Biochimica degli ormoni

Biochimica degli Ormoni Appunti per studenti di medicina

ver. 0.3.5 (3 ottobre 2014) Generato con LATEX

ii Questo documento è copyright © 2010-2014 Lorenzo Bandieri. Alcuni diritti riservati. I diritti d’autore sull’opera appartengono a Lorenzo Bandieri e sono disciplinati nei termini della licenza Creative Commons BY-NC-SA (Attribuzione-Non CommercialeCondividi allo stesso modo) 2.5 Italia, il cui testo integrale è disponibile all’indirizzo http://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/2.5/it/legalcode.

cbea In pratica, questo documento può essere riprodotto e distribuito in tutto o in parte, con ogni mezzo fisico o elettronico, purché questo avviso di copyright sia mantenuto su tutte le copie e l’autore sia debitamente citato. La ridistribuzione commerciale non è permessa. Ogni traduzione, lavoro derivato o comprendente questo documento deve contenere questo stesso avviso di copyright: per esempio, non si possono produrre lavori derivati da questo documento ed imporre restrizioni aggiuntive sulla sua distribuzione. Per tutte le condizioni non esplicitamente menzionate si prega di consultare il testo della licenza. Per ulteriori informazioni si prega di contattare l’autore all’indirizzo lorenzoPUNTObandieriATgmailPUNTOcom.

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FAQ (Frequently Asked Questions) Q: Cos’è questo documento? A: È una risorsa per gli studenti di medicina che devono preparare l’esame di biochimica. Non sono sbobinature, né appunti riordinati delle lezioni. Probabilmete "dispense" è il termine che più si adatta. Ho scritto questi appunti partendo da articoli e testi vari che per esigenze tecniche non erano citati interamente nella versione iniziale di questo documento. Dalla versione 0.3.0 il testo è stato convertito in un formato più adatto. Questo mi ha permesso di inserire una parziale bibliografia, che sarà ampliata in futuro. In ogni caso, qualunque errore contenuto in queste pagine è unicamente mia responsabilità.

Q: Perché scriverlo? A: Perché nel programma dell’esame di biochimica c’è una parte dedicata agli ormoni, che sui classici testi (Lehninger, ma anche altri) non sono trattati in maniera sistematica, oppure sono trattati in maniera eccessivamente superficiale. Inoltre l’aver prodotto documento e illustrazioni consente di poterlo distribuire in maniera libera, gratuitamente, anche via internet, sotto licenza Creative Commons.

Q: Ok, fantastico. Io però volevo solo stampare queste dispense. Ho scaricato uno *.zip, ma ci sono dentro un sacco di file. Quale diavolo devo stampare? A: Se stai leggendo questo, hai già trovato il file da stampare. L’archivio *.zip contiene: 1. 2 file PDF: questa è l’ultima versione della Biochimica degli Ormoni. L’unica differenza tra i due è che uno è solo fronte, mentre l’altro è fronte-retro (cambiano solo i margini e l’orientamento dei numeri di pagina). In pratica: se vuoi stamparlo e rilegarlo, stampa il fronte-retro; se vuoi vederlo su pc, tablet o simili prendi solo fronte. 2. CHANGELOG.txt: questo file contiene un registro dei cambiamenti introdotti con le varie versioni. 3. source: questa cartella contiene i sorgenti da cui vengono generati i PDF. Puoi ignorarla.

Q: Come faccio a sapere se questa è la versione più recente e aggiornata? A: Carico sempre la versione più recente su Scribd e Medwiki (cercando su google si trovano facilmente i link); se la versione (sulla copertina) è la stessa, il documento è alla versione più recente. Nel dubbio, mandami pure una mail.

Q: Cos’è cambiato rispetto alla precedente versione del documento?

iv A: In linea di massima, viene rilasciata una nuova versione quando ci sono delle correzioni. Per sapere esattamente cosa è cambiato da una versione all’altra, puoi andare a vedere il file CHANGELOG.txt nel file zip scaricabile da MedWiki.

Q: Come posso fare per dare una mano? A: Puoi dare una mano in qualunque modo tu riesca a immaginare. Per me è molto importante la semplice segnalazione di errori o di parti poco comprensibili, o consigli su argomenti che andrebbero espansi/ridotti/riscritti. O anche schemi/immagini. Il tuo contributo è particolarmente importante nel caso in cui all’esame ti venga chiesto qualcosa che non è incluso qui. Ci vogliono pochi minuti per scrivere una mail e segnalare un errore, ma è una cosa utilissima che puoi fare per rendere migliore lo studio per gli altri.

Q: Ho trovato un errore/ho un suggerimento/vorrei fare due chiacchiere/vorrei insultarti. Come posso contattarti? A: Puoi contattarmi scrivendo una mail a lorenzoPUNTObandieriATgmail.com.

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Ringraziamenti • Prof.ssa Paola Chiarugi; • Veronica Gironi (kalendy); • Raffaello Bonacchi; • Daniele Rizzo; • Fiammetta Maria Colla; • Federica Perini; • Virginia Lotti.

Indice 1 Generalità 1.1 Il concetto di ormone . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1.2 Classificazione degli ormoni . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1.2.1 Classificazione degli ormoni in base alla solubilità . . . . . . . . 1.2.2 Classificazione degli ormoni in base alla natura chimica . . . . 1.2.3 Classificazione degli ormoni in base alla modalità di diffusione 1.3 Chi sintetizza gli ormoni? . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 Ormoni proteici e peptidici 2.1 Ormoni dell’asse ipotalamo-ipofisi . . . . . . . . . 2.1.1 Generalità . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.1.2 Ossitocina . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.1.3 Vasopressina (ADH, ormone antidiuretico) 2.1.4 Releasing hormones ipotalamici . . . . . . 2.1.5 Ormoni dell’adenoipofisi . . . . . . . . . . 2.2 Ormoni dell’apparato digerente . . . . . . . . . . . 2.2.1 Insulina . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.2.2 Glucagone . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.3 Ormoni della tiroide e delle paratiroidi . . . . . . . 2.3.1 Paratormone (PTH) . . . . . . . . . . . . . . 2.3.2 Calcitonina . . . . . . . . . . . . . . . . . .

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3 Ormoni derivati da aminoacidi 3.1 Generalità . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.2 Ormoni della zona midollare della ghiandola surrenale 3.2.1 Catecolamine . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.3 Ormoni della tiroide . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.3.1 Triiodotironina e tetraiodotironina . . . . . . . .

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1 1 2 2 3 3 5

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6 6 7 12 14 17 19 41 41 66 73 73 80

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4 Ormoni derivati dall’acido arachidonico 114 4.1 Origine degli eicosanoidi . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 114 4.2 Classificazione e nomenclatura . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 114

Indice 4.3 4.4 4.5 4.6 4.7 4.8

Sede di elaborazione . . . . . . . . . . . . . . . . Biosintesi . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Secrezione e regolazione . . . . . . . . . . . . . . Secrezione, trasporto nel plasma e degradazione Recettore . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Effetti fisiologici degli eicosanoidi . . . . . . . . .

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5 Ormoni derivati dalla vitamina D 132 5.1 Ormoni del rene . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 132 5.1.1 Calcitriolo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 132 6 Ormoni steroidei 6.1 Struttura e generalità . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6.2 Ormoni della corteccia della ghiandola surrenale . . . . . . 6.2.1 Corticosteroidi: mineralcorticoidi e glucocorticoidi 6.3 Ormoni delle gonadi . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6.3.1 Androgeni ed estrogeni . . . . . . . . . . . . . . . .

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140 140 142 142 155 155

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Elenco delle figure 1.1 2.1 2.2 2.3 2.4 2.5 2.6 2.7 2.8 2.9 2.10 2.11 2.12 2.13 2.14 2.15 2.16 2.17 2.18 2.19 2.20 2.21 2.22 2.23 2.24 2.25

Le modalità di diffusione degli ormoni . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Ormoni dell’ipofisi anteriore e posteriore . . . . . . . . . . . . . . . . . Influenze dell’ipotalamo sull’ipofisi anteriore e posteriore . . . . . . . . Schema dei circuiti di feedback tra ipotalamo, ipofisi, e tessuto periferico Struttura aminoacidica dell’ossitocina . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Struttura aminoacidica dell’ADH . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Releasing hormones ipotalamici . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Rappresentazione schematica della pre-POMC . . . . . . . . . . . . . . Peptidi derivati dal POMC . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Pathway di trasduzione del segnale del GH . . . . . . . . . . . . . . . . Asse ipotalamo-ipofisi-tiroide . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Asse ipotalamo-ipofisi-gonadi . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Asse ipotalamo-ipofisi-surrene . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Struttura tridimensionale dell’insulina . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Insulina . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Pathway segnalatori del recettore insulinico . . . . . . . . . . . . . . . . Regolazione della glicogeno fosforilasi . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Regolazione della glicogeno fosforilasi da parte dell’insulina . . . . . . Regolazione della glicogeno sintasi . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Regolazione della glicogeno sintasi da parte dell’insulina . . . . . . . . Schema riassuntivo della regolazione del glicogeno da parte dell’insulina. Regolazione della glicolisi e della gluconeogenesi nel fegato . . . . . . Regolazione della lipasi ormone sensibile . . . . . . . . . . . . . . . . . Regolazione della glicogeno fosforilasi da parte del glucagone . . . . . Regolazione della glicogeno sintasi da parte del glucagone . . . . . . . Schema riassuntivo della regolazione del glicogeno da parte dell’aumento del cAMP . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.26 Schema riassuntivo della regolazione del glicogeno da parte della diminuzione del cAMP . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.27 Il circuito fondamentale di feedback tra calcio, PTH e calcitriolo . . . .

4 8 9 11 12 14 18 24 26 32 37 39 40 42 43 47 50 53 53 54 55 57 60 69 71 72 72 76

Elenco delle figure 3.1 3.2 3.3 3.4

Surrene . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Struttura di catecolo e catecolamine . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Biosintesi delle catecolamine . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Schema semplificato dei pathway che portano alla degradazione delle catecolamine . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.5 Schema dei pathway che portano alla degradazione delle catecolamine 3.6 Schema delle reazioni degradative della dopamina . . . . . . . . . . . . 3.7 Tiroide . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.8 Struttura degli ormoni tiroidei . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.9 Formazione di MIT e DIT . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.10 Struttura di MIT e DIT . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.11 Fusione di MIT e DIT . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.12 La cellula tiroidea . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

90 91 93 102 103 106 106 107 108

4.1 4.2 4.3 4.4 4.5

Struttura delle prostaglandine . . . . . . . . . . . . . Eicosanoidi prodotti dall’acido arachidonico. . . . . Eicosanoidi prodotti dagli acidi linoleico e linoleico. Eicosanoidi prodotti dall’acido arachidonico. . . . . Via delle lipossigenasi . . . . . . . . . . . . . . . . .

117 120 121 123 126

5.1

Biosintesi della vitamina D . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 133

6.1 6.2 6.3 6.4 6.5 6.6 6.7 6.8

Struttura generale degli steroidi. . . . . . . . . . . Conversione del colesterolo in pregnenolone . . . Biosintesi dei corticosteroidi. Zona glomerulosa. . Biosintesi dei corticosteroidi. Zona fascicolata. . . Biosintesi dei corticosteroidi. Zona reticolare. . . . Biosintesi degli androgeni. . . . . . . . . . . . . . . Biosintesi degli estrogeni. . . . . . . . . . . . . . . Conversione del testosterone in diidrotestosterone

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1 Generalità 1.1 Il concetto di ormone Con l’evoluzione si sono sviluppati e perfezionati numerosi meccanismi molecolari in grado di informare le cellule su cosa sta succedendo al loro esterno e su come modificare il proprio comportamento. Una delle caratteristiche peculiari degli organismi viventi è proprio la capacità di recepire stimoli provenienti dall’ambiente extracellulare e di reagire a livello molecolare. Una cellula può così modulare il proprio metabolismo (per esempio regolando positivamente o negativamente certi enzimi), alterare l’espressione genica (per esempio attivando o inibendo un promotore), o entrambi. Questa proprietà si rivela determinante in particolare negli organismi pluricellulari, dove è necessaria una fine coordinazione tra le cellule. Si pensi alla complessità insita nell’armonizzare l’attività delle 1013 cellule dell’uomo, specializzate in almeno 210 differenti citotipi. Questi processi biochimici trovano il loro cardine negli ormoni, termine che fu coniato nel 1905 dall’eminente fisiologo Ernest Starling [12]. Con il passare degli anni, il concetto di ormone si è modificato in maniera notevole rispetto all’idea iniziale, dove il termine designava esclusivamente i messaggeri chimici secreti nel sangue dalle ghiandole endocrine. La definizione “classica” qualifica un ormone come una sostanza chimica prodotta in una ghiandola specializzata, rilasciata nel circolo sanguigno, che evoca una risposta fisiologica in tessuti distanti. Tuttavia, oggi è noto che [4]: • Sono molte le molecole di valenza ormonale a non essere prodotte da ghiandole specializzate, bensì da cellule specializzate intersperse in un tessuto, o, in certi casi, da cellule considerate “non specializzate”; • Molti dei segnali che una cellula riceve provengono da cellule vicine o dalla cellula stessa; • Si conoscono molti esempi in cui le molecole segnale sono rappresentate da semplici sostanze, a cui convenzionalmente non veniva dato valore di ormone (come lo ione calcio);

1 Generalità • Frequentemente, un recettore ormonale è espresso in cellule che non sono considerate tra i bersaglio classici di quell’ormone. È divenuto evidente che molte altre molecole condividono la medesima funzione di segnali chimici, agiscono con le stesse modalità e attraverso gli stessi meccanismi biochimici fondamentali; così la denominazione è stata progressivamente estesa ad una pletora di fattori molto diversi tra loro (fattori umorali, paracrini, autocrini...) [4]. Ad oggi, nel mondo scientifico è sempre più diffusa la tendenza a considerare ormone qualunque segnale in grado di indurre una risposta in una cellula. Tale risposta è evocata grazie al legame dell’ormone con un recettore, che è una molecola per mezzo della quale vengono espletati gli effetti biologici. Una cellula con cui l’ormone interagisce tramite un legame con recettori è detta cellula bersaglio. Quindi, possiamo parlare di ormone a proposito, ad esempio, di insulina e glucagone, ma anche a proposito di citochine e interleuchine, o, estendendo al massimo il concetto, della luce. È importante sottolineare che di solito un ormone non agisce su un solo citotipo, ma su tipi cellulari differenti. Non viene perduta con ciò la capacità di evocare risposte tessuto-specifiche, grazie al fatto che ogni cellula risponde in modo diverso al segnale. Nella maggior parte dei casi questo è dovuto all’espressione di recettori lievemente differenti.

1.2 Classificazione degli ormoni Gli ormoni sono classificabili secondo diversi criteri, i più comuni dei quali sono solubilità, natura chimica, e modalità di diffusione.

1.2.1 Classificazione degli ormoni in base alla solubilità Classificare gli ormoni in base alla solubilità consente di ripartirli in due grandi gruppi: ormoni idrosolubili e liposolubili. Questa suddivisione è molto importante perché riflette anche fondamentali differenze funzionali. Gli ormoni idrosolubili: • vengono solubilizzati dai fluidi biologici, e tendono a non legarsi a trasportatori; • non sono in grado di attraversare la membrana, ed hanno recettori sulla membrana cellulare, attraverso la cui mediazione il segnale viene trasdotto a livello intracellulare, sfruttando i cosiddetti secondi messaggeri;

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1 Generalità Gli ormoni liposolubili, al contrario: • hanno bisogno di trasportatori, essendo poco o per niente solubili nel plasma; • sono in grado di attraversare la membrana plasmatica, quindi hanno recettori intracellulari (in certi casi, non esclusivamente), legati ai quali si portano a livello nucleare per influenzare l’espressione genica – i recettori quindi agiscono come fattori di trascrizione attivati dal ligando;

1.2.2 Classificazione degli ormoni in base alla natura chimica Classificare gli ormoni secondo la loro natura chimica permette di suddividerli in: • Ormoni proteici e peptidici. Costituiscono la maggior parte degli ormoni in circolo, e sono rappresentati da molecole le cui dimensioni vanno dai 3 ai 200 aminoacidi. Tipicamente subiscono alcune modifiche post-traduzionali; tra queste vi è la glicosilazione. Dunque, questa classe comprende anche ormoni glicoproteici. • Ormoni derivati dagli aminoacidi. Sono ottenuti modificando alcuni aminoacidi. Ne fanno parte le catecolammine, idrosolubili, e gli ormoni sintetizzati dalla tiroide, liposolubili. Derivano entrambi dalla tirosina. • Ormoni steroidei. Derivano tutti dal colesterolo, e sono lipofili. • Ormoni derivati dall’acido arachidonico. Sono rappresentati dagli eicosanoidi, e sono lipofili. • Ormoni derivati dalla vitamina D. Derivano dal colesterolo, ma a rigore non possono esser considerati steroidi a causa della loro struttura chimica. Sono lipofili.

1.2.3 Classificazione degli ormoni in base alla modalità di diffusione Una distinzione degli ormoni sulla base della modalità di diffusione tiene conto di come l’ormone raggiunge la cellula bersaglio e del raggio d’azione (Fig 1.1). Comunemente, si parla di: • Ormoni endocrini. Raggiungono la cellula bersaglio attraverso il circolo sanguigno; sono potenzialmente in grado di agire a lungo raggio, e diffondersi in tutto il corpo.

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1 Generalità

B) Modalità di diffusione paracrina

A) Modalità di diffusione endocrina

C) Modalità di diffusione autocrina

Figura 1.1: Le tre principali modalità di diffusione con cui un ormone raggiunge le cellule bersaglio: A) modalità endocrina; B) modalità paracrina; C) modalità autocrina.

• Ormoni paracrini. Sono rilasciati nello spazio extracellulare, e raggiungono la cellula bersaglio per diffusione; agiscono sulle cellule circostanti alla cellula secernente. • Ormoni autocrini. Agiscono sulla stessa cellula che ha secreto l’ormone. Alcuni testi parlano anche di una modalità iustacrina (dal latino juxta, accanto). Queste modalità d’azione non si escludono mutualmente: un ormone può, per esempio, essere sia paracrino che autocrino, oppure paracrino ed endocrino, etc. Quest’ultimo è il caso, ad esempio, del testosterone: sintetizzato dalle cellule di Leydig nel testicolo (e in piccola parte a livello della zona corticale delle ghiandole surrenali) ha numerosi effetti a livello endocrino, come il mantenimento del trofismo muscolare, ma agisce anche a livello paracrino sulle cellule del Sertoli dei tubuli seminiferi, stimolando la spermatogenesi. Ad oggi sono note decine di ormoni, e ne vengono scoperti continuamente di nuovi. Esplorare la biosintesi di ciascuno va oltre gli scopi di queste pagine; per questo motivo nei prossimi capitoli esamineremo nel dettaglio solo la biosintesi degli ormoni più significativi.

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1 Generalità

1.3 Chi sintetizza gli ormoni? Una cellula sintetizza un ormone se esprime gli enzimi necessari, e/o se esprime il gene relativo all’ormone in questione (nel caso degli ormoni peptidici). Nel caso di molti ormoni che prenderemo in considerazione, la sintesi avviene esclusivamente o quasi in tessuti specializzati, che possono costituire ghiandole. Un esempio sono gli ormoni tiroidei, sintetizzati esclusivamente dalle cellule follicolari della tiroide. Talora, se la sintesi dell’ormone è molto complessa, può essere necessaria la collaborazione di tessuti diversi: è il caso del calcitriolo o degli estrogeni. Tuttavia, alcune molecole di valore ormonale sono sintetizzate da quasi tutte le cellule del corpo; un esempio importante sono gli eicosanoidi.

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2 Ormoni proteici e peptidici La grande maggioranza degli ormoni sintetizzati dall’uomo sono di natura proteica/peptidica. In questo gruppo, come si può immaginare, sono dunque comprese molecole segnalatorie estremamente diverse, sintetizzate da una varietà di organi e cellule, e dalle funzioni più disparate. A causa dell’ampiezza dell’argomento, non saranno trattati tutti gli ormoni conosciuti, ma solo quelli più importanti. In particolare, esamineremo a grandi linee gli ormoni dell’asse ipotalamo-ipofisario, di fondamentale importanza per comprendere le relazioni che intercorrono tra sistema nervoso ed apparato endocrino, e le modalità con cui questi ormoni esercitano il loro controllo sul resto del corpo. Esamineremo poi due dei tre ormoni importanti per l’omeostasi del calcio e del fosfato (PTH e calcitonina)1 . Infine, tratteremo due importanti ormoni che ricoprono un ruolo centrale nel metabolismo energetico dell’organismo umano: insulina e glucagone. Un tema ricorrente nella trattazione di questi messaggeri chimici, su cui il lettore è invitato a fare attenzione, è che gli ormoni peptidici e proteici sono sintetizzati spesso come precursori più grandi, che vengono attivati mediante proteolisi limitata.

2.1 Ormoni dell’asse ipotalamo-ipofisi Dove siamo? Ipotalamo e ipofisi L’ipofisi, o ghiandola pituitaria, è una piccola ghiandola rotondeggiante che sporge dalla base dell’encefalo. È accolta nella sella turcica dell’osso sfenoide, ed è collegata al resto dell’encefalo da un peduncolo che si estende posteriormente al chiasma ottico, l’infundibolo. Consta di due parti, dette lobi: un lobo anteriore (adenoipofisi) e un lobo posteriore (neuroipofisi). Tra le due è interposta la pars intermedia, una regione che nell’uomo è scarsamente sviluppata.

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Il terzo, il calcitriolo, sarà trattato con gli ormoni derivati dalla vitamina D, a pagina 132.

2 Ormoni proteici e peptidici

L’ipotalamo è una regione encefalica (in particolare, diencefalica) connessa all’ipofisi per mezzo dell’infundibulo. L’ipotalamo è in pratica un insieme di nuclei, cioè aggregati di corpi neuronali, immersi nella sostanza bianca. Sono proprio gli assoni che si dipartono dai corpi neuronali che formano alcuni di questi nuclei che costituiscono l’infundibolo.

2.1.1 Generalità L’ipofisi secerne due tipi fondamentali di ormoni: 1. molecole segnale la cui funzione fisiologica è controllare e modulare la secrezione di altri ormoni (a livello dell’adenoipofisi); 2. molecole segnale la cui funzione fisiologica è regolare direttamente alcune funzioni omeostatiche (soprattutto a livello della neuroipofisi). Nel primo caso, gli ormoni liberati dall’ipofisi raggiungono le ghiandole endocrine periferiche con il circolo sanguigno e regolano il rilascio di altri ormoni; in generale, sono messaggeri chimici piuttosto specifici nella loro azione, nel senso che ciascuno regola il rilascio di un ormone o di un gruppo di ormoni funzionalmente correlati. Nel secondo caso, l’azione fisiologica dei messaggeri elaborati dall’asse ipotalamoipofisario non è di regolare il rilascio di altri ormoni, bensì di agire direttamente come ormoni, regolando varie funzioni corporee. L’adenoipofisi è responsabile della sintesi di (Fig. 2.1): • ACTH, ormone adenocorticotropo - Stimola la sintesi degli ormoni corticosteroidi, a livello della ghiandola surrenale (trattati nella sezione 6.2.1 a pagina 142); • FSH, ormone follicolostimolante - Stimola la sintesi degli ormoni sessuali, a livello delle gonadi maschili e femminili (trattati nella sezione 6.3 a pagina 155); • GH (Growth Hormone), ormone della crescita - Promuove l’accrescimento del corpo (trattato in questo capitolo, pag. 29); • LH, ormone luteinizzante - Come l’FSH, stimola la sintesi degli ormoni sessuali (trattati nella sezione 6.3 a pagina 155); • PRL, prolattina - Agisce a livello della ghiandola mammaria (pag. 29); • TSH, ormone tireostimolante - Stimola la sintesi degli ormoni tiroidei a livello della ghiandola omonima (trattati nella sezione 3.3 a pagina 102);

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2 Ormoni proteici e peptidici

lobo anteriore dell'ipofisi

lobo posteriore dell'ipofisi

ACTH

GH

ADH (vasopressina)

LH ed FSH

PRL

Ossitocina

TSH

(endorfine e lipotropine)

Figura 2.1: I principali ormoni secreti dal lobo anteriore e dal lobo posteriore dell’ipofisi

• Endorfine e lipotropine - Molecole coinvolte in numerose funzioni fisiologiche, tra le quali (particolarmente interessante per gli studenti di medicina) il dolore (pag. 24). Collettivamente ACTH, FSH, LH e TSH sono detti ormoni tropinici perché agiscono su altre ghiandole endocrine; come abbiamo detto sono molecole segnale la cui funzione fisiologica è controllare e modulare la secrezione di altri ormoni. A livello della neuroipofisi vengono secreti ormoni che agiscono come tali (Fig. 2.1): • Ossitocina - Esplica numerose funzioni nel parto e non solo; • Vasopressina o ADH - Interviene nella regolazione del bilancio idrico, dell’osmolarità e della pressione del plasma; Anche senza una specifica conoscenza della fisiologia di questi ormoni, appare chiaro che l’ipofisi nel suo complesso abbia il ruolo di “direttore d’orchestra” nei confronti dell’apparato endocrino e, più in generale, nell’omeostasi del corpo umano. È legittimo chiedersi, a questo punto, come vengano regolate le funzioni ormonali dell’ipofisi, e a quali segnali risponda. La risposta sta nell’ipotalamo, che si trova nelle vicinanze della ghiandola, e nel concetto di feedback. A livello dell’ipotalamo avviene l’integrazione tra i segnali provenienti da altre aree dell’SNC e recettori sensoriali; complessivamente, questa struttura è raggiunta da una serie molto ampia di stimoli (relativi ad es. alla sensibilità viscerale, oppure stimoli sensoriali esterni, etc.). È noto che l’ipotalamo riceve afferenze da praticamente tutte le

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2 Ormoni proteici e peptidici

Neuroni parvocellulari CRH

GHRH

GnRH

Somatostatina

TRH

Dopamina

Neuroni magnocellulari

Circolo portale ipofisario lobo anteriore dell'ipofisi

lobo posteriore dell'ipofisi

ACTH

GH

ADH (vasopressina)

LH ed FSH

PRL

Ossitocina

TSH

(endorfine e lipotropine)

Figura 2.2: Le influenze ipotalamiche sulla secrezione dei principali ormoni secreti dal lobo anteriore e dal lobo posteriore dell’ipofisi

altre regioni dell’encefalo: è quindi perfettamente integrato nel sistema nervoso, ed è costantemente raggiunto da numerose informazioni. I neuroni che lo compongono ricevono segnali attraverso neurotrasmettitori, esattamente come tutti gli altri neuroni. Tuttavia, piuttosto che propagare un potenziale d’azione e rilasciare un neurotrasmettitore, alcuni neuroni ipotalamici sintetizzano e rilasciano molecole di valenza ormonale (Fig. 2.2): • i neuroni magnocellulari (appartenenti ai nuclei sopraottico e paraventricolare) sintetizzano ossitocina e vasopressina. Gli assoni di questi neuroni percorrono l’infundibulo, il peduncolo che connette l’ipotalamo all’ipofisi, e si portano a livello della neuroipofisi: in effetti, la neuroipofisi può esser considerata una estensione dell’ipotalamo. Qui mettono in circolo ossitocina e vasopressina, che agiscono come ormoni endocrini. • i neuroni parvocellulari sintetizzano molecole segnale che inibiscono o promuovono la secrezione degli ormoni adenoipofisari – che, a loro volta, dirigono le ghiandole endocrine periferiche.

9

2 Ormoni proteici e peptidici Quindi: a livello dell’ipotalamo arrivano diversi stimoli, della cui natura adesso non ci preoccupiamo, in base ai quali vengono inviati segnali all’ipofisi o vengono liberati ormoni endocrini; l’ipofisi, in base agli stimoli ricevuti, secerne o meno ormoni – che poi andranno a regolare la sintesi di altri, ulteriori ormoni, per esempio a livello della ghiandola surrenale o delle gonadi. Per avere il quadro completo dobbiamo sovrapporre a questo scenario, già abbastanza articolato, un intricato sistema di feedback. In sostanza, la biosintesi o la secrezione di un ormone può essere influenzata dalla concentrazione di certi ioni, di altri ormoni, o dell’ormone stesso: si ha feedback negativo quando il risultato di questa regolazione è una inibizione, feedback positivo quando il risultato è un aumento; il primo è decisamente comune. L’ipotalamo può subire una regolazione a feedback da parte (Fig. 2.3): 1. di un ormone secreto dall’ipotalamo stesso; 2. di un ormone secreto dall’ipofisi; 3. di un ormone secreto da una ghiandola endocrina in risposta ad un ormone tropinico dell’ipofisi. Allo stesso modo, l’ipofisi, oltre a sottostare alla regolazione (non di tipo feedback) dell’ipotalamo, può subire regolazione feedback da parte di un ormone secreto da una ghiandola endocrina perifica (in risposta ad un ormone tropinico ipofisario). È molto comune la situazione in cui l’ormone periferico inibisce sia l’ormone ipofisario che l’ormone ipotalamico. L’asse ipotalamo-ipofisario è costituito proprio dai complessi e intimi rapporti regolativi che si instaurano tra questi due organi, che collaborano nella direzione di molti processi fisiologici del corpo. È frequente che tale denominazione venga estesa anche alle ghiandole endocrine terminali (per cui si parla anche di asse ipotalamo-ipofisario-gonadico, o asse ipotalamoipofisario-surrenale), così come alle aree cerebrali che stanno a monte (asse limbicoipotalamo-ipofisi-adrenocorticale). Adesso esamineremo brevemente gli ormoni secreti dall’ipotalamo, trattando prima i neurormoni dei neuroni magnocellulari (e quindi neuroipofisi posteriore), poi dei neuroni parvocellulari (che controllano la secrezione adenoipofisaria). Successivamente esamineremo l’adenoipofisi, soffermandoci sulla biosintesi solo quando questa presenti aspetti insoliti o di interesse clinico e biochimico. I neuroni magnocellulari dell’ipotalamo, come abbiamo accennato, sintetizzano ossitocina e vasopressina. Questi vengono poi secreti a livello dell’ipofisi posteriore, che in effetti rappresenta un’estensione dell’ipotalamo.

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2 Ormoni proteici e peptidici

Ipotalamo

+

Ipofisi

-

+

Ghiandola periferica

-

Figura 2.3: Questo schema illustra un tipico circuito di feedback tra ipotalamo, ipofisi, e una ghinadola periferica.

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2 Ormoni proteici e peptidici 2

1

Tyr

Cys 6

7

8

9

Cys

Pro

Leu

Gly

3

Ile 4

5

Gln

Asn

NH 2

Figura 2.4: La struttura dell’ossitocina. Si tratta di un peptide composto da 9 aminoacidi, con un ponte disolfuro che crea un ciclo intramolecolare. Risulta molto simile all’ADH.

2.1.2 Ossitocina Struttura L’ossitocina è un peptide di 9 aminoacidi con struttura ad anello (data da un ponte disolfuro intramolecolare tra due Cys, fig. 2.4). Sede di elaborazione Viene sintetizzata e secreta dai neuroni magnocellulari dei nuclei sopraottico e paraventricolare, i cui assoni si estendono nella neuroipofisi (ipofisi posteriore). A livello della terminazione assonica l’ormone viene immagazzinato in vescicole, per poi essere secreto per esocitosi in risposta ad una depolarizzazione, che provoca un aumento intracellulare di Ca2+ . Quest’ultimo innesca la liberazione delle vescicole. Biosintesi L’ossitocina è sintetizzata nel reticolo endoplasmatico come pre-ormone; passa poi nel Golgi, e viene in seguito impacchettata in grossi granuli secretori, che vengono trasportati lungo l’assone dei neuroni magnocellulari (a livello macroscopico, dobbiamo immaginarli viaggiare lungo il peduncolo ipofisario). Durante il trasporto, all’interno dei granuli, il pre-ormone subisce modifiche post-traduzionali, in seguito alle quali si produce l’ormone attivo e un peptide derivato dal processamento del pre-ormone, la neurofisina I. Quindi, durante il trasporto assonale, l’ossitocina si trovava legata alla neurofisina I e collettivamente formavano il pre-ormone; in seguito a taglio proteolitico, queste vengono separate in due frammenti peptidici distinti. Al momento della secrezione ossitocina e neurofisina I vengono liberate insieme. Secrezione e regolazione La secrezione di ossitocina avviene per esocitosi, ed è innescata da una depolarizzazione. L’attività elettrica delle cellule ipotalamiche è condizionata da una varietà di stimoli: in generale, l’ormone viene immesso in circolo durante l’allattamento e il parto. In particolare:

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2 Ormoni proteici e peptidici • per quanto riguarda il ruolo dell’ossitocina nel parto, la distensione della cervice uterina al termine della gravidanza, provocata dal feto, e la contrazione dell’utero durante il parto stesso inducono il rilascio di ossitocina; • durante l’allattamento la suzione del capezzolo induce il rilascio di ossitocina attraverso la stimolazione di recettori sensoriali. • il rilascio di ossitocina è stimolato dall’ossitocina stessa (feedback positivo!); questo avviene con un meccanismo di tipo autocrino – pare che una parte dell’ossitocina sia secreta a livello dell’ipotalamo; • la secrezione di ossitocina è inibita dal dolore, dall’aumento della temperatura corporea e dal rumore. Trasporto nel plasma e degradazione Nel plasma, l’ossitocina ha emivita breve (pochi minuti), e viene rimossa dalla circolazione soprattutto dal rene. Circola essenzialmente in forma libera. Recettori L’ossitocina esplica la sua azione biologica tramite recettori accoppiati a proteine G, che stimolano l’adenilato ciclasi, innalzando la concentrazione di cAMP, che è quindi il secondo messaggero. Nel miometrio, il pathway più sfruttato è tuttavia quello della fosfolipasi C-Ca2+ -PKC. Questi recettori sono espressi soprattutto dalle cellule uterine e mammarie. Effetti fisiologici A livello dell’utero, induce contrazioni ritmiche che favoriscono il parto o la mestruazione. Dato che la secrezione di ossitocina è stimolata dalle contrazioni uterine, siamo in presenza di un meccanismo di tipo feedback positivo – notare peraltro che durante le fasi terminali della gravidanza, gli ormoni sessuali determinano un incremento esponenziale dell’espressione dei recettori per l’ossitocina a livello uterino. Questo rende l’utero molto più ricettivo all’ormone. A livello della mammella, induce la contrazione delle cellule mioepiteliali che si trovano a livello degli alveoli che compongono il tessuto ghiandolare mammario, provocando la fuoriuscita del latte materno. Si ipotizza che l’ossitocina influenzi il comportamento, in particolare il comportamento materno, il comportamento sociale e il comportamento sessuale, anche se l’attività nell’uomo non è stata dimostrata in modo convincente.

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2 Ormoni proteici e peptidici 2

1

Tyr

Cys

3

6

7

8

9

Phe

Cys

Pro

Arg

Gly

4

5

Gln

Asn

NH 2

Figura 2.5: La struttura dell’ADH. Si tratta di un peptide composto da 9 aminoacidi, con un ponte disolfuro che crea un ciclo intramolecolare. Risulta molto simile all’ossitocina.

2.1.3 Vasopressina (ADH, ormone antidiuretico) L’arginina vasopressina (sinonimi: vasopressina, argipressina, AVP, ADH - da antidiuretic hormone, ormone antidiuretico) è un ormone peptidico che entra in gioco nella regolazione del bilancio idrico, dell’osmolarità plasmatica e degli elettroliti plasmatici. Struttura è un peptide di 9 aminoacidi, strutturalmente molto simile all’ossitocina (Fig. 2.5). In particolare, è estremamente simile la composizione aminoacidica, e presenta una simile struttura ciclica dovuta ad un anello intramolecolare, formato da un ponte disolfuro tra due cisteine. Sede di elaborazione Come l’ossitocina, viene sintetizzato dai neuroni magnocellulari dell’ipotalamo, e rilasciato dai loro assoni a livello della neuroipofisi. Biosintesi La biosintesi della vasopressina segue le stesse tappe della biosintesi dell’ossitocina; anche l’ADH viene immagazzinato in granuli secretori, dove il taglio proteolitico del pre-ormone produce la vasopressina o ADH e la neurofisina II. Secrezione e regolazione Una depolarizzazione del neurone promuove il rilascio per esocitosi di ormone e neurofisina II. L’ADH regola il bilancio idroelettrolitico dell’organismo modulando il riassorbimento dell’acqua da parte del rene: in pratica, è un ormone che evita una disidratazione eccessiva. La regolazione della secrezione avviene ad opera: • dell’aumento dell’osmolarità plasmatica (l’osmolarità aumenta se il plasma diviene più concentrato, cioè se il contenuto di acqua diminuisce). Specifici osmocettori, estremamente sensibili, sono presenti nell’ipotalamo, nell’organo subfornicale, nel nucleo preottico mediano e nell’organum vascolosum della lamina terminalis; quando vi è perdita di liquidi, con alterazione anche minima dell’osmolarità plasmatica, anche questi recettori perdono liquido intracellulare

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2 Ormoni proteici e peptidici per motivi osmotici. La conseguente riduzione del volume cellulare innesca il segnale che porterà alla sintesi e alla secrezione di ADH. Allo stesso modo, quando vi è eccessiva diluizione del plasma, gli osmocettori aumentano di volume e riducono la secrezione di ADH. • della riduzione della pressione sanguigna (la pressione diminuisce se diminuisce il volume plasmatico). Barocettori sensibili alla pressione si trovano negli atri del cuore, nell’aorta, nelle carotide, nelle vene. Questi barocettori inviano al sistema nervoso degli impulsi che inibiscono tonicamente (cioè continuamente) la secrezione di ADH. Se stimolati meccanicamente dalle variazioni della tensione delle pareti vascolari in seguito alla diminuzione di pressione, riducono i loro impulsi, e la secrezione di ADH cessa di essere inibita. La sensibilità alle variazioni di pressione sanguigna è minore rispetto alla sensibilità alle variazioni di osmolarità. Parallelamente, a livello renale si può avere la secrezione di renina in risposta a stimoli correlati ad una diminuzione della pressione sanguigna. La renina effettua un taglio proteolitico che converte l’angiotensinogeno, prodotto dal fegato in angiotensina I, che dopo ulteriori modifiche diventa angiotensina II. Quest’ultima molecola concerta la modulazione di un gran numero di processi fisiologici, che hanno come risultato ultimo l’incremento della pressione sanguigna; tra questi vi è l’aumento della secrezione di ADH. • La secrezione di ADH può essere influenzata anche da altri stimoli e sostanze: dolore, stress, ipoglicemia, nicotina, esercizio fisico intenso etc. Correlazioni cliniche: Alcool e ADH L’etanolo è una sostanza che molte persone hanno assunto almeno una volta nella vita (e qualcuno tante volte). Un fenomeno che si accompagna al consumo di bevande alcoliche è, notoriamente, l’effetto diuretico. L’etanolo inibisce la secrezione di ADH, diminuendo il riassorbimento di acqua da parte del rene. Il rene quindi produce più urina, e questo sembra essere il principale meccanismo dell’effetto diuretico associato all’ingestione di alcool [34, 35].

Trasporto nel plasma e degradazione Come l’ossitocina, anche l’emivita dell’ADH è breve. L’ormone circola prevalentemente in forma libera, in concentrazioni dell’ordine dei ng/L, e viene massicciamente escreto con le urine: dato che la principale azione dell’ormone è a livello renale, filtra direttamente attraverso i capillari glomerulari.

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2 Ormoni proteici e peptidici Recettori L’azione biologica dell’ormone antidiuretico è mediata da recettori accoppiati a proteine G. Sono noti tre tipi di recettori dell’ADH: • V1A (noto anche come V1 ): è espresso in molti tessuti, tra cui fegato, muscolatura liscia, piastrine e miometrio; è accoppiato alla proteina Gq, che attiva soprattutto le fosfolipasi C e A2 , determinando nel primo caso un aumento del calcio intracellulare attraverso il pathway dell’IP3 , nel secondo caso la sintesi di eicosanoidi. • V1B (noto anche come V3 ) è considerato un recettore minore, ed è espresso soprattutto nelle cellule dell’adenoipofisi che secernono ACTH. Agisce come il V1A , attivando cioè la fosfolipasi C. • V2 : è espresso nei tessuti renali; è accoppiato a una proteina Gs, che attiva l’adenilato ciclasi, incrementando i livelli intracellulari di cAMP. Effetti fisiologici Gli effetti più importanti dell’ADH si apprezzano soprattutto nel rene e nella muscolatura liscia dei vasi. Rene L’ADH controlla il riassorbimento dell’acqua a livello dei dotti collettori distali nella quota del 10% circa. Il 90% circa dell’acqua è invece riassorbito in maniera ormone-indipendente nei tubuli prossimali, dove le cellule esprimono in maniera costitutiva l’acquaporina-1, un proteina integrale di membrana che forma dei canali per l’acqua. La vasopressina legandosi al recettore V2 aumenta i livelli di cAMP nelle cellule dei dotti collettori distali, attivando quindi una PKA che fosforila l’acquaporina-2. La fosforilazione provoca lo spostamento dell’acquaporina-2 dal citosol alla membrana. In definitiva, l’ADH aumenta il numero di canali per l’acqua attivi, permettendo un maggior riassorbimento di acqua libera da soluti. Questo provoca una maggiore concentrazione delle urine, e una maggiore conservazione di liquidi. Può sembrare strano che l’ADH controlli solo il 10% dell’acqua riassorbita, ma considerando che in un uomo adulto si formano 180 litri di filtrato glomerulare ogni giorno, se l’ormone non controllasse quel 10%, avremmo l’escrezione di ben 18 litri di urina al giorno! Muscolatura liscia dei vasi A livello della muscolatura liscia dei vasi, l’ADH determina vasocostrizione (da qui il nome di vasopressina).

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2 Ormoni proteici e peptidici Correlazioni cliniche: Diabete insipido Storicamente, due grandi malattie sono state denominate come “diabete”: il diabete mellito ed il diabete insipido. La parola diabete deriva probabilmente dal greco διαβαίνω (pronuncia: diabàino), “scorrere, passare attraverso”, in riferimento alla marcata emissione di urine (poliuria) che caratterizza queste due malattie. Tuttavia, a parte la poliuria, il diabete mellito ed insipido non hanno praticamente niente in comune, e sono due malattie sostenute da meccanismi diversi. Il diabete mellito è la malattia a cui di solito ci si riferisce quando si parla di diabete senza specificare altro: la poliuria qui è causata da un’eccesso di glucosio ematico (iperglicemia). Quando il glucosio è in quantità tali da superare le capacità di riassorbimento del rene e passa nelle urine, si porta dietro acqua per osmosi e provoca quindi un aumento del volume di urine emesse (diuresi osmotica). Nel diabete insipido la poliuria deriva da un meccanismo completamente diverso: il rene non riceve o non è in grado di rispondere al segnale ormonale per il riassorbimento di acqua. I termini insipido e mellito derivano dal fatto che i medici del passato erano soliti assaggiare le urine dei loro pazienti: se le urine erano dolci il diabete era mellito (cioè dolce, per il glucosio - Willis nel 1674 definiva le urine dei diabetici “sorprendentemente dolci, come fossero miscelate con miele o zucchero”; gli credo sulla parola); se le urine erano insapori (perché molto diluite) il diabete era insipido. Il diabete insipido può essere causato da una insufficiente secrezione di ADH (diabete insipido “centrale”), oppure dalla mancata risposta del rene allo stimolo della vasopressina (diabete insipido “nefrogenico”). L’insufficiente secrezione di ADH è la causa più frequente: si può realizzare in seguito a tumori, traumi, infezioni, autoimmunità o cause più rare. Talvolta non si riesce a trovare una causa, e quindi il diabete insipido è idiopatico. Il diabete insipido nefrogenico è raro e insorge in seguito a mutazioni dei recettori V2 dell’ADH o mutazioni dell’acquaporina; talvolta è secondario a patologie renali. Dal punto di vista clinico, il diabete insipido si manifesta con poliuria (la produzione di grandi quantità di urine molte diluite, giorno e notte, fino a diversi litri al giorno) e polidipsia (una sete insopprimibile, per compensare alla perdita di liquidi con le urine).

2.1.4 Releasing hormones ipotalamici I neuroni parvocellulari dell’ipotalamo sintetizzano e rilasciano, a livello dell’eminenza mediana, neuropeptidi che controllano la secrezione dell’ipofisi anteriore (Fig. 2.6). I neuropeptidi giungono all’adenoipofisi attraverso un sistema venoso portale, e

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2 Ormoni proteici e peptidici Neuroni parvocellulari dell'ipotalamo

TRH

GnRH

CRH

Somatostatina

GHRH

Dopamina

Recettori accoppiati a proteine G

AC

AC

PLC

PLC

AC

cellule tireotrope

cellule gonadotrope

cellule corticotrope

cellule somatotrope

cellule lattotrope

ACTH

GH

PRL

TSH

LH

FSH

Recettori accoppiati a proteine G

AC

AC

AC

AC

AC

Recettori delle citochine classe 1

diversi meccanismi di trasduzione del segnale

Figura 2.6: I releasing hormones ipotalamici. PLC: fosfolipasi C; AC: adenilato ciclasi.

esercitano la loro attività biologica mediante recettori accoppiati a proteine G; la maggior parte della trasduzione intracellulare del segnale è mediata dalla stimolazione della adenilato ciclasi; in altri casi (TRH e GnRH), si ha l’attivazione del pathway della fosfolipasi C. I neurormoni sono: CRH, ormone di rilascio delle corticotropine agisce sulle cellule che rilasciano ACTH (cellule corticotrope) e altre molecole segnale derivate dal un grande pro-ormone chiamato propriomelanocortina; TRH, ormone di rilascio della tireotropina agisce sulle cellule che rilasciano l’ormone tireostimolante (cellule tireotrope); GHRH, ormone di rilascio dell’ormone della crescita agisce sulle cellule che rilasciano l’ormone della crescita (cellule somatotrope); GnRH, ormone di rilascio delle gonadotropine agisce sulle cellule che rilasciano LH e FSH (cellule gonadotrope); Dopamina agisce sulle cellule che rilasciano prolattina (cellule lattotrope); Somatostatina ha molti effetti biologici; tra quelli che ci interessano adesso, l’inibizione della secrezione di GH, TSH e prolattina.

