BACTERIOLOGIE GENERALA

BACTERIOLOGIE GENERAL|

1.1.DEFINIŢIA ŞI OBIECTUL STUDIU AL MICROBIOLOGIEI

DE

Microbiologia (gr.micros=mic, bios=viaţă şi logos=ştiinţă) este ştiinţa care se ocupă cu studiul vieţuitoarelor invizibile cu ochiul liber, denumite microbi sau microorganisme. Microorganismele au apărut pe pământ în urmă cu aproximativ 3 miliarde de ani şi au evoluat, cu succesiuni de ordinul minutelor între generaţii, diversificându-se atât de mult, încât astăzi constituie o lume invizibilă imensă, ce justifică opinia potrivit căreia trăim într-o lume a microorganismelor şi nu într-o lume cu microbi. Ele au o structură celulară sau subcelulară şi sunt foarte diferite ca morfologie, caracteristici metabolice şi poziţie în arborele filogenetic şi sistematica biologică. Considerând dimensiunea microscopică ca principal element comun şi criteriu de încadrare, specialiştii au inclus în categoria microorganismelor, virusurile, bacteriile, ciupercile microscopice (micromiceţii sau fungii), algele şi protozoarele. Termenul de „microb”, creat de S e d i l l o t în 1878 a fost utilizat însă numai pentru desemnarea bacteriilor, 110

BACTERIOLOGIE GENERAL|

virusurilor şi micromiceţilor, protozoarele rămânând prin convenţie şi tradiţie în sfera de preocupări a parazitologiei. Relativ recent, în categoria microorganismelor au fost incluşi încă doi agenţi patogeni neconvenţionali: viroizii (D i e n e r, 1971), cu o structura subcelulară mai simplă decât cea a virusurilor şi prionii (P r u s i n e r - premiul Nobel 1997), care sunt proteine infecţioase transmisibile, incriminate în etiologia encefalopatiilor spongiforme la om (boala Kreutzfeld – Jacob, boala kuru, boala Alzheimer, insomnia familială fatală, boala Gerstmann-Straüssler ) şi la diverse specii de animale (encefalopatia spongiformă a bovinelor sau boala vacii nebune, encefalopatia transmisibilă a nurcilor, boala cronică cahectizantă a cervideelor, encefalopatia ongulatelor exotice, encefalopatia spongiformă felină, tramblanta oilor sau scrapia, encefalopatia transmisibilă a vizonului). Ca urmare a dezvoltării cunoştinţelor despre microorganisme, din domeniul vast al microbiologiei s-au desprins treptat ramuri sau ştiinţe distincte, care au un caracter fundamental (bacteriologia, virusologia, micologia, protozoologia, algologia) sau aplicativ (microbiologia medicală, medical-veterinară, industrială, marină, a alimentelor, a solului, a petrolului, etc.).

1.2. SISTEMATICA MICROORGANISMELOR Stabilirea poziţiei microorganismelor în sistematica biologică a întâmpinat în decursul anilor dificultăţi obiective, generate de criteriile care au stat la baza împărţirii lumii vii în două, trei, patru sau chiar cinci regnuri, de marea diversitate a acestor vieţuitoare, cât şi de faptul că unele categorii de microorganisme se apropie prin unele caracteristici de regnul 111

BACTERIOLOGIE GENERAL|

animal (protozoarele) iar altele de regnul vegetal (algele, ciupercile microscopice, bacteriile). Privite în ansamblu, aceste vieţuitoare au însă trăsături distinctive de restul lumii vii, fiind situate de fapt pe o treaptă inferioară de evoluţie şi organizare. Luându-se drept criteriu de bază nivelul de organizare biologică (subcelular, unicelular, sau pluricelular; eucariot sau procariot), la propunerea lui H a e c k e l (1866), reluată de Stanier (1964 ), microorganismele au fost incluse într-un al treilea regn, alături de cel vegetal şi animal, regnul Protista, divizat în protiste superioare care grupează microorganismele eucariote (algele, protozoarele, micromiceţii) şi protiste inferioare, reprezentate de microorganismele procariote (algele albastre-verzi şi bacteriile). In 1968, M u r r a y încadrează bacteriile şi algele albastre-verzi(cianobacteriile) în regnul Procaryotae, taxon însuşit de Determinatorul Bergey (1984) – lucrare de o înaltă probitate ştiinţifică, unanim acceptată de către bacteriologii din întreaga lume. Un an mai târziu (1969), W h i t t a k e r creează un nou regn-regnul Fungi - care grupează ciupercile microscopice. Virusurile, deoarece se deosebesc de celelalte microorganisme prin cel puţin două trăsături esenţiale – structura subcelulară şi lipsa metabolismului propriu – au fost încadrate într-un regn de sine stătător, regnul Vira.

112

BACTERIOLOGIE GENERAL|

1.3. ISTORICUL MICROBIOLOGIEI Evoluţia cunoştinţelor despre microorganisme poate fi împărţită în patru etape mai importante (Răducănescu H., Bica-Popii Valeria, 1986; Carp-Cărare M.,2001): ♦ etapa intuitivă, de admitere ipotetică a existenţei microorganismelor; ♦ etapa descoperirii microorganismelor, a studiului lor morfologic şi a primelor încercări de diferenţiere şi clasificare a acestora; ♦ etapa constituirii microbiologiei ca ştiinţă şi a dezvoltării ei pe baze moderne; ♦ etapa contemporană de dezvoltare a microbiologiei. 1.3.1. ETAPA INTUITIVĂ, DE ADMITERE IPOTETICĂ A EXISTENŢEI MICROORGANISMELOR Această etapă se întinde din antichitate şi până în a 2-a jumătate a secolului XIX. Ea este caracterizată prin elaborarea de către diferiţi învăţaţi a unor ipoteze sau teorii care încearcă să explice contagiozitatea unor îmbolnăviri, dintre care merită a fi reţinute următoarele: a) Teoria miasmatică a celebrului medic grec HIPOCRAT din COS (460-380 î.e.n.) reprezintă prima teorie medicală de profunzime. Conform acestei teorii, bolile molipsitoare sunt produse de miasme vehiculate prin aer. Este însă admisă şi 113

BACTERIOLOGIE GENERAL|

posibilitatea transmiterii bolilor prin “ape alterate aduse de la distanţă”. Astfel de consideraţiuni teoretice sunt urmate şi de recomandări practice, cum ar fi executarea de fumigaţii cu sulf sau esenţe aromate şi fierberea apei, în cazul apariţiei bolilor molipsitoare. HIPPOCRAT este primul care face observaţii privind existenţa unor cauze comune la bolnavii care prezintă aceleaşi manifestări de boală. Tot în antichitate au mai fost admise puncte de vedere privind cauza transmiterii unor boli, de către unii istorici şi scriitori: ♦ THUKIDIDE (465-388 î.e.n.) atribuie apariţia epidemiilor unor factori de contagiune – contagium animatum. Renumitul istoric grec a făcut în acelaşi timp observaţii privind imunitatea, menţionând în scrierile sale că după trecerea prin boală nu se produc îmbolnăviri a doua oară. ♦ MARCUS TERENTIUS VARO (116-27 î.e.n.) corelează apariţia unor îmbolnăviri cu particularităţile zonale ale locului respectiv, ca de exemplu existenţa mlaştinilor. Filozoful roman admite ca probabilă prezenţa în regiunile palustre a unor animale minuscule – aniamlia minuta- ce plutesc în aer şi cărora le revine responsabilitatea etiologică a îmbolnăvirilor. Teoria miasmatică a fost însă cea mai bine consolidată, având valoarea unei teorii medicale. De aceea ea a persistat şi în evul mediu, coexistând cu teoria contagiunii până în timpurile moderne.

114

BACTERIOLOGIE GENERAL|

b) Teoria contagiunii, emisă de către medicul şi poetul italian GIOROLAMO FRACASTORO (1478-1553), cunoscut şi sub numele latinizat HYERONIMUS FRACASTORIUS. în lucrarea sa “De contagionibus, de morbis contagios et eorum curatione”, FRACASTORO numeşte particulele responsabile de boli, “seminaria” sau “contagium vivum” şi le consideră entităţi vii, capabile de multiplicare. Lucrarea cuprinde şi precizări asupra modalităţilor de contagiune: directă, indirectă, la distanţă. Una dintre ideile noi care apar în teoria lui FRACASTORO,este aceea a afinităţii elective a germenilor pentru anumite specii animale sau pentru unele organe. 1.3.2. ETAPA DESCOPERIRII MICROORGANISMELOR, A STUDIULUI LOR MORFOLOGIC ŞI A PRIMELOR ÎNCERCĂRI DE DIFERENŢIERE ŞI CLASIFICARE A ACESTORA Această perioadă începe odată cu ultimele decenii ale secolului al XVII-lea şi se întinde până în a doua jumătate a secolului al XIX-lea. Ea este caracterizată prin cunoaşterea nemijlocită a obiectului microbiologiei şi este tributară progresului tehnic în plin avânt. a) Inventarea microscopului. Descoperirea microorganismelor nu ar fi fost posibilă fără apariţia instrumentelor de amplificare optică. Prima încercare de construcţie a unui microscop se datorează lui ROGER BACON în secolul XIII, urmat abia peste aproximativ două secole 115

BACTERIOLOGIE GENERAL|

de fraţii ZACCHARIAS şi HANS JENSEN (1590) şi de GALILEO GALILEI (1610). ROBERT HOOKE (1665) aduce perfecţionări microscopului şi-l foloseşte pentru cercetarea structurii organismelor vegetale. în aceaşi perioadă au apărut şi alţi constructori de microscoape, printre care se numără şi LEUWENHOECK. b)

Descoperirea microorganismelor ANTONY VAN LEUWENHOECK (1632-1723) construieşte un microscop care se pare că mărea de 300 ori, cu ajutorul căruia face cercetări în salivă şi puroi, examinează spermatoizi, solzi de fluturi etc. Fiind dotat cu un pătrunzător spirit de observaţie şi capacitate de sesizare a noului, LEUWENHOECK observă, descrie şi desenează (fig. 1) în lucrarea sa “Arcana naturae ope microscopiorum detecta”, microorganisme, astăzi omologabile cu bacteriile şi ciupercile inferioare, pentru care foloseşte denumirea “animalcula”. Lucrarea este prezentată la Societatea Regală de Biologie din Londra în 1675, este tipărită la DELFT în 1695 şi reprezintă certificatul de naştere al microbiologiei.

Secolul al XVIII-lea a marcat puţine progrese în cunoaşterea lumii microbiene descoperite de LEUWENHOECK. Cercetările întreprinse s-au concretizat în acumulări de date cu caracter predominant empiric privind morfologia microorganismelor. 116

BACTERIOLOGIE GENERAL|

c)

Primele încercări de diferenţiere şi clasificare a microorganismelor . LINNÉ (1707-1778) ţine seama de existenţa acestor vieţuitoare şi în lucrarea sa “Systema naturae” apărută în 1735, le încadrează întrun singur gen, căruia îi dă numele de “chaos”, sugestiv pentru stadiul cunoştinţelor despre microbi din acel timp.

d)

Primele încercări de diferenţiere şi clasificare a microorganismelor. LINNÉ (1707-1778) ţine seama de existenţa acestor vieţuitoare şi în lucrarea sa “Systema naturae” apărută în 1735, le încadrează întrun singur gen, căruia îi dă numele de “chaos”, sugestiv pentru stadiul cunoştinţelor despre microbi din acel timp.

117

BACTERIOLOGIE GENERAL| Fig. 1 Desenul lui LEUWENHOECK în care sunt redate bacteriile observate în salivă

FRIEDRICH MÜLLER între 1773-1786 este primul care subliniază faptul că nu toate microorganismele sunt identice şi propune împărţirea lor în două genuri: Vibrio şi Monas. Ulterior se fac şi alte propuneri de noi genuri şi specii. Apar primele sisteme de clasificare ale microorganismelor. FERDINAND COHN în 1854 crează termenul de bacterie şi împreună cu EHRENBERG desprind acest grup de microorganisme din regnul animal şi argumentează încadrarea lui în regnul vegetal, pe baza prezenţei peretelui celular. Astfel, în cadrul vieţuitoarelor microscopice, bacteriile devin un grup de sine stătător, diferenţiat, deocamdată pe baza criteriilor morfologice. 1.3.3. ETAPA CONSTITUIRII MICROBIOLOGIEI CA ŞTIINŢ| ŞI A DEZVOLTĂRII EI PE BAZE MODERNE Această etapă cuprinde a doua jumătate a secolului al XIX-lea. Ea este strâns legată de apariţia a două personalităţi: LOUIS PASTEUR şi ROBERT KOCH, care prin contribuţiile lor şi a şcolilor pe care le-au creat, au fundamentat microbiologia ca ştiinţă şi au declanşat dezvoltarea ei impetuoasă. Tot în această perioadă se situează şi începuturile imunologiei, ramură a ştiinţelor biologice, astăzi de sine stătătoare, dar care îşi are originea şi s-a dezvoltat până nu demult în strânsă conexiune cu microbiologia.

118

BACTERIOLOGIE GENERAL|

a) Rolul lui LOUIS PASTEUR şi a şcolii sale în revoluţionarea microbiologiei. LOUIS PASTEUR (1822-1895) a fost un savant de larg orizont şi de o excepţională fecunditate, profunzime şi probitate ştiinţifică. Cu toate că a fost chimist ca formaţie şi că în primii săi ani de activitate a elaborat câteva valoroase lucrări de chimie, PASTEUR şi-a dedicat întreaga sa activitate studiului microorganismelor. Mobilul schimbării domeniului său de cercetare l-a constituit studiul unor procese chimice care, în final, s-au dovedit a fi produse de microorganisme. Plecând de la această constatare, PASTEUR şi-a lărgit treptat sfera de investigaţii asupra microorganismelor. Astfel, s-a ajuns la depăşirea etapei morfologice de studiu a microorganismelor şi inaugurarea etapei fiziologice, în care pe prim plan trece investigarea activităţilor enzimatice microbiene, cu implicaţiile acestora pentru diferite domenii ale activităţii umane. Cele mai importante descoperiri ale lui PASTEUR în domeniul microbiologiei şi a biologiei în general, sunt redate sintetic în continuare. • Demonstrarea naturii microbiene a fermentaţiilor. Solicitat fiind să elucideze unele probleme ale procesului de vinificaţie, PASTEUR dovedeşte că orice fermentaţie este “un act corelativ unui fenomen vital”. El infirmă teoria lui LEIBIG, conform căreia fermentaţiile erau considerate rezultatul descompunerii microorganismelor. în 1865, PASTEUR descoperă fermentaţia butirică şi bacteriile anaerobe. • Fundamentarea naturii microbiene a infecţiilor. PASTEUR stabileşte relaţia cauzală microb-infecţie pe care o verifică 119

BACTERIOLOGIE GENERAL|

•

•

experimental. Pornind de la studiul unor boli ale larvelor fluturelui de mătase, PASTEUR şi-a extins mai târziu studiile asupra unor infecţii ale animalelor şi omului. El demonstrează că prezenţa germenilor în organele oilor moarte de antrax nu este consecinţa bolii, ci cauza acesteia. în concluziile sale, PASTEUR porneşte de la analogia existentă între fermenaţie şi infecţie, ambele procese fiind efectul activităţii biologice a bacteriilor. Infirmarea definitivă a teoriei generaţiei spontane. Actualizată în secolul al XIX-lea de FELIX-ARCHIMEDE POUCHET, teoria generaţiei spontanee constituia în acea perioadă o frână în dezvoltarea ştiinţelor biologice. Bazat pe descoperirile sale privind mecanismele fermentaţiilor şi a infecţiei, PASTEUR demonstrează fără echivoc că microorganismele nu apar spontan. Ele ajung în substraturile în care se multiplică, din aer, de pe suprafaţa obiectelor care vin în contact cu aerul etc. Un substrat nutritiv sterilizat întrun recipient închis la flacără, rămâne practic steril la infinit. Aceste experinţe au stat şi la baza introducerii sterilizării în practica medicală. Prepararea unor vaccinuri. Vaccinul contra holerei aviare a fost primul vaccin antibacterian bazat pe atenuarera germenilor în condiţii de laborator. Această descoperire a fost consecinţa unei întâmplări. PASTEUR a uitat o tulpină de Pasteurella multocida la termostat şi a constatat apoi că ea nu mai 120

BACTERIOLOGIE GENERAL|

reproduce infecţia la găini. Mai mult chiar, găinile inoculate au devenit rezistente la infecţia cu o tulpină virulentă aparţinând aceleeaşi specii. Inspirat din această întâmplare, PASTEUR a atenuat şi bacilul cărbunelui. Pe baza unei experienţe ştiinţifice, organizate după un protocol bine stabilit în 1881, în localitatea Pouilly le Fort, este spectaculos demonstrată eficacitatea vaccinului anticărbunos pasteurian pentru oaie. Geniul lui PASTEUR este şi mai pregnant ilustrat prin prepararea vaccinului antirabic. Fără a cunoaşte natura agentului etiologic al turbării, PASTEUR reuşeşte în 1885 să obţină prin treceri succesive intracerebrale pe iepure, virusul rabic fix, incapabil să reproducă turbarea pe cale subcutanată, dar cu proprietăţi imunizante. Practica imunizării antirabice cu virusuri fixe s-a păstrat până în zilele noastre. • Izolarea şi identificarea agenţilor etiologici ai unor infecţii ale omului şi animalelor. Lui PASTEUR îi revine meritul de a fi izolat şi descris mai mulţi germeni printre care Clostridium septicum (vibrionul septic al lui PASTEUR), stafilococii şi streptococii. PASTEUR a avut numeroşi elevi, în jurul lui constituindu-se o şcoală la care s-au format o serie de eminenţi microbiologi, din rândul cărora se cuvine a fi menţionaţi: ♦ EMILE ROUX (1853-1933), alături de YERSIN, s-a distins, printre altele, în studiul toxinelor microbiene. ♦ EDMOND ISIDORE ETIENNE NOCARD (1850-1903) împreună cu ROUX izolează şi 121

BACTERIOLOGIE GENERAL|

identifică mai mulţi germeni cunoscuţi astăzi sub numele de micoplasme. ♦ CHARLES EDUARD CHAMBERLAND este autorul unor inovaţii tehnice deosebit de utile activităţii curente de laborator, ca de exemplu primul filtru bacteriologic şi autoclavul. Printre discipolii lui PASTEUR se numără şi VICTOR BABEŞ, fondatorul şcolii româneşti de microbiologie. Marile descoperiri ale lui PASTEUR n-au întârziat să-şi găsească laturi aplicative şi în alte domenii ale medicinei. Aşa a fost cazul introducerii antisepsiei în chirurgie de către JOSEPH LISTER (1827-1917), cel mai convins şi activ susţinător al teoriei biologice a lui Pasteur, căruia îi scria: ,, dacă veţi veni vreodată la Edinburg, veţi găsi, cred, cea mia bogată răsplată văzând în spitalul nostru ce binefaceri pentru umanitate produce opera dumneavoastră."”Este vorba despre considerabila scădere a mortalităţii prin infecţia de spital, ca urmare a folosirii fenolului. b) Rolul lui ROBERT KOCH şi a şcolii sale în dezvoltarea microbiologiei. ROBERT KOCH (1843-1910), medic de ţară, animat de o neobosită sete de cunoaştere şi o enormă putere de muncă, trebuie considerat al doilea fondator al microbiologiei ştiinţifice. Contribuţiile sale cele mai importante în acest sens au fost următoarele: • Stabilirea criteriilor pe baza cărora un microorganism poate fi considerat agentul cauzal al unei boli. Aceste criterii sunt exprimate sub forma a trei condiţii cunoscute sub numele de postulatele sau triada lui KOCH. în conceperea şi formularea lor, 122

BACTERIOLOGIE GENERAL|

•

•

KOCH s-a inspirat din lucrările profesorului său JAKOB HENLE (1809-1885). Postulatele elaborate între anii 1878 şi 1884 precizează că, un microb poate fi considerat agentul cauzal al unei boli atunci când: - se găseşte la toţi indivizii care au prezentat aceleaşi semne de boală; - se izolează şi se menţine în culturi pure, care - inoculate, reproduc în condiţii experimentale, o infecţie identică sau asemănătoare cu infecţia naturală. Cu toate că nu oglindesc toate faţetele procesului complex al infecţiei microbiene, postulatele lui KOCH au contribuit substanţial la fundamentarea ştiinţifică a patologiei bolilor infecţioase. Punerea la punct a tehnicii de izolare a bacteriilor în culturi pure. Obţinerea culturilor pure a fost condiţionată de introducerea în practica de laborator a mediilor de cultură solide pe care bacteriile se dezvoltă sub formă de colonii. Posibilitatea izolării în culturi pure a marcat un important pas înainte în practica individualizării germenilor din punct de vedere taxonomic. Semnalarea primului fenomen de alergie şi prepararea primei substanţe revelatoare. KOCH a observat o sensibilitate deosebită a cobailor inoculaţi cu bacilul tuberculozei, care, în cazul unei reinoculări, reacţionează prin apariţia unei inflamaţii urmate de un ulcer la locul inocularii. Această reacţie este cunoscută sub numele de fenomenul lui KOCH. Totodată, cu intenţia iniţială de a prepara un vaccin, ROBERT KOCH a obţinut tuberculina care, în stare 123

BACTERIOLOGIE GENERAL|

purificată (PPD), este utilizată şi astăzi ca preparat revelator în diagnosticul alergic al tuberculozei. • Izolarea şi identificarea agenţilor etiologici ai unor infecţii grave ale omului şi animalelor. KOCH a stabilit etiologia tuberculozei umane, obţinând în culturi pure agentul cauzal (Mycobacterium tuberculosis), pentru care şi astăzi este uzual apelativul “Bacilul lui Koch” ,ca nume comun. O altă bacterie izolată şi descrisă de KOCH este agentul holerei umane (Vibrio cholerae). Şcoala germană de microbiologie fondată de ROBERT KOCH a fost şi ea ilustrată prin renumiţi bacteriologi, printre care s-au numărat Friedrich Löffler şi Hans Christian Gram. FRIEDRICH LÖFFLER (1852-1915), izolează şi descrie agenţii etiologici ai morvei şi rujetului, imaginează reţeta unor medii de cultură şi a unor tehnici de colorare şi împreună cu PAUL FROSCH (1860-1928) descoperă virusul febrei aftoase. HANS CHRISTIAN GRAM (1853-1938) introduce în anul 1884 metoda de colorare care-i poartă numele, rămasă până astăzi tehnica de bază pentru examenele bacteriologice curente. în perioada marilor descoperiri ale lui PASTEUR şi KOCH este elucidată cauza a numeroase infecţii, fiind identificaţi şi descrişi agenţii etiologici ai acestora de către o serie de bacteriologi de renume: ESCHERICH, (Escherichia coli, 1882), NICOLAIER şi KITASATO, (Clostridium tetani, 1884), BRUCE, (Brucella melitensis, 1887), NOCARD şi ROOX (Mycoplasma mycoides, 1898) etc. a. Descoperirea virusurilor. 124

BACTERIOLOGIE GENERAL|

Cu toate că anterior descoperirii lor, JENNER şi PASTEUR au preparat vaccinuri antivirale , primul virus a fost pus în evidenţă abia în anul 1892. DIMITRI IOSIFOVICI IVANOVSKI (1869-1920), un botanist rus, descoperă virusul mozaicului tutunului, precizând că această boală este produsă de un microb extrem de mic, invizibil la microscop, care traversează porii filtrelor bacteriologice. După şase ani (1898), LOFFLER şi FROSCH descoperă primul microb filtrabil patogen pentru animale- virusul febrei aftoase. b. Începuturile imunologiei. Pe baza marilor descoperiri din domeniul microbiologiei şi paralel cu aceasta, ia naştere şi se dezvoltă imunologia. EDWARD JENNER (1749-1823), un medic englez, preparase cu aproximativ un secol în urmă (1798) vaccinul contra variolei umane dintr-o suspensie de cruste recoltate de pe ugerul vacilor cu variolă. Din lucrările lui JENNER se inspiră PASTEUR în prepararea vaccinurilor contra holerei aviare, cărbunelui şi turbării. Aceste importante descoperiri destinate rezolvării unor probleme practice de mare stringenţă sunt urmate de cercetări privind mecanismele de apărare antimicrobiană ale organismului animal. Cele mai importante probleme elucidate în ultimele decenii ale secolului al XIX-lea, care conferă suport teoretic metodelor imunologice deja intrate în practica prevenirii bolilor microbiene, sunt: ♦ stabilirea proprietăţilor antimicrobiene ale sângelui şi tumorilor de către FODOR în 1887; 125

BACTERIOLOGIE GENERAL|

♦ descoperirea fenomenului de fagocitoză de către ILIA MECINIKOV (1845-1916); ♦ prepararea primelor seruri imune de către BABEŞ şi LEPP în 1889, urmaţi de BEHRING şi KITASATO în 1890; ♦ investigarea mecanismelor unor reacţii antigenanticorp (precipitare –KRAUS, 1887; imunocitoliza –PFEIFFER şi ISAEFF, 1894; fixarea complementului –BORDET, 1899). HANS BUCHNER (1850-1902) şi PAUL EHRLICH (1854-1915) sunt autorii primelor teorii privind modul de formare al cuplului antigen-anticorp. Teoria “catenelor laterale” a lui EHRLICH subliniază substratul chimic care stă la baza constituirii cuplului. 1.3.4. ETAPA CONTEMPORANĂ DEZVOLTARE A MICROBIOLOGIEI

DE

Etapa pe care microbiologia a parcurs-o de la începutul secolului XX este dominată de o serie de importante descoperiri, datorate, în mare măsură, implementării în microbiologie a noilor metode corespunzătoare progresului tehnico-ştiinţific din chimie, optică, electronică, şi alte domenii de activitate. Cele mai de seamă cuceriri ale microbiologie contemporane pot fi considerate următoarele: introducerea substanţelor chimioterapice şi antibiotice în tratamentul bolilor microbiene, cunoaşterea detaliilor structurale şi a proceselor fiziologice de fineţe ale microorganismelor, începuturile, urmate de progresul rapid al studiilor de genetică microbiană, descoperirea 126

BACTERIOLOGIE GENERAL|

ultrastructurii virusurilor şi a mecanismelor infecţiei virale, dezvoltarea imunologiei şi afirmarea ei ca ramură independentă a ştiinţelor biologice. a) Îmbogăţirea arsenalului terapeutic antimicrobian. Până în primele decenii ale secolului XX numeroase boli microbiene erau practic incurabile, fapt care a determinat menţinerea unui procent ridicat de mortalitate în cazul unor epidemii ca antraxul, pesta, holera etc. Chimioterapicele au fost introduse în practica medicală de către PAUL EHRLICH, care a obţinut salvarsanul, folosit cu succes în tratamentul sifilisului în jurul anului 1910. Chimioterapia şi-a lărgit considerabil sfera de aplicaţii odată cu descoperirea sulfamidelor.Cu toate că prima sulfamidă a fost preparată de PAUL GELMO încă din 1908, folosirea lor pe scară largă în tratamentul infecţiilor microbiene a început abia în anul 1932 când GERHARD DOMACK a avut iniţiativa utilizării în acest scop, a prontozilului (sulfamida roşie), preparat de MIETSCH şi KLARER. Antibioticele au intrat în patrimoniul terapiei antimicrobiene în anul 1941, când ERNST CHAIN şi HOWARD FLOREY tratează primii pacienţi cu penicilină. Efectul antibacterian al acestei substanţe a fost descoperit încă din 1929 de către ALEXANDER FLEMING, în urma sesizării antagonismului exercitat de o ciupercă din genul Penicillium faţă de o cultură de stafilococ. în anii următori au fost identificate şi extrase numeroase alte antibiotice (WAKSMAN obţine în 1944 streptomicina din Streptomyces griseus, BURKHOLDER extrage în 1947 cloromicetina, din Streptomyces venezuelae etc.), iar unele au fost obţinute prin sinteză sau semisinteză, încât astăzi medicina dispune de de un 127

BACTERIOLOGIE GENERAL|

arsenal foarte bogat de antibiotice, de o mare varietate din punct de vedere al originii şi al spectrului de activitate. b) Adâncirea studiului morfologiei şi fiziologiei microorganismelor. Cunoaşterea detaliilor de structură şi a mecanismelor fiziologice de fineţe au fost determinate de progresele din domeniul fizicii şi chimiei contemporane. Vizualizarea virusurilor şi cunoaşterea ultrastructurii microorganismelor a fost posibilă datorită inventării microscopului electronic. Primele microscoape electronice au fost construite în perioada 1930-1940 de către firma Siemens şi aproximativ din aceaşi perioadă datează şi primele cercetări electronooptice în domeniul microbiologiei. Aprofundarea cunoaşterii mecanismelor fiziologice ale microorganismelor este tributară dezvoltării biochimiei şi introducerii în biologie a modului de lucru cu izotopi radioactivi. Astfel, a devinit posibilă cunoaşterea structurii chimice a microorganismelor, studierea activităţii lor enzimatice, stabilirea cu ajutorul atomilor marcaţi a soartei diferitelor substanţe din mediu în raport cu procesele vitale, etc. c) Descoperirea determinanţilor genetici microorganismelor şi dezvoltarea geneticii microbiene.

ai

Primele observaţii, care mai târziu au contribuit la descoperirea sediului informaţiei genetice, aparţin lui GRIFFITH. în 1928, acesta a constatat că pneumococii avirulenţi, aparţinând tipului serologic II, se pot transforma în pneumococi virulenţi aparţinând tipului serologic III, dacă sunt inoculaţi la animale în amestec cu o suspensie de pneumococi de tip III omorâţi prin 128

BACTERIOLOGIE GENERAL|

căldură. în 1944, reluând experimentul lui GRIFFITH, OSWALD AVERY stabileşte că responsabilitatea transformării revine AND-ului eliberat de pneumococii de tip III omorâţi, care a pătruns în celulele pneumococilor de tip II, aducând cu sine mesajul genetic ce codifică însuşirile caracteristice tipului III. Descoperirea lui AVERY stă la baza geneticii moleculare moderne, ea dovedindu-şi valabilitatea pentru toate vieţuitoarele. în anii următori au fost demonstrate şi alte posibilităţi de recombinare genetică la bacterii. Astfel, LEDERBERG şi TATUM au descris în 1946 fenomenul de conjugare, iar ZINDER şi LEDERBERG, în 1952, fenomenul de transducţie fagică. Elucidarea acestuia din urmă a fost posibilă datorită unei întregi suite de descoperiri anterioare, începând cu virusurile bacteriofage semnalate de TWORT în 1915 şi fenomenul de lizogenie descris de BORDET şi CIUC| în 1920. O importantă contribuţie la dezvoltarea geneticii bacteriene au avut JACOB şi MONOD, prin elucidarea mecanismului genetic de reglare a variaţiilor fenotipice pe baza teoriei operonului. 1.3.5. DEZVOLTAREA MICROBIOLOGIEI îN ROMÂNIA începuturile cercetării şi practicii microbiologice în România se situează spre sfârşitul secolului al XIX-lea. a) Şcoala românească de microbiologie medicală a avut ca fondator pe marele savant VICTOR BABEŞ (1854-1925), care s-a format lucrând în perioada 129

BACTERIOLOGIE GENERAL|

1881-1884 în laboratorul lui PASTEUR şi în 1885 în laboratorul lui KOCH. BABEŞ a desfăşurat o prodigioasă activitate ştiinţifică elaborând peste 1.000 lucrări, 25 monografii şi primul tratat de bacteriologie, în colaborare cu VICTOR CORNIL, în 1883. Descoperirea în 1887 a incluziilor produse de virusul turbării în celulele piramidale din cornul lui Ammon, cunoscute sub denumirea de “incluziile lui Babeş-Negri”, a serurilor imune (împreună cu LEPP în 1889), a paraziţilor din hematiile unor specii de animale – pentru care a fost creat genului Babesia, în semn de recunoaştere a paternităţii acestei descoperiri -, reprezintă contribuţiile cele mai importante ale lui VICTOR BABEŞ la tezaurul ştiinţei româneşti şi universale. Pe lângă acestea, trebuie menţionate numeroasele sale cercetări privind antagonismului bacterian şi descrierea granulelor metacromatice din citoplasma bacilului difteriei (corpusculii Babeş-Ernst). Paralel cu activitatea ştiinţifică, VICTOR BABEŞ a dezvoltat şi o bogată activitate didactică, organizatorică şi obştească, conturându-se ca o figură luminoasă de savant patriot. Savanţii care ulterior au dezvoltat în mod strălucit şcoala de microbiologie medicală românească au fost: IOAN CANTACUZINO (1863-1934), CONSTANTIN IONESCU-MIH|ESTI (1883-1962), MIHAI CIUCA (1883-1969), DUMITRU COMBIESCU (1887-1961), iar în domeniul virusologiei CONSTANTIN LEVADITI (1874-1952) şi ŞTEFAN S. NICOLAU (1896-1967). b)

Şcoala de microbiologie veterinară.

130

BACTERIOLOGIE GENERAL|

Elev al lui VICTOR BABEŞ, PAUL RIEGLER (18671938) a fost fondatorul şcolii româneşti de microbiologie veterinară. El a introdus practica diagnosticului bacteriologic în medicina veterinară românească şi a fondat în 1911 Institutul de seruri şi vaccinuri de uz veterinar (în acea perioadă, al treilea de acest fel în lume), care în 1922 primeşte numele lui PASTEUR. Ca cercetător, a desfăşurat o susţinută activitate ştiinţifică, remarcându-se prin lucrările sale privind bacilul morvei. RIGLER a fost primul profesor de Microbiologie şi Anatomie Patologică la Şcoala de Medicină Veterinară din Bucureşti, având marele merit de a fi creat o şcoală în cadrul căreia s-au format personalităţi de seamă, care s-au distins pe plan naţional şi internaţional, continuându-i opera. ALEXANDRU VECHIU (1890-1954) s-a remarcat printr-o activitate multilaterală. El a condus, după RIGLER, Institutul Pasteur şi Catedra de Microbiologie. VECHIU a fost printre primii cercetători care au reuşit adaptarea virusului pestei porcine, pe iepure. ALEXANDRU CIUCA (1880-1972) a fost profesor de Boli Infecţioase la Facultatea de Medicină Veterinară din Bucureşti. Prin activitatea sa ştiinţifică a adus contribuţii importante în probleme ca: infecţia experimentală cu bacilul morvei la taurine, tipizarea virusului febrei aftoase prin RFC, tratamentul durinei cu neosalvarsan, etc. CONSTANTIN CERN|IANU (1890-1972) s-a remarcat printr-un studiu amplu asupra piroplasmelor şi o îndelungată activitate ca director al Institutului Pasteur. ILIE POPOVICI (1902-1982), personalitate multilaterală, a avut contribuţii deosebite în domeniul preparării de noi vaccinuri contra febrei aftoase, turbării, agalaxiei contagioase a oilor şi caprelor şi holerei aviare. 131

BACTERIOLOGIE GENERAL|

VLADIMIR WYNOHRADNIK (1902-1972) a adus o contribuţie substanţială la dezvoltarea cercetării virusologice în medicina veterinară şi a organizat producţia biopreparatelor antipestoase porcine în cadrul Institutului Pasteur. NICOLAE STAMATIN (1905-1993), profesor de Microbiologie la Facultatea de Medicină Veterinară din Bucureşti, continuând tradiţia inaugurată de PAUL RIGLER, a contribuit la înflorirea şcolii româneşti de Microbiologie Veterinară. Practica veterinară îi datorează, printre altele, două vaccinuri cu mare valoare profilactică: vaccinul anticărbunos preparat din tulpina acapsulogenă 1190 R şi vaccinul antirujetic preparat din tulpina VR2 vaccinuri adoptate astăzi şi în alte ţări. Totodată, cercetările fundamentale întreprinse în domeniul biologiei sporogenezei, a antagonismului microbian, a bacteriofagilor speciilor din genul Bacillus, contribuţiile aduse în domeniul clasificării stafilococilor şi pasteurelelor, completează palmaresul care îl situează pe NICOLAE STAMATIN printre reprezentanţii de frunte ai bacteriologiei veterinare româneşti. NICOLAE MUNTIU (1909-1977), după o serie de lucrări inedite privind bacilul morvei, a iniţiat şi organizat cercetarea şi producţia de biopreparate în domeniul febrei aftoase. Pe lângă ,,pionierii” Microbiologiei româneşti, se cuvine a fi menţionate şi alte personalităţi reprezentative, care au desfăşurat o rodnică activitate pe tarâmul microbiologiei veterinare, ca: ♦ ALEXANDRU POP, microbiolog, erudit a adus contribuţii originale în domeniul brucelozei şi al unor probleme de imunologie teoretică. 132

BACTERIOLOGIE GENERAL|

♦ CONSTANTIN SURDAN a elaborat numeroase lucrări privind pararickettsiile. ♦ VALENTIN VOLINTIR, pionier al unor domenii de cercetare, a diagnosticat şi izolat, primul în ţara noastră, agenţi etiologici ca Listeria monocytogenes, Moraxella bovis etc. ♦ POPA OCTAVIAN, autor al unor lucrări privind salmonelozele animalelor şi cursuri de Microbiologie şi Imunologie la F.M.V. Timişoara. ♦ ANDREI STOENESCU (1914-2001), strălucit reprezentant al microbiologiei veterinare româneşti, a condus destinele disciplinei de Microbiologie şi Imunologie în cadrul Facultăţii de Medicină Veterinară Iaşi, din anul 1962 (data înfiinţării disciplinei), până în anul 1974. Profesorul Stoenescu a desfăşurat o prestigioasă activitate de cercetare, concretizată în peste 130 lucrări ştiinţifice originale. Demne de menţionat, datorită priorităţii lor naţionale, sunt studiile privind encefalomielita infecţioasă (boala de Teschen) la porc în nordul Moldovei. ♦ ALEXANDRU GRECIANU (1930-1998), distins intelectual, remarcabil cercetător microbiolog şi cadru didactic de excelenţă, a continuat consolidarea şcolii de Microbiologie din cadrul F.M.V. Iaşi, în perioada 1974-1995. Pe plan ştiinţific, a adus contribuţii originale la metodica identificării grupului E. coli şi la stabilirea corelaţiilor existente între serogrup şi specia animală receptivă.

133

BACTERIOLOGIE GENERAL|

Institutul Pasteur, disciplinele de Microbiologie şi Imunologie de la cele patru facultăţi de Medicină Veterinară, laboratoarele centrale, reţeaua laboratoarelor judeţene şi a laboratoarelor din întreprinderi de industrie alimentară, reprezintă astăzi cadrul care asigură dezvoltarea practicii şi a cercetării în domeniul microbiologiei veterinare la noi în ţară.

2.1. CONCEPTUL DE BACTERIE Bacteriologia este ramura microbiologiei care se ocupă cu studiul bacteriilor.Termenul de bacterie a fost creat 134

BACTERIOLOGIE GENERAL|

de F e r d i n a n d C o h n în 1872, odată cu încercarea de a elabora una dintre primele clasificări ale acestor microorganisme. Bacteriile sunt microorganisme unicelulare cu structură procariotă - tip de organizare caracterizat prin lipsa membranelor intracelulare, spre deosebire de tipul eucariot la care nucleul şi unele organite (cloroplastele, mitocondriile) posedă membrane proprii. Materialul genetic sau genomul bacterian este reprezentat de un cromozom format dintr-o moleculă mare de ADN şi de unităţi ereditare extracromozomale numite plasmide, constituite din molecule de ADN mult mai mici (aproximativ 1% din masa cromozomului). Bacteriile sunt lipsite de mitocondrii, aparat Golgi şi reticul endoplasmatic propriu-zis. Funcţiile acestor structuri, caracteristice celulei eucariote, sunt suplinite de alte componente celulare, mai ales de membrana citoplasmatică.

135

BACTERIOLOGIE GENERAL|

Caracterele diferen]iale `ntre principalele categorii de microorganisme (dup\ M.Carp-C\rare, 2001) Caracterul diferen]ial

Prioni

Viroizi

Virusuri

Bacterii

Ciuperci

Num\rul tipurilor de acid nucleic Tipul de organizare Organizarea materialului genetic

-

1 (ARN)

1(ADN SAU ARN) niciodat\ ambii Acelular Genom viral

2 (ADN + ARN)

2 (ADN + ARN)

Celular procariot Un singur cromozom [i plasmide Prezente

Celular eucariot Mai mul]i cromozomi

Acelular -

Acelular ARN de talie mic\

Echipament enzi-matic [i activitate metabolic\ proprie Cre[tere Mod de reproducere

Absente

Absente

Absente

Absent\ Sintez\ amplificat\ prin conversie

Absent\ Sunt sintetiza]i de celula gazd\

Absent\ Sunt sintetizate de celula gazd\

Prezent\ Independent, sciziparitate

Prezent\ Independent, sau asexuat

Capacitate diferen]iere celular\ Parazitism absolut Forme biologice existen]\ `n natur\

Nu este cazul

Nu este cazul

Nu este cazul

Absent\

Prezent\

Constant obligat Constant obligat P.P.C.: protein\ ARN mic prionic\ celular\ intranuclear normal\ P.P.S.: protein\ prionic\ din scrapie patologic\

Constant, obligat • Virion infec]ios, temporar extracelular • Virus vegetativ, intracelular, `n curs de sintez\ • Virus integrat, fixat `n genomul celulei gazd\

Absent • Celul\ vegetativ\, capabil\ de diviziune • Spor (form\ de conservare )

Absent • Miceliu sau pseudomiceliu • Spor (form\ de reproducere)

La grani]a dintre viu [i neviu

La grani]a dintre viu [i neviu

Microorganisme cu organizare procariot\

Microorganisme diverse grade organizare

Pozi]ia pe filogenetic\

de de

scara

Idem

110

Prezente

sexuat

cu de

BACTERIOLOGIE GENERAL|

Bacteriile sunt metabolic active, dispunând de un echipament enzimatic propriu care realizează reacţiile celulare de degradare şi biosinteză. Nutriţia este de tip absorbtiv, din punct de vedere al accesului substanţelor nutritive în celulă şi de tip chimiotrof sau fototrof, după modul de obţinere a energiei necesare proceselor nutritive. Principala modalitate de multiplicare a bacteriilor este diviziunea simplă binară sau sciziparitatea. Unele specii bacteriene pot exista în natură sub două forme biologice alternative: forma vegetativă care reprezintă celula bacteriană propriu-zisă, dotată cu toate însuşirile caracteristice speciei din care face parte şi forma sporulată, care este o formă de rezistenţă şi de conservare a speciei în condiţii ostile, improprii vieţii. Spre deosebire de celula vegetativă biologic activă, sporul bacterian este o formă dormandă, caracterizată prin absenţa funcţiilor de multiplicare şi a celor biosintetice şi cu o foarte redusă intensitate a celorlalte activităţi vitale. Bacteriile se diferenţiază de celelalte grupe de microorganisme prin caracterele prezentate în tabelul 1.

2.2. NOŢIUNI DE TAXONOMIE NOMENCLATURĂ BACTERIANĂ

ŞI

2.2.1. TAXONOMIA BACTERIILOR Taxonomia (gr. taxon = grup) sau sistematica biologică este ştiinţa clasificării, în a cărei sferă de preocupări intră următoarele obiective: ♦ stabilirea criteriilor taxonomice;

110

BACTERIOLOGIE GENERAL|

♦ clasificarea indivizilor sau a unităţilor de bază în categorii taxonomice (taxoni) pe baza criteriilor stabilite; ♦ nomenclatura sau denumirea taxonilor. ♦ identificarea unităţilor necunoscute prin comparaţie cu sistemul taxonomic rezultat din primele trei operaţiuni. Un taxon biologic reuneşte o sumă de indivizi asemănători între ei în virtutea descendenţei dintr-un strămoş comun, deci posesori ai unei informaţii genetice comune. Prin urmare, clasificarea organismelor vii este o clasificare naturală sau filogenetică. Comparativ cu celelalte regnuri, clasificarea organismelor procariote pe baza acestui criteriu a întâmpinat numeroase dificultăţi, generate de cauze obiective, dintre care menţionăm: ♦ numărul redus de caractere morfologice şi insuficienţa amprentelor fosile care reflectă filogenia ; ♦ bacteriile nu pot fi studiate ca indivizi, ci ca populaţii, din cauza dificultăţilor de manipulare a unei singure celule; ♦ apariţia frecventă în populaţiile bacteriene a variantelor. în consecinţă, clasificarea bacteriilor s-a sprijinit deseori pe criterii fenotipice discutabile, din care derivă gradul mult mai mare de convenţional şi arbitrar al taxonomiei bacteriene, în comparaţie cu cel al plantelor şi animalelor. Gruparea bacteriilor în categorii taxonomice pe criterii filogenetice a devenit posibilă relativ recent, prin aplicarea tehnologiilor moderne de biologie moleculară şi biochimie în studiile de genetică bacteriană. Principalii parametri luaţi în studiu, în acest scop, sunt : 1. conţinutul relativ de guanină + citozină( G+C%) al ADN purificat; cu cât conţinutul G+C a două bacterii este mai apropiat, cu atât acestea sunt mai înrudite; 111

BACTERIOLOGIE GENERAL|

2. omologia secvenţelor nucleotidice ale ADN, cuantificată prin formarea moleculelor hibride pornind de la două catene ADN cu origini diferite; 3. studiul secvenţelor oligonucleotidice ale ARN ribozomal; gradul de înrudire a două organisme este direct proporţional cu omologia secvenţelor nucleotidice din ADN sau cu numărul de secvenţe oligonucleotidice comune din ARN ribozomal. 4. studiul structurii primare a enzimelor izofuncţionale sau a citocromului C; 5. studiul imunologic al proteinelor bacteriene omoloage. Pe baza criteriului omologiei materialului genetic, în ultimii ani clasificările convenţionale ale bacteriilor au fost supuse unor repetate remanieri. Deşi acest criteriu de identificare şi încadrare taxonomică a bacteriilor este, indiscutabil, cel mai obiectiv, din cauza gradului crescut de dificultate tehnică şi a aparaturii pe care o reclamă, în practica bacteriologică curentă se recurge în continuare la identificarea pe baza caracterelor fenotipice (morfologice, culturale, metabolice, antigenice, ecologice, de patogenitate, de sensibilitate la factori fizici, chimici şi biologici, etc. ).

