Biochemistry relatory. Cromatography

Relatório Separação dos componentes de uma mistura por filtração em gel

Grupo VI

Gonçalo Palma (43038); Margarida Brotas (43040); Pedro Patrício (43155).

Docente: Manuel Piedade.

Índice Resumo.......................................................................................................................................... 2 Parte experimental........................................................................................................................ 2 Materiais ................................................................................................................................... 2 Reagentes .................................................................................................................................. 3 Procedimento ............................................................................................................................ 3 Discussão dos resultados .............................................................................................................. 4

Resumo

As biomoléculas são purificadas utilizando técnicas cromatográficas que as segregam consoante as diferenças nas suas propriedades específicas. Existem quatro tipos de técnicas de cromatografia: partição, absorção, filtração em gel e troca iónica. No caso desta experiência laboratorial, recorreu-se à filtração em gel numa coluna (GF  – 

Gel Filtration), que separa as biomoléculas de diferentes dimensões pelas suas massas

moleculares relativas. Pretendeu-se isolar as moléculas de hemoglobina, cromato de potássio e azul de dextrano a partir de uma mistura. O conceito de cromatografia exige sempre a passagem de uma fase móvel por uma fase estacionária. Como tal, nesta experiência, a fase estacionária é o gel e a fase móvel é a solução de NaCl a 0,9% e a mistura a separar, sendo que o NaCl vai permitir a eluição de moléculas com determinado tamanho e função. Conforme se vai movimentando a fase móvel, esta vai causar uma migração diferencial das moléculas, que irão ser separadas ao longo da fase estacionária. A ordem de eluição será por ordem decrescente da massa molecular das proteínas.

Parte experimental

Materiais



Espectrofotómetro da marca Spectronic Instruments, modelo Spectronic ® 20 Genesis™;



Coluna cromatográfica.

Reagentes



Solução de NaCl a 0,9% (w/v)  – previamente preparada;



Sephadex G-100 (12 g em 210 mL de solução de NaCl a 0 ,9%);



Amostra (previamente preparada em 2 mL de solução de NaCl alcalinizada com hidróxido de sódio): o

4 mg de azul de dextrano 2000;

o

4 mg de cromato de potássio;

o

30 mg de hemoglobina.

Procedimento Foram numerados e marcados 20 tubos de ensaio com o volume de 2 mL (no entanto, só foram necessários 18). A coluna de gel Sephadex G-100, previamente preparada 3

com 10 cm  da solução de NaCl, foi deixada eluir até que o limite da solução de NaCl ficasse aproximadamente a 3 mm do limite do gel (neste passo foi feita uma primeira tentativa em que o gel ficou seco, devido ao facto de se ter removido demasiado eluente, tendo portanto de se recorrer a uma coluna de gel substituta). De seguida, fechou-se a saída da coluna. Mediu-se um 1 mL da amostra com uma pipeta de 2 mL, transferindo-se com movimentos circulares e lentos para o topo da coluna de gel, para não danificar a superfície do gel. De seguida, colocou-se o tubo de ensaio nº1 na saída da coluna, abrindo-se a sua saída. Deixou-se a amostra penetrar no gel, perfazendo-se depois a coluna com eluente. Desta forma se foram enchendo todos os tubos, completando-se sempre a coluna com NaCl, quando esta solução escasseava. Posteriormente, mediu-se a absorção no espectrofotómetro de cada uma das fracções recolhidas para os comprimentos de onda λ  = 410 nm e λ  = 620 nm, a fim de se calcular o volume de eluição de cada componente. Utilizou-se como branco a água destilada.

Discussão dos resultados Tabela 1: Absorvância das fracções recolhidas aos comprimentos de onda

Fracção nº 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18

 A410 0,000 -0,005 0,000 0,175 1,004 1,168 0,253 1,157 0,798 0,519 0,580 0,872 0,178 0,372 0,193 0,155 0,056 -0,013

λ=410

nm e λ=620 nm

 A620 0,000 0,000 -0,100 0,073 0,324 0,142 0,059 0,045 0,029 0,012 0,004 0,001 -0,003 -0,004 -0,004 -0,003 -0,007 0,007

1.2 1 0.8 Absorvância(410nm)

0.6

Absorvância(620nm) 0.4 0.2 0 0

5

10

15

-0.2 Figura 1- Gráfico de eluição da mistura.

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