajuci potencijal se iskazuje kao ∆G0' za reakciju hidolitičkog cijepanja fosfoanhidrine veze u ATP. To je -30,5 KJ/mol. A ono sto je vazno je da ATP nije jedini spoj koji ima visok fosforilirajuci potencijal. U organizmu su prisutni i drugi spojevi koji imaju visok fosforilirajuci potencijal. Neki spojevi imaju i visi potencijal za prenos fosfatne grupe. ( slajd sa spojevima i vrijednosti potencijala –

6

TREBA ZNATI ! )

2.METABOLICKI PUTEVI: ANABOLIZAM,KATABOLIZAM,OKSIDOREDUKCIJE.

7

Prosli puta smo tumacili metabolizam, rekli smo da je to cjelokupnost hemijskih reakcija koje se desavaju u cijelom organizmu kroz metabolicke puteve. Metabolicki putebi su enzimski katalizirae reakcije, u kojim se polazna supstanca metabolickog puta prevodi u produkt tog metabolickog puta. Obicno se desavaju relativno male enzimske promjene, a kada posmatramo metabolizam onda se cini da se radi o ogromnom broju enzimskih reakcija. Metabolicki putevi su medjusobno isprepletani i cesto dijele neke zajednicke metabolite(a sve to zavisi od potreba celije). Ako gledamo metabolizam, imamo-prvo da razjasnimo sta imamo strateski. Imamo one puteve-katabolicke puteve,to su putevi razgradnje. One gorivne supstance, ugljeni hudrati,masti i proteini cijom razgradnjom treba da se obezbjedi energija -idu u katabolicke reakcije,pri cemu se prevode u mnogo jednostavnije supstance koje su energetski siromasni spojevi. Sustina ovih katabolickih puteva je da se obezbjedi energija koja je potrebna organizmu. Na koji nacin? U tim metabolickim putevima,koji se odnose na katabolizam i ragradnju gorivnih supstanci u sustini odvijaju se oksidoredukcijske reakcije. Slobodna energija se u tim procesima odmah koristi za sintezu ATP-a. I drugo kada idu ti putevi razgradnje,najcesce tu imamo oksidacije enzimski katalizovane koje se odnose na dehidrogenaze,odnosno uz kataliticko djelovanje dehidrogenaza. Ako je takav tip oksido redukcija onda imamo 2 kljucna koenzima u reakcijama to su NAD+ koji ce se reducirati u NADH i to su FAD i FADH koji ce se reducirati u FADH2. Ako idu anabolicke reakcije,ice preko jednostavnijih prekursora-odvija ce se biosinteza molekula. Uz aminokiseline ide biosinteza proteina,iz monosaharida ide biosinteza polisaharida, a iz njih nukleinskih kiselina. Ali anabolicki putevi podrazumjevaju jos jedan tip biosinteza, kad se purinski i pirimidinski nukleotidi ugradjuju u neke slozenije spojeve. Sustina je da takvi procesi uvjek zahtjevaju utrosak energije,i tu ce energiju obezbjediti ATP. Drugo sto je vazno ako razmatramo koenzima, to je da anabolicki putevi u sustini zahtjevaju reakcije redukcije-kljucni koenzim je NADPH koji se pri tome oksidira u NADP+. NADPH-funkcija reducenasa u biosintetskim putevima(anabolickim) NADP+,NADPH-fukcija oksidanasa u katabolickim putevima Degradativna faza,ili faza razgradnje u metabolizmu To je faza u kojoj se organske molekule prevode u spojeve tipa CO2,NH3...mlijecnu kiselinu,vodu. Pritom katabolicki putevi su vazni zato sto oslobadjaju energiju od koje se nesto postigne stvaranjem ATP-a,i reduciranjem ostatka elektrona Reakcije anabolizma-to su biosintetske reakcije u kojim se iz malih prekursora izgradjuju vece i slozenije molekule,one zahtjevaju dotok energije kako ce se dopremiti energija-po potencijalu za prenos fosfatne skupine uz ATP.Preko ATP-a se provodi tok slobodne energije u bioloskim sistemima i zahtijevaju reducirajucu snagu u ovom slucaju NADPH. Strajer-sematski prikaz metabolizma:

8

Ovo je biostrateski pregled. Nutritijenti koji zadrze energiju idu putem katabolizma, nastace energijom siromasniji i jednostavniji spojevi,sustina je da se odvijaju oksidoreduktacijske reakcije kljucni koenzimi su NAD+,NADP, koji imaju funkciju oksidanasa,oni ce se ovdje reducirati,slobodna energija reakcija oksidacija iz ovih katabolickih puteva bice iskoristena za biosintezu ATP-a.To su procesi kojom se celija,odnosno organizam obezbjedjuje energijom. Drugi su anabolicki putevi gdje se iz polaznih molekula biosintetizuju one slozenije molekule,organizam ima sposobnost da in vivo sintetizuje i neke AK(da se sintetizuju purinski i pirimidinski nukleotidi,a otatla i biosinteza N.K.) 2.1.Biološke oksidacije i redukcije i tipovi oksidacija i redukcija koji se nalaze u bioloskim sistemima. Prenos fosfatnih grupa sa ATP-a je jedno od vaznih obiljezja metabolizma. Drugo i podjednako vazno je druga vrsta transporta,transvera elektrona u oksiroredukcijskim procesima. Uvjek cemo govoriti o transveru elektrona i to uvjek podrazumjeva da se neka molekula ako predaje elektrone oksidirala,a ako prima reducirala. Reakcije ukljucuju gubitak elektrona sa 1 hemijske vrste,ona koja izgubi elektron se oksidira s tim da ce elektrone morati da primi neka druga hemijske vrsta koja se pritom reducira. Kad se gleda metabolizam moramo imati u vidu da je tok elektrona u oksidoredukcijskim procesima direktno ili indirektno odgovoran za cjelokupni rad koji vrsi organizam,jer

9

oksidoredukcije pored sto podrazumjevaju tok elektrona,podrazumjevaju i to da se slobodna energija koristi za sintezu ATP-a i daj energiju za vrsenje razlicitih biosintetskih procesa,odnosno razlicitih vrsta rada. Elekroni se po tipovima reakcija sa 1 molekula ili hemijske vrste koja je donor elektrona prenose na 2 koja je akceptor na 1 do 4 razlicita nacina u bioloskim sistemima.

Ti nacini su sledeci: 1.Da se prenose direktno kao elektroni Fe(+2)+Cu(+2).......Fe(+3)+Cu Recimo imamo prenos jona sa Fe 2+ na Cu 2+ jon. Ako Fe 2+ jon preda elektron on prelazi u vise oksidacijsko stanje Fe3+,a onaj koji primi elektron ce se reducirati i to podrazumjeva postojanje u sustini 2 produktirana (Fe 2+ i Fe3+ i Cu2+ i Cu+) Transver moze ici preko proteina, jednostavan primjer prenosa elektrona direktno u obliku. 2.Da se elektroni prenose sa jedne hemijske vrste u drugu u obliku atoma hidrogena AH2-------A+2e- + 2H AH2+B-----A+BH2 Ako pogledamo iz cega je sastavljen atom H iz protona i iz elektrona. Sa neke hemijske vrste se ukloni atom H,i onda se u sustini sa atoma H uklonio elektron i to je doslo do oksidacije. Obicno kad idu ove reakcije dehidrogenizacije uklanjaju se 2 atoma H. Ovdje se pogleda samo ona supstanca koja se oksiduje,u reakciji. Opsta formula AH2 ako se uklone 2 atoma H ona ce se oksidirati. Ali da bi postojala hemijska reakcija mora postojati spoj koji ce te elektrone tj.atome H primiti i pri tome se reducirati. U ovom tipu oksidoredukcija odvija se dehidrogenitacija. Koenzim koji sudjeluje je (ako se sa 1 molekula uklanjaju 2H)-FAD i MMF i oni se nalaze trajno vezani za proteinski dio enzima-flavoproteini. Da bi presao u FADH2 i MMFH2. Ono sto je kljucno da se prvo vratimo na strukturu tog koenzima FAD(Flavin adenin dinukleotid).Reaktivni dio je izoaleksazinski prsten moze da primi 1 atom H,H+ i elektron,ako primi 1 nastace semikinonski prsten, ako primi 2 atoma nastace potpuno redukovani FADH2. Reakcije oksidacje ako ucestvuje FAD su reakcije uvodjenja dvostrukih veza. Posmatra se reakcija pa ce se dehidrogenize sa koenzima FAD I MMF suidjelovati u onim rekcijama oksidacije u kojima su u hemijsku vrstu uvodjene = veze. Dehidrogenizacija----osl.H2----enzim katalizira(dehidrogenaze-flavoproteini)----FAD kao oksidans, onda ce nastati R-C=C-CHOH-CH2-----+NADH2.Uklonilla su se 2 H atoma,to je ekvivalent 2H2(+) + 2e-. Normalno da se promjenilo oksidirajuce stanje atoma C,i taj atom C je u oksidiraniranijem stanju od onog prvog. FLAVINSKI NUKLEOTIDI SU UVJEK CVRSTO VEZANI ZA PROTEINSKI DIO NUKLEOTIDA KAO NJIHOVE PROSTETICNE GRUPE. (Koenzim FAD kod ovih reakcija). 3.Kada se sa neke hemijske vrste elektroni uklanjaju u obliku hidridnog jona.(:H-) -ovo se desava pri djelovanju dehidrogenaza uz koenzim NAD.

10

Ova oksidoredukcijska reakcija u kojoj se sa spoja koji se oksidirao elektroni uklanjaju u obliku hidridnog jona koji sadrzi 1 proton i 2 elektrona,i zato se uvjek obiljezava kao H3O+ jon. A ovo se desava preko dejstva dehidrogenaza u cijim reakcijama sudjeluje NAD+. Ovdje imamo sledeci slucaj. On je u vodi rastvorljivi nosac elektona i nije vezan za proteinski dio dehidrogenaza. Osim toga on funkcionira kao koenzim,ali ua razliku od FAD koji je trajno vezan za protein on je mobilni nosac elektrona I u ovim oksidoredukcijama on fukcionira kao koenzim i on i supstrat ce se vezati za aktivno mjesto enzima,desice se transver reducirajucih ekvivalenata i onda ce NAD da disocira. Nije trajno vezan. Struktura:Nikotin amin adenin di nukleotid. Onaj dio koji je reakcitan je nikotin amin. Moze primiti hidridni jon jer je u nikotin aminu atom H +4,i ima pozitivan naboj zbog toga ce se ta struktura jako lako primiti hidronijum jon,koji potice sa neje hemijske vrste. Ako je primio hidronijum jon(on je u redukovanom obliku trovalentan i ima sloibodan elktronski par)ako je primio hidronijum jon,primio je 2P i 1E i jos se otpusta ovaj proton,oznacen kao H+. Ide reakcija dehidrogenizacije sa hemijske vrste ce se ukloniti 2 atoma H, NAD+ ce primiti hidridni jon i jedan H+ proton ce se osloboditi. U kojem tipu oksidoredukcija ce sudjelovati? Ovaj koenzim sujdeluje u onim reakcijama oksidacije u kojim ALKOHOLNA SKUPINA OKSIDIRA U KETO SKUPINU! Imamo NAD+ i da bi se alkoholna skupina oksidirala,moraju se ukloniti 2 atoma hidrogena. Jedan tip-oksidacija/dehidrogenizacija uz uvodjenje = veze,onda se nukloeotidi prevode,alkoholna skupina se prevodi u keto skupinu pa su to dehidrogenaze koje kao koenzim koriste NAD+. Koenzimi su u vezi sa vitaminima,pa se ovdje moze reci da je NAD+ u vezi sa nikotinskom kiselinom ili niacinom. Taj vitamin je neophodan da bi organizam raspolagao dovoljnim kolicinama NAD+. Nesto nikotin amina u met.AK triptofana se dobije. Ako imamo FAD+ on je u vezi sa riboflavinom,tako da je ovi vitamini trebaju da bi funkcionirao energetski metabolizam(NIACIN i RIBOFLAVIN). 4.Direktnim vezivanjem sa oksigenom(u ovom slucaju oksigen se vezuje sa organskim reduktantom) R-CH3 + 1/2 O2-------R-CH2-OH Imamo CH3 skupinu i ovdje imamo CH2OH skupinu doslo je do reakcije hidroksilacije pri cemu je u neki organski supstrat uveden atom hidrogena. A taj atom O potice iz molekulskog oblika. Termin reduktirajuci ekvivalent se koristi da bi se oznacio ekvivalent od jednog elektrona koji sudeluje u reakciji oksidoredukcije,bez obzira da li je ovaj ekvivalent sam elektron,atom hidrogena,hidridni jon ili se transver elektrona odvija u reakciji sa oksigenom,uz nastajanje oskidiranog produkta reakcije. Ali uz biohemiji biolosko gorivne molekule obicno se oksidiraju trako sto se vrsi dehidrogenizacija i ta dehidrogenizacija ukljucuje odvajanja 2 atoma H2,a u biohemiji reducirajuci ekvivalent podrazumjeva 2e-. Zato kazemo da oksigen finalni akceptor svih elektrona u oksidoredukcijskim reakcijama bioloskih sistema molekula-to ostvarujemo putem disamnja, gdje se odvija oksidacija,redukcija koencima. I finalno dakle elektrone sa ovih hemijskih vrsta u toku

11

katabolizma prihvatice dajke molelkula O2. Kad primi el-, on ce se reducirati u O2- sa H+ jonima kao drugi krajnji produkt razgradnje gorivnih supstanci. Zato se kaze da sa reducirajucih ekvivalenata kao supstrata prelaze na oksigen. Ovo su neki skolski primjeri sta se desava u katabolickim reakcijama, ako se pogleda oksidacijsko stanje od ova 2C atoma,elektronegativniji je onaj koji vise za sebe vezuje elektrona.

*Strateški pregled katabolickih puteva: Prva faza:

Druga faza:

12

Treca faza:

13

Put kojim glukoza ide u katabolicki put-naziva se GLIKOLIZA,koja joj ustvari omogucava prevodjenje u piruvat. Ovaj sada piruvat ide u posebnu reakciju oksidativne dekarboksilacije, i prevodi se u AcetilCoa,koja je aktivirana acetatna kiselina. Sta ovdje znaci odvodjenje ekektrona?To znaci da ce se u glikolizi desavati neke reakcije oskidacije,jer ce se sa odredjenih vrsta uklanjati elektroni,ili u glikolizi obicno NADH+. Ako imamo masne kiseline one idu isto tako putem koji se naziva beta oksidacija masnih kiselina pa ce se one beta oksidacijom razgradjivato do Acetil Coa. U katabolizmu masnih kiselina,desavaju se oksidoredukcije gdje se sa odredjenog intermediuma uklanjaju reducirajuci ekvivalentni. Ono sto je najslozenije je katabolizam AK,uklanja se alfa amino skupina,ono sro ostane su ugljenikovi skeleti,onda idu razlicitim putevima razgradnje,svaka razlicito pa se prevode u acetil Coa,i neke intermedijere citratnog ciklusa. Kada nastane acetilCoa,u katabolickim putevima,on ulazi u kruzni metabolicki put u kome se sabiru putevi razgradnje UH,proteina,AK,i MK. To je citratni ciklus odnosno ciklus limunske kiseline. U samom ciklusu limunske kiseline, to je onaj metabolicki put u kome se stvara 02 koji se izbacuje procesom disanja. I drugo od 8 reakcija ovog kruznog puta 4 su reakcije oksidoredukcije gdje dolazi do oksidacije i sa odredjenih intermedijera citratnog ciklusa se uklanjaju reducirajuci enzimi. Ko ce ih prihvatizti,vidi se ovdje,i one elektrone iz prethodnih puteva. A elektroni iz citratnog ciklusa prihvatice NAD ILI FAD i pri tome ce se reduciratireducirani koenzimi koji se nazivaju reducirani nosaci elektrona. I u sustini u finalnoj

14

fazi,treba da dodje do katabolickih puteva-nastaje jedan od krajnjih produkata a to je CO2. Sad treba vidjeti gdje c doci do finalne oksidacije,do oksidacije ovih reduciranih nosaca elektrona ce doci u mitohondrijskom nacinu transporta,ili respiratornom lancu. U respiratornom lancu elekrona doci ce do oksidoredukcija ovih redukciranih koenzima, a akceptor je molekula kiseonika koji kad prihvata elektrone se reducira i sa H+ jonima daje drugi krajnji produkt metabolizma a to je H2O. A ovaj proces je oksidativna fosforilacija, odvija se niz oksidoredukcijskih reakcja,slobodna energija ovih reakcija bice iskoristena za sintezu ATP-a iz AMP-a ili anorganskog fosfata. I zato ovdje imamo oksidativnu fosforilaciju a kad tumacimo to sa biohemijskog aspekta ona je najkompleksnija. Na taj nacin se reguliraju metabvolicki putevi. Slozena mreza reakcija koja cini intermedijerni metabolizam,mora biti u sustini strogo kontrolisana a ta kontrola mora biti fleksibilna jer su uslovi u kojim se nalazi neka celija mjenjaju pa se metabolicki putevi moraju prilagoditi uslovima unutar i izvan celije. Kontrola mora biti: STROGA I FLEKSIBILNA(jer vanjski uslovi nisu konstantni) 2.2.Mehanizmi regulacije metabolizma 1.Kolicinom enzima: Celija se nadje u nekim uslovima gdje neki put mora biti intenzivan da se odvija. Jedan od nacina da su povecane transkripcije gena a onda i translacije za kljucne enzime tog metabolicnkog puta. To znaci da dodje do povecanja sinteze enzima datog metabolickog puta,ili se poveca stupanj ekspresije gena za enzime datog metabolickog puta,odmah se poveca nivo enzima,jednostavno ih je mnogo vise kao katalizatora. To znaci da ce se translacijom sintetizirati u sustini vise tih enzima pa se ima u povisenom nivoz prisutnih katalizatora za date metabolicke puteve. 2.Da se regulise kataliticka aktivnost vec postojeces enzima u celiji(mnogo brze kontrole) Postojeci enzimi-prvo mora doci do alostericke inhibicije koja je najbrza. Enzim koji ima specificno mjesto na koje moze vezati neki alostericki efektor,kad se veze on producira takvu promjenu konformacije da enzim postaje kataliticki manje aktivan i u metabolickim putevima cesto se koristi i feed back mehanizam povratne sprege gdje produkt metabolickog puta je alostericki inhibitor enzima koji katalizira prvi stepen biosinteze. Drugi nacin regulacije postojecih enzima je da dodje do reverzibilne modifikacije(reverz.fosforilacija),da enzimi jedni postaju katabolicki inaktivni,drugi postaju katabolicki aktivni i time se jedni metabolicki putevi ukljucuju a drugi iskljucuju. 3.Dostupnošću supstrataKolicina svakog enzima zavisi od kolicine njegove sinteze i razgradnje i nivo vecine enzima primarno se kontrolira promjenom stepena transkripcije gena koji se kodiraju. To podrazumjeva da se recimo ako dodje do povecanja transkripcije ili ako treba blokirati neki puzt dodje do supresije transkripcije gena. Kolicina enzima: Vecina reakcija je inhibirana krajnjim proizvodom. Reverzibilno kovalentnom modifikacijom-najcesci slucaj reverzibilna fosforilizacija,neki enzimi su aktivisani neki inaktivisani, uvjek je pod hormonskom kontrolom. Ako gledamo brzinu najbrza je alostericka pa kovalentna a najsporuja je promjena ekspresije gena jer zahtjeva i transkripciju i translaciju.

15

*4.Kontrola dotoka supstrata: Iz jednog u drugi celijski odjeljak, takodje moze sluziti kao tacka kontrole. Imate katabolicke puteve koji se vrse i u 2 celijska odjeljka,biosinteza pocne u mitohondrijama,pa jedan od intermedijera treba da se transportuje u citosol da bi se nastavio pa prema tome i ovaj prenos supstrana moze biti tacka kontrole metabolickih puteva. $Vazan generalni princip metabolizma je da su putevi biosinteze i razgradnje gotovo uvjek razliciti odnosno suprotni. Smisao katabolickih puteva je da se obezbjedi energija i oni se se odvijati kada je energija potrebna. Ako energija treba,onda dok se desavaju katabolicki putevi anabolicki ce biti blokirani(jer trose energiju). Oni su hemijski razliciti, ali ovo razdvajanje je neophodno iz energetskih razloga i to olaksava kontrolu metabolizma. Kod eukariota metabolicki putevi su i razdvojeni u odnosu na celijske uvjete gdje se odvijaju. Biosinteza masnih kiselina se odvija u citosolu,a oksidacija u mitohondrijama sto opet olaksava regulaciju metabolizma. Da u sustini katabolicki putevi obezbjedjuju energiju i kad se potreba energ.,intenzivno se odvijaju. Kontrola zavisno od energetskog naboja celije. Mnoge reakcije u metabolizmu kontolira energetsko stanje celije i u sustini 1 od pok.energetskog stanja je enetgetski naboj koji se def.na sledeci nacin: TO JE KONCENTRACIJA ATP-a U CELIJI,+ 1/2 KONCENTRACIJE ADP-a, PODJELJENA SA KONCENTRACIJOM ATP-a+KONCENTRACIJA ADP+KONCENTRACIJA AMP-a. Zasto 1/2 ADP-a? Ako nastane puno ADP-a, moze da dodje do sledeceg,da enzimski katalizatori redukuju mol.ATP-a pa se vrsi kataliticki prenos jedne fosfatne skupine sa mol ATP-a,a ovaj predje u AMP. Vrijednost kol.u celijama od 0,80-0,95. To znaci da je potrebno da se u celiji uvjek odrzava ovaj energetski naboj da bi se odrzao odigravace se ili katabolicki ili anabolicki putevi. Putevi u kojima se stvara ATP-katabolicki, visok energetski naboj...ako celija rasp.sa dovoljno energije katabolicki putevi ce biti inhibisani, bice visoki energetski naboj-suprotno,anabolicki putevi-energetski naboj je nizak,celija nema dovoljno energije anabolickli putevi ce biti inhibisani a stimulisani katabolicki. ENERGETSKI NABOJ=(ATP)+1/2(ADP)/(ATP)+(ADP)+(AMP)

3.VARENJE I APSORPCIJA UGLJENIH HIDRATA Ako gledamo najvise energetskih potreba covjek obezbjedjuje unosom ugljenih hidrata. Najsira faza,koji su to dijetalni karbohidrati koje mozemo unijeti putem hrane? To je skrob, koji je glavni nutritijent i biljni polisaharid,sastoji se od amiloze i amilopektina. Razlika je u glikozidnim podjedinicama: Amiloza:alfa 1,4 glikozidne veze. .Amilopektin-razgranat u osnovi lanac alfa 1,4 a na mjestima grananje alfa 1,5 glikozidne

16

veze. Glikogen je zivotinjski polisaharid, isto samo je razgranatiji i samim tim su grananja cesca. Ono sto unosimo to je saharoza,disaharid izgradjen iz glukoze i fruktoze. Ovdje je konfiguracija na glukozi 1 alfa na fruktozi je beta. Mlijecni:laktoza, galaktoza i glukoza je grade. Trehaloza je disaharid-mlade sljive, zahtjeva poseban enzim da bi se mogao cijepati do monosaharida. Putem hrane -monosaharidi kao glukoza i fruktoza. Ovdje je prisutan saharid u sjemenkama, leguminoza to je rafinoza,to je saharoza koja moze imati glikozidno vezanu 1 ili vise molekula galaktoze. U tom slucaju-proces digestije,pratimo sledecu sliku: Proces digestije otpocinje u ustima, zvakanjem dolazi do lucenja pljuvacke, u pljuvacci je prisutna alfa amilaza,i njeno djelovanje zapocinje proces varenja karbohidrata. Taj sadrzaj prolazi kroz zeludac, i dospije u tanko crijevo. Kljucni enzim u digestziji skroba je pankreasna alfa amilaza. Ona katalizuje hidroliticko cijepanje alfa 1-4 glikozidne veze,, i ona u sustini nece cijepati alfa 1,6 glikozidne veze i alfa 1,4 glikozidne veze na kojima se nalaze grananja(endosaharidoza je,ne otcjepljuje sa krajeva vec u unutrasnjosti lanaca, i to je specificno za alfa 1,4 glikozidne veze). Produkti digestivnog

17

djelovanja alfa amilase skrob ili disaharid maltoza,maltotrioza i alfa gran.dextrin(8 glukoznih ostataka sa 1 ili vise alfa 1,6 glikozidnih veza). Do kojeg se stupnja razgradjuje amiloskroba-amilopektin:maltoze,maltotrioze i alfa grananje dextrina, a amiloza samo do stupnja maltoze. Ko nastavlja digestiju? Oni enzimi koji su usidreni u epitelne celije tankog crijeva. U 1 dijelu to je crijevni niz egzosaharidaza one koje otcjepljuju glukozidne ostatke sa neredukujucih krajeva grananja dextrina. To su alfa glikozidaze ako imamo disaharid saharozu,onda je enzim saharidaza i ima specificnost prema slikozidnom ostatku- prema odredjenom monosaharidu i konformaciji glikozidne veze koja djeluje na saharozu ima specificnosta za alfa glukozidne ostatke. I kad pogledamo, konacni produkti digestije su:glukoza, fruktoza, galaktoza. Svi koji su ozbjegli procese digestije dospijece u donje dijelove crijevnog trakzta, i njih ce digestirati bakterije koje su prisutne u tim dijelovima crijevnog trakta jer raspolazu sa mnogo saharidaza koje imaju raznoliku specificnost od ovih koji sudheluju u digestiji u organizmu. Nastale UH te iste bakterije ce anaerobno katabolizirati u glukozu, pa ce nastati mlijecna kiselina,gasovi,metan i to je uzrok nadutosti crijeva. E sad onih ugljenih hidrata koji su dov.do monosaharida se sada moraju apsorbovati i onda transportovati dalje u krvotok i da vidimo na koji nacin apsorpcijom enterocita-I TRANSPORTNI SISTEM,KOTRANSPORTER koji ce istovremeno transportovati jone Na i glukozu/galaktozu(Na gradijent kroz membranu)-vezani transport Na jona i monosaharida koji ce pok.koncentracijski gradijent Na jona. On sam po sebi ne trosi energiju ali trosi na 2 nacin,i ovdje je sekundarni aktivni transport,da bi se odrzao koncentracijski gradijent Na jona onda se on odrzava uz dejstvo K i Na Atepeaze. Ako ovdje dodje do ulaska do transporta Na jona onda ustvari Na,K atepeaza trosi direktvno ATP, treba da ispumpava te Na jone da bi odrzala koncentracijski gradijent-Nacin na koji ce se Na i Glukoza kotransportovati. Ovdje imamo PRISUTAN GLUT 5 TRANSPORTER. Transport za fructozu DESNU, koji ne ovisi o koncentraciji Na Jona. I sad u tim enterocitima, imamo zbog apsorpcije visoku koncentraciju monosaharida,sad oni treba da se isporuce u krv, u kapilare na koji nacin? To ce da urade, to je GLUT 2 transporter koji ce se sve te monosaharide iz enterocita gdje je visoka koncentracija transportera u krvne kapilare u smijeru pada koncentracije gradinih monosaarida.

18

4.GLUT

TRANSPORTERI :)

3.3.2014

Prosli put smo radili digestiju ugljenih hidrata i rekli da u tom procesu UH mogu da se hidroloticki razloze do monosaharida,i rekli smo na koji nacin ce se izvrsiti apsorpcija putem GLUT TRANSPORTERA u kapilare. Tumacimo transport glukoze u razlicite celije i tkiva. O cemu se radi? Glukoza je polarna supstanca i polarne supstance u odredjenom stupnju mogu da difunduju kroz bioloske membrane,medjutim takav tip unosa nije adekvatan i u sustini za jone, za polarne supstance uvjek moraju biti dizajnirani specificni proteini koji ce vrsiti taj transport. Jedan od tipova tih proteina su transporteri-za glukozu,oznaceni kao glut transporteri. Ako generalno pogledamo postoje od prokariota u svim eukariotskim organizmima, a i u covjeka. Nekoliko transportera posreduje u termodinamicki povoljnom smijeru transport glukoze kroz plazma membranu zivotinjskih celija. Ako je nesto termodinamicki povoljno onda to znaci da zahtijeva utrosak energije,jer se radi o transporterima koji olaksavaju difuziju.

