Bilirrubina Delta
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Descripción: Estudio bioquimico de la Bilirrubina Delta...
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BILIRRUBINA DELTA ORIGEN El metabolismo normal de la bilirrubina parte desde de la degradación de los grupos hem de los eritrocitos senescentes, lo cual tiene lugar principalmente en los cordones esplénicos del bazo cuando estos son retirados de la circulación. Estos producen la bilirrubina no conjugada, la cual como ya se ha mencionado es insoluble en agua, por lo cual debe circular acompañada de la albúmina hacia el hígado para ahí ser conjugada a fin de aumentar su solubilidad para poder ser excretada a través de la orina en forma de urobilinógeno o a través de las heces en forma de estercobilinógeno; teniendo en cuenta que cuando esta bilirrubina conjugada se dirige hacia estos órganos se disuelve en plasma o se disuelve con las sales biliares para ser expulsado por la vesícula biliar respectivamente. Un paciente en condiciones fisiopatologicas como daño hepatocelular agudo (la ruptura de hepatocitos libera la bilirrubina conjugada producida al espacio sinusoidal, junto con el resto de su contenido enzimático) o colestasis (a cualquier nivel implica la obstrucción de la excreción de la bilis, por lo cual esta pasa al plasma) presenta altas concentraciones de bilirrubina conjugada (hiperbilirrubinemia conjugada), que si se mantiene en el tiempo puede unirse de manera irreversible a la albúmina mediante un enlace covalente de tipo amida (Jacobo Díaz Portillo, Aspectos Básicos de Bioquímica Clínica), que según Lauff y cols ocurre entre el carbono carbonilo de uno de los ácidos propiónicos y los extremos aminoterminales de los residuos de histidina de la molécula de albúmina, dando origen a la bilirrubina delta (BD). Esto ocurre de manera espontánea y sin inversión de ATP. Esta bilirrubina delta tiene igual vida media que la albúmina, puesto a que si se une de manera irreversible no puede ser eliminada vía renal por cuanto a que normalmente la albúmina no se elimina de manera masiva en la orina, por lo cual no es posible determinar esta fracción de bilirrubina en orina. Esto implica que el aclaramiento de la bilirrubina conjugada sea menor al de esta fracción de bilirrubina.
con este método. De esta manera fue clasificada igualmente como bilirrubina directa por muchos años. Luego en 1982, Lauff y Cols empleó la técnica de cromatografía líquida de alta eficacia (HPLC), donde determinó cuatro fracciones: Dos conjugadas, correspondientes a la Bilirrubina Conjugada, una no conjugada, y una fracción unida a albúmina a la que llamo biliproteina o Bilirrubina Delta. De manera independiente Kuenzle y cols determinaron las mismas cuatro fracciones de bilirrubina en una cromatografía líquida de columna abierta, sin desproteinización previa. Por otra parte, Kubasik y cols, demostraron que en pacientes tratados por ictericia obstructiva ocurría un descenso de la bilirrubina conjugada si el tratamiento era exitoso, pero la bilirrubina directa empleada en esta determinación se mantenía elevada a causa de esta fracción delta que también reaccionaba, lo cual no era congruente con la evolución del paciente. Todo esto cuestiona la ecuación de bilirrubina que se ha utilizado durante tantos años (BT= BD+BI) Entonces, en 1984, Wu y cols, realizaron por primera vez la técnica de química seca para la determinación independiente de bilirrubina total, bilirrubina conjugada y bilirrubina no conjugada, la cual internacionalmente se determina en la actualidad por algunos autoanalizadores que veremos a continuación. Química Seca. Son metodologías donde todos los reactivos para una determinada prueba se fijan a una fase sólida, de tal manera que ocurra la reacción solo con la adición de la muestra. Consiste en un “Slide”, o un elemento autónomo con múltiples capas, donde cada capa realiza funciones físicas y químicas particulares. Todas estas capas se encuentran en un soporte de poliéster adaptado al tamaño de una estampilla. Las capas son las siguientes: -
IDENTIFICACIÓN Y CUANTIFICACIÓN Esta bilirrubina delta reacciona y se comporta químicamente como la bilirrubina conjugada con el reactivo acido sulfanílico diazotado, puesto a que igualmente el carbono alfa se encuentra expuesto a este; y es igualmente cuantificado junto a la bilirrubina directa
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Capa de difusión: permite la difusión uniforme de la muestra. En esta capa se quedan retenidas las proteínas (hemoglobina, albúmina, lipoproteínas), de modo que se elimina la interferencia espectral por hemólisis y lipemia Capa de filtro o barrera protectora: impide la interferencia espectral de lo que se ha quedado fijado en la capa de difusión, impidiendo que esto absorba luz Capa de reactivo: se encuentra impregnada con el reactivo, y es aquí donde ocurre la reacción Capa indicadora: El producto de la reacción se recolecta para el análisis espectral.
