biohemija-4-skripta

BIOHEMIJA LIJEKOVA ~ LIJEK – je svaka hemijska supstanca koja ostvaruje efekat na organizam. ~ KSENOBIOTIK (grč. xenos – strano, bios – život) su hemijski spojevi koji djeluju npr. kao karcinogeni ili se mogu akumulirati u životnoj sredini sa toxičnim efektima na ekosisteme. (svaka tvar koju nalazimo unutar organizma, a da se obično ne proizvodi niti se očekuje da će unutar njega biti prisutna – internet) Terapeutski index – odnos između koncentracije lijeka potrebne da izazove terapeutski efekat i koncentracije koja izaziva toxičnost. Molekularni mehanizmi djelovanja lijekova  Fizikalnim svojstvima  Hemijskom reakcijom  Složenim biohemijskim procesima · Receptori · Enzimatski sistemi · Jonski kanali i drugi transportni sistemi · Druge ćelijske makromolekule (DNK) RECEPTOR – mjesto u organizmu na koje djeluje lijek.  Specifični receptori  Vezano mjesto lijeka  Regulatorni proteini Najvažniji načini primjene lijeka 1 Oralna 2 Sublingvalna 3 Inhalaciona 4 Rektalna 5 Intravenozna 6 Intramuskularna 7 Subkutana (potkožna) 8 Topikalna 1 ORALNA PRIMJENA LIJEKA ~ Prednosti: · Najčešća, jednostavna za uzimanje, bezbolna · Ekonomična – lijek ne mora da se steriliše, može da se proizvede u velikim količinama · Raznovrsna – tablete, kapsule, suspenzije ~ Nedostaci: · Nekad nedovoljna – visoko doziran lijek ili njegova niska rastvorljivost mogu da uzrokuju slabu raspoloživost, tako da se lijek djelimično apsorbuje. · Nepredvidiva apsorpcija nekih lijekova 1

· · ·

Efekat prvog prolaza kroz jetru Hrana i funkcija GIT mogu da utiču na apsorpciju Lokalni efekat – antibiotici mogu da unište normalnu crijevnu floru i omoguće rast fungalnih vrsta; iritacija GIT.

2 SUBLINGVALNA PRIMJENA ~ Prednosti: · Vrlo brzo početak djelovanja lijeka; brza apsorpcija – dobra prokrvljenost tkiva. · Prvi prolaz – jetra je zaobiđena, tako da nema gubitka lijeka. BR je povećana. · Stabilnost lijeka – pH u ustima je relativno neutralna (želudac – kiseo). Znači, lijek je više stabilan. ~ Nedostatci : · Držanje lijeka u ustima nije prijatno (samo manje doze, oko 10 mg) · Maskiranje ukusa · Iritacija mukoze

3 INTRAVENOZNA (i.v.) PRIMJENA ~ Prednosti: · Brz efekat lijeka. · Cijela doza lijeka je aplicirana u krvni sistem; veće doze se mogu dati produžavanjem vremena infuzije. · Vene su relativno neosjetljive na iritacije sa iritantima u povećanim koncentracijama. ~ Nedostatci: · Ponekad je teško naći odgovarajuću venu. · Moguć toxičan efekat kod brže administracije lijeka – pratiti toxičnost. · Zahtijeva trenirano osoblje. · Skupa – zbog neophodne sterilnosti preparata veći su troškovi pripreme, transporta i uskladištenja. 4 SUBKUTANA (POTKOŽNA) PRIMJENA ~ Prednosti: · Pacijent može sam da primijeni lijek (inzulin) · Apsorpcija lijeka spora, ali obično kompletna (povećava se masažom ili toplotom). Vazokonstriktor se može dodati da smanji 2

apsorpciju lokalnog anestetika i produži njegovo djelovanje na željenom mjestu. ~ Nedostatci: · Može biti bolna · Lijekovi sa iritantnim djelovanjem mogu da oštete lokalno tkivo. · Može se aplicirati max 2ml 5 INTRAMUSKULARNA (i.m.) PRIMJENA ~ Prednosti: · Moguće je aplicirati veće volumene nego kod subkutane primjene lijeka · Moguće je postići produženo djelovanje lijeka (prokain penicilin) ~ Nedostaci: · Zahtijeva trenirano osoblje. Mjesto injiciranja utiče na apsorpciju (preporučen deltoidni mišić). · Apsorpcija je često nepredvidiva, posebno za slabo rastvorljive lijekove kao što su diazepam i fenitoin. · Rastvarač može da se apsorbuje brže nego lijek uzrokujući precipitaciju (taloženje) lijeka na mjestu injekcije. 6 REKTALNA ~ Prednosti: · Zaobilazi jetru – vene iz rektuma mogu direktno da se ulijevaju u opštu cirkulaciju. · Koristan za pacijente koji ne mogu da uzimaju lijek oralno ili za manju djecu. ~ Nedostatci: · Apsorpcija je nepredvidiva i često nepotpuna · Nije popularan način terapije 7 ~ ~ ~

TOPIKALNA PRIMJENA Lokalni efekat – kapi za oči, antiseptici, krema za sunčanje, itd. Sistemski efekat – npr. nitroglicerinska mast Apsorpcija kroz kožu, posebno u slučaju abrazija i ogrebotina, može biti vrlo značajna. Ovo je problem u farmaceutskoj praksi i radu sa toksičnim supstancama.

8 INHALACIONA PRIMJENA ~ Jedna od najstarijih metoda efikasne terapije; vijekovima se koristi u terapiji astme sa prorodnim (prirodnim) produktima. ~ Lokalni efekat – bronhodilatatori ~ Sistemski efekat – generalna anestezija ~ Brza apsorpcija, zaobilazi jetru. ~ Apsorpcija čvrstih i tečnih supstanci se smanjuje ako su čestice veće od 10µm, koje neće dospjeti do alveolarnih vrečica. ~ Nedavno se počela češće koristiti u primjeni lijekova steroida i peptida, koji se inaktiviraju nakon oralne primjene (izbjegnut je efekat prvog prolaza). 3

Ostali načini primjene lijeka: - Intra-nazalna - Intra-arterijska – npr. kod hemoterapije kancera da bi se maksimizirala koncentracija lijeka na mjestu tumora. - Intratekalna – direktno u cerebrospinalnu tečnost.

Oralna primjena lijeka - Česta, sigurna i ekonomična - Ograničena apsorpcija nekih lijekova - Iritacija GI mukoze - Razgradnja nekih lijekova usljed niskog pH u želudcu i digestivnih enzima - Efekat prvog prolaza kroz jetru - Iregularna apsorpcija usljed prisustva hrane ili drugih lijekova - Neophodna saradnja pacijenta

Parenteralna primjena lijeka - Brže, extenzivna i predvidiva raspoloživost - Efektivna doza se može tačnije primjeniti - Nesvjestan pacijent - Izbjegnut preliminarni metabolizam u GIT i jetri - Neophodna sterilnost - Skupa - Bolna - Pacijenti je ne mogu lako sami primjeniti

Lijekovi se mogu administrirati na razne načine, ali će željeni terapeutski efekt biti ostvaren samo ako:  Farmakološki aktivna supstanca stigne do mjesta djelovanja (ciljne ćelije u organizmu)  U koncentraciji dovoljnoj za odgovarajući efekt  Ostane na tom mjestu za odgovarajuće potrebno vrijeme prije nego što se eliminiše iz organizma. Apsorpcija lijeka – je suma svih procesa kojima ljekovita supstanca mora da bude izložena nakon njene administracije prije nego što dospije u sistemsku cirkulaciju.  Postignuta koncentracija aktivnog oblika primarno ovisi o stepenu i brzini apsorpcije  Dakle, da bi proizveo karakteristične efekte lijek mora da:  Uključi u proces kretanja od mjesta aplikacije u extracelularni prostor organizma  Bude prisutan u odgovarajućoj koncetraciji na mjestu djelovanja. Biološka raspoloživost – označava dio lijeka koji dospije u opštu cirkulaciju i raspoloživ je za farmakološko djelovanje; definiše se i kao stepen apsorpcije u sistemsku cirkulaciju.  Varira između: 4

· · ·

Različitih lijekova Različitih farmaceutskih formulacija istog lijeka Različitih osoba