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2 Ormoni proteici e peptidici Come si può intuire, praticamente tutta la secrezione ipofisaria è sotto il controllo dei neurormoni ipotalamici. La liberazione di questi neurormoni da parte dell’ipotalamo sottostà a diversi tipi di regolazione, come abbiamo accennato parlando dell’asse ipotalamo ipofisario. Si tratta di: 1. una massiccia regolazione di tipo feedback (negativo o positivo) da parte di altri ormoni endocrini; 2. l’influenza dei segnali provenienti dall’ambiente esterno e da altre aree cerebrali. Per esempio, il rilascio del TRH, che promuove la secrezione di TSH, è influenzato dai livelli plasmatici degli ormoni tiroidei di cui il TSH stimola l’immissione in circolo (vedi anche fig. 2.10, pag. 37). Esistono sistemi di feedback similari (in cui cioè l’ormone ipotalamico risente con un meccanismo feedback della concentrazione dell’ormone ipofisario, che a propria volta risente con un altro circuito di feedback della concentrazione dell’ormone periferico) per ciascuno degli ormoni ipotalamici: quindi, il GnRH sarà regolato mediante feedback dalla concentrazione di LH e FSH, che saranno regolati dalla concentrazione degli ormoni sessuali, etc. A questi si possono sovrapporre altri feedback: per esempio, CRH stimola a livello ipofisario la secrezione di ACTH, il quale a propria volta stimola la secrezione di alcuni ormoni, detti adrenocorticoidi, tra cui il cortisolo; il cortisolo poi, oltre ad inibire l’ACTH, inibisce direttamente il CRH. Quando un ormone periferico inibisce un ormone ipotalamico si parla di feedback lungo. Per quanto riguarda il controllo da parte di altre aree cerebrali sulla attività secretoria ipotalamica, è importante menzionare il nucleo soprachiasmatico: si tratta di un nucleo ipotalamico, situato superiormente al chiasma ottico, sincronizzato con l’alternanza giorno-notte; regola, attraverso gli ormoni ipotalamici, i ritmi pulsatili circadiani con cui alcuni ormoni ipofisari sono rilasciati. Altri ormoni ipofisari, sempre attraverso la mediazione degli ormoni ipotalamici, sono rilasciati secondo ritmi collegati ai cicli di sonno-veglia, e la combinazione di ritmi circadiani e ritmi sonno-veglia è responsabile della ciclicità che si osserva nella secrezione ormonale.

2.1.5 Ormoni dell’adenoipofisi Abbiamo quindi visto, in generale, che tipo di ormoni sono secreti dall’ipotalamo (prima da parte dei neuroni magnocellulari: ossitocina e vasopressina; poi da parte dei parvocellulari: releasing hormones), e come molti di questi controllino la secrezione adenoipofisaria; adesso andiamo ad esaminare proprio gli ormoni della adenoipofisi.

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2 Ormoni proteici e peptidici Queste molecole, come ormai abbiamo avuto modo di ripetere più volte, vanno ad agire sulle altre ghiandole endocrine del corpo, promuovendo la sintesi di ormoni periferici; a loro volta, questi regolano tramite feedback gli ormoni adenoipofisari – che, riassumendo, si adeguano da una parte alla regolazione periferica, dall’altra alla regolazione ipotalamica. Sulla base di omologie strutturali e di azione, gli ormoni della adenoipofisi sono classificabili in tre gruppi: • Il gruppo degli ormoni glicoproteici, composto da: – ormone tireostimolante, TSH; – ormone luteinizzante, LH; – ormone follicolo-stimolante, FSH; – gonadotropina corionica umana, hCG (attenzione: non è un ormone secreto dall’adenoipofisi; viene trattato in questa sede per convenienza, dato che ha una importante omologia strutturale con TSH, LH e FSH.); • Il gruppo dei peptidi derivati dalla pro-opiomelanocortina (POMC), che comprende una serie di molecole derivate da un unico precursore: – ormone adrenocorticotropo, ACTH; – β-lipotropine – β-endorfine • Il gruppo composto da ormone della crescita (GH), prolattina (PRL). Il gruppo degli ormoni glicoproteici Fanno parte del gruppo degli ormoni glicoproteici l’ormone tireostimolante (TSH), l’ormone luteinizzante (LH), l’ormone follicolo-stimolante (FSH). Nonostante non sia sintetizzato né secreto dall’adenoipofisi, bensì dalla placenta, tratteremo la gonadotropina umana corionica (hCG) insieme a questi ormoni, poiché ne condivide struttura e modalità d’azione. Struttura Gli ormoni glicoproteici sono quelli più grandi e complessi: sono glicoproteine eterodimeriche, costituite da: • una subunità α (92 a.a.), N-glicosilata a livello di due residui di asparagina. È identica per TSH, LH, FSH e hCG ed è molto conservata tra specie diverse;

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2 Ormoni proteici e peptidici • una subunità β, che conferisce l’azione biologica e che può essere glicosilata. È la subunità che differenza tra di loro gli ormoni glicoproteici e che conferisce la specificità di azione. Entrambe le subunità sono necessarie perché l’ormone sia attivo, ed il pentapeptide C-terminale della subunità α sembra essenziale per il legame al recettore. In definitiva, gli ormoni che fanno parte di questo gruppo sono caratterizzati da una grande omologia strutturale; la probabile causa è l’origine dei loro geni da un unico gene ancestrale comune. Si pensa che un gene iniziale codificasse per la subunità α; sarebbe poi andato incontro a duplicazione genica, producendo il gene per la subunità β, che avrebbe dato origine alla diversità tra le subunità per un fenomeno di divergenza genica. Questi ormoni hanno un peso molecolare di circa 30 kDa. Sede di sintesi Mentre l’espressione del gene per la subunità α è comune ai diversi citotipi che sintetizzano gli ormoni glicoproteici (le due popolazioni ipofisarie di cellule gonadotrope e tireotrope e le cellule placentari), l’espressione del gene per la subunità β è specifica del citotipo che produce l’ormone corrispondente, mentre i geni per le subunità degli altri ormoni non sono normalmente espressi. • le cellule tireotrope dell’ipofisi esprimono il gene per la specifica subunità β del TSH; • le cellule gonadotrope dell’ipofisi esprimono il gene per la subunità β di FSH ed LH; • le cellule trofoblastiche della placenta durante la gravidanza esprimono il gene per la subunità β della hCG [16].2 Biosintesi Le subunità α e β sono tradotte da mRNA separati. Si ritiene che la sintesi delle due subunità sia regolata in maniera indipendente, e, poiché sono state trovate libere nel citoplasma soltanto subunità α, sembra probabile che la disponibilità di subunità β sia limitante per la produzione dell’ormone completo. Le subunità sono tradotte come pro-pre-ormoni, che poi vanno incontro a diverse modifiche post-traduzionali: • proteolisi limitata per rimuovere il peptide segnale; • glicosilazione a livello dei residui di asparagina; 2

Anche alcuni tumori esprimono hCG.

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2 Ormoni proteici e peptidici • formazione di ponti disolfuro tra residui di cisteine. Vi sono cinque ponti disolfuro nella subunità α e sei nella subunità β. Non ci sono ponti disolfuro intermolecolari, solo intramolecolari: le subunità sono associate non covalentemente! Secrezione e regolazione La regolazione del rilascio, nonché della biosintesi, è effettuata dai releasing hormones ipotalamici corrispondenti e dagli ormoni periferici: • il TRH (ormone di rilascio della tireotropina) ipotalamico regola il TSH (ormone tireostimolante o tireotropina) ipofisario. Anche gli ormoni tiroidei regolano il TSH con un feedback negativo; • il GnRH (ormone di rilascio delle gonadotropine) ipotalamico regola LH ed FSH ipofisari. FSH ed LH sono coinvolti a loro volta, insieme a GnRH, agli ormoni sessuali, e ad altre molecole regolatorie, in uno dei loop di feedback più complessi del corpo umano. Maggiori informazioni su questo aspetto saranno fornite nel Capitolo 6. • la regolazione della hCG non è chiara: sono state individuate numerose molecole con azione paracrina in grado di regolare la sintesi dell’ormone, e sembra sia coinvolta anche una regolazione autocrina; alcuni studiosi hanno invece ipotizzato una regolazione da parte del GnRH, mentre altri hanno provato a correlarne la secrezione allo stadio di sviluppo della placenta. Ricordiamo che TRH e GnRH agiscono, rispettivamente sulle cellule tireotrope e gonadotrope, tramite il pathway della fosfolipasi C-IP3 -Ca2+ , a differenza degli altri releasing hormones, che sfruttano l’adenilato ciclasi. Trasporto nel plasma e degradazione Questi ormoni vengono secreti nel sistema portale ipofisario, dove circolano prevalentemente in forma non legata. Da lì passano alla circolazione sistemica. Una volta legati al recettore vengono probabilmente internalizzati e degradati. Recettori La trasduzione del segnale di TSH, FSH, LH e hCG è mediata da recettori accoppiati a proteine G. In tutti i casi, viene attivata la adenilato ciclasi tramite la subunità G αs. Il secondo messaggero è quindi cAMP, che vede aumentare la propria concentrazione. Effetti fisiologici degli ormoni del gruppo delle glicoproteine

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2 Ormoni proteici e peptidici TSH Il TSH ha come azione generica quella di stimolare la secrezione degli ormoni elaborati dalle cellule della tiroide. Si ritiene che agisca sui tireociti con effetti a breve e lungo termine: Effetti a breve termine: Stimola la biosintesi e la secrezione degli ormoni tiroidei a diversi livelli: 1. aumenta l’attività di una pompa che promuove l’ingresso all’interno delle cellule dello ione iuduro, che è essenziale per la biosintesi degli ormoni; 2. promuove l’incorporazione dello iodio all’interno della molecola che ha il ruolo di preormone; 3. stimola il processamento di tale preormone per ottenere l’ormone maturo. Tutti questi effetti saranno più chiari dopo lo studio degli ormoni tiroidei (sezione 3.3 a pagina 102) Effetti a lungo termine: aumenta il flusso ematico che giunge alla tiroide, modula l’espressione genica nelle cellule e ne promuove il trofismo (sia in termini di aumento di dimensioni, sia aumento di numero). FSH ed LH FSH ed LH sono prodotte dalle cellule gonadotrope dell’ipofisi anteriore, che sono il citotipo più rappresentato. Molte di queste cellule sintetizzano entrambe le molecole, mentre sono poche a sintetizzare uno soltanto dei due. Le cellule bersaglio delle gonadotropine LH ed FSH si trovano a livello dell’apparato riproduttore: cellule follicolari dell’ovaio (cioè, le cellule della teca e della granulosa), cellule del Sertoli e cellule del Leydig nel testicolo. FSH ed LH sono essenziali per la riproduzione: • Stimolano la gametogenesi (soprattutto FSH): spermatogenesi e follicologenesi; • Nella donna, regolano l’ovulazione; durante le varie fasi del ciclo si osserva uno schema di secrezione pulsatile molto complesso, in cui la secrezione di un ormone prevale sull’altro a seconda del momento fisiologico; • Regolano la sintesi degli ormoni sessuali, che fanno parte degli ormoni steroidei (vedi sezione 6.3 a pagina 155). Il colesterolo è utilizzato come precursore per la biosintesi di questi ormoni: FSH ed LH promuovono la maggior parte delle reazioni della biosintesi del colesterolo (che portano, nel complesso, alla condensazione dell’acetato in squalene), e la reazione di commissionamento del colesterolo alla biosintesi degli ormoni steroidei, che come vedremo è la conversione del colesterolo in un composto chiamato pregnenolone. Il pregnenolone viene poi utilizzato per sintetizzare tutti gli altri ormoni steroidei, compresi gli ormoni sessuali, sia androgeni che estrogeni (es. progesterone, testosterone, etc.).

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2 Ormoni proteici e peptidici

Pre-POMC

267 a.a.

N

C

Figura 2.7: Rappresentazione schematica del POMC completo del peptide segnale, per un totale di 267 aminoacidi. Le linee tratteggiate rappresentano i principali siti di taglio.

hCG La hCG è sintetizzata negli stadi precoci della gravidanza dalle cellule del sinciziotrofoblasto, che con il procedere della gestazione diventerà placenta. È molto simile all’LH, e, poiché i suoi livelli nelle urine e nel sangue aumentano immediatamente dopo l’impianto dell’embrione, è alla base dei comuni test di gravidanza. Si ritiene che il suo ruolo sia quello di “avvertire” il sistema materno della presenza dell’embrione, in modo da salvare il corpo luteo ed evitare la mestruazione. Dopo il terzo mese di gestazione, i suoi livelli decrescono. È ritenuto responsabile della nausea e del vomito mattutino che interessano comunemente le donne durante la prima fase della gravidanza, ma le prove a sostegno di questa ipotesi non sono conclusive [22, 8]. Il gruppo degli ormoni derivati dalla pro-opiomelanocortina (POMC) Il gruppo dei peptidi derivati dalla pro-opiomelanocortina (POMC) comprende diversi ormoni e neuroormoni, tutti derivati dallo stesso precursore, la POMC. Questo peptide viene tagliato in maniera differente a seconda del tessuto, con produzione di queste molecole segnale: • ACTH; • lipotropine; • melanotropine; • endorfine. Collettivamente, queste molecole sono note con il nome di melanocortine. Sede di elaborazione Vedi il paragrafo successivo “Biosintesi”. Biosintesi Il gene della POMC viene trascritto nel nucleo, quindi trasferito nel citoplasma, dove inizia la traduzione. Il peptide continua la traduzione nel lume del reticolo endoplasmatico come pre-POMC (267 aminoacidi, vedi fig. 2.7). Qui, prima ancora della fine della traduzione, il peptide segnale viene rimosso (-26 aminoacidi), e viene quindi prodotta proopiomelanocortina, di 241 aminoacidi. Questo polipeptide

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2 Ormoni proteici e peptidici andrà incontro a numerose modifiche post-traduzionali: alcune sono modifiche a livello di singoli aminoacidi, ma quelle più evidenti consistono in estesi tagli proteolitici, che frammentano la POMC in una serie di molecole segnale in modo tessuto-specifico (Fig. 2.8). Vi sono 8 potenziali siti di taglio all’interno della sequenza della POMC, che possono divenire substrato di specifiche endopeptidasi a serina (simili alla tripsina), le proormone convertasi. I siti di taglio sono costituiti da coppie di aminoacidi basici (Lys-Arg, Arg-Lys, Arg-Arg, Lys-Lys). A seconda di quali peptidasi vengono espresse in un tessuto dove è stata tradotta la POMC, e quindi in base a quali siti di taglio sono sfruttati, si possono avere frammenti diversi. Inoltre, i peptidi ottenuti sono ulteriormente processati con numerose modifiche spesso a carico di aminoacidi (molto frequente è l’acetilazione). Nelle cellule corticotrope dell’adenoipofisi vengono prodotti soprattutto ACTH (ormone adrenocorticotropo) e β-lipotropina – il tutto sotto il controllo del CRH ipotalamico. Viene prima effettuato un primo taglio sul POMC con il quale si produce la β-lipotropina, poi con un secondo taglio viene rilasciato l’ACTH. Talora, la βlipotropina può venire ulteriormente tagliata in queste cellule, ma dà origine a prodotti che sono rilasciati in quantità trascurabili. Nelle cellule melanotrope della pars intermedia dell’ipofisi e in altri tessuti periferici dove viene espresso il gene del POMC (intestino, placenta, organi riproduttivi maschili, melanociti dell’epidermide, alcune cellule del sistema nervoso in particolare a livello ipotalamico) sia ACTH che β-lipotropina sono ulteriormente frammentate con un terzo e un quarto taglio: l’ACTH viene spezzato in α-MSH (ormone melanotropo α) e CLIP (peptide della pars intermedia corticotropino-simile); la β-lipotropina in γ-lipotropina e β-endorfina. La γ-lipotropina, se ulteriormente frammentata, dà origine a β-MSH questo avviene nei tessuti diversi dall’ipofisi. Anche la β-endorfina può poi andare incontro ad ulteriori tagli proteolitici che la trasformano in altre endorfine. In alcune cellule nervose, anche la parte N-terminale del POMC viene processata, con rilascio di γ-MSH. Secrezione e regolazione La sintesi e il rilascio di questi ormoni sono regolati dal CRH ipotalamico, che agisce legandosi ad un recettore, chiamato CRH-1, accoppiato ad una proteina G, con attivazione dell’adenilato ciclasi e quindi del pathway cAMP, come avviene per molti degli ormoni ipofisiotropi. CHR-1 è espresso nelle cellule dell’encefalo, dell’ipofisi, della cute. Esiste anche un recettore CHR-2, espresso in molti altri tessuti, ma il suo ruolo non è chiaro.

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2 Ormoni proteici e peptidici

Pre-POMC

267 a.a.

POMC

241 a.a.

γ-MSH

ACTH

β-lipotropina

(a.a. 77-87)

(a.a. 138-176)

(a.a. 179-267)

α-MSH

CLIP

γ-Lipotropina

β-endorfina

(a.a. 138-150)

(a.a. 156-176)

(a.a. 179-234)

(a.a. 237-267)

β-MSH

γ-Endorfina

(a.a. 217-234)

(a.a. 237-251)

α-Endorfina (a.a. 237-250)

Figura 2.8: Rappresentazione schematica delle modalità di elaborazione del POMC. Sono indicati i principali peptidi che originano dalla frammentazione della molecola

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2 Ormoni proteici e peptidici Trasporto nel plasma e degradazione La molecola meglio studiata in merito al suo destino nel plasma è l’ACTH, che, essendo secreto in maniera episodica ed avendo una emivita di alcuni minuti, risulta avere livelli plasmatici molto variabili. Viene degradato da diverse aminopeptidasi plasmatiche [31]. Recettori ed effetti fisiologici Le melanocortine esercitano la loro azione ormonale principalmente tramite il gruppo dei recettori delle melanocortine MCR, di cui si conoscono 5 membri. Sono tutti recettori accoppiati a proteine G (quindi con 7 dominî transmembrana): • MCR-1: vi si lega MSH; è espresso a livello della cute; • MCR-2: è il recettore a cui si lega l’ACTH, è espresso a livello della corteccia surrenale ed è coinvolto nella regolazione della biosintesi degli ormoni steroidei; • MCR-3: il suo ruolo biologico non è chiaro; • MCR-4: espresso a livello dell’encefalo, ed è coinvolto nella regolazione dell’appetito; • MCR-5: è coinvolto nella termoregolazione; Le lipotropine esplicano attività biologica su diversi di tessuti, ma i loro effetti non sono del tutto chiari. Sono state così chiamate quando è stato notato che nel coniglio provocano lipolisi e mobilizzazione degli acidi grassi, ma nell’uomo apparentemente hanno altri effetti, e quello della lipolisi sembra essere trascurabile. Per quanto riguarda gli ormoni melanotropi (MSH, Melanocyte Stimulating Hormone), come abbiamo visto le forme conosciute sono tre: α-, β-, γ-. Sono prodotte, soprattutto la α-MSH (che è la più abbondante e la più importante), dalla pars intermedia dell’ipofisi. Per quanto riguarda la β-MSH, si hanno evidenze di una sua produzione durante la vita fetale, ma non è chiaro se venga prodotta nella vita postnatale dell’uomo. La loro funzione è quella stimolare la biosintesi e la secrezione di melanina da parte dei melanociti a livello della cute – in poche parole, sono responsabili della pigmentazione cutanea. L’MSH sembra non essere unicamente un ormone endocrino, ma pare che abbia anche un’azione paracrina: alcuni studi suggeriscono che venga sintetizzato anche dai melanociti, con azione locale. Le endorfine invece sono ormoni molto noti anche al di fuori dell’ambiente scientifico, soprattutto per il loro coinvolgimento nella sensazione del dolore. La β-endorfina, che è la principale e la più importante, è prodotta dal taglio proteolitico della βlipotropina – questo avviene soprattutto (ma non solo) a livello della pars intermedia dell’ipofisi. La β-endorfina viene poi rapidamente acetilata, una modifica post-

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2 Ormoni proteici e peptidici traduzionale che si pensa la inattivi, e messa in circolo. In diverse regioni del sistema nervoso (centrale e periferico) viene poi deacetilata, oppure sintetizzata in loco e secreta direttamente non acetilata, e sembra utilizzata come neurotrasmettitore o neuro modulatore. Inoltre, la β-endorfina può andare incontro a tagli ulteriori a livello della regione C-terminale per dare origine a γ- e α-endorfina. Le endorfine sono dei cosiddetti oppioidi endogeni, ovvero molecole sintetizzate dal nostro stesso organismo che sono in grado, legandosi a specifici recettori, di evocare risposte fisiologiche che mediano l’analgesia e altre risposte che hanno a che fare con il comportamento, come la modulazione dell’euforia o delle dipendenze. I recettori oppioidi sono accoppiati a proteine G. Correlazioni cliniche: I recettori oppioidi Si legano agli stessi recettori delle endorfine anche i potenti analgesici oppioidi, di cui l’esponente più noto è la morfina. L’eroina (o diamorfina) è un’altra sostanza oppiode molto nota come stupefacente. Sintetizzata nella seconda metà dell’800, paradossalmente all’inizio venne pubblicizzata dalla casa farmaceutica produttrice come un farmaco alternativo alla morfina che non induceva dipendenza (addiction).

I principali recettori degli oppiodi sono tre: κ, δ e μ (ne esiste anche un quarto, ma non ne parleremo). Questi recettori influenzano la conduttanza di alcuni ioni: • δ e μ: mediano la risposta fisiologica agli oppioidi attivando la subunità Gi . Il pathway porta ad una stimolazione della fosfolipasi C e dei canali del K+ . • κ: mediano la risposta fisiologica agli oppiodi inibendo direttamente i canali del calcio. In questo modo, condizionano il rilascio di neurotrasmettitori da parte dei neuroni su cui agiscono. L’azione del CLIP (Corticotropin-Like Intermediate Lobe Peptide, peptide simile alla corticotropina del lobo intermedio) non è chiara. Per quanto riguarda l’ACTH (ormone adrenocorticotropo), la sua azione è meglio caratterizzata, e si esplica soprattutto a livello della ghiandola surrenale, dove stimola la produzione di alcuni ormoni steroidei, come il cortisolo. Viene rilasciato in risposta a condizioni di stress (inteso in senso ampio: stress fisico, come una ferita, o stress psicologico, come una forte emozione). In effetti, il cortisolo è spesso definito “l’ormone dello stress” proprio perché media l’adattamento a situazioni di questo tipo.

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2 Ormoni proteici e peptidici La secrezione di ACTH segue un ritmo circadiano, con un picco intorno alle 4-5 del mattino. Gli effetti dell’ACTH sono mediati da recettori accoppiati a proteine G; viene stimolata la subunità G αs, che porta ad un aumento di cAMP con attivazione della PKA. La principale azione biologica dell’ACTH consiste nell’incrementare la steroidogenesi (sintesi degli ormoni steroidei) soprattutto a livello della zona corticale della ghiandola surrenale, in particolare glucocorticoidi e mineralcorticoidi. Anche l’ACTH, come FSH ed LH, promuove la maggior parte delle reazioni della biosintesi del colesterolo (che portano, nel complesso, alla condensazione dell’acetato in squalene), nonché la reazione di commissionamento del colesterolo alla biosintesi degli ormoni steroidei, la conversione in pregnenolone. Il cortisolo, il principale glucocorticoide, regola con feedback negativo sia la secrezione di ACTH (a livello ipofisario) che di CRH (a livello ipotalamico). Ormone della crescita e prolattina L’ormone della crescita (GH) promuove l’accrescimento corporeo, mentre la prolattina (PRL) ha attività lattogenica. Si pensa che GH e PRL (insieme ad un’altra molecola segnalatoria, la somatomammotropina corionica) siano originati da uno stesso gene ancestrale. Struttura

GH e PRL sono ormoni peptidici accomunati da similitudini strutturali:

• le loro dimensioni sono comparabili (circa 190 aminoacidi). L’ormone della crescita è un peptide di 191 aminoacidi e 22 kDa di peso molecolare. La prolattina ha un peso molecolare di 23kDa; • hanno un singolo residuo di triptofano in posizioni simili (85 per il GH, 91 per PRL); • entrambi presentano due legami disolfuro nella stessa posizione; • hanno un’omologia di sequenza del 35%. Sede di sintesi Il GH è sintetizzato dalle cellule somatotrope, che sono uno dei citotipi più abbondanti nell’ipofisi, mentre il PRL dalle cellule lattotrope, che sono meno rappresentate. Biosintesi

La biosintesi non presenta aspetti particolari in nessuno dei due casi.

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2 Ormoni proteici e peptidici Secrezione e regolazione mente:

La sintesi e la secrezione del GH sono regolate principal-

• positivamente dal GHRH ipotalamico, attraverso la classica attivazione della adenilato ciclasi, incremento del cAMP, attivazione della PKA; il pathway risulta nella sintesi di alcuni fattori di trascrizione che regolano positivamente l’espressione del gene del GH e del recettore per il GHRH; • negativamente dalla somatostatina, sintetizzata dall’ipotalamo e altre aree cerebrali, nonché a livello periferico (es. dal pancreas endocrino); esplica la regolazione attraverso recettori accoppiati a proteina G, e stimolando la subunità inibitoria, che inibisce l’adenilato ciclasi; il pathway risulta in una diminuzione della concentrazione di cAMP. • attraverso feedback negativo, dall’Insulin-like Growth Factor 1 (IGF-1), che è una molecola che media l’azione del GH a livello periferico; • Da una varietà di altre molecole segnale (peptidi ipotalamici, ormoni, neurotrasmettitori), che esplicano la loro azione intervenendo sulla secrezione di GHRH o di somatostatina, oppure modulando la sensibilità delle cellule somatotrope a questi due regolatori. Da notare che anche il glucosio, in questo caso, si comporta come un ormone: l’ipoglicemia stimola la secrezione di GH, l’iperglicemia la inibisce. Anche alcuni aminoacidi (arginina in particolare) sono in grado di aumentare la secrezione di GH. Segnaliamo infine la regolazione positiva da parte della grelina, ormone secreto dallo stomaco. La sintesi e la secrezione della PRL sono regolate in maniera piuttosto complessa. La secrezione è influenzata da molti tipi di stimoli, alcuni interni e altri esterni. • Esiste una regolazione negativa costitutiva da parte della dopamina, secreta dall’ipotalamo – questa agisce tramite recettori dopaminergici accoppiati a proteine G inibitorie, che sopprimono l’attività della adenilato ciclasi; • La prolattina inibisce la propria secrezione stimolando il rilascio di dopamina ipotalamica, il che è un meccanismo di tipo feedback negativo; • promuove la secrezione di PRL lo stimolo della suzione del capezzolo materno, tramite un riflesso neuroendocrino che riduce la secrezione di dopamina a livello ipotalamico; anche ossitocina e vasopressina contribuiscono alla mediazione di questo effetto; • Promuovono la secrezione di PRL il sistema serotininergico e altri ormoni circolanti;

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2 Ormoni proteici e peptidici Quindi, lo stato normale della secrezione di prolattina è l’inibizione tramite la dopamina; quando giunge lo stimolo della suzione, la secrezione di dopamina decresce, e la prolattina entra in circolo – da una parte, mediando i propri effetti fisiologici, dall’altra ritornando a incrementare la secrezione di dopamina ed esercitando così un feedback negativo sulla propria secrezione. Trasporto nel plasma e degradazione L’emivita del GH è di 10-20 minuti. Circa il 50% del GH è legato a specifiche GH Binding Proteins (GHBP), che ne limitano le oscillazioni nella concentrazione plasmatica agendo da buffer e ne prolungano l’emivita. La PRL permane nel plasma per un tempo maggiore, con una emivita di 25-50 minuti. Sono degradati a livello di fegato e rene. Recettori I recettori del GH appartengono alla superfamiglia dei recettori delle citochine di classe 1 (noti anche come recettori dell’ematopoietina). Mediano risposte intracellulari tramite l’attivazione di protein chinasi. Il GH, legandosi ad un recettore, provoca un cambiamento conformazionale che ne innesca la dimerizzazione con un altro. La dimerizzazione attiva una delle cosiddette Janus chinasi (JAK-2), particolari chinasi che fosforilano su residui di tirosina sia il recettore che loro stesse. Il recettore fosforilato innesca una serie di pathway di trasduzione del segnale, utilizzati anche da altri recettori: 1. reclutando proteine STAT (Signal Transducers and Activator of Transcription) e facilitando la loro fosforilazione da parte di JAK. La fosforilazione attiva le proteine STAT, che dimerizzano tra loro, per poi entrare nel nucleo, dove agiscono come fattori di trascrizione, modulando l’espressione genica della cellula bersaglio (Fig. 2.9); 2. il pathway delle MAP chinasi (che coinvolge le proteine adattatrici Shc/Grb2); 3. fosforilazione della proteina IRS-1 (substrato del recettore dell’insulina) che attiva la fosfainositide 3-chinasi (il nome è dovuto al fatto che questo pathway è utilizzato anche dall’insulina); 4. Pathway della fosfolipasi C-DAG-PKC. Questi recettori si trovano per esempio a livello degli adipociti. I recettori della PRL sono anche in questo caso recettori della superfamiglia dei recettori delle citochine di classe 1, espressi in ovaie, ghiandole mammarie e alcune aree cerebrali. In seguito al legame, i recettori dimerizzano, e mediano una trasduzione intracellulare del segnale analoga a quella vista per l’ormone della crescita (JAK-STAT).

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2 Ormoni proteici e peptidici

GH

1

2

Recettore

P

JAK

P

Stat

3

4

P P

P

P

P

P

Nucleo Figura 2.9: 1. Recettore in assenza di GH. 2. Il recettore dimerizza, JAK si attiva e lo fosforila. 3. La fosforilazione permette il reclutamento delle STAT protein, che giungono a portata delle JAK, e vengono fosforilate. 4. Le STAT fosforilate dimerizzano e migrano nel nucleo.

Effetti fisiologici Il GH esplica la sua azione: • direttamente, legandosi ai propri recettori sulle cellule bersaglio. • indirettamente, stimolando in alcuni citotipi la sintesi e la secrezione di due fattori di crescita, Insulin-like Growth Factor-1 e 2 (IGF-1 e IGF-2) o somatomedine. Si tratta di peptidi di circa 7,5 kDa simili, come dice il nome, all’insulina. Tuttavia, gli IGF mantengono una porzione della catena polipeptidica, chiamata peptide C, che nell’insulina viene tagliata proteoliticamente. Mediano molti degli effetti anabolici e mitogenici del GH. Sono sintetizzati in seguito a stimolazione del GH soprattutto nel fegato, da dove vengono rilasciati nel sangue, agendo quindi con modalità endocrina. Circolano in forma libera solo in piccola parte, mentre la quota maggiore si trova legata a proteine di trasporto (dette IGFBP, IGF Binding Proteins, a loro volta sintetizzate nel fegato), in particolare alla isoforma IGBF-3. Le IGF sono prodotte anche da altri citotipi, ma con valenza paracrina ed autocrina. In questo caso non entrano in circolo, ma agiscono localmente, sulle cellule circostanti: un esempio è dato dai condrociti. A livello delle cartilagini metafisarie, queste cellule secernono IGF-1, che agisce localmente promuovendone l’espansione clonale, in sinergia con il GH, così da stimolare la crescita in lunghezza delle ossa. Anche gli osteoblasti sintetizzano IGF, con funzione simile. La regolazione della biosintesi di questi peptidi è affidata, come si è detto, al GH ed in parte agli ormoni steroidei. Le proteine di trasporto

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2 Ormoni proteici e peptidici IGFBP sono importanti per quanto riguarda la regolazione a livello periferico: in molti casi, oltre a prolungarne l’emivita, modulano la biodisponibilità di questi fattori; inoltre, permettono un trasporto tessuto-specifico. La regolazione della biodisponibilità tramite le proteine di trasporto è mediata dall’intervento di specifiche proteasi, che sono in grado di tagliare le IGFBP in modo da ridurne l’affinità con gli IGF, innescandone il rilascio. Per quanto riguarda l’azione biologica, sembra che quasi tutti i tessuti siano potenzialmente in grado di divenire bersaglio degli IGF. Gli IGF-1 e 2 si legano ai rispettivi recettori, delle tirosin chinasi di membrana eterotetrameriche che si autofosforilano in seguito al legame con il recettore. Attivano quindi un esteso pathway di trasduzione intracellulare del segnale, che inizia con la fosforilazione della proteina IRS-1 (substrato del recettore dell’insulina, Insulin Receptor Substrate) con attivazione della fosfatidilinositolo-3-chinasi (PI3K), Grb2 etc, e termina con l’attivazione di numerose chinasi (Raf, MAPK...). IGF-1 è in grado inoltre di legarsi ai recettori dell’insulina. Gli IGF hanno molti effetti: stimolano la sintesi di DNA, RNA e proteine; modulano la crescita, la proliferazione cellulare, la differenziazione e l’apoptosi; stimolano la condrogenesi e l’osteogenesi (sono molto importanti per l’accrescimento lineare delle ossa lunghe); inibiscono la degradazione proteica a livello muscolare e del collagene; stimolano l’assunzione del glucosio nelle cellule. La maggior parte di questi effetti sono stati dimostrati per IGF-1; nonostante i livelli di IGF-2 nel plasma siamo molto maggiori, il suo ruolo non è stato definito chiaramente, ma sembra che sia solo parzialmente correlato al GH. Possiamo così riassumere gli effetti (diretti e indiretti) del GH: • a partire dai due anni di età (e in particolare durante la pubertà) assume un ruolo critico per il normale sviluppo dell’individuo: stimola la crescita corporea nella fase postnatale della vita, soprattutto nell’infanzia e nella pubertà. Durante il periodo prenatale non ha grande importanza; • influenza il metabolismo glicidico, lipidico e proteico; • Ha effetti sul sistema immunitario e sul sistema nervoso. È importante sottolineare ancora una volta che molti degli effetti anabolici e somatotropici attribuiti al GH sono in realtà dovuti agli IGF, di cui il GH stimola la sintesi. Tuttavia, è vero che in genere l’ormone della crescita coopera con l’azione delle IGF. Vediamo più in dettaglio le principali azioni del GH.

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2 Ormoni proteici e peptidici Ossa e cartilagini Stimola la condrogenesi, promuovendo quindi l’aumento in lunghezza delle ossa lunghe durante la pubertà, e l’osteogenesi, regolando il turnover osseo; raggiunge questi effetti sia stimolando direttamente la proliferazione e la differenziazione delle cellule secernenti matrice cartilaginea ed ossea, ma soprattutto indirettamente, grazie alla mediazione degli IGF. Effetti sul metabolismo il GH modula il metabolismo glicidico, lipidico e proteico, in alcuni casi direttamente, in altri attraverso la mediazione degli IGF, in altri casi ancora sia direttamente che indirettamente. 1. Carboidrati: ha effetti anti-insulinici, e determina un incremento della glicemia inducendo gluconeogenesi nel fegato e glicogenolisi; interferisce con l’azione dell’insulina, riducendo l’utilizzo periferico del glucosio ma induce iperinsulinemia.3 2. Lipidi: stimola la lipolisi negli adipociti, inibisce l’accumulo di trigliceridi e l’enzima lipoproteinlipasi, incrementando quindi gli acidi grassi liberi circolanti; promuove l’ossidazione degli acidi grassi, soprattutto nel fegato; 3. Proteine: stimola l’uptake degli aminoacidi e la sintesi proteica, inibisce la degradazione proteica e l’ossidazione degli aminoacidi, soprattutto a livello di tessuto muscolare scheletrico. Equilibrio idroelettrolitico Il GH promuove la ritenzione idrica e il riassorbimento di diversi ioni (calcio, magnesio, fosfato, potassio, sodio cloro), influenzando in questo modo anche il metabolismo dei minerali. Effetti sul sistema immunitario e sul sistema nervoso modula molte delle funzioni del sistema immunitario (produzione di anticorpi, attività delle cellule, etc) e a livello dell’SNC modula l’umore e il comportamento; Inoltre, il GH presenta anche una limitata attività lattogenica, in analogia alla prolattina. La prolattina nella donna promuove la sintesi e la secrezione del latte a livello della ghiandola mammaria. La sua secrezione aumenta molto durante la gravidanza, in risposta agli alti livelli di estrogeni. Non si conosce invece quale sia il ruolo della prolattina nell’uomo. 3

Almeno, in seguito a somministrazione esogena. È possibile che il significato biologico di questa azione sia da inquadrare come una sorta di effetto feedback negativo: forse questa azione è stata selezionata nel corso dell’evoluzione perché impedisce oscillazioni troppo brusche della glicemia.

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2 Ormoni proteici e peptidici La PRL: • Stimola la crescita e lo sviluppo della ghiandola mammaria, soprattutto a livello degli acini ghiandolari; • Induce la sintesi del latte e la sua secrezione. Per espletare questa funzione, promuove l’uptake di glucosio e aminoacidi, oltre che l’espressione e la produzione di proteine del latte come lattoalbumina e caseina; stimola inoltre la biosintesi di lattosio e acidi grassi nelle cellule bersaglio; • Mantiene il corpo luteo durante la gravidanza – questo avviene sicuramente in alcune specie di mammiferi, e probabilmente anche nell’uomo; • inoltre, la prolattina esplica altre regolazioni nell’ambito della riproduzione e della gravidanza, come la modulazione della sintesi di progesterone e GnRH. • Almeno negli animali, influenza alcuni aspetti della vita sessuale e sociale, come l’istinto materno; ci sono opinioni discordi riguardo l’esistenza di un effetto simile sull’uomo. • È ormai accertato il ruolo della prolattina come mediatore endocrino, paracrino ed autocrino nelle risposte immunitarie e nell’infiammazione. Correlazioni cliniche: Nanismo e gigantismo Nanismo è un termine usato per indicare tutte quelle condizioni in cui l’accrescimento somatico è patologicamente ridotto; gli individui affetti risultano di statura molto inferiore alla norma. Si distingue il nanismo armonico, in cui pur essendo la statura ridotta sono mantenute le normali proporzioni del corpo, dal nanismo disarmonico, in cui una o più parti corporee sono sproporzionate. La deficienza di GH è una possibile causa di nanismo (cosiddetto nanismo ipofisario) quando insorge prima del termine dell’accrescimento; quindi in caso di deficit di GH insorto nell’età adulta, essendo l’accrescimento ormai terminato, non si ha nanismo. Sono note cause congenite di deficit di GH (per lo più su base genetica), e cause acquisite (tra cui tumori, traumi, e radioterapia a livello encefalico). Non raramente, non si riesce a determinare la causa della disfunzione (deficit idiopatico). Il gigantismo è una condizione di esagerato accrescimento somatico, da cui risulta una statura molto superiore alla norma, che può superare i 2,50 m.

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2 Ormoni proteici e peptidici

Il gigantismo è di solito dovuto ad una abnorme secrezione di GH durante il periodo della crescita (cioè prima della fusione delle cartilagini di accrescimento). Un eccessiva secrezione di GH nell’adulto dà invece origine al quadro dell’acromegalia. In quest’ultima condizione, c’è accrescimento osseo (specie a carico di alcuni distretti, come il cranio) ma non aumento di statura. Si verificano anche un aumento di volume dei tessuti molli (labbra, mani, piedi, lingua), visceromegalia (aumento di volume di alcuni organi come fegato e tiroide), cardiomegalia ed alterazioni metaboliche (soprattutto del metabolismo del glucosio, fino al diabete). I tratti del volto divengono grossolani, e con il tempo i pazienti assumono una facies particolare (facies acromegalica). Acromegalia e gigantismo sono praticamente sempre conseguenti ad adenomi ipofisari che secernono GH in maniera incontrollata.

Vediamo adesso in generale e in modo schematico i principali esempi di asse ipotalamo-ipofisi-ormone periferico. Non c’è bisogno di imparare adesso questi schemi, perché la regolazione sarà trattata per ciascun ormone. L’importante è capire il quadro generale. Sarà più utile ritornare su questi schemi una volta studiati gli ormoni periferici relativi. L’asse ipotalamo-ipofisi-tiroide Gli ormoni tiroidei e la loro regolazione sono trattati in maggiore dettaglio alla sezione 3.3 (pag. 101). Qui viene illustrato a grandi linee l’asse ormone ipotalamico-ormone ipofisario-ormone periferico per quanto riguarda la tiroide (Fig. 2.10, pag. 37). L’asse ipotalamo-ipofisi-tiroide è così strutturato [39]: • TRH è il releasing hormone ipotalamico, che stimola il rilascio di TSH da parte della ipofisi; • il TSH ipofisario stimola il rilascio degli ormoni periferici T3 e T4 da parte della tiroide; • T3 rappresenta l’ormone tiroideo più attivo. Viene rilasciato dalla tiroide come tale oppure viene ottenuto dal T4 per conversione ad opera di particolari enzimi

36

2 Ormoni proteici e peptidici

Ipotalamo

TRH

+

-

TSH

Ipofisi

+

-

T4

T3

(forma libera)

(forma libera)

T4

T3

Tiroide

(forma legata alle proteine plasmatiche)

Figura 2.10: In questa figura sono mostrati i rapporti di feedback che caratterizzano l’asse ipotalamoipofisi-tiroide.

37

2 Ormoni proteici e peptidici (deiodinasi; sono trattati nella sezione dedicata agli ormoni tiroidei). Entrambi gli ormoni possono esistere in forma libera oppure in forma legata a proteine di trasporto. Le due forme sono in equilibrio tra loro, e solo la forma libera è in grado di interagire con i recettori. La forma legata può essere considerata inattiva. T3 con un loop di feedback inibisce la secrezione sia del TSH che del TRH. L’asse ipotalamo-ipofisi-gonadi Gli ormoni sessuali e la loro regolazione sono trattati nel capitolo 6 (pag. 140). Qui viene illustrato a grandi linee l’asse ormone ipotalamico-ormone ipofisario-ormone periferico per quanto riguarda le gonadi (Fig. 2.11, pag. 39). L’asse ipotalamo-ipofisi-gonadi è diverso nei due sessi. Nel sesso femminile è molto complesso perché entra in gioco il ciclo mestruale. Una trattazione più completa verrà presentata nel capitolo relativo. A grandi linee, l’asse è così strutturato: • Il GnRH è il releasing hormone ipotalamico, che stimola il rilascio di FSH ed LH da parte della ipofisi. A seconda della fase del ciclo mestruale, può essere favorita la secrezione dell’uno o dell’altro; • FSH ed LH ipofisari stimolano il rilascio da parte dell’ovaio di ormoni sessuali (principalmente estrogeni, in particolare estradiolo) e di inibina, una proteina eterodimerica membro della famiglia dei TGF- β; • L’estradiolo con un loop di feedback inibisce la secrezione di GnRH; non è chiaro se inibisce direttamente anche la secrezione di FSH. Questo cambia durante la fase follicolare (non mostrato in figura), quando l’estradiolo con un feedback positivo stimola la secrezione di GnRH e ne modifica il “ritmo” di secrezione. Questo diverso pattern di secrezione del GnRH favorisce la secrezione di LH, che incrementa sempre di più (per il feedback positivo) fino ad arrivare ad un picco in corrispondenza del quale si verifica l’ovulazione. Successivamente, viene prodotto progesterone dal corpo luteo, che modifica il pattern di secrezione del GnRH favorendo nuovamente l’FSH. • l’inibina inibisce la secrezione di FSH (viene secreta soprattutto durante la fase follicolare). Nel sesso maschile il circuito è più semplice. A grandi linee, l’asse è così strutturato:

38

2 Ormoni proteici e peptidici

Ipotalamo

GnRH

+

LH

-

FSH

Ipofisi

+

?

-

Estrogeni

Gonadi femminili

Inibina

Ipotalamo

GnRH

-

+

FSH

Ipofisi

-

+

Inibina

-

LH

Estradiolo

Testosterone

Gonadi maschili

Figura 2.11: In questa figura sono mostrati i rapporti di feedback che caratterizzano l’asse ipotalamoipofisi-gonadi.

39

2 Ormoni proteici e peptidici

Ipotalamo

CRH

+

ACTH

+

-

-

Glucocorticoidi

Surrene

Figura 2.12: In questa figura sono mostrati i rapporti di feedback che caratterizzano l’asse ipotalamoipofisi-surrene.

• Il GnRH è il releasing hormone ipotalamico, che stimola il rilascio di FSH ed LH da parte della ipofisi; • LH ipofisario stimola il rilascio da parte delle cellule di Leydig, che si trovano nel testicolo, di ormoni sessuali (androgeni, principalmente testosterone); l’FSH si lega alle cellule del Sertoli e stimola la spermatogenesi4 e la secrezione di diverse sostanze, tra cui inibina B (la cui secrezione potrebbe non essere esclusiva delle cellule del Sertoli [23]). I testicoli producono anche piccole quantità di estrogeni, che partecipano alla regolazione dell’asse (inoltre è possibile che gli androgeni inibiscano l’asse non in quanto tali, ma per mezzo di una conversione a estrogeni che avverrebbe localmente, cioè a livello cerebrale). • Gli androgeni inibiscono la secrezione di GnRH e di LH, mentre l’inibina B inibisce la secrezione di FSH [23]. L’asse ipotalamo-ipofisi-surrene Gli ormoni secreti dalla zona corticale della ghiandola surrenale e la loro regolazione sono trattati nel capitolo 6 (pag. 140); la loro regolazione viene presa in esame in 4

la spermatogenesi è anche stimolata dal testosterone prodotto dalle cellule del Leydig.

40

2 Ormoni proteici e peptidici modo meno schematico in quel capitolo. Vediamo, sempre a grandi linee, l’asse ipotalamo-ipofisi-surrene (Fig. 2.11, pag. 39): • CRH è il releasing hormone ipotalamico, che stimola il rilascio di ACTH da parte della ipofisi; • l’ACTH ipofisario stimola il rilascio di diversi ormoni steroidei da una parte della ghiandola surrenale chiamata corteccia, principalmente glucocorticoidi; • I glucocorticoidi (il glucocorticoide per antonomasia è il cortisolo) inibiscono a feedback il rilascio di CRH e ACTH. Abbiamo quindi terminato di vedere gli ormoni dell’asse ipotalamo-ipofisi. Passiamo adesso ai restanti ormoni proteici periferici.

2.2 Ormoni dell’apparato digerente Dove siamo? Pancreas Il pancreas è una ghiandola anficrina (cioè con funzioni sia esocrine che endocrine), di forma allungata, annessa all’apparato digerente. È situata nella cavità addominale tra i due reni, posteriormente allo stomaco. Istologicamente e funzionalmente è caratterizzata dalla presenza di diverse popolazioni cellulari. La grande maggioranza è costituita da cellule esocrine, che sintetizzano ormoni proteolitici necessari alla digestione; in mezzo al parenchima esocrino sono presenti aggregati formati da cordoni cellulari di cellule endocrine, che appaiono come isole endocrine in mezzo ad un mare di cellule esocrine: da qui il nome di isole di Langerhans. Ogni isola è composta da tre tipi fondamentali di cellule: le cellule α, che sintetizzano glucagone, le cellule β, che sintetizzano insulina, e le cellule δ, che secernono somatostatina.