Luego, por fotometría de reflectancia, se utilizan las densidades ópticas para medir la concentración del producto de la reacción en la capa indicadora, que es proporcional a la cantidad de analito. Una de las tecnologías citadas en las referencias consultadas para la determinación de bilirrubina es la utilizada por el multianalizador VITROS, cuyas placas son provistas por la casa comercial Johnson&Johnson, la cual utiliza este principio de química seca. Se utiliza de manera separada una placa para bilirrubina total y una placa para las bilirrubinas Conjugada y no conjugada, y la bilirrubina delta es calculada por diferencia. En la placa de bilirrubina conjugada y no conjugada, la bilirrubina delta se queda atrapada en la capa de difusión a causa de la albúmina, junto a otras proteínas, mientras que difunden hacia la capa de reactivo la bilirrubina conjugada y la bilirrubina no conjugada. Ambas se unen a un mordiente cationico, que actua como fijador de pigmento, lo cual incrementa notablemente su absortividad específica a 400 nm para la bilirrubina conjugada (mono y diconjugada presentan un pico de absorción idéntico a esta longitud de onda) y a 460 nm para la bilirrubina no conjugada. En la placa de bilirrubina total se utiliza el principio del reactivo diazo modificado, que utiliza difilina para disociar la Bilirrubina no conjugada y la bilirrubina delta de la albumina. Toda esta bilirrubina reacciona con una sal diazónica para producir cromóforos de bilirrubina con una absortividad cercana a los 520 nm. Obteniendo las concentraciones de ambas determinaciones es posible calcular por diferencia la bilirrubina delta. UTILIDAD CLÌNICA Permite evaluar la integridad fisiológica del hepatocito: luego de un daño hepatocelular agudo como en las hepatitis virales, en la fase de convalescencia se produce una elevación de la bilirrubina directa: si se determina que la causa de esta elevación es la bilirrubina delta y no la conjugada, indica que ya el funcionalismo hepático ha sido reestructurado debido a que se ha restituido la integridad hepática en el caso de que éste daño sea reversible, como en el caso de la hepatitis A. Integridad de las vías biliares: indica como el paciente responde a un determinado tratamiento ante una ictericia obstructiva, cuando se determina que la causa de la elevación de bilirrubina es a expensas de la bilirrubina delta y no de la bilirrubina conjugada, lo cual habla de una restructuración de la integridad de las vías biliares y una adecuada excreción de la bilirrubina conjugada. Por esto
se recomienda que la determinación de bilirrubina directa se acompañe con la cuantificación diferencial de la bilirrubina delta. Monitoreo post-transplante hepático: Wu y cols determinaron que un aumento de 40-50% de bilirrubina delta acompañada de una bilirrubina conjugada menor al 10% de la bilirrubina total es buen pronóstico. La explicación que le da a este planteamiento es que otros marcadores hepáticos como por ejemplo la bilirrubina total, directa o indirecta y las enzimas pueden estar aumentados aún por recidivas del daño hepático antes del transplante, pero al determinar que la causa de elevación de la bilirrubina directa sea consecuencia de la bilirrubina delta y no de la bilirrubina conjugada, indica que el funcionalismo hepático (conjugación) fue restituido con el transplante. Distinción entre pacientes con daño hepático irreversible vs reversible en hepatitis alcohólica: Se recomienda realizar un monitoreo en casos de tratamiento de desintoxicación alcohólica, a fin de diferenciar estos casos de aquellos con mayor propensión a desarrollar cirrosis, donde la bilirrubina delta estará aumentada, aunque la bilirrubina conjugada permanezca normal, indicando falla de funcionalismo hepático progresiva.
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