Bacteriologie de l'Eau

1. Introduction :

Il est aujourd’hui évident que l’eau est essentielle ess entielle à bien des égards. Disposer d’une eau  potable et évacuer des eaux usées les moins polluées possibles constituent deux problèmes majeurs de l’hygiène urbaine mais ma is aussi de la plupart des industries alimentaires. Les eaux destinées à l’alimentation l’alimentati on humaine (boissons, préparation d’aliments etc.) ont des origine diverses (eaux souterraines ou de surface). La flore microbienne présente dans l’eau est très variée et dépend de l’origine de l’eau (eau de captage ou de distribution, eau résiduaire etc.).  Parmi les principaux microorganismes susceptibles de se trouver dans l’eau on rencontre rencontre essentiellement des germes normalement aquatiques, des germes telluriques et des germes d’origine intestinale : • Les bactéries vivant normalement dans l’eau sont surtout représentées par des bacilles ou des vibrions Gram - (Vibrio, ( Vibrio, Pseudomonas, Acinetobacter, bactéries sulfato-réductrices ou  ferrugineuses, etc...) des bactéries Gram + (Streptomyces, (Streptomyces, Micrococcus, Micrococcus, Corybacterium). Corybacterium). Bon nombre des bactéries typiquement aquatiques sont difficiles à cultiver au laboratoire et requièrent des milieux très dilués ne cultivent pas ou peu sur les milieux ordinaires) et ont des températures optimales de croissance de 20°C ou moins. • Les germes telluriques sont surtout représentés par des germes sporulés comme par exemple Clostridium, Bacillus ou des germes des genres Enterobacter genres Enterobacter ou Streptomyces. • Les germes de contamination intestinale humaine ou humaine  ou animale sont souvent pathogènes (Streptocoques D, entérobactéries dont Salmonella, Clostridium, Vibrio etc...). Ces bactéries ne se multiplient pas dans l’eau “peu chargée” char gée” en matières organiques. Ces germes sont “blessés” dans l’eau et leur culture nécessite nécessite souvent la revivifivation. En dehors de ces microorganismes on peut signaler la présence éventuelle dans l’eau : • d’algues microscopiques, microscopiques, de protozoaires et d’autres parasites animaux ou humains, des de s virus (virus de la poliomyélite, hépatite virale, entérovirus, etc.). La présence de microorganismes pathogènes dans l’eau est généralement la résultante d’une contamination de la nappe ou de la rivière ou encore du lac. Une contamination “secondaire” de l’eau de distribution peut intervenir avec des de s installations détériorées. Ces germes  pathogènes sont généralement peu résistants en milieu aqueux et leur survie n’est pas bonne : les problèmes sanitaires qu’ils posent résultent alors de leur présence en nombre limité. 2. Les techniques de numérotation utilisées En microbiologie alimentaire l’intérêt de l’étude à la fois quantitative et qualitative de la flore  présente dans un aliment est considérable. Bien que de nombreuses nombreuses techniques de numération soient utilisables, il n’existe pas à l’heure actuelle actuelle de technique parfaite. Certaines méthodes ne permettent pas permettent pas de différentier les germes vivants des germes morts, d’autres s’avèrent s’avèrent incapables de compter individuellement les cellules microbiennes lorsque celles-ci sont associées (Staphylococcus, (Staphylococcus, Streptococcus , mycélium etc..) et permettent d’évaluer d’ évaluer des unités formant colonies (UFC) ou des unités formant trouble ( UFT) ou de donner un nombre estimé à partir de la table de Makcrady dans le

1

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2.1 Technique du nombre le plus probable : NPP La technique du NPP fait appel à la méthode de fermentation en tubes multiples, au cours de laquelle au moins trois dilutions décimales de l'échantillon sont ensemencées dans des éprouvettes de bouillon et incubées à une température précise, pendant une période donnée. La méthode du NPP, dérivée des études de Mac Grady, consiste à interpréter les résultats en comparant les trois essais et leurs résultats. Il s’agit d’une interprétation probabiliste. 2.2 Méthode de filtration sur membrane Cette méthode consiste à faire passer un certain volume d’échantillon ou de ses dilutions au travers d’une d’une membrane filtrante, dont la porosité moyenne est de 0,45 mm à 0,22 μm, sur laquelle sont retenus les microorganismes recherchés. recherchés. Après filtration, on rince l’entonnoir supérieur avec de l’e au distillée distillée afin de récupérer la totalité des germes et d’éliminer d’éliminer du filtre lui-même d’éventuels agents microbicides. Le filtre est alors posé sur la surface sur un milieu gélosé spécifique du germe à rechercher, face  portant les micro-organismes vers le haut. Après incubation, comme dans le cas de la numération en milieu gélosé, on compte les colonies formées à la surface du filtre. 3. Méthodes de recherche et dénombrement des micro-organismes micro-organismes dans l’eau brute et l’eau traité. 3.1 Recherche et dénombrement des germes revivifiables

