Biochimie

UNIVERSITATEA TEHNICĂ A MOLDOVEI FACULTATEA TEHNOOGIE ŞI MANAGEMENT ÎN INDUSTRIA ALIMENTARĂ CATEDRA „ENOLOGIE”

BIOCHIMIE Îndrumar de laborator

Chişinău U.T.M.

2007

2

Îndrumarul este destinat studenţilor anilor 2(U) şi 3(U) a secţiilor de zi şi cu frecvenţă redusă pentru toate specialităţile tehnologice ale facultăţii TMIA care studiază cursul de "Biochimie".

Elaborare: conf.univ., dr. Liudmila Palamarciuc conf.univ., dr. Tatiana Vrabie lector superior Aliona Sclifos Redactor responsabil: prof.univ., dr. Anatol Bălănuţă Recenzent: conf.univ., dr.Rodica Sturza

––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––– Bun de tipar 23.05.07. Formatul 60x841/16 Hîrtie ofset. Tipar RISO Tirajul ex. 200 Coli de tipar 7,25. Comanda nr. 85 U.T.M., 2004, Chişinău, bd.Ştefan cel Mare, 168. Secţia Redactare şi Editare a U.T.M. 2068, Chişinău, str.Studenţilor 9/9

3

© U.T.M., 2007 ORGANIZAREA ŞI METODICA EFECTUARII LUCRĂRILOR DE LABORATOR, REGULILE TEHNICII DE SECURITATE PENTRIU LABORATORUL DE BIOCHIMIE

Înainte de a începe lucrul în laborator trebuie să fie cunoscute regulile generale de lucru, regulile tehnicii securităţii, măsurile de preîntîmpinare şi prevenire a accidentelor. Studentul care răspunde materialul însuşit profesorului este notat într-un registru special. Cei care sînt nepregătiţi pentru efectuarea lucrării practice nu sînt admişi. Regulile generale de efectuare a lucrărilor practice 1. Înainte de a începe lucrarea practică trebuie să fie însuşit materialul teoretic la această lucrare din îndrumarul metodic. Materialul învăţat se expune profesorului, aceasta fiind ca permis la efectuarea lucrării. 2. În procesul lucrării practice trebuie să fie respectate consecutivitatea operaţiilor recomandate de regulile de securitate şi de indicaţia metodică. 3. În timpul lucrului studentul trebuie să fie atent, să păstreze liniştea, să fie punctual. 4. Se interzice ca studentul să lucreze în laborator singur, fără supravegherea profesorului sau a inginerului. 5. Fiecare student trebuie să lucreze la locul stabilit, să folosească aparatele, vesela chimică, reactivele, care sînt pe masă la lucrarea corespunzătoare. Dacă lipseşte un reactiv sau un vas chimic trebuie de adresat la profesor sau inginer. Se interzice de a lua reactive şi vase chimice de pe alte mese de laborator. 6. Pe masa de laborator nu trebuie să fie obiecte ce nu au legătură cu lucrarea practică. După terminarea lucrării, locul de lucrul din laborator trebuie să fie adus în ordine. 4

Tehnica de securitate pentru laboratorul de biochimie şi regulile de folosire a reactivelor chimice 1. Pe parcursul efectuării experienţelor trebuie cu atenţie de folosit vasele chimice, aparatele şi reactivele. 2. Se interzice de lucrat cu vase chimice nespălate sau stricate. 3. Se interzice de lăsat fără supraveghere aparatele în funcţiune. 4. Toate lucrările cu substanţele toxice sau cu miros iritabil trebuie să fie efectuate în nişa de ventilare. 5. În timpul lucrărilor practice legate de substanţe inflamabile (eter, alcool, benzină, benzol, acetonă şi altele) sau explozive trebuie de respectat următoarele reguli: • substanţele date se ţin cît mai departe de foc şi de aparatele de încălzire; • nu se admite păstrarea lor în vase de sticlă subţire şi închise ermetic cu dop; • nu se admite păstrarea reactivelor în cantităţi mari pe masa de laborator; • se interzice de turnat aceşti dizolvanţi aproape de foc sau de încălzit la foc deschis. Se permite de încălzit numai în baia de apă cu răcitor de apă invers; • se interzice de turnat reactivele date în chiuvetă; • dacă au fost vărsate cantităţi mari de substanţe inflamabile trebuie imediat de închis toate robinetele de gaz, de deconectat aparatele electrice, aparatele de încălzit, de deschis toate ferestrele şi de strîns soluţia vărsată cu cîrpa. 6. Vasele cu reactive trebuie de astupat cu dopuri respective. 7. Se interzice de lăsat soluţia în vase fără inscripţii. 8. Pentru a cîntări probe de produs de natură vegetală trebuie de folosit cîntarul tehnic şi nu cel analitic.

5

9. Se interzice categoric de tras cu ajutorul gurii în pipete soluţii care pot provoca arsuri chimice (acizi şi baze alcaline concentrate, reactivele Fehling, amestecul formolic şi altele). 10. În laborator nu se mănîncă nici nu se bea din vesela chimică. 11. În laborator se interzice de fumat, de consumat băuturi alcoolice sau droguri. Primul ajutor în caz de arsuri şi intoxicaţii 1. Dacă arsura provine de la un obiect incandescent sau de la foc leziunea trebuie tratată cu o soluţie de alcool etilic, apoi de uns cu glicerină sau vaselină. Arsurile grave se tratează cu soluţie de permanganat de potasiu sau cu vaselină şi se adresează la medic. 2. Dacă pe suprafaţa pielii au nimerit stropi de lichid agresiv ea trebuie spălată imediat cu apă din robinet, apoi neutralizată: acidul – cu soluţie de sodă calcinată de 3 % sau amoniac, iar baza alcalină – cu soluţie de acid acetic de 2 %. 3. Dacă în ochi au nimerit stropi de acid concentrat, spălaţi imediat cu apă din robinet, apoi cu soluţie de sodă calcinată de 3 %, adreseaţi-va urgent la medic. Dacă au nimerit stropi de bază alcalină se spală cu apă , apoi cu cantităţi mari de soluţie de 0,5 % de acid boric, se adresează urgent la medic . 4. Dacă întîmplător au nimerit reactive în organism se recomandă: în caz de bază alcalină – de băut o cantitate mare de apă, apoi un pahar cu soluţie de 2 % de acid acetic sau citric; în caz de acid – un pahar cu soluţie de 2 % de bicarbonat de sodiu. 5. Dacă s-a produs lezare cu sticlă în primul rînd trebuie de înlăturat cioburile din rană, apoi de dezinfectat cu soluţie alcoolizată de 3 % de iod şi de legat cu pansament steril. Dacă scurgerea e mare, mai sus de rană se aplică un garou, apoi se adresează la medic. 6. Dacă în laborator izbucneşte incendiu, trebuie închise imediat robinetele de gaz şi de lichidat focarul incendiului cu nisip 6

sau stingător de bioxid de carbon. Dacă s-a aprins haina – stingerea se face cu o plapumă de lînă.

7

Lucrarea de laborator nr. 1 Determinarea azotului total în produse vegetale (după metoda Kjeldahl) Importanţa analizei Această metodă este utilizată pentru determinarea azotului aminic, amidic, peptidic şi a amoniacului liber. În materia vegetală (cu excepţia pomuşoarelor şi strugurilor) masa principală de substanţe azotoase este reprezentată de proteine. Protidele şi proprietăţile lor Protidele sînt substanţe formate din aminoacizi, ele au o importanţă primordială (grec. ’protos’- primul) pentru organismele vii. Protidele se găsesc în toate organismele vegetale şi animale. În regnul animal protidele sînt substanţe predominante 65-70 %, în plante 2-35 % din masa uscată. Necesitatea fiziologică a omului este de 100 grame pe zi. Compoziţia elementară a proteinelor: C - 50,6 - 54,5 %; O - 21,5 - 23,5 %; N - 15,0 - 17,6 %; H - 6,5 - 7,3 %; S - 0,3 - 2,5 %; Numeroase proteine mai conţin în cantităţi mici şi alte elemente: P, Fe, Mg, Cu, Mn etc. Reieşind din conţinutul azotului N în proteină (16 % în mediu) se poate determina indirect cantitatea de proteină brută din materialul cercetat, utilizînd formula: Proteina brută = N x 100/16 = N x 6,25 În organismele vii proteinele exercită funcţiile de cataliză, structură, transport, apărare, depozitare, recepţie şi de reglare a activităţii genomului, efectuează mişcările şi reprezintă o mare parte de hormoni. Pentru proteine se deosebesc patru niveluri de organizare intramoleculară: structura primară, secundară, terţiară şi cuaternară. 8

Proteinele formează aceste structuri datorită celor cinci tipuri de legături dintre aminoacizi: peptidice, covalente disulfidice, ionice, de hidrogen şi hidrofobe. Proteinele au proprietăţi amfotere, fiindcă conţin grupări acide şi bazice. Proteinele uşor denaturează, ca rezultat îşi schimbă proprietăţile biologice şi fizico-chimice. Sub acţiunea enzimelor, bazelor şi acizilor proteinele se descompun formînd produse intermediare (peptone, polipeptide) şi la ultima fază a hidrolizei –aminoacizi. Clasificarea proteinelor simple şi conjugate Toate proteinele se împart în două grupe mari: proteine simple (proteine), în compoziţia cărora intră numai resturi de aminoacizi şi proteine conjugate (proteide), care reprezintă o combinaţie dintre o proteină simplă cu un compus de natură neproteică, denumit gruparea prostetică. Proteinele simple În funcţie de solubilitatea şi proprietăţile fizice proteinele simple se divizează în următoarele grupe: albumine, globuline, prolamine, protamine, histone, gluteline, scleroproteine sau proteinoide. Albuminele sînt proteine solubile în apă. Au masa moleculară relativ mică – de la 10 mii pînă la 100 mii unităţi. Sînt foarte răspîndite în natură: ovalbumina din albuşul de ou, leucozina din grîu, legumelina din mazăre, lactalbumina din lapte, etc. Globulinele sînt proteine insolubile în apă, dar solubile în soluţii de săruri ale metalelor uşoare (5-10 % NaCl sau Na2SO4). Au o masă moleculară mare 100 000 – 1 000 000. Sînt foarte răspîndite în natură: lactoglobulina din lapte, miozina din muşchi, legumina din mazăre, fasolina din fasole albe etc. Prolaminele (sau gliadinele) sînt proteinele greu solubile în apă şi în alcool absolut, dar solubile în alcool de 60-80 %. Ele conţin multă prolină. Se găsesc mai ales în plante, în seminţele cerealelor: gliadina din boabele de grîu şi secară, zeina din boabele de porumb. Protaminele sînt proteine, soluţiile cărora au un caracter bazic puternic, sînt uşor solubile în soluţii diluate de acizi, masa 9

moleculară este joasă (pînă la 12 000). Nu conţin sulf, se găsesc în cantităţi mari în nucleul celular şi sperma peştilor: clupeina din scrumbie, sturina din nisetru. Histonele – proteine nucleare cu un caracter slab bazic, solubile în soluţii diluate de acizi. Intră in componenţa proteidelor cromozomilor, eritrocitelor , leucocitelor, celulelor timusului. Glutelinele sînt proteine cu un caracter slab acid, solubile în baze diluate. Sînt bogate în acid glutamic, au proprietăţi mucilaginoase, ca şi prolaminele se găsesc în seminţe de cereale (gluteina din boabele de grîu, orizenina din boabele de orez). Amestecul format din gluteina şi gliadina care se izolează din făina de grîu poartă denumirea de gluten. Proteinele din gluten prin punţile lor -S-S- conferă făinii de grîu proprietatea de a forma cu apa un aluat elastic, care reţine într-un mod caracteristic dioxidul de carbon eliberat în timpul fermentării, dînd pîinii o structură poroasă şi un volum corespunzător. Scleroproteinele – proteine insolubile (fibrilare). Conţin o cantitate mare de glicină şi cisteină. Reprezentanţii tipici sînt colagenul din ţesutul conjunctiv, elastinele din arterii şi tendoane , cheratinele din păr, coarne, copite, piele, lînă, unghii. Proteine conjugate (proteide) Proteidele în funcţie de gruparea prostetică se clasifică în subgrupe: 1. Fosfoproteidele sînt un grup mic de proteine care conţin acid fosforic. Au caracter acid, sînt solubile în soluţii alcaline, se conţin în lapte (cazeina), în gălbenuşul de ou (vitelina). Unele enzime sînt fosfoproteide: pepsina, fosforilaza, fosfoglucomutaza, fosfotriozoizomeraza etc. În plante fosfoproteidele au fost identificate în polenul de porumb. 2. Cromoproteidele au o grupare prostetică colorată şi în general sînt biocatalizatori ai fotosintezei şi ale altor reacţii de oxidoreducere. Ca grupare prostetică pot servi derivaţi ai porfirinei (clorofila, hem), izoaloxazinei, carotinei. Clorofila intră în componenţa cloroglobinei, hemul împreună cu globina 10

formează hemoglobina, izoaloxazina este gruparea prostetică a flavinproteidelor (dehidrogenazelor aerobe), derivaţii carotinei formează rodopsina din retina ochiului. 3. Glicoproteidele au gruparea prostetică de natură glucidică. În majoritatea cazurilor, gruparea prostetică este reprezentată de mucopoliglucide, care prin hidroliză dau manoza, galactoza, hexozaminele, acizii glucuronic, acetic şi sulfuric. Cele mai importante glicoproteide sînt mucinele în secreţia mucoaselor (protejează mucoasele tractului gastrointestinal) şi mucoidele (intră în constituţia cartilagiilor, oaselor, tendoanelor şi ligamentelor). Avidina este o glicoproteidă din albuşul de ou crud, care inhibă activitatea biotinei. În seminţe şi alte organe vegetale se găsesc glicoproteide care produc aglutinarea eritrocitelor, ele se numesc lectine. Cantităţi mai mari de lectine se găsesc în leguminoase. 4. Lipoproteidele au în componenţa lor lipide: colesterol, fosfolipide, acilgliceroli. Lipoproteidele au o largă distribuţie, fiind componente structurale ale biomembranelor. În cantităţi mari se găsesc în ţesutul nervos, plasma sîngelui, lapte, gălbenuş de ou. Ele ajută la transportul unor substanţe liposolubile (vitamine, hormoni, carotinoide, diverse medicamente). 5. Metaloproteidele conţin un metal (Fe, Cu, Mg, Zn, Mn, Co etc.) fixat prin legături complexe direct de componenţa proteică. Grupările proteinei care fixează metalul poartă denumirea de liganzi. Unele metaloproteide sînt enzime (polifenoloxidaza, alcooldehidrogenaza), altele îndeplinesc funcţia de proteine transportatoare de metal (transferina) şi rezerva de metal (feritina). Ele participă la diverse procese metabolice: fotosinteza, respiraţia, transportul de O2 şi electroni. 6. Nucleoproteidele sînt constituite din acid nucleic şi proteină, au o masă moleculară mare (de la cîteva mii pînă la 11

__

sute de milioane). Cromozomii, ribozomii, viruşii sînt particule nucleoproteice. Principiul metodei Produsul vegetal, care conţine substanţe azotoase, se mineralizează prin ardere în acid sulfuric concentrat. Ca catalizator, în dependenţă de substanţă care se arde, se foloseşte sulfat de cupru sau peroxid de hidrogen, mercur, permanganat de potasiu, selen etc. Pentru a ridica temperatura de fierbere a acidului sulfuric se folosesc cristale de sulfat de sodiu sau potasiu. În procesul de mineralizare se formează amoniac, care se uneşte apoi cu acidul sulfuric, formînd sulfat de amoniu: __ __ R CH COOH + H2SO4 CO2 + H2O + SO2 + (NH4)2SO4 NH2 Arderea produsului analizat se efectuează în balonul Kjeldahl. După mineralizarea totală soluţia răcită se dozează cu o cantitate mare de hidroxid de sodiu, iar amoniacul eliminat se distilează şi se reţine cu soluţie diluată de acid sulfuric. Cantitatea de acid sulfuric legat se recalculează în amoniu, apoi în azot, care se exprimă în procente în raport cu masa produsului analizat. Pentru a calcula cantitatea de azot în substanţa proteică rezultatul se înmulţeşte cu coeficientul corespunzător. Pentru majoritatea proteinelor se foloseşte coeficientul 6,25 din considerarea că cantitatea de azot este în medie 16 %. Pentru proteinele din cereale coeficientul este egal cu 5,71 din cauză că cantitatea de azot este în medie 17,5 %.

Aparate, vase şi materiale:  aparat pentru ardere;  aparatul Kjeldahl;  2 baloane Kjeldahl;  2 pipete gradate de 5 cm3 şi pipeta Mor de 10 cm3;  2 baloane conice de 250 cm3; 12

 cilindru de 10 cm3;  H2SO4 concentrat;  sulfat de cupru (cristale), CuSO4;  sulfat de natriu sau potasiu (Na2SO4 sau K2SO4);  soluţie de 0,02n H2SO4;  soluţie de 0,02n NaOH;  soluţie de 33 % NaOH;  indicator mixt (metilrot-metilen albastru): 0,2 g metilrot şi 0,012 g metilen albastru se dizolvă în 60 cm3 alcool şi cu apă se aduce pînă la 100 cm3. Ordinea îndeplinirii lucrării Aparatul Kjeldahl (fig. 1) este constituit din vaporizator (1), umplut cu apă distilată cu ajutorul pîlniei (2). Balonul Kjeldahl (6) este unit cu vaporizatorul printr-un tub (3) înzestrat cu o pîlnie (4) cu clemă (5) pentru dozarea soluţiei de 33 % NaOH şi este unit cu răcitorul (7) prin captatorul de picături (8). Alonjul răcitorului (10) este unit cu un balon conic (de recepţie) de 250 cm3 (9).

13

Figura 1. Aparatul Kjeldahl Metoda determinării azotului total în produse lichide În două baloane Kjeldahl se măsoară cu pipeta gradată cîte 5 cm3 soluţie pentru analiză (vin, suc etc.). Baloanele se încălzesc la aparatul de ardere şi se fierb pînă cînd volumul soluţiei ajunge la 1-1,5 cm3 (nu se admite prinderea de fund). Apoi în fiecare balon după răcire, se dozează cu cilindrul 3 cm3 de H2SO 4 concentrat, aproximativ 50 mg de CuSO4 şi 0,5 g de Na2SO4, balonul se închide liber cu dop de sticlă şi se pune la ardere în nişa de ventilare. Arderea probei se face pînă cînd soluţia din balon devine incoloră şi nu conţine resturi carbonizate de substanţă. Se pregăteşte aparatul Kjeldahl pentru distilare. Apa din vaporizatorul (1) se fierbe. Balonul Kjeldahl (6) cu proba neutralizată şi răcită se uneşte la aparat. În balonul conic (de recepţie) de 250 cm3 (9) se dozează cu pipeta Mor 10 cm3 soluţie 0,02n de H2SO4 şi balonul se instalează sub răcitorul (7) astfel, încît capătul alonjului (10) să fie de 2-3 mm în soluţie. În balonul Kjeldahl prin pîlnia (4) se dozează 15 cm3 de apă distilată, apoi cu cilindrul soluţie 33 % de NaOH din raportul (la fiecare 1 cm3 H2SO4 concentrat luat la ardere se adaugă cîte 5 cm3 soluţie 33 % de NaOH). Se închide repede clema (5) la pîlnia (4) şi se începe procesul de distilare a amoniacului, care decurge 15 min. În ultimele 5 minute alonjul răcitorului nu trebuie să fie în soluţia de acid. După distilare alonjul se spală cu o cantitate mică de apă distilată. La soluţia obţinută din balonul conic de 250 cm3 se dozează 4-6 picături de indicator mixt şi surplusul de acid se titrează cu soluţie 0,02 n de NaOH din biuretă. Paralel se pune proba de control, pentru care în balonul Kjeldahl în loc de vin se ia apă distilată şi se repetă aceleaşi operaţii descrise mai sus. 14

La recalcularea cantităţii de azot total se ia în considerare că 1 cm3 soluţie 0,02 n NaOH corespunde la 0,28 mg de azot. Cantitatea de azot (X) în mg/dm3 în produsul analizat se calculează după formula:

(a-b) * K * 0,28 * 1000 ____________________ V , unde: a - cantitatea (cm3) de soluţie 0,02 n de NaOH, folosită la titrarea acidului sulfuric pentru proba de contro,; b - cantitatea (cm3) de soluţie 0,02 n NaOH, folosită la titrarea acidului sulfuric pentru proba de lucru; K – coeficientul de corecţie al bazei; 0,28 – cantitatea de azot în mg, care corespunde unui cm3 de soluţie 0,02 n NaOH; V – volumul soluţiei analizate, cm3. X=

Întrebări de control: 1. Caracteristica generală a proteinelor. 2. Compoziţia elementară a proteinelor. 3. Clasificarea proteinelor simple şi compuse. 4. Metoda de determinare a azotului total în produse lichide. 5. Regulile tehnicii de securitate ce trebuie respectate în procesul determinării azotului total după metoda Kjeldahl.