19

Clanovi ove familije proteina=GLUT TRANSPORTERI-GLUT 1,2,3,4,5-ako gledamo proteini su i sastoje se iu 1 polipeptidnoh lanca koji u sustini sadrzi oko 500 AK ostataka. Kakav je stukturni motiv ovih transportera nije jos potpuno jasno. Najcesca struktura pristupno u glut transporterima je 12 membranskih segmenata koji imaju strukturu amfipaticne alfa uzvojnice koji su bocno disocirane,tako da stvaraju u sustini u unutrasnjosti jednu glukozu koja je ispunjena vodom. Amfipaticna alfa uzvojnica sto ima i polarni i nepolarni dio. Sad kad su oni asocirani bocno polarni,idu ka unutra a nepolarni pomazu da se transporter drzi nekovalentnim silama asociran u lipidnom matriksu membrana- 12 transmembranskih segmenata sa strukturom amfipaticne alfa uzvojnice,asociranih bocno:U-POLARNI,V-NEPOLARNI aminokiselinski ostaci. Ako pogledamo to je jedan polipeptidni lanac od 500 AK ostataka, 12 transmembranskih segmenata svi strukt.imaju amfipaticne uzvojnice, sto je hidrofobro zuto,s vanjske strane a hidrofilmo unutra. TRANSPORTERI ZA GLUKOZU: Glut 1-Plazma membrana eritrocita: Sta je vazno za transport. To su proteini koji imaju visoku specificnost ili selektivnost prema mol.ili jonu koji ce se transportovati. Znaci da oni u svojoj konformaciji imaju podrucje preko kojeg specificni prepoznaju u slucaju transporta glukoze samo glukozu, na koju se vezuje glukoza ce se na tom transporteru vezati sa afinitetom specificno kakvo ima vezivanje enzim-supstrat. Visoko su selektivni/specificni za molekule ili jone koji ce se transportovati. Zato sto u svojoj konformaciji imaju tacno podrucje preko koga ce se specificno prepoznati i vezati za datu supstancu. Ako gledamo transport za glukozu oni nju visoko specijalizuju, ali samo za desnu glukozu visoko specijalizovani. Mnogo manje za desnu galaktozu,desnu manozu a jos manje za L glukozu. Kada transporter prepozna glukozu,kako se vrsi transport? Transport se vrsi putem promjene koncentracije transportera. Tu za razliku od enzimskih reakcija nema hemijske reakcije. Sada pogledajte GLUT TRANSPORTER moze imati 2 konformacijska oblika-T1 transportni oblik,to je onaj oblik gdje mjesto vezivanja za glukozu orjentiramo prema ekstracelularnoj strani,i ovu konformaciju ce kat.jedan odredjeni afinitet prema glukozi. Taj transporter u T1 konformaciji ima visoko specificno mjesto preko koga ce specificno prepoznavati i vezati desnu glukozu. Kada se glukoza veze za to specificno mjestp,njeno vezivanje ce pokrenuti u sustini promjenu konformacije transportera pri cemu ce on prijeci u T2 konformacijski oblik koji je otvoren prema citosolnoj strani,i koja sad ima nizak afinitet prema glukozi i moze je otpustiti. O cemu se u tom slucaju radi? Kada se glukoza veze za T1 konformaciju, njeno vezivanje ce sniziti energiju aktivacije za prelaz konformacije glut transportera iz T1 u T2 konformacijsko stanje. Kada se veze za T1 sustina je da ce njeno vezivanje inducirati promjenu konformacije. Jednostavnbo ce se sniziti energija aktivacije promjene konformacije iz T1 u T2. Kada predje u T2 oblik, mjesto vezivanja otvoreno prema citosolu,ima nizak afinitet prema glukozi te dovodi do njenog otpustanja ,i to otpustanje ponovo pokrece promjenu konformacije iz T2 u T1. Prema tome transport ide uz promjenu konformacije samog transportera. Smisao Km vrijednosti: Imamo 5 vrsta transportera za glukozu koji su prisutni u celijama razlicitih tkiva i organa. Oznaceni su sa GLUT 1,2,3,4,5.

20

Koja vrijednost karakterizira-KM vrijednost predstavlja afinitet datog transportera prema glukozi. To je ona koncentracija kod koje ce doci do poluzasicenja transporta glukoze. Ako pogledamo oni se veoma razlikuju. Glut 1 u celijama tkiva sisara i Glut 3.Sta ih karakterise? Imaju Km 1 mMol. Imaju veoma visok afinitet prema glukozi,a normalna koncentracija glukoze u krvi je 4-5mMola. Kod normalne koncentracije glukoze u krvi oni su stalno zasiceni glukozom, i stalno se onaj bazalni unos glukoze u celije i tkiva koji se fakticki i odvija u stanju i hipoglikemije. Visoki afinitet govori da su oni stalno zasiceni, potpuno zasiceni glukozom i da ce izvrsiti ovaj bazalni osnovni unos glukoze u celije svih tkiva i svih organa bez obzira na nivo glukoze,cak i u stanjima hipoglikemije. GLUT 1 i GLUT 3 su posebno vazni za unos glukoze..u eritrocite je Glut 1ISKLJUCIVO ZAVISI OD GLUKOZE KAO JEDINE GORIVNE SUPSTANCE. Glut 3 u celijama mozga i mozak je potpuno ovisan da se obezbjedi energija koju preuzimaju kiseline. Glut 2 u biohemijskom i fizioloskom smislu. Km vrijednost 15-20mM, i prisutan je u membranama jetrenih celija, i beta celijama pankreasa. Ova Km vrijednost govori da ovaj transporter ima veoma nizak afinitet prema glukozi,i fakticki da ce on glukozu samo nositi u celije pankreasa i jetrene celije,kad su koncentracije glukoze u krvi veoma visoki. To je vazno jetra uvjek prihvatanjem glukoze u krvi uvjetuje nivo glukoze u krvi,jetra ce jako preuzimati tu glukozu putem glut 2 i onda se moze deponovati u obliku glikogena, i svariti glikogen kao rezervnu gorivnu supstancu i regulisati nivo glukoze u krvi. Beta celije pankreasa-tu je vazno,one preko glut 2 detektuju novo glukoze u krvi i na njega odg.adekvatnim izlucivanjem insulina koji ce biti proporcionalan nivou glukoze u krvi. Zato je glut 2 semnzor preko kojeg beta celije pankreasa detektuju nivo glukoze u krvi i onda odg.izlucivanjem insulina. Glut 4 prisutni u misic.celijama i adipocitima. Ako pogledamo Km vrijednost 5 mM. I u sustini glut 4 unos glukoze u misicne celije i adipocite je pod kontrolom insulina. Komplexan mehanizam. Glut 5 tanko crijevo primarni transport kod unosa fructoze. Ako pogledamo Glut 4,unos glukoze u adipocite i mis.celije odvijace se dok su povecani nivoi insulina u krvi:1 MOLEKULA INSULINA SE VEZE NA INSULINSKI RECEPTOR). Insulinski receptor ima 2 alfa i 2 beta podjedinice. One 2 alfa podjedinice grade mjesto za vezivanje insulina na receptor.insulina se veze samo jedna mol.insulina.Pogledajte gdje su glut 4 transporteri pohranjenj? Unutar celije na povrsini celije uvjek je prislonjen odredjeni broj glut transportera, kada su u pitanju misicne celije i adipociti. Ali onda kad je povecan nivo glukoze u krvi u skladu sa tim povecava se i broj glut 4 u plazma membranama ovih celija i doci ce do povecanog unosa glukoze. Glut 4 transporteri locirani su u samim celijama u memb.ovih malih vezikula koje su locirane u blizini same bazalne membrane. Kad se insulin veze za insulinski receptor,mehanizam koji je jedini poznat pokrece se fuzija ovih vezikula koje su glut 4 transporteri sa plazma membrane i time ce se povecati broj glut 4 transportera u plazma memnrani,a kad se novo insulina smanji u one granice opet ce doci do odvajanja tih glut 4 sa plazma membrane,doce do endocitoze fuzionisace se endos.pa ce se one glut 4 odvojiti sekrecijom u jednom podrucju ovoga endosoma i

21

isdvojiti ponovo i postati samostalne u citosolu. Ako tumacimo sada signalne puteve insulina,malo cemo se vratiti na nivo transkripcije gena, zato sto insulin kao hormon djeluje na 2 nacina: 1.moze pokretati puteve reverz.(fosforilacije)kada se veze za receptor i brzo djeluje 2.Moze da djeluje na nivou transkripcije gena-pa da povecanjem insulina povecava se stepen transkripcije enzima ili proteina koji su pod njegovom kontrolom. Kako ide put ovaj dio do nastajanje fosforiliranog supstrata 1 insulinskog receptora je ispijen i pocetni je i za 1 i 2 mehanizam. Sada cemo prvo protumaciti mehanizam koji kontrolira stupanj transkripcije gena. Ponovo znaci treba 1 molekula insulina veze se na mjesto koje izgradjuje alfa podjedinica insulinskog receptora koji ima tirozin kinaznu aktivnost insulinskog receptora. Sta znaci ta aktivnost? ako ima receptor ovu aktivnost to znaci da ce on katalizirati fosforilizaciju tirozinskih ostataka na onim proteinima koji su supstrat za ovaj receptor. Prvo sto je vatno da se zapamtui je da je insulinski receptor enzimski receptor,koji ima takvu aktivnost tirozin kinaznu i katalizuje reakciju fosforilacije tirozinskih ostataka, na onim ciljnim proteinima koji su supstrat za ovaj receptoir. Ako je enzim on mora imati specificnost i u sustini oni se nazivaju IMF supstrat 1 insulinskog receptora. Kada se insulin veze za receptor, onda ce doci prvo do autofosforilacije samog receptora,sta to znaci? I 1 alfa podjedinica i 2 alfa podjedinica uzajamno fosforiliziraju specificne tirozinske ostatke u blizini karboksiterminalmnih krajeva beta podjedinica. To je prikazano ovdje: Ovom fosforilacijom tirozinskih ostataka aktivira se tirozin kinazna aktivnost insulinskog receptora. Insulinski receptor ima 2 alfa i 2 beta podjedinice. Na alfa podjedinicama = je mjesto gdje ce se vezati insulin. Kada se veze onda ce se 1 alfa beta podjedinice uzajamno fosforilirati jedna drugu gdje na specificnim tirozinskim ostacima u blizini karboksiterminalnih krajeva beta podjedinica. Ovom fosforil.se aktivira tirozin kinazna aktivnost insulinskog receptora i on ce fosforilirati specificne tirozinske ostatke na 1 od proteina koji je supstrat za insulinski receptor,oznacen sa ISS1 supstrat insulinskog 1 receptorA-PROTEIN.Na fosforilizirani ostatak ISS1 se sada asocirati protein oznacen kao GRB2 u transdukciji signala prema nukleusu. Na taj Grb2 asocirace sada S(SOS) i ovaj sada SOS sad ce pokrenuti zamjenu gvanozin difosfata vezanog za RAS protein sa gvanozin 3 fosfat i time ce se ovaj RAS protein aktivirati,tako sto ce katalizirati zamjenu gvanozin 2 i 3 fosfata a ras proteina u fam.g proteina koji sudjeluje u razlicitim procesima biosignalizacije. Mi pratimo glikolizu. Sad taj aktivirani RAF ce vezati i asimilirati prvu od protein kinaza oznacenu kao RAF1. Ta aktivirana RAF1 ce sada fosforilirati 2 serinska ostatka na sl,kinazi u ovoj transdukciji signala oznacena kao MET-kako ce akt.tako sto ce fosforilirati specificne serinske ostzatke na met.met ce preci u fosf.oblik i taj met se fosforilira i akt.sledecu prozein kinazu oznacenu kao MAPK. I to fosforilaciju ce izvrsizti na 1 treoninskom i 1 tirozinskom ostatku na MAPK. Fosforilirani MAPK iz citosola difunduje u nucleus, i tu ce izvrsiti fosforilaciju

22

specificnog transkripcijskog faktora koji je oznacen kao ELP1. I tu ce fosfor. MAPK u sustini izvrsiti dosforilizaciju specificnog faktora ELP1. Na ovaj fosforilirani ELP1 ce asocirati drugi faktor SRF i u sustini sada ce se oni vezati na specificne DNA sekvence i kontrolirati transkripciju onih gena koji su pod kontrolom insulina. Ovaj SRF kad prevode serumski faktor. Kad djeluje na nivou transkripcije odmaj djeluje na kontrolu datih proteina ili enziamamjenjace mu kolicinu. Sad za drugi dio trebamo da vidimo kako ce u sustini ici za pokretanja glut 4 transportera u plazma membrani. Pocetak je da ce se insulin vezati za vezujuci receptor,ici ce sve do fosforilacije supstrata 1 insulinskog receptora,sad u sustini kad ide ta fosforilacija supstrata insulinski receptor na ovaj fosfotirozinski ostatak vidjecemo jos 1 sliku koja ima u Marksu kasnije, na ovaj fosfotirozinski ostatak supstrata 1 ins.receptora vezace se prva kinaza oznacena kao fosfatidil-inozitol 3 kinaza(Pi3K)- ona vrsi FOSFORILACIJU,fosforilirace membran.lipida fosfatidil inozitol 4,5 bifosfat ce fosforilirati u polozaju 3 pa ce nastati FIP3,fosfatidil inozitol 3,4,5.3 fosfatidil inozitol.na ovaj FIP3 asocira enzim FTK1 pd fosfatidil inozitola zavisna kinaza. I ona ce kad se veze za FIP3 aktivirati i izvrsiti fosforilaciju ove kinaze PKB(protein kinaza b). Sada ce od fosfatidil inozitol 1 ce se u sustini vezati za polozaj 5,3 i izvrsiti zavrsnu fosforilaciju protein kinaze B i ona se naziva APK,protein kinaza B ce biti aktivnija ukljucena je u one meh koji pokrecu fuziju vezikula za glut 4 sa plazma membrane. Sad da napravimo aspekt fosforilacije enzima. Ova aktivirana protein kinaza B ce u sustini,gledajte sad izvrsiti fosforilaciju enzima to je kinaza K3 glikogen sitaza. Znaci mozete prevesti kako hocete GS je glikogen simtaza,a ova kinaza koja ce fosforilirati je K3,pa je ta kinaza oznacena GSK3 sad gledajte sta pona radi. Fosforilizira odnosno katalizira fosforilaciju enzima GS i on postaje hemoliticki aktivan. Objasnjenje slike iz Marksa: 1.INSULIN SE VEZE ZA RECEPTOR 2.AUTOFOSFORILACIJA 3.AKTIVIRA SE TIROZIN KINAZNA AKTIVNOST INSULINSKOG 1 RECEPTORA 4.ON FOSFORILIRA SUPSTRAT 1 INSULINSKOG RECEPTORA NA TIROZINSKIM OSTATCIMA 5.NA NJEGA SE ASOCIRA PROTEIN 3 KINAZA(fosfatidil inozitol) 6.ONA KATALIZUJE FOSFORILACIJU MEMB.LIPIDA 7.U PIP3 8.NA PIP3 ASOCIRA OD FOSFAT INOZITOL ZAVISNA KINAZA1 KOJA CE IZVODITI FOSFORILACIJU PROTEIN KINAZE B(APK) 9.I SADA JE FOSF.AKTIVNA PROTEIN KINAZA B, 10.ONA POKRECE MEH,FUZIJE VEZIKULA KOJI CE OMOGUCITI MEHANIZAM BIOSINTEZE GLIKOGENA.

23

5.GLIKOLIZA Glikoliza je metabolicki put koji se razlicito odvija u svim celijama I u eukariotskim I prokariotskim. U eukariotskim ovaj process je lociran u citosolu. Proces glikolize podrazumijeva metabolicki put kojim se intracelularno razgradjuje glukoza. Dva su osnovna puta tj cilja procesa glikolize, zapravo intracelularnog kataboliza glukoze: 1. Da se celiji obezbijedi energija u obliku ATP-a(da podmiri svoje energetske potrebe), 2. Da celija obezbijedi gradivne blokove za biosintetske puteve/reakcije. Proces glikolize: kada se putem GLUT transportera glukoza unese u celiju ona ima samo jednu sudbinu, odmah će se fosforilirati u glukoza 6-fosfat. Ovom fosforilacijom ona postaje hemijski reaktivnija te postaje polarnija zbog prisustva fosfatne skupine I ona više ne može napustiti ćeliju. Zašto je glukoza značajnija u odnosu na mnogobrojne druge monosaharide? Ona je nastala dosta rano iz formaldehida u nekim prebiotičkim uslovima I ona je kao gradivna supstanca bila na raspolaganju već veoma ranim biološkim sistemima. Glukoza također ima nizak potencijal da neenzimski glikozilira proteine. Šta je neenzimska glikozilacija proteina? Postoje glikozilacije koje se vrše enzimski kataliziranim reakcijama. Međutim usljed npr. povišene glukoze u krvi gdje mogu nespecifično odnosno neenzimski da dođe do glikozilacijenekih protein tj doći će do nastanka neenzimske glikozilacije nekih proteina. Ako dođe do takve glikozilacije obično to može da izmijeni konformaciju I da utiče na biološku funkciju datog proteina. Danas se kao parameter određuje glikozilirani Hb. Dakle u slučaju povišenih nivoa može da dođe do tih nespecifičnih glikozilacija time one utiču na konformaciju proteina I mogu uticati na biološku funkciju proteina. Da bi krenula glikozilacija, onaj protein koji ce izvršiti glikozilaciju mora se nalaziti u otvorenom lančastom obliku. Reakcija glikozilacije će ići tako što će se stvarati šifove baze sa onim amino skupinama u bočnim lancima nekih aminokiselina u proteinu. Potom se te šifove baze pregrađuju u stabilne kovalentne veze. To je neenzimska glikozilacija. Uslov je dakle, da monosaharid mora biti u otvorenom lančastom obliku. U vodenoj sredini glukoza se dominantno nalazi u prstenastom obliku(negdje oko 96%) tako da je njen lančasti oblik prisutan u veoma niskim koncentracijama samim tim je smanjen njen potencijal neenzimske glikozilacije. Kad uđe u ćeliju glukoza se dakle fosforilirati u glukoza 6-fosfat- ova reakcija fosforilacije je enzimski katalizirana reakcija, katalizira je enzim heksokinaza(kinaza specifična za heksoze, u jetri je glukokinaza). Put glikolize ima dvije faze: 1. Faza ulaganja/investiranja- to je ona faza glikolize u kojoj se troši energija u obliku ATP-a. Ta energija će se trošiti za fosforilaciju glukoze u glukoza 6-fosfat. Potom će glukoza 6-fosfat izomerizirati u fruktoza 6-fosfat, potom se fruktoza 6fosfat fosforilira u fruktoza 1-6bisfosfat uz utrošak ATP-a. Zatim će se fruktoza 16bis fosfat da se cijepa na dvije fosforilirane trioze: dihidroksi acetat(96%) I

24

gliceraldehid trifosfat(4%). Kada nastanu trioze završena je prva faza glikolize.

2. Faza naplate- u ovoj fazi u reakciju ide gliceraldehid 3-fosfat koji će se nizom enzimski kataliziranih reakcija(oksidativnim prevođenjem) prevesti u piruvat, u ovom nizu reakcija će se dobiti energija u vidu ATP-a I reduciranog NADH. Trioza fosfat izomeraza će dihidroksi aceton-fosfat izomerizirati u gliceraldehid 3-fosfat. Ovaj enzim je katalitički perfektan enzim, koji velikom brzinom prevodi dihidroksiaceton-fosfat u gliceraldehid 3- fosfat. Tako da ćemo iz jedne molecule glukoze dobiti 2 molekule gliceraldehid 3-fosfata a glikolizom će nastati dvije molecule piruvata. Gliceraldehid 3-fosfat će se u reakcijama prevesti u piruvat, dihidroksiaceton-fosfat enzimom biva preveden u gliceraldehid 3-fosfat! U narednim reakcijama važno je pratiti ireverzibilne I reverzibilne reakcije. Ireverzibilne su one koje imaju veliku negativnu promjenu slobodne energije, one koje su u blizini nule one su reverzibilne. 1. Reakcija je fosforilacija glukoze u glukoza 6-fosfat, katalizira process HEKSOKINAZA, fosforilacija se vrši sa ATP-om I prisustvom Mg2+ iona. Ovdje je energija visoka-ireverzibilna je reakcija! 2. Reakcija izomerizacije kojom se glukoza 6-fosfat(fosforilirana aldoza) prevodi u fruktoza 6-fosfat(fosforilirana ketoza). Enzim koji katalizira reakciju je FOSFOHEKSOZA IZOMERAZA. Reakcija je reverzibilna. U ovoj reakciji se šećeri nalaze u prstenastom obliku pa ih je prvo potrebno prevesti u lančasti oblik a potom izvršiti izomerizaciju a potom iskatalizirati ponovno zatvaranje prstena. 3. Ireverzibilna reakcija u kojoj fruktoza 6-fosfat fosforilira u fruktoza 1-6bisfosfat. Fosforilacija ides a ATP-om a enzim koji to katalizira je FOSFOFRUKTOKINAZA 1- složen aldosterički enzim koji predstavlja glavnu tačku kontrole glikolitičkog puta. Reakcija je visoko egzergona. 4. Po nastanku fruktoza 1-6bisfosfata aktivirat će se enzim ALDOLAZA koji će fruktoza 1-6bisfosfat cijepati na dvije fosforilirane trioze tj gliceraldehid 3-fosfat I dihidroksi aceton fosfat. Reakcija je reverzibilna. Suprotna reakcija je aldolna kondenzacija kada od produkata kondenzacijom nastane fruktoza 1-6bisfosfat. U daljnju reakciju ide gliceraldehid 3-fosfat, odavdje idu reakcije koje proizvode energiju. 5. Gliceraldehid3-fosfat pod katalitičkim dejstvom enzima GLICERALDEHID 3FOSFAT DEHIDROGENAZA prevodi se u 1,3bisfosfoglicerol( to je acil, jedan od 3 spoja koji imaju veći fosforilirajući potencijal od ATP-a). Reakcija je reverzibilna. U reakciji sudjeluje gliceraldehid-fosfat+ anorganski P I NAD- koji daju 1,3 bisfosfoglicerol+ NADH(reducirani)+H+. Ovdje je prvo doslo do jedne egzergone reakcije a to je oksidacija aldehidne skupine gliceraldehid3-fosfata u karboksilnu skupinu I promjena slobodne energije za ovu reakciju je visoko negativna priblizno -50kJ/mol. Drugi dio reakcije koju katalizira ovaj enzim je visoko endergona- podrazumijeva vezivanje anorganskog fosfata na karboksilnu skupinu, bojcano gledano to je ista vrijednost energije kao kod egzergone reakcije samo u suprotnog predznaka tj +50kJ/mol. Kako GLICERALDEHID 3-fosfat DEHIDROGENAZA poveze ovu endergonu I

25

egzergonu reakciju tj kataliticki mehanizam enzima: On slobodnu energiju egzergone reakcije oksidacije iskoristi za endergono stvaranje anhidridne veze. Oksidans u ovoj reakciji je NADH koji je presao u NAD+. Reakcija ide tako da će enzim u toku same katalize sačuvati dio slobodne energije oksidacije aldehidne skupine u obliku tioesterske veze u obliku intermedijata koji će biti dvovalentno vezani za enzim. Enzim u aktivnom mjestu ima cisteinski ostatak a u bočnom lancu ima SH skupinu, na enzimu a u blizini aktivnog mjesta je I specificno mjesto na koje se veže NAD+(oksidans u ovoj reakciji), sada reaguje gliceraldehid 3-fosfat reaguje sa SH skupinom na enzimu pri čemu će se prolazno stvoriti tiohemiacetal(intermedijer). NAD+ izvrsi oksidaciju tako što će preuzeti hidridni ion sa tiohemiacetala I preći se u reducirani oblik NADH, na enzimu će ostati vezan tioesterski kovalentno vezan intermedijer. Tioesterske veze se takođe smatraju energijom bogatim vezama. Dio slobodne energije oksidacije gliceraldehidne skupine ostat će sačuvan u tioesterskoj vezi. Zatim, reducirani NADH će da disocira sa enzima a na molekul enzima se ponovo veze NAD+ koji dodatno polarizira tioestersku vezu I olakšava napad anorganskog fosfata na tu tioestersku vezu te će tako nastati 1,3 bisfosfoglicerat dok će se enzim vratiti u prvobitni oblik(endergoni dio reakcije). Dakle, reakcija je važna jer je nastao spoj koji ima visok fosforilirajući potencijal kao I zbog toga što u ovoj reakciji nastaje reducirani NADH. Nakon ovoga ide reakcija u kojoj će se stvoriti prva molekula ATP-a na način da će se sa 1,3bisfosfoglicerata fosfatna skupina prenijeti na ADP pri čemu će nastati 3-fosfoglicerat I ATP, reakciju katalizira enzim FOSFOGLICERAT KINAZA. Ovaj način nastajanja ATP se označava kao fosforilacija na nivou supstrata tj. Direktno stvaranje ATP-a(postoji jos jedna ovakva reakcija u glikolizi). Drugi način je oksidacijom reduciranih koenzima tzv oksidativnom fosforilacijom u mitohondrijskom lancu za transport elektrona. Naredna reakcija glikolize je ta da 3-fosfoglicerat izomerizira u 2-fosfoglicerat, pod katalitičkim dejstvom enzima FOSFOGLICERAT MUTAZA( enzimi MUTAZE su takvi da kataliziraju intramolekulsko premještanje hemijskih grupa). Potom, iz 2 –fosfoglicerat nastaje spoj koji ima veći fosforilirajući potencijal od ATP-a a to je fosfoenolpiruvat, reakciju katalizira enzim ENOLAZA, u reakciji se izdvaja I molekula vode. Nastaje fosforilirani enolni oblik piruvata visokog fosforilirajućeg potencijala. Reakcija je reverzibilna . U posljednjoj reakciji glikolize će se fosfatna skupina sa fosfoenolpiruvata prenijeti na ADP pri čemu će nastati ATP I piruvat. Reakcija je ireverzibilna. Katalizira je PIRUVAT KINAZA. Neto reakcija prevođenja glukoze u piruvat je sledeća: glukoza prevest će se u dvije molekule piruvata, potom oksidacija koja od 2 molekule NAD+ koje se reduciraju u 2 NADH+, imat ćemo i dvije molekule ADP-a i dvije molekule Pi te će nastati 2 molekule ATP-a. 2 molekule su utrošene za fosforiliranje, 4 su dobivene u konverzijama iz čega zaključujemo da je neto dobitak 2 molekule ATP-a pri prevođenju molekule glukoze u dvije molekule piruvata.