Brzina apsorpcije – vrijeme do max. koncetracije u plazmi (Tmax); određuje početak farmakološkog djelovanja i utiče na intenzitet, a ponekad i na dužinu djelovanja lijeka. Bioekvivalentnost - Bioekvivalentna su dva lijeka jednakog stepena i brzine bioraspoloživosti. - Obično 10% modernih oblika doziranja lijeka predstavlja aktivna supstanca, koja je pomiješana sa različitim, farmakološki inertnim, supstancama ili excipijentima (boje, antioksidanti, konzervansi, pojačivači ukusa, vezivna sredstva i sl.) - Ljekoviti proizvodi su farmaceutski ekvivalentni ako sadrže istu aktivnu komponentu, ako su isti po jačini i koncentraciji, doziranoj formi i načinu primjene. Apsorpcija lijeka iz GIT-a - Osnovni mehanizam je isti kroz sve epitelne membrane – uglavnom pasivni transport, čija je brzina određena stepenom jonizacije i lipofilnošću lijeka. - Oko 75% lijeka administiranog oralno se apsorbuje u toku 1-3h. - Fiziološki faktori koji utiču na apsorpciju lijekova iz GIT:  Karakteristike GIT  Protok krvi na mjestu apsorpcije  Prisustvo hrane ili tečnosti u želudcu  Pražnjenje želudca  Brzina prolaska kroz tanko crijevo (velika površina apsorpcije)  Ko-administracija 2 ljekovite supstance, koje mogu uticati na apsorpciju jedna druge ili odložiti pražnjenje želudca (administracija salicilata sa propantelinom (smanjuje) ili sa metoklopramidom (ubrzava gastrično pražnjenje))  Stanje lijeka u crijevima; npr. mlijeko sprečava apsorpciju tetraciklina koji se vežu za jone Ca. Distribucija lijeka Glavni sistemi u organizmu su: 1 Plazma (5% tjelesne težine) 2 Intersticijska tečnost (16%) extracelularna 3 Limfa (1%) tečnost 4 Intracelularna tečnost (35%) 5 Transcelularna tečnost (2%) – CS, intraokularna, pleuralna, sinovijalna tečnost i sekreti GIT 6 Masno tkivo (20%) 5

U svakom od ovih sistema lijek je prisutan u vezanom i slobodnom obliku, ali samo nevezana (slobodna) forma može da se kreće između pojedinih sistema. Sudbina lijeka u organizmu (ADME) – ADME koncept: 4 procesa u farmakokinetskoj fazi biološke dispozicije lijeka (apsorpcija, distribucija, metabolizam, eliminacija). Faktori koji utiču na apsorpciju lijekova: 1 Fizičko-hemijske osobine molekule lijeka i karakteristike dozirane formulacije. 2 Biološki faktori:  specifični za način primjene (pražnjenje želudca, hrana)  površina područja primjene  protok krvi  kiselo-bazne osobine apsorbirajuće površine  genetski određene inter-individualne razlike

BIOLOŠKE MEMBRANE I MEMBRANSKI TRANSPORT

-

Ćelijska membrana se sastoji od lipida i proteina Lipidne molekule u dvosloju mogu da se kreću lateralno, što doprinosi fluidnosti, fleksibilnosti i relativnoj nepropusnosti prema visokopolarnim molekulama. Proteini u sastavu membrane služe kao: ~ Receptori ~ Jonski kanali ~ Nosači ~ Predstavljaju ciljeve u djelovanju lijekova 6

-

Ćelijska membrana je selektivno propusna

Tipovi membrana: 1 Epitelne membrane – koža, GI lumen, kornea, mokraćni mjehur; zaštita od vanjskih uticaja. 2 Barijera između krvi i mozga 3 Bubrežna glomerularna membrana 4 Bubrežni tubuli – eliminacija lijeka i reapsorpcija (zavisno od pH i pKa lijeka) 5 Placenta – spora ekvilibracija 6 Peritoneum – slobodan prolaz Barijera između krvi i mozga  Najveći dio kapilara u mozgu nema pore – mnoge polarne supstance ne mogu da prolaze (toxini)  Supstance rastvorljive u mastima lako prolaze (opšti anestetici) Bubrežna glomerularna membrana  Glomerulus – glavni filter u nefronu  Porozni kapilari – mnoge polarne i nepolarne supstance mogu da prolaze (veličine skoro do MT albumina - 69000) → to je vrlo korisno u bubrezima – ekskrecija toxičnih supstanci.

Vrste transporta kroz membrane: 1 Pasivni transport · smatra se važnijim mehanizmom, koji osigurava dobru apsorpciju nepolarnih liposolubilnih lijekova iz crijeva (uglavnom tankog) zbog njegove ogromne apsorptivne površine. · Koncentracijski gradijent omogućava brzu i potpunu apsorpciju mnogih lijekova 2 Olakšani transport · Neophodan je molekularni nosač lijeka, ali energija nije (npr. transport vitamina B12) · Može se zasititi ako nema dovoljno nosača · Održava se u smijeru koncentracijskog gradijenta ; brži od pasivnog transporta · Specifični nosači su obično prisutni u ćelijskoj membrani u obliku specifičnih područja (domain – specific fashion). 3 Aktivni transport · Neophodna energija, neophodan nosač · Proces se može zasititi (saturacija) · Transport se može odvijati nasuprot koncentracijskom gradijentu 4 Pinocitoza (endocitoza) · Supstance sa većom MT – proteini, antigeni, bakterijski toxini itd. 7

Dakle od spomenutih mehanizama apsorpcije lijekova, posebno su važna:  Difuzija kroz lipidne membrane (pasivna difuzija)  Rastvorljivost lijeka u mastima je jedan od najvažnijih faktora koji utiče na brzinu pasivne difuzije i određuje farmakokinetske osobine lijeka. Molekularna težina je manje važan faktor.  Transport koji se bazira na nosaču (olakšana difuzija i aktivni transport)  Renalni tubuli  Bilijarni trakt (žučni putevi)  Krvno-moždana barijera  Gastro-intestinalni trakt

Uticaj pH na apsorpciju lijekova -

-

-

Lijekovi se na osnovu svoje hemijske stukture ponašaju kao kiseline ili baze, jer mogu da prime ili oslobode H+ jon. U određenom pH području ti lijekovi će biti u naelektrisanoj, dok će u drugom pH području biti u nenaelektrisanoj formi (tj. stepen jonizacije lijeka varira u ovisnosti od pH sredine) Nenaelektrisana forma lijeka je rastvorljiva u mastima i samo ona može proći kroz lipidne membrane Dakle na apsorpciju lijeka utiču:  pKa lijeka  pH na mjestu apsorpcije Raspodjela lijeka usljed pH ukazuje da se slabe kiseline akumuliraju u sistemu sa relativno visokim pH, dok se slabe baze akumuliraju u sistemu sa relativno niskim pH Pretpostavlja se da se u ravnotežnom stanju lijek slaba kiselina akumulira na više bazičnoj strani membrane, dok se slabe baze akumuliraju na više kiseloj strani membrane – fenomen hvatanja jona (ion trapping) Gastrična mukozna membrana se najvjerovatnije ponaša kao jednostavna lipidna barijera, koja je propusna samo za nejonizovanu, lipofilnu formu lijeka. Bazirano na ovom konceptu, može se pretpostaviti da će se slabe kiseline bolje apsorbirati iz želuca (pH 1-2) nego iz gornjeg dijela intestinalnog trakta (pH 3-6) i obrnuto za baze Lijekovi koji imaju nisku rastvorljivost u lipidima, kao i jake kiseline ili baze, se slabo apsorbuju iz crijeva. Ovi lijekovi se uglavnom zadržavaju u plazmi i intersticijskoj tečnosti. Lijekovi koji su rastvorljivi u mastima dospijevaju u sve sisteme i mogu se akumulirati u masnom tkivu

Neke važne posljedice mehanizma raspodjele lijeka usljed pH:  Urinarna acidifikacija će ubrzati ekskreciju slabih baza, a usporiti ekskreciju slabih kiselina, dok će alkalizacija urina imati suprotni efekt.

8

 Povećanje pH plazme (npr. sa administracijom Na-bikarbonata) će uzrokovati ekskreciju lijekova slabih kiselina iz CNS u plazmu – korisno u tretmanu prekomjernog doziranja aspirina. Dva dodatna faktora koji imaju važan uticaj na distribuciju i eliminaciju lijekova:  Distribucija u masno tkivo  Vezivanje za proteine plazme  Albumin je najvažniji protein plazme koji učestvuje u vezivanju lijekova; uglavnom veže kiseline.  Alkalni lijekovi se mogu vezati i sa β-globulinom i kiselim glikoproteinom.  Povećano vezivanje za proteine može da uspori eliminaciju (metabolizam i/ili ekskreciju glomerularnom filtracijom).  Lijekovi koji se čvrsto vežu za proteine uglavnom ne napuštaju plazmu (mali Vd).

BIOTRANSFORMACIJA LIJEKOVA Biotransformacija lijekova (BT)– hemijska tansformacija ksenobiotika u živim organizmima, obično katalizovana enzimatskim reakcijama. Produkt ove hemijske promjene se naziva METABOLIT.!!! - Može se odvijati: - in vivo kroz spontane , nekatalizovane hemijske reakcije -većina reakcija je katalizovana specifičnim ćelijskim enzimima - Obično se vrši u jetri (efekat 1. prolaza), ali može i u: crijevnom zidu, bubrezima, mišićima, plućima, koži i plazmi. 9

Metabolizam lijeka u toku procesa apsorpcije: ~ Dio inicirane doze koja dospije u portalnu venu – APSORBOVANI DIO ~ Dio koji dostigne krvnu cirkulaciju nakon prvog prolaza kroz jetru – BIORASPOLOŽIVOST LIJEKA Na subcelularnom nivou odvija se najviše u ER i citoplazmi, zatim u mitohondrijama, nuklearnoj i plazma membrani. MIKROZOMI su glavno mjesto BT u hepatocitima i drugim ćelijama – membrane ER formiraju ova tjelašca (kesice) nakon homogenizacije i manipulisanja tkiva. Metabolizam lijekova se odnosi na i uključuje:  interakcije lijekova  karcinogenost, mutagenost i teratogenost  bioaktivaciju  inhibiciju supstrata  indukciju enzima  terminaciju djelovanja lijeka -

Generalno, BT prevodi lipofilni ksenobiotik u polarnu supstancu i time omogućava i ubrzava njegovo efikasno izlučivanje u urinu. !!!