15

Lucrarea de laborator nr. 2 Determinarea potenţiometrică a derivaţilor formolici ai α – aminoacizilor Importanţa analizei α–aminoacizii sînt elemente structurale ale moleculei proteice, adică monomerii proteinelor. Totodată aminoacizii liberi îndeplinesc funcţii vitale în organisme. Aminoacizii şi amidele lor se întîlnesc, de regulă, în cantităţi mici în stare liberă în materia primă de origine vegetală sau animală şi în produsele prelucrării lor. Dar se găsesc şi în cantităţi mari. De exemplu, în mustul din struguri, în sucuri şi vinuri aminoacizii constituie mai mult de jumătate din substanţele azotoase. În organism şi la prelucrarea materiei prime alimentare din aminoacizi se formează un şir de substanţe, care determină gustul, culoarea şi mirosul produselor. Melaninele, melanoidinele, uleiurile de basamac ş. a. se obţin din aminoacizilor Proprietăţile chimice ale aminoacizilor α–Aminoacizii sînt derivaţi ai acizilor carbonici, în molecula cărora atomul de hidrogen de lîngă atomul α–carbonic este înlocuit cu gruparea aminică (-NH2). Avînd proprietăţi amfotere (reacţia 1), α–aminoacizii pot să reacţioneze ca amine (reacţiile 2-4) şi ca acizi carbonici (reacţiile 5-6): 1) R

CH

R

COOH

CH

COO-

NH3 + NH2 Datorită grupării aminice α–aminoacizii intră în reacţia specifică cu acidul azotos, pot să reacţioneze cu acizii minerali, cu aldehidele şi glucidele reducătoare. De exemplu:

16

2) R–CH–COOH + HNO2 → R–CH–COOH + N2↑ + H2O | | NH2 OH În rezultatul ultimii reacţii se elimină azotul şi se formează hidroxiacidul. Această reacţie stă la baza determinării cantitative a aminoacizilor după metoda Van Slyke (se ia în considerare cantitatea de azot eliminat). 3) Cu HCl se formează o sare complexă: R – CH - COOH + HCl → [ R–CH–COOH ] Cl— | | + NH 2 NH 3 4) În urma interacţiunii aminoacizilor cu aldehide (de exemplu cu glucide) se formează baze Schiff: R–CH–COOH + O=CH–R → R–CH–COOH + H2O | aldehida | NH2 N=CH–R baza Schiff Din baze Schiff pot fi formate melanoidine (substanţe de culoare întunecată). Grupa carboxilică a aminoacizilor reacţionează cu baze (reacţia 5) şi alcooli (reacţia 6), formînd respectiv săruri şi esteri: 5) R–CH–COOH + NaOH → R–CH–COONa + H2O | | NH2 NH2

17

6) R–CH–COOH + HO–C2H5 → R–CH–COOC2H5 + H2O | | NH2 NH2

În rezultatul ultimii reacţii aminoacizii din stare solidă se transformă în esteri lichizi, amestecul cărora se poate separa prin distilarea fracţionată cu vid. Toţi aminoacizii reacţionează cu ninhidrina, formînd în mediul acid produse incolore, iar în mediul neutru sau bazic produse colorate albastru intens. În mediul acid aminoacidul este degradat pînă la aldehidă, iar ninhidrina se reduce pînă la ceto-alcool: CO

OH

+R OH

C CO

CO 2

C CO

OH +R OH

CH

COOH

H+

OH COOH

H

C CO

NH2

CH

CO

OH

CO

CO

+

__

C =N CH CO

NH2

__ + R CHO + NH 3 + CO 2

CO

__ + R CHO + 3H2O + CO 2

Reacţia cu ninhidrină are o mare importanţă pentru recunoaşterea şi dozarea aminoacizilor. α–aminoacizii prin încălzire lentă pierd două molecule de apă şi se transformă în substanţă ciclică – dicetopiperazină. De exemplu, din două molecule de glicocol se formează 2,5 – dicetopiperazina:

18

COOH

NH2 CH2

+

CH2 NH2

COOH

H2C -2 H2O

NH C=O

O=C NH

CH2

Prin încălzirea rapidă a unui amestec de aminoacizi se elimină n molecule de apă din gruparea carboxilică a unui aminoacid şi gruparea aminică a altui aminoacid şi se formează peptide (sau polipeptide): CH

COOH + HNH

CH

COOH

-H

H2N

O

2

R

R1 H2N

CH R

CO

NH

CH

COOH

R1

dipeptidă Legătura ce se formează între doi aminoacizi (sau n molecule de aminoacizi) se numeşte legătură peptidică (-CO-NH-). Aminoacizii, care se conţin în materia primă alimentară, pot fi supuşi proceselor biochimice de dezaminare oxidativă şi în continuare decarboxilării şi hidrolizei. Aceste reacţii au loc la diferite operaţii tehnologice în prezenţa oxigenului, peroxizilor, chinonelor şi altor oxidanţi. În rezultat se formează aldehide, care dau deseori produselor finale o aromă specifică. Dezaminărea aminoacizilor are loc în mai multe etape cu formare de iminoacid (prin dehidrogenare), care apoi prin hidroliză trece într-un cetoacid şi amoniac. Iar cetoacidul prin decarboxilare trece în aldehidă. Respectiv, prin decarboxilarea iminoacidului rezultă o aldimină, care prin hidroliză se transformă în aldehidă şi amoniac:

19

R

CH

- 2 H+

COOH

R

C

NH2

iminoacid

COOH

NH

R

C

COOH

O

3

2

N H

+

-C

O H2

-

- CO2

R

CHO

aldehida

O

+ H2O - NH3

R

CH

NH

Principiul metodei α–Aminoacizii uşor reacţionează cu un exces formaldehidă formînd baze Schiff (sau derivaţi formolici): R

CH

de

COOH

NH2 + O = CH2

R

CH

COOH

+ H2 O

N=CH2

Prin aceasta aminogrupele îşi pierd proprietăţile bazice, iar grupele carboxilice libere se titrează cu bază (NaOH), formînd săruri: R

CH

COOH

+

R

NaOH

CH

COONa

+

H2 O

N = C H2

N = C H2

Se consideră convenţional, că numărul grupelor carboxilice titrate sînt echivalente cu numărul grupelor aminice legate de formaldehidă (ceea ce e corect pentru aminoacizii monocarboxilici). Pentru a introduce corecţia la aminoacizii dicarboxilici (acidul glutamic, asparagic şi alţii), soluţia se neutralizează în prealabil cu bază pînă la pH = 6,8. 20

Totodată se titrează şi acizii organici (tartric, acetic, malic, citric etc.), care se conţin în vinuri şi sucuri. Aparate, vase şi materiale:  potenţiometru, pH-673 M sau pH-150 MA;  agitator magnetic ;  pahar de 100 cm3;  biuretă de 25 cm3;  cilindru de 25 cm3;  pipetă Mor de 10 cm3;  soluţie 0,1n NaOH;  amestec formolic (20 cm3 formalină 40 % + 1 cm3 fenolftaleină, se titrează cu soluţie 0,2 n NaOH pînă la pH = 6,8);  probe de materie primă (vin, suc). Ordinea îndeplinirii lucrării Pentru titrare se foloseşte potenţiometrul cu doi electrozi de sticlă şi calomel. Înainte de a începe lucrarea pH–metrul se încălzeşte 30 minute. Electrozii se spală bine cu apă distilată şi se usucă cu hîrtie de filtru. Biureta se umple cu soluţie 0,1n de NaOH. În pahar se dozează 10 cm3 soluţie pentru analiză (vin sau suc) şi se adaugă apă distilată 10 cm3. Se introduc electrozii şi se titrează pînă la pH 6,8. Titrarea se efectuează în felul următor: 1. Se determină pH-ul soluţiei analizate. 2. Se cuplează agitatorul magnetic. 3. Proba analizată se titrează cu soluţie 0,1n de NaOH cu viteza de 5-7 picături pe secundă concomitent urmărind indicaţia de pe ecranul pH–metrului. 4. Cînd indicaţia pH-metrului ajunge la 6,8 titrarea se stopează. În acelaşi pahar se adaugă 10 cm3 de amestec formolic cu ajutorul cilindrului gradat. 21

5. Biureta se aduce la „zero” cu bază (volumul de NaOH care s-a consumat la titrarea soluţiei analizate pînă la pH – ul 6,8 nu se ia în calcul). 6. Conţinutul paharului se titrează cu bază pănă la pH 9,1 Titrarea se repetă de 3-4 ori. Diferenţa volumelor la titrare nu trebuie să depăşească 0,1 cm3. Pentru determinarea cantităţii de azot aminic se ia în considerare numai volumul (în cm3) de bază, care s-a consumat la titrarea soluţiei de lucru după ce a fost adăugat amestecul formolic. 1 cm3 de soluţie 0,1n NaOH corespunde la 1,4 mg de azot aminic. Se calculează conţinutul de azot aminic în mg/dm3 de soluţie analizată după formulă: N =

V ×1,4 × K ×1000 , Vp

unde V–volumul NaOH în cm3; K—coeficientul de corecţie al bazei; Vp—volumul probei în cm3 ; Întrebări de control 1. Descrieţi însemnătatea analizei şi principiul metodei. 2. Scrieţi şi explicaţi reacţiile caracteristice gruparii aminice. 3. Scrieţi şi explicaţi însemnătatea reacţiilor, caracteristice pentru gruparea carboxilică. 4. Prezentaţi reacţiile aminoacizilor cu ninhidrina. 5. Explicaţi prin reacţii modul de formare a legăturii peptidice intre aminoacizi în diferite condiţii termice. 6. Prezentaţi schema formării aldehidelor din aminoacizi.

22

Lucrarea de laborator nr. 3. Determinarea amoniacului după metoda Conwei şi Bairn Importanţa analizei În toate plantele, în materia primă şi produsele alimentare se conţin în cantităţi mari diferite substanţe azotoase. La ele se referă proteinele, polipeptidele, aminoacizii, amidele, vitaminele grupei B, ureea şi amoniacul. Pentru biosinteza compuşilor cu azot plantele şi microorganismele pot folosi azotul anorganic. Omul şi animalele în cazul proceselor similare folosesc numai azot organic. Azotul necesar plantelor se găseşte în natură sub formă nitrică sau amoniacală. Azotul nitric (NO3-) din sol este direct asimilabil de către plante. În celulele plantelor azotul nitric este redus la azotul nitros (NO2-) şi apoi la azot amoniacal (NH3 sau NH4+). Azotul nitric din sol provine fie din îngrăşămintele chimice administrate în sol, sau se formează prin oxidarea amoniacului de către microorganisme specifice (nitrificatoare). Azotul amoniacal este asimilat direct de către plante. În organismul vegetal azotul amoniacal participă direct sau indirect sub formă de compuşi (săruri de amoniu ale acizilor organici, amidele acizilor asparagic şi glutamic) la biosinteza aminoacizilor. Azotul amoniacal din sol provine din îngrăşăminte chimice sau din resturile substanţelor organice în curs de degradare. Procesul se numeşte amonificare. Azotul organic provenit din substanţele organice aflate în sol nu este direct asimilabil. Sub acţiunea bacteriilor de putrefacţie, azotul organic este transformat în procesul de amonificare în azot amoniacal asimilabil. Azotul atmosferic nu este asimilabil pentru plante direct, dar prin intermediul bacteriilor fixatoare de azot, care trăiesc în nodozităţile de pe rădăcinile leguminoaselor. Transformarea azotului atmosferic în azot amoniacal este un proces de reducere enzimatică. 23

Amoniacul în organismul vegetal se formează ca rezultat al proceselor de dezaminare suferite de aminoacizi şi de alţi compuşi cu azot şi serveşte în primul rînd la biosinteza de noi aminoacizi şi compuşi cu azot. Excesul de amoniac, fiind toxic pentru celule este fixat de plantă sub formă de săruri de amoniu ale acizilor organici, amide ale aminoacizilor dicarboxilici şi ca uree. Toţi aceşti compuşi constituie rezervele de azot ale plantei. Plantele bogate în acizi organici liberi, numite plante acide (măcriş, revent, begonia etc.) au capacitatea deosebită de a fixa amoniacul sub formă de săruri de amoniu (oxalat de amoniu, malat de amoniu, citrat de amoniu, fumarat de amoniu etc.). Cea mai importantă cale de detoxicare a amoniacului în celulele plantelor este fixarea sub formă de amide, îndeosebi ale acizilor aspartic (asparagina) şi glutamic (glutamina). Asparagina şi glutamina au fost identificate nu numai în plantele superioare, ci şi în ciuperci, drojdii, bacterii, precum şi în organismele animale. Formarea asparaginei şi glutaminei este un proces care decurge cu consum de ATP: ATP

ADP

HOOC - CH - (CH2) - CO - O - P

HOOC - CH - CH2- CH2- COOH NH2

+ NH3

2

acid glutamic

NH2

+

acid fosfoglutamic (forma activa)

HOOC - CH - CH2- CH2- CO - NH2 + H3PO4 NH2

glutamina

Amoniacul fixat sub formă de amide (asparagină şi glutamină) nu este toxic, poate fi eliberat prin hidroliza enzimatică pentru a fi utilizat în biosinteza compuşilor cu azot sau în menţinerea echilibrului acido-bazic din plantă: HOOC - CH - CH2- CH2- CO - NH2 NH2

glutamina

+ H2O

- NH3

HOOC - CH - CH2- CH2- COOH NH2

24

acid glutamic

Fixarea (dezintoxicarea) amoniacului sub formă de uree este un proces întîlnit în regnul animal şi uneori în cel vegetal, numit ciclul ureogenetic sau ornitinic. După cum susţin savanţii V.I. Nilov şi I. M. Scurihin cantităţile mari de amoniac duc la scăderea calităţii şi anume gustului vinului, sucului, compotului. De aceie determinarea amoniacului are o însemnătate teoretică şi practică. Principiul metodei Cînd la soluţia analizată, care conţine săruri de amoniu, se adaugă bază, se elimină amoniac, care cantitativ se reţine cu soluţie de 0,02 n H2SO4 luată în exces. Titrînd cu hidroxid de sodiu excesul de acid, care n-a reacţionat cu amoniacul, se poate calcula cantitatea de acid necesară pentru a neutraliza amoniacul. Bazele puternice, odată cu descompunerea sărurilor de amoniu, parţial hidrolizează şi amidele, care se conţin în obiectele analizate: R – CO – NH2 + KOH → R – COOK + NH3 Amoniacul format în acest caz poate falsifica rezultatele analizei. De aceea pentru a evita hidroliza amidelor, în loc de bază la soluţia analizată se dozează soluţie saturată de K2CO3, care în procesul hidrolizei formează un mediu bazic relativ slab. Chimismul procesului: K2CO3 + H2O = KHCO3 + KOH NH4Cl + KOH = KCl + NH3 + H2O 2 NH3 + H2SO4 = (NH4)2SO4 H2SO4 exces+ NaOH = Na2SO4 + H2O

25

Aparate, vase şi materiale:  4 ceşti Conwei;  2 pipete Mor de 5 cm3 şi o pipetă gradată de 5 cm3;  4 baloane conice de 100 cm3;  soluţie saturată de carbonat de potasiu (K2CO3);  soluţie de 0,02 n H2SO4;  soluţie de 0,02n NaOH;  indicator mixt (metilrot-metilen albastru): 0,2 g metilrot şi 0,012 g metilen albastru se dizolvă în 60 cm3 alcool şi cu apă se aduce pînă la 100 cm3. Ordinea îndeplinirii lucrării Se dozează 5 cm3 soluţie 0,02n H2SO4 în camera internă (1) a ceştii Conwei (fig.1). În camera externă (2) se dozează 5 cm3 soluţie analizată (vin, suc etc.). Ceaşca Conwei se închide aproape la 9/10 cu o placă de sticlă şlefuită. Prin gaura deschisă cu ajutorul pipetei gradate se dozează în camera externă 3 cm3 soluţie saturată de K2CO3. Ceaşca se închide cu placa şi prin clătinări atente, uşoare se amestecă soluţia analizată cu K2CO3. Se pune în termostat şi se ţine 1 oră la temperatura 50-55 oC.

Fig.1.Ceaşca Conwei După ce se scoate din termostat, ceaşca Conwei se deschide şi soluţia din camera internă se transferă cantitativ în balonul conic de 100 cm3 cu apă distilată (≈ 10 cm3). Soluţia se titrează cu soluţie de 0,02n NaOH în prezenţa indicatorului mixt pînă la schimbarea culorii din violet în verde. 26

Experienţa se repetă în 2 ceşti Conwei. Paralel se face proba de control, unde în loc de soluţie analizată se foloseşte apă distilată. Cantitatea de azot amoniacal (mg/dm3) în soluţia analizată se calculează după formula: (Vcontrol - V lucru) * K * 0.28 * 1000 X= V unde: V control – volumul soluţiei de 0,02n NaOH, folosită la titrarea probei de control, cm3; V lucru - volumul soluţiei de 0,02n NaOH, folosită la titrarea probei de lucru, cm3; K – coeficientul de corecţie al bazei; 0,28 – cantitatea de azot în mg, care corespunde unui cm3 de soluţie 0,02n NaOH; V – volumul probei analizate, cm3. Întrebări de control: 1. Numiţi substanţele azotoase din organisme vii. 2. Ce forme de azot pot utiliza plantele şi animalele ? 3. Descrieţi transformările azotului nitric în plante. 4. Cum se numeşte procesul oxidării amoniacului pîna la nitraţi ? 5. Daţi definiţia amonificării. 6. Descrieţi asimilarea azotului atmosferic ? 7. Prin ce procese se produce amoniacul în organism ? 8. Cum se fixează excesul de amoniac în plante ? 9. Scrieţi reacţiile formării şi descompunerii amidelor în plante. 10. Descrieţi principiul metodei determinării amoniacului. 11. Regulile tehnicii de securitate la determinarea amoniacului.

27

Lucrarea de laborator nr. 4 Determinarea proteinelor în vin după metoda Lowry Unele din caracteristicile importante ale proteinelor sînt: capacitatea de a precipita din soluţii şi capacitatea de adsorbţie. Din soluţii proteinele pot precipita reversibil sau ireversibil. Precipitaţia reversibilă – are loc cînd se adaugă următoarele reactive:  soluţii concentrate de săruri neutri ale metalelor alcaline (sulfat de amoniu, sulfat de natriu, clorură de natriu, etc.);  soluţii apoase concentrate de alcool: metilic, etilic, propilic;  soluţii concentrate apoase de acetonă. În urma dozării acestor substanţe, care concurează cu proteinele pentru apă, învelişul apos din jurul moleculelor de proteină începe să se descompună şi moleculele sub influenţa forţelor de coeziune moleculară formează agregate mari; soluţia se tulbură şi apare un precipitat floculos, care se aşează pe fundul vasului. Precipitatul format la fundul vasului dispare cînd soluţia este diluată cu apă. Alcoolul şi acetona în soliţii diluate formează precipitate proteice reversibile, iar dacă au o concentraţie mare formează precipitate ireversibile. Sărurile alcaline se comportă diferit faţă de proteine. În soluţii diluate măresc solubilitatea proteinelor, iar în soliţii concentrate determină precipitarea lor reversibilă. Cauza precipitării proteinelor este hidratarea ionilor cu apă extrasă din macromolecula proteică. Neavînd apă suficientă proteinele precipită, floculează, sau se coagulează. Prin precipitarea ireversibilă proteinele suferă modificări fizico-chimice adînci şi se produce denaturarea structurii lor moleculare.

28

Precipitaţia ireversibilă are loc, cînd proteinele formează precipitate insolubile, care nu se dizolvă la înlăturarea factorului precipitant. Denaturarea este modificarea structurii spaţiale a moleculei proteice ce duce la micşorarea solubilităţii, pierderea activităţii biologice. Denaturarea poate fi reversibilă şi ireversibilă. Denaturarea proteinelor are loc sub acţiunea unor agenţi denaturanţi care pot fi de natură fizică sau chimică. Factorii fizici sînt: încălzirea, creşterea presiunii, congelarea, radiaţiile ionizante, ultrasunetele etc. Agenţii chimici: ureea, sărurile metalelor grele (mercur, argint, cupru, plumb, bismut, stibiu), solvenţii organici, acidul tricloracetic, compuşii coloidali (acid wolframic, tanin), pH mai mic de 4 şi mai mare de 10, detergenţi. Denaturarea este foarte importantă în panificaţie, prepararea prafului de ou, lapte, conservare. Proteoliza proteinelor denaturate este mai rapidă, deci şi asimilarea lor este mai rapidă. Altă proprietate caracteristică a proteinelor este capacitatea de adsorbţie pe argila de bentonită sau silicagel, răşini sintetice, gelatină, cărbune. Fenomenul de adsorbţie (reţinere la suprafaţă) are loc la suprafaţa de contact dintre faza dispersă şi mediul dispergent şi constă în fixarea substanţelor (proteinelor) ce se găsesc în soluţie de către partuculele coloidale. Adsorbţia are un rol important în vinificaţie şi conservare. Se aplică acest proces la limpezirea mustului înainte de fermentaţie, sucurilor şi vinurilor. Principiul metodei Metoda Lowry este una din cele mai sensibile metode de determinare a proteinelor. Este bazată pe două reacţii concomitente - biuretică şi Folin. Ultima este caracteristică pentru aminoacizii triptofan, tirozina, cisteina, care reduc Reactivul Folin (amestec de acizi dodecawolframofosforic H3PW12O40 şi dodecamolibdofosforic H3PMo12O40) pînă la oxizi (W8O23, Mo8O23) de culoare albastră. Din cauza formării complecşilor moleculelor proteice cu cupru coloraţia cu reactivul Folin devine mult mai intensă decît numai datorită aminoacizilor sus-numite. Deoarece în reacţie intră şi alţi 29

aminoacizi, intensitatea culorii este direct proporţională cu cantitatea de proteine în soluţia analizată şi se determină cu ajutorul fotoelectrocolorimetrului la lungimea de undă 650 nm. Aparate, vase şi materiale:  centrifuga de laborator;  fotoelectrocolorimetru KFK-2;  acid tricloracetic de 80 %;  reactivul "A"— conţine 20 g de NaOH, 100g de Na2CO3, 2g de sare Seignette, 0.5 g de CuSO4 x 5 H2O. Fiecare component se dizolvă aparte în apă distilată, se amestecă în balon cu cotă de 1 dm3, volumul soluţiei se aduce la cotă;  reactivul "B"—reactivul Folin diluat (la 0,5 cm3 de reactiv Folin 1 n se adaugă 4 cm3 apă distilată);  soluţie 1 n de NaOH;  reactivul Folin—100 g wolframat de sodiu şi 25 g molibdat de sodiu se dizolvă în 700 cm3 apă, se adaugă 50 cm3 acid ortofosforic 85 % şi 100 cm3 acid clorhidric concentrat, se dizolvă şi se fierbe cu răcitor invers timp de 10 ore, apoi se adaugă 150 grame sulfat de litiu, 50 cm3 apă distilată şi 3-5 picături de brom şi iarăşi soluţia se fierbe 15 minute fără răcitor sub nişa de ventilare pentru a înlătura excesul de brom. Apoi soluţia se răceşte pîna la temperatura de cameră şi se aduce cu apă la volumul de 1 dm3, se filtrează şi se păstrează într-un balon întunecat cu dop rodat. Înainte de a începe lucrarea soluţia se diluează în aşa fel, ca să corespundă acidului 1 n. Concentraţia soluţiei se controlează prin titrarea reactivului Folin diluat de 10 ori cu soluţie 0,1 n hidroxid de sodiu după fenolftaleină;  patru eprubete şi cilindru de 5-10 cm3;  pipete de 1-2 cm3 şi de 5 cm3;  baie de apă;  termometru.