26

6.KONTROLA PROCESA GLIKOLIZE Prošli puta smo tumačili glikolizu i u suštini rekli kako ide taj put od glukoze do piruvata, a sad ćemo tumačiti na koji način se regulira i kontrolira proces glikolize, a onda i ulazak drugih monosaharida njihovim priključivanjem na glikolitički put. Glikolitički put ima dva cilja: 1.) da ćeliji obezbijedi potrebnu energiju u obliku ATP-a i 2.) da obezbijedi gradivne blokove za biosintentske procese. Glikolitički put je strogo kontrolisan u smislu da se zadovolje ove dvije potrebe: za ATPom i za gradivnim blokovima za biosintetske procese. Kako se principu kontroliraju metabolički putevi? Metabolički putevi se reguliraju tako što se vrši kontrola aktivnosti onih enzima koji kataliziraju ireverzibilne reakcije u datom metaboličkom putu. Ako pogledamo proces glikolize, onda su to tri ireverzibilne reakcije: 1) rekacija koju katalizira heksokinaza, to je fosforilacija glukoze u glukoza 6-fosfat 2)rekacija koju katalizira fosfofruktozakinaza 1, to je fosforilacija frukoze 6-fosfat u fruktoza 1,6-bisfosfat 3)rekacija koju katalizira piruvat kinaza, to je posljednja rekacija glikolitičkog puta kojom se se fosfoenol piruvat prevodi u piruvat Ova tri enzima koji kataliziraju tri ireverzibilne reakcije su one tačke preko kojih se kontrolira intenzitet, brzina ili stupanj u kom će se odvijati glikoliza unutar ćelije. Ovi enzimi pored i katalitičke, imaju i regulatornu ulogu i svaki služi kao mjesto kontrole. Na koji način se vrši kontrola aktivnosti u ćeliji već postojećih enzima? To smo tumačili u načinima regulacije metabolizma. Regulacija se vrši reverzibilnim vezivanjem alosteričkih efektora, to mogu biti alosterički inhibitori ili alosterički aktivatori enzima. Alosterička kontrola je najbrža kontrola, ona se odvija već u milisekundama. To je u suštini intracelularna kontrola katalitičke aktivnosti, zavisi od konentracije onih molekula koje su alosterički efektori datih enzima. Drugi način je da se vrši kovaletna modifikacija, rekli smo da je onaj najčešći reverzibilna fosforilacija. Vrijeme potrebno za reverziblnu alosteričku kontrolu su milisekunde, za reverzibilnu fosforilaciju sekunde, ali onaj treći mehanizam kojim se regulira stepen ili inzenzitet metaboličkog puta je da se izmijeni broj ili nivo molekula datog enzima datog metaboličkog puta. To podrazumijeva transkripciju i translaciju i to je najsporiji vid kontrole i zahtijeva sate, ali ćelija se može naći i u tim uslovima da dugoročno zahtijeva intenzivno odvijanje nekog metaboličkog puta. Shema Stryer – recipročna regulacije glikolize i glukoneogeneze Uopšteno: tri su tačke kontrole, to je prvo da se glukoza prevede u glukoza 6-fosfat, tu reakciju katalizira heksokinaza. Za glikolizu ključna tačka preko koje se kontrolira glikolitički put je rekacija koju katalizira fosfofruktokinaza 1 (foforilaciju fruktoze 6fosfat u fruktoza 1,6-bisfosfat). To je složen enzim, tetramer i u suštini aktivnost fosfofruktokinaze 1 katalizira cijeli niz alosteričkih efektora. (Na shemi ono što je označeno sa + su alosterički aktivatori, a ono što je označeno sa – su alosterički

27

inhibitori). Za fosfofruktokinazu 1 alosterički aktivator je AMP. Ako su visoki nivoi AMP, to znači da su ispcrpljeni energetski naboji ćelije i da je potrebno da se aktivira glikoliza kako bi se obezbijedila energija u obliku ATP-a. Kad gledamo AMP, on je alosterički aktivator i regulira proces glikolize vezano za energetski naboj ćelije. S druge strane, ATP je alosterički inhibtor ovog enzima. Visoki nivoi ATP-a signaliziraju da ćelija raspolaže sa dovoljno energiju u obliku ATP-a i da nije potrebno da se dalje razlaže glukoza u cilju da se obezbijedi energija. Drugo, rekli smo (obraćamo pažnju na citrat) da je drugi cilj glikolize da obezbijedi gradivne blokove za biosintetske procese. Vidjećete kad budemo dalje tumačili piruvat, njegovu daljnju sudbinu, on će ići ako su aerobni uslovi u oksidativnu dekarboksilaciju i prevešće se u acetil-CoA. On može ići u citratni ciklus, a cilj je daljnja oksidacija i dobivanje energije, ali i iz acetil-CoA ide sinteza holesterola, masnih kiselina, prema tome piruvat koji je nastao glikolizom koristiće se i u biosintetske svrhe. Zašto citrat? Taj metabolit unutar ćelije koji alosterički kontrolira aktivnost fosfofruktokinaze 1, citrat u suštini nastaje u onoj početnoj rekaciji citratnog ciklusa i visoki nivoii citrata signaliiziraju da ćelija da posjeduje dovoljne količine gradivnih blokova za biosint.reak. I onda kad se citrat veže za fosfofruktozu 1 kao alosterički efektor, on pojačava inhibitirno djelovanje ATP. ZNAČI ima dovoljno gradivnih blokova, to su visoki nivoi citrata i dovoljno ATP-a u ćeliji i oni će alosterički inhibirati fosfofrutokinazu 1. Ovdje imamo prikazano, ne atom hidrogena, nego H+ jon. Visku koncentraciju H+ jona vidjećete kad budete radili metaboličke sudbine piruvata, ako nema dovoljno kisika na raspolaganju da se piruvat dalje potpuno aerobno metabolizira, stvaraće se u anaerobnim uslovima visoki nivoi mliječne kiseline. Dobro je da H+ joni inhibiraju fosfofruktokinazu 1 iz sljedećeg razloga: zato što se onda sprečava prekomjerno stvaranje mliječne kiseline. Ono bi dovelo do naglog pada pH i acidoze. To je još jedan alosterički efektor fosfofruktokinaze 1. Nakon toga ćemo tumačiti jedan poseban alosterički efektor fruktoza 2-bisfosfat, vidjećemo kako nastaje i kako su niovi fruktoza 2-bisfosfata pod hormonskom kontrolom. Elaboracija :P Fosfofruktokinaza 1 je glavni kontrolni element u glikolitičkom putu sisara. To je tetramer koji se sastoji iz 4 identične podjedinice. Visoki nivoi ATP-a alosterički inhibiraju fosfofruktokinazu 1. Na shemi samog enzima vidjećemo : ako gledamo katalitička mjesta su locirana ovdje :p, a alosterička mjesta su ona mjesta na enzimu koja se razlikuju od mjesta gdje se vezuje supstrat. Ako se visoki niovi ATP-a vežu za alosterička mjesta, ona će smanjiti afinitet enzima prema supstratu, to je frukzoza 6-fosfati i to se opaža na krivoj enzimske kinetike gdje na osnovu koncentracije supstrata prazimo brzinu enzimske rekacije. Ona preći iz oblika hiperbole u sigmoidni oblik. Uz promjenu ta dva oblika, mijenja se i Km koji ilustrira izmijenjen afinitet enzima prema supstratu ( u ovom slučaju glukoza 6-fosfat). Kod niskih nivoa ATP-a kriva ima oblik hiberbole, a kod visokih nivoa ATP-a sigmoidni oblik. AMP poništava inhibitirno djelovanje ATP-a i kažemo da je on pozitivni alosterički aktivator fosfruktokinaze 1, on stimulira glikolizu. Sa sniženjem količnika koncentracije

28

ATP-a sa koncentracijom AMP-a došlo je do pada energetskog naboja, tada će se stimulirati glikoliza. Obrnuto ukoliko količnik kontracije ATP-a sa koncentracijom AMPa raste, onda će doći do alosteričke inhibicije fosfokrukzokinaze 1. Nelson i Cox, slika. Izolovane dvije podjedinice. Imamo aktivna mjesta, a nekom području interfaze između podjedinica imamo alosterička mjesta za koja se vezuju adeninski nuleotidi: ATP i AMP. Kad se pitamo zašto baš AMP? U ćeliji imamo ATP, ADP i AMP. U nekim kraćim vremenskim rastojanjima, adenilatni put čini koncentracija ATP-a, ADP-a i AMP-a i on je relativno konstantan. Najviša je koncentracija ATP-a, ADP-a je nešto niža, a najniža AMP. Ako se u ćeliji intezivno troši ATP, onda nastaju velike količine ADP-a. onda enzim adenilat-ciklaza, može iz ADP da regenira nešto ATP. ADP + ADP ---- ATP + AMP (reakcija reverzibilna, enzim: adenilat – ciklaza) Enzim katalazira prenos fosfatne grupe s jedne molekule ADP-a na drugu, usljed čega nastaje ATP i AMP. Rezultat je mala promjena koncentracije ATP-a, ali značajna promjena koncentracije AMP-a i onda je ta kontrola putem AMP-a vezana za energetski naboj mnogo finija. MALE PROMJENE U KONCENTRACIJI ATP-a REZULTIRAĆE VELIKIM PROCENTNIM PROMJENAMA U KONCENTRACIJI AMP-a, na postojeću koncentraciju, koncentracija AMP-a se najviše mijenja i onda je obezbijeđena mnogo preciznija kontrola fosfofruktokinaze 1 vezano za energetski naboj. ( u strajeru dosta lijepo opisana) 1980. otkriven je spoj koji je snažan alosterički aktivator fosfofrukzokinaze 1 i taj spoj naziva se fruktoza 2,6-bisfosfat ( ima dvije fosfatne skupine na 2. i 6. ugljikovom atomu). Ona aktivira fosfofruktokinazu 1 tako što povećava afinitet ovog enzima prema supstratu. Ako se gleda fruktoza 2,6-bisfosfat, kažemo da je to alosterički aktivator koji mijenja konformacijsku ravnotežu ovog tetramernog enzima sa T u R stanje (katalitički aktivnije ). Na koji način se regulira u ćeliji odgovarajuća koncentracija fruktoza 2,6-bisfosfata? Ona se regulira ili fosforilacijom fruktoze (nastaje na taj način) ili defosforilacijom fruktoza 2,6-bisfosfata u fruktoza 6-fosfat (reakciju katalizira fosfofruktokinaza 2 ili bifunkcionalni enzim). Biofunkcionalni enzim tj fosfofruktokinaza 2 ima jedan polipeptidni lanac svijen u dvije domene. Jedna domena ima kinaznu, a druga fosfataznu aktivnost. Na N-terminalnom kraju nalazi se serinski ostatak koji se reverzibilno može fosforilirati i zavisno od toga da li je enzim fosforiliran, isključena je kinazna aktivnost, a aktivirana fosfatazna. Ako je enzim desforiliran onda je isključena fostazana, a uključena kinazna aktivnost. Kinazna domena PFK 2 (6-fosfofrukto 2-kinaza jer će se fruktoza 6-fosfat fosorilirati u položaju 2) katalizira fosforilaciju fruktoza 6-fosfata sa ATP-om i nastajanje fruktoza 2,6bisfosfata. Domena sa fosfataznom aktivinošću naziva se fruktozabisfosfataza 2 (fosfati su na razičitim C atomima, zato su bis, a ne di) katalizira hidrolitičko otcjepljenje fosfata sa položaju 2 fruktoza 2,6-bisfosfata i nastajenje fruktoza 6-fosfata. Obje enzimske aktivnosti nalaze se na jednom polipetidnom lancu. Bifunkcionalni enzim vjerovatno je evolucijski nastao fuzijom gena koji kodiraju kinaznu i fosfataznu domenu.

29

Slajd – elektronska verzija Strajera Jedan polipetidni lanac koji na N-terminalnom kraju ima serinski ostatak (područje regulatorne aktivnosti) koji se može reverzibilno fosforilirati. On (lanac) je svijen u jednu domenu koja ima kinaznu i drugu domenu koja ima fosfataznu aktivnost. Bifunkcionalni enzim postoji u 5 izoenzimskih oblika koji je razlikuju po veličini molekule, kinetici enzima, imunološkim i regulatornim svojstvima. Onaj izoenzimski oblik koji je označen kao L oblik dominatno je zastupljen u jetri, dok je M oblik prisutan u mišićima. I jedan i drugi nastaju alternativnim splajsingom produkata transkripcije jednog gena koji kodira sve ove izoenzimske oblike. Kad se gen transkribira prvo nastaje primarni transkript, pa se on isijeca (splajsing) te nastaje zrela mRNK na kojoj se sintetizira polipetid. I ovo je jedan od primjera različitih splajsigna istog primarnog RNA transkripta usljed čega nastaju različite zrele mRNKod kojih neke kodiraju duže, a neke kraće polipetidne lance. ( Jetreni) L-oblik PFK-2 pomaže u održavanju hemeostaze glukoze u krvi. Šta određuje kada će na bifunkcionalnom enzimu dominirati katalitička aktivnost PFK-2, a kada katalička aktivnost fosfofruktobisfosfataze 2? Ove dvije akivnosti enzima su recipročno kontrolirane fosforilacijom specifičnog enzimskog ostatka. Sad trebamo tumačiti da li u slučaju snižene koncentracije glukoze u krvi proces glikolize biti inhibiran ili intenziviran? Prvo ako se snizi koncentracija glukoze u krvi, nema smisla da u takvom stanju intracelularno nastavlja proces glikolize. Tada se u krvi povećava nivo polipeptidnog hormona glukagona koji je izlučen iz pankreasa. On ide u stanjima kada imamo hipoglikemiju i ono što je važno je to da glukagon djeluje na jetru, vezat će se na onaj specifični receptor u plazma membrani jetrenih ćelija tj. receptror za glukagon. I onda će aktivirati koju kaskadu? Transdukcije signala. Glukagon djeluje preko adenilat ciklaze i ciklčkog AMP kao drugog glasnika. Ako je snižena koncetracija glukoze u krvi, poveća se nivo hormona glukagona. on će se vezati na receptore za glukagon u plazma membrani jetrenih celija. Kada se veže za receptor onda se aktivira gen protein u toj transdukciji siganla. Promjena konformacije receptora vezivanjem hormona inducirat će zamjenu gvanozin difosfata za gvanozin trifosfatom na alfa podjedinici gen proteina. Ta će podjedinica disocirati od druge dvije podjedinice i odmah će aktivirati enzim koji se zove adenilciklaza. Ona dok je aktivirana iz ATP-a će sintetizirati ciklički adenozin monofosat kao drugi glasnik. Ciklični adenozin monofosfat je alosterički aktivator protein kinaze A i enzima koji je uključen u indukciju signala glukagona i drugih hormona. Zašto protein kinaze a ? To je od adenilat ciklaze i ciklickog AMP i kad je cikličkim AMP-om aktivirana protein kinaza A, ona će katalizirati reakciju fosforilacije ovog bifunkcionalong enzima na specifičnom serinskom ostatku na N-terminalnom regulatornom području. Tom fosforilacijom isključit će se kinazna aktivnost i aktivirat će se fosfatazna aktivnost bifukcionalnog enzima. Ona katalizira reakciju hidrolitičkog

30

otcjepljenja fosfata iz položaja 2 fruktoza 2,6- bisfosfata. On ce se premjestiti u fruktoza 6-fosfat, što znači da je u ćeliji snižena koncentracija frukotza 2,6 bisfosfata i nema vise alosteričke stimulacije aktivnosti PFK 1 i onda je u suštini inaktiviran i enzim i čitav proces glikolize. Dakle glukagon to izvodi preko bifnkcionalnog enzima i to se održava na nivo fruktoza 2,6- bisfosfata. Šta se dešava u slučaju povišene koncentracije glukoze krvi? GLUKOLIZA JE TADA STIMULIRANA. U jetrene ćelije uvešće se glukoza preko glut 2 transportera koji ima Km vrijednost od 15-20mM. On dakle ima nizak afinitet, ali će doći do unosa glukoze u jetru kada su povišeni nivoi glukoze u krvi. Jetra sadrži poseban izoenzimski oblik heksokinaze koji se naziva glukokinaza i ona ima 50 puta slabiji afinitet prema glukozi od heksokinaze mišića ili drugih tkiva. Tek kad je glukoza prisutna u izobilju u krvi i preko glut 2 transportera unijeta u ćeliju i u njoj također prisutna u izobilju, doći će do njene fosforilacije u glukoza 6-fosfat djelovanjem glukokinaze. Glukoza 6-fosfat dalje će se izomerizirati u fruktoza 6- fosfat i u uslovima izobilja glukoze u krvi, postoji i izobilje fruktoze 6-fosfat unutar ćelije. Visoke koncentracije frukzoze 6-fosfata unutar ćelije će stimulirati jednu protein fosfatazu prisutnu unutar ćelije, a taj enzim će hidrolitički otcijepiti fosfatnu skupinu sa bifunkcionalnog enzima i na taj način će naći u defosforilisanom obliku čime je ugašena fosfatazna, a aktivirana kinazna aktivnost. Sad će kinazna aktivnost bifunkcionalnog enzima fosforilirati fruktoza 6-fosfat u fruktoza 2,6-bisfosfat čime će koncentracija ovog alosteričkog aktivatora povećati, a glikoliza ubrzati. (zbirna shema !!!) Ako je izbilje glukoze u krvi, onda će biti glikoliza aktivna. U ćeliji će biti visoki nivoi fruktoza 1,6-bisfosfata, a on stimulira proteinfosfatazu a.k.a fosfoproteinfosfatazu. To je enzim koji otcjepljuje fosfatne ostatke sa fosforiliranih proteina. U suštini imamo 4 tipa proteinfosfataza, a ako je aktiviramo ona će hidrolitički otcijepiti fosfatnu skupinu s enzima, čime će on postati defoforiliziran čime će ugasiti fosfatazna, a aktivirati kinazna aktivnost bifunckionalnog enzima, a koja će dalje fosforilirati fruktoza 2,6-bisfosat, povećaće se njegovi nivoi i stimuliraće se PFK1, a time i odvijanje procesa glikolize. Druga tačka kontrole: U suštini PFK 1 je ona ključna tačka za kontrolu, ali ireverzbilnu reakciju katalizira i enzim koji se naziva heksokinaza (ona fosforilira glukozu u glukoza 6-fosfat). Heksokinazu, enzim koji katalizira prvi stupanj glikolize, inhibira njegov proizvod glukoza 6-fosfat. Visoki nivoi glukoza 6-fosfata signaliziraju da ćelija više ne treba glukozu niti za dobivanje energije u obliku ATP-a, niti za skladištenje u obliku glikogena, niti kao gradivne blokove u biosintetskim procesima što znači da će glukoza 6-fosfat inhibirati heksokinazu. Ovdje trebamo imati 2 stvari na umu: da će mišićnu heksokinazu glukoza 6-fosfat inhibirati, dok jetrenu glukokinazu neće (50 puta slabiji afinitet prema glukozi od heksokinaza u ostalim tkivima). To je jako važno jer jetra puferuje nivo glukoze u krvi, te kada je prisutna u izobilju glukoza će se putem glut 2 transportera unositi u jetru, fosforilirati u glukoza 6-fosfat, de će dalje ići proces sinteze glikogena koji će se potom pohranjivati.. To je strateški važno da znate kao ljekati :P Ali ako dođe do inhibijce PFK 1, onda imamo visoke nivoe fruktoza 6-fosfata. Fruktoza 6-fosfat će izomezirati u glukoza 6-fosfat. Glukoza 6-fosfat će, za izuzetkom jetre,

31

inhibirati heksokinazu. Ako postoji inhibicija PFK1, postoji i inhibicija heksokinaze. Kada se PFK1 inaktivna, povećava se koncentracija fruktoza 6-fosfata, a time će povećava i koncentracija glukoza 6-fosfata jer će fruktoza 6-fosfat izomezirati u glukoza 6-fosfat. VAŽNO: Zašto je fosfofrukto kinaza, a ne heksokinaza, ključni enzim koji određuje ritam glikolize?? Reakcija koju katalizira heksokinaza daje glukoza 6-fosfat,a glukoza 6-fosfat može da ide glikolizu, u glikogenezu, u ciklus pentoza fosfata gdje je oksidira pa se dobiva se redukovani NADPH. Ali prevođenje fruktoza 6-fosfata u fruktoza 1,6-bisfosfat je ireverzibilna reakcija glikolize i ona je jedinstvena za glikolizu, te je to upravo reakciju koju katalizira PFK i ona je ključna tačka kontrole glikolize. Treća tačka kontrole je kontrola aktivnosti piruvat kinaze. On katalizira prevođenje fosfoenolpiruvata u piruvat tj. posljednju reackiju glikolitičkog puta. Piruvat kinaza je tetramer, 57kDa podjedinica i katalizira reakciju u kojoj će nastati ATP i piruvat, centralni metabolički intermedijat, koji se može dalje oksidirati ili koristiti kao gradivni blok. Kod sisara postoji nekoliko izoenzimski (ili u novije vrijeme izozimskih) oblika piruvat kinaze koje kodiraju različiti geni, za razliku od bifunkcionalnog enzima čije izoenzimske oblike kodira jedan gen. L oblik preovladava u jetri, a M oblik u mišića i mozgu. L i M oblike piruvat kinaze imaju više zajedničkih svojstava. Oba kooperativno vezuju supstrat – fosfoenolpiruvat. (kooperativno vezivanje supstrata na enzim u podjediničnim obliku ( nisam sigurna šta je rekla ovdje) – veže se jedan, pa poveća afinitet drugih mjesta, drugi lakše vezuju, te se uvijek odvija kroz promjenu konformacije proteina. Fruktoza 1,6-bisfosfat koja je proizvod djelovanja PFK alosterički aktivira oba izoenzimska oblika piruvat kinaze i jetreni i mišićni i to omogućava takvu katalitičku aktivnost da oni uspijevaju održati korak sa nadolazećim tokom intermedijera koji su nastali u prethodnim reakcijama, te da se konačno prevedu u piruvat. Enzimska katalitička aktivnost zavisi od energetskog naboja. ATP alosterički inhibira i L i M oblik piruvat kibaze, što znači da da će visok energetski naboj usporavati glikolizu sa alosteričkim inhibicijom i piruvat kinaze. Alanin koji se u jednom stupnju sintetizira iz piruvata, također može alosterički inhibirati priruvat kinazu. Visoki nivoi alanina signaliziraju da ćelija raspolaže sa dovoljno gradivnih blokova. Ono po čemu se razlikuju jetreni i mišićni izoenzimski oblici piruvat kinaze je hormonska regulacija koja ide reverzibilnom fosforilacijom. Oni se razlikuju dakle po osjetljivosti na kovalentnu modifikaciju. Katalitička svojstva L oblik piruvat kinaze kontroliraju se reverzibilnoj fosforilacijom. Ponovno je to vezano za nivo glukoze u krvi, snižen nivo glukoze u krvi dovodi do povećanog nog izlucivanja glukagona, glukagon se veze na svoj glukagonski receptor, aktivira se kasakada adenilat ciklaze, ciklički se povisi nivo drugog glasnika tj. ciklcki AMP-a, on aktivira protein knazu A . Protein kinaza A će fosforilirati piruvat kinazu, koja je prisutna u jetri i time je ona kataliticki inaktivirana kao i onaj bifunkcionalni enzim . Ta dva enzima su pod hormonskom kontrolom, kontrolom glukagona. Ovim hormonom pokretana fosforilacijom sprecavaju jetru da koristi glukozu, ako je hitnije

32

trebaju mozak il misići. Jetra ce je koristiti samo kada su izuzetno visoki novoi glukoze u krvi. Kataliticka aktivnost piruvat kinaze misica, M izoenzimskog oblika koji je prisutnan u mišićima i mozgu ne kontrolira se reverzibilnom fosforilacijom, eto zašto. Mozak potpuno zavisi od preuzimanja glukoze iz krvi, unos ide putem glut 3 tasnportera, on ima Km vrijednost 1 mM visok afinitet. Kad udje ona ce se fosforilirati I nema smisla da se blokira glikoliza u mozgu, ako je snizen nivo glukoze u krvi, ona u mozgu treba stalno da se odvija da bi on obezbijedio potrebni ATP. Kod misićne imamo glut 4, on je u mišićima i adicpocitima, pod kotrolom inzuilna i ima Km 4,5 ali će ako su povišeni nivo glukoze, unijet će se glukoza putem glut 4 transportera. Heksokinaza ima visok afinitet, ona ce preuzetu glukozu fosforilirati i ona ce ići ili u glikolizu ili će se sintetizirati u glikogen, kao rezervno spremište. I onda M oblik u mišićima neće zavisiti od piruvat kinaze. On nije pod hormonskom kontrolom. Mišići kad vrše kontrakciju troše energiju ATP-a, to treba da ide da bi se podmirile potrebe mišićnih ćelija, ili iz glukoze će se povećano razgrađivati glikogen do glukoze pa će glukoza ulaziti u put razgradnje da se njenim katabolizmom obezbijedi energija u oblika ATP-a. Shema - Strajer Fosfoenolpiruvat – reakciju katalizira piruvat kinaza --- nastaće piruvat i ATP . Rekli smo da su alosterički aktivatori je fruktoza 1,6 - , a alosterički inhibitori visoki nivoi ATP-a i alanina. A u suštini samo onaj izoenimski oblik piruvat kinaze koji se nalazi u jetri tj. njegova aktivnost se kontrolira reverzibilnom fosforilacijom. Uz nizak nivo glukoze u krvi, glukagon će pokrenuti put kojim će se izvršiti fosforilacija piruvat kinaze i preći će u katalitčki inaktivni oblik. Onaj koji će je defosforilirati pri visokim nivoima glukoze u krvi i prevesti je u aktivni oblik je, fosfoproteinkinaza.

33

6.SUDBINA PIRUVATA U RAZLICITIM USLOVIMA Različite metaboličke sudbine piruvata koji je nastao glikolizom: U jednoj od reakcija glikolize stvarao se reducirani NADH(u glikolitickoj reakciji koju katalizira gliceraldehid 3-fosfat dehidrogenaza).Zalihe NAD+ kao koenzima u ćelijama su ograničene(za sintezu NAD+ je potrebna nikotinska kiselina=vitamin nijacin koji se unosi hranom,ali postoje neke ograničene količine NAD+ koje su prisutne unutar ćelije). NAD+ je oksidans u reakciji gliceraldehid 3–fosfat dehidrogenaze I reducira se u NADH.Da bi se odvijala glikoliza neophodno je da se taj nastali reducirani NADH reoksidira u NAD+ pa da bi on opet mogao vršiti funkciju oksidansa u ovoj reakciji.Dakle,reoksidacija NADH je neophodna da bi se odvijao proces glikolize.To se odvija kroz dalje sudbine piruvata,sto zavisi od organizma.Mi cemo razmotritit sve 3 I onda cemo reći koje važe za čovječiji organizam. Ako smo imali glikolizu,nastao je piruvat.U čovječijem organizmu u aerobnim uslovima,ovaj piruvat ce ići u reakciju oksidativne dekarboksilacije piruvata I odvija se na jednom multienzinskom kompleksu koji se naziva kompleks piruvat dehidrogenaze. Pri tome se piruvat prevodi u acetil koenzim A, a on može ako dalje idu katabolički putevi ići u dalju oksidaciju a to uključuje citratni ciklus I oksidativnu fosforilaciju mitohondrijskog lanca za transport elektrona.U citratnom ciklusu reducirani nosači elektrona se oksidiraju oksidativnom fosforilacijom.U aerobnim uslovima onda onaj reducirani NADH se oksidira procesom oksidativne fosforilacije u mitohondrijskom lancu za transport elektrona. U mišićima koji intenzivno vježbaju, intenzivno se odvija glikoliza I nastaje piruvat I stvaraju se visoke količine reduciranog NADH,ali u takvim mišićima nema dovoljno molekulskog kisika.To nisu dovoljno aerobni uslovi,tu se dešava reoksidacija tako što će se piruvati prevesti u mliječnu kiselinu/laktat. Reakcija je reverzibilna,ako se piruvat prevodi u laktat,reducens je NADH a on se oksidira u NAD+ I suprotno.Enzim koji to katalizira je laktat dehidrogenaza.Ovo se naziva mliječno-kiselinsko vrenje,ako je sudbina piruvata koji je nastao glikolizom u nekim mikroorganizmima gdje dolazi do mliječno-kiselinskog vrenja. 3 sudbina piruvata se dešava u kvascu I nekim drugim mikroorganizima,to je alkoholno vrenje(put kojim će piruvat nastao glikolizom da se prevede u etanol).Piruvat se prevodi u acet-aldehid ovdje će prvo doći do dekarboksilacije tj.izdvajanja CO2,a enzim koji katalizira tu reakciju je piruvat-dekarboksilaza ( ono što je važno kao koenzim uz ovu reakciju treba tiamin-pirofosfat TPP( koenzimski oblik vitamin B1-tiamin )) . I onda će acet-aldehid da se prevede u etanol,jednostavno ide redukcija.Reducirani NADH je

34

reducens pri cemu ce se oksidirati u NAD+ ako ide u obrat rekaciju ide I obrat NAD+ u NADH.Enzim za ovu rekaciju je alcohol dehidrogenaza.Reakcija je reverzibilna. Kad je u pitanje čovječiji organizam kad budemo radili glikoneogenezu vidjeti cemo kako nivo alkohola utice na nivo glukoze u krvi,kako kasnije moze uticati na oksidaciju masnih kiselina ili na smanjenje njihovog katabolizma sto dovodi do akumulacije triacilglicerola u jetri sto je vezano uz patološka stanja. U čovječijem organizmu su ove 2 sudbine piruvata jedna je vezana za aerobne,a druga za anaerobne uslove. U prisustvu kisika sto je najcešće u višećelijskim organizmima I u velikom br. jednoćelijskih piruvat se matabolizira u CO2 I H20 dakle ide citratni ciklus I oksidativna fosforilacija.U odsustvu oksigena piruvat se moze prevesti/fermetirati u mliječnu kiselinu.Laktat se stvara u mišićima u situaciji kada su potrebe mišića za energijom veće zbog mogucnosti snadbijevanja kisikom I to se naziva mliječno-kiselinsko vrenje odvija se u većini mikroorganizama.Treće da ide feremntacija u etanol. Fermentaciju je definirao Paster kao život bez zraka.To je proces obezbjedjivanja energije u odsustvu oksigena.Fermentacija je proces stvaranja ATPa u kome su organske komponente I donori I akceptori elektrona.Proces se odvija u odsustvu molekula kisika(tj.u anaerobnim uslovima). Prevođenje piruvata u laktat koji katalizira laktat dehidrogenaza(mora se znati strukturno prikazati,a ne samo tekstualno).Reducens je NADH ,reducirati ce se keto skupina u alkoholnu I nastati ce laktat. Ovaj reducirani NADH nastao je u rekciji gliceraldehid 3-fosfat dehidrogenaze..Ukupna reakcija prevođenja glukoze u laktat nastati ce 2 molekule laktata,utrositit ce se 2 molekule ATP-a I 2 molekule anorganskog fosfata,nastati ce 2 molekule ATPa I 2 molekule vode I kad se to sve zbirno rekonstruise(treba se prisjetiti pri kojim reakcijama se trosi/stvara ATP,a u kojim se izdvaja voda i onda sebi rekonstruišite, gdje se izdvaja voda- to je enolaza,a gdje se stvara ATP- to je fosforilacija na nivou supstrata 2 reakcije). 2.sudbina je alkoholno vrenje koja zahtjeva piruvat, piruvat dekarboksilaza I TPP.Nastati ce acet aldehid I onda ce alkohol dehidrogenaza izvrsiti redukciju ovog acet-aldehida u etanol.Pri tome nastaju 2 molekule etanola,2 molekule CO2,2 molekule ATP(nastaje u samoj glikolizi) I 2 molekule vode. Nije obavezno!!! Alkohol-dehidrogenaza-prvi enzim kada mu je određena rentgenskom kristalografijom 3D struktura,utvrudjeno je da ima posebnu domenu za koju se veze NAD+ ,to je ta dehidrogenaza za koju se veže adeninski nukleotid.Onda je utvrdjena struktura te domene recimo ima 4 alfa uzvojnice,jednu beta ravan sa 6 paralelnih lanaca I taj strukturni motiv domen na koji se veže adeninski nukleotid u dehidrogenazama ( gdje je NAD+ oksidans )naziva se Rozmanovo svijanje/folding.(Majk Rozman-Nobelovac) Kasnija istraživanja su pokazala gliceraldehi 3-P dehidrogenaza su isto pokazala da posjeduju domenu za vezivanje NAD+ .Ta domena je prisutna u cijelom nizu 35

dehidrogenaza.