2.2.1.1. Categorii de taxoni Conceptul de specie bacteriană. Unitatea taxonomică de bază a lumii vii este specia. În cazul organismelor superioare, din regnul vegetal sau animal, există criterii bine stabilite de delimitare a speciilor, cel mai important fiind capacitatea de încrucişare. Luând în considerare acest criteriu de bază, specia poate fi definită ca o comunitate reproductivă formată din populaţii care habitează un anumit areal şi ai căror indivizi se încrucişează liber în natură cu orice individ de sex opus, dând naştere la descendenţi 112

BACTERIOLOGIE GENERAL|

fertili care menţin relativ omogen fondul de gene al populaţiei (Buiuc G.,1999). Spre deosebire de reproducerea organismelor superioare, diviziunea celulară a bacteriilor este o înmulţire vegetativă, iar schimbul de material genetic prin conjugare (vezi cap. Genetică) este rar şi nu reprezintă un caracter de specie. Aceste diferenţe, la care se adaugă deosebirile fenotipice mai puţin tranşante ale bacteriilor şi capacitatea mult mai mare de a suferi variaţii fenotipice şi genotipice, sporesc gradul de dificultate în delimitarea speciilor bacteriene şi găsirea unui punct de vedere unitar asupra conceptului de specie bacteriană. Din cele câteva încercări de definire, cărora literatura ultimelor decenii le-a acordat mai multă atenţie ( S t a m a t i n1958; C o w a n- 1975; G o r d o n – 1978; S t a l e y şi K r i e g – 1984; citaţi de Răducănescu şi col., 1986) rezultă că speciile bacteriene ar putea fi privite ca populaţii de celule cu caractere fenotipice comune, prin care diferă semnificativ de alte populaţii. Fiecare populaţie care aparţine unei specii poartă numele de tulpină bacteriană (clonă sau suşă). Ea este o cultură pură care îşi are originea într-o singură izolare dintr-un mediu natural. Pentru practica bacteriologică, tulpina bacteriană are, prin analogie cu organismele superioare, valoarea unui individ. Toate examenele necesare identificării bacteriilor şi încadrării lor taxonomice se execută pe tulpini şi nu pe celule izolate, plecând de la premiza că o populaţie care constituie o tulpină provine din descendenţa uneia sau a unui număr restrâns de celule şi că este genetic omogenă. Studiile de taxonomie bacteriană se efectuează întotdeauna pe un număr cât mai mare de tulpini. Pentru fiecare specie bacteriană, într-una din colecţiile bacteriene recunoscute pe plan internaţional, se găseşte o tulpină tip sau de referinţă la care se raportează şi cu care se compară celelalte tulpini din specia respectivă. 113

BACTERIOLOGIE GENERAL|

Periodic, avându-se în vedere fenomenele de variabilitate care se produc în orice populaţie bacteriană, tulpinile din colecţii se clonează. Operaţia de clonare constă în dispersarea germenilor pe medii solide, urmată de transplantarea unui număr de colonii izolate. în urma examinării subculturilor, se selecţionează pentru a fi păstrate mai departe în colecţie, clonele ale căror proprietăţi se apropie, pe cât posibil până la identificare, de proprietăţile iniţiale pe care le prezenta tulpina respectivă la izolarea ei din mediul natural. Păstrarea tulpinilor bacteriene în colecţii se realizează prin treceri (pasaje) pe medii proaspete la intervale de timp impuse de longevitatea în culturi a speciei, sau prin liofilizare. Subdiviziunile speciei bacteriene. Crearea unor subdiviziuni în cadrul speciei se justifică prin existenţa unor diferenţe de diverse grade de esenţialitate între tulpini. Aceste subdiviziuni sunt subspecia şi varianta sau tipul. Subspecia implică diferenţe privind caractere importante, fără a depăşi însă limitele admise pentru specie. Varianta (var.) sau tipul se abate de la genotipul speciei printr-un singur caracter diferenţial, sau printr-un număr restrâns de caractere. Este taxonul infrasubspecific cu care se operează cel mai frecvent în practica bacteriologică. în funcţie de caracterul diferenţial se pot distinge mai multe categorii de variante sau tipuri ( tab. 2). Taxonii de rang superior speciei, în succesiunea lor ascendentă, sunt: genul, familia, ordinul, clasa şi diviziunea (încrengătura sau phylum). Genul reprezintă un grup taxonomic alcătuit din mai multe specii înrudite cu specia tip. El poate fi format dintr-o singură specie (gen monotipic), sau, obişnuit,din mai multe specii. Toate bacteriile îşi au locul în cadrul unui gen, iar identificarea genului stă la baza diagnosticului bacteriologic curent. Familia grupează mai multe genuri înrudite, dintre care unul este considerat genul tip. Numeroase genuri nu au fost încadrate încă în familii. 114

BACTERIOLOGIE GENERAL|

Ordinul este un taxon format din familii înrudite, mai rar utilizat, puţine grupe de bacterii fiind încadrate în ordine. Clasa este un taxon superior, care grupează mai multe ordine înrudite. Diviziunea reprezintă o grupare de clase înrudite. Tabelul 2 Taxoni infraspecifici (după Staley şi Krieg cit. de Răducănescu şi col., 1986 , completat de autoare) Denumirea taxonului Biovar

Sinonim

Caracterul diferenţial

Biotip

Serovar Patovar

Serotip Patotip

Fagovar

Fagotip

Proprietăţi biochimice sau fiziologice speciale Particularităţi de structură antigenică Patogenitatea pentru organisme gazdă din anumite specii Sensibilitatea faţă de anumiţi bacteriofagi Caractere morfologice aparte Particularităţi metabolice

Morfovar Chimiosau chemovar Colicinosau bacteriocinovar

Morfotip Chimiosau chemotip Colicinosau bacteriocinotip

Sensibilitate diferită la anumite colicine sau bacteriocine

2.2.1.2. Clasificarea bacteriilor In ultimele cinci decenii au apărut mai multe încercări de clasificare a bacteriilor, P r e v o t (1957 şi 1961), K r a s i l n i c o v (1959), S k e r m a n (1967), M u r r a y (1974). Ultima clasificare a apărut în 1994 în cadrul Manualului de Sistematică Bacteriană a lui B e r g e y (tab. 3). Cele patru filumuri se diferenţiază prioritar prin structura peretelui celular. Clasele, familiile, genurile şi speciile sunt departajate pe baza unor caractere morfologice, fiziologice, biochimice, ecologice, etc. 115

BACTERIOLOGIE GENERAL|

Tabelul 3 Clasificarea bacteriilor la nivelul taxonilor superiori Diviziunea (Phylum)

Clasa

I. Gracilicutes – bacterii Gram negative

I.1. Scotobacteria I.2. Anoxyphotobacteria I.3. Oxyphotobacteria II.1. Firmibacteria II.2. Thallobacteria III.1. Mollicutes

II. Firmicutes – bacterii Gram pozitive III. Tenericutes – bacterii lipsite de perete celular IV. Mendosicutes – perete celular lipsit de stratul de peptidoglican

IV.1. Archaeobacteria

Clasificarea uşurează efortul de identificare a speciilor în scopuri practice, acesta fiind de altfel, obiectivul principal al manualului amintit anterior. 2.2.2. NOMENCLATURA BACTERIILOR Conform normelor generale de nomenclatură în biologie, fiecare bacterie este denumită, după sistemul binominal al lui Linné, prin două cuvinte latinizate (de exemplu, Bacillus anthracis), care caracterizează foarte sintetic bacteria respectivă. Primul cuvânt indică genul şi este un substantiv la singular de origine latină, greacă, sau de altă origine, dar latinizat. Numele genurilor sunt inspirate, de regulă, de : ♦ unele caractere morfologice, frecvent forma şi modul de grupare (Bacillus = baston mic; Staphylococcus = 116

BACTERIOLOGIE GENERAL|

ciorchine de strugure; Sarcina = pachet, etc.), asociate uneori cu habitatul natural al bacteriei (Lactobacillus = bastonaş din lapte); ♦ numele bacteriologului care a izolat primul bacteria respectivă sau a avut merite deosebite în studiul ei: Brucella (Bruce), Pasteurella (Pasteur), Escherichia (Escherich), etc. Numele genului se scrie cu iniţială majusculă, întreg sau, în cazul unor enumerări şi numai atunci când precede numele speciei, prescurtat: B. anthracis, E. coli, S. aureus. Cel de-al doilea cuvânt denumeşte specia şi este descriptiv pentru substantivul care reprezintă genul. El poate fi: ♦ un adjectiv acordat gramatical cu numele genului (Proteus vulgaris, Clostridium septicum, Pasteurella multocida, etc.); ♦ un substantiv la cazul genitiv (Streptococcus lactis, Mycobacterium tuberculosis, Bacillus anthracis, etc.); ♦ un nume propriu la cazul genitiv (Providencia rettgeri), etc. Numele speciei se scrie întotdeauna cu literă mică. El se poate referi la: ♦ un caracter morfologic, cultural sau biochimic (Staphylococcus aureus, Lactobacillus acidophilus, etc.); ♦ gazda receptivă la care produce infecţii (Brucella suis, Streptococcus equi, Mycoplasma gallinarum, etc.); ♦ boala, un simptom sau o leziune caracteristică (Clostridium tetani, Bacillus anthracis, Mycoplasma agalactiae, Listeria monocytogenes, etc.); ♦ numele bacteriologului care a descris primul bacteria (Actinobacillus lignieresii, Clostridium chauvoei, Coxiella burneti, etc.). 117

BACTERIOLOGIE GENERAL|

Numeroase specii bacteriene au şi nume comune, folosite deseori în vorbirea curentă, ca de exemplu : bacilul piocianic sau bacilul puroiului albastru, pentru Pseudomonas aeruginosa; bacilul lui Koch sau B.K., pentru Mycobacterium tuberculosis; bacilul tetanosului, pentru Clostridium tetani, etc. Pentru o tulpină bacteriană care nu a fost încă identificată se foloseşte denumirea de ,,izolat”, iar după încadrarea în gen, până la precizarea speciei, denumirea genului urmată de abrevierea termenului species: sp. pentru singular şi spp. pentru plural (ex. Streptococcus sp., Salmonella spp.). Subspeciile şi variantele se denumesc adăugând la numele speciei, termenii subspecies (prescurtat subsp.), respectiv varietas (prescurtat var.), urmaţi de numele subspeciei sau variantei respective: Campylobacter fetus subsp. fetus; Francisella tularensis var. palearctica, etc. Variantele sau tipurile se mai notează cu cifre (la Streptococcus pneumoniae şi Brucella spp.), litere (la Clostridium perfringens şi Clostridium botulinum), sau prin specificarea antigenilor O şi H, (la Escherichia coli şi Salmonella spp.). Un caz particular se întâlneşte la leptospire şi salmonele, unde serotipurile sunt tratate, din punct de vedere al nomenclaturii, la fel ca speciile, pentru denumirea serotipurilor de Salmonella utilizându-se frecvent numele localităţilor de unde au fost izolate : S. dublin, S. panama, S. branderburg, etc. Ordinul şi familia sunt denumite cu numele genului celui mai reprezentativ pentru gruparea taxonomică respectivă, la care se adaugă sufixele ,,ales” pentru ordin şi ,,aceae” pentru familie (ex. genul reprezentativ Rickettsia, ordinul Rickettsiales, familia Rickettsiaceae). Încrengătura şi clasa – taxoni de rang superior – au denumiri constituite dintr-un nume generic şi diverse sufixe. La ora actuală, în taxonomia bacteriană se manifestă tendinţa de a se opera 118

BACTERIOLOGIE GENERAL|

din ce în ce mai puţin cu aceste categorii taxonomice, din cauza relativităţii şi ineficienţei lor. În unele cazuri, clasificările operează cu ordine, familii şi intermediari (subordine, subfamilii, triburi), iar alteori, se ignoră şi acestea, operându-se direct cu categoriile: gen, specie (uneori subspecie) şi variantă (tip).

2.3. MORFOLOGIA BACTERIILOR

SI

BIOLOGIA

2.3.1. MORFOLOGIA CELULEI VEGETATIVE Cunoaşterea caracteristicilor morfologice (formă, dimensiuni, mod de grupare, afinităţi tinctoriale, particularităţi morfologice) are o importanţă deosebită în cercetarea şi identificarea bacteriilor, deoarece acestea constituie criterii taxonomice de bază. 2.3.1.1. Forma si modul de grupare a bacteriilor Forma celulelor bacteriene este greu de apreciat în probele prelevate din mediile naturale, motiv pentru care morfologia bacteriilor se studiază pe celulele cultivate în condiţii artificiale, de laborator, pe medii de cultură adecvate. Forma bacteriilor este controlată genetic, dar este influenţată într-o mare măsură de factorii de mediu (temperatură, pH, compoziţia mediului de cultură, etc.) şi de vârsta culturii. Deoarece condiţiile de cultură se modifică în timp putând cauza apariţia unor forme aberante, morfologia bacteriilor se apreciază numai pe culturi tinere (proaspete).

119

BACTERIOLOGIE GENERAL|

După forma celulei, bacteriile pot fi grupate în patru categorii distincte: sferice, cilindrice, spiralate sau helicoidale şi pătrate (fig.3.).

Fig.3 Forme posibile la bacterii 1.coc sferic; 2.coc oval; 3.coc asimetric cu un pol ascuţit şI unul rotunjit; 4.coc asimetric reniform; 5.formă cocoidă; 6.cocobacil; 7.bacil fin; 8.bacil asimetric în formă de măciucă; 9.bacil cu capetele retezate; 10.bacil cu capetele rotunjite; 11.vibrion; 12.spirochetă cu spire mari; 13.spirochetă cu spire mici; 14. bacterii pătrate

La cele mai multe specii bacteriene, celulele – fiice rezultate în urma diviziunii se separă şi rămân independente datorită mişcării browniene, activităţii flagelilor în cazul bacteriilor mobile, curenţilor de convecţie din mediu etc. La unele specii însă, majoritatea celulelor-fiice nu se despart timp de una sau mai multe generaţii, formând constant grupări caracteristice cu valoare taxonomică. Modul de grupare a bacteriilor este determinat de raportul geometric dintre planurile succesive de diviziune şi de tendinţa celulelor-fiice de a rămâne unite.

120

BACTERIOLOGIE GENERAL|

• Bacteriile sferice In terminologia curentă aceste bacterii poartă denumirea de coci. Ele pot avea formă sferică, ovală, lanceolată sau reniformă, diametrele celulei fiind aproximativ egale. In funcţie de raporturile care se stabilesc între celulele-fiice după diviziune, cocii pot fi izolaţi sau grupaţi. Principalele moduri de grupare sunt (fig. 4):

Fig.4. Modalităţile de grupare a cocilor în funcţie de orientarea planurilor de diviziune celulară.(după Tortora J.G. şi col.,1997)

121

BACTERIOLOGIE GENERAL|

a) diplococul, care rezultă prin diviziunea celulelor în planuri succesive paralele, celulele fiice rămânând grupate câte două; b) streptococul, constituit din coci înlănţuiţi ca urmare a diviziunilor succesive în planuri paralele şi a persistenţei legăturilor între celulele-fiice pe parcursul mai multor generaţii; c) tetrada sau tetracocul - o grupare de patru celule rezultată din două diviziuni succesive în planuri perpendiculare; d) sarcina - o grupare de opt coci sub forma a două tetrade suprapuse, care rezultă în urma a trei diviziuni în planuri perpendiculare: al doilea pe primul şi al treilea pe primele două; e) stafilococul, la care planurile succesive de diviziune sunt dispuse în direcţii diferite, astfel încât celulele rezultate formează grămezi neregulate, asemănătoare ciorchinilor de struguri.

• Bacteriile cilindrice cunoscute sub denumirea comună de bacili, au formă de bastonaşe. Raportul dintre cele două axe variază însă foarte mult, încât, unii bacili au un aspect filamentos, uneori ramificat, iar alţii se apropie de forma sfericovală, fiind numiţi din acest motiv cocobacili. Bacilii pot fi drepţi sau uşor încurbaţi la mijloc sau la una din extremităţi, cu capetele tăiate drept ca la Bacillus anthracis, rotunjite ca la majoritatea speciilor, ascuţite ca la Fusobacterium fusiformis, sau dilatate în formă de pişcot sau de haltere - caracteristică a genului Corynebacterium. 122

BACTERIOLOGIE GENERAL|

Diviziunea bacililor are loc după un singur plan transversal pe axul longitudinal. După diviziune, bacilii pot rămâne izolaţi sau grupaţi câte doi (diplobacili), în lanţuri cu lungimi variabile (streptobacili), în palisadă (asemănător dinţilor unui pieptene), sau sub formă de idiograme chinezeşti (fig. 5) Filamentul este considerat de unii autori o formă iar de alţii, un mod de grupare. Se pare că ultimul punct de vedere este mai corect întrucât filamentul reprezintă în realitate un plasmodiu, multiplicarea citoplasmei şi a materialului nuclear nefiind urmată şi de constituirea pereţilor celulari şi a membranelor citoplasmatice separatoare între celule. Formele ramificate sunt o excepţie la bacterii. Ele reprezintă tot plasmodii şi sunt caracteristice actinomicetelor - grup de bacterii limitrofe, din punct de vedere morfologic şi al poziţiei taxonomice, ciupercilor.

• Bacteriile spiralate sau helicoidale In funcţie de numărul de spire şi flexibilitatea peretelui celular, există trei subtipuri morfologice de bacterii spiralate :

a) vibrionul, cu aspect de virgulă sau asemănător literei ,,S”; b) spirilul, cu mai multe spire şi un perete celular rigid, care îi conferă stabilitate morfologică şi dimensională.; c) spirocheta, alcătuită de asemenea din mai multe spire, dar care sunt flexibile (se pot strânge sau relaxa) datorită elasticităţii peretelui celular .

123

BACTERIOLOGIE GENERAL|

Fig.5. Modalităţile de grupare a bacililor: 1.diplobacil; 2.grupare în forma literei V; 3.streptobacil; 4.filament; 5.filament cu citoplasmă granulară; 6.formă ramificată; 7.grupare în palisadă; 8. grupare în ideograme chinezeşti.

•

Bacteriile pătrate au fost puse în evidenţă în probele

de apă hipersalină prelevate din bălţile Peninsulei Sinai. Ele formează adesea placarde de 4-16 celule rezultate din mai multe diviziuni succesive, la care se disting cu multă claritate planurile de diviziune. Forma pătrată a acestor bacterii şi faptul că sunt mult aplatizate (0,1 – 0,5 µm grosime) se explică prin lipsa presiunii interne a celulelor în mediu hiperosmotic, situaţie în care, teoretic,bacteriile pot lua orice formă. 124

BACTERIOLOGIE GENERAL|

2.3.1.2. Constantele fizice Dimensiunile bacteriilor variază în funcţie de specie, între 0,1 –15 micrometri (µm) lungime (bacteriile filamentoase ajunând până la 500 µm) şi 0,02 – 2 µm, diametru transversal. Din acest punct de vedere, bacteriile pot fi grupate în trei categorii: mici 0,3 – 1,5/0,1 –0,5 µm (ex. Brucella spp.); mijlocii 2 – 3/0,5 – 1 µm (ex.Escherichia spp.); mari 10 - 15/1 - 2 µm (ex. Bacillus spp., Clostridium spp. ). In general, există o corelaţie între lungimea şi diametrul transversal al celulelor bacteriene, fără ca aceasta să constituie o regulă. Astfel, germenii din genurile Bacillus şi Clostridium, care sunt cei mai lungi (cu excepţia celor filamentoşi), sunt în acelaşi timp şi cei mai groşi, pe când bacilul rujetului (Erysipelothrix rhusiopathiae), a cărui lungime poate ajunge la 3 – 4 µm, este foarte subţire (0,2 – 0,4µm, diametru transversal ). Volumul bacteriilor oscilează între 0,oo3 x 10-12 (ex. Mycoplasma spp. ) şi 7,068 x 10-12 (Bacillus megatherium ). Densitatea sau greutatea specifică a celulelor bacteriene este ceva mai mare decât a apei, situându-se între 1,07 şi 1,032. Valoarea acestui indice diferă în funcţie de compoziţia chimică a bacteriilor, care variază de la o specie la alta şi este influenţată de condiţiile de mediu şi de vârsta celulei. Astfel, celulele tinere, care sunt turgescente, au o densitate mai mică decât cele îmbătrânite, iar la bacteriile cultivate pe medii lichide, densitatea este mai mică decât la cele cultivate pe medii solide. Datorită densităţii apropiate de cea a apei, bacteriile plutesc în mediile lichide, din care pot fi separate prin centrifugare.

125

BACTERIOLOGIE GENERAL|

2.2.1.3. Structura celulei bacteriene Celula bacterină este constituită dintr-un înveliş şi un conţinut. Unele specii bacteriene sunt prevăzute în plus cu organite de mişcare (cilii sau flagelii) şi/sau cu organite de aderenţă ( pilii sau fimbriile). In figura numărul 6 este reprezentată schematic structura unei bacterii ipotetice, cu toate componentele menţionate.

Fig.6 Structura unei celule bacteriene tipice (după Măzăreanu C, 1999)

126

BACTERIOLOGIE GENERAL|

Învelişul Principalele componente ale învelişului celulei bacteriene sunt:

♦ membrana citoplasmatică, prezentă la toate bacteriile în contact intim cu citoplasma; ♦ peretele celular situat la exteriorul membranei, prezent la toate bacteriile cu excepţia micoplasmelor; ♦ capsula şi glicocalixul – structuri extraparietale prezente numai la un număr restrâns de specii bacteriene şi numai în anumite condiţii de mediu.

Membrana citoplasmatică Numită şi membrană plasmatică sau membrană celulară, această componentă esenţială a tuturor bacteriilor acoperă de jur împrejur citoplasma, separând-o de faţa internă a peretelui celular. Examinată la microscopul electronic, membrana citoplasmatică apare ca o formaţiune triplu stratificată, cu o grosime de 7,5 – 10 nanometri, constituită dintr-un strat subţire electronotransparent, delimitat de ambele părţi de câte un strat mai gros, electronoopac. Scheletul biochimic al membranei este constituit dintr-un strat dublu de fosfolipide amfipatice cu o orientare polară a regiunilor hidrofile, spre exterior şi respectiv spre interior şi a celor hidrofobe, faţă în faţă (fig.7). Acest strat bimolecular fosfolipidic conferă membranei rolul de barieră osmotică şi oferă un sediu numeroaselor proteine enzimatice care se deplasează spre exteriorul sau interiorul celulei. 127

BACTERIOLOGIE GENERAL|

Fig.7 Membrana citoplasmatică - reprezentare schematică a unui model tridimensional (după Lodish şi Rothman,1979; cit.de Zarnea G., 1983). Membrana citoplasmatică serveşte drept filtru selectiv, permiţând accesul substanţelor nutritive în celulă şi eliminarea cataboliţilor - procese reglate enzimatic de către sistemele de transport şi permeaze. Ea este implicată, de asemenea, în reglarea proceselor de diviziune celulară şi sporogeneză. Prin invaginarea şi plierea membranei spre interiorul celulei bacteriene iau naştere nişte formaţiuni numite mezozomi (fig.8), care se leagă de genomul bacterian şi care, în funcţie de configuraţia pliurilor, pot fi veziculari sau saciformi, lamelari şi tubulari.

128

BACTERIOLOGIE GENERAL|

Fig.8 Structura schematică a mezozomului bacterian (după Reusch şi Burger, 1973; cit.de Zarnea G.,1983).

Mezozomii sunt sediul unei intense activităţi enzimatice şi îndeplinesc următoarele funcţii biologice: ♦ suplinesc lizozomii şi mitocondriile – organite absente în celula de tip procariot; ♦ reglează replicarea genomului în procesul de diviziune celulară; ♦ participă la formarea septului transversal care separă celulele după diviziune; 129

BACTERIOLOGIE GENERAL|

♦ reprezintă zonele specializate pentru pătrunderea în celulă a fragmentelor de ADN în cursul procesului de transformare genetică.

Peretele celular Este situat la exteriorul membranei citoplasmatice fiind mai gros decât aceasta (15 – 30 nanometri), rigid şi poros. Structura morfochimică a peretelui celular este determinantă pentru grosimea, gradul de rigiditate şi afinitatea sa faţă de anumite substanţe colorante (afinitate tinctorială). In funcţie de modul în care se colorează prin metoda Gram, bacteriile se împart în Gram pozitive (colorate în violet) şi Gram negative (colorate în roşu), iar prin metoda Ziehl – Neelsen, în acidorezistente şi neacidorezistente. La bacteriile Gram pozitive peretele este gros şi rigid, iar la cele Gram negative este mai subţire şi mai elastic. Pe baza prezenţei, respectiv a absenţei peretelui celular şi a însuşirilor sale mai sus menţionate, G i b b s o n şi M u r r a y au propus clasificarea regnului Procaryotae în trei subdiviziuni: Mollicutes – bacteriile fără perete (micoplasmele), Firmicutes – bacteriile Gram pozitive cu peretele gros şi rigid, Gracilicutes – bacteriile Gram negative cu peretele mai subţire şi mai elastic. Peretele celular este format dintr-un strat bazal care aderă la membrana citoplasmatică, similar ca şi compoziţie chimică la toate bacteriile şi un strat superficial cu o structură diferită la cele trei categorii tinctoriale (Gram pozitive, Gram negative, acidorezistente), numit stratul structurilor speciale. Stratul bazal este un polimer glicopeptidic numit peptidoglican sau mureină (lat. murus = zid). El este format din macromolecule lungi de zaharide (N-acetilglucozamină şi acid Nacetilmuramic) dispuse paralel şi legate între ele prin punţi polipeptidice, realizând astfel o reţea care încorsetează celula şi îi conferă rezistenţă mecanică (fig. 9). 130

BACTERIOLOGIE GENERAL|

Fig.9 Model de structură moleculară a peptidoglicanului (după Tripper şi Wright,1977; cit. Zarnea,1983): G = N-acetilglucozamină; M = acid N-acetilmuramic; Y = punţi polipeptidice;

La bacteriile Gram pozitive, stratul structurilor speciale conţine polizaharide şi proteine iar la numeroase specii, acizi teichoici, lipoteichoici şi teichuronici (reprezentaţi în fig.9, sub forma unor tuburi flexibile), care conferă peretelui rigiditate. Peretele bacteriilor Gram negative, deşi mai subţire, are o structură mai complexă. Stratul bazal este format dintr-un complex peptidoglican-lipoproteină, iar stratul structurilor speciale este constituit dintr-o membrană externă în care predomină 131

BACTERIOLOGIE GENERAL|

liopopolizaharidele (LPS). Componenta lipidică a membranei externe diferă foarte puţin de la o specie bacteriană la alta, în timp ce componenta poliglucidică are specificitate chimică şi antigenică (antigenul somatic ,,O”), pemiţând identificarea serologică şi serotipizarea mai multor specii bacteriene (Escherichia coli, Salmonella spp, Pasteurella multocida, etc.). Poliglucidul ,,O” îndeplineşte şi rolul de receptor pentru bacteriofagi, iar în ansamblul său, complexul LPS are funcţia de endotoxină.

Fig.10 a. Structura peretelui bacterian la bacteriile Gram pozitive (după Hart T. şi Shears P., 1997)

132

BACTERIOLOGIE GENERAL|

Intre peretele celular şi membrana citoplasmatică a bacteriilor Gram negative se găseşte un spaţiu periplasmatic, care conţine proteine de legare cu rol în chimiotaxie şi numeroase enzime (fosfatază alcalină, enzime hidrolitice, deoxiribonucleaze, etc.) cu rol în pregătirea substanţele care au traversat peretele, pentru trecerea lor prin membrana citoplasmatică. Stratul structurilor speciale este mai bine reprezentat cantitativ la speciile Gram negative, în comparaţie cu cel bazal, raport inversat la speciile Gram pozitive (fig. 10 a, b). La bacteriile acidorezistente, structurile speciale sunt foarte bogate în complexe formate din acid micolic şi ceruri, fapt care explică rezistenţa acestora la decolorarea cu acizi (coloraţia Ziehl – Neelsen). Peretele celular are o semnificaţie biologică multiplă: ♦ prin rigiditatea sa, asigură menţinerea formei celulelor bacteriene; ♦ îndeplineşte rol protector faţă de factorii nocivi de mediu, în special faţă de şocul osmotic, având în vedere că mediile de viaţă ale bacteriilor sunt hipotonice în raport cu conţinutul celulei bacteriene; ♦ prin porii săi, mediază schimbul de substanţe între mediu şi celulă; ♦ participă la procesul de creştere şi diviziune celulară, urmând membrana citoplasmatică în formarea septurilor transversale care separă celula-mamă în cele două celulefiice; ♦ conţine receptori pentru bacteriofagi şi bacteriocine; ♦ conţine enzime autolitice care se activează în momentul sporulării eliberând sporul prin liza sporangiului şi în momentul germinării, determinând liza învelişurilor sporale.

133

BACTERIOLOGIE GENERAL|

Orice factor care alterează sau inhibă sinteza peptidoglicanului (fermenţi litici, antibiotice, carenţe nutritive , etc.) determină, atât ,,in vitro” cât şi ,,in vivo”, apariţia unor bacterii cu morfologie modificată, cunoscute sub denumirile de protoplaşti şi sferoplaşti. Iniţial, aceste forme au fost descrise de către Klieneberger – Nobel în 1935 sub denumirea de forme ,,L”, după numele Institutului Lister din Londra.

Fig.10.b. Structura peretelui bacterian la bacteriile Gram negative (după Hart T. şi Shears P., 1997) 134

BACTERIOLOGIE GENERAL|

Protoplaştii sunt celule bacteriene lipsite de perete celular, obţinute prin tratarea bacteriilor Gram pozitive cu lizozim sau penicilină. Ei au o formă sferică, indiferent de forma iniţială a bacteriei din care provin şi sunt foarte sensibili la şocul osmotic. Deoarece funcţia de barieră osmotică a membranei citoplasmatice este mult mai labilă în lipsa protecţiei conferite de peretele celular rigid, în mediile hipotonice protoplastul se lizează. Sferoplaştii rezultă din bacteriile Gram negative sub influenţa aceloraşi factori. Ei păstrează însă porţiuni din peretele celular, deoarece factorii litici amintiţi (lizozimul, penicilina) sunt inactivi faţă de compuşii lipidici ai peretelui celular. In consecinţă, aceste bacterii cu perete defectiv iau forme diferite: filamentoase, piriforme, cu aspect de înmugurire, etc. Spre deosebire de protoplaşti, sferoplaştii sunt mai rezistenţi la factorii de mediu, având capacitatea de a-şi resintetiza peretele celular în medii de cultură optime, lipsite de factorul care a indus defecţiunea.

Capsula Este o formaţiune extraparietală, prezentă numai la unele specii bacteriene şi numai în anumite condiţii de mediu. Speciile patogene capsulează de regulă în organism sau în cazul prezenţei în mediul de cultură a unui lichid organic (ser sanguin, plasmă, lichid ascitic, etc.) Bacteriile capsulogene care interesează patologia veterinară sunt: Bacillus anthracis, Streptococcus pneumoniae, Klebsiella pneumoniae , Clostridium perfringens, Pasteurella multocida. Capsulele acestor specii se deosebesc prin gradul de aderenţă la peretele celular, grosime, consistenţă şi structură chimică. Pe baza aderenţei la peretele celular, a grosimii şi consistenţei, se pot distinge patru tipuri de capsulă (fig.11): 135

BACTERIOLOGIE GENERAL|

♦ microcapsula, sub forma unui strat fin şi aderent, nedetectabilă prin metodele microscopice uzuale, caracteristică pentru Pasteurella multocida ; ♦ capsula propriu-zisă, cu o grosime aproximativ egală cu cea a celulei bacteriene, consistentă şi evidenţiabilă prin metode speciale de colorare, întâlnită la Bacillus anthracis şi Streptococcus pneumoniae; ♦ substanţa mucoasă capsulară moale, sub forma unei mase amorfe care uneori nu mai păstrează raporturi anatomice cu celula bacteriană ; ♦ zooglea , constând într-o masă mucilaginoasă neorganizată care înglobează mai multe celule bacteriene, întâlnită la unele specii saprofite.

Fig.11

Tipurile

de

structuri

capsulare

la

bacterii:

1.microcapsula; 2.capsula propriu-zisă; 3.strat mucos; 4.zooglee.P.C. perete celular; M.C. – microcapsulă; mc – membrană citoplasmatică.

Din punct de vedere chimic, capsula este formată din 98% apă, restul fiind reprezentat de polizaharide sau polipeptide, în funcţie de specie. 136

BACTERIOLOGIE GENERAL|

Capsulogeneza este un proces cu determinism genetic, supus variaţiilor fenotipice şi genotipice. Variaţiile fenotipice se produc sub influenţa factorilor de mediu, în principal factori nutritivi. De regulă, organismul animal reprezintă un mediu favorabil capsulogenezei, spre deosebire de mediile de cultură abiotice uzuale, care devin favorabile numai prin adăugarea unor substanţe proprii organismului (ser, plasmă, lichid ascitic, etc.). Variaţiile genotipice sunt rezultatul mutaţiilor. Selectarea în condiţii experimentale a mutantelor acapsulogene s-a dovedit a fi utilă în practica preparării vaccinurilor, deoarece tulpinile acapsulogene sunt nepatogene (ex. tulpina de Bacillus anthracis 1190 R, acapsulogenă, apatogenă, edematogenă şi imunogenă). Funcţia biologică a capsulei este de a proteja celula bacteriană faţă de acţiunea unor factori nocivi. In cazul speciilor patogene, capsula are un rol important în evitarea procesului de fagocitoză, constituind un important factor de agresivitate. Inafara organismului, prin conţinutul crescut de apă, capsula protejează bacteriile de efectele desicaţiei.

Glicocalixul Este o structură mai simplă decât capsula, constituită dintr-o reţea de fibre de natură poliglucidică cu aspect de pâslă. El este prezent numai la unele bacterii şi numai în condiţii naturale de mediu, fiind absent ,,in vitro”. Pentru bacteriile patogene, glicocalixul constituie un factor de colonizare a diverselor epitelii, având rol în menţinerea unor infecţii urinare şi intestinale. Pe lângă aderenţă, această formaţiune conferă bacteriilor rezistenţă faţă de bacteriofagi şi bacteriile prădătoare.

137

BACTERIOLOGIE GENERAL|

Conţinutul Conţinutul celulei bacteriene se compune din citoplasmă şi genom bacterian.

Citoplasma Citoplasma celulei bacteriene are consistenţă de gel, nu prezintă curenţi citoplasmatici şi în consecinţă, nici deplasări evidente ale elementelor componente. La celulele tinere şi în condiţii normale de dezvoltare, citoplasma aderă la membrană şi se prezintă ca o masă densă, omogenă şi intens colorabilă. La celulele îmbătrânite, citoplasma îşi pierde treptat afinitatea tinctorială, se retractează centripet şi capătă o structură granulară cu numeroase vacuole . Citoplasma reprezintă sediul materialului genetic şi al unor structuri cu caracter de granule, incluzii şi vacuole. Spre deosebire de celulele eucariote, in citoplasma celulelor bacteriene lipsesc mitocondriile, aparatul Golgi şi reticulul endoplasmatic propriu-zis. Ribozomii sau granulele lui Palade reprezintă elementele de bază ale citoplasmei, în care apar ca mici granule relativ sferice, cu un diametru de 10-20 nanometri, numărul lor fiind de ordinul zecilor de mii. Din punct de vedere chimic, ribozomii sunt alcătuiţi din acid ribonucleic (65%) şi proteine (30-35%). Sub raport funcţional, ribozomii constituie sediul sintezei proteinelor structurale şi enzimatice, pe baza informaţiei genetice preluate de la ADN prin intermediul ARN-ului mesager. In faza de creştere activă a celulei bacteriene se formează conglomerate de ribozomi, numite polizomi sau poliribozomi, elementul de legătură reprezentându-l filamentele fine de ARN – mesager. 138

BACTERIOLOGIE GENERAL|

Activitatea ribozomilor bacterieni poate fi inhibată de unele antibiotice cum sunt streptomicina, neomicina şi tetraciclinele. La organismele eucariote, ribozomii sunt insensibili faţă de antibiotice, fapt care permite utilizarea acestora în terapia bolilor infecţioase, fără afectarea organismului. Incluziile sunt structuri inerte, prezente inconstant în citoplasma bacteriilor. Ele reprezintă materiale de rezervă care se acumulează în celulă direct proporţional cu vârsta şi conţinutul mediului în substanţe nutritive. Din punct de vedere chimic, incluziile sunt formate din polimeri organici (amidon, glicogen, acid poli-β-hidroxibutiric), cristale de substanţe anorganice (sulf, carbonat de calciu) şi polimeri anorganici. Din ultima categorie de substanţe, la numeroase specii bacteriene sunt prezente incluziile de polimetafosfat, cunoscute sub denumirile de corpusculi Babeş-Ernst sau granule de volutină (din cauza prezenţei lor în număr mare la specia Spirillum volutans). Ele apar la microscop sub forma unor granulaţii metacromatice, deoarece se colorează mai intens decât restul citoplasmei (fig.12).

Fig.12 .Granulaţii metacromatice evidenţiate la microscopul fotonic (în cerc)şi electronic. (după Winkler cit. de Zarnea G.,1963). 139

BACTERIOLOGIE GENERAL|

Cromatoforii, prezenţi la bacteriile fotosintetizante, sunt organite specializate în procesele de biosinteză prin mecanisme analoage fotosintezei plantelor. Vacuolele sunt variabile ca mărime (0,3 – 0,5 µm) şi număr (6-20/celulă), fiind mai frecvent întâlnite la celulele tinere. Ele pot conţine lichide cu rol în reglarea presiunii osmotice, sau gaze. Vacuolele cu gaze sunt prezente în citoplasma unor bacterii din sol, capabile să capteze azotul atmosferic şi la bacteriile acvatice aerobe pe care le antrenează la suprafaţa apei, asigurându-le contactul cu oxigenul atmosferic. In citoplasma celulelor bacteriene se găseşte cea mai importantă parte din echipamentul enzimatic răspunzător de metabolismul celulei, precum şi diferite tipuri de ARN (mesager, ribozomal şi solubil). Pigmenţii sunt substanţe colorate prezente în citoplasma bacteriilor cromogene. Speciile patogene pentru om şi animale, producătoare de pigmenţi sunt: Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Rhodococcus equi, Mycobacterium tuberculosis. în funcţie de structura chimică pigmenţii bacterieni se împart în: • pigmenţi fenazinici, cum sunt fluoresceina de culoare galbenă şi piocianina de culoare albastră-verde, prezente la mai multe specii din genul Pseudomonas; • pigmenţi carotenoizi, de culoare roşie, galbenă sau portocalie, cum sunt lutexina, xantina, licopenul, sintetizaţi în principal de către stafilococi; • pigmenţi melanici, de culoare brună, frecvenţi la bacteriile fixatoare de azot din genul Azotobacter; • pigmenţi antocianici, elaboraţi mai ales de actinomicete, printre care şi unele specii producătoare de antibiotice din genul Streptomyces;

140

BACTERIOLOGIE GENERAL|

•

derivaţi pirolinici de tipul clorofilelor, prezenţi la bacteriile fotosintetizante. După localizarea pigmenţilor în celulă şi posibilităţile de difuzare în mediu, bacteriile cromogene se clasifică în: • bacterii cromofore, a căror pigmenţi rămân cantonaţi la locul sintezei; • bacterii paracromofore, care au pigmenţii localizaţi în peretele celular; • bacterii cromopare, ai căror pigmenţi sunt eliminaţi în mediu, colorându-l. Semnificaţia biologică a pigmenţilor bacterieni diferă în funcţie de natura chimică a pigmentului şi de specia pigmentogenă, fără a fi complet elucidată. Rolul clorofilelor în fotosinteză este bine stabilit, însă asupra funcţiei celorlalţi pigmenţi, părerile emise au valoare ipotetică. Astfel, pigmenţii carotenoizi se pare că protejează bacteriile de acţiunea radiaţiilor ultraviolete, iar piocianina şi unii pigmenţi elaboraţi de actinomicete se comportă ca antibiotice, intervenind în fenomenele de antagonism microbian. Unii pigmenţi, cum sunt flavoproteina produsă de Lactobacillus delbrueckii şi ftiocolul produs de Mycobacterium phlei, sunt din punct de vedere biologic, vitamine. în practica identificării bacteriilor, prezenţa pigmenţilor este un criteriu taxonomic valoros şi uşor decelabil. Citoplasma constituie sediul metabolismului bacterian unde se desfăşoară procesele de asimilaţie şi dezasimilaţie, precum şi alte funcţii vitale ale celulei bacteriene cum sunt reproducerea şi sporogeneza.

Materialul genetic 141

BACTERIOLOGIE GENERAL|

Materialul genetic al bacteriilor este constituit din material genetic nuclear şi din plasmide . Materialul genetic nuclear este format dintr-un singur cromozom şi nu este delimitat de o membrană proprie. Pentru a marca aceste diferenţe faţă de nucleul celulelor eucariote, termenul de ,,nucleu” a fost înlocuit cu termenii de ,,nucleoid”, ,,genom bacterian”, ,,cromozom bacterian” sau ,,nucleozom”. Cromozomul este constituit dintr-o moleculă de ADN bicatenar, pliat prin răsucire şi suprarăsucire de aproximativ 100 de ori, având o formă asemănătoare cu a celulei bacteriene - sferică în cazul cocilor şi alungită în cazul bacililor. El ocupă 5-16% din volumul celulei. Plasmidele sunt molecule mici de ADN dublu catenar, independente de cromozom, caracteristice pentru celula procariotă. Pentru desemnarea lor se utilizează deseori termenii de material genetic auxiliar sau extracromozomal. Plasmidele reprezintă aproximativ 1% din mărimea şi masa moleculară a cromozomului şi sunt, în majoritatea lor, transferabile de la o celulă bacteriană la alta în cadrul fenomenului de conjugare. Atât cromozomul cât şi plasmidele au posibilitatea de autoreplicare. Replicarea plasmidelor are loc independent de cea a cromozomului. Funcţia biologică a materialului genetic constă în determinarea caracterelor care definesc fiecare specie bacteriană şi transmiterea lor ereditară. Având în vedere posibilitatea de transfer a plasmidelor, se poate aprecia că ele au un rol major în procesul de circulaţie a informaţiei genetice în cadrul populaţiilor bacteriene, care are ca rezultat o mai bună adaptare a acestora la condiţiile de mediu.

Organitele celulare 142

BACTERIOLOGIE GENERAL|

Organitele celulare (cilii sau flagelii şi pilii sau fimbriile) sunt formaţiuni extraparietale, prezente numai la unele specii bacteriene, cu rol în procesele de adaptare la mediu.

Cilii (flagelii ) Sunt organite de formă cilindrică, cu diametrul de 12-25 nanometri şi lungimea de 25-30 micrometri, întâlnite mai ales la bacteriile alungite – bacili, vibrioni, spirili – şi mai rar la formele cocoide. Au rol în mişcare, bacteriile ciliate fiind mobile. Intre speciile bacteriene ciliate există diferenţe sub aspectul numărului şi al modului de dispunere a cililor pe suprafaţa celulei bacteriene, distingându-se următoarele categorii de bacterii: atricha (neciliate), monotricha (un singur cil dispus polar), amfitricha (câte un cil la ambii poli), lofotricha (un smoc de cili la unul din poli) şi peritricha (numeroşi cili amplasaţi pe toată suprafaţa celulei) – fig.

13 Fig. 13 Numărul şi modalităţile de dispunere a cililor pe

143

BACTERIOLOGIE GENERAL| suprafaţa celulei bacteriene: 1. atricha; 2. monotricha;3. lofotricha; 4.

lofotricha; 5. peritricha.;

Părţile componente ale unui cil sunt: corpusculul bazal, articulaţia sau cârligul şi filamentul helicoidal extracelular (fig. 14). Corpusculul bazal reprezintă componenta cilului prin care acesta se ataşează de celula bacteriană. La bacteriile Gram pozitive el este compus din 2 discuri : ♦ discul M (de membrană), numit şi rotor, dispus în grosimea membranei citoplasmatice, care se roteşte liber în spaţiul membranar şi, ♦ discul S , sau stator, cu o poziţie supramembranară.

144

BACTERIOLOGIE GENERAL| Fig.14 Ultrastructura cililor la bacteriile Gram negative (a) şi modul de ancorare a acestora în peretele celular

(b)- după Larpent şi col., 1990.

La bacteriile Gram negative, structura se complică prin apariţia unor discuri suplimentare – discul P, inclus în stratul peptidoglicanic şi discul L, situat în membrana externă - care au rolul de a asigura ancorarea întregii structuri într-un perete celular mai complex. Cele patru discuri sunt interconectate printr-un ax de transmisie. Articulaţia sau cârligul este o zonă flexibilă care se interpune între axul de transmisie şi filament. Filamentul extracelular sau cilul propriu-zis reprezintă partea flexibilă, în general spiralată a cilului. Din punct de vedere chimic, cilii sunt constituiţi din flagelină, o proteină antigenică (antigenul ,,H’’) cu masa moleculară de 40000 daltoni. Cu ajutorul cililor, bacteriile se pot deplasa cu viteza de 20-80 micrometri pe secundă, echivalând cu de 40 de ori lungimea celulei bacteriene. Pentru comparaţie, menţionăm faptul că ghepardul, considerat cel mai rapid dintre animale, aleargă cu o viteză care nu depăşeşte de trei ori lungimea corpului pe secundă . Bacteriile realizează o mişcare de rostogolire când cilii se rotesc în sensul acelor de ceasornic şi o deplasare în linie dreaptă când aceştia se rotesc în sens antiorar. In determinarea direcţiei de deplasare intervin mecanismele de tip chimiotactic. Substanţele utile metabolismului bacterian (glucidele, aminoacizii, ionii de calciu şi de magneziu, oxigenul pentru bacteriile aerobe,etc.) sunt 145

BACTERIOLOGIE GENERAL|

atractante, exercitând un chimiotactism pozitiv asupra bacteriilor ciliate, iar cele nocive (alcoolii, ionii de hidrogen, ionii hidroxil, metalele grele, etc.) au un efect repelant (de respingere), printr-un chimiotactism negativ. Analog capsulogenezei, sinteza cililor este dirijată de factori genetici a căror represare şi depresare este realizată de factorii mediului ambiant. Factorii de mediu capabili să inducă variaţii fenotipice în geneza şi motilitatea cililor sunt temperatura şi diverse substanţe chimice. Astfel, Yersinia enterocolitica şi Listeria monocytogenes sunt mobile numai la 20-22 ºC (nu şi la 37ºC), serurile hiperimune specifice inhibă mobilitatea salmonelelor şi a altor specii ciliate, iar acidul boric şi sulfatiazolul inhibă mobilitatea speciei Proteus vulgaris. Variaţiile genotipice se traduc prin obţinerea de mutante aciliate. Deşi mobilitatea bacteriilor este corelată, în general, cu prezenţa cililor, există şi bacterii mobile neciliate. Este cazul myxobacteriilor, care se deplasează prin glisare şi a spirochetelor, care, cu ajutorul unor filamente axiale intracitoplasmatice (endoflageli), execută mişcări de rotaţie în jurul axului longitudinal, mişcări de translaţie şi mişcări de flexie şi extensie, ca efect al contracţiei acestor structuri (Laprent J. P. şi col., 1990).

Pilii (fimbriile) Pilii sunt apendici filamentoşi mult mai subţiri şi mai scurţi decât cilii dar mult mai numeroşi, aşezaţi peritrich pe suprafaţa bacteriilor şi vizibili numai la microscopul electronic. Denumirile prin care sunt desemnate aceste structuri sugerează caracteristicile lor morfologice: fimbrii (lat. fimbria = franjuri), pili (lat. pilus = păr). 146

BACTERIOLOGIE GENERAL|

Spre deosebire de cili, pilii nu posedă un aparat corespunzător corpusculului bazal. In funcţie de unele caractere morfologice, de număr şi de funcţia biologică pe care o îndeplinesc, se deosebesc 6 tipuri de pili, notate cu cifre romane de la I la V şi cu litera F (pilul sexual sau donor). In ultimii ani există tendinţa de a departaja, din punct de vedere semantic, cei doi termeni - ,,fimbrii” şi ,,pili” - în sensul utilizării primului pentru desemnarea tipurilor I-V şi a celui de-al doilea, numai pentru pilii de sex. Fimbriile sunt formaţiuni tubulare compacte, fără canal axial, cu dimensiuni cuprinse între 1-20 µm lungime şi 3-14 nm diametru. Ele sunt dispuse pericelular, uneori polar sau bipolar, numărul lor variind între 1 şi 1000 per celulă. Sinteza fimbriilor este controlată de gene cromozomale iar creşterea lor se face prin depunere de fimbrilină - o proteină cu masa moleculară de 16600 daltoni– la extremitatea liberă a filamentului. Fimbriile conferă bacteriilor capacitatea de a adera la suprafaţa epiteliilor şi a altor substraturi, fiind considerate factori de patogenitate. Pilii de tip F, denumiţi şi pili sexuali, sunt structuri tubulare străbătute de canal axial, în structura cărora intră o fosfoglicoproteină (pilina), ale cărei molecule sunt ansamblate după o simetrie helicoidală. Ei sunt codificaţi de o plasmidă sau un epizom numit factorul ,,F” (de fertilitate sau de sex), care conferă celulei purtătoare proprietatea de donor de material genetic sau celulă - mascul F+.

147

BACTERIOLOGIE GENERAL|

Rolul pililor ,,F” este analog organului copulator, deoarece prin lumenul lor are loc transferul de ADN de la o celulă bacteriană F+ la una F- în cadrul procesului de conjugare - o formă primitivă de sexualitate, singura posibilă la bacterii. Pilii de tip F sunt evidenţiabili la unele bacterii cu ajutorul bacteriofagilor care prezintă specificitate pentru pilii de sex, numiţi fagi masculi. 2.3.2. FIZIOLOGIA BACTERIILOR

2.3.2.1. bacteriene

Compoziţia

chimică

a

celulei

Compoziţia chimică elementară a bacteriilor, sub aspectul conţinutului în elemente biogene, nu diferă de a celorlalte organisme vii. Compoziţia moleculară se diferenţiază însă de cea a organismelor vegetale şi animale prin prezenţa unor constituenţi moleculari specifici bacteriilor. O celulă bacteriană conţine aproximativ 3000-6000 tipuri de molecule diferite, dintre care aproximativ jumătate aparţin compuşilor anorganici cu masă moleculară mică (apa şi sărurile minerale), iar cealaltă jumătate, compuşilor organici cu diverse grade de complexitate structurală.

2.3.2.1.1. Compuşii anorganici Apa reprezintă aproximativ 75-80 % din greutatea umedă a celulei bacteriene, în care se găseşte sub formă liberă sau legată inseparabil de alte structuri chimice. 148

BACTERIOLOGIE GENERAL|

Ea constituie mediul care asigură vehicularea substanţelor nutritive şi a metaboliţilor, precum şi desfăşurarea reacţiilor chimice care stau la baza proceselor vitale. Sărurile minerale reprezintă 2 – 30% din greutatea bacteriilor uscate. Elementele care intră în compoziţia lor sunt: P, K, Na, Cl, S, O, H, Fe şi în proporţii mai reduse, Mg, Cu, şi Zn. Sărurile biologice:

minerale

îndeplinesc

următoarele

funcţii

• asigură reglarea presiunii osmotice la nivelul membranei citoplasmatice; • realizează sistemul tampon adecvat menţinerii pH-ului optim al mediului celular; • activează unele sisteme enzimatice, rol pe care îl îndeplinesc mai ales ionii de Cu şi de Mg; • intră în structura unui important număr de constituienţi celulari (rol plastic).

2.3.2.1.2. Compuşii organici Glucidele totalizează 4 – 25% din greutatea celulelor bacteriene uscate, proporţia lor variind în funcţie de specia bacteriană, vârsta culturii şi compoziţia chimică a substratului nutritiv. Ele sunt reprezentate de aproximativ 200 tipuri de molecule, incluzând mono-, di-, tri- şi polizaharide. Spre deosebire de celula vegetală, în structura bacteriilor nu intră celuloza. Semnificaţia biologică a glucidelor este diferită: glucidele simple iau parte la metabolismul intermediar al celulei, iar polizaharidele îndeplinesc, după caz, rol plastic, energetic sau de material de rezervă. Lipidele, prezente în celula bacteriană în proporţie de 1 – 20 % din greutatea uscată a bacteriilor, pot fi din punct de vedere 149

BACTERIOLOGIE GENERAL|

chimic, gliceride, fosfatide, steride şi ceruri. O lipidă frecvent întâlnită sub formă de incluzii citoplasmatice este poli-βhidroxibutiratul. Fosfatidele şi cerurile sunt prezente cu precădere la bacteriile acido-alcalo-alcoolo-rezistente din genul Mycobacterium, iar conţinutul în steroli constituie o particularitate a micoplasmelor. Alături de glucide, lipidele constituie rezervele nutritive ale celulei bacteriene cu un potenţial energetic crescut. Acizii nucleici. Spre deosebire de virusuri, care conţin un singur tip de acid nucleic, în celula bacteriană sunt prezenţi ambii acizi nucleici. Acidul dezoxiribonucleic (ADN) reprezintă aproximativ 1/5 din conţinutul celulei, fiind constituientul nucleoidului, respectiv al cromozomului bacterian şi al plasmidelor (fragmente de material genetic extracromozomal). Acidul ribonucleic (ARN), se găseşte în citoplasmă sub cele trei forme diferite sub aspectul mărimii moleculei şi al funcţiei biologice pe care o îndeplinesc în mecanismul sintezei proteinelor: ARN mesager, ARN de transport sau solubil şi ARN ribozomal. ARN-ul total constituie 10 – 20 % din greutatea uscată a celulei. Rolul biologic al acizilor nucleici este acelaşi la toate organismele vii. El a fost menţionat la structura celulei bacteriene şi urmează a fi detaliat în capitolul de genetică microbiană. Proteinele reprezintă aproximativ 60% din greutatea uscată a bacteriilor şi constituie componentele esenţiale pentru viaţa celulei bacteriene. Ele se găsesc atât în stare pură cât şi sub formă de complexe lipo- sau glicoproteice.