30

Ordinea îndeplinirii lucrării Într-o eprubetă cu 10 cm3 de vin se dozează 1 cm3 acid tricloracetic. Soluţia se pune în frigorifer pe douăzeci şi patru ore. Apoi soluţia se centrifughează 1 oră la 5000 ture/minut şi se decantează. În eprubetă cu precipitat se dozează 1 cm3 soluţie 1n NaOH şi după 30 minute se adaugă 1 cm3 H2O. Din proba obţinută, în altă eprubetă, se ia 1 cm3 soluţie şi se dozează 1 cm3 reactiv "A" şi după 10 minute se adaugă 4 cm3 reactiv "B". Paralel cu proba de analiză se pregăteşte proba de comparaţie, constituită din: 1 cm3 H2O + 1 cm3 NaOH + 2 cm3 reactivul"A" + 8 cm3 reactivul "B". Eprubetele cu probele de analiză şi comparaţie se plasează în baia de apă la temperatura 55 oC pe 5 minute şi după răcire rapidă se măsoară intensitatea culorii. Probele se colorimetrează folosind filtru de lumină №8 (roşu) cu lungimea de undă λ=650 nm, cuva cu lungimea 10 mm. Conţinutul proteinelor se calculează după formula: X = Do x 2 x 250 =Do x 50 V unde: X – cantitatea de proteine în soluţia analizată, mg/dm3; Do – densitatea optică a soluţiei analizate; 2 – volumul bazei şi soluţiei analizate, în cm3; 250 – coeficient de recalculare; V – volumul vinului luat pentru analiză, în cm3. Întrebări de control 1.Caracteristica generală a proteinelor. 2.Compoziţia elementară şi clasificarea proteinelor. 3.Proprietăţile caracteristice ale proteinelor. 4.Metodica determinării proteinelor după Louri. 5.Regulile tehnicii de securitate în procesul îndeplinirii lucrării. 31

Lucrarea de laborator nr. 5 Reacţiile de culoare a proteinelor S-a stabilit că proteinele datorită aminoacizilor formează circa 30 reacţii de culoare caracteristice. Cele mai importante sînt: biuretică, xantoproteică, Millon, Louri, Adamkiewics, sulfhidrilică etc. Sînt şi reacţii incolore care se realizează prin hidroliza proteinelor cu acizi, baze sau enzime. Prin hidroliza proteinelor rezultă produşi mai simpli şi în ultima fază – aminoacizi. Hidroliza acidă este mai frecvent utilizată. În acest caz soluţia proteică se fierbe în fiole ermetic închise 10-12 ore cu soluţie 10 % de acid clorhidric sau soluţie 20 % de H2SO4. Proteinele se descompun pînă la aminoacizi, dar dispare complet triptofanul. Hidroliza alcalină se realizează cu hidroxizi alcalini timp de 10-12 ore cu soluţie 10 % de NaOH sau Ba(OH) 2. Metoda are avantajul că nu se distruge triptofanul, însă se descompun alţi trei aminoacizi: arginina, citrulina, histidina. Din punct de vedere biologic mai importante sînt procesele de hidroliză enzimatică. Hidroliza enzimatică se realizează prin intermediul enzimelor la temperatura 20-40 oC şi la pH –ul aproape de neutru. În acest caz nu se distruge nici un aminoacid. Hidroliza enzimatică are loc în tubul digestiv al organismului animal, uman, în celula vegetală a fructelor, legumelor, în struguri şi vinuri. De exemplu, la prelucrarea strugurilor hidroliza enzimatică are lor după schema: Proteine →albumoze→ peptone → polipeptide → → oligopeptide→aminoacizi. Aparate, vase şi materiale:  lapte degresat sau soluţie 0,5 g cazeină în 100 cm3 bază de 1 %; 32

 soluţie de albuş de ou, (albuşul unui ou se separă de gălbenuş, se amestecă cu 0,5 dm3 apă distilată şi se agită minuţios);  soluţie 1 % de gelatină;  soluţie 1 % de CuSO4;  soluţie 10 % de NaOH;  soluţie 30 % de NaOH sau 20 % de NH4OH;  acid azotic concentrat de HNO3;  acid acetic glacial de CH3 COOH;  acid sulfuric concentrat de H2SO4;  reactivul Millon: la 40 g mercur se dozează sub nişa de ventilaţie 50 cm3 acid azotic concentrat (ρ=1,42), se lasă pe 30 minute la temperatura de cameră, apoi se încălzeşte în baia de apă pînă mercurul se dizolvă complet. Soluţia obţinută se diluează cu două volume de apă (aproximativ pînă la 160 – 180 cm3 ), după depunere se decantează de sediment;  5 % soluţie de Pb(CH3COO)2.

Reacţia biuretică. Această reacţie este caracteristică pentru toate proteinele, polipeptidele care conţin grupa peptidică (– CO – NH –). Dar reacţia biuretică se poate obţine şi cu o serie de compuşi, care nu au nimic comun cu proteinele, de exemplu, cu biuretul NH2-CO-NH-CO-NH2, sau oxamida NH2-CO-CO-NH2, etc. În urma tratării soluţiei de proteine cu soluţie de bază alcalină (NaOH) şi cîtorva picături de soluţie diluată de sulfat de cupru (CuSO4), proteinele obţin o culoare violetă datorită faptului că cuprul formează substanţe complexe cu grupele (-CO-NH-). Chimismul reacţiei: CuSO4

Cu (OH)2 + Na2SO4

+ 2 NaOH

33

R CH

CO

NH

NH OC ...

CH

CH

C

CO

N

OH OH

...

NH

CH

NH

CO

C

HC

R2

R3

un sector din catena polipeptidicã R

...

CH C-OH -2 H2O

HO HO N

C

N CH R2

R1

CH

C

N

O

N

CH C-OH

Cu ...

C

N

Cu

HO

CH

R3

R1

...

...

R

R1

HO HC R3

N

O

N

C

CH R2

complex biuretic

Ordinea îndeplinirii lucrării În trei eprubete se administrează: în prima – 0,5 cm3 soluţie de cazeină sau lapte degresat; în a doua – 0,5 cm3 soluţie albuş de ou; în a treia - 0,5 cm3 soluţie gelatină. În fiecare eprubetă se dozează cîte 0,5 cm3 soluţie 10 % NaOH şi cîte 5 picături soluţie 1% CuSO4. Eprubetele se agită. Apare culoarea violetă. Se face concluzia despre natura chimică a substanţelor analizate. Reacţia xantoproteică. Aminoacizii aromatici la fierbere cu HNO3 concentrat se supun nitrării. Ca rezultat soluţia capătă o culoare galbenă care trece în oranj la adăugarea bazei. Acidul azotic nitrează nucleul benzenic al aminoacizilor ciclici: tirozină, fenilalanină, formînd nitrocompuşi de culoare galbenă. De exemplu, radicalul tirozinei din componenţa proteinei în prezenţă HNO3 se transformă în nitrotirozină galbenă, care în mediul bazic dă culoare oranj (forma chinoidică). Chimismul reacţiei:

34

O

...

HN

CH

C

O

...

...

CH2

HN

CH

C

...

...

HN

C0 ...

CH2

CH2

+ HO

CH

NO2

+ NH4+ + H2O

+ NH4OH

O

O N

N OH

Radicalul tirozinei Radicalul în forma

O

OH

O

O

Radicalul nitrotirozinei chinoidică

Ordinea îndeplinirii lucrării În trei eprubete se administrează: în prima – 0,5 cm3 soluţie de cazeină sau lapte degresat; în a doua – 0,5 cm3 soluţie albuş de ou; în a treia – 0,5 cm3 soluţie gelatină. În fiecare eprubetă se dozează cîte 5-6 picături HNO3 concentrat şi eprubetele se încălzesc (orientîndu-le în direcţie opusă de la sine sau de la persoanele, care lucrează în laborator). În urma fierberii, conţinutul eprubetelor se colorează în galben. După răcire în eprubete se adaugă 10 picături soluţie 30 % de NaOH (sau soluţie 20 % de NH 4OH), culoarea soluţiilor devine oranj. Se face concluzia despre compoziţia aminoacidică a proteinelor analizate Reacţia Millon. Reacţia este caracteristică aminoacizilor care au radicalul fenolic, de exemplu, tirozina. Reactivul Millon la cald dă cu tirozina o coloraţie roşie. Adică, la încălzirea proteinei cu o soluţie azotat mercuric şi în prezenţa acidului azotic concentrat cu puţin acid azotos se formează un precipitat roşu cărămiziu, datorită formării nitrocompuşilor tirozinei în forma chinoidică. Ordinea îndeplinirii lucrării În trei eprubete se administrează: în prima – 0,5 cm3 soluţie de cazeină sau lapte degresat; în a doua – 0,5 cm3 soluţie albuş de ou; în a treia – 0,5 cm3 soluţie gelatină. În fiecare eprubetă se dozează cîte 5-7 picături reactiv Millon, eprubetele se încălzesc atent, îndreptîndu-le în direcţie opusă. Peste un timp se observă 35

apariţia unei coloraţii roşietice şi apariţia precipitatului cărămiziu. După schimbarea culorii se face concluzie despre proteinele în care este prezentă tirozina. Chimismul reacţiei: O

...__ HN

CH C CH2 __ +2HO--NO 2 + Hg2(NO3)2

2

OH ...

HN

O CH C

O ...

...

__

HN

CH2

CH C

O

O

=N__O__Hg__Hg__O__N=

O2 N

...

CH2

O

NO2 O

Reacţia sulfhidrilică. La încălzirea soluţiilor proteice cu baze în prezenţa sărurilor de Pb se formează culoarea neagrăcafenie în urma reacţiei cu aminoacidul cisteina: CH2

SH

CH2 OH

+2NaOH

+Na2S +H2O

HOOC CH NH2

HOOC CH NH2

Cu plumb sulfura de sodiu formează un sediment PbS. Na2S + (CH3COO)2Pb PbS + 2 CH3COONa Intensitatea culorii depinde de cantitatea cisteinei în proteina şi concentraţia proteinei în soluţie. Ordinea îndeplinirii lucrării În trei eprubete se administrează: în prima – 0,5 cm3 soluţie de cazeină sau lapte degresat; în a doua – 0,5 cm3 soluţie albuş de ou; în a treia – 0,5 cm3 soluţie gelatină. În fiecare eprubetă se dozează cîte 5 picături de 30 % NaOH şi 1 picătură de 5 % Pb(CH3COO)2. La încălzirea îndelungată lichidul devine cafeniu şi se formează sedimentul negru de PbS. Reacţia Adamkiewics. Soluţiile de triptofan sau proteine, care conţin resturi de triptofan fiind tratate cu acid 36

glioxilic (în formă de impurităţi în acidul acetic glacial) în prezenţa acidului sulfuric concentrat formează la nivelul zonei de contact un inel violaceu. O

O ...

HN

CH C ...

...

HN

CH C

O

...

CH2

CH2 H

H

O HN

+ H2SO4 - H2O

HN

CH C

...

HN

CH C ... CH2

CH2 CH HN

HN

CH C

...

O

...

C

O HN

HO

O

HO

Intensitatea culorii depinde de cantitatea de triptofan. Triptofanul în cantităţi mai mici se găseşte în lapte, carne, ouă. În cantităţi mai mari se conţine în icre negre şi roşii de peşte. Ordinea îndeplinirii lucrării În trei eprubete se administrează: în prima – 0,5 cm3 soluţie de cazeină sau lapte degresat; în a doua – 0,5 cm3 soluţie albuş de ou; în a treia – 0,5 cm3 soluţie gelatină. În fiecare eprubetă se dozează cîte 5 cm3 acid acetic concentrat, puţin se încălzeşte, apoi atent (pe peretele eprubetei) se adaugă 1 cm3 acid sulfuric concentrat. Se notează în care eprubete la nivelul zonei de contact dintre lichide apare inelul roşu-violet, care se extinde treptat în ambele părţi. După intensitatea culorii se face concluzia despre proteinele în care este prezent triptofanul. Întrebări de control: 1.Caracteristica generală a proteinelor. 2.Caracteristica reacţiei biuretice. 3.Caracteristica reacţiei xantoproteice. 4.Caracteristica reacţiei Millon. 5.Caracteristica reacţiei Adamkiewics. 6.Descrierea metodelor de hidroliză a proteinelor. 37

Lucrarea de laborator nr. 6 Determinarea formei reduse a glutationului (în levuri sau germenii cerealelor) Glutationul este o tripeptidă formată din trei resturi de aminoacizi: acidul glutamic, cisteină, glicocolul (glicina): HS

CH2 NH2 - CH - CH2 - CH2 - CO - NH - CH - CO - NH - CH2 -COOH COOH

Glutationul este foarte răspîndit în natură, se conţine în aproape toate celulele vii în cantităţi mici. În cantitate mare a fost găsit în germenii grîului pînă la 0,45 % din masa uscată, în levurile vechi, struguri. El prezintă o substanţă solidă, albă, solubilă în apă şi alcool. Din soluţia alcoolică cristalizează sub formă de prisme. Glutationul are 2 grupe carboxilice libere, deci are un caracter pronunţat acid (pH= 2,83). Datorită grupării sulfhidrilice (-SH) glutationul are proprietăţi reducătoare puternice. Poate fi în două forme: redusă (G - SH) şi oxidată ( G-S-S-G). Aceste forme trec uşor una în alta după următoarea reacţie:

G - SH + HS - G

-2 H+ + 2 H+

G -S-S-G

Transformările de oxidare şi reducere sînt reversibile şi în organismele vii sînt catalizate de enzime specifice, anume de glutationreductază în prezenţa acidului dehidroascorbic (acceptor de hidrogen). Multe enzime proteolitice de natură vegetală, care au în centrul activ gruparea –SH (enzime tiolice) sînt activate de glutationul redus. Ca rezultat se hidrolizează proteinele de rezervă (gluten) din făină şi aluatului se lasă, nu ţine volumul. Acţiunea de activare a glutationului se datorează faptului, că el este un reducător puternic şi se oxidează uşor. 38

Forma redusă de glutation se acumulează în cantităţi mai mari la încolţirea cerealelor şi în procesul de învechire a levurilor, şi deci este un factor, care diminuează puternic calitatea acestor produse vegetale. De exemplu, la a patra zi de germinare cantitatea de glutation redus în orz creşte de 2,5 ori. În panificaţie pentru a preveni distrugerea glutenului, glutationul redus se oxidează cu acidul dehidroascorbic (vitamina C oxidată). Glutationul redus protejează oxidarea acidului ascorbic şi al adrenalinei. Principiul metodei Metoda se bazează pe oxidarea grupării –SH a glutationului redus cu iod. Pentru a primi soluţii stabile de iod se foloseşte KIO3 şi titrarea se petrece în prezenţă de KI în mediul acid:

KIO3 + 5 KI + 2 H3PO4

2 K3PO4 + 3 H2O + 3 I2

Iodul oxidează glutationul redus conform ecuaţiei:

2G-SH + I2

G-S-S-G

+ 2HI

Titrarea se termină cînd apare culoarea albastră a amidonului, ce indică prezenţa iodului şi dispariţia glutationului în forma redusă. Aparate, vase şi materiale:  materie primă pentru analiză: levuri de panificaţie sau de vin, germeni de cereale, crupe, cereale.  soluţie de 5 % acid meta-fosforic;  soluţie de 1,5 % KI (se pregăteşte înainte de determinare);  soluţie de 1 % amidon cu adaos de NaCl;  soluţie de 0,001 n KIO3 (potasiu iodat);  mojar cu pistil;  balon cotat de 50 cm3;  baloane conice de 100 cm3; 39

microbiuretă sau biureta de 10 cm3; pipete: 1, 5, 10 cm3; pîlnie de sticlă; hîrtie de filtru pliată. Ordinea îndeplinirii lucrării Proba produsului analizat (2 g) se transferă în mojar şi se mărunţeşte cu pistilul cu nisip de cuarţ în prezenţa a 5 cm 3 soluţie de 5 % acid meta-fosforic. Apoi, masa mărunţită cantitativ se transferă în balonul cotat de 50 cm3, se aduce pînă la cotă cu apă distilată. După 5 min de macerare conţinutul balonului se agită 2-3 min şi se filtrează prin hîrtie de filtru pliată. Pentru determinarea conţinutului de glutation în balonul conic de 100 cm3 se administrează 5 cm3 de filtrat, 1 cm3 soluţie de 1,5 % KI şi 5 picături de soluţie de 1% amidon după care se titrează din microbiuretă cu soluţie de 0,001 n KIO3 pînă la apariţia culorii albastre. Conţinutul glutationului se exprimă în mg-% la masa uscată a materialului analizat după formula : A*0,307*C*100*1000 , mg -%, X= P*b*1000 unde: X – cantitatea glutationului în mg-%; 0,307 – coeficientul de recalculare a glutationului, care arată că 1cm3 soluţia de 0,001 n KIO3 este echivalent cu 0,307 mg de glutation redus; P – masa levurilor, grame; C – volumul finit al suspensiei de levuri, cm3; A – cantitatea de soluţie de 0,001 n KIO3, care a fost folosită la titrare, cm3; b – volumul filtratului luat la titrare; 100 – recalcularea la 100 g de produs; 1000 – recalcularea g în mg. Întrebări de control 1. Descrieţi structura glutationului şi proprietăţile lui.    

40

2. Pe ce se bazează principiul metodei de determinare a formei reduse a glutationului ? 3. Ce împortanţă practică are analiza glutationului redus ? 4. Ce enzime sînt activate de glutationul redus, care este mecanismul acestei activări ?