7.ULAZAK DRUGIH SECERA U GLIKOLITICKI PUT Danas trebamo vidjeli kako ce se drugi seceri se prikljuciti na glikolitički put.Ako se sjecate mi smo rekli da se u velikim kolicinama u organizam unosi saharoza ,to je disaharid glukoze i frukoze a ako ide proces digestije onda ce enzim saharaza da cijepa saharozu na glukozu i fruktozu.Sad cemo vidjeti na koji nacin ce se metabolizirati fruktoza(Ja Bogami ne razumijem sta je htjela reci –majkemi ) u sustini do onih intermedijera koji se mogu odmah prikljuciti na glikoliticki put.Drugo recimo ako se konzumira mlijeko unosi se laktoza u organizam,onda ce laktoza ici u proces digestije a enzim laktaza ce da je cijepa na galaktozu i glukozu,sada cemo vidjeti kako se metabolizira kada dospije do celija i vidjet cemo kako se galaktoza moze prikljuciti na glikoliticki put.Upoznat cemo se sa genskim defektima koji su prisutni u digestiji. Znaci ako unesemo saharozu saharaza je cijepa na glukozu i fruktozu,ako unesemo laktozu lakataza je cijepa na galaktozu i glukozu( gledaj sliku na prezentaciji )Sad cemo pratiti kako se galaktoza prikljucuje na glikoliticki put. Sa prezentacije : Galaktoza se u glikolitički put uključuje tako što se prevodi u metabolite glukoze. U četiri stupnja galaktoza se prevodi u glukoza 6- fosfat. ►Prva reakcija konverzije galaktoze u metabolit glukoze je fosforilacija galaktoze u galaktoza 1-fosfat koju katalizira galaktokinaza. ►Galaktoza 1-fosfat potom prihvata uridilnu grupu sa UDP-glukoze, intermedijera u sintezi glikozidnih veza. Reakciju katalizira galaktoza 1-fosfat uridil transferaza. Nastaju glukoza 1- fosfat i UDP-galaktoza. ►Galaktozni dio UDP-galaktoze potom epimerizira u glukozni. Konfiguracija –OH grupe na C- 4 atomu mijenje se djelovanjem UDP-galaktoza 4-epimeraza. Zbir reakcija koje kataliziraju kinaza, transferaza i epimeraza je: Gakaktoza + ATP → glukoza 1- fosfat + ADP + H+ ►Glukoza 1-fosfat izomerizira u glukoza 6- fosfat djelovanjem fosfoglukomutaze. ○ Konverzija UDP-glukoze u UDP-galaktozu, djelovanjem UDP-galaktoza 4epimeraze, je reverzibilna. To je od esencijalne važnosti za sintezu galaktozilnih ostataka u složenim polisaharidima i glikoproteinima, ukoliko količina galaktoze unesene putem hrane ne odgovara potrebama. Kada galaktoza 1 fosfat prihvati uridilnu skupinu sa UDP glukoze nastane glukoza 1 fosfat i UDP galaktoza –sada ov glukoza 1 fosfat moze izmorezirati u glukoza 6 fosfat da se prikljuci na glikoliticki put . Shema:galaktoza ide u galaktoza 1 fosfat,sada u sustini ide aktivacija galaktoze 1 fosfat uridiltransferaze i prenosi se fosfatna skupina na galaktoza 1 fosfat i nastane glukoza 1 fosfat i UDP galaktoza.Glukoza 1 fosfat moze izomerizirati iu glukoza 6 fosfat i prikljuciti se na glikoliticki put i sad UDP glaktoza 4 epimeraza epimerizira UDP galaktozu u UDP glukozu koja moze ici dalje u reakcije. Kad postoji genski defekt kod prikljucenja galaktoze na glikoliticki put i taj defekt je na

36

enzimu galktoza 1 fosfat uridil transferaze,sprijeceno je prikljucivanje galaktoze(profesorica rekla glukoze ali ja mislim da treba galaktoze ) na glikoliticki put .Epimerizacija je jako važna.Djelovanjem UDP galaktoze 4 epimeraze reakcija je reverzibilna i to je od esencijalne vaznosti zbog sinetez slozenih polisaharida,glikoproteina ukoliko kolicina galaktoze koja se uvede putem hrane ne odgovara potrebama organizma Shema: galaktoza ce djelovanjem galaktokinaze da se fosforilise sa atp-om u galaktoza 1 fosfat,sad ide rekacija koju katalizira galaktoza 1 fosfat uridil transferaza i ona ce prenijeti uridin fosfatni dio na galaktoza 1 fosfat i nastat ce glukoza 1 fosfat i udp galaktoza.Sada da glukoza 1 fosfat moze izomerizirati u glukoza 6 fosfat i prikljuciti se u glikoliticki put.(izvjestaj za rijec u sustini do sada 18 puta ) Sve cita ostalo sa prezentacije : Nastajanje katarakte ► Katarakta je zamaglenje očnih sočiva. ● Ukoliko galaktoza 1- fosfat uridil transferaza nije aktivna, aldoza reduktaza prisutna u očnim sočivima, reducira galaktozu u galaktitol. ● Galaktitol je osmotski aktivan, zbog čega voda difundira u sočiva, što potiče stvaranje katarakte. ○ Postoji visoka incidenca stvaranja katarakte kod starije populacije koja konzumira veće količine mlijeka u zreloj dobi. Hipolaktazija (hypolactasia) ► Uzrokuje je deficit aktivnosti enzima laktaze, koji cijepa laktozu na glukozu i galaktozu. Šta se događa sa laktozom u intestinumu osoba sa deficitom laktaze? ► Laktoza je dobar izvor energije za mikroorganizme u kolonu i oni je fermentiraju u mliječnu kiselinu uz istovremeno stvaranje metana (CH4) i hidrogena (H2). Nastali gas stvara neugodan osjećaj nadimanja. Mliječna kiselina koju su stvorili mikroorganizmi osmotski je aktivna, kao i nedigestirana laktoza, i povlači vodu u intestinum, što dovodi do dijareje. U težim slučajevima, gas i dijareja sprječavaju normalnu apsorpciju drugih nutrijenata, kao što su masti i proteini. ● Jednostavan tretman je izbjegavanje konzumiranja proizvoda koji sadrže mnogo laktoze. Alternativno enzim laktaza može se ingestirati sa mliječnim proizvodima. (plesna tacka )

37

Aktivnost laktaze u epitelnim ćelijama intestinuma. (a) Za laktazu specifična antitijela masivno obilježavaju mikrovile odrasle osobe tolerantne na laktozu. (b) Intestinalni mikrovili na laktozu netolerantnih odraslih osoba pokazuju slabo obilježavanje ili potpuni izostanak obilježavanja istim antitijelima. Laktaza je detektirana tretiranjem tankih sekcija intestinalnog tkiva antitijelom koje se specifično vezuje na enzim laktazu. Na antitijela su vezane čestice koloidnog zlata, koje se na snimcima elektronske mikroskopije opažaju kao crne (elektronski guste) tačke. Ulazak fruktoze u glikolitički put D-fruktoza, koja je u slobodnom obliku prisutna u voću, kao i ona nastala hidrolizom saharoze u tankom crijevu kičmenjaka, fosforilira se djelovanjem heksokinaze:

38

Mg2+ Fruktoza + ATP → fruktoza 6-fosfat + ADP Ovo je glavni put ulaska fruktoze u glikolitički put u mišićima i bubrezima. U jetri, enzim fruktokinaza katalizira fosforilaciju fruktoze na C-1: Mg2+ Fruktoza + ATP → fruktoza 1- fosfat + ADP Fruktoza 1- fosfat cijepa se na dihidroksiaceton fosfat i gliceraldehid, djelovanjem fruktoza 1- fosfat aldolaze. fruktozo-1 fosfat aldolaza Fruktoza 1- fosfat ↔ dihidroksiaceton fosfat + gliceraldehid Gliceraldehid se fosforilira sa ATP u gliceraldehid 3 - fosfat , djelovanjem trioza kinaze: trioza kinaza Gliceraldehid + ATP → gliceraldehid 3- fosfat + ADP Mg2+ Dihidroksiaceton fosfat izomerizira u gliceraldehid 3-fosfat djelovanjem triozafosfat izomeraze. Oba produkta hidrolize fruktoza 1- fosfata ulaze u glikolitički put.

8.KANCER I GLIKOLIZA Treba razjasniti šta se dešava sa metaboličkim putem glikolize u slučaju tumora. Kada se razvija tumorsko tkivo, onda se ćelije brzo dijele, i u suštini, da bi tumorsko tkivo preživjelo treba da se izvrši njegova vaskularizacija. Zašto? Da bi se ćelije tumorskog tkiva mogle snadbijevati potrebnim kisikom i potrebnim gorivnim supstancama za preživljavanje. Vaskularizacija se nikada ne odvija toliko brzo koliko se odvija bujanje tumorskog tkiva. U suštini, tumorske ćelije se nađu u hipoksičnim uslovima. Adaptacija, koju će uraditi da bi preživjele, dok se ne izvrši vaskularizacija, u suštini, ide na sljedeći način:

39

U hipoksičnim uslovima, u tumorskom tkivu će se povećano eksprimirati jedan transkripcijski faktor, hipoksijom inducirani transkripcijski faktor 1 (HIF1). Šta će on uraditi? On će se vezati na regulatorne sekvence u promotorima gena koji kodiraju glikolitičke enzime. Doći će do pojačane transkripcije ključnih enzima glikolize. Time će se u suštini povećati enzimski kapacitet za odvijanje glikolize. Uz te ključne glikolitičke enzime, pojačano će se transkribovati i enzim laktat – dehidrogenaza. Zašto? Da bi se odvijala glikoliza, piruvat će da se reducira u laktat u tim hipoksičnim uslovima kada u tumorskim ćelijama nema dovoljno raspoloživog kisika. Sljedeće što će se u suštini povećano eksprimirati, su geni za GLUT1 i GLUT3 transportere. One transportere za glukozu, koji su odgovori za bazalni unos glukoze. Prema tome, šta će se desiti u hipoksičnom tumorskom tkivu? Doći će do povećanog unosa glukoze u tumorske ćelije, do pojačanog odvijanja glikolize, da bi si one obezbijedile energiju potrebnu za preživljavanje, s tim što će se ta glukoza metabolizirati u mliječnu kiselinu. S druge strane, HIF1 će isto tako utjecati na transkripcijski faktor, on će u suštini utjecati na povećanu ekspresiju vaskularnog endotelnog faktora rasta, koji doprinosi vaskularizaciji i nekih drugih signalnih molekula koji sudjeluju u vaskularizaciji tkiva. Prema tome, ono što moramo zapamtiti, to je da povećan unos glukoze i intenzivnije odvijanje glikolize u hipoksičnm uslovima u ćelijama tumorskog tkiva će omogućiti preživljavanje u hipoksičnim uslovima. Ako ne dođe do adekvatne vaskularizacije, tumorsko tkivo neće preživjeti. Ono će postati čvrsto ili će atrofirati, biti uklonjeno. Ali ako vaskularizacija bude dobra, onda to doprinosi progresiji i agresiji tumorskog tkiva. Kasnije ćete, u nekim ispitivanjima faza u kanceru, kao biohemijski parametar uvijek vidjeti enzim laktat dehidrogenazu. Njegova aktivnost će služiti da se kvalifikuje faza u kanceru.

(tabela) Proteini metabolizma glukoze, kodirani genima koje kontrolira HIF1: - GLUT1 i GLUT3 (od transportera) -

Glikolitički enzimi: Heksokinaza i fosfofruktokinaza Aldolaza Gliceraldehid- 3-fosfat dehidrogenaza 40

-

Fosfoglicerat – kinaza Enolaza Piruvat – kinaza

Pošto su hipoksični uslovi, da bi se glikoliza odvijala, onda se reducirani NADH mora reoksidirati u NAD+, i to se vrši tako što će se enzim laktat – dehidrogenaza piruvat reducirati u laktat. Slika prikazuje tumorsko tkivo, njegovu vaskularizaciju, ako dođe do hipoksije onda će se povećano transkriptirati i sintetizirati HIF1. On je aktiviran, šta radi? Stimulira rast krvnih sudova, a metabolička adaptacija je povišenje sadržaja nivoa glikolitičkih enzima i GLUT1 i GLUT3 transportera.

9.PUT PENTOZA FOSFATA Kada glukoza uđe u ćelije, onda ide njena fosforilacija u gluk-6 fosfat, onda ovaj proizvod može da ide u proces glikolize da nastane piruvat, a od piruvata i drugih nekeskoznih spojeva može da ide proces sinteze glukoze tj. Glukoneogeneza. Drugi put je da glukoza ide u proces sinteze glukogena, odnosno da glikogen ide u proces razradnje, glikogenolize, da bi nastala glukoza-6-fosfat. Ovo su dva puta koje smo do sada načili. Još jedan put gluk-6-fosfata je put pentoza fosfata.

41

Cilj ovog puta: Glukoza-6-fosfat može da ide u oksidativne reakcije ciklusa pentoza fosfata sa jednim ciljem: u tim oksidativnim reakcijama ciklusa pentoza fosfata stvara se reducirani NADPH. Reducirani NADPH je reducens, koenzim, u biosentetskim putevima i ove oksidativne reakcije su onaj metabolički put u organizmu u kome se stvara reducirani NADPH. Pitamo se gdje to nam treba? –Treba u velikom broju tkiva, tj. Tamo gdje ide biosinteza masti i stereoida, te se u ovim tkivima ciklus pentoza fosfata intenzivno odvija. Također, roducirani NADPH je veoma važan za održavanje redoks potencijala,pa se intenzivno odvija u eritrocitima, u nervnim ćelijama jer štiti ove ćelije od reaktivnih vrsta kisika – oksidativno oštećenje. Pored reduciranog NADPH nastaje riboza-5-fosfat. Tako da ovim putem može gluk-6-fosfat da se prevede u pentoza-5-fosfat, tj. Heksoza u pentozu uz nastajanje NADPH. Međutim, ciklus pentoza fosfata ima i svoje neoksidativne reakcije u kojima se riboza 5-fosfat može ponovo, posebnim setom reakcija, vratiti u glukoza-6-fosfat. Glukoza-6-fosfat ponovo može da ide u oksidativne rakcije. To je u ćelijama onih tkiva koji zahtjevaju za biosintetske precese visoke nivoe reduciranog NADPH. Potom, imamo tkiva koja se regeneriraju, rastu, a svaka dioba ćelije zahtjeva i sintezu nukleinskih kiselina. Da bi se one sinzetizirale, mora biti prisuna pentoza, ili riboza, ili deoksiriboza.U ovakvim tkivima gluk-6-fosfat ide u neoskdiativne reakcije ciklusa pentoza fosfata kojim će se stvarati dovoljne količine riboza-5-fosfata. Tok reakcije (ŠŠema iz Marksa). Glukoza-6-fosfat može da ide i u niz dugih reakcija, ali ovdje, imamo glukozu koja ide u ciklus pentoza fosfata. U oksidativnim reakcijama ciklusa pentoza fosfata, stvara se reducira NADPH (reducens u biosintetskim reakcijama, važan za sintezu masnih kiselina,holesterola,steroidnih hormona, nekih neurotransmitera, te nukleotida, ali za redukciju glutationa- zaštitu od oksidativnog oštećenja), te riboza-5-fosfat. Prvo nastaje ribuloza-5-fosfat, koja može da izomerizira u svoj epimer- ksiluloza-5-fosfat, pa u suštini riboza nastati izomerizacijom fosforilirane ketoze u ribozu. Druge neoksidativne reakcije imaju za cilj da se iz glukoza 6-fosfata sintetizira riboza-6-fosfat za potrebe sinteze nukleotida. Ovaj put naziva se još i fosfo-gkukonatni put, gdje se u suštini nizom oksidativnih reakcija iz gluk-6-fosfata nastaje reducirani NADPH i riboza-5-fosfat. Zbirno ako prikažemo reakciju, od gluk-6-P uz izdvajanje CO2 (jer imamo prelaz iz heskoze u pentozu), nastaju dvije molekule NADPH. Reakcije: Gluk-6-P ulazi u reakciju koju katalizira enzim gluk-6-P dehidrogenaza, tako da dehidrogenacijom glu-6-P biva prevedena u 6-fosfo-glukono-lakton. Ovo je prva reakcija u kojoj se stvara reducirani NADPH. Djelovanjem enzima laktonaze, 6-fosfo-glukono-lakton se prevedi u 6-fosfoglukonat. Enzim 6—fosfo-glukonat dehidrogenaza katalizira sljedeću reakciju u kojom dolazi do dekarboskilacije uz izdvajanje CO2 te oksidacije gdje se OH skupina prevodi u keto skupinu i u suštini uklanjaju se 2 atoma H. Ovo je druga reakcija u kojoj se stvara NADPH. Nastaje fosforilirana ketoza: D ribuloza 5-fosfat. Ona može da izomerizirau riboza-5-fosfat. (Ribuloza-5-P je fosforilirana

42

ketopentoza,a ovo je fosforilirana aldopentoza.) Tada imao reakciju izomerizacije uz djelovanje fosfo-pentoza izomeraze. Ribuloza-5 fosfat može i epimerizirati u ksliluloza-5-fosfat (i to reverzibilno). Ona je važna za one neoskidativne reakcije ciklusa pentoza fosfata. Ako pogledamo oksidativne reakcije, u njima će nastati reducirani NADPH, i riboza-5- fosfat. Neoskidativne reakcije ciklusa penzoza fosfata: Nakon nastajanja riboza-5-P odvija se izomerizacija i epimerizacija. Ako se riboza-5-fosfat prevodi u ksiluloza-5-P onda će ići izomerizacija u ribulozu, pa potom epimerizacija ribuloze u ksilozu. U neoksidativnom puti funkcioniraju dvije rakcije u kojima će se izvršiti transformacija fosforiliranih pentoza u fosforilirane heksoza. Jedna od reakcija je transketolazna a druga je transaldolazna reakcija. Transketolazna reakcija: enzim transketolaza kao prostetsku skupinu sadrži TPP, a on je koenzimski oblik vitamina B1. Ako posmatramo transketolaznu reakciju imamo sljedeće: sa neke ketoze koja je donor prenosi se C2 skupina (skupina od dva ugljikova atoma), na aldozu koja je akceptor C2 skupine. Kada ketoza izgubi ovu C2 skupinu, onda će preći u aldozu, ali koja ima dva C atoma manje. Dok aldoza, koja je primila 2 C atoma, prelazi u ketozu koja ima 2 C atoma više. U neoksidativnom puutu sa fruktoza-6P se prenosi C2 jedinica na gliceraldehid trifosfat. Tada fruktoza prelazi u aldozu sa 4 C atoma: eritrosa-4-fosfat. A gliceraldehid trifosfat prelazi u ketozu sa 5 ugljikovim atoma: ksiluloza-5-fosfat. Pogledajmo još jednu konverziju: sedoheptuloza-7-fosfatje ketoza (7C atoma), u trasketolaznoj reakciji prelazi u aldosu sa 5 atoma: ribozu-5-fosfat, a gliceraldehid koji je primio 2 C atoma, prelazi u ksiluloza-5-fosfat. Za odvijanje trasketolazne reakcije neophodan je TPP. Pri samoj reakciji, mehanizam reakcije, znači imamo tranketolazu koja kao prostetsku grupu ima- TPP. Reaktivni dio TPP je tiazolni prsten. U njemu je atom N četverovalentan i ima pozitivan naboj, zbog njega H atom na C2 ima kiseo naboj i lako će disocirati proton, na ugljikovom atomu će ostati 2 elektronska para tj. Nastaće karbanjon. On može da napada keto skupinu neke ketoze koja je donor C2 jedinice, i u suštini na TPP sada se kovalnetno vezuje ta ketoza koja je donor C2. Ovo prisutvo pozitivnog naboja će olakšavati cijepanje veze na ovom intermedijatu i oslobotit će se riboza-5-fosfat. Na enzim ostaje vezana skupina koja još ima karbanjon. On se sada napasti karbonilni ugljik aldoze koja će biti akceptor C2 jedinice, i iz gliceraldehid trifosfata nastaće ksilulaza-5-P. Ovo je tranketolazna jedinca gdje se C2 jedinica prenosi sa fosforilirane ketoze na aldozu kao akceptor. Transaldolazna reakcija: Druga reakcija koja se odvija. Katalizira je enzim tranaldolaza. Ovaj enzim nema prostetsku skupinu te sam izvodi ovu reakciju prenosi. U ovoj reakciji se prenosi C3 jedinica (dihidroksiacetonska jedinica sa 3 C atoma) sa ketoze kao donora na aldozu kao akceptora. Cijeli mehanizam se odvija uz stvaranje Šifovih baza. Sama trasaldolaza u aktivnom mjestu ima lizinski ostatak koji u bočnom lancu ima E(epsilon) amino-skupinu, koja grad Šifovu bazu za keto skupinom ketoze. Protonizacija nitrogena u Šifovoj bazi olakšava cijepanje C-C veze, pri čemu se oslobađa ketoza koja ima 2 C atoma manje. Reakcija ide u dva stepena, ali suština je sljedeća: Prvo se kao Šifova baza na enzim veže ketoza, doći će do protonizacije, otcijepiti će se šećer sa 3 C atoma manje, a onda se reaguje sa aldozom kaja je akceptor. Tako dolazi do

43

prenosa C3 jedinice sa jednog na drugi šećer. Neoksidativne reakcije (transaldolazne i transketolazne) (bez obzira na šemu) u potpunosti su reverzibilne! Šema: Riboza 5-fosfat (aldoza) i ksiluloza 5 fosfat (ketoza), prvo u trasketolaznoj reakciji razmijene C2 jedinicu (sa ketoze na aldozu), tako da nastane iz ketoze gliceraldehid trifosfat, a iz aldoze sedoheptuloza-7-fosfat(ketoza). Potom ide transaldolazna reakcija gdje će se C3 jedinica prenijeti sa sedoheptuloze -7-fosfata na gliceraldehid trifosfat. Pri tome će sedoheptuloza preći u aldozu sa 4 C atoma- eritroza-4fosfat, a gliceraldehid 3-fosfat će preći u fruktozu-6-fosfat. Ova fruktoza-6-fosfat može da izomerizira u glukoza-6-fosfat. Ovako nastaje prva fosforilirana heksoza. Sada se ponovo odvija transketolazna reakcija u kojoj dolazi do prenosa C2 jedinice sa ksiluloza-5-P na eritroza-4-P. Ksiluloza-5-P prelazi u gliceraldehid 3-P (aldozu), a eritroza prelazi u fruktoza-6-P. (Nastaje druga heksoza, te imamo gliceraldehid 3-P). U ovom ciklusu se utrošilo 3 fosforilirane pentoze, a dobilo smo 2 fosforilirane heksoze, ali nastao je i gliceraldehid 3-P. Ako se niz reakcija ponovi još jednom, imaćemo da je utrošeno 6 fosforiliranih pentoza, dobilo se 4 fosforilirane heksoze, ali i 2 gliceraldehid 3-P, iz koga se može sintetizirati još jedna molekula fruktoza-6-P (glukonegeneza). 6 fosforiliranih pentoza -> 5 fosforiliranih heksoza Odnosno, iz 5 heksoza, dobićemo 6 pentoza jer su reakcije reverzibilne.

10.GLUKONEOGENEZA Ako gledamo i tumačimo glukoneogenezu, to je metabolički put koji je izuzetno važan za održavanje nivoa glukoze u krvi, kažemo, u gladovanju. Ali ne bukvalno gladovanju, nego u onim periodima perioda između obroka, do unosa, apsorpcije, kada se unese glukoza u tkiva, a i oni periodi kada se ne unosi hrana, i u suštini onda funkcioniše glukoneogeneza, i ona je pod utjecajem hormona. Glukoneogeneza, kao metabolički put, ponovno stvaranje (geneza stvaranje, a neogeneza – ponovno stvaranje glukoze).