Efekti BT ( 3 su moguća): 1. AKTIVACIJA – neaktivni prekursor lijeka (prodrug) se transformiše u farmakološki aktivan lijek (L dopa u dopamin) 2. ODRŽAVANJE AKTIVNOSTI – transformacija u aktivni metabolit (diazepam u oksazepam – oba aktivna) 3. INAKTIVACIJA – transformacija u neaktivne produkte (pentobarbital u u hidroksilirane metabolite)

-

Postoje 2 faze biotransformacije lijekova:

-

1.FAZA - Reakcije funkcionalizacije Oksidacija Redukcija Hidroliza Deaminacija

2.FAZA – Biosintetske reakcije (konjugacije) - Konjugacija sa glukuronskom kiselinom - Konjugacija sa sulfatnom 10

-

Promjene na prstenu

kiselinom Konjugacija sa glutationom Konjugacija sa aminokiselinama (glicinom) - Acetilacija - Metilacija - Hidratacija epoxida  Ovim reakcija se -funkcionalna grupa maskira dodavanjem nove grupe (npr. acetil grupe, sulfata, glukuronske kiseline ili nekih aminokiselina) – kovalentno vezivanje  Produkti su uglavnom farmakološki inaktivni  Još više se povećava polarnost ksenobiotika, koji se time brže izlučuje -



Ovim enzimatskim reakcijama se: - uvodi nova ili modificira već postojeća funkcionalna grupa u molekuli supstrata - otkriva funkcionalna grupa ili akceptorsko mjesto za reakcije faze II  Produkti mogu biti: -farmakološki aktivni ili inaktivni -obično supstrati za enzime faze II  Ksenobiotik postaje polarniji i lakše se izlučuje -

Zajednička karakteristika svih reakcija BT lijekova: ~ Produkti BT su obično više rastvorljivi u vodi (više polarni) – da bi se smanjila tubularna reapsorpcija u bubrezima i povećala eliminacija lijekova. ~ Aromatski i heterociklični amini ovise o metaboliznu da bi ispoljili kancerogenost ~ Genetski polimorfizam mnogih metabolizirajućih enzima može da modifikuje rizik razvoja kancera.

11

I faza BT lijekova 1. OKSIDACIJA -

Najčešći tip BT lijekova

1. 2. 3. 4. 5. 6.

Alkil grupa → alkohol (npr. fenobarbiton) Aromatski prsten → fenol (npr. fenitoin) – aromatska hidroksilacija Oxidacija S ili N (npr. hlorpromazin) Dvo-fazna oxidativna dealkilacija (npr. fenacetin) Monoaminoxidaza (npr. 5-hidroksitriptamin) Alkohol dehidrogenaza u jetri, bubrezima i plućima

-

Mikrozomalni sistem oksidacije uključuje: ~ Citohrom P450 (CYP) ~ NADPH-citohrom P450 reduktaza (CPR) ~ Katalizuje veliki broj reakcija oxidacije ~ Najvažnija grupa enzima koji metabolišu lijekove ~ Superfamilija hemo – tiolat proteina koji su široko rasprostranjeni u svim živim sistemima.

Tipična reakcija katalizirana sa citohrom P450 (CYP) je: NADPH + H+ + O2 + RH → NADP+ + H2O + R-OH ·

Ovaj sistem koristi NADPH-citohrom P450 reduktazu (CPR) da prebaci elektrone sa NADPH na hemoprotein (Fe3+).

·

CPR je flavoprotein koji se sastoji od 2 elektro-mobilizirajuće grupe:  FAD (flavin-adenin-dinukleotid)  FMN (flavin-mononukleotid) CPR je elektron-donor za mnoge oksigenaze u ER: CYP, hemoksigenaza, skvalen monooksigenaza, citohrom b5

·

Citohrom P450 -

Cito – mikrozomalne vezikule, hrom – obojen, P – pigment, 450 – spec.max.apsorpcije !!!

-

Oxidacija i redukcija Redukovana forma ovog hemoproteina veže CO, stvarajući komplex koji ima specifičan apsorpcioni spektar na 450nm Najsvestraniji biokatalizator:  Katalizira preko 60 različitih tipova reakcija

-

12

-

 Djeluje na 100 000 različitih supstrata. Raznovrsne reakcije oxidacije: alifatska oxidacija, aromatska hidroksilacija; N-,O-,S- dealkilacija; N-oxidacija, formiranje sulfoxida. (hidroxilacija – najvažnija!!!)

-

Lokacija :  U ćeliji (proteini vezani za membrane):  Unutrašnja membrana mitohondrija (MT) - Feredoxin – donor elektrona za CYP u MT - Feredoksin reduktaza, NADPH  ER - CPR donor elektrona za CYP u ER - FAD, FMN  Tkiva :  Različiti CYP enzimi se mogu naći u skoro svakom tkivu: jetra, bubrezi, tanko crijevo, pluća pa čak i mozak.

-

CYP djeluje na ovako raznovrstan spektar supstrata na osnovu 2 glavna razloga:  Multiple molekularne forme enzima  Niska specifičnost za supstrat svake od ovih izoformi

Katalitički ciklus CYP:

1. Vezivanje supstrata (vjerovatno blizu mjesta liganda hema) 2. 1-elektron radukcija Fe sa flavoprotein NADPH citohrom P450 reduktazom 3. Reakcija fero forme sa O2 do nestabilnog FeO2 kompleksa 4. Dodatak drugog elektrona od NADPH ili citohroma b5 5. Heterolitičko presjecanje FeO-O(H) veze da bi se formirao perferil oksigen kompleks (FeO)3+ 13

6. Oksidacija supstrata 7. Oslobađanje produkta CYP indukovano formiranje aktivnih metabolita:  Aktivacija biguanidnog antimalarika proguanila u cikloguanil je katalizirana sa CYP3A i CYP2C19  Oksidativni metabolit terfenadina; kada je ovaj CYP3A-indukovani put inhibisan sa potentnim inhibitorima (ketokonazol) zabilježena je teška, ponekad letalna kardiotoxičnost zbog akumulacije osnovne komponente. Multiple forme CYP: -

Sekvencirano kod ljudi 115 gena: 57 funkcionalnih CYP gena i 59 pseudogena (pseudogen – defektan gen koji ne proizvodi funkcionalan protein)

CYP 2 D 6 4 Familija

Subfamilija

Izo-enzim

Alel

-

18 familija, 44 subfamilije – humanih citohrom P450

-

U oksidaciji su najvažniji – odgovorni su za oxidaciju više od 90% trenutno korištenih lijekova (bez 2A6) !!!  CYP3A4 (najvažniji), CYP2D6, CYP2C9, CYP2C19  Ostali važni su CYP2E1, CYP2A6 i CYP1A2

 

CYP koji uglavno degradiraju ksenobiotike: CYP1, CYP2A..2E, CYP3 CYP uključeni u metabolizam steroida: CYP2G1, 7, 8B1, 11, 17, 19, 21, 27A1, 46, 51 CYP koji metabolišu masne kiseline: 2J2, 4, 5, 8A1



U metabolizmu učestvuju: CYP3A4 40%, 2D6 30%, 2C9 10%, 2C19 8%, 1A2 8%, a ostali samo 4%. -

CYP familije 1-3 su odgovorne za 70-80% svih reakcija faze I metabolizma lijekova.