41

Lucrarea de laborator nr. 7 Determinarea activităţii invertazei în vinuri, sucuri Enzimele sînt catalizatori biologici specifici de natură proteică, care se sintetizează în celulele organismelor vegetale şi animale. Datorită enzimelor toate organismele vii pot realiza un număr enorm de diverse procese chimice legate de metabolismul substanţelor. Enzimele se împart în două grupe: enzime monocomponente (proteine), care sînt constituite din aminoacizi şi enzime bicomponente (proteide), constituite dintr-o componentă proteică (apoenzimă) şi o moleculă de natură neproteică (cofactor). Deseori cofactorul prezintă derivaţii vitaminelor hidrosolubile. Din enzimele monocomponente fac parte multe hidrolazele, iar din enzimele bicomponente --oxidoreductazele, transferazele, liazele, izomerazele şi ligazele. Cînd gruparea prostetică se leagă de apoenzimă prin legături slabe, uşor disociabile, atunci cofactorul se numeşte coenzimă. În cazul cînd gruparea prostetică se leagă de apoenzimă prin legături covalente, nedisociabile, atunci cofactorul se numeşte gruparea prostetică. Substanţa asupra căreia acţionează enzima se numeşte substrat. În cele mai multe cazuri legătura dintre substrat şi enzimă se face prin intermediul „centrelor active”(regiunea enzimei, care direct realizează cataliza). Unităţi de măsură ale activităţii enzimelor. Activitatea enzimelor se determină prin: măsurarea gradului de transformare a substratului, măsurarea concentraţiei produsului de reacţie sau măsurare a cineticii de reacţii, urmărite într-un anumit interval de timp prin metode fizice sau chimice adecvate. Activitatea enzimelor se exprimă cantitativ în unităţile propuse de Comisia de Enzime (CE) şi anume: 42

Unitatea de activitate enzimatică (U) reprezintă cantitatea de enzimă care catalizează transformarea a 1μmol substrat /min., în condiţii standard (t 0 = 25 0C, pH şi concentraţie de substrat optime). Această unitate de măsură este recomandată de CE din 1961 şi folosită pînă în prezent. Dar CE recomandă trecerea la unitatea Katal. Katalul (Kat) reprezintă cantitatea de enzimă care catalizează transformarea a 1 mol substrat ре secundă în condiţii standard. În practică se foloseşte microkatalul (μKat = 10–6Kat), nanokatalul (nKat =10–9 Kat), picokatalul (pKat=10–12 Kat). Pentru enzimele solide (praf) se foloseşte activitatea specifică – reprezintă numărul de unităţi enzimatice /mg proteină (respectiv Kat/mg proteină şi Kat/kg proteină), sau reprezintă numărul de Katali care corespund la 1 kg de enzimă. Pentru enzime în stare cristalină cu masa moleculară cunoscută se foloseşte activitatea enzimatică molară (număr de transfer) – reprezintă numărul de molecule de substrat transformate de către o moleculă de enzimă timp de 1 min sau 1s (Kat/mol enzimă), sau reprezintă numărul de katali care revin unui mol de enzimă. Metodele principale de separare şi purificare a enzimelor. Enzimele se conţin în stare dizolvată în plasma tuturor ţesuturilor vegetale, animale şi a microorganismelor (bacterii, drojdii, mucegaiuri). Prelucrarea materiei prime de origine vegetală, animală sau microbiană este în linii generale aceia-şi: omogenizare, extracţie, concentrare, fracţionare şi uscare. Preparatele enzimatice parţial purificate pot fi în formă lichidă, semilichidă sau uscată. Enzimele din ţesuturi se extrag uşor cu ajutorul apei, soluţiilor de săruri, acizi şi baze slabe. Un dizolvant bun pentru majoritatea enzimelor îl constituie soluţia apoasă de glicerol. Dacă enzimele sînt strîns legate cu elementele structurale ale celulei, atunci pentru distrugerea ţesuturilor se folosesc: nisipul 43

de cuarţ sau sticlă, dezintegrarea prin macerare, autoliza şi în aparate speciale – omogenizatoare etc. Impurităţile (molecule cu masa moleculară mică) din soluţiile obţinute se înlătură prin dializă, electrodializă, precipitarea enzimelor cu alcool, acetonă, săruri. După extracţie soluţiile enzimatice se purifică şi se concentrează prin metodele de cromatografie şi electroforeză. Rolul invertazei În natură sînt mult răspîndite enzimele care catalizează hidroliza legăturilor glicozidice din glicozide, oligoglucide şi poliglucide. Aceste enzime au denumirea generală de carbohidraze. Se disting enzime care hidrolizează numai poliglucidele (poliazele) şi enzime care hidrolizează oligoglucidele (glicozidaze). Enzima β-fructofuranozidaza se referă la carbohidraze (glicozidaze). Această enzimă catalizează inversia sau hidroliza zaharozei şi de aceea se numeşte invertaza sau zaharază. Invertaza acţionează asupra legăturii β-fructo-furanozidice din moleculele zaharozei, rafinozei etc., şi desprinde de la ele restul de β-D-fructofuranoză. Zaharoza este o dizaharidă din cele mai răspîndite dintre oligozaharide. Se găseşte aproape în toate plantele, în cantităţi mai mari se găseşte în sucul florilor alături de monozaharide, apoi în sfeclă, în trestia de zahăr şi în cocenii tineri de porumb. Sub influenţa acizilor sau a invertazei zaharoza se hidrolizează formînd un amestec de monoglucide (D-glucoza şi Dfructoza):

44

CH2OH H OH

H OH

O

H

CH2OH H

H

O

H OH CH2OH

O H

OH

OH

H

Acţiunea invertazei Zaharoza (sustratul invertazei) are proprietăţi optic active, este dextrogiră (rotaţia specifică + 66,5o). După hidroliză soluţia rezultată devine levogiră [α]D20 = -20o, deoarece fructoza este pronunţat levogiră [α]D20= -93o în comparaţie cu glucoza care este dextrogiră [α]D20 = +52,5o. Această hidroliză se numeşte inversie sau invertire, inversiune, iar amestecul echimolar de glucoză şi fructoză are denumirea de „zahăr invertit” (mierea de albine). Invertaza e mult răspîndită în plante, în drojdii, ciuperci şi bacterii, în struguri, suc şi vin. Împreună cu enzima maltaza (care se conţine în drojdia de bere) invertaza are o mare însemnătate pentru industria alimentară. Aceste enzime se folosesc în industria panificaţiei şi fermentaţiei: ele catalizează hidroliza zaharozei şi maltozei şi prin aceasta pregătesc materia primă de fermentaţie. Invertaza este foarte rezistentă la acţiunea SO2, este sensibilă la etanol şi activitatea ei variază foarte mult cu temperatura. Tratarea mustului şi vinului cu bentonita (fixează proteinele) diminuează activitatea invertazei. La prelucrarea strugurilor numai o treime din invertază trece în must, cea mai mare parte rămîne fixată pe componentele solide ale boştinei şi în burbă. Strugurii au potenţial invertazic ridicat: 1 cm3 must nedeburbat cu pH 3,5 la temperatura 30 oC are în mediu 200 unităţi. Datorită potenţialului invertazic ridicat al mustului zaharoza adăugată în el (şaptalizarea) este complect hidrolizată în cîteva ore. Drojdiile cu o activitate mică de inversie nu pot fi utilizate în industria panificaţiei şi fermentaţiei. De aceea studierea activităţii acestor enzime are o însemnătate practică. 45

Principiul metodei Activitatea invertazei se determină după cantitatea de zahăr invertit care s-a format la hidroliza unei anumite cantităţi de zaharoză sub acţiunea invertazei la to = 25 oC timp de 24 ore. Cantitatea de zahăr invertit se determină după metoda Bertrand. Aparate, vase şi materiale:  4 baloane conice 100 cm3;  4 baloane cotate 100 şi 200 cm3 ;  4 cilindre de 50 cm3;  pîlnie Şott nr.3;  2 baloane Bunzen de 500 cm3;  pipete 5 şi 10 cm3;  soluţie de zaharoză 10 %;  soluţie-tampon acetică cu pH = 4,7 (la 50 cm3 soluţie 1N de NaOH se adaugă 96,8 cm3 soluţie 1 N de CH3 COOH şi volumul amestecului se aduce cu apă distilată pînă la cota 500 cm3). În soluţia tampon acetică se adaugă 1-2 cm3 toluol pentru reducerea creşterii microorganismelor în probele de materie primă (vin, suc);  reactivul Fehling I: se dizolvă 40 g CuSO4 x 5 H2O într-un dm3apă de distilată;  reactivul Fehling II: se dizolvă într-un dm3 apă de distilată 200g sare de Seignette (tatrat dublu de sodiu şi potasiu) şi 150 g de NaOH;  soluţie ferică amoniacală (86g sulfat feric amoniacal se dizolvă în 500 cm3 apă, la soluţie se adaugă 108 cm3 acid sulfuric concentrat cu densitatea 1,84 şi volumul amestecului se aduce cu apă distilată pînă la un dm3). Înainte de întrebuinţare soluţia ferică amoniacală se oxidează cu cîteva picături de 0,1N KMnO4 pînă la culoarea slab roză;  soluţie 0,05N KMnO4, care se păstrează în sticle brune la întuneric;  probe de materie primă (vin, suc). 46

Ordinea îndeplinirii lucrării Pregătirea probelor pentru inversia zaharozei Probe de 10 cm3 vin sau suc se dozează în două baloane conice de 100 cm3. Conţinutul primului balon (proba de control) se fierbe timp de 3 minute pentru inactivarea enzimei. Apoi în ambele baloane se dozează cîte 5 cm3 soluţie 10 % zaharoză, 10 cm3 soluţie-tampon acetică cu toluol. Baloanele se închid strîns cu dopuri şi se lasă pentru 24 ore la temperatura 25 oC în termostat. După expirarea termenului proba de lucru (cu excepţia probei de control) se fierbe 3 minute pentru inactivarea enzimei. Diluarea probelor Conţinutul ambelor baloane se transferă cantitativ în două baloane cu cotă de 200 cm3 şi se aduc cu apă distilată pînă la cotă, se amestecă minuţios. Din fiecare balon se iau cu pipeta probe de 10 cm3, care se transferă în baloane conice de 100 cm3 şi se determină în ele zahărul rezidual după metoda Bertrand. Pentru aceasta la fiecare probă se adaugă cu cilindru cîte 10 cm3 soluţie Fehling I şi II. Probele se încălzesc şi se fierb 3 minute. La încălzirea soluţie Fehling I şi II cu zahărul invertit (zaharuri reducătoare) se depune Cu2O (protoxid de cupru) roşu – cărămiziu şi au loc următoarele reacţii: CuSO4 + 2 NaOH → Cu(OH)2 + Na2SO4 COOK

CHOH CHOH

COOK +

CHO

Cu (OH)2

CHO

COONa

COONa

complex cuprotartric

47

Cu +

2 H2O

CH= O HCOH HOCH

COOH COOK

+ 2

HCOH HCOH

CHO CHO

COOK

HCOH

Cu + 2 H2O

HOCH

+ Cu2O

HCOH

+2

HCOH

HCOH

COONa

COONa

HCOH

CH2OH

CH2OH

Deoarece reactivul Fehling II este un reactiv alcalin, în prezenţa lui fructoza se poate transforma într-o aldoză (glucoză sau manoză), care reacţionează cu soluţia Fehling: H

CH2OH

C OH

CH= O

C=O

C OH

CH(OH)

HOCH

HOCH

HOCH

HCOH

HCOH

HCOH

HCOH

HCOH

HCOH

CH2OH

CH2OH

CH2OH

Fructoza Forma enolică Aldoza Pentru determinarea cantităţii Cu2O trebuie de îndeplinit următoarele procese. Conţinutul primei probe (de control) după răcire pînă la 50 o – 60 C se transferă în pîlnia Şott, (care are un strat de 0,5 cm de asbest – celuloză), unită cu balonul Bunzen. Balonul Bunzen se uneşte cu pompa de apă. Soluţia se filtrează prin pîlnia Şott şi se spală de 5-6 ori cu apă fierbinte distilată pînă cînd soluţia devine incoloră. Precipitatul de Cu2O din pîlnia Şott şi din balonul conic (unde a fost proba) tot timpul trebuie să fie menţinut sub un strat de apă pentru a nu permite oxidarea Cu2O în contact cu aerul. 48

Imediat după ultima spălare în vasul conic (unde a fost proba) se adaugă 10 cm3 soluţie ferică – amoniacală (cu cilindrul) pentru dizolvarea sedimentului de Cu2O şi se agită pînă cînd dispare precipitatul roşu – cărămiziu de pe pereţii balonului conic. Între timp pîlnia Şott se montează pe un alt balon Bunzen curat, iar pompa de apă se deconectează. Soluţia ferică - amoniacală din balonul conic se toarnă peste precipitatul din pîlnia Şott şi se amestecă cu o baghetă de sticlă pînă la dizolvarea completă a precipitatului de Cu2O. Apoi balonul Bunzen se uneşte cu pompa de apă şi amestecul obţinut se filtrează. Balonul conic (unde a fost soluţia ferică - amoniacală) se spală de 5-6 ori cu apă distilată fierbinte şi se filtrează prin pîlnia Şott pînă cînd picăturile de filtrat din balonul Bunzen au reacţie neutră (dispare reacţia acidă a soluţiei, pH se determină prin intermediul indicatorului universal de hîrtie). Are loc reacţia de dizolvare a sedimentului de Cu2O în soluţia de sulfat feric Fe2(SO)3: Cu2O + Fe2(SO4)3 +H2SO4→2CuSO4 + 2 FeSO4 + H2O Sulfatul feros format (FeSO4) se titrează cu KMnO4 : 10 FeSO4 + 2 KMnO4 + 8 H2SO4 → 5 Fe2(SO4)3 + +2 MnSO4 + K2SO4 + 8 H2O. Filtratul limpede cu nuanţe verzui se titrează cu soluţie 0,05 n de KMnO4 direct în balonul Bunzen pînă cînd soluţia se colorează în roz şi la o picătură în exces de KMnO4 coloraţia persistă un minut. Volumul soluţiei 0,05N KMnO4 consumat la titrarea probei se fixează. Analogic se tratează şi se filtrează proba de lucru. Pentru a obţine rezultate comparabile este necesar în probele diluate de vin de repetat determinarea zahărului prin metoda Bertran de 2-3 ori (în proba de lucru şi control). În corespundere cu reacţiile scrise mai sus 1 cm3 soluţie 0,05 n permanganat de potasiu echivalează cu 3,18 mg cupru. Cantitatea de zahăr invertit în mg se determină după tabelul Bertrand (tab.1), care indică ce cantitate de zahăr invertit corespunde la anumite cantităţi de cupru. 49

Tabelul 1. Calculul conţinutului de zahăr invertit în mg după

Bertrand. Zahăr 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32

Cu 20,6 22,6 24,6 26,5 28,50 30,50 32.5 34.5 36.4 38.4 40.4 42.3 44.2 46.1 48.0 49.8 51.7 53.6 55.5 57.4 59.3 61.1 63.0

Zahăr 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55

Cu 64.8 66.7 68.5 70.3 72.2 74.0 75.9 77.7 79.5 81.2 83.0 84.8 86.5 88.3 90.1 91.9 93.6 95.4 97.1 98.8 100.6 102.3 104.0

Zahăr 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78

50

Cu 105.7 107.4 109.2 110.9 112.6 114.3 115.9 117.6 119.2 120.9 122.6 124.2 125.9 127.5 129.2 130.8 132.4 134.0 135.6 137.2 138.9 140.5 142.1

Zahăr

Cu

79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100

143.7 145.3 146.9 148.5 150.0 151.6 153.2 154.8 156.4 157.9 159.5 161.1 162.6 164.2 165.7 167.3 168.8 170.3 171.9 173.4 175.0 176.5

Calculul activităţii enzimei invertaza Activitatea invertazei sau zaharazei (Az) se exprimă în „unităţi de activitate enzimatică” într-un dm3 vin sau suc. Pentru aceasta cantitatea de zahăr invertit găsită după tabelul Bertrand (Z) se recalculează la conţinutul lui în volumul balonului cu cotă (200 cm3) şi se înmulţeşte cu 0,95 (coeficientul de recalculare a zahărului invertit în zaharoză), şi se determină cantitatea zaharozei (mg), care s-a supus hidrolizei. Activitatea invertazei se determină după formula: As =

P ⋅1000 ⋅1000 342 ⋅ t ⋅ v

unde: P – masa de zaharoză care a fost hidrolizată [mg]; P = Plucru-Pcontrol = (Zlucru –Zcontrol) x 0,95 x 20 342 – masa moleculară a zaharozei; t – durata inversiei [min]; v – volumul de vin [cm3]. 1000 - transformarea mg în micrograme ; 1000 - recalcularea la 1 dm3. Întrebări de control: 1. Numiţi unităţile de măsură ale enzimelor. 2. Descrieţi structura şi proprietăţile chimice ale zaharozei şi zahărului invertit. 3. Descrieţi metodele de separare şi purificare a enzimelor. 4. Descrieţi enzima invertaza. 5. Metoda determinării invertazei.

51

Lucrarea de laborator nr. 8 Determinarea activităţii enzimei polifenoloxidaza Pînă în prezent au fost studiate mai mult de 3000 enzime diferite. Enzimele se clasifică după tipul reacţiilor pe care le catalizează şi după substraturile asupra cărora acţionează. Denumirea enzimelor este alcătuită din trei părţi. Prima parte indică denumirea substratului asupra căruia acţionează enzima, a doua parte indică natura reacţiei catalizate şi a treia parte ─sufixul „aza”. De exemplu, polifenoloxidaza, piruvatdecarboxilaza, etc. Se deosebesc numai enzimele din clasa 3 – hidrolazele, care sînt formate din denumirea substratului unit cu sufixul „aza”. De exemplu amilaza, zaharaza, ureaza. Odată cu denumirile raţionale se păstrează şi denumiri mai vechi: pepsina, tripsina, papaina, etc. După tipul reacţiei catalizate enzimele se clasifică în următoarele 6 clase: 1. Oxidoreductazele sau enzimele, care catalizează reacţiile de oxidoreducere (cu transfer de hidrogen sau de electroni sau prin combinarea unui substrat cu oxigenul molecular). 2. Transferazele sînt enzimele, care catalizează reacţii de transfer ale unor atomi sau grupări de atomi (-NH2, - CH3, CH2OH, - O-PO3-H2 etc.) de pe un substrat donator pe un alt substrat acceptor. 3. Hidrolazele sînt enzime, care catalizează scindarea hidrolitică a legăturilor esterice, glicozidice, peptidice, amidice etc. după următorul mecanism: R1 – R2 + H–OH → R1 – OH + R2 - H 4. Liazele catalizează reacţiile de scindare nehidrolitică a legăturilor chimice. Se elimină molecule de CO2, H2O, NH3 etc. şi des se formează legături duble. Liazele Catalizează şi reacţiile inverse. 5. Izomerazele sînt enzimele care catalizează diverse reacţii de izomerizare sau de rearanjări intramoleculare. 52

6. Ligazele sau sintetazele sînt enzime care catalizează reacţiile de formare a legăturilor chimice între două molecule cu ajutorul energiei cedate de substanţele macroergice (ATP, GTP, etc.) Fiecare enzimă are codul de patru cifre, stabilit de Comisia de Enzimologie a Uniunii Internaţionale de Biochimie (1961). Prima cifră indică clasa la care aparţine enzima. Şase clase de enzime se formează în funcţie de tipul general al reacţiilor catalizate. A doua cifră indică subclasa, referitor la natura chimică a grupărilor la substrat, a treia cifră reflectă o subdiviziune din aceeaşi subclasă, iar a patra – enzima concretă (numărul de ordine al enzimei respective în subdiviziunea din interiorul subclasei). De exemplu, enzima dehidrogenaza alcoolului (codul 1.1.1.1) este o oxidoreductază (clasa 1), acţionează asupra grupei CHOH a donatorului de hidrogen (subclasa 1), piridinnucleotidele (NAD+ şi NADP+) servesc ca acceptor de hidrogen (subsubclasa 1) şi enzima este prima (a patra cifră-1) din această ultimă diviziune. Importanţa analizei Polifenoloxidaza (EC.1.10.3.2) este cunoscută şi sub denumirea catecholoxidaze, o-difenoloxidaza sau, mai recent, oxigen oxidoreductaza – enzima din grupa oxidazelor clasei oxidoreductazelor, care transportă electronii direct la oxigen. Polifenoloxidaza este răspîndită în plante, găsindu-se în cantitate mai mare în special în ciuperci, tuberculi de cartofi, frunze de ceai şi de tutun, boabe de cafea şi în diferite fructe: mere, piersici, caise, banane, în struguri, etc. Polifenoloxidaza (PFO) are o masă moleculară de 34000, reprezintă o proteină, ce conţine cupru (0,26 %). Ea poate cataliza oxidarea monofenolilor în difenoli (activitatea crezolică) şi a o-difenolilor în o-chinone (activitatea catecholazică):

53

R

__

Activitatea catecolazica __ R + 1/2 O2

Activitatea crezolica __ R + 1/2 O

2

O

OH

OH monofenol

OH o-difenol

O chinona

PFO oxidează substanţele tanante (taninurile). Prin acţiunea ei se explică brunificarea legumelor şi fructelor la uscare. PFO are un rol important la respiraţia plantelor. După teoria lui V.I. Paladin sistema polifenol-chinonă are un rol însemnat în calitate de verigă intermediară la oxidarea diferitelor substanţe organice în procesul respiraţiei plantelor. Participarea PFO în acest proces poate fi redată prin schema următoare: Compus redus

o-chinona

R

H2O O O

R

OH OH

Compus oxidat

+ 1/2 O2

o-difenol

Aşadar o cantitate mică de polifenol şi chinonă respectivă poate de multe ori să fie supusă variabil oxidării şi reducerii. Sistema PFO, polifenolilor şi chinonilor respectivi, poate oxida acidul ascorbic în materia primă alimentară. Această situaţie se ia în considerare la prelucrarea fructelor, legumelor şi strugurilor, care conţin acid ascorbic. Materia primă vegetală (fructe proaspete tăiate, legume şi struguri) în contact cu oxigenul din aer se îmbrunează din cauza 54

polimerizării oxidative a chinonelor formate din mono- şi difenoli. Pentru inactivarea PFO şi prevenirea formării chinonelor se foloseşte tratamentul termic (de exemplu, blanşarea fructelor) sau chimic – cu SO2 sau cu K2S2O5 etc. Principiul metodei Metoda determinării polifenoloxidazei se bazează pe proprietatea ei de a oxida pirocatehina în orto-chinonă. Ortochinona oxidează acidul ascorbic. Anume acidul ascorbic rămas în mediu de reacţie se determină cantitativ prin metoda de titrare cu 0,02 n soluţie de iod. o-chinona H2O

Acidul ascorbic O O

OH

Acidul dehidroascorbic

OH

+ 1/2 O2

pirocatehina

Prin această metodă se determină activitatea polifenoloxidazei numai în primele 2 minute de acţiune asupra substratului. Aparate, vase şi materiale:     

patru baloane conice de 100 cm3; mojar cu pistil; pîlnie din sticlă; balon cotat de 50 cm3; pipete Mor 5 cm3, 10 cm3; 55

 patru pipete gradate 2 şi 5 cm3;  soluţie de substrat: se dizolvă 100 mg acid ascorbic în 100 3 cm apă distilată;  soluţie 0,02 n pirocatechină, (2,2 g în 1 dm3);  soluţie 10 % acid fosforic (orto sau meta) ;  soluţie 0,02 n soluţie de iod;  soluţie 1 % amidon;  amestec tampon (aparte se dizolvă 11, 867 g de Na2HPO4 x 2 H2O într-un dm3 apă distilată şi 9,078 g de KH2PO4 într-un dm3 apă distilată) Amestecînd volume egale de soluţie obţinem amestecul tampon cu pH-6,8) ;  materie vegetală (mere, cartofi, struguri);  cîntar tehnic. Ordinea îndeplinirii lucrării Pentru a obţine extractul de enzime din materia primă vegetală de cîntărit 5 g de produs cu balanţa tehnică (precizia de 0,01 g). De transferat proba în mojarul de porţelan şi de mărunţit cu pistilul. Extracţia enzimelor se efectuează cu cantităţi mici de apă distilată. Conţinutul mojarului se transferă cantitativ într-o pîlnie cu filtru din materie instalat într-un balon cotat de 50 cm3. Conţinutul balonului se aduce pînă la cota 50 cm3 cu apă şi se agită. În patru baloane conice se dozează cîte 5 cm3 de filtrat şi cîte 10 cm3 de H2O. Două baloane se încălzesc pînă la fierbere şi se fierb 2 minute pentru inactivarea enzimei (probele de control), apoi se răcesc. Probele (de control şi lucru) se aduc la temperatura 25oC. În fiecare balon se adaugă cîte 5 cm3 soluţie-tampon (cu pH-ul 6,8), cîte 2 cm3 soluţie pirocatehină, cîte 5 cm3 soluţie acid ascorbic şi baloanele se omogenizează timp de 2 minute. În fiecare balon se adaugă cîte 1 cm3 soluţie 10 % acid fosforic şi se titrează cu 0,02 n soluţie de iod în prezenţa 1 cm3 soluţie 1 % amidon. Se notează volumul de iod consumat la titrare. Deoarece 1 cm3 soluţie de 0,02 n iod este echivalent la 1,76 mg sau 10 µ mol de acid ascorbic, activitatea PFO ce 56

corespunde unui gram de produs, exprimată în unităţi de „activitatea enzimatică” se calculează după formula: (Vc-Vl) x 10 x 10 APFO = = (Vc-Vl) x 10 5x2 , unde: Vc – volumul soluţiei 0,02 n iod, care s-a consumat la titrarea a 5 cm3 soluţie de control; Vl – volumul soluţiei 0,02 n iod, care s-a consumat la titrarea a 5 cm3 soluţie de lucru; 10 – numărul de µ mol de acid ascorbic; 10 – gradul de diluare a probei; 5 – volumul filtratului, cm3 ; 2 - durata acţiunii enzimei, minute. Întrebări de control: 1. Nomenclatura şi clasificarea enzimelor. 2. Caracteristica enzimei PFO. 3. Este posibilă oxidarea acidului ascorbic cu PFO în lipsa polifenolilor? 4. Pe ce se bazează metoda determinării activităţii PFO? 5. Chimismul determinării activităţii PFO.