2.2.1 Insulina Il ruolo dell’insulina è rivolto principalmente alla regolazione del metabolismo di carboidrati e lipidi in senso anabolico. Si tratta di un ormone che viene tipicamente (ma non solo) secreto in condizioni di iperglicemia, che possono essere pensate come situazioni di abbondanza di sostanze nutritive e di benessere. Le sue funzioni sono rivolte ad abbassare la concentrazione di glucosio nel sangue per ristabilire la normoglicemia. Questo viene ottenuto stimolando l’assunzione del glucosio in alcuni

41

2 Ormoni proteici e peptidici

Figura 2.13: Struttura tridimensionale dell’insulina porcina, che differisce da quella umana per un solo aminoacido (una treonina presente nell’insulina umana è sostituita da una alanina nell’insulina porcina). La struttura è stata ottenuta dall’RCBS Protein Data Bank (id: 4INS) e l’immagine realizzata con QuteMol http://qutemol.sourceforge.net [40].

citotipi (come il muscolo), mentre il metabolismo energetico viene indirizzato verso la sintesi di glicogeno e lipidi, le forme classiche con cui l’organismo immagazzina energia per un uso futuro, approfittando della temporanea disponibilità di substrati energetici. Struttura L’insulina è un ormone costituito da 2 catene polipeptidiche, chiamate A e B, unite da due ponti disolfuro. La catena A è composta da 21 aminoacidi e presenta un ponte disolfuro intracatena; la catena B è formata da 30 aminoacidi. La figura 2.13 mostra una immagine della struttura tridimensionale dell’insulina porcina (molto simile a quella umana). Sede di elaborazione L’insulina viene secreta dalle cellule β del pancreas. Biosintesi L’insulina viene tradotta dal relativo gene, situato sul cromosoma 11, come pre-pro-insulina; in seguito all’ingresso nel lume del RER, si formano i ponti disolfuro; nel passaggio successivo il peptide segnale (una sequenza idrofobica di 23 aminoacidi) viene staccato enzimaticamente, generando proinsulina (figura 2.14, pag. 43). Può essere considerata il peptide precursore vero e proprio (inattivo). A livello di questa catena peptidica si possono già evidenziare le due future catene che andranno a costituire l’ormone attivo: la catena A (21 aminoacidi al C-terminale), e la catena B (30 aminoacidi all’N-terminale); queste sono unite da un tratto polipeptidico di connessione detto catena C. Quindi, la sequenza del proormone è: (2 HN)-B-C-A(COO- ). Nonostante la catena C non sia presente nell’ormone attivo, è molto importante

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2 Ormoni proteici e peptidici Peptide C

SH

Peptide C

SH

S

Peptide A

Sequenza segnale

SH

SH

SH

SH

S

Peptide A COOH

Peptide B

S

S

S

S

COOH

Peptide B

NH3

NH3

Preproinsulina

Proinsulina

Peptide C

S

S

Peptide A S

S

S

S

COOH

Peptide B NH3

Insulina e peptide C

Figura 2.14: Struttura della preproinsulina, della proinsulina e della insulina. La proinsulina si forma quando dalla preproinsulina si distacca il peptide segnale e si formano i legami disolfuro; l’insulina si forma con la rimozione del peptide C.

per il corretto ripiegamento del polipeptide: si tratta un requisito indispensabile per la già menzionata formazione dei ponti disolfuro che uniscono le catene A e B 5 . La conversione da pro-ormone ad ormone attivo avviene nel reticolo endoplasmatico ad opera di alcune endopeptidasi chiamate proormone convertasi, le quali operano il taglio proteolitico che rilascia il peptide C. L’insulina e la catena C sono immagazzinate in vescicole secretorie, che si accumulano nel citoplasma in attesa del segnale che produrrà il rilascio. Il peptide C è presente nelle vescicole in quantità stechiometriche con l’insulina, e viene anch’esso rilasciato nel sangue; ha un’emivita maggiore dell’insulina, il che equivale a dire che permane nel sangue per più tempo. Queste caratteristiche consentono di poter utilizzare la determinazione della concentrazione ematica della catena C per stimare 5

Questo è il motivo per cui i primi tentativi di sintetizzare insulina in laboratorio a partire dalle catene A e B non andarono a buon fine.

43

2 Ormoni proteici e peptidici l’entità della secrezione insulinica in un soggetto. La regolazione del rilascio di insulina avviene grazie a diversi meccanismi. Poiché nelle cellule pancreatiche vi è una grande quantità di insulina già sintetizzata, depositata in attesa di essere rilasciata, il controllo principale è esercitato a livello della secrezione: • La secrezione avviene in risposta ad un innalzamento della glicemia, con meccanismi non del tutto chiari. La concentrazione di glucosio nel sangue a digiuno tende ad essere mantenuta intorno ai 90 mg/dL ( 80-100 mg/dL); l’aumento di questo valore scatena il rilascio di insulina. Si ritiene che l’aumento della concentrazione plasmatica di glucosio provochi con qualche meccanismo un innalzamento del Ca2+ intracellulare, che innesca l’esocitosi delle vescicole. Il modello che ha ricevuto più consensi è questo: il glucosio, divenuto abbondante, penetra all’interno delle cellule β del pancreas grazie al trasportatore GLUT-2, e viene fosforilato dalla glucochinasi. Viene poi commissionato alla glicolisi e al ciclo di Krebs, con incrementata produzione di ATP, che chiude alcuni canali ionici del K+ ATP sensibili; la membrana plasmatica si depolarizza, con apertura dei canali del calcio voltaggiodipendenti. Il calcio avvia il pathway della fosfolipasi C, e l’IP3 che si libera attiva canali del calcio presenti sulla membrana del reticolo endoplasmatico. Questo porta ad un ulteriore incremento di calcio, che innesca la secrezione. • Anche gli aminoacidi innescano la secrezione di insulina, probabilmente attraverso la generazione di ATP a partire dal loro catabolismo o una depolarizzazione diretta della membrana plasmatica. • Altre sostanze che si sono dimostrate in grado di stimolare la secrezione di insulina sono: la acetilcolina (occorre ricordare che è un neurotrasmettitore utilizzato dai nervi del sistema nervoso autonomo), la colecistochinina, il peptide gastrointestinale e il glucagon-like peptide 1 (GLP-1). Le cellule β esprimono recettori per queste molecole, ed i pathway che entrano in gioco sono quelli della fosfolipasi C e della adenilato ciclasi. Nel caso della PLC, analogamente a quanto visto per il glucosio si ha liberazione di Ca2+ . Nel caso della attivazione della adenilato ciclasi, si ha un aumento della concentrazione di cAMP con attivazione della PKA cAMP-dipendente; a questo fa seguito una complessa serie di eventi che culmina con la fosforilazione e l’attivazione di proteine implicate nell’esocitosi. • Ad inibire la secrezione di insulina a livello della secrezione provvedono catecolammine e somatostatina. Queste due molecole hanno recettori accoppiati a proteine G e inibiscono l’adenilato ciclasi, disattivando il pathway visto poc’anzi. Le catecolammine sono ormoni che hanno la funzione di preparare l’organismo a situazioni di emergenza (“fight or flight ”, combatti o fuggi), e come tali una

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2 Ormoni proteici e peptidici parte delle loro funzioni è volta a garantire disponibilità di substrati energetici ai tessuti, per far sì che siano pronti a fronteggiare una intensa attività. Risulta quindi intuitivo che inibiscano l’azione dell’insulina, che invece “sequestra” il glucosio nelle cellule. Una parte della regolazione si esplica anche attraverso una modulazione dell’espressione genica. Il glucosio aumenta infatti la trascrizione dell’mRNA della proinsulina, e sembra essere in grado di stabilizzare quello già esistente. Ne risulta che il glucosio regola il rilascio di insulina a due livelli: provoca la secrezione dell’insulina già sintetizzata (regolazione immediata, a breve termine), e indirettamente stimola la sua produzione agendo sulla quantità di mRNA disponibile (regolazione a lungo termine). Recettore ed effetti fisiologici dell’insulina Come abbiamo avuto modo di accennare, l’azione dell’insulina è complessivamente di tipo anabolico e ipoglicemizzante. Alcuni degli effetti dell’ormone sono eclatanti e si verificano a breve termine, con rapide variazioni nel metabolismo; altri si manifestano a lungo termine, con alterazioni della differenziazione e della crescita cellulare. Il recettore insulinico, che media questi potenti effetti, è un recettore ad attività tirosin chinasica (Receptor Tyrosin Kinase, RTK). Appartiene ad una famiglia di recettori molto importanti, coinvolti tra le altre cose nella crescita e nel differenziamento cellulare.6 È formato da due subunità, ciascuna delle quali è un eterodimero composto da una subunità α e una subunità β; quindi in totale abbiamo due subunità α e due subunità β ( α2 β2 ). Il recettore quindi è costituzionalmente in forma dimerica (o meglio tetramerica, dato che ogni subunità è un eterodimero), anche in assenza del suo ligando [30], a differenza del recettore del GH che dimerizza dopo il legame con l’ormone. La subunità α è esclusivamente extracellulare, e contiene il dominio con il sito di legame per l’insulina. La β è in posizione transmembrana e comprende il dominio intracellulare tipico di questa classe di recettori, dotato di una attività tirosin chinasica intrinseca. Il legame dell’insulina porta ad un cambiamento conformazionale che attiva il recettore, e le due subunità β si fosforilano a vicenda sui residui di tirosina che si trovano nel dominio intracitoplasmatico (autofosforilazione), per poi fosforilare le tirosine di altre proteine intracellulari. I residui di tirosina del recettore, ora fosforilati, vengono legati da specifiche proteine che possiedono un dominio SH2: i substrati del recettore insulinico (IRS, Insulin Receptor Substrate). Ad oggi se ne conoscono quattro, chiamati IRS-1, IRS-2, IRS-3, IRS-4. 6

Membri importanti di questo gruppo di recettori sono i recettori per gli IGF (Insulin-Like Growth Factor).

45

2 Ormoni proteici e peptidici In seguito all’interazione con il recettore, gli IRS sono a loro volta fosforilati a livello delle proprie tirosine. A questo punto, le varie proteine IRS attivano differenti pathway, che amplificano il segnale dell’insulina. Le principali vie segnalatorie attivate in questo modo sono la via della fosfoinositide-3 chinasi (PI3K) e delle MAP chinasi (MAPK). La sequenza precisa di eventi è meglio conosciuta nel caso di IRS-1, quindi descriveremo solo questa. La via PI3K è un pathway attivato da molti recettori RTK, implicato nella mediazione di segnali che regolano la sopravvivenza, la longevità, la crescita e la proliferazione della cellula – e, nel caso dell’insulina, il metabolismo. L’enzima chiave da cui prende origine la via è la fosfoinositide-3 chinasi (PI-3K): questo enzima si lega a IRS-1 mediante un dominio SH2, attivandosi. La PI-3K trova il suo substrato tra i fosfolipidi della cellula, in particolare nel fosfatidil-inositolo. L’enzima attivato fosforila l’anello dell’inositolo a livello del terzo carbonio. A seconda del fosfolipide substrato possono essere generati PIP3 (fosfatidilinositolo-3,4,5-trifosfato), PIP2 (fosfatidilinositolo-3,4-difosfato) o PIP (fofatidilinositolo-3-P): collettivamente queste molecole sono chiamate fosfoinositidi. È a questi ultimi che è affidato il ruolo di secondi messaggeri, in particolare a PIP3 . Il fosfatidilinositolo trifosfato attiva a propria volta altre tirosin-chinasi e serina/treonina chinasi (tra cui Atk, una importante isoforma PKB), determinando in molti casi la loro traslocazione alla membrana. Gli effetti a valle di queste chinasi in molti casi consistono in attivazione di protein fosfatasi o inattivazione di chinasi. Dato che viene anche attivata la cAMP fosfodiesterasi (antagonizzando quindi le protein chinasi cAMP-dipendenti), si conclude che questo ormone tende a portare e mantenere molte proteine cellulari allo stato defosforilato. Questa affermazione non è in contraddizione con quanto abbiamo appena visto: continua a essere vero che l’insulina attiva delle chinasi, in particolare PKB, le quali ovviamente per svolgere la loro funzione fosforilano altre proteine; tuttavia, a valle di queste chinasi, l’effetto consiste spesso in defosforilazione di proteine importanti. Questo pathway media i principali effetti metabolici dell’insulina, ma è anche coinvolto, come si è detto, nella proliferazione, nella crescita e nella sopravvivenza delle cellule. Anomalie in questa via segnalatoria sono state osservate in molti tumori. La via MAPK è una via molto sfruttata dai fattori di crescita e dalle sostanze mitogene: mentre la via PI3K media soprattutto gli effetti metabolici dell’insulina, questa via media soprattutto gli effetti sulla proliferazione cellulare. Questa via è il modello tipico della cascata di chinasi che si attivano a vicenda. La via comincia con SOS, noto anche come fattore di scambio del nucleotide guanina, che viene attivato da IRS-1 con la mediazione di una proteina “adattatrice” avente un dominio SH2, Grb2. SOS consente ad una proteina Ras (K-Ras, frequentemente) di rilasciare GDP e legarsi a GTP, attivandosi. Ras fosforila e attiva RAF, una Ser/Thr chinasi, che fosforila e attiva

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2 Ormoni proteici e peptidici

NH3 S

S

S

S

S

S

COOH NH3

NH3

S

S

S

S

S

S

S

2

S

S

S

S

S

1

COOH

COOH

P

3

P

RAS GDP

P

GTP P

GRB-2

SOS

IRS-1

P

-1 IRS

IRS-1

P

P

4

P

P

RAS

IRS-1

5

GTP

P

6

P

P

PI3-K

RAF-1 RAF-1

IP3

P

PKB

MEK MEK

P

IP3

P PKB

MAPK MAPK

P

Figura 2.15: Principali pathway di trasduzione del segnale innescati dal recettore insulinico. 1) Il recettore si attiva in seguito al legame con l’ormone. 2) Il recettore si autofosforila e 3) fosforila IRS-1. 4) IRS-1 attiva principalmente due vie: la via delle MAP chinasi e la via PI3K. 5) La via delle MAPK: con la mediazione di GRB-2, IRS-1 attiva SOS, che facilita il rilascio di GDP da parte di Ras, e il legame con GTP. Poi Ras fosforila e attiva Raf, che fosforila e attiva MEK, che fosforila e attiva MAPK - il quale agisce poi a livello nucleare. 6) La via PI3K: La PI3 chinasi converte un fosfolipide di membrana; PIP3 determina l’attivazione di varie chinasi, soprattutto PKB.

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2 Ormoni proteici e peptidici la Ser/Thr chinasi MEK, che fosforila e attiva la chinasi MAPK (Mitogen Activated Protein Kinase). MAPK a sua volta fosforila un grande numero di proteine, che in ultimo influenzano la trascrizione e l’espressione genica. Dopo aver brevemente descritto il recettore dell’insulina e le vie da esso attivate, esaminiamo quali sono gli effetti di questo ormone sui tessuti bersaglio. Uno degli aspetti più sorprendenti dell’insulina è la sua capacità di influenzare in maniera importante il metabolismo pur giocando con l’attivazione o l’inattivazione di relativamente pochi enzimi chiave. I tessuti su cui l’azione dell’insulina è più rilevante sono il tessuto muscolare, il tessuto adiposo e il fegato. L’azione metabolica dell’insulina si concentra su tre fronti: regolazione del metabolismo del glucosio e del glicogeno, regolazione del metabolismo degli acidi grassi, regolazione della sintesi proteica. Metabolismo del glucosio Uno dei primi cambiamenti di cui si rende responsabile l’insulina consiste in un abbassamento della glicemia plasmatica: il muscolo, il fegato e il tessuto adiposo sono responsabili di gran parte di questo abbassamento, in quanto, sotto l’effetto di questo ormone: • incrementano significativamente il proprio uptake del glucosio (solo muscolo e tessuto adiposo, l’assunzione di glucosio da parte del fegato è insulinoindipendente!); • incrementano il consumo dello zucchero per le proprie esigenze energetiche, indirizzandolo verso la glicolisi; • incrementano il consumo dello zucchero indirizzandolo alla sintesi del glicogeno; • diminuscono la sintesi di glucosio de novo inibendo la gluconeogenesi; • diminuiscono la demolizione del glicogeno. Il glucosio penetra nelle cellule mediante specifici trasportatori denominati GLUT. Se ne conoscono diverse isoforme, la cui espressione può essere o meno tessutospecifica. Il trasportatore GLUT-1 ad esempio è espresso praticamente da tutti i tessuti, ed è responsabile del trasporto basale del glucosio in eritrociti, muscolo scheletrico, tessuto adiposo, etc.; GLUT-2 ha una espressione limitata a pochi tessuti (principalmente epatici) e caratteristiche cinetiche particolari che consentono alle cellule che lo esprimono di avere una concentrazione intracellulare di glucosio che riflette strettamente la concentrazione plasmatica; GLUT-3 è espresso dai neuroni, etc. Il trasportatore che media gli effetti dell’insulina sull’uptake del glucosio è il GLUT-4, e il meccanismo con il quale viene reclutato è peculiare. In assenza di

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2 Ormoni proteici e peptidici stimolazione insulinica, questo recettore non è esposto sulla superficie della cellula, ma si trova per lo più sequestrato in vescicole intracellulari. In altre parole, è inattivo, “in attesa” all’interno della cellula. In seguito al segnale dell’insulina, il recettore viene prontamente trasferito alla membrana mediante esocitosi, dove entra in azione incrementando l’uptake di glucosio da parte del muscolo e del tessuto adiposo. È importante ribadire che le cellule epatiche non risentono di questo effetto dell’insulina poiché esprimono, come già accennato, il trasportatore GLUT-2. Questo fa sì che le cellule epatiche assumano glucosio in maniera costitutiva. Oltre all’incremento dell’uptake, che in pratica trasferisce il glucosio in eccesso dal sangue alle cellule, l’insulina influenza vistosamente il metabolismo del fegato e del tessuto adiposo, attivando tutte le vie metaboliche in grado di ridurre la concentrazione di glucosio libero. È importante tenere presente che una delle funzioni principali dell’insulina è quella di sequestrare e immagazzinare il glucosio, rimuovendolo dal sangue. Nel fegato, questo scopo viene raggiunto: 1. attivando la glicolisi; 2. attivando la glicogenosintesi; 3. inibendo la gluconeogenesi; 4. inibendo la glicogenolisi; 5. stimolando la sintesi di alcune proteine. Nel caso di 1 e 2, entrambe le vie consumano glucosio; nel caso di 3 e 4, il prodotto finale, cioè altro glucosio, è indesiderato. Le vie coinvolte nel metabolismo epatico del glucosio possono essere regolate indipendemente in maniera conveniente attraverso un intervento dell’insulina sullo stato di fosforilazione degli enzimi regolatorî delle diverse vie metaboliche. Il quadro complessivo è concettualmente ostico, e può generare confusione, ma cercheremo di rendere il più semplice possibile la comprensione di questi meccanismi prendendo in esame i cambiamenti indotti dall’insulina da una prospettiva particolare. Ci chiederemo cioè quali sono le modifiche sullo stato di fosforilazione delle proteine necessarie per ottenere determinati effetti; quindi, cercheremo di spiegare in che modo l’insulina arriva a determinare i cambiamenti opportuni. Iniziamo prendendo in considerazione i due processi speculari della glicogenolisi e della glicogenosintesi. L’enzima chiave della glicogenolisi è la glicogeno fosforilasi; l’effetto finale dell’attività della glicogenolisi è un aumento della concentrazione del glucosio, in quanto monomeri di glucosio vengono staccati dal polimero più

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2 Ormoni proteici e peptidici

ATP

Glicogeno fosforilasi chinasi

PKA

P

PP1 P

ADP

Glicogeno fosforilasi chinasi

H2O ADP

ATP

Glicogeno fosforilasi (inattiva)

Glicogeno fosforilasi (attiva)

Glicogeno (integro)

P

Glicogeno (in degradazione) P

PP1

H2O

Figura 2.16: Regolazione della glicogeno fosforilasi.

grande. La glicogeno fosforilasi dovrà quindi essere inibita. L’enzima chiave della glicogenosintesi è invece la glicogeno sintasi; l’effetto finale di questa via metabolica è una diminuzione del glucosio libero, in quanto viene polimerizzato a glicogeno. La glicogeno sintasi dovrà quindi essere attivata. La regolazione di questi due enzimi è complessa. Per questo è necessario soffermarsi e illustrarne la regolazione (Fig. 2.16). Per quanto riguarda la glicogeno fosforilasi, questo enzima esiste in due forme: la forma a, che rappresenta la forma attiva dell’enzima, e la forma b, che invece è la forma meno attiva. La conversione da una forma all’altra si esplica tramite fosforilazione/defosforilazione. L’enzima defosforilato è in forma b (meno attiva); in seguito a fosforilazione assume la forma a (più attiva). La conversione tra le due forme avviene ad opera di due enzimi: • la fosforilasi a fosfatasi 1 (PP1) defosforila l’enzima, rendendolo meno attivo e di conseguenza diminuendo l’attività della glicogenolisi. È un enzima centrale per l’azione dell’insulina, e lo reincontreremo. • La fosforilasi b chinasi fosforila l’enzima, rendendolo più attivo e incrementando l’attività della glicogenolisi.

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2 Ormoni proteici e peptidici Per completezza dobbiamo sottolineare che la regolazione della glicogeno fosforilasi non si esaurisce qui, poiché entrano in gioco anche dei regolatori allosterici, il cui effetto si integra a quello della regolazione covalente in maniera complessa. Uno dei principali regolatori allosterici in senso attivante per la glicogeno fosforilasi è l’AMP, che però ha effetti importanti solo sull’enzima non fosforilato (quindi sulla forma b)7 . Viceversa, l’ATP è un regolatore allosterico in senso inibitorio, ma solo per la glicogeno fosforilasi attivata (quindi sulla forma a)8 . Tornando alla regolazione che è sotto controllo ormonale (Fig.2.17, pag. 53), l’enzima che è attivato dall’insulina è ovviamente la PP1, poiché porta ad un decremento della glicogenolisi defosforilando e inattivando la glicogeno fosforilasi. L’insulina però non si limita a questo. La fosforilasi b chinasi infatti è a propria volta soggetta a un controllo che in parte si esplica tramite fosforilazione/defosforilazione. Viene fosforilata, e parzialmente attivata, da una PKA cAMP-dipendente, mentre una fosfatasi la defosforila e la inattiva. Sia per completezza, sia perché queste informazioni saranno importanti quando confronteremo l’azione di insulina, glucagone e adrenalina, dobbiamo chiarire meglio come avviene la regolazione di questo enzima. La fosforilasi b chinasi è composta infatti da quattro subunità (dette α, β, γ, δ), che si associano ciascuna in quattro copie: quindi la composizione dell’enzima è α4 β4 γ4 δ4. Queste quattro differenti subunità hanno ruoli molto precisi: la subunità γ è responsabile dell’attività catalitica, mentre le altre subunità consentono la regolazione di questo enzima. • La subunità β viene fosforilata dalla PKA e in seguito a questa modifica viene parzialmente attivata. Da questo si può intuire che gli ormoni che innalzano la concentrazione di cAMP (come glucagone e adrenalina) attivano questo enzima. La subunità β viene defosforilata da una fosfatasi, che altri non è che la PP1. Questa fosfatasi quindi inattiva per defosforilazione sia la glicogeno fosforilasi chinasi sia la glicogeno fosforilasi stessa. • la subunità δ è particolare in quanto ha una struttura molto simile alla calmodulina. In altre parole, questa subunità è in grado di legare il calcio; questo ione esplica una azione regolatoria, attivando parzialmente la fosforilasi chinasi. Quindi, in tutte le situazioni in cui la concentrazione intracellulare di Ca2+ aumenta (ad esempio durante una contrazione muscolare), la fosforilasi chinasi

7

Poiché un’alta concentrazione di AMP nella cellula è sintomo di una penuria energetica, non sorprende che questa molecola attivi un enzima che porta ad una liberazione di glucosio. 8 La situazione è l’esatto opposto di quella dell’AMP: un’alta concentrazione di ATP significa una grande disponibilità energetica, e quindi viene meno la necessità per la cellula di una glicogeno fosforilasi attiva.

51

2 Ormoni proteici e peptidici viene parzialmente attivata; questo consente all’enzima di fosforilare la glicogeno fosforilasi, attivandola. Perché l’enzima sia totalmente attivo è necessaria la compresenza di calcio e fosforilazione; uno solo di questi due regolatori provoca un’attivazione solo parziale dell’enzima. Prima di proseguire lo studente dovrebbe assicurarsi di aver compreso bene la regolazione della glicogeno fosforilasi chinasi, perché è un’enzima su cui ritorneremo. Tornando all’insulina (Fig.2.17), la sua azione attiva la fosfatasi che defosforila la glicogeno fosforilasi chinasi (oltre ad accellerare la degradazione di cAMP, il che ostacola la PKA cAMP-dipendente), inattivando quindi l’enzima, che non può più fosforilare e attivare la glicogeno fosforilasi. Quindi, l’insulina neutralizza a due livelli l’azione della fosforilasi: in primo luogo stimolando la sua defosforilazione, in secondo luogo impedendo la sua fosforilazione. E’ importante notare come questa regolazione sia reciproca: abbiamo una attivazione di fosforilasi e una contemporanea inibizione di chinasi. Dopo aver esaminato la regolazione della glicogeno fosforilasi passiamo alla glicogeno sintasi (Fig. 2.18). Anche questo enzima è soggetto ad una regolazione tramite fosforilazione/defosforilazione, ed è attivo nello stato defosforilato. L’insulina, evidentemente, dovrà agire in modo tale da promuovere la defosforilazione della glicogeno sintasi. Quindi, considerando glicogeno sintasi e glicogeno fosforilasi, l’insulina fa sì che entrambi vengano defosforilati. Tuttavia, la stessa modifica regolatoria ha effetti opposti nei due enzimi: l’uno viene attivato, l’altra è reso inattivo. In questo modo si ottiene rispettivamente una attivazione della glicogenosintesi ed una inibizione della glicogenolisi. Il quadro della regolazione della glicogeno sintasi è molto complesso (Fig. 2.19). L’insulina giunge alla defosforilazione della glicogeno sintasi attivando la fosfoproteina fosfatasi-1, o PP1, che incontriamo per la terza volta. Rivediamo brevemente le funzioni di questo importante enzima: • Abbiamo appena visto che catalizza la defosforilazione diretta della glicogeno sintasi; • Prima abbiamo esaminato il suo ruolo nella defosforilazione diretta della glicogeno fosforilasi; • Infine abbiamo visto che catalizza anche la defosforilazione della glicogeno fosforilasi chinasi, l’enzima che, quando è fosforilato e attivo, catalizza la fosforilazione della glicogeno fosforilasi, attivandola. Abbiamo imparato che la PP1

52

2 Ormoni proteici e peptidici

Glicogeno fosforilasi chinasi

PKA

P

+

Insulina

+

ATP

PP1

Insulina

P

ADP

Glicogeno fosforilasi chinasi

H2O ADP

ATP

Glicogeno fosforilasi (inattiva)

Glicogeno fosforilasi (attiva)

P

Glicogeno (integro)

Glicogeno (in degradazione) P

PP1

H2O

+

Insulina

Figura 2.17: Regolazione della glicogeno fosforilasi quando è presente l’insulina. GSK3

diverse chinasi ADP

ATP

Glicogeno sintasi (attiva)

Glicogeno sintasi (inattiva)

Glicogeno (in attiva sintesi)

P

Glicogeno (non in attiva sintesi) P

PP1

H2O

Figura 2.18: Regolazione della glicogeno sintasi.

53

2 Ormoni proteici e peptidici

Insulina

+

GSK3

diverse chinasi

ATP

ADP

Glicogeno sintasi (attiva)

Glicogeno sintasi (inattiva)

Glicogeno (in attiva sintesi)

P

Glicogeno (non in attiva sintesi) P

PP1

H2O

+

Insulina

Figura 2.19: Regolazione della glicogeno sintasi quando è presente l’insulina.

54

2 Ormoni proteici e peptidici Insulina

-

+

+

Glicogeno sintasi

GSK3

-

PP1

-

-

PKA

Glicogeno fosforilasi

+ -

Glicogeno fosforilasi chinasi

+

Figura 2.20: Schema riassuntivo della regolazione del glicogeno da parte dell’insulina.

previene questo defosforilando la glicogeno fosforilasi chinasi e inattivandola, e quindi assicurando che la glicogeno fosforilasi rimanga inattiva. Anche in questo caso, però, l’azione dell’insulina non si ferma qui. Infatti, l’insulina non solo defosforila la glicogeno sintasi, ma inattiva anche uno degli inzimi responsabili della sua fosforilazione. In questo modo previene l’inattivazione della glicogeno sintasi – abbiamo visto che l’ormone fa una cosa simile anche nel caso della glicogeno fosforilasi. Sono state identificate diverse proteine in grado di fosforilare e inattivare la glicogeno sintasi: attualmente se ne conoscono undici, ma è possibile che ne vengano identificate altre. Alcune di queste chinasi sono controllate dai livelli di cAMP, altre dai livelli di calcio, altre dal diacilglicerolo o fosfolipidi. La principale chinasi regolata dall’insulina è la glicogeno sintasi chinasi 3 (GSK3). Abbiamo visto che la via PI3K culminava con l’attivazione di diverse chinasi, in particolare PKB. Ed è proprio una PKB che, fosforilando la GSK3, la inattiva. Questo impedisce all’enzima di fosforilare la glicogeno sintasi e di inattivarla. Questo è un esempio che illustra molto bene in che senso “l’insulina promuove lo stato defosforilato delle proteine”. Attivando la PKB, l’insulina provoca la fosforilazione della glicogeno sintasi chinasi 3; tuttavia, questa fosforilazione è diretta a favorire la defosforilazione della glicogeno sintasi, che è uno degli enzimi-chiave dell’azione dell’insulina. In fig. 2.20 viene riassunta l’azione dell’insulina sul metabolismo del glicogeno.

55

2 Ormoni proteici e peptidici Esaminiamo ora le due vie speculari della gluconeogenesi e della glicolisi (Fig. 2.21). L’enzima chiave della glicolisi è la fosfofruttochinasi-1 (PFK-1). L’effetto finale della glicolisi è un abbassamento della concentrazione di glucosio, perché lo zucchero che viene indirizzato in questa via viene ossidato a piruvato. La PFK-1 dovrà quindi essere attivata per incrementare il flusso di metaboliti attraverso la glicolisi. L’enzima chiave della gluconeogenesi è invece la fruttosio-1,6-bisfosfatasi. Poiché questa via metabolica produce nuovo glucosio, la fruttosio-1,6-bisfosfatasi dovrà essere inibita. Questi due enzimi non sono regolati direttamente tramite fosforilazione; hanno invece una pluralità di regolatori allosterici. Tra i diversi regolatori, il fruttosio-2,6-bisfosfato agisce, con effetti opposti, su entrambi gli enzimi; la sua influenza sulla attività enzimatica è piuttosto marcata. Si tratta quindi di un candidato ideale per l’azione dell’insulina, ed infatti è proprio su questo metabolita che agisce l’ormone. L’azione del fruttosio-2,6-bisfosfato è relativamente semplice: l’aumento della sua concentrazione favorisce la PFK-1 e inibisce la fruttosio-1,6-bisfosfatasi. Quindi: più è alta la concentrazione di fruttosio-2,6-bisfosfato, più la glicolisi è attiva e più la gluconeogenesi è inibita. Ci aspettiamo dunque che l’insulina incrementi la produzione di questo regolatore allosterico. La concentrazione di fruttosio-2,6-bisfosfato è determinata dall’attività relativa di due enzimi: la fosfofruttochinasi-2 (PFK-2) lo sintetizza a partire dal fruttosio-6-fosfato, mentre la fruttosio-2,6-bisfosfatasi lo degrada. Queste due attività enzimatiche sono situate sulla stessa proteina. La stessa molecola presenta quindi due funzioni enzimatiche: con una attività produce fruttosio-2,6-bisfosfato, con l’altra lo degrada. La concentrazione di questo modulatore in un dato momento dipende da quanto è attiva una attività enzimatica rispetto all’altra. Nel fegato si è sviluppato un sistema molto efficiente per regolare entrambe le attività enzimatiche in maniera coordinata: quando la proteina bifunzionale è fosforilata, la fruttosio-2,6-bisfosfatasi è attivata e la PFK-2 è meno attiva; quando l’enzima è defosforilato, la situazione si inverte: la fruttosio-2,6-bisfosfatasi diviene meno attiva mentre la PFK-2 è attivata. Per avere un incremento nella sintesi di fruttosio-2,6-bisfosfato, l’insulina dovrà far sì che l’enzima sia defosforilato. Questo è in effetti quello che accade, in quanto i pathway segnalatori intracellulari dell’insulina negli epatociti attivano una fosfatasi che rimuove il gruppo fosfato dall’enzima bifunzionale, incrementando la sintesi di fruttosio-2,6-bifosfato. Quindi: • l’insulina attiva una fosfoproteina fosfatasi; • la fosfoproteina fosfatasi defosforila la PFK-2/fruttosio-2,6-bisfosfatasi;

56

2 Ormoni proteici e peptidici

+

PFK-1

fruttosio-2,6-BP

-

FBPasi-1

+

diminuzione gluconeogenesi

aumento glicolisii PFK-2 (attiva)

FBPasi-2 (inattiva)

P

ATP

PKA

fosfatasi

H2O

ADP

PFK-2 (inattiva) P

diminuzione glicolisi

FBPasi-2 (attiva)

aumento gluconeogenesi

-

PFK-1

+

fruttosio-2,6-BP

-

FBPasi-1

Figura 2.21: Regolazione della glicolisi e della gluconeogenesi nel fegato. L’insulina induce la defosforilazione dell’enzima bifunzionale, che porta all’aumento di fruttosio-2,6-bisfosfato, inibendo la gluconeogenesi e attivando la glicolisi. Ormoni come il glucagone e l’adrenalina esercitano effetti opposti attivando la PKA. Questo è il meccanismo con cui durante il digiuno il glucagone blocca la glicolisi epatica e promuove la gluconeogenesi. Notare che in tessuti diversi dal fegato la regolazione è diversa.

57

2 Ormoni proteici e peptidici • l’attività di PFK-2 è incrementata rispetto a quella fosfatasica; • La concentrazione di fruttosio-2,6-bisfosfato aumenta, e regola allostericamente PFK-1 e fruttosio1,6-bisfosfatasi; • PFK-1 è attivata dal regolatore allosterico, e con essa anche la glicolisi; • la fruttosio-1,6-bisosfatasi è inibita dal regolatore allosterico, e con essa la gluconeogenesi. Questo meccanismo di fosforilazione/defosforilazione invece non si verifica nel muscolo. In tessuti diversi dal fegato vengono infatti espressi altri isoenzimi della PKA [33] dotati di differenti caratteristiche strutturali e funzionali. Nel muscolo e nel cuore l’insulina (ma ad esempio anche l’adrenalina) stimola la glicolisi con altri meccanismi non del tutto chiari [15]. Infine, la regolazione del metabolismo glucidico da parte dell’insulina si esplica anche nel lungo termine: a fianco degli effetti che abbiamo appena visto, l’insulina incrementa l’espressione di molti dei geni coinvolti a vario livello nel consumo di glucosio, in particolare sul fronte ossidativo (enzimi glicolitici etc.). Tra questi, è importante ricordare che la glucochinasi, l’enzima che fosforila il glucosio non appena penetra nelle cellule. L’aumento dell’espressione della glucochinasi interessa principalmente gli epatociti. Inoltre, sembra che molti enzimi coinvolti nelle vie metaboliche “indesiderate” (es. gluconeogenesi) vedano una diminuzione della propria sintesi. Infine, ricordiamo che ormai da tempo è noto che l’insulina attivi anche la piruvato deidrogenasi per defosforilazione - il meccanismo preciso però non è chiaro. Ad ogni modo, questo serve per ricordarci che l’aumentato catabolismo del glucosio porta alla formazione di acetil-coA, che, nelle cellule in grado di farlo, possono servire per la sintesi degli acidi grassi. Metabolismo lipidico. La principale regolazione del metabolismo dei lipidi avviene a livello del tessuto adiposo e del fegato. Nel tessuto adiposo l’insulina 1. stimola la lipogenesi, trasformando il glucosio in eccesso in una riserva energetica conveniente; 2. inibisce la lipolisi e la chetogenesi, in quanto rappresentano fonti energetiche che non è conveniente usare in condizioni di abbondanza di glucosio. La regolazione si esplica a diversi livelli: • La mobilizzazione degli acidi grassi nel tessuto adiposo ha due attori: la lipasi ormone sensibile e le perilipine. La lipasi ormone sensibile è l’enzima che

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2 Ormoni proteici e peptidici partecipa alla mobilizzazione degli acidi grassi; la sua fosforilazione ha significato attivante. Le perilipine sono proteine che negli adipociti circondano, rivestendole, le gocce lipidiche. Si ritiene che proteggano la goccia lipidica dalle lipasi, impedendo agli enzimi di accedere ai trigliceridi. La loro fosforilazione determina cambiamenti conformazionali che espongono la goccia lipidica all’azione lipasica. La lipolisi è quindi attivata da due meccanismi cAMP dipendenti (Fig. 2.22): da una parte, la fosforilazione delle perilipine, che rendono la goccia lipidica accessibile all’azione enzimatica; dall’altra fosforilazione della lipasi che attiva l’enzima. In entrambi i casi la fosforilazione è da imputare alla PKA. Non è tuttora chiaro come avvenga la regolazione, ma si ritiene che che l’insulina blocchi questa attivazione facendo precipitare la concentrazione di cAMP. Alcuni studi tuttavia lasciano supporre che questo effetto potrebbe essere da imputare anche ad una fosfatasi, che agirebbe in antagonismo alla fosforilazione delle perilipine e della lipasi. Ad ogni modo, il risultato è che la lipasi si trova defosforilata e inattivata, e la lipolisi viene dunque inibita. Grazie a questa regolazione, l’adipocita cessa di immettere acidi grassi nel circolo sanguigno. Questa è la principale modifica metabolica responsabile della inibizione della lipolisi. • Regolazione della acetil-coA carbossilasi (ACC), l’enzima regolatore della biosintesi degli acidi grassi. La ACC è un enzima biotina-dipendente che indirizza gli acetil-coA, carbossilandoli a malonil-coA, verso la biosintesi degli acidi grassi. Le unità di malonil-coA sono infatti utilizzate dal grande complesso della acido grasso sintasi come punto di partenza per la biosintesi e l’allungamento degli acidi grassi. La ACC esiste in uno stato fosforilato, nel quale è inattiva, ed uno stato defosforilato nel quale è attiva. Mentre la fosforilazione è promossa da una PKA, che media l’azione di ormoni come glucagone o adrenalina, l’insulina promuove la defosforilazione per mezzo di una fosfatasi. Questo rende la ACC più attiva, permettendole di sintetizzare più malonil-coA. Ricordiamo che l’acetil-coA in questo momento metabolico è fornito in abbondanza dal catabolismo del glucosio (sia grazie alla stimolazione della glicolisi che grazie alla attivazione della piruvato deidrogenasi). Questo intervento metabolico ha una doppia valenza: 1. è un modo per attivare la biosintesi degli acidi grassi, in quanto fornisce materia prima per questa via metabolica. E’ soprattutto a causa di questa regolazione che l’insulina stimola la conversione dei carboidrati in grassi; 2. è un modo per inattivare la beta-ossidazione. Un’alta concentrazione di malonil-coA infatti va ad inibire la carnitina aciltransferasi I, componente fondamentale del cosiddetto shuttle della carnitina. In questo modo, l’insu-

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2 Ormoni proteici e peptidici

Vaso sanguigno Perilipina

Lipasi Goccia lipidica P P

PKA

P

P

P

Figura 2.22: Regolazione della lipasi ormone sensibile. In alto, le perilipine ricoprono la goccia lipidica impedendo l’accesso alla lipasi, che è inattiva (è quello che si verifica in presenza di insulina). In basso, la fosforilazione da parte della PKA (es. in presenza di glucagone) provoca il distacco delle perilipine e l’attivazione della lipasi ormone sensibile che ora può accedere alla goccia lipidica.

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2 Ormoni proteici e peptidici lina riesce a impedire agli acidi grassi di accedere alla matrice mitocondriale, dove avviene la beta-ossidazione. • L’insulina, sul lungo periodo, incrementa l’espressione di molti degli enzimi chiave nel metabolismo lipidico: acil-coA carbossilasi, acido grasso sintasi, enzima malico, etc. Peraltro, è bene prestare attenzione al fatto che l’insulina inibisce indirettamente la chetotgenesi. Da una parte, abbassando il rate della lipolisi, fa sì che vi siano meno acidi grassi liberi in circolo – che, come è noto, favoriscono la formazione dei corpi chetonici. Dall’altra parte, l’insulina ostacola l’ingresso degli acidi grassi nel mitocondrio, e anche questo è un fattore limitante per la chetogenesi. Nel fegato, l’insulina partecipa alla regolazione del metabolismo del colesterolo. L’insulina incrementa l’espressione della HMG-CoA reduttasi di ben dieci volte [29]. In passato si riteneva che l’insulina (così come il glucagone) regolassero questo enzima principalmente attraverso cambiamenti dello stato di fosforilazione (l’insulina promuoverebbe la defosforilazione dell’enzima). Oggi tuttavia si ritiene che la fosforilazione/defosforilazione abbiano un ruolo limitato e che la regolazione dell’espressione genica sia la principale modalità con cui l’insulina regola l’enzima [28]. Metabolismo proteico. L’insulina attiva la sintesi proteica in parecchi tessuti – per questo è considerata un ormone anabolico. Il muscolo e il tessuto epatico sono i tessuti a livello dei quali l’azione dell’insulina è più marcata a livello di sintesi proteica. Ovviamente, si tratta di un effetto che si manifesta nel lungo termine (ore, giorni). Correlazioni cliniche: Diabete mellito Il diabete mellito è una patologia cronica del metabolismo, caratterizzata da un deficit della azione o della secrezione di insulina, o entrambi. Poiché l’insulina è il principale ormone che promuove l’ingresso di glucosio nelle cellule, il deficit insulinico porta all’iperglicemia, che può essere considerata l’elemento distintivo della malattia diabetica. Dal punto di vista classificativo, si distinguono diverse forme di diabete mellito sulla base della patogenesi. • Diabete mellito di tipo 1: in questo caso il diabete deriva della distruzione delle beta-cellule pancreatiche; c’è un deficit assoluto di insulina. Nel 95% dei casi la distruzione è autoimmune (tipo 1a); in circa il 5% dei casi, è idiopatica (cioè da causa sconosciuta; tipo 1b). In passato il diabete mellito di tipo 1 era chiamato “diabete

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2 Ormoni proteici e peptidici

giovanile” perché nella maggior parte dei casi insorge nell’infanzia o nell’adolescenza; veniva anche chiamato “diabete insulino-dipendente” perché i soggetti affetti si basano completamente sull’insulina esogena per sopperire alla loro carenza assoluta di ormone. Oggi questi termini sono scoraggiati. • Diabete mellito di tipo 2: la patogenesi è più complessa; è caratterizzato da un variabile grado di resistenza all’azione dell’insulina, associato ad una insufficiente secrezione compensatoria dell’ormone. Il contributo relativo di questi due fattori è variabile: in alcuni soggetti prevale l’insulino-resistenza, mentre in altri l’insulinoresistenza è minima ed il diabete deriva soprattutto da una insufficiente secrezione. È la forma più frequente di diabete mellito, ed è una delle malattie croniche più comuni della popoplazione adulta e anziana. In passato era anche noto come “diabete non insulino-dipendente” o “diabete dell’adulto”. Questa terminologia è oggi scoraggiata, anche perché qualunque forma di diabete può richiedere prima o poi un trattamento con insulina. • Diabete gestazionale: è una condizione di alterato metabolismo glicidico che si verifica durante la gravidanza in donne senza precedente diagnosi di diabete mellito; • Altri tipi particolari di diabete: in questa categoria vengono inserite tutte le altre forme di diabete mellito, a varia patogenesi: diabete da difetti genetici, associato ad altre endocrinopatie, infezioni etc. Il diabete mellito di tipo 1 ha spesso un esordio acuto o subacuto (talora drammatico), mentre il diabete mellito di tipo 2 ha generalmente un esordio più insidioso, e spesso è diagnosticato in soggetti apparentemente asintomatici, quando viene rilevata un’iperglicemia a controlli di routine. In linea di massima, una modesta iperglicemia può essere totalmente asintomatica. L’iperglicemia si manifesta clinicamente quando raggiunge valori elevati (>200-300). Tra i sintomi più caratteristici c’è la poliuria (dovuta al fatto che il glucosio passa nelle urine quando è in quantità tali da superare le capacità di riassorbimento del rene, portandosi dietro l’acqua per osmosi), che causa disidratazione e quindi, come meccanismo di compenso, polidipsia (sete intensa). Molto frequente è l’astenia (cioè mancanza di forze, fatica eccessiva rispetto allo sforzo compiuto), verosimilmente legata alla disidratazione che porta ad ipotensione. Un altro sintomo dell’iperglicemia sono le alterazioni visive transitorie (visione sfocata); sembrano dovute a cambiamenti di forma del cristallino, causate da alterazioni del contenuto di acqua, che ne alterano il potere rifrattivo. Sarebbero secondarie a disturbi osmotici indotti

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2 Ormoni proteici e peptidici

dall’iperglicemia. Il diabete è anche in grado di accelerare la formazione di cataratta, cosa che può contribuire ai disturbi visivi. Il diabete di tipo 2 è spesso diagnosticato quando è ancora asintomatico. In ogni caso tutti questi sintomi si manifestano in maniera graduale e insidiosa perché i fenomeni responsabili dell’iperglicemia in questa forma di diabete (un variabile grado di insulino-resistenza con un deficit relativo di insulina) si instaurano lentamente. C’è sempre un certo grado di secrezione di insulina, solo che non è sufficiente a controllare la glicemia. “Insulino-resistenza” significa che i tessuti rispondono in maniera ridotta allo stimolo ormonale: una certa quantità di insulina produce effetti inferiori rispetto a quanto ci aspetteremmo. Una risposta inferiore significa che, per esempio, i tessuti bersaglio dell’insulina (es. muscolo e tessuto adiposo) non effettuano un adeguato uptake di glucosio; a livello epatico non viene correttamente soppressa la gluconeogenesi e l’immissione di glucosio nel torrente ematico, e così via. I meccanismi che portano all’insulino-resistenza rimangono misteriosi. Sembra che si instauri fino a 10-20 anni prima dell’insorgenza del diabete. La patogenesi appare molto complessa, ma sembra esserci un legame molto forte con l’obesità. Per chi fosse interessato, ci sono molti articoli che affrontano l’argomento in dettaglio [37, 19, 36]. Comunque si origini l’insulino-resistenza, inizialmente il pancreas riesce a compensare secernendo una maggiore quantità di insulina che permette, almeno in un primo tempo, di normalizzare la glicemia (c’è uno stato di “iperinsulinismo”, cioè una secrezione di insulina sovrafisiologica). Con il tempo la capacità di compenso pancreatica si esaurisce e la situazione sfugge progressivamente al controllo omeostatico. Si manifestano delle alterazioni del metabolismo glicidico che inizialmente non sono marcate, ma che tuttavia non possono essere considerate normali. Queste situazioni prediabetiche di alterato metabolismo glicidico che si trovano nell’area grigia tra la normalità e il diabete franco sono note come impaired glucose tolerance (IGT) e impaired fasting glucose (IFG) [1, 32]. Alla fine, l’insulina secreta non è più sufficiente per impedire l’instaurarsi di un’iperglicemia franca. Non sono noti i fattori che determinano questo esaurimento funzionale delle beta-cellule. Nel diabete di tipo 1, l’esordio spesso è drammatico perché il pancreas esaurisce rapidamente la propria capacità di produrre insulina. Gli eventi che portano dall’inizio dell’autoimmunità alle manifestazioni cliniche e la loro successione cronologica sono oggetto di discussione (anche recentemente [2]), ma secondo la visione tradizionale il processo autoimmune distruggerebbe progressivamente le beta cellule nel corso della fase preclinica (probabilmente della durata di alcuni anni). Il diabete si manifesterebbe quando circa l’80%–90% delle cellule sono distrutte. L’iperglicemia si instaura bruscamente, e quindi i sintomi insorgono improvvisamente (giorni o poche settimane) in bambini o adolescenti precedentemente in buona salute. La poliuria e

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2 Ormoni proteici e peptidici

la sete sono intense; il soggetto si disidrata e perde elettroliti con le urine (soprattutto sodio e potassio, con conseguenti squilibri elettrolitici). Sintomi comuni sono anche la polifagia (fame intensa) e l’astenia. Poiché le cellule non ricevono il segnale insulinico, il metabolismo si regola come se l’organismo stesse affrontando un digiuno: vi è una elevata increzione di glucagone, il tessuto adiposo va incontro a lipolisi (aumento di acidi grassi liberi e glicerolo), ed il muscolo viene catabolizzato; gli acidi grassi liberi vengono convertiti in corpi chetonici a livello epatico. La lipolisi e la disidratazione rendono conto della marcata perdita di peso che si osserva poco prima dell’esordio clinico del diabete di tipo 1. I corpi chetonici hanno un pKa acido, e quindi la loro sintesi porta ad una condizione di acidosi metabolica (chetoacidosi). La presenza di corpi chetonici può essere sospettata sulla base di un caratteristico odore che conferiscono all’alito del paziente (soprattutto l’acetone, che è il più volatile), descritto come simile a quello della frutta matura. L’acidosi, la disidratazione e gli squilibri elettrolitici provocano nausea, vomito, confusione, poi sonnolenza/letargia, e infine il coma. Prima dell’introduzione della terapia con insulina purificata (1922), il diabete di tipo 1 era una malattia invariabilmente fatale. Questa scoperta è valsa un premio Nobel per Banting, Best, MacLeod e altri ricercatori. Superata la fase acuta, il diabete di tipo 1 ha sostanzialmente gli stessi problemi a lungo termine del diabete di tipo 2. La relativa povertà di segni e sintomi derivanti dall’iperglicemia non deve indurre a sottovalutare il diabete mellito. L’aspetto più temibile del diabete mellito sono le complicanze a lungo termine. L’iperglicemia, a lungo termine, risulta tossica per l’organismo, provocando lesioni a carico di molti organi e tessuti, che si manifestano in genere dopo 10-20 anni di malattia. Le persone affette da diabete mellito di tipo 1 quasi sicuramente svilupperanno queste complicanze, perché si ammalano giovani e quindi sono esposte all’iperglicemia per molti anni. I meccanismi con cui il glucosio risulta tossico sono diversi: uno dei più caratterizzati consiste nella formazione di advanced glycation end products (AGEs). Se esposte ad alte concentrazioni di glucosio, le proteine plasmatiche e tissutali vengono glicate e ossidate tramite una reazione non enzimatica, conosciuta come reazione di Maillard. Inizialmente si forma una base di Schiff tramite reazione del gruppo aldeidico dello zucchero con un gruppo amminico di un amminoacido; successivamente avviene un riarrangiamento che porta alla formazione di un composto di Amadori, che poi viene ossidato formando un AGE [11]. Gli AGE, oltre ad alterare la strutture delle proteine di partenza, possono generare ROS, formare cross-link, e legarsi ad alcuni recettori coinvolti nella risposta infiammatoria. Le principali complicanze sono rappresentate da: • complicanze macrovascolari: il diabete accelera il processo aterosclerotico a carico dei grandi vasi, con aumentato rischio di infarto e stroke.