Kristalna struktura CYP - Astex kompanija posjeduje tehnologiju za određivanje trodimenzionalne strukture humanih CYP. - Astex je riješio strukture CYP2C9 i CYP3A4 (najznačajniji enzimi u metabolizmu lijekova kod ljudi) (modifikacija postojećih lijekova da bi postali stabilniji supstrati za CYP3A4 – duže se zadržavaju u tijelu prije eliminacije). 14

Poznate CYP kristalne strukture: - CYP 2C9 – 2003 CYP2C8 – 2004 - CYP3A4 – 2004 CYP2A6 – 2005 - CYP2D6 – 2006 INDUKCIJA CYP (stepen sinteze enzima je ↑ u odnosu na neindukovan organizam):  Indukcija CYP uključenih u biosintezi steroida od strane ACTH (adenokortikotropnog hormona)  Klofibrat (tretman hiperlipoproteinemija i hipertrigliceridemija) ~ Veže se za protein PPAR (peroxisome proliferator activated receptor) – faktor transkripcije, hormonski nuklearni receptor. ~ CYP4A1 je indukovan ovim mehanizmom. ~ Peroxizomi oksidiraju masne kiseline i CYP4A1 je poznata hidroxilaza masnih kiselina  Aromatski hidrokarboni indukuju CYP1 familiju (pušenje CYP1A2)  Etanol – CYP2E  Fenobarbiton – CYP2B (40-50x) INHIBICIJA CYP:  Naringin u grejpfrutu inhibiše CYP3A4 Neinvazivni markeri za određivanje nivoa CYP kod ljudi: CYP katalizuje specifične reakcije koje se mogu pratiti u uzorcima URINA, KRVI ili DAHA pacijenata kojima je administriran neinvazivni marker.  Kofein – marker za CYP1A2. - Brzina demetilacije je određena količinom CYP1A2 u jetri ispitanika - Može da pokaže ako je osoba bila izložena policikličnim aromatskim hidrokarbonima (PAH)  Određeni polutanti – indukuju CYP1A enzime - Odrediti nivo ovih enzima u jetri ribe – prati se nivo zagađenja vode. Funkcije humanih CYP i bolesti uzrokovane CYP defektima:  CYP1 - Hidroksiliraju estrogen (CYP1A2 i 1B1) - Oksidiraju uroporfirinogen do uroporfirina u metabolizmu hema - Inducirani sa PAH (dim cigarete, hrana sa roštilja) - Aktiviraju supstance u kancerogene - Visok nivo CYP1A2 povezan sa ↑ rizikom za kancer debelog crijeva  CYP1B1 - Povezan sa primarnim kongenitalnim glaukomom  CYP2B 15

-

Induciran sa barbituratima kod glodara; uloga kod ljudi još nije jasno definisana.

Genetski polimorfizam CYP  Kod bjelaca polimorfizam je uočen kod oko 3% populacije  Kod azijaca je zabilježen kod 20% populacije.

CYP3A4 · · ·

CYP3A je jedna od najvažnijih familija enzima koji metaboliziraju lijekove kod ljudi. CYP3A4 je najviše prisutan CYP u humanoj jetri metabolizira preko 120 različitih lijekova

CYP 3A4 supstrati:  Acetaminofen  Kodein  Ciklosporin A (imunosupresiv)  Diazepam  Eritromicin  Lidokain (anestetik)  Lovastatin (inh HMGCoA reduktaze, ↓ holesterol)  Taksol (citostatik)  Varfarin (antikoagulans) Inhibicija CYP3A4:  Eritromicin  Ketokonazol, Itrakonazol (antifungalno djelovanje) Ako se ovi lijekovi daju zajedno sa onima koji se normalno metabolišu sa CYP enzimima: - Vrijeme poluživota ovih drugih lijekova će se produžiti - Nivoi u plazmi će porasti - Ako oni utiču na srčani ritam ili druge kritične sisteme, rezultat može biti fatalan - npr. inhibicija CYP3A4 kod pacijenata koji uzimaju VARFARIN (antikoagulans) može da uzrokuje krvarenje  6,7-dihidroksibergamotin (u soku grejpfruta) – uzrokuje oko 12x ↑ konc. nekih lijekova i efekt traje više dana

CYP2D6 Otkriće kristalne strukture CYP2D6 je od izuzetne važnosti i značaja, budući da ovaj enzim: · Odgovoran je za preko 70 različitih oksidacija lijekova · Učestvuje u metabolizmu najveće frakcije poznatih lijekova · Pokazuje značajne interindividualne varijacije 16

Jedinjenja koja se metabolišu pod katalitičkim dejstvom CYP2D6:  Sadrže N i planarni aromatični prsten  tj. karakteristike koje su zajedničke za lijekove koji djeluju na KVS i CNS Mutacije na razini CYP2D6 gena uzrokuju slabi, srednji i jaki metabolizam za 30 KV i CNS lijekova. CYP2D6 supstrati:  Antiaritmici - felkainid, meksiletin  Antidepresivi - amitriptilin, fluoksetin (Prozak), paroksetin  Antipsihotici - hlorpromazin, haloperidol  Beta-blokatori – timolol, propranolol, pindolol, metoprolol  Analgetici – kodein, fentanil, oksikodo, meperidin ·

Azijci i afrikanci imaju veći % nefunkcionalnog CYP2D6 (ili smanjenje funkcije) nego bjelci (40-50% naspram 26% kod bjelaca).

·

Dekstrometorfan i spartein – probe supstrati da se odredi aktivnost CYP2D6

Inhibitori CYP2D6:  Fluoksetin i norfluoksetin (efikasni)  Cimetidin, ritonavir, terbinafin Do sada još nije određeno da li se CYP2D6 može indukovati.

GP CYP2D6:

17

8-10% nemaju aktivan CYP2D6, tako da ne mogu da metabolišu kodein do morfina i time nemaju željeni analgetski efekat. Tamoxifen, jedna od najčešće korištenih lijekova za rak dojke, moguće je da ne bude toliko aktivan za žene sa određenom genetskom varijantom enzima koji ga metabolizira. Tamoxifen se metabolizira sa CYP2D6 u endoxifen (koji je do 100x jači antiestrogen od tamoxifena). Postoje 3 varijante ovog gena i jedna od njih je znatno manje aktivna (''slab metabolizer''). Kod ovih žena postoji 2x veća vjerovatnoća od ponovnog oboljevanja od raka dojke. Više od 10% žena nasljeđuje ovu osobinu. Prevalenca (%) CYP genotipa kod populacije bjelaca Metabolizer Extended (EM) Intermediate (IM) Poor (PM)

2D6 50 40 10

2C9 59.5 40 0.5

2C19 77 20 3

CYP2C9 ·

Mnoga tkiva: jetra, bubrezi, testisi, prostata, jajnici, duodenum.

·

Inhibitori : ritonavir, sulfafenazol, flukonazol, fluvoksamin.

·

Indukcija : rifampicin – smanjuje serumski nivo varfarina, tolbutamida i fenitoina. 18

CYP2C19 ·

Jetra (zajedno sa CYP2C9 predstavlja oko 20% ukupne CYP aktivnosti)

GP CYP2C19: 2-6% bjelaca, 15-20% Japanaca i 10-20% afrikanaca su slabi metabolizeri. ·

S-mefenitoin - proba supstrat da bi se utvrdio slab metabolizer.

·

Supstrati : fenitoin, ciklofosfamid.

·

Inhibitori : fluvoksamin, omeprazol, fluoksetin, ritonavir; oralni kontraceptivi – umjereni inhibitor. ~ Simultano korištenje S-omeprazola i diltiazema vodi ka 81% porasta vremena poluživota diltiazema i usporene eliminacije.

·

Indukcija : rifampicin, antikonvulzivi i steroidi.

CYP1A2 · ·

Jetra Hidroksilacija i demetilacija

·

Supstrati: kafein, teofilin, naproksen.

·

Inhibitori: sok grejpfruta, fluvoksamin, ciprofloksacin ~ Nivoi supstrata u serumu su povećani (toxičnost)

·

Indukcija: kupus, brokule, izgorjelo meso; pušenje (PAH) – kancerogenost

·

Kod Kineza muškarci imaju veću aktivnost nego žene

CYP2E1

· Induciran kod alkoholičara GP CYP2E1 : postoji polimorfizam asociran uz ovaj gen koji je češći kod Kineza; ova mutacija korelira sa 2x većim rizikom nazofaringealnog kancera koji je povezan sa pušenjem · Povezan sa pušenjem uzrokovanim kancerom (pored CYP1A2). Individualno doziranje lijekova bazirano na metaboličkom profilu Ampli Clip ® CYP450 testa Ampli Clip ® CYP450 test – test za analizu CYP2D6 i CYP2C19 gena, identifikacija pacijentovog genotipa i na osnovu analize predviđanje mogućeg fenotipa. Ova 2 genetska koda su izuzetno bitna jer kodiraju enzime koji metaboliziraju mnoge antidepresive, antipsihotike, kao i druge lijekove. Ampli Clip ® CYP450 test može pomoći da se naprave individualne terapije za 19

pacijete, na osnovu njegovog fenotipa (baziranog na genotipu), koje će dati najbolji terapijski rezultat.