La recherche et le dénombrement des germes revivifiables se réalise à deux températures différentes afin de cibler à la fois les micro-organismes à tendance psychrophiles soit à 20° et ceux franchement mésophiles soit 37°C. A partir de l’eau à analyser, porter aséptiquement 2 fois 1ml dans deux boites de Pétri vides préparées à cet usage et numérotées numé rotées comme l’indique le schéma n°1. Compléter ensuite chacune des boites avec environ environ 20 ml de gélose TGEA fondue  puis refroidie à 45±1°C. Faire ensuite des mouvements circulaires et de va-et-vient en forme de « 8 » pour  permettre à l’inoculum de se mélanger à la gélose, puis laisser solidifier sur paillasse. Incubation : La première boite sera incubée, couvercle en bas à 20°C,  La seconde sera incubée couvercle en bas à 37°C,   pendant 72 heures avec : - première lecture à 24 heures , - deuxième lecture à 48 heures , et - troisième lecture à 72 heures . Lecture : Les germes revivifiables se présentent dans les deux cas sous forme de colonies lenticulaires  poussant en masse.

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R echerche cherche et et dénom dénombr brem eme ent des des ge g er mes r evivi vi viffi ables ables

Eau à Analyser

1 ml

1ml

Ajouter environ 20 ml de gélose TGEA Laisser solidifier sur paillasse Ajouter une double couche ( 5 ml )

Incuber à 37°C pendant 72 heures

Dénombrer les colonies lenticulaires en masse

Schéma n°1

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2.2 R echerche cherche et dé dénombr nombre ement de des Coli C olifform ormes tota totaux ux et fécaux fécaux en mi mi lie li eux liqui li quide dess dans dans

les eaux brute brutess Les coliformes se présentent sous forme de Bacilles Gram négatifs (BGN), non sporogènes, oxydase négative, aéro-anaérobies facultatifs, capables de croître en présence de sels biliaires et capables de fermenter le lactose avec production d’acides et de gaz, en 24 à 48 heures à 37°C. Les coliformes sont considérés comme indices de contamination fécale.  Technique en milieu liquide de Bouillon Lauryl Sulfate de Tryptose

La technique en milieu liquide fait appel à deux tests consécutifs à savoir :  le test de présomption : réservé à la recherche des Coliformes totaux.  le test de confirmation : encore appelé test EC medium et réservé à la recherche des Coliformes fécaux à partir des tubes positifs du du test de Présomption. 

Test de présomption.

A partir de l’eau à analyser, anal yser, porter aséptiquement : aséptiquement :   

3 fois 10 ml dans 3 tubes contenant 10 ml de milieu Bouillon Lauryl Sulfate de Tryptose D/C D/C muni d’une cloche de Durham 3 fois 1 ml dans 3 tubes contenant 10 ml de milieu Bouillon Lauryl Sulfate de Tryptyse S/C muni d’une cloche de Durham 3 fois 0,1 ml dans 3 tubes contenant 10 ml de milieu Bouillon Lauryl Sulfate de Tryptose S/C muni d’une cloche de Durham, comme l’indique le schéma n° 2.

Chassez le gaz présent éventuellement dans les cloches de Durham et bien mélanger le milieu et l’inoculum. Incubation : L’incubation se fait fait à 37°C pendant 24 à 48 heures. Lecture : Sont considérés comme positifs les tubes présentant à la fois :  un dégagement gazeux (supérieur au 1/10 de la hauteur de la cloche),  La fermentation du lactose, qui se traduit par l’apparition de gaz dans les cloches de Durham en moins de 48 heures, indique la présence de coliformes. Ces deux caractères étant témoins de la fermentation du lactose dans les conditions opératoires décrites. La lecture finale se fait selon les prescriptions de la table du NPP qui figure en annexe. 