57

Lucrarea de laborator nr. 9 Determinarea activităţii enzimei lacaza Lacaza (oxigenreductaza E.C. 1.10.3.1.) este o enzimă de origine fungică secretată de mucegaiul Botrytis cinerea, care în unele condiţii infectează struguri. Lacaza ca şi polifenoloxidaza este o cuproproteidă dar are un spectru de acţiune mult mai larg, oxidînd orto- şi para-difenolii, antociane şi acidul ascorbic din must şi vin. Oxidarea directă a antocianelor este cauza principală a degradării rapide a culorii vinurilor roşii (casarea oxidazică). Tratarea mustului şi vinului cu bentonită şi SO2 puţin reduce activitatea lacazei. Determinarea lacazei în bobiţe, struguri şi vinuri, cunoaşterea caracteristicilor fizico-chimice ale acestei enzime (temperatura optimă, pH-ul optim, constantele, inhibitorii, etc.) permit de a acţiona asupra proceselor de vinificaţie. Lacaza denaturează în 10 minute prin încălzirea mustului, vinului la temperatura 45 oC. Temperatura de 75 oC inactivează lacaza complet. Metodele de determinare a lacazei Sînt utilizate două tipuri de metode: • metode colorimetrice, utilizînd substraturi sensibile, care formează după oxidare compuşi coloraţi, determinaţi prin spectrofotometrie; • metode polarografice, utilizînd electrozi specifici de oxigen pentru determinarea cantitativă a oxigenului consumat din mediu pe parcursul oxidării unui substrat specific de către enzimă.

58

Determinarea colorimetrică a activităţii lacazei Principiul metodei Siringaldazina (4-hidroxi-3,5-dimetoxibenzaldehid azin) este substratul specific utilizat care prezintă o formă redusă fenolică, incoloră sau pînă la galben pal, care după oxidare cu O2 formează o chinonă, care se condensează formînd un compus colorat roşu– violet, apariţia cărui-a poate fi urmărită la spectrofotometru la λ =530 nm (coeficientul de extincţie molară ε = 65000). Chimismul reacţiei: H3COHO-

- OCH3 - HC=N - N=CH -

H3CO -

-OH

-2H+,-2e-

- OCH3

Forma redusa fenolica (incolora pina la galben pal)

- OCH3

H3COO=

=HC-N=N-CH=

H3CO-

=O - OCH3

Forma oxidata chinonica (rosu-violet)

Exprimarea rezultatelor O unitate de activitate a lacazei corespunde cantităţii enzimei care catalizează oxidarea unui nanomol (10-9) de siringaldazina în minut în condiţiile de reacţie (temperatura 20 oC, pH=5, 1cm3 probă prealabil diluată pentru 3 cm3 de amestec reactiv, λ =530 nm; cuva = 1 cm, ε = 65000). 59

Notă: metodele colorimetrice necesită de a lucra cu soluţii destul de limpezi şi incolore la start. Ele pot fi rezervate pentru lucrul în soluţii pure (pentru determinarea pH-lui optim, Km şi Vm) sau în cazul mustului din struguri, pentru determinări în „must decolorat”.

Determinarea activităţii lacazei în soluţii pure Determinările pH-ului optim şi constantelor cinetice (Km şi Vm) necesită utilizarea unei enzime deja purificate. Deci, studiul pH-ului optim va fi efectuat cu Lacaza din Pyricularia oryzæ (disponibilă în comerţ) şi nu din Botrytis cinerea. PH-ul optim: Măsurările sînt efectuate la 20 o C (temperatură ambiantă) într-o soluţie apoasă de lacază pură (EC.1.10.3.2.), determinările la λ =650 nm. Într-o cuvă de sticlă (1 cm3) curată şi uscată se introduc succesiv: 1,4 cm3 soluţie-tampon citrat - fosfat 0,1 M; 0,6 cm3 soluţie siringaldazină de 60 mg/l. Se agită printr-o returnare pentru omogenizare (de a evita contactul amestecului cu degetele, utilizînd parafilm pentru a închide cuva). Cuva se instalează în spectrofotometru, capacul se lasă în jos şi se reglează la indicaţia „0” (zero). Se programează 15 minute la cronometru. Din soluţia analizată de lacază se ia cu exactitate 1 cm3. Foarte rapid acest volum se introduce în cuva de măsurat, (fără a o scoate din spectrofotometru), în acelaşi moment se deschide cronometrul (timpul zero). Amestecul reacţionat se agită prin returnare (scotînd cuva din spectrofotometru şi utilizînd parafilm pentru a închide cuva) şi apoi cuva se reinstalează rapid în aparat. Capacul se lasă jos. 60

Notă: valoarea extincţiei trebuie să fie deja diferită de indicaţia zero iniţială. De notat pentru fiecare probă variaţia extincţiei în fiecare minut, timp de 8 minute (după ce aparatul a fost reglat la "zero" în timpul zero) Determinările se efectuează cu fiecare din soluţiile tampon propuse: tampon citrat – fosfat 0,1 M, pH-3; 4; 5; 6 şi 7. Rezultate 1.Cinetica Trasa-ţi pe aceiaşi foaie de hîrtie milimetrică curbele reprezentative a cineticii de oxidare a siringaldazinei: Extincţia = = f (timpul) pentru diferite valori a pH-lui în soluţiile tampon analizate. (Se va lua ca unitate pentru axa absciselor 25 cm = 10 minute). 2. Vitezele iniţiale Determinaţi pantele curbelor, exprimate în ∆ extincţie/minut. Aceste pante corespund vitezelor iniţiale de oxidare enzimatică. Trasa-ţi curba ∆ Extincţie /minut = f (pH). Analizaţi această curbă. La ce concluzii aţi ajuns? Notă: toate rezultatele experimentate şi calculele trebuie să fie prezentate în formă de tabel.

Determinare activităţii lacazei în must şi struguri Alte tipuri de polifenoloxidaze se găsesc în struguri sănătoşi (în particular tirozinaza), această determinare implică utilizarea unui substrat specific de Lacază. În cazul determinării colorimetrice: De asemenea este obligatoriu de a elimina în prealabil (fără a denatura enzima) compuşii fenolici din mediu (taninuri, antociani) din cauza rolului de inhibitor la oxidarea siringaldazinei. 61

Această eliminare se va face prin tratarea mustului cu o răşină absorbantă : polivinilpolipirolidonă (PVPP). Ordinea îndeplinirii lucrării a) Eliminarea compuşilor fenolici: Într-un balon conic Erlenmeyer de 50 cm3 care conţine 0,8 g PVPP, se dozează 10 cm3 suc (limpezit la necesitate) sau must, se agită energic (aproximativ 1 minut) şi se lasă în contact 10 minute, se filtrează cu vid (filtrul Millipore), recuperînd filtratul (care trebuie să fie decolorat) într-un tub prevăzut pentru acest scop. Aşadar, se obţine prima probă de „suc decolorat”, care va fi diluată, la necesitate, pentru determinarea activităţii. b) Determinarea activităţii Lacazei: Măsurările se vor efectua la spectrofotometru Spectronic 20, temperatura 20 oC şi λ =530 nm. Într-o cuvă de 1 cm, curată şi uscată, se dozează:  2,8 cm3 soluţie-tampon acetat pH=5,0;  1,2 cm3 soluţie de substrat (siringaldazină de 60 mg/l). Soluţia se agită prin returnare pentru omogenizare (fără a pune degetele în contact cu amestecul, utilizînd o bucăţică de peliculă mică de peliculă de film pentru a închide cuva). Cuva se instalează în spectrofotometru, se lasă în jos capacul şi se reglează la indicaţia „0”. Se programează 15 minute la cronometru. Din proba analizată (suc decolorat, prealabil diluat) se ia cu exactitate 2 cm3. Acest volum se dozează foarte rapid în cuva (fără a scoate cuva din spectrofotometru),în acelaşi moment se deschide cronometrul(timpul zero).Amestecul reactiv se agită rin returnare (scoţînd cuva din spectrofotometru şi utilizînd parafilm pentru a închide cuva) şi apoi cuva se reinstalează rapid în aparat. Capacul se lasă jos. 62

Notă: valoarea extincţiei trebuie să fie deja mai mare de „0”, care este valoarea iniţială. Se notează valoarea extincţiei în timp (8 minute). c) Rezultate: 1. Cinetica Trage-ţi Pe aceia-şi foaie de hîrtie milimetrică curbele reprezentative a cineticii oxidării siringaldazinei: Extincţia = f (timpul) pentru diferite probe examinate. (De luat ca unitate pentru axa absciselor 25 cm = 10 minute). 2. Vitezele iniţiale De determinat pantele curbelor, exprimate în extincţie/minut. Aceste pante corespund la vitezele iniţiale de oxidare enzimatică. Transforma-ţi aceste rezultate în „unităţi de activitate” considerînd că, în condiţiile de măsurări utilizate, o soluţie de 1 μmole de siringaldazină pe litru (1μM) reprezintă o extincţie de 0,065 (ε = 65000, l = 1 cm). (P.M. siringaldazină = 360) 3. Comparaţi activităţile Lacazei pentru diferite probe analizate. Ce a-ţi putea spune despre gradul de contaminare cu Botrytis cinerea.?

Determinarea polarografică a activităţii lacazei Principiul metodei Cu ajutorul unui electrod specific la oxigen (electrodul lui CLARC), se măsoară consumul de O2 a unei probe în prezenţa unui reactiv, ce conţine un substrat fenolic specific lacazei (cu excepţia siringaldazinei, de exemplu: hidroxichinona sau altul), asociat cu un ihibitor specific „tirozinazei”. 63

În rezultat, dacă lacaza se conţine numai în boabele contaminate de Botrytis cinerea, boabele strugurilor sănătoşi conţin în mod normal o altă fenoloxidază: tirozinaza (EC 1.10.3.1.), capabilă de a oxida un număr mare de compuşi monofenolici şi orto-difenolici şi care trebuie, deci, să fie inhibaţi în timpul măsurării activităţii numai a lacazei. Electrodul polarografic

Cînd se aplică o diferenţă de potenţial negativă de 0,6-0,8 V între un electrod inert (aur sau platină) şi un electrod de referinţă (de calomel ori Ag/AgCl) într-o soluţie neutră de KCl, oxigenul dizolvat este redus la suprafaţa catodului. Curentul calibrat în raport cu oxigenul dizolvat este înregistrat. Acest curent este proporţional presiunii parţiale a oxigenului dizolvat („presiunea oxigenului”). Cînd catodul, anodul şi electrolitul sînt separaţi de mediu printr-o membrană plastică, permeabilă pentru gaze, dar impermeabilă pentru majoritatea ionilor, rezistenţa esenţială la transferul de masă se datorează în special membranei, ceea ce permite măsurarea „presiunii oxigenului” în diverse lichide. Reacţia la catod: O2 + 2 H2O + 2 eֿ H2O2 + 2 OH 64

H2O2 + 2 eֿ  2 OH Reacţia la anod: Ag + Cl-→ AgCl + eֿ Reacţia sumară: 4Ag + O2 + 2 H2O + 4Cl → 4AgCl + 4OH Fiindcă O2 este rapid consumat la catod, se poate de considerat, că presiunea O2 (Po2) asupra membranei este nulă, deci, forţa responsabilă de difuzie a O2 prin această membrană este proporţională cu Po2 în exteriorul membranei. Dacă Po2 creşte, se e difuzează mai mult O2 prin membrană şi un curent mai mare traversează detectorul; o presiune Po2 mai joasă va corespunde la un curent mai slab. Exprimarea rezultatelor O unitate de activitate a lacazei corespunde cantităţii de enzimă care catalizează consumul a 100 µg de oxigen într-o minut la 1 litru must, în condiţiile experienţei (temperatura 35 oC; pH= 5; 4 cm3 probă prealabil diluată pentru 20 cm3 amestec reactiv saturat cu oxigen). Întrebări de control: 1. Caracteristica lacazei. 2. Explicaţi metoda colorimetrică a activităţii lacazei. 3. Explicaţi metoda polarografică a activităţii lacazei. 4. Cum se determină lacaza în soluţii pure şi must de struguri? 5. Tehnica securităţii la determinarea lacazei.

65

Lucrarea de laborator nr. 10 Determinarea activităţii catalazei după A. Bah şi A.Oparin Oxidoreductazele după mecanismul de acţiune se clasifică în trei grupe:  Dehidrogenaze anaerobe şi aerobe, care sînt enzime transportoare de hidrogen;  Citocromi, care sînt enzime transportoare de electroni;  Oxidaze, enzime care catalizează reacţiile de oxidare a substratului cu oxigenul molecular sau cu oxigenul peroxidic. Oxidazele se împart în trei subgrupe: • Oxigenaze • Hidroxilaze • Oxidaze transportoare de electroni. Oxigenazele – catalizează reacţiile de combinare a substratului cu oxigenul molecular (cu ambii atomi din moleculă): AO2 AOOH; sau A + O2 AH + O2 Hidroxilazele – enzime care oxidează substratul cu formarea concomitentă a apei. Un atom din oxigenul molecular participă la oxidarea substratului, iar alt atom la formarea apei: A + SO + H2O AH2 + S + O2 unde: AH2 – donator de hidrogen; S – substrat; A – donator liber; SO – substrat oxidat. Oxidazele transportoare de electroni conţin în molecula sa ioni metalici şi catalizează reacţia de oxidare a substratului cu ajutorul oxigenului atomic. Oxidazele se împart în două subgrupe: 66

• Cupruoxidaze, enzime care conţin cupru, din ele fac parte fenoloxidazele, polifenoloxidazele, ascorbatoxidaza, tirozinaza etc.; • Feroxidaze, enzime care conţin fier, din ele fac parte peroxidazele şi catalazele. Peroxidazele, sînt enzime cu structura heteroproteidică, adică heminproteide, ce conţin Fe3+. Ele descompun peroxidul de hidrogen (H2O2) numai în prezenţa unui acceptor de oxigen sau a unui donator de hidrogen: H2O2 + A AO + H2O; H2O2 + AH2 2 H2O + A Ele sînt larg răspîndite în regnul vegetal (mai ales în rădăcinile de hrean) şi mai puţin în cel animal (lapte, salivă, ficat, leucocite). Peroxidazele sînt active în struguri în perioada maturării lor. Temperatura de peste 70 oC şi dozele ridicate de SO2 inactivează sau distrug peroxidazele din must şi vin. Catalazele sînt heminproteide, ce conţin Fe3+. Se găsesc în toate celulele vegetale, dar pot fi secretate şi de microorganisme, în special de bacteriile acetice. La animale se conţin mai mult în sînge şi ficat. Catalaza (E.C. 1.11.1.6.) are proprietatea de a descompune peroxidul de hidrogen (apa oxigenată) în apă şi oxigen molecular. Peroxidul de hidrogen poate fi şi donator de oxigen:

H2O2 2 H2O2

catalaza catalaza

H2O + 1/2 O2 2 H2O + O2 67

Catalaza se inhibează de cianuri, hidrogenul sulfurat şi fluoruri. Apa oxigenată se formează la etapa finală de oxidare biologică, cînd dehidrogenazele aerobe (flavinice) transmit hidrogenul direct oxigenului atmosferic. Apa oxigenată (H2O2) este toxică pentru celulele vii. Descompunînd apa oxigenată, catalaza protejează celulele de intoxicaţii. Catalaza este foarte sensibilă şi îşi pierde activitatea la încălzire. Preparatele enzimatice de catalază, obţinute din ficat de bovine sau prin sinteza microbiană, se utilizează în industria alimentară pentru distrugerea H2O2 rămase în urma conservării laptelui, pasteurizării ouălor. Principiul metodei Determinarea activităţii catalazei se bazează pe evidenţa apei oxigenate, descompuse de enzimă timp de 30 minute, prin titrarea peroxidului cu permanganat de potasiu 0,1 N: 5 H2O2 + 2 KMnO4 + 4 H2SO4

5 O2 + 2 KHSO4 + 2MnSO4 + 8 H2O

Diferenţa volumelor de soluţie 0,1N KMnO4 (cm3) a probei de control şi probei de lucru, indică cantitatea apei oxigenate descompuse de enzimă. Ordinea îndeplinirii lucrării a) Pentru probe solide Aparate, vase şi materiale:     

baloane conice 100 cm3 şi 250cm3 ; cilindru de 100 cm3; mojar cu pistil; pipete 5, 10 şi 20 cm3; biuretă 25 cm3; 68

   

soluţie 1 % apă oxigenată; soluţie 0,1N KMnO4; soluţie 10 % H2SO4; probe de produs (făină, cereale, malţ).

5 g de produs se infuză timp de 1,5 ore cu 100 cm 3 apă distilată la temperatura camerei în balon conic de 250 cm3. Suspensia obţinută se filtrează prin hîrtie de filtru pliată. Pentru determinare se iau două probe cîte 20 cm3 de filtrat limpede. Conţinutul probei de control se fierbe timp de 5 minute pentru inactivarea enzimei. În ambele probe se dozează cîte 20 cm3 apă distilată şi 3 cm3 soluţie 1 % peroxid de hidrogen şi se lasă pentru 30 minute la temperatura de cameră. Acţiunea enzimei este stopată prin administrarea a 3 cm3 soluţie 10 % de H2SO4, iar restul de peroxid de hidrogen se titrează cu soluţie 0,1 n de KMnO4. Diferenţa volumelor de soluţie 0,1n de KMnO4 (cm3) a probei de control şi probei de lucru, indică activitatea enzimei. Activitatea catalazei poate fi exprimată în mg peroxid de hidrogen sau cm3 soluţie 0,1 n KMnO4 la 1g produs analizat. 1 cm3 soluţie 0,1n KMnO4 corespunde 1,7 mg peroxid de hidrogen. Activitatea catalazei (Ac) în mg H2O2/g x 30 min se determină după formula:

Ac =

(a-b) x 1,7 x 5 n

unde: a – volumul soluţiei 0,1N KMnO4 pentru titrarea probei de control, cm3; b - volumul soluţiei 0,1N KMnO4 pentru titrarea probei de lucru, cm3; 5 – recalcularea la volumul extractului 1,7 – mg H2O2 echivalente 1cm3 0,1N KMnO4; n- masa probei, g. 69

b) pentru probe lichide Aparate, vase şi materiale:  soluţie 1 % de apă oxigenată, prealabil neutralizată cu soluţie 0,1n NaOH;  soluţie 0,05 n de KMnO4;  soluţie 10 % de H2SO4;  probe de produs (vin, suc). În 4 baloane conice cu dop rodat de 100 cm3 se adaugă cîte 10 cm3 de vin sec. Două probe ( de control) se fierb 5 minute cu răcitor invers pentru inactivarea enzimei. În două probe de lucru şi în cele de control se adaugă cîte 10 cm3 de apă distilată şi cîte 3 cm3 soluţie 1% de H2O2, preventiv neutralizată cu soluţie 0,1n NaOH şi se lasă în repaus 30 minute la temperatura camerei. Apoi în toate probele se adaugă cîte 5 cm3 soluţie 10 % H2SO4, se agită bine şi se titrează cu soluţie 0,05 n KMnO4. Titrarea continuă pînă cînd apare culoare roză stabilă 5 secunde. Activitatea catalazei se exprimă prin cantitatea de peroxid, descompusă de enzimă timp de 30 minute, care se conţine în 1 cm3 de vin. Activitatea catalazei se determină după formula:

Ac =

(a-b) x 0,85 n

unde: a – volumul soluţiei 0,05 n de KMnO4 pentru titrarea probei de control, cm3; b - volumul soluţiei 0,05 n de KMnO4 pentru titrarea probei de lucru, cm3; 0,85 – mg de H2O2 echivalente cu 1cm3 0,05 n de KMnO4; 70

n - volumul vinului analizat, cm3. Întrebări de control: 1. Caracteristica oxidoreductazelor, oxidazelor. 2. Explicaţi de ce catalazele se referă la oxidaze. 3. Importanţa catalazelor şi peroxidazelor pentru organismele vii. 4. Descrieţi metodele de determinare a catalazei în produse solide şi lichide.