150

BACTERIOLOGIE GENERAL|

Din punct de vedere al rolului pe care îl îndeplinesc, proteinele bacteriene pot fi grupate în : • proteine constitutive, care fac parte din structura diferitelor componente celulare, şi • proteine enzimatice, care constituie biocatalizatorii întregii activităţi metabolice a celulei bacteriene. Rolul lor esenţial în viaţa celulei justifică tratarea lor în continuare mai pe larg. Enzimele constituie, în ansamblul lor, aparatul sau echipamentul enzimatic al celulei bacteriene. El este caracteristic pentru fiecare specie bacteriană şi reprezintă, prin urmare, un important criteriu taxonomic. Punerea în evidenţă a enzimelor bacteriene prin reacţii sau teste biochimice face parte din conduita curentă a identificării bacteriilor. Enzimele bacteriene prezintă caracterele generale ale tuturor enzimelor şi anume: • sunt eficiente în cantităţi extrem de mici; • se regăsesc nemodificate la sfârşitul reacţiei; • au o mare specificitate de substrat. Proteinele enzimatice pot fi simple sau conjugate. în al doilea caz, enzima activă (holoenzima) este formată din două componente, inactive când se găsesc separat: apoenzima (proteina care determină specificitatea reacţiei) şi coenzima (ioni metalici, substanţe organice, vitamine, etc.) – fig.15.

151

BACTERIOLOGIE GENERAL|

Fig. 15 Structura unei holoenzime. Coenzimele ajută enzimele să accepte atomii proveniţi de la substrat sau să cedeze atomii necesari substratului. Două dintre cele mai importante coenzime implicate în metabolismul bacterian sunt NAD (nicotinamidă-adenină-dinucleotid) şi NADP (nicotinamidă-adenină-dinucleotid-fosfat). Reacţiile mediate enzimatic parcurg următoarele etape : 1. suprafaţa substratului intră în contact cu o regiune specifică a enzimei numită situs activ; 2. se formează un complex temporar substrat-enzimă; 3. moleculele substratului sunt transformate prin rearanjarea atomilor, desfacerea structurii moleculare sau combinarea cu o altă moleculă substrat; 4. moleculele substratului transformat, respectiv produşii de reacţie, se separă de molecula enzimatică; 5. enzima astfel eliberată poate reacţiona din nou cu o moleculă de substrat. 152

BACTERIOLOGIE GENERAL|

Activitatea enzimelor este influenţată de factorii de mediu (temperatură, pH), concentraţia substratului, prezenţa sau absenţa inhibitorilor enzimatici. Inhibitorii enzimatici pot fi necompetitivi (sărurile metalelor grele, cianurile, acidul tanic, acidul tricloracetic, etc.) şi competitivi. Aceştia din urmă, numiţi antimetaboliţi, sunt substanţe cu structuri spaţiale identice cu acelea ale substratului specific enzimei. Datorită acestui fapt, ei sunt capabili să intre în competiţie cu substratul, fixându-se pe situsul activ al enzimei pe care îl blochează ireversibil. în consecinţă, substratul rămâne nemodificat iar bacteriile se găsesc în imposibilitatea de a-l utiliza pentru sinteza propriilor constituienţi. Fenomenul are o mare importanţă în practica medicală, stând la baza utilizării unor medicamente cu acţiune bacteriostatică cum sunt sulfamidele, antibioticele, etc. Enzimele bacteriene pot fi clasificate după mai multe criterii şi anume: După locul de acţiune în raport cu celula, se împart în: ♦ exoenzime, sintetizate în celulă şi eliminate în exterior, unde descompun substanţele cu moleculă complexă în molecule mai mici, accesibile celulei bacteriene; ♦ endoenzime nedifuzabile în mediu, care pot fi decelate în filtratele culturilor lizate. Acestea sunt, în majoritatea cazurilor, enzime de sinteză cu rol în procesele anabolice. După permanenţa sintezei lor în cursul vieţii bacteriilor, enzimele se împart în: ♦ enzime constitutive, elaborate permanent de bacterie indiferent de substratul pe care se dezvoltă; ♦

enzime adaptative (inductibile), sintetizate numai în prezenţa unui anumit substrat. Substratul exercită o acţiune de depresare a genelor

153

BACTERIOLOGIE GENERAL|

♦

responsabile de sinteza enzimei adaptative. Apariţia enzimei adaptative constituie un fenomen de variaţie fenotipică. enzime inductive (mutative) inexistente în mod obişnuit la o anumită specie bacteriană. Ele apar consecutiv unei mutaţii, iar sinteza lor are loc numai la mutanta respectivă.

2.3.2.2. Nutriţia la bacterii Microorganismele, ca şi celelalte organisme vii, sunt caracterizate printr-o activitate fiziologică neîntreruptă, mai mult sau mai puţin intensă, în cursul căreia cresc, se divid, îşi modifică structura, compoziţia chimică şi poziţia în mediu, etc. Exercitarea acestor activităţi presupune prezenţa în mediile lor de viaţă a unor substanţe nutritive utilizabile în sinteza constituienţilor celulari (surse plastice) şi a unor surse de energie. Se înţelege prin nutriţie bacteriană, modalităţile prin care bacteriile utilizează aceste surse pentru creştere şi multiplicare (Ivanof A. şi col., 1982).

2.3.2.2.1. Exigenţe şi tipuri nutritive la bacterii Considerate în ansamblu, microorganismele sunt cele mai omnivore organisme deoarece îşi realizează metabolismul folosind cele mai diverse surse de substanţe nutritive: de la N molecular, CO 2 şi S, până la substanţele organice complexe. Necesităţile nutritive ale bacteriilor s-au putut stabili prin utilizarea mediilor sintetice. S-au conturat astfel tipuri principale de 154

BACTERIOLOGIE GENERAL|

nutriţie pe baza a două criterii importante: sursa de energie şi sursa de carbon necesar constituirii materialului celular. In raport cu sursa de energia pe care o utilizează, bacteriile se încadrează în două tipuri principale : ♦ tipul fototrof, care utilizează energia luminoasă, transformând-o în energie de legare chimică cu ajutorul unor pigmenţi asemănători clorofilei, şi ♦ tipul chimiotrof, lipsit de pigmenţi fotosintetizanţi, pentru care unica sursă de energie o reprezintă reacţiile biochimice de oxidoreducere a unor substanţe organice sau anorganice. în ceea ce priveşte sursa de carbon, se diferenţiază : ♦ tipul litotrof (lith = piatră) sau autotrof (în sensul de independent , liber) căruia îi aparţin bacteriile capabile să-şi sintetizeze toţi constituenţii celulari plecând de la carbon anorganic (CO2 ), şi ♦ tipul organotrof sau heterotrof în care se încadrează bacteriile dependente de materia organică, care nu se pot dezvolta decât în prezenţa substanţelor organice ca surse de energie şi C. Deci, în timp ce autotrofele prin sintezele lor generează substanţe organice, heterotrofele le descompun. Ansamblând cele două criterii, bacteriile fototrofe pot fi grupate în fotoautotrofe (fotolitotrofe) şi fotoorganotrofe (fotoheterotrofe), iar bacteriile chimiotrofe se pot clasifica, de asemenea, în chimioautotrofe (chimiolitotrofe) şi chimioorganotrofe (chimioheterotrofe). In rândul bacteriilor chimiotrofe se pot diferenţia tipuri intermediare capabile să utilizeze atât compuşi organici cât şi anorganici. Astfel, există bacterii capabile să utilizeze carbonul organic sau anorganic şi azotul anorganic constituind un subtip numit mezotrof. 155

BACTERIOLOGIE GENERAL|

O redare sintetică a principalelor tipuri nutritive şi a caracteristicilor acestora se găseşte în tabelul 4. Posibilitatea de a utiliza diverse substraturi nutritive este condiţionată de gradul de dotare a bacteriilor cu echipament enzimatic. Tabelul 4 Tipuri nutritive la bacterii

Tipuri nutriti ve

Capacita te de sinteză

Autotrof

Totală

Surse de carbon CO2

Surse azot

NH3

de Surse de energie

Lumina

Felul bacteriilor

Bacterii fototrofe

(fotosinteză) Substanţe anorganice Bacterii (reacţii chimiotrofe chimice) Mezotrof

Incompletă pentru N

CO2 sau C organic

NH3

Reacţii chimice

Bacterii sulfatoreducătoare

N organic

Reacţii chimice

Bacterii chimioorganotrofe

Facultati vă pentru C Hetero-trof

Atenuată

C organic

Sub acest aspect atât în rândul bacteriilor autotrofe cât şi al celor heterotrofe există mari diferenţe individuale, în sensul că unele specii, ca de exemplu cele din genul Pseudomonas, pot utiliza ca unică sursă de carbon şi energie 70 – 200 substanţe chimice diferite, în timp ce altele sunt foarte ,,specializate", utilizând un număr limitat de nutrienţi (bacteriile metilotrofe 156

BACTERIOLOGIE GENERAL|

utilizează numai metanul şi metanolul, bacteriile celulozolitice numai celuloza, ş.a.m.d.). Deoarece bacteriile autotrofe nu interesează bacteriologia medicală şi medical-veterinară, în continuare vor fi menţionate numai sursele de substanţe organice pentru cele mai importante elemente biogene necesare bacteriilor chimioheterotrofe, categorie în care se încadrează majoritatea bacteriilor patogene. Principala sursă de carbon pentru aceste bacterii o reprezintă glucidele şi polialcoolii şi într-o proporţie mai redusă diferiţi acizi organici, cetonele, lipidele, acizii graşi, etc. Sursele de azot organic sunt reprezentate în primul rând de aminoacizi, urmaţi în cazul a numeroase specii, de alte substanţe cu azot, diferite ca grad de complexitate: uree, peptone, proteine. Unele bacterii patogene pot folosi şi surse de azot anorganic, cum este amoniacul rezultat din hidroliza ureei sau din reducerea nitraţilor în nitriţi şi a nitriţilor în amoniac. Pe lângă de carbon şi azot, toate bacteriile au nevoie de macroelemente (P, S, O, H, K, Mg, Fe, Ca, Mn, etc.) şi microelemente (Cu, Zn, Mo, etc.), acestea din urmă fiind indispensabile activităţii catalitice a unor enzime. Concomitent cu sursele plastice şi energetice de bază, pentru numeroase bacterii patogene este indispensabilă prezenţa în mediul lor de viaţă a unor substanţe pe care acestea sunt incapabile să le sintetizeze. Ele au fost numite factori de creştere, în cazul unei nevoi permanente, şi factori de plecare, în cazul când substanţa respectivă este necesară doar la izolare şi uneori în primele subculturi. Astfel de factori sunt reprezentaţi de vitamine, aminoacizi, hematine, baze azotate purinice şi pirimidinice, etc. De exemplu, 157

BACTERIOLOGIE GENERAL|

bacteriile din genul Haemophilus reclamă unul sau doi factori de creştere şi anume : ♦ factorul X sau hematina, un feropigment prezent în hematii, astfel că sursa de factor X curent folosită în laborator este sângele hemolizat, şi ♦ factorul V reprezentat NAD sau NADP, care se găseşte în ţesuturi animale şi vegetale, bacterii şi levuri (frecvent utilizându-se extractul de drojdie de bere). Prin urmare, mediile utilizate în practica bacteriologică pentru cultivarea bacteriilor ,,in vitro” trebuie să aibă o compoziţie adecvată exigenţelor nutritive ale acestora. In cazurile în care nevoile specifice de factori de creştere sau de plecare sunt cunoscute, aceştia pot fi incluşi ca atare în compoziţia mediilor de izolare. Deoarece, de cele mai multe ori, aceste necesităţi nu sunt precis identificate, mediile pentru izolarea bacteriilor cu exigenţe nutritive se prepară din medii uzuale, adaugând, ca sursă de factori de creştere sau de plecare, substanţe organice complexe şi ieftine cum sunt: extractul de drojdie de bere, serul sanguin, sângele, lichidul ascitic, etc.

2.3.2.2.2. Accesul substanţelor nutritive în celula bacteriană O parte din substanţele nutritive pătrund în celula bacteriană, ca atare, străbătând prin porii peretelui celular şi membrana citoplasmatică. Cele care, din caza mărimii moleculelor sau a structurii complexe, nu pot traversa învelişurile

158

BACTERIOLOGIE GENERAL|

celulare, sunt în prealabil reduse dimensional şi structural de către exoenzime. Dacă traversarea peretelui celular este un act pasiv, acesta îndeplinind rolul unui filtru mecanic, pătrunderea prin membrana citoplasmatică se realizează prin patru modalităţi diferite şi anume: difuzia pasivă, difuzia facilitată, translocaţia de grup şi transportul activ. Difuzia pasivă (simplă, liberă sau nemediată) este procesul de trecere liberă a substanţelor solubile prin membrana citoplasmatică, de la o concentraţie mai ridicată la o concentraţie mai scăzută, fără a interacţiona cu moleculele din structura acesteia şi fără consum de energie. Deoarece forţa de propulsie este gradientul de concentraţie, difuzia încetează în momentul când substratul ajunge la aceeaşi concentraţie atât în interiorul celulei bacteriene cât şi în mediu. Difuzia pasivă se limitează la apă, unele gaze (oxigen, bioxid de carbon), acizi graşi, substanţe liposolubile şi anumiţi ioni, deoarece concentraţia celor mai mulţi metaboliţi este mai mare în interiorul decât înafara celulei. Condiţia esenţială pentru substanţele care difuzează pasiv este mărimea moleculei, care nu trebuie să depăşească 0,6 – 0,8 nm. Difuzia facilitată se realizează prin intervenţia unor proteine prezente în membrana citoplasmatică, cu o poziţie transmembranară, numite proteine-carrier sau permeaze. Ele au rol de purtător specific, mărind viteza de traversare a moleculelor dizolvate, de câteva sute de ori în raport cu difuzia liberă. 159

BACTERIOLOGIE GENERAL|

Difuzia facilitată se desfăşoară în trei faze (fig. 16):

Fig. 16 Difuzia facilitată (după Tortora J.G. şi col, 1997)

1. recunoaşterea şi legarea specifică a substanţei transportate de către proteina-purtător; 2. translocaţia substanţei prin membrană; 3. disocierea complexului substanţă-purtător, de partea opusă a membranei. Transportul substanţelor prin acest mecanism se realizează sub impulsul gradientului de concentraţie, în ambele sensuri (în sau din celulă), fără consum de energie. Proteinele– purtător facilitează difuzia transmembranară atâta timp cât de o parte şi de cealaltă a membranei există o diferenţă de concentraţie a substratului respectiv.

160

BACTERIOLOGIE GENERAL|

Translocaţia de grup este o altă modalitate de transport mediat de proteinele-carrier, care presupune transformarea chimică a substanţelor în timpul transferului din exterior în interiorul celulei bacteriene. Transformarea constă într-un proces de fosforilare, mediat de un complex enzimatic numit sistemul fosfotransferazei.

Datorită faptului că produsul pătruns în celulă nu se acumulează, deoarece diferă chimic de cel iniţial, transportul poate continua fără consum de energie chiar şi atunci când concentraţia intracelulară a substratului modificat este mult mai mare. Acest sistem intervine în transportul glucozei, sub formă de glucozo-6-fosfat şi a altor glucide şi polialcooli: fructoza, sorboza, manoza, respectiv sorbitolul, manitolul, etc. Spre deosebire de difuzia facilitată, în translocaţia de grup transportul este unidirecţional; glucidele fosforilate nu pot fi eliminate din celulă, deoarece sub această formă nu mai au afinitate pentru proteinele–purtător. Transportul activ este procesul prin care diferite substanţe solubile (glucide, aminoacizi, peptide, nucleotide, ioni) sunt ,,pompate“ în celulă prin membrana citoplasmatică, acumulându-se nemodificate chimic, în concentraţii de sute şi mii de ori mai mari decât în exterior. Transportul se realizează cu ajutorul permeazelor, ca şi în cazul difuziei facilitate, cu deosebirea că acestea intervin activ consumând energie, deoarece transportul substanţelor se face împotriva gradientului de concentraţie. Procesul este similar cu propulsarea unui lichid ,,la deal“, contra gravitaţiei. Substanţele transportate activ rămân în interiorul celulei, deoarece proteinele-carrier, sub influenţa energiei de cuplare, suferă modificări conformaţionale, care fac ca situsul de legare 161

BACTERIOLOGIE GENERAL|

îndreptat spre interiorul celulei să devină inaccesibil, în timp ce afinitatea pentru substratul extern rămâne aceeaşi. Prin particularităţile sale, transportul activ are o importanţă deosebită în procurarea de nutrienţi din mediile în care aceştia se găsesc în concentraţii mici şi în menţinerea unor concentraţii interne relativ constante a diferiţilor metaboliţi în raport cu fluctuaţiile mari din mediul extern. Primul sistem de transport activ identificat este cel al βgalactozidpermeazei la E. coli, care poartă situsul de recunoaştere şi de transport al lactozei. Acest sistem de transport permite bacteriei să folosească lactoza şi să acumuleze în celulă acest glucid, sau analogii lui, în concentraţie de 500 de ori mai mare decât în mediu.

2.3.2.3. Metabolismul bacterian Prin analogie cu celula vegetală şi animală, metabolismul bacterian implică totalitatea reacţiilor biochimice catalizate enzimatic care permit bacteriilor să obţină din nutrienţi, atât compuşii necesari pentru sinteza constituienţilor celulari, cât şi energia necesară pentru aceste sinteze şi pentru alte activităţi care necesită consum de energie. Activitatea metabolică a bacteriilor poate fi diferenţiată în metabolism energetic, care include catabolismul şi respiraţia şi metabolism de sinteză sau anabolism.

2.3.2.3.1. Catabolismul Substraturile exogene care pot constitui surse energetice şi plastice pentru bacteriile heterotrofe sunt reprezentate, în 162

BACTERIOLOGIE GENERAL|

majoritatea cazurilor, de compuşi organici cu structură complexă: proteine, glucide, lipide. Eliberarea energiei prin procesele de catabolism se realizează treptat, în trei faze distincte. (Răducănescu H. şi col., 1986) Faza I . Macromoleculele sunt dezansamblate în unităţile lor de construcţie: proteinele în aminoacizi, polizaharidele în monozaharide, iar lipidele în glicerol şi acizi graşi. In această primă fază se eliberează de obicei mai puţin de 1% din energia totală a macromoleculelor, care se pierde în bună parte sub formă de căldură. Faza II. Aminoacizii, monozaharidele şi acizii graşi rezultaţi în prima etapă suferă o degradare incompletă cu formarea de produşi intermediari (amoniac, acid piruvic, acizi graşi inferiori, etc.), bioxid de carbon şi apă. Energia eliberată reprezintă aproximativ o treime din energia totală a substraturilor iniţiale. In această fază, hexozele pot fi metabolizate pe diverse căi (glicoliză, calea Entner-Doudoroff sau calea hexozomonofosfatului) dar produşii finali nu sunt foarte diferiţi. In mod similar, aminoacizii pot fi catabolizaţi pe căi diferite, însă, indiferent de calea utilizată, rezultatul constă în formarea de acetil-Co A sau de intermediari ai ciclului acizilor tricarboxilici (ciclul Krebs) . Faza III In cursul acestei faze, produşii intermediari sunt descompuşi până la CO2 şi H2O pe calea acizilor tricarboxilici, rezultând, de regulă, cantitatea maximă de energie. Nu toate 163

BACTERIOLOGIE GENERAL|

substraturile ajung însă la această ultimă fază. In multe cazuri, degradarea se opreşte la produşii intermediari, care sunt deseori preluaţi sub formă de precursori şi introduşi în filiera reacţiilor anabolice, sub acţiunea enzimelor biosintetizante. Pentru produşii finali rezultaţi din activitatea catabolică, celula bacteriană dispune de multiple căi de utilizare, şi anume :

• hidrogenul rezultat din procesele de oxidare este introdus în circuitul respirator pentru reacţiile de reducere, cu cedare către alţi acceptori. • oxigenul rezultat în urma reacţiilor de reducere este valorificat în procesele de oxidare; • energia rezultată în diferitele etape ale degradării catabolice este utilizată în procesele endergonice ale biosintezelor celulare.

2.3.2.3.2. Respiraţia Bacteriile chimiotrofe îşi procură cea mai importantă parte a energiei prin procesul de respiraţie celulară, care constă într-o succesiune de reacţii de oxido-reducere biologică ce pot avea loc în aerobioză sau anaerobioză*(Stamatin N., 1965; Zarnea G., 1970,1984) Bacteriile, ca toate celelalte vieţuitoare, respiră, ceea ce în sensul obişnuit al cuvântului înseamnă că ele consumă oxigen pentru a produce cu ajutorul lui reacţii chimice exoterme, eliberatoare de energie. Pasteur a observat cel dintâi că unele specii bacteriene trăiesc şi se înmulţesc în absenţa oxigenului mai bine chiar decât în prezenţa lui, deci respiră fără oxigen. Această constatare, pe lângă altele, a dus la o lărgire a conţinutului noţiunii de respiraţie, în sensul că se numeşte proces respirator orice reacţie chimică eliberatoare de energie care se petrece in vivo, în prezenţa sau în absenţa oxigenului. *

164

BACTERIOLOGIE GENERAL|

Prin oxido-reducere biologică se înţelege pierderea atomilor de H (e¯ şi H +) din molecula unei substanţe chimice (S) care se oxidează eliberând energie şi transferul lor către o substanţă acceptoare (A) care se reduce, conform ecuaţiei: SH2 + A< => S + AH2 + energie Respiraţia la bacterii se rezumă, în esenţă, la preluarea hidrogenului rezultat din reacţiile catabolice, prin intermediul unor enzime numite dehidrogenaze şi cedarea lui către un acceptor final care poate fi oxigenul sau altă substanţă. După natura acceptorului final de electroni de H, respiraţia bacteriană este de trei tipuri : 1. respiraţia aerobă (oxibiotică), un proces de de oxidare completă a substraturilor cu ajutorul oxigenului molecular ca acceptor final de H şi eliberarea unei cantităţi mari de energie; 2. respiraţia anaerobă (anoxibiotică) în care acceptorul final de H poate fi orice substanţă anorganică, exceptând oxigenul (NO3-, SO4-, S, CO2); 3. fermentaţia, un proces de oxido-reducere biologică care are loc în condiţii de anaerobioză sau în prezenţa oxigenului dar fără intervenţia lui şi în care energia este obţinută prin utilizarea compuşilor organici, atât ca donatori cât şi ca acceptori de electroni. Spre deosebire de respiraţia aerobă, în cursul fermentaţiei se eliberează o mică parte din energia conţinută în substrat, rezultând numeroşi produşi de degradare parţială. Aceştia variază foarte mult în raport cu substratul şi calea metabolică *∗. *Fermentaţia lactică constă în transformarea hexozelor în acid lactic. Ea este caracteristică unor specii din genurile Lactobacillus şi Streptococcus, responsabile de acidifierea laptelui nefiert. Aceste bacterii sunt utilizate în industria prelucrării laptelui, sub formă de 

165

BACTERIOLOGIE GENERAL|

Deoarece eliberarea bruscă a energiei din substraturile oxidate - într-o singură treaptă (aşa cum arată reacţia de mai sus) - ar fi dăunătoare pentru celulă, transferul hidrogenului către acceptorul final se realizează în mai multe etape, cu participarea unui întreg arsenal de enzime respiratorii, care servesc ca acceptori tranzitorii de hidrogen. Ele se reduc şi se oxidează succesiv prin preluarea şi respectiv, cedarea hidrogenului de la una la alta către acceptorul final, constituind sistemul transportor de electroni sau catena de respiraţie celulară. In funcţie de structura chimică şi ordinea în care intră în acţiune de-a lungul catenei de respiraţie, enzimele respiratorii bacteriene se încadrează în trei grupe. 1. Grupa dehidrogenazelor piridinice formată din enzimele ale căror coenzime sunt NAD (nicotinamidă-adeninădinucleotid) şi NADP (nicotinamidă-adenină–dinucleotidfosfat). Fracţiunea activă a acestor coenzime este nicotinamida, care se poate găsi sub două forme alternative: oxidată (NAD şi NADP) şi redusă (NADH 2 şi NADPH2). Reacţia dintre un substrat oxidabil şi o coenzimă din grupul nicotin-adenin-dinucleotidelor constă în dehidrogenarea (oxidarea) celui dintâi şi hidrogenarea (reducerea) coenzimei. Cum NAD şi NADP sunt uşor disociabile de maiele, pentru obţinerea diferitelor sortimente de iaurturi şi brânzeturi. Fermentaţia alcoolică produce alcool din hexoze. Este rar întâlnită la bacterii, fiind caracteristică levurilor şi unor miceţi. Fermentaţia acidă mixtă este caracteristică bacteriilor enterice şi multor specii saprofite, care eliberează prin fermentarea glucozei, acid piruvic, acid lactic, acid formic, acid succinic şi etanol. Alte fermentaţii posibile sunt: fermentaţia propionică cu formare de acid propionic; fermentaţia butilen-glicolică cu formare de acetilmetilcarbinol şi butilen-glicol; fermentaţia butilic-butirică din care rezultă o cantitate mare de acetonă (cu posibilităţi de exploatare industrială), alcool izopropilic, butanol ş.a. 166

BACTERIOLOGIE GENERAL|

apoenzimele lor, fiecare poate participa succesiv la numeroase reacţii de oxido-reducere, după cuplarea lor cu diferite apoenzime. 2. Grupa dehidrogenazelor flavinice este reprezentată de enzimele respiratorii flavoproteice, care conţin o grupare prostetică solid fixată (cofactor), reprezentată în majoritatea cazurilor de FAD (flavin-adenin-dinucleotid). La bacteriile aerobe, aceste enzime îndeplinesc rolul de transportori de hidrogen între dehidrogenazele piridinice şi citocromi. De la dehidrogenaze, indiferent de natura lor, atomii de hidrogen cedează electronii (e¯) citocromilor, iar ei trec în mediul celular sub formă de protoni (H + ). 3. Sistemul citocromilor constă într-un grup de proteine conjugate, conţinând fiecare un grup prostetic solid fixat numit ,,hem”, în care fierul poate fi oxidat şi redus în mod reversibil prin câştigarea sau pierderea unui electron: + eFe+++ < = > Fe++ Citocromul iniţial din acest sistem (citocromul b) acceptă, unul câte unul, electronii transferaţi de la dehidrogenaze, pe care îi transferă mai departe citocromului c care, la rândul său, efectuează un transfer similar citocromului a. Acesta din urmă transferă fiecare electron acceptorului final, reprezentat de oxigenul molecular (O2), prin intermediul unei enzime speciale numită citocromoxidază. Când fierul sub formă redusă (Fe++) din hemul ultimului citocrom este reoxidat (Fe+++) sub acţiunea citocromoxidazei, oxigenul molecular este redus şi se transformă în ionul O ¯capabil să se unească cu protonii ( H+ ) din mediul celular pentru a forma apa (H2 O). 167

BACTERIOLOGIE GENERAL|

In cursul metabolismului, în funcţie de natura substratului şi de enzimele prezente în celulă, bacteriile utilizează diverse combinaţii de acceptori tranzitorii de hidrogen de-a lungul lanţului de respiraţie celulară (fig. 17).

Fig.17 Reprezentarea schematică a modalităţilor de utilizare a transportorilor de electroni în cursul metabolismului bacterian:

A – reacţii de oxido-reducere la bacteriile aerobe, care utilizează o serie completă de transportori de electroni; B – metabolism aerob cu utilizarea exclusivă a flavinei ca transportor intermediar; C – transportul de electroni în procesele fermentative, realizat obişnuit de un singur transportor (NAD sau NADP).

O parte din energia eliberată prin oxido-reducere se pierde sub formă de căldură sau este utilizată direct pentru unele funcţii celulare (transport, biosinteze, mobilitate, etc.), iar energia suplimentară (care depăşeşte nevoile de moment ale celulei bacteriene) este înmagazinată într-un compus organic cu fosfor, sub forma unor legături intens energetice numite legături macroergice . Principalul compus macroergic este acidul adenozintrifosforic (ATP) care derivă din acidul adenozin-monofosforic (AMP) prin două fosforilări oxidative consecutive, cuplate cu lanţul respirator (fig. 18). 168

BACTERIOLOGIE GENERAL|

169

BACTERIOLOGIE GENERAL|

Fig.18 Catena de respiraţie celulară cuplată

cu fosforilarea oxidativă.

Prima fosforilare duce la formarea acidului adenozindifosforic (ADP) care are o singură legătură macroergică şi care, la rândul lui, prin adiţionarea unei molecule de fosfat anorganic se transformă în ATP, înmagazinând o cantitate dublă de energie. Atât ATP cât şi ADP pot ceda cu uşurinţă fosforul iar energia eliberată prin desfacerea legăturilor macroergice devine accesibilă consumului pentru diferitele nevoi ale celulei

170

BACTERIOLOGIE GENERAL|

In funcţie de modalitatea utilizată pentru eliberarea energiei şi de comportamentul faţă de oxigenul molecular, bacteriile pot fi grupate în cinci tipuri respiratorii. 1. Bacteriile strict – sau obligatoriu – aerobe (Bacillus anthracis, Pseudomonas aeruginosa, Mycobacterium tuberculosis, etc.) folosesc oxigenul molecular ca acceptor final de hidrogen, având sistemul citocromilor bine reprezentat (citocromi de tipurile a, a3 , b, c, c1). Prin urmare, au nevoie de prezenţa continuă a oxigenului atmosferic. Aviditatea de oxigen a acestor bacterii face ca ele să se dezvolte foarte bine pe suprafaţa mediilor solide. In cazul însămânţărilor efectuate în masa mediilor agarizate şi în mediile lichide, creşterea are loc numai la suprafaţă (fig 19a). Pentru a obţine culturi abundente de bacterii aerobe în mediile lichide este necesară o aerare a mediului. Incapacitatea de a se dezvolta în anaerobioză s-ar datora lipsei enzimelor necesare respiraţiei anaerobe, sau faptului că, pentru aceste bacterii, produşii finali ai respiraţiei anaerobe sunt toxici.

171

BACTERIOLOGIE GENERAL|

2.

toxic şi de aceea, în scopul cultivării, se utilizează diferite metode pentru Bacteriile strict sau obligatoriu – anaerobe

(Clostridium tetani, Clostridium botulinum, Fusobactrium spp, Bacteroides spp. ş.a.) nu se pot dezvolta în prezenţa oxigenului (fig 19 c). Pentru ele oxigenul este eliminarea sau blocarea acţiunii lui. Cultivarea în absenţa oxigenului se realizează, în mod curent, prin incubarea culturilor în aparate speciale numite anaerostate sau prin incorporarea în mediul de cultură a unor substanţe puternic reducătoare (tioglicolat de sodiu, cisteină, sulfit de sodiu, etc.). Fig. 19 Efectul concentraţiei oxigenului asupra creşterii bacteriilor.

Bacteriile strict anaerobe sunt lipsite de enzimele respiratorii din categoria citocromilor, implicit de citocromoxidază. In această deficienţă rezidă şi explicaţia anaerobiozei lor stricte, deoarece în prezenţa O2, care se comportă ca acceptor final de H, nu se mai formează apa ci peroxidul de hidrogen (produs toxic), conform reacţiei: S – H2+ O2 — > S + H2 O2

172

BACTERIOLOGIE GENERAL|

Bacteriile aerobe, spre deosebire de cele anaerobe, nu sunt expuse acţiunii toxice a apei oxigenate, deoarece ele sau nu produc acest peroxid sau, dacă-l produc, au două posibilităţi de a-l transforma în produşi inofensivi: fie prin intrarea în acţiune a catalazei, care îl descompune în apă şi oxigen (H2 O2 —catalază— > H2 O + ½ O2 ), fie prin utilizarea lui ca acceptor de hidrogen în oxidările catalizate de peroxidaze, care îl reduc la apă (H2 O2 + 2 (H)—peroxidază— > 2 H2 O). Bacteriile anaerobe sunt lipsite de catalază şi peroxidază şi ca atare sunt susceptibile de a suferi de pe urma acţiunii H 2 O2 care se acumulează în mediu în concentraţii toxice. După o altă ipoteză, moartea anaerobilor în prezenţa oxigenului nu s-ar datora acestor deficienţe, ci ar fi determinată de afectarea ireversibilă a proteinelor enzimatice care, la aceste bacterii, sunt foarte sensibile la oxidare. O dovadă în sprijinul acestei ipoteze o constituie faptul că, anaerobii obligaţi pot fi cultivaţi în prezenţa oxigenului, dacă în mediul de cultură se introduce una din substanţele reducătoare mai sus menţionate, pentru a-i menţine potenţialul redox la un nivel scăzut. 3. Bacteriile aerobe, anaerobe facultativ sunt bacterii aerobe care şi-au dezvoltat capacitatea de a supravieţui în absenţa oxigenului. Ele sunt dotate enzimatic cu posibilităţi de a obţine energie atât prin procesele de oxidare aerobă cât şi prin fermentaţie, în funcţie de disponibilităţile de oxigen. Cultivate în bulion şi în masa mediilor solide, ele epuizează în scurt timp oxigenul dizolvat, continuând să se dezvolte în condiţii anaerobe (fig.19 b). In această categorie se încadrează majoritatea speciilor bacteriene care interesează patologia umană şi veterinară . 4. Bacteriile anaerobe, aerotolerante sunt bacteriile anaerobe la izolare, care în subculturi devin tolerante faţă de oxigen (fig.19 d). Un exemplu tipic îl constituie specia Clostridium perfringens. 173

BACTERIOLOGIE GENERAL|

5.

Bacteriile microaerofile (Campylobacter spp, Helicobacter spp., Brucella spp. ş.a.) au nevoie de o cantitate de oxigen mai redusă decât concentraţia existentă în aer, astfel încât în tuburile cu medii solide însămânţate prin incorporarea inoculului, cultura se dezvoltă într-un orizont limitat, acolo unde se realizează concentraţia respectivă (fig.19 e). Această particularitate - microaerofilia - s-ar datora sensibilităţii unora dintre enzime la condiţiile de oxidare puternică. Prin urmare, cultivarea acestor bacterii reclamă incubarea în termostate cu atmosferă reglabilă, care să conţină oxigen 5-7%, bioxid de carbon 8-10% şi azot 85% (Buiuc D., 1999).

6.

2.3.2.3.3. Anabolismul Anabolismul constă în secvenţe de reacţii enzimatice, desfăşurate în trepte, prin care se efectuează sinteza constituienţilor celulari pornind de la precursori reprezentaţi de produşii intermediari ai catabolismului sau de substanţele preluate direct din mediu. Ca şi procesele de catabolism, reacţiile de biosinteză se realizează tot în trei faze care se succed în sens invers :

• producerea de subunităţi care vor intra în componenţa macromoleculelor specifice fiecărui constituient celular; • activarea subunităţilor cu ajutorul energiei eliberate prin descompunerea compuşilor macroergici de tip ATP , în care a fost stocată pe parcursul degradării diferiţilor compuşi; • formarea de macromolecule prin polimerizarea sau condensarea subunităţilor activate. 174

BACTERIOLOGIE GENERAL|

Totuşi, căile catabolice şi anabolice pentru un anumit substrat nu sunt complet reversibile. Astfel, reacţiile anabolice au ca punct de plecare, de cele mai multe ori, compuşi intermediari foarte diferiţi de cei care rezultă din catabolismul compusului respectiv, iar enzimele implicate sunt parţial diferite. De exemplu, catabolismul serinei duce la formarea de piruvat, în timp ce sinteza ei începe de la 3-fosfoglicerat; histidina este catabolizată la α-cetoglutarat, iar sinteza ei este iniţiată de la ribozo-5-fosfat; degradarea glicogenului la acid lactic este catalizată de 12 enzime, dintre care numai 9 catalizează reacţii reversibile .

2.3.2.4. Creşterea şi multiplicarea bacteriilor 2.3.2.4.1. Creşterea bacteriilor Celula bacteriană creşte pe seama depunerii de substanţă celulară rezultată din metabolismul de biosinteză şi a sporirii conţinutului în apă. Creşterea se poate realiza uni- sau multidimensional, în funcţie de locul şi modalitatea de dispunere a substanţei nou elaborate. După L a m a n n a (cit. de Zarnea G., 1984), există următoarele posibilităţi teoretice de creştere a celulei bacteriene (fig.20):

175

BACTERIOLOGIE GENERAL|

176

BACTERIOLOGIE GENERAL|

Fig. 20 Modalităţi de creştere la bacterii: 1 – celula bacteriană imediat

după diviziune; 2 – creşterea la o singură extremitate; 3 – la ambele extremităţi; 4 - în zona septului transversal; 5 – prin intususcepţiune; 6 – prin depunere de substanţă în zona periferică a celulei.

1. creşterea la una din extremităţi; 2. creştera la ambele extremităţi; 3. creşterea în vecinătatea constituirii viitorului sept de diviziune; 4. creşterea prin intususcepţiune (depunerea de substanţă nouă, diseminat şi intercalat printre constituienţii celulari preexistenţi); 5. creştere prin depunerea materialului nou în zona periferică a celulei (limitrof învelişului). In cursul creşterii celulei bacteriene, raportul suprafaţă/volum se micşorează treptat datorită faptului că, în timp ce suprafaţa bacteriilor se dublează, volumul lor se triplează. Ori, activitatea normală a bacteriilor este condiţionată de existenţa unui raport optim între volumul celulei, care consumă şi suprafaţa ei, prin care se face absorbţia substanţelor nutritive şi eliminarea cataboliţilor. In consecinţă, pe parcursul creşterii, aportul de 177

BACTERIOLOGIE GENERAL|

substanţe nutritive satisface din ce în ce mai puţin exigenţele metabolice ale celulei iar echilibrul ei chimic se alterează, deoarece circulaţia substanţelor prin difuzie în ambele sensuri devine mai dificilă. Din cauza acestor perturbări, atunci când disproporţia dintre suprafaţă şi volum atinge un anumit punct critic, raportul lor adecvat se restabileşte prin diviziunea celulei. Astfel, diviziunea celulară este prin ea însăşi o formă necesară de reglare a activităţii celulei bacteriene.

2.3.2.4.2. Multiplicarea bacteriilor Formele de multiplicare Spre deosebire de organismele pluricelulare, la care multiplicarea celulelor duce la mărirea taliei individului, la bacterii şi la toate celelalte organisme unicelulare, ea are ca rezultat creşterea numărului de indivizi şi implicit a populaţiei respective. Majoritatea speciilor bacteriene se multiplică numai prin diviziune directă (diviziune simplă, sciziparitate), unele (micoplasmele, actinomicetele) putându-se multiplica şi pe alte căi: prin corpi elementari, ramificare , înmugurire, spori. Ca regulă generală, multiplicarea bacteriilor este asexuată, deşi uneori ea poate fi precedată de forme rudimentare de sexualitate, care constau într-un schimb de material genetic între două celule bacteriene prin fenomenul de conjugare (vezi cap.de Genetică bacteriană ).

178

BACTERIOLOGIE GENERAL|

Multiplicarea prin diviziune directă constă în scindarea unei celule bacteriene care a atins punctul critic de creştere în două celule-fiice, cel mai frecvent identice. La bacteriile de formă alungită (bacili, spirochete), diviziunea se face transversal după un plan perpendicular pe marele ax al celulei, în centrul acesteia şi rareori excentric. La coci, diviziunea se poate realiza după unul, două sau trei planuri perpendiculare succesive. In urma diviziunii, celulele rezultate se pot separa sau, la numeroase specii, pot să rămână unite una sau mai multe generaţii realizând grupări caracteristice cu valoare taxonomică. Diviziunea celulei bacteriene este precedată şi iniţiată de replicarea semiconservativă a AND-ului cromozomal, în momentul în care corpii nucleari nou formaţi sunt disponibili pentru segregare, astfel încât cele două celule–surori să fie înzestrate cu o copie exactă a genomului celulei parentale. Spre deosebire de celulele eucariote, la care separarea materialului nuclear se realizează graţie aparatului mitotic, la bacterii segregarea este asigurată de mezozomii pe care membrana citoplasmatică îi formează prin invaginare până la nivelul fiecărui corp nuclear. In acest mod, replicarea materialului genetic este corelată cu creşterea celulară, prin intermediul semnalelor chimice transmise de membrana citoplasmatică în creştere, sistemului enzimatic de reglare a replicării. Separarea celulei bacteriene în cele două celule-fiice se poate realiza în două moduri: prin ştrangularea celulei şi prin formarea unui sept transversal. Diviziunea prin ştrangulare, caracteristică bacteriilor care aparţin tipului cultural “S„ se realizează prin îngustarea mediană a celulei, determinată de invaginarea concomitentă a membranei citoplasmatice şi a peretelui celular (fig. 21). 179

BACTERIOLOGIE GENERAL|

Fig.21 Reprezentarea schematică a diviziunii bacteriilor prin ştrangulare (după Bisset cit. de Zarnea, G.,1963.)

Diviziunea prin sept transversal se caracterizează prin constituirea, într-o primă fază, a unui sept rezultat din invaginarea membranei citoplasmatice, pentru ca, în a doua fază, să se constituie şi partea de perete celular ce urmează să despartă celulele-fiice rezultate. Acest mod de diviziune se întâlneşte cu predilecţie la bacteriile aparţinând tipului cultural rugos - ”R„ (fig.22).

Fig. 22 Reprezentarea schematică a diviziunii bacteriilor prin sept

transversal (după Bisset cit. de Zarnea G., 1963).

180

BACTERIOLOGIE GENERAL|

Multiplicarea prin corpi elementari a fost descrisă la chlamidii, bacterii la care, pe lângă diviziunea directă, există posibilitatea desfăşurării unui ciclu vital. Punctul de plecare al acestui ciclu este reprezentat de structuri mici corpusculare, electronoopace, cu un diametru aproximativ de 0,2 – 0,5 micrometri, numite corpi elementari. In celula gazdă, fiecare corp elementar creşte, transformându-se în corp iniţial sau reticulat care ajunge la 0,8 – 1,5 micrometri. In continuare, corpii reticulaţi se multiplică prin diviziune iar celulele-fiice se reorganizează, în sensul transformării lor în corpi elementari. Multiplicarea prin ramificare, înmugurire şi spori proprie ciupercilor microscopice (miceţi filamentoşi şi levuri) – este întâlnită doar la actinomicete şi unele bacterii fotosintetizante. Dinamica multiplicării bacteriilor Deoarece examinarea directă a bacteriilor în diferite medii naturale este foarte dificilă, se cunosc puţine date referitoare la multiplicarea populaţiilor bacteriene în natură (Zarnea G., 1994). Cultivarea bacteriilor în laborator a permis însă un studiu detaliat al dinamicii procesului de multiplicare în condiţii experimentale şi al relaţiilor dintre multiplicare şi factorii de mediu. S-a constatat astfel, că o cultură bacteriană prezintă în cursul existenţei sale patru faze, distincte prin viteza de multiplicare a germenilor şi prin numărul de celule vii pe unitatea de volum. 181

BACTERIOLOGIE GENERAL|

Aceste faze sunt: faza iniţială de adaptare (de latenţă sau de lag1), faza de multiplicare exponenţială sau logaritmică, faza staţionară şi faza de declin (fig. 23). Un aspect esenţial pentru practica examenului bacteriologic este faptul că proprietăţile mediului de cultură (starea de agregare, compoziţia chimică, pH – ul, etc.) generează o serie de particularităţi ale multiplicării, referitoare la viteza de succesiune a diviziunilor celulare, morfologia bacteriilor, expresia macroscopică a populaţiilor bacteriene (caracterele culturale), longevitatea bacteriilor în culturi, etc. (Răducănescu H. , Valeria Bica Popii, 1986

1

(engl. to lag =a întârzia, a rămâne în urmă) 182

BACTERIOLOGIE GENERAL|

183

BACTERIOLOGIE GENERAL|

Fig.23 Curba de multiplicare a bacteriilor.

Particularităţile multiplicării bacteriilor în vas închis. Cultivarea bacteriilor în vase închise, în cantităţi determinate de mediu, este metoda uzuală de cultivare a bacteriilor în laboratoarele de diagnostic. Inoculum este reprezentat, fie de un produs patologic în care se suspectează prezenţa bacteriilor, fie de o cantitate mică de cultură de pe un alt mediu artificial.

A. Multiplicarea în mediile lichide.

184

BACTERIOLOGIE GENERAL|

Faza de latenţă este cuprinsă între momentul introducerii celulelor bacteriene în mediu, prin însămânţare sau transplantare şi momentul când încep să se multiplice. Este o perioadă de adaptare la noile condiţii, eventual de modificare a acestora (Stamatin N.,1965), caracterizată prin lipsa diviziunii şi moartea unor celule bacteriene din cauza neacomodării. Bacteriile viabile acumulează în celulă metaboliţii esenţiali şi sistemele enzimatice necesare creşterii. Durata perioadei de adaptare este condiţionată de următorii factori:

• specia bacteriană (la majoritatea speciilor durează în medie două ore, iar la bacilii tuberculozei, câteva zile); • calitatea nutritivă a mediului însămânţat şi diferenţele faţă de mediul din care provine inoculum (atunci când acesta provine dintr-un alt mediu sau este un produs patologic, adaptarea reclamă o perioadă mai lungă de timp decât atunci când provine din acelaşi mediu de cultură); • vitalitatea bacteriilor însămânţate (cele provenite din culturi îmbătrânite, produse patologice învechite sau procese supurative cronice se adaptează mai greu, în timp ce bacteriile din culturi tinere, din procese supurative acute, sunt active metabolic şi se adaptează mai uşor). In cazul sporilor, transformarea lor în celule vegetative presupune uneori o prelungire a perioadei de adaptare. Faza de multiplicare exponenţială sau logaritmică se caracterizează prin multiplicarea celulelor bacteriene, la debut cu o viteză progresiv mărită, apoi, într-un ritm constant şi 185

BACTERIOLOGIE GENERAL|

caracteristic pentru fiecare specie bacteriană în condiţii bine definite (mediu de cultură, temperatură, Ph, etc.). La majoritatea bacteriilor patogene şi condiţionat patogene (vezi cap. Noţiuni de ecologie microbiană), în condiţii optime, diviziunile se succed la intervale de 20-30 de minute timp care reprezintă vârsta unei generaţii şi care este urmat de dublarea populaţiei bacteriene. O excepţie fac bacilii tuberculozei, la care intervalul dintre două diviziuni este de 3-15 ore (în funcţie de specie). In această fază, culturile bacteriene conţin celule tinere care prezintă toate proprietăţile morfo-fiziologice caracteristice speciei şi o intensitate maximă a tuturor proceselor vitale. Datorită metabolismului foarte activ, ele sunt considerabil mai sensibile la acţiunea agenţilor antibacterieni (antibiotice, chimioterapice) decât în celelalte faze ale multiplicării. Durata fazei de multiplicare logaritmică este în medie de 6-24 de ore, cu aceeaşi excepţie – bacilii tuberculozei – la care ritmul lent de diviziune face ca această perioadă să se prelungească până la 15-60 de zile. Faza staţionară urmează unei scurte perioade (aproximativ 2 ore) în care multiplicarea nu se mai produce în progresie geometrică ci într-un ritm care scade progresiv. Incetinirea multiplicării este determinată de modificarea mediului de cultură (scăderea concentraţiei nutrienţilor, acumularea metaboliţilor toxici în concentraţii inhibitorii, reducerea conţinutului în oxigen , etc.), dar mai ales de realizarea unei concentraţii maxime de celule bacteriene pe unitatea de volum (3×107 - 3×109 pe ml). O dovadă a faptului că principala cauză este o problemă de spaţiu, o constituie multiplicarea de înlocuire care caracterizează această perioadă, în care rata de creştere a 186

BACTERIOLOGIE GENERAL|

populaţiei bacteriene este nulă. Practic, diviziunile continuă numai în limita disponibilităţilor de spaţiu create prin moartea unor celule. Această fază durează de la câteva ore până la 7-8 zile, în funcţie de specie. Faza de declin se caracterizează prin absenţa diviziunilor şi moartea logaritmică a celulelor bacteriene, până la sterilizarea mediului. Cauzele care duc la moartea bacteriilor sunt multiple şi sunt legate în special de epuizarea substanţe nutritive, diminuarea rezervelor respiratorii şi acţiunea toxică exercitată de cataboliţii acumulaţi în mediu. Uneori, un număr mic de bacterii poate supravieţui câteva săptămâni sau luni pe seama substanţelor nutritive eliberate prin autoliza celulelor moarte. Fenomenul este cunoscut sub denumirile de reluarea creşterii, creştere criptică sau canibalism. S-a estimat că pentru un supravieţuitor sunt necesare substanţele provenite de la aproximativ 50 de celule moarte (Grecianu Al., 1986 ). In faza de declin, bacteriile prezintă un polimorfism accentuat determinat de prezenţa celulelor îmbătrânite, cu forme atipice (celule sferice, mici sau gigante, deformate, filamentoase, ramificate, etc.) şi cu afinitate tinctorială scăzută. Evitarea erorilor generate de aceste modificări reclamă efectuarea examenelor pentru încadrarea taxonomică, testarea patogenităţii, testarea sensibilităţii bacteriilor ş.a., numai pe culturi în faza exponenţială. B. Multiplicarea bacteriilor pe mediile solide.