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2 Ormoni proteici e peptidici

• complicanze microvascolari: il diabete danneggia i piccoli vasi della retina (è una delle principali cause di cecità nei paesi sviluppati!), del rene (con danni variabili fino all’insufficienza renale con necessità di dialisi), e dei nervi (neuropatia diabetica). • maggiore suscettibilità alle infezioni (l’iperglicemia sembra in qualche modo ostacolare la funzione dei granulociti e dei linfociti T); • piede diabetico: è un termine che si usa per indicare le consequenze dell’interessamento del piede da parte delle complicanze del diabete mellito (essenzialmente, l’ischemia e la neuropatia). Sono molto frequenti le ulcere, le infezioni e le deformazioni articolari. Non raramente si deve ricorrere all’amputazione delle dita o dell’intero piede.

Correlazioni cliniche: l’insulina rapida L’introduzione di analoghi dell’insulina ottenuti tramite tecnologie di ingegneria genetica ha avuto un grande impatto nel trattamento del diabete. I primi passi in questo senso sono stati compiuti intorno ai primi anni ’80, quando furono introdotte le prime insuline umane sintetiche. Uno dei primi prodotti fu commercializzato con il nome di Humulin. Questo tipo di insuline (come del resto le insuline porcine e bovine che erano utilizzate precedentemente) si aggregano in esameri complessandosi con lo zinco; poiché l’interazione con il recettore è possibile solo per la forma monomerica dell’insulina, questo fenomeno interferisce con la biodisponibilità dell’insulina, che, in seguito ad iniezione sottocutanea, viene rilasciata con una velocità che non sempre corrisponde a quella desiderata. Per esempio, l’insulina naturale iniettata per via sottocutanea viene rilasciata dopo circa 90 minuti dall’iniezione, troppo lentamente per coprire il fabbisogno dell’organismo dopo un pasto. A partire dalla metà degli anni ’90 furono introdotte sul mercato delle insuline sintetiche leggermente modificate in modo da alterarne le proprietà, soprattutto in relazione alla rapidità d’azione. Attualmente, esistono insuline rapide e insuline lente. Le insuline rapide hanno un assorbimento cutaneo più veloce, ed entrano in circolo già dopo pochi minuti dall’iniezione; in questo modo possono essere iniettate subito prima o subito dopo un pasto e fornire la quota di insulina adatta. La loro azione si esaurisce dopo poche ore: in definitiva queste insuline riproducono più fedelmente le modalità di secrezione fisiologica dell’insulina. Sono ottenute tramite una modifica a livello dell’estremità C-terminale della catena B, invertendo la posizione di due aminoacidi, una lisina e una prolina (per questo sono note anche come insuline “lispro”). Questa modifica non interferisce con il legame con

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2 Ormoni proteici e peptidici

il recettore, ma impedisce la formazione degli esameri. Le insuline lente sono di molti tipi, ma si caratterizzano per un tempo di rilascio e una durata d’azione molto prolungate. Sono adatte ad essere utilizzate come terapia di fondo, cioè per generare un livello di insulinemia basale. In generale, le terapie moderne prevedono l’associazione di diversi tipi di insulina, in modo da avere un controllo della glicemia il più possibile simile a quello fisiologico.

2.2.2 Glucagone Generalità Il glucagone è un ormone polipeptidico i cui effetti sono essenzialmente antagonisti a quelli dell’insulina: si tratta cioè di un ormone iperglicemizzante. In altre parole, in condizioni in cui la concentrazione di glucosio nel sangue non è sufficiente, il glucagone ha la funzione di coordinare alcuni tessuti per ristabilire la glicemia e mantenere l’omeostasi del glucosio. La situazione tipica in cui viene rilasciato glucagone è il digiuno: il glucagone in questi casi è fondamentale per assicurare un apporto di glucosio continuo a quei tessuti che non utilizzano altri substrati per l’approvvigionamento energetico. Struttura

Il glucagone è un ormone polipeptidico di 29 aminoacidi.

Sede di elaborazione Viene sintetizzato e secreto principalmente dalle cellule α del pancreas (vedi anche il paragrafo “Biosintesi”). Biosintesi Il glucagone viene sintetizzato sotto forma di pre-ormone di 158 aminoacidi (pro-glucagone) dalle cellule α del pancreas endocrino. Il gene del glucagone tuttavia è espresso in diversi altri tessuti, tra cui alcune popolazioni neuronali del sistema nervoso centrale e a livello intestinale. Immagazzinato all’interno di vescicole secretorie, il pro-glucagone va incontro a proteolisi limitata, che dà origine a diversi frammenti peptidici. In generale, il proglucagone può essere suddiviso in una porzione N-terminale, che prende il nome di glicentina (aminoacidi 1–69), e una C-terminale (70–158), che invece prende il nome di MPGF, Major ProGlucagon Fragment.

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2 Ormoni proteici e peptidici C’è una certa tessuto-specificità nel processo di proteolisi, il che fa sì che i frammenti che si generano siano diversi a seconda della sede di espressione del gene. • Nelle cellule α del pancreas, il frammento di glicentina viene ulteriormente tagliato in due frammenti: l’estremità che va dal N-terminale della glicentina al sito di taglio prende il nome di GRPP (Glicentin-Related Polypeptide), mentre il glucagone è formato dagli aminoacidi che vanno dal sito di taglio della glicentina al C-terminale. L’MPGF non va incontro ad altre modifiche, cosicché le cellule pancreatiche rilasciano glucagone, GRPP e MPGF. Tra questi, il glucagone ha gli effetti biologici più importanti. • Nelle cellule intestinali, il frammento della glicentina non viene processato, mentre l’MPGF viene tagliato producendo principalmente tre frammenti: IP-2, GLP-1 e GLP-2 (GLP sta per Glucagon-Like Peptide). • Nel tessuto nervoso, il processo di elaborazione è vario. Non vedremo la funzione degli altri peptidi prodotti dal pro-glucagone; accenniamo soltanto al fatto che GLP-1 è rilasciato dall’intestino in risposta ad alte concentrazioni di glucosio, e ha la funzione di potenziare il rilascio dell’insulina. Secrezione e regolazione La regolazione del rilascio di glucagone presenta ancora diversi punti poco chiari. In generale, si osserva che la secrezione di glucagone: • È innescata da basse concentrazioni ematiche di glucosio; • È innescata dalle catecolamine attraverso stimolazione β-adrenergica; • È innescata da pasti molto proteici; • È inibita da alte concentrazioni ematiche di glucosio; • È inibito da somatostatina e insulina. Sono documentati anche gli effetti del sistema nervoso autonomo sul rilascio di glucagone, ma le conclusioni dei diversi studi sono contrastanti e non definitive. Trasporto nel plasma e degradazione Il glucagone può essere degradato per proteolisi da numerose proteasi plasmatiche. Recettore Il recettore del glucagone è un classico recettore accoppiato a proteine G. Il legame con l’ormone attiva l’adenilato ciclasi e innalza la concentrazione di cAMP; a valle si ha attivazione della PKA con fosforilazione di alcuni enzimi chiave

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2 Ormoni proteici e peptidici – in generale, la fosforilazione è a carico di quegli enzimi che l’insulina tendeva a defosforilare. Questo spiega perché l’azione del glucagone abbia effetti antagonisti a quelli dell’insulina. Effetti biologici del glucagone Il glucagone agisce soprattutto su due tessuti: fegato e tessuto adiposo. I recettori del glucagone sono espressi anche in altri tessuti (cuore, alcune popolazioni di neuroni nell’encefalo, alcune cellule delle ghiandole surrenali e dello stomaco), ma il loro ruolo biologico non è stato ancora caratterizzato con precisione. L’effetto del glucagone nei tessuti bersaglio si può riassumere affermando che il glucagone tende a incrementare la concentrazione di glucosio nel sangue. Questa funzione viene assolta principalmente agendo su due tessuti. Metabolismo del glucosio Nel fegato, viene stimolata la gluconeogenesi e la glicogenolisi, mentre la glicolisi e la glicogenosintesi vengono inibite. Ci si potrebbe chiedere perché il glucagone abbia questi effetti solo sul fegato. La risposta è che si tratta dell’unico organo in grado di secernere glucosio nel sangue: è l’unico tessuto che può innalzare la glicemia. Come nel caso dell’insulina, la regolazione metabolica coinvolge la modifica dello stato di fosforilazione di pochi enzimi, ma il tipo di modifica in genere è esattamente opposto. Ovverosia: dove l’insulina defosforila, il glucagone fosforila. Se gli effetti dell’insulina sono stati compresi, capire quelli del glucagone dovrebbe essere semplice. • Incremento della glicogenolisi: è basato sulla fosforilazione della glicogenofosforilasi, che la converte dalla forma b (defosforilata e inattiva) alla forma a (fosforilata e attiva) (Fig. 2.23). Il glucagone innesca questa fosforilazione attraverso la glicogeno fosforilasi chinasi. Quindi: il glucagone attiva la PKA, che fosforila e attiva la glicogeno fosforilasi chinasi, che a propria volta fosforila e attiva la glicogeno fosforilasi. Quest’ultima inizia a distaccare unità di glucosio dal glicogeno. Inoltre, il glucagone inibisce la fosfoproteina fosfatasi, che potrebbe defosforilare la glicogeno fosforilasi e la glicogeno fosforilasi chinasi. • Inibizione della glicogenosintesi: è basata sulla fosforilazione della glicogeno sintasi, che converte l’enzima nella sua forma inattiva (Fig. 2.24). Sono numerose le chinasi in grado di fosforilare la glicogeno sintasi; si ritiene che nel caso del glucagone sia coinvolta essenzialmente la PKA. È bene precisare però che alcune prove sperimentali sembrano suggerire che il glucagone possa attivare, con meccanismi sconosciuti, delle chinasi cAMP-indipendenti.

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2 Ormoni proteici e peptidici

ATP

+

PKA

P

PP1

+

+

Glucagone

Glicogeno fosforilasi chinasi

Glucagone

P

ADP

Glicogeno fosforilasi chinasi

H2O ADP

ATP

Glicogeno fosforilasi (inattiva)

Glicogeno fosforilasi (attiva)

Glicogeno (integro)

P

Glicogeno (in degradazione) P

PP1

H2O

+

Glucagone

Figura 2.23: Regolazione della glicogeno fosforilasi quando è presente il glucagone. Confrontare con le figg. 2.16 e 2.17

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2 Ormoni proteici e peptidici

70

• Incremento della gluconeogenesi e inibizione della glicolisi: si verificano per lo più attraverso un decremento del fruttosio-2,6-bisfosfato, a propria volta indotto dalla fosforilazione dell’enzima bifunzionale fruttosio-2,6-bisfosfatasi/fosfofruttochinasi2. La fosforilazione inattiva l’attività chinasica e attiva quella fosfatasica. L’enzima chiave della gluconeogenesi, la fruttosio-1,6-bisfosfatasi, è più attivo in presenza di scarse quantità del modulatore allosterico, così che il flusso complessivo attraverso la via è aumentato. Viceversa, la PFK-1 è meno attiva, e l’entità del flusso attraverso la glicolisi diminuisce. Un altro effetto mediato dal glucagone che contribuisce alla regolazione è la fosforilazione della piruvato chinasi, l’enzima glicolitico che converte il fosfoenolpiruvato in piruvato. La modifica covalente inattiva l’enzima e riduce il flusso metabolico della glicolisi; inoltre, il fosfoenolpiruvato già prodotto viene indirizzato verso la gluconeogenesi. È bene ricordare che anche l’aumentata disponibilità di acidi grassi liberi (determinata dalla stimolazione della lipolisi a livello del tessuto adiposo) contribuisce a indirizzare il metabolismo epatico verso la sintesi del glucosio. • Infine, il glucagone influenza anche l’espressione genica, aumentando o riducendo l’espressione degli enzimi chiave. L’effetto è mediato dalla fosforilazione di una proteina chiamata CREB (cAMP Response Element Binding protein), che agisce da fattore di trascrizione, legandosi ai cAMP response elements a livello del DNA. Per avere un quadro completo, in fig. 2.25 è illustrato l’effetto dell’incremento del cAMP (che è un effetto del glucagone e anche dell’adrenalina) sul metabolismo del glicogeno, e in fig. 2.26 l’effetto della diminuzione del cAMP (come avviene con l’insulina). Metabolismo lipidico Nel tessuto adiposo, il glucagone essenzialmente promuove la lipolisi. Questo effetto viene ottenuto con la mediazione della PKA, che fosforila le perilipine e la lipasi ormone-sensibile (Fig. 2.22, pag. 60). Il glucagone regola inoltre la acetil-coA carbossilasi (ACC), stimolando la sua fosforilazione e inibendola. L’enzima non è noto con certezza, ma probabilmente si tratta di una PKA. Nel fegato, il glucagone regola il metabolismo del colesterolo con effetti opposti a quelli dell’insulina, cioè diminuendo l’espressione della HMG-CoA reduttasi. In passato si riteneva che la regolazione avvenisse attraverso cambiamenti dello stato di fosforilazione, ma oggi si pensa che il glucagone agisca principalmente tramite la modulazione dell’espressione genica [28].

2 Ormoni proteici e peptidici

Glucagone

+ +

+ +

PKA

diverse chinasi

?

ADP

ATP

Glicogeno sintasi (attiva)

Glicogeno sintasi (inattiva)

Glicogeno (in attiva sintesi)

P

Glicogeno (non in attiva sintesi) P

PP1

H2O

+

Glucagone

Figura 2.24: Regolazione della glicogeno sintasi quando è presente il glucagone. Confrontare con le figg. 2.18 e 2.19.

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2 Ormoni proteici e peptidici

cAMP

+ PKA

+ Glicogeno fosforilasi chinasi

+ Glicogeno fosforilasi chinasi

PP1

PP1

+

+ Glicogeno fosforilasi

Glicogeno sintasi

Glicogeno fosforilasi

Glicogeno sintasi

Figura 2.25: Schema riassuntivo degli effetti dell’incremento della concentrazione di cAMP sulla regolazione del metabolismo del glicogeno. I principali ormoni in grado di aumentare il cAMP sono l’adrenalina e il glucagone.

cAMP

PP1

+ Glicogeno fosforilasi chinasi

+ Glicogeno fosforilasi chinasi

Glicogeno fosforilasi

+

Glicogeno sintasi

Glicogeno sintasi

Glicogeno fosforilasi

Figura 2.26: Schema riassuntivo degli effetti del decremento della concentrazione di cAMP sulla regolazione del metabolismo del glicogeno. Il principale ormone in grado di diminuire il cAMP è l’insulina.

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2 Ormoni proteici e peptidici

2.3 Ormoni della tiroide e delle paratiroidi Dove siamo? Paratiroidi Le paratiroidi sono delle piccole ghiandole situate nel collo. Hanno una forma rotondeggiante, le dimensioni di un chicco di riso, e in genere sono situate a contatto con la superficie posteriore della tiroide (vedi il box “Dove siamo?” sulla tiroide, pag. 101), in numero di tre o quattro (due superiori e due inferiori). C’è comunque una certa variabilità nel numero (alcuni soggetti hanno 6 o 8 ghiandole paratiroidi) e nella posizione (possono ad esempio essere incluse nel contesto del parenchima tiroideo o essere dislocate nel mediastino). Istologicamente, le paratiroidi hanno una struttura più compatta della tiroide. Ci sono due principali citotipi: • cellule principali: sono numericamente le cellule più rappresentate, e sono le cellule che sintetizzano l’ormone PTH. • cellule ossifile: sono caratterizzate da un citoplasma acidofilo e dalle grandi dimensioni; sono quantitativamente meno rappresentate, e la loro funzione non è chiara.

2.3.1 Paratormone (PTH) Generalità Il paratormone, o ormone paratiroideo (PTH), ha un ruolo centrale nell’omeostasi del calcio, insieme a calcitonina9 e il metabolita attivo della vitamina D, il calcitriolo. Struttura Il paratormone, è un polipeptide di 84 aminoacidi con una massa molecolare di circa 9,5 kDa. Sede di Sintesi

Viene sintetizzato e secreto dalle cellule principali delle paratiroidi.

Biosintesi Come accade per diversi altri ormoni peptidici, anche il PTH non viene tradotto direttamente, ma è parte di un precursore più grande e inattivo (pre-propeptide), da cui vengono via via eliminati frammenti, fino ad ottenere l’ormone vero

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In realtà, come vedremo, il ruolo della calcitonina nell’omeostasi del calcio è quantomeno dubbio.

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2 Ormoni proteici e peptidici e proprio. Probabilmente, processi come questo si sono evoluti e conservati non per rispondere ad esigenze strutturali, ma regolative. Il pre-proormone (che rappresenta l’immediato prodotto genico) è di 115 aminoacidi, e comprende un peptide segnale (la breve sequenza amino-terminale idrofobica che consente il trasferimento del peptide nel lume del RE) di 25 aminoacidi. Il peptide segnale viene rimosso per proteolisi a livello del RE stesso (quindi cotraduzionalmente), con produzione di proparatormone.10 Sembra che gran parte del pro-PTH sintetizzato venga degradato a questo livello. Nel Golgi vengono rimossi altri 6 aminoacidi per lo più basici (la cui funzione è ignota), convertendo il pro-PTH che non è stato degradato in PTH,11 che viene accumulato in granuli di secrezione. A questo punto, i possibili destini per il PTH sono due: • può essere liberato; • può andare incontro a diverse reazioni proteolitiche di degradazione, prima di essere secreto. La sintesi di PTH infatti è continua, e così la regolazione viene effettuata tramite processi degradativi. L’attività biologica risiede soprattutto nel primo terzo della molecola (34 aminoacidi), a partire dall’estremità N-terminale, che è responsabile per il legame al recettore. Secrezione, trasporto nel plasma e degradazione Il peptide di 84 aminoacidi è la forma intatta di PTH, ed è soprattutto in questa forma che l’ormone viene secreto dalle paratiroidi. Tuttavia, il PTH può andare incontro a proteolisi in diversi momenti, dando origine ad alcuni frammenti specifici che si ritrovano poi in circolo. Sul totale di metaboliti associabili al paratormone in circolo, il PTH intatto rappresenta il 10%; il 90% è costituito dai frammenti.12 I processi proteolitici che danno origine a questi metaboliti avvengono: 1. in parte nelle parotidi stesse, mentre il PTH è ancora all’iterno della cellula prima della secrezione;

Il pro-PTH è quindi composto da 115 -25 = 90 aminoacidi. Questo porta il PTH a 90 -6 = 84 aminoacidi 12 Questo non è in contraddizione con il dato che il PTH intatto è la principale forma nella quale l’ormone viene secreto: il PTH viene secreto per lo più intatto, ma in circolo sono più numerosi i frammenti, che vengono prodotti anche dalla proteolisi periferica del PTH intatto.

10

11

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2 Ormoni proteici e peptidici 2. in parte in sede periferica, dopo la secrezione: soprattutto nel fegato, a livello delle cellule del Kupfer, e in minor quantità nel rene. I frammenti originati dal PTH constano di: • frammenti amino-terminali, contenenti gli aminoaciddi 1-34 o 1-36. In circolo si ritrovano solo i PTH1-34 , perché i PTH1-36 vengono subito degradati ulteriormente in di- e tri-peptidi. I PTH1-34 rappresentano il 10% dei metaboliti circolanti associabili al paratormone. Hanno attività biologica, ma emivita breve. • frammenti carbossi-terminali, contenenti gli aminoacidi 35-84 o 37-84. Rappresentano l’80% dei metaboliti circolanti associabili al paratormone; non hanno attività biologica, ma emivita più lunga. Riassumendo, il PTH in circolo è così distribuito: 10% PTH intatto, l’ormone vero e proprio; 10% frammenti amino-terminali; 80% frammenti carbossi-terminali. Questo 90% di frammenti è prodotto, come abbiamo visto, da una degradazione del PTH in parte nelle paratiroidi stesse, in parte a livello periferico, mentre l’ormone circola dopo che è stato secreto. Gli enzimi che catalizzano questi processi di frammentazione sono le catepsine B e D, presenti sia nella paratiroidi che perifericamente. Le catepsine sono una famiglia di proteasi, di cui fanno parte circa 15 enzimi; alcune sono proteasi a serina, altre a cisteina, altre ancora ad asparato. In genere raggiungono la massima attività a bassi pH, infatti sono frequentemente presenti nei lisosomi.13 La catepsina B taglia il PTH in due frammenti tra gli aminoacidi 36 e 37, producendo i frammenti PTH1-36 e PTH37-84 . Il frammento contenente gli aminoacidi 1-36 viene subito degradato ulteriormente, per cui dall’azione di questo enzima si ottiene solo PTH37-84 . La catepsina D taglia il PTH tra gli aminoacidi 34 e 35, producendo i frammenti PTH1-34 e PTH35-84 . Ricapitolando: • il PTH viene sintetizzato ed impacchettato in vescicole secretorie; già a questo livello si hanno intensi processi degradativi (prima a livello del pro-PTH, poi a livello del PTH). • Viene rilasciato soprattutto PTH intatto, mentre la quota maggiore dei frammenti sono conservati nelle cellule delle paratiroidi, e solo una minor parte passa nel sangue. 13

Potrebbero essere clinicamente importanti in quanto sono maggiormente espresse in alcuni tumori, e sembrano implicate in altre patologie.

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2 Ormoni proteici e peptidici diminuzione della calcemia

aumento concentrazione PTH

aumento sintesi di calcitriolo (1,25-diidrossi-vitamina D3)

aumento della calcemia

ritorno alla normalità

Figura 2.27: La diminuzione della concentrazione plasmatica di calcio incrementa la secrezione di PTH; il PTH da una parte aumenta direttamente la concentrazione plasmatica di calcio, dall’altra favorisce la produzione di calcitriolo, il quale partecipa all’azione ipercalcemizzante. Il calcio, aumentando, inibisce la secrezione di PTH con un circuito a feedback; un’altra inibizione a feedback è esercitata dal calcitriolo. Alla fine, si ha il ritorno alla normalità.

• Il PTH intatto, attraverso la circolazione, giunge al fegato, dove avviene la proteolisi periferica. Sulla membrana plasmatica delle cellule del Kupfer è esposta una catepsina (la B), che produce i frammenti; questi poi continuano a circolare. Sembra che anche il rene partecipi a questa proteolisi, ma verosimilmente i frammenti vengono escreti e non reimmessi in circolo. Regolazione Per quanto riguarda la regolazione di questo ormone, si sono evoluti meccanismi di regolazione che intervengono a diversi livelli nel metabolismo. Abbiamo: • una regolazione a livello della biosintesi; • una regolazione post-traduzionale • una regolazione a livello della secrezione; • una regolazione tramite degradazione periferica; Regolazione a livello della biosintesi Si esplica sia a livello dell’espressione del gene, sia con modifiche post-traduzionali (trattate separatamente), sia attraverso una

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2 Ormoni proteici e peptidici regolazione del numero e delle dimensioni delle cellule che lo sintetizzano. Dato che la funzione del paratormone è, in buona sostanza, quella di innalzare la concentrazione plasmatica di calcio, una regolazione da parte del calcio stesso è intuitiva (Fig 2.27). I meccanismi con cui questo avviene sono piuttosto complessi, e in parte da chiarire, ma è dimostrato che un decremento della concentrazione plasmatica di Ca2+ porta ad un incremento dell’mRNA del PTH e della sintesi del relativo peptide. Si pensa che questo avvenga tramite una regolazione della trascrizione, della stabilità dell’mRNA e della traduzione. La regolazione a livello genico avviene anche ad opera del calcitriolo (1 α,25diidrossicolecalciferolo), un ormone lipofilo derivato dalla vitamina D che, complessatosi con il proprio recettore, si lega ai response elements della vitamina D nella regione del promotore del gene del PTH decrementandone la trascrizione. La relazione che lega PTH e calcitriolo sarà illustrata meglio più avanti (vedi paragrafo 5.1.1 a pagina 132); per il momento, ciò che occorre sapere è che questa rappresenta una inibizione a feedback. Uno degli effetti del PTH infatti è quello di stimolare la produzione di calcitriolo, che da un lato partecipa nell’aumento della calcemia, dall’altro con un loop di feedback negativo va ad inibire la produzione del PTH stesso. Regolazione a livello post traduzionale Come abbiamo accennato, gran parte del proPTH sintetizzato viene degradato immediatamente nel RE, e questo processo è indipendente dal calcio; invece, la calcemia sembra influenzare il processo proteolitico che interessa il PTH nelle vesciole secretorie, rallentando la degradazione in risposta ad una diminuzione di calcio plasmatico, incrementandola in caso contrario. Questo avviene grazie ad un recettore sensore del calcio parotideo (Calcium Sensing Receptor), in grado di percepire anche piccole variazioni della calcemia. La scoperta di questo importantissimo recettore ha rappresentato una tappa fondamentale per la comprensione della omeostasi del calcio. Si tratta di un recettore accoppiato alle proteine G esposto sulla membrana di alcuni citotipi, tra cui le cellule parotidee. Quando il calcio è legato al recettore (perché è abbondante)14 , questo è attivato, e media una complessa serie di segnali intracellulari che coinvolgono diverse fosfolipasi, tra cui la fosfolipasi A2 . Conosceremo meglio la fosfolipasi trattando la biosintesi degli eicosanoidi, per adesso ci basti sapere che grazie a questo enzima si ha la sintesi di leucotrieni, che inibiscono la secrezione di PTH attraverso una attivazione massiccia della sua degradazione. Quando il calcio non è legato a questo recettore (perché è scarso), questo passa allo stato inattivo: i leucotrieni non sono prodotti, la degradazione diminuisce, e la secrezione di PTH non è più tenuta a freno. È piuttosto interessante il fatto che si sia evoluto un 14

Il calcio è presente, nel plasma, in tre forme: ionizzato, cioè come Ca2+ libero; complessato con altri ioni; complessato con le proteine. Il calcium sensing receptor “avverte” solo il calcio ionizzato.

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2 Ormoni proteici e peptidici meccanismo di regolazione per cui la sintesi è costitutiva, mentre l’inibizione avviene modulando l’intensità dei processi proteolitici (pur tenendo presente che il calcio ha effetti sull’mRNA del PTH). Infine, in specie in caso di prolungata ipocalcemia o di deficienza di calcitriolo, la sintesi di PTH viene incrementata attraverso un aumento del numero e delle dimensioni delle cellule produttrici. Regolazione a livello della secrezione Abbiamo visto come il calcio serico contribuisca a regolare la biosintesi, sia determinando un incremento dell’mRNA del gene del PTH, sia inibendo la degradazione del PTH intatto nelle vescicole. La regolazione a feedback negativo esplicata dal calcio plasmatico però non si ferma qui, ma si estende anche a livello della secrezione. Dato che il PTH ha la funzione di innalzare la calcemia, la secrezione deve avvenire quando il calcio diminuisce. Di nuovo, a mediare questo processo, è il Calcium Sensing Receptor. Oltre ad attivare la fosfolipasi A2 , attiva anche la fosfolipasi C, con produzione di diacilglicerolo (DAG) e IP3 ; il risultato è un aumento della concentrazione intracellulare di calcio. Al contrario degli altri meccanismi di esocitosi conosciuti, che sono attivati da un aumento della concentrazione intracellulare di calcio, nelle cellule delle paratiroidi la secrezione delle vescicole è inibita da alte concentrazioni di calcio intracellulare. Quando il calcio si dissocia dal calcium sensing receptor, questo è inattivato, e la concentrazione intracellulare di calcio precipita, innescando il rilascio delle vescicole. Regolazione tramite degradazione periferica Avviene per lo più nel fegato ad opera delle catepsine B e D, e di questa abbiamo già parlato: vengono prodotti per lo più frammenti carbossi-terminali, inattivi. In definitiva, la principale regolazione è affidata alla calcemia. Recettori Sono stati identificati tre tipi di recettori per il PTH: PTHR1, PTHR2 e PTHR3. Di questi, il PTHR1 è il mediatore degli effetti fisiologici più importanti. È espresso dagli osteoblasti e dalle cellule del rene. Sono tutti recettori accoppiati a proteine G. Gli effetti del PTH sono mediati attraverso l’attivazione della adenilato ciclasi e quindi del cAMP; si ha quindi l’attivazione della PKA, con fosforilazione di proteine specifiche. La cascata segnalatoria promuove l’attivazione di geni ed enzimi. Effetti fisiologici del paratormone Il PTH viene spesso definito come un “ormone ipercalcemizzante”, intendendo con questo che le sue azioni biologiche hanno, come ultimo risultato, quella di innalzare la concentrazione plasmatica di Ca2+ . Il paratormone influenza anche la concentrazione plasmatica di fosfato e promuove l’attivazione

78

2 Ormoni proteici e peptidici della vitamina D. Del resto, calcemia e fosfatemia sono correlate tra loro, poiché i sali di calcio e fosfato sono i componenti principali del tessuto osseo, e la vitamina D attivata ha un ruolo nell’omeostasi calcica. Le cellule bersaglio sulle quali il paratormone esercita la sua azione si trovano essenzialmente a livello renale ed osseo. Azione sui tubuli renali. Stimola il riassorbimento del Ca2+ a livello della porzione distale dei tubuli, il che consente al PTH di influire sul 40% del totale di calcio riassorbito a livello renale.15 Come agisce esattamente il PTH? L’ormone promuove l’esposizione e l’apertura di canali per il calcio a livello della membrana apicale delle cellule. Penetrato nell’ambiente intracellulare, il calcio si lega alla calbindina-D 28K, che facilita la diffusione dello ione dalla membrana apicale (rivolta verso il lume del tubulo) a quella basolaterale (rivolta verso l’interstizio renale), dove il calcio fuoriesce nello spazio interstiziale grazie ad un trasportatore ATP-dipendente. Si stabilisce quindi un flusso unidirezionale di calcio attraverso la cellula, dalla membrana apicale a quella basolaterale. Inoltre, il PTH riduce il riassorbimento di ioni fosfato, agendo a livello dei suoi trasportatori Na+ /Pi di tipo II, esposti sulla membrana.16 L’ormone induce la loro internalizzazione e, una volta racchiusi in vescicole, la loro distruzione. Sintesi della vitamina D L’azione del PTH sul rene non si limita soltanto ai tubuli renali. A livello del rene, si ha l’induzione della 1 α-calcidiolo-idrossilasi, l’enzima responsabile della formazione del calcitriolo. Come abbiamo accennato (e come

15

Non tutto il riassorbimento del calcio è sotto controllo ormonale. Vi sono due modalità con le quali avviene tale riassorbimento: la via transcellulare e la via paracellulare. Nella porzione prossimale dei tubuli, il trasporto del calcio avviene con la via paracellulare, che rappresenta un processo passivo, correlato al riassorbimento di sodio, e non regolabile. Nella porzione distale, il riassorbimento avviene invece mediante la via transcellulare, attiva e regolabile da ormoni come il PTH (o farmaci). Nella porzione ascendente dell’ansa di Henle, il riassorbimento avviene con entrambe le modalità. 16 È interessante chiedersi perché l’evoluzione abbia selezionato questa azione, che apparentemente sembra avere poco a che vedere con il calcio. In realtà calcio e fosfato sono intimamente connessi, entrando nella costituzione della componente minerale delle ossa. Quando la fosfatemia plasmatica si abbassa, a causa della aumentata escrezione dello ione, i cristalli di idrossiapatite solubilizzano più facilmente, rendendo più agevole il richiamo di calcio dalle ossa (una delle azioni del paratormone è quella di incrementare il riassorbimento della matrice ossea, con liberazione degli ioni contenuti nei sali che formano la matrice inorganica). Inoltre, il fatto di aumentare l’escrezione di fosfato permette di contenere l’innalzamento della fosfatemia che consegue al riassorbimento della matrice minerale ossea.

79

2 Ormoni proteici e peptidici vedremo meglio più avanti, pag. 132), il calcitriolo esercita un’azione sinergica a quella del PTH. Si può pensare che il PTH deleghi alcuni compiti al calcitriolo. Azione a livello osseo Il PTH agisce a livello osseo stimolandone il riassorbimento, con rilascio di Ca2+ dalla matrice. Ad operare la degradazione della matrice extracellulare sono gli osteoclasti. Il paratormone non li stimola direttamente, ma agisce sugli osteoblasti. Sono questi ultimi che esprimo i recettori per l’ormone, e che provvedono a reclutare gli osteoclasti, mediando quindi l’azione del PTH. Il paratormone stimola negli osteoblasti la sintesi di RANKL17 (sinonimi: ODF, fattore differenziante gli osteoclasti), un recettore che le cellule espongono sulla loro membrana. RANKL si lega a RANK, che invece è espresso sulla membrana dei precursori osteoclastici. Il legame determina un cambiamento conformazionale di RANK, che media effetti intracellulari, ed in ultimo determina l’espressione dei geni che promuvono il differenziamento dei precursori in osteoclasti maturi. Inoltre, il PTH riduce la secrezione di osteoprotegerina (una proteina che inibisce il differenziamento degli osteoclasti) da parte degli osteoblasti e stimola la sintesi di fattori di crescita e interleuchina, il cui effetto è quello di attivare gli osteoclasti. Tutti questi effetti si risolvono in un aumento della calcemia.

2.3.2 Calcitonina Generalità La calcitonina è un ormone coinvolto nell’omeostasi del calcio, insieme a PTH e calcitriolo. Mentre questi due hanno effetto ipercalcemizzante, la calcitonina ha un effetto opposto, di tipo ipocalcemizzante. Struttura La calcitonina è un ormone peptidico di 32 aminoacidi. L’attività biologica è posseduta dall’intero peptide, e quindi la frammentazione dell’ormone porta alla sua inattivazione. In particolare, sembra essere importante la parte N-terminale della molecola, che è costituita da un ciclo di 7 aminoacidi, uniti attraverso un ponte disolfuro Cys-Cys. La prolina C-terminale è inoltre amidata. Una caratteristica curiosa dell’ormone sta nella incredibile variabilità che si osserva tra ormoni di specie diverse (per esempio, nel caso della calcitonina umana e suina, gli aminoacidi differenti sono circa la metà); tuttavia, questo non sembra pregiudicare l’attività biologica interspecie – tant’è che la calcitonina di salmone è più attiva di quella umana, e viene utilizzata in terapia. 17

Sta per RANK Ligand, cioè ligando di RANK.

80

2 Ormoni proteici e peptidici Sede di sintesi Viene sintetizzata principalmente dalle cellule C della tiroide – sembra tuttavia che la biosintesi possa avvenire anche in altri distretti corporei (encefalo, paratiroidi, timo, cellule di bronchi e polmoni, prostata), ma non si conosce il ruolo fisiologico dell’ormone in questi distretti. Biosintesi La calcitonina si forma, come accade per molti altri ormoni peptidici, in seguito alla proteolisi limitata di un precursore più grande. Il trascritto primario del gene della calcitonina contiene l’informazione per la traduzione sia della procalcitonina sia di un’altra proteina, il peptide correlato al gene della calcitonina (CGRP), potente vasodilatatore; lo splicing alternativo del trascritto consente alle cellule di produrre l’uno o l’altro, in maniera tessuto-specifica. La pro-calcitonia viene convertita in calcitonina nel Golgi, quindi immagazzinata in vescicole. Secrezione e regolazione Il rilascio della calcitonina è sotto il controllo della calcemia plasmatica: quando questa supera i 9-10 mg/100 mL, viene innescata l’esocitosi. Questo effetto è mediato da un recettore sensibile al calcio. Notare che, pur trovandosi nella tiroide, le cellule C, il citotipo responsabile della secrezione di calcitonina, non sono in alcun modo sotto il controllo dell’ipofisi, al contrario dei tireociti, che sono regolati dal TSH. Trasporto nel plasma e degradazione La calcitonina viene rapidamente eliminata dal rene per degradazione proteolitica. I suoi metaboliti sono privi di attività. Effetti fisiologici e recettori Gli effetti biologici della calcitonina sono conosciuti ma non è chiaro quale sia il peso effettivo della calcitonina sulla regolazione della calcemia. Per esempio, nei due casi estremi di tiroidectomia (rimozione chirurgica della intera tiroide), e di carcinoma della tiroide (con ipersecrezione di calcitonina), non si osservano alterazioni rilevanti nell’omeostasi calcica.18 In un certo senso, la calcitonina è un ormone in cerca di una funzione [10]. È possibile che l’ormone abbia un ruolo nell’omeostasi del calcio, ma che non sia necessario perché il calcio sia regolato correttamente.

18

Nel caso della tiroidectomia, una possibilità è che la sintesi extratiroidea di ormone sia sufficiente a garantirne le funzioni.

81

2 Ormoni proteici e peptidici La calcitonina produce un abbassamento della calcemia – si tratta quindi di un ormone ipocalcemizzante. Le cellule bersaglio di questo ormone si trovano a livello di tessuto osseo e rene, e presentano recettori accoppiate a proteine G: Azione sulle ossa. Agisce sugli osteoclasti, inibendone la motilità, l’attività ed il numero. Il riassorbimento osseo quindi viene ad essere inibito, ed il calcio cessa di essere immesso nel torrente plasmatico. L’azione sugli osteoclasti avviene grazie ai recettori esposti sulla superficie cellulare, ed il segnale intracellulare è mediato attraverso i pathway cAMP-PKA e Ca2+ -PKC; gli effetti principali consistono in una disorganizzazione del citoscheletro, che causa una perdità di polarità delle cellule e smantella l’orletto increspato (ruffled borders). Azione sul rene A livello dei tubuli renali, la calcitonina inibisca il riassorbimento del Ca2+ e altri ioni (sodio, fosfato), favorendo la loro escrezione con le urine, e quindi sottraendo ioni al pool plasmatico. Anche in questo caso, si ha l’attivazione della adenilato ciclasi. Una overview della regolazione ormonale dell’omeostasi calcica sarà presentata al momento di esaminare l’azione fisiologica del calcitriolo.

82

3 Ormoni derivati da aminoacidi 3.1 Generalità Gli ormoni derivati dagli aminoacidi sono rappresentati principalmente dalle catecolamine e dagli ormoni tiroidei. Sono sintetizzati a partire dall’aminoacido tirosina. Le catecolamine principali sono adrenalina (o epinefrina), noradrenalina (o norepinefrina) e dopamina. Il loro nome deriva dal fatto che sono strutturalmente correlate al catecolo. Sono sintetizzate a livello della zona midollare della ghiandola surrenale con valenza di ormoni endocrini (cioè sono secrete nel circolo sanguigno), e a livello neuronale con valenza di neurotrasmettitori (soprattutto a livello del sistema nervoso simpatico).1 È interessante notare come a livello embriologico i due tessuti siano fortemente correlati: la midollare surrenale deriva da cellule delle creste neurali, che si distaccano dal tubo neurale. Le catecolamine sono idrofile, e nel sangue hanno un’emivita estremamente breve. Gli ormoni tiroidei sono la triiodotironina (T3 ) e la tetraiodotironina (T4 ); sono sintetizzate nei follicoli tiroidei, e sono ormoni lipofili con lunga emivita. Nel gruppo degli ormoni derivati dagli aminoacidi possono essere inclusi anche l’ossido nitrico (NO), la melatonina, la serotonina (5-HT) e l’istamina. Le catecolamine, la serotonina e spesso l’istamina vengono indicate collettivamente come "amine biogene" [20].

1

Si tratta probabilmente di una precisazione superflua, in quanto, come abbiamo già avuto modo di rilevare, è difficile, oltre che artificioso, separare nettamente il neurotrasmettitore dall’ormone.

3 Ormoni derivati da aminoacidi

Figura 3.1: La ghiandola surrenale (in rosso) incappuccia il polo superiore di ciascun rene. La surrenale di destra è tradizionalmente descritta come a forma di "cappello frigio". Probabilmente per alcune persone è più familiare se descritta come a forma di "cappello dei puffi" :)

3.2 Ormoni della zona midollare della ghiandola surrenale Dove siamo? Surrene Le ghiandole surrenali (vedi figura 3.1) sono piccole strutture di forma piramidale che incappucciano il polo superiore di ciascun rene. Funzionalmente ed anatomicamente possono essere suddivise in una regione corticale (esterna) ed una midollare (interna). Zona corticale: conferisce alle surrenali un colore giallastro a causa della grande presenza lipidica; questa zona infatti sintetizza ormoni steroidei. Procedendo dall’esterno verso l’interno è suddivisibile in tre zone: 1. zona glomerulare, 2. zona fascicolata 3. zona reticolata. Zona midollare: popolata da cellule cromaffini, che secernono catecolamine.

84

3 Ormoni derivati da aminoacidi HO

HO

CH2 CH2 NH2

HO

HO

Dopamina

Catecolo

HO HO

H

H

C

C

HO

H

Adrenalina

HO H N

HO CH3

H

H

C

C

HO

H

NH2

Noradrenalina

Figura 3.2: Le tre principali catecolamine (adrenalina, noradrenalina e dopamina) sono dotate di un nucleo catecolico a cui è legato un gruppo aminico.