71

Lucrarea de laborator nr. 11 Determinarea părţii de masă a amidonului În prezent toate polizaharidele convenţional se împart în două grupe: oligoglucide (oligozide) şi polizaharide superioare (poliozide sau poliglucide). Din oligozide fac parte ozidele cu o masă moleculară relativ mică, care conţin 10-20 resturi de monoze. Poliozidele sînt substanţe macromoleculare cu un număr mare de resturi de monoze (de la cîteva zeci pînă la cîteva mii), şi alte substanţe, care, nu fac parte din glucide, numite agliconi. Cele mai importante din ele sînt poliozidele vegetale: amidonul, celuloza, hemicelulozele, inulina, substanţele pectice etc., şi poliozidele de origine animală: glicogenul şi aşa-numitele mucopoliglucidele (acizii hialuronic, condroitinsulfuric, heparina şi altele). Importanţa analizei: Un rol important ca substanţă de rezervă în plante îl are amidonul, la fel şi glicogenul - atît pentru om cît şi pentru animale. Amidonul reprezintă o poliglucidă de rezervă cu formula (C6H10O5)n, care se depozitează sub formă de granule (de la 2 pînă la 150 μm) în tuberculi, seminţe, frunze, rădăcini şi chiar în părţile lemnoase ale plantelor. Granulele de amidon la diferite specii se deosebesc după dimensiuni, formă, componenţa chimică şi proprietăţi, ce serveşte ca metoda determinării provenienţei fainei. Amidonul este un praf, insolubil în apă rece, alcool şi eter. În apă caldă se umflă formînd geluri. Amidonul este constituit din 3 % substanţe minerale, acizi graşi şi 97 % amiloză, amilopectină. Amiloza este o poliglucidă liniară care conţine 200 – 1000 resturi de α – D – glucopiranoză, unite prin legături glicozidice de tipul α –1,4 în lanţ liniar (masa moleculară variază pînă la 30.000 – 72

1000.000 unităţi). Caracteristica amilozei şi amilopectinei este prezentată în tabelul 1. Caracteristica amilozei şi amilopectinei. Tabelul 1. Structura chimică Forma moleculei Reacţia cu I2 Masa moleculară Solubilitate a Stabilitatea soluţiilor

Amiloza Polimer al α – D – Glp format prin legătura α (1→4) Neramificată Culoarea albastră

Amilopectina Polimer al α – D – Glp format prin legătura α (1→4) şi α (1→6) Ramificaţia la fiecare 20 de resturi Culoarea albastru–violet

100 – 900 de mii

Pînă la 20*106

Solubilă în apa caldă, formează soluţii cu viscozitatea relativ joasă, nu se gelifică Instabile

Se dizolvă la temperaturi înalte, formează soluţii cu viscozitate înaltă, se gelifică. Stabile

Structura macromoleculei de amiloză:

73

Structura macromoleculei de amilopectină:

Amiloza în apă caldă formează o dispersie coloidală (dar nu formează geluri). Amiloza se colorează cu iodul în albastru. Molecula amilopectinei este puternic ramificată. Este alcătuită din 600 – 6000 resturi de α – D – glucopiranoză, legate între ele prin legături α –1,4 şi după 25-30 resturi de glucoză apare o ramificare cu legătura glucozidică de tipul α –1,6. Masa moleculară a amilopectinei este cuprinsă între 100 000 şi 1 000 000 unităţi sau zeci de milioane unităţi. De exemplu, în componenţa amidonului de cartofi se conţin fracţii de amilopectină cu masa moleculară mai mare de 70 mln. unităţi. Amilopectina nu se dizolvă în apă rece. Cu iodul se colorează în albastru-violet. În apă caldă formează un sistem dispers stabil cu viscozitate mare (cleister). Principalele tipuri de materie primă care conţin amidonul sînt cartofii, cerealele şi produsele de prelucrare a lor (crupele, făina). Conţinutul amidonului în cartofi în mediu constituie 17,5 % (sau 70-80 % din masa uscată), în seminţele cerealelor 40-80 % din masa uscată. Amidonul uşor hidrolizează în prezenţa acizilor minerali (chiar diluaţi), pînă la glucoză:

74

(C6H10 O5)n

+ n H2O

dextrine Acid mineral

nC6H12 O6 Acid mineral

Hidroliza amidonului este catalizată şi de enzimele α- şi βamilaze, care se conţin în malţ şi în salivă. Produsul final al acestei hidrolize enzimatice este maltoza: amilaze amidon

amilaze dextrine

maltoza

Amidonul la 96,1 –97,7 % este format din polizaharide, care la hidroliza acidă formează glucoza. De aceea metodele existente de determinare cantitativă a amidonului se bazează pe proprietăţile glucozei de reducere, activitatea optică etc. Din cele mai răspîndite metode de determinare a amidonului pot fi numite: polarimetrice, colorimetrice, chimice, gravimetrice. În industria fermentativă de producere a amidonului şi melasei, în alte ramuri ale industriei alimentare sînt răspîndite metodele polarimetrice (metodele Evers, Lintner, Arhipovici). Metoda Evers este metoda standard de bază pentru determinarea amidonului la aprecierea calităţii cerealelor şi produselor de prelucrare a lor. Pentru determinarea conţinutului de amidon în materia primă vegetală prin această metodă este necesar în prealabil de transferat amidonul în stare solubilă şi de hidrolizat pînă la glucoză, ce se realizează prin tratarea produsului analizat cu acid clorhidric sau cu clorură de calciu. Pentru a înlătura substanţele însoţitoare (care împiedică determinarea), îndeosebi proteinele, şi pentru a limpezi hidrolizatul, soluţia este tratată cu unul din reactive – precipitante, care pot fi: acidul dodecawolframofosforic, acidul picric, molibdatul de amoniu, reactivul Karrez (un amestec de soluţii ale sărurilor ferocianurii (II) 75

de potasiu şi sulfatului de zinc). Soluţia transparentă se polarimetrează. Aparate, vase şi materiale:  zaharimetru universal CУ-3;  cîntar tehnic;  baia de apă;  2 baloane cu cotă de 50 cm3;  baloane conice de 250 cm3;  cilindre de 25 cm3;  pipete de 2, 5, 10, 25 cm3;  pîlnie din sticlă;  filtru de hîrtie;  soluţie 0,31n de HCl (sau soluţie cu concentraţia 1,124%);  soluţie 25 % HCl;  reactivul Karrez I: (15g [K4Fe (CN)6]3 X 3 H2O cu eroarea ± 0,01 g, se dizolvă în balon cotat 100 cm3 şi se aduce cu apă distilată pînă la cotă);  reactivul Karrez II: (30g ZnSO4 X 7 H2O cu eroarea ± 0,01 g, se dizolvă în balon cotat 100 cm 3 şi se aduce cu apă distilată pînă la cotă). Reactivul Karrez I şi II pot fi înlocuite cu soluţie 2,5 % molibdat de amoniu sau soluţie 4 % de acid dodecavolframofosforic;  produse pentru analiză: făină, crupe şi cereale măcinate. Ordinea îndeplinirii lucrării Proba de lucru. Într-un balon cotat uscat de 50 cm3 se dozează cu cilindru 15 cm3 soluţie 0,31 n de HCl. Cu ajutorul pîlniei se administrează agitînd permanent 2,5 g de produs analizat (făină, crupe, etc). Pîlnia şi gîtul balonului se clătesc cu 10 cm3 soluţie 0,31 n de HCl. Conţinutul balonului se menţine 3 minute în baia de apă la temperatura fierberii, agitînd permanent. Apoi încălzirea în baia de 76

apă se prelungeşte 12 minute. Balonul se scoate din baia de apă şi repede se răceşte sub robinet pînă la ot = 20 oC. Pentru a precipita proteinele şi a limpezi soluţia în balon se adaugă cu cilindrul reactivul – precipitant: cîte 1 cm3 soluţie Karrez I şi II. După 5 minute conţinutul balonului se aduce cu apă distilată pînă la cota 50 cm3. Soluţia se agită şi se filtrează prin hîrtie de filtru pliată într-un balon conic uscat. Primele porţii de filtrat (pînă la 5-10 cm3) nu se folosesc. Cu filtratul limpede la ot = 20 oC se umple tubul de polarizare cu lungimea 2 dm. Se determină unghiul de rotaţie a planului de polarizare la zaharimetru CУ-3. Concomitent se pregăteşte proba de control pentru a introduce corecţie la substanţele solubile în apă optic active care, nu precipită cu reactivul precipitant şi se găsesc în soluţie (în special glucidele). Pentru proba de control se cîntăreşte 5 g de produs, care se transferă în balonul cotat de 50 cm3, se adaugă 30 cm3 apă distilată şi se agită timp de 15 minute. Pîlnia şi gîtul balonului se clătesc cu 10 cm3 apă distilată şi soluţia se decolorează cu reactivul– precipitant Karrez I şi II ca în proba de lucru. Timp de 5 minute conţinutul balonului se agită şi se aduce cu apă distilată pînă la cota 50 cm3, se filtrează. Se măsoară cu cilindrul 25 cm3 de filtrat limpede, se transferă într-un balon cotat de 50 ml şi se adaugă 1 cm3 soluţie 25 % HCl, se menţine 15 minute în baia de apă la fierbere, apoi se răceşte sub robinet pînă la ot = 20 oC şi se aduce pînă la cotă cu apă distilată. Cu filtratul limpede la ot = 20 oC, se umple tubul de polarizare cu lungimea 2 dm. Se determină unghiul de rotaţie a planului de polarizare la zaharimetru CУ-3. Conţinutul amidonului se calculează după formula:

C=

(α l − α c ) × 100 × 100 × 50 [α ] 20D × m × l × (100 − W ) ,

unde: C – partea de masă a amidonului (%) în substanţe uscate; αl– mărimea unghiului de rotaţie a planului de polarizare obţinut de substanţele optic active în experienţa de bază, în grade a zaharimetrului ; 77

αc – mărimea unghiului de rotaţie a planului de polarizare obţinut de substanţele solubile în apă optic active (nu de amidon) în proba de control, în grade a zaharimetrului; (αl - αc) – mărimea unghiului de rotaţie a planului de polarizare obţinut de proba de amidon dizolvată, în grade a zaharimetrului; m – masa (2,5 g) produsului analizat, g; l – lungimea tubului de polarizare, dm; [α] D20 – capacitatea de rotaţie spicifică a amidonului din produsul analizat, în grade; W – conţinutul de masă a umidităţii în produsul analizat, %. De obicei pentru a calcula conţinutul de masă a amidonului se utilizează tabelul 1, unde sînt date mărimile capacităţii de rotaţie specifică [α] D20 pentru diverse produse ce conţin amidon şi coeficientul Evers (F, egal cu 1000/[α]D20), pentru diverse produse ce conţin amidon. Capacitatea de rotaţie specifică [α] D20 pentru diverse produse ce conţin amidon. Tabelul 1. Amidon [α] D20 F Orez 176,7 5,66 Grîu 177,5 5,64 Porumb 177,5 5,64 Cartofi 181,2 5,50 1. 2. 3. 4. 5. 6.

Întrebări de control: Structura şi proprietăţile amilozei. Structura şi proprietăţile amilopectinei. Hidroliza amidonului. Metodele principale de determinare a amidonului în produse vegetale. Care este principiul de determinare a amidonului în metodele polarimetrice ? Ce reprezintă coeficientul Evers ? 78

Lucrarea de laborator nr. 12 Determinarea fotocolorimetrică a vitaminei C Vitamina C sau acidul ascorbic este cea mai răspîndită vitamină în regnul vegetal şi poate fi sintetizată de toate animalele excepţie fiind omul, primatele şi cobaiul. Insuficienţa în hrană a vitaminei C duce la oboseală, dureri de dinţi. Lipsa în organism este determinată de apariţia scorbutului. Boala se manifestă prin inflamarea şi sîngerarea gingiilor, insuficienţă cardiacă şi apariţia de hematoame. Necesitatea zilnică pentru om este de 50-100 mg. Conţinutul vitaminei C este mai mare în fructe şi frunze, în cantităţi mai mici se conţin în rădăcini şi în cantităţi minime de tot în organismele animale (tab.1). Conţinutul de acid ascorbic în produse vegetale (mg -% sau mg/100 g de produs) Tabelul 1 Produsul vegetal

Conţinutul de Produsul Conţinutul de acid ascorbic vegetal acid ascorbic Coacăză Ardei verde 100-400 100-400 neagră Pătrunjel 150 Lămîi 40 Mărar 100-150 Mere 3-17 Varză albă 30-50 Vişine 15 Măcriş 40-60 Struguri 3-12 Măceşul de Cartofi 20-30 2000-4500 nord Ceapă verde 30 Nuci verzi 3000 Tomate 20-25 Cătină albă 100-400 Mazăre Cetină de 25 150-200 verde brad şi pin Acidul ascorbic participă activ în procesele de oxidare şi reducere care au loc în celula vie. Acesta se datorează sistemului 79

(acid ascorbic - acid dehidroascorbic) care are rol de reglare a potenţialului redox din celule, contribuind la transportul hidrogenului. Prin oxidare lentă vitamina C se transformă în acid dehidroascorbic: CH -2H +2H H-C HO O O=C H2-C-H -C CH +OH + 2OH

O=C

O=C +

-2 H

HO - C HO - C

O

O=C

+ 2 H+

O

O=C

HC

HC

HO - C - H

HO - C - H CH2OH

CH2OH

acid L-ascorbic acid L-dehidroascorbic În plantele crucifere (varză, ridiche de iarnă, ridiche de lună etc.) alături de acidul ascorbic liber se conţine forma (complexul) asociată, numită a s c o r b i n o g e n. Structura lui poate fi redată prin formulele următoare: O C O HC - CH2 - C

CH C - OH O HC

NH

HO - C - H CH2OH

80

O

O C

O CH2 - C

CH

HC

C - OH

O

O HC

NH

HO - C - H CH2OH

Această substanţă în prezenţa acidului clorhidric uşor se hidrolizează formînd acidul ascorbic liber. Hidroliza ascorbinogenului are loc în tubul digestiv. Proprietăţile chimice ale acidului ascorbic Vitamina C aparţine acizilor deşi în structura sa lipseşte gruparea carboxilică – COOH. Vitamina C este lactona unui acid hexonic şi caracterul acid se datorează grupei –OH enolice de la C3. De aceea cu baze diluate acidul ascorbic formează săruri.

O

O

C C - OH C - OH

C C

NaOH O +

O

O C - O Na

HC

HC

HO - C - H

HO - C - H

+

H2O

CH2OH

CH2OH

Ascorbinat de sodiu Acidul ascorbic uşor reduce iodul, diclorfenolindofenolul şi alţi oxidanţi. 81

2,6–

O

O

C

C - OH C - OH

+

O

C

I2

C

O

C

O

HC

HC

HO - C - H

HO - C - H

CH2OH

+

O

2 HI

CH2OH

În prezenţa oxidanţilor mai puternici, îndeosebi în mediul neutru şi bazic, acidul ascorbic trece ireversibil în acid oxalic şi treonic: O

C

O

C - OH C - OH

O

O

C

COOH

C

O

C

O

HC

HC

HO - C - H

HO - C - H

CH2OH

O

H2O

COOH

acidul oxalic

C

O

O

COOH

C

O

H2O

COOH

+

H-C-OH

H-C-OH

HO - C - H

HO - C - H

CH2OH

CH2OH

acidul 2,3-diceto-L-gulonic

CH2OH

acidul treonic

Vitamina C este foarte instabilă, se distruge în mediul neutru şi bazic la temperatura 20 oC, este mai stabilă în mediul acid. Conţinutul în acid ascorbic scade mult la conservare şi fierberea alimentelor. Uşor se distruge în prezenţa luminii şi oxigenului, cationilor metalelor grele şi mai repede în prezenţa enzimelor din clasa oxidoreductazelor (ascorbatoxidazei, polifenoloxidazei). Conţinutul în acid ascorbic se micşorează mult în procesul păstrării materiei prime alimentare. Principiul metodei Acidul ascorbic se extrage din materialul analizat cu acid oxalic. După filtrarea extractului (cu pH-ul 3-4) se titrează cu soluţie de 0,001n 2,6-diclorfenolindofenol. Ultimul este un oxidant 82

selectiv şi reacţionează cu acidul ascorbic, dar nu reacţionează asupra zahărului şi a altor substanţe reducătoare. Cl

Cl

O

N

H

ONa

+

O

Cl 2,6-diclorfenolindofenolat de sodiu (albastru) diclorfenolindofenol (roşu)

N Cl

2,6-

C

O

Cl O

OH

N

OH + Na

C - OH O C - OH

+

HC

Cl

HO - C - H CH2OH

O

C C

O

C

O

Cl O

HC HO - C - H CH2OH

+

HO

NH Cl

substanta incolora

Aparate, vase şi materiale:  fotocolorimetru, KFK-2;  cîntar tehnic;  mojar cu pistil;  trei baloane cotate de 100 cm3;  şase eprubete;  pipete de 0,5; 1,0; 5,0; 10,0; 20,0 cm3;  pîlnie din sticlă;  filtru din materie, 83

OH

 soluţie de acid oxalic de 1 %;  soluţie de 0,001n de sare de sodiu 2,6diclorfenolindofenol;  cristale de acid ascorbic;  produse pentru analiză: mere, struguri, măcriş, mărar, ceapă verde, varză, cartofi etc. Pregătirea soluţiei de 2,6 - diclorfenolindofenol Reactivul (sau indicatorul) se pregăteşte cu soluţie-tampon fosfată cu pH= 6,9 – 7,0 deoarece în soluţia apoasă el se distruge. Pentru tampon se pregătesc următoarele soluţii: KH2PO4 – 9,078 g în 1 dm3 de apă distilată şi NaHPO4 x 2 H2O –11,867 g în 1 dm3 de apă distilată. Fiecare soluţie se păstrează aparte. Înainte de întrebuinţare soluţiile se amestecă: 2 volume soluţie KH2PO4 şi 3 volume soluţie NaHPO4. 0,26 g de reactiv 2,6- diclorfenolindofenol se transferă în balonul cotat de 1 dm3, se adaugă 700 cm3 apă distilată, amestecul se aduce pînă la cotă cu soluţie-tampon pH= 6,9 – 7,0. Soluţia de 2,6 – diclorfenolindofenol se păstrează la întuneric nu mai mult de 7 zile. Titrul soluţiei se controlează zilnic cu soluţie 0,01 n tiosulfat de sodiu. Determinarea titrului se bazează pe proprietatea 2,6diclorfenolindofenolului de a oxida cantitativ iodidul în iod. Determinarea titrului 2,6- diclorfenolindofenolului În patru baloane conice de 50 cm3 se dozează:  în primele două (probe de lucru) cîte 10 cm3 soluţie indicator, 0,5 -1 cm3 acid sulfuric (1:4) şi 1 cm3 soluţie 10 % KI;  în cele de control în loc de indicator se adaugă 10 3 cm apă distilată, 0,5 -1 cm3 acid sulfuric (1:4) şi 1 cm3 soluţie 10 % KI. Soluţia din baloane se agită şi iodul, eliberat la oxidarea KI, se titrează în prezenţa soluţiei 1 % amidon cu 0,01n de tiosulfat. Cantitatea de acid ascorbic care corespunde la 10 cm3 de 2,6- diclorfenolindofenol se determină prin înmulţirea volumului soluţiei de tiosulfat, care a mers la titrare cu coeficientul 0,88. (V lucru - V control) * 0,88 T= 10 84

Ordinea îndeplinirii lucrării Analiza produselor lichide 40-50 cm3 de suc sau must se dozează în balon cotat de 100cm3 şi se aduce pînă la cotă cu soluţie de 5 % acid acetic. Amestecul se agită şi cu pipeta se transferă 30-40 cm3 într-un balon cotat de 50 cm3 în care se adaugă 0,5 g CaCO3 praf (în cantităţi mici pentru a evita spumegarea). După dizolvarea CaCO3 se dozează 5-10 cm3 soluţie acidă de 5 % de acetat de plumb. Amestecul se aduce pînă la cotă cu soluţie de 5 % acid acetic. Soluţia se amestecă şi se filtrează sau se centrifughează. Ulterior se măsoară cu pipeta (în dependenţă de conţinutul acidului ascorbic) 10-20 cm3 de filtrat şi se titrează din microbiuretă cu soluţie 0,001 n 2,6diclorfenolindofenol pînă la apariţia culorii slab roze, care se menţine timp de 30-60 secunde. Se fixează volumul de 2,6diclorfenolindofenol consumat la titrare şi se adaugă 2 picături (de control) 2,6- diclorfenolindofenol şi dacă apare culoare roză intensivă se consideră că titrarea a fost efectuată corect. Se repetă titrarea la probe de 2-3 ori. Conţinutul acidului ascorbic se calculează după formula: 100 100 50 =V x T x x x V1 x D V3 V2 unde: a – conţinutul de acid ascorbic în mg-%; V - volumul soluţiei de 2,6-diclorfenolindofenol consumat la titrare; T - cantitatea de acid ascorbic în mg, care corespunde la 1 cm3 de 2,6-diclorfenolindofenol; V1 – volumul de suc sau must luat pentru analiză, în cm3; V2 – volumul probei luat la titrare în cm3; V3 – volumul probei luat pentru titrarea cu acetat de plumb, în cm3; D – densitatea optică a sucului sau a mustului analizat.