Non-CYP enzimi i oxidativni metabolizam Aldo-keto reduktaze (AKR) -

NDPH oxidoreduktaze – redukcija aldehida i ketona do primarnih i sekundarnih alkohola. - Djeluju na spektar različitih supstrata:  Lijekovi, kancerogeni i reaktivni aldehidi  Njihova bioaktivacija ili detoksikacija Enzimi koji vrše oxidaciju ksenobiotika: 1. Citohrom P450 2. Aldo-keto reduktaza (AKR) 3. Flavin monooksigenaza (FMO) – efedrin, fenotiazini, pesticidi 4. Prostaglandin sintaza – formiranje toxičnih metabolita (npr.fenitoin) 5. Alkohol dehidrogenaza (ADH) 6. Aldehid dehidrogenaza (ALDH) 7. Monoaminoksidaza (MAO) 8. Diaminoksidaza (DAO) Ostali enzimi iz I faze BT lijekova: 9. Molibden hidroksilaza (XO) – teofilin, teobromin, kofein 10. Aldehid oxidaza - famciklovir 11. Karboksil-esteraze i peptidaze – organofosforni pesticidi 12. Karbonil reduktaze – haloperidol, varfarin

Aldo-keto reduktaze (AKR) -

Pripadaju grupi enzima iz I faze metabolizma lijekova – prevode karbonil grupe u primarne ili sekundarne alkohole Uključeni su u duhanom-uzrokovanoj kancerogenezi – aktiviraju policiklične aromatske trans-dihidrodiole u reaktivne i redoks-aktivne okinone. Kataliziraju detoksikaciju derivata nikotina (nitrozoamino ketona (NNK) koji je vrlo kancerogen) Detoksiciraju reaktivne aldehide nastale od: ~ Egzogenih toksina (aflatoksin) ~ Endogenih toksina ~ Raspadom lipidnih peroksida

AKR endogeni supstrati: aldehidi, retinoli, steroidni hormoni, prostaglandini, prekursori žučnih kiselina. AKR i metabolizam lijekova:  Steroidni hormoni (Tibolon) – bioaktivacija prekursora lijeka 20

 Hemoterapeutici (Doksorubicin, Ciklofosfamid) – kardiotoksičan metabolit  Lijekovi koji djeluju na CNS (Naltrekson) opijatni antagonist produžavaju djelovanje lijekova AKR i metabolizam kancerogena  Aktivacija Policikličnih Aromatskih Hidrokarbona (PAH) – humane AKR (1A1, 1C1)  PAH su vrlo rašireni zagađivači okoline nastali sagorijevanjem fosilnih goriva i prisutni u: u: ~ Izduvnim gasovima automobila ~ Duhanskom dimu ~ Hrani pripremljenoj na roštilju  PAH su dovedeni u vezu sa razvojem kancera pluća; zahtijevaju metaboličku aktivaciju da bi ispoljili svoje negativne efekte. AKR vrše: 1. PAH aktivaciju 2. Detoksikaciju Nikotin-baziranih karcenogena (NNK) 3. Detoksikaciju aflatoksina ~ Aflatoxin B1 je hepatokancerogen nađen na žitaricama, kikirikiju, bademima, lješnjacima zagađenim gljivicom Aspergillus flavus. Metabolički se aktivira sa CYP3A4 do aflatoxin B1-8,9-epoxida (kancerogen).

Flavin monooksigenaze (FMO) -

Prvi put izolovana i prečišćena iz jetrenih mikrozoma (1971.) Oksigenacija na N ili S u molekuli ksenobiotika Flavoprotein (jedna molekula FAD), koristi NADPH FMO i CYP imaju sličnu specifičnost za supstrate, ali obično produkuju različite metabolite sa potencijalno značajnim toksikološkim/farmakološkim posljedicama FMO obično rezultira sa metabolitima koji imaju smanjenu toxikološku i farmakološku aktivnost

Katalitički ciklus FMO:

21

· · · ·

Prvo, FAD se redukuje (-2e) sa NADPH. Redukovani flavin brzo reaguje sa molekularnim O2 stvarajući peroksiflavin i u ovom stabilnom obliku FMO može da dominira u ćeliji čekajući na odgovarajući nukleofil sa kojim će reagovati. Ovaj nukleofilni napad supstrata (S) na FADOOH rezultira u transferu 1 atoma molekularnog oksigena na supstrat i od 1 atoma se formira voda. Supstrat nije potreba za aktivaciju kiseonika (razlika od CYP)

FMO supstrati:  Primarni amini: amfetamin, tiramin.  Sekundarni amini: N-deacetil ketokonazol, dezipramin, efedrin, metamfetamin, nortriptilin, propranolol.  Tercijarni amini: amitriptilin, benzamfetamin, hlorimipramin, klozapin, etilmorfin, flufenazin.  Lidokain  Nikotin  Hidrazini: N-aminomorfolin FMO izoenzimi- 5 familija humane FMO, svaka po 1 član (FMO1-FMO5)  FMO1 – ima najširu specifičnost za supstrate; glavna forma u jetri fetusa, te bubrezima i crijevima odraslih ljudi.  FMO2 - je više specifična za supstrate, dok je FMO3 negdje između.  FMO3 - je glavna forma u jetri odraslih ljudi.  FMO4 i FMO5 - vjerovatno ne učestvuju značajno u metabolizmu lijekova kod ljudi.  FMO1 i FMO3 inaktivišu se na temp. 45-50oC (5 min), kao i niskim koncentracijama anjonskih deterdženata. FMO2 je relativno stabilna pri ovim uslovima , posebno uz prisustvo NADPH. 22

FMO genetske varijante i polimorfizam Polimorfizam humane FMO3 reziltira u abnormalnom metabolizmu trimetilamina (TMA): trimetilaminurija (TAMU). ·

Kod zdravih ljudi: TMA → TMA N-oksid (bez mirisa, polaran)

·

Kod TAMU pacijenata – izlučuje se TMA (Sindrom ''ribljeg mirisa'') – rijedak poremećaj

Ljudi homozigotni za pojedine FMO3 alelske varijante (npr. nul varijante) takođe rezultiraju u peremećenom metabolizmu prema drugim FMO supstratima (ranitidin, nikotin, derivati fenotiazina).

Aminooksidaze (AO) R-CH2NH2 + O2 + H2O

R-CHO + NH3 + H2O2

Aldehid reduktaza aldehid OH (oxidaza)

R-CH2OH

R-COOH

Produkti reakcije (aldehid, peroxid, amonijak) su potencijalno toxični. 1. AO koje sadrže FAD 

Monoaminooxidaze (MAO) – MAO-A I MAO-B - Smještene u membrani mitohondrija - Uloga u metabolizmu neurotransmitera (NA) i drugih bioloških amina (tiramin, adrenalin) - Senzitivne na inhibiciju sa acetil-amin derivatima (klorgilin, selegilin i paragilin) - Ne inhibišu se sa semikarbazidom -

MAO-inhibitori – među prvi otkrivenim antidepresantima MAO-A katalizuje oksidaciju 5HT (serotonina), MAO-B benzilamina i 2-feniletilenamina Dvije izoforme nisu jednako distribuirane u humanom mozgu, glavna forma u bazalnom ganglionu je MAO-B Funkcije:  U perifernim tkivima (crijeva, jetra, pluća i placenta) – štiti organizam oksidirajući amine iz krvi. MAO-B metabolička barijera u BBB.  U CNS i PNS – intraneuralni izoenzimi MAO-A i MAO-B - Štite neurone od egzogenih amina - Zaustavljaju djelovanje amina neurotransmitera - Regulišu sadržaj intracelularnih rezervi amina. 23



Poliamin-oxidaze (PAO) - Koriste sekundarne amine spermin i spermidin kao svoje preferirane supstrate - Vjerovatno regulišu rast ćelija

2. AO koje sadrže TPQ ili semikarbazid – senzitivne aminooksidaze (SSAO) · · · 



· ·

sadrže Cu sadrže kofaktor koji ima jednu ili više karbonil grupa, najčešće topaquinon (TPQ) Inhibišu se sa karbonil- reaktivnim supstancama (semikarbazid) Diaminooksidaze (DAO) - Preferira diamine putrascin i kadaverin kao supstrate - Intracelularni enzim (placenta, bubrezi, crijeva) - Oksidira i histamin – važna u regulaciji inflamacije i alergijskih reakcija Lizil oksidaze i ostale SSAO - Uglavnom rastvorljive i prisutne na ćelijskoj površini - Različiti preferirani supstrati - Nisu senzitivne ili su samo slabo senzitivne na klasične MAO inhibitore (hlorgilin ili deprenil). Izonijazid (antibiotik), hidralazin (antihipertenziv), meksiletin (antiaritmik) inhibišu SSAO; biološki efekti ove inhibicije nisu još definisani Pored uloge u katabolizmu biogenih amina, sugerisane su i nove funkcije:  U metabolizmu glukoze (krajnji produkti SSAO)  SSAO-ovisno formiranje Schiff-ovih baza u kretanju leukocita

Ove dvije drupe AO se razlikuju po njihovim kofaktorima, subcelularnoj distribuciji, supstratima, inhibitorima, biološkim funkcijama. MPTP (1-metil-4-fenil-1,2,3,6-tetrahidropiridin) - Supstanca koja je greškom proizvedena u toku proizvodnje droge MPPP (derivat heroina) 1976. - Injekcija MPTP – simptomi akutne Parkinsonove bolesti. - MPTP inhibira tirozin-hidroksilaciju, esencijalnu za formiranje dopamina. Izaziva Parkinsonovu bolest usljed smanjenja nivoa dopamina. - MPTP se prvo metabolizira do toxičnog MPP+ pod djelovanjem MAOB - MAOB inhibitori sprečavaju ovu biotransformaciju.