187

BACTERIOLOGIE GENERAL|

Particularităţile multiplicării pe mediile solide se datorează în primul rând absenţei mişcărilor browniene, care asigură dispersarea bacteriilor în masa mediilor lichide şi accesul nediscriminatoriu al celulelor la resursele nutritive. Prin urmare, atât pe suprafaţa, cât şi în profunzimea mediilor solide, în urma multiplicării bacteriilor rezultă aglomerări de milioane de celule, care, în funcţie de abundenţa inoculului şi activitatea aparatului ciliar, pot îmbrăca macroscopic două forme: colonia izolată şi gazonul bacterian. Colonia reprezintă o masă compactă de celule, rezultate, de regulă, din multiplicarea unei singure celule bacteriene. După declanşarea fazei logaritmice, diviziunile se distanţează treptat, pe măsură ce colonia creşte, deoarece între celulele bacteriene care o compun se creează diferenţe privind posibilităţile de acces la substanţele nutritive sau la oxigen (în cazul speciilor aerobe), în funcţie de poziţia lor: limitrofă mediului sau în centrul coloniei. Celulele de la periferia coloniilor, care beneficiază de un aport optim de oxigen şi de nutrienţi, se multiplică activ, în timp ce bacteriile din centrul coloniei pot fi moarte. Dezvoltarea unei colonii bacteriene este condiţionată, nu numai de interacţiunile celulelor individuale, ci şi de influenţa coloniilor vecine. Astfel, cu cât coloniile sunt mai numeroase şi mai dese, cu atât sunt mai mici, din cauză că se jenează reciproc prin eliminarea de metaboliţi toxici şi prin diminuarea concentraţiei nutrienţilor. Coloniile bacteriene diferă prin formă, relief, margini, dimensiuni (0,1 mm - 3-4 mm), suprafaţă, grad de opacitate, prezenţa sau absenţa pigmentului, etc.

188

BACTERIOLOGIE GENERAL|

Aceste particularităţi au permis diferenţierea a două tipuri principale de colonii: colonia de tip ,,S” (netedă) şi colonia de tip ,,R’’ (rugoasă). Colonia de tip ,,S” (engl. smooth=neted) reprezintă rezultatul multiplicării în condiţii optime, la majoritatea speciilor bacteriene (excepţie fac Bacillus anthracis, antracoizii şi Mycobacterium tuberculosis). Este rotundă, bombată, cu suprafaţa netedă şi lucioasă şi marginile regulate (fig.24). Coloniile netede se detaşează cu uşurinţă de substrat şi formează suspensii omogene şi stabile în soluţie salină izotonică (NaCl 9%). Bacteriile care formează astfel de colonii sunt dispuse izolat sau în grupuri mici (diplo, lanţuri scurte) şi prezintă stratul structurilor speciale al peretelui bacterian şi capsula (în cazul speciilor capsulate), bine sintetizate. Prin urmare, structura lor antigenică este completă, iar atunci când aparţin speciilor patogene, corespund formei virulente cu patogenitate şi rezistenţă la fagocitoză, maxime. In bulion, aceste bacterii cresc repede, tulburându-l uniform Colonia de tip „ R” (engl. rough = rugos) este plată, cu suprafaţa rugoasă, zbârcită şi marginile neregulate (fig. 25). Aspectul se datorează tendinţei celulelor de a forma lanţuri lungi

189

BACTERIOLOGIE GENERAL|

190

BACTERIOLOGIE GENERAL|

sau filamente, care se întretaie schimbându-şi reciproc direcţia şi care formează bucle atunci când întâlnesc în mediu un obstacol mecanic.

Fig. 24 Colonie bacteriană de tip ,,S” (după Zarnea G., 1970).

Fig.25 Colonie bacteriană de tip ,,R” (după Zarnea G.,1970).

191

BACTERIOLOGIE GENERAL|

Acest tip de colonie este specific variantelor acapsulogene şi bacteriilor necapsulate ca specie, care şi-au pierdut capacitatea de sinteză normală a structurilor speciale de perete. Drept urmare, aceste bacterii au o structură antigenică incompletă şi aparţin, de regulă, variantelor cu patogenitate atenuată sau nevirulente. Face excepţie specia Mycobacterium tuberculosis, al cărei tip cultural la izolare este ,,R” şi la care pierderea capacităţii de sinteză a factorului cord (o glicolipidă din structura peretelui celular) se însoţeşte de o variaţie R→S. Coloniile de tip „ R” formează suspensii neomogene în soluţie salină fiziologică, iar în bulion cresc aglutinat, formând un sediment la fundul tubului. Dezvoltarea bacteriilor pe mediile solide sub formă de colonii izolate stă la baza tehnicilor uzuale de izolare a bacteriilor în culturi pure. Gazonul sau pânza reprezintă cultura care rezultă prin confluarea coloniilor în cazul însămânţărilor abundente, sau prin invazia mediului de către bacteriile cu aparat ciliar foarte activ, ca urmare a fenomenului de roire sau căţărare . Culturi continue Durata fazei de creştere exponenţială a culturilor bacteriene în vas închis (culturi discontinue) nu permite acumularea unei cantităţi mari de biomasă. Deoarece numeroase bacterii sunt utilizate la scară industrială pentru obţinerea unor produse utile (vitamine, enzime, hormoni, etc.), este necesară conservarea fazei logaritmice o lungă perioadă de timp.

192

BACTERIOLOGIE GENERAL|

Acest deziderat se poate realiza dacă mediul de cultură este reînoit continuu, concomitent cu eliminarea produşilor de catabolism. La nivel de laborator, culturile continue se pot obţine cu ajutorul unei instalaţii speciale numită chemostat (fig. 26). Spre deosebire de cultura statică, în care concentraţia substratului scade pe măsură ce bacteriile se multiplică, ducând în final la diminuarea ratei de creştere, în chemostat, adăugarea mediului proaspăt în mod continuu stabilizează concentraţia substratului şi rata de creştere.

Fig. 26. Schema unui chemostat.

2.3.3. MORFOLOGIA ŞI BIOLOGIA SPORULUI 193

BACTERIOLOGIE GENERAL|

BACTERIAN Sporul bacterian este o formă de conservare a unor specii bacteriene în condiţii nefavorabile, prin rezistenţa sa crescută la factorii nocivi pentru celula vegetativă. Procesul de formare a sporului are loc în interiorul celulei vegetative (endospor) şi poartă denumirea de sporogeneză. In condiţii de mediu optime are loc germinarea sporului, din care va rezulta o nouă celulă vegetativă. Faptul că într-o celulă vegetativă se formează un singur spor, iar prin germinarea acestuia rezultă o singură celulă vegetativă, demonstrează că sporogeneza la bacterii nu reprezintă o cale de înmulţire. Excepţie fac actinomocetele, singurele bacterii la care, ca şi la ciupercile microscopice, sporul reprezintă o formă de reproducere. Atât sporogeneza cât şi germinarea se găsesc sub controlul unor gene cromozomale (aproximativ 50) care acţionează alternativ, fiind represate sau depresate de diverşi factori interni sau din mediul ambiant. Speciile sporogene patogene pentru om şi animale aparţin genurilor Bacillus şi Clostridium. Cocii, cu excepţia speciei Sporosarcina ureae , nu formează spori.

2.3.3.1. Sporogeneza Sporogeneza este un proces de formare în interiorul celulei bacteriene a unei celule de tip nou, diferită din punct de vedere chimic, enzimatic şi fiziologic. In celula vegetativă, asupra genelor care codifică acest proces acţionează inhibitor un represor sintetizat pe baza unor compuşi chimici preluaţi din mediu. Când substanţele respective sunt epuizate şi represorul nu mai este prezent în celulă, genele 194

BACTERIOLOGIE GENERAL|

sunt depresate şi se exprimă fenotipic prin declanşarea procesului de sporogeneză. Alţi factori care influenţează favorabil sporogeneza sunt: anumite limite de temperatură (la Bacillus anthracis între 18o C şi 400 C), uscăciunea, prezenţa oxigenului la bacteriile aerobe şi absenţa lui la cele anaerobe, o anumită densitate a germenilor pe unitatea de volum, etc. Sporogeneza evoluează în trei faze succesive (fig. 27): stadiul preparator, formarea presporului şi maturarea acestuia.

Fig. 27 Fazele sporogenezei: 1 – celula bacteriană în stadiul premergător

sporogenezei; 2 – scindarea materialului genetic cromozomal; 3 – formarea presporului prin constituirea septului de sporogeneză; 4 – formarea cortexului; 5 – formarea celorlalte învelişuri sporale; 6 – spor liber (după Răducănescu H. şi col.,1986).

195

BACTERIOLOGIE GENERAL|

Pregătirea celulei pentru procesul de sporogeneză constă în replicarea semiconservativă a AND-ului nuclear cu formarea a doi cromozomi distincţi. Formarea presporului presupune, într-un stadiu incipient, separarea celor doi cromozomi printr-un sept transversal rezultat din invaginarea membranei citoplasmatice. Cele două segmente celulare vor evolua pe căi diferite, unul devenind prespor iar celălalt, sporangiu. Presporul îşi măreşte gradul de refringenţă şi de opacitate faţă de lumină şi electroni, paralel cu încetarea replicării cromozomului şi iniţierea organizării învelişurilor sporale. Sporangiul, reprezentat de restul celulei vegetative, se autolizează sub acţiunea unor enzime specifice eliberând sporul (ex. Bacillus cereus), sau rămâne ataşat de spor un timp nedefinit (ex. Clostridium tetani), fără a se putea preciza dacă păstrează sau nu însuşirile vieţii Maturarea sporului reprezintă stadiul final de organizare a constituenţilor sporali, însoţit de dobândirea însuşirilor biologice caracteristice. Ea se realizează prin următoarele transformări care se petrec în prespor: • • • • •

morfogeneza învelişurilor sporale; apariţia unor compuşi chimici specifici, inexistenţi în celula vegetativă; reducerea sensibilă a activităţii metabolice; dobândirea rezistenţei la factorii fizici şi chimici faţă de care celula vegetativă este sensibilă.

2.3.3.2. Morfologia sporului In frotiuri, sporii se pot găsi liberi, ataşaţi de celula în care sau format sau în interiorul acesteia, având formă rotundă, ovală sau 196

BACTERIOLOGIE GENERAL|

cilindrică. In cazul când sporul rămâne în interiorul sporangiului, el poate fi aşezat central, subterminal (în apropierea unui capăt), terminal (la unul din capete) sau lateral (fig. 28). Diametrul sporului poate fi egal, mai mare sau mai mic în comparaţie cu diametrul transversal al celulei bacteriene. In funcţie de poziţia sporului şi raportul dintre cele două diametre, bacteriile sporulate pot adopta diferite forme cu semnificaţie taxonomică, şi anume: • bacil nedeformat (bacteridie) cu sporul situat central, caracteristică pentru bacteriile din genul Bacillus; • bacil deformat de sporii care depăşesc diametrul transversal al celulei vegetative (clostridie), având aspect de: ♦ lămâie, când sporul este situat central; ♦ sticlă de lampă de petrol, când sporul este situat subterminal; ♦ rachetă de tenis sau băţ de chibrit, cu spor sferic terminal; • bacil asimetric cu sporul excentric, caracteristic speciei Bacillus laterosporus.

Fig.28 Raporturi posibile între spor şi sporangiu:

1 – spor liber; 2 – spor central nedeformant; 3 – 6, diferiţi spori cu diametrul transversal mai mare decât al celulei (3 - central; 4 – subterminal; 5 – terminal; 6 – lateral). 197

BACTERIOLOGIE GENERAL|

2.3.3.3. Ultrastructura sporului Părţile componente ale sporului bacterian, pornind de la interior spre exterior sunt (fig.29):

Fig.29 Anatomia sporului:

1 – sâmburele sporului; 2 – sporoplasma; 3 – nucleoplasma; 4 – ribozomi; 5 – cortex; 6 - învelişuri sporale externe; 7 – exosporium.

198

BACTERIOLOGIE GENERAL|

1. inima sporului numită şi sâmbure, ,, core “ sau protoplast sporal, cuprinde: ♦ sporoplasma, corespunzătoare citoplasmei, dar mai densă şi cu aspect granular, şi ♦ materialul nuclear sau nucleoplasma. 2. membrana internă (intina) similară membranei citoplasmatice, care rezultă din creşterea septului sporal în jurul protoplastului; 3. cortexul sporal constituit din peptidoglican modificat, similar peretelui bacterian; 4. învelişul extern (exina sau tunicile sporale), pluristratificat; 5. exosporium, un înveliş suplimentar analog capsulei, prezent numai la sporii anumitor specii; 6. corpii parasporali, formaţiuni cristaloide obseservate pe suprafaţa sporilor unor specii bacteriene patogene pentru insecte (ex. Bacillus thuringiensis) Afinităţile tinctoriale ale sporului diferă de cele ale celulei vegetative, astfel încât prin metoda Gram se colorează palid numai conturul sporului, nu şi conţinutul. Pentru colorarea acestuia sunt necesare metode energice, care presupun colorarea la cald cu soluţii concentrate, capabile să impregneze structurile dense ale sporului.

2.3.3.4. Particularităţile sporului Particularităţile biochimice Din punct de vedere biochimic, sporii se caracterizează printr-un conţinut mai redus în apă liberă, săruri de fosfor, săruri de potasiu şi acizi nucleici. Ei conţin într-o proporţie mai mare decât celula vegetativă, cisteină, ioni de calciu şi ioni magneziu. 199

BACTERIOLOGIE GENERAL|

In spor se găsesc şi unii compuşi chimici absenţi în celula vegetativă, cum sunt enzimele litice sporale şi acidul dipicolinic (circa 10% din greutatea uscată a sporului), prezent sub formă de sare de calciu (dipicolinat de calciu).

Particularităţile fiziologice ale sporului constau în faptul că procesele metabolice se desfăşoară cu o intensitate mult redusă, sporul fiind o celulă dormantă, care nu realizează schimburi de substanţe cu mediul ambiant, care nu creşte şi nu se multiplică.

Insuşirile biologice Sporii bacterieni se caracterizează printr-o rezistenţă foarte mare la căldură, radiaţii, uscăciune şi acţiunea substanţelor chimice, asigurând supravieţuirea speciei în natură o perioadă îndelungată (zeci, sute, sau chiar mii de ani)2. De exemplu, sporii de Bacillus anthracis îşi păstrează capacitatea de germinare timp de peste 70 de ani şi rezistă câteva ore la 120 0 C şi câteva minute la 1800 C căldură uscată. Sporii altor specii îşi menţin viabilitatea timp de o săptămână în fenol 5% şi mai multe săptămâni în alcool. Rezistenţa sporilor la factorii nocivi din mediul extern este asigurată de un complex de factori dintre care o importanţă majoră prezintă : •

starea de deshidratare (apă 40-50%, faţă de 80-90% la formele vegetative) şi conţinutul foarte scăzut în apă liberă; apa ,,legată” de diverse structuri nu poate participa

S-au gasit spori viabili în roci care s-au format în era cuaternară şi care au fost scoase de la adâncimi de 37-45 m. Prezenţa unui număr de 5-10 spori pe gram de rocă, exclude contaminarea ulterioară (Zarnea G., 1983) . 2

200

BACTERIOLOGIE GENERAL|

• •

la reacţiile chimice de denaturare şi coagulare a proteinelor prin căldură, antiseptice şi dezinfectante ; prezenţa unei cantităţi mari de dipicolinat de calciu, care are rolul de a modifica conformaţia proteinelor enzimatice, conferindu-le astfel termostabilitate; numărul mare de învelişuri protectoare.

2.3.3.5. Germinarea sporului Germinarea sporului reprezintă procesul de transformare a sporului în celulă vegetativă activă. Germinarea este declanşată de umiditate, o temperatură apropiată de optimum termic al speciei, dar şi de şocul termic (încălzirea bruscă la 60- 800 C ), Ph-ul cuprins între 6 şi 8, prezenţa în mediu a glucozei, aminoacizilor, nucleozidelor şi a altor substanţe utile metabolismului bacterian. Germinarea biologic distincte:

se realizează în două faze morfologic şi

♦ iniţierea germinării, când sporul se măreşte în volum consecutiv absorbţiei de apă şi elimină în mediu dipicolinat de calciu, peptidoglican şi alte substanţe de origine sporală, pierzându-şi majoritatea însuşirilor specifice. ♦ distrugerea învelişurilor sporale şi trecerea în faza vegetativă prin reluarea activităţii metabolice şi redobândirea tuturor însuşirilor morfologice şi fiziologice caracteristice celulei vegetative. Au o acţiune inhibantă asupra germinării, apa distilată, glicerina, şi unele antibiotice care interferează cu sinteza peretelui celular, a proteinelor şi a acizilor nucleici. 201

BACTERIOLOGIE GENERAL|

2.3.3.6. Implicaţiile sporogenezei în patologie şi epidemiologie Bacteriile sporogene se caracterizează printr-o existenţă saprofită. Nişa ecologică naturală a speciilor sporulate patogene pentru om şi animale este solul. De aici, bacteriile pot ajunge accidental în organism, provocând îmbolnăviri cunoscute sub denumirea generică de infecţii telurice (antraxul, tetanosul, cărbunele emfizematos), sau în alimente, unde elaborează toxine determinâd intoxicaţii (Clostridium botulinum) şi toxiinfecţii alimentare (Bacillus cereus, Clostridium perfringens).

2.3.4. GRUPE DE BACTERII CU PARTICULARIT|ŢI MORFOFIZIOLOGICE

2.3.4.1. Rickettsiile Microorganismele din acest grup au fost considerate o lungă perioadă de timp ca având o poziţie intermediară între bacterii şi virusuri, datorită dimensiunilor reduse şi parazitismului intracelular obligatoriu. Studiul ultrastructurii şi al fiziologiei rickettsiilor au convins pe sistematicieni să le încadreze definitiv în rândul bacteriilor, pe baza următoarelor argumente: ♦ conţin ambii acizi nucleici; ♦ au un echipament enzimatic propriu; ♦ au aceleaşi componente structurale (citoplasmă, aparat nuclear, membrană citoplasmatică şi perete celular); 202

BACTERIOLOGIE GENERAL|

♦

nu sunt sintetizate de celula pe care o parazitează, asemănător virusurilor, ci se multiplică prin diviziune simplă binară. Parazitismul intracelular obligatoriu al acestor bacterii s-ar datora, fie permeabilităţii excesive a membranei citoplasmatice care nu poate reţine unii metaboliţi esenţiali (defect compensat prin dezvoltarea intracelulară), fie dificultăţilor de acoperire a nevoilor energetice prin mijloacele enzimatice proprii, fiind deci paraziţi de energie. Primul reprezentant al acestui grup de germeni a fost izolat şi descris de cercetătorul american H o w a r d T e y l o r R i c k e t t s în 1910, ca agent etiologic al unei boli la om, transmisibilă prin căpuşi, cunoscută sub denumire de ,,febra pătată a munţilor stâncoşi“. In cursul experienţelor, R i c k e t t s s-a infectat cu acestă bacterie şi a murit la vârsta de numai 40 de ani. In 1915, cercetătorul austriac Stanislas Provaz e k izolează şi descrie al doilea reprezentant al grupului rickettsiilor, care produce la om tifosul exantematic, având parte în cursul lucrărilor de aceeaşi soartă tragică ca şi R i c k e t t s. Alte entităţi morbide produse de aceşti germeni sunt tifosul endemic cauzat de R.mooseri şi febra Q ( engl. query= necunoscut, bizar ) produsă de Coxiella burneti. Pentru a cinsti memoria tânărului savant a cărui viaţă a fost sacrificată pe altarul ştiinţei, toate microorganismele cu caractere asemănătoare agentului febrei pătate a munţilor stâncoşi au primit denumirea generică de ,, rickettsii”. Ele au fost încadrate în ordinul Rickettsiales, care cuprinde trei familii, 13 genuri şi peste 50 de specii. Morfologic, rickettsiile sunt bacterii mici (0,1 – 2 µm) de formă bacilară sau cocoidă, imobile, necapsulate, nesporulate, Gram negative. Deoarece prin metoda Gram se colorează slab, având o uşoară acidorezistenţă, rickettsile se colorează în mod 203

BACTERIOLOGIE GENERAL|

obişnuit prin metode speciale: Stamp, Machiavello, Giemsa, Castaneda ş.a.. Fiind obligatoriu parazite, rickettsiile se găsesc numai în organismele infectate. O caracteristică a acestor bacterii este transmiterea lor la om prin intermediul insectelor hematofage (purice, păduche, căpuşă), care constituie vectori activi şi rezervor natural . Rickettsiile se cultivă, la fel ca virusurile, pe ouă embrionate de găină şi pe culturi celulare. Vârsta optimă a embrionilor este de 6-9 zile iar calea de inoculare cea mai eficientă este cea intravitelină, deoarece provoacă moartea embrionilor în 2-4 zile. Controlul multiplicării rickettsiilor se face în frotiuri din sacii vitelini, în care se observă un număr mare de germeni.

2.3.4.2. Chlamidiile Chlamidiile sunt bacterii parazite obligatoriu intracelular, deoarece sunt incapabile să producă compuşi macroergici de tip ATP pentru stocarea energiei. Prin urmare, asemănător rickettsiilor, chlamidiile sunt paraziţi de energie. (Zarnea G., 1983; Răducănescu H. şi col., 1986; Răpuntean Gh., Răpuntean S., 1999; Măzăreanu C., 1999). Ele alcătuiesc ordinul Chlamidiales, care conţine o singură familie – Chlamidiaceae, cu două specii: Chlamidia trachomatis şi Chlamidia psittaci. Morfologic, se prezintă sub formă cocoidă şi dimensiuni de 0,2 – 1,5 µm.

204

BACTERIOLOGIE GENERAL|

Chlamidiile au un ciclu vital specific, caracterizat prin alternanţa a două stadii: unul infecţios şi altul reproductiv (fig. 30).

Ciclul de multiplicare la Chlamidia psittaci ( după Moulder, 1964, cit. de Zarnea G., 1983) Fig.30

Ciclul este iniţiat de forme extracelulare infecţioase numite corpi elementari, care, ,,in vitro”, au o viaţă latentă. Aceştia au forma unor sferule electronoopace de 0,2 – 0,5 µm, cu un perete celular rigid şi un nucleoid compact, nefuncţional. în celulelegazdă, în care pătrund prin endocitoză, corpii elementari suferă un proces de activare, însoţit de trecerea nucleoidului, din forma compactă într-o reţea fibrilară laxă, accesibilă enzimelor de transcriere şi replicare. Ca urmare a activării, corpii elementari se 205

BACTERIOLOGIE GENERAL|

divid, dând naştere formelor vegetative metabolic active numite corpi reticulaţi, lipsite de infecţiozitate. Corpii reticulaţi cresc în dimensiuni (0,8 – 1,5 µm), peretele celular devenind subţire şi fragil, apoi se multiplică prin diviziuni binare repetate, prin fragmentare sau înmugurire, rezultând mai mulţi corpi mici, care, prin maturare se transformă în noi corpi elementari. Aceştia se eliberează din celula parazitată consecutiv lizei pereţilor celulari, astfel încât, după aproximativ 30 de ore de la debutul infecţiei, ciclul se repetă. Patogenitatea chlamidiilor se manifestă printr-o serie de boli cauzate omului şi animalelor: Chlamidia trachomatis produce diferite infecţii la om (trahom, conjunctivite, uretrite) iar Chlamidia psittaci cauzează psitacoza şi ornitoze la om şi păsări, pneumonii (ovine, bovine, porcine), poliartrite (viţel, porc), enterite, infecţii genitale, etc.

2.3.4.3. Micoplasmele Descrise iniţial sub denumirea de germeni PPLO (,,pleuropneumonia like organisms” = organisme asemănătoare cu agentul pleuropneumoniei bovideelor), micoplasmele sunt bacterii lipsite de perete celular. Datorită acestei caracteristici, unică în lumea bacteriilor, ele au fost incluse într-un filum distinct – Tenericutes, cu o clasă Mollicutes şi un ordin – Mycoplasmatales. Denumirea de ,,Mollicutes” este inspirată de proprietatea esenţială a învelişului acestor germeni, care, din cauza absenţei peretelui celular, este moale şi elastic (lat. mollis = moale; cutis = piele). 206

BACTERIOLOGIE GENERAL|

Micoplasmele manifestă o plasticitate morfologică deosebită (polimorfism), în sensul că, în cadrul aceleeaşi specii forma celulelor poate varia mult: celule cocoide, bacilare, filamentoase (fig. 31). Faptul că forma filamentoasăcaracteristică miceţilor – este frecvent întâlnită la aceste bacterii, a sugerat denumirea ordinului în care ele au fost încadrate. Fig. 31 Micoplasma pneumoniae (după Tortora şi col., 1989, citat de Măzăreanu C.,1999)

Această varietate nu împiedică însă diferenţierea speciilor, deoarece, cultivate în condiţii de mediu bine controlate, fiecare specie se prezintă cu o morfologie caracteristică (fig. 32). Celulele micoplasmelor sunt foarte mici, variind între 0,1 – 0,25 µm. în funcţie de specie, sunt imobile sau se deplasează prin alunecare (glisare), rotaţie, flexiune, sau cu ajutorul unui cil (Zarnea G.,1983). Ultrastructura lor este foarte simplă, fiind alcătuite numai din structurile esenţiale pentru creştere şi multiplicare: membrana citoplasmatică, ribozomi şi o moleculă de ADN dublu catenar. Structura, dimensiunile reduse şi lipsa peretelui celular conferă micoplasmelor următoarele proprietăţi: sensibilitate osmotică, rezistenţă la antibioticele care acţionează asupra peretelui celular, capacitatea de a traversa filtrele impenetrabile pentru bacteriile cu perete celular. Multiplicarea pare să îmbrace mai multe modalităţi: diviziune, înmugurire, fragmentarea filamentelor. 207

BACTERIOLOGIE GENERAL|

Pe mediile artificiale, micoplasmele se dezvoltă dacă se adaugă în compoziţia acestora steroli şi alţi factori de creştere. Coloniile sunt foarte mici (sub 1 mm diametru), vizibile doar cu lupa binoculară şi au aspectul de,, ouă ochiuri”. în condiţii naturale, micoplasmele sunt frecvent parazite, fenomen facilitat de natura chimică a membranei citoplasmatice (similară membranelor gazdei), care face ca celulele bacteriene să nu fie recunoscute de fagocite ca ,,nonself”.Unele micoplasme s-au dovedit patogene, fiind considerate agenţii etiologici ai unor entităţi clinice bine conturate (pleuropneumonia contagioasă a bovinelor,

Fig.

32

Două specii de micoplasme: A. Micoplasma genitalium; B. Spiroplasma sp., (linia = 0,1 µm) – după Măzăreanu C., 1999.

agalaxia contagioasă a oilor şi caprelor, boala cronică respiratorie la găini, etc.) şi a unor infecţii cu diverse localizări: mamite, poliartrite, conjunctivite, septicemii, etc. Practic, sunt afectate toate speciile de animale domestice şi sălbatice, păsările şi animalele marine.

208

BACTERIOLOGIE GENERAL|

2.3.4.4. Formele ,,L”. Formele ,,L” ale bacteriilor au fost descoperite de Klieneberger Nobel în 1935 la Institutului Lister (Londra), de unde şi denumirea de forme ,,L”. Studiind o tulpină de Streptobacillus moniliformis izolată din pulmonul unor şoareci de laborator, cercetătoarea a constatat coexistenţa în culturi a două forme morfologice distincte: forme bacilare caracteristice speciei şi forme granulare mici pe care le numeşte forme ,,L” şi le consideră iniţial germeni proveniţi dintr-o contaminare exogenă. Ulterior însă, asemenea forme au fost descrise şi la alte specii aparţinând genurilor Salmonella, Proteus, Escherichia, Streptococcus, Staphylococcus, Shigella, Bacillus, Clostridium, Neisseria, etc., dovedindu-se că ele reprezintă variante morfologice lipsite de perete celular. Această concluzie s-a bazat pe observaţia că ambele forme, atât cele bacilare cât şi cele granulare, au proprietăţi biochimice şi serologice identice (Zarnea G.,1983; Grecianu Al., 1986). Formele ,,L” pot să apară spontan sau prin inducţie cu substanţe care distrug peretele celular sau inhibă sinteza acestuia, cum sunt lizozimul şi penicilina. în geneza lor au mai fost incriminaţi diferiţi alţi factori nefavorabili, ca: radiaţiile, anticorpii specifici, bacteriofagii, substanţe cu un anumit grad de nocivitate (glicina, cromul hexavalent, etc.). Pe lângă particularităţile morfologice, lipsa peretelui celular conferă formelor ,,L” şi alte caractere distinctive faţă de specia de origine şi anume : - au o sensibilitate crescută la variaţiile de presiune osmotică; - nu se colorează prin metoda Gram, ci cu soluţie Giemsa; - sunt rezistente la antibioticele care acţionează asupra peretelui celular, în special la penicilină, dar sunt mult 209

BACTERIOLOGIE GENERAL|

mai sensibile faţă de antibioticele care acţionează la nivelul citoplasmei bacteriene; - sunt lipsite de antigenii ,,H”, ,,K” şi de receptorii pentru bacteriofagi; - coloniile au aceeaşi morfologie (mici, cu diametrul de 23 mm, slab delimitate, încrustate în geloză), indiferent de specia bacteriană din care provin; - când derivă din specii patogene, au în general o patogenitate mult mai redusă; Formele ,,L” au o importanţă de ordin epidemiologic prin rezistenţa lor faţă de antibiotice, infecţiile în care intervin fiind cronice şi cu tendinţă la recădere. Deoarece micoplasmele au multiple analogii cu formele ,,L”, iniţial acestea au fost considerate ca fiind forme ,,L” stabilizate (ireversibile la forma iniţială), apărute spontan în natură ca rezultat al unei mutaţii. Studiile de genetică moleculară au infirmat însă această ipoteză, pe baza lipsei de omologie a ADN.

2.3.4.5 Spirochetele Spirochetele se diferenţiază de restul bacteriilor prin următoarele caracteristici: 1. structura internă helicoidală, care le imprimă forma spiralată; 2. raportul foarte mare dintre lungime (3-500 µm) şi diametrul transversal (18 nm), fiind atât de subţiri încât străbat membranele filtrante impermeabile pentru celelalte bacterii; 3. mobilitatea accentuată datorată endoflagelilor. Corpul celulei bacteriene este constituit din următoarele elemente (fig. 33): cilindrul protoplasmatic, flagelii periplasmici şi teaca externă. 210

BACTERIOLOGIE GENERAL|

Cilindrul protoplasmatic (protoplast helical), învelit de membrana citoplasmatică şi peretele celular, are o organizare internă de tip procariot, identică din punct de vedere structural şi biochimic cu a bacteriilor clasice. în jurul cilindrului protoplasmic helical sunt înfăşurate nişte structuri filamentoase numite fibrile periplasmice sau filamente axiale, al căror număr variază de la o specie la alta (între 2 şi 100) şi care sunt asemănătoare flagelilor, ca structură, compoziţie chimică şi funcţie.

Fig. 33 Structura spirochetelor a) amplasarea şi înfăşurarea filamentelor axiale; b) secţiune transversală printr-o spirochetă cu un număr mare de filamente axiale (după Măzăreanu C., 1999). 211

BACTERIOLOGIE GENERAL|

Ansamblul reprezentat de cilindrul protoplasmatic şi fibrilele periplasmice este învelit de o membrană subţire, triplustratificată, numită teacă externă, echivalentă membranei externe a peretelui celular la bacteriile Gram negative Datorită prezenţei acestei formaţiuni, fibrilele periplasmice, spre deosebire de cilii propriu-zişi, sunt structuri endocelulare, localizate în spaţiul delimitat de peretele celular şi teacă. Ele sunt fixate cu un capăt la un pol al celulei, celălalt rămânând liber. Capetele libere de la cele două smocuri de filamente axiale depăşesc zona ecuatorială a celulei şi se întrepătrund, dând impresia unui filament continuu. La unele specii, filamentele depăşesc extremităţile cilindrului protoplasmatic, devenind parţial flageli externi. Spirochetele sunt mobile datorită filamentelor axiale, care imprimă corpilor bacterieni trei tipuri de mişcare: rotaţie în jurul axului longitudinal, flexie şi translaţie. Spirochetele se întâlnesc în medii foarte variate: ape curgătoare, lacuri, mări, ape uzate, substanţe organice în descompunere, corpul animalelor şi omului. Sunt aerobe, facultativ anaerobe sau anaerobe. Nu sporulează şi se înmulţesc prin diviziunea binară. Un număr important de specii sunt patogene pentru om şi/sau animale. Ele fac parte din genurile Treptonema (T. pallidum – agentul etiologic al sifilisului), Serpulina (S. hyodysenteriae –agentul etiologic al dizenteriei treponemice a porcului), Borrelia (B. anserina – patogenă pentru păsări) şi Leptospira (L. interrogans – pluripatogenă).

2.3.4.6. Actinomicetele. Actinomicetele reprezintă un grup de bacterii polimorfe, frecvent filamentoase, cu tendinţă la ramificare, Gram pozitive (fig. 34). Datorită prezenţei miceliului la majoritatea speciilor şi a sporilor de diseminare, poziţia lor sistematică a fost controversată, 212

BACTERIOLOGIE GENERAL|

fiind considerate iniţial fungi. încadrarea taxonomică a actinomicetelor în clasa Bacteria, ordinul Actinomycetales, familia Actinomycetaceae, s-a efectuat pe baza unor caractere, ca: structura de tip procariot, dimensiunea inferioară fungilor (diametrul transversal al filamentelor este de aproximativ zece ori mai mic), compoziţia chimică (lipsa celulozei şi a chitinei din structura peretelui celular), activitatea metabolică (prezenţa unor forme strict anaerobe şi cu nutriţie de tip chimioautotrof), sensibilitatea la acţiunea unor fagi de tip bacterian, sensibilitatea la antibioticele antibacteriene şi rezistenţa la celeMorfologic, antifungice, etc. actinomicetele prezintă o mare varietate în funcţie de specie, materialul în care se găsesc şi vârsta culturii. Actinomyces bovis, spre exemplu, în culturi are aspectul unui bacil mic şi fin, pe când în frotiurile din leziuni se prezintă sub forma unor filamente lungi şi subţiri, uneori ramificate şi cu extremităţile dilatate. Pe mediile de cultură, majoritatea speciilor formează colonii complexe alcătuite din micelii multinucleate, ramificate. Fig 34. Aspectul filamentos al actinomicetelor ( Actinomyces israellii) Ele se diferenţiază morfologic şi funcţional în regiuni cu rol vegetativ şi regiuni cu rol reproductiv. Majoritatea speciilor de actinomicete produc pigmenţi de diferite culori: galben, portocaliu, roşu, violet, albastru, verde, 213

BACTERIOLOGIE GENERAL|

cenuşiu. Uneori pigmentul difuzează în mediu, care, la rândul lui, poate influenţa pigmentogeneza prin compoziţie. Sporii actinomicetelor, numiţi şi actinospori, au diferite forme: sferici, ovali, alungiţi, cilindrici, unii prezentând şi diferite ornamentaţii (ţepi, butoni, peri). După modul de formare, ei se pot grupa în trei tipuri principale: sporangiospori, endospori şi spori hifali. Nutriţia actinomicetelor este omnivoră, permiţându-le să se dezvolte pe substraturi dintre cele mai diferite (lipide, parafine, fenoli, lignină, taninuri, cauciuc, etc.). Majoritatea speciilor sunt saprofite în sol, pe resturi vegetale, plante, bălegar, în apa şi nămolul lacurilor, având un rol important în mineralizarea rezidurilor organice. Pe medii de cultură artificiale, aceste bacterii sintetizează substanţe din grupul vitaminelor (B1, B2, B12, biotină, acid folic, acid pantotenic, acid nicotinic) şi diferiţi compuşi care dau culturilor un miros caracteristic de pământ, de camfor sau de fructe. Dintre actinomicete, foarte cunoscut şi studiat pentru importanţa sa în practica medicală este genul Streptomyces. El cuprinde un mare număr de specii producătoare de anlibiotice. De altfel, peste 50% dintre actinomicetele izolate din sol produc antibiotice, iar cca. 60% dintre antibioticele cunoscute sunt produse de actinomicete. Unele actinomicete sunt patogene pentru om, animale şi plante (Zarnea G.,1983; Răpuntean Gh. şi col., 1999). Streptomyces scabies produce râia comună la cartofi, Actinomyces bovis este considerat agentul etiologic al actinomicozei bovine (o osteomielită supurativă localizată la nivelul maxilarelor), A. vîscosus şi A. hordeovulneris sunt patogene pentru câini la care provoacă abcese cu diverse localizări, A. israelii este patogenă în principal pentru om.

214

BACTERIOLOGIE GENERAL|

2.3.5. GENETICA BACTERIANĂ Genetica este ramura biologiei care studiază două fenomene biologice fundamentale: ereditatea şi variabilitatea speciilor. Ereditatea este însuşirea biologică generală a vieţuitoarelor de a conserva proprietăţile structurale şi funcţionale ce caracterizează specia şi de a le transmite nemodificate din generaţie în generaţie. Variabilitatea reprezintă latura opusă stabilităţii ereditare, care duce la apariţia unor diferenţe între descendenţi şi genitori, asigurând evoluţia speciilor. Aşezarea geneticii pe bazele ei actuale se sprijină, în principal, pe studiile efectuate pe bacterii şi virusuri, cu toate că aceste microorganisme au intrat relativ târziu în sfera de preocupări a geneticienilor. Experimentul microbiologic cu semnificaţie pentru genetica modernă, efectuat în 1928 de G r i f f i t h şi reluat în 1944 de O.T. A v e r y şi colaboratorii (vezi fenomenul de transformare), a demonstrat pentru prima dată rolul acizilor nucleici de purtători ai informaţiei genetice. Din momentul acestei descoperiri epocale, geneticienii au realizat că utilizarea bacteriilor ca model experimental în studiile de genetică prezintă câteva avantaje majore şi anume: ♦ simplitatea şi rapiditatea efectuării experimentului; ♦ numărul imens de indivizi într-un volum foarte mic (miliarde / ml); ♦ durata foarte redusă a intervalului dintre două diviziuni (15-20 de minute), care face ca în 24 de ore să se succeadă 72 de generaţii; ♦ posibilitatea detectării rapide a variaţiilor; 215

BACTERIOLOGIE GENERAL|

♦ accesibilitatea investigării şi manipulării materialului genetic. Astfel, caracterul rudimentar de organizare a microorganismelor, considerat cândva o piedică în efectuarea experienţelor de genetică, a devenit un argument. Ca urmare, genetica microbiană s-a dezvoltat rapid şi a devenit o ştiinţă de avangardă a biologiei, conturând şi fundamentând, de fapt, aproape toate cunoştinţele actuale de genetică moleculară. Legea unităţii lumii vii, în diversitatea formelor ei de manifestare, a dobândit prin cercetările moderne de genetică microbiană şi moleculară, o bază biologică de interpretare profund ştiinţifică şi obiectivă.

2.3.5.1. Ereditatea la bacterii şi mecanismele ei 2.3.5.1.1. Compoziţia moleculară a materialului genetic Suportul material al eredităţii este acidul dezoxiribonucleic (ADN) care constituie genomul bacterian. El este constituit din două lanţuri (catene) polinucleotidice paralele, legate între ele prin punţi de hidrogen astfel încât formează un dublu helix cu spire regulate. Fiecare nucleotid este format dintr-o pentoză (dezoxiriboza), o bază azotată purinică (adenina, guanina) sau pirimidinică (timina, citozina) şi un radical fosforic (fig.35).

216

BACTERIOLOGIE GENERAL|

Fig.35

Structura şi orientarea celor două catene polinucleotidice ale AND (după Tamaş V., şi col., 1981)

In structura unui lanţ polinucleotidic, succesiunea bazelor azotate se poate face într-o infinitate de variante, în timp ce legătura dintre polinuclotidele adiacente este în mod constant de tip covalent 3' – 5' fosfodiester. Aceste legături se realizează între o grupare OH din poziţia 3' a dezoxiribozei aparţinând unui mononucleotid şi gruparea OH situată în poziţia 5' a dezoxiribozei din mononucleotidul adiacent, prin intermediul radicalului fosforic (fig. 36). Catenele dublului helix sunt reunite prin punţi de hidrogen care leagă gruparea aminată a bazei situată pe un lanţ cu cea hidroxilică a bazei de pe lanţul complementar. împerecherea bazelor este guvernată de ,,legea complementarităţii bazelor azotate” conform căreia, o purină se leagă în mod constant de o pirimidină şi invers. Specificitatea acestui mod de legare are un caracter riguros şi constă în faptul că adenina se leagă întotdeauna cu timina prin două 217

BACTERIOLOGIE GENERAL|

punţi de hidrogen, iar guanina de citozină prin trei punţi de hidrogen. Rezultă astfel patru tipuri de legături posibile: A - T, T - A, G - C şi C - G. Raportul A + T/ G + C este constant pentru ADN-ul unei specii, dar variază de la o specie la alta, constituind un criteriu taxonomic de bază.

2.3.5.1.2. Unităţile funcţionale ale materialului genetic la bacterii Secvenţa bazelor azotate pe traiectul longitudinal al catenei ADN stă la baza unităţilor funcţionale ale materialului genetic. Gena este secvenţa de ADN care, transcrisă într-una sau mai multe molecule de ARNm, este capabilă să controleze sinteza unei proteine responsabilă pentru un anumit caracter. Fiecare genă are o poziţie determinată pe cromozom, numită locus. Un locus poate fi ocupat de o singură genă (de tip nonalelic) sau de gene alternative numite alele, care controlează exprimări diferite ale aceluiaşi caracter. în cadrul genei se pot distinge două unităţi infragenice: cistronul şi poziţia.

218

BACTERIOLOGIE GENERAL|

Fig.36 Structura unor fragmente din macromolecula de ADN şi ARN.

Cistronul este o secvenţă funcţională din genă la nivelul căreia se poate transcrie o moleculă de ARN-m responsabilă pentru 219

BACTERIOLOGIE GENERAL|

sinteza unei proteine date. In majoritatea cazurilor, o genă este constituită dintr-un singur cistron. Poziţia (mutonul, reconul) este cea mai mică secvenţă dintrun cistron la nivelul căreia poate fi localizată o mutaţie sau un fenomen de recombinare genetică. Operonul este un complex funcţional de gene care acţionează sub controlul aceleeaşi gene operatoare şi reglatoare. Cromozomul, care la bacterii se identifică cu genomul, reprezintă totalitatea materialului genetic nuclear (nucleoidul). Plasmidele, constituind în ansamblul lor plasmonul, sunt molecule de ADN extracromozomale, a căror replicare este independentă de cromozom.

Genomul bacterian (nucleoidul, cromozomul) Genomul bacterian este constituit dintr-o singură moleculă de ADN dublu catenar, cu o configuraţie circulară, având lungimea de 1100-1400 micrometri şi diametrul de 25Å. Masa moleculară a ADN-ului nuclear este de ordinul 109 daltoni, permiţându-i stocarea informaţiei pentru sinteza a 5000 – 6000 molecule proteice diferite. Comparativ cu celula eucariotă, cantitatea de material genetic din celula bacteriană este de 1000-22000 de ori mai mică. întrucât molecula de ADN depăşeşte de mai multe sute de ori lungimea celulei bacteriene, ea este pliată pe baza răsucirii şi superrăsucirii în jurul propriului ax, alcătuind un corp cromatic compact de aproximativ 1500 de ori mai mic decât propria sa dimensiune în stare desfăşurată. In mod normal, bacteriile aflate în faza de repaos (în culturi staţionare şi vechi) au un singur cromozom, deci sunt uninucleate. In faza de creştere exponenţială a culturilor pe medii optime, celulele bacteriene pot fi multinucleate având doi sau mai mulţi cromozomi, ca rezultat al unei lipse de sincronizare între ritmul mai accelerat de replicare a ADN-ului şi ritmul normal de diviziune celulară. 220

BACTERIOLOGIE GENERAL|

Fig.37 Mecanismul replicării moleculei de ADN. Săgeţile negre curbate indică direcţiile de rotaţie ale catenelor (după Zarnea G.,1970).

Apariţia bacteriilor multinucleate se mai poate datora acţiunii unor factori care interferează diviziunea celulară, cum este spre exemplu penicilina, care blochează sinteza componentei muramice 221

BACTERIOLOGIE GENERAL|

a peretelui celular. Acesta nu mai poate participa la formarea septului transversal de diviziune şi astfel apar celulele filamentoase sau globuloase cu mai mulţi nuclei. Indiferent de numărul nucleilor prezenţi la un moment dat în celulă, bacteriile sunt organisme haploide deoarece nucleii provin dintr-un singur cromozom parental şi sunt genetic identici. Multiplicarea cromozomului şi transmiterea echivalentă a informaţiei genetice la celulele-fiice sunt asigurate prin replicarea semiconservativă a macromoleculei de ADN (fig. 37). Chiar şi atunci când celula bacteriană primeşte material genetic exogen prin transfer de la o altă celulă, diploidia nu este decât parţială şi tranzitorie. Cu ajutorul mijloacelor moderne de cercetare s-au putut identifica genele componente şi locusul fiecăreia pe cromozomul bacterian, ajungându-se pe această cale la alcătuirea de hărţi genetice detaliate ale unor specii bacteriene. Escherichia coli – specia de referinţă în cercetările de genetică - este bacteria cu cele mai multe gene cartografiate (fig.38). Cromozomul bacterian poartă informaţia genetică esenţială pentru existenţa bacteriei, informaţie codificată de genele care controlează metabolismul energetic şi de biosinteză, creşterea, diviziunea şi reglarea diferitelor activităţi celulare.

Plasmidele (Plasmonul) Plasmidele sunt molecule mici de AND dublu catenar extracromozomial, cu o configuraţie circulară. Ele reprezintă sub aspect cantitativ, aproximativ 1% din masa genomului Plasmidele pot fi clasificate pe baza mai multor criterii.

a) în funcţie de capacitatea lor de integrare în cromozom, se împart în două categorii: - plasmide propriu-zise, care au întotdeauna o existenţă autonomă şi sunt neintegrabile în cromozom, şi 222

BACTERIOLOGIE GENERAL|

-

epizomi, care pot avea o existenţă autonomă, de fază plasmidică, dar care se pot integra temporar în cromozom. Integrarea se realizează prin deschiderea ambelor formaţiuni circulare – plasmidă şi cromozom – urmată de reunirea lor prin extremităţi într-un singur dublu helix inelar.

Fig.38 Harta cromozomului la E.coli. Distanţele sunt măsurate în minute necesare transferului prin conjugare. Sunt menţionate câteva locusuri din cele câteva sute cunoscute: locusuri ale genelor de sinteză a treoninei (thr),leucinei (leu), etc.,de utilizare a unor zaharuri ca lactoza (lac), galactoza (gal), de rezistenţă cromozomală la streptomicină (str), acid nalidixic (nal). în interior sunt marcate câteva din punctele de integrare a factorului F, dând naştere la diverse tulpini Hfr; orientarea săgeţii arată ordinea în care sunt transferate genele cromozomale în conjugare (după Ivanof A.şi col., 1982).

223

BACTERIOLOGIE GENERAL|

b) Pe baza posibilităţii de a se transfera de la o celulă bacteriană la alta prin procesul de conjugare, plasmidele se împart în: – plasmide neconjugative sau criptice, incapabile de a se transfera prin conjugare, şi – plasmide conjugative (conjugoni) care au capacitatea de a trece de la o celulă bacteriană la alta prin conjugare. Plasmidele, ca şi cromozomul bacterian, sunt ataşate de membrana citoplasmatică prin intermediul mezozomilor şi sunt dotate cu proprietăţi autoreplicante. In stare autonomă replicarea lor este independentă şi necorelată cu replicarea genomului, iar în stare integrată se replică simultan cu acesta. Prezenţa plasmidelor nu este esenţială pentru definirea genotipului şi nici pentru supravieţuirea bacteriilor în condiţii normale de mediu, deoarece ele nu codifică desfăşurarea activităţilor vitale ale celulei. Plasmidele poartă o informaţie genetică accesorie, ,,de confort”, care permite bacteriilor o mai bună adaptare la condiţiile de mediu noi sau modificate, motiv pentru care mai sunt numite minicromozomi, material genetic auxiliar sau suplimentar. Prin urmare, plasmidele pot lipsi, sunt transmise de la o celulă bacteriană la alta, sau pot fi pierdute, fără ca celula de origine să sufere. Principalele tipuri de plasmide sunt: plasmidele F (de fertilitate), plasmidele R (de rezistenţă faţă de antibiotice), plasmidele ,,col”(de colicinogeneză sau bacteriocinogeneză), plasmidele ,,ent”(de enterotoxicitate) şi genomul fagic integrat. Plasmidele F. Identificarea plasmidelor F, numite şi factori de fertilitate sau de sex, este strâns corelată cu descoperirea de către L e d e r b e r g şi T a t u m (1946) a fenomenului de conjugare. 224

BACTERIOLOGIE GENERAL|

Prezenţa plasmidelor F într-o celulă bacteriană îi conferă capacitatea de donor de material genetic, deoarece ele codifică sinteza pilului sexual sau conjugativ, prin lumenul căruia are loc transferul. Plasmidele F sunt plasmide mari (20 x 10 6 daltoni), trec cu uşurinţă din faza plasmidică în faza epizomală şi invers şi sunt conjugative. în afară de transferul lor propriu, plasmidele F sunt capabile să ,,mobilizeze” în vederea transferului şi alte categorii de material genetic, cum ar fi unele plasmide care în starea lor obişnuită sunt neconjungative şi fragmente de cromozom. în funcţie de prezenţa sau absenţa plasmidelor F în celulă, de faza plasmidică sau epizomală în care acestea se află, celulele bacteriene se împart în: - F - lipsite de plasmide F, echivalente unor celule femele, care sunt receptoare de material genetic; + - F - cu factorul F în faza plasmidică, echivalente unor celule mascule donatoare de material genetic prin transmiterea factorului F ; - Hfr (High frequency of recombination = cu mare frecvenţă de recombinare) – cu plasmide F în faza epizomală, considerate supermascule având în vedere posibilitatea lor de a transfera un număr variabil de gene cromozomale, uneori o replică a cromozomului în întregime ; - F’ – celulă masculă purtătoare de factor F în faza plasmidică, în urma reversiei lui din faza epizomală. în acest caz, factorul F conţine secvenţe din materialul genetic cromozomal pe care le va transfera celulelor receptoare. Harta genetică a plasmidelor F este constituită din aproximativ 12 gene, posibilitatea de transfer prin conjugare fiind controlată de genele ,,tra”, care codifică sinteza pilul sexual prezent la bacteriile F+. 225

BACTERIOLOGIE GENERAL|

Plasmidele F îşi exprimă cu o frecvenţă relativ redusă capacitatea de transfer, datorită controlului de tip represiv căruia le sunt supuse genele ,,tra”. Derepresarea acestora şi iniţierea conjugării este de regulă rezultatul unei mutaţii plasmidice. Bacteriile F+ sunt, de cele mai multe ori, incapabile de a primi material genetic de la alţi donori - proprietate numită “excluzia intrării”. Plasmidele R (de rezistenţă) sunt implicate în determinismul genetic al rezistenţei extracromozomale la antibiotice. Unele sunt conjungative, iar altele neconjungative. Plasmidele R conjungative se transmit cu uşurinţă de la o celulă bacteriană la alta, fenomen cunoscut sub denumirea de ,,R- infecţie”. Ele sunt mai mari decât cele neconjugative, având o masă moleculară de aproximativ 20 – 80 x 106 daltoni, iar genle care le compun sunt grupate în 3 ansambluri funcţionale: ♦ Genele care condifică capacitatea autoreplicantă (replicatorul); ♦ genele care determină rezistenţa faţă de antibiotice (determinanţii r ). ♦ genele care controlează posibilitatea de transfer, constituind factorul RTF (,,rezistance transfer factor”), absent la plasmidele R neconjugative. Această secvenţă de gene se poate desprinde de plasmida R, devenind independentă şi comportându-se asemănător cu o plasmidă F. Numărul determinanţilor r poate varia de la 1 până la un număr care asigură rezistenţa la toate antibioticele utilizate în terapie la un moment dat.