a

85

Analiza produselor solide (prin metoda fotocolorimetrică) Proba produsului analizat (10 g) se transferă în mojar şi se mărunţeşte cu pistilul în prezenţa acidului oxalic de 1 %. Apoi, cantitativ se transferă în balonul cotat de 100 cm3 , se aduce pînă la cotă cu acid oxalic şi se agită. Conţinutul balonului se filtrează prin filtrul de materie într-un balon conic. În filtratul obţinut se adaugă 6 cm3 2,6–diclorfenolindofenol. În continuare, se determină extincţia D1: soluţia obţinută se transferă în cuvă (cu lungimea de 1 cm), se fotocolorimetrează la lungimea de undă λ=540 nm (contra apei distilate). La determinarea extincţiei D2: în cuva cu soluţie analizată se adaugă cîteva cristale de acid ascorbic (culoarea 2,6-diclorfenolindofenolului dispare) soluţia se agită şi iarăşi se fotocolorimetrează. Pentru a introduce o corecţie la schimbarea intensităţii culorii la păstrarea soluţiei de 2,6-diclorfenolindofenol, se măsoară extincţia amestecului (Do), format din 10 cm3 de 2,6diclorfenolindofenol, 6 cm3 de soluţie de 1 % de acid oxalic. Ulterior se măsoară extincţia (D) soluţiei proaspăt pregătite de 2,6diclorfenolindofenol, din care se scade extincţia (Do). Densitatea optică a soluţiei analizate se determină după formula:

Dx = D1 + (D - Do) - D2

Corecţia (D-Do) se include în calcul atunci cînd calibrarea şi determinarea D1 şi D2 nu se face în aceeaşi zi. După graficul de calibrare se determină concentraţia de acid ascorbic (Cx) care corespunde Dx. Graficul de calibrare Substrat ascorbic: se dizolvă 100 mg acid ascorbic în balon cotat de 100 cm3 şi se aduce pînă la cotă cu soluţie 1 % acid oxalic. 86

Pentru a construi graficul de calibrare se diluează substratul ascorbic: 10 cm3 soluţie de substrat ascorbic se transferă în balon cotat de 100 cm3 şi se aduce la cotă cu soluţie de 1 % acid oxalic (concentraţia soluţiei diluate de substrat ascorbic este 100 mkg/cm3). În şase cilindre se administrează de la 1 cm3 pînă la 6 cm3 de soluţie diluată de substrat ascorbic, (ce va corespunde concentraţiilor 16,6; 33,2; 50,0; 100 mkg/cm3) apoi se dozează 10cm3 soluţie proaspăt pregătită de 2,6-diclorfenolindofenol. Volumul la fiecare cilindru se aduce pînă la 16 cm 3 cu soluţie de acid oxalic de 1 %. Exemplu: C, mkg/cm3 D

16.6 1.3

33.2 1.2

50 1

66.6 0.8

83.2 0.7

100 0.6

Determinarea concentraţiei de vitamina C D 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 0

20

40

60

80

100

120

C, m kg/cm 3

Recalcularea în mg-% (mg de vitamina C în 100 g de produs alimentar): 87

K =

C * 100 * 100 a * 1000

K – conţinutul de vitamina C în mg-%, a – masa probei; 1000- recalcularea în mg. Întrebări de control: 1. Care sînt proprietăţile fiziologice ale acidului ascorbic ? 2. În care produse se găseşte vitamina C în cantităţi mai mari ? 3. Scrieţi structura şi proprietăţile chimice ale acidului ascorbic. 4. Principiul metodei de determinare a acidului ascorbic. 5. Descrieţi metoda determinării acidului ascorbic în produse lichide şi tari. 6. Argumentaţi formula de calcul a acidului ascorbic prin două metode. 7. Regulile tehnicii de securitate la determinarea acidului ascorbic.

88

Lucrarea de laborator nr. 13 Metoda cromatografică de determinare a carotinelor Însemnătatea analizei Rolul biochimic al vitaminei A:  intră în componenţa membranelor plasmatice, micşorează permeabilitatea la factori patogeni, prin aceasta protejează celulele epiteliale;  participă în recepţia luminii, fiind în componenţa purpurului vizual - rodopsinei;  participă la fotosinteză, în reglarea fosforilării oxidative, ciclului acizilor tricarboxilici, biosintezei mucopoliglucidelor; Insuficienţa vitaminei A duce la încetarea creşterii copiilor, se micşorează rezistenţa la infecţii. Apare boala „orbul găinilor” (hemeralopia) – scăderea vederii în amurg ori noaptea. Lipsa vitaminei A în hrană provoacă boala „xeroftalmie” (grec. xeros – uscat, ophtalmos - ochi) din cauza inflamării corneei şi cheratinizării epiteliului canalelor lacrimogene, ceea ce duce la închiderea lor. Aceasta boală se întîlneşte mai des la copii. Necesitatea zilnică în vitamina A pentru un om matur constituie 1,5 – 2 mg, iar în carotine 3 – 5 mg. Vitaminele grupei A se găsesc exclusiv în produse animale. În cantităţi mai mari în untura şi ficatul de peşte. De exemplu în bibanul marin – 5 mg-%; în paltus – 8 mg-%; în ficatul de vite – 1,5 – 2 mg-%. În cantităţi mai mici se găsesc în lapte, unt, gălbenuş de ou, etc. În natură se întîlnesc vitamina A1 şi A2. Vitamina A1 (retinol) reprezintă un alcool, ce are în moleculă ciclul β – iononic, o catenă laterală din 2 resturi izoprenice şi gruparea terminală – CH2– OH în poziţia trans, conţine 5 duble legături conjugate. 89

Vitamina A2 (dehidroretinol) se întîlneşte mai mult în ficatul peştilor de apă dulce. Are în plus o legătură dublă în poziţiile 2-3 ale ciclului β – iononic. Structura chimică a vitaminei A1 C20H30O.

__ __

CH=CH

__

C = CH

CH3 __

CH =CH

__

__

CH3

CH3

__

H3C

C = CH

__

CH2OH

CH3

Structura chimică a vitaminei A2 C20H28O. CH3

__ CH=CH __ __

C = CH

CH3 __

CH =CH

__

__

CH3

__

H3C

C = CH

__

CH2OH

CH3

Provitaminele sau carotine se conţin în produse vegetale şi plante, sînt hidrocarburi cu structura C40H56, substanţe cristaline de culoare oranj. Se conţin în: morcov – 5 – 15 mg-%, verdeaţă – 3 – 10 mg-%, mai puţin în frunze şi struguri verzi, caise, piersici, pepene galben, bostan, iar în roşii se conţine licopina. În vinuri lipseşte, dar poate fi în cantităţi mici în vinurile aromatizate. Din carotine se cunosc trei izomeri: α, β, γ, care se deosebesc prin caracterul şi numărul de cicluri: β – carotina este mai activă, deoarece conţine două cicluri β – iononice; α – carotina conţine un ciclu β – iononic şi altul α – iononic; γ – carotina conţine numai un ciclu β – iononic. În organismul omului şi animalelor carotinele se transformă în vitamina A. Din β–carotina prin hidroliza enzimatică în organismul animal se formează 2 molecule de vitamina A1. Iar din α şi γ–carotine se obţine numai cîte o moleculă de vitamina A1.

90

β – carotina + HO

CH3

__ __

(CH=CH

__

C = CH)2

__

H3C

CH3

H

CH3

__ CH=CH)2 CH = CH__ (CH=C

+ H

CH3

__

__

CH3

__

H3C

__

H3C __

OH

CH3

H3C

__ __

(CH=CH

__

C = CH)2

__

__

2

CH2OH

CH3

CH3

α – carotina

__

(CH=CH

__

C = CH)2

__

__

__

H3C

CH3

CH3

CH3

__

H3C

CH3

__ __ CH = CH (CH= C CH=CH)2 H3C __

CH3

γ – carotina

__

(CH=CH

__

C = CH)2

H3C

CH3

CH3 __

CH = CH

__

__

CH3

__

H3C

(CH= C

__

CH=CH)2

__ CH

__

CH3

HC

H3C __

3

licopina H3C

CH3

CH3

H3C

__

CH3

__

C

__ __ __ __ __ HC CH __ (CH=CH C = CH)2 CH = CH (CH= C CH=CH)2 __

CH3 C

H3C __

CH3

Vitamina A şi carotinele uşor se descompun, se oxidează cu oxigenul din aer din cauza prezenţei legăturilor duble în molecula lor. De aceea nu se poate de păstrat mult timp morcovul şi verdeaţa tăiate mărunt. 91

Carotenoidele se folosesc ca coloranţi naturali netoxici în industria alimentară, farmaceutică, medicină, cosmetică şi ca adaos în hrana animalelor de fermă pentru intensificarea coloritului unor produse alimentare (gălbenuşul de ou, grăsimea corpului păsărilor). Principiul metodei de determinare a carotinelor Se bazează pe extragerea lor cu solvenţi organici corespunzători din plante (fructe) mărunţite şi prin separarea ulterioară a impurităţilor cu ajutorul cromatografiei de adsorbţie urmată de fotocolorimetrare. În practica de laborator se foloseşte pe larg metoda cromatografică de separare a carotinelor după M. S. Ţvet, modificată de I.K. Murri. Aparate, vase şi materiale:  fotocolorimetru KFK - 2;  coloana cromatografică – tub de sticlă cu lungimea 30 cm cu diametrul inferior 1 cm;  balon Bunzen, uscat;  pompa cu vid;  mojar cu pistil;  baloane cotate 50, 100 cm3, uscate;  adsorbent – Al2O3 (praf) sau carbonat acid de magneziu activat;  Na2SO4 calcinat;  probe de materie primă (legume colorate, fructe, plante verzi);  hîrtie de filtru;  solvent organic: eter de petrol sau pentan, hexan, heptan, etc. NOTĂ: Solvenţii organici sînt inflamabili. Respectaţi regulile de securitate !

92

Ordinea îndeplinirii lucrării Metoda cromatografică Proba de material vegetal 1 g (pînă la 5 g în dependenţă de umiditate) se mărunţeşte în mojarul de porţelan cu pistilul, dar nu mai mult de 30 minute, pentru a evita oxidarea carotenilor. Pentru deshidratarea probei în mojar se adaugă periodic cristale de Na2SO4 calcinat pînă cînd se obţine o masă uscată, fină. Masa obţinută se lasă în mojar pe 20 – 30 minute. În partea îngustă a coloanei cromatografice se pune un tampon de vată cu grosimea 1 de cm. Apoi coloana se umple cu Al2O3 (praf) pînă la înălţimea 5-10 m, în dependenţă de cantitatea carotinelor şi compoziţia pigmenţilor adsorbiţi. Pe suprafaţa stratului adsorbant se aşează hîrtie de filtru. Proba de analizat mărunţită se transferă cantitativ în coloana cromatografică. Coloana cromatografică se uneşte cu balonul Bunzen (fig.1). În coloană se toarnă solvent organic pînă cînd conţinutul ei devine umed Balonul Bunzen se uneşte la pompa cu vid sau la pompa de apă. Proba de analizat se spală cu solvent (1-2 picături pe secundă), pînă cînd culoare galbenă a picăturilor dispare. Este necesar ca adsorbantul să fie acoperit tot timpul cu solvent organic, deoarece carotenii uşor se oxidează în curentul de aer care trece prin coloană. Conţinutul balonului Bunzen se transferă în balonul cotat de 50 sau 100 cm3 şi se aduce pînă la cotă cu solvent. Conţinutul de carotene din soluţia obţinută se determină prin metoda fotocolorimetrică. La aparatul KFK – 2, la lungimea de undă λ=540 nm (filtrul de lumină verde), dacă soluţia este colorată intensiv galben – oranj şi la lungimea de undă λ = 490 nm (filtrul de lumină albastruverde), dacă soluţia este colorată în galben pai. Pentru determinarea extincţiei se folosesc cuve din sticlă cu lungimea de 5 cm (care se acopere cu căpăcel de sticlă). 93

Ca soluţie de comparaţie va servi soluţia incoloră de solvent organic. Cuvele se clătesc cu solvent, se usucă cu hîrtie de filtru. După finalizarea lucrării solventul şi soluţiile se toarnă în baloane corespunzătoare. Solvenţii organici se interzice să fie turnaţi în lavoar ! Reglarea aparatului KFK – 2 Aparatul KFK-2 (fig.2) este alcătuit din : 1. Microampermetrul cu două scări ; scara de sus gradată în % T, iar scara de jos – în unităţi ale extincţiei (absorbţiei) D. 2. Locaşul cuvelor. 3. Suportul (pîrghia) pentru permutarea cuvelor. 4. Comutatorul filtrelor de lumină. 5. Manete pentru reglarea sensibilităţii : scara neagră pentru fotoelementul F–4 ; scara roşie - pentru fotodioda FD–7K. 6. Maneta pentru reglarea grosieră şi fină a acului galvanometrului la diviziunea 100 %T.

Fig.2. Aparatul KFK-2 Aparatul se conectează la reţeaua electrică şi se lasă 15-20 minute pentru a se încălzi. În acest timp lăcaşul cuvelor trebuie să 94

fie deschis. La ridicarea capacului aparatului placa metalică închide calea fluxului luminos către fotoelemente. Rotind maneta din partea stîngă a comutatorului se reglează lungimea de undă necesară. Cuva cu solvent pur (proba de comparaţie) se pune în suportul pentru cuve (în partea din stînga), iar cuva cu soluţia de analizat în partea dreaptă a suportului şi capacul aparatului se închide. În prealabil se reglează scara aparatului la zero cu ajutorul manetei din partea dreaptă (reglarea grosieră şi fină a acului galvanometrului la diviziunea 100 % T sau la diviziunea „0” pe scara extincţiei D). Schimbînd poziţia suportului de sub capacul aparatului permutaţi cuvele în fluxul luminos şi notaţi valoarea extincţiei pe scara de jos a galvanometrului. Repetaţi măsurările de 3 ori şi notaţi valoarea medie a rezultatului. Graficul de calibrare Cantitatea de carotine se determină cu ajutorul graficului de calibrare, construit în coordonatele: extincţie – concentraţie. Pe baza rezultatului obţinut din graficul de calibrare se calculează cantitatea de carotină mg în 100 g de probă vegetală. Pentru a construi graficul de calibrare se utilizează soluţia standard de K2Cr2O7 (bicromat de potasiu). 300 mg K2Cr2O7 uscat şi recristalizat (de trei ori) se dizolvă în apă distilată în balonul cu cotă 1dm3. 1 cm3 de aşa soluţie după culoare corespunde la 0,00208 mg (2,08 μg) de carotină. În 10 baloane cu cotă de 100 cm3 se introduce o anumită cantitate de soluţie K2Cr2O7 conform tabelului1. Soluţiile se aduc pînă la cotă cu apă distilată, se agită şi se determină extincţia fiecărei soluţii. În baza rezultatelor obţinute se completează tabelul1 şi se construieşte graficul de calibrare în coordonatele: extincţie (D) – 95

concentraţie (C) în μg. Ca soluţie de comparaţie va servi apa distilată. Volumul K2Cr2O7 şi concentraţiile carotinei. Tabelul 1. 10 15 20 25 30 50 75 100 V ml 2 5 K2Cr2O7 4 10 21 31 42 52 73 104 156 208 C μg D Conţinutul carotinelor (X) în mg-% se calculează după formula următoare: C * 100 X= m * 1000 , unde m—masa probei în g Întrebări de control: 1. Rolul biochimic al vitaminelor grupei A şi carotinelor. 2. Structura vitaminelor A1, A2, şi a carotinelor. 3. Descrieţi principiul de separare a carotinelor prin metoda cromatografică. 4. Cum se determină extincţia soluţiilor colorate la aparatul KFK – 2 ? 5. Cum se pregătesc soluţiile pentru graficul de calibrare a carotinelor ?

96

Lucrarea de laborator nr. 14 Determinarea indicilor de calitate a lipidelor Lipidele reprezintă o categorie de substanţe solubile în solvenţi organici (cloroform, acetona, benzen, eter etilic), dar insolubile în apă şi săruri minerale. Din punct de vedere chimic lipidele sînt substanţe foarte heterogene, caracterizate în general prin structura hidrofobă apolară. Lipidele au un rol plastic şi energetic, participă la formarea membranei celulare, la permeabilitatea celulară şi la vehicularea diferitelor substanţe organice. Lipidele au funcţiile de termoizolare, termogeneză, apărare de leziuni mecanice, hidroizolare. Organismul uman necesită pe zi 70-145 grame de lipide. Schema generală a clasificării lipidelor poate fi redată astfel: Gliceride Simple

Steride Ceride

Lipide (esteri ai acizilor graşi)

Glicerolipide Complexe Sfingolipide Monoterpene C10 Diterpene C20

Lipide (pe baza izoprenei)

Politerpene C500 – C25000

97

Acizii graşi Majoritatea acizilor graşi separaţi din grăsimile naturale sînt acizi monocarboxilici cu catena normală, care conţin un număr par de atomi de carbon. Acizii graşi cu catena saturată corespund următoarei formule generale: CH3–(CH2)n – COOH, n=2–30 • n = 10, C12 – acidul lauric (unt de laur); • n = 14, C16 – acidul palmitic (majoritatea grăsimilor); • n = 16, C18 – acidul stearic (majoritatea grăsimilor); • n = 18, C20 – acidul arahic (ulei de arahide); Acizii graşi lineari nesaturaţi sînt acizii monocarboxilici care conţin în molecula lor una sau mai multe legături duble. Structura acizilor graşi nesaturaţi poate fi codificată prin cifre. De exemplu codul 18.1∆ 9 înseamnă că în structura acidului oleic intră 18 atomi de carbon, este o singură legătură dubla lîngă C–9. • 12.1∆ 9 – acidul lauroleic (lapte de capră); • 16.1 ∆ 9 – acidul palmitoleic (grăsimi animale); • 18.2∆ 9, 12 – acidul linoleic (în majoritatea lipidelor); • 18.3∆ 9, 12, 15 – acidul linolenic (ulei de in); • 18.4∆ 5, 8, 11, 14 – acidul arachidonic (lipide complexe). Ultimii trei acizi graşi constituie vitamina F, care stimulează procesele de creştere la mamifere, previne dermatitele şi acumularea colesterolului în sînge. Gliceride Gliceridele sînt esteri ai acizilor graşi cu glicerolul (propantriolul). Denumirea gliceridelor se formează ţinînd seama de acizii graşi din structura lor şi de poziţia acestora.

CH2–O–CO–(CH2)7–CH=CH–(CH2)7–CH3 CH –O–CO–(CH2)14–CH3 CH3–O–CO–(CH2)16–CH3 Oleopalmitostearina 98

Gliceridele de consistenţă lichidă (uleiurile vegetale) conţin acizi graşi nesaturaţi. Grăsimile unde predomină acizii graşi saturaţi sînt solide. Grăsimile lichide se transformă în solide prin hidrogenizarea la locul legăturilor duble (prepararea margarinei). Sînt mai mulţi indici care caracterizează calitatea grăsimilor. De exemplu, indicele de saponificare (Is) reflectă cantitatea legăturilor esterice în molecula gliceridului şi masa moleculară a acizilor graşi. Indicii de saponificare al unor grăsimi alimentare sînt următorii: unt de vaca 220 – 240, ulei de floarea soarelui 186 – 198 (mg de KOH necesar pentru saponificarea 1 g de grăsime). Indicele de iod reflectă cantitatea legăturilor duble în gliceride şi se exprimă în g de iod fixate de 100 g grăsime. Ulei de floarea soarelui are indicele de iod 114 – 135, de soia – 114 – 140. La acţiunea luminii, la contactul cu oxigenul şi cu vaporii de apă grăsimile sînt supuse transformărilor degradative, cunoscute sub denumirea de rîncezire. Rincezirea poate fi hidrolitică şi oxidativă. În urma rîncezirii hidrolitice se acumulează acizii graşi liberi, care au un miros şi gust neplăcut. Reacţiile de oxidare duc la formarea a) cetonelor şi b) peroxizilor, aldehidelor, aldoacizilor.

Acumularea produselor de oxidare duce la pierderea proprietăţilor organoleptice şi scăderea valorii nutritive a grăsimilor. Oxidarea grăsimilor poate fi prevenită prin introducerea antioxidanţilor (tocoferoli, hidrochinona, derivaţi ai acidului galic etc.).