44

Sinteza ide iz neheksoznih prekursora, onih koji nisu sami šećeri. Vidjet ćemo koje su to krupne supstance iz kojih ide glukoneogeneza. Ona predstavlja stvaranje novog šećera (glukoze). U živom svijetu predstavlja univerzalan metabolički put zastupljen u organizmima svih životinja, biljaka, mikroorganizama i kada su u pitanju organizmi sisara, i kada je u pitanju čovjek, biosinteza glukoze je apsolutno neophodna. Zašto? Jer mozak i nervni sistem, eritrociti, testisi, renalna medula trebaju glukozu u krvi kao svoju jedinu ili glavnu gorivnu supstancu. Dnevne potrebe mozga za glukozom su 120g, toliko treba da preuzme iz krvi i izmetabolizira glukozu da bi podmirio svoje energetske potrebe. Ono što sad posebno moramo zapamtiti je mozak, jer je on isključivo zavisan od glukoze koju preuzima iz krvi. Eritrociti su su također apsolutno ovisni o glukozi, jer je ona jedina gorivna supstanca za njih. Metabolizam glukoze i transport kiseonika putem hemoglobina su tijesno vezani. Koji su prekursori? Prekursori su polazne supstance iz kojih se u životinjskim organizmima ili u organizmima čovjeka, može glukoneogenezom resintetizirati glukoza. To su laktat, piruvat, glicerol i neke aminokiseline. Zašto laktat? Već smo rekli da glukoza jedina gorivna supstanca za eritrocite, ali eritrociti nemaju mitohondrije, prema tome odvija se glikoliza i stvarat će se mliječna kiselina. Ta kiselina stvorena u eritrocitima isporučit će se u krv i putem nje će se transportovati do jetre, gdje će se iz laktata, mliječne kiseline sintetizirati glukoza i to se konstantno odvija. Drugo, kod visoke mišićne aktivnosti, ako je potrošnja glukoze u svrhu stvaranja energije velika, a snadbijevanjem kiseonikom nije adekvatno, stvarat će se velike količine mliječne kiseline, a ista će se iz mišićnih ćelija isporučiti u krv, a onda će se u jetri, iz tog laktata sintetizirati glukoza. Taj proces se stalno ponavlja. Zašto piruvat? Piruvat se također stvara u velikim količinama, laktat se na kraju i prevodi u piruvat. Centralni put glukoneogeneze je od piruvata do glukoze. Zašto glicerol? To ćemo kasnije elaborirati. Glikolizom 3 acil glicerola u masnom tkivu oslobađaju se trohidroksilni alkohol glicerol i slobodne masne kiseline. Te masne kiseline, vezuju se za albumin krvne plazme i transportuju do jetre. Glicerol je polarna molekula, i on se putem krvi transportuje do jetre. Jetra je taj organ koji može da ga iskoristi, jedina ima enzim glicerol kinazu koji fosforilira glicerol u glicerol-3-fosfat i onda ide glukoneogenza. Neke aminokiseline prilikom kataboliziranja, razgradnje, sa velikog broja aminokiselina uklone se prvo alfa amino skupine u reakcijama transaminacije. Ostaje ono što se naziva „ugljikovi skeleti aminokiselina“ koje onda ulaze u puteve razgradnje i onda će se 45

razgraditi do nekog od intermedijera citratnog ciklusa, a ako se razgradi do onih intermedijera citratnog ciklusa od koji nastaje oksal – acetat (od njega ide glukoneogenza), onda su to tzv. glukogene aminokiseline. Veoma važan put glukoneogeneze, kod djelovanja kortizola, glukagona, u nekim uslovima, ide što će se povećano razgrađivati proteini skeletnih mišića, oslobađati aminokiseline, ići u jetru, ići u puteve razgradnje i onda će iz produkata razgradnje(onih iz kojh može nastati oksal – acetat) ići glukoneogeneza. Kod čovjeka, glukoneogeneza se najvećim dijelom odvija u jetri i, u manjem stupnju u renalnom korteksu, a sintetizirana glukoza prelazi u krv i putem krvi vrši se snadbijevanje drugih tkiva. Ako gledamo put reakcije glukoneogeneze, isti je u svim organizmima, međutim metabolički kontekst i regulacija se razlikuju od jedne do druge vrste organizma i jedne do druge vrste tkiva. Centralni put kojim se razgrađuju šećeri je prevođenje glukoze u piruvat. Centralni put glukoneogeneze je od piruvata ka glukozi. Ova dva metabolička puta, glikoliza i glukoneogeneza, se odvijaju u citosolu (neke reakcije glukoneogeneze otpočinju u mitohondrijama), a smisao ova dva metabolička puta se razlikuje. Razgradnja glukoze ide kada su potrebni gradivni blokovi energija, biosinteza će ići kad ima dovoljno gradnih blokova energije i kada ćelije raspolažu sa dovoljno energije u obliku ATP-a. To znači da su oba puta strogo i recipročno regulisana. Neophodna je njihova recipročna i koordinirana regulacija. Recipročno – aktiviran je jedan metabolički put, a je drugi inhibiran. Koji će biti aktivan, zavisi od energetskog stanja i raspoloživih gradivnih blokova i općeg stanja i potreba organizma. Ako gledamo reakcije glukoneogeneze i glikolize (odvija se u 10 stupnjeva), imaju zajedničke reakcije. 7 od 10 glikolitičkih reakcija su reverzibilne i funkcioniraju i u glukoneogenezi, a one reakcije glikolize koje ne funkcionišu u glukoneogenezi su 3 ireverzibilne rekacije glikolize, visoko egzergone, a to su : - fosforilacija glukoze u glukoza- 6-fosfat, djelovanjem heksokinaze - fosforilacija fruktozo – 6 fosfata u fruktozo- 1,6 – bifosfat djelovanjem fosfofruktokinaze - prevođenje fosfoenolpiruvata u piruvat djelovanjem piruvat kinaze One su egzergone, ireverzibilne i kao takve ne fukcioniraju u glukoneogenezi. Šta postoji u glukoneogenezi? Postoji niz enzimskih reakcija, koje čine takozvanu prvu, drugu i treću zaobilaznicu. To su one enzimske reakcije u glukoneogenezi kojima se zaobilaze ireverzibilne reakcije glikolize, ali su i one same po sebi dovoljno egzergone da su praktično ireverzibilne u procesu glukoneogeneze. 46

Ako je promjena slobodne energije blizu nule, takve se reakcije mogu odvijati u oba smjera. Da napomenemo, da su glikoliza i glukoneogeneza procesi koji su u ćeliji praktično ireverzibilni. Slika prikazuje put glikolize i glukoneogeneze Ako se gleda glikoliza, ide glukoza, onda fosforilacija, fruktoza – 6fosfat, rekacija fosfofruktokinaze je ireverzibilna, onda ide niz reverzibilnih reakcija, koje vode nastanku fosfo – enol piruvata, ona reakcija koja je ireverzibilna u glikolizi – reakcija piruvat – kinaze, ponovo se fosfo enol piruvat prevodi u piruvat. Šta će se sada dešavati u glukoeneogenezi? Centralni put vodi od piruvata do nastanka glukoze. Imamo aminokiselinu alanin, kada dođe do njenog prvog unosta u mitohondrijama u jednoj rekaciji, u jednom stupnju, u reakciji transaminacije prevodi se u piruvat pa iz njega može ići glukoneogeneza. U prvoj zaobilaznici ide cijeli jedan set enzimski kataliziranih reakcija kojima će se u glukoneogenezi piruvat prevesti u fosfoenolpiruvat. Piruvat će se u mitohondrijama karboksilirati uz katalitčko djelovanje enzima piruvat karboksilaze u oksal –acetat. Onda će on biti reduciran u eomalat (jabučna kiselina, sirćetna, eomalat je u disociranom, anjonskom obliku u fiziološkom pH organizma). Mitohondrijska malat – dehidrogenaza će izvršiti redukciju oksal – acetata u malat, a nastali malat će jednim transporterom, L-malat-alfaketoglutarat biti isporučen u citosol, gdje će citosolna malat – dehidrogenaza ponovo oksidirati malat u oksal – acetet, a onda će on u reakciji koji katalizira fosfoenolpiruvat karboksikinaza prevesti oksal acetat u fosfoenolni piruvat u reakciji specifičnoj za put glukoneogeneze. Nizom enzimskih reakcija u prvoj zaobilaznici glukoneogeneze piruvat će se prevesti u fosfoenolpiruvat. Nakon toga, idu stupnjevi koji su obrat glikolitičkih rekacija, dok ne nastane fruktoza – 6- fosfat,a onda je ona treba prevesti u fruktoza 1,6 bifosfat. Važna je reakcija koju katalizira piruvat – karboksilaza, ova rekacija je glavna, a funkcionira u glukoneogenezi, a glavna (..) reakcija kojom se održavaju nivoi oksal – acetata u citratnom ciklusu. Tako da su 2 razloga da je dobro zastupljena. U prvoj zaobilaznici vrši se konverzija piruvata u fosfoenolpiruvat i vidjet ćemo da rekacija zahtijeva 2 egzergone reakcije u kojima će se trošiti energija. Fosforilacija piruvata odvija se zaobilaznim nizom reakcija uz sudjelovanje enzima citosola i mitohnodrija . Piruvat se prvo iz citosola 47

transportuje u mitohondrije, ili je nastao u mitohondrijama iz alananina reakcijom transaminacije. Onda otpočinje prva reakcija glukoneogeneze, karboksilacija piruvata u oksal – acetat. Izvršit će je enzim piruvat – karboksilaza i on kao prostetsku skupinu sadrži biotin. Biotin je koenzim, vitamin H, funkcioniše u reakciji karboksilacije, gdje prenosi C1 skupinu, tj. one skupine koje imaju jedan C atom, ali one skupine u kojima se taj C atom nalazi u najoksidarinijem obliku, kao CO2 ili karboksilna skupina. Biotin je vitamin H1, on je prostetska skupina piruvat – karboksilaze, ali funkcioniše kao nosač C1 jedinica, to su skupine koje imaju jedan C atom u najoksidiranijem obliku. Reakcijski mehanizam uključuje biotin kao nosač aktiviranog (32.min). Reakcija karboksilacije piruvata, je anaplerotska reakcija i njome se nadoknađuju i održavaju nivi oksal – acetata u citratnom ciklusu. Reakcija karboksilacije piruvata (slika), donor karboksilne skupine je bikarbonatni jon. Reakciju će katalizirati enzim piruvat – karboksilaza, koja kao prostetsku skupinu sadrži biotin. Nastat će oksal – acetat i ova reakcija karboksilacije je egzergona, zahtijeva utrošak energije koju će obezbijediti ATP koji će se cijepati na ADP i anorganski fosfat. Zbirno, to je piruvat + bikarbonatni jon + ATP dat će oksal – acetat + ADP + anorganski fosfat. Ali, glukoza ima 6 C atoma, a piruvat 3, prema tome za sintezu jedne molekule glukoze treba utrošiti 2 molekule piruvata, što znači da je sve ovo pomonoženo sa 2. Potrebne su, dakle, 2 molekuje ATP-a. U samim mitohodrijama ide redukcija oksal – acetata u eomalat i reakciju će katalizirati mitohondrijska malat – dehidrogenaza (postoje mitohondrijska i citosolna) Ova reakcija odvija se u glukoneogenezi, međutim mi ćemo istu ovu reakciju, samo u suprotnom smjeru imati u citratnom ciklusu. Citratni ciklus i ova faza glukoneoeneze odvijaju se u matriksu mitohondrija. Malat sada napušta mitohondrije pomoću malat - α- ketoglutarat transportera, on će transportovati L – malat sa mitohodrija u citosol u zamjenu za unos α- ketoglutarata iz citosola u matriks mitohodrija. (antiport) U citosolu se sada malat ponovo reoksidira u oksal – acetat, uz nastajanje citosolnog NADH, reakcijom katalizira citosolna malat – dehidrogenaza. Malat + NAD+ ↔ oksalacetat + NADH + H+ Ponovo nastaje oksal – acetat. Sada će se u citosolu oksal-acetat prevesti u fosfoenolni piruvat u reakciji koju katalizira fosfoenol piruvat karboksikinaza.

48

Oksalacetat + GTP ↔ fosfoenolpiruvat + CO2 + GDP Ovo je reakcija koja zahtijeva utrošak energije, a to obezbjeđuje guanozin – 3 – fosfat. Ova, od magnezijuma ovisna reakcija zahtijeva guanazin – 3- fosfat kao donor fosfatne skupine u fosfoenol piruvatu. Reakcija je u ćelijskim uslovima reverzibilna, jer stvaranje visokoenergetskog fosfatnog spoja izbalansirano je cijepanjem fosfatidilne veze u guanozin – 3 – fosfatu. Znači jedna energijom bogata veza se cijepa, druga se stvara i u ćelijskim uslovima reakcija je reverzibilna. Zbirna reakcija za prvi niz zaobilaznih reakcija kojima se piruvat prevodi u fosfoenolpiruvat, Piruvat + ATP + GTP + HCO3- (bikarbonat za reakciju karboksilacije)→ fosfoenolpiruvat + CO2 + ADP + GDP + Pi Piruvat + bikarbonat(za reakciju karboksilacije), ova reakcija zahijeva utrošak ATP-a. Fosfoenol piruvat karboksi kinaza zahtijeva utrošak guanozin -3fosfata, nastaje PEP, izdvojit će se CO2, nastat će ADP i guanozin difosfat i jedan anorganski fosfat, a onaj sa GTP-a ostat će u PEP-u. (ponavlja se dva puta, što znači da su potrebne 4 energijom pogate veze ili 2 ATP-a i 2 guanozin – 3 fosfata) Reakcija koju katalizira fosfoenol piruvat karboksikinaza, ovo je oksal acetat Enzim će prvo izvršiti dekarboksilaciju oksal – acetata, izdvojit će se karboksilna skupina koju je dodala piruvat karboksilaza, onda se izvodji CO2, doći će do preuređenja elektrona, što olakšava napad karbonilnog oksigena na γ-fosfat GTP. Normalno, nastat će PEP, to je fosforilisani oblik piruvata i oslobodit će se GTP. Dva energijom bogata ekvivalenta, jedan potiče od ATP-a, drugi od GTP-a, od kojih svaki u ćelijskim uslovima daje oko 50kJ/mol za fosforilaciju molekule piruvata u PEP. U ćeliji je reakcija prevođenja piruvata piruvata u PEP snažno ireverzibilna. 2 energijom bogata (...), od kojih u ćelijskim uslovima svaki daje po 50kJ/mol, to znači da zavidi od koncentracije reaktanata i produkata cijepanjem ATP- a i GTP-a da bi se jedna molekula piruvata predala u fosforilirani enolni oblik, tj. u PEP

Da bi se odvijao proces glukoneogeneze u citosolu moraju biti na raspologanje dovoljne količine reduciranog NADH. Zašto je potreban reducirani NADH? On nastaje u reakciji glikolize, uz pomoć enzima gliceraldehid trifosfat dehidrogenaze kojom će se gliceraldehid trifosfat prevesti u glicerol 49

1,3 bisfosfoglicerat. Da bi se odvijala glikoliza, reducirani NADH se mora reoksidirati . Ovdje imamo, ako ide reakcija u obrnutom smjeru, onda mora da se 1,3, bisfosfolicerat preveo u glicerol Nivoi reduciranog NADH u citosolu su niski, a oksidiranog oblika visoki. Za razliku od mitohondrija gdje su visoke koncentracije reduciranog NADH, a niske koncentracije oksidiranog oblika. Na koji način će se sada u citosol dopremati taj reducirani NADH potreban za odvijanje glukoneogeneze? Tako što će u mitohondrijama ići redukcija oksal-acetata u malat djelovanjem malat dehidrogenaze. Taj malat će se transportovati u citosol, pa će citosolna malat dehidrogenaza oksidirati L-malat u oksalacetat i pri tom će se stvarati reducirani NADH. Prema tome, ovim nizom reakcija, obezbjedit će se reducirani NADH potreban za dalje reakcije i odvijanje glukoneogeneze u citosolu. Sada imamo transport, kako će se obezbijediti transport od malata iz mitohodrija u citosol i njegovim prevođenjem u oksal acetat efikasno se premještaju reducirajući ekvivalenti iz mitohondrija u citosol gdje se troše za reakciju glukoneogeneze kataliziranu od gliceraldehidtrifosfat dehidrogenaza ..., ali u onom smijeru koji je obratan glikolitičke reakcije. Pošto se citosloni NADH troši, za glukoneogenezu u konverziji 1,3 bisfosfoglicerata u gliceraldehid 3 - fosfat, biosinteza glukoze se ne može odvijati ukoliko na raspolaganju nema dovoljno reduciranog NADH. Odnos reduciranog NADH i NAD+ u citosolu i mitohondrijama, rekli smo da u samom citosolu konc NAD+ je mnogo veća od konc NADH, iznosi 8x10-4, iz čega vidimo koliko je u suštini niža konc NADH od NAD+ u citosolu. U suštini, kažemo da je količnih 105 puta je niži nego u mitohondrijama. U mitohondijama imamo odnos reduciranog NADH i NAD+ iznosi 80, isti ovaj količnik u citosolu je 0, 0008, znači u mitohodrijama su na raspologanju mnogo veće količine reduciranog NADH, tamo se odvijaju oksido – redukcijske reakcije i beta oksidacije gdje se stvaraju ogrome količine reduciranog NADH. Drugi (i kraći) zaobilazni put od piruvata do fosfoenolpiruvata (PEP) preovladava kada je prekursor u glukoneogenezi laktat Ako dođe do unosa u laktata u jetrene ćelije, onda će se enzim laktat dehidrogenaza oksidirati laktat u piruvat i tu se stvara reducirani NADH . Piruvat se transportuje (ima poseban transporter) u matriks mitohondrija gdje će se ponovo izvršiti njegova karboksilacija u oksal – acetat djelovanjem mitohondrijskog iozenzima fosfoenolpiruvat karboksikinaze i ovom slučaju u mitohondrijama će nastati PEP koji 50

će se isporučiti u citosol. Ovo je kraći put, ali ako je polazna supstanca sam laktat, onda laktat dehidrogenaza obezbijedi reducirani NADH za odvijanje glukoneogeneze. Druge ireverzibilne reakcije glukoneogeneze. Kako je nastao PEP i koji će enzim 2 fosfoglicerat, a on će djelovanjem fosfo... izomerizirati 3 fosfogicerat, a on će da se prevede u 1,3, bisfosfolicerat djelovanjem fosfoglicerat kinza. Reakcija gdje se stvara molekula ATP-a u glikolizi Dobili smo 1,3, bisfosfoglicerat..., kojom će nastat gliceraldehid trifosfat, trioza fosfat izomeraza Ireverzibilna reakcija u glikolizi, sada tumačimo drugu zaobliaznicu glukoneogeneze To je druga zaobilaznica, gdje se fruktoza 1,6, bisfosfat prevodi u fruktoza 6 fosfat. U glikolizi je to obratno, one glikolitiče reakcije koje katalizira fosfofruktokinaza 1. U glukoneogenezi, fruktoza 1,6, bisfosfat pevest će se u fruktoza- 6 fosfat djelovanjem Mg jon zavisne fruktoza 1,6 bisfosfataze koje će hidrolitički odcijepiti fosfat sa položaja 1 fruktoza 1,6 bisfosfata. Nastat će se fruktoza 6 - fosfat i anorganski fosfat. Ovdje imamo promjenu standardne slobodne energije koja je( ...) Fruktoza 6- fosfat će izomerizirati u glukoza 6 fosfat i u treću zaobilaznicu glukoneogeneze potrebno je da se defosforilira glukoza 6 fosfata i da nastane slobodna glukoza. Treća zaobilaznica je konverzija glukoza 6 fosfata u slobodnu glukozu i to je finalna reakcija glukoneogeneze. Reakciju će katalizirati enzim glukoza 6 fosfataza i kataliziranje reakcije hidrolitičkog otcjepljenja fosfata sa glukoza 6 fosfata i nastajanje slobodne glukoze. Enzim glukoza 6 fosafataza nije prisutan u mišićnim ćelijama i mozgu, što znači da glukoza nema fosforilacije u tim ćelijama. Ovaj enzim pristuan je u jetrenim ćelijama i jetra ima ulogu da isporuči u krvotok i održava nivo glukoze u krvi. Sama reakcija lociran glukoza 6 fosfataza, sa luminalne strane membrane endoplazmatskog retikuluma i to zahtijeva sada. Za katalitičku enzima potreban je ST protein, Ca vezujući...protein. Sada, da bise izvršila defosforilacija, prvo je potrebno da se putem transportera glukoza 6 fosfata iz citosola transportuje u endoplazmatski retikulum, onda će glukoza 6 fosfataza vršiti defosforilaciju i potrebnu se sada da se u endoplazmatskom retikulumu glukoza transportuje nazad putem ovo transportera u citosolu, i potreban je transporter za anorganski fosfat iz Er-a u citosol.

51

Glukoneogeneza je energetski skup proces Zbir biosintetskih reakcija koje od piruvata vode do slobodne glukoze je: 2 Piruvat(da bi nastala 1 molekula glukoze) + 4ATP + 2GTP + 2NADH + 4H2O → glukoza + 4ADP + 2GDP + 6Pi + 2NAD+ + 2H+ 2 molekule ATP-a i 2 GTP idu u prvoj zaobilaznici. Još 2 molekule ATP-a, u glikolizi kada imamo glicerol 3 fosfat treba da se prevede...katalizira fosfoglicerat kinaza, tu se vrši fosforilizacija sa ATP-om. To jeste reverzibilna reakcija, ali kada se prevodi treba da nastane 1,3 bisfosfoglicerat. 4 molekule vode odu, 2 troše unos enolaza i 2 glukoza 6 fosafataza da bi konačno izvršila defosforilaciju.

11.REGULACIJA GLUKONEOGENEZE Kako izgleda alosterička kontrola ključnih enzima glukoneogeneze i kako ide hormonska kontrola enzimskog kapacitet a glikoze i glukoneogeze? Glukoneogeneza i glikoliza su recipročno regulisane. Ova dva metabolička puta koordinirana su tako da je u ćeliji jedan metabolički put inaktivan, dok je drugi visoko aktivan. Količine i aktivnosti određenih enzima svakog od ovih metaboličkih puteva koordinirani su tako da oba puta nisu visoko aktivna u isto vrijeme. I glikoliza i glukoneogeneza fosforiliziraju se preko enzimskih stupnjeva koji su jedinstveni za svaki od ovih metaboličkih puteva. Ako se ne odvija u glikolizi, to su enzimi: piruvat karboksilaza i fosfofrukto kinaza(uprvoj zaobilaznici), a u drugoj zaobilaznici je to fruktoza 1,6 bisfosfataza koja katalizira obrat rekcije fosfofrukto kinaze 1, i veoma je važna tačka kontrole glukoneogeneze.

52

(shema)Ovdje sam rekla samo da je H+ jon, ako pogledamo u prvoj zaobilaznici, kada se piruvat prevede u fosfoenol piruvat, one tačke kontrole su enzim piruvat karboksilaza i drugo fosfoenol piruvat karboksikinaza. Generalno, aktivnost ovih enzima je alosterički regulisana i zavisi od energetskog stanja, energetskog naboja ćelije. Glikuneogeneza troši energiju , je endergon proces i zahtijeva dosta energiju i ako su visoki nivoi ADP, znači da ćelije nema dovoljno energije za glukoneogenezu. Prema tome je ADP aldosterički inhibitor piruvat karboksilaze i aldosterički inhibitor fosfoenol piruvat karbiksikinaze. Onaj spoj koji je aldosterički aktivator piruvat karboksliaze je acetil konezima A, koji signalizira da ćelija raspolaže sa dovoljno gradivnih blokova. Zašto? Piruvat se inace reakcijom oksidativne dekarboksilacije na kompleksu piruvat dehidrogenze prevodi u acetilen koenzim A. Prema tome ako su visoko nivoi acetil coA, onda će on alosterički aktivirati piruvat karboksliazu i ići će reakcije sinteze ćelija, oksal acetata. Glukoneogeneza je amortizovana uslovima kada je ćelija bogata ATPom i biosintetskim prekursorima. Piruvat karoksilazu aktivira acietil CoA, a inhibira ADP, a acetil CoA signilizara postojanje izobiljegradivnih blokova za biosintetske procese. Visoki nivoi ATP signaliziraju nizak energetski naboj ćelije i inhibirana je i piruvat karboksilaza i fosfoenol bifosfat karboksikinaza. Regulacija fruktoza 1.6 bisfosfataze Ona je recipročno regulisana u odnosu na fosfrukto kinazu 1. Visoki nivoi ATP signaliziraju iscrpljene energetske rezerve i oni onda aldostericki inhibiraju fruktoza 1,6 bisfosfataza, a visoki nivoi citrata signaliziraju postojanje izobilja gradivnih blokova i onda se uz to aldosterički aktivatori fruktoza 1,6 bisfosfataze i u tom smislu ovaj enzim je obrnuto alosterički regulisan od fosfofrukto kinaze 1. Visoki nivoi AMP ce aktivirati fosfofrukto kinazu 1, a visoki nivoi citrata ce inhibirati fosfofrukto kinazu 1. Prema tome energetski naboji recipročno obrnuto regulisu fosfofrukto kinazu 1 glikolize i fruktoza 1,6 bisfosfatazu glukoneogeneze. Ali fruktoza 1,6 bisfosfatazu aldosterički regulira i fruktoza 2,6 bisfosfat,on je snažan aktivator fosfofrukto kinaze 1 i u suštini inhibitor fruktoza 1,6 bisfosfataze. Fruktoza 1,6 bisfosfatazu snažno inhibira fruktoza 2,6 bisfosfat, to znači da fosfofrukto kinazu 1, koji funkcionira u glikolizi i fruktoza 1,6 bisfosfatazu, enzim koji funkcionira u glukoneogenezi, recipročno regulira fruktoza 2,6 bisfosfat. Ka Fruktoza 2,6 bisfosfat sintetizira kao aldosterički efektor ova dva enzima, to je enezim disfuncionalni enzim. To je fosfofrukto kinaza 2, koji ima kinaznu i fosfataznu domenu. Ako je aktivirana fosfatazna, 53

onda će hidrolozirati hidrolitičko otcjepljenje fosfata sa položaja dva fruktoza 2,6 bisfosfata i onda će se sprječavati priboj ovog aldosteričkog efektora i voditi inhibiranju glikolize iz... glukoneogeneze. Čim se smijesi priboj fruktoza 2,6 bisfosfata prestane aldosterička inhibicija fruktoza 1,6 bisfosfataze. Ako je glukoza prisutna u izobilju, u izobliju se unosi u jetrene ćelije, fosforilira, izomerizira se glukoza 6 fosfat u fruktoza- 6 fosfat, on onda djeluje kao aktivator one fosfoprotein fosfataze koja će izvršiti defosforilaciju disfunkcionalnog enzima. Isključuje se fosfatazna, a uključuje se kinazna aktivnost. Iz fruktoza 6 fosfata ide fosforilacije i stvaranje fruktoza 2,6 bisfosfata, on snažno stimulira glikolizu,a inhibira glukoneogenezu, to faktički zavisi od nivoa glukoze u krvi. Ako je prisutna glukoza u krvi, onda je stimulirana glikoliza, ako je snižen nivo glukoze u krvi, to smo tumačili preko glukagona (kako ce ici kaskada i fosforilacija, onda je inhibirana glikoliza, a stimulirana glukoneogeneza). Glukagon stimulira odvijanje glukoneogeneze u uslovima snižene koncentracije glukoze u krvi. Inzulin stimulira odvijanje glikolize. Inzulin je povećan kada je povećana sitost i kada je glukoza prisutna,unosi se u ćeliju, stimulirat će se odvijanje glikolize, nastat ce piruvat, on se prevede u acetil CoA ,a iz njega ide biosinteza masnih kiselina, pa kasnije holesterola iz masnih kiselina u triacilglicerole i inzulin koji uvijek stimulira biosintetske puteve. Ima smisla da stimulira glikolizu jer su to jedini gradivni blokovi za biosintezu masti. U našem organizmu, sav višak šećera će se vratiti u masti, a masti se nikad neće vratiti u šećer. Biosintetske stimulacije inzulina U stanju sitosti glikoliza je povećana a glukoneogeneza smanjena . Tokom gladovnja preovladava glukoneogeneza jer je nivo glukoza 2,6 bisfosfata veoma niska i to je pod kontolom glukagonana. Glukoza nastala u tom procesu glukonogeneze u jetri, u ovim uslovima esencijalna je za preživljavanje mozga i mišića. Ne samo da postoje aldosteričke kontole, zavisno od nivoa glukoze u krvi mijenja se odnos inzulin-glukagon u samoj krvi. Zavisno od toga preovladavat će djelovanje inzulina ili djelovanje glukagona, ali ova dva hormana utjecat će na stupanj transkripcije gena za ključne enzime glikolize,odnosno glukoneogeneze. Inzulin će stimulirati ekspresiju ključnih enzima za glukoneogenezu, a inhibrat će se ekspresija ključnih enzima glikolize. Time se mijenja nivo enzima datog metaboličkog puta i govorimo o enzimskom kapacitetu za odvijanje tog metaboličkog puta. Glukagon će stimulirati ekspresiju gena ključnih enzima glukoneogeneze, a inhibirati transkripciju gena za ključne enzime glikolize. 54

Sada će, pored aldosteričke kontrole, djelovati hormonska kontrola na nivou transkripciju gena za ključne enzime glikolize i gukoneogeneze. Na ekspresiju gena hormoni djeluju tako da primarno mijenjaju stupanj transkripcije gena za date i enzime i reguliraju razgradnju mRNK. Nivo inzulina u krvi povećava se nakon jela, kada glukoze ima u izobilju i inzulin čiji se nivo u krvi povećava u stanju sitosti, stimušie ekspresiju fosfofruktokinaze 1, piruvat kinaze i bifunkcionalnog enzima (PFK-2) koji stvara i razgrađuje F-2,6-bisfosfat i time inzulin podstiče glikolizu. U stanju gladovanja, kada je snižena koncentracije glukoze u krvi, povećava se nivo glukagona u samoj krvi. Onda će glukagon inhibirati ekspresiju regulatornih enzima glikolitičkog puta a stimulirati ekspresiju enzima glukogeogeneze, i to fosofenolpiruvat karboksikinaze, fruktoza 1,6-bisfosfataze, glukoza 6-fosfataze. Svi su specifčni za glukoneogenezu. Kako to može izgledati kontrola pogledat ćemo na promotorskom mjestu enzima fosfoenolpiruvat karboksikinaza. Visok odnos glukagon/inzulin u krvi povećava enzimski kapacitet glukoneogeneze, a smanjuje enzimski kapacitet glikolize. Nizak odnos glukagon/inzulin ima suprotno djelovanje, povećava enzimski kapacitet glikolize, a smanjuje enzimski kapacitet glukoneogeneze. Bogatstvo i složenost hormonske kontrole grafički su predstavljeni na promotoru gena za fosfoenolpiruvat krboksi kinazu i promotorsko mjesto za istu sadrži regulatorne sekvence preko kojih hormoni inzulin, glukagon, glukokotikoidi i hormon štitnjače kontroliraju transkripciju ovog gena.