Prin urmare, antibiorezistenţa indusă bacteriilor de prezenţa factorului R este de tip ,, multi steep “, deosebindu-se de rezistenţa cromozomală la antibiotice (consecutivă unei mutaţii), care este de tip ,,one- steep”(faţă de un singur antibiotic). In mod obişnuit, plasmidele de rezistenţă conţin până la 6 determinanţi r , pentru

226

BACTERIOLOGIE GENERAL|

notarea cărora se utilizează prescurtările uzuale pentru antibiotice, urmate de litera ,,r”. Prima hartă genetică a unei plasmide R (fig. 39) a fost întocmită în anul 1963 de către cercetătorul de origine japoneză W a t a n a b e, cel care a demonstrat că rezistenţa multiplă faţă de antibiotice este infecţioasă, în sensul că ea se poate transmite de la o celulă bacteriană la alta.

Fig.39 Harta genetică a unui factor R, cuprinzând determinanţii genetici ai rezistenţei la antibiotice şi factorul de transfer al rezistenţei (RTF) – după Watanabe cit. de Zarnea G., 1970.

Transferul factorului R se realizează prin conjugare (fig. 40) sau, în cazul plasmidelor neconjugative, prin transducţie mediată de fagii cu dimensiuni mari. Transferul prin conjugare se realizează 227

BACTERIOLOGIE GENERAL|

însă în egală măsură de la donatori F + şi F– , necesitând sinteza unei substanţe cu rol în formarea punţilor de conjugare. Structura morfologică a acestor punţi este asemănătoare cu cea a sexpililor de conjugare.

228

BACTERIOLOGIE GENERAL|

Fig.40 Transmiterea rezistenţei infecţioase la antibiotice, implicând transferul factorului R prin conjugare (după Zarnea G.,1970). 229

BACTERIOLOGIE GENERAL|

230

BACTERIOLOGIE GENERALA

Spre deosebire de antibiorezistenţa dobândită prin mutaţie, care nu apare decât după prima diviziune celulară, exprimarea fenotipică a antibiorezistenţei prin factor R are loc imediat după transfer: instalarea rezistenţei la sulfamide necesită doar 2 minute, la cloramfenicol 4 minute, la tetracicline 5 minute şi la streptomicină 11 minute. De asemenea, rezistenţa infecţioasă la antibiotice se propagă în populaţia bacteriană cu o frecvenţă ridicată, care contrastează vizibil cu frecvenţa joasă a instalării rezistenţei prin mutaţie (o celulă dintr-o populaţie bacteriană de 107 – 108 celule). Plasmidele R se integrează rareori în cromozom, însă între ele au loc deseori fenomene de reasortare care se realizează prin inserţia sau desprinderea de elemente genetice mobile. între diferitele plasmide R pot exista relaţii de incompatibilitate, exprimate prin imposibilitatea coexistenţei lor în celulele aceleeaşi specii bacteriene. Această constatare a dus la clasificarea plasmidelor în grupe de incompatibilitate (peste 15 grupe la E. coli, 6 grupe la Pseudomonas, etc.). Plasmidele R au fost evidenţiate la majoritatea membrilor familiei Enterobacteriaceae, la bacteriile din genurile Pseudomonas, Staphylococcus, Streptococcus, Clostridium, ş.a. Transferul factorului R se realizează între tulpinile bacteriene din aceeaşi specie dar şi între speciile înrudite taxonomic, oriunde există o floră bacteriană mixtă: în intestin, de exemplu, dar şi înafara organismului, în produsele patologice recoltate de la animalul bolnav. Acest aspect prezintă importanţă epidemiologică având în vedere posibilitatea de transfer a factorului R de la bacteriile purtătoare nepatogene, care constituie microbiota normală a organismului, la bacteriile patogene invadatoare, înrudite taxonomic. De exemplu, tulpini de E.coli şi de Proteus spp. pot transmite factorul R, bacteriilor din genurile Salmonella şi Shigella, care devin astfel rezistente la acelaşi spectru de antibiotice (Duca Eugenia şi col., 1979; Grecianu Al., 1976). 140

BACTERIOLOGIE GENERALA

înafară de R-infecţie, deci câştig de rezistenţă la antibiotice, s-a constatat că plasmidele R se pot pierde cu uşurinţă, având un grad slab de fixitate în celula bacteriană. Ele pot fi eliminate spontan sau sub acţiunea unor factori fizici (raze ultraviolete, păstrarea timp îndelungat în anumite condiţii de temperatură) şi chimici (diferite substanţe colorante, detergenţi, etc.). Aspectele privind câştigarea şi pierderea factorului R impun o anumită conduită în practicarea antibiogramei. Pentru ca testul să evidenţieze situaţia reală a sensibilităţii faţă de antibiotice a tulpinilor bacteriene testate, este obligatorie însămânţarea produsului patologic în prima oră sau imediat după recoltare şi efectuarea antibiogramei pe cultură primară, ori de câte ori este posibil (densitate suficientă a bacteriei infectante, produs necontaminat sau slab contaminat). Rezistenţa faţă de antibiotice determinată de plasmidele R se realizează prin cel puţin patru mecanisme (Zarnea G.,1984): 1. blocarea transportului antibioticului în celulă de către proteinele-purtător prin modificarea stucturii acestora; 2. alterarea ţintei asupra căreia acţionează antibioticul, reprezentată de ribozomi sau ARN-polimeraza, prin înlocuirea unor aminoacizi din structura proteinelor constitutive; 3. utilizarea unei căi alternative (paralele) celei perturbate de antibiotic; 4. producerea unor enzime care inactivează antibioticele. Referitor la ultimul mecanism de acţiune, A n d e r s o n şi D a t t a (cit. de Grecianu Al., 1986) au demonstrat în 1967 că rezistenţa la penicilină determinată de factorul R se datorează producerii unei enzime hidrolitice – penicilinaza – care transformă penicilina în acid penicilinoic, derivat inactiv. Ulterior, au fost identificate şi alte enzime capabile să inactiveze antibioticele şi a căror sinteză este controlată de plasmidele R. Spre exemplificare, menţionăm streptomicinadeniltransferaza şi cloramfenicol-acetiltransferaza, enzime care prin 140

BACTERIOLOGIE GENERALA

adenilarea şi respectiv acetilarea antibioticelor respective, împiedică legarea lor de ribozomi. Plasmidele Col (de colicinogeneză sau bacteriocinogeneză) sunt determinanţii genetici ai colicinelor sau bacteriocinelor. Acestea sunt substanţe antibiotice active faţă de tulpini bacteriene din aceeaşi specie sau aparţinând unor specii strâns înrudite taxonomic. Celulele bacteriene care conţin factor ,,col” sunt imune faţă de colicina omologă. Ca şi celelalte plasmide, plasmidele ,, col” pot fi conjungative şi neconjungative. Plasmidele ,,col” conjungative sunt mai mari, cu masa moleculară de 40 - 80 x 108 daltoni şi sunt compuse din 100-200 gene. Plasmidele ,,col” neconjungative sunt mai mici, având masa moleculară de numai 4,2 – 8 x 10 6 daltoni. Activitatea lor autoreplicantă este mai intensă, în celulă găsindu-se totdeauna un număr mai mare de copii, comparativ cu cel al plasmidelor ,,col” conjugative. Grupele de gene comune ambelor tipuri de plasmide sunt: • genele care codifică autoreplicarea; • gena determinantă a sintezei bacteriocinei; • gena responsabilă pentru sinteza proteinei de imunitate. Plasmidele ,,col” conjungative posedă în plus genele ,,tra”, responsabile de transfer. Genomul fagic integrat. Virusurile pot exista în natură sub trei forme: virion (virus matur sau complet), virus vegetativ şi virus integrat sau provirus. Forma de virus integrat sau provirus se caracterizează prin integrarea reversibilă a genomului viral în genomul celulei gazdă, unde se comportă ca un fragment de material genetic propriu celulei, replicându-se şi transmiţându-se celulelor fiice în timpul diviziunilor celulare. 140

BACTERIOLOGIE GENERALA

Acest fenomen a fost semnalat prima dată virusurile bacteriofage (virusuri care parazitează bacteriile) de către B o r d e t şi C i u c ă în 1921 (cit. de Răducănescu H. şi col., 1986). Genomul fagic integrat în cromozomul bacterian (profagul) are toate însuşirile unei plasmide în faza ei epizomală. Integrarea profagului în genomul bacterian poartă numele de lizogenie, iar populaţiile bacteriene la care s-a produs acest fenomen sunt numite lizogene. Tulpinile bacteriene lizogene sunt imune faţă de infecţia cu acelaşi bacteriofag. în 1949, R o u n t r e e (cit. de Răducănescu H. şi col., 1986) dovedeşte însă posibilitatea polilizogeniei, adică a integrării mai multor fagi diferiţi în genomul aceleeaşi celule bacteriene. Termenul ,,lizogenie” a fost inspirat din caracteristica populaţiilor lizogene, rezistente la liza fagică datorită imunităţii mai sus menţionate, dar generatoare de liză fagică în contact cu o populaţie lizosensibilă, care nu conţine fagul integrat. Posibilitatea populaţiilor lizogene de a provoca liza populaţiilor sensibile se datorează faptului că, la o tulpină lizogenă genomul fagic nu se integrează în 100% din celulele populaţiei respective. într-un număr foarte redus de celule, virusul este multiplicat, iar virionii eliberaţi prin liză sunt insesizabili în populaţia lizogenă. în contact cu populaţia lizosensibilă, ei generează însă liza evidentă a acesteia. Fenomenul de integrare a bacteriofagilor a fost studiat în detaliu de L e d e r b e r g în 1951, pe modelul fagului λ la Escherichia coli. Genomul fagic este constituit din aproximativ 35 gene, din care 6 participă la stabilirea şi menţinerea lizogeniei prin inserarea genomului fagic în cromozomul bacterian. Stabilizarea sistemului fag integrat – bacterie este asigurată de o proteină represor care reprimă transcrierea informaţiei genelor fagice responsabile de replicarea, biosinteza şi morfogeneza noilor virioni. Singurele gene virale care rămân în funcţie sunt cele care controlează biosinteza genomului fagic integrat. 140

BACTERIOLOGIE GENERALA

Poziţia genomului fagic pe cromozomul bacterian este, în cazul unor fagi, întotdeauna aceeaşi, în timp ce alţi fagi se pot integra în mai multe regiuni ale cromozomului. Acest tip de ciclul evolutiv al virusurilor este numit ciclu reductiv sau lizogenizant, în opoziţie cu cel productiv sau litic, în care genomul fagic rămâne în stare autonomă, sau trece în stare autonomă desprinzându-se din cromozom şi dirijează activitatea celulei gazdă în sensul producerii de noi virioni (fig.41). Odată cu reluarea ciclului productiv, unii fagi pot ancora fragmente din cromozomul bacterian sau din plasmide, transferând genele astfel preluate, la bacteriile pe care le vor infecta într-o etapă următoare, prin fenomenul de transducţie. Prezenţa unui genom fagic în cromozomul bacterian poate determina însuşiri diferite celulelor populaţiei lizogene, în funcţie de suplimentul de informţie genetică conţinută în bacteriofagul integrat. Dobândirea unor proprietăţi noi de către o populaţie lizogenă, consecutiv integrării bacteriofagului, se numeşte conversie fagică sau lizogenă. Determinanţii genetici ai acestor proprietăţi sunt asociaţi constant cu genomul fagic, ceea ce deosebeşte conversia, de transducţia fagică. Astfel de proprietăţi bacteriene sunt toxinogeneza la Corynebacterium diphteriae, producerea eritrotoxinei la streptococii de grup A, schimbarea structurii antigenice la Salmonella typhi, creşterea ratei de sporogeneză la Bacillus anthracis, sinteza de bacteriocine, etc.( Zarnea G., 1986)

2.3.5.1.3. Transcrierea şi traducerea informaţiei genetice Informaţia din genomul bacterian este transpusă în activitatea vitală a celulei prin mecanismele de transcriere şi traducere, al căror suport material îl constituie acizii ribonucleici. Acizii ribonucleici au o compoziţie chimică asemănătoare cu cea a acidului dezoxiribonucleic, de care se deosebesc prin următoarele particularităţi: 140

BACTERIOLOGIE GENERALA

140

BACTERIOLOGIE GENERALA

Fig.41 Raporturile dintre genomul fagilor temperaţi şi cromozomul bacterian în cazul bacteriilor lizogene: după infecţie, genomul fagic poate să rămână autonom în citoplasmă, unde se replică şi iniţiază o infecţie litică, sau este integrat ca profag în cromozomul bacteriei, care astfel devine lizogenă (după Watson, cit. de Zarnea G., 1970) 140

BACTERIOLOGIE GENERALA

140

BACTERIOLOGIE GENERALA

• pentoza este reprezentată de riboză, în locul dezoxiribozei; • uracilul (U) substituie timina (T); • configuraţia moleculară a secvenţei nucleotidelor este monocatenară. Pe baza funcţiei pe care o îndeplinesc, acizii ribonucleici se împart în trei categorii: acizi ribonucleici mesageri (ARNm), solubili sau de transport (ARNs) şi ribozomali (ARNr). Acizii ribonucleici mesageri (ARNm) au o configuraţie moleculară lineară şi aceeaşi secvenţă de baze ca AND-ul de pe care sunt transcrişi, cu deosebirea că în locul timinei conţin uracil. Informaţia genetică este determinată de succesiunea bazelor azotate pe lanţul de ADN, transcrisă pe ARNm, iar combinaţiile de câte trei baze de pe traseul lanţului de ARNm, sunt responsabile de poziţia aminoacizilor în structura polipeptidelor. Secvenţa a trei baze care codifică sinteza unui aminoacid poartă denumirea de tripletă sau codon. în afară de codonii purtători de informaţie genetică, există şi triplete care nu codifică aminoacizi (triplete non sens), ci intervin în mecanismele de stopare a sintezei lanţurilor peptidice. în toate sistemele vii, acelaşi aminoacid este codificat de acelaşi codon - corelaţie care poartă numele de cod genetic. Caracterul universal şi legic al codului genetic stă la baza unităţii şi diversităţii lumii vii. Acizii ribonucleici solubili sau de transport (ARNs sau ARNt) sunt constituiţi dintr-un lanţ pliat în aşa fel încât molecula are aspectul unui trifoi cu patru foi (fig. 42). La extremitatea a două din cele 4 ramuri ale moleculei se găsesc sedii de cuplare cu un înalt grad de specificitate şi anume: ♦ anticodonul (nodocul), reprezentat de bazele azotate complementare celor din codonii care se succed de-a lungul lanţului de ARNm (de exemplu, unui codon 141

BACTERIOLOGIE GENERALA

ACG– adenină-citozină-guanină îi va corespunde un anticodon UGC- uracil – guanină-citozină ); ♦ zona de acceptare pentru aminoacid, reprezentată de o grupare chimică complementară acestuia, astfel încât fiecărui aminoacid îi corespunde un ARNs specific. Acizii ribonucleici ribozomali (ARNr), intră în structura ribozomilor.

Fig. 42 Configuraţia moleculei de ARN solubil (după Răducănescu H., şi col.,1986).

142

BACTERIOLOGIE GENERALA

Ribozomii (granulele lui Palade) sunt formaţiuni corpusculare diseminate în citoplasmă, la nivelul cărora are loc traducerea informaţiei genetice, concretizată în sinteza proteinelor prin ansamblarea aminoacizilor în lanţuri polipeptidice. în celula bacteriană se găsesc în medie 20000 – 30000 de ribozomi de tip 70 S. Din punct de vedere al structurii chimice, ribozomii sunt ribonucleoproteine, grupate în două subunităţi diferite ca formă şi mărime (fig. 43): o subunitate mică, asemănătoare cu o pereche de haltere asimetrice şi o subunitate mare, având forma aproximativă a unui fotoliu. Cele două subunităţi se unesc şi se disociază reversibil. în timpul sintezei proteinelor, ele sunt cuplate în aşa fel încât gâtul halterei se sprijină de spătarul fotoliului, delimitând un canal prin care se deplasează ARNm.

Fig. 43 Reprezentarea schematică a structurii ribozomilor 143

BACTERIOLOGIE GENERALA

Ribozomii prezintă două sedii sau situsuri de cuplare: unul destinat ataşării aminoacidului nou transportat de ARNs (situsul Aacceptor sau aminoacid), situat pe subunitatea mai mică şi altul pe care este translocat şi menţinut ARNs sosit anterior, până în momentul formării legăturii dintre cei doi aminoacizi (situsul P – peptidic sau donor), în vederea formării lanţului peptidic. Transcrierea constă în sinteza ARNm, având ca matriţă o secvenţă de pe un lanţ al moleculei de ADN (un cistron), sub acţiunea unei transcriptaze: ARNm polimeraza ADN dependentă. Iniţierea sintezei ARNm se declanşează într-o regiune a ADN numită promotor. La bacterii, promotorii au, de regulă, aceeaşi secvenţă de baze. Astfel, la distanţa de 10 nucleotide înaintea situsului de iniţiere a ARNm se găseşte suita de baze U A U A A T G, cunoscută ca secvenţă Pribnow. Sinteza ARNm dureză până în momentul intervenţiei mecanismelor de stop, reprezentate de semnale de transmitere, constituite din secvenţe poli A şi de unele proteine specifice, cum este cazul factorului ,,rho” evidenţiat la Escherichia coli. Traducerea este un mecanism complex prin care mesajul genetic, transmis de la ADN prin ARNm, este recepţionat şi citit la nivelul ribozomilor, în vederea constituirii lanţurilor peptidice. Acestea se formează prin secvenţializarea aminoacizilor transportaţi la ribozomi de către ARNs. în traducerea informaţiei genetice se pot distinge mai multe faze şi anume: 1. ataşarea ARNm de ribozomi la nivelul situsului A, în cursul deplasării acestuia prin canalul delimitat de cele două subunităţi constituiente ale ribozomilor; 144

BACTERIOLOGIE GENERALA

2. iniţierea lanţului peptidic pe baza semnalului reprezentat de un codon de iniţiere (AUG sau GUG), care recunoaşte un anumit tip de ARNs ce transportă metionina formilată; complexul ARNs-aminoacid este ataşat la situsul A al ribozomului, fiind apoi translocat pe situsul P. Odată cu această translocare, situsul A este eliberat, ARNm deplasându-se şi ataşând de ribozom, codonul următor. 3. creşterea lanţului peptidic prin ataşarea de aminoacizi printr-un mecanism similar celui de iniţiere; 4. încheierea sintezei lanţului peptidic prin acţiunea unui mecanism de stop, declanşată de sosirea la nivelul ribozomului a unuia dintre codonii non sens (UAA. UAG şi UGA). Această colinearitate AND →ARNm →proteine, în transferul şi materializarea informaţiei genetice, este un exemplu concludent de aplicare în biologie a ,,teoriei informaţiei”.

2.3.5.1.4. Autoreglarea proceselor de biosinteză Celula bacteriană dispune de mecanisme eficiente de autoreglare permanentă a proceselor de biosinteză, care-i permit să funcţioneze ca un veritabil sistem biocibernetic, pe principiul maximei eficienţe şi economii. Aceste mecanisme sunt: 1. inducţia enzimatică, care reprezintă introducerea în funcţie a unor dispozitive de producţie celulară; 2. represia enzimatică, care reprezintă procesul invers, de scoatere din funcţie a acestor dispozitive; 3. inhibiţia activităţii enzimelor, care constă în modificarea nivelului de activitate a unor dispozitive, fără a merge până la scoaterea lor din funcţie. 145

BACTERIOLOGIE GENERALA

Primele două categorii de mecanisme au fost explicate pe baza unui model general de reglare genetică a sintezei proteinelor conceput de F. J a c o b şi J. M o n o d (1961), cunoscut sub denumirea de “teoria operonului”. Controlul genetic prin operon al inducţiei şi represiei sintezei enzimelor. Operonul inductibil. Teoria lui J a c o b şi M o n o d a fost elaborată pe baza studiului reglării genetice a sintezei enzimelor prin care Escherichia coli descompune lactoza. De aceea autorii au desemnat acest operon cu simbolul “lac”. Majoritatea tulpinilor acestei specii (tulpini lac+) au proprietatea de a folosi lactoza ca unică sursă de carbon şi energie. Dizaharidul este introdus în celulă prin transport activ, cu participarea beta-galactozid-permeazei, apoi este scindat în glucoză şi galactoză sub acţiunea beta-galactozidazei şi a tiogalactozidtransacetilazei. Numărul moleculelor de beta-galactozidază într-o celulă de Escherichia coli este foarte redus în cazul când mediul nu conţine lactoză şi ajunge până la aproximativ 3000 în prezenţa substratului. Controlul genetic al sintezei celor trei enzime se realizează prin gene cu poziţii limitrofe pe cromozom. Studiul relaţiei dintre concentraţia substratului din mediu şi nivelul sintezei enzimelor menţionate au permis lui J a c o b şi M o n o d formularea “teoriei operonului”, pe care ei îl definesc ca pe o secvenţă de gene structurale care se găsesc sub controlul aceloraşi gene operatoare şi reglatoare. Genele structurale deţin informaţia genetică privind structura enzimelor care catalizează reacţiile metabolismului 146

BACTERIOLOGIE GENERALA

bacterian. în cazul operonului ,,lac” ele au fost notate cu simbolurile z, y şi a. Gena operatoare (operonul) este segmentul cromozomic adiacent genelor structurale, care funcţionează ca receptor specific de semnale induse din citoplasmă. Pe baza acestor semnale, gena operatoare iniţiază sau întrerupe transcrierea informaţiei genetice de pe genele structurale pe ARNm. Gena operatoare poate adopta faţă de genele structurale, două poziţii alternative: a. deschis (poziţie de start), declanşând transcrierea informaţiei genetice şi sinteza enzimelor sau b. închis (poziţie de stop), blocând transcrierea informaţiei genetice şi procesul de biosinteză. Promotorul este un segment al moleculei de AND cu poziţie intermediară între genele structurale şi gena operatoare, care declanşează transcrierea. Gena reglatoare, numită şi genă de represor este o unitate genetică de control care îndeplineşte funcţii multiple şi anume: • acţionează ca transmiţător de semnale; • determină viteza de transcriere a informaţiei genetice pe ARNm şi prin aceasta, rata sintezei enzimei; • codifică sinteza represorului. Acţiunea operonului este declanşată sau oprită de semnale chimice, reprezentate de inductor, de regulă prezent în mediu şi de represor sintetizat de celulă. Rolul de inductor îl are substratul faţă de care celula sintetizează enzima sau secvenţa de enzime capabile să-l descompună (lactoza constituie inductorul pentru beta-galactozidpermează, beta-galactozidază şi tiogalactozid – transacetilază). Represorul este un constituent citoplasmatic polipeptidic sau proteic a cărui sinteză este codificată de gena reglatoare, care-i determină totodată structura şi specificitatea de acţiune. Compoziţia chimică şi masa moleculară a represorilor variază în funcţie de inductor şi de enzima în a cărei sinteză intervin. Ei sunt sintetizaţi în cantităţi foarte mici, o singură moleculă fiind suficientă pentru 147

BACTERIOLOGIE GENERALA

reglarea sintezei a 100 000 molecule proteice. Represorul acţionează ca un semnal chimic asupra operatorului, determinându-l să blocheze transcrierea genelor structurale pe ARNm. Represorul este sintetizat permanent în celulă şi se poate găsi, sub aspectul funcţionalităţii sale, în două ipostaze: • aporepresor inactiv, care rezultă din combinarea represorului cu inductorul pe baza unor structuri alosterice complementare; • represor activ sau funcţional, care se cuplează cu gena operatoare, în vecinătatea primei gene structurale (în cazul operonului lac, limitrof genei z), blocând astfel transcrierea; Deci, reglarea sintezei enzimelor implicate în reacţiile catabolice este asigurată de operonii inductibili, prin inducţie şi represie. Inducţia este determinată de prezenţa inductorului (substratul specific enzimei) şi constă în următoarele fenomene: • inductorul se combină cu represorul, inactivându-l prin transformarea în aporepresor; • gena operatoare rămâne nereprimată şi intră în poziţie deschisă, de start, declanşând transcrierea informaţiei genetice de pe genele structurale pe ARNm; • ARNm se ataşează de ribozomi, unde informaţia genetică este decodificată şi se exprimă fenotipic prin sinteza enzimei sau grupului de enzime codificate de operon. Represia este mecanismul declanşat de absenţa inductorului, când represorul, rămas liber sub forma activă, se cuplează cu gena operatoare blocând astfel sinteza enzimelor codificate de genele structurale.

148

BACTERIOLOGIE GENERALA

Operonul represibil Spre deosebire de operonii inductibili, care controlează descompunerea diferitelor substanţe pentru a le face accesibile metabolismului bacterian, operonii represibili sunt majoritatea celor care codifică sinteza substanţelor necesare celulei bacteriene. Modelul operonului represibil se bazează pe studiile lui Y a n o f s k y (1976) şi S o o l (1977) privind controlul genetic al sintezei triptofanului (operonul “trp”). Prezenţa triptofanului în mediul de cultură al unei tulpini de Escherichia coli ,,trp”+ inhibă selectiv formarea triptofan-sintetazei, enzimă care participă la biosinteza acestui aminoacid. Produsul terminal al căii de biosinteză a tiptofanului reprezintă, prin urmare, un semnal pentru celulă, care, printr-un fenomen de feedback negativ, adică de represie prin produs final, opreşte sinteza enzimei devenită inutilă. Principala deosebire în reglarea funcţionării celor două tipuri de operoni, constă în faptul că gena reglatoare a operonului inductibil codifică sinteza represorului în forma lui activă, acesta transformându-se în aporepresor inactiv în urma cuplării lui cu inductorul din mediu, în timp ce, în cazul operonilor represibili, gena reglatoare codifică represorul sub forma lui inactivă. Activarea represorului se face în prezenţa substratului specific enzimei, care are rol de corepresor. Astfel, triptofanul îndeplineşte rolul de corepresor în menţinerea în stare inactivă a ansamblului de gene capabile să-i codifice sinteza. în absenţa triptofanului, operonul ,,trp” este depresat datorită revenirii represorului în starea lui inactivă, din cauza lipsei corepresorului. O formă particulară de represie, caracteristică metabolismului glucidic, este represia prin catabolit. în acest caz, rolul de corepresor este îndeplinit de un catabolit. Acesta va activa represorul, care, la rândul său, va bloca sinteza enzimei ce urmează să catalizeze următoarea treaptă a filierei anabolice. 149

BACTERIOLOGIE GENERALA

Inhibiţia activităţii enzimelor Inhibiţia activităţii enzimelor, numită şi inhibiţie prin produs final, retroinhibiţie sau inhibiţie prin feedback este un mecanism de reglare genetică a activităţii enzimelor, de mare promptitudine şi fineţe. Ea se aseamănă ca efect cu represia, dar diferă de aceasta prin mecanism, oportunitate şi viteză. în cazul represiei, este oprită sinteza enzimei prin acţiunea represorului, în timp ce, în cazul retroinhibiţiei este blocată activitatea enzimelor, nu însă şi sinteza lor. Pentru explicarea mecanismului retroinhibiţiei, M o n o d, C h a n g e u x şi I a c o b (1961, 1963) au elaborat un model bazat pe principiul reacţiilor alosterice. Conform acestuia, proteinele enzimatice au două sedii reactive cu specificitate stereochimică, faţă de două substanţe diferite: un sediu specific de combinare cu substratul, care reprezintă ,,locul activ”, răspunzător de activitatea biologică a enzimei şi un al doilea sediu, cu o configuraţie stereochimică complementară unui metabolit. Acest sediu reprezintă ,,suprafaţa alosterică”, iar metabolitul care se cuplează cu enzima este numit ,,efector alosteric”. Enzima îşi poate modifica reversibil activitatea biologică în funcţie de sediul şi natura substanţei cu care se combină. în momentul când pe suprafaţa enzimei se fixează efectorul alosteric, aceasta devine incapabilă de a se mai cupla şi de a acţiona asupra substratului. Efectorul alosteric are deci o acţiune inhibitoare asupra enzimei, care devine inactivă biologic. Celula are posibilitatea să selecteze între cele două mecanisme prin feedback (represie sau retroinhibiţie), în funcţie de nevoile activităţii celulare. Represia, reprezentând anularea unei activităţi productive (sinteza unei enzime), este un proces mai lent şi mai tardiv, care nu 150

BACTERIOLOGIE GENERALA

poate răspunde unei nevoi imediate a celulei. Retroinhibiţia însă, blochează extrem de rapid o cale metabolică, fiind astfel mult mai eficientă în satisfacerea unor nevoi imediate de reglare a metabolismului bacterian. Figura numărul 44 redă modelul general de control al biosintezei proteinelor la bacterii, după Monod, Changeux şi Jacob (cit. de Zarnea G.,1970), ilustrând mecanismele de acţiune ale inducţiei, represiei prin produs final, represiei prin catabolit şi retroinhibiţiei. Descoperirea mecanismelor de reglare genetică a metabolismului bacterian a oferit explicaţia extraordinarei capacităţi a acestor organisme de a se adapta la medii noi şi de a utiliza cu o eficienţă maximă, resurse nutritive dintre cele mai diferite. Graţie acestor mecanisme, celula bacteriană nu risipeşte niciodată nutrienţii sau energia în sinteze inutile, ci produce întotdeauna metaboliţi intermediari şi enzime în cantităţi echilibrate.

151

BACTERIOLOGIE GENERALA

Fig.44. Modelul general de control al biosintezei proteinelor la bacterii (după Monod,Changeaux şi Jacob).

2.3.5.2. Variabilitatea la bacterii şi mecanismele ei În cursul multiplicării microorganismelor, la fel ca la celelalte grupe de vieţuitoare apar fenomene de variaţie. Întrucât în bacteriologie nu se poate opera curent cu celula bacteriană ca individ, variaţiile fenotipice se urmăresc pe tulpini bacteriene, care sunt populaţii relativ omogene din punct de vedere genetic, ţinând seama de faptul că se obţin prin operaţiunea de clonare (transplantarea unei colonii izolate). Spre deosebire de plante şi animale, la microorganisme variabilitatea este mult mai accentuată, datorită simplităţii tipului de organizare şi activitate biologică, precum şi a succesiunii rapide a 152

BACTERIOLOGIE GENERALA

generaţiilor. în funcţie de mecanismul de producere şi de caracteristicile lor, variaţiile bacteriene pot fi grupate în două categorii: fenotipice şi genotipice (tabel 5). Tabelul 5 Caracterele distinctive între variaţiile fenotipice şi genotipice Variaţii Caracterul c o n s i d e r a t

Fenotipice

Genotipice

Se realizează Acţiunea mediului prin Starea Nu comportă modificări genomului

Mutaţii şi recombinări genetice Comportă modificări struc tural e

Rolul factorilor Inductori al variaţiei prin de mediu actualizarea unei Selectivi posibilităţi genetice

153

ai varia ntelo r

BACTERIOLOGIE GENERALA

Proporţia Toate sau majoritatea celulelor afectate dintr-o populaţie bacteriană Transmiterea variaţiei la Nu descendenţi

Foarte mică (1/108 - 109 ) Da; descendenţii formează o clonă variantă

2.3.5.2.1. Variaţiile fenotipice Genotipul reprezintă complexul de gene care determină realizarea unui anumit fenotip (caracter, însuşire). Exprimarea aceluiaşi genotip prin mai multe fenotipuri este posibilă datorită genelor alele. Variaţiile fenotipice (negenetice sau fiziologice) sunt dependente de factorii de mediu, faţă de care constituie fenomene de adaptare. Factorii de mediu determinanţi ai acestor variaţii, care acţionează ca inductori sau corepresori, pot fi diferite substanţe din mediul de cultură, temperatura de cultivare, etc. Variaţiile fenotipice afectează o întreagă populaţie bacteriană simultan, sunt instabile (în sensul că dispar odată cu factorul inductor) şi nu se transmit ereditar, deoarece nu implică nici o modificare în structura genomului. Variabilitatea fenotipică poate interesa toate caracterele celulei bacteriene: morfologice, culturale, biochimice, antigenice, etc. Redăm în continuare câteva exemple ilustrative. 1.Variaţii ale capsulogenezei. 154

BACTERIOLOGIE GENERALA

Speciile capsulate Bacillus anthracis şi Diplococcus pneumoniae îşi sintetizează capsula numai în organismul animalului infectat sau pe mediile de cultură care conţin lichide organice (ser, sânge 5-10%). Pe mediile simple, în absenţa substanţelor necesare capsulogenezei, ele formează culturi de variante acapsulogene. Pierderea capsulogenezei poate deveni şi un caracter ereditar. Un exemplu în acest sens îl constituie tulpinile de Bacillus anthracis acapsulogene obţinute prin cultivarea pe sânge defibrinat de cal (tulpina 1190 R - Stamatin, 1936) sau pe ser de cal, în atmosferă de bioxid de carbon (tulpina 34 F2 – Sterne, 1937). Ambele tulpini şi-au pierdut definitiv capacitatea de a se încapsula în organismul animal, caracterul de acapsulogeneză devenind genotipic. Deoarece capsula conferă bacteriilor protecţie antifagocitară, prin pierderea ei bacteriile îşi pierd implicit virulenţa şi capacitatea de a determina procese septicemice. 2.Variaţii ale aparatului ciliar. Speciile ciliate pot deveni imobile în prezenţa unor factori de mediu care au efect inhibitor asupra cilogenezei. Astfel, sinteza cililor la speciile Listeria monocitogenes şi Yersinia enterocolitica are loc la 20 – 250 C, fiind inhibată la 370 C. în mod asemănător, o serie de substanţe ca insulina, acidul boric, sulfatiazolul, tripaflavina, serurile anti-,,H”, dacă sunt incluse într-un mediu de cultură solid pot anula fenomenul de roire la bacteriile din genul Proteus. 3.Variaţii privind sporogeneza. Cultivarea speciilor sporogene pe medii cu antiseptice sau pe medii bogate în ioni de calciu poate induce apariţia de variante asporogene. Acelaşi efect represor asupra genelor responsabile de sporogeneză îl exercită anumite valori termice. La Bacillus anthracis, de exemplu, sporogeneza are loc numai în intervalul 12– 42,50 C. Varianta asporogenă se deosebeşte de tulpina originală 155

BACTERIOLOGIE GENERALA

sporogenă prin caractere culturale noi şi printr-o virulenţă mai redusă (Grecianu Al., 1976). 4.Variaţii privind caracterele culturale. Aspectul coloniilor este caracteristic fiecărei specii şi variază în raport cu mediul (măsura în care sunt asigurate sursele nutritive pentru sinteza diferitelor structuri) şi cu starea genetică a bacteriei . în general, tipul de colonie ,,S” este considerat ca fiind normal pentru majoritatea speciilor bacteriene. Excepţiile sunt B. anthracis, antracoizii şi M. tuberculosis care, pe medii adecvate exigenţelor lor nutritive, formează colonii de tip ,,R” . S-a constatat însă că prin învechirea culturilor, coloniile de tip ,,S”, la unele specii, au tendinţa de a se transforma treptat în colonii de tip ,,R”, fenomen cunoscut sub denumirea de disociaţie ,,S”↔ ,,R” sau rofizare. în producerea acestei variaţii, rolul inductor este atribuit acumulării de cataboliţi şi epuizării substanţelor necesare pentru sinteza unor structuri de înveliş (capsulă, perete). Deoarece genomul bacteriei nu suferă modificări, transformarea este reversibilă în urma transplantării pe medii proaspete, cu o compoziţie adecvată exigenţelor nutritive ale speciei. Rofizarea este însoţită de o serie de modificări de ordin cultural, fiziologic şi de patogenitate, pe care le redăm în tabelul 6. Tabelul 6 Caracterele distinctive ale formelor ,,S” şi ,,R” la bacterii Caracterul considerat

Forma ,,S”

156

Forma ,,R”

BACTERIOLOGIE GENERALA

Morfologia celulei

în limitele speciei

Forme filamentoase

Cultura solide

pe

medii

Colonii netede, lucioase, cu margini regulate

Colonii mate, rugoase, cu margini neregulate

Cultura lichide

în

medii

Turbiditate uniformă

Sediment floconos

Capsula

Prezentă

Absentă

Stabilitatea în soluţie 0,8% NaCl

Stabilă

Aglutinează

Stabilitatea în soluţie 1/500 de tripaflavină

Stabilă

Aglutinează

Patogenitatea

Prezentă

Atenuată sau absentă

Infecţia indusă

Acută

Cronică

5.Variaţii ale însuşirilor de patogenitate. Patogenitatea unei bacterii poate suferi variaţii în sensul atenuării sau, dimpotrivă, în sensul exaltării ei. Reducerea patogenităţii bacteriilor se realizează prin mijloace fizice, chimice şi biologice, în scopul obţinerii de tulpini vaccinale. Dintre mijloacele fizice, în mod curent se utilizează temperaturile disgenetice, superioare confortului termic al speciei supuse atenuării. Factorii chimici atenuanţi sunt reprezentaţi de diverse substanţe care, introduse în mediul de cultură, frânează dezvoltarea normală a germenilor. Apelând la cel de-al doilea mijloc, C a l m e t t e şi G u é r i n au obţinut atenuarea unei tulpini de Mycobacterium bovis (tulpina ,,Lait Nocard”) în urma a 198 de treceri pe cartof glicerinat cu bilă de bou, pe parcursul a 11 ani (1908 – 1919). Vaccinul B.C.G. este utilizat şi astăzi pe scară largă în medicina umană pentru vaccinarea antituberculoasă a copiilor. 157

BACTERIOLOGIE GENERALA

Mijloacele biologice de atenuare constau în inocularea în serie a unei tulpini bacteriene pe o specie animală care, în mod natural, este rezistentă la infecţia respectivă. Consecutiv acestor pasagii repetate, se obţine o reducere a patogenităţii faţă de specia sau speciile natural sensibile. Exaltarea patogenităţii bacteriilor se realizează prin trecerea repetată a unei bacterii pe o gazdă în mod natural sensibilă (de la animalul bolnav la ce sănătos, în cursul infecţiilor naturale). 6. Variaţii ale caracterelor biochimice. Variaţiile fenotipice ale caracterelor biochimice constau în sinteza enzimelor adaptative indusă de substrat, care exercită o acţiune de derepresare a genelor respective. La E. coli, de exemplu, sinteza beta-galactozidazei şi a celorlalte enzime codificate de operonul ,,lac” este condiţionată de prezenţa lactozei în mediul de cultură. Gama caracterelor care sunt supuse variaţiilor fenotipice este extrem de largă şi numărul exemplelor de felul celor prezentate mai sus este nelimitat pentru lumea bacteriană.

2.3.5.2.2. Variaţiile genotipice Cercetările de genetică a microorganismelor au demonstrat faptul că stabilitatea materialului genetic nu este absolută, el fiind susceptibil, într-o anumită măsură, să sufere diverse modificări structurale. Genotipul modificat este stabil, transmisibil ereditar şi se exprimă printr-un fenotip diferit de cel normal (corespunzător genotipului sălbatic). Mecanismele de producere a variaţiilor genotipice sunt mutaţiile şi recombinările genetice. 158

BACTERIOLOGIE GENERALA

Mutaţiile sunt consecinţa unor modificări în structura genomului, care se produc atât în faza stabilă a ADN-ului cât şi în cursul autoreplicării acestuia, fără aport de material genetic străin. Recombinările genetice sunt rezultatul unui proces de transfer unidirecţional de material genetic, de la o celulă donatoare la una acceptoare, care dobândeşte caractere noi în funcţie de informaţia genetică cuprinsă în materialul primit.

Mutaţiile Mutaţiile reprezintă modificări ale numărului sau secvenţei bazelor azotate din structura moleculei de ADN. Ele survin brusc şi se exprimă fenotipic prin apariţia în sânul unei populaţii omogene, a unei ,,mutante”, adică a unui individ capabil de a transmite descendenţilor caractere noi, prin care se deosebeşte de populaţia omogenă în care a apărut. Una din teoriile cele mai pertinente asupra mecanismelor moleculare ale mutaţiilor este teoria ,,copierii greşite” a informaţiei genetice de pe catena complementară în cursul autoreplicării semiconservative a ADN – ului (W a t s o n şi C r i c k, 1953). Aceste erori de transcriere pot consta în: • substituţia unei baze azotate cu alta; • deleţia sau suprimarea unei baze sau a unui bloc de baze; • inserţia sau adiţia unei baze sau a unui bloc de baze suplimentare; • inversarea succesiunii bazelor, care în cursul copierii îşi schimbă poziţia. Clasificarea mutaţiilor se poate efectua după mai multe criterii. 1. După modul de apariţie, mutaţiile se împart în induse şi spontane. 159

BACTERIOLOGIE GENERALA

Mutaţiile induse sunt consecinţa acţiunii dirijate, în scop experimental, a unor factori de mediu numiţi agenţi mutageni deoarece sunt capabili să determine modificări în structura ADN. (Răducănescu H. şi col., 1986; Zarnea G.,1986). Agenţii mutageni mai frecvent utilizaţi sunt factori fizici (radiaţiile ultraviolete, radiaţiile ionizante,) şi chimici (5bromuracilul, 2-aminopurina, acidul nitros, coloranţii de acridină, hidroxilamina, nitrozoguanidina, etc.), care acţionează asupra ADN în diferite moduri. Unii agenţi mutageni, cum sunt analogii bazelor azotate, induc erori de replicare a ADN prin substituirea bazelor normale (ex. 5-bromuracilul se substituie timinei, determinând încorporarea în catena complementară a guaninei în locul adeninei, rezultatul fiind înlocuirea perechii de baze originare A-T cu G-C), alţii acţionează asupra precursorilor necesari sintezei ADN, iar alţii asupra unor sisteme enzimatice corelate cu sinteza ADN. Mutaţiile induse sunt utilizate în practică în scopul obţinerii unor tulpini bacteriene cu însuşiri dorite, utile în diverse domenii de activitate. Astfel, există preocupări privind obţinerea de mutante bune imunogene (necesare preparării vaccinurilor şi serurilor), mutante capabile să determine calităţi gustative deosebite unor produse alimentare, mutante bune producătoare de antibiotice sau vitamine, mutante auxotrofe∗ utilizate în experienţele de inginerie genetică, etc. Mutantele (variantele) auxotrofe rezultă din bacteriile prototrofe (tulpini sălbatice, izolate din natură), prin pierderea sau dobândirea capacităţii de a metaboliza diferiţi compuşi chimici. Mutantele auxotrofe au permis descoperirea recombinării la bacterii. 

160

BACTERIOLOGIE GENERALA

Mutaţiile spontane sunt cele care apar în natură datorită unor cauze necunoscute, în condiţii de mediu obişnuite şi fără intervenţia unui factor decelabil. Totuşi, plecând de la datele cunoscute privind mecanismele moleculare ale mutaţiilor induse - date care arată că nici o mutaţie nu se produce fără o cauză - Z a m e n h o f (cit. de Zarnea G.,1986) interpretează caracterul ,,spontan” al mutaţiilor ca rezultând din faptul că factorii lor determinanţi reali sunt omniprezenţi în natură şi necunoscuţi. Au fost incriminaţi ca având un rol în producerea mutaţiilor ,,spontane”, numeroşi factori fizici naturali (temperatura, radiaţiile UV, radiaţiile cosmice, radioactivitatea unor substanţe, etc.), dar şi unele substanţe rezultate din metabolismul celular normal. S-a constatat, de exemplu, că unele purine şi diferiţi derivaţi ai purinelor au efect mutagen asupra speciei Escherichia coli, astfel încât şi unele mutaţii ,,spontane” ar putea fi induse în realitate de mutageni endogeni. 2. După mărimea segmentului genetic modificat, mutaţiile pot fi punctiforme şi extinse. Mutaţiile punctiforme corespund alterării unui singur nucleotid (cea mai mică unitate structurală a materialului genetic) sau a unui singur codon (cea mai mică unitate funcţională). Mutaţiile extinse sunt cele care afectează o genă alcătuită din mai mulţi codoni (mutaţie genică), sau chiar mai multe gene (mutaţie poligenică). 3. După sens, mutaţiile se împart în mutaţii înainte şi mutaţii înapoi. Mutaţiile ,,înainte” (foreword mutations) implică o modificare de la o stare genetică considerată, arbitrar, ca fiind ,,normală” (corespunzătoare tipului sălbatic), la o stare nouă (mutantă), cum ar fi, de exemplu, pierderea capacităţii de a capsula la o specie capsulogenă sau obţinerea unei mutante 161

BACTERIOLOGIE GENERALA

auxotrofe, capabilă să metabolizeze o substanţă inaccesibilă speciei bacteriene respective. Mutaţiile ,,înapoi” sau regresive, retromutaţiile (,,back” sau ,,reverse mutations”) afectează o celulă mutantă, determinând revenirea acesteia la tipul sălbatic, iniţial, al speciei. Pe baza aceloraşi exemple date la mutaţiile ,,înainte”, mutaţiile ,,înapoi” vor consta în redobândirea capacităţii de a capsula şi respectiv pierderea proprietăţii de a metaboliza substanţa accesibilă metabolic numai mutantei auxotrofe. 4.După posibilitatea exprimării fenotipice se pot deosebi 3 feluri de mutaţii. a) Mutaţii imperceptibile, când modificarea structurii din genom nu se exprimă fenotipic. b) Mutaţii perceptibile, care se exprimă fenotipic prin apariţia sau pierderea unor însuşiri sesizabile. c) Mutaţii letale, în care alterarea mesajului genetic este incompatibilă cu viaţa, iar consecutiv producerii mutaţiei, bacteria moare. 5.în funcţie de caracterul fenotipic afectat, mutaţiile pot fi: a) morfologice, cilogeneza, sporogeneza, etc.;

care

privesc

capsulogeneza,

b) metabolice sau biochimice, care constau în dobândirea sau pierderea capacităţii de sinteză a unei enzime şi implicit, obţinerea mutantelor auxotrofe; c) antigenice, care se exprimă de cele mai multe ori prin modificarea tipului antigenic; d) de patogenitate, generatoare de mutante apatogene, cu patogenitate atenuată sau exacerbată;

162

BACTERIOLOGIE GENERALA

e) de rezistenţa la agenţii inhibitori fizici, chimici sau biologici, cum este cazul mutantelor antibiorezistente. Indiferent de tip, mutaţiile la bacterii au următoarele caracteristici comune: spontaneitatea, discontinuitatea, raritatea, stabilitatea şi specificitatea. Spontaneitatea. Modificările produse de factorii mutageni apar într-un moment imprevizibil, iar faptul că interesează o anumită genă este un fenomen întâmplător. Mutaţia are deci un caracter spontan, fenomenul mutaţional fiind distribuit aleator în timp şi spaţiu genetic. Caracterul spontan mai rezidă şi în faptul că mutaţia se produce în lipsa factorului de mediu faţă de care celula bacteriană cu genom modificat manifestă un comportament mutant. L u r i a şi D e l b r ü k (cit.de Răducănescu H. şi col.,1986) au fost primii care au demonstrat în 1943 că mutantele streptomicinorezistente de E.coli apar în absenţa antibioticului. Punerea în evidenţă a mutantelor este posibilă însă numai pe agar cu streptomicină, care permite dezvoltarea mutantelor, inhibând restul celulelor bacteriene sensibile. Deci, mediul cu antibiotic nu induce mutaţia, ci o relevă. Discontinuitatea se referă la faptul că, o mutantă poate să apară brusc sau trecând prin etape succesive.