3.2.1 Catecolamine Struttura Il nome di "catecol-amine" rispecchia piuttosto bene la struttura di questi composti, che sono dotati di un nucleo catecolico (cioè un anello benzenico diidrossilato in posizione 1 e 2) a cui è legato un gruppo aminico (vedi figura 3.2, pag. 85). Sede di elaborazione La noradrenalina è il principale neurotrasmettitore sintetizzato dai neuroni postgangliari del sistema simpatico e alcuni neuroni del SNC [5].2 L’adrenalina è il principale ormone secreto dalla zona midollare della ghiandola surrenale (ammonta a circa l’80% delle catecolamine della midollare del surrene; il restante 20% è rappresentato da noradrenalina). Le cellule cromaffini sintetizzano anche altre molecole (encefaline, cromoganina, adrenomedullina) che non prenderemo in considerazione.3 L’adrenalina viene anche sintetizzata da alcune popolazioni neuronali del sistema nervoso centrale [21, 24]. La dopamina è un neurotrasmettitore utilizzato da alcune popolazioni neuronali del sistema nervoso centrale. Questi neuroni vanno a costituire le cosiddette "vie dopaminergiche".4

2

In particolare, i neuroni del locus ceruleus [20]. Inoltre, la corteccia della ghiandola surrenale sintetizza ormoni steroidei, come avremo modo di vedere (vedi sezione "Corticosteroidi: mineralcorticoidi e glucocorticoidi", pag. 142). 4 Le principali vie dopaminergiche sono la via nigrostriatale, la via mesocorticale e la via tuberoinfundibolare [5]. 3

85

3 Ormoni derivati da aminoacidi Biosintesi Le catecolamine vengono sintetizzate con la stessa sequenza di reazioni (Fig. 3.3, pag. 87.). Questa via è comune a tutte le catecolamine, ma una cellula può non esprimere tutti gli enzimi, il che determina quali catecolamine la cellula è in grado di produrre. Ad esempio, i neuroni postgangliari del sistema simpatico non esprimono l’ultimo enzima della via biosintetica, la fenoletanolammina-N-metiltransferasi (PNMT, di cui parleremo tra poco), che consentirebbe la conversione della noradrenalina in adrenalina; quindi la sintesi, non potendo proseguire, si ferma con la noradrenalina. Le cellule cromaffini della midollare del surrene esprimono la PNMT, quindi la noradrenalina può essere convertita in adrenalina con l’ultima reazione della via. Il precursore diretto per le catecolamine è l’aminoacido L-tirosina. Le cellule si procurano questo aminoacido precursore: • Dall’ambiente extracellulare, con meccanismi di trasporto attivo; • A partire dalla fenilalanina. La conversione è effettuata dall’enzima fenilalanina idrossilasi, una monossigenasi. La fenilalanina è un aminoacido essenziale. La tirosina viene convertita in adrenalina tramite quattro reazioni a sede citosolica: 1. Tirosina idrossilasi. L’enzima coinvolto è una ossigenasi che utilizza O2 per idrossilare la tirosina a livello dell’anello benzenico, convertendola in L-3,4diidrossifenilalanina (L-DOPA). L’enzima necessita di tetraidrobiopterina come cofattore; durante la reazione la tetraidrobiopterina viene ossidata a diidrobiopterina.5 Questa è la reazione limitante la velocità, e di conseguenza l’enzima rappresenta un punto di regolazione. 2. DOPA decarbossilasi (sinonimi: aminoacido aromatico decarbossilasi). L’enzima che catalizza questo secondo passaggio decarbossila la L-DOPA a dopamina, utilizzando piridossal fosfato come cofattore. Come succede per ogni decarbossilazione, la CO2 diffonde facilmente e si allontana dall’ambiente di reazione, spingendo l’equilibrio verso i prodotti per il principio di azione di massa. Per i neuroni dopaminergici del sistema nervoso centrale la via si ferma qui. Questi neuroni rilasciano direttamente dopamina (sono i neuroni delle vie dopaminergiche di cui sopra). 3. Dopamina β idrossilasi. L’enzima coinvolto è una monossigenasi a rame che utilizza come cofattore acido ascorbico e O2 per idrossilare la dopamina e produrre noradrenalina. È interessante notare come questo enzima sia stato ritrovato nella frazione particolata delle cellule impegnate nella sintesi di adrenalina. In altre 5

In particolare, la reazione catalizzata dalla tirosina idrossilasi produce 4-OH-tetraidrobiopterina, che si disidrata spontaneamente o enzimaticamente a diidrobiopterina. Il cofattore viene riciclato grazie all’enzima diidropteridina reduttasi (NADH dipendente), che rigenera tetraidrobiopterina.

86

3 Ormoni derivati da aminoacidi

HO

CH2 CH

COOH

H 2N

L-Tirosina Tetraidrobiopterina

+

O2

+

O2

Tirosina idrossilasi Diidrobiopterina HO HO

CH2 CH

COOH

H 2N

L-DOPA

DOPA decarbossilasi

Piridossal fosfato

CO 2

HO CH2 CH2 NH2

HO

Dopamina Acido ascorbico

Dopamina β idrossilasi Acido deidroascorbico HO HO

HC

CH2 NH2

HO

Noradrenalina S-adenosil-metionina

Feniletanolammina N-metiltransferasi

S-adenosil-omocisteina HO HO

HC

CH2 NH

HO

CH3

Adrenalina

Figura 3.3: Per le spiegazioni delle singole reazioni si rimanda al testo.

87

3 Ormoni derivati da aminoacidi parole, si pensa che sia incorporato all’interno dei granuli secretori, associato alla membrana, e che l’enzima venga secreto insieme alle catecolamine. Per quanto esistano sistemi di recupero dell’enzima, le cellule devono comunque tradurlo in continuazione. La singolare localizzazione dell’enzima implica che la conversione della dopamina a noradrenalina avvenga all’interno dei granuli secretori. La dopamina, che viene prodotta nel citosol, viene concentrata nelle vescicole secretorie con trasporto attivo. 4. Fenoletanolammina-N-metiltransferasi (PNMT). L’ultima reazione prevede la N-metilazione della noradrenalina ad adrenalina; il donatore del metile è la S-adenosilmetionina. La transmetilasi che catalizza questa tappa è idrosolubile, e si ritiene si trovi nel citoplasma: la noradrenalina esce quindi dai granuli con trasporto passivo, viene convertita in adrenalina, e viene reimmessa nei granuli con un trasporto attivo ATP-dipendente; in questo processo sono coinvolti trasportatori monoaminici delle vescicole. L’attività di PNMT è regolata da un imponente flusso di steroidi surrenalici, che giungono alle cellule della zona midollare attraverso il sistema di sinusoidi che mette in comunicazione le due zone. Si invita il lettore a prestare attenzione al fatto che ogni enzima di questa via utilizza un cofattore diverso. Secrezione e regolazione Abbiamo un sistema di regolazione a livello della biosintesi, un sistema di regolazione a livello della secrezione, e un sistema a livello recettoriale. Il principale sito di regolazione della biosintesi è rappresentato dall’enzima tirosina idrossilasi. I sistemi di regolazione sono essenzialmente tre: • una regolazione a feedback negativo da parte dei prodotti finali, la più importante; • regolazione positiva dal cAMP; • regolazione positiva da parte di stimoli nervosi. Le catecolamine, una volta sintetizzate secondo questo processo, vengono accumulate in granuli secretori, il cui rilascio è ovviamente controllato. Le cellule cromaffini rilasciano tre tipi di granuli: • granuli contenenti adrenalina; • granuli contenenti noradrenalina; • granuli contenenti adrenalina e noradrenalina.

88

3 Ormoni derivati da aminoacidi Questi granuli vengono secreti per esocitosi. Il segnale che induce il rilascio delle vescicole da parte delle cellule cromaffini della midollare surrenale è impartito da fibre nervose di neuroni pregangliari simpatici (nervo splancnico), che rilasciano acetilcolina. Legandosi a recettori sulle cellule cromaffini, si innesca una depolarizzazione della cellula che porta all’aumento di concentrazione di Ca2+ . L’aumento delle concentrazioni di Ca2+ plasmatico provoca l’esocitosi dei granuli. La secrezione di catecolamine è una risposta allo stress in senso lato: può essere innescata da una ferita, una emorragia, paura, etc. Il processo è simile anche per i neuroni che secernono noradrenalina o dopamina; il segnale è impartito da impulsi nervosi che, propagandosi lungo l’assone fino alle sinapsi, depolarizzano la cellula innescando l’ingresso di Ca2+ e quindi l’esocitosi. Una parte della regolazione degli effetti delle catecolamine avviene a livello dei recettori. Si può avere una regolazione negativa ed una regolazione positiva. La regolazione negativa corrisponde al processo di desensibilizzazione recettoriale: quando i recettori delle catecolamine vengono esposti in modo persistente e prolungato all’azione di una sostanza che li attiva (catecolamine o farmaci), subentrano dei fenomeni per cui la durata e l’efficacia della risposta sono progressivamente ridotte. La regione C-terminale intracellulare dei β recettori presenta dei siti di fosforilazione che sono fondamentali per questo processo di desensibilizzazione: il fenomeno è mediato dalla fosforilazione del recettore, che viene legato da una proteina inibitoria detta β-arrestina; agisce impedendo al recettore di attivare Gs. In altri casi, si ha l’internalizzazione dei recettori, o la inibizione della loro espressione genica. La regolazione positiva invece corrisponde ad un incremento della espressione di questi recettori; è indotto, per esempio, dagli ormoni tiroidei e dai glucocorticoidi Trasporto nel plasma e degradazione I neuroni che utilizzano le catecolammine come neurotrasmettitori rilasciano le molecole nello spazio sinaptico, quindi localmente – dopo essersi legate ai loro recettori vengono per lo più ricaptate (cioè riassorbite) dal neurone che le ha rilasciate, anche se una piccola parte sfugge e passa in circolo [10]. Le cellule della midollare surrenale invece rilasciano le catecolammine sintetizzate nella circolazione plasmatica, con valenza di ormoni endocrini. Nel plasma, le catecolamine hanno un’emivita estremamente breve (nell’ordine delle decine di secondi). Una frazione delle catecolamine che rappresenta circa la metà del totale circola associata all’albumina.

89

3 Ormoni derivati da aminoacidi HO

HO H

H

C

C

HO

H

HO

NH2

HO

Noradrenalina

MAO

C

C

HO

H

HO

NH2

H

OH

C

C

HO

H

HO

Normetanefrina

CH3O H

HO

COMT

CH3

H

H

C

C

HO

H

H N CH3

MAO PST

PST ADH

SO4

H

Metanefrina

DOPEG

MAO

CH3O

HO

H N

AR HO

H

C

COMT

MAO AR

H

H

C

Adrenalina

COMT

CH3O

H

H

H

C

C

HO

H

NH2

Normetanefrina solfato

ADH

ADH

CH3O

CH3O HO

H

O

C

C

HO

VMA

OH

SO4

H

H

C

C

HO

H

H N CH3

Metanefrina solfato

Urine Figura 3.4: Schema semplificato dei pathway che portano alla degradazione delle catecolamine. DOPEG: 3,4-diidrossi-fenilglicole (sinonimi: DHPG); VMA: acido 3-metossi-4-idrossi-mandelico (sinonimi: acido vanillil mandelico); COMT: catecol-O-metiltransferasi; MAO: monoaminoossidasi; ADH: Aldeide deidrogenasi; AR: aldeide reduttasi; PST: fenol sulfotransferasi.

La degradazione delle catecolamine non è semplice. In figura 3.4 (pag. 90) ne viene presentato uno schema semplificato.6 Le reazioni avvengono in parte nei siti stessi dove le catecolamine sono sintetizzate, in parte nei tessuti bersaglio, ma soprattutto nel fegato, ad opera di due enzimi: la catecol-O-metiltransferasi (COMT) e la monoamina ossidasi (MAO). • catecol-O-metiltransferasi (COMT). Catalizza una reazione di O-metilazione; il donatore di metili è la S-adenosilmetionina. • monoamina ossidasi (MAO). Catalizza una reazione di deaminazione ossidativa, ed ha come suoi principali substrati metanefrina, normetanefrina, adrenalina o noradrenalina. 6

Chi ha i nervi saldi può dare un’occhiata alla figura 3.5 a pag. 91 che non risparmia i dettagli più cruenti. . .

90

3 Ormoni derivati da aminoacidi HO

HO H

H

C

C

HO

H

HO

NH2

HO

Noradrenalina

MAO

H

C

C

HO

H

HO

C

HO

H

H N CH3

COMT

MAO

HO H

H

C

Adrenalina

COMT

CH3O

H

HO

NH2

H

O

C

C

CH3O H

HO

HO

DOPGAL

Normetanefrina

H

C

C

HO

H

H N CH3

Metanefrina

ADH

AR

HO

HO HO

H

H

OH

C

C

HO

H

H

HO

H

O

C

C

OH

HO

DOMA

DOPEG

COMT

CH3O HO

H

OH

C

C

HO

H

H

MOPEG

COMT

MAO

CH3O HO

H

O

C

C

H

HO

MAO

ADH

MOPGAL

ADH

PST CH3O HO

PST

H

O

C

C

OH

HO CH3O SO4

H

H

C

C

HO

H

VMA

CH3O SO4

NH2

Normetanefrina solfato

H

H

C

C

HO

H

H N CH3

Metanefrina solfato

Urine Figura 3.5: Schema dei pathway che portano alla degradazione delle catecolamine. DOPGAL: 3,4-diidrossi-fenilglicolaldeide (sinonimi: 3,4-diidrossi-mandelaldeide); DOMA: acido 3,4diidrossi-mandelico; DOPEG: 3,4-diidrossi-fenilglicole (sinonimi: DHPG); MOPEG: 3-metossi-4idrossi-feniletilenglicole; MOPGAL: 3-metossi-4-idrossifenilglicolaldeide; VMA: acido 3-metossi-4idrossi-mandelico (sinonimi: acido vanillil mandelico); COMT: catecol-O-metiltransferasi; MAO: monoaminoossidasi; ADH: Aldeide deidrogenasi; AR: aldeide reduttasi; PST: fenol sulfotransferasi.

91

3 Ormoni derivati da aminoacidi Questi due enzimi entrano in gioco in diverse tappe delle vie degradative. La sequenza esatta di reazioni è in parte tessuto-specifica (vedi dopo). • Adrenalina e noradrenalina possono essere deaminate ossidativamente (MAO) a un intermedio a breve emivita, che viene metabolizzato a composti alcolici o acidi più stabili. Per lo più viene prodotto DOPEG(3,4-diidrossi-fenilglicole). Queste reazioni avvengono già nei siti di produzione delle catecolamine (neuroni del simpatico, midollare del surrene), e la DOPEG poi passa in circolo. Raggiunge il fegato e altri tessuti e qui proseguono le reazioni. Questa molecola diviene substrato delle COMT e viene convertita in una aldeide instabile, che successivamente, con l’intervento dell’aldeide deidrogenasi che nel processo riduce NAD+ a NADH, porta alla formazione di acido vanillilmandelico (VMA), il principale prodotto dei pathway degradativi delle catecolamine. Viene poi escreto con le urine. Una parte del DOPEG (non mostrato in figura) può essere coniugata a solfato ed escreta in questa forma. • Adrenalina e noradrenalina possono essere metilate dalla COMT rispettivamente a metanefrina e normetanefrina. Successivamente: – possono essere coniugate da solfatasi a metanefrina e normetanefrina solfato, e poi escrete con le urine; – possono essere metabolizzate a VMA con l’intervento delle MAO e dell’aldeide deidrogenasi. La cosa più importante da ricordare è che esistono diversi possibili pathway che convergono su VMA e metanefrine, che sono i principali prodotti che si ritrovano nelle urine. La sequenza preferenziale di tappe metaboliche con cui questi metaboliti sono prodotti è diversa a seconda del sito di produzione [10]: • Catecolamine prodotte nella midollare del surrene: una parte delle catecolamine prodotte sono metabolizzate a metanefrine già nelle cellule midollari. Le metanefrine poi passano in circolo; • Catecolamine prodotti dai neuroni del simpatico: Il 10% delle catecolamine rilasciate nel terminale sinaptico passa in circolo; la restante parte viene ricaptata (riassorbita) dal terminale sinaptico e metabolizzata a DOPEG. Il DOPEG passa in circolo, raggiunge il fegato e altri tessuti e viene convertito in VMA che viene escreto con le urine; oppure viene coniugato a solfato ed escreto con le urine. • Le catecolamine rilasciate in circolo (sia quelle sfuggite dalle sinapsi che quelle rilasciate in circolo come ormoni endocrini dalla midollare surrenale) vengono

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3 Ormoni derivati da aminoacidi HO HO

CH2 CH2 NH2

Dopamina

COMT

MAO

H3CO

HO HO

HO

CH2 COOH

DOPAC

CH2 CH2 NH2

3-Metossitiramina

MAO COMT ADH

H3CO HO

CH2 COOH

HVA

Figura 3.6: Schema delle reazioni degradative della dopamina. DOPAC: acido 3,4diidrossifenilacetico; HVA: acido omovanillico; COMT: catecol-O-metiltransferasi; MAO: monoaminoossidasi; ADH: Aldeide deidrogenasi.

per la maggior parte convertite in DOPEG e poi in VMA che viene escreto con le urine. Una minor parte è convertita in metanefrine da una forma circolante di COMT, che però è poco attiva. • Le metanefrine in circolo (rilasciate dalla midollare surrenale o prodotte dalle catecolamine) vengono soprattutto coniugate con gruppi solfato e poi escrete con le urine. La dopamina produce, con reazioni simili, acido omovanillico, HVA (fig. 3.6). La sua degradazione avviene principalmente nei neuroni, attraverso le MAO, producendo DOPAC e poi acido omovanillico. Il DOPAC e l’HVA sono poi escreti con le urine. Recettori ed effetti fisiologici La risposta biologica evocata dalle catecolamine è mediata da recettori accoppiati a proteine G. La trasduzione del segnale di adrenalina e noradrenalina (e la risultante azione fisiologica) è sicuramente tra le più complesse che vedremo, poiché esistono diversi recettori, che in alcuni casi mediano effetti opposti, e che sono espressi in maniera tessuto-specifica. Si distinguono innanzi tutto:

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3 Ormoni derivati da aminoacidi • Recettori adrenergici: vi si legano tendenzialmente epinefrina e norepinefrina; sono espressi in moltissimi tessuti, tra cui miocardio, tessuto muscolare striato scheletrico e liscio (in specie nel tratto digerente), fegato, tessuto adiposo, tessuto nervoso, rene. È opportuno ricordare che le catecolamine rilasciate dalla midollare del surrene hanno una valenza endocrina, e non agiscono a livello encefalico (a causa della barriera emato-encefalica); viceversa, le catecolamine rilasciate a livello encefalico hanno valenza di neurotrasmettitori. • recettori dopaminergici: vi si lega tendenzialmente la dopamina; sono espressi a livello encefalico e da alcuni tessuti periferici. I recettori adrenergici sono ulteriormente suddivisi sulla base del tipo di subunità della proteina G che presentano e della capacità di legare alcune molecole agoniste e antagoniste in diversi tipi e sottotipi.7 • recettori α – recettori α1 ; – recettori α2 ; • recettori β – recettori β1 ; – recettori β2 ; – recettori β3 . Gli effetti che mediano sono eterogenei, talora ridondanti e talora contrastanti, ma si può vedere negli effetti scatenati dalla secrezione di catecolamine un significato biologico: in generale siamo in presenza di effetti che hanno la funzione di predisporre l’organismo al combattimento, o, in alternativa, a fuggire il più velocemente possibile (reazioni "fight or flight "). Si può cioè pensare che questi ormoni abbiano il ruolo di preparare l’organismo ad affrontare situazioni di "emergenza", inducendo uno stato di allerta, predisponendo a prestazioni psicofisiche intense e mobilizzando riserve a livello di fegato e tessuto adiposo, per assicurare la disponibilità di substrati energetici rapidamente utilizzabili.

7

Nell’ambito dei recettori α1 e α2 , grazie allo sviluppo della biologia molecolare, sono stati riconosciuti ulteriori sottotipi ( α1A , α1B , α1D e α2A , α2B , α2C ) tuttavia non ne parleremo molto. Chi fosse interessato può consultare un testo di farmacologia, per esempio: L. Brunton, B. Chabner e B. Knollman. Goodman and Gilman’s The Pharmacological Basis of Therapeutics. Twelfth Edition. McGraw-Hill, 2010.

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3 Ormoni derivati da aminoacidi

Recettori α1 α2 β1 β2 β3

Potenza relativa dell’agonista

Proteine G

Noradrenalina > adrenalina Noradrenalina ≥ adrenalina Adrenalina ≈ noradrenalina Adrenalina >>> noradrenalina Noradrenalina > adrenalina

G αq G αi o G0 G αs G αs G αs

Tabella 3.1: Affinità dei recettori adrenergici per adrenalina e noradrenalina.

Alcuni tra questi recettori mediano effetti opposti, pur essendo espressi nello stesso tessuto. La presenza dei recettori con effetti opposti serve per modulare la risposta biologica, in base (1) all’affinità del singolo ormone per i diversi recettori (tabella 3.1) e (2) alla quantità di recettori presenti in un dato tessuto. Per esempio, i recettori α1 (che provocano vasocostrizione) hanno più affinità per la noradrenalina che per l’adrenalina, mentre per i recettori β2 (che provocano vasodilatazione) è vero il contrario: sono più affini per l’adrenalina che per la noradrenalina. Quindi, quando l’adrenalina è secreta nel circolo sanguigno in basse concentrazioni, si legherà preferenzialmente ai β2 e non agli α1 , e quindi prevarrà la vasodilatazione (infatti l’adrenalina in basse concentrazioni provoca vasodilatazione, con un lieve abbassamento della pressione arteriosa). Tuttavia, quando l’adrenalina è presente in alte concentrazioni, si lega anche agli α1 , che essendo più numerosi, vedono il loro effetto prevalere (vasocostrizione). Un terzo fattore che contribuisce alla modulazione della risposta biologica (oggettivamente complessa) è la diversa proporzione di catecolamine nel sangue: la noradrenalina costituisce circa il 10% delle catecolamina secrete nel sangue dalla midollare nel surrene. Tutti i recettori adrenergici sono GPCR, recettori accoppiati a proteine G eterotrimeriche. Ciascun sottotipo è connesso preferenzialmente a una classe di G proteine. Strutturalmente, i varii recettori sono relativamente simili tra loro (tra i recettori α e β c’è il 30-40% di omologia di sequenza). Nell’elenco qui di seguito prenderemo in esame i loro effetti principali – tenendo presente che non sono gli unici. Recettori α1 adrenergici presentano subunità G αq . Attivano la fosfolipasi C, sfruttando il pathway DAG-PKC-IP3 -Ca2+ . Attivano anche la fosfolipasi A2 , e modulano alcuni trasportatori ionici (es. canali del K+ , scambiatori Na+ /H+ , pompe del Ca2+ ... probabilmente attraverso la fosforilazione da parte della PKC) [5]. Presentano maggiore affinità per la noradrenalina rispetto alla adrenalina. Si ammette l’esistenza di almeno tre sottotipi di recettori α1 ( α1A , α1B e α1D ), con

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3 Ormoni derivati da aminoacidi alcune differenze nella distribuzione tissutale.8 Sono espressi soprattutto da muscolatura liscia, dalle cellule epatiche e dalle cellule cardiache. Quando vi si lega un agonista innescano: • la contrazione del muscolo liscio a livello di vasi (vasocostrizione) e bronchi, e in tutto il tratto genito-urinario: sono i recettori in gran parte responsabili della contrazione della muscolatura liscia a seguito di una stimolazione simpatica. Questo può essere spiegato dall’aumento di concentrazione del Ca2+ intracellulare, che, attivando proteine calcio-dipendenti (su tutte, la chinasi delle catene leggere della miosina calmodulina-dipendente), avviano la contrazione muscolare; • rilasciamento muscolare a livello del muscolo liscio del tratto gastrointestinale [25];9 • dilatazione della pupilla (midriasi);10 • Nel fegato mediano un aumento della glicogenolisi e della gluconeogenesi, che rende disponibile glucosio [41, 9]; • promuovono la crescita delle cellule cardiache e influenzano la struttura del miocardio. Recettori α2 adrenergici Sono caratterizzati da una subunità G αi o G0. Possono attivare diversi pathway: tendenzialmente mediano l’inattivazione della adenilato ciclasi, e quindi un decremento della concentrazione intracellulare di cAMP con inattivazione della PKA. Possono anche attivare o inibire diversi canali ionici, nonché la via delle MAPK, ma il significato fisiologico di questi pathway non è chiaro. Hanno maggiore affinità per la noradrenalina. Sono espressi soprattutto dai neuroni (in particolare, neuroni facenti parte del sistema simpatico, dove si trovano a livello presinaptico), dalla muscolatura liscia del tratto gastrointestinale e dei vasi, dalle cellule β del pancreas, dagli adipociti e dalle piastrine. Provocano:

8

Per esempio, nel miocardio sono espressi prevalentemente gli α1A e α1B , mentre gli α1D sono espressi dalle cellule delle arterie coronariche) [17, 18]. 9 Forse provocata da una iperpolarizzazione della cellula, innescata dall’attivazione di canali del K+ Ca2+ dipendenti. 10 In questo modo la funzione visiva è permessa anche in condizioni di scarsa luminosità.

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3 Ormoni derivati da aminoacidi • rilassamento della muscolatura del tratto gastrointestinale (tranne che a livello degli sfinteri), con una maggiore potenza rispetto ai recettori α1 [25, 6]; • vasocostrizione a livello della muscolatura liscia dei vasi; • inibizione della lipolisi nel tessuto adiposo; • inibizione della secrezione di insulina pancreatica; • incremento dell’aggregazione piastrinica; • induzione del rilascio di glucagone [14]; • influenzano il rilascio di neurotrasmettitori. Sembrano inibire il rilascio di noradrenalina, riducendo quindi il tono simpatico – un meccanismo di feedback negativo. Recettori β1 adrenergici Sfruttano una subunità G αs. Il pathway che viene attivato dunque è quello della stimolazione della adenilato ciclasi, con aumento di cAMP intracellulare e attivazione della PKA, che fosforila molte proteine intracellulari. Questi recettori sono espressi in particolare a livello miocardico, ma anche da adipociti, rene, muscolo scheletrico, neuroni del sistema nervoso centrale. Sembrano avere una affinità simile per adrenalina e noradrenalina. Promuovono i seguenti effetti: • incremento della forza e della frequenza di contrazione cardiaca; incremento della velocità di conduzione cardiaca; incremento della velocità di rilassamento.11 Questo effetto è molto importante: vediamo come avviene [3]. L’aumento della concentrazione di cAMP attiva la PKA, che fosforila una proteina sarcolemmale chiamata p27. Questo porta ad un aumentato ingresso di calcio attraverso i canali del calcio voltage-gated di tipo L; a sua volta questo porta a un incremento del rilascio di calcio dai recettori della rianodina a livello del reticolo sarcoplasmatico, che vengono inoltre fosforilati (calcium-induced calcium release). Dunque la concentrazione di calcio intracitoplasmatica raggiunge un picco più elevato e sale più rapidamente. Questo consente un maggior numero di interazioni calcio-troponina C, che inducono un maggior numero di molecole di tropomiosina a cambiare 11

In fisiologia cardiovascolare, si parla di inotropismo quando ci si riferisce alla forza di contrazione cardiaca, cronotropismo quando si parla della frequenza di contrazione, dromotropismo per la velocità di conduzione, e lusitropismo quando si parla della velocità di rilasciamento. Quindi gli effetti dei recettori β1 possono essere descritti anche come effetto inotropo positivo, cronotropo positivo, dromotropo positivo e lusitropo positivo.

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3 Ormoni derivati da aminoacidi conformazione e diventare permissive per l’interazione di actina e miosina. Questo si traduce in un maggior numero di cross bridge, ed è il corrispettivo molecolare dell’effetto inotropo positivo. L’effetto cronotropo positivo è mediato dall’aumento di velocità della depolarizzazione spontanea delle cellule del nodo del seno, che raggiungono più rapidamente la soglia per l’inizio del potenziale d’azione. L’effetto lusitropo (aumento della velocità di rilassamento) è mediato dalla fosforilazione (da parte della PKA) del fosfolambano e della troponina I. • stimolazione della lipolisi a livello del tessuto adiposo; questo effetto è dovuto alla fosforilazione delle perilipine, che espongono la goccia lipidica, e fosforilazione della lipasi, che incrementa la propria attività. • incremento del rilascio di renina, che attiva il sistema renina angiotensina. Il sistema renina-angiotensina è un sistema omeostatico che contribuisce a regolare la pressione sanguigna. La renina è in grado di tagliare l’angiotensinogeno, prodotto dal fegato, e convertirlo in angiotensina I, che viene ulteriormente processata ad angiotensina II. Quest’ultima molecola concerta la modulazione di un gran numero di processi fisiologici, che hanno come risultato ultimo l’incremento della pressione sanguigna. • incremento della velocità di conduzione nervosa nei neuroni [10]. Recettori β2 adrenergici Come gli altri recettori β sono dotati di una subunità G αs. Presentano una spiccata affinità per l’adrenalina. Sono espressi a livello della muscolatura liscia dei bronchi e del tratto gastrointestinale, nonché dei vasi; si trovano anche nel fegato, in alcune aree cerebrali, e nelle cellule di cuore, rene, muscolatura scheletrica. Mediano: • Rilassamento della muscolatura liscia (con vaso- e broncodilatazione, rilassamento della muscolatura gastrointestinale, etc.) – sono i principali recettori coinvolti nel miorilassamento a livello di questi distretti. Sono responsabili di vasodilatazione delle arteriole della muscolatura scheletrica, dell’arteria epatica e delle coronarie [10]. • Stimolazione della glicogenolisi associata ad inibizione della glicogenosintesi nel muscolo scheletrico; • Induzione della gluconeogenesi e della glicogenolisi nel fegato, con inibizione di glicogenosintesi e glicolisi [7].

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3 Ormoni derivati da aminoacidi Recettori β3 Sfruttano lo stesso pathway degli altri β recettori (subunità G αs). Sono espressi principalmente a livello del tessuto adiposo, del muscolo scheletrico, del cuore, e in minor misura altri tessuti (es. tratto gastrointestinale). • regolano la termogenesi nel muscolo scheletrico; • incrementano la lipolisi nel tessuto adiposo. Cerchiamo di ricapitolare l’espressione di questi recettori a livello dei varii tessuti: • Miocardio: esprime prevalentemente recettori β1 , che ne stimolano la forza, la frequenza di contrazione e la velocità di conduzione; c’è anche una popolazione di altri recettori (es. β2 ) ma sono meno importanti. • Muscolatura liscia di vasi: questo tessuto esprime prevalentemente recettori α1 ; i recettori α2 e β2 sono espressi soprattutto sui vasi dei muscoli scheletrici e delle coronarie. In caso di attivazione degli α1 , abbiamo vasocostrizione (con conseguente effetto ipertensivo); nel caso degli α2 e dei β2 , vasodilatazione (che porta ad un aumento di irrorazione sanguigna). • Muscolatura liscia del tratto gastrointestinale: esprime α1 , α2 e β2 , che quando attivati provocano rilasciamento della muscolatura. Questo fa sì che la digestione si arresti temporaneamente; la funzione di questo effetto fisiologico è quella di impedire l’utilizzo di risorse metaboliche in processi che non sono essenziali (o quantomeno, non essenziali di fronte ad un pericolo mortale). Notare che gli sfinteri esprimono recettori α1 , che in queste strutture portano a contrazione. • Muscolatura liscia dei bronchi: esprime soprattutto il recettore β2 , che porta a rilasciamento muscolare (broncodilatazione). • Fegato: Gli epatociti espongono sulle loro membrane soprattutto i recettori α1 e β2 , che in questo tessuto determinano principalmente effetti sul metabolismo glucidico. In particolare, inibiscono la sintesi del glicogeno (inibendo la glicogeno sintasi) e ne promuovono la degradazione per rilasciare glucosio (attivando la glicogeno fosforilasi). Inibiscono anche la glicolisi e stimolano la gluconeogenesi. Il perché l’evoluzione abbia selezionato questo effetto è intuitivo: in momenti di pericolo, cioè quando si deve essere pronti a fuggire oppure combattere, il glucosio deve essere disponibile. L’adrenalina influenza anche il metabolismo lipidico, agendo (come l’altro principale ormone catabolico, il glucagone) tramite la fosforilazione di diversi enzimi chiave. Tra questi, la acetil-coA carbossilasi (che viene inibita, arrestando la sintesi degli acidi grassi). • Rene: in questo organo si osserva una espressione prevalente del recettore β1 , attraverso il quale lo stimolo ormonale induce secrezione di renina. Attraverso

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3 Ormoni derivati da aminoacidi una serie di reazioni che complessivamente sono parte del cosiddetto "sistema renina-angiotensina", viene attivata l’angiotensina II. Questo è di fatto un ormone che produce una serie di effetti volti ad incrementare la pressione sanguigna. • Tratto genitourinario: esprime recettori α2 (stimolano la contrazione di uretra e vescica) e β2 (provocano il rilassamento della vescica). • Tessuto adiposo: viene espresso soprattutto il recettore β3 , che quando attivato dal legame con l’ormone media segnali intracellulari che culminano nella attivazione della lipolisi. Esprime anche gli α1 , i β1 ed i β2 (che incrementano la lipolisi) e gli α2 (che la inibiscono). • Occhio: esprime recettori α1 , che portano a dilatazione pupillare (midriasi). Per quanto riguarda i recettori della dopamina, attualmente se ne conoscono 5 (D1 , D2 , D3 , D4 , D5 ); sono solitamente suddivisi in due gruppi sulla base di affinità nella sequenza aminoacidica e delle loro proprietà farmacologiche: • D1 -like – D1 ; – D5 ; • D2 -like – D2 ; – D3 ; – D4 . Sono tutti GPCR, ma i D1 -like attivano proteine GS (aumento dell’cAMP), mentre i D2 -like attivano proteine GI/O e varii sistemi segnalatori (portano ad una diminuzione del cAMP e alla modulazione di diversi canali ionici). Sono espressi nel sistema nervoso centrale e in alcuni tessuti periferici (cuore e vasi, rene, retina). Non parleremo delle loro funzioni e della loro distribuzione nell’SNC, che sono molto complesse.12 Tra gli effetti più importanti della dopamina al di fuori del sistema nervoso centrale: • modula la perfusione e la funzione renale; • incrementa la secrezione di renina (attivazione del sistema renina-angiotensina!) • modula la secrezione di catecolamine dalla midollare surrenale; 12

Chi fosse interessato può consultare un testo di neurofisiologia. Un classico è E. Kandel et al. Principles of Neural Science. Fifth Edition. McGraw-Hill, 2012.

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3 Ormoni derivati da aminoacidi • è il principale regolatore della secrezione di prolattina, attraverso recettori D2 espressi dalle cellule lattotrope. Viene secreto dall’ipotalamo, e inibisce tonicamente il rilascio di questo ormone. Ad alte concentrazioni, la dopamina è in grado di attivare i recettori β e α adrenergici. Nel sistema nervoso centrale, la dopamina è coinvolta nella regolazione del movimento, nella generazione della sensazione di gratificazione, e in alcune funzioni cognitive. Si ritiene coinvolta nella genesi di diverse patologie neurologiche e psichiatriche come il morbo di Parkinson, la schizofrenia, la dipendenza da sostanze. Correlazioni cliniche: Feocromocitoma Il feocromocitoma è un tumore delle cellule cromaffini della midollare del surrene (può insorgere anche dalle cellule dei paragangli del sistema simpatico, e in tal caso viene chiamato paraganglioma). Il feocromocitoma può produrre e rilasciare in circolo catecolammine, di solito in maniera episodica. Questo può portare a una sintomatologia molto varia che richiama ad una iperattività del simpatico: da una ipertensione costante e resistente alle terapie a crisi ipertensive episodiche; palpitazioni; irrequietezza; sudorazione; cefalea; insonnia; iperglicemia; può anche simulare degli attacchi di panico.

3.3 Ormoni della tiroide Dove siamo? Tiroide La tiroide è una ghiandola situata nel collo (figura 3.7, pag. 102). Avvolge la parte anteriore della trachea, al di sotto della cartilagine tiroidea. È composta da due lobi uniti da una porzione ristretta detta istmo. Microscopicamente è composta da follicoli, formazioni sferoidali di cellule disposte a circondare una cavità follicolare, che può essere, a seconda del momento fisiologico, colma di una sostanza detta colloide. La tiroide può essere dunque immaginata come composta da tante piccole “cisti”. Le popolazioni cellulari essenzialmente sono:

101

3 Ormoni derivati da aminoacidi

Figura 3.7: La tiroide è una ghiandola situata a livello del collo, composta da due lobi collegati da un istmo. Microscopicamente, è composta da piccole strutture grossolamente sferoidali (follicoli), contenenti un materiale PAS positivo noto come colloide. Le cellule follicolari delimitano il lume dei follicoli.

• Cellule follicolari: delimitano il lume dei follicoli, sono coinvolte nella sintesi della colloide e degli ormoni tiroidei; • Cellule C: non sono in contatto con il lume dei follicoli, sono coinvolte nella sintesi di calcitonina. • Altri citotipi: cellule endoteliali che delimitano i vasi, fibroblasti, adipociti, etc.

3.3.1 Triiodotironina e tetraiodotironina Struttura Gli ormoni tiroidei sono la triiodotironina (T3 ) e la tetraiodotironina (T4 ). Lipofili, derivano anch’essi, come le catecolamine, dall’aminoacido tirosina (o, indirettamente, dalla fenilalanina), e nella loro costituzione entra a far parte in maniera significativa lo iodio (Fig. 3.8, pag. 103). Sede di elaborazione Gli ormoni tiroidei vengono sintetizzati dalle cellule follicolari tiroidee (sinonimi: tireociti).

102

3 Ormoni derivati da aminoacidi OH

OH I

O

OH

O

I

CH2 HC

NH2

COOH

Tirosina

I

CH2 HC

I

I

NH2

I

I

CH2 HC

NH2

COOH

COOH

T3

T4

Figura 3.8: Struttura degli ormoni tiroidei; da notare le somiglianze con la struttura del loro precursore, l’aminoacido tirosina.

Biosintesi Per formare gli ormoni tiroidei i tireociti devono combinare due molecole di tirosina iodinate in posizioni particolari. Per le cellule follicolari dunque si presentano diverse necessità, peculiari rispetto ad altre cellule nel corpo umano: • devono raccogliere e concentrare in gran quantità lo iodio, che è un elemento relativamente poco abbondante, se non raro in alcune parti del mondo; • devono modificare la tirosina e iodinarla; • devono complessare tra loro diverse tirosine modificate e iodate a formare i due ormoni tiroidei. Durante l’evoluzione si è sviluppato un processo di sintesi piuttosto peculiare. Le cellule follicolari accumulano grandissime quantità di iodio; sintetizzano poi una proteina, la tiroglobulina, molto ricca di residui di tirosina, che viene sfruttata come un supporto o una impalcatura molecolare per effettuare le modifiche alla tirosina a livello del versante extracellulare della membrana plasmatica apicale13 e successivamente l’unione dei residui di tirosina modificati. Queste reazioni rappresentano i primi passaggi della biosintesi. Il processo viene interrotto, e la tiroglobulina rimane nelle cavità follicolari, conservata sotto forma di colloide; quando arriva lo stimolo per la secrezione, la colloide viene riassorbita, e la tiroglobulina ritorna ad essere il supporto molecolare dove si completano gli ultimi passaggi della biosintesi con i quali i due ormoni vengono liberati. La tiroglobulina deve essere degradata perché i due ormoni siano liberati. 13

Cioè il versante rivolto verso la cavità follicolare.

103

3 Ormoni derivati da aminoacidi L’ormone TSH (Thyroid Stimulating Hormone) controlla sia la sintesi che il rilascio degli ormoni tiroidei; ne esamineremo l’azione più avanti. La figura 3.12 (pag. 108) riassume la biosintesi nel suo complesso. Sarà più facile comprendere il procedimento biosintetico facendo riferimento allo schema. Abbiamo detto che l’impalcatura molecolare a livello della quale avviene gran parte della biosintesi degli ormoni tiroidei è la tiroglobulina. Si tratta di una glicoproteina composta da due subunità, del peso molecolare di 660 kDa; è formata da circa 5000 residui aminoacidi, di cui 115 sono costituiti da tirosina. Ciascuno di questi 115 residui è virtualmente nelle condizioni di essere iodinato. La tiroglobulina viene tradotta a livello della porzione basale delle cellule follicolari. Successivamente, passa attraverso RER e Golgi, dove subisce la glicosilazione (la componente carboidratica al termine delle modifiche post traduzionali rappresenta circa il 10% del peso molecolare della proteina). Racchiusa in vescicole che gemmano dal Golgi, viene esocitata a livello della porzione apicale delle cellule, cioè nel lume follicolare. È qui che avviene la iodinazione dei residui di tirosina. Da dove proviene lo iodio? Le cellule follicolari si sono specializzate nel concentrare al loro interno lo iodio: si stima che la concentrazione dello ione ioduro nel loro citoplasma sia 25-30 volte maggiore della concentrazione plasmatica.14 Lo iodio deriva: • in parte dalla dieta: sale, alimenti marini, piante cresciute in terreni ricchi di iodio...; • in parte dal riciclaggio dello iodio che le cellule non sono riuscite ad incorporare negli ormoni (questo processo sarà esaminato successivamente). Lo iodio esogeno viene concentrato nelle cellule con un sistema di trasporto attivo, sfruttando una pompa di trasporto Na+ -K+ ATP-dipendente, associata ad un simporto Na+ -I- chiamato NIS. Questa proteina è espressa tipicamente dalle cellule tiroidee ed esposta a livello della membrana basolaterale.15 Il meccanismo con cui si attua questo trasporto (“intrappolamento dello ioduro”) è il seguente: lo iodio entra nella cellula contro gradiente (lo iodio è più concentrato dentro la cellula che fuori), a livello della membrana basolaterale, insieme a due ioni Na+ che invece si muovono secondo gradiente (il Na+ è più concentrato nel liquido extracellulare che all’interno della cellula). Il gradiente di sodio che sostiene il processo 14

Un fatto peraltro sfruttato per la valutazione della tiroide in medicina nucleare. È possibile visualizzane le alterazioni funzionali tramite un radioisotopo dello iodio, che viene concentrato esclusivamente nella ghiandola e può essere tracciato perché emette radiazioni. Si possono così mettere in evidenza regioni della ghiandola che non concentrano correttamente lo iodio o che viceversa lo concentrano eccessivamente. 15 Ma viene espresso anche da altri tessuti, a bassi livelli (placenta, ghiandole salivari, mammella).

104

3 Ormoni derivati da aminoacidi è mantenuto grazie alla Na+ -K+ ATP-dipendente. L’espressione del gene di NIS è inibita dallo iodio e promossa dal TSH. Una volta nel citoplasma, lo iodio appena trasportato, insieme allo iodio riciclato, si sposta verso la membrana apicale, dove viene trasportato nel lume grazie ad un canale per lo iodio che aumenta la permeabilità della membrana per questo ione. Abbiamo quindi visto come lo ioduro sia stato trasportato nel lume del follicolo, dove sono presenti anche le tiroglobuline, con i loro residui di tirosina esposti. Può avvenire quindi l’organicazione dello iodio. L’organicazione dello iodio richiede la sua ossidazione, perché I- ha gli orbitali completi e non forma legami. La reazione è catalizzata dall’enzima tireoperossidasi, una proteina tetramerica contenente un gruppo eme, localizzata a livello del versante extracellulare della membrana apicale delle cellule follicolari. Questo enzima ossida lo ioduro riducendo H2 O2 ad H2 O. Il perossido di idrogeno necessario per questa reazione è fornito da una flavoproteina NADPH-dipendente.16 Lo iodio ossidato viene legato al carbonio 3 oppure sia al carbonio 3 sia al carbonio 5 dell’anello fenilico dei residui di tirosina, producendo rispettivamente 3-monoiodotirosina (MIT) o 3,5-diiodotirosina (DIT) (Fig. 3.9, pag. 106; fig. 3.10, pag. 106.). Lo stesso enzima tireoperossidasi è in grado di condensare tra loro MIT e DIT in due diverse combinazioni, a produrre triiodotironina (T3 ) e tetraiodotironina (T4 ) (Fig. 3.11, pag. 107). “Tironina” identifica il composto originatosi dalla unione di due molecole di tirosina. La reazione consiste nel trasferimento di gruppi monoiodofenolici o diiodofenolici, provenienti rispettivamente da una MIT o una DIT, sui gruppi monoe diiodofenolici di altri residui di MIT e DIT. Quindi, prima le tirosine vengono iodinate, e poi complessate insieme. Queste condensazioni possono avvenire tra MIT e DIT nell’ambito della stessa tiroglobulina, o tra MIT e DIT di tiroglobuline vicine. Notare che sia T3 che T4 rimangono in questa fase covalentemente legati alla tireoglobulina. Non tutte le MIT e le DIT riescono ad essere condensate, cosìcché le tiroglobuline del lume follicolare, che costituiscono la colloide, tipicamente contengono MIT, DIT (il 70% circa delle tirosine è in una di queste due forme), T3 e T4 (30%). La tetraiodotironina è molto più abbondante della triiodotironina (il rapporto è di circa 7:1). Gli ormoni tiroidei sono conservati in questa forma fino a che non giunge lo stimolo del TSH ipofisario. A questo punto, le cellule follicolari riassorbono la colloide mediante endocitosi. Le vescicole così formatesi, contenenti tiroglobulina, si fondono all’interno della cellula con lisosomi, le cui proteasi degradano la tiroglobulina nei suoi aminoacidi costituenti, e quindi rilasciando MIT, DIT, T3 e T4 . Questi ultimi vengono 16

Questo è, peraltro, un esempio di una condizione fisiologica in cui per la cellula si rende necessario produrre ROS.

105

3 Ormoni derivati da aminoacidi

R CH2

I

I OH

CH2

+

I-

H

+

O

O H

OH

tireoperossidasi

R

3,5-diiodotirosina (DIT) H

+

O H

R CH2

Residuo di tirosina

I OH

3-monoiodotirosina (MIT)

Figura 3.9: Formazione di MIT e DIT. Lo ioduro viene ossidato e poi legato al carbonio 3 oppure sia al carbonio 3 sia al carbonio 5 dell’anello fenilico dei residui di tirosina della tireoglobulina, producendo rispettivamente 3-monoiodotirosina (MIT) o 3,5-diiodotirosina (DIT). Questa reazione è extracellulare ed avviene a livello del versante apicale delle cellule follicolari tiroidee (cioè il lato che aggetta nel lume del follicolo).

OH

OH I

CH2 HC

NH2

COOH

I

I

CH2 HC

NH2

COOH

3-monoiodotirosina

3,5-diiodotirosina

(MIT)

(DIT)

Figura 3.10: Struttura di MIT e DIT.