Ako pogledamo shematski, ovdje je prikazano promotorsko mjesto, gena za fosfoenol piruvat karboksikinazu, ima 500 baznih parova. Od broja 1 otpočinje sam gen za ovaj enzim. Ovdje prikazano u bojama, promotorsko mjesto sadrži specifične DNK sekvence, označene kao RT elementi. Ovo je element odgovora, sekvenca prilikom koje će na

55

transkripciju djelovati inzulin(zeleno). Sekvenca, RT element zbog kojeg će na transkripciju gena na fosfoenolpiruvat karboksikinazu djelovati glukokortikoidi (kortizol stimulira glukoneogenezu). Plavo je hormon štitnjače,a žuto obojeni su oni elementi preko kojih se kontroliše oni hormoni koji djeluju preko cAMP kao drugog glasnika. Znači ...kontrola transkripcije gena ovog enzima glukoneogeneze. Ako je snižen nivo glukagona, vezat će se na receptor, aktivirat će se adenilat ciklaza, cAMP će se povisiti, on će aktivirati protein kinaze A, a ona će fosforilirati jedan protein označen kao CREB ("cAMP- response element binding protein″- protein koji se vezuje na element odgovora na cAMP), to je u suštini na element odgovoran cAMP vezujući protein. Fosforilirani oblik se vezuje na element odgovora na DNK sekvencu koja ide preko cAMP i u ovom slučaju će biti povećana transkripcija gena za fosfoenolpiruvat karboksikinazu. S druge strane, inzulin će djelovati preko proteina označenog kao IREB, i inhibirat će transkripciju gena. Protein kinaza A fosforilira protein CREB ("cAMP- response element binding protein″- protein koji se vezuje na element odgovora na cAMP), transkripcijski faktor koji se u svom fosforiliranom obliku može vezati na CRE u promotorskom mjestu (CRE – element odgovora na cAMP). CRE je element unutar regulatornog područja gena koji odgovara na cAMP. Vezivanje fosforiliranog CREB na CRE u promotorskom mjestu pokreće transkripciju gena koji kodiraju ključne enzime glukoneogeneze, kao što je fosfoenolpiruvat karboksikinaza. Inzulin djeluje suprotno glukagonu. Inzulin djeluje preko signalne kaskade koja rezultira aktivacijom proteina IREB (proteina koji se vezuje na element odgovora na inzulin – IRE – u promotoru gena). IRF u sekvenci označenoj kao IRE u promotoru gena, on se vezuje na sekvencu DNK i inhibira transkripciju gena za ključne enzime glukoneogeneze.

12.GLIKOGEN 56

-Metaboliziranje etanolaLjudi konzumiraju alkohol,to je ustvari etanol i njegovo prekomjerno konzumiranje moze dovesti do ozbiljnih posljedica po zdravlje. Dva su puta metaboliziranja etanola jedan cemo sad objasnit a drugi kasnije(preko seminarskih radova). REAKCIJA 1: U sustini etanol djelovanjem enzima alkohol-dehidrogenaze se prevodi u acetalldehid,odnosno etanol ce se oksidirati u acet-aldehid.Ono sto moramo zapamtiti.a to je da u ovoj reakciji oksidans je NAD+. Acet-aldehid sam po sebi je vrlo reaktivan ako dolazi do njegove akumulacije.Ovim procesom oksidacije pored acet-aldehida nastaje i reducirani NADH. Ova reakcija se odvija u citostolu jetrenih celija. REAKCIJA 2: Druga reakcija metabolickog puta se odvija u mitohondrijama jetrenih celija,a to je: Acet-aldehid ce se sada oksidirati u acetat koji se zatim fakticki izlucuje iz organizma.Ureakciji sudjeluje kao oksidans NAD+ i voda.Na kraju reakcije pored acetata nastatce i reducirani NADH,enzim koji to katalizira je alkohol-dehidrogenaza. Konacno ce djelovanjem ova dva enzima etanol se prevodi u acet-aldehid a on ce se oksidirati u acetat koji ce da napusti celiju.Ali ono sto je vazno za metaboliziranje samog etanola je da se stvaraju visoke kolicine reduciranog NADH. I usustini kod visokih kolicina reduciranog NADH nedostajat ce gradivnih blokova za glukoneogenezu i doci ce do hipoglikemije(snizenog nivoa glukoze u krvi). Pitate se zasto??? Piruvat ce uz djelovanje enzima laktat- dehidrogenaze prevest u laktat.Ali zbog visoke koncentracije reduciranog NADH,nema mogucnosti da se laktat prevede u piruvat sto je potrebno za odvijanje procesa glukoneogeneze i rezultat toga u sustini jeste hipoglikemija .Drugi rezultat ove reakcije ce bit da usljed stvaranja visokih koncentracija laktata ce nastat laktatna acidoza. (Sad mi ne radimo metabolizam masnih kiselina ali mozete i to pribiljezit) Visoke koncentracije NADH ce u sustini blokirati beta oksidaciju masnih kiselina,a svrha beta oksidacije masnih kiselina je da se dobije energija.Medutim u toku odijanja ove reakcije doci ce do stvaranja novih kolicina NADH,tako da cemo imat visoke nivoe NADH koji ce blokirati u sustini katabolizam beta oksidacije masnih kiselina. Kao rezultat toga je da ce se povecati nivo tri-acil-glicerola u jetri i nastatce oboljenje tkz. masna jetra.

57

Glikogen je veliki razgranati polimer izgraden od glukoznih jedinica.Najveci dio glukoznih jedinica je povezan L(alfa) 1,4 glikozidnom vezom ,a na mjestima granjanja L(alfa)1,6 glikozidnom vezom. Glikogena najvise ima u jetri,jetra ima veliki kapacitet za sintezu glikogena.U stanju sitosti nejgova normalna vrijednost iznosi 10% vlazne tezine tijela,znaci na 100 grama jetrenog tkiva 10 otpada na glikogen.Uloga glikogena u jetrenim celijama je odrzavanje nivoa glukoze u krvi. Drugo tkivo u kojem imamo velike kolicine glikogena su misici. Normalna vrijednost glikogena u misicima iznosi 2% vlazne tezine tijela. Cemu sluzi? U sustini kao rezervoar glukoze i prilikom njegove razgradnje se dobiva glukoza koja se kasnije iskoristi kao gorivna supstanca.

58

Na snimcima elektronske mikroskopije prikazane su granule glikogena u jetri dobro uhranjenog pacova i relativno odsustvo granula (zbog razgradnje glikogena da bi se odrzao nivo glukoze ) u jetri pacova koje je gladovao duze od 24 sata. U granulama glikogena se nalaze enzimi za sintezu i razgradnju.

GLIKOGENOLIZA Proces razgradnje se naziva glikogenoliza, i jos se naziva fosforoliza glikogena. Zntel zasto???

59

U glikogenu kada ide glikogenoliza dolazi do cijepanja L(alfa) 1,4 glikozidnih veza i potrebno je da se cijepaju i L(alfa)1,6 glikozidne veze, ali ono sto kazemo da je fosforoliza to je kataliticki djelovanje enzima glikogen-fosforilaze koja ce cijepati L(alfa) 1,4 glikozidnu vezu pod djelovanjem anorganskog fosfata,taj enzim nece samo cijepati ove glikozidne veze nego ce onaj otcjepljeni ostatak glukoze sa nereducirajuceg kraja glikogena prenjeti na anorganski fosfat. Onda ce glukoza djelovanjem glikogenfosforilaze dobiva u vec fosforiliranom obliku kao glikoza1-fosfat,a onda ce djelovanjem fosfogluko-mutaze izomerizirat u glukoza 6 fosfat. To je ona prednost sa energetskog gledista prednost fosforilize. Kod potpune razgradnje glikogena iz mjesta granjanja se djelovanjem L8alfa)1,6 glikozidazne aktivnosti enzimi derazgranavanja otcjepljuje slobodnu glukozu. Uprocesu razgradnje glikogena idu dva enzima: - Glikogen fosforilaze

60

- Enzim derazgranavanja U procesu glikogenolize oslobodena glukoza , oko 90% se nalazi u fosforiliranom obliku( odnosno glukoga 1-fosfat), a 10% kao slobodna glukoza (to su glukozni ostatci koji su vezani L(alfa) 1,6 glikozidnim vezama. Ako gledamo sta radi glikogenfosforilaza.Ovo je ne reducirajuci kraj ,glikogen fosforilaza ce cjepat L(alfa)1,4 glikozidnu vezu to cijepanje se odvija pod djelovanjem anorganskog fosfata i dobiva se glukoza 1fosfat.Taj proces sukcesivnog cijepanja ne reducirajuceg kraja ide do cetvrtog glukoznog ostatka prije mjesta grananja. I onda se ukljucuje enzim

derazgranavanja(to je bifunkcionalni enzim sa dvije zasebne enzimske aktivnosti na jednom polipeptidnom lancu. Transferazna aktivnost enzima derazgranavanja prenosi segment kojeg cine 3 glukozna ostatka iz mjesta granjanja na neki drugi ne reducirajuci kraj pricemu ce na mjestu granjanja ostati samo ostatci koji su vezani L(alfa) 1,4 glikozidnom vezom. Na ovaj produzeni bocni lanac ce ponovo djelovat glikogen-fosforilaza a ovo otcjepljivanje ce se izvrsiti L(alfa)1,6 glikozidaznom aktivnosti istog enzima derazgranavanja.Tako da cemo na kraju imat 90% fosforilirane glukoze i 10% slobodne glukoze. 61

Sada gledajte nesto ... fosfoglukomutaza Glukoza 1- fosfat ↔ glukoza 6- fosfat Ako ide fosforiliza onda ce nastala glukoza 1-fosfat djelovanjem fosfoglukomutaze fosforilirat u glukoza 6 fosfat.(mutaze djeluju premjestanjem grupa unutar molekule).I sada u sustini ce djelovat enzim glukoza-fosfataza da bi prevela fosforiliranu glukozu u slobodnu glukozu jer samo u tom obliku moze uci u krvotok i da bude na raspolaganju ostalim tkivima i organima.Ono sto smo naucili za misice to je da oni ne spremaju glukoza 6 fosfataznu aktivnost,ova fosforilirana glukoza 6 fosfat ulazi u glikoliticki put. 12.1.BIOSINTEZA GLIKOGENA U jetri glikogen sluzi kao rezervoar glukoze. Razgradnjom se prevodi u glukozu u krvi i distribuira drugim tkivima.U misicima glukoza nastala razgradnjom glikogena metabolizira se glikolizom da bi se obezbjedila ATP energija potrebna za misicnu kontrakciju. (Sada u sustini da bi isla sinteza glikogena moramo u sustini protumaciti te reakcije). glukokinaza (jetra) D- glukoza + ATP → D- glukoza 6- fosfat + ADP heksokinaza (mišići) Prvo glukoza u reakcijama gdje se stvaraju glikozidne veze mora se nalaziti u aktiviranom obliku a to je uridin-difosfat-glukoza.Cak u sustini ako sinteza ide iz same glukoze potrebno je da se ta glukoza fosforilira sa ATP_om ako je u jetri to je glukokinaza ako je u misicima to je heksokinaza,i da nastane glukoza 6 fosfat. fosfoglukomutaza Glukoza 6- fosfat ↔ Glukoza 1- fosfat Sada u sustini glukoza 6 fosfat treba da izomerizira djelovanjem fosfoglukomutaze u glukoza 1 fosfat. glukoza 1-fosfat Glukoza 1- fosfat + UTP → UDP- glukoza + PPi uridil transferaza Onda ce glukoza 1 fosfat i uridil 3 fosfat djelovanjem glukoza 1 fosfat uridil transferaze preci u aktivan oblik uridil di fosfat glukoze kojim ona ide u reakcije stvaranja glikozidnih vezai pri tome ce se ocjepiti anorganski pirofosfat koji ce kasnije djelovanjem pirofosfataze cijepati na 2 molekue anorganskog fosfata. Kako izgleda uridil di fosfat glukoza?

62

Glukoza 1 fosfat i uridil mono fostat glukoza vezani su fosfo anhidridskim vezama i time je aktivirana glukoza za stvaranje glikozidnih veza. Sinteza molekule glikogena zapocinje na proteinu glikogeninu koji

63

ima molarnu masu 37 kilodaltona.Ali ovaj protein ima u sustini kataliticku aktivnost ,odnosno glikolizirajucu aktivnost.Da bi otpocela sinteza ,proteina glikogenin ima glikoziltransferaznu aktivnost koja ce izvrsiti glikolizaciju na bocnom lancu tirozina u polozaju tyr 194.sta ce uraditi ova glikoziltransferazna aktivnost? Prenjet ce glukozne ostatke iz aktiviranog oblika (to je uridil di fosfat glukoze) na oh skupinu tirozina u polozaju 194. Glikogenin ce potom sa glikogen sintetazom da gradi cvrsti spoj. Glikogenin svojom glikozil transferazom aktivnoscu produzavat zapoceti lanac glikogena dok se ne sintetizira segment duzine 8 glukoznih ostataka.To ce uraditi glikoziltransferazna aktivnost glikogenina. Kako ??? Tako sto ce prenositi gluikozne ostatke sa uridil di fosfat glukoze i vezivat ce se L(alfa) 1,4 glikozidnom vezom . Kada glikogenil izvrsi glikogenizaciju i kada se sintetizira ovaj lanac duzine 8 glukonskih ostataka sada ce sintezu nastvaiti glikogen-sintetaza i ona ce u sustini nastaviti dodavanje glukonskih ostataka.Kada se formira lanac odgovarajuce duzine onda ce se ukljuciti enzim grananja koji ce segment duzine 607 penosit sa tog lanca na unutrasnjost ovog polimera L(alfa) 1,6 glikozidnim vezama.U sustini kada je sintetizirana molekula glikogena,glikogenil ostaje uronjen u cesticu glikogena kovalentno vezan na jedan reducirajuci kraj molekule glikogena .Kombinovanim djelovanjem enzima glikogen sintetaze i enzima grananja kompletira se sinteza molekule glikogena. SINTEZA GLIKOGENA

Glikogen sintetaza ce sa uridin di fosfat glukoze prenositi glukozne ostatke koji ce se L(alfa)1,4 glikozidnom vezom vezati za ne reducirajuce krajeve lanaca.Kada glikogen sintetaza sintetizira lanac odredene duzine u kojem su glukozni ostatci povezani L(alfa)1,4 glikozidnim vezama onda ce u sustini jedna transferazna aktivnost enzima grananja koja se naziva glukano 1,6 transferaza prenjeti segment duzine 6-7 glukoznih ostataka ocjepit ce se ova L(alfa) 1,4 glikozidna veza i onda ce se prenjeti i katalizirati stvaranje l(alfa) 1,6 glikozidne veze. I tako kombinovanim djelovanjem ta 2 enzima sintetizirat ce se molekula glikogena.

64

13.REGULACIJA METABOLIZMA GLIKOGENA Regulacija metabolizma glikogena je vrlo slozena. Enzim glikogen-fosforilaza i fosforilaza-kinaza dva su kljucna enzima pri razgradnju glikogena i predstavljaju kljucne tacke samog procesa razgradnje. Glikogen fosforilaza i fosforilaza-kinaza se regulisu na 2 nacina: Reverzibilna fosforilacija i alostericka kontrola. 1)Reverzibilna fosforilacija je pod kontrolom hormona epinefrina,inzulina,i glukagona. 2) alostericka kontrolaovih aktivnosti jako se razlikuje alostericka kontrola enzima u misicnoj celiji i onih u jetrenoj celiji.sto je sustini rezultat razlicite namjene glikogena deponovanog u jetri i misicnim celijama. (sada tumacimo po stryeru). Ako tumacimo prvu tacku kontrole to je enzim glikogenfosforiliza i ona se regulira alosterickim interakcijama i reverzibilnom fosforilacijom.aktivnost glikogen fosforilaze ce regulirati nekoliko alosterickih efektora koji signaliziraju energetsko stanje celije i reverzibilna fosforilaciaj koja je pod kontrolom hormona epinefrina,inzulina,i glukagona. Postoje razlike u kontroli metabolizma glikogena u jetri i skeletnim misicima usljed cinjenice da: -misici koriste glukozu za proizvodnju energije za sopstvene potrebe -jetra deponovani glikogen sluzi za odrzavanje homeostaze glukoze u krvi odnosno cijelom organizmu. I ono sto je u sustini primarno vazno jeste da glikogen fosforilaza u misicima ce regulirat energetski naboj,a njega ce signalizirati nivoi AMP-a i ADP-a u tom slucaju se radi o alostericoj kontroli unutar same celije. Kod intenzivnog vjezbanja nervni implus ce pokrenuti izlucivanje hormona epinefrina onda on pokrece aktivnost regulacije enzima reverzibilnom fosforilacijom. Ako gledamo glikogen fosforilazu prvo cemo sad napravit jednu shemu! (sema sa predavanja) Imamo glikogen fosforilazu b( koja se nalazi u nefosforiliranom obliku,ona je metabolicki inaktivna) a ako dodje do reverzibilne fosforilacije preci ce u fosforilirani oblik(fosforilaza a) fosforilacijom serinskih ostataka na svakoj od podjedinica enzima.

65

Fosforilacija ide sa ATP-om pri cemu ce nastat ADP i u sustini glikogen fosforilaza moze iz fosforiliranog oblika da predje u nefosforilirani.Enzim koji katalizira ovu fosforilaciju je fosforilaza-kinaza. Glikogen fosforilaza je dimer koji se sastoji iz 2 podjedinice. Glikogen moze da se nadje u 2 oblika: Jedan oblik je fosforilaza b u T-stanju i to je neaktivan oblik,a drugi je fosforilaza b u Rstanju i to je aktivniji oblik ( ali ne toliko aktivi kao sto je fosforilaza a). Glikogen fosforilaza takodje moze biti u Ti R konformacijsom stanju. Sada ponovo sudjeluje ATP koji prelazi u ADP . Sustina je sljedeca ,sada da unutar celije glikogen fosforilaza u nefosforiliranom obliku moze se nalaziti u T i R stanju pri cemu je R aktivniji od T konformacije. Sada u misicnim celijama postoje alostericki efektori koji ce ravnotezu izmedu T i R oblika pomjeriti u stranu R. Koji su TO??? Za misicnu celiju je vazan energetski naboj. Prema tome u misicnoj kontrakciji prvo ce doci do povisenja nivoa AMP-a on ce se vezati na specificno alostericko mjesto na ovom T obliku i inducirat promjenu ne fosforiliranog oblika u R-stanje koje je metaboliticki aktivniji. Mi kazemo pomjerit ce ravnotezu izmedu T i R oblika nefosforiliranog enzima prema R obliku koja je kataliticki aktivnija. U ovoj reakciji je alostericki efektor AMP. Kada imamo visoke koncentracije ATP-a onda nema potrebe da se vrsi razgradnja glikogena,prema tome visoki nivoi ATP-a oni ce se isto vezati na nukleotidno mjesto ali ce pomjerat ravnotezu u T stanje.Ako su visoki nivoi glukoze 6 fosfat ,alostericki efektori ce takoder pomjeriti ravnotezu prema T stanju. To je alostericka kontrola u misicnoj celiji i u sustini drugi nacin kontrole to je reverzibilna fosforilacija i nju ce u misicnim celijama pokrenut adrenalin i nervni implus.Onda ce preci u glikogen fosforilazu koja je maksimalno aktivna. Ako gledamo sada jetru glikogen deponovan u jetri ima druge funkcije da odrzi nivo glukoze u krvi i energetski naboj jetrenih celija se ne mjenja toliko drasticno kao kod misicnih celija koje vrse rad vjezbanje kontrakciju itd. Ako gledamo u jetri u alosterickoj kontroli enzim moze biti nefosforiliran ili fosforiliran i to je pod kontrolom hormona. Hormon koji primarno djeluje na metabolizam glikogena u jetri je glukagon ,a u misicnim celijama je adrenalin.U jetri glikogen podlijeze alosterickoj kontroli ali samo fosforilirani oblik enzima,ali onaj efektor koji ce uticat je nivo glukoze u krvi.Ako je nivo glukoze u krvi visok,onda se glukoza unese u jetrene celije i onda ce se pomjeriti ravnoteza iz R u T stanje. Misicnu fosforilazu regulira intracelularni energetski naboj ,enzim je dimer i nalazi se u 2 oblika koji mogu prelaziti jedan u drugi(glikogen fosforilaza a koja je kataliticki aktivna i glikogen fosforilza b koja je inaktivna).glikogen fosforilaza b se prevodi u glikogen fosforilazu a specifinom fosforilacijom serinskih ostataka na polozaju 14 na svakoj od podjedinica enzima. Ovu kovalentnu modifikaciju katalizira regulatorni enzim fosforilaza kinaza. Kod intenzivne misicne aktivnosti hormon epinefrin ce pokrenuti fosforilaciju serinskih ostataka u polozaju 14 fosforilaze b i prevodi je u fosforilau a. Elektricna stimulacija misica tkd. Rezultira fosforilacijom glikogen fosforilaze i prelaskom enzima u aktivniji fosforilirani oblik. Znaci imamo glikogen koji je kataliticki aktivan, kada su misicne celije u pitanju ako je glikogen fosforiliran nema vise alostericke kontrole AMP-a u ATP on je sada preveden u

66

aktivn obliki nema alostericke kontrole. Svaki od oblika glikogen fosforilaze i fosforilaza a i b nalaze se u 2 konformacijska stanja relaksiranom R stanju koje je aktivnije i napetom T stanju koje je manje aktivno a izmedu njih je uspostavljena ravnoteza. Polozaj ravnoteze ta fosforilazu a favorizuje aktivnije R stanje. Energetski naboj misicne celije oznacavaju nivoi AMP-a i ATP.a unutra celije . AMP i ATP kontroliraju glikogen tranziciju fosforilaze b izmedu T i R stanja a time i aktivnost enzima. Misicna fosforilaza B aktivna je samo u prisustvu visokih koncentracija AMP-a koji se vezuju za nukleotidno mjesto na enzimima i strabiliziraju konformacijz fosforilaze b u R stanje . ATP djeluje kao negativni alostericki efektor koji se takmici sa AMP-om i favorizuje T stanje. Glukoza 6 fosfat favorizuje T stanje fosforilaze b.

Sad ako pogledate glikogen fosforilazu, ona je dimer. Ovo je shematski prikaz. Fosforilaza b. Moze biti u T i R stanju. Ovo je aktivno mjesto enzima, a ovo je nukleotidno mjesto za koje se veze ATP ili ADP zavisno od njihovih nivoa unutar celije. T stanje je prakticki, katalitički inaktivno. Ako pogledate strukturno, ovo je dio polipeptidnog lanca, on se na neki nacin umjesta na to aktivno mjesto i blokira to aktivno mjesto. U R komformaciji ono je u potpunosti otkriveno. Ovdje su dva AMP-a, dvije podjedinice,. AMP ce pomjerati ravnotezu fosforilacije b, na stranu R stanja, a ATP i glukoza-6-fosfat na stranu T stanja, ovo sto smo tu napisali. (shema s table)

67

Ako pogledate sliku (Nelson), to je glikogen fosforilaza u misicima, misicna fosforilaza, kao dimer. Ovo zuto su u sustini, serinski ostaci preko kojih ide reverzibilna fosforilacija. Ovo gdje je crveno, je glukoza, to je u sustini aktivno mjesto, glukoza-1-fosfat ce nastati kao produkt. Ovo gdje je tamno plavo to su alostericka mjesta na koja ce se nadovezati adeninski nukleotidi, ATP ili AMP. I ono sto je u sustini interesantno za glikogen fosforilazu je ovo sto je prikazano zuto. To je piridoksal fosfat koji ovdje ima svoj koenzimski oblik vitamina B6, koji ima drugu ulogu u metabolizmu, ali kada je u pitanju glikogen fosforilaza, on ima ulogu u sudjelovanju u kiselinsko-baznoj katalizi. U vecini fizioloskih uslova, fosforilaza b je inaktivna zbog inhibitornog djelovanja ATP-a i glukoza-6-fosfata. I u misicima koji se odmaraju, sav enzim se nalazi u inaktivnom obliku b. Otpocinjanje misicne aktivnosti vjezbanja dovodi do povisenja nivoa AMP-a i

68

potom dolazi do alostericke aktivacije fosforilaze b. Vjezbanje rezultira otpustanje hormona koji ce pokrenuti fosforilaciju glikogen fosforilaze i prelazak tog enzima u ovaj kataliticki poptuno aktivni oblik (pokazuje na glikogen fosforilazu a, R stanje :P ), a ako je enzim fosforiliran onda ATP, AMP i glukoza-6-fosfat nece vise uticati na kataliticku aktivnost enzima. Glikogen fosforilaza a je u sustini poptuno aktivna i ne zavisi od nivoa ATP, AMP i glukoza-6-fosfata u samoj celiji. Regulacija jetrene glikogen fosforilaze se znacajno razlikuje od misicnog enzima. Zasto? Cilj razgradnje glikona u jetri je stvaranje glukoze koja ce se isporuciti u krv i dati na raspologanje drugim organima i tkivima. I sad vidimo ovdje, glukoza je negativan alostericki aktivator aktivnosti jetrene fosforilaze b. (vraticemo se na glikogen fosforilazu na kraju izlaganja) Alosteričko vezivanje glukoze na jetrenu fosforilazu a pomjera ravnotežu „a“ oblika sa njegovog aktivnijeg R na T konformacijsko stanje, što dovodi do deaktivacije enzima. Glikogen fosforilaza prisutna u jetri za razliku od misicne fosforilaze nije osjetljiva na regulaciju AMP jer u jetri ne dolazi do dramatičnih promjena energetskog naboja koje se opažaju kod mišića. Ako pogledamo jetreni i misicni oblik glikogen fosforilaze, oni imaju 90% identicne aminokiselinske sekvence. Znaci, onih 10% su mjesta gdje dolazi do varijacije u aminokiselinskoj sekvenci, ali to u sustini doprinosi potpuno razlicitim regulacijama ova dva enzima u ova razlicita tkiva, odnosno organa. Sad ako imamo jetrenu fosforilazu a, koja se moze naci u T i R stanju, i rekli smo da je glukoza onaj alostericki regulator koji ce pomjeriti ravnotezu iz R stanja prema T stanju i time ce enzim biti kataliticki inaktivan. Sad idemo tumaciti fosforilaza kinazu. Prvo idemo vidjeti gradju ovog enzima a zatim kako se regulira aktivnost ovog enizma, i kako ga reguliraju hormoni. Fosforilaza kinaza je veliki protein sa podjediničnom kompozicijom (αβγδ)4 , znaci ima 16 podjedinica i (u misicima) molekulskom masom 1200 kDa. Katalitička aktivnost locirana je na γ podjedinici, dok druge podjedinice α, β i δ imaju regulatornu funkciju. Fosforilaza kinaza je pod dvostrukom kontrolom: ■ Fosforilacijom na β podjedinici fosforilaza kinaza se prevodi se iz oblika niske aktivnosti u katalitički visoko aktivan oblik. A u sustini ovu aktivaciju fosforilaza kinaze vrši protein kinaza A (PKA), koju aktivira cAMP kao drugi glasnik. Koji hormoni djeluju preko cAMP a da uticu na metabolizam glikogena? Glukagon i adrenalin! Oba djeluje preko kaskade adenilat ciklaze i cAMP.a! ■ Fosforilaza kinazu djelomično aktiviraju nivoi Ca2+ jona u citosolu viši od 1μM. δ podjedinica fosforilaza kinaze je kalmodulin, protein senzor za Ca 2+, koji stimulira više enzima kod eukariota. Jel se sjecate kalmodulina? Da ili ne? :D Sjecamo! Eh u transdukcijama signala kod povisenih nivoa kalcijumovih jona, kalcijumovi joni se

69

vezu sa kalmodulinom u kompleks kalcijum kalmodulin. Koliko mjesto za vezivanje kalcijuma ima na kalomodulinu? Ima 4! Da bi kompleks kalcijum-kalmodulin bio aktivan potrebno je da se na kalmodulin vezu tri kalcijumova jona, a onda taj kompleks moze da aktivira neke protein kinaze. Koje? Od kompleksa kalcijum-kalmodulin ovisne protein kinaze! Imate protein kinazu A u kaskadi adenilat ciklaze, imate protein kinazu C u kaskadi fosfatidilinozitol-4,5-bisfosfata. Njih ce aktivirati kompleks kalcijumkalmodulin. Kalmodulin je znaci, protein koji je senzor za kalcijumove jone u citosolu. Ako gledamo fosforilaza kinazu, δ podjedinica je kalmodulin i kalcijumovi joni mogu da reguliraju kataliticku aktivnost ovog enzima. Ovaj način aktivacije fosforilaza kinaze važan je u mišićima u kojima otpuštanje Ca2+ sa endoplazmatskog retikuluma pokreće kontrakciju mišića. Ako do tog dodje onda ce doci do aktiviranja ovog enzima vezivanjem kalcijumovih jona za delta podjedinicu ovog enzima. Fosforilaza kinaza ima maksimalnu aktivnost onda kada je fosforilirana β podjedinica i istovremeno vezan Ca2+ ion na δ podjedinicu enzima. Sada cemo to shematski pogledati. Ovdje je shematski prikazana fosforilaza kinaza. Ovdje je gama podjedinica-koja ima kataboliticka aktivnost, a ostale podjedinice imaju reglatornu aktivnost. Beta podjedinica podlijeze reverzibilnoj fosforilaciji pa to dovodi do aktivacije fosforilaza kinaze. Kako ce ici to? To ce vrsiti protein kinaza A i u sustini ova fosforilacija je pod kontrolom hormona. Drugo, delta podjedinica je kalmodulin, senzor za kalcijumove jone. Misicna kontrakcija, zatim neki hormoni i nervni impuls ce pokrenuti oslobadjanje kalcijumovih jona. Vezat ce se za delta podjedinicu i time postaje enzim djelimicno aktivan. Maksimalno je fosforilaza kinaza akitvna ako je fosforilirana beta podjedinica i ako su na delta podjedinici vezani kalcijumovi joni. I onda ce ovaj enzim fosforilirati na onim serinskim ostacima fosforilazu b i prevesti je u fosforilirani oblik „a“. Razgradnju glikogena pokreću glukagon i epinefrin (adrenalin). Epinefrin (adrenalin) stimulira razgradnju glikogena u mišićima i u manjem stepenu u jetri. Mišićna aktivnost dovodi do otpuštanja epinefrina (adrenalina) iz adrenalne medule. Glukagon, polipeptidni hormon koji izjučuju α-ćelije pankreasa kada je nivo glukoze u krvi nizak, stimulira razgradnju glikogena u jetri.