163

BACTERIOLOGIE GENERALA

Raritatea. Probabilitatea ca o bacterie să sufere o mutaţie într-o unitate definită de timp, de obicei egală cu timpul unei generaţii, este foarte mică. în majoritatea cazurilor, ea se situează în jurul valorii de 1 dintr-o populaţie de 105-109 celule bacteriene. Stabilitatea. Spre deosebire de variaţiile negenetice, proprietăţile noi obţinute prin mutaţie persistă în absenţa agentului care a servit la selecţie şi se transmit ereditar. Specificitatea. Fiecare caracter poate suferi o mutaţie, independent de celelalte caractere. Rezistenţa la penicilină, de exemplu, este independentă de rezistenţa la sterptomicină. Probabilitatea ca o bacterie să devină, prin mutaţie, rezistentă la ambele antibiotice este egală cu produsul probabilităţilor individuale ale celor două mutaţii.

Recombinările genetice Recombinările genetice constau în transferul de material genetic cromozomal sau plasmidic de la o celulă donatoare la o celulă receptoare, urmat de recombinarea acestuia cu genomul endogenot. Ele au un grad de asemănare cu procesele sexuale, de care se deosebesc prin următoarele particularităţi: • absenţa unei veritabile fuziuni a celor două celule şi genomuri; • caracterul unidirecţional al transferului. • contribuţia inegală a celor două celule implicate. Celula acceptoare de ADN devine temporar şi parţial diploidă, deoarece conţine pe lângă materialul genetic propriu (endogenotul) şi materialul genetic străin (exogenotul) primit de la donor. Ea dobândeşte astfel caracterul unui merozigot. Starea

164

BACTERIOLOGIE GENERALA

normală, haploidă, a celulei receptoare se restabileşte prin integrarea exogenotului în materialul genetic propriu. Ca urmare a integrării exogenotului, celula acceptoare dobândeşte unul sau mai multe caractere noi, care constituie ,,markerii” genetici prin care se identifică recombinările. Studiile privind fenomenul de recombinare genetică la bacterii au fost efectuate în condiţii de laborator, optime sub raportul densităţii tulpinilor bacteriene, al compoziţiei mediilor de cultură, al temperaturii, Ph- ului, etc. Tendinţele de extrapolare a datelor obţinute în laborator, la mediile naturale, au oscilat între două extreme: de la negarea posibilităţii producerii lor în mediile naturale, până la ideea că bacteriile ar fi într-o stare de flux genetic permanent (prin intermediul plasmidelor transmisibile) datorită căreia, în urma înglobării de ADN străin, ar putea fi compromisă însăşi identitatea speciilor (Zarnea G., 1994). Recombinările genetice se realizează prin 3 categorii de mecanisme: transformarea, transducţia şi conjugarea. Transformarea Transformarea constă în transferul de material genetic de la o celulă donatoare, din care este eliberat prin autoliză sau extracţie chimică, către o celulă receptoare în care pătrunde prin traversarea învelişurilor acesteia. Fenomenul de transformare a fost descoperit de G r i f f i t h în 1928 cu ocazia experienţelor privind patogenitatea pneumococului (fig.45). Injectând la şoareci două tipuri de pneumococi distincţi antigenic, tipul S III capsulogen şi virulent (sub formă de suspensie de germeni omorâţi) şi tipul R II acapsulogen şi 165

BACTERIOLOGIE GENERALA

nevirulent (sub formă de suspensie de germeni vii), G r i f f i t h a izolat de la şoarecii morţi, pneumococi aparţinând tipului virulent. El nu a putut să explice atunci, cum a fost posibilă transformarea pneumococilor nevirulenţi sub influenţa germenilor virulenţi omorâţi.

Fig. 45 Experienţa de transformare a pneumococilor efectuată de

Griffith.

Natura agentului transformant care opera în experienţele lui G r i f f i t h a fost cunoscută abia în 1944, când A v e r y, Mc Carty şi Mac L e o d au arătat că fragmente de ADN, eliberate prin liza bacteriilor moarte sau prin extracţie chimică, pătrund în celulele pneumococul viu înzestrându-l cu determinanţii genetici ai sintezei polizaharidelor capsulare de tip S III.

166

BACTERIOLOGIE GENERALA

în mod similar pot fi transmişi determinanţii genetici ai rezistenţei la antibiotice, ai sintezei enzimelor implicate în catabolismul sau anabolismul celular, etc. Descrisă iniţial la pneumococ (Streptococcus pneumoniae), transformarea genetică a fost pusă în evidenţă ulterior la cel puţin încă 17 specii aparţinând genurilor: Streptococcus, Haemophilus, Bacillus, Neisseria, Salmonella, Pasteurella, etc. Pe lângă transformarea genetică intraspecifică, au fost descrise şi numeroase cazuri de transfer interspecific ( Haemophilus influenzae √ Haemophilus parainfluenze, Bacillus subtilis ∏ Bacillus niger, Pseudomonas fluorescens ∏ Pseudomonas aeruginosa, etc.) şi chiar intergeneric ( Neisseria ∏ Moraxella, Micrococcus ∏ Staphylococcus, etc.). Fenomenul de transformare se realizează în mai multe etape şi depinde de unele condiţii pe care trebuie să le îndeplinească materialul genetic transferabil şi celula receptoare. ADN transformant trebuie să fie dublu catenar, să aibă configuraţie ciclică şi o masă moleculară minimă de 1-5 x 10 6 daltoni. Numărul celulelor transformate creşte proporţional cu lungimea ADN donator, concentraţia acestuia în mediu şi durata perioadei de contact cu bacteriile receptoare. Pe de altă parte, transformarea este posibilă numai dacă bacteria receptoare se găseşte în aşa-numita ,,stare de competenţă”, care îi permite să interacţioneze cu un fragment de ADN exogen şi să-l înglobeze ireversibil. Această însuşire este determinată genetic, fiind dovedită posibilitatea mutagenezei spre competenţă a unor tulpini bacteriene necompetente, precum şi obţinerea de mutante necompetente din tulpini competente. Escherichia coli, de exemplu, nu suferă procesul de transformare genetică în mod natural, datorită lipsei stării de competenţă. 167

BACTERIOLOGIE GENERALA

Competenţa este o stare fiziologică tranzitorie a celulei bacteriene, care variază mult în cursul diferitelor faze ale multiplicării şi de la o specie bacteriană la alta. La Streptococcus pneumoniae, de exemplu, maximum de competenţă se situează la mijlocul fazei de multiplicare exponenţilă, iar la Bacillus subtilis, la sfârşitul ei. Se pare că agentul inductor al stării de competenţă este o ,,proteină activator” sintetizată de celula receptoare. Ea iniţiază o serie de alterări ale peretelui bacterian prin intermediul enzimei murein-hidrolaza, demascând receptorii pentru ADN din structura membranei citoplasmatice (Zarnea G.,1986). Celulele competente au peretele celular mai poros şi o suprafaţă intens electropozitivă, favorizând legarea fragmentelor de ADN, încărcate electronegativ. Totodată, la nivelul mezozomilor se produc modificări care sugerează posibilitatea implicării acestora în transportul ADNului transformant. Proporţia celulelor competente dintr-o populaţie bacteriană variază de la 10-20% la Bacillus subtilis, la 100% în cazul unor specii din genul Haemophilus. Procesul de transformare se realizează în mai multe etape, după cum urmează: ♦ fixarea fragmentului de ADN exogen pe celula receptoare la nivelul receptorilor specifici ; ♦ înglobarea ADN-ului transformant în celulă, sub formă monocatenară, cu ajutorul unei endonucleaze localizate în membrana celulară, care hidrolizează una din catene în timp ce ,,împinge” cealaltă catenă prin membrană; ♦ legarea reversibilă a catenei ADN-ului străin de o secvenţă complementară a ADN-ului endogen, prin interacţiuni ionice; 168

BACTERIOLOGIE GENERALA ♦

integrarea ireversibilă a catenei ADN-ului transformant în structura

ADN-ului receptor, prin substituirea unui segment de catenă pe baza omologiei nucleotidelor la situsul de legare. ♦ replicarea materialului genetic integrat odată cu replicarea întregii molecule de ADN endogen, a cărei parte componentă a devenit şi transmiterea ereditară a informaţiei genetice dobândite. Caracterele noi ale celulelor transformate reprezintă ,,markeri”, adică însuşiri pe baza cărora celulele care au suferit transformarea pot fi izolate de restul populaţiei bacteriene cu ajutorul mediilor selective. Deşi transformarea este un proces descoperit în laborator, numeroase observaţii pledează pentru existenţa sa în natură, unde acţionează ca un mecanism prin care unele specii ,,moştenesc” de la bacteriile moarte determinanţii genetici ai unor caractere, care le conferă o capacitate mai mare de adaptare la condiţiile de mediu. Transducţia fagică Transducţia este procesul prin care un fragment de cromozom bacterian este transferat de la o celulă bacteriană la alta prin intermediul capsidei anumitor fagi temperaţi. Fenomenul a fost descoperit de Z i n d e r şi L e d e r b e r g (1952) care, studiind fenomenul de recombinare genetică pe două tulpini auxotrofe diferite de Salmonella typhimurium, au realizat că se pot obţine celule prototrofe în absenţa contactului direct între celulele mutantelor auxotrofe, transferul de gene fiind mediat de un bacteriofag temperat (P22 ).

169

BACTERIOLOGIE GENERALA

Transducţia presupune, aşadar, trei parteneri (celula donatoare, fagul transductor şi celula receptoare) şi următoarele etape (fig. 46) : 1. infectarea tulpinii bacteriene donatoare cu virusul bacteriofag; 2. evoluţia infecţiei fagice în celulele donatoare sub forma ciclului litic (productiv) sau a ciclului lizogenizant (reductiv), când fagul preia un fragment de ADN din genomul celulei gazdă, devenind astfel fag transductor; 3. eliberarea fagului transductor din celule donatoare prin liza acesteia; 4. infectarea tulpinii bacteriene receptoare cu virusul transductor; 5. încorporarea fragmentului de ADN preluat de fag din celula donatoare, în genomul celulei receptoare, fenomen care poate fi asociat cu lizogenizarea acesteia. În funcţie de ciclul evolutiv al bacteriofagului transductor şi de materialul genetic transferat prin fag, transducţia poate fi împărţită în două tipuri distincte: transducţie generalizată şi specializată

170

BACTERIOLOGIE GENERALA

Fig.46 Reprezentarea schematică a unei experienţe de transducţie (după Zarnea G., 1970).

167

BACTERIOLOGIE GENERALA

Trasducţia generalizată presupune transducerea oricărei gene cromozomale, indiferent de poziţia ei în cromozom. Ea se realizată în majoritatea cazurilor atunci când infecţia fagică evoluează sub forma ciclului litic, care presupune replicarea ADN-ului viral şi traducerea informaţiei genetice virale, concretizată în sinteza proteinelor care intră în structura capsidei. Fagii de transducţie generalizată se formează printr-o greşeală de ansamblare, când unele capside fagice încorporează ADN bacterian în loc de ADN fagic, sau ADN bacterian şi o cantitate mică de ADN fagic. Mărimea fragmentului cromozomal încorporat este proporţională cu cea a genomului fagic normal, astfel încât ei nu se deosebesc ca dimensiuni, formă, caracteristici de adsorbţie şi proprietăţi antigenice, de fagii normali, alături de care se formează (Zarnea G.,1986). Fagii de transducţie generalizată sunt întotdeauna defectivi, în sensul că nu se replică şi nu lizează celula gazdă, deoarece sunt lipsiţi de genele virale esenţiale. După infecţia unei celule bacteriene cu un fag de transducţie generalizată, genele bacteriene introduse în celula receptoare se recombină cu ADN cromozomal din celula respectivă prin înlocuirea unor determinanţi genetici ai receptorului cu cei proveniţi de la donator. Transducţia specializată, cunoscută şi sub denumirea de transducţie restrictivă sau localizată, presupune provenienţa fagului transductor dintr-o bacterie lizogenă. Ea are loc în momentul reversiei fagului din forma epizomală de profag în cea de virus vegetativ, iar fragmentele de ADN transduse sunt întotdeauna cele din vecinătatea situsului unde a fost integrat genomul fagic. Odată cu excizia genomului viral din cel bacterian, de genomul viral vor rămâne ataşate secvenţele nucleotidice adiacente acestuia, care vor fi vehiculate de fag la populaţia 169

BACTERIOLOGIE GENERALA

acceptoare. Astfel, s-a stabilit că fagul λ (lambda), care infectează celulele de Escherichia coli, se integrează într-o regiune a cromozomului situată între operonii “gal” şi “bio” pe care îi transduce în mod obişnuit.

170

BACTERIOLOGIE GENERAL|

în cazul transducţiei specializate, plusul de ADN preluat din genomul bacterian nu înlocuieşte nici o secvenţă din genomul fagic, de aceea masa genomului fagic transductor este mai mare decât a fagului normal. încorporarea materialului genetic transdus în genomul celulei receptoare are un caracter instabil în cazul când se integrează împreună cu genomul viral şi stabil în condiţiile neintegrării genomului viral transductor. Fenomenul de transducţie are o incidenţă scăzută; într-un filtrat în care se găsesc bacteriofagi, numai un virion din 10 5-108 particule fagice se comportă ca fag transductor, iar la bacteriile receptoare, care au primit material genetic nou prin transducţie, caracterul dobândit (markerul) corespunzător materialului genetic primit, se exprimă fenotipic numai la una din 105 bacterii. Conjugarea Conjugarea este o modalitate de transfer de material genetic printr-un pil sexual, în urma contactului direct dintre celula donatoare şi cea receptoare, opuse ca sexualitate . Descoperirea fenomenului de conjugare s-a datorat cercetărilor efectuate de L e d e r b e r g şi T a t u m în 1946, pe trei tulpini de Escherichia coli, diferite din punct de vedere al exigenţelor nutritive: ♦ o tulpină sălbatică (prototrofă) de E. coli K12 , capabilă să sintetizeze singură 4 aminoacizi (biotina, metionina, treonina şi leucina) şi

171

BACTERIOLOGIE GENERAL|

♦ două tulpini auxotrofe, din care una capabilă să sintetizeze doar biotina şi metionina, iar cealaltă, treonina şi leucina. Autorii au cultivat cele trei tulpini pe medii de cultură minimale (uzuale), care nu conţineau cei 4 aminoacizi menţionaţi mai sus. Tulpina sălbatică s-a dezvoltat bine pe acest mediu, deoarece şi-a sintetizat cei 4 aminoacizi necesari, în timp ce nici una din mutantele auxotrofe n-a crescut, ele nefiind capabile să-şi sintetizeze câte 2 din cei 4 aminoacizi necesari. însămânţând însă pe acelaşi mediu minimal un amestec din ambele mutante auxotrofe, s-au dezvoltat aproximativ 20 de colonii. Deci, împreună ele au fost capabile să sintetizeze cei 4 aminoacizi. Căutându-se explicaţia acestui fenomen, s-a avut în vedere faptul că, utilizarea unor tulpini dublu mutante, deficiente în ceea ce priveşte sinteza a câte doi factori de creştere, exclude posibilitatea unei retromutaţii spontane la condiţia prototrofă, deoarece probabilitatea acestui fenomen este extrem de redusă. Rămânea ca plauzibilă ipoteza unui transfer genetic între cele două tulpini diferite genotipic, însămânţate împreună pe mediul minimal. Cultivarea lor într-un mediu lichid, în câte una din ramurile unui tub în formă de ,,U”, separate printr-un filtru poros, nu a mai avut ca efect apariţia de celule prototrofe, ceea ce a confirmat presupunerea că dezvoltarea de colonii prototrofe pe mediul solid era rezultatul unui transfer genetic, realizabil numai în condiţiile unui contact direct între celulele celor două tulpini. Faptul că deplasarea repetată, sub presiune, a lichidului de cultură dintr-o parte în alta a filtrului separator, era ineficientă pentru reconstituirea prototrofiei, excludea intervenţia ca agent transformant a ADN- ului eliberat din celulele lizate şi sugera necesitatea unui contact obligatoriu între celulele intacte, vii.

172

BACTERIOLOGIE GENERAL|

Ulterior, studii de microscopie electronică şi analiza genetică au confirmat această ipoteză, dovedind realizarea transferului de material genetic printr-un proces de conjugare între celulele bacteriene (Zarnea G.,1986). De-a lungul anilor, s-a demonstrat că recombinarea genetică prin conjugare are loc la numeroase alte bacterii Gram negative, înafară de Escherichia coli, dar şi la unele specii Gram pozitive (streptococi). I. Conjugarea la bacteriile Gram negative Capacitatea acestor bacterii de a transfera material genetic prin conjugare este determinată de prezenţa în celulă a plasmidelor F, sau a plasmidelor R şi Col conjugative, care au în structura lor determinanţii genetici ce controlează sinteza pililor sexuali: genele ,,tra” ( la plasmidele F şi Col ) şi genele ,,FTR”(la plasmidele R). Morfochimic şi funcţional există o similitudine între pilul sexual şi coada bacteriofagilor cu structură complexă. Analogia constă în structura tubulară a ambelor formaţiuni şi în funcţia pe care o îndeplinesc: aceea de a servi drept canal pentru injectarea de material genetic în celula bacteriană. Cele mai conjugative sunt plasmidele F care, spre deosebire de celelalte două tipuri, au capacitatea de a se integra reversibil în cromozom şi de a transfera gene cromozomale. în funcţie de starea autonomă sau integrată în care se găseşte factorul F în celula donatoare, receptorul fiind în toate cazurile o celulă F-, există mai multe tipuri de conjugare. a) Conjugarea dintre bacteriile F+ şi F − Este forma cea mai frecventă şi mai simplă, care presupune prezenţa factorului F în starea lui plasmidică. După sinteza pilului 173

BACTERIOLOGIE GENERAL|

sexual şi formarea cuplurilor, celulele F+(mascule) transferă o copie a plasmidei F, celulelor F − (femele) – fig. 47. Transferul se caracterizează printr-o eficienţă mare, de până la 100%, astfel încât în populaţiile bacteriene în care are loc această formă de conjugare, proporţia celulelor F+ creşte considerabil, în relaţie directă cu scăderea celulelor F-. în urma conjugării, fiecare celulă F- care primeşte factorul F, devine F+. Factorul F poate fi distrus prin tratarea celulelor F + cu acridinorange - substanţă care inhibă selectiv autoreplicarea factorului de sex. în cadrul acestei forme de conjugare nu se transferă niciodată material genetic cromozomal

174

BACTERIOLOGIE GENERAL|

Fig. 47. Reprezentarea schematică a conjugării între bacteriile F + şi

F- (după Zarnea G., 1970).

175

BACTERIOLOGIE GENERAL|

b).Conjugarea între bacterii Hfr (High frequency of recombinants) şi F-, numită recombinare de înaltă frecvenţă, presupune integrarea prealabilă a factorului F în cromozomul celulei, în regiuni ale acestuia în care există similitudini de secvenţă a bazelor azotate (trecerea lui în faza epizomală) – fig.

48. Fig.48. Reprezentarea schematică a procesului de conjugare la E. coli

între o celulă Hfr şi una F- : sus – transferul integral al cromozomului, inclusiv factorul F; jos – transferul parţial (un singur marker genetic) datorită întreruperii procesului.

176

BACTERIOLOGIE GENERAL|

Prezenţa în cromozom a factorului F conferă acestuia capacitatea de a fi transferat parţial sau total prin conjugare şi este determinantă pentru calitatea de Hfr sau de ,,supermascul” a celulei bacteriene. în stare integrată, factorul F se comportă diferit de forma sa plasmidică, în sensul că încetează să se mai replice autonom şi nu mai este transferabil decât excepţional de rar, deoarece el constituie întotdeauna fragmentul terminal al cromozomului angajat în transfer. în plus, replicarea factorului F integrat, sincronă cu cea a cromozomului, nu mai poate fi inhibată de acridinorange. Recombinarea următoarele faze:

de

înaltă

frecvenţă

se

desfăşoară

în

I. deschiderea inelului cromozmic în zona de inserţie a factorului F şi trecerea lui de la configuraţia ciclică, la cea lineară; II. transferul cromozomului către celula F-, începând cu extremitatea opusă factorului F; III. încheierea procesului de conjugare, care poate avea loc fie ca urmare a transferării cromozomului în întregime, fie ca urmare a întreruperii transferului pe parcurs. în prima situaţie, care presupune transferul factorului F, procesul durează 90 – 100 minute, iar celula receptoare devine F+ . în a doua situaţie, factorul F rămâne în celula donatoare (având în vedere poziţia sa terminală), motiv pentru care celula receptoare, deşi a primit prin transfer material genetic, rămâne F -. Durata conjugării depinde, în cazul transferului parţial, de mărimea segmentului transferat, ţinând seama că viteza de conjugare este de aproximativ 105 perechi de baze pe minut.

177

BACTERIOLOGIE GENERAL|

III Pe baza întreruperii la diferite intervale de timp a transferului s-a putut stabili succesiunea genelor pe cromozom şi au fost alcătuite hărţile genetice. Conjugarea de înaltă frecvenţă nu duce la sărăcirea materialului cromozomic în celula donatoare, fapt care se explică prin replicarea ADN-ului cromozomal în timpul conjugării, materialul transferat fiind, de fapt, o copie. Conjugarea între bacterii F’ şi F ducţia) – fig. 49. c).

−

(sexducţia sau F-

Tulpinile Hfr au uneori tendinţa să redevină F + , prin reversia factorului F din starea epizomală în starea plasmidică. în acest caz, factorul F poate conţine un număr variabil de gene cromozomale, pe care le-a încorporat în momentul reversiei din regiunile adiacente locului său de inserţie, devenind factor F’. Consecutiv transferului unui factor F’, celula receptoare Fdobândeşte calitatea de F+ prin primirea factorului de sex, caracterele codificate de genele cromozomice integrate în structura sa, precum şi calităţi Hfr. Transferul factorului F’ poate fi comparat cu transducţia, rolul fagului transductor fiind suplinit în acest caz de factorul F’, care vehiculează genele cromozomice către celula receptoare. Conjugarea iniţiată de factorii ,,R” poate duce la transferul plasmidei în întregime, numai a componentei RTF (care se poate desprinde de plasmidă, devenind independentă şi comportându-se asemănător cu o plasmidă F), sau numai a determinanţilor r . Transferul RTF conferă celulei receptoare, ca şi în cazul transferului de factor ,,F”, numai proprietatea de fertilitate. în această situaţie, dacă în receptor există determinanţi r, se poate reface o plasmidă R specificând o altă rezistenţă. 178

BACTERIOLOGIE GENERAL|

Transferul numai al determinanţilor r conferă antibiorezistenţă, dar nu şi capacitate de transfer

II.

Conjugarea la streptococi

Conjugarea la streptococi este mediată de unele plasmide (p, AD1 ) care nu conţin în structura lor determinanţii genetici ai pilului sexual. Rolul acestuia în conjugare este preluat de un sistem alcătuit din hormoni de sex (feromoni), secretaţi de celula receptoare, care activează în donator o gena plasmidică ce specifică sinteza unei substanţe de agregare. La coliziunea întâmplătoare a celor două tipuri

179

BACTERIOLOGIE GENERAL|

Fig.49. Fenomenul de sexducţie la bacterii (după Zarnea G.,1970). 180

BACTERIOLOGIE GENERAL|

de celule, substanţa de agregare prinde celula mascul de receptorii celulei femele (asemănător fixării pililor F) şi activează genele de transfer. Transferul ar putea avea loc fie printr-o punte intercitoplasmatică, fie traversând membranele citoplasmatice ale celor două celule aflate în contact, asemănător pătrunderii AND în procesul de transformare (Ivanof A.şi col. 1982). Etapele procesului de conjugare, indiferent de specia bacteriană şi de materialul transferat, sunt următoarele: a) formarea cuplurilor specifice donator-receptor, prin aderarea celulelor donatoare la nivelul unor receptorii specifici de pe suprafaţa celulei receptoare - proces condiţionat de o anumită densitate de celule bacteriene pe unitatea de volum; b) transformarea cuplurilor specifice în cupluri eficiente prin constituirea unor punţi de legătură donator-receptor (pil de sex, punte citoplasmatică); c) mobilizarea materialului genetic pentru transfer, prin desfacerea dublei catene ciclice a ADN-ului în dreptul unui situs, care reprezintă originea transferului (,,ori T”). La plasmidele F, ,,ori T” are un sediu distinct de cel în care are loc iniţierea replicării autonome a plasmidei. d) transferul materialului genetic prin replicarea de tip ,,inel rotativ” a ADN şi angajarea uneia din cele două catene replicate, în canalul punţii care leagă perechea donatorreceptor, în timp ce a doua catenă îşi reconstruieşte perechea complementară. Realizarea transferului necesită 181

BACTERIOLOGIE GENERAL|

un metabolism energetic activ, donatorului, cât şi a receptorului.

Mecanismele genetice

moleculare

ale

atât

din

partea

recombinărilor

Transferul de material genetic prin mecanismele naturale descrise anterior, are loc numai între celulele aceleaşi specii bacteriene şi în unele cazuri, între specii apropiate ∗. în celula gazdă, materialul genetic străin poate suferi două feluri de procese: restricţia sau modificarea. 1. Restricţia constă în degradarea enzimatică a ADN exogenot de către endonucleaze - enzime care se pot încadra în două tipuri distincte prin masa moleculară, compoziţia chimică şi condiţiile în care acţionează. Endonucleazele de tip I au masa moleculară de aproximativ 250000 daltoni, sunt constituite din mai multe subunităţi şi acţionează condiţionat de S-adenozil-metionină, ATP şi ionii de magneziu, care îndeplinesc rolul de cofactori. Endonucleazele de tip II au molecula mai mică (100000 daltoni) şi mai simplă, necesitând numai intervenţia ionilor de magneziu. Până în prezent au fost identificate peste 100 de endonucleaze cu situsuri diferite de recunoaştere a secvenţelor de nucleotide la nivelul cărora clivează catenele de ADN.

Prin tehnici de inginerie genetică a devenit posibil transferul de material genetic intergeneric şi chiar între regnuri diferite 

182

BACTERIOLOGIE GENERAL|

2. Modificarea este un mecanism celular prin care ADN este protejat de acţiunea endonucleazelor de restricţie, care se bazează pe efectul inhibitor al reacţiilor de metilare a unor baze (adenină sau citozină) asupra activităţii de clivare a secvenţelor de nucleotide. Exogenotul rămas nealterat datorită modificării, se recombină cu genomul endogenot prin una din cele două modalităţi posibile de recombinare: generalizată şi situs specifică (nelegitimă). Recombinarea generalizată are loc pe baza omologiei bazelor de la extremităţile celor două segmente recombinate. în majoritatea cazurilor, se produce la nivelul anumitor secvenţe nucleotidice, numite ,,zone fierbinţi” (hot spots). La Escherichia coli s-au evidenţiat până în prezent 6 gene la nivelul cărora eficienţa recombinării este mai mare. Ele sunt desemnate cu simbolul ,,rec”. La rândul lor, eficienţa genelor rec nu este egală, fiind de exemplu mai mare la genele rec A decât la genele rec B şi C. Pentru mecanismul molecular al încorporării fragmentului de ADN străin în genomul gazdei, au fost descrise două modele: a) modelul rupere şi reunire ( breakage-reunion) al lui M e s s e l s o n şi W e i g l e, admis astăzi ca cel mai probabil, conform căruia cele două materiale genetice se unesc la extremităţile lor libere în puncte omologe; b) modelul copierii alternative sau al alegerii modelului (copy choice), după care materialele parentale nu se unesc între ele dar, ca orice material genetic, se autoreplică. Pe baza acestui model, ADN nou format rezultă din copierea alternativă, când de pe matriţa catenei de ADN din celula receptoare, când de pe cea a ADN primit prin transfer de la donator. Materialul genetic al recombinatului este astfel integral sintetizat “de novo”, în structura sa fiind însă înscrisă informaţia genetică din ambele materiale parentale. 183

BACTERIOLOGIE GENERAL|

Indiferent de model, în genomul recombinat se pot deosebi două feluri de regiuni: ♦

regiuni homoduplex situate la extremităţile zonei unde s-a produs

recombinarea, care pot proveni de la acelaşi fragment genomic parental sau de la fragmente parentale diferite şi ♦ regiunea heteroduplex situată în centrul zonei unde a avut loc recombinarea, în care cele două catene provin din cele două genomuri parentale diferite. După recombinare, în regiunea heteroduplex au loc fenomene de separare a ADN în punctele de neomologie, ceea ce poate duce la pierderea unor gene alele şi la o segregare asimetrică a acestora, fenomen numit conversie genică. Recombinarea situs-specifică sau nelegitimă este posibilă între tulpini aparţinând unor taxoni mai îndepărtaţi. Ea se realizează prin translocare (transpoziţie), fenomen care constă în deplasarea unor fragmente de material genetic de la un situs la altul. Secvenţele de ADN translocabil identificate la bacterii sunt de două feluri: secvenţe de inserţie şi transpozoni. Secvenţele de inserţie sunt mai mici şi nu se exprimă fenotipic, în timp ce transpozonii sunt mai mari şi codifică unele caractere cum sunt: rezistenţa la antibiotice, factori de patogenitate, unele proprietăţi metabolice, etc. Procesul de translocare are următoarele particularităţi:

 este unilateral, în sensul că inserţia la un situs nu este dependentă de excizia de la un alt situs;

184

BACTERIOLOGIE GENERAL|

 are un grad de specificitate mai redus în comparaţie cu recombinarea generalizată, prezenţa unei secvenţe specifice la locurile de inserţie nefiind necesară;

 poate

determina scoaterea din funcţie a unor operoni situaţi în regiunea în care s-a integrat materialul translocat, care are deseori în structura sa codoni non sens;

 are

grade variabile de eficienţă, în funcţie de originea elementelor recombinate; translocările plasmidă-plasmidă şi cromozom-plasmidă sunt mai eficiente decât cele plasmidă-cromozom.

2.3.6. INFLUENŢA FACTORILOR ASUPRA BACTERIILOR

DE MEDIU

Ca şi viaţa organismelor superioare, viaţa microorganismelor este dependentă şi permanent influenţată de complexul factorilor fizici, chimici şi biologici, care constituie mediul ambiant. Citoplasma bacteriilor este formată dintr-un ansamblu heterogen de substanţe în stare coloidală sau cristaloidă, foarte sensibil la acţiunea diferiţilor agenţi externi. în condiţii favorabile de mediu, reacţiile metabolice implicate în procesele de creştere şi multiplicare se desfăşoară normal, în timp ce în urma unor acţiuni nefavorabile pentru aceste reacţii sau pentru substraturile lor, apar dezechilibre care se pot traduce prin: ♦ moartea bacteriei (efect bactericid); 185

BACTERIOLOGIE GENERAL|

♦ oprirea reversibilă a multiplicării (efect bacteriostatic); ♦ transformarea în spori, în cazul bacteriilor sporogene; ♦ modificarea bacteriei, fie prin inducerea mutaţiilor, fie prin selectarea mutantelor rezistente (vezi cap. Genetică). Determinarea unuia sau altuia dintre aceste efecte depinde de caracteristicile factorului activ (intensitatea sau concentraţia lui), particularităţile morfofiziologice ale bacteriei supusă acţiunii sale (structura învelişurilor celulare, sporogeneza, antibiorezistenţa, etc.), natura mediului în care are loc acţiunea (bacteriile înglobate în produse patologice, alimente, medii de cultură şi alte substanţe organice complexe sunt mai rezistente decât cele aflate într-o suspensie apoasă), timpul de acţiune (pentru acelaşi efect, timpul de acţiune este direct proporţional cu intensitatea factorilor fizici şi concentraţia celor chimici), etc. Studiul acţiunii factorilor de mediu asupra microorganismelor a avut drept rezultat deducerea şi elaborarea majorităţii metodelor nespecifice şi a produselor de care dispune astăzi medicina pentru prevenirea şi terapia infecţiilor: metodele de sterilizare, conduita lucrului aseptic, chimioterapia, antibioterapia.

2.3.6.1. Acţiunea bacteriilor

factorilor

fizici

asupra

2.3.6.1.1.Acţiunea temperaturii Spre deosebire de temperaturile extreme, care sunt nocive, temperaturile moderate permit desfăşurarea normală a proceselor metabolice şi prin aceasta, creşterea şi multiplicarea bacteriilor. 186

BACTERIOLOGIE GENERAL|

Ansamblul acestor valori termice reprezintă zona temperaturilor de dezvoltare. în această zonă, cuprinsă între –5 şi 70-800C, există valori care corespund temperaturii optime, minime şi maxime de dezvoltare pentru o specie dată. Diferenţa dintre temperatura minimă şi cea maximă este mare la bacteriile euriterme ( 60 C şi respectiv 500C) şi foarte mică la cele stenoterme (350 C şi respectiv 400 C). Temperatura optimă de dezvoltare este definită convenţional ca fiind temperatura la care diviziunile celulare se succed cu o viteză maximă, având ca rezultat formarea celui mai mare număr de celule bacteriene într-un timp dat (Zarnea G., 1994). Practic, s-a constatat însă că numărul cel mai mare de celule nu se acumulează când diviziunea se face foarte rapid, ci dimpotrivă, în condiţiile unei diviziuni mai lente deoarece se reduce ritmul de producere şi acumulare a produşilor toxici de catabolism (fig.50) Temperatura minimă de dezvoltare reprezintă valoarea termică cea mai scăzută la care bacteriile se mai multiplică încă în mod evident. La această temperatură, metabolismul este scăzut, iar ritmul diviziunilor celulare este diminuat în mod semnificativ. Astfel, intervalul dintre două diviziuni se prelungeşte de la 15 – 20 de minute la 6 – 7 ore şi chiar mai mult. Limita ei inferioară este determinată teoretic de temperatura de congelare a apei, dar în mod practic se situează sub 00C datorită faptului că punctul de congelare al constituienţilor celulari este mai scăzut decât cel al apei pure, în prezenţa moleculelor organice şi minerale pe care le conţin în soluţie.

în condiţii particulare care măresc zona de stabilitate fizică a apei celulare (conţinutul bogat în diferite substanţe, presiunea osmotică ridicată, etc.), temperatura minimă tolerată de bacterii poate să scadă până la –180. Aceasta explică de ce anumite specii bacteriene se multiplică în apa mării la - 5 0C, 187

BACTERIOLOGIE GENERAL|

110C, iar unele specii din genul Pseudomonas se multiplică în soluţii concentrate de zahăr (sirop de fructe) chiar la – 180 C.

Fig. 50 Efectul temperaturii asupra formării de biomasă la Staphylococcus aureus, în raport cu timpul. Cifrele indică durata generaţiei în minute, pentru fiecare temperatură (după Graham şi Smith, 1980 cit. de Zarnea G., 1994).

La asemenea temperaturi scăzute, toate reacţiile metabolice se desfăşoară atât de lent, încât durata unei generaţii este de săptămâni şi chiar luni. Temperatura maximă de dezvoltare reprezintă valoarea cea mai ridicată la care activitatea biologică a unei bacterii este încă posibilă, iar multiplicarea poate fi evidenţiată. Ea este de obicei cu 10-150C superioară temperaturii optime a speciei respective şi corespunde cu limita de termotoleranţă a proteinelor şi acizilor nucleici. 188

BACTERIOLOGIE GENERAL|

în funcţie de preferinţele termice, bacteriile, ca şi celelalte microorganisme, au fost grupate în trei categorii: psichrofile (criofile), mezofile şi termofile (tabel 7). Intervalele de temperatură minimă, optimă şi maximă specifice grupelor ecologice de temperatură nu sunt rigide şi diferă de la autor la autor.

Tabelul 7 Clasificarea bacteriilor după preferinţele termice Grupa ecologică

Caracteru l

Temperatura 0 C

Minimă

Optim ă

Maximă

-5 - 5

15 – 18

20 – 25

-5 - 5

25 - 30

30 - 36

Mezofile

10 – 15

30 – 40

35 – 47

Termofile

40 - 45

55 - 75

60 - 80

Hipertermofile

50 - 82

80 105

Psichrofile (Criofile)

obligate facultativ e

-

85 - 110

Bacteriile psichrofile, de exemplu, au fost considerate iniţial ca organisme capabile să se dividă în intervalul 0-300C. în realitate, există două grupe distincte de bacterii care se dezvoltă la asemenea temperaturi.

189

BACTERIOLOGIE GENERAL|

Denumirea de ,,psichrofile” este rezervată bacteriilor care se dezvoltă optim la cca 150C şi îşi încetează creşterea la valori termice de peste 200C. Din acest motiv, cultivarea lor în termostate reglate la temperaturi superioare acestei valori nu dă rezultate. Cealaltă grupă este constituită din speciile capabile să se multiplice la temperaturi pozitive apropiate de 00C, dar şi la temperaturi de 25-300C şi chiar mai mari. Ele au fost denumite psichrotrofe sau psichrofile facultative şi sunt adesea identificate cu bacteriile care se pot multiplica în condiţiile termice din frigider (40C). Unii autori grupează cele două subgrupe într-una singurămicroorganisme psichrofile – care cresc la temperaturi cuprinse între 0-300C, cu un optimum termic de 15 - 200C. Microorganismele psichrofile sunt de regulă saprofite şi îşi au habitatul în apele reci, în solul regiunilor de altitudine şi polare precum şi în alimentele conservate prin frig. Bacteriile mezofile au temperatura optimă de dezvoltare între 30 şi 400 C, cu limita superioară în jur de 45 0 C şi cea inferioară în jur de 100 C. Acest grup cuprinde majoritatea bacteriilor patogene pentru om şi animalele homeoterme, dar şi o mare parte dintre speciile saprofite. Bacteriile termofile au un preferendum termic cuprins între 55 şi 750C. Ele sunt prezente în apele uzate calde provenite de la diferite industrii, furajele însilozate, platformele de gunoi. Bacteriile hipertermofile se dezvoltă optim la temperaturi cuprinse între 80-1050C, fiind inactive la temperaturi mai mici de 60-800C. Habitatul acestor specii îl reprezintă izvoarele termale terestre şi submarine. Majoritatea sunt anaerobe şi au capacitatea de a metaboliza sulful. Temperatura maximă la care s-ar putea

190

BACTERIOLOGIE GENERAL|

desfăşura încă procesele metabolice a fost extinsă, pe baza unor date experimentale, până la 1500C. Mecanismele prin care bacteriile termofile şi hipertermofile sunt capabile de asemenea performanţe nu sunt încă elucidate, fiind propuse doar o serie de ipoteze; după unii autori, proteinele structurale şi enzimatice ale acestor bacterii ar avea o structură specială care le conferă termostabilitate. în cazul speciei Bacillus stearothermophilus, s-a constatat că fosfolipidele sunt formate aproape integral din sfingomieline, care au un punct de topire ridicat în raport cu cel al fosfolipidelor din celula bacteriilor mezofile. Acţiunea temperaturilor supramaximale Temperaturile care depăşesc limitele maxime tolerabile ale bacteriilor sunt nocive determinând moartea acestora. Efectul bactericid al căldurii – factorul cel mai utilizat în sterilizare - este atribuit în primul rând denaturării proteinelor celulare, în special a enzimelor, care sunt termosensibile. La aceasta se adaugă şi o gravă intoxicare celulară legată de faptul că, la temperaturi înalte procesele metabolice sunt intensificate, determinând o creştere rapidă a concentraţiei cataboliţilor toxici. în plus, la bacteriile aerobe apare o stare de asfixie ca urmare a creşterii nevoii de oxigen a celulelor şi a reducerii solubilităţii lui în mediu. Cu excepţia temperaturilor foarte ridicate, moartea unei populaţii bacteriene nu este instantanee ci se produce treptat, ceea ce permite evidenţierea unor factori care influenţează sensibilitatea bacteriilor la căldură şi anume: particularităţile de specie, gradul de umiditate, pH-ul şi compoziţia chimică a mediului, numărul iniţial de germeni, durata expunerii, etc. 191

BACTERIOLOGIE GENERAL|

Ca regulă generală, formele vegetative sunt mult mai sensibile decât sporii bacterieni, iar umiditatea crescută măreşte sensibilitatea la căldură, ca rezultat al hidratării celulare care favorizează coagularea proteinelor. Prin urmare, formele vegetative sunt omorâte în 10 minute la temperaturi de 50 – 600 C căldură umedă şi 60 – 800C căldură uscată, în timp ce sporii sunt omorâţi în 20 de minute la temperaturi între 100 – 1200 C căldură umedă şi 140 – 1800 C căldură uscată, în funcţie de specie. Sensibilitatea bacteriilor faţă de temperaturile ridicate este apreciată convenţional prin doi indicatori – punctul termic mortal şi timpul termic mortal - care reflectă temperatura letală şi respectiv, durata ei de acţiune (Duca Eugenia, Duca M., Furtunescu G., 1979). Punctul termic mortal reprezintă temperatura cea mai scăzută care omoară în 10 minute toţi indivizii unei populaţii microbiene, în condiţii standard: 1 – 2 ml suspensie cu o concentraţie de 50000 microbi/ml, în tampon fosfat pH 7, în tuburi de sticlă ermetic închise (pentru sterilizarea prin căldură umedă). Timpul termic mortal exprimă cel mai scurt interval de timp necesar pentru ca toţi indivizii unei populaţii microbiene să fie omorâţi la o temperatură dată, în condiţii standard. în mod corect, sensibilitatea bacteriilor la temperaturi ridicate se apreciază prin corelarea celor doi indici, deoarece, cu cât temperatura este mai ridicată, cu atât durata expunerii cu efect letal este mai mică şi invers. Acţiunea temperaturilor subminimale

192

BACTERIOLOGIE GENERAL|

Temperaturile scăzute sunt mai bine tolerate de microorganisme decât temperaturle supramaximale. Concomitent cu scăderea temperaturii sub limita minimă de dezvoltare, metabolismul se reduce treptat şi înmulţirea încetează. La temperaturile frigiderului (+4, + 100 C), majoritatea bacteriilor trec într-o stare de viaţă latentă, care poate să dureze luni şi chiar ani de zile dacă se evită uscarea. Excepţie fac unele specii adaptate la comensalism şi parazitism, cum sunt gonococul şi meningococul, care mor repede sub temperatura optimă de multiplicare. Stocarea în frigider reprezintă şi la ora actuală metoda curentă de conservare a culturilor bacteriene, alimentelor, medicamentelor şi a altor produse biologice. Procesul de îngheţare lentă, la temperaturi puţin sub 00 C, are un puternic efect bactericid determinat de acţiunea asociată a trei factori: 1. 2. 3.

denaturarea structurilor celulare prin deshidratarea lor; pierderea prin îngheţ a apei cu rol de solvent, ceea ce determină o concentrare a electroliţilor în celulă (,,moarte prin sare ”); ruperea învelişurilor celulei bacteriene sub acţiunea cristalelor de ghiaţă intra- sau extracelulare.

La temperaturi de congelare mult mai scăzute (- 300 C, 400 C), efectul bactericid este practic anulat, deoarece îngheţarea bruscă împiedică cristalizarea apei, care trece într-o stare amorfă, vitroasă (Zarnea G., 1970; Duca Eugenia, 1974). Decongelate brusc până la temperaturile optime de multiplicare şi introduse în medii favorabile, bacteriile îşi reiau metabolismul, creşterea şi multiplicarea.

193

BACTERIOLOGIE GENERAL|

îngheţarea, dar şi dezgheţarea lentă a bacteriilor compromit viabilitatea acestora, iar îngheţul şi dezgheţul repetat reprezintă chiar o metodă de dezintegrare a bacteriilor pentru extracţia conţinutului celular. Liofilizarea (gr. lio=lichid; filein=a atrage). Capacitatea microorganismelor de a rezista şi de a-şi conserva timp îndelungat viabilitatea atunci când suferă, în anumite condiţii, acţiunea unor temperaturi foarte scăzute, le face accesibile procedeului de conservare prin uscare în vid, precedată de congelare la temperaturi joase (-300, -800C). Acest procedeu, denumit liofilizare, este aplicat în practică pentru conservarea culturilor microbiene şi a diferitelor produse biologice (preparate enzimatice, extracte celulare, toxine, antibiotice, etc.). El asigură o conservare îndelungată (timp de ani sau zeci de ani) în vid sau în prezenţa unui gaz inert (argon). Deşi, în cazul culturilor microbiene această modalitate de conservare se însoţeşte de o diminuare a numărului de celule viabile, în mod obişnuit rămân totdeauna suficiente celule capabile să iniţieze dezvoltarea unei culturi. Asocierea congelării la uscare are scopul de a diminua nocivitatea desicaţiei, determinând modificări ale citoplasmei similare celor care, în mod natural, însoţesc sporularea. Produsul final al liofilizării este o pulbere foarte solubilă în diferite lichide.

2.3.6.1.2. Acţiunea gradului de ionizare Majoritatea proceselor vitale sunt condiţionate de pH-ul mediului de cultură. Fiecare specie se dezvoltă la un anumit pH optim, caracteristic speciei respective. în general, pH-ul optim pentru bacteriile patogene este neutru sau uşor alcalin, cuprins între 7,2-7,4 - pH care corespunde cu gradul de ionizare al ţesuturilor şi umorilor 194

BACTERIOLOGIE GENERAL|

organismului. Există însă patogeni adaptaţi la aciditatea gastrică (pH =1,6-2,0), cum este cazul speciei Helicobacter pylori, căreia i se atribuie responsabilitatea etiologică în ulcerul gastroduodenal la om. Ionii de H (mediile acide) sunt mai toxici decât ionii oxidrilici OH (mediile alcaline)

2.3.6.1.3.Acţiunea presiunii osmotice Se ştie că presiunea osmotică a unei soluţii este direct proproţională cu concentraţia totală a diferiţilor ioni şi molecule prezente în soluţie. în condiţii normale, o soluţie molară a unui ion oarecare are o presiune osmotică de 22,4 atmosfere. în general, presiunea osmotică din interiorul celulelor bacteriene este mai mare decât a mediilor de cultură uzuale, datorită faptului că citoplasma conţine în stare solvită cantităţi mari de substanţe minerale şi organice. Ca urmare, apa din mediu tinde să pătrundă în celulă pentru egalizarea concentraţiilor intraşi extracelulare a substanţelor solvite, determinând o stare de turgescenţă a acesteia, caracteristică de altfel tuturor celulelor vii. Dezvoltarea bacteriilor decurge normal atunci când mediul lor de viaţă are o presiune osmotică aproximativ echivalentă cu cea intracelulară, deci în condiţii de izotonie. Excepţie fac bacteriile osmofile, care se dezvoltă numai în medii cu presiune osmotică ridicată şi bacteriile osmotolerante sau facultativ osmofile, care se pot dezvolta la presiuni osmotice variabile. Ele se numesc halofile atunci când se dezvoltă în condiţiile unei salinităţi crescute (apa mărilor şi a oceanelor, a lacurilor sărate şi a salinelor, în care concentraţia de NaCl poate atinge 16 – 35 % ) şi zaharofile când se dezvoltă în prezenţa unei concentraţii mari de zahăr (50 – 70%). Dintre bacteriile patogene, doar stafilococii, vibrionii şi listeriile (Larpent J.P., 2000) sunt capabile să se dezvolte în 195

BACTERIOLOGIE GENERAL|

medii hipersaline. Halofilia constituie un important criteriu taxonomic şi reprezintă proprietatea pe care se bazează izolarea acestor bacterii în culturi pure folosind mediile selective hiperclorurate. Spre deosebire de celulele animale care, fiind lipsite de un perete celular rigid sunt foarte sensibile la variaţiile osmotice, majoritatea bacteriilor - protejate de un perete celular suficient de rezistent (mai ales la Gram pozitive) – suportă relativ uşor modificările presiunii osmotice, dacă abaterile de la izotonie survin lent. Micoplasmele - bacteriile lipsite de perete celular – evită apariţia unor diferenţe mari de presiune osmotică prin acumularea în celulă a unor concentraţii mici de Na+ şi K+ . în cazul variaţiilor mari şi bruşte ale presiunii osmotice, bacteriile suferă două tipuri de modificări: plasmoliza şi plasmoptiza. Plasmoliza sau ,,uscarea osmotică” se produce în mediile hipertonice, deoarece apa din celulă trece în mediul extracelular. în consecinţă, volumul celulei se reduce iar citoplasma se retractează odată cu membrana celulară, dezlipindu-se de peretele celular. în această stare, unele bacterii intră într-o fază de viaţă latentă, iar altele mor. Uscarea osmotică are aplicaţii în conservarea alimentelor prin saramurare şi în siropuri concentrate de zahăr. Prezenţa bacteriilor osmofile în aceste condiţii nu determină întotdeauna alterarea alimentelor, unii halofili având chiar o acţiune utilă prin participarea la procesele de ,,maturare” a unor alimente (brânzeturi, carne sărată, ş.a.). Plasmoptiza are loc în cazul suspendării bacteriilor într-un mediu hipotonic (de exemplu, apa distilată). Din cauza pătrunderii apei din exterior, turgescenţa celulei creşte până când presiunea intracelulară, depăşind capacitatea de distensie a peretelui celular, 196

BACTERIOLOGIE GENERAL|

determină ruperea învelişurilor şi moartea bacteriei prin dispersia citoplasmei în mediu.