106

3 Ormoni derivati da aminoacidi O

O NH

NH

CH2

NH

NH CH3

O

O

OH I

I

OH

3-monoiodotirosina (MIT)

OH

+

O

+

I

I

I

I

tireoperossidasi CH2 NH

O

NH O

3,5-diiodotirosina (DIT)

CH2 NH

O

NH O

Triiodotirosina (T3 )

Figura 3.11: Fusione di MIT e DIT. La reazione consiste nel trasferimento di gruppi monoiodofenolici o diiodofenolici, provenienti rispettivamente da una MIT o una DIT, sui gruppi mono- e diiodofenolici di altri residui di MIT e DIT. Questa reazione, che forma T3 e T4 , è extracellulare ed avviene a livello del versante apicale delle cellule follicolari tiroidee (cioè il lato che aggetta nel lume del follicolo).

secreti a livello della membrana basolaterale, mentre MIT e DIT vengono deiodinati. questo è il processo di riciclaggio che consente alle cellule di riutilizzare lo iodio per iodinare nuove tiroglobuline. La reazione è catalizzata dall’enzima deiodinasi, che utilizza NADPH. Secrezione e regolazione La regolazione è essenzialmente a carico del TSH ipofiario, o ormone tireostimolante. Quest’ultimo è un ormone glicoproteico dell’asse ipotalamoipofisi, ed è stimolato a sua volta dal releasing hormone ipotalamico. Il TSH agisce legandosi a recettori accoppiati a proteine G; a valle, avviene la stimolazione della adenilato ciclasi, con aumento della concentrazione di cAMP. La regolazione esplicata dal TSH si evidenzia con effetti a breve e a lungo termine. Gli effetti a breve termine prevedono una stimolazione di tutte le tappe della biosintesi: • aumento dell’uptake di iodio e della sua organicazione; • promozione del trasporto intracellulare e dell’attività degli enzimi coinvolti; • stimola la secrezione ed il processamento della tiroglobulina. Con gli effetti a lungo termine, il TSH upregola l’espressione genica: • del simporto Na/I, responsabile della concentrazione dello iodio nei tireociti; • della tireoglobulina e della perossidasi tiroidea;

107

3 Ormoni derivati da aminoacidi

I-

Tireoperossidasi TYR

TYR

I-

DIT

TYR

DIT

T4

TYR

DIT

TYR

DIT

MIT

TYR

Tireoglobulina

MIT

MIT DIT

TYR TYR

Pendrina

TYR

T3

Residuo di tirosina

TYR

5

4

Na

+

K

+

II-

+

Na -K

I-

Na

+

K

+

ATPasi

+

I-

Na

+

I-

Na

+

NIS

5

4

2

I-

6

3

7 1

MIT

I-

MIT DIT

Na

+

K

DIT T4

T3

+

8

9

I-

Na

+

K

+

T3

T4

Figura 3.12: La figura mostra una tipica cellula follicolare tiroidea. (1) La tireoglobulina viene sintetizzata e, dopo essere passata dal RER e dall’apparato del Golgi, (2) viene esocitata nel lume follicolare, dove forma la colloide. (3) Nel frattempo anche lo iodio viene trasportato nel lume follicolare. (4) L’organicazione dello iodio produce MIT e DIT a partire dai residui di tirosina, (5) che vengono fusi a formare T3 e T4 ; entrambi i processi sono catalizzati dalla tireoperossidasi. Nel riquadro sono illustrati a maggior ingrandimento. Quando le cellule tiroidee ricevono lo stimolo a secernere gli ormoni, (6) la colloide viene riassorbita. (7) All’interno della cellula avviene la fusione con i lisosomi, in seguito alla quale la tireoglobulina viene degradata, liberando i residui di MIT e DIT non fusi, T3 e T4 . I primi sono degradati, e lo iodio viene riciclato (8);gli ormoni sono secreti (9).

108

3 Ormoni derivati da aminoacidi • Inoltre, aumenta il flusso ematico che giunge alla tiroide e promuove il trofismo dei tireociti. Gli ormoni tiroidei, in particolare la T3 originata a livello ipofisario, inibiscono tramite feedback negativo la secrezione di TSH; a livello dell’ipotalamo, inibiscono la secrezione di TRH. Un meccanismo di regolazione TSH-indipendente che è importante citare consiste nel cosiddetto effetto Wolff-Chaikoff. Quando la concentrazione di iodio circolante è estremamente elevata, l’organicazione dello iodio nel follicolo tiroideo viene autoinibita per downregolazione dell’espressione della tireoperossidasi, e con essa la secrezione degli ormoni. In genere, l’attività riprende dopo alcuni giorni in seguito a fenomeni non del tutto chiari. Trasporto nel plasma e degradazione A livello della tiroide viene prodotto molto più T4 che T3 . Considerando i livelli totali, T4 ha una concentrazione 40 volte maggiore rispetto a T3 . È necessario comunque tener presente che quasi tutte le molecole di ormone in circolo, essendo lipofile, risultano legate a tre proteine. Ciò condiziona la loro concentrazione “effettiva”, in quanto solo l’ormone libero è in grado di interagire con i recettori e quindi esercitare un effetto biologico. Solo lo 0,3% degli ormoni tiroidei circola libero. Gli ormoni tiroidei risultano legati nel sangue: • Ad una globulina detta TBG (Thyroxine Binding Protein), che lega con grandissima affinità la T4 e con minore affinità T3 . Circa il 70% delle molecole sono legate alla TBG. Questo fa sì che, considerando la frazione di molecole libere, non vi sia una differenza così marcata tra la concentrazione plasmatica dei due ormoni, che è comune estremamente bassa. • Ad una prealbumina17 detta TBPA (Thyroxine Binding Pre-Albumin), o transtiretina, in grado di legare entrambi gli ormoni, ma soprattutto T4 , anche se con minore affinità rispetto alla precedente • All’albumina, con scarsa affinità; è in grado di legare entrambe, ma soprattutto T3 . Il fatto che quasi tutto l’ormone in circolo sia legato a proteine ne prolunga in maniera sostanziale l’emivita. T4 , che complessivamente tra i due si lega alle proteine con più affinità, ha una emivita di ben 7 giorni, mentre T3 di 1 giorno. Il rilascio degli ormoni tiroidei dalle proteine di trasporto è in equilibrio dinamico: via via che questi ormoni vengono degradati o si legano ai recettori a livello delle cellule bersaglio esplicando la loro azione, l’equilibrio si sposta, e gradualmente gli ormoni 17

Il termine prealbumina non sta a significare che questa molecola sia un precursore dell’albumina. Si riferisce al fatto che, eseguendo un’elettroforesi delle proteine plasmatiche, la banda della prealbumina si pone davanti alla banda dell’albumina, quindi è “prima” dell’albumina.

109

3 Ormoni derivati da aminoacidi si distaccano dalle proteine di trasporto. Dunque, oltre a prolungarne l’emivita, il legame alle proteine plasmatiche costituisce anche una riserva di ormone. Il metabolismo periferico degli ormoni tiroidei consiste di una serie di deiodinazioni sequenziali. T4 viene deiodinata nei tessuti periferici per produrre T3 , che è circa 10 volte più attivo – dunque T4 può essere considerato un pro-ormone. In altre parole, T3 è più attivo ma è presente in bassa concentrazione; T4 è il suo precursore ed è più abbondante nel plasma. In un certo numero di casi (all’incirca il 30%), la deiodinazione di T4 non produce T3 , ma rT3 (reverse T3 ). Questo accade quando viene eliminato lo iodio in posizione 5 dell’anello più interno. L’rT3 ha una scarsissima attività biologica, a differenza del T3 , e può essere considerato come un suo antagonista. Le deiodinazioni successive non hanno significato attivatorio, e producono forme inattive, che vengono solfatate e glucuronidate per poi essere escrete con le urine o con la bile. T3 e rT3 vengono convertiti in diiodotironina (T2 ), del tutto inattivo. Gli enzimi che catalizzano queste reazioni sono le deiodinasi, che utilizzano il raro elemento selenio nella loro attività catalitica; sono stati identificati diversi tipi di deiodinasi: • Deiodinasi I: catalizza soprattutto le deiodinazione di T4 e di rT3 . È l’enzima responsabile della gran parte delle deiodinazioni che portano alla conversione di T4 nel più attivo T3 , ed è espressa in tiroide, rene e fegato. • Deiodinasi II: catalizza la deiodinazione di T4 a T3 nel tessuto nervoso, adiposo, muscolare scheletrico, muscolare cardiaco, e ipofisi – questo enzima è molto importante soprattutto a livello di quest’ultima, dove riveste un ruolo nell’inibizione a feedback del T3 sul TSH, producendo una quota dell’ormone direttamente a livello ipofisario. • Deiodinasi III: è in grado di convertire T4 in rT3 e T3 in T2 . È espressa a livello del tessuto nervoso, oltre che nell’epidermide e nella placenta. In quest’ultimo tessuto è importante perché riduce la quota di T3 che passa dalla madre al feto, proteggendolo dall’eccesso di ormoni. Questi processi di inattivazione, come già detto, si concludono con la solfatazione e la glucuronazione, che si svolgono soprattutto nel rene e nel fegato. Il rene è anche in grado di eliminare direttamente le forme libere di T4 e T3 . Recettori

110

3 Ormoni derivati da aminoacidi • I recettori (intracellulari) per gli ormoni tiroidei sono espressi in quasi tutti i citotipi umani; • gli ormoni tiroidei agiscono principalmente tramite effetti a livello genico, ma anche a livello metabolico – anche se non è chiaro attraverso quali processi sia esplicata questa azione non genica. I recettori nucleari sono molto simili ai recettori degli ormoni steroidei, e sono chiamati α e β. Il recettore β, in particolare, sembra molto importante, e mutazioni a suo carico determinano resistenza agli ormoni tiroidei. Di solito si trovano associati alla cromatina a livello di specifici response elements, legati a diversi repressori. Il legame con l’ormone, che avviene con più affinità per T3 che per T4 , determina la dissociazione dei repressori e il legame di attivatori. I recettori attivati agiscono, analogamente a quanto accade per i recettori intracellulari degli altri ormoni lipofili, come fattori di trascrizione. In genere attivano o inibiscono la trascrizione di un gene legandosi a livello del promotore, o comunque a zone del gene dette Thyroid Response Elements – identificate dalla sequenza nucleotidica 3’-AGGTCANNNNAGGTCA-5’. Effetti fisiologici degli ormoni tiroidei Le risposte fisiologiche evocate dagli ormoni tiroidei sono estremamente eterogenee, ed hanno come bersaglio una ampia serie di tessuti. Alcuni geni la cui trascrizione è attivata dagli ormoni tiroidei sono: • La ATPasi Na+ -K+ (questo aumenta indirettamente il consumo di ossigeno); • proteine disaccoppianti, con aumento di produzione di calore; Oltre a questo, gli ormoni tiroidei • aumentano il metabolismo basale e intermedio; • promuvono la sintesi proteica; • incrementano la glicogenolisi e la gluconeogenesi; • favoriscono la sintesi del colesterolo. • A livello del tessuto osseo, stimolano la crescita e il riassorbimento osseo attivando osteoblasti e osteoclasti; • Negli adipociti, stimolano l’accumulo di lipidi intracellulari e attivano le proteine disaccoppianti; • Nel fegato, stimolano il metabolismo lipidico e glicidico;

111

3 Ormoni derivati da aminoacidi • A livello dell’ipofisi e dell’ipotalamo inibiscono la secrezione, rispettivamente, di TSH e TRH; inoltre, stimolano la sintesi ed il rilascio dell’ormone della crescita. Correlazioni cliniche: Ipotiroidismo ed ipertiroidismo L’ipotiroidismo è il quadro clinico provocato da una ridotta funzione tiroidea, con deficit di ormoni circolanti. Il quadro clinico “da manuale” è caratterizzato da un generale rallentamento del metabolismo, con astenia (debolezza), difficoltà di concentrazione o sonnolenza, raucedine, bradicardia, intolleranza al freddo, aumento di peso ed alterazioni del ciclo mestruale. Si può anche osservare mixedema (un turgore del sottocute dovuto a deposizione di mucopolisaccaridi nel derma, per ridotto catabolismo). L’ipotiroidismo viene classificato in: • primario: dovuto cioè ad una insufficienza della tiroide, che non riesce a produrre ormoni; tra le cause più comuni, la tiroidite di Hashimoto, la rimozione chirurgica della tiroide, la carenza di iodio, e alcuni farmaci (per esempio amiodarone o litio). Sono inoltre descritte patologie genetiche in cui vi sono dei difetti nella biosintesi degli ormoni tiroidei. • secondario: il deficit di ormoni tiroidei è provocato da un deficit di TSH. La tiroide non viene stimolata e quindi non produce ormoni. È dovuto a lesioni ipofisarie di vario tipo (traumi, lesioni chirurgiche, tumori che comprimono l’ipofisi). • terziario (molto raro): per patologie ipotalamiche che compromettono la produzione di TRH; • ipotiroidismo dovuto a resistenza periferica agli ormoni tiroidei. La tiroidite di Hashimoto è una malattia autoimmune in cui si sviluppano anticorpi contro la TPO e la tireoglobulina, con una distruzione (più o meno rapida, più o meno estesa) della ghiandola. L’ipertiroidismo è una condizione di esaltata funzione della ghiandola tiroide, che può condurre a tireotossicosi, cioè il quadro clinico provocato da un eccesso di ormoni tiroidei circolanti. I due termini sono spesso usati come sinonimi; in senso stretto, si riferiscono a concetti differenti: una condizione di tireotossicosi può non coincidere con una condizione di ipertiroidismo (es. nelle tiroiditi si verifica un danno delle cellule tiroidee che rilasciano ormoni in circolo, ma non c’è iperfunzione; la stessa considerazione vale per chi, intenzionalmente o accidentalmente, assume eccessive quantità di ormoni tiroidei).

112

3 Ormoni derivati da aminoacidi

La tireotossicosi è caratterizzata clinicamente da sintomi “opposti” a quelli dell’ipotiroidismo, cioè segni e sintomi che richiamano ad un aumento generale del metabolismo: palpitazioni ed aritmie cardiache, irrequietezza ed agitazione, diarrea, sudorazione ed intolleranza al caldo, perdita di peso, aumento dell’appetito. La forma più comune di tireotossicosi (e di ipertiroidismo) è la malattia di Graves, una malattia autoimmune in cui vengono prodotti anticorpi diretti contro il recettore del TSH, e che lo legano in maniera tale da stimolarlo. Il recettore quindi si attiva come se venisse stimolato, ma, a differenza del TSH, gli anticorpi ovviamente non rispondono ad un circuito di feedback, quindi anche con elevate quantità di ormoni circolanti, gli autoanticorpi continuano a stimolare il recettore (ed il TSH viene soppresso). Altre forme di tireotossicosi sono rappresentate da condizioni in cui una o più aree della tiroide si svincolano dal controllo del TSH, acquisendo la capacità di secernere ormoni tiroidei autonomamente (es. adenoma tossico di Plummer); situazioni in cui le cellule tiroidee sono danneggiate e rilasciano in circolo ormoni (es. tiroiditi); alcuni farmaci. Ci sono poi diverse cause rare; tra queste, condizioni di secrezione inappropriata di TSH (es. per adenomi ipofisari), in cui il TSH non risponde correttamente al feedback negativo e viene secreto anche quando c’è una elevata concentrazione di ormoni tiroidei circolanti.

113

4 Ormoni derivati dall’acido arachidonico 4.1 Origine degli eicosanoidi Gli ormoni derivati dagli acidi grassi sono chiamati collettivamente eicosanoidi. Il nome deriva dal greco antico εικοσα- (eicosa-), che significa “20”, ad indicare che queste molecole tipicamente sono sintetizzate a partire dall’ossidazione di acidi grassi a 20 atomi di C, soprattutto dall’acido arachidonico. L’acido arachidonico, o acido 5,8,11,14-eicosatetraenoico, è un acido grasso essenziale (20:4 Δ5,8,11,14 ) che si trova per lo più nei fosfolipidi della membrana cellulare, esterificato al glicerolo, solitamente in posizione 2. Costituisce da solo dal 5% al 15% degli acidi grassi dei fosfolipidi. Per essere impiegato nella sintesi, l’arachidonato deve essere prima liberato – questa reazione è catalizzata dalla fosfolipasi A2 . Altri due acidi grassi sono utilizzati come substrato per la sintesi degli eicosanoidi: • l’acido diomo γ-linolenico (20:3 Δ8,11,14 ), o acido 8,11,14-eicosatrieonico: è ottenuto a partire dall’elongazione dell’acido γ-linoleico, quest’ultimo sintetizzato desaturando l’acido linoleico (18:2 Δ9,12 ), un altro acido essenziale assunto con la dieta. • L’acido 5,8,11,14,17-eicosapentaenoico (20:5 Δ5,8,11,14,17 ), ottenuto dall’acido α-linolenico (18:3 Δ9,12,15 ),1 essenziale.

4.2 Classificazione e nomenclatura Abbiamo detto che gli eicosanoidi derivano da acidi grassi a 20 C con 3, 4, o 5 doppi legami, essenziali (e dunque assunti con la dieta) o sintetizzati a partire da acidi grassi essenziali. Sono di un’importanza biologica notevole: agendo come ormoni autocrini e 1

Attenzione a non confondere l’acido linolenico con l’acido linoleico!

4 Ormoni derivati dall’acido arachidonico paracrini, entrano in gioco in processi molto diversi (in certi casi con ruoli antagonisti) come l’infiammazione, il controllo della vasocostrizione, o l’emostasi. Poiché sono così numerosi, è importante avere ben chiara la classificazione di questi composti per poterne comprendere al meglio la biosintesi e l’azione fisiologica. Gli eicosanoidi sono divisi in classi su base strutturale: • Prostaglandine (PG); • Prostacicline (PGI); • Trombossani (TX); • Leucotrieni (LT); • Lipossine (LX). PG e PGI sono detti collettivamente prostanoidi – alcuni autori includono in questo gruppo anche i trombossani. In genere, il termine eicosanodi è utilizzato per riferirsi ad un composto facente parte di una di queste classi – si parla, soprattutto nella letteratura anglosassone, di “eicosanoidi classici”. Tuttavia, diversi altri composti possono essere ricondotti alla famiglia – si parla allora di “eicosanoidi non classici” o “novel eicosanoids”. Si tratta solitamente di metaboliti e intermedi degli stessi acidi grassi da cui derivano gli eicosanoidi, in alcuni casi originatisi da vie ossidative alternative o reazioni di ossidazione spontanee, e dotati di attività biologica. • idroperossidi di acidi eicosatetraenoici (HPETE, HydroPeroxyEicosaTetraEnoic acids) • idrossidi di acidi eicosatetraenoici (HETE, da HydroxyEicosaTetraEnoic acids) • epossidi di acidi eicosatrienoici (EET, da EpoxyEicosaTrienoic acids) • diidrossidi di acidi eicosatetraenoici (diHETE, da diHydroxyEicosaTetraEnoic acids) Le varie classi di eicosanoidi hanno strutture molto variabili: in generale, prostaglandine, prostacicline e trombossani sono formati da un anello a cui sono legate due catene laterali; leucotrieni e lipossine hanno invece struttura lineare. Ogni ecosanoide si identifica tramite: • Due lettere che indicano la classe (es. PG per le prostaglandine);

115

4 Ormoni derivati dall’acido arachidonico • Una lettera, stabilita in modo arbitrario, che indica il tipo e la posizione di certi sostituenti. (es. PGE indica la serie E della classe delle prostaglandine, i cui composti sono caratterizzati dalla presenza di un gruppo β-idrossi-chetonico); • Queste tre lettere sono accompagnate da un indice sottoscritto (es. PGE2 ) che si riferisce al numero di doppi legami nelle catene laterali. È molto comune raggruppare gli eicosanoidi in serie sulla base del numero di doppi legami (per esempio, “prostaglandine della serie 2” si riferisce a tutte le prostaglandine con il numero 2 come pedice, e dunque con due doppi legami nelle catene laterali). • Una lettera greca indica la configurazione stereochimica dell’ OH legato in C9, quando presente: α indica che il gruppo OH si proietta sotto il piano dell’anello, β che si proietta sopra. Esaminiamo rapidamente le caratteristiche delle classi principali. Prostaglandine (PG). Strutturalmente assimilabili all’acido prostanoico (vedi figura 4.1), mediano la risposta infiammatoria. Le contraddistingue un anello a cinque termini ciclopentanico. Come abbiamo accennato, a seconda dei sostituenti e delle caratteristiche di questo anello sono divise in 9 sottoclassi: PGA, PGB, PGC, PGE, PGF, PGG, PGH, PGI. Ciascuna classe è ulteriormente divisa in sottogruppi, identificati da un numero sottoscritto (PGA1 , PGA2 , etc) sulla base del numero di doppi legami della catena laterale. Le prostaglandine più comuni sono quelle dei gruppi A, E ed F. Oltre ad intervenire nei processi infiammatori, queste molecole hanno un ruolo nella regolazione della temperatura corporea quando agiscono a livello ipotalamico, e nella contrazione o nel rilassamento della muscolatura liscia di vasi, bronchi e della muscolatura uterina. Prostacicline (PGI). Sono spesso considerate come un gruppo di eicosanoidi a sé stante, ma in realtà sono una sottoclasse delle prostaglandine (le PGI, appunto). Come tali, anche queste sono strutturalmente assimilabili all’acido prostanoico. La loro caratteristica distintiva è la presenza di due anelli: l’anello a 5 termini tipico delle prostaglandine, più un secondo anello, pentagonale ed eterociclico. Quando si parla di “prostaciclina”, senza specificare, ci si riferisce di solito alla PGI2 . Promuovono la vasodilatazione e inibiscono l’aggregazione piastrinica. Trombossani (TX). Nei trombossani, l’anello ciclopentanico è sostituito da un anello eterociclico a sei termini contenente ossigeno. Sono divisi in due sottoclassi: TXA e TXB. I trombossani promuovono il processo della aggregazione piastrinica nonché la vasocostrizione; trombossani e prostacicline hanno quindi azione antagonista.

116

4 Ormoni derivati dall’acido arachidonico

Catena laterale a 7 C Anello a 5 C 1

COOH

O

9

8

10 11 12

7 6

9

5 4

3

10

1

2

HO

16

13

5

COOH

14

11

18

15

catena laterale a 8 C

HO

17 19

20

Struttura generale di una prostaglandina (PGE 2 )

Acido prostanoico

Le 8 serie di prostaglandine: caratteristiche dell'anello

O

O

O

OH

R7

R7

R8

O

R8

PGA

PGE

O

O

O

R

R

PGFα

R

R7

R7

OH

R8

R8

O

O

HO

HO

R8

PGD

PGB

R7

R7

R7

HO

HOO

PGH

PGG

HO

R8

PGI

Figura 4.1: La struttura delle prostaglandine. In alto a destra è mostrata la prostaglandina PGE2 , al fine di illustrare la struttura generale di una prostaglandina (un anello a 5 C, due catene laterali di 7 e 8 C); confrontare con l’acido prostanoico, in alto a sinistra, da cui queste molecole prendono il nome. In basso sono mostrate le strutture dell’anello a 5 C. È in base a questo anello che le prostaglandine sono suddivise in varie classi.

117

4 Ormoni derivati dall’acido arachidonico Leucotrieni (LT). Caratterizzati dall’assenza di anelli (sono quindi molecole lineari), e dalla presenza di tre doppi legami coniugati – il nome infatti deriva dall’unione di leuco-, perché queste molecole sono state isolate dai leucociti, e -trieni, che secondo la nomenclatura della chimica organica indica tre insaturazioni. Spesso è presente un ulteriore doppio legame, non coniugato, per un totale di quattro. Sono divisi nelle sottoclassi A, B, C, D, E. I leucotrieni entrano in gioco nei processi infiammatori, nelle reazioni anafilattiche, nell’asma, e nella chemiotassi delle cellule del sistema immunitario. Lipossine (LX). Caratterizzate dall’assenza di anelli, come i leucotrieni, e dalla presenza di quattro legami insaturi coniugati. Sono di due tipi: A4 e B4 . Hanno azione vasocostrittrice e ruolo immunodepressivo.

4.3 Sede di elaborazione Gli eicosanoidi vengono virtualmente sintetizzati da tutti i tessuti (in specie le prostaglandine), fatta eccezione per gli eritrociti, anche se vi sono delle specificità tissutali per quanto riguarda il tipo e la quantità di ormoni prodotti.

4.4 Biosintesi Vediamo come vengono sintetizzati questi composti, In questa sezione esamineremo in maniera schematica le vie metaboliche che consentono di sintetizzare questa vastissima rosa di composti a partire da tre acidi grassi, cercando di averne una visione generale. Le vie metaboliche preponderanti sono due, e prendono il nome dai due enzimi coinvolti: • Prostaglandine, prostacicline e trombossani sono ottenuti quando gli acidi grassi precursori diventano substrato della via della ciclossigenasi; • Leucotrieni e lipossine sono ottenuti quando gli acidi grassi precursori diventano substrato della via delle lipossigenasi. Attraverso una di queste due vie (in realtà ne esiste anche una terza, di cui parleremo più avanti, che ha un ruolo minoritario) gli acidi grassi precursori danno origine a varii composti (Figg. 4.2, pagina 120 e 4.3, pagina 121):

118

4 Ormoni derivati dall’acido arachidonico • Gli eicosanoidi derivati dall’ acido arachidonico attraverso la via della ciclossigenasi sono prostaglandine, prostacicline e trombossani con due doppi legami (PG2 , PGI2 , e TXA2 ). La via della lipossigenasi produce leucotrieni e lipossine con 4 doppi legami (LT4 e LX4 ). • Gli eicosanoidi derivati dall’acido diomo γ-linolenico tramite la via della ciclossigenasi sono prostaglandine e trombossani con un doppio legame (PG1 , TXA1 ), mentre la via della lipossigenasi dà origine a leucotrieni con tre doppi legami (LT3 ). • Gli eicosanoidi derivati dall’acido eicosapentaenoico sono prostaglandine, prostacicline e trombossani con tre doppi legami (PG3 , PGI3 , e TXA3 ), prodotti attraverso la via della ciclossigenasi, e leucotrieni con cinque doppi legami (LT5 ) prodotti attraverso la via della lipossigenasi . Esamineremo in modo più approfondito il destino dell’acido arachidonico, poiché dà origine agli ecoisanoidi più comuni nel corpo umano (le prostaglandine della serie 2), nonché alcuni tra i più importanti. Abbiamo visto che l’acido arachidonico si trova esterificato al glicerolo in posizione 2 a formare i fosfolipidi di membrana; poiché le reazioni con cui vengono prodotti eicosanoidi avvengono solo sull’acido grasso libero, questo viene innanzi tutto staccato. L’enzima fosfolipasi A2 è in grado di idrolizzare il legame estere tra l’acido arachidonico ed il glicerolo in risposta ad uno stimolo che può essere di varia natura. Questa è considerata la rezione velocità limitante, in quanto influenza la disponibilità di substrato. Altre fonti quantitativamente meno importanti di acido arachidonico sono rappresentate da: • Esteri del colesterolo con acido arachidonico; • Insaturazione dell’acido diomo γ-linolenico da parte della Δ5 desaturasi; • Azione della fosfolipasi C, che produce diacilglicerolo e inositolo trifosfato; il diacilglicerolo diviene poi substrato della diacilglicerolo lipasi ed eventualmente della monogliceride lipasi. Liberato l’acido arachidonico, come abbiamo accennato, questo può entrare in tre diverse vie, che dunque competono per lo stesso substrato: • via della ciclossigenasi: l’arachidonato subisce una reazione catalizzata dal complesso della prostaglandina G/H sintasi (o ciclossigenasi, COX), che produce PGH2 , un endoperossido. A partire da questo composto, si possono produrre, a seconda di quale enzima subentri: – altri PG2 (delle serie D, E ed F);

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4 Ormoni derivati dall’acido arachidonico

Membrana plasmatica COO-R COOH

diomo γ-linolenato

Esteri dell'acido arachidonico

Fosfolipasi A 2

Diacilglicerolo lipasi

Δ 5 desaturasi

COOH

Acido arachidonico

Via delle ciclossigenasi

Via delle lipossigenasi

Prostaglandina G/H sintasi (COX) 12-LOX

5-LOX

15-LOX PGG 2 15-HPETE

12-HPETE

Prostaglandina G/H sintasi (perossidasi)

Lipossine

leucotrieni della serie B

5-HETE

5,12-HPETE

LTA 4

PGH 2

PGD 2

PGE 2

TXA 2

PGF 2

TXB 2

5,15-HPETE

LTB 4

LTC 4

Prostaglandine e trombossani della serie 2 LTD4

Leucotrieni della serie 4

LTE 4

Figura 4.2: Eicosanoidi prodotti a partire dall’acido arachidonico.

PGI 2

120

4 Ormoni derivati dall’acido arachidonico

18:2 Δ 9,12

acido linoleico

acido α-linolenico

18:3 Δ 9,12,15

Acido ottadecatetraenoico

18:4 Δ 6,9,12,15

Acido eicosatetraenoico

20:4 Δ 8,11,14,17

6

Δ desaturasi

18:3 Δ 6,9,12

acido γ-linolenico

Elongasi

20:3 Δ 8,11,14

Acido diomo γ-linolenico

Δ5 desaturasi

PGE 1

PGF 1

TXA 1

Via delle lipossigenasi

LTA 5

LTB 5

LTC 5

20:5 Δ 5,8,11,14,17

Via delle ciclossigenasi

PGD 3

PGE 3

PGF 3

TXA 3

PGI 3

Figura 4.3: Eicosanoidi prodotti a partire dagli acidi linoleico e linoleico.

Prostaglandine e trombossani della serie 3

LTD3

PGH 1

Leucotrieni della serie 5

LTC 3

Acido eicosapentaenoico

Via delle ciclossigenasi

Prostaglandine e trombossani della serie 1

LTA 3

Leucotrieni della serie 3

Via delle lipossigenasi

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4 Ormoni derivati dall’acido arachidonico – La prostaciclina PGI2 ; – il trombossano TXA2 . L’espressione degli enzimi responsabili di queste conversioni varia con il citotipo, dunque il destino della PGH2 è tessuto-specifico. • Via della lipossigenasi: l’arachidonato diviene substrato di tre diverse lipossigenasi, ciascuna in grado di introdurre ossigeno in tre differenti posizioni: 12, 5, e 15. In seguito all’azione combinata di questi tre enzimi, vengono prodotti leucotrieni, lipossine, HPETE ed HETE. • Una terza via, molto meno attiva delle prime due, produce diHETE ed HETE; la catalisi è affidata soprattutto a citocromo P450. Via delle ciclossigenasi : l’enzima cardine su cui si basa questa via è la prostaglandina G/H sintasi (PGS), che si trova per lo più a livello del reticolo endoplasmatico. Si tratta di un omodimero: ciascuna delle due subunità presenta tre dominî: • un dominio con l’attività di ciclossigenasi (COX); • un dominio con attività idroperossidasica (PG idroperossidasi); • un dominio di legame con la membrana, attraverso il quale l’enzima è ancorato al reticolo endoplasmatico o, più raramente, alla membrana nucleare esterna. L’enzima è spesso chiamato semplicemente COX. Nella prima tappa, l’acido arachidonico subisce una ciclizzazione intramolecolare data dal legame tra C8 e C12; allo stesso tempo, due molecole di O2 vengono introdotte a formare un endoperossido (tra C9 e C11) ed un idroperossido in C15. Il meccanismo di reazione che è stato proposto per l’enzima prevede la rimozione stereospecifica dell’idrogeno prochiralico-S dal C13 da parte della tirosina 385 del sito attivo; questo dà origine ad un carbonio radicalico. Segue l’ossigenazione in C11, con formazione dell’endoperossido e dell’anello a 5 termini. Una seconda molecola di O2 viene poi introdotta in C15, cui segue la formazione dell’idroperossido. La molecola formata in questa prima tappa è la PGG2 ; l’attività perossidasica, glutatione ridotto dipendente, il cui sito attivo si trova nelle vicinanze dell’attività COX, converte il gruppo idroperossido in gruppo idrossilico, producendo PGH2 , H2 O e glutatione ossidato. L’attività della COX ha la peculiarità di essere discontinua, perché l’enzima si autoinattiva dopo circa 30 secondi di attività. Poiché l’enzima di fatto si autodistrugge fa parte dei cosiddetti “enzimi suicidi”. Queste prime fasi della sintesi di prostaglandine e trombossani sono effettuate virtualmente in tutti i tessuti (tranne che negli eritrociti). Ciò significa che tutti i tessuti

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4 Ormoni derivati dall’acido arachidonico

COOH

Acido arachidonico

COX

O COOH O

OOH

PGG 2

COOH OH COOH

O O COOH

OH

O

O

PGD 2

OH

OH

PGH 2

OH

PGI 2

O COOH

COOH

O O

OH

OH

OH

TXA 2

PGE 2

OH

OH COOH

OH

OH

COOH HO

O

OH

TXB 2

PGF 2α

Figura 4.4: Eicosanoidi prodotti a partire dall’acido arachidonico.

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4 Ormoni derivati dall’acido arachidonico esprimono COX. È però necessario precisare che di COX si conoscono, ad oggi, tre isoenzimi: COX-1, COX-2 e COX-3; quest’ultimo tuttavia viene considerato come una variante di COX-1 (i loro mRNA sono frutto dello splicing alternativo del trascritto dello stesso gene) espressa a livello della corteccia cerebrale e del miocardio, il cui ruolo non è stato chiarito. COX-1 e COX-2 sono meglio conosciuti e considerati più importanti: hanno circa il 65% della sequenza aminoacidica in comune, e peso molecolare comparabile; anche gli aminoacidi a livello dei siti attivi sono molto conservati. Le due COX agiscono praticamente allo stesso modo a livello catalitico (ci sono piccole differenze di specificità, in realtà), tuttavia la loro inibizione differenziale porta a differenti conseguenze: • COX-1 è un enzima costitutivo (o housekeeper), espresso in quasi tutti i tessuti. Le prostaglandine sintetizzate da queste cellule sono coinvolte in molti processi fisiologici e in generale nell’omeostasi; per esempio, a livello di mucosa gastrica, dove regolano la secrezione di muco, che protegge le pareti dello stomaco dall’azione dei succhi gastrici. Un altro esempio è dato dalla regolazione del flusso renale. Dunque, l’inibizione di questo enzima è in grado, potenzialmente, di creare dei problemi; per esempio, una maggiore vulnerabilità della parete gastrica nei confronti della erosione da parte degli acidi gastrici (con possibilità di sanguinamenti). • COX-2 è un enzima inducibile, indotto durante l’infiammazione soprattutto a livello di macrofagi, monociti e nei tessuti sede di infiammazione o esposti a fattori di crescita o altri mediatori dell’infiammazione (interleuchina-1 o LPS, lipopolisaccaride batterico), oltre che nei neuroni, nelle cellule muscolari lisce e nelle cellule endoteliali; le prostaglandine sintetizzate da queste cellule sono coinvolte nella mediazione dell’infiammazione, nel dolore, e nella febbre – dunque un’inibizione della sintesi di queste prostaglandine riduce anche l’entità di questi processi. Correlazioni cliniche: gli enzimi COX ed i FANS Perché è importante conoscere la differenza tra i due isoenzimi COX? La sintesi degli eicosanoidi è un processo su cui il medico si trova spesso a dover intervenire farmacologicamente, ad esempio per tentare di modulare processi infiammatori. Questo avviene tramite due tipi di farmaci: da un lato, esistono i farmaci anti-infiammatori steroidei, dall’altro i non steroidei (i cosiddetti FANS, o NSAID secondo l’acronimo inglese).

124

4 Ormoni derivati dall’acido arachidonico

I farmaci antiinfiammatori steroidei (per es. prednisone) inibiscono la risposta infiammatoria in molti modi, come la regolazione dell’espressione di geni coinvolti nell’infiammazione (tra queste azioni, merita citare l’inibizione della fosfolipasi A2 ). Questi farmaci agiscono con le stesse modalità dei corticosteroidi (vedi sez. 6.1, pag. 140.). I FANS esplicano la loro azione a livello della COX. L’aspirina (acido acetilsalicilico) è il prototipo dei FANS: agisce acetilando irreversibilmente una serina presente nel sito attivo della COX. Tuttavia l’aspirina, così come molti altri FANS, agisce su entrambi gli isoenzimi (anzi, più efficaciemente sulla COX-1!). Quindi, nonostante si somministri il farmaco con lo scopo di inibire la COX-2 per eliminare dolore, infiammazione e febbre, si finisce con l’inibire anche la COX-1, i cui effetti, al contrario, non sono indesiderati. Questo crea diversi problemi: per esempio, è noto che l’utilizzo prolungato di FANS aumenta il rischio di ulcere gastriche e sanguinamenti. Questo perché la COX-1 è coinvolta nella sintesi di prostaglandine che regolano la secrezione di muco, che ha funzione gastroprotettiva. Un altro esempio classico di FANS è dato dall’ibuprofene, che agisce però con un diverso meccanismo rispetto all’aspirina. Grazie agli sforzi della ricerca, sono stati messi a punto nuovi anti-infiammatori non steroidei (“newer NSAIDs” o coxib) più specifici verso la COX-2, ma non privi di effetti collaterali. Tra questi farmaci, il celecoxib, etoricoxib ed il refecoxib (ora ritirato dal mercato) sono i più noti. In ricerca, sono disponibili inibitori della COX-2 1000 volte più specifici, ma, per varii motivi, non possono essere usati come farmaci.

Il PGH2 , a seconda del citotipo, può essere substrato di diversi enzimi che portano alla sintesi di prostaglandine diverse e trombossani (figura 4.4, pagina 123). • PGE2 e PGF2 α : prodotte soprattutto in milza e reni per l’intervento prima di una isomerasi (o PGE sintasi), che produce PGE2 , e poi di una reduttasi, che porta a PGF2 α . • PGI2 : prodotta dalla prostaciclina sintasi. • PGD2 : prodotta dalla PGD sintasi. • TXA2 : prodotta dalla trombossano sintasi. È un potente vasocostrittore, sintetizzato soprattutto dalle piastrine, che viene rapidamente inattivato a TXB2 . Ha una emivita estremamente breve. Via delle lipossigenasi. Se la via delle ciclossigenasi produce composti ciclici, la via delle lipossigenasi converte l’acido arachidonico in leucotrieni e lipossine (figura 4.5),

125

4 Ormoni derivati dall’acido arachidonico COOH

Acido arachidonico

5-LOX

12-LOX

COOH

15-LOX

OOH

COOH

COOH

OOH OOH

5-HPETE

15-HPETE

12-HPETE

COOH

COOH

HO

HO

15-HETE

12-HETE

Lipossine

Leucotrieni della serie B

OH

OH COOH

Leucotrieni della serie 4

COOH

5-HETE

HO

5,15-HPETE

OH COOH HO

5,12-HPETE

Figura 4.5: La via delle lipossigenasi. L’acido arachidonico può divenire substrato di almeno 3 differenti enzimi lipossigenasi (LOX), con produzione di numerosi leucotrieni e lipossine.

126

4 Ormoni derivati dall’acido arachidonico composti lineari. Gli enzimi coinvolti in questo pathway sono le lipossigenasi, enzimi citosolici con attività di diossigenasi, che catalizzano l’incorporazione di entrambi gli atomi di ossigeno di una molecola di O2 a livello di uno dei doppi legami dell’ acido arachidonico, producendo idroperossidi (HPETE); gli intermedi successivi porteranno alla sintesi di leucotrieni della serie 4 e lipossine. Sono tre le lipossigenasi principali che entrano in gioco in questa via, ognuna delle quali è specifica per uno dei doppi legami dell’arachidonato: • 5-lipossigenasi (5-LOX). Molto espressa in leucociti (granulociti neutrofili e basofili, linfociti B), macrofagi e mastociti, dà origine ai leucotrieni più importanti nella mediazione dei processi infiammatori, ed è bersaglio di diversi farmaci. Introduce un gruppo idroperossido a livello del carbonio 5 dell’acido arachidonico producendo 5(S)-HPETE2 . La catalisi avviene con la collaborazione della FLAP, acronimo inglese per Proteina Attivante la Lipossigenasi, che sembra in qualche modo “presentare” il substrato all’enzima. Sia come sia, è pacifico che la FLAP sia essenziale per una catalisi efficiente e corretta. Il 5-HPETE, come tutti gli altri HPETE, è un intermedio estremamente reattivo, occupante una posizione centrale nel metabolismo dei leucotrieni, che qui si fa straordinariamente complesso. Il 5-HPETE infatti: 1. può ridursi al corrispondente HETE, spontaneamente (spesso ossidando glutatione) o tramite la catalisi di una perossidasi; 2. può divenire substrato di una delle altre due lipossigenasi, con produzione di 5,12-diHPETE o 5,15-diHPETE; 3. oppure può dare origine al leucotriene LTA4 , in grado di essere convertito in altri leucotrieni. Il 5-HPETE è quindi un intermedio estremamente importante. • 12-lipossigenasi (12-LOX). Molto espressa in piastrine, cellule delle isole pancreatiche, cellule muscolari lisce dei vasi. Introduce l’ossigeno a livello del carbonio 15 dell’arachidonato e produce così 12(S)-HPETE. Come succedeva per il 5-HPETE, anche questo idroperossido ha molti possibili destini. Viene soprattutto ridotto, con modalità simili al precedente, al corrispondente 12-HETE, che esplica funzioni biologiche, e in parte dà origine ad alcuni leucotrieni della serie B. • 15-lipossigenasi (15-LOX). Espressa soprattutto in reticolociti, granulociti eosinofili, linfociti T, cellule dell’epitelio della trachea. Produce 15(S)-HPETE, che, come il precedente, non dà origine a leucotrieni, e può essere convertito in 2

Il carbonio ossigenato diviene asimmetrico; la idroperossidazione è specifica per lo stereoisomero S.

127

4 Ormoni derivati dall’acido arachidonico 15-HETE. Tuttavia, il destino principale di questo intermedio è quello di produrre lipossine antiinfiammatorie. In realtà vi è anche una 8-lipossigenasi, ma non la prenderemo in considerazione in quanto non partecipa alla biosintesi degli eicosanoidi. Inoltre, è da sottolineare il fatto che non sono state presentate tutte le possibili interrelazioni metaboliche tra i composti visti fino ad adesso, per non complicare ulteriormente (e con il probabile effetto di rendere il tutto molto più arido e sterile) un quadro già complesso – tuttavia, è bene tener presente che il metabolismo di questi composti è molto più articolato e tortuoso di quello che abbiamo visto! Riassumendo, abbiamo illustrato come l’arachidonato venga idroperossidato a 5(S)-HPETE dall’attività diossigenasi della 5-lipossigenasi, che fa parte della via delle lipossigenasi. La stessa 5-lipossigenasi presenta anche l’attività di deidrasi che può convertire il 5(S)-HPETE a leucotriene LTA4 . Sarà questo il pathway metabolico lungo il quale proseguiremo adesso. Questa attività deidrasica è chiamata spesso LTA4 sintasi. Il leucotriene A4 è un epossido (dunque un composto abbastanza instabile) che può essere convertito in: • LTB4 da una idrolasi, che idrata (aggiunge una molecola d’acqua) l’LTA4 , aprendo il suo anello epossido. In questa reazione avviene un riarrangiamento dei doppi legami, ma il numero totale rimane invariato. • LTC4 , dalla LTC4 sintasi, che coniuga l’LTA4 ad una molecola di glutatione ridotto in posizione 6 – per questo motivo, l’enzima è anche chiamato glutatione-S transferasi II. In ogni caso, la reazione apre l’anello epossido. L’LTC4 è un leucotriene molto importante, poiché a partire da questo composto la cellula è in grado di sintetizzare i cosiddetti cisteinil-leucotrieni, così denominati in quanto contenenti cisteina. Ne fanno parte LTD4 , LTE4 e lo stesso LTC4 (il glutatione contiene cisteina). Poiché il LTC4 è secreto dalla cellule mediante un trasportatore, queste reazioni di conversione avvengono nell’ambiente extracellulare. La conversione avviene grazie alla rimozione sequenziale, per idrolisi, di glutammato (che produce LTD4 ) e poi di glicina (LTE4 ). La produzione di leucotrieni in quantità importanti avviene soprattutto ad opera dei leucociti. Via dei citocromi P450. Non ci resta che esaminare brevemente la terza via con la quale vengono prodotti eicosanoidi, catalizzata da citocromi P450, soprattutto a funzione idrossilasica, epossigenasica e idrolasica. Il substrato è nuovamente l’acido arachidonico, grande protagonista di queste vie metaboliche, e, come abbiamo visto,

128

4 Ormoni derivati dall’acido arachidonico a capo della biosintesi di una serie incredibilmente ampia di composti con funzioni segnalatorie – tanto da far parlare gli studiosi di “cascata dell’acido arachidonico”. I prodotti a cui dà origine attraverso questo pathway sono 19,20-diHETE, 20-HETE, 19-HETE, EET. Le funzioni biologiche di questi composti sono eterogenee ed entrano in gioco nei sistemi vascolare, renale, polmonare e cardiaco in processi molto diversi (proliferazione cellulare, apoptosi, infiammazione, etc.). Ricordiamo tra tutti il 20HETE, potente vasocostrittore; gli EET, di contro, hanno azione vasodilatatrice.

4.5 Secrezione e regolazione La regolazione della biosintesi di questi composti si esplica soprattutto a livello della fosfolipasi, e quindi attraverso una modulazione della disponibilità di substrato. In generale, l’azione della fosfolipasi A2 e la sua traslocazione a livello della membrana: • sono promosse dalla sua fosforilazione e dall’aumento di concentrazione del calcio; • sono inibite dagli steroidi, in particolare dai corticosteroidi. Nonostante siano molecole lipofile, è stato dimostrato che la secrezione e l’uptake di questi composti da parte delle cellule sono mediati, almeno nel caso delle prostaglandine, da dei trasportatori. In particolare, un trasportatore ABC chiamato MRP4 (o trasportatore delle prostaglandine ) ne promuove il rilascio.

4.6 Secrezione, trasporto nel plasma e degradazione I composti di cui abbiamo esaminato la biosintesi fino ad adesso sono ormoni di tipo paracrino ed autocrino. Come tali, agiscono nelle immediate vicinanze della cellula da cui sono stati secreti, ed hanno emivita tendenzialmente breve (decine di secondi, minuti nel caso di prostaglandine e trombossani, poche ore nel caso dei leucotrieni). Sono inattivati in situ oppure, se entrano nel circolo sanguigno, soprattutto a livello polmonare. • Le prostaglandine sono inattivate mediante ossidazione del gruppo -OH in posizione 15, o β-ossidazione del carbossile terminale.

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4 Ormoni derivati dall’acido arachidonico • Il trombossano A2 ha una emivita biologica brevissima; è inattivato in pochi secondi a TXB2 (Fig. 4.4, pag. 123) quando entra in contatto con molecole di acqua. • Per quanto riguarda i leucotrieni, il LTB4 è inattivato mediante ω-ossidazione del gruppo metile (cioè, ossidazione del carbonio più distante dal gruppo carbossilico), seguita da β-ossidazione. LTC4 è convertito in LTD4 e LTE4 , dopodiché quest’ultimo subisce inattivazione con le stesse modalità del LTB4. • Altri eicosanoidi vengono inattivati mediante riduzione dei doppi legami.