70

Slika iz Strayera! Pokazuje sljedece. Ako se radi o jetrenim celijama, ako se snizi nivo glukoze u krvi, onda se povecano izlucuje glukagon. Glukagon se veze za specificni glukagonski receptor na plazmi membrani jetrenih celija. Kompleks glukagon-receptor do aktivacije proteina G. Gs je stimulirajuci. Ta aktivacija ukljucuje zamjenu GDP sa GTP na alfa podjedinici G proteina, cime najstaje Gs protein. On difunduje do adenilat ciklaze, aktivira je i on katalizira sintezu cAMP iz ATP. Camp je drugi glasnik i on je alostericki aktivator drugog enzima-protein kinaze A. Protein kinaza A ima dvije kataliticke i dvije regulatorne podjedinice. Na svakoj od

71

regulatornih podjedinica nalaze se po dav alostericka mjesta za vezanje cAMP. Kada se vezu po dvije molekule cAMP za regulatorne podjedinice, onda ce one disocirati sa katalitickih i onda ce protein kinza A prijeci u kataliticki aktivnu. Kataliticki aktivna protein kinaza A ce izvrsiti fosforilaciju beta podjedinice fosforilaza kinaze, a ova ce onda katalizirati fosforilaciju fosforilaze b u fosforilazu a i onda ce ici razgradnja glikogena, ide glikogenoliza i oslobadja se glukoza-1-fosfat. Sad ako su u pitanju misicne celije na ovaj beta andrenergicki receptor ce djelovati adrenalin i on ima istu transdukciju signala kakvu ima glukagon u jetri. Kasnije cemo objasniti kako ce adrenalin djelovati preko alfa adrenergickih receptora u samoj jetri. Da vidimo sljedece. Ako glukagon i adrenalin aktiviraju glikegenolizu oni ce u sustini istovremeno inhibirati sintezu glikogena tako sto ce protein kinaza A fosforilirati glukagon sintazu A i time je inaktivirati jer je ona u aktivnom stanju nefosforilirana. I tu imamo primjer, hormonom pokretanih reverzibilnih fosforilacija u kojima se zavisno od situacija, jedan kataliticki put aktivira a drugi istovremeno inhibira. Sad ide druga shema, iz Marxa, jer u njemu imaju zbirne slike gdje se sve vidi. -.-

Kaze: Sve smo rekli, ali hajde sad da vidimo. Prvo ako se odvija misicna kontrakcija, trosit ce se ATP i povecat ce se nivoi AMP. Sad se desava sljedece. Sjecate se toga?! (naravno) ATP se cijepa na ADP i Pi (anorganski fosfat). Sada se aktivira adenilat kinaza koja moze regenerirati jednim dijelom ADP ali to opet povratno dovodi do stvaranja velikih kolicina AMP-a. AMP je alostericki aktivator glikogen fosforilaze b. Drugo, ako ide misicna kontrakcija, onda ce se povecano

72

izlucivati epinefrin. On ce prouzrokovati transdukcija signala i stvaranje cAMP, a on ce aktivirati protein kinazu A, a ona ce izvrsiti fosforilaciju beta podjedinicu fosforilaza kinaze, a ona ce onda izvrsiti fosforilaciju glikogen fosforilaze b u glikogen fosforilazu a! Sljedece sto moze je nervni impuls da stimulira. Kako? Dolazi do povecanog oslobadjanja kalcijumovih jona iz sarkoplazmatskog retikuluma. Poviseni nivoi kalcijumovih jona dovode do stavranja kompleksa kalcijum-kalmodulin, do vezivanja kalcijumovih jona na delta podjedinicu fosforilaza kinaze i njenog aktiviranja. Sad tumacimo sljedece: sta ce se desavati sa glikogen sintaze! Aktivnost glikogen sintaze regulira se kovalentnom modifikacijom. Kataliticki ktivni oblik enzima, glikogen sintaza a, fosforilacijom se prevodi u inaktivni oblik, glikogen sintazu b. Glikogen sintaza se fosforilira na više mjesta djelovanjem protein kinaze A i nekoliko drugih kinaza. Najveci stupanj fosforilacije je u N i C terminalnom podrucju enzima. Nefosofrilirani - a - oblik glikogen sintaze ima rezultirajući naboj -13, a potpuno fosforilirani enzim - 31. Fosforilirani b oblik glikogen sintaze postaje katalitički aktivan samo kod visokih nivoa glukoza 6-fosfata. Sad ide slika iz Strayera. Shematski prikazan enzim. Na krajevima vidimo -8 i -8, too je – 16 i +3, rezultirajuci naboj dakle -13! I najveci stupanj fosforilacije u N terminalnom i C terminalnom podrucju enzima. Sljedeca shema preuzeta iz Marksa. Prije nego prijedjemo na fosfatazu, imamo znaci, glukagon i epinefrin, transdukcija signala preko aktiviranja adenilat ciklaze, cAMP ce se vezati za regulatorne podjedinice protein kinaze A i ona ce postati kataliticki aktivna. Ona ce izvrsiti fosforilaciju fosforilaza kinaze b u fosforilaza kinazu a. Enzim ce postati kataliticki aktivan i fosforilirati glikogen fosforilazu b u glikogen fosforilazu a i onda ce ici razgradnja glikogena, ide glikogenoliza, stvara se glukoza-1-fosfat koja ce izomerizacijom prijeci u glukoza-6-fosfat, Glukoza6-fosfataza u jetri ce izvrsiti defosforilaciju i glukoza ce se otpustiti u kv. Ali ova protein kina A ce izvrsiti i fosforilaciju glikogen sintaze A (kataliticki aktivne) u fosforilirani kataliticki inaktivan oblik, glikogen sintazu b. I ovdje tako vidimo kako razgradnja glikogena inhibira sintezu glikogena. Eh sad se pitamo kako ce sad doci do sinteze glikogena a do inhibiranja razgradnje. Za to je potrebno da dodje do defosforilacije ovih enzima a za to je potrebna protein fosfataza 1. Kaze: Je l' vam postaje komplikovanije? (komesanje) Pa ja, rekla sam ja vama! :D Rekli smo da adrenalin moze dovesti do razgradnje glukoagona i u jetri ali da ovdje djeluje preko alfa

73

adrenergickih receptora a u misicaima djeluje preko beta adrenergickih receptora. Znaci, veze se adrenalin za alfa adrenergicki receptor na plazma membrani jetrenih celija. Kompleks adrenalin-receptor ce aktivirati G protein. G protein ce sad aktivirati sljedeci enzim: fosfolipazu C. Ona ce cijepati fosfatidil inozitol 4,5-bisfosfat na sljedeca dva lipida u plazma membrani. To su inozitol 1,4,5-trifosfat (IP3) i diacilglicerol (DAG) . Diacilglicerol, kao drugi glasnik, aktivira protein kinazu C (C zato sto za svoju kataliticku aktivnost treba kalcijumove jone, za razliku od protein kinaze A koja za aktivnost treba cAMP!) Diacilglicerol ce je aktivirati i pri nizim koncentracijama kalcijumovih jona. Drugi glasnik koji nastaje djelovanjem fosfolipaze C je IP3. On je taj koji ce se u membrani endoplazmatskog retikuluma vezati na posebne proteine, doci ce do otvaranja posebnih pora na membrani endoplazmatskog retikuluma i doci ce do izlaska kalcijumovih jona iz endoplazmatskog retikuluma u citosol. Znaci, IP3 se veze za te posebne translokaze u membrani e,r i to tri molekule IP3 treba da se vezu na jednu translokazu.. I kalcijumovi joni odlaze u citosol gdje onda raste njihova koncentracija. Tu dolazi onda do aktiviranja kompleksa kalcijum.kalmodulin, aktiviranja fosforilaza kinaze i do razgradnje glikogena. Sad vidimo da na vise nacina dolazi do fosforilacije glikogen sintaze A cime se ona inhibise. Prvo, moze je fosforilirati sama protein kinaza C! Drugo, od kalcijum kalmodulin zavisna protein kinaza Trece: moze je fosforilirati fosforilaza kinaza. Znaci, epinefrin (adrenalin) putem α-adrenergičkog receptora u plazma membrani jetrenih ćelija, aktivira kaskadu fosfatidil inozitola i dovodi do povećanog otpuštanja glukoze u krv. Znaci, G protein aktivira fosfolipazu C. Ona cijepa fosfatidil inozitol 4,5-bisfosfat na sljedeca dva lipida u plazma membrani. To su inozitol 1,4,5-trifosfat (IP3) i diacilglicerol (DAG) . Dag aktivira protein kinazu C. Ona moze fosforilirati glikogen sintazu. Drugo, IP3 ce dovesti do isticinja Ca jona u citosol, oni mogu da se vezu za kalmodulin kao senzor, stavra se komplek Ca-kalmodulin, i onda od kompleksa Ca-kalmodulin ovisna protein kinaza moze fosforilirati glikogen sintazu! I treci nacin: Ca joni se vezu za delta podjedinicu i bla bla, fosforilacija glikogen sintaza. I na taj nacin, u stanjima stresa omogucava se mobilizacija glukoze i da se nadje na raspologanju. Znaci, Diacilglicerolom (DAG) posredovana aktivacija protein kinaze C, Ca2+ jonima posredovana aktivacija fosforilaza kinaze i od kalmodulina zavisne protein kinaze, važni su za inaktivaciju glikogen sintaze reverzibilnom fosforilacijom. Sad tumacimo sljedece: Rekli smo da ce protein fosfataza 1 defosforilirati sve ove enzime! Ali, ako su uslovi takvi da mora ici razgradnja glikogena onda i ova protein fosfatza 1 mora biti

74

blokirana! I to je pod hormonskom kontrolom. Prvo cemo protumaciti gradju pa onda aktivnost. Protein fosfataza 1 ponistava regulatorne efekte kinaza u metabolizmu glikogena. Protein fosfataza 1 (PP1) defosforilacijom inaktivira fosforilaza kinazu i glikogen fosforilazu i tako smanjuje stupanj razgradnje glikogena. Protein fosfataza 1 (PP1) takodje uklanja fosfatnu grupu sa glikogen sintaze b i prevodi ovaj enzim u katalitički aktivan oblik a, cime dovodi do sinteze glikogena. Kompletan kompleks PP1 čine tri komponente: sama PP1, 37 kDa katalitička podjedinica, G (RGI) podjedinica (123 kDa) koja ima visok afinitet prema glikogenu i inhibitor 1 (mala regulatorna podjedinica) čiji fosforilirani oblik inhibira PP1. Na slici, C predstavlja kataliticku aktivnost PP1 , G je podjedinica koja treba tu C podjedinicu da dopremi do glikogena, tj. Do supstrata enzima na kojeg ce djelovati, i treci je mali protein koji se naziva inhibitorom i koji je ukljucen u regulaciju. PP1 je aktivna samo kada je asocirana na molekulu glikogena. Sama PP1 nizak afinitet prema granulama glikogena. G podjedinica doprema PP1 u granule glikogena , u blizinu supstrata na koje može djelovati (to su fosforilirani enzimi ragradnje i sinteze glikogena). Katalitičko djelovanje PP1 blokira fosforilirani oblik inhibitora 1. Stupanj fosforilacije inhibitora 1 je pod hormonskom kontrolom. Nefosforilirani oblik inhibitora 1ne blokira katalitičko djelovanje PP1. Objasnjava sad ovu sliku: Ova C podjedinica sama ima nizak afinitet prema glikogenu. Nju ce do glikogena dopremiti G podjedinica.. Treca podjedinica je ovaj mali inhibitorni protein. Sta se sad desava?! Kada je potrebno da PP1 bude blokirana, oni hormoi, oni enzimi koji vrse fosforilaciju enzima za razgradnju glikogena i time doprinose razgradnji, moraju sad izvrsiti fosforilaciju na tacno odredjenim mjestima PP1 da bi ona bila blokirana. Evo ako je u pitanju glukagon ili adernalin. Oni ce uRrditi sljedece: kad se aktivira protein kinaza A, ona ce izvrsiti fosforilaciju ove podjedinice G na PP1. A fosforilirani oblik G vise ne moze vezati kataliticku podjedinicu C. Prema tome blokirana je doprema C podjedinice do glukogena. A s druge strane, protein kinaza A ce fosforilirai mali inhibitorni protein, koji ce sad kao takav vezati kataliticku podjedinicu i stvoriti kompleks u kome je PP1 inaktivna! I time je hormonima pokrenuta fosforilacija podjedinica PP1, dovela do inhibicije PP1. I Sad dole ovo samo ponovi. :D

75

Dok uslovi zahtijevaju razgradnju glikogena u jetri,treba biti blokirana kataliticka aktivnost protein fosfataze 1.To je onaj enzim koji ove fosforilirane enzime koji sudjeluju u katabolizmu i u biosintezi glikogena prevodi u nefosforilirani oblik.I glukagon ce uraditi sta istovremeno ? On ce preko Adenilat ciklaze fosforilirati dvije komponente protein fosfataze 1 (protein fosfataza ima 3 podjedinice : kataliticku jedinicu 37kD,R podjedinicu koja doprema kataliticku u granulu glikogena do samog polimera i u sustini time kataliticku podjedinicu doprema do onih enzima koji su supstrati za njeno djelovanje i treca komponenta je inhibitor-mali protein (regulatorni protein inhibitor).Šta ce uraditi se pod kontrolom glukagona ? Protein kinaza A ce fosforilirati dvije komponente protein fosfataze 1. Fosforilirat ce R podjedinicu,onda foosforilirana R podjedinica ne moze da veze kataliticku da je dopremi u granulu glikogena gdje se nalaze enzimi koji su u supstrati za njeno djelovanje i drugo fosforilirat ce inhibitor 1 a time blokira kataliticku aktivnost protein fosfataz 1. Sad se pitamo koliko ce ova stimulacija trajati (transdukcija signala)? Zavisno od nivoa glukoze u krvi,glukagon veze na receptor i aktivira adenilat ciklazu.Do kada traje ta stimulacija ? Vi znate da kada se aktivira da aktivacija vezivanjem hormona na receptor aktivira G protein.G protein ima tri podjedinice : alfa,beta i gama.Na alfa je vezana GDP.Aktivacijom ce biti zamijenjen za GTP.Disocirat ce i onda ta gvanozin trifosfatni oblik alfa podjedinice aktivira adenilat ciklazu.I ona katalizira sintezu drugog glasnika.Al koliko ce to trajati? Gledajte nesto (mlatara rukama)  U alfa podjedinici G proteina locirana je GTp-azna aktivnost .Znate sta je Gtp-azna aktivnost ? To je ona enzimska aktivnost koja ce otcijepiti terminalni fosfat sa GTP i alfa podjedinicu prevesti u GDP oblik.Ona onda asocira sa beta i gama podjedinicom i u sustini G protein se vraca u ne stimulirani oblik.Sad u sutini ta GTp-azna aktivnost alfa podjedinice aktivira se u kratkim vremenskim intervalima.To je jedan mehanizam koji stimulira ono vrijeme dok se ne aktivira GTp-azna aktivnost i vezani GTP ne prevede u GDP-ni oblik.Drugo u sustini cAMP kao drugi glasnik koji se stvara imat cemo fosfodiesterazu koja ce cijepati taj cAMP i prevoditi ga u onaj AMP i time ce se regulisati nivoi drugog glasnika.Tako hormon ce se izlucivati i vezati na molekule ovoga receptora i izregulisano je vrijeme koliko ce ta stimulacija trajati. Još jedan hormon utice na metabolizam glikogena a to je inzulin.Za razliku od epinefrina i glukagona (koji kao hormoni stimuliraju katabolicke puteve ne samo u metabolizmu karbohidrata) ovaj inzulin uvijek stimulira biosintetska puteve,kao i sintezu glikogena.Inzulin stimulira sintezu glikogena tako sto ce aktivirati protein fosfatazu

76

1.Kod visokih nivoa glukoze u krvi inzulin pokrece put aktivacije Protein fosfataze 1 i time ce istovremeno iskljuciti sintezu glikogena .

Sada cemo vidjeti gdje ce on tacno djelovati da bi stimulirao protein fosfatazu 1. Inzulin ▼ Aktiviran receptorski protein ▼ Aktivirane na inzulin osjetljive protein kinaze ▼ Fosforilacija G (RGI) na mjestu koje se razlikuje od onoga koje fosforilira protein kinaza A (pod kontrolom glukaogona) ▼ Vezivanje PP1 sa RGI i granulom glikogena ▼ Defosforilacija glikogen sintaze, fosforilaza kinaze i glikogen fosforilaze ■ Defosforilirana glikogen sintaza – katalitički aktivna (enzim prelazi u kataliticki aktivan oblik) ■ Defosforilirana fosforilaza kinaza – katalitički inaktivna Sustina je slijedeca : da ce inzulin aktivirati PP1 tako sto ce pokrenuti fosforiliciju R podjedinice na mjestu koje se razlikuje od mjesta fosforilacije koje je pod kontrolom glukagona.Tako fosforilirana R ili G podjedinica ce dopremiti kataliticku podjedinicu u granulu glikogena i izvrsit ce se defosforiliacija enzima razgradnje i same glikogen sintaze. Ovo su bili nacini na koji hormoni kontrolisu metabolizam glikogena.Ali u sustini na neki nacin i nivo glukoze u krvi svojim sopstvenim mehanizmom moze da utice na regulaciju nivoa glukoze u krvi.Sad cemo da vidimo na koji nacin.Ovaj sad mehanizam koji cemo tumaciti je mehinazam na koji ce sam nivo glukoze u krvi regulirati u sustini stimulirati sintezu glikogena u jetri.Ako nakon obroka bogatog karbohidratima povećat ce se nivo glukoze u krvi i u sustini povecat ce se sinteza glikogena u jetri.Mada je inzulin primaran signal za sintezu glikogena u jetri funkcioniraju i oni ne hormonski mehanizmi u jetrenim ćelijama .U sustini ( hahahahhahahahah) enzim glikogen fosforilaza A jetrena je senzor koji detektuje nivoe glukoe u krvi.Rekli smo pod kojom je alosterickom kontrolom glikogen fosforilaza A.Glikogen fosforilaza A moze se naci u dva konformacijska oblika.Jedan je T koji je kataliticki inaktivan i drugi je R koji je kataliticki aktivan.Sad polozaj ravnoteze izmedju T i R kontrolira sama glukoza.Za

77

glikogen fosforilazu A postojie ona alostericka mjesta na koja se vezuje glukoza kao alostericki efektor. Ovde je prikazan fosforilirani oblik glikogen fosforilaze A u jetri.Glikogen fosforilaza A je dimer i na svakoj podjedinici nalazi se alostericko mjesto na koje se moze vezati glukoza.Kada se glukoza veze na ova alostericka mjesta za glukozu doci ce do promjene konformacije glikogen fosforilaze A iz ove R u ovaj T konformacijski oblik.Tom promjenom konformacije onda oni fosforilirani serinski ostaci ce biti izlozeni za djelovanje fosfoprotein fosfataze (da bi smo za te fosfataze imale na umu da su supstrati fosforilirani proteini.(ili protein fosfataza 1 se jos zove).Protein fosfataza 1 ce sada defosforilirati ove serinske ostatke i onda ce enzim preci u nefosforilirani oblik .Prema tome nece biti katabolizma glikogena u jetri dok su poviseni nivoi glukoze u krvi.

Sad imamo isto ovo tumacenje na ovoj slici iz Strayera.Pnovo pokazuje R fosforilacijksi oblik glikogen fosforilaze A u jetri.Na nju je asocirana PP1.Ali PP1 je tada kataliticki

78

neaktivnaa.Kada se glukoza veze za ona alostericka mjesta na podjedinicama glikogen fosforilaze A onda ce enzim preci iz R u T konformacijsko stanje i sada PP1 koja je asocirana na T konformacijsko oblik enzima postaje kataliticki aktivna.I izvrsit ce defosforilaciju glikogen fosforilaze A koja ce preci u nefosforilirani oblik glikogen fosforilaze B.Sad kad izvrsi tu defosforilaciju PP1 ce disocirati od glikogen fosforilaze A i onda ce izvrsiti defosforilaciju glikogen sintaze B i prevesti ovaj enzim u kataliticki aktivni oblik i time ce aktivirati sintezu glikogena.Prema tome znaci ovim mehanizmom zavisno od nivoa glukoze u krvi,neovisno od samog inzulina,mogu visoki nivoi glukoze u krvi da reguliraju sintezu glikogena u jetri.Zasto?Zato sto glikogen fosforilaza jetrena ima funkciju senzora za nivo glukoze u krvi.Ako su visoki nivoi glukoze u krvi GLUT 2 transporteri unosit ce glukozu u celije i u sustini u celijama ce biti visoki nivoi glukoze. OVIM SMO REGULACIJU GLIKOGENA ZAKLJUCILI !!

14.OKSIDATIVNA DEKARBOKSILACIJA PIRUVATA U AcetilCoA Piruvat se na kompleksu piruvat dehidrogenaze oksidativno dekarboksilira u acetil-CoA. Reakcija je ireverzibilna, slozena, zahtjeva sudjelovanje 5 koenzima od kojih su 4 vezani za vitamine, 3 su koenzima prostetske skupine , 2 su koenzim kosupstrati u ovoj reakciji. Kompleks piruvat dehidrogenaze cine 3 enzima: - enzim E1 koji se I sam zove piruvat dehidrogenaza, kao prostetsku skupinu sadrzi tiamin pirofosfat, on ce izvrsiti reakciju dekarboksilacije I oksidacije piruvata, -enzim E2 se naziva dihidrolipoil transacetilaza, on ce acetilnu skupinu koja je tioesterski vezana na lipoamidnu skupinu prenijeti na SK skupinu CoA I nastat ce acetil CoA, - enzim E3 kao prostetsku skupinu sadrzi FAD, naziva se dihidrolipoil dehidrogenaza, on treba reduciranu lipoamidnu skupinu enzima E2 prevesti u oksidirani oblik, tada FAD prelazi u reducirani oblik FADH2, ovdje je neobicno to sto ce se reducirajuci ekvivalenti sa FADH2 enzima E3 prenijeti na NAD+ koji je konacni akceptor reducirajucih ekvivalenata. NAD+ je oksidans u ovoj reakciji oksidativne dekarboksilacije. Prenos reducirajucih ekvivalenata uvijek ide u obrnutom smijeru.