Molibden hidroksilaze (MoH) 24

-

-

Citozolni enzimi Kompleksni flavoproteini, koji se sastoje od dvije identične subjedinice (MT 145000) Svaka subjedinica sadrži Mo, FDA i 2 redoks centra sa Fe/S kao rezervoarem elektrona. Nađene u mnogim vrstama uključujući ribe i insekte. Nalaze se u mnogim tkivima:  AlO – pluća, jetra, testisi  KsO – jetra, crijeva, ezofagus, uterus Reaguju sa velikim brojem lijekova, ksenobiotika i endogenih supstanci.

 Aldehid oksidaza (AlO)  Ksantin oksidaza (KsO) · Obje koriste O2 kao oksidirajući supstrat  Ksantin dehidrogenaza (KDH) · Drugi funkcionalni oklik KsO, kodirana istim genom Oxidativna fosforilacija katalizirana sa MoH: RH + H2O → ROH + 2H+ + 2eAlO : metotreksat, ciklofosfamid; endogeni – retinaldehid, N-metilnikotinamid KsO: katabolizam purina; oksidacija hipoksantina do ksantina. Reakcije katalizovane sa MoH:  Oksidacija - Nenaelektrisanih N-heterociklusa - Aldehida  Redukcija - Nitroredukcija - Nitrata sa KsO - Oksima - Azo boja (u hrani, kancerogeni) - N-funkcionalnih grupa - Sulfoksida - Reduktivna dehalogenacija Individualne razlike kod MoH - 1% populacije afro-amerikanaca (muškarci) ima vrlo nisku KsO aktivnost. Nedostatak Kso je rijedak autosomalni recesivni poremećaj poznat kao nasljedna ksantinurija. · Tip 1 : nedostaje KsO · Tip 2 : nedostaju obje KsO i AlO - Zaleplon (sedativ hipnotik) metaboliše se sa AlO i CYP450; metabolizam varira od nivoa AlO 25

Lipoksigenaze (LO) -

Non-hemo proteini sa Fe; prisutni u citozolu Inkorporira oba atoma kiseonika (O2) u arahidonsku kiselinu LO katalizuju oksigenaciju nezasićenih masnih kiselina

-

Indikacije da učestvuju u metabolizmu industrijskih hemikalija, pesticida, nekih lijekova (aminopirin, promazin, diltiazem, fenitoin), ali su potrebne dodatne studije da jasno ustanove ulogu LO u oksidaciji ksenobiotika.

2. REDUKCIJA -

Manje česta reakcija BT Dodatak hidrogena ili oduzimanje kiseonika Redukcija nitro, nitrozo i azo grupe: Azo (-N=N-) ili nitro grupa (-NO2) → amini (-NH2) (npr. Nitrazepam)

-

Uključuje citohrom P450 sistem

3. HIDROLIZA -

Dodatak vode uz raspad molekule Najčešće se vrši u jetri (esteraze) ili plazmi (esteraze, peptidaze) Čest put BT lijekova za estere i amide: ~ Esteri → alkohol + kiselina (npr. aspirin u salicilnu kiselinu) ~ Amidi → amini + kiselina (npr. prokainamid)

Lokacije metaboličkih enzima i procesa u ćelijama (FAZA I) 1. Oksidacija  Citohrom P450 (mikrozomi)  ADH (citozol)  ALDH (mitohondrije)  Aldehid oksidaza (citozol)  Ksantin oksidaza (citozol)  MAO (mitohondrije)  DAO (citozol)  Prostaglandin H sintaza (mikrozomi)  FMO (mikrozomi) 2. Redukcija  Azo i nitro redukcija (mikroflora, mikrozomi, citozol)  Karbonil (citozol)  Redukcija kinina (citozol, mikrozomi)  Reduktivna dehalogenacija (mikrozomi) 3. Hidroliza  Karboksil esteraza (mikrozomi, citozol) 26

 Peptidaza (krv, lizozomi)  Epoksid hidrolaza (mikrozomi, citozol)

II faza BT lijekova Epoksidacija - Lijekovi, npr. karbamazepin i mnogi kancerogeni se biotransformišu uz citohrom P450 u toxične epoksidne derivate. - Rezulatat oksidativne biotransformacije (faza I) mnogih aromatskih i alkanskih supstanci. - Epoksidi su organske supstance koji imaju 3-atomski ciklični eterski prsten u svojoj strukturi (oksiranski prsten – koji je vrlo reaktivan)

1. Hidratacija epoksida -

Detoksikacija epoksida → dihidrodiol derivat Katalizovana sa enzimom - epoksid hidrolaza ER svih tkiva, u blizini CYP Mnogo izoenzima – mikrozomski i citoplazmatski oblik nađen u jetri i drugim tkivima Detoksicirajući enzim – hidrolizuje visoko reaktivne aren okside u inaktivne u vodi rastvorljive trans dihidrodiol metabolite

2. Glukuronidacija -

Konjugacija sa glukuronskom kiselinom Jedna od najvažnijih reakcija faze II BT (npr. alifatski alkoholi, fenoli, morfin) Važni fiziološki efekti u neutralizaciji reaktivnih intermedijera proizvedenih od strane CYP450 enzima Uridin difosfat – glukuronska kiselina (UDPGK) – je oblik koji reaguje sa ksenobioticima uz djelovanje enzima UDP glukuronozil-transferaza (UGT) UDPGK + Benzoična kiselina → Benzoil-glukuronid + UDP

Produkti reakcije glukuronidacije - Rezultirajući glukuronidi sadrže D-glukopiranurozil radikal povezan sa – OR, -SR, -NR'R'' ili –CR. - Nakon reakcije glukuronidacije formiraju se: · O-glukuronid eteri – od supstrata kao što su alifatski alkoholi i fenoli · O-glukuronid esteri od supstrata kao što su karbonilne kiseline · Ovo su najčešći glukuronidi - Glukuronidacija primarnih, sekundarnih aromatskih i alifatskih amina, kao i tercijarnih amina vodi ka formiranju N-glukuronida. 27

-

Prisustvo sulfidril funkcionalne grupe rezultira u stvaranju Sglukuronida. Karbonil grupe – C-glukuronida.

Bioaktivacija glukuronida - Generalno, glukuronidi su biološki i hemijski manje aktivni od ishodišnih molekula. - Neki glukuronski konjugati su aktivniji  Npr. glukuronidacija morfina :  Morfin-3-O-glukuronid – primarni metabolit (20x veća koncentracija u krvi od morfina) – antagonist morfina  Morfin-6-O-glukuronid – 2x veća koncentracija u krvi od morfina – agonist opijatnih receptora – 650x jače analgetsko djelovanje od morfina – može prolaziti kroz KMB Toksičnost glukuronida  Hepatotoksičnost  Kancerogeneza (O-glukuronidi N-hidroksilarilamina) Metabolizam propranolola kod ljudi (sekvencijalni metabolizam): SEKVENCIJALNI METABOLIZAM – je metabolizam koji se odvija u sekvencama (fazama), srepeničasto – jedna faza ide nakon druge i nema preskakanja faza.

UDP-glukuronozil transferaza (UGT) 28

-

Ključni enzim u detoksikaciji mnogih kseno- (lijekovi, pesticidi, karcinogeni) i endobiotika (bilirubin, žučne kiseline, steroidi) u hidrofilne glukuronide (ekskrecija u žuči i urinu). - UGT katalizirane reakcije glukuronidacije su odgovorne za oko 35% svih lijekova metaboliziranih enzimima faze 2. Lokacija: - Najviše su prisutni u jetri ali su nađeni i u: tankom crijevu, plućima, koži, nadbubrežnim žlijezdama, slezeni. - Vezani su za unutrašnju membranu ER Endogeni UGT supstrati:  Bilirubin  Steroidni hormoni  Tiroidni hormoni  Žučne kiseline  Vitamini rastvorljivi u mastima Inhibicija UGT  Imunosupresivi – posebno jaki  NSAID  Benzodiazepini  Triciklični antidepresivi  Valproična kiselina  Probenecid Indukcija UGT - Mnogi lijekovi koji indukuju UGT enzime, također ↑ ekspresiju drugih enzima koji metaboliziraju lijekove kao što je CYP:  Rifampicin  Fenobarbital  Fenitoin  Karbamazepin Transport i metabolizam bilirubina u jetri ~ Bilirubin se veže u krvi za albumin i dospijeva u jetru, gdje se veže za glukuronsku kiselinu uz djelovanje UGT. U ovom obliku bilirubin je rastvorljiv i izlučuje se putem žuči u tanko crijevo.  Superfamilija UGT gena kod sisara ima 117 članova, koji se dijele u 4 familije: UGT1, 2, 3, 8.  Humana UGT superfamilija se sastoji od dvoje familije: UGT1 i UGT2 , 3 subfamilije 1A (9 funkcionalnih proteina), 2A (1 funk. prot.) i 2B (7 funk. prot.) Relativno učešće humanih jetrenih UGT izoenzima u glukuronidaciji lijekova:

29

UGT -

probni supstrati: UGT1A1 - Bilirubin UGT1A4 - Amitriptilin UGT1A6 - Serotonin UGT1A9 - Propofol UGT2B7 - Morfin, karbamazepin

Genetski polimorfizam UGT: - Genetski polimorfizam uzrokuje različite fenotipove djelujući na aktivnost ili nivo ekspresije pojedinačnih UGT. - Ove međusobne varijacije na nivou UGT djeluju na endogeni metabolizam i dovode do žutice i drugih bolesti. - Poremećena glukuronidacija ksenobiotika ima važan farmakološki efekat, koji može potencirati nus-pojave terapije ili izazvati kancer. - Genetske varijacije i SNP su vrlo česti - Opisan za 6 humanih UGT gena: UGT1A1, 1A6, 1A7, 2B4, 2B7, 2B15. - Funkcionalni značaj polimorfizma sigurno dokazan za UGT1A1

UGT1A1 -

-

Odgovoran za homeostazu bilirubina Glukuronidacija mnogih ksenobiotika UGT1A128 – Čest GP vodi ka ↓ expresiji enzima i povezan je sa:  Gilbertovim sindromom:  7-19% bijele populacije  Blaga forma hiperbilirubinemije (nekonjugovani), bez vidljivih patoloških posljedica  Pogoršava se usljed stresa i infekcije  Smanjenom eliminacijom  SN-38 (aktivni metabolit irinotekana) – toksičnost lijeka  Acetaminofena  Lorazepama Crigler-Najjar tip I i II sindrom – GP koji uzrokuje rijetku (~1%), ali tešku hiperbilirubinemiju, žuticu i oštećenje mozga.