4.7 Recettore Gli eicosanoidi si legano rapidamente dalle cellule mediante un recettore accoppiato ad una proteina G. Spesso viene attivato il pathway dell’adenilato ciclasi-cAMPproteinchinasi oppure DAG-IP3 -Ca2+ .

4.8 Effetti fisiologici degli eicosanoidi Gli eicosanoidi agiscono tendenzialmente in maniera paracrina ed autocrina. Non tratteremo in maniera approfondita le risposte biologiche mediate dagli eicosanoidi, in quanto questi composti sono numerosissimi, e le azioni da loro promosse sono ancora di più – inoltre, in certi casi si tratta di azioni contrastanti. Le prostaglandine: • mediano la risposta infiammatoria. In questo ambito, possono essere coinvolte in deviazioni patologiche di questi processi, ad esempio a carico di articolazioni (artrite reumatoide), pelle (psoriasi), occhi, etc.; • contribuiscono alla regolazione della temperatura corporea, e hanno a che fare con l’insorgere della febbre; • esercitano un controllo sulla muscolatura liscia, in specie quella vascolare, con numerose conseguenze: provocano ad esempio vasocotrizione (PGF) o vasodilatazione (PGE, PGA, PGI); • stimolano le contrazioni uterine in diversi momenti fisiologici; • sono mediatori del dolore;

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4 Ormoni derivati dall’acido arachidonico • sono modulatori del processo dell’emostasi (in particolare, le prostacicline sono antiaggreganti e antagonisti dei trombossani: inibiscono l’attivazione delle piastrine e vasodilatano). I trombossani promuovono l’aggregazione piastrinica e la vasocotrizione, e operano in maniera antagonista alle prostacicline. Sono potenti ipertensivi. Sfruttano recettori accoppiati a G proteine, con attivazione della fosfolipasi C, e sfruttano quindi il pathway segnalatorio DAG-IP3 -Ca2+ . Leucotrieni e lipossine sono sintetizzate principalmente dalle cellule del sangue della serie bianca, ma anche a livello encefalico, polmonare e miocardico. Modulano: • la chemotassi e attivazione di leucociti (per esempio, la degranulazione); processi infiammatori; • risposte allergiche; • presentano inoltre azione bronco- e vasocostrittrice; • sono in grado di incrementare la permeabilità vascolare, provocando edema.

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5 Ormoni derivati dalla vitamina D Il termine vitamina D è utilizzato per indicare una serie di composti: i due principali sono ergocalciferolo, o vitamina D2 , e colecalciferolo, o vitamina D3 . Entrambi sono, di fatto, dei pro-ormoni: subiscono alcune reazione per dare origine infine all’ormone calcitriolo. Il calcitriolo è un ormone lipidico coinvolto soprattutto nell’omeostasi del Ca2+ , come paratormone e calcitonina, ma esplica anche altre funzioni.

5.1 Ormoni del rene 5.1.1 Calcitriolo Struttura Il calcitriolo (1 α,25-diidrossicolecolaciferolo) è il solo ormone derivante dalle vitamina D. Come tale, è assimilabile da un certo punto di vista anche al colesterolo, poiché il composto precursore della vitamina D è un intermedio della biosintesi del colesterolo. Tuttavia il calcitriolo non può a rigore essere considerato un ormone steroideo in quanto ha perduto la struttura tetraciclica.1 Viene per questo fatto rientrare nella classe dei secosteroidi, termine che designa composti nei quali uno dei quattro anelli tipici degli steroidi è aperto, solitamente l’anello B. Sede di elaborazione La tappa principale della sintesi del calcitriolo avviene a livello renale, che può essere considerato la sede di sintesi dell’ormone. Biosintesi Se è vero che la tappa principale della sintesi del calcitriolo avviene nel rene, a monte di questa vi sono altre tappe che hanno luogo in diversi distretti del corpo, e che da un precursore del colesterolo portano alla vitamina D (figura 5.1, pagina 133): 1

Gli steroidi sono composti formati da quattro anelli ciclici: tre molecole di cicloesano (peridrofenantrene), e un ciclopentano. Vedi la sezione 6.1, pag. 140.

5 Ormoni derivati dalla vitamina D

Fegato

Cute

CH3 CH2

HO

HO

HO

7-deidrocolesterolo

Previtamina D Colecalciferolo

OH

CH2 HO

OH

1,25-diidrossicolecalciferolo (Calcitriolo)

OH

OH OH

CH2

CH2

HO

HO

25-idrossicolecalciferolo

OH

1,24,25-triidrossicolecalciferolo

OH OH

CH2 HO

Rene

24,25-diidrossicolecalciferolo

Figura 5.1: Biosintesi della vitamina D. Le reazioni avvengono a livello di cute, fegato e rene. I nomi degli enzimi non sono mostrati (dettagli nel testo).

133

5 Ormoni derivati dalla vitamina D • La sintesi del colesterolo prevede la condensazione di diverse molecole di acetilCoA, fino ad ottenere squalene. Questo composto viene poi rimaneggiato a formare lanosterolo, la cui struttura tetraciclica ricorda quella del colesterolo. Altre modifiche convertono il lanosterolo in composti intermedi, fino ad ottenere 7-deidrocolesterolo.2 Questo composto può subire una riduzione per essere convertito a colesterolo, oppure divenire il substrato per la sintesi della vitamina D. • A livello della cute (soprattutto nello strato dell’epidermide), i raggi UVB provenienti dal sole innescano la fotolisi non enzimatica del 7-deidrocolesterolo nella provitamina D3 . La reazione consiste nella rottura del legame tra C9 e C10. La provitamina D3 , composto biologicamente inattivo, isomerizza spontaneamente (anche questa reazione non è catalizzata, ed in effetti è molto lenta) in colecalciferolo, o vitamina D3 . Questa viene trasportata nel plasma dalla proteina legante la vitamina D. La vitamina D3 può anche essere ottenuta direttamente con la dieta, o a partire dall’ergocalciferolo (vitamina D2 ). Quetst’ultimo composto viene sintetizzato a partire dall’egosterolo da piante, funghi e invertebrati; al giorno d’oggi, viene prodotto a livello industriale irradiando lieviti, e poi aggiunto a molti cibi. • È nel fegato che avviene la tappa successiva: ergocalciferolo e colecalciferolo vengono qui idrossilati in posizione 25; la reazione, scarsamente regolata, avviene a livello del RE, e richiede NADPH, ossigeno molecolare e magnesio. Gli enzimi coinvolti sono due: una citocromo P450 reduttasi NADPH-dipendente e la 25-idrossilasi, un citocromo P450. I prodotti sono 25-idrossicolecalciferolo e 25-idrossiergocalciferolo, che vengono entrambi reimmessi nel circolo sanguigno. Il 25-OH-D3 (chiamato anche calcidiolo) risulta la forma più abbondante di vitamina D che si ritrova nel sangue – anche a causa della sua lunga emivita, dell’ordine di giorni. • Dal circolo i composti passano nel rene, dove possono essere sottoposti a due idrossilazioni, con diverso significato: un’idrossilazione in posizione 24, con significato inattivatorio, e una idrossilazione in posizione 1, con significato attivatorio, che porta all’attivazione definitiva della vitamina D con la formazione (nel caso della D3 ) di 1 α,25-diidrossicolecalciferolo, o calcitriolo, depositario della massima attività biologica. L’ercalcidiolo (25-idrossiergocalciferolo) forma 1,25diidrossiergocalciferolo o ercalcitriolo.

2

Una spiegazione più dettagliata della sintesi del colesterolo può essere trovata in qualunque testo di biochimica.

134

5 Ormoni derivati dalla vitamina D Questa reazione di idrossilazione in posizione 1, che avviene nei mitocondri delle cellule della porzione convoluta del tubulo prossimale renale, richiede tre enzimi: 1. ferredossina reduttasi renale, una flavoproteina; 2. ferredossina renale, una proteina ferro-zolfo; 3. 1 α-idrossilasi, un citocromo P450. Sono richiesti come cofattori NADPH, Mg2+ e ossigeno molecolare. Il citocromo catalizza una classica reazione di tipo monossigenasi sfruttando l’ossigeno molecolare. A differenza della reazione precedente, questa è strettamente regolata. La regolazione negativa di questo enzima favorisce l’idrossilazione inattivatoria in posizione 24 da parte della 24-idrossilasi (vedi il paragrafo "Regolazione".). Dopo la sintesi, il calcitriolo viene quindi rilasciato in circolo dove svolge le sue funzioni come un ormone endocrino. Secrezione e regolazione Il principale punto regolativo è l’enzima 1 α-idrossilasi, che attiva definitivamente la vitamina D3 . Questo enzima, e con esso l’intera via biosintetica, è regolato: • positivamente dal PTH, che aumenta l’attività dell’enzima; • negativamente dal calcitriolo, con un feedback negativo che influenza l’espressione genica e la biosintesi dell’enzima; inoltre il calcitriolo riduce anche la sintesi del PTH. • negativamente dai livelli plasmatici di calcio. Anche questa può essere considerata una forma di feedback negativo (il calcitriolo porta all’incremento della calcemia); Si ritiene che anche calcitonina, prolattina e gli ormoni sessuali (estrogeni in particolare) contribuiscano alla regolazione, ma rivestono in ogni caso un ruolo minore. Il calcitriolo inoltre upregola l’enzima che idrossila in posizione 24. Come gli altri ormoni liposolubili il calcitriolo non viene accumulato nelle cellule in vescicole secretorie, ma viene rilasciato in circolo via via che viene sintetizzato. Trasporto nel plasma e degradazione Il calcitriolo in circolo si trova legato, così come i suoi metaboliti idrossilati, alla proteina legante la vitamina D (VDBP), una

135

5 Ormoni derivati dalla vitamina D glicoproteina (in particolare, si tratta di una globulina) del peso molecolare di circa 52 kDa. Presenta tre dominî, uno dei quali in grado di legare secosteroli.3 Presenta forti omologie con l’albumina. Per quanto riguarda la degradazione, avevamo visto come nel rene le reazioni a cui poteva andare incontro il calcidiolo (o l’ercalcidiolo) erano due: una idrossilazione in posizione 1 e una in posizione 24. Quest’ultima produce un metabolita inattivo, il 24,25-diidrossicolecalciferolo. Anche l’1,25-diidrossicolecalciferolo può subire questa reazione, dando origine, parimenti, ad un metabolita inattivo, il 1,24,25-triidrossi-D3 . Il 24,25-diidrossicolecalciferolo si forma quando l’idrossilazione in posizione 1 (attivatoria) viene inibita. Il 1,24,25-triidrossi-D3 si forma quando l’idrossilazione in posizione 1 è avvenuta, il calcitriolo ha adempito alle sue funzioni e deve essere degradato. Questi due prodotti vengono poi trasportati al fegato ed eliminati con la bile, oppure con le urine nel rene stesso. Recettore

Gli effetti biologici sono raggiunti per mezzo di:

• una azione a livello genico (tipica degli ormoni lipofili). È lenta e presuppone l’interazione con un recettore citosolico (VDR, Vitamin D Receptor) che in seguito al legame con il ligando si sposta nel nucleo e agisce come fattore di trascrizione; • con meccanismi che hanno effetto a breve termine, e coinvolgono recettori sulla membrana plasmatica e un processo di trasduzione del segnale.4 Il VDR, estremamente specifico nel suo legame, è molto simile ai recettori per gli ormoni steroidei: entrambi contengono, ad esempio, il motivo zinc-finger, con il quale si legano al DNA. Effetti fisiologici del calcitriolo L’ 1,25-diidrossicolecalciferolo è un ormone ipercalcemizzante: la sua azione produce un aumento del calcio plasmatico. Le cellule bersaglio del calcitriolo si trovano a livello intestinale e nelle paratiroidi, ma anche nel tessuto osseo e nel rene. Azione a livello intestinale. Questa è l’azione più importante. Il sito d’azione è il duodeno e parte del digiuno. L’1,25-didrossicolecalciferolo stimola l’assorbimento 3

È stato riportato che questa stessa proteina lega l’actina che riesce a penetrare nel circolo sanguigno (in seguito ad un danno cellulare, per esempio). 4 Tuttavia anche questo secondo pathway va ad influenzare, come parte dei suoi effetti, l’espressione genica.

136

5 Ormoni derivati dalla vitamina D del calcio da parte degli enterociti. Questo è ottenuto incrementando l’espressione di proteine di trasporto, come il canale del calcio TRPV6, che permette il trasporto intracellulare del calcio a livello della membrana apicale delle cellule, o di proteine leganti il calcio, come la calbindina, che promuove il trasporto del calcio dalla porzione apicale della cellula a quella basolaterale. Una pompa ATP-dipendente a livello della membrana basolaterale pompa il calcio fuori dall’enterocita, nel circolo sanguigno. Il trasporto del calcio stimolato dal calcitriolo è di tipo attivo, ed chiamato "via transcellulare". Nelle altre porzioni dell’intestino avviene un trasporto di calcio di tipo passivo ("via paracellulare"), indipendente dalla regolazione ormonale. Azione a livello delle paratiroidi. Riduce la trascrizione del gene del PTH. Poiché la sintesi del calcitriolo è fortemente attivata dal paratormone (vedi anche sez. 2.3.1, pag. 73), questo rappresenta una sorta di feedback negativo indiretto, ed evita fluttuazioni eccessive della calcemia. Azione sui tubuli renali. Stimola il riassorbimento del calcio e del fosfato nella porzione distale dei tubuli renali, facendo sì che un maggior numero di ioni calcio vengano reimmessi nella circolazione. Azione sul rene. Il calcitriolo, con un meccanismo di feedback negativo diretto, diminuisce l’espressione della 1-idrossilasi, ed aumenta l’espressione della 24-idrossilasi, inibendo quindi la propria sintesi e promuovendo la formazione di metaboliti inattivi. Azione a livello osseo. Il calcitriolo stimola gli osteoclasti nella loro produzione di idrolasi acide, e stimola il loro differenziamento, incrementandone quindi il numero. Questo fa sì che il riassorbimento osseo aumenti, con innalzamento di calcemia e fosfatemia. Per quanto riguarda il metabolismo del calcio, nonostante l’1,25-colecalciferolo contribuisca a promuovere il riassorbimento osseo, in caso di una deficienza di vitamina D si osservano patologie a carico del sistema scheletrico (come il rachitismo nei bambini), perché il calcio non può essere assorbito in maniera adeguata, e la disponibilità di calcio è un presupposto per la deposizione di matrice inorganica nelle ossa. Altri effetti. Il calcitriolo ha anche altri effetti, solo in parte conosciuti, che vanno molto al di là del metabolismo del calcio. Sono stati dimostrati effetti a livello della

137

5 Ormoni derivati dalla vitamina D proliferazione e del differenziamento di diversi citotipi, molti dei quali correlati al sistema immunitario, oltre che azione anti-infiammatoria. Inoltre, è stato osservato che il calcitriolo è necessario per la normale secrezione dell’insulina. Correlazioni cliniche: ipocalcemia ed ipercalcemia L’ipocalcemia si instaura quando la concentrazione di calcio totale plasmatico scende al di sotto di 8.5-9 mg/dL (in presenza di una concentrazione normale di proteine plasmatiche) o 4.5-4.7 mg/dL se si considera solo la frazione libera (calcio ionizzato). Tra le cause di ipocalcemia: l’ipoparatiroidismo (deficit di secrezione di PTH; può verificarsi nel corso di malattie autoimmuni o in seguito a danneggiamento accidentale delle paratiroidi nel corso di interventi chirurgici sulla tiroide), lo pseudoipoparatiroidismo (in cui la secrezione di PTH è normale, ma i tessuti sono resistenti all’azione dell’ormone), deficit di vitamina D, malattie renali che portano a perdita di calcio con le urine. Ci sono poi altre cause, più o meno rare (es. pancreatite, farmaci). L’ipocalcemia può essere asintomatica; quando è evidente, il quadro clinico dell’ipocalcemia è dominato dalle manifestazioni neurologiche: crampi muscolari e spasmi fino alla tetania, iperreflessia, convulsioni, parestesie, sintomi psichiatrici (depressione o irritabilità, psicosi), aritmie cardiache. Il meccanismo della tetania non è chiaro; sembra che l’ipocalcemia incrementi la permeabilità delle membrane delle cellule eccitabili al sodio, facilitandone la depolarizzazione. L’ipercalcemia è definita come una concentrazione di calcio totale superiore a 10.5 mg/dL o superire a 5.2 mg/dL se si considera solo il calcio ionizzato. Le cause più frequenti sono rappresentate da iperparatiroidismo (eccessiva secrezione di PTH), eccesso di vitamina D e tumori. L’iperparatiroidismo è primitivo quando la secrezione abnorme di PTH è causata da una malattia delle paratiroidi (genetica o acquisita, es. un adenoma delle paratiroidi), secondario quando le paratiroidi sono stimolate eccessivamente da un’ipocalcemia cronica e si sviluppa un’iperplasia ghiandolare, che porta ad una secrezione di PTH inappropriata rispetto ai livelli di calcemia. L’ipercalcemia nei tumori è causata dalla stimolazione del riassorbimento osseo con varii meccanismi, ad esempio la secrezione di PTH-related peptide (PTHrP); si tratta di una proteina il cui frammento N-terminale è simile a quello del PTH, e che ne mima gli effetti. Anche l’ipercalcemia può essere asintomatica. Le manifestazioni cliniche salienti sono riassunte nello mnemonic "stones, bones, groans, moans, thrones and psychiatric overtones", ovverosia: calcoli (soprattutto renali); dolori ossei; letargia, debolezza muscolare, anoressia, nausea, vomito, dolori addominali, stipsi (groans e moans = lamenti); poliuria (throne = il

138

5 Ormoni derivati dalla vitamina D

trono, cioè la toilette...); confusione, depressione, ansia, allucinazioni. A questo si devono aggiungere le possibili aritmie.

139

6 Ormoni steroidei 6.1 Struttura e generalità Il termine steroidi designa una pletora di composti strutturalmente correlati al ciclopentanoperidrofenantrene, uno sterano. Questa struttura è formata dalla fusione di quattro anelli ciclici alifatici: tre molecole di cicloesano, a cui ci si riferisce con le lettere A B e C e note collettivamente come peridrofenantrene, e un ciclopentano, identificato dalla lettera D (fig. 6.1). È una struttura condivisa da tutti gli steroidi, che si differenziano essenzialmente per gruppi funzionali sostituiti agli idrogeni. La sostituzione di uno o più idrogeni con gruppi -OH dà origine per esempio agli steroli. Nell’uomo, quando si parla di “steroidi” ci si riferisce agli ormoni steroidei. Questi sono generalmente suddivisi in due gruppi: • ormoni adrenocorticoidi: comprendono mineralcorticoidi (il cui principale rappresentante è l’aldosterone) e glucocorticoidi (cortisolo e corticosterone). Sono composti a 21 atomi di carbonio. • ormoni sessuali e progestinici: comprendono gli androgeni (androstenedione, testosterone, diidrotestosterone), a 19 C, e gli estrogeni (estradiolo, estriolo, estrone), a 18 C. Tra i progestinici, a 21 C, il principale è il progesterone. Sono tutti sintetizzati a partire dal colesterolo, uno sterolo caratterizzato da: • un -OH in posizione 3; 12 11 1 2 3

A 4

9

10

B 5

13 17

C D

16

14 15

8 7

6

Figura 6.1: Struttura generale degli steroidi e nomenclatura.

6 Ormoni steroidei • un doppio legame tra le posizioni 5 e 6; • due gruppi metilici in posizione 10 e 13; • una catena laterale in posizione 17. Le fonti del colesterolo utilizzato per sintetizzare gli ormoni sono in parte di origine esogena (colesterolo introdotto con l’alimentazione, in particolare con alimenti di origine animale), in parte di origine endogena (colesterolo sintetizzato ex novo). Rivediamo sinteticamente i processi con cui questo composto si rende disponibile alle cellule.1 • Il colesterolo esogeno, alimentare, viene assorbito a livello dell’intestino (insieme ai triacilgliceroli) all’interno dei chilomicroni, che circolano nel sistema linfatico, per poi venire immessi nel circolo sanguigno, quindi trasportati al fegato. Qui il colesterolo viene “impacchettato” nelle lipoproteine LDL (a bassa densità), e inviato ai tessuti periferici. Il colesterolo entra nelle cellule con endocitosi mediata dal recettore per le LDL; a questo punto può andare incontro a diversi destini: per esempio, può entrare a far parte della membrana plasmatica, oppure - ed è il destino che prenderemo in esame tra poco - in alcuni tessuti (gonadi, corteccia della ghiandola surrenale, placenta) può essere utilizzato come precursore per la sintesi degli ormoni steroidei. • Per quanto riguarda il colesterolo endogeno, rivediamo il processo a grandi linee: 1. A partire da acetil-CoA viene sintetizzato mevalonato; 2. Il mevalonato viene decarbossilato per formare delle unità isoprenoidi; 3. Sei di queste unità vengono condensate nello squalene; 4. Lo squalene viene ciclizzato a formare lanosterolo; 5. Il lanosterolo è ulteriormente modificato in colesterolo; La biosintesi del colesterolo avviene soprattutto nel fegato (20-25%), a livello dell’intestino, nella zona corticale della ghiandola surrenale, negli organi dell’apparato riproduttore; notare come questi ultimi due organi siano proprio quelli maggiormente coinvolti nella steroidogenesi. Qualunque sia la fonte del colesterolo, nelle gonadi (ovaie o testicoli), nella zona corticale della ghiandola surrenale e (almeno in alcuni momenti fisiologici) placenta, questo viene utilizzato come precursore per la sintesi degli ormoni steroidei. Esiste 1

Per i dettagli, si rimanda ad un testo di biochimica, ad esempio: D. L. Nelson e M. M. Cox. Lehninger Principles of Biochemistry. Sixth Edition. W. H. Freeman, 2012, Chapter 21.

141

6 Ormoni steroidei anche una sintesi di ormoni steroidei in organi diversi da questi: ne parleremo dopo. Comunque sia, in ciascuno di questi organi, il colesterolo viene innanzi tutto convertito in pregnenolone in seguito alla rimozione della catena laterale in C17. Questa è la reazione di commissionamento del colesterolo verso la biosintesi degli ormoni steroidei. Il pregnenolone, a seconda del tessuto e delle esigenze, potrà poi subire diverse reazioni (che avranno luogo nei mitocondri oppure nel reticolo endoplasmatico) che porteranno alla sintesi dei varii ormoni. Adesso vedremo la sintesi di ciascuno, esaminando un tessuto alla volta.

6.2 Ormoni della corteccia della ghiandola surrenale Per un breve cenno all’anatomia e alla struttura delle ghiandole surrenali, si veda il box “Dove siamo?” a pagina 84.

6.2.1 Corticosteroidi: mineralcorticoidi e glucocorticoidi Sede di elaborazione La ghiandola surrenale sintetizza, a livello della zona corticale, gli ormoni adrenocorticoidi più una piccola quantità di androgeni (ma non il testosterone). Schematicamente: • zona glomerulosa: mineralcorticoidi (es. aldosterone); • zona fascicolata: glucocorticoidi (es. cortisolo), e corticosterone; • zona reticolata: androgeni (es. androstenedione), e glucocorticoidi. Un modo per ricordarsi gli ormoni prodotti dalle zone della surrenale è tenere a mente la frase: “Go Find Rex, Make Good Sex.”2 Biosintesi La prima reazione che incontriamo è la conversione del colesterolo in pregnenolone. Ricordiamo che questo è lo step di commissionamento, oltre che la reazione velocità-limitante. L’enzima che catalizza la reazione si trova all’interno dei mitocondri. Vediamo più in dettaglio come si svolge questa tappa. Il colesterolo nelle cellule delle ghiandole surrenali si trova esterificato in gocce lipidiche nel citoplasma (apprezzabili in microscopia elettronica). È evidente che uno 2

“Go Find Rex” aiuta a ricordarsi le zone della corticale, dall’esterno all’interno (Glomerulosa, Fascicolata, Reticolata); “Make Good Sex” indica i principali ormoni che vengono rispettivamente sintetizzati dalle tre zone (Mineralcorticoidi, Glucocorticoidi, ormoni Sessuali).

142

6 Ormoni steroidei H 3C O2

NADPH

O

NADP +

CH

+ HO

Colesterolo

O

Isocaproaldeide

HO

CYP450 11A1

143

Pregnenolone

Figura 6.2: Reazione di conversione del colesterolo in pregnenolone. Il pregnenolone è il precursore di molti ormoni che saranno illustrati in seguito.

dei prerequisiti per il procedere della via biosintetica sia la disponibilità di substrato, dunque il colesterolo deve innanzi tutto essere liberato e trasportato dove si svolge la reazione, cioè all’interno del mitocondrio. La mobilizzazione del colesterolo è una tappa regolata da segnali differenti nella zona glomerulosa (dove è stimolata dall’angiotensina II) e nelle zone fascicolata e reticolata (dove è stimolata dall’ACTH) (vedi Secrezione e Regolazione). Entrambi i segnali comunque attivano una esterasi, la quale agisce sulle gocce lipidiche e promuove la mobilizzazione del colesterolo. Il colesterolo penetra nella membrana esterna dei mitocondri, e viene traslocato a livello della membrana interna del mitocondrio da una proteina detta StAR (Steroidogenic Acute Regulatory protein), anche questa regolata. All’interno della matrice mitocondriale si trova un importante membro della numerosa famiglia dei citocromi P450 (che conta più di 4500 membri!), CYP11A1. Come altri citocromi, il CYP450 11A1 catalizza una reazione monossigenasi: utilizzando un ossigeno a partire dall’O2 , l’attività enzimatica catalizza l’idrossilazione di un substrato. L’altro ossigeno invece è ridotto ad H2 O utilizzando il potere riducente del NADPH. Questo tipo di reazione merita attenzione per diverse ragioni: un buon motivo è rappresentato dal fatto che questo è un potenziale “luogo metabolico” dove può avvenire formazione di ROS (Reactive Oxygen Species) per incompleta riduzione dell’ossigeno. Nel caso del colesterolo, la reazione che avviene è illustrata in figura 6.2. Il meccanismo di reazione comporta due idrossilazioni sequenziali, realizzate secondo le modalità appena viste, sul C22 e sul C20. Si formano quindi, come intermedi di reazione, prima 22-idrossicolesterolo, poi 20,22-diidrossicolesterolo. Infine, avviene il taglio ossidativo della catena laterale, con formazione di isocaproaldeide e pregnenolone (21 C). Il pregnenolone ha a questo punto diversi possibili destini. In generale, si tratta di reazioni a livello del mitocondrio o del REL che coinvolgono numerose idrossilasi (che richiedono O2 e NADPH), alcune deidrogenasi, una isomerasi e una liasi. Queste

6 Ormoni steroidei reazioni sono diverse a seconda della zona della corticale. Le diverse sequenze di reazioni portano ai composti che sono secreti dalle zone della corticale. Riferendoci agli schemi delle pagine 145, 146 e 147 esaminiamo come procede la sintesi. Il punto di partenza è il pregnenolone, in alto a sinistra. Zona glomerulosa. Osserviamo la figura 6.3 (pagina 145). Le cellule di questa zona della corteccia non esprimono l’enzima 17 α-idrossilasi, dunque la biosintesi procedere verso il progesterone (21 C). La catalisi è a carico di due enzimi del REL: • 3 β-idrossisteroide deidrogenasi (ossida il gruppo -OH sul C3 a gruppo chetonico); • Δ5,4 -isomerasi (sposta il doppio legame dalle posizioni 5,6 a 4,5). In generale, tutte le idrossilasi del REL che incontreremo sono citocromi. Un’altra idrossilasi del REL converte il progesterone in 11-deossicorticosterone (DOC). Questo è un mineralcorticoide, ma ha scarsa attività e non viene secreto in quantità apprezzabili: il suo ruolo metabolico è essenzialmente di fungere da precursore dell’aldosterone. I successivi enzimi sono mitocondriali. L’11- β-idrossilasi catalizza la sintesi del corticosterone, che presenta attività mineralcorticoide e glucocorticoide. L’azione sequenziale delle attività enzimatiche 18-idrossilasi e deidrogenasi, che complessivamente inseriscono un gruppo aldeidico in C18, portano alla sintesi dell’aldosterone. Zona fascicolata. Le reazioni sono illustrate nella figura 6.4 (pagina 146). A livello della zona fascicolata avviene gran parte della sintesi dei glucocorticoidi (in parte avviene anche nella zona reticolata), che viene condotta da tre idrossilasi, in grado di inserire gruppi -OH a livello di C17, C21, C11. Come prima, il composto di partenza è il pregnenolone. Nella maggior parte dei casi, questo diviene substrato della 17- α-idrossilasi (REL) ottenendo 17-idrossipregnenolone, che viene poi trasformato in 17-idrossiprogesterone, per subire le altre due idrossilazioni in sequenza. Infine, si ottiene cortisolo. Una minor quota di pregnenolone viene convertito prima in progesterone e poi idrossilato in 17. Occasionalmente, una parte del pregnenolone viene indirizzata alla sintesi dei mineralcorticoidi, ma le cellule della zona fascicolata non esprimono né la 18-idrossilasi, né la 18-idrossisteroide deidrogenasi, dunque si arriva al massimo fino al corticosterone.

144

O

C

HO

Pregnenolone

H 3C

C

O OH

HO

17,20-Liasi

H 3C

17α-Idrossilasi

6 Ormoni steroidei

O

HO

Deidroepiandrosterone

17-Idrossipregnenolone

O

C

O

Progesterone

H 3C

C

O OH

O

17-Idrossiprogesterone

17,20-Liasi

H 3C

17α-Idrossilasi

3β-Idrossisteroide deidrogenasi - Δ5,4 -Isomerasi

O

O

Δ 4 Androstene-3,17-dione

21 C Idrossilasi

HOCH2

HOCH2 O C

O

C

O OH

O

11-Deossicorticosterone

11-Deossicortisolo

11β-Idrossilasi

CH2OH C

HOCH2

O

OH

HO

O

C

O OH

O

Cortisolo

Corticosterone

18-Idrossilasi Zona glomerulosa 18-Idrossisteroide deidrogenasi

O HO

O

CH

CH2OH C

Zona fascicolata

Zona reticolare

O

Aldosterone

Zona midollare Zona corticale

Figura 6.3: Biosintesi degli ormoni corticosteroidei. Nella zona glomerulosa (in rosso nel riquadro grande) avvengono le reazioni evidenziate.

145

O

C

HO

Pregnenolone

H 3C

C

O OH

HO

17,20-Liasi

H 3C

17α-Idrossilasi

6 Ormoni steroidei

O

HO

Deidroepiandrosterone

17-Idrossipregnenolone

O

C

O

Progesterone

H 3C

C

O OH

O

17-Idrossiprogesterone

17,20-Liasi

H 3C

17α-Idrossilasi

3β-Idrossisteroide deidrogenasi - Δ5,4 -Isomerasi

O

O

Δ 4 Androstene-3,17-dione

21 C Idrossilasi

HOCH2

HOCH2 O C

O

C

O OH

O

11-Deossicorticosterone

11-Deossicortisolo

11β-Idrossilasi

CH2OH C

HOCH2

O

OH

HO

O

C

O OH

O

Cortisolo

Corticosterone

18-Idrossilasi Zona glomerulosa

18-Idrossisteroide deidrogenasi

O HO

O

CH

CH2OH C

Zona fascicolata

Zona reticolare

O

Aldosterone

Zona midollare Zona corticale

Figura 6.4: Biosintesi degli ormoni corticosteroidei. Nella zona fascicolata (in rosso nel riquadro grande) avvengono le reazioni evidenziate.

146

O

C

HO

Pregnenolone

H 3C

C

O OH

HO

17,20-Liasi

H 3C

17α-Idrossilasi

6 Ormoni steroidei

O

HO

Deidroepiandrosterone

17-Idrossipregnenolone

O

C

O

Progesterone

H 3C

C

O OH

O

17-Idrossiprogesterone

17,20-Liasi

H 3C

17α-Idrossilasi

3β-Idrossisteroide deidrogenasi - Δ5,4 -Isomerasi

O

O

Δ 4 Androstene-3,17-dione

21 C Idrossilasi

HOCH2

HOCH2 O C

O

C

O OH

O

11-Deossicorticosterone

11-Deossicortisolo

11β-Idrossilasi

CH2OH C

HOCH2

O

OH

HO

O

C

O OH

O

Cortisolo

Corticosterone

18-Idrossilasi Zona glomerulosa

18-Idrossisteroide deidrogenasi

O HO

O

CH

CH2OH C

Zona fascicolata

Zona reticolare

O

Aldosterone

Zona midollare Zona corticale

Figura 6.5: Biosintesi degli ormoni corticosteroidei. Nella zona reticolare (in rosso nel riquadro grande) avvengono le reazioni evidenziate.

147

6 Ormoni steroidei Zona reticolata. L’illustrazione di riferimento è la figura 6.5 (pagina 147). Il pregnenolone viene idrossilato in posizione 17 come accadeva nella zona fascicolata, con produzione di 17-idrossipregnenolone. Quest’ultimo viene destinato per lo più alla sintesi dei glucocorticoidi, ma una frazione minore diviene substrato di una liasi. Questa attività liasica è fornita da una subunità che si trova complessata con la subunità che presenta l’attività catalitica 17-idrossilasi. La liasi catalizza la rimozione ossidativa di ciò che rimaneva della catena laterale del colesterolo, elaborando come prodotto deidroepiandrosterone. Questo è un androgeno, ma la sua azione è piuttosto scarsa, e il suo significato è soprattutto quello di precursore di androgeni più potenti. La conversione avviene grazie a due enzimi che abbiamo già incontrato, 3 β-idrossisteroide deidrogenasi (ossida l’-OH sul C3 a gruppo chetonico) e Δ5,4 -isomerasi (sposta il doppio legame dalle posizioni 5,6 a 4,5), e che agiscono anche su questo substrato per produrre androstenedione. Secrezione e Regolazione Abbiamo visto che per la sintesi di questi ormoni è necessaria la liberazione del colesterolo. Nella zona fascicolata e reticolata il segnale per la sintesi dei glucocorticoidi, che impartisce anche l’ordine per la liberazione del colesterolo, è portato dall’ormone adrenocorticotropo (ACTH), secreto dall’adenoipofisi in risposta ad un segnale dall’ipotalamo. L’ACTH si lega a recettori sulle cellule della corteccia surrenale; si tratta di recettori legati a proteine G, che scatenano la cascata intracellulare consueta: l’adenilato ciclasi converte l’ATP in cAMP, che aumenta vertiginosamente la propria concentrazione. Questa cascata intracellulare di trasduzione del messaggio provoca due effetti principali: • In un tempo molto breve (pochi minuti) il cAMP attiva una PKA che fosforila, attivandola, la esterasi, che agisce sulle gocce lipidiche e promuove la mobilizzazione del colesterolo. La PKA fosforila inoltre la Steroidogenic Acute Regulatory (StAR) protein, che permette la traslocazione del colesterolo nella membrana interna del mitocondrio. È una proteina di circa 50 kDa, di fatto ACTH-dipendente, che nell’uomo è causa di patologie quando non è funzionante. • In un tempo più lungo (alcune ore) si ha aumento della trascrizione degli enzimi coinvolti nella biosintesi degli ormoni steroidei. Nella zona glomerulosa (quella più esterna) il segnale è dato principalmente dall’angiotensina II. Questa si lega al proprio recettore accoppiato ad una proteina G, che attiva la fosfolipasi C per generare IP3 e diacilglicerolo. Come di consueto, questi secondi messaggeri attivano una PKC e producono un innalzamento della

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6 Ormoni steroidei concentrazione intracellulare di Ca2+ . La chinasi procede poi alla fosforilazione degli enzimi coinvolti nella sintesi dell’aldosterone, attivandoli ed incrementando la velocità complessiva della via metabolica. Inoltre, si evidenziano effetti simili a quelli che si osservano dopo stimolazione da parte dell’ACTH.3 Il fatto che nella zona glomerulosa lo stimolo per la secrezione giunga dall’angiotensina II significa che la secrezione dei mineralcorticoidi, prodotto principale di questa area, si verifica in risposta una riduzione del volume ematico o ad una perdita di sali. A questo proposito, si ammette che anche il potassio contribuisca a regolare la secrezione dei mineralcorticoidi. Ricapitolando: • la sintesi ed il rilascio dei mineralcorticoidi (zona glomerulosa della corteccia del surrene) è soprattutto sotto il controllo dell’angiotensina II, che viene prodotta in seguito ad una riduzione del volume ematico o perdita di sali minerali. Un ruolo minore è rivestito da ACTH. Anche la concentrazione degli ioni potassio regola questi ormoni; • La sintesi ed il rilascio dei glucocorticoidi e degli androgeni surrenalici (zona fascicolata e reticolata) è sotto il controllo neuroendocrino dell’ACTH, in risposta a situazioni di stress o malattia. Trasporto nel plasma e degradazione Il principale glucocorticoide rilasciato è il cortisolo, seguito dal corticosterone. Nel plasma, questi composti sono gli adrenocorticoidi più abbondanti; si trovano per lo più legati non covalentemente a proteine di trasporto, e solo una piccola frazione circola in forma libera. Come sempre, quest’ultima quota rappresenta la frazione biologicamente attiva, mentre la quota legata alle proteine ha la funzione di una riserva di ormone in equilibrio dinamico con la forma libera. Il fatto di essere legati a proteine protegge questi composti dal metabolismo di tipo degradativo, e ne prolunga l’emivita a diverse decine di minuti. Le proteine di trasporto sono: • Transcortina, o globulina legante i corticosteroidi, o α2-globulina legante i glucocorticoidi, sintetizzata dal fegato; • Albumina, che lega questi composti in modo aspecifico; I glucocorticoidi, dalla circolazione, diffondono • verso i tessuti bersaglio; 3

Peraltro, si ritiene che anche questo ormone entri direttamente in gioco nella regolazione, anche se con un ruolo minore.

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6 Ormoni steroidei • nel tessuto adiposo, dove prosegue una parte del loro metabolismo. Questo tessuto non è un bersaglio, ma esprime enzimi in grado di convertire i glucocorticoidi in ormoni sessuali, in particolare estrogeni. • in fegato e rene, dove ha luogo il metabolismo catabolico. Qui gli ormoni vengono inattivati a 17-idrossicorticosteroidi, e spesso coniugati per formare solfati e glucuronati, escreti con le urine. In particolare, il cortisolo viene convertito a cortisone, che ha attività biologica inferiore, ed entrambi poi vengono idrossilati. Per quanto riguarda i mineralcorticoidi, il principale ormone rilasciato è l’aldosterone. Nel plasma ha una concentrazione estremamente bassa, nell’ordine dei centesimi di μ/100 mL. Si lega scarsamente alle proteine di trasporto degli altri adrenocorticoidi, mentre è più affine all’albumina. Ha un’emivita breve rispetto ad altri ormoni lipofili (poche decine di minuti). Viene metabolizzato soprattutto nel fegato, dove avviene la coniungazione con un derivato dell’acido glucuronico, e viene escreto con le urine principalmente in questa forma. Tra gli androgeni, vengono rilasciati soprattutto androstenedione e deidroepiandrosterone. Quest’ultimo è frequentemente esterificato al solfato, ed è soprattutto in questa forma che si trova in circolo. La restante quota in parte si lega ad una proteina di trasporto (Sex Hormone Binding Protein) a cui si legano altri ormoni sessuali, e in minor parte all’albumina. Nei tessuti periferici entrambi gli ormoni sono convertiti in androgeni ed estrogeni, soprattutto estradiolo. Una certa quota degli ormoni sessuali in circolo deriva da androgeni surrenalici. Recettori Gli adrenocorticoidi esercitano la loro attività biologica grazie a recettori intracellulari, come succede caratteristicamente per gli altri ormoni lipofili. I recettori degli ormoni steroidei, attivati dal legame con l’ormone, sono in grado di agire come fattori di trascrizione, legandosi a specifiche sequenze di DNA dette Response Elements (RE). In questo modo, gli ormoni steroidei possono influenzare l’espressione genica. Questo tipo di azione è tipicamente lenta, perché presuppone numerosi passaggi (trascrizione, processamento dell’mRNA, traduzione, etc.), cosicché l’azione di questi ormoni si evidenzia dopo ore o giorni. Glucocorticoidi e mineralcorticoidi hanno due tipi di recettori diversi, anche se strettamente correlati: vi è un elevato grado di omologia a livello del dominio che lega l’ormone, mentre il dominio che lega il DNA è praticamente identico. I recettori dei glucocorticoidi sono espressi in moltissimi tessuti, e quello più comune è il recettore di tipo α; sono estremamente specifici per i glucocorticoidi. I recettori dei mineralcorticoidi invece sono meno specifici, e sono in grado di legarsi sia ai mineralcorticoidi che

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6 Ormoni steroidei ai glucocorticoidi - tuttavia, l’aldosterone si dissocia molto lentamente dal recettore. Le cellule che esprimono i recettori dei mineralcorticoidi presentano dei sistemi per evitare che i recettori si leghino esclusivamente ai glucocorticoidi, come l’espressione di enzimi in grado di inattivare i glucocorticoidi. Si ritiene che gli steroidi possano anche avere effetti non genomici, in certi casi attraverso la mediazione con recettori extracellulari, ma le modalità non sono chiare. Effetti fisiologici L’aldosterone è coinvolto nella modulazione dell’escrezione di diversi ioni plasmatici. Agisce soprattutto a livello delle cellule della porzione distale dei tubuli e nei dotti collettori nel rene, promuovendo • incremento del riassorbimento del Na+ , attraverso una stimolazione del trasporto transcellulare dello ione. Questo avviene grazie ad un aumento della trascrizione dei geni per i trasportatori del sodio sulla membrana apicale, che sottraggono sodio al filtrato glomerulare, e per le pompe Na+ /K+ ATPasi esposte sulle membrane basolaterali delle cellule, che esportano sodio intracellulare ed importano potassio; • incremento dell’escrezione di K+ , H+ e NH4+ . Questa azione è in parte favorita indirettamente dall’aumentato riassorbimento di Na+4 , in parte dall’aumento dell’espressione di specifici canali, per esempio H+ -ATPasi. L’aldosterone ha quindi anche un ruolo nel regolare l’acidità del plasma. L’aldosterone agisce anche incrementando il riassorbimento di sodio a livello delle ghiandole salivari e sudoripare, e promuovendo l’escrezione di K+ nel colon. In definitiva, l’aldosterone gioca un ruolo molto importante nella regolazione a lungo termine della pressione sanguigna. I recettori per l’aldosterone sono espressi da un numero di citotipi minore rispetto agli altri adrenocorticoidi, ma la risposta che suscita è più potente. Inoltre, questo ormone ha effetto anche su alcune aree cerebrali. Studi recenti sembrano aver trovato evidenze di un’azione paracrina di questo ormone, almeno in certi tessuti. Il cortisolo e in generale i glucocorticoidi hanno un’azione potenzialmente molto estesa, dato che quasi tutte le cellule esprimono recettori. Influenzano il metabolismo intermedio di aminoacidi, lipidi e glicidi; regolano il sistema immunitario e hanno azione antiinfiammatoria; modulano l’umore nel sistema nervoso centrale. In tutti i casi, questi effetti vengono modulati tramite la regolazione dell’espressione genica degli enzimi coinvolti:

4

Per i dettagli,si rimanda ai testi di fisiologia.

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6 Ormoni steroidei • Aumento della gluconeogenesi e della glicogenolisi epatiche; incremento della glicogenolisi e della gluconeogenesi periferica; incremento dei livelli plasmatici di glucosio, e inibizione dell’utilizzo periferico di questo zucchero (azione anti-insulinica); promuove la sintesi di RNA e la sua traduzione; • Aumento della degradazione delle proteine muscolari, inibizione dell’utilizzo catabolico degli aminoacidi – questo serve per rendere disponibili aminoacidi per la gluconeogenesi; • Incremento della lipolisi nel tessuto adiposo, con mobilizzazione degli acidi grassi. Sia l’azione rivolta all’incremento della degradazione proteica che questo incremento della lipolisi hanno un effetto di risparmio del glucosio: il cortisolo devia il metabolismo verso l’utilizzo di altri substrati; • Promuove la ritenzione idrica, e favorisce l’ipertensione causata dalle catecolammine; • A livello delle cellule del sistema immunitario, aumenta la produzione di citochine antiinfiammatorie e riduce la produzione di citochine proinfiammatorie; induce la produzione di lipocortine, che a loro volta inibiscono la fosfolipasi A 2, impedendo la sintesi di prostaglandine e leucotrieni; riduce il numero della maggior parte dei leucociti circolanti, interferendo con l’azione dei fattori di crescita, e ne ostacola la motilità; tutto questo si traduce in un complessivo effetto di soppressione della risposta immunitaria. • A livello del sistema nervoso centrale modula l’umore e le emozioni, e inibisce tramite feedback negativo il rilascio di CRH e e ACTH. Per quanto riguarda gli androgeni surrenalici, non è chiaro se abbiano una loro azione in quanto tali, e nel caso, quale sia; è certo che gran parte vengono convertiti in altri ormoni sessuali e quindi sicuramente una gran parte della loro azione è svolta sotto questa forma. Correlazioni cliniche: Sindrome e malattia di Cushing La sindrome di Cushing è il caratteristico quadro clinico provocato da una condizione sufficientemente prolungata nel tempo di eccesso di ormoni corticosteroidei (ipercorticosurrenalismo o ipercortisolismo; quest’ultimo è un termine usato soprattutto nella letteratura internazionale). Una condizione di abnorme presenza di cortisolo in circolo può realizzarsi:

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6 Ormoni steroidei

• a causa di una ipersecrezione di ACTH, che ne stimola la produzione (e in questo caso l’ipercorticosurrenalismo è detto ACTH-dipendente perché è secondario allo stimolo dell’ACTH); • per una ipersecrezione incontrollata di cortisolo, che in qualche modo si è svincolata dal controllo dell’ACTH (ipercorticosurrenalismo ACTH-indipendente); • in seguito a una terapia prolungata con cortisonici (quindi il cortisolo è esogeno, ed anche in questo caso l’ipercorticosurrenalismo è ACTH-indipendente); in quest’ultima situazione si parla di sindrome di Cushing iatrogena. L’ipersecrezione di ACTH può derivare da un tumore dell’ipofisi che ha acquisito la capacità di secernere ACTH in modo incontrollato, indipendentemente dal controllo del CRH; in questo caso si parla di malattia o morbo di Cushing (quindi il morbo di Cushing è un caso particolare di sindrome di Cushing). Più raramente, ci può essere una produzione di ACTH ectopico, cioè da un sito diverso da quello fisiologico (per esempio da parte di un tumore, tipicamente i tumori a piccole cellule del polmone). L’ipersecrezione incontrollata di cortisolo può essere dovuta a tumori della corticale del surrene oppure a iperplasia del surrene. In questo caso, così come nel caso di una somministrazione di cortisolo esogeno, l’asse ipotalamo-ipofisario è soppresso (l’eccesso di corticosteroidi inibisce con il feedback negativo la secrezione di CRH ed ACTH). La sindrome di Cushing si manifesta con un corteo molto ricco di segni e sintomi classici: obesità con un pattern tipico (è detta tronculare, cioè a carico di collo, torace ed addome); ipertensione; alterazioni cutanee (acne, lividi che insorgono facilmente e lenta guarigione delle ferite); irsutismo; alterazioni del metabolismo glicidico fino al diabete; osteoporosi; debolezza; sintomi da interessamente del sistema nervoso centrale, con alterazioni del tono dell’umore, fino ad allucinazioni e psicosi.