2.3.6.1.4. Acţiunea presiunii hidrostatice Rezistenţa bacteriilor la acţiunea presiunilor înalte este variabilă în funcţie de habitatul lor natural şi este favorizată de capacitatea de sporogeneză, sporul fiind de două ori mai rezistent decât forma vegetativă. în funcţie de comportarea lor în raport cu valoarea presiunii hidrostatice, bacteriile pot fi (Zarnea G., 1994): a) barofobe, sensibile la presiuni care depăşesc 200 de atmosfere – categorie în care se încadrează bacteriile din sol, apele puţin adânci, zonele de suprafaţă a oceanelor şi mărilor; b) barofile - bacterii care populează adâncul mărilor (- 1500m) şi sunt adaptate la presiuni de 400-500 atmosfere, în lipsa cărora unele specii (barofilele absolute) nu se pot dezvolta; c) barotolerante, care preferă presiunea normală (1 atm.) dar suportă şi presiuni moderat ridicate; d) barodure sau abisale, izolate de pe fundul mărilor şi din adâncul oceanelor (- 5100 m), capabile să reziste la 1000 – 1400 atmosfere (ex. Pseudomonas bathycetes). Majoritatea bacteriilor sunt foarte sensibile la modificările bruşte alternative ale presiunii, astfel încât compresarea şi decompresarea poate constitui un procedeu de distrugere a celulelor bacteriene.

197

BACTERIOLOGIE GENERAL|

2.3.6.1.5. Acţiunea radiaţiilor Radiaţiile electromagnetice emise de soare au lungimi de undă diferite, pe baza cărora au fost grupate în categorii distincte (tabel 8). Efectul acţiunii radiaţiilor asupra microorganismelor diferă în funcţie de lungimea de undă a acestora. Astfel, radiaţiile cu lungimi de undă mai mari de 12000 A 0 (radiaţiile herţiene şi cele infraroşii) au un conţinut energetic atât de slab, încât sunt incapabile să producă o schimbare în structura chimică a materiei vii care le absorarbe. Radiaţiile cuprinse între 12 000 A0 şi 2000 A0 au un conţinut energetic suficient pentru a provoca modificări fotochimice cu efect bactericid. Dintre acestea, o largă utilizare în practica decontaminării o au radiaţiile ultraviolete (UV). Eficacitatea bactericidă maximă a UV se manifestă în intervalul 2600 – 2700 A0, care corespunde cu absorbţia maximă a radiaţiilor de către acizii nucleici. Această energie suplimentară determină ruperea punţilor de hidrogen intercatenare şi înlocuirea lor cu legături mai solide, de tip dimer timină - timină, blocând astfel replicarea ADN-ului (Zarnea G.,1970). Tabelul 8 Clasificarea radiaţiilor electromagnetice Tipul radiaţiilor

Lungimea de undă

Radiaţii cosmice

0,0001 – 0,01 A0

Radiaţii γ

0,01 – 1,0 A0

Radiaţii X

100 A0

Radiaţii ultraviolete

100 – 4000 A0

Spectrul vizibil

4000 – 6000 A0 198

BACTERIOLOGIE GENERAL| Radiaţii roşii

6000 – 50 000 A0

Radiaţii infraroşii

50 000 A0 – 1 cm

Radiaţii hertziene

1 cm – 545 m

Efectul letal al UV se exercită şi în mod indirect, prin acţiunea fotochimică asupra mediului (formarea de ozon în aer şi peroxizi în ape). Printr-un mecanism necunoscut încă, un număr de indivizi dintr-o populaţie bacteriană iradiată letal cu UV ,,reînvie” în urma expunerii acesteia la lumină în următoarele trei ore. Fenomenul poartă denumirea de fotorestauraţie. în general, la acţiunea radiaţiilor ultraviolete sunt mai sensibile formele vegetative decât sporii bacterieni. Bacillus anthracis, de exemplu, în stare vegetativă este distrus în 30 de minute, iar sub formă sporulată, numai după două ore. Utilizarea radiaţiilor ultraviolete în decontaminare a devenit posibilă prin realizarea lămpilor cu vapori de mercur, care emit UV cu lungimi de undă de 254 nm, foarte active. Aceste lămpi sunt utilizate pentru sterilizarea aerului din laboratoare, săli de operaţie, clinici veterinare şi alte spaţii, precum şi pentru sterilizarea suprafeţelor de lucru pe care UV cad perpendicular: mese de laborator, mese de operaţie, etc. Radiaţiile cu lungimi de undă sub 2000 A0 au un conţinut energetic atât de ridicat încât moleculele situate pe traiectul lor sunt ionizate prin desprinderea electronilor, de unde şi denumirea de radiaţii ionizante dată radiaţiilor X, particulelor alfa, beta şi gama şi radiaţiilor cosmice. Efectul ionizării este mutagen sau letal, în funcţie de capacitatea de penetrare a radiaţiei.

199

BACTERIOLOGIE GENERAL|

Acţiunea radiaţiilor gama, cele mai penetrante şi microbicide, este din ce în ce mai utilizată în sterilizarea la scară industrială a unor produse farmaceutice, medicale (seringi, sonde, etc.) şi alimentare, care nu suportă sterilizarea termică.

2.3.6.1.6. Acţiunea factorilor mecanici Bacteriile, având dimensiuni mici şi un perete rigid, sunt în general rezistente la leziunile de ordin mecanic. Totuşi, particulele mici şi dure, sub formă de pudre fine cu granule de ordinul micrometrilor, pot distruge peretele celular dacă sunt agitate energic cu o suspensie bacteriană.

2.3.6.1.7. Acţiunea ultrasunetelor Ultrasunetele (vibraţiile cu o frecvenţă mai mare de 20 000 Hz) produc moartea bacteriilor prin ruperea pereţilor celulari, ca o consecinţă a fenomenului de cavitaţie. Acesta constă în bombardarea bacteriilor de către bulele foarte mici de gaz care se formează în lichidul de suspensie, ca rezultat al agitaţiei produse de vibraţiile cu frecvenţă înaltă. Acţiunea bactericidă a ultrasunetelor a găsit aplicaţii în industria vaccinurilor pentru dezintegrarea celulelor bacteriene în scopul eliberării antigenelor somatice, în separarea endoenzimelor bacteriene sau a altor constituienţi chimici ai celulei bacteriene şi în sterilizarea anumitor produse.

2.3.6.2 Acţiunea factorilor chimici asupra bacteriilor

200

BACTERIOLOGIE GENERAL| în

funcţie de natura şi concentraţia lor, substanţele chimice pot exercita asupra bacteriilor un efect favorabil, atunci când pot fi utilizate ca surse plastice şi energetice, sau un efect nociv (bacteriostatic sau bactericid), prin producerea unor dezechilibre fizico – chimice. De exemplu, în concentraţie de 1% zaharoza reprezintă o sursă de carbon şi energie, iar în concentraţii mari (40%) se comportă ca un agent bacteriostatic faţă de majoritatea speciilor. Acţiunea substanţelor chimice diferă nu numai în raport cu natura şi concentraţia unei substanţe date, ci şi în funcţie de particularităţile fiziologice ale bacteriilor supuse acţiunii ei. Mycobacterium tuberculosis, de exemplu, reclamă pentru dezvoltare, prezenţa în mediul de cultură a glicerinei - substanţă nocivă pentru restul speciilor bacteriene. Substanţele cu efect antibacterian au o largă utilizare în acţiunile de prevenire şi combatere a bolilor infecţioase prin decontaminare (dezinfectantele şi antisepticele), precum şi în terapia acestora (chimioterapicele de sinteză). Substanţele utilizate în decontaminare – acţiunea de îndepărtare, neutralizare sau distrugere a microorganismelor de pe suprafaţa elementelor animate şi neanimate - se numesc dezinfectante dacă, din cauza efectelor iritante sau toxice, pot fi aplicate numai pe suprafeţe inerte (duşumele, jgheaburi, pereţi, instrumentar, etc.) şi antiseptice, dacă toxicitatea mai redusă permite aplicarea lor pe tegumente, mucoase sau plăgi (Coman I., Bârhală Helena-Maria, Florescu Rodica, 1997; Buiuc D., Neguţ M., 1999). Uneori, aceeaşi substanţă (de exemplu, cloramina) în soluţii diluate este antiseptic, iar în soluţii concentrate, dezinfectant. Agenţii

decontaminanţi

îşi

microorganismelor pe diverse căi:

201

exercită

acţiunea

nocivă

asupra

BACTERIOLOGIE GENERAL|

♦ modificarea permeabilităţii peretelui celular şi a membranei citoplasmatice (fenolul, săpunurile, detergenţii anionici şi cationici); ♦ denaturarea proteinelor, determinând suprimarea activităţii enzimatice şi precipitatea sau coagularea proteinelor structurale (acizii, alcalii, alcoolii); ♦ interferenţa cu grupările active ale enzimelor, blocând sau modificând activitatea enzimatică (formaldehida, sărurile metalelor grele, permanganatul de K, peroxizii, clorul ); etc. Chimioterapicele sunt produse de sinteză a căror acţiune toxică se exercită selectiv asupra microorganismelor, fără a leza celulele organismului gazdă, ceea ce permite utilizarea lor în terapia infecţiilor. Principalele grupe de substanţe chimioterapice sunt: sulfamidele, nitrofuranul şi derivaţii acestuia, acidul paraaminosalicilic (PAS), hidrazida acidului nicotinic (HIN), etanbutolul, acidul nalidixic şi derivaţii săi, etc. Majoritatea au efect bacteriostatic şi acţionează ca, inhibitori competitivi ai unor produşi de metabolism esenţiali pentru celula bacteriană. Sulfamidele, de exemplu, acţionează prin blocarea sintezei acidului folic - factor indispensabil pentru formarea acizilor nucleici, respectiv pentru creşterea şi multiplicarea bacteriilor. Datorită analogiei sterice cu acidul paraaminobenzoic (vitamina H), care este precursor în sinteza acidului folic, sulfamidele intră în competiţie cu acesta, substituindu-l şi formând analogi nefuncţionali ai acidului folic (fig.51). Bacteriile cu funcţiile de creştere blocate din cauza sulfamidelor, care acţionează ca o antivitamină, sunt distruse de organism prin elementele naturale de apărare ale acestuia. 202

BACTERIOLOGIE GENERAL|

Celulele organismul gazdă, precum şi unele bacterii care nu sintetizează acidul folic ci sunt dependente de aportul exogen, nu sunt sensibile la acţiunea toxică a sulfamidelor. De asemenea, sunt rezistente la sulfamide speciile bacteriene care produc masiv acid p-aminobenzoic şi care înving astfel în competiţia cu sulfamidele. în cadrul speciilor sensibile (gonococ, streptococ, pneumococ, etc.), pot să apară mutante sulfamidorezistente. Acestea sunt relevate de mediile cu sulfamide, care permit multiplicarea mutantelor, inhibând celule bacteriene sensibile. După obţinerea unor antibiotice prin sinteză chimică, unii autori au introdus şi antibioticele în categoria chimioterapicelor. în sens strict însă, termenul de substanţă chimioterapică trebuie rezervat produselor obţinute exclusiv prin sinteză chimică şi nu plecând de la un model de natură biologică.

203

BACTERIOLOGIE GENERAL|

Fig.51 Mecanismul de acţiune a sulfamidelor

2.3.6.3. Acţiunea factorilor biologici asupra bacteriilor Relaţiile care se stabilesc între microorganismele care ocupă o nişă ecologică, precum şi relaţiile dintre microorganisme şi organismele superioare, animale şi vegetale, constituie de fapt relaţii sau raporturi ecologice. De aceea considerăm ca fiind oportună detalierea lor în capitolul ce urmează.

2.3.7. NOŢIUNI DE ECOLOGIE MICROBIANĂ Ecologia microorganismelor este unul dintre cele mai noi domenii ale microbiologiei, care studiază relaţiile biologice dintre microorganismele prezente într-un habitat comun şi interacţiunile care apar între componenţii biotici şi abiotici ai acestuia (Zarnea G., 1994). Pentru a caracteriza poziţia unei populaţii de microorganisme într-o comunitate se utilizează în mod curent termenii de ,,habitat”, ,,nişă ecologică” sau ,,biotop”, deşi semnificaţia lor nu este în întregime superpozabilă. Habitatul unui microorganism reprezintă locul în care acesta trăieşte, se reproduce sau, cel puţin, supravieţuieşte. Dimensiunile habitatelor variază de la foarte mari (oceane, mări), la foarte mici (intestinul unei insecte) iar numărul lor este 204

BACTERIOLOGIE GENERAL|

imens, deoarece, puţine regiuni de pe suprafaţa planetei sunt lipsite de microorganisme. Natura habitatelor este de asemenea foarte variată incluzând solul, apele dulci şi marine, aerul, animalele, plantele, etc. Atunci când în perimetrul unui habitat parametrii factorilor fizico-chimici sunt neuniformi, se crează regiuni, uneori foarte apropiate, care oferă condiţii favorabile pentru anumite specii şi intolerabile pentru altele, numite microhabitate. Tractusul intestinal al mamiferelor, de exemplu, nu reprezintă un habitat unic ci un mozaic de microhabitate, situate în lumenul diferitelor segmente anatomice, pe suprafaţa epiteliilor şi în criptele mucoaselor care căptuşesc aceste segmente. Conceptul de ,,biotop” şi cel de ,,nişă ecologică” au o semnificaţie mai largă, deoarece se referă nu numai la spaţiul ocupat de un microorganism ci şi la funcţia lui în habitat. Ansamblul de microorganisme care populează un biotop constituie microbiocenoza sau microbiota biotopului respectiv.

2.3.7.1. Răspândirea microorganismelor în natură Microorganismele sunt prezente, din abundenţă, în toate mediile în care au fost căutate: sol, ape, aer, corpul fiinţelor vii (om, animale, plante), materia organică moartă, etc. Această ubicvitate decurge din capacitatea de a coloniza şi de a supravieţui în habitatele cele mai puţin adecvate vieţii (fundul oceanelor, gheţurile polare, zăcămintele de ţiţei, izvoarele hidrotermale, etc.) şi de a metaboliza cele mai neobişnuite substraturi anorganice (N2, S, CO, CO2) şi organice (hidrocarburi, fenoli, crezoli, lemn, asfalt, etc.). în ceea ce priveşte răspândirea pe verticală a microorganismelor, ea este de asemenea neobişnuit de extinsă în raport cu a celorlalte vieţuitoare. Cu ajutorul unor sonde speciale, bacteriile au putut fi detectate în atmosferă la înălţimea de 12.000 205

BACTERIOLOGIE GENERAL|

m, la 4000 m adâncime în pământ şi la 11000 m în adâncul mărilor şi al oceanelor. Practic, nu există mediu natural la nivelul căruia să fie posibilă viaţa şi din care microorganismele să lipsească. Distribuţia microorganismelor în natură, aspectele calitative şi cantitative ale microflorei sunt determinate în cea mai mare parte de particularităţile biotopului. De exemplu, în lacurile sărate predomină bacteriile halofile, în apele termale se găsesc microorganisme termofile şi termotolerante, care lipsesc în izvoarele reci, iar în regiunile polare şi în adâncul oceanelor, unde temperatura rămâne tot timpul coborâtă, trăiesc numai bacterii psichrofile. în mediile naturale obişnuite, mai puţin selective, microflora este mult mai heterogenă şi mai uniform răspândită, astfel încât graniţele comunităţilor de microorganisme sunt greu, sau uneori chiar imposibil de delimitat. Cu toate acestea, pe baza unor criterii cum sunt prezenţa constantă şi în număr mare, microorganismele din fiecare biotop pot fi grupate în două categorii: 1. microorganisme adaptate filogenetic la condiţiile fizico– chimice oferite de biotop, care alcătuiesc o comunitate de populaţii (specii) relativ stabilă, formând microbiota autohtonă ( normală sau rezidentă ) şi 2. microorganisme provenite din alte medii, a căror prezenţă este în mod obişnuit tranzitorie, deoarece sunt mai puţin adaptate la noile condiţii. Ele constituie microbiota alohtonă sau străină a biotopului respectiv. Eliminarea alohtonilor este determinată de incapacitatea lor de a competiţiona cu microorganismele autohtone, mai numeroase şi mai bine adaptate, sau cu factorii abiotici diferiţi. Studiul comunităţilor de microorganisme care ocupă constant un biotop a arătat că structura lor evoluează în timp şi că stabilitatea finală a acesteia este condiţionată de înlocuirea unor populaţii cu 206

BACTERIOLOGIE GENERAL|

altele mai bine adaptate şi care, prin interacţiuni de tip cooperant, asigură cea mai bună exploatare a habitatului. Fenomenul este cunoscut sub denumirea de succesiune ecologică, iar ecosistemul terminal stabilizat este numit climax.

2.3.7.2.Microbiota apelor Micobiota autohtonă a apelor variază, sub aspectul structurii populaţiilor de microorganisme, în funcţie de caracteristicile fizicochimice ale mediului acvatic şi este corelată cantitativ cu bogăţia în nutrienţi. Cea mai redusă încărcătură microbiană o are apa de izvor în apropiere de sursă, datorită suportului nutritiv foarte redus. Microorganismele prezente sunt cele antrenate din straturile subterane în cursul trecerii spre suprafaţă. în cazul izvoarelor minerale, apa conţine o microbiotă autotrofă specifică, capabilă să metabolizeze Fe, S, sau alte minerale şi compuşii lor anorganici. Cea mai abundentă şi mai variată microfloră se găseşte în apele de suprafaţă (râuri, lacuri), deoarece conţin cantităţi relativ mari de substanţe organice provenite din flora şi fauna proprie. în plus, ele sunt expuse contaminării cu microorganisme din sol şi din apele reziduale deversate de centrele urbane şi marile complexe zootehnice. Pe lângă bacteriile provenite din sol, (Azotobacter spp, bacterii nitrificatoare, etc.), râurile conţin comunităţi bacteriene ce se diversifică pe măsura îndepărtării de izvoare. Microbiota normală, cu un caracter permanent, este compusă din bacterii aprţinând genurilor Achromobacter, Acinetobacter, Caulobacter, Flavobacterium, Hyphomicrobium, Moraxella, Pseudomonas, Aeromonas, etc., din cianobacterii, levuri şi microfungi.

207

BACTERIOLOGIE GENERAL|

Lacurile şi alte ape stătătoare au o microbiotă extrem de variată, care include practic toate categoriile de microorganisme: bacterii, microfungi, microalge şi protozoare. Microbiota mărilor şi a oceanelor este alcătuită din microorganisme psichrofile, barofile şi halofile - însuşiri care constituie adaptări la particularităţile acestui biotop. Ele prezintă şi un pleomorfism accentuat, determinat probabil de efectele presiunilor hidrostatice mari (Zarnea G., 1994). Majoritatea microorganismelor al căror habitat natural îl constituie apele, nu trăiesc liber ci sunt asociate cu planctonul şi cu detritusurile organice, având un rol major în mineralizarea acestora. Dintre bacteriile asociate zooplanctonului, unele prezintă potenţial patogen pentru peşti, fiind capabile să producă infecţii cu evoluţie endemico-epidemică şi pierderi economice apreciabile (Aeromonas hydrophila, Aeromonas salmonicida, Vibrio anguillarum, etc.), iar altele, prezente la diverse specii din fauna marină (peşti, crabi, scoici, etc.), sunt agenţi ai toxiinfecţiilor alimentare (Vibrio parahaemolyticus, Vibrio vulnificus, Aeromonas hydrophila, Clostridium botulinum tip E, etc.). Microbiota alohtonă, contaminantă, a apelor de suprafaţă se compune deseori din bacterii patogene pentru om şi pentru animale, apa reprezentând sursa de infecţie pentru un număr mare de boli infecto-contagioase (leptospiroza, salmoneloza, tuberculoza, febra aftoasă, etc.). Infecţiile pentru care sursa principală de contaminare este apa, sunt cunoscute sub denumirea generică de infecţii hidrice. Bacteriile patogene, ajunse accidental în mediul acvatic, au o existenţă temporară din cauza următorilor factori inhibanţi : a. diluţia mare a substanţelor nutritive şi temperatura relativ scăzută a apei; b. competiţia cu populaţiile microbiene acvatice rezidente, mult mai numeroase şi mai adaptate la condiţiile oferite de acest mediu; 208

BACTERIOLOGIE GENERAL|

c. prezenţa în apă a bacteriofagilor, care le distrug prin bacterioliză; d. acţiunea bactericidă a razelor solare, care sunt eficiente, dacă apa este limpede, până la 1 m adâncime. Datorită factorilor menţionaţi, apele de suprafaţă suferă un proces de autopurificare, graţie căruia, la aproximativ 10-20 km în aval de sursa contaminantă, apele râurilor sunt în general lipsite de germeni patogeni. Apele subterane rezultă din ploi, topirea zăpezilor şi infiltrarea apei din lacuri şi râuri până la nivelul unor straturi impermeabile. încărcătura microbiană a acestor ape este invers proporţională cu adâncimea şi dependentă de natura subsolului străbătut, care acţionează ca un filtru mai mult sau mai puţin sterilizant. Rocile nisipoase au proprietatea de a reduce numărul germenilor din apă, reţinându-i în cursul fitrării, în timp ce rocile calcaroase, care sunt parţial dizolvate, permit trecerea microorganismelor. O l s o n şi colaboratorii (cit. de Zarnea G.,1994) au evidenţiat prezenţa bacteriilor sulfito-reducătoare la adâncimea de 1264 – 1752 m.

2.3.7.3. Microbiota solului Solul conţine un număr imens de virusuri bacteriofage, bacterii, microfungi, protozoare şi alge, de o diversitate mai mare decât alte medii naturale. Microorganismele autohtone sunt cele mai numeroase şi sunt caracteristice pentru un anumit tip de sol. Majoritatea sunt autotrofe, astfel încât dezvoltarea lor nu este condiţionată de nutrienţii din afara solului şi nu sunt expuse la fluctuaţii numerice semnificative (Zarnea G., 1994). Rolul lor este imens pentru nutriţia plantelor şi asigurarea fertilităţii solului, deoarece sunt singurele organisme 209

BACTERIOLOGIE GENERAL|

capabile să îmbogăţească solul în azot prin fixarea azotului molecular din marele rezervor atmosferic. Unele dintre ele – microorganismele zimogene, sau de fermentaţie - sunt heterotrofe, fiind dependente de substanţele organice provenite din exterior (resturi vegetale, excrete, cadavre animale, etc.). Prin activitatea lor metabolică, aceste bacterii realizează mineralizarea rezidurilor organice, având un rol esenţial în circuitul natural al carbonului şi azotului. Ele sunt puţin numeroase şi au o activitate periodică, dezvoltându-se luxuriant după adăugarea substanţelor organice exogene, pentru a reveni la normal când concentraţia nutrienţilor accesibili a diminuat. Microbiota alohtonă a solului se compune din patogenii pentru plante, animale şi om, care ajung în sol odată cu ţesuturile vegetale infectate, apele reziduale, dejecţiile, secreţiile şi cadavrele animalelor bolnave. Solurile cele mai contaminate se află în perimetrul spitalelor, fermelor zootehnice, staţiunilor de ecarisaj, cimitirelor de animale, etc. Aceste microorganisme au un caracter tranzitoriu, deoarece în sol nu găsesc condiţii de multiplicare ci numai de supravieţuire temporară, condiţionată de factorii de mediu şi de eventualitatea întâlnirii cu specia-gazdă. Cea mai mare longevitate o au bacteriile patogene sporogene (genurile Bacillus şi Clostridium), care rezistă în sol zeci sau chiar sute de ani. Infecţiile pentru care sursa primară de contaminare este solul, poartă denumire de infecţii telurice (antraxul, tetanosul, cărbunele emfizematos). Concentraţia microorganismelor în sol este maximă în straturile superioare ale acestuia (primii 5 cm; rareori până la 150 cm), exceptând stratul extern cu o grosime de câţiva milimetri, unde numărul de germeni este mai redus din cauza factorilor de mediu 210

BACTERIOLOGIE GENERAL|

care acţionează direct asupra lor (razele ultraviolete, căldura, variaţiile bruşte de temperatură şi umiditate, etc). Straturile profunde ale solului, cu excepţia celor care prezintă fisuri, sunt lipsite de microorganisme, din cauza rolului de filtru pe care îl joacă straturile succesive.

2.3.7.4. Microbiota aerului Aerul nu poate fi considerat un biotop în sensul strict al cuvântului deoarece, fiind lipsite de un suport nutritiv, microorganismele nu se pot multiplica. în acest mediu, ele găsesc doar condiţii de supravieţuire temporară, cel mai adesea în stare latentă (sub formă de spori). De aceea, ideea mai veche a existenţei unei microbiote specifice aerului, a fost abandonată (Zarnea G., 1994). Aerul reprezintă însă cel mai important mijloc de dispersare a microorganismelor, curenţii de aer putând să le vehiculeze, atât pe orizontală cât şi pe verticală, la distanţe apreciabile. Antrenate de curenţii de aer şi protejate de picăturile mici de apă sau praf, bacteriile ajung până la înălţimea de 500 m, dar s-au putut izola şi la 12.000 m, unde au însă o supravieţuire redusă din cauza efectului bactericid al razelor ultraviolete, temperaturilor scăzute şi variaţiilor mari ale umidităţii relative. Spaţiul cosmic explorat până în prezent este microbiologic steril. Principalele surse de contaminare microbiologică a aerului sunt solul (prin particulele de praf, secreţii şi excreţii uscate, care sunt antrenate în atmosferă de curenţii de aer) şi aerosolii fini, microscopici, numiţi picături Pflüge, expulzaţi din căile respiratorii ale omului şi animalelor prin expiraţie, tuse şi strănut. Cele mai importante implicaţii ale prezenţei microorganismelor în aer sunt transmiterea pe cale aerogenă a unor 211

BACTERIOLOGIE GENERAL|

boli infecţioase (tuberculoza, difteria, micoplasmoza, gripa, etc.) şi contaminarea culturilor microbiene în timpul operaţiunilor de însămânţare şi transplantare. Cel de-al doilea neajuns poate fi evitat prin efectuarea manoperelor microbiologice în hote (boxe) cu aer laminar pentru siguranţă microbiologică (fig. 52). Spaţiul de lucru din aceste boxe este scăldat de aer sterilizat prin filtrare, cu ajutorul filtrelor HEPA (High Efficienty Particulate Air Filtres ).

Fig. 52 Hotă cu flux de aer laminar pentru siguranţă microbiologică 212

BACTERIOLOGIE GENERAL|

2.3.7.5. Microbiota unor alimente de origine animală Prin nutrienţii din compoziţia lor, alimentele constituie un mediu de cultură optim pentru multiplicarea unui număr mare de specii bacteriene şi microfungi şi asigură supravieţuirea pentru un timp limitat a microorganismelor strict parazite (rickettsii, chlamidii, virusuri). Microbiota autohtonă a alimentelor este constituită din microorganismele saprofite pe care fiecare aliment le întâlneşte în circuitul său, de la obţinere până la consumator. Prezenţa acestor microorganisme în număr mare reprezintă un indicator al condiţiilor de igienă necorespunzătoare şi influenţează negativ sănătatea consumatorului prin produşii rezultaţi din degradarea enzimatică a alimentelor (alterare). De asemenea, prin microorganismele patogene pe care le vehiculează şi prin metaboliţii lor toxici, alimentele pot genera toxiinfecţii alimentare şi boli infecţioase grave cu poartă de intrare digestivă ( tuberculoza, antraxul, hepatitele virale, etc. ).

2.3.7.5.1. Microbiota laptelui Laptele provenit de la animalele sănătoase şi recoltat în condiţii igienice conţine de obicei un număr redus de microorganisme (300 – 500/ml). încărcătura microbiană a laptelui este mai mare în primele jeturi, deoarece antrenează microflora existentă pe mucoasa canalelor galactofore, apoi scade treptat. în laptele provenit de la animalele cu infecţii ale glandei mamare, cazate în adăposturi insalubre, sau la care mulsul se efectuează în condiţii necorespunzătoare (recipiente sau instalaţii de 213

BACTERIOLOGIE GENERAL|

muls neigienizate, mulgători cu mâinile murdare, uger murdar, etc.), numărul microorganismelor pe mililitru poate fi de ordinul sutelor de mii sau chiar mai mult ( Grecianu Al. şi col., 1973) Imediat după muls, microorganismele sunt repartizate uniform în masa laptelui. în timpul păstrării însă, odată cu ridicarea grăsimilor, ele sunt antrenate către suprafaţă, concentrându-se în stratul de smântână. Microbiota normală a unui lapte igienic se compune în cea mai mare parte din bacterii aparţinând genurilor Lactobacillus (L. acidophilus, L.casei, ş.a. ) şi Streptococcus ( S. lactis, S. cremoris, S. thermophilus, etc.) - bacterii care prin activitatea lor fermentativă imprimă produselor lactate gustul specific. Mirobiota de contaminare a laptelui este dependentă calitativ şi cantitativ de condiţiile de recoltare şi de păstrare. Ea poate însuma specii bacteriene aparţinând genurilor: Pseudomonas, Achromobacter, Leuconostoc, Micrococcus, Propionibacterium, Proteus, Escherichia, Enterobacter, Clostridium, etc. (Mănescu S., 1989). Dată fiind originea intestinală a unora dintre aceste bacterii (Escherichia coli, Proteus spp., Clostridium perfringens), prezenţa lor denotă o poluare de origine fecală şi constituie un indicator al condiţiilor sanitare pe circuitul laptelui. Speciile patogene care pot contamina laptele şi care produc infecţii la om în urma consumului de lapte nefiert sunt: Mycobacterium bovis, Brucella abortus, Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Streptococcus pyogenes etc.

2.3.7.5.2. Microbiota cărnii Carnea conţine o floră microbiană foarte variată, dependentă de posibilităţile de contaminare în timpul vieţii animalului (în cursul infecţiilor septicemice) şi după sacrificare. Condiţiile de mediu, în special temperatura crescută şi umiditatea, permit microflorei 214

BACTERIOLOGIE GENERAL|

existente să se multiplice şi să producă, într-un timp relativ scurt, alterarea (putrefacţia) cărnii prin proteoliză enzimatică. Microorganismele care iau parte la procesul de putrefacţie se succed în funcţie de condiţiile favorabile multiplicării, existente la un moment dat. Astfel, bacteriile aerobe şi anaerobe facultativ, cum sunt micrococii, streptococii, speciile aparţinând genurilor Pseudomonas, Proteus, Achromobacter, bacilii sporulaţi aerobi (Bacillus subtilis, Bacillus mycoides) intervin primele, consumând oxigenul de la suprafaţă şi creând condiţii favorabile dezvoltării bacteriilor anaerobe din genul Clostridium. Putrefacţia cărnii poate avea loc şi la temperaturi scăzute, când intervin bacteriile criofile şi mucegaiurile din genurile Mucor, Penicilium, Aspergillus, Cladosporium, etc. Prin intermediul cărnii contaminate se pot transmite la om numeroase boli infecţioase ca antraxul, tuberculoza, salmoneloza, rujetul, bruceloza, tularemia, morva şi altele. Din acest considerent, carnea constituie unul din obiectivele principale ale expertizei sanitar-veterinare.

2.3.7.5.3. Microbiota ouălor La depunere, ouăle păsărilor sănătoase sunt sterile. Ele se contaminează ulterior cu microorganismele din cuibare sau de pe grătare şi în timpul manipulării. De pe coaja ouălor proaspete se izolează frecvent bacterii din genurile Proteus, Pseudomonas, Achromobacter, Aeromonas, Escherichia, etc. Ca o consecinţă a învechirii ouălor, aceste bacterii pătrund în interior determinând alterarea conţinutului prin putrefacţie (Grecianu Al., 1986; Mănescu S., 1989). Alterarea prin mucegăire apare sub formă de pete colorate pe faţa internă a cojii şi pe gălbenuş. Mai frecvent implicate în mucegăirea ouălor sunt genurile: Cladosporium, Penicillium, Sporotrichum şi Mucor. 215

BACTERIOLOGIE GENERAL|

în albuşul ouălui proaspăt, microorganismele sunt absente sau în număr foarte redus, datorită acţiunii bactericide a lizozimului (ferment glucidolitic activ faţă de bacteriile Gram pozitive), care se găseşte în cantitate apreciabilă. Dintre bacteriile patogene pentru om, mai frecvent vehiculate prin ou sunt salmonelele, deoarece pot fi transmise pe cale verticală de păsările purtătoare. Consumul de ouă contaminate cu salmonele, ca atare, sau sub formă de preparate neprelucrate sau insuficient prelucrate termic, constituie o cauză frecventă a toxiinfecţiilor alimentare.

2.3.7.6. Microbiota organismului animal Corpul animalelor şi al omului oferă condiţii favorabile de dezvoltare pentru numeroase microorganisme: bacterii, microfungi şi protozoare. Ele găsesc pe şi în corpul animalelor, suport nutritiv, condiţii constante de pH şi presiune osmotică, iar în cazul homeotermelor, şi condiţii de temperatură constante. în cursul vieţii intrauterine, organismele animale sunt sterile. Popularea cu microorganisme începe la naştere, în timpul trecerii prin vagin şi continuă prin contactul cu indivizii şi obiectele din jur, prin inspiraţie, alimentaţie, etc., pe tot parcursul vieţii. Ele colonizează pielea şi mucoasele care căptuşesc diferite regiuni şi cavităţi ce comunică cu mediul extern: nazofaringele, conjunctiva, tubul digestiv şi căile genitourinare inferioare. Microorganismele asociate cu organismele animale se constituie în cele două tipuri de microbiotă deja cunoscute: microbiota autohtonă şi microbiota alohtonă.

216

BACTERIOLOGIE GENERAL|

Microbiota autohtonă este reprezentată de comunităţi de microorganisme a căror asociere cu organismul animal a fost stabilită filogenetic, în cursul evoluţiei comune şi a căror structură diferă în cursul evoluţiei ontogenetice a fiecărui individ. Imediat după naştere, colonizarea tegumentelor şi a mucoaselor aparente este fortuită şi dependentă de primele microorganisme întâlnite, un rol important revenind microbiotei organismului matern. După câteva săptămâni însă, ca urmare a contactului cu alţi indivizi şi cu diverse medii naturale, organismul nou-născutului este populat de o microbiotă asemănătoare celei a adultului sănătos. Deoarece fiecare regiune a corpului animal diferă din punct de vedere fizico-chimic de celelalte regiuni, organismul animal constituie în ansamblul său un mozaic de microhabitate. Pentru a le coloniza, microorganismele trebuie să învingă numeroase obstacole, care diferă în funcţie de natura habitatelor respective. Printre acestea se numără sistemele de eliminare mucociliare şi peristaltismul intestinal (care îndepărtează bacteriile nelegate de epitelii), procesul periodic de îndepărtare a celulelor epiteliale senescente, imunitatea locală, variaţiile de Ph, competiţia cu alte microorganisme, etc. O condiţie esenţială a colonizării este complementaritatea care terbuie să existe între adezinele bacteriene şi receptorii de pe suprafaţa celulelor epiteliale ale gazdei. Cel mai frecvent, adezinele sunt reprezentate de fimbrii, care se leagă de receptori de natură glicoproteică. în ultimii ani s-a semnalat existenţa unei înrudiri imunologice între microorganismele şi mucusul sau mucoasa intestinală în care acestea ocupă în mod normal un habitat (Zarnea G., 1994).

217

BACTERIOLOGIE GENERAL|

Prin urmare, faptul că aceste microorganisme sunt recunoscute ca proprii (,,self”) de sistemul imunitar al gazdei, constituie un alt factor favorizant al colonizării habitatelor respective. între diferitele specii de microorganisme care alcătuiesc microbiota normală a microhabitatelor organismului animal există un echilibru dinamic, care poartă denumirea de eubioză. Ruperea acestui echilibru din diverse cauze (frecvent, antibioterapia de lungă durată şi modificările de Ph) se numeşte disbioză şi favorizează apariţia îmbolnăvirilor prin multiplicarea în exces a unor specii rezidente, sau prin implantarea microorganismelor străine patogene. Microbiota alohtonă sau străină a organismului animal se compune din microorganismele provenite din mediul extern (aer, apă, sol, alimente) sau de la alte animale. Comparativ cu microbiota autohonă, ea are un caracter tranzitoriu deoarece este incapabilă să se adapteze la noile condiţii şi implică posibilitatea de a conţine specii patogene. Microorganismul străin poate ocupa doar o nişă eliberată de un autohton, atunci când aceasta este perturbată şi adusă la o condiţie anormală. Când sistemul revine la normal, microorganismul autohton îşi va reocupa nişa, eliminând specia alohtonă. Capacitatea microorganismelor alohtone de a coloniza un anumit habitat şi de a se multiplica în el numai în circumstanţe anormale reprezintă, după S a v a g e , 1997 (citat de Zarnea G., 1994), distincţia fundamentală dintre microbiota alohtonă şi cea autohtonă. Cele mai studiate dintre microhabitatele organismului animal sunt cele oferite de segmentele anatomice ale tubului digestiv. Menţionăm faptul că la acest nivel, un microorganism poate fi autohton pentru un anumit segment şi alohton pentru altul, pe 218

BACTERIOLOGIE GENERAL|

care-l tranzitează după ce s-a desprins din habitatul său natural. De exemplu, un microorganism din colon poate fi alohton dacă provine din segmentele superioare (cavitatea bucală, stomac, intestin subţire) sau chiar de la nivelele inferioare colonului (în cazul animalelor coprofage).

2.3.7.6.1. Microbiota gastrică Microorganismele ajung în stomac odată cu alimentele ingerate şi apa. Acestă contaminare este foarte accentuată în cazul animalelor coprofage (iepure, porc), care pot ingera zilnic cantităţi imense de microorganisme alohtone provenite din fecale. Deoarece, odată ajunse în stomac, majoritatea microorganismelor sunt distruse de aciditatea sucului gastric (Ph = 1,7 –2,2) şi de enzime, multă vreme stomacul a fost considerat steril. Totuşi, din conţinutul gastric se izolează frecvent specii acido-tolerante aparţinând genurilor Lactobacillus, Candida şi Torulopsis. în număr mai mic au mai fost semnalate: Bifidobacterium spp., Clostridium spp., Streptococcus spp., Veillonella spp., Peptostreptococcus spp., Bacteroides spp., Helicobacter spp., ş.a. Pentru a fi considerate ca semnificativ prezente în stomac, microorganismele trebuie să fie prezente la mai mulţi indivizi investigaţi şi să depăşească densitatea de 103 celule/ ml.

2.3.7.6.2. Microbiota intestinului subţire Acest segment al tubului digestiv cuprinde cel puţin trei habitate diferite sub aspectul gradientului de Ph: duodenul (Ph apropiat de cel al stomacului ), jejunul (Ph = 5,9 – 6,6) şi ileonul (Ph = 7 – 7,3). 219

BACTERIOLOGIE GENERAL|

în duoden şi jejun, din cauza acidităţii încă destul de crescute, este prezent un număr redus de specii (Streptococcus spp., Lactobacillus spp. şi Candida albicans), unele dintre ele fiind derivate în mod cert din cavitatea bucofaringiană. Numărul acestora poate creşte însă, în aclorhidrie şi în alte stări patologice. Ileonul, datorită Ph-ului uşor alcalin, constituie un habitat optim. Dintre speciile prezente în densităţi semnificative sunt de menţionat cele aparţinând genurilor: Lactobacillus, Streptococcus, Bifidobacterium, Clostridium, Bacteroides, Veillonella, Staphylococcus, Actinobacillus, cărora li se alătură bacteriile coliforme şi bacilii anaerobi Gram pozitivi. Alţi factorii care limitează prezenţa şi multiplicarea bacteriilor în intestinul subţire, înafară de aciditate, sunt peristaltismul rapid şi existenţa unor substanţe care inhibă multiplicarea acestora.

2.3.7.6.3. Microbiota intestinului gros Rezervor major de microorganisme, intestinul gros conţine o comunitate microbiană exterm de complexă. Ea este alcătuită, la cele mai multe mamifere, inclusiv la om, din câteva sute de specii bacteriene, dintre care numai puţine au fost cultivate in vitro şi identificate. Majoritatea aparţine genurilor: Escherichia, Proteus, Aerobacter, Fusobacterium, Bacteroides, Enterococcus, Clostridium, ş.a. Din numărul total al bacteriilor, contrar statisticilor mai vechi, coliformii reprezintă doar 0,1 - 1% (Zarnea G., 1994). Microbiota intestinului gros include şi microorganisme alohtone provenite din alimente sau din segmentele superioare ale tubului digestiv. Aflate în tranzit, ele sunt nesemnificative numeric şi funcţional comparativ cu populaţiile microbiene stabile. Din cauza tranzitului lent, care permite multiplicarea bacteriilor, în ultimul segment al intestinului gros (rectum) numărul 220

BACTERIOLOGIE GENERAL|

acestora atinge densităţi enorme: aproximativ 1010 celule bacteriene/gram, ceea ce reprezintă 10% din greutatea conţinutului total al colonului sau 25% din greutatea uscată a fecalelor. Această microfloră desfăşoară o activitate metabolică considerabilă, în cea mai mare parte benefică pentru organism: -

la ierbivore fermentează celuloza, punând la dispoziţia organismului o sursă suplimentară de energie; - sintetizează cantităţi importante de vitamine din grupul B, vitamina K, vitamina PP, acid pantotenic, acid folic, etc., acoperind o parte din necesarul organismului. Aspectele negative legate de prezenţa microbiotei intestinale constau în eliberarea de produşi toxici (indol, scatol, amoniac, etc.) prin hidroliza enzimatică a unor proteine şi aminoacizi. Deoarece membranele celulare ale epiteliului intestinal sunt extrem de permeabile faţă de amoniac şi din cauza toxicităţii cronice a acestui catabolit, se consideră că microbiota colonului ar avea rol în geneza unor boli, printre care şi cancerul de colon.

2.3.7.6.4. Microbiota rumenului Sucurile digestive la ierbivore, ca şi la celelalte mamifere, sunt lipsite de enzime digestive pentru celuloză şi alte polizaharide complexe (pectine, amidon, etc.), deşi acestea reprezintă substratul de bază al nutriţiei lor vegetale. Din această cauză, ierbivorele folosesc microorganismele celulozolitice prezente în tubul digestiv pentru a asigura transformarea substanţelor polizaharidice complexe în forme solubile şi asimilabile. Contribuţia microorganismelor la nutriţia gazdei este diferită în funcţie de compartimentul în care îşi desfăşoară activitatea. La erbivorele nerumegătoare, degradarea ţesuturilor vegetale are loc, după digestia în stomac şi intestinul subţire, într-un cecum 221

BACTERIOLOGIE GENERAL|

lărgit şi uneori foarte lung, unde gradul de digerare a celulozei şi a altor polizaharide este de 20 – 30 %. La iepuri şi la cobai această ineficienţă este parţial compensată prin coprofagie.

2.3.7.7. Relaţiile ecologice ale bacteriilor între speciile bacteriene componente ale microbiocenozelor, între acestea şi alte categorii de microorganisme care colonizează un habitat sau se găsesc în tranzit (virusuri, micromiceţi, protozoare), precum şi între microorganisme şi macroorganisme, apar interacţiuni care pot fi grupate în trei categorii: indiferente (neutralism), de tip beneficial sau cooperant şi de tip antagonic.

2.3.7.7.1. Relaţii ecologice interbacteriene şi ale bacteriilor cu alte microorganisme Neutralismul, care presupune lipsa unor influenţe reciproce între două sau mai multe specii, este considerat de mulţi cercetători ca o relaţie puţin probabilă în natură sau, în orice caz, cu o importanţă minimă. El este întâlnit atunci când populaţiile microbiene sunt destul de îndepărtate unele de altele şi în cazul microorganismelor foarte diferite sub raportul exigenţelor nutritive, care nu competiţionează pentru aceiaşi nutrienţi. Interrelaţii microbiene de tip beneficial (cooperant) Relaţiile de tip beneficial sau cooperant presupun ca cel puţin una dintre speciile care interacţionează să aibă un beneficiu. în funcţie de gradul de reciprocitate al beneficiului, de gradul de dependenţă care se crează între speciile partenere şi de efectele 222

BACTERIOLOGIE GENERAL|

acţiunii cooperante a bacteriilor asupra substratului, relaţiile beneficiale pot fi de mai multe feluri. 1. Comensalismul sau metaboliza este un tip de relaţie în care una dintre specii profită de asociere, iar cealaltă, în aparenţă, nici nu profită şi nici nu este influenţată negativ. Relaţiile comensale, la rândul lor, îmbracă mai multe aspecte. • Relaţii în care beneficiul constă în punerea la dispoziţia bacteriei care profită, a unei substanţe nutritive necesare activităţii ei vitale, care este un metabolit produs de cealaltă bacterie. Pe baza unui asemenea tip de relaţie se realizează circulaţia în natură a principalelor elemente biogene (N, C, S), unele specii bacteriene producând substratul necesar celorlalte. Un exemplu în acest sens îl constituie bacteriile din sol care oxidează nitriţii în nitraţi (Nitrobacter, Nitrocystis) şi care nu se pot dezvolta decât în prezenţa bacteriilor care oxidează în prealabil amoniacul în nitriţi (Nitrosomonas, Nitrosocystis), furnizându-le subsatanţa azotată absolut necesară nutriţiei. • Relaţii în care una dintre bacteriile asociate furnizează celeilalte un factor de creştere esenţial. Un exemplu tipic pentru acest gen de relaţie este asocirea dintre hemofili bacterii care reclamă prezenţa în mediul de cultură a factorului V (NAD sau NADP ) - şi unele specii capabile să-l sintetizeze, desemnate din acest considerent cu termenul de “doică”: stafilococi albi, Bacillus spp., Enterococcus faecalis, Pseudomonas aeruginosa, Sarcina lutea, levuri (Buiuc G., 1999 ). Coloniile de Haemophilus se dezvoltă cu precădere limitrof coloniilor-doici, datorită concentraţiei mari de factor V în această zonă, fenomen ce poartă denumirea de ,,satelitism”. 223

BACTERIOLOGIE GENERAL|

•

•

Relaţii în care beneficiul rezultă din degradarea sau neutralizarea unei substanţe cu efect nociv pentru partener. Astfel, Escherichia coli şi alţi Gram negativi produc penicilinază - enzimă cu ajutorul căreia degradează penicilina, creând condiţii de multiplicare bacteriilor penicilinosensibile . Relaţii bazate pe modificarea mediului, astfel încât acesta devine favorabil pentru comensal, sub raport fiziologic. Microorganismele aerobe şi facultativ anaerobe, consumând oxigenul, diminuează potenţialul redox al mediului şi crează condiţii favorabile pentru anaerobii stricţi. Un exemplu caracteristic este cel al gangrenei gazoase, în care bacteriile contaminante crează condiţiile necesare pentru dezvoltarea agenţilor patogeni specifici (Clostridium perfringens, Clostridium oedematiens, Clostridium septicum, etc.).

2. Simbioza este o relaţie cu caracter specific şi permanent (se crează o dependenţă complementară între parteneri), în care beneficiul este bilateral. Acest tip de relaţie este întâlnit mai frecvent la cianobacterii, licheni şi protozoare. 3. Mutualismul sau simbioza nutriţională reprezintă o relaţie între două specii de microorganisme, care au nevoie una de alta pentru dobândirea anumitor metaboliţi esenţiali. Spre deosebire de simbioza propriu-zisă, în cadrul relaţiilor mutuale asocierea nu este permanentă şi nu constituie o condiţie sine qua non a existenţei celor doi parteneri. Relaţia poate fi pusă în evidenţă pe medii de cultură deficiente, în care nici unul dintre microorganisme nu poate creşte separat. Speciile Haemophilus canis şi Haemophilus parainfluenzae, de exemplu, nu cresc atunci când sunt însămânţate separat în apă peptonată, dar, dacă sunt asociate formează pe acelaşi mediu culturi abundente. Analiza activităţii lor metabolice a arătat că fiecare dintre 224

BACTERIOLOGIE GENERAL|

ele realizează sinteza unui factor de creştere absolut indispensabil celeilalte, care însă nu are capacitatea de a-l elabora: H. canis sintetizează factorul V, iar H. parainfluenzae, factorul X (hematina). Un alt exemplu îl constituie asocierea Mucor – Rhodotorula, două ciuperci microscopice care nu cresc pe medii lipsite de tiamină (vitamina B1). Cultivate împreună, ele nu mai necesită aport exogen de tiamină, deoarece Mocor sintetizează o parte din molecula vitaminei (nucleul tiazolic) iar Rodothorula, cealaltă parte (nucleul pirimidinic). 4. Sinergismul este o relaţie facultativă, în care două bacterii care se multiplică la nivelul aceluiaşi biotop produc un efect (degradare, sinteză, leziune, etc.) pe care nici una dintre ele nu este capabilă să-l producă singură. Relaţia este întâlnită în mediile naturale, în cadrul microbiocenozelor organismului animal şi chiar în etiopatogeneza unor infecţii. Astfel, arginina este descompusă până la stadiul de putresceină numai prin acţiunea sinergică a speciilor Escherichia coli şi Streptococcus faecalis; pigmentul prodigiosina poate fi sintetizat uneori de tulpini apigmentogene de Serratia marcescens cultivate împreună; în pododermatita infecţioasă a bovinelor şi ovinelor, specia Bacteroides nodosus declanşează procesul patologic, iar Fusobacterium necrophorum şi alte specii asociate în mod constant (stafilococi, actinomicete, treponeme, etc.) poartă responsabilitatea tabloului lezional. Relaţiile sinergice dintre microorganisme au găsit aplicaţie în diverse domenii de activitate, printre care şi industria laptelui. Maelele obţinute din asocierea unor bacterii lactice (Streptococcus lactis, S. cremoris, Lactobacillus acidophylus, etc.), din bacterii şi levuri, sunt utilizate la prepararea diferitelor produse lactate, pentru a le conferi calităţi gustative specifice.