99

1. Determinarea indicelui de aciditate Indicele de aciditate se exprimă în mg de KOH necesare pentru neutralizarea acizilor graşi liberi, care se conţin în 100 g de lipide. Cantitate de acizi graşi liberi în grăsime nu este stabilă, fiindcă depinde de tehnologia obţinerii, duratei şi condiţiilor păstrării şi de alţi factori. Caracterizează prospeţimea grăsimilor şi se măreşte cu durata păstrării. Determinarea se bazează pe neutralizarea acizilor graşi liberi în proba de grăsime cu soluţii alcoolice de NaOH sau KOH. Aparate, vase şi materiale:  soluţia saturată de NaCl;  două baloane conice de 150- 200 cm3;  biureta de 50 cm3;  baia de apă;  1% fenolftaleina, soluţie alcoolică;  0,1 n soluţie alcoolică de NaOH sau KOH (4,5 g de NaOH sau 6 g de KOH mărunţim, transferăm în balon, adăugăm 60-70 cm3 96 % alcool etilic rectificat, închidem balonul cu dop şi lăsăm pe 24 ore. Soluţia de hidroxid o separăm de sediment prin filtrare (prin vată de sticlă sau asbest), diluăm cu apa distilată pînă la concentraţia necesară;  amestecul neutru de alcool şi eter (1:2 — raportul volumelor). Ordinea îndeplinirii lucrării (pentru grăsimi de culoarea deschisă) În baloanele conice de 150-200 cm3 introducem 3-5 g de grăsimi analizate cu eroarea 0,01 g, adăugăm 50 cm3 de amestec neutralizat de etanol şi eter etilic, agităm conţinutul. Dacă grăsimea nu se dizolvă, balonul îl încălzim la baia de apă, agitînd permanent. Răcim balonul pînă la 15-20 0C, adăugăm 3-5 picături de 1 % 100

soluţie alcoolică de fenolftaleină şi agitînd permanent titrăm proba cu 0,1 n soluţie alcoolică de NaOH sau KOH pînă la apariţia culorii slab roz, care nu dispare timp de 30 sec. Indicele de aciditate (mg/g grăsime) se calculează după formula : V × K × 5,61 Ia = b m unde: Vb – volumul (cm3) soluţiei de NaOH sau KOH pentru titrarea acizilor graşi; K – coeficientul de corecţie a soluţiilor bazice; 5,61 – cantitatea de KOH (mg) în cm3 soluţie de 0,1 n ; m – masa probei, g. Ordinea îndeplinirii lucrării (pentru grăsimi de culoare închisă) În aceasta metodă nu se utilizează solvent pentru grăsime. Pentru separarea fazelor se introduce soluţia saturată de NaCl. La titrare se utilizează 1% fenolftaleina. După ce toţi acizii liberi se neutralizează, surplusul de bază trece în soluţia de NaCl şi îl colorează în roz. NaCl inhibă hidroliza grăsimilor şi nu permite formarea emulsiilor stabile la titrare. Într-un balon de 200 cm3 introducem 10 g de grăsime (cîntărite cu eroarea 0,01 g), adăugăm cu cilindru 50-60 cm 3 soluţie saturată de NaCl şi 0,5 cm3 de 1 % soluţie alcoolică de fenolftaleină. Balonul îl închidem cu dop, agităm, apoi o titrăm cu 0,1 n KOH. La titrarea agităm fiecare dată după adăugarea 4-5 picături de KOH pînă nu dispare culoarea stratului de jos a soluţiei. În procesul de titrare coloraţia trebuie să se schimbe lent, de aceea la finisarea titrării agitarea o facem mai des. Titrarea se termină, cînd în stratul de jos a sării va apărea culoarea roz stabilă, care nu dispare timp de 30 sec. Indicele de aciditate (mg/g grăsime) se calculă după formula : 101

Ia =

Vb × K × 5,61 , m

Unde: Vb – volumul (cm3) soluţiei de NaOH sau KOH pentru titrarea acizilor graşi K – coeficientul de corecţie a soluţiilor bazice 5,61 – cantitatea de KOH (mg) în cm3 soluţie de 0,1 n m – masa probei, g Limitele normelor admisibile de indicele de aciditate pentru unele uleiuri şi grăsimi (mg/g grăsime): Ulei de floarea soarelui • rafinat – 0,4 • nerafinat calitatea superioară – 1,5 • nerafinat calitatea I – 2,25 Ulei de soia • rafinat – 0,3 • hidratat calitatea I – 1,0 Ulei de porumb • rafinat 0,3 • nerafinat – 5,0 Grăsimi alimentare topite: • calitatea superioară—1,3 • calitatea I—2,2 2. Determinarea indicelui de saponificare Indicele de saponificare Is se exprimă în mg de KOH pentru saponificarea gliceridelor şi neutralizarea acizilor graşi liberi întrun gram de grăsime. Valoarea Is depinde de masa moleculară a acizilor graşi din componenţa lipidelor. Cu cît masa moleculară e mai mare, cu atît valoarea Is este mai mică. Is este mai mare la lipide cu indicele de 102

aciditate mai mare. Is la mono- şi digliceride e mai mic de cît la trigliceride. După Is în producere se calculează cantitatea de bază, necesară pentru saponificarea grăsimilor, de exemplu, la rafinarea uleiurilor—la etapa neutralizării. Aparate, vase şi materiale: • 2 baloane de 250-300 cm3 cu ştif; • răcitor de aer; • biureta –25 cm3; • baia de apă; • 0,5 n soluţie alcoolică de KOH; • 0,5 n soluţie de HCl; • 1 % soluţie de fenolftaleină.

Ordinea îndeplinirii lucrării Într-un balon de 250-300 cm3 cu ştif se introduce 2-3 g (cu precizia 0,0002 g), de grăsime analizată prealabil bine amestecată şi filtrată din biuretă, se adaugă 25cm3 de 0,5n soluţie alcoolică de KOH şi balonul se uneşte prin ştif cu răcitorul de aer. Colba se menţine o oră într-o baie de apă la 100 oC (la fierbere), periodic conţinutul se agită şi nu se admite evaporarea alcoolului. E necesar ca nivelul soluţiei în balon să fie mai jos decît nivelul apei în baie. Concomitent în aceleaşi condiţii se face proba de control prin menţinerea balonului cu 25 cm3 de 0,5 n soluţie alcoolică de KOH . Soluţia din balon după terminarea saponificării trebuie să fie transparentă, fără picături de grăsime. Apoi conţinut ambelor baloane se titrează cu 0,5 n soluţie de KOH în prezenţa indicatorului (1 % soluţie alcoolică de fenolftaleină pentru grăsimi de culoare deschisă şi timolftaleină, pentru grăsimi de culoare închisă) pînă la dispariţia culorii. Soluţia de lucru se titrează fierbinte, puţin răcită. 103

Indicele de saponificare Is (mg KOH/g ) se calculează după formula: Is= 28,05 (a-b) K P Unde: 28,05 – titru 0,5g soluţie de KOH, mg/cm3; a – cantitate de 0,5n soluţie de HCl pentru titrarea KOH în proba de control, cm3; b - cantitate de 0,5n soluţie de HCl pentru titrarea KOH în proba de lucru, cm3; K – coeficientul de corecţie de 0,5n soluţie HCl; P – masa grăsimii, g. Devierile admisibile la probele paralele nu trebuie să fie mai mari de 0,1mg KOH/g. Limitele normelor admisibile de indicele de saponificare pentru unele uleiuri şi grăsimi (mg/g grăsime):

Ulei de floare soarelui Ulei de soia Ulei de cocos Ulei de măsline Ulei de bumbac Unt de vacă Unt de cacao Grăsime topită de vită

188-194 192-194 242-269 185-200 191-200 220-245 192-196 193-200

3. Determinarea indicelui de iod Indicele de iod reflectă cantitatea legăturilor duble în gliceride şi se exprimă în g de iod fixate de 100 g grăsime. La legăturile duble acizii graşi uşor se oxidează, ce determină procesele de rîncezire şi uscare a grăsimilor. Indicele de iod se 104

utilează la calculul cantităţii de hirogen pentru hidrogenizarea lipidelor. Determinarea cantităţii legăturilor duble sau indicelui de iod este bazată pe fixarea unei molecule de halogen (iod, clor, brom) de o legătură dublă în condiţii cînd halogenul nu substituie hidrogenul. Reacţia are loc după următoare schemă: CH2

O- CO- (CH2)7- CH = CH- (CH2)7- CH3

CH

O - CO- R1

CH2

O - CO- R1

+ I2 I

CH2

I

O- CO- (CH2)7- CH - CH- (CH2)7- CH3

CH

O - CO- R1

CH2

O - CO- R2

,

unde R1 şi R2 sînt radicalii acizilor graşi saturaţi. Pentru determinarea indicelui de iod în industrie este convenabilă metoda lui Margoşes. Această metodă după precizia rezultatelor cedează metodelor standard, dar este mai rapidă, necesită mai puţine reactive complicate şi toxice, nu se cere calificarea înaltă a personalului. Metoda este bazată pe reacţia acidului gras nesaturat cu acidul hipoiodos, care se formează în rezultatul interacţiunii iodului cu apă: I2 +H2O─→HOI + HI Reacţia acidului gras cu acidul hipoiodos trece în modul următor: CH3(CH2)7CH=CH(CH2)7COOH + HOI → CH3(CH2)7CHOH – CHI - (CH2)7COOH Restul de iod se titrează cu tiosulfat de sodiu. Aparate, vase şi materiale: • sticlă de ceas; • păharul chimic; • baie de apă; 105

• ceaşca Petri; • cilindru de 200 cm3; • biureta 25 cm3; • etanol 96 %; • soluţia alcoolică de iod (25 g de iod cristalin în dm3 de 96 % etanol); • 0,1 n tiosulfat de sodiu Na2S2O3; • 1 % soluţie de amidon. Ordinea îndeplinirii lucrării Pe o sticlă de ceas, prealabil cîntărită cu eroarea 0, 0002 g, se introduc 3-5 picături de grăsime analizată şi se cîntăreşte, sticla cu grăsime se plasează într-un pahar chimic şi se adaugă 100 de volume de 96 % etanol: E de dorit ca masa grăsimii să fie între 0,20,3 g, atunci cantitatea de alcool adăugata va fi 20-30cm3.Pentru dizolvarea mai bună amestecul încălzeşte în baia de apa la temperatura 45-50o C, permanent agitînd conţinutul păharului pînă la dispariţia picăturilor de grăsime. Păharul trebuie să fie acoperit cu ceaşca Petri, apoi în păhar din biuretă se adaugă 20 cm 3 de soluţie alcoolică de iod şi cu cilindrul 200 cm3 de apă distilată. La adăugarea apei amestecul permanent se agită cu bagheta de sticlă, apoi păharul se acoperă şi se lasă pe 5 minute, după ce surplusul de iod se titrează cu 0,1n soluţie de Na2S2O3 în prezenţa soluţiei de amidon, de 1%. Paralel, în aceleaşi condiţii, se face proba de control (fără grăsime). Indicele de iod (g de iod la 100 g de grăsime) se calculează după formulă : Indicele de iod = (a-b) x K x 100 x 0,01269 P unde a – cantitatea de 0,1 n soluţie de Na2S2O3 pentru titrarea probei de control, cm3; b – cantitatea de 0,1 n soluţie de Na2S2O3 pentru titrarea probei de lucru, cm3; K – coeficientul de corecţie a 0,1 n soluţie Na2S2O3; 106

0,011269 – cantitatea de iod, care corespunde 1 cm3 0,1 n soluţie Na2S2O3, g; P – masa grăsimii, g.

107

Lucrarea de laborator nr. 15 Determinarea substanţelor aromatice în pîine şi alte produse de panificaţie Mirosul este un indice organoleptic important al calităţii pîinii. Aroma pîinei într-o mare măsură caracterizează calitatea şi prospeţimea ei. Cea mai intensivă este aroma pîinii calde, la răcire şi păstrare aroma suficient scade. În formarea aromei pîinii participă aproape 300 de substanţe care reprezintă alcooli, fenoli, aldehide, cetone, acizi, lactone, compuşi cu sulf, esteri, amine. Toate acestea substanţe se află în pîine în cantităţi foarte mici. Complexul substanţelor aromatice se formează la toate etapele pregătirii aluatului. În procesul formării aluatului creşte conţinutul alcoolilor , acizilor organici, esterilor, substanţelor carbonilice. Importantă este prezenţa în aluat înainte de coacere a glucidelor reducătoare şi produşilor hidrolizei proteinelor – peptidelor şi aminoacizilor. Finalizarea proceselor formării aromei are loc anume la coacere, cînd se formează melanoidinele cu un miros specific şi alte substanţe aromatice. Determinarea aromei pîinii este prevăzută de standarde întrun şir de indice de apreciere organoleptică a calităţii produselor de panificaţie. Substanţele carbonilice cantitativ prezintă aproape o treime din toate substanţele aromei pîinii. Conţinutul substanţelor carbonilice în miezul pîinii de secară şi de grîu-secară – 6,8 - 28,9 cm3 0,1 n soluţie de iod la 100g substanţelor uscate, în miezul pîinii de grîu – 5,4 – 28. În coaja pîinii de secară şi de grîu-secară – 43,6-162,7, în coaja pîinii de grîu – 20,4-108,2 cm3 0,1 n soluţie de iod la 100g substanţelor uscate.

108

Principiul metodei Metoda se bazează pe interacţiunea substanţelor carbonilice cu bisulfit de sodiu NaHSO3. Determinarea constituie din următoarele etape: • reacţia formării compuşilor bisulfitcarbonilici; • eliminarea surplusului de NaHSO3; • scindarea compuşilor bisulfitcarbonilici; • determinarea cantitativă a NaHSO3 eliminat, care este echivalent cu conţinutul substanţelor carbonilici. Conţinutul substanţelor carbonilice se exprimă în cm3 0,1 n soluţie de iod pentru titrarea bisulfitului de sodiu, legat cu substanţele carbonilice din 100 g de pîine uscată. Aparate, vase şi materiale: • 0,15 % soluţie de NaHSO3 (0,75 g de NaHSO3 nehidratat se dizolvă în 400 cm3 de apă, se acidulează cu 2 n acid acetic în prezenţa 3-5 picături de indicator metilrot pînă la culoarea roz, apoi volumul se aduce pînă la 500 cm3); • soluţie-tampon pH -8,3 (30 g de acid boric şi 5 g de NaOH se dizolvă în 1000 cm3 de apă distilată). Ordinea îndeplinirii lucrării Proba de pîine cu masa de 10 g (eroarea 0,01 g) se mărunţeşte în mojar cu soluţia 0,15 % de NaHSO3. Suspensia se transferă cantitativ în balonul cotat de 100 cm3, se aduce pînă la cotă cu soluţia de bisulfit de sodiu, se agită 10 min, se lasă pentru decantare 10 min şi se filtrează într-un balon uscat. Într-un balon conic de 150 cm3 introduc cu pipeta 10 cm3 de filtrat, la analiza soluţiilor intens colorate se ia 10 cm3 de filtrat şi 10 cm3 de apă distilată. Surplusul de bisulfit de sodiu se titrează cu 0,1 n soluţie de iod în prezenţa indicatorului (1 cm3 de 0,1 % soluţie de amidon) pînă la culoarea violet-albastră slabă. Dacă a fost adăugat mai mult iod, el se titrează cu 0,01 n soluţie de tiosulfat de sodiu Na2S2O3.

109

Pentru scindarea compuşilor bisulfitcarbonilici se utilizează soluţie-tampon, care permite de a aduce pH mediului pînă la 8,3. Titrarea bisulfitului de sodiu eliminat se face în două etape: ̶ Titrarea de orientare ̶ Titrarea principală Titrarea de orientare. În balonul conic după îndepărtarea excesului de bisulfit de sodiu se adaugă 15 cm3 de soluţie-tampon şi în acelaşi moment încep titrarea din microbiuretă a bisulfitului eliminat cu 0,01 n soluţie de iod pînă la apariţia culorii violetalbastră, care nu dispare 15 s. Se notează volumul titratului. Titrarea principală. În balonul conic după îndepărtarea excesului de bisulfit de sodiu se adaugă 90 % de volum soluţie de 0,01 n iod, care s-a utilizat pentru titrarea de orientare, apoi 15 cm3 de soluţie-tampon şi termină titrarea cu 0,01 n soluţie de iod. Conţinutului substanţelor carbonilice se calculează după următoare formulă:

, unde : X – conţinutul substanţelor carbonilice în cm3/100 g; K - coeficientul de corecţie a soluţiei de iod; V - volumul de 0,01 n soluţie de iod pentru titrarea principală a 10 cm3 de filtrat, cm3; 10 – coeficientul de recalculare la 0,1 n soluţie de iod; W – % de umiditate în pîine.

110

PRELUCRAREA STATISTICĂ A DATELOR EXPERIMENTALE Pentru prelucrarea statistică a datelor experimentale se îndeplinesc următoarele calcule: • se efectuează un număr dat de determinări paralele (n) • se determină valoarea medie •

se găseşte devierea (abaterea)

•

se calculează devierea standard:

• se determină devierea standardă relativă: Sr = S/x se calculează dispersia: 2 V=S

•

•

se determină limita de certitudine a mediei εα

x ± εα, sau x ± S tα Toate rezultatele prelucrării statistice se introduc în tab.1. n

Tabelul 1. Rezultatele finale ale prelucrării statistice. x S Sr V x±ε α

Calcularea indicilor statistice Valoarea medie. Dacă în rezultatul dozărilor directe nu se cunosc erori grave şi sistematice, se obţine un număr destul de mare de măsurări şi rezultate, valoarea cea mai probabilă a 111

parametrului, care se determină trebuie luată ca media aritmetică, obţinută dint-un şir de măsurări. Ea se notează prin simbolul x: x = (x1 + x2 + x3 + ... + xn)/n = ∑ x/n , Unde n este numărul de măsurări. Devierea (abaterea). Este diferenţa dintre variantă şi valoarea medie. Ea se notează prin litera "d": d = (xi-x). Devierea "d" se caracterizează prin: ∑d = 0 Devierea standard. Măsurările separate sau rezultatele analizei sînt dispersate faşă de valoarea medie. Pentru caracteristica statistică a acestei dispersări se foloseşte devierea standardă: S=

∑d

2

k

unde k este numărul gradelor de libertate, egal cu n-1 Devierea standardă relativă. Sr este egală cu devierea standardă, împărţiţi la valoarea medie Sr = S/x Dispersia. Devierea standardă la pătrat se numeşte dispersie V= S2. Cu cît e mai mică dispersia cu atît e mai mică împrăştierea datelor şi e mai corectă analiza. S=

d2 n( n −1)

Limita de certitudine a mediei - εα. Întrucît determinarea valorii reale a parametrului măsurat este imposibilă, ne mărginim cu determinarea limitelor în care ea se include x ± εα.

ε ε

α.

se calculează după formulă :

= S tα , unde tα este parametru Stiudent pentru probabilitatea α =0,95. Dacă d > 2S, atunci acest rezultat se exclude din rîndul variantei, supuse prelucrării statistice la probabilitatea admisă. α.

112

BIBLIOGRAFIE 1. Брухман Е.Е. Прикладная биохимия. – М.; Легкая и пищевая промышленность: 1981. 2. Кретович В.Л. Биохимия растений.-М.; Высшая школа: 1986. 3. Основы биохимии. Под ред.Анисимова А.А. – М.; Высшая школа: 1986. 4. Kucerenco N.E., Babeniuk Iu.D. ş. a. Biochimie. - Chişinău; Universitas: 1993. 5. G. Neamţu Biochimie alimentară. – Bucureşti: Editura Cereş: 1997. 6. R. Segal R. Biochimia. – Galaţi; Universitatea "Dunăre de Jos": 1992. 7. Лабораторный практикум по общей технологии пищевых производств. Под редакцией Ковальской Л.П. -М.; ВО „ Агропромиздат”: 1991. 8. Рихтер М., Аугустат З., Ширбаум Ф. Избранные методы исследования крахмала.-М.; Пищевая промышленность: 1975.

113

CONŢINUTUL ORGANIZAREA ŞI METODICA EFECTUARII LUCRĂRILOR DE LABORATOR, REGULILE TEHNICII DE SECIRITATE PENTRU LABORATORUL DE BIOCHIMIE.............................. ………………..3 Lucrarea 1. DETERMINAREA AZOTULUI TOTAL ÎN PRODUSE VEGETALE(DUPĂ METODA KJELDAHL)..........................................6 Lucrarea 2. DETERMINAREA POTENŢIOMETRICĂ A DERIVAŢILOR FORMOLICI A α– AMINOACIZILOR......................14 Lucrarea 3. DETERMINAREA AMONIACULUI DUPĂ METODA CONWEI ŞI BAIRN................................................................................21 Lucrarea 4. DETERMINAREA PROTEINELOR ÎN VIN DUPĂ METODA LOURI....................................................................................26 Lucrarea 5. REACŢIILE DE CULOARE A PROTEINELOR.......................................................................................30 Lucrarea 6. DETERMINAREA FORMEI REDUSE A GLUTATIONULUI (ÎN LEVURI SAU GERMENII CEREALELOR)......................................................................................36 Lucrarea 7. DETERMINAREA ACTIVITĂŢII INVERTAZEI ÎN VINURI, SUCURI..................................................................................40 Lucrarea 8. DETERMINAREA ACTIVITĂŢII ENZIMEI POLIIFENOLOXIDAZA.........................................................................50 Lucrarea 9. DETERMINAREA ACTIVITĂŢII ENZIMEI LACAZA..................................................................................................56 Lucrarea 10. DETERMINAREA ACTIVITĂŢII CATALAZEI DUPĂ A. BAH ŞI A.OPARIN.................................................................64 Lucrarea 11. DETERMINAREA PĂRŢII DE MASĂ A AMIDONULUI........................................................................................70 Lucrarea 12. DETERMINAREA FOTOCOLORIMETRICĂ A VITAMINEI C.........................................................................................77 Lucrarea 13. METODA CROMATOGRAFICĂ DE DETERMINARE A CAROTENILOR ..................................................87 Lucrarea 14. DETERMINAREA INDICILOR DE CALITATE A LIPIDELOR.............................................................................................95 Lucrarea 15. DETERMINAREA SUBSTANŢELOR AROMATICE ÎN PÎINE ŞI ALTE PRODUSE DE PANIFICAŢIE.......................................................................................106 PRELUCRAREA STATISTICĂ A DATELOR EXPERIMENTALE.............................................................................109

114

UNIVERSITATEA TEHNICĂ A MOLDOVEI

BIOCHIMIE Îndrumar de laborator

Chişinău 2007 115