30

Polimorfizam UGT1A1 koji utiče na terapiju sa lijekovima protiv kancera Irinotekan se metabolizira preko CYP3A do inaktivnog metabolita ili preko karboksiesteraze (CE) koja daje aktivni metabolit SN-38. UGT1A1 zatim inaktivira SN-38; Ekspresija proteina varira – 17-52x međusobne varijacije u brzini SN-38 glukuronidacije. Niska UGT1A1 aktivnost → akumulacija SN-38

UGT2B7 -

Glavni enzim odgovoran za glukuronidaciju morfina do morfin-3-Oglukuronida i morfin-6-O-glukuronida. UGT2B72 – GP kod ~1/3 bijele populacije (homozigoti)

3. Sulfatacija (sulfonacija) -

Konjugacija sa sulfatima

-

Generalno, proces detoksikacije u organizmu, nastaju esteri sulfatne kiseline – hidrofilni metaboliti Bioaktivacija: Minoksidil (stimulans rasta kose), Holecistokinin (CCK) (neuroendokrini peptid) Sulfatacija nekih supstanci može da proizvede elektrofilne metabolite, koji se onda kovalentno vežu za ćelijske makromolekule, DNK i RNK  mutagenost i kancerogenost ksenobiotika, npr: Hodroksi-metilnih policikličnih aromatskih hidrokarbona N-hidroksilarilamina (kao i kod glukuronidacije)

-

-

Fenoli, alkoholi i hidroksilamini su podložni reakciji katalizovanoj sa sulfotransferazama Acetaminofen, salicilamid, metil-dopa, etanol i mnogi steroidni hormoni Sulfatacija i glukuronidacija su procesi konjugacije koji se odvijaju jedan pored drugog i često se takmiče za iste supstrate (npr. acetaminofen). 31

Rakcije sulfatacije – mehanizam : ATP + SO42- → Adenozin-5'-Fosfosulfat (APS) + PP (enzim – sulfurilaza) APS + ATP → 3'-Fosfoadenozin-5'-fosfosulfat (PAPS) + ADP (enzim – APS kinaza) PAPS + ROH → RO-SO3H + 3'-Fosfoadenozin-5'-fosfat (PAP) (enzim – SULT) -

Dakle PAPS se stvara iz ATP i anorganskog sulfata.

Metabolizam acetaminofena (paracetamola) 90% konjugiran sa glukuronskom i

32

sulfatnom, 5% metabolizam sam CYP... ekskrecija urinom + 5% nepromijenjen.

Sulfotransferaze (SULT) -

Kataliziraju transfer sulfonatne grupe sa 3'-Fosfoadenozin-5'fosfosulfat (PAPS) na supstrat. Citozolni enzimi nađeni u mnogim tkivima – jetra, bubrezi, crijevo i leukociti Važno mjesto sulfonacije, posebno nakon oralne primjene, su crijeva. Kompeticija za intestinalnu sulfataciju između istovremeno primjenjenih lijekova može uticati na njihovu bioraspoloživost i terapeutski efekt  Npr. acetaminofen i oralni kontreceptiv etinilestradiol Visoko prisutni u fetusu – možda glavni detoksicirajući enzimatski sistem u razvoju čovjeka Stepen sulfatacije ovisi o dobi – s godinama se ↓

2 glavne klase sulfotransferaza:  Vezane za membrane u Golđi aparatu  metabolizam endogenih supstanci (glukozaminoglikana, glukoproteina, peptida (CCK)  ne metabolišu ksenobiotike  Prisutne u citoplazmi  metabolišu ksenobiotike 33

 

neke endogene supstance (steroidi, žučne kiseline, neurotransmiteri) ova klasa klasa je označena kao SULT

Čovjek ima barem 13 SULT izoenzima, koji se značajno razlikuju po: distribuciji između tkiva i specifičnosti prema supstratima.  SULT1 – sulfoniraju jednostavne fenole, estradiol i tiroidne hormone, kao i ksenobiotike iz okoline  SULT2 – kataliziraju sulfataciju hidroksil grupa steroida (androsteron, alopregnanolon i dehidro-epi-androsteron (DHEA))  SULT4 – primarno prisutni u mozgu !!!; aktivnost i funkcija nisu još određene  SULT6 – prisutan u testisima primata; aktivnost i funkcija nisu još određene Lokacija humanih SULT  Samo su SULT1A1 i SULT1A3 nađeni u više različitih tkiva  SULT1A1: najviše u jetri  SULT1A3: najviše u crijevima, značajna u mnogim u mnogim drugim tkivima i samo malo u jetri  SULT4A1 – mozak  Expresija nekih izoenzima (SULT2A1) se mijenja sa starošću  Citoplazma SULT supstrati:  Benzil alkoholi – SULT1A1  Sekundarni nitroalkani (2-nitropropan) – SULT1A1  Aromatski hidroksilamini – SULT1A1, SULT1A2  Alil alkoholi (hidroksi-tamoksifen) – SULT 2A1  Benzil aldehidi i ketoni – 1-formilpiren (SULT2A1), 1-acetilpiren (SULT1E1) Metaboliti navedenih supstanci su pokazali genotoksičnost. Genetski polimorfizam SULT -

Značajna interindividualna razlika u SULT aktivnosti kod humane populacije (5-36%) SNP primjećen kod svih SULT gena Važan u predviđanju individualnog odgovora na ksenobiotike Npr. uticaj SULT1A1 genotipa (Arg213His polimorfizam) na podložnost kolorektalnom kanceru i kanceru dojke i pluća

SULT enantioselektivnost  SULT1E1  SULT2A1 34



Pokazuju 160x veću selektivnost i preferencu za (-) enantiomer i 15x za (+) enantiomer 1-(α-hidroksietil) pirena.



Poznate kristalne strukture mnogih SULT enzima.



SULT1A3 – stereoselektivnost u sulfataciji fenolnih fenetanolamina.

-

Glutation – je endogeni tripeptid – lanac od 3 aminokiseline – glicin, cistein i glutaminska kiselina. Glutation postoji u redukovanom (GSH) i oksidovanom (GSSG-disulfid) obliku.

4. Konjugacija sa glutationom

-

Primjer ksenobiotika – etakrinska kiselina i bromobenzen

Glutation-S-transferaza (GST) -

Katalizira konjugaciju glutationa (GSH) sa različitim endogenim i egzogenim elaktrofilnim supstancama.

-

2 glavne familije:  Mikrozomalne GST (vezane za membrane) – u metabolizmu leukotrijena i prostaglandina  Citozolne GST (rastvorljive) – 8 familija ili klasa; metabolizam ksenobiotika

-

Humane citozolne GST - 8 klasa : alfa, mu, omega, pi, teta, zeta, sigma i kapa; 16 članova  Pi i mu klasa reguliše MAPK signal koji učestvuje u ćelijskom opstanku i ćelijskoj smrti.  Smatra se da je GST odgovorna za razvoj rezistencije prema hemoterapiji (npr. doksorubicin)  Ekspresija specifičnih GST izoenzima je povećana u različitim tumorima, a može imati ulogu i u etiologiji neurodegenerativnih bolesti, multiploj sklerozi i astmi.