225

BACTERIOLOGIE GENERAL|

Interrelaţii microbiene de tip antagonist Relaţiile de tip anatagonist presupun un efect nefavorabil sau nociv al unuia dintre parteneri pentru celălalt. în funcţie de mecanismul de acţiune, relaţiile antagonice pot fi, la rândul lor, de mai multe feluri. Parazitismul este un tip de relaţie în care un microorganism se multiplică pe seama celuilalt, distrugându-l. O relaţie tipică de parazitism în lumea microorganismelor este bacteriofagia - fenomenul de parazitism al virusurilor bacteriene, numite şi bacteriofagi sau fagi, în celula bacteriană. Efectul multiplicării bacteriofagilor de către celula bacteriană este liza celulei gazdă (bacterioliza). El este vizibil în gazonul bacterian pe medii solide, sub forma unor discontinuităţi circulare numite “plaje”. Specificitatea de gazdă a bacteriofagilor a permis valorificarea fenomenului de bacteriofagie în scopul identificării unor genuri şi specii bacteriene prin test fagic (Salmonella spp., Brucella abortus, Bacillus anthracis, etc.), şi al creării de subdiviziuni în cadrul unor specii (fagovariante, fagotipuri sau lizotipuri). Fagotipizarea este utilă mai ales în stabilirea filierelor epidemiologice a unor infecţii bacteriene cum sunt cele produse de Salmonella typhi, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, ş.a. Parazitarea unei bacterii de către o altă bacterie este un fenomen mai rar întâlnit decât bacteriofagia, dar care are acelaşi rezultat : bacterioliza. Un caz foarte cunoscut este endoparazitismul speciei Bdellovibrio bacteriovorus la numeroase bacterii din genurile Escherichia, Salmonella, Serratia, Proteus, Pseudomonas, 226

BACTERIOLOGIE GENERAL|

Streptococcus, etc. Datele de microscopie electronică arată că, după un atac mecanic direct asupra peretelui celular, foarte probabil asociat cu acţiunea unei exoenzime, parazitul pătrunde în celula – gazdă determinând dezorganizarea şi digestia conţinutului celular pe seama căruia creşte şi se multiplică, producând în cele din urmă liza celulei parazitate. Competiţia este o interacţiune cu importanţă fundamentală pentru toate organismele şi probabil cea mai importantă ca mecanism selectiv. Ea este observată frecvent în cazul microorganismelor stabilite în acelaşi habitat, care au nevoie de aceiaşi nutrienţi, iar aceştia se găsesc în cantităţi limitante, adică prea mici pentru a le satisface cerinţele. Unii cercetători extind conceptul de competiţie, de la nutrienţi, la spaţiu, lumină, oxigen şi oricare altă necesitate comună faţă de o sursă limitată a biotopului comun. Spre deosebire de parazitism, în competiţie influenţele adverse se realizează indirect, prin luptă bilaterală pentru satisfacerea unor necesităţi comune. Specia privilegiată este aceea care se multiplică mai repede, eliminând din biotop specia sau speciile competitoare care au un ritm de multiplicare mai lent.

227

BACTERIOLOGIE GENERAL|

Fig.53 Competiţia dintre Escherichia coli şi Staphylococcus aureus (după Oberhofer şi Frazier, 1961, citat de Zarnea G., 1994)

Un exemplu în acest sens îl constituie evoluţia în culturi mixte a speciilor E. coli şi S. aureus. Figura 53 prezintă curbele de creştere, practic identice, în culturi monospecifice şi efectul cultivării lor asociate. Se observă diminuarea netă a numărului de celule bacteriene aparţinând speciei S. aureus, determinată de ritmul mai rapid de multiplicare a E. coli, care, consumând nutrienţii, limitează creşterea speciei asociate. 228

BACTERIOLOGIE GENERAL|

Un alt avantaj pentru o specie aflată în competiţie, pe lângă viteza mai mare de multiplicare, este mobilitatea. Bacteriile invadante, care roiesc de obicei pe suprafaţa mediilor solide, sunt capabile să ocupe un habitat înaintea celor imobile şi a celor cu un aparat ciliar mai puţin activ. Competiţia este observată frecvent in vitro pe plăcile Petri: coloniile foarte apropiate între ele, care competiţionează pentru spaţiu şi nutrienţi, sunt mult mai mici comparativ cu cele distanţate. De asemenea, în culturile mixte nu se ajunge niciodată la densitatea maximă observată în culturile monospecifice, deoarece, în majoritatea cazurilor, există o specie avantajată prin viteza de multiplicare şi/sau mobilitate, care va inhiba multiplicarea celorlalte prin spolierea mediului în nutrienţi esenţiali. în condiţii naturale, competiţia dintre microorganisme este influenţată şi de o serie de parametri abiotici ai mediului (Ph, temperatură, concentraţia oxigenului sau a sărurilor, etc.), care pot afecta viteza de creştere a populaţiilor de microorganisme. Acest fenomen este evident în cazul populaţiilor de bacterii psichrofile şi psichrotrofe, care, prezente asociat, competiţionează pentru aceiaşi nutrienţi. La temperaturi joase sunt avantajate microorganismele psichrofile, care se multiplică cu viteze mai mari, putând exclude psichrotrofele. La temperaturi mai ridicate, situaţia se inversează, fiind avantajate psichrotrofele. în habitatele cu variaţii periodice de temperatură, avantajele evoluează când într-un sens, când într-altul, determinând predominanţa uneia sau alteia din cele două populaţii. Antagonismul propriu-zis sau antibioza se realizează prin intermediul unor substanţe sintetizate şi eliminate în mediu de unele specii microbiene, care exercită un efect nociv asupra altor specii. în funcţie de natura acestor substanţe şi de modalitatea de acţiune, antagonismul microbian poate fi specific şi nespecific.

229

BACTERIOLOGIE GENERAL|

Antagonismul specific se realizează pe baza unor substanţe sintetizate de unele specii de bacterii şi fungi, denumite antibiotice. în funcţie de toxicitatea pentru celula animală şi de spectrul antibacterian, antibioticele se împart în două categorii: antibiotice propriu-zise şi bacteriocine. Primul antibiotic a fost descoperit de A l e x a n d e r F l e m i n g în 1929, în urma sesizării antagonismului exercitat de o ciupercă din genul Penicillium faţă de stafilococ. Plecând de la observaţia lui F l e m i n g, o echipă de cercetători de la Universitatea din Oxford, condusă de C h a i n şi F l o r y, a reuşit în 1940 să extragă din culturile de Penicillium şi să purifice substanţa activă cu efect antibiotic (penicilina), introducând-o pe scară largă în terapia infecţiilor. în anii următori au fost identificate şi extrase numeroase alte antibiotice. Cele mai multe se obţin din actinomicete aparţinând genului Streptomyces (streptromicina, cloramfenicolul, tetraciclina, eritromicina, etc.), din bacterii aparţinând genului Bacillus (polimixina, bacitracina, etc.) şi din ciuperci microscopice, cum este cazul genurilor Penicillium şi Cephalosporium (penicilina, cefalosporina, etc.). Pe lângă antibioticele de biosinteză, există numeroase antibiotice obţinute prin sinteză chimică şi semisinteză. Antibioticele acţionează selectiv, numai asupra celulei bacteriene (majoritatea având un efect bacteriostatic), fiind lipsite de nocivitate pentru celula animală. Ele pot fi clasificate după mai multe criterii: compoziţia chimică, spectrul antibacterian, mecanismul de acţiune, etc. Pe baza spectrului antibacterian, antibioticele se împart în : ♦ antibiotice de tip penicilinic, predominant active faţă de bacteriile Gram pozitive (penicilina, eritromicina, novobiocina, etc.); ♦ antibiotice de tip streptomicinic, predominant active faţă de bacteriile Gram negative (streptomicina, neomicina, kanamicina, polimixina B, etc.); 230

BACTERIOLOGIE GENERAL|

♦ antibiotice cu spectru larg, active faţă de bacteriile Gram pozitive şi Gram negative (tetraciclinele, cloramfenicolul, cefalosporinele, etc). Pe baza mecanismului de acţiune, antibioticele pot fi grupate astfel :

♦ antibiotice cu efect inhibitor asupra sintezei peretelui celular, care blochează diferite faze ale sintezei peptidoglicanului (penicilina, cefalosporinele ş.a.); ♦ antibiotice care alterează ireversibil structura membranei citoplasmatice şi implicit funcţia de barieră osmotică a acesteia, astfel încât celula pierde ioni esenţiali pentru desfăşurarea normală a metabolismului (polimixina B, nistatina, colistina, ş.a.); ♦ antibiotice cu efect dereglator asupra transcrierii sau traducerii informaţiei genetice, care acţionează prin blocarea replicării ADN, blocarea fazei de iniţiere a transcrierii informaţiei genetice de pe ADN pe ARN mesager, modificarea secvenţei aminoacizilor în cursul sintezei lanţurilor peptidice prin schimbarea conformaţiei ribozomilor, etc. Fiecare specie bacteriană se caracterizează printr-un spectru de sensibilitate şi de rezistenţă naturală la antibiotice, controlat genetic de gene cromozomale sau plasmidice. Acest spectru se poate modifica datorită posibilităţii dobândirii antibiorezistenţei prin diferite mecanisme genetice şi biochimice. Mecanismele genetice de dobândire a rezistenţei la antibiotice sunt mutaţiile la nivel cromozomal (cu o rata de 10-5 - 1011 ) şi recombinările genetice consecutive primirii de material genetic exogen prin transformare, transducţie, conjugare. Rolul cel mai important în dobândirea antibiorezistenţei îl are, însă, transferul plasmidelor R. Mecanismele biochimice de rezistenţă la antibiotice constau în: 231

BACTERIOLOGIE GENERAL|

♦ inactivarea antibioticului în afara celulei bacteriene cu ajutorul unor exoenzime; ♦ stoparea accesului în celulă; ♦ alterarea sediului-ţintă al antibioticului. Practica medicală şi cea veterinară trebuie să urmărească limitarea posibilităţilor de dobândire a antibiorezistenţei de către bacterii, prin utilizarea cât mai raţională a antibioticelor în scopuri terapeutice şi folosirea cât mai limitată şi mai atent supravegheată a deşeurilor rezultate de la fabricarea antibioticelor, ca biostimulatori în zootehnie. Tendinţa actuală este de înlocuire a acestora într-o proporţie cât mai mare, mai ales în reţetele furajere, cu probioticele. Bacteriocinele reprezintă o clasă specială de substanţe antibiotice cu acţiune bactericidă, sintetizate de un număr mare de specii bacteriene purtătoare de informaţie genetică specifică, conţinută în plasmidele ,,col”. Primele bacteriocine au fost identificate şi descrise la specia Escherichia coli de A n d r é G r a t i a (1925), care le-a dat denumirea generică de “colicine”. Ulterior, deoarece s-au identificat substanţe asemănătoare la numeroase alte specii bacteriene, s-a creat termenul mai general de “bacteriocine”, iar în funcţie de specia bacteriană care le produce, ele au primit denumiri inspirate din epitetul de gen (listeriocine, vibriocine, etc.) sau de specie (colicine, piocine welchicine, etc.). Din punct de vedere al structurii, bacteriocinele se împart în două categorii: bacteriocine cu nivel de organizare molecular şi bacteriocine cu structură corpusculară, vizibile electronooptic, asemănătoare cu bacteriofagii sau cu fragmente din particula fagică (capete, dar mai ales cozi). Bacteriocinele produse de bacteriile Gram-negative au un spectru îngust de activitate, limitat, în cele mai multe cazuri, la tulpini bacteriene din aceeaşi specie sau aparţinând unor specii înrudite taxonomic. Bacteriocinele Gram-pozitivilor sunt lipsite de specificitate, fiind active faţă de unele bacterii Gram-pozitive îndepărtate taxonomic de specia producătoare. 232

BACTERIOLOGIE GENERAL|

Mecanismele prin care aceste substanţe îşi exercită efectul bactericid sunt elucidate doar în câteva cazuri. în general, bacteriocinele se leagă iniţial de celulele sensibile prin intermediul unor receptori specifici de pe suprafaţa acestora (asemănător bacteriofagilor), apoi pătrund în interior şi acţionează dereglator asupra unor ,,ţinte” vitale (metabolism energetic, biosinteza de ADN şi ARN, etc.). Caracteristica principală a bacteriocinelor, care le deosebeşte fundamental de antibioticele propriu-zise, constă în faptul că biosinteza lor are efect letal asupra celulelor producătoare. în acest caz, perpetuarea proprietăţii de bacteriocinogeneză în rândul populaţiilor bacteriene se explică prin numărul redus de celule în care acest caracter letal potenţial devine actual şi prin faptul că restul celulelor bacteriene purtătoare de factor ,,col” sunt imune la acţiunea colicinei exogene omologe. Prin urmare, odată elaborată în mediu, o anumită colicină are efect antibiotic numai asupra celulelor aparţinând aceleeaşi specii, dar care nu o pot elabora, fiind lipsite de factorul ,,col” respectiv. Avându-se în vedere acţiunea bactericidă a tulpinilor purtătoare de plasmide ,,col”, centrată în jurul speciei omologe, se poate presupune că fenomenul de bacteriocinogeneză are un rol de reglare a populaţiilor bacteriene în diferite ecosisteme naturale (Buiuc G.,1999). în practica diagnosticului bacteriologic, bacteriocinogeneza şi bacteriocinosensibilitatea sunt acceptate uneori ca markeri ai patogenităţii. S-a constatat, de exemplu, că în cadrul speciei Escherichia coli tulpinile colicinogene sunt de regulă şi patogene, iar cele bacteriocinosensibile, nepatogene. O altă aplicaţie a bacteriocinelor în practica de laborator este bacteriocinotipia. Bacteriocinotipul (bacteriocinovarianta) este o subdiviziune a speciei bacteriene care grupează toate tulpinile sensibile la aceleaşi bacteriocine. Bacteriocinotipia are implicaţii asemănătoare cu fago(lizo)tipia, în urmărirea unor filiere 233

BACTERIOLOGIE GENERAL|

epidemiologice, sau în evidenţierea altor proprietăţi corelate în mod constant cu bacteriocinotipul. Antagonismul nespecific este impus de speciile bacteriene capabile să producă substanţe nocive pentru alte specii, asupra cărora acţionează neselectiv (Duca Eugenia şi col., 1979 ). Un exemplu îl constituie bacteriile acido-lactice componenete ale microbiotei normale a intestinului, mucoasei bucale, mucoasei vaginale, care inhibă dezvoltarea bacteriilor patogene prin acidifierea mediului. Pe baza acestui considerent, în tratamentul unor infecţii intestinale se recomandă înlocuirea antibioticelor cu preparatele probiotice. Majoritatea cercetătorilor definesc drept probiotice, produsele ce conţin bacterii vii, în stare vegetativă sau sub formă de spori, care administrate la om şi animale împiedică înmulţirea bacteriilor potenţial patogene. Probioticele conţin culturi pure sau mixte de tulpini bacteriene aparţinând genurilor Lactobacillus (L. acidophilus, L. casei, L. helveticus, L. lactis, L. bulgaricus), Bifidobacterium, Streptococcus (S. thermophilus), Enterococcus ( E. hirae), etc., levuri, sau amestecuri de bacterii şi levuri (de exemplu, Lactobacillus spp. şi Sacharomyces spp.). Administrarea de suspensii sau preparate comerciale de Lactobacillus acidophilus este considerată astăzi indispensabilă pentru ameliorarea echilibrului microbiotei normale a intestinului, compromis în cursul administrărilor orale de antibiotice cu spectru larg. I l i a Me c i n i c o v – laureat al premiului Nobel - a fost primul cercetător care a avut ideea înlocuirii terapeutice a microflorei patogene a tubului digestiv, cu o microfloră ,,impusă“ formată din lactobacili şi streptococi, prin consum de iaurt şi lapte bătut (Duca Eugenia şi col., 1979; Carp-Cărare M., 1991). 234

BACTERIOLOGIE GENERAL|

Caracteristicile unui bun probiotic însumează: ♦ lipsa de patogenitate şi toxicitate pentru organismul animal; ♦ capacitatea de a supravieţui şi de a fi metabolic activ în mediul gastro-intestinal; ♦ efectele benefice asupra organismului; ♦ accesibilitatea din punct de vedere economic. Efectele produselor probiotice sunt, în principal, următoarele: 1. reducerea numărului unor grupe de microorganisme cu potenţial patogen, prin producerea de metaboliţi cu efect toxic (acizi organici, H2O2, antibiotice) şi/sau prin competiţie pentru nutrienţi sau pentru situsurile de adeziune de pe suprafaţa epiteliilor intestinale (experimental, s-a demonstrat că Lactobacillus spp. aderă la peretele intestinal, rezistând la cel puţin patru spălări succesive cu soluţie tampon); 2. stimularea creşterii animalelor prin stimularea apetitului, îmbunătăţirea conversiei hranei şi protecţia oferită faţă de infecţiile intestinale (fig. 54); 3. efect anticancerigen (în special, Lactobacillus spp.) prin inhibarea creşterii celulelor tumorale sau supresia bacteriilor care produc enzime (beta-glucuronidază, nitroreductază) răspunzătoare de eliberarea unor substanţe cancerigene din compuşi inofensivi; 4. stimularea imunităţii prin creşterea activităţii macrofagelor sau a concentraţiei imunoglobulinelor anticorp - efect condiţionat de trecerea probioticelor în circulaţia generală (B e a l m e r şi col. citaţi de Zarnea G., 1994). După cum s-a demonstrat, lactobacilii pot străbate mucoasa intestinală, supravieţuind câteva zile în splină, ficat şi pulmon.

235

BACTERIOLOGIE GENERAL|

Animal nou născut

Contact limitat cu mediul şi cu organismul matern

Dezvoltare normală.Posibilitate de contaminare din mediu

Microbiotă deficitară (neprotectoare)

Microbiotă normală completă

Microorganisme probiotice

Protecţie

236

BACTERIOLOGIE GENERAL|

Fig. 54

Reprezentarea schematică a modului de intervenţie al microorganismelor probiotice (după Zarnea G., 1994)

2.3.7.7.2. Relaţii macroorganisme

ecologice

între

bacterii

şi

între bacteriile componente ale microbiotei rezidente (autohtone) şi tranzitorii (alohtone) a organismelor animale şi vegetale şi gazdă se stabilesc relaţii de tip cooperant sau antagonic, asemănătoare celor existente între microorganismele care interacţionează. Relaţiile de tip beneficial Comensalismul este relaţia dintre organismul animal şi majoritatea bacteriilor rezidente pe tegumente şi mucoase, unde găsesc surse de hrană (celule descuamate, mucus) şi condiţii de multiplicare, de care beneficiază fără a prejudicia gazdei. Simbioza reprezintă tipul de interacţiune al bacteriilor din tubul digestiv al ierbivorelor cu animalul-gazdă. Prin activitatea lor biologică, aceste bacterii degradează unele polizaharide inaccesibile enzimelor digestive (celuloza, hemicelulozele, lignina, etc.), transformându-le în produşi absorbabili cu un potenţial energetic de obicei considerabil. Totodată, bacteriile intestinale şi cele ruminale sintetizează majoritatea vitaminelor complexului B. Alte activităţi biosintetice de natură bacteriană au ca rezultat convertirea unor compuşi simpli care conţin în molecula lor azot, în proteine microbiene, digerabile prin acţiunea unor enzime proteolitice prezente în segmentele posterioare ale tubului digestiv. Relaţiile de tip simbiotic între bacterii şi plante sunt cunoscute îndeosebi la leguminoase, care preiau azotul atmosferic 237

BACTERIOLOGIE GENERAL|

prin intermediul bacteriilor fixatoare de azot din genul Rhizobium, prezente în nodozităţile de pe traiectul rădăcinilor. în categoria interacţiunilor cooperante micro-macroorganism se situează şi antagonismul impus microorganismelor alohtone patogene de către microbiota normală, prin ocuparea nişelor anatomice, elaborarea de substanţe antibiotice, competenţă mai mare în utilizarea nutrienţilor şi a altor resurese din habitat, etc. Relaţiile de tip antagonic Principala relaţie conflictuală macro-microorganism este infecţia (lat. inficere = a otrăvi, a deteriora). în sens larg, prin infecţie se înţelege pătrunderea şi multiplicarea microorganismelor patogene în organismele cu organizare superioară, precum şi reacţia de răspuns pe care o provoacă acestora. Ea poate îmbrăca forma unei stări potenţiale (infecţie inaparentă clinic sau latentă), însoţită doar de restructurarea imunologică a organismului, sau poate avea o evoluţie asociată cu perturbarea stării normale de sănătate a organismului-gazdă şi cu fenomene de disconfort caracteristice stării de boală (boala infecţioasă). Infecţia este o interrelaţie ecologică dinamică, la apariţia şi evoluţia căreia participă activ ambii parteneri: microorganismul prin mecanismele sale de patogenitate şi organismul-gazdă prin factorii apărării antiinfecţioase (genetici, fiziologici, imunologici). Numeroşi factori endogeni şi de mediu pot influenţa această relaţie de tip conflictual în favoarea unuia sau a celuilalt partener.

238

BACTERIOLOGIE GENERAL|

PATOGENITATEA BACTERIILOR ŞI MECANISMELE EI Termen discutabil din punct de vedere semantic, patogenitatea defineşte în sensul cel mai larg, aptitudinea unui microb de a determina, în mod natural sau în condiţii experimentale, un efect nociv asupra organismului-gazdă. Patogenitatea bacteriilor este legată în general de parazitismul lor, deşi cele două proprietăţi nu sunt superpozabile. Principalele însuşiri care condiţionează patogenitatea intrinsecă a bacteriilor sunt virulenţa şi toxicitatea, la care se adaugă uneori capacitatea de sensibilizare alergică a organismului. A. VIRULENŢA ŞI FACTORII DE VIRULENŢĂ Virulenţa reprezintă capacitatea bacteriilor de a coloniza la poarta de intrare (de a se adapta şi de a se înmulţi) şi, eventual, de a invada umorile şi ţesuturile, evitând sau neutralizând mecanismele de apărare nespecifică ale gazdei. Factorii care conferă bacteriilor virulenţă sunt reprezentaţi de structuri ale celulei bacteriene şi enzime. Ei pot fi grupaţi în funcţie de modalitatea de acţiune în două categorii: factori de colonizare şi pătrundere în organism şi factori de invazie . 1. Factorii de colonizare şi pătrundere Fimbriile (pilii) de aderenţă şi alte adezine (acizii lipoteichoici, proteinele membranei externe a bacteriilor Gramnegative, etc.), asigură legarea bacteriilor de epiteliile mucoaselor dar şi de celulele epiteliale cheratinizate, endotelii, 239

BACTERIOLOGIE GENERAL|

dinţi, etc., împiedicând astfel eliminarea lor prin fluxul diferitelor secreţii, tuse, mişcarea cililor, peristaltism. Totodată, se crează posibilitatea de acces a bacteriilor patogene la nutrienţi, temperatură favorabilă, protecţie faţă de anticorpi şi lizozim, etc. Ca dovadă, celulele de Escherichia coli aderente la epiteliul intestinal, după o perioadă de lag mai scurtă, se multiplică mult mai intens decât celulele neaderente. Legarea este condiţionată de existenţa unor receptori celulari specifici adezinelor bacteriene, având uneori un important grad de selectivitate. Astfel, fimbriile de tip - 1 permit aderarea la mucoasa intestinului gros, iar fimbriile P sau Pap (Pyelonephritis associated pili) şi adezina 075X favorizează colonizarea căilor urinare (Zarnea G.,1994). În baza acestei specificităţi, Streptococcus pyogenes şi Corynebacterium diphteriae aderă la epiteliul faringian, Escherichia coli enteropatogenă şi Vibrio cholerare aderă la mucoasa jejun-ileonului, iar Neisseria gonorrhoeae aderă în mod special la epiteliul uretral şi cervical (Duca Eugenia şi col., 1979). Cele mai multe bacterii au însă două sau mai multe tipuri de adezine cu specificităţi de legare diferite. Rolul receptorilor celulari în producerea infecţiilor a fost demonstrat fără echivoc de S e l l w o o d şi colaboratorii (citaţi de Zarnea G., 1994) în 1975. Porcii foarte rezistenţi la infecţia cu tulpini de Escherichia coli K88, producătoare de enterite severe, nu au receptori pentru această bacterie, spre deosebire de animalele foarte sensibile, care poartă numeroşi receptori de adezine. În mod asemănător, sensibilitatea omului la pielonefrita cu Escherichia coli este corelată cu numărul receptorilor de pe membrana uroepiteliului, foarte variabil de la o persoană la alta. Se pare că în infecţiile urinare ascendente cu E. coli uropatogenă, colonizarea se datorează şi flagelilor (cililor), cu 240

BACTERIOLOGIE GENERAL|

ajutorul cărora bacteria se deplasează contra curentului de scurgere a urinei. Ig A proteazele reprezintă un factor important de colonizare, deoarece permite bacteriilor patogene să supravieţuiască pe suprafaţa mucoaselor, prin clivarea moleculei anticorpilor de tip Ig A. Ele au fost evidenţiate la Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenze, Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis, etc. Pătrunderea în organism a bacteriilor se realizează prin mecanisme incomplet elucidate. La majoritatea speciilor, ea este condiţionată de apariţia unor discontinuităţi accidentale (plăgi, microleziuni) sau disfuncţii la nivelul barierelor naturale antiinfecţioase. Bacteriile foarte mobile şi foarte subţiri aparţinând genurilor Leptospira, Borrelia şi Treponema sunt capabile să pătrundă prin mucoase şi chiar prin tegumentele intacte. Mobilitatea acestor bacterii se datorează flagelilor periplasmatici numiţi şi filamente axiale. Unele bacterii (ca de exemplu, Corynebacterium diphteriae) sunt dotate cu fimbrii şi cu enzime de alterare, prin care produc leziuni locale, creându-şi porţi de intrare şi colonizând în mucoasă. La bacteriile parazite intracelular, mecanismul cel mai frecvent de pătrundere în celula-gazdă este endocitoza facilitată de parazit prin intermediul unor lipopolizaharide şi proteine membranare (procedeu descris la Shigella flexneri, Escherichia coli enteroinvazivă (EIEC), Neisseria gonorrhoeae) şi prin mecanisme încă necunoscute (Duca Eugenia şi col., 1979; Zarnea G., 1994). 241

BACTERIOLOGIE GENERAL|

Bacteriile endocitate sunt incluse în vacuole delimitate de o membrană derivată din membrana celulei-gazdă, în interiorul cărora se multiplică şi supravieţuiesc, rezistând la fagocitoză. 2. Factorii de invazie Invadarea organismului este condiţionată, în principal, de factorii bacterieni antifagocitari şi de enzimele care facilitează difuzarea bacteriilor în ţesuturi. a. Factorii antifagocitari de inhibare a înglobării în fagocit Capsula reprezintă pentru speciile capsulate (Bacillus anthracis, Streptococcus pneumoniae, Clostridium perfringens) un important factor de virulenţă, deoarece bacteriile dotate cu acest înveliş vâscos nu sunt înglobate de leucocitele polimorfonucleare neutrofile, prin neaderarea acestora la suprafaţa bacteriei. Ca exemplu clasic de patogenitate datorată în exclusivitate prezenţei capsulei, poate fi citat pneumococul; tulpinile de tip S (smooth) capsulate sunt patogene, iar cele de tip R (rough) necapsulate sunt lipsite de patogenitate (vezi experienţa lui Griffith, cap. de Genetică bacteriană). Compuşii parietali ce fac parte din structurile speciale ale peretelui bacterian prezintă proprietăţi antifagocitare bine demonstrate pentru proteina ,,M” a streptococilor beta-hemolitici grup A, antigenul ,,Vi” prezent la unele specii de Salmonella (S. typhi, S. paratyphi C, S. dublin), antigenul K prezent la Escherichia coli, etc. Unii autori identifică aceşti factori cu fimbriile de virulenţă, care asigură aderenţa specifică la ţesutul parazitat şi implicit rezistenţa la fagocitoză. 242

BACTERIOLOGIE GENERAL|

Rolul antifagocitar al acestor factori este demonstrat experimental prin anularea virulenţei consecutiv tratării bacteriilor cu ser imun specific factorului respectiv: ser anticapsular, antiproteină M, anti-Vi. Coagulaza liberă, o enzimă elaborată de Staphylococcus aureus, este din punct de vedere chimic şi funcţional asemănătoare cu protrombina. Ea coagulează plasma sanguină în jurul celulelor bacteriene, formând un manşon cu rol antichimiotactic pentru fagocite. Având la suprafaţă acest strat protector, bacteriile nu mai sunt recunoscute ca non-self, fiind vorba deci, de un mimetism la scară celulară. Mobilitatea, după B r u b a k e r, 1985 (citat de Zarnea G., 1994), ar constitui un factor important pentru virulenţă. Astfel, prin capacitatea lor de a se deplasa rapid în mediile vâscoase, cum sunt cele din organism, spirichetele (Leptospira, Borrelia, Treponema) se sustrag procesului de fagocitoză, încât leucocitele le capturează cu mare dificultate. b. Factorii antifagocitari de inhibare a digestiei în fagocit Unele bacterii, numite bacterii parazite facultativ intracelular, supravieţuiesc în interiorul fagocitelor, iar unele reuşesc chiar să se multiplice, transformând aceste celule în factori de diseminare a infecţiei în organism. Rezistenţa la digestia în fagocit se realizează prin mecanisme incomplet elucidate, ce diferă de la o specie bacteriană la alta (Zarnea G., 1994).

243

BACTERIOLOGIE GENERAL|

1.împiedicarea fuziunii fagolizozomale este un mecanism comun, întâlnit la Mycobacterium spp., Chlamydia spp., Legionella pneumophila, etc., dar care are baze moleculare diferite. Astfel, la Mycobacterium tuberculosis, fuziunea este blocată de ,,cord-factor”- o glicolipidă (6,6-dimycoltrehaloza) din structura peretelui celular; la Mycobacterium microti, prin creşterea concentraţiei intracelulare a AMP; la Chlamidia psittaci, prin modificarea structurii membranei fagozomului în care este conţinută. 2.Evadarea din fagozomi la scurt timp după pătrunderea în celule a fost descrisă la rickettsii (Rickettsia mooseri, Rickettsia tsutsugamushi). Un rol esenţial în acest proces îl are fosfolipaza A, care atacă membrana fagozomului. 3.Rezistenţa la acţiunea enzimelor lizozomale în macrofagele din organismul neimunizat este întâlnită la unele bacterii Gram-pozitive (Listeria monocytogenes, Erysipelothrix insidiosa), la numeroase genuri Gram-negative (Salmonella, Brucella, Yersinia, Shigella, Coxiella, Francisella, Haemophilus) şi la bacteriile acidorezistente (Mycobacterium spp.). Mecanismele rezistenţei sunt incomplet cunoscute. La unele specii, se pare că factorul care opune rezistenţă enzimelor lizozomale îl constituie lipidele de perete (factorul cord, lipopolizaharidele Gram-negativilor). c. Agresinele - enzime care favorizează difuzarea în ţesuturi Hialuronidazele sunt exoenzime care clivează acidul hialuronic din structura substanţei fundamentale a ţesutului conjunctiv, realizând astfel permeabilizarea barierelor fiziologice (epiteliale, mucoase, tisulare), favorabilă difuzării bacteriilor în organism. 244

BACTERIOLOGIE GENERAL|

Ele sunt sintetizate stafilococi, clostridii, etc.

de

streptococii

beta-hemolitici,

Fibrinolizinele produc liza barierei de fibrină pe care organismul o formează în jurul focarelor inflamatorii pentru a limita diseminarea germenilor în ţesuturi. Prin intermediul acestor agresine, unii stafilococi şi streptococi determină infecţii septicemice. Colagenaza, enzimă puternic proteolitică elaborată de Clostridium perfringens, hidrolizează colagenul din structura ţesutului conjunctiv, creând astfel breşe adânci pe care apoi le invadează. Alte enzime bacteriene, ca proteazele, lipazele, dezoxiribonucleaza, ureaza, fosfataza acidă, etc., fără a avea o valoare deosebită în determinarea patogenităţii, o potenţează. B. TOXICITATEA BACTERIILOR Toxicitatea este proprietatea unor bacterii de a exercita un efect alterativ sau dereglator asupra unui organism neimunizat, prin componente structurale sau prin secreţii celulare, numite toxine. Ele sunt neutralizate în organismul imunizat (CarpCărare M., 1991; Duca Eugenia, 1974). Ideea că unele manifestări patologice sunt produse de anumite substanţe chimice (,,sepsine”) a fost formulată pentru prima dată de K l e s s (1872), referindu-se la leziunile produse de stafilococi. L ö f f l e r (1880) a demonstrat faptul că specia Corynebacterium diphteriae rămâne localizată în nazofaringe, fiind absentă in organele interne (miocard, rinichi, ficat, sistem 245

BACTERIOLOGIE GENERAL|

nervos, etc.), care sunt cele mai afectate de leziunile produse la distanţă de locul infecţiei. K o c h (1884) a descris holera ca pe observaţiilor că agentul patogen rămâne invadeze structurile acestuia şi ţesuturile administrarea orală a filtratului de cultură timp ce, pe cale parenterală este inofensiv.

o toxicoză, pe baza în intestin, fără să învecinate. în plus, reproduce boala, în

R o u x şi Y e r s i n (1888) au folosit primii termenul de ,,toxină”, pe care o considerau ,,un fel de enzimă”. în prezent, termenul defineşte orice substanţă toxică de provenienţă biologică, sintetizată de bacterii, fungi (micotoxine), celule vegetale sau animale (Zarnea G., 1994). Termenul de ,,otravă” este rezervat substanţelor chimice organice sau anorganice (stricnină, săruri de argint, arseniu, etc.) care, introduse într-un organism pe diverse căi, produc leziuni celulare sau tisulare, perturbarea sau suspendarea unor activităţi fiziologice normale şi, în funcţie de doză, chiar moartea organismului. Clasificarea toxinelor bacteriene Au fost propuse mai multe sisteme de clasificare a toxinelor. Probabil, faptul că nici unul nu satisface exigenţele unei clasificări riguros ştiinţifice, explică utilizarea curentă (cu toată ambiguitatea sa) a conceptului dualist de împărţire în exotoxine (toxine extracelulare) şi endotoxine (legate de corpul bacterian sau reţinute în celulă). Principalele diferenţe între cele două categorii de toxine sunt sintetizate în tabelul numărul 8. În funcţie de ţesutul sau celula ţintă asupra cărora acţionează şi efectul pe care-l produc, se cunoaşte o mare varietate de toxine: 246

BACTERIOLOGIE GENERAL|

hemolizine, leucocidine, neurotoxine, toxine cu efect necrotic, enterotoxine, etc. Hemolizinele sunt enzime bacteriene care determină în principal liza globulelor roşii dar şi a altor categorii de celule (leucocite, trombocite, celule tisulare). Ele au fost puse în evidenţă la numeroase specii bacteriene: Clostridium tetani, Clostridium perfringens, Clostridium septicum, stafilococi, streptococi, enterobacteriacee, etc. Leucocidinele sunt factori eliberaţi de unele bacterii după înglobarea lor în fagocite, determinând moartea acestora. Bacteriile Tabelul 8 Caractere distinctive între exo- şi endoenzime Caracterul diferenţial

Exotoxine

Endotoxine

Categorii de bacterii producătoare

Gram-pozitive

Gram-negative

Compoziţia chimică

Proteine

1.Lipopolizaharide (LPS prezente în membrana externă a peretelui celular la toate bacteriile Gramnegative); 2.Proteine holerică şi shiga)

Mecanismul eliberării din celulă

Sunt eliminate pe parcursul sintezei. Concentraţia intracelulară este 247

(toxina toxina

Dezintegrarea celulei

BACTERIOLOGIE GENERAL|

neglijabilă. Sensibilitatea la 600 C şi la enzi-mele proteolitice

Sensibile

Relativ rezistente

Efectul toxic

Specific şi puternic în doze mici

Nespecific şi slab

Modul separare

de

Prin filtrarea sau centrifugarea culturilor

Dezintegrarea celulelor bacteriene prin metode: fizice (ultrasonare, îngheţdezgheţ); chimice (tripsină, acid tricloracetic); biologice (bacteriofagi)

Răspunsul la acţiunea formo-lului 0,4% şi a căldurii (400 C)

Se transformă în anatoxine (toxoizi) netoxice dar antigenice

Nu se transformă în anatoxine

Imunogenitat Puternică (induc formarea e unor cantităţi mari de anticorpi antitoxici neutralizanţi)

Slabă

producătoare de leucocidine, ca stafilococii şi streptococii, sunt denumite bacterii ,,piogene”, deoarece leucocitele moarte se acumulează în focarul inflamator, contribuind la formarea puroiului. Neurotoxinele sunt exotoxine cu tropism pentru ţesutul nervos, determinând tulburări în transmiterea influxului nervos către organele efectoare. Principalele specii producătoare de 248

BACTERIOLOGIE GENERAL|

neurotoxine sunt Clostridium tetani (toxina tetanică), Clostridium botulinum (toxina botulinică) şi Shigella dysenteriae (toxina shiga). Toxinele cu efect necrotic acţionează asupra ţesuturilor, determinând moarte locală prin citoliză sau citotoxicitate. Reprezentative pentru această categorie sunt toxina difterică şi lecitinaza. Toxina difterică (Corynebacterium diphteriae) acţionează atât local, la nivelul mucoasei faringiene, cât şi la distanţă, ca urmare a difuzării pe cale sanguină şi a fixării mediate de receptori, pe diverse ţesuturi şi organe (miocard, ţesutul nervos, ficat, rinichi,etc.). Lecitinaza este o toxină-enzimă produsă de Clostridium perfringens şi de unele tulpini de Staphylococcus aureus, care scindează lecitina (lipid ce constituie o importantă substanţă de cimentare a membranelor celulare şi a mitocondriilor) şi produce liza rapidă a globulelor roşii, leucocitelor şi a unor celule tisulare. Enterotoxinele constituie un grup particular de exotoxine, implicate în majoritatea toxiinfecţiilor alimentare (Bârzoi B., Meica S., Neguţ S., 1999). Ele sunt elaborate de specii bacteriene Gram-pozitive (Staphylococcus aureus, Clostridium perfringens, Clostridium difficile, Clostridium sordellii), dar mai ales de bacterii Gram-negative: Escherichia coli enterotoxigenă (ETEC) şi enterohemoragică (EHEC), Vibrio cholerae, Vibrio parahaemolyticus, Salmonella spp., Shigella dysenteriae, Aeromonas hydrophila, Campylobacter jejuni, etc. În general, enterotoxinele acţionează direct asupra mucoasei intestinale, determinând fenomene citotoxice şi distructive (liza şi descuamarea enterocitelor) sau tulburări funcţionale, care modifică fluxul apei şi ionilor prin bariera epitelială.

249

BACTERIOLOGIE GENERAL|

Dereglările funcţionale sunt cauzate de activarea enzimelor adenilat-ciclaza sau guanilat-ciclaza din membrana celulară, urmată de creşterea cantităţilor de AMPc (adenozin-monofosfat ciclic), respectiv GMPc intracelular. Consecinţa acestei acumulări este inversarea polarităţii funcţionale a enterocitului, care, din celulă absorbantă devine celulă excretoare de apă şi electroliţi (Na+, Cl-). Alterările histologice şi funcţionale produse de enterotoxine se traduc, din punct de vedere clinic, printr-o diaree abundentă. Un alt mecanism de acţiune, specific enterotoxinelor stafilococice, ar consta (după Răducănescu H., Bica-Popii Valeria, 1986; Bârzoi D. şi col. 1999) în stimularea terminaţiilor nervului vag la nivelul stomacului, stimuli care, ajungând la centrul vomitiv din creier, declanşează contracţii peristaltice şi antiperistaltice şi, consecutiv acestora, descărcări diareice şi vomismente după o perioadă scurtă de incubaţie (1-6 ore). Tulburările se accentuează până la stare de şoc după trecerea toxinei în circulaţia sanguină, unde interacţionează cu macrofagele şi limfocitele T, determinând eliberarea în exces a citokinelor. C. FACTORII DE SENSIBILIZARE Factorii de sensibilizare sau factorii de alterare secundară sunt substanţe bacteriene corpusculare sau excretate (enzime, toxine), puternic antigenice, care complică boala infecţioasă după apariţia anticorpilor, prin cuplare cu aceştia. Nu toate reacţiile antigen-anticorp care au loc în organism sunt favorabile acestuia. Uneori, alterări grave pot fi produse de prezenţa concomitentă a antigenului (bacterie, produs microbian, 250

BACTERIOLOGIE GENERAL|

antigene tisulare similare antigenelor bacteriene) şi a anticorpilor corespunzători. În principiu, orice microorganism care a produs o infecţie, dacă nu a fost repede eliminat din organism, poate – cu condiţia întrunirii anumitor proporţii şi cantităţi antigen-anticorp – să determine fenomene de sensibilizare mediate de anticorpi şi/sau limfocitele T. Bacteriile care determină frecvent complicaţii prin fenomene de sensibilizare sunt prezentate în tabelul numărul 9. Tabelul 9 Factori bacterieni de sensibilizare Bacteria producătoare

Natura chimică

Denumirea

Mycobacterium spp.

Proteină

Tuberculină

Bulkholderia mallei

Proteină

Maleină

Brucella spp.

Proteină

Brucelină

Treponema pallidum

Proteină

Luetină

Francisella tularensis

Proteină

Tularină

Streptococcus pyogenes serogrup A



Factor ,,reumatogen”

Bacterii negative

LPS

Gram-

Factor ,,nefritogen”

251

Endotoxine

BACTERIOLOGIE GENERAL|

RELAŢIA DINTRE PATOGENITATEA BACTERIILOR ŞI PARAZITISM Modul de viaţă parazitar implică, pe de o parte, pierderea funcţiilor ce asigură supravieţuirea în mediile naturale, iar pe de altă parte, o adaptare complexă la mediul intern, ostil, al organismului-gazdă, care să le permită supravieţuirea şi chiar multiplicarea în prezenţa factorilor apărării antiinfecţioase (Zarnea G., 1994). . Teoretic, dobândirea factorilor de virulenţă necesari, care sunt codificaţi genetic, poate avea loc ca rezultat al unui proces îndelungat de evoluţie sau brusc, ca urmare a primirii unor gene de virulenţă prin intermediul plasmidelor transferabile sau al fagilor lizogeni. În funcţie de gradul de dependenţă a bacteriilor de organismul-gazdă şi de dotarea cu factori de patogenitate sunt descrise trei categorii de bacterii parazite: extracelulare, facultativ intracelulare şi obligat intracelulare. Bacteriile parazite extracelular colonizează în mod normal pielea şi mucoasele. Supravieţuirea lor in vivo este condiţionată de rezistenţa la fagocitoză, care este asigurată fie prin colonizarea unor regiuni inaccesibile fagocitelor, fie prin sinteza unor substanţe cu acţiune antifagocitară de tipul leucocidinelor sau al polizaharidelor şi polipeptidelor capsulare. Bacteriile parazite facultativ intracelular sunt bacterii adaptate la viaţa intracelulară, fiind capabile să pătrundă şi să se multiplice în celulele organismului-gazdă, fără a-şi pierde însă capacitatea de supravieţuire în mediul extracelular. 252

BACTERIOLOGIE GENERAL|

După B r u b a k e r , 1985 (citat de Zarnea G., 1994), acestea sunt de două tipuri. 1.Bacteriile parazite facultativ intracelular ,,specializate” sunt capabile să pătrundă şi să se multiplice în fagocitele ,,neprofesioniste” sau în alte tipuri de celule, dar nu şi în macrofage (ex. Shigella spp.). 2.Bacteriile facultativ intracelulare care practică un parazitism ,,generalizat”, în sensul că sunt capabile să se multiplice şi în fagocitele ,,profesioniste”, devenind uneori rezidenţi stabili ai acestora (ex. Salmonella typhimurium, Mycobacterium tuberculosis) . Atât bacteriile parazite extracelular cât şi cele parazite facultativ intracelular nu sunt dependente de organismul-gazdă, având posibilitatea de a se dezvolta şi in vitro, pe medii de cultură lipsite de celule vii. Bacteriile parazite obligat intracelular se multiplică exclusiv în celulele vii, deşi pot supravieţui perioade lungi de timp şi în mediile extracelulare. Dependenţa lor de celula-gazdă are la bază cauze diverse, în mare parte încă neelucidate. în cazul bacteriilor din genurile Chlamidia, Rickettsia şi Coxiella, parazitismul obligatoriu este generat de pierderea capacitatăţii de a stoca energia sub formă de compuşi macroergici, fiind dependente de rezerva de ATP a celulei-gazdă.

253

BACTERIOLOGIE GENERAL|

CONDIŢIONAREA PATOGENIT|ŢII BACTERIILOR ŞI CRITERIILE DE IMPLICARE ETIOLOGIC| Dinamica relaţiilor microorganism-gazdă este dependentă de interacţiunea dintre gradul de patogenitate intrinsecă a microorganismelor (dotarea cu factori de patogenitate) şi rezistenţa organismului (dotarea cu factori de apărare). În acest context, patogenitatea bacteriilor formează un spectru continuu care se extinde de la bacteriile nepatogene la bacteriile înalt patogene (Duca Eugenia şi col., 1979; Buiuc D., Neguţ M., 1999). Bacteriile nepatogene, incapabile să determine îmbolnăviri, sunt autotrofele saprofite din mediul extern, care nu găsesc în ţesuturile şi umorile organismului animal condiţiile fizicochimice şi nutrienţii necesari dezvoltării, fiind lipsite totodată de virulenţă şi toxicitate. Bacteriile accidental patogene sunt bacterii rezidente pe tegumente sau mucoase, cu un potenţial invaziv redus, încât, pătrunse accidental în ţesuturi şi umori sunt uşor lichidate de fagocite şi de factorii umorali ai apărării antiinfecţioase. Ele pot iniţia infecţii doar atunci când, prin leziuni traumatice (traumatisme craniene, vertebrale, fracturi) sau chirurgicale (chirurgie cardiovasculară), ajung în situsuri profunde, lipsite (sau aproape lipsite) de factori de apărare (lichidul cefalorahidian, zonele de creştere a osului, depozitele de fibrină de pe suprafaţa valvulelor cardiace, etc.), în care fagocitoza este practic absentă, iar lizozimul şi alţi factori umorali sunt absenţi sau în cantitate redusă. 254

BACTERIOLOGIE GENERAL|

Adaptându-se greu şi înmulţindu-se încet, bacteriile accidental patogene dau infecţii cu evoluţie lentă, dar cu leziuni grave, adesea irecuperabile: meningite posttraumatice, endocardite subacute, osteomielite, etc. Bacteriile condiţionat patogene fac parte din microbiota normală a organismului şi a mediilor naturale. Ele posedă factori de virulenţă şi toxicitate, dar sunt eficient reţinute de tegumentele şi mucoasele normale. Ca urmare, manifestarea patogenităţii lor este condiţionată de apariţia unor breşe în sistemul barierelor antiinfecţioase naturale şi de lipsa imunităţii specifice, de unde şi denumirea de ,,infecţii oportuniste” (engl. opportunity=ocazie bună; împrejurare favorabilă pentru a-şi ataca gazda) atribuită îmbolnăvirilor pe care le produc. Odată cu restabilirea integrităţii barierelor antiinfecţioase ale gazdei şi apariţia răspunsului imun, bacteriile condiţionat patogene revin la relaţia de comensalism, limitată la învelişuri. Implicarea în etiologia infecţiilor a speciilor accidental patogene şi condiţionat patogene (stafilococi, streptococi, pasteurele, corinebacterii, actinomicete, etc.) diferă după cum bacteria este izolată dintr-un produs normal steril (sânge, lichid cefalorahidian, măduvă osoasă, colecţii închise, etc.), sau din produse contaminate. În primul caz, însăşi prezenţa în asemenea prelevate conferă microorganismelor depistate (prin microscopie directă, izolare), semnificaţie clinică. Totuşi, pentru bacteriile accidental patogene, rezidente ale tegumentului (stafilococi coagulazo-negativi, streptococi viridans, etc.), se impune eliminarea suspiciunii de contaminare a probelor în timpul recoltării, prin argumente suplimentare, ca: 255

BACTERIOLOGIE GENERAL|

♦ izolarea aceleeaşi bacterii în hemoculturi repetate în condiţiile unei asepsii stricte; ♦ prezenţa în frotiul direct, a unei bacterii cu aceleaşi caractere microscopice (de exemplu, în probele de puroi); ♦ contextul clinic (la om, Staphylococcus epidermidis capătă semnificaţie clinică în hemoculturi de la pacienţii cu endocardită subacută şi proteză valvulară cardiacă, în aspirat din peritoneul pacienţilor imunocompromişi supuşi dializei extrarenale). În cazul prelevatelor contaminate pe traiectele de eliminare naturală (urină, secreţie lactată, spută, etc.), se impune argumentarea semnificaţiei clinice a bacteriilor oportuniste, care contaminează uzual aceste prelevate. în acest caz, principalul criteriu de incriminare etiologică este concentraţia semnificativ mai mare a acestor bacterii în focarul de infecţie decât atunci când contaminează probele corect recoltate. În prelevatele din zone normal colonizate (tegument, mucoase aparente), examenul bacteriologic urmăreşte, în funcţie de tabloul clinic, depistarea principalelor bacterii patogene care-l pot cauza (de exemplu, izolarea salmonelelor din fecalele diareice, izolarea brucelelor sau a campylobacteriilor din avortoni, placentă, lichide fetale). Absenţa din probă a bacteriilor patogene, care să explice tabloul clinic, orientează investigaţia spre bacteriile condiţionat patogene. în această situaţie, implicarea etiologică a bacteriilor depistate se face pe baza testelor de patogenitate. Bacteriile înalt patogene au suficienţi factori de agresivitate pentru a îmbolnăvi o gazdă cu apărare antiinfecţioasă normală. Ele depăşesc cu uşurinţă barierele apărării nespecifice (externe şi interne) ale organismului neimunizat (susceptibil), fiind agenţii 256

BACTERIOLOGIE GENERAL|

etiologici ai bolilor infecţioase clasice, cu letalitate crescută şi/sau complicaţii cronice grave. Simpla prezenţă a unei specii înalt patogene (Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium bovis, Bacillus anthracis, Salmonella spp., Brucella spp. Leptospira spp.,etc.) într-un produs patologic, alături de manifestarea clinică - deseori tipică reprezintă criterii suficiente pentru a-i atribui responsabilitatea etiologică.

257