79

Enzim E1, u reakciju ulazi piruvat I ovaj enzim zbog prisustva tiamin pirofosfata kao konzima prostetse skupine izvrsit ce reakcije dekarboksilacije, cijepat ce one veze koje su alfaketo skupine. Na TPP ostane vezana aktivirana aldehidna skupina. Sada ce isti enzim piruvat dehidrogenaa izvrsiti oksidaciju ove aktivirane aldehidne skupine, reducirajuce ekvivalente ce prihvatiti lipoamidna skupina enzima E2 koja ovdje prelazi u reducirani oblik. Oksidacija ide da bi se uklonila reducirajuca ekvivalenta da bi se COH skupina oksidirala u keto skupinu. Na kraju imamo tiesterski vezanu na reducirani oblik lipoamidne skupine enzima E2. Zatim ce enzim E2 da izvrsi prenos acetilne skupine sa lipoamidne skupine na coA I oslobodit ce se acetil CoA. Enzim E3 treba sada da prevede ovu skupinu u oksidirani oblik da bi se enzimski kompleks vratio u svoj prvobitni funkcionalni oblik. Reakcija je dosta slozena I zahtijeva neke vitamine. TPP-u je potreban vitamin B1, FAD B2, NAD nikotinska kiselina, CoA pantotenska kiselna. Stehiometrijski reakcija izgleda jednostavno, izdvaja se CO2 I nastaje CoA. Oksidativna dekarboksilacija je ireverzibilna reakcija izmedju glikolize I citratnog ciklusa.l CoA se ne moze prevoditi nazad u piruvat. Ovo je strogo kontroliran process, kontrolira se na dva nacina: 1. Alostericka regulacija 2. Regulacija reverzibilnom fosforilacijom Sam kompleks osim ovih do sada nabrojanih enzima sadrzi js dva koji imaju regulatornu ulogu: protein kinaza I fosfoprotein fosfataza. Svaki od ovih enzima (3 + 2) prisutni su u vise kopija. Broj kopija je razlicit, kao I velicina kompleksa, I razlikuju se kod razlicitih organizama. Alostericka regulacija zavisi od onih produkata, odnosno signalnih molekula unutar same celije. Dva su alostericka efektora kompleksa piruvat dehidrogenaze: 1. Acetil coA, visoki nivoi acetil coA alostericki inhibiraju enzim E2, 2. NADH, visoki nivoi je alostericki inhibirati enzim E3. Regulacija reverzibilnom fosforilacijom Fosforilaciju ce vrsiti protein kinaza, vrsi fosforilaciju specigicnog serinskog ostatka enzima E1. Ako je enzim fosforiliran onda je kataliticki inaktivan. Defosforilaciju ce uraditi protein fosfataza. Visoki nivoi NADH,ATP I acetilCoA ce pokrenuti protein kinazu, odnosno fosforilaciju. Ako se smanjuje nivo ATPa, smanjuje se aktivnost protein kinaze a povecava protein fosfataze. Visoki nivoi piruvata I ADP su alostericni aktivatori proteinfosfataze. U vecini slucajeva protein fosfataza je I pod hormonskom regulacijom. U jetri ce se adrenalin vezati za α1, transdukcija ide kaskadom fosfatidil inozitol 4,5 bisfosfat, pa ce onda IPA djelovati tako d ace se povisiti koncentracija Ca jona, povisena koncentracija ovih jona isto aktivira fosfo protein fosfatazu. Sudbina acetilCoA – ide u citratni ciklus, u oksidaciji stvaranje reduciranih koenzima koji ce se dalje oksidirati u mitohondrijskom lancu za transport elektrona. Cilj ovih puteva je da se dobije energija u obliku ATPa. AcetilCoA moze da ide I u put stvaranja masnih kiselina, onda se iz viska masnih kiselina sintetiziraju triacil-gliceroli. Inzulin stimulira glikolizu u jetri, dok je glukagon inhibira. Inzulin vrsi aktiviranje

80

protein fosfataze koja vrsi defosforilaciju piruvat dehidrogenaze, I prevodi je u kataliticki aktivni oblik. Glukoza nastala aktiviranjem glikolize prevodi se u piruvat koji oksidativnom dekarboksilacijom prelazi u acetil CoA, koji se dalje koristi pri stvaranju gradivnih blokova za stvaranje masnih kiselina, a kasnije I masti. Sav visak neiskoristene glukoze prevodi se u masti. Postoji genski defekt aktivnosti protein fosfataze, tad se kompleks piruvat dehidrogenaze odrzava u fosforiliranom , kataliticki neaktivnom stanju. U ovim uslovima se piruvat prevodi u laktat da bi se odvijala glikoliza, tad nastaje laktatna acidoza, snizen je pH krvi. Ovo stanje posebno steti nervnom tkivu. Usljed smanjenog unosa tiamina, vitamina B1 dolazi do bolesti koja se naziva beri-beri. To je ozbiljno oboljenje sa neuroloskim I kardioloskim simptomima. Javlja se u zemljama DI, kod ljudi koji konzumiraju poliranu rizu, tiamin se nalazi samo u ljuskicama rize. Mozak svoje energetske potrebe podmiruje iskljucivo iz glukoze u krvi. Ta ce glukoza ici u proces glikolize. Neka druga tkiva mogu koristiti katabolizam masti za dobijanje energije, nije im potreban vitamin B1, dok to nije slucaj sa mozgom. Tri su enzima zavisna od tiamina: piruvat dehidrogenaza, αketoglutarat dehidrogenaza (citratni ciklus) I transketolaza (ciklus pentoza fosfata). Usljed nedostatka tiamina imamo povisen nivo piruvatai αketo glutarata u krvi. Imamo povisenu reakciju okidativne dekarboksilacije αketo glutarata u sukcinil CoA. Sve ovo dovodi do smanjenog metabolizma usljed ne stvaranja ATPa, tako nastaju neuroloski poremecaji uzrokovani nedostatkom tiamina. Slicne simptome beri-beri moze izazvati trovanje arsenitom ili zivom. Arsenit AsO3 3-. Oni se mogu vezati za SH skupinu reduciranog dihidrolipoila(lipo amidna), pa kompleks piruvat dehidrogenaze ne moze da funkcionise, jer blokiraju enzim E2. Tioilni reagensi (imaju SH skupinu) uzimaju se kao antidote, npr. 2,3 dimerkaptopropanol (ima dvije SH skupine koje se sad takmice sa lipoamidnom I skidaju Hg ili arsenit sa kompleksa), produkti detoksikacije izlucit ce se putem urina. Oksidativna dekarboksilacija piruvata

81

Kljucna reakcija kojom se piruvat prevodi u acetil CoA. Piruvat dehidrogenaza katalizira ovu reakciju: Reakcija je ireverzibilna, slozena, zahtjeva sudjelovanje pet koenzima, od kojih su cetiri vezani za vitamine, tri koenzima su prostetske skupine, a dva su koenzima kosupstrati u ovoj reakciji. Ovo je komplex piruvat dehidrogenaza, cine ga tri enzima:  enzim E1, koji se i sam naziva piruvat dehidrogenaza, kao pristetsku skupinu sadrzi tiamin pirofosfat i on ce izvrsiti reakciju dekarboksilacija i oksidacije piruvata  enzim E2 dihidrogenlipoil transacetilaza, koji ce usustini (objasnit cemo kasnije) ovu acetilnu skupinu koja je tioesterski vezana na ovu lipoamidnu skupinu prenijeti na SH skupinu koenzima A i nastat ce acetil CoA  enzim E3 koji kao prostetsku skupinu sadrzi flavin adenin dinukleotid (FAD) i naziva se dihodrogenlipoil dehidrogenaza, on treba reduciranu lipoamidnu skupinu enzima E2 u oksidirano oblik. Kao prostetsku skupinu ima FAD koji kada izvrsi tu oksidaciju prelazi u reducirani oblik FADH2, a ono sto je neuobicajno da ce se ti reducirajuci ekvivalenti sa FADH2 enzima E3 prenijeti na NAD+ koji je konacni akceptor reducirajucih ekvivalenata. On je oksidans u reakciji oksidativne dekarboksilacije. Ono sto je obicno je da prijenos reducirajucih ekvivalenata uvijek ide u obrnutom smjeru, ali ovdje imamo sa FADH2 na NAD+. Enzim E1 katalizira: u reakciju ulazi piruvat i ovaj enzim zbog prisustva tiamin pirofosfata kao koenzima prostetske skupine izvrsit ce sljedece: reakciju dekarboksilacije, to smo vidjeli u ranijem primjeru, da ce cijepati one veze koje su u blizini alfa keto

82

skupine i na tiamin pirofosfat ostaje vezena aktivirana aldehidna skupina. Sada ce isti enzim, piruvat dehidrogenaza, izvrisiti oksidaciju ove aktivirane aldehidne skupine: reducirajuce ekvivalente ce prihvatiti lipoamidna skupina enzima E2, koja ovdje prelazi u reducirani oblik. Zasto ce usustini da ide oksidacija? Trebala bi se ukloniti ova dva reducirajuca ekvivalenta da bi se ova vodikova OH skupina oksidirala u keto skupinu. I na kraju cemo imati tioesterski vezanu acetilnu skupinu na ovaj reducirani oblik lipoamidne skupine enzima E2. Sada ce Enzim E2 da izvrsi pijenos acetilne skupine sa lipoamidne skupina na koenzim A i oslobodit ce se acetil CoA. Enzim se naziva dihidrolipoil transacetilaza. Sada je potrebno da enzim dihrolipoil dehidrogenaza prevede lipoamidnu skupinu u oksidirani oblik da bi se enzimski oblik vratio u svoj prvobitni funkcionalni oblik. Sama reakcija se odvija dosta slozeno. Potrebi su vitamini: za tiamin pirofosfat je potreban TIAMIN tj vitamin B1, za FAD potreban je riboflavin s. vitamin B2, na NAD je potreban nicacin to je nikotinska kiselina, i u sastav koenzima A ulazi pantotenska kiselina. Ako se vratimo na samu reakciju, ona stehiometrijski izgleda jednostavno, izdvaja se CO2 i nastaje acetil CoA, ali se ona odvija na veoma slozen nacin. Rekacija oksidativne dekarboksilacije piruvata je veza izmedju glikolize i citratnog ciklusa. Ireverzibilna je jer kad se piruvat prevede u acetil CoA vise nema povratka, zivotinjski organizmi ne mogu prevoditi acetil CoA nazad u piruvat. Ovaj enzimski komplex je strogo reguliran i postoje dva nacina regulacije: - prvi nacin je alostericka regulacije ovog kompleksa. - A drugi je regulacija reverzibilnom fosforilacijom. Sam komplex piruvat dehodrogenaza pored ovih enzima koji sudjeluju u reakciji svaki od njim ima vise kopija, a broj kopija varira od jedne do druge zive vrste , sadrzi jos dva enzima koji imaju regulatornu ulogu. To je jedna protein kinaza i drugi je fosfoprotein fosfataza. Alostericka aktivacija komplexa pirivat dehidrogenaze: Alostericka regulacija zavisi od nivoa onih produkata , iona i molekula unutar same celije. Ovdje imamo piruvat koji ide u reakciju oksidativne dekarboksilacije i nastaje acetil CoA. Dva su alostericka efektora ovog kompleksa:  prvo je acetil CoA. Visoki nivoi acetil CoA alostericki inhibiraju E2 enzim komlepksa piruvat dehidrogenaze.  Drugi alostericki efektor je reducirani oblik NADH. Visoki nivoi NADH ce alostericki inhibirati E3 enzim kompleksa piruvat dehidrogenaze. Kovalentna modifikacija je reverzibilna fosrofilacija. Fosforilaciju ce vrsiti enzim protein kinaza, koja je sastavni dio ovog kompleksa, tako sto fosforilila specificni serinski ostatak E1 enzima. Ako je enzim fosforilisan on je kataliticki inaktivan, defosforilaciju ce uraditi jedna fosfoprotein fosfataza. I kinaza i fosfataza koji reguliraju ovaj proces, su visoko regulisani proteini. Ako su visoki nivoi ATP-a,visoki nivoi NADH i visoki nivoi acetil CoA enzim ce biti kataliticki inaktivan. Ti visoki nivoi aktiviraju protein kinazu i pokrecu fosforilaciju ovog kompleksa.

83

Ako nivoi ATP i njegova koncent opadaju, smanjuju se nivoi protein kinaze, a povecava se nivo protein fosfataze. Smanjenjem nivoa ATP i povecanjem ADP dolazi do smanjenja energetskog nivoa celije, cime dolazi do prestanka stimulacije protein kinaze a akitivira se fosfoprotein fosfataze. Visoki novoi piruvata i ADP su alostericki aktivatori protein fosfataze. U nekim slucajevima protein fosfataza je pod hormonskom kontrolom. Na koje receptore u jetrinim celijama se moze vezati adrenalin? Na alfa jedan adrenergickog u jetri. Onda ta transdukcija ide kojom kaskadom? Fosfatidil inozitol 4,5 disfosfat pa ce onda inozitol 1,4 disfosfat djelovati tako da ce se povisit koncentracija Ca jona u citosolu, povecava se i koncentracija Ca jona u mitohondrijama onda povisena koncentracija jona moze takodjer aktivirat fosfoprotein fosfatazu. I prelazit ce komplex piruvat dehidrogenaze u kataliticki aktivan oblik. Acetil CoA ide u citratni ciklus, ide u oksidaciju u stvaranje reduciranih koenzima, koji ce se oksidirat u mitohondrijskom lancu za transport elektrona. Cilj ovih metabolickih procesa je dobijanje energije. Drugo u sto ide acetil CoA jeste u sintezu masnih kiselina, a iz viska masnih kiselina se sitetiziraju triacilgliceroli. Inzulin stimulira glikolizu. Glukagon ce inhibirati, a inzulin djeluje tako da stimulira glikolizu, stimulira aktivnost one fosfoprotein fosfataze 1. On uvijek stimulira protein fosfataze, i stimulira defosforilaciju onih enzima koji su pod njegovom kontrolom. U jetri ce uvijek stimulirati protein fosfatazu, a time i prevodjenje komplexa piruvat dehidrogenaze u nefosforiliranu i kataliticki aktivni oblik. Time je omoguceno da glukoza ide u proces glikolize, glikolizom nastaje piruvat i taj piruvat ide u reakciju oksidativne dekarboksilacije i davat ce acetil CoA. Koji je gradivni blok za sintezu masnih kiselina. Inzulin stimulira sintezu masnih kiselina i triacilglicerola. Visak glukoze biva preveden u masne kiseline. Genski defekt na protein fosfatazi, kada postoji deficit aktivnosti ovog enzima. U takvim slucajevima taj komplex piruvat dehidrogenaze odrzava se u fosforiliranom i kataliticki inaktivnom obliku, a u takvim uslovima se pituvat prevodi u laktat, da bi se odvijala glikoliza. U tim slucajima dolazi do laktatne acidoze, snizen je pH krvi, i ta acidoza jako remeti funkciju drugih organa i tkiva. Posebno skodi nervnom sistemu. Deficit dijetarnog tiamina(B1) – Beri beri. Ozbiljno neurolosko i kardiolosko oboljenje. Pogadja populacije dalekog istoka, koje se hrane rizom, ako je riza polirana. Jer se samo u ljuskicama rize javlja tiamin. Komplex piruvat dehidrogenaze ne funkcionira jer nema koenzima za enzim E1. Prvenstveno je pogodjen nervni sistem, jer mozak usustini iskljucivo svoje energetske potrebe podmiruje tako sto uzima glukozu iz krvi, sto ce ta glukoza ici u proces glikolize, piruvat ce ici u proces oksidative dekarboksilacije, prevest ce se u acetil CoA, koji ide u citratni ciklus, onda se odvija oksidacija reduciranih koenzima u mitohondrijskom lancu za transport elektrona. Neki drugi organi i tkiva kao gorivnu supstancu mogu koristiti masne kiseline pa katabolizmom masnih kiselina si obezbjediti potrebnu energiju. Katabolizam masnih kiselina ne ovisi o tiaminu. (znati za test!) Pored komplexa piruvat dehidrogenaze za energetski metabolizam vazan je i komplex alfa keto glutarat dehidrogenaze(analogan piruvat dehidrogenazi i nalazi se u citratnom ciklusu). Bitan je i enzim transketolaza, ima kao prostetsku skupinu tiaminpirofosfat, vrsi

84

koverziju fosforiliranih pentoza u fosforilirane hexoze, i obratno, onim ne oksidativnim reakcijama ciklusa pentoza fosfata. Ako nema adekvatnog unosa tiamina, u krvnoj plazmi ce biti povecani nivoi piruvata, on se ne moze adekvatno prevoditi u acetil CoA. A u citratnom ciklusu imamo reakciju oksidativne dekarboksilacije alfa keto glutarata u sukcinil-CoA, imat cemo i povisene nivoe alfa keto glutalne kiseline. I ako je pogodjena i oksidativna dekarboksilacija citratnog ciklusa, tu postoji kod deficita vitamina B1 potpuni pad produkcije energetskog metabolizma i proizvodnje ATP-a, i onda se to manifestuje u neuroloskim poremecajima. Slicne simptome „Beri Beri“, moze izazvati trovanje zivom ili arsenitom(AsO3 3-). U slucaju trovanja zivom li arsenitom, ziva ili arsenit ce graditi veze sa SH skupinama reduciranog oblika lipoamidne skupine(dihidrolipoilna skupina). I time blokiraju E2 enzim komplexa piruvat dehidrogenaze. Onda taj komplex ne funkcionira i razvijaju se neuroloski simptomi. Osmislili su antidot(protivotrov) za ovaj tip trovanja da se uzimaju tiolni reagensi(imaju SH skupinu). Jedan od njih je 2,3 dimerkaptopropanol(daje se u velikim kolicinama), propanol sa dvije SH skupine, koje se takmice sa dihidrolipoilnim skupinama i skinut ce zivu ili arsenit. Ti se produkti izluce iz organizma putem urina.

85

Karboksilacija piruvata u oksalacetat Ako smo dosli glikolizom do piruvata, oksidativnom

dekarboksilacijom nastaje acetil CoA, koji u potpunoj oksidaciji ide u citratni ciklus.Da bi funkcionirao citrati ciklus na raspolaganju mora biti dovoljno oksalacetata. Reakciju karboksilacije piruvata u oksalacetat katalizira enzim koji se naziva piruvat karboksilaza. Ovu reakciju smu susretali u glukoneogenezi, to je glavna anaklerotsku reakcija za odrzavanje intermedijera citratnog ciklusa, zapravo za odrzavanje nivoa oksalacetata. Prostetska skupina piruvat karboksilaze je biotin, i biotin je koenzim i

86

specijalizirani nosac C1 grupe u njenom najoksidiranijem obliku karboxi grupe(COO-), to je grupa sa samo jednim ugljikovim atomom. Biotin je vitamin H. On je kovaletnom amidnom vezom vezan epsilon amidnu grupu lizinskog ostatka i gradi biotinil enzim. Biotin je strukturno ciklicki derivat uree koji sadrzi tiofanski prsten. Imamo karboxilnu skupinu koja je amidno vezana za epsilon amino skupinu lizinskog ostatka u aktivnom mjestu enzima. Reakcija zahtjeva utrosak ATP-a, i za karboksilaciju piruvata potreban je bikarbonatni jon. Nastaje iz CO2 I H2O i daje karbonatnu kiselinu koja odmah disocira. Nitrogen iz biotina ce nukleofilno napasti ovaj karbonilni ugljik u bikarbonatnom jonu. A ovaj atom oksigena bikarbonata ce nukleofilni napasti gama fosfat(zapravo atom fosfora). I u prvoj fazi reakcije, ono sto nije prikazano, stvarat ce se mjesoviti anhidrid bikarbonata i anorganskog fosfata. ( U Karlsonu!) On ima anhidridnu vezu. A nakon toga ce doci do karboksilacije biotina, i nastat ce karboxi biotinil enzim. (Ovo cemo imati kod biosinteze masnih kiselina.) U drugom stupnju reakcije ce se ova karboksilna skupina prenijeti sa karboxi biotinil enzima na piruvat i izvrsit ce se karboksilacija piruvata uz nastajanje oksalacetata. *Piruvat je u obliku enolatnog aniona. Sam komplex piruvat karboksilaze je tetramer i sadrzi 4 identicne jedinice i svaka sadrzi amidno vezan biotin. Enzim ima dva zasebna aktivna mjesta. Reakcija se odvija u dva stupnja. Biotinilna skupina djeluje kao flexibilna ruka koja se premjesta kada nastane karboxi biotinil na jednom aktivnom mjestu onda ce se kovaletno veza prebaciti u drugo aktivno mjesto gdje ce se izvrsiti karboxilacija piruvata i nastati oksalacetat. Citratni ciklus (ciklus trikarbonskih kiselina)

87

To je jedan kruzni metabolicki put. I u samom citratnom ciklusu ce se objediniti putevi razgradnje ugljikohidrata, AK i masti. A mi sada gledamo kako ce se prikljuciti i zavrsiti katabolizam ugljenih hidrata. Odvija se u matrixu mitohondrija. U citratni ciklus ulazi acetil CoA i otpocinje reakcijom kondenzacije acetil CoA i oksalacetata u reakciji koju katalizira citart sintaza. Sad ce nastati citrat pa ce iz citrata preko cis akonitata nastaje izocitart pa ce ici reakcija dekarboksilacije i oksidacijepa ce nastati alfa keto glutarat, pa ce reakcijom oskidativne dekarboksilacije nastati sukcinil CoA, iz sukcinil CoA nastat ce djelovanjem sukcinil CoA sintetaze sukcinat. Onda ide reakcija dehidrogenacije iz sukcinata nastat ce fumarat,

88

Citratni ciklus-cilus trikarbonskih kiselina To je kruzni metabolicki put.U citratnom ciklusu ce se objediniti putevi razgradnje ugljikohidrata,aminokiselina i masti i sad gledamo kako ce se prikljuciti i zavrsiti katabolizam ugljikohidrata.Citratni ciklus se odvija u matriksu mitohondrija.U citratni ciklus ulazi acetil-CoA,i u sustini citratni ciklus otpocinje reakcijom kondenzacije acetilCoA i oksalacetata u reakciji koju katalizira citrat-sintaza.Nastat ce citrat,pa iz citrata preko cis-akonitata nastajati izocitrat,pa ce ici reakcija dekarboksilacije i oksidacije izocitrata nastat ce α-keto glutarat.α-keto glutarat u reakciju oksidativne dekarboksilacije u sukcinil-CoA,iz sukcinil-CoA djelovanjem sukcinil-CoA sintetaze nastat ce sukcinat.Onda ide ponovo reakcija oksidacije djelovanjem sukcinat-dehidrogenaze nastat ce fumarat,a djelovanjem fomarata nastat ce L-malat i onda ide oksidacija L-malata u oksalacetat djelovanjem enzima malat-dehidrogenaze.Citratni ciklus se odvija u 8 reakcija(stupnjeva).4 reakcije citratnog ciklusa su reakcije oksidacije i u njima se stvaraju reducirani koenzimi(u njima ocuvana energija oksidacije,to su NADH,FADH2).U 3 reakcije stvarat ce se reducirani NADH,a u jednoj,rekaciji sukcinat-dehidrogenaze stvarat ce se reducirani FADH2.Citratni ciklus je kruzni metabolicki put u kome se stvara CO2,to je onaj CO2 kao jedan od krajnjih produkata konacne oksdacije ili katabolizma gorivnih supstanci.Sa energetskog stanovista je ovaj put vazan zato sto ce se reducirani koenzimi oksidirati u mitohondrijskom lancu za transport elektrona i onda ce ta slobodna energija oksidacije biti iskoristena za sintezo ATP-a i nastaje voda kao drugi krajnji produkt potpunog katabolizma.U energetskom metabolizmu znacaj je jos sto mnogi intermedijeri citratnog ciklusa u molekulama sadrze 4-5 ugljikovih atoma su polazne supstance za sintezu drugih molekula.(npr.intermedijer α-keto glutarat moze biti koristan za sntezu glutamata,oksalacetat-aspartata,,sukcinil CoA za sintezu Hem-a).Prema tome intermedijeri citratnog ciklusa su prekursori u biosintezi drugih bioloski vaznih molekula.U svakom krugu citratnog ciklusa ulazi 1 acetilna grupa sadrzi 2 C atoma i ulazi u obliku acetil-CoA,a ciklus ce napustiti 2 molekule CO2.Citratni ciklus zauzima centralno mjesto u katabolickim putevima kojima se dobija energija.C4 i C5 intermedijati cit.ciklusa prekursori su za sintezu mnostva drugih produkata.Kod eukariota sve reakcije citratnog ciklusa odvijaju se u mitohondrijama(u njima i oksidativna dekarboksilacija piruvata).Enzimi koji kataliziraju one reakcije kondenzacije koje se odvijaju bez trosenja energije u obliku ATP-a ili GTP-a nazivaju se sintazama,a oni u kojima se trosi sintetazama. 1)Prva reakcija citratnog ciklusa(formiranje citrata) rekacija kondenzacije acetil-CoA i oksalacetata u citrat,reakciju katalizira enzim citratsintaza.Ova reakcija je egzergona,ireverzibilna.Kad ide sama kondenzacija veza ce se stvarati izmedju ugljika iz metilne skupine acetil-CoA i ugljika koji pripada karbonilnoj skupini oksalacetata.U toku same reakcije prolazno ce se stvarati intermedijer citroilCoA,a onda ce se hidroliticki cijepati tioesterska veza,oslobodit ce se CoA i nastat ce citrat.Rekacija je egzergona zato sto ce se osloboditi energija iz hidrolitickog cijepanja tioesterskih veza,i ta energija ce obezbijediti odvijanje ove reakcije.Hidroliza ovog citroil-CoA visokoenergetskog zbog tioesterske veze cini ukupnu reakciju visoko egzergonom i ireverzbilnom.Velika negativna promjena standardne slobodne energije reakcije citrat sintaze esencijalna je za odvijanje citratnog ciklusa,jer su konc.oksalacetata

89

veoma niske.(prikazana citrat sintaza-oblik enzima kao dimer na koji nije vezan supstrat).Da bi isla reakcija kondenzacije trebaju se vezati 2 supstrata :oksalacetat i acetilCoA.Rendgensko kristalografska istrazivanja su pokazala da je crveno aktivno mjesto vezivanja oksalacetata,kada se on veze dolazi do znacajne promjene konformacije citratsintaze,to se naziva inducirano prilagodavanje enzima i supstrata i pri tome se formira mjesto na koje ce se vezati acetil-CoA(2.supstrat). 2)Formiranje izocitrata U ovoj rekaciji citrat treba da se prevede u izocitrat.Razlika je u polozaju H atoma i OH skupine.Ovu rekaciju prevodjenja citrata u izocitrat katalizira enzim akonitaza.To prevodjenje ide preko spoja koje se naziva Cis-akonitat.Djelovanjem akonitaze prvo ce se rastvoriti molekula vode pa ce nastati Cis-akonitat(cis je jer su karboksilne skupine s iste strane) i onda ce djelovanjem akonitaze ponovo da se adira voda na dvostruku vezu i nastat ce izocitrat.Akonitaza moze katalizirati reakciju u 1 i u drugom smjeru,obicno negdje bude samo 10 % izocitrata ostalo bude citrat.Ako se izocitrat koristi u sljedecem stupnju ciklusa onda se stalno citrat prevodi u izocitrat.Akonitaza( ovo plavo proteinski dio) je enzim koji sadrzi Fe-S centar,imamo 4 S skupine,ovo Fe je koordinativno vezano s atomima sumpora koji pripadaju cisteinskim ostatcima.Fe-S centar sluzi u samoj katalizi uklanjanja i dodavanja vode i pomaze u pozicioniranju citrata kao supstrata za odvijanje same reakcije.(prikazan je bazni aminokiselinski ostatak koji pripada proteinskom djelu enzima). 3)Izocitrat-dehidrogenaza katalizira rekaciju dekarboksilacije i oksidacije izocitrata,nastaje α-keto glutarat Reakcija kako su Nelson i Koks napisali,nije oksidativna dekarboksilacija nego katalizira reakciju dekarboksilacije i oksidacije.Oksidans je NAD+,koji ce se reducirati u NADH i izdvojit ce se CO2.Ova reakcija je reverzibilna,i prva reakcija citratnog ciklusa u kojoj se izdvaja CO2.Karboksilna skupina ce se izdvojiti u obliku CO2,a reakcijom oksidacije ce se OH skupina oksidirati u keto skupinu,za to je ksidans NAD+ i to je prva reakcija u kojoj ce nastati prvi od 3 reducirana NADH. 4)Reakcija oksidativne dekarboksilacije α-ketoglutarata u sukcinil-CoA Ova reakcija odvija se na kompleksu koji se naziva kompleks α-ketoglutarat dehidrogenaze,on je analogan kompleksu piruvat-dehidrogenaze i reakcija se odvija na isti nacin.Reakcija je ireverzibilna. Kompleks α-ketoglutarat dehidrogenaze cine 3 enzima : E1,E2,E3 i imaju iste prostetske skupine kao kompleks piruvat-dehidrogenaze i sudjeluje NAD+ i CoA,a razlikuju se u tome sto E1 enzim piruvat-dehidrogenaze treba da prepozna piruvat kao supstrat,a E1 enzim α-ketoglutarat dehidrogenaze da prepozna αketoglutarat.E3 enzim je potpuno isti,E2 su veoma slicni.Ovo je reakcija u kojoj ce se stvoriti druga molekula CO2. 5) Iz sukcinil-Coa uz kataliticko djelovanje sukcinil-CoA sinetetaze nastat ce sukcinat.U ovoj reakciji citratnog ciklusa ce se direktno stvoriti 1 fosfoanhidridna veza,naime iz GDP i anorganskog fosfata sintetizirat ce se GTP.Energiju za stvaranje ove fosfoanhidridne veze ce obezbijediti cijepanje tioesterske veze u,sukcinil-CoA ce se osloboditi CoA,to je egzergono i obezbijediti ce energiju za stvaranje ove veze.U ovoj reakciji se direktno stvara GTP koji je analog ATP-u.Sukcinil-CoA sintetaza u aktivnom

90

mjestu ima histidinski ostatak,a u aktivnom mjestu enzima vezuje se sukcinil-CoA i sada u reakciju stupa anorganski fosfat.Nastat ce na enzim vezani sukcinil-fosfat,a osloboditi ce se CoA.Sukcinil-fosfat je acil-fosfat i on ima visok fosforilirajuci potencijal,on ce fosfolirati histidinski ostatak u aktivnom mjestu enzima i nastat ce fosfohistidil enzim2.stupanj.U 3.stupnju ce se sa fosfohistidil enzima (fosfolirilanog histidnskog ostatka)prenijeti fosfatna skupina na GDP i sintetizirati ce GTP. 6)Oksidacija sukcinata u fumarat: U ovoj rekaciji se sukcinat djelovanjem sukcinat-dehidrogenaze prevodi u fumarat.Sukcinat-dehidrogenaza je flavoprotein sadrzi FAD kao prostetsku skupinu.Ovaj enzim je jedini enzim citratnog ciklusa koji je asociran na unutrasnju membranu mitohondrija,on je u sustini kmpleks II mitondrijskog lanca za transport elektrona(respiracijskog lanca). 7)Prevodjenje fumarata u L-malat Enzim fumaraza adicijom vode na dvostruku vezu prevodi fumarat u L-malat.Fumaraza je stereospecificna i katalizira hisrataciju samo trans dvostruke veze.Kada nastane Lmalat ide posljednja reakcija citratnog ciklusa. 8)Oksidacija L-malata u oksalacetat L-malat djelovanjem mitohondrijske malat dehidrogenaze prevodi se u oksalacetat.Oksidans je NAD+ koji ce se reducirati u NADH.∆G0 je visoko pozitivna i ravnoteza reakcije je pomjerena daleko ulijevo prema L-malatu.Pokretat ce je egzergona prva reakcija citrat sintaze,ona pomjera prevodjenje L-malata u oksalacetat.Shematski prikazano stvaranje 3 reducirana NADH,nastaje 1 reducirani FADH2,1 molekula GTP i izvojit ce se 2 molekule CO2. Stohiometrijski citratni ciklus : acetil-CoA +3 NAD+ +FAD+GDP+Pi+2H2O

91