Genetski polimorfizam humane GST - S obzirom da su GST uključene u metabolizam velikog broja kancerogenih supstranci, GP ovih enzima je povezan sa varijacijama u enzimatskoj aktivnosti i time može uticati na koncentraciju aktivirane kancerogene supstance u tijelu - 3 slijedeća GP za GST su do sada dobro dokumentirani: GSTM10 (nuli), T10 (nuli), P1A313G - Rezisrencija na terapiju u liječenju kancera. 35

-

-

Kod premenopauzalnih žena, kombinacija GSTM3B alele sa GSTT100 i GSTP1AA genotipom, izgleda da dovodi do 26x povećanog rizika razvoja kancera dojke, u poređenju sa drugim GST genotipovima Odgovor na terapiju sa hemoterapeutskim agensima:  Pacijenti sa kancerom dojke, koji imaju 2 kopije GSTP1B i/ili GSTP1C, imaju veće šanse preživljavanja nego pacijenti sa dvije kopije GSTP1A i/ili GSTP1D  Vjerovatno zbog:  GSTP1B i/ili GSTP1C alele kodiraju enzime sa smanjenom aktivnošću prema anti-kancer lijekovima  Razlike u interakciji GSTP1 subjedinica sa stres-kinazama

5. Acetilacija -

Transfer acetata sa acetil CoA na funkcionalne grupe primarnih aromatskih amina i hidrazina, sto rezultira u stvaranju acetamida i hidrazida Kataliziran sa NAT

-

Supstance koje podliježu acetilaciji: sulfonamidi,PABA, Izonijazid, Prokainamid, kofein, različiti kancerogeni aromatski amini

-

N-acetilacija prokancerogenih aromatskih amina se obično smatra procesom detoksikacije Ima važnu ulogu i u bioaktivaciji potencijalnih kancerogena (npr. acetilacija hidroksilamina u acetoksi ester – kancerogen).

-

N-acetiltransferaza (NAT) -

Citoplazmatski enzim Katalizira transfer acetata sa acetil CoA na funkcionalne grupe primarnih aromatskih amina i hidrazina NAT acetilira mnoge arilamine i heterociklične amine  duhanski dim, dobro pečeno meso

-

Prvi put identifikovan kao inaktivator izonijazida (tuberkulostatik) – jedan od prvih primjera farmakogenetske varijacije; - Identifikovana u Mycobacterium Tuberculosis – odgovorma za modulaciju odgovora na Izonijazid. Metabolizam arilamina  2 glavna metabolička puta : · Konjugacija uz enzime faze II BT – hidrosolubilni metabolit · Oksidacija (FMO,CYP) – jetre CYP1A2 (glavni)  Nije poznat mehanizam odabira između konjugacije i oksidacije – utiču: 36

· · · -

Selektivnost enzima za specifični arilamin supstrat Koncentracija arilamina Intraćelijska sredina

NAT je također odgovorna za 0-acetilaciju N-hidroksilamina. Učestvuje u detoksikaciji i aktivaciji mnogih lijekova (antibakterijskih) i kancerogena.

Primjeri supstanci koje podliježu acetilaciji:  Sulfonamidi  Izonijazid  Prokainamid  PABA  Kofein  Različiti kancerogeni aromatski amini

-

Do sada identifikovana 2 humana NAT gena, koji kodiraju funkcionalne proteine: NAT1, NAT2. ~ NAT1  Prisutan u većini tkiva i ranoj fazi razvoja (placenta)  Aktivira i deaktivira arilamine i karcinogene  Acetilira specifično p-aminobenzoil glutamat (potencijalni endogeni supstrat)  p-aminosalicilat i PABA – do 20X individualna razlika u brzini acetilacije  Redoks stanja utiču na aktivnost NAT1. Oksidacijom indukovana inaktivacija NAT1 može da utiče na metabolizam mnogih ksenobiotika. ~ NAT2  Prisutan uglavnom u jetri i crijevima (tipično za enzime koji metabolišu lijekove)  Acetilira izonijazid, neke sulfonamide i kancerogene arilamine  Identifikovana 3 izoenzima

37

Genetski polimorfizam NAT -

Obje humane NAT forme su visoko polimorfne, sa >20 alela na svakom lokusu. NAT geni predstavljaju dobro karakterisanu seriju SNP: 26 NAT1 alela, 36 NAT2 alela.

NAT1 - Odnos između genotipa i fenotipa nije još potpuno jasan  ''brze'' (NAT110)  ''spore'' (NAT111 i NAT114) alele - Asociran sa povećanom frekvencijom: · Mnogih kancera · Urođenih defekata (NAT1 i metabolizam folata) NAT2 - Dobro ustanovljen - NAT2 fenotipovi:  Spori  Umjereni  Brzi acetilatori - Dvije alele su asocirane sa brzom acetilacijom (češća kod orijentalaca) - Treća alela povezana sa sporom acetilacijom (50% bjelaca). - Povezan sa kancerogenezom · Mokraćni mjehur · Kolon · Dojka Izonijazid i polimorfna N-acetilacija (NAT2)  Spori: t1/2= 140-200 min · Veća akumulacija u plazmi i veći stepen izlječenja. 38

· ·



Više neželjenih efekata i interakcija a drugim lijekovima Interakcije: Izonijazid inhibira metabolizam fenitoina, što vodi ka akumulaciji visokog i toksičnog nivoa fenitoina. Brzi: t1/2 = 45-80 min · Niži nivoi u plazmi i niži stepen izlječenja. · Oštećenje jetre i hepatitis usljed bržeg stvaranja acetilhidrazida.

Nedavna analizan 7 studija, o povezanosti NAT2 varijanti sa kancerom dojke, je sugerisala da ne postoji direktna veza između NAT2 sporo- ili brzoacetilirajućeg fentipa i rizika kancera dojke. Međutim, pušenje može da modifikuje ovu vezu – može da dođe do razvoja kancera dojke ako dođe do ekspozicije duhanskom dimu.

6. Metilacija -

-

-

Mnogi kseno- i endobiotici se transformišu uz djelovanje enzima metiltransferaza (u citosolu), koje koriste S-adenozilmetionin (SAM) kao donor metil grupe. Transfer metil grupe – na O-, N-, S-nukleofilu – O-, N-, Smetiltransferaze Ključna za biosintezu mnogih supstranci Važna u inaktivaciji mnogih fiziološki aktivnih biogenih amina – neurotransmitera · Norepinefrin, dopamin, serotonin, histamin. Identifikovano oko 100 metiltransferaza Nejvažnija je reakcija O-metilacije.

Metiltransferaze 1. COMT (Katehol O-metiltransferaza) – metilacija fenolnih hidroksilnih grupa u endogenim i egzogenim kateholaminima: dopamin, norepinefrin, epinefrin, L-dopa 2. Histamin N-metiltransferaza (HNMT) – metilacija histamina u jetri 3. Hidroksiindol O-metiltransferaza 4. N-metiltransferaza – metilacija histamina u jetri 5. Feniletanolamin N-metiltransferaza (PNMT)– metilacija noradrenalina u nadbubrežnoj žlijezdi 6. Tiopurin S-metiltransferaza (TPMT) – metilacija derivata purina, npr. 6merkaptopurin i azatioprin 7. Tiol S-metiltransferaza – djeluje na kaptopril i D-penicilamin (ne-purinski agensi)

Katehol O-metiltransferaza (COMT) ·

Katalizira trasfer metil grupe sa SAM na katehol 39

·

Važna uloga u inaktivaciji noradrenalina i dopamina, kao i lijekova (Ldopa, karbidopa, benserazid, izoprenalin, dobutamin).

·

Nađena u mnogim tkivima, sa navećom aktivnošću u jetri, bubrezima i crijevima. 1980 – uvedeni potentni i selektivni COMT inhibitori, koji se koriste u terapiji Parkinsonove bolesti da bi se povećala bioraspoloživost L-dope.

·

2 forme enzim: 1. S-COMT – rastvorljiva forma u citoplazmi  Izolovana iz jetre i humane placente  Prisutna u mnogim tkivima 2. MB-COMT – forma vezana za membrane grubog ER  Najviše zastupljena u mozgu Iako je sekvenca vrlo slična, kinetičke osobine ova dva izoenzima se značajno razlikuju. Genetski polimorfizam COMT -

-

Poznata su 2 polimorfna oblika enzima: 1. Termolabilna forma sa niskom aktivnošću 2. Termostabilna forma sa visokom aktivnošću Ove dvije alele razultiraju: ~ Kod homozigotnih osoba u niskoj ili visokoj aktivnosti COMT ~ Kod heteroziotnih osoba u srednjoj aktivnosti enzima ~ Orijentalci i crnci imaju obično veću COMT aktivnost nego bjelci COMT polimorfizam je nedavno doveden u vezu sa: ~ Neurološkim i psihičkim poremećajima (šizofrenija, agesivnost, drogiranje, bipolarni poremećaji, anksioznost) Rezultati studije: COMT val158/108met polimorfizam utiče na efikasnost procesiranja prefrontalnih kortikalnih informacija – moguć mehanizam kojim je COMT genotip povezan sa psihopatologijom COMT met/met osobe su izložene povećanom riziku neželjenih efekata amfetamina na mozak. ~ Povećanim rizikom kancera dojke

Tiopurin S-metiltransferaza (TPMT) ·

Ima važnu ulogu u inaktivaciji široko korištenih lijekova protiv kancera i i imunosupresiva (6-merkaptopurin (MP), 6-tioguanin (TG) i azatioprin). · Identifikovan u mnogim tkivima. · Endogeni supstrat još nije definisan, tako da je biološka uloga TPMT još nepoznata. Genetski polimorfizam TPMT - Prisutan je kod 10% bjelaca -