Correlazioni cliniche: Insufficienza surrenalica e malattia di Addison L’insufficienza surrenalica o iposurrenalismo è il quadro clinico provocato da una insufficiente produzione di ormoni da parte della corticale surrenale (soprattutto mineralcorticoidi e glucocorticoidi). L’insufficienza surrenalica viene definita primaria quando si realizza per un problema delle ghiandole surrenali; secondaria quando il problema è ipofisario; terziara quando è ipotalamico.

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6 Ormoni steroidei

Alla base delle forme primarie c’è quindi un difetto di produzione, mentre nelle forme secondarie o terziarie c’è un difetto di stimolazione. L’insufficienza surrenalica primaria è nota come malattia di Addison. È una condizione abbastanza rara, in cui c’è una distruzione o una disfuzione della ghiandola surrenale. Nei paesi industrializzati riconosce nella maggior parte dei casi una patogenesi autoimmune: si verifica cioè una reazione immunitaria rivolta contro la corticale surrenale, che va incontro ad atrofia. L’iposurrenalismo secondario e terziario può essere una consequenza di qualunque patologia che comprometta la secrezione, rispettivamente, di ACTH da parte dell’ipofisi e di CRH da parte dell’ipotalamo. L’insufficienza surrenalica è difficile da sospettare clinicamente perché i sintomi non sono caratteristici e si sviluppano lentamente, in modo insidioso; tuttavia diagnosticarla è importante perché se non riconosciuta e trattata può portare a morte. Tra i segni ed i sintomi più comuni dell’ipocorticosurrenalismo primitivo: stanchezza, debolezza, perdita di peso, disidratazione, ipovolemia, ipotensione (ridotta pressione arteriosa), dolori addominali e muscolari, nausea e vomito. Nel corso delle indagini laboratoristiche possono emergere ipoglicemia, iponatremia, iperkaliemia ed acidosi. Alcuni pazienti riferiscono un desiderio particolare di assumere cibi salati. Inoltre, nell’ipocorticosurrenalismo primario è talora possibile osservare una iperpigmetazione di tutta la cute o in corrispondenza di particolari aree (cicatrici, pieghe palmoplantari). Questo fenomeno è spiegabile in base al meccanismo di feedback che regola l’asse ipotalamo-ipofisi-surrene. La produzione di ACTH è aumentata (per tentare di compensare ai ridotti livelli di steroidi corticosurrenalici); il precursore dell’ACTH (la proopiomelanocortina o POMC) tuttavia dà origine anche a varie forme di MSH, il melanocyte-stimulating hormone. Nell’iposurrenalismo primario il quadro clinico è dovuto alla carente produzione di glucocorticoidi e mineralcorticoidi, mentre nell’iposurrenalismo secondario e terziario la produzione di mineralcorticoidi è normale (perché?) e dunque segni e sintomi sono dovuti solo alla ridotta produzione di cortisolo (mancano quindi disidratazione, ipovolemia, iperkaliemia e spesso anche l’ipotensione).

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6 Ormoni steroidei

6.3 Ormoni delle gonadi 6.3.1 Androgeni ed estrogeni Generalità Prima di trattare gli ormoni prodotti dalle gonadi, è necessaria una raccomandazione. Il lettore dovrebbe liberarsi di eventuali preconcetti legati alla natura degli ormoni: non esistono ormoni “maschili” e ormoni “femminili”. Non ci si dovrebbe aspettare che nell’uomo vengano prodotti solo androgeni e nella donna solo estrogeni [13]. È vero però che l’uomo produce più androgeni che estrogeni, mentre nella donna è vero il contrario. Quindi, sia nel maschio che nella femmina sono presenti sia androgeni che estrogeni; quello che cambia è la proporzione con cui vengono sintetizzati e si ritrovano in circolo. Per esempio, gli uomini producono 5-8 mg di testosterone al giorno (tipicamente considerato un ormone “maschile”), ma anche la donna lo produce; nella donna però la produzione è molto minore, circa di 0,5 mg al giorno. Nell’uomo, il principale ormone che viene secreto è il testosterone. Tuttavia, nonostante la grande notorietà di questo metabolita al di fuori dell’ambiente scientifico, il testosterone si potrebbe considerare un pro-ormone, in quanto non è il reale depositario della massima attività fisiologica. Questa si esplica quando il testosterone viene convertito in diidrotestosterone a livello dei tessuti bersaglio – inoltre, il testosterone a livello dei tessuti periferici può essere anche convertito in estradiolo, un estrogeno. Nella donna, vengono sintetizzati androgeni con le stesse reazioni. La differenza è che vengono in gran parte aromatizzati e convertiti in estrogeni, cosisicché gli androgeni si trovano in circolo solo in piccole quantità. Gli ormoni sessuali che si ritrovano in maggiore quantità nella donna sono quindi estrone, 17 β-estradiolo e, in talune condizioni fisiologiche, progesterone ed estriolo. Sede di sintesi Gli ormoni sessuali e progestinici sono sintetizzati in gran parte dalle gonadi. Nell’uomo le gonadi sono rappresentate dai testicoli, nella donna dalle ovaie. Nell’uomo, a livello delle cellule di Leydig del testicolo avviene la quota maggiore della sintesi degli androgeni – infatti, come abbiamo visto, una parte viene prodotta dalla zona corticale della ghiandola surrenale. Le cellule di Leydig sintetizzano anche una quota di estrogeni. Sembra che una quantità anche maggiore venga sintetizzata da cellule germinali e spermatociti in via di maturazione [13], tuttavia probabilmente gran parte di questi estrogeni agiscono localmente a livello del testicolo. Nel maschio

155

6 Ormoni steroidei la quota maggiore di estrogeni circolanti è ottenuta per conversione extragonadica a partire dal testosterone [27]; questi estrogeni agirebbero soprattutto localmente, cioè là dove sono prodotti. Nella donna, a livello ovarico,le cellule della teca e cellule della granulosa sono considerate i principali citotipi coinvolti nella sintesi ormonale. Schematicamente, le cellule della teca producono androgeni, mentre le cellule della granulosa producono estrogeni. Quindi, la sede di sintesi è il follicolo in via di maturazione. Durante la menopausa, la sintesi ormonale viene portata avanti da cellule dello stroma ovarico e in siti periferici, extragonadici[10]. In entrambi i sessi una quota minore ma non trascurabile di ormoni è sintetizzata in siti extragonadici, per esempio tessuto adiposo e epidermide, che esprimono l’enzima aromatasi e sono in grado quindi di sintetizzare estrogeni [27, 38]. Biosintesi Andremo innanzi tutto ad esaminare la biosintesi del testosterone, e poi vedremo i suoi possibili destini. Le prime fasi della sintesi del testosterone sono simili a quelle viste per quanto riguarda gli adrenocorticoidi. • Il precursore è anche in questo caso il colesterolo; • la mobilizzazione e il trasporto del colesterolo nel mitocondrio avvengono nello stesso modo che abbiamo visto per gli altri ormoni steroidei. Anche in questo caso, si tratta della tappa limitante la velocità dell’intera via metabolica, e anche in questo caso è coinvolta la StAR protein. La regolazione tuttavia è effettuata da ormoni diversi (vedi il paragrafo “Secrezione e regolazione”, pag. 160). • La reazione che converte il colesterolo a pregnenolone è identica alla reazione che avviene a livello della corteccia surrenale. Anche in questo caso dunque la via di biosintesi comincia con il pregnenolone. Le reazioni sono illustrate in figura 6.6, a pagina 157. Il pregnenolone può essere convertito in testosterone seguendo due vie: • attraverso la conversione prima in deidroepiandrosterone, poi in Δ5-androstenediolo. In un certo numero di casi, il deidroepiandrosterone viene convertito in androstenedione. Questa via metabolica, detta via del deidroepiandrosterone (o Δ5), è quella più utilizzata nei testicoli. • attraverso la conversione in progesterone. Questa è chiamata via del progesterone (o Δ4), ed è più utilizzata nelle ovaie. In entrambi i casi, gli enzimi in gioco sono gli stessi, e si trovano tutti a livello del REL:

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6 Ormoni steroidei

H 3C

H 3C O

C

O

C

HO

O

Progesterone

17α-idrossilasi

17α-idrossilasi

H 3C O OH

C

HO

17α-idrossipregnenolone

17,20-liasi

O

HO

3β-Idrossisteroide deidrogenasi - Δ5,4 -Isomerasi

Pregnenolone

H 3C C

O OH

O

17α-idrossiprogesterone

17,20-liasi

O

O

Deidroepiandrosterone

Androstenedione

17β-idrossisteroide deidrogenasi

17β-idrossisteroide deidrogenasi

OH

HO

Δ 5 -androstenediolo

OH

O

Testosterone

Figura 6.6: Biosintesi degli androgeni. Queste reazioni avvengono sia nelle ovaie che nei testicoli.

157

6 Ormoni steroidei • 3 β-idrossisteroide deidrogenasi e Δ5,4 -isomerasi. Queste due attività enzimatiche, riunite in una unica proteina, entravano in gioco anche durante la sintesi degli adrenocorticoidi. • 17 α-idrossilasi e 17,20-liasi. Queste due attività enzimatiche caratterizzavano la sintesi dei glucocorticoidi. • 17 β-idrossisteroide deidrogenasi. Questo enzima è specifico delle gonadi. In pratica, ciò che differenzia le due vie è l’ordine in cui intervengono 3 βidrossisteroide deidrogenasi e Δ5,4 -isomerasi. Nell’uomo, una volta che il testosterone è stato sintetizzato, viene secreto (vedi paragrafo “Trasporto nel plasma e degradazione”, pag. 164). Una parte del testosterone viene poi utilizzato per produrre estrogeni con modalità simili a quelle che vedremo nella donna. Questo avviene sia a livello gonadico (cellule del Leydig, forse cellule germinali e spermatociti [13]), che a livello extragonadico. Nella donna il testosterone è utilizzato a livello delle ovaie come precursore per gli estrogeni. Abbiamo visto come a livello delle ovaie prevalga nettamente la via del progesterone per la sintesi del testosterone. Alcuni metaboliti di questa via sono aromatizzati per sintetizzare estrogeni secondo lo schema 6.7 (pagina 159). Sulla parte sinistra dello schema è riportata sinteticamente la sintesi degli androgeni, che si svolge secondo le due vie che abbiamo esaminato. Nella donna, gli androgeni utilizzati per queste vie metaboliche sono costituiti da: • in parte androgeni prodotti dalla ghiandola surrenale (deidroepiandrosterone e androstenedione); • in parte androgeni prodotti in situ con le stesse modalità viste prima (androstenedione e testosterone); • dal testosterone originatosi perifericamente per la conversione degli steroidi surrenalici; Nelle ovaie l’enzima aromatasi, un citocromo P450, è in grado di convertire sia il testosterone che l’androstenedione in due diversi estrogeni: • l’estrone (E1 ) viene sintetizzato dall’aromatizzazione dell’anello A dell’androstenedione; • l’estradiolo (E2 ) viene sintetizzato dall’aromatizzazione dell’anello A del testosterone. È l’estrogeno più attivo.

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6 Ormoni steroidei

Pregnenolone

Progesterone

17α-idrossipregnenolone

17α-idrossiprogesterone

O

O

Deidroepiandrosterone

O

HO

Estrone (E1)

aromatasi

Androstenedione

OH OH

HO

Estriolo

17β-OH deidrogenasi

OH

OH

O

16α-idrossilasi

17,20-liasi

HO

Testosterone

17β-Estradiolo (E2)

Figura 6.7: Biosintesi degli estrogeni. Queste reazioni avvengono soprattutto nelle ovaie. Le formule di struttura non rappresentate sono reperibili in figura 6.5 (pagina 147).

6 Ormoni steroidei L’enzima 17 β-OH deidrogenasi è in grado di convertire i composti l’uno nell’altro. Inoltre, dall’estrione si può ottenere l’estriolo, il terzo principale estrogeno circolante. Queste aromatizzazioni coinvolgono dei processi ossidativi molto complessi a carico del gruppo metile legato in C10, che viene infine eliminato. In questi processi entrano in gioco O2 e NADPH. Si ritiene che queste attività biosintetiche avvengano grazie alla coordinazione di cellule tecali e cellule della granulosa, nell’ambito del follicolo ovarico. • Le cellule della granulosa esprimono gli enzimi che consentono loro di sintetizzare gli estrogeni, e possono convertire il colesterolo in progesterone, ma non possono effettuare le reazioni che dal progesterone producono androgeni (mancano di CYP17, l’enzima con attività 17 α-idrossilasi e 17,20-liasi). • Le cellule della teca esprimono gli enzimi che consentono loro di convertire il colesterolo in androgeni, ma non per effettuare le conversione ad estrogeni (non esprimono l’aromatasi). Quindi, le cellule della teca, sotto lo stimolo di LH/FSH, producono androgeni (soprattutto androstenedione), che viene inviato alle cellule della granulosa, le quali procedono alle reazioni appena viste per convertirlo soprattutto in estradiolo, il quale viene secreto. Secrezione e regolazione Gli ormoni che inducono la steroidogenesi degli ormoni sessuali sono LH, l’ormone luteinizzante, e FSH, l’ormone follicolostimolante. Le cellule bersaglio di questi ormoni sono: • nell’uomo, le cellule di Leydig (LH) e del Sertoli (FSH); • nella donna, le cellule della teca e della granulosa. Queste gonadotropine si legano a recettori transmembrana accoppiati a proteine G, attivando in particolare la subunità G αS , che attiva adenilato ciclasi e innalza la concentrazione di cAMP. L’attivazione consenguente della PKA fosforila proteine che mediano l’azione degli ormoni. Regolazione nell’uomo LH agisce soprattutto sulle cellule del Leydig. Si ha, entro pochi minuti, una attivazione degli enzimi coinvolti nella steroidogenesi e della StAR protein; in un lasso di tempo più lungo si osserva modulazione della espressione genica. Notare che gli ormoni sessuali inibiscono con un meccanismo di feedback il rilascio di GnRH ed LH, rispettivamente a livello ipotalamico ed ipofisario.

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6 Ormoni steroidei FSH agisce soprattutto sulle cellule del Sertoli, dove stimola la produzione di una proteina detta Testosterone-Estrogen Binding Protein (TEBP; vedi dopo) e la spermatogenesi. Stimola inoltre la secrezione di inibina B, un ormone peptidico che inibisce selettivamente la secrezione di FSH. Regolazione nella donna Sfortunatamente (per lo studente di biochimica), la regolazione ormonale è complicata nella donna dalla presenza del ciclo ovarico. Questo consiste nella periodica maturazione di un ovocita, che viene selezionato e predisposto per la fertilizzazione. Schematicamente, distinguiamo: • una fase follicolare in cui l’oocita si sviluppa e che termina con l’ovulazione, cioè l’espulsione dell’oocita dalle ovaie; • una fase luteale che inizia dopo che è avvenuta l’ovulazione, ed in cui l’ovaio secerne ormoni che hanno la funzione, nel caso in cui l’oocita venisse fecondato, di favorirne l’impianto. Esaminiamo cosa succede nella fase follicolare. Prima dell’inizio del ciclo, gli oociti sono quiescenti (oociti primari). I follicoli primordiali sono le strutture di partenza: sono formati da un oocita primario, uno strato di cellule della granulosa appiattite, e una membrana basale . Il meccanismo in seguito al quale i follicoli primordiali sono reclutati per andare incontro al ciclo non è chiaro; comunque sia, un certo numero di follicoli primordiali viene reclutato e va incontro alla trasformazione in follicolo primario (le cellule della granulosa assumono forma cuboidale e si sviluppa la zona pellucida). Lo stadio successivo è quello del follicolo secondario, che si caratterizza per la moltiplicazione delle cellule della granulosa e la formazione di uno strato di cellule della teca esterno rispetto alla membrana basale; in un secondo momento queste si differenziano in cellule della teca interna e cellule della teca esterna. Il follicolo secondario inizia ad esprimere recettori per l’FSH, ma il suo sviluppo è FSH-indipendente in questa fase. Il passaggio da follicolo primordiale a secondario costituisce la cosiddetta fase preantrale dello sviluppo follicolare. La successiva fase antrale inizia quando all’interno del follicolo si forma l’antro, una cavità piena di liquido che segna il passaggio a follicolo terziario. Poco dopo l’inizio della fase antrale i follicoli sono dipendenti dall’FSH per la loro sopravvivenza: se non riescono ad ottenerlo in concentrazioni sufficienti vanno incontro ad atresia (morte del follicolo). Dopo la formazione dell’antro, le cellule della granulosa e della teca continuano a moltiplicarsi e si differenziano in sottopopolazioni, mentre l’antro si espande. Le cellule della granulosa iniziano a produrre activina, una proteina che fa parte della famiglia dei TGF. È un dimero formato da una combinazione di due diverse subunità β

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6 Ormoni steroidei (L’activina A è formata dalle subunità βA βA , l’activina AB da βA βB , l’activina B da βB βB ), e sembra avere un ruolo autocrino, stimolando l’espressione del recettore dell’FSH. L’inibina è un altro importante membro della famiglia dei TGF prodotto dalle cellule della granulosa. È un eterodimero formato da una subunità α e una subunità β (l’inibina A è formata dalle subunità α βA , l’inibina B da α βB ). Vengono secrete entrambe e inibiscono selettivamente la secrezione di FSH. Poiché la sua produzione è stimolata dall’FSH, si tratta di un meccanismo a feedback negativo. FSH ed LH in questa fase stimolano la produzione di ormoni sessuali secondo le modalità già viste: • Le cellule della teca, che rispondono soprattutto all’LH, producono gli androgeni (androstenedione soprattuto). In queste cellule LH incrementa il numero di suoi recettori, e stimola l’espressione e l’attività della StAR protein e di alcuni enzimi delle vie biosintetiche degli androgeni (3 β-idrossisteroide deidrogenasi e CYP17, l’enzima bifunzionale 17 α-idrossilasi/17,20-liasi) • Le cellule della granulosa, che rispondono soprattutto all’FSH, aromatizzano gli androgeni tecali ad estrogeni, producendo principalmente estradiolo, ottenuto tramite la riduzione dell’estrone, a sua volta derivato dall’aromatizzazione dell’androstenedione. L’FSH in queste cellule stimola l’espressione dell’aromatasi e della 17 β-OH deidrogenasi. Gli estrogeni e l’FSH stimolano anche l’espressione di recettori per l’LH in queste cellule, che è un prerequisito per la responsività agli estrogeni che caratterizza queste cellule negli stadi successivi. Le cellule della granulosa a questo punto iniziano ad esprimere recettori per l’LH. Sotto questi stimoli, i livelli di ormoni estrogeni quindi iniziano a salire. Gli estrogeni esercitano un feedback negativo sulla secrezione di FSH, i cui livelli diminuiscono. Poiché a questo punto i follicoli sono dipendenti dall’FSH per la loro sopravvivenza, si viene a creare un processo di selezione, per cui i follicoli più grandi, che hanno più recettori dell’FSH, riescono ad acquisirne a sufficienza per sopravvivere, mentre i più piccoli vanno incontro ad atresia. Alla fine di una lotta all’ultimo sangue, emerge un follicolo dominante che è in grado di assumere il sempre più scarso FSH. L’FSH, insieme agli estrogeni che continuano a salire, promuove l’espressione dei recettori dell’LH da parte delle cellule della granulosa. I recettori divengono quindi sempre più abbondanti. Intanto, a livello ipofisario, l’aumento esponenziale di estrogeni in qualche modo cambia il loro feedback verso il GnRH da negativo a positivo, mutandone il pattern di secrezione in modo da stimolare la secrezione di LH. LH sale bruscamente con un picco (surge); 36 ore dopo il picco di LH si verifica l’ovulazione. Il segnale di feedback

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6 Ormoni steroidei che termina il surge di LH non è noto. Rimane comunque una produzione di LH di base, che permette di mantenere in una fase iniziale il corpo luteo. Inizia quindi la fase luteale, in cui il follicolo ovarico che ha espulso l’oocita diventa corpo luteo, che è formato a partire dalla differenziazione di cellule della granulosa e cellule interstiziali. In risposta all’LH, le cellule della teca luteinica incrementano l’espressione degli enzimi per la produzione dell’androstenedione, mentre le cellule della granulosa luteinica incrementano l’attività dell’aromatasi. Viene indotta anche l’espressione della 3 β-idrossisteroide deidrogenasi così che viene stimolata la produzione di progesterone. In definitiva, il corpo luteo produce soprattutto progesterone, e in minor quantità estradiolo e 17-idrossiprogesterone. Questi ormoni inibiscono a feedback la secrezione delle gonadotropine. Se si verifica una gravidanza, la secrezione di hCG da parte dell’embrione che si sta sviluppando salva il corpo luteo (si lega agli stessi recettori dell’LH); il corpo luteo viene poi mantenuto per 2-3 mesi e continua a produrre i diversi ormoni. In caso contrario, il corpo luteo, circa 9 giorni dopo l’ovulazione inizia ad andare in contro a degenerazione, ed è completamente involuto dopo 14 giorni, con caduta dei livelli di progesterone ed estrogeni. Sembra che questo sia legato ad una sensibilità progressivamente minore all’LH. Questo comunque diminuisce il feedback negativo sull’FSH, i cui livelli risalgono. Vengono reclutati altri follicoli che stanno diventando FSH-dipendenti, ed il ciclo ricomincia. Abbiamo visto che in caso di gravidanza il corpo luteo viene mantenuto solo alcuni mesi, quindi cessa di esistere prima del momento del parto; eppure continuano ad essere sintetizzati numerosi ormoni, tra i quali anche progesterone ed estrogeni. L’organo che fa le veci del corpo luteo è la placenta, un organo che non ha corrispettivo maschile. Tra gli ormoni secreti (tra i quali spicca per importanza la hCG, gonadotropina umana corionica) vi sono anche progesterone ed estrogeni. La sintesi placentare di progesterone comincia in genere all’8° settimana di gestazione. La placenta non sintetizza il colesterolo, ma sfrutta quello circolante legato alle LDL; una volta captato il colesterolo esogeno, ne effettua la conversione in progesterone seguendo le vie che abbiamo visto. Per quanto riguarda gli estrogeni, il principale ormone prodotto dalla placenta è l’estriolo. È interessante notare come, per questa sintesi, sia necessaria una coordinazione tra le ghiandole surrenali della madre e del feto. Questo è necessario poiché la placenta è priva degli enzimi 17 αidrossilasi (idrossila progesterone o pregnenolone in posizione 17) e 17,20-liasi (rimuove ossidativamente la catena laterale in 17 da 17-idrossipregnenolone o 17-idrossiprogesterone), il che impedisce la sintesi in situ di androgeni ed estrogeni. Come viene risolta la situazione? • La ghiandola surrenale fetale produce deidroepiandrosterone che viene inviato

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6 Ormoni steroidei al fegato; • Il fegato fetale lo converte in 16 α-idrossiepiandrosterone solfato; • Attraverso il circolo placentare, questo composto arriva alla placenta, dove viene desolfatato e aromatizzato dall’aromatasi; altre reazioni enzimatiche permettono di ottenere estradiolo ed estriolo. L’estriolo è prodotto in quantità significative in questo modo, quindi essenzialmente durante la gravidanza. Ricapitolando: • in un primo tempo lo sviluppo del follicolo è FSH-indipendente; • nella fase di selezione del follicolo dominante, l’FSH è il principale ormone; i livelli di estrogeni iniziano ad aumentare; • In tarda fase follicolare, la secrezione di FSH diminuisce per il feedback negativo degli estrogeni e dell’inibina, ed il follicolo dominante è stato selezionato; • poco prima dell’ovulazione, l’LH diventa l’ormone principale; gli alti livelli di estrogeni provocano la preferenziale secrezione di LH, che raggiunge un picco. • 36 h dopo il picco avviene l’ovulazione; • nella fase luteinica, il follicolo dà origine al corpo luteo che sintetizza progesterone ed estrogeni; il progesterone è l’ormone principale di questa fase, e inibisce la secrezione delle gonadotropine. • Se non si è verificata la fecondazione, il corpo luteo degenera, i livelli di progesterone ed estrogeni cadono, e GnRH ed FSH tornano ad aumentare. Trasporto nel plasma e degradazione per lo più legato:

Il testosterone nel circolo sanguigno si trova

• ad una β-globulina sintetizzata al fegato, detta Sex Hormone Binding Protein (SHBG). • ad una proteina molto simile alla precedente, detta Testosterone-Estrogen Binding Protein (TEBP) prodotta dalle cellule del Sertoli nel testicolo sotto stimolo dell’FSH, e rilasciata nel lume dei tubuli seminiferi. Viene utilizzata essenzialmente per il testosternone destinato alla regolazione della spermatogenesi. Sembra che questa proteina inoltre possa interagire con recettori di membrana indipendenti dai recettori citosolici degli ormoni tiroidei. • oppure all’albumina.

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6 Ormoni steroidei OH

OH NADP +

NADPH

O

O

5α-reduttasi Testosterone

Diidrotestosterone

Figura 6.8: Reazione di conversione del testosterone in diidrotestosterone, che può essere considerata la forma attiva.

Una volta in circolo, il testosterone ha davanti a sé diversi possibili destini. Nei tessuti bersaglio, il testosterone può divenire substrato dell’enzima 5 αreduttasi, che, utilizzando NADPH come coenzima, riduce lo steroide a livello dell’anello A, producendo 5 α-diidrotestosterone (DHT), un androgeno dotato di grande attività (figura 6.8). Questa reazione avviene nel REL di molti delle cellule bersaglio. In realtà, una piccola parte di diidrotestosterone viene prodotto anche a livello dei testicoli. Una volta formatosi il DHT, non c’è modo di convertire questo composto in un estrogeno. Il DHT agisce legandosi fortemente ai recettori intracellulari; esaurita la sua azione, viene converito in composti meno attivi, soprattutto androstanediolo (pressoché inattivo). Questi composti vengono poi ulteriormente catabolizzati, e infine escreti con le urine. In alcuni tessuti bersaglio il testosterone invece non viene convertito e si lega al recettore direttamente. A livello del tessuto adiposo, il testosterone può venire aromatizzato a 17 βestradiolo dall’aromatasi. Anche l’androstenedione surrenalico può subire questo destino. Ritroveremo quest’ultima reazione con la sintesi degli estrogeni. Nel fegato, e in misura minore in altri tessuti, avvengono reazioni con significato catabolico: la loro funzione è quella di creare un coniugato idrosolubile dello steroide, affinché possa essere escreto con le urine. Il testosterone viene per prima cosa ossidato in posizione 17: l’enzima che catalizza questa reazione è la 17 β-idrossisteroide deidrogenasi II, che viene espressa nel fegato; durante la reazione si ha riduzione di NAD+ a NADH. A questa reazione ne seguono altre, che culminano con la produzione di varii 17-chetosteroidi inattivi o poco attivi, principalmente androsterone e etiocolanolone. Questi 17-chetosteroidi vengono poi glucuronidati o solfatati ed eliminati con le urine. L’estradiolo può:

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6 Ormoni steroidei • entrare in circolo ed esercitare la sua azione sui tessuti periferici; • diffondere dalla cellula e agire con modalità paracrina; • legarsi ai suoi recettori se presenti nella cellula che lo ha sintetizzato. L’estradiolo circola soprattutto legato alla SHBP e all’albumina, mentre una quota minima è in forma libera. Nei tessuti periferici, dall’estradiolo si ottengono metaboliti inattivi. Viene soprattutto convertito in estrone, che ha un’azione biologica più debole. Nel fegato, l’estrone: • può poi essere convertito ad estriolo, che è l’altro maggior estrogeno circolante (anche se è realmente abbondante praticamente solo durante la gravidanza); • essere elaborato in senso catabolico; In generale, gli estrogeni (estrone, estradiolo, estriolo) vengono glucuronati o solfatati, oppure idrossilati e poi metilati a formare metossi-estrogeni; in entrambi i casi, vengono poi escreti con le urine. Per quanto riguarda il progesterone, abbiamo visto che viene prodotto massivamente a livello ovarico durante la fase luteale, sotto la prevalente stimolazione dell’LH; circola soprattutto legato all’albumina. Il suo metabolismo avviene nel fegato e prevede glucuronazione e solfatazione, spesso in posizione 20, analogamente a quanto avviene per esotreni e androgeni. Recettori Il recettore degli androgeni fa parte, insieme agli altri recettori degli ormoni lipofili, della superfamiglia dei recettori nucleari. Presenta, come gli altri recettori, tre dominî: uno per il ligando, uno per il legame con il DNA, e uno per altri fattori coinvolti nella regolazione della trascrizione. In assenza di ligando, si trova nel citosol associato a delle Heat Shock Protein (o chaperonine). Quando l’ormone diffonde attraverso la membrana plasmatica e giunge nel citosol, può interagire con il recettore e legarvisi. In seguito al legame, le Heat Shock Protein si dissociano. Il recettore quindi dimerizza e viene trasferito nel nucleo, dove si lega ai response elements degli androgeni, influenzando la trascrizione genica. Sono stati identificati due recettori, detti A e B, complessivamente molto simili in termini di sequenza aminoacidica. Per quanto riguarda gli estrogeni, anche questi ormoni hanno recettori citosolici che fanno parte della stessa superfamiglia di cui fanno parte i recettori degli androgeni. Hanno caratteristiche molto simili: un dominio N-terminale per il legame con il DNA, uno C-terminale per l’ormone, e uno o due dominî con cui interagiscono diversi fattori di trascrizione.

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6 Ormoni steroidei Si conoscono due tipi di recettori per gli estrogeni: • recettore α - espresso nell’endometrio e nello stroma delle ovaie; • recettori β - è espresso nelle cellule della granulosa, in rene, mucosa intestinale, polmoni, midollo osseo e osso, encefalo e nell’uomo prostata;5 Gli effetti mediati da questi recettori sono di tipo genomico, ed avvengono tendenzialmente in maniera lenta (ore). Si è osservato che gli estrogeni mediano anche degli effetti che sono posti in essere in brevissimo tempo, e dunque si ritiene che questi ormoni abbiano anche dei recettori sulla membrana plasmatica in grado di produrre secondi messaggeri, i quali mediano effetti non genomici. È stato proposto, in alternativa, che i recettori intracellulari interagiscano con proteine citosoliche. Anche i recettori del progesterone modulano l’espressione genica con modalità simili a quelle viste per i recettori degli altri ormoni steroidei (sono cioè fattori di trascrizione ligando-inducibili), e sono di due tipi: A e B. Gli estrogeni promuvono l’espressione di questi recettori, mentre il progesterolo la inibisce. Questo significa che, affinché il progesterone abbia effetto in modo significativo, è necessaria una esposizione agli estrogeni: l’espressione di questi recettori aumenta nella prima metà del ciclo mestruale, poi, durante la seconda metà, i livelli di progesterone aumentano e l’espressione dei recettori diminuisce di nuovo. Effetti fisiologici Abbiamo visto che il testosterone non ha la massima attività biologica, e che viene in gran parte convertito in DHT (diidrotestosterone), il quale si lega al recettore con maggiore affinità. In realtà, una parte del testosterone non viene convertita, ma si lega comunque al recettore, anche se meno fortemente. È possibile in effetti distinguere tra gli effetti del testosterone e del DHT. Collettivamente, i due androgeni esercitano, attraverso una regolazione dell’espressione genica nelle cellule bersaglio, le seguenti azioni: • Regolano la differenziazione sessuale nell’embrione: controllano le strutture derivate dai dotti di Wolff, lo sviluppo della prostata, la discesa dei testicoli, crescita del pene, fusione delle pieghe labioscrotali, etc. • Promuovono la comparsa dei caratteri sessuali secondari durante la pubertà e il raggiungimento della maturità sessuale: aumento di dimensioni di testicoli, pene, prostata, vescichette seminali; crescita dei peli pubici, degli arti e del volto; modifiche del tono di voce; attività delle ghiandole sebacee, etc. • Controllano la spermatogenesi, la fertilità e la funzione riproduttiva; 5

Ricordiamo che anche nell’uomo sono presenti piccole quantità di estrogeni.

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6 Ormoni steroidei • Controllano il desiderio sessuale e influenzano il comportamento; • Hanno effetti anabolici su massa muscolare e tessuto osseo; condizionano in questo modo la crescita corporea che segue la pubertà, lo sviluppo della massa muscolare, lo sviluppo della massa ossea (quest’ultimo effetto è in realtà mediato dal 17 β-estradiolo, che deriva dalla conversione periferica del testosterone). Il DHT è l’androgeno attivo a livello dei tessuti bersaglio, cioè il ligando che si lega al recettore intracellulare in: • prostata, • vescichette seminali, • organi secondari maschili, • cute. Gli estrogeni (di cui l’estradiolo è il maggior rappresentante, seguito da estriolo ed estrone) esplicano i loro effetti genomici soprattutto a livello dell’apparato riproduttivo: • Crescita, differenziazione e mantenimento dell’apparato riproduttore femminile; • Promuovono la proliferazione cellulare a livello dello strato basale dell’endometrio, determinano angiogenesi a livello dello strato funzionale; incrementano l’espressione dei recettori per l’ossitocina sulle cellule muscolari lisce uterine. • Promuovono la mitosi a livello delle cellule della granulosa; • Partecipano alla regolazione della mestruazione e della funzione riproduttiva (parto e allattamento), agendo come timer per l’ovulazione; • Promuovono lo sviluppo dei caratteri sessuali secondari; • A livello della ghiandola mammaria, stimolano la proliferazione cellulare (possibile fattore di rischio per il carcinoma mammario) e l’ipertrofia della ghiandola; • A livello epatico, influenzano la produzione delle lipoproteine plasmatiche e l’espressione dei loro recettori, dimuendo le LDL e il colesterolo totale; modulano l’espressione dei geni dei fattori coinvolti nella coagulazione; • funzione neuroprotettiva a livello dell’SNC, e influenza dell’umore; • Promuovono la maturazione ossea, e inibiscono il riassorbimento della matrice ossea, mantengono la massa e la struttura del sistema scheletrico; Tra gli effetti non genomici degli estrogeni ricordiamo la vasodilatazione e l’attivazione di pathway correlati a fattori di crescita.

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6 Ormoni steroidei Concludiamo trattando brevemente il progesterone, che predispone l’apparato riproduttivo alla gravidanza, mentre a livello del sistema nervoso regola il comportamento sessuale. • A livello dell’utero, stimola la secrezione e lo sviluppo ghiandolare; contribuisce al trofismo dell’organo durante il ciclo mestruale e nelle prime fasi della gravidanza attraverso la regolazione localizzata della sintesi di fattori di crescita e la modulazione della sensibilità delle cellule a questi fattori. In generale, prepara l’endometrio ad accogliere l’oocita fecondato e facilita l’impianto. Inibisce inoltre la contrattilità dell’utero, diminuendo l’espressione di canali per il calcio e bloccando quindi l’uptake di calcio, necessario alla contrazione; modula l’espressione di altri canali per aumentare il potenziale elettrico delle cellule; diminuisce la sintesi locale di prostaglandine, che promuovono le contrazioni uterine. • A livello ipofisario, inibisce la secrezione delle gonadotropine; • A livello della ghiandola mammaria , il progesterone stimola lo sviluppo di alveoli e lobuli, ma impedisce la sintesi di latte prima del parto, antagonizzando tra l’altro la prolattina. • Riduce gli effetti degli estrogeni a livello dell’apparato riproduttore; • Provoca un innalzamento della temperatura corporea riducendo il flusso di sangue periferico. Correlazioni cliniche: Ipogonadismo L’ipogonadismo è una condizione di ridotta funzione delle gonadi, con insufficiente biosintesi degli ormoni sessuali. Questo può condurre ad alterazioni del normale sviluppo sessuale e dei processi di ovulazione o spermatogenesi, fino a condurre all’infertilità. Si distinguono: • l’ipogonadismo primitivo, o periferico, o ipogonadismo ipergonadotropo; • l’ipogonadismo secondario, o centrale, o ipogonadismo ipogonadotropo; • la resistenza periferica agli ormoni sessuali. Nel primo caso l’ipogonadismo è causato da un difetto della gonade, che non risponde correttamente allo stimolo delle gonadotropine ipofisarie (l’ipofisi chiama, ma l’ovaio non risponde); è chiamato "ipergonadotropo" perché le gonadotropine sono elevate a causa della mancata inibizione a feedback. Sono note cause congenite (es. la sindrome di Klinefelter,

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6 Ormoni steroidei

S. di Turner) e cause acquisite (tutto ciò che può danneggiare le gonadi: dai traumi alle infezioni all’autoimmunità). Nell’ipogonadismo ipogonadotropo il problema è una insufficiente secrezione di gonadotropine, che sono patologicamente ridotte nonostante gli insufficienti livelli di ormoni periferici (l’ipofisi non chiama e l’ovaio non risponde). Anche in questo caso sono possibili cause congenite (es. la sindrome di Kallmann) e cause acquisite (tumori del sistema nervoso centrale, traumi, stress...). La resistenza periferica agli ormoni sessuali si verifica per esempio nel caso di deficit a carico dell’enzima 5 α-reduttasi: questi soggetti non sono in grado di convertire il testosterone in diidrotestosterone. Sono individui con genotipo 46,XY, ma a causa della scarsa sensibilità periferica agli androgeni, si possono avere gradi variabili di ambiguità dei genitali esterni, fino a un fenotipo completamente femminile (pseudoermafroditismo); quindi questi individui possono essere cresciuti come delle bambine anche se genotipicamente sono maschi.

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Bibliografia [1] Muhammad A Abdul-Ghani, Devjit Tripathy e Ralph A DeFronzo. “Contributions of β-cell dysfunction and insulin resistance to the pathogenesis of impaired glucose tolerance and impaired fasting glucose”. In: Diabetes care 29.5 (2006), pp. 1130–1139. [2] Mark A Atkinson e George S Eisenbarth. “Type 1 diabetes: new perspectives on disease pathogenesis and treatment”. In: The Lancet 358.9277 (2001), pp. 221–229. [3] Robert O Bonow et al. Braunwald’s Heart Disease: A Textbook of Cardiovascular Medicine. Elsevier Health Sciences, 2011. [4] R. Bouillon et al. “The Changing Face of Endocrinology”. In: SMAD 5 (2003), H6. [5] L. Brunton, B. Chabner e B. Knollman. Goodman and Gilman’s The Pharmacological Basis of Therapeutics. Twelfth Edition. McGraw-Hill, 2010. [6] NIALL S Doherty e ARTHUR A Hancock. “Role of alpha-2 adrenergic receptors in the control of diarrhea and intestinal motility.” In: Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics 225.2 (1983), pp. 269–274. [7] JH Exton. “Mechanisms of hormonal regulation of hepatic glucose metabolism”. In: Diabetes/metabolism reviews 3.1 (1987), pp. 163–183. [8] Edwina C Furneaux, Alison J Langley-Evans e Simon C Langley-Evans. “Nausea and vomiting of pregnancy: endocrine basis and contribution to pregnancy outcome”. In: Obstetrical & gynecological survey 56.12 (2001), pp. 775–782. [9] A Gardemann, U Jahns e K Jungermann. “Control of glycogenolysis and blood flow by arterial and portal norepinephrine in perfused liver”. In: American Journal of Physiology-Endocrinology And Metabolism 260.5 (1991), E762–E771. [10] David G. Gardner e Dolores M. Shoback. Greenspan’s basic & clinical endocrinology. 9th. McGraw-Hill Medical New York, 2011. [11] Alison Goldin et al. “Advanced glycation end products sparking the development of diabetic vascular injury”. In: Circulation 114.6 (2006), pp. 597– 605. [12] J. Henderson. “Ernest Starling and ""Hormones”: an historical commentary.” In: The Journal of Endocrinology 184.1 (2005), p. 5. [13] Rex A Hess et al. “Estrogen in the adult male reproductive tract: a review”. In: Reprod Biol Endocrinol 1.1 (2003), p. 52.

Bibliografia [14] H Hirose et al. “Effects of alpha 2-and beta-adrenergic agonism on glucagon secretion from perfused pancreata of normal and streptozocin-induced diabetic rats.” In: Metabolism: clinical and experimental 42.8 (1993), p. 1072. [15] Louis Hue e Mark H Rider. “Role of fructose 2, 6-bisphosphate in the control of glycolysis in mammalian tissues.” In: Biochemical Journal 245.2 (1987), p. 313. [16] R. O. Hussa. “Biosynthesis of human chorionic gonadotropin”. In: Endocrine Reviews 1.3 (1980), pp. 268–294. [17] Brian C Jensen, Timothy D O’Connell e Paul C Simpson. “Alpha-1-adrenergic receptors: targets for agonist drugs to treat heart failure”. In: Journal of molecular and cellular cardiology 51.4 (2011), pp. 518–528. [18] Brian C Jensen et al. “The alpha-1D Is the predominant alpha-1-adrenergic receptor subtype in human epicardial coronary arteries”. In: Journal of the American College of Cardiology 54.13 (2009), pp. 1137–1145. [19] Steven E Kahn, Rebecca L Hull e Kristina M Utzschneider. “Mechanisms linking obesity to insulin resistance and type 2 diabetes”. In: Nature 444.7121 (2006), pp. 840–846. [20] E. Kandel et al. Principles of Neural Science. Fifth Edition. McGraw-Hill, 2012. [21] K. Kitahama et al. “Adrenergic neurons in human brain demonstrated by immunohistochemistry with antibodies to phenylethanolamine-N-methyltransferase (PNMT): Discovery of a new group in the nucleus tractus solitarius”. In: Neuroscience Letters 53.3 (1985), pp. 303 –308. doi: 10.1016/0304-3940(85)905555. [22] Pagona Lagiou et al. “Nausea and vomiting in pregnancy in relation to prolactin, estrogens, and progesterone: a prospective study”. In: Obstetrics & Gynecology 101.4 (2003), pp. 639–644. [23] SJ Meachem, E Nieschlag e M Simoni. “Inhibin B in male reproduction: pathophysiology and clinical relevance”. In: European Journal of Endocrinology 145.5 (2001), pp. 561–571. [24] I. Mefford et al. “Epinephrine localization in human brain stem”. In: Neuroscience Letters 5.3–4 (1977), pp. 141 –145. doi: 10.1016/0304-3940(77)90037-4. [25] Brent W Miedema e Joel O Johnson. “Methods for decreasing postoperative gut dysmotility”. In: The lancet oncology 4.6 (2003), pp. 365–372. [26] D. L. Nelson e M. M. Cox. Lehninger Principles of Biochemistry. Sixth Edition. W. H. Freeman, 2012. [27] Linda R Nelson e Serdar E Bulun. “Estrogen production and action”. In: Journal of the American Academy of Dermatology 45.3 (2001), S116–S124. [28] Gene C Ness, Zhihong Zhao e Linda Wiggins. “Insulin and glucagon modulate hepatic 3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A reductase activity by affecting immunoreactive protein levels.” In: Journal of Biological Chemistry 269.46 (1994), pp. 29168–29172.

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Bibliografia [29] Aaron R Osborne et al. “Identification of insulin-responsive regions in the HMGCoA reductase promoter”. In: Biochemical and biophysical research communications 318.4 (2004), pp. 814–818. [30] FP Ottensmeyer et al. “Mechanism of transmembrane signaling: insulin binding and the insulin receptor”. In: Biochemistry 39.40 (2000), pp. 12103–12112. [31] VN Potaman et al. “Degradation of ACTH/MSH (4–10) and its synthetic analog semax by rat serum enzymes: an inhibitor study”. In: Peptides 14.3 (1993), pp. 491– 495. [32] Barbara A Ramlo-Halsted e Steven V Edelman. “The natural history of type 2 diabetes: practical points to consider in developing prevention and treatment strategies”. In: Clinical Diabetes 18.2 (2000), pp. 80–84. [33] M Rider et al. “6-phosphofructo-2-kinase/fructose-2, 6-bisphosphatase: headto-head with a bifunctional enzyme that controls glycolysis”. In: Biochem. J 381 (2004), pp. 561–579. [34] Kathleen E Roberts. “Mechanism of dehydration following alcohol ingestion”. In: Archives of internal medicine 112.2 (1963), p. 154. [35] Milton E Rubini, Charles R Kleeman e Ezra Lamdin. “Studies on alcohol diuresis. I. The effect of ethyl alcohol ingestion on water, electrolyte and acid-base metabolism”. In: Journal of Clinical Investigation 34.3 (1955), p. 439. [36] Varman T Samuel e Gerald I Shulman. “Mechanisms for insulin resistance: common threads and missing links”. In: Cell 148.5 (2012), pp. 852–871. [37] Gerald I Shulman et al. “Cellular mechanisms of insulin resistance”. In: Journal of Clinical Investigation 106.2 (2000), pp. 171–176. [38] ER Simpson. “Sources of estrogen and their importance”. In: The Journal of steroid biochemistry and molecular biology 86.3 (2003), pp. 225–230. [39] R. H. Costa-e Sousa e A. N. Hollenberg. “Minireview: the neural regulation of the hypothalamic-pituitary-thyroid axis”. In: Endocrinology 153.9 (2012), pp. 4128– 4135. [40] M. Tarini, P Cignoni e C. Montani. “Ambient Occlusion and Edge Cueing for Enhancing Real Time Molecular Visualization”. In: IEEE Transactions on Visualization and Computer Graphics 12.5 (2006), pp. 1237–1244. issn: 1077-2626. doi: http://dx.doi.org/10.1109/TVCG.2006.115. [41] Vera Ulken, Gerhard P Puschel ¨ e Kurt Jungermann. “Increase in Glucose and Lactate Output and Perfusion Resistance by Stimulation of Hepatic Nerves in Isolated Perfused Rat Liver: Role of α 1-, α 2-> β 1-and β 2-Receptors”. In: Biological chemistry Hoppe-Seyler 372.1 (1991), pp. 401–410.

173