T est de conf confii r matio tion

Le test de confirmation ou test de Mackensie est basé sur la recherche de Coliformes,

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-  produit de l’indole à partir du tryptophane tryptophane à 44°C, - donne un résultat positif à l’essai au rouge de méthyl, - ne produit pas de l’acéthyl méthyl carbinol, - n’utilise pas le citrate comme source source unique de carbone. Pour les coliformes totaux le test de confirmation est effectué en milieu vert brillant : Le bouillon lactosé bilié au vert brillant est utilisé pour les recherche et dénombrement des coliformes, des coliformes thermotolér ants ants et d’ Escherichia coli (Test de Mackenzie) dans les eaux d’alimentation. La fermentation du lactose, qui se traduit par l’apparition de gaz dans les cloches de Durham) en moins de 48 heures, indique la présence de coliformes. Les tubes de milieu Bouillon Lauryl Sulfate de Tryptose trouvés positifs lors du dénombrement des Coliformes totaux feront l’objet d’un repiquage à l’aide d’une anse an se  bouclée dans tube contenant le milieu EC medium muni d’une cloche de Durham,  Durham,   et aussi dans un tube contenant le BLBVB comme l’indique le schéma n°3. Chasser le gaz présent éventuellement dans les Cloches de Durham et bien mélanger le milieu et l’inoculum. l’inoculum. Incubation : L’incubation se fait cette fois-ci fois-ci au bain marie à 44°C pendant 24 heures, pour les coliformes fécaux et à 37°C pendant 48 heures pour les coliformes totaux. Lecture : Sont considérés comme positifs, les tubes présentant à la fois :  un dégagement gazeux, et surface , témoin de la production d’indole par Escherichia Coli  un anneau rouge en surface, après adjonction de 2 à 3 gouttes du réactif de Kowacs. La lecture finale s’effectue également selon les prescriptions de la table du NPP en tenant compte du fait qu’Escherichia Coli est à la l a fois producteur de gaz et d’indole à 44°C . 44°C .

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C olim olimétri tri e en mili mili eu li quide ui de : T est de de pr pr ésomp somption

Eau à Analyser

3 X10 ml

3 X 1 ml

BLST D/C

BLST D/C

3 X 0,1ml

BLST S/C

37°C, 24 à 48 heures

+

+ 3

+

+

+ 2

-

-

0

-

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C olim li métri tri e : T est de conf confii r mati ati on

Ensemencement des tubes positifs Repiquage sur milieu EC medium pour Coliformes fécaux

+

-

1

Repiquage sur milieu BLBVB Coliformes totaux

+

-

1

Lecture sur la table de Mac craddy NPP/100ml

Schéma n°3

Même chose : Dénombrement des tubes positifs (troubles+ gaz)

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2.3 Recherche et dénombrement des bactéries coliformes et d’E coli dans les eaux traitées

La colimétrie par filtration est une méthode rapide, simple, normalisée mais nécessitant la disponibilité d’une rampe de filtration.    

Tout d’abord, il faudrait stériliser un entonnoir à l’aide d’un bec bunsen. Le refroidir soit avec l’eau l’ea u à analyser ou bien avec de l’eau distillée distillée stérile. Mettre en place de façon aseptique une membrane de 0,45 µ entre la membrane poreuse et l’entonnoir à l’aide d’une pince stérile. Fixer ce dernier avec la pince correspondante.  Test présomptif :

R echerche cherche des des bacté bactérr i es coli colifform ormes    

Remplir de façon aseptique l’entonnoir avec 100 ml d’eau à anal yser. Actionner la pompe à vide pour permettre le passa ge de l’eau à travers la membrane. m embrane. Retirer ensuite la membrane à l’aide d’une pince stérile et la placer dans une boite de Pétri de 45 mm de diamètre contenant de la gélose TTC. Cette membrane sera incubée à 37°C, pendant 24 heures et servira à la recherche des  bactéries coliformes.

R echerche d’ E coli.    

Remplir par la suite l’entonnoir avec 100 ml d’eau à analyser. Actionner de la même façon la pompe pompe à vide pour permettre le passage de l’eau à travers la membrane. Retirer ensuite la membrane à l’aide d’une pince stérile et la placer dans une boite de Pétri de 45 mm de diamètre contenant de la gélose TTC. Cette deuxième membrane sera incubée à 44°C, pendant 24 heures et servira à la recherche d’E. d’E. coli.

L ectur cture e et et inte i nterr prétat prétatii on

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C olim olimétri tri e par par f i ltrat ltr atii on : T est de de pr ésom sompti pti on

Filtration de 100 ml d’eau Eau à Analyser

Entonnoir Membrane 0,45µ Rampe de filtration à 3 postes

Pompe

37°C

44°C

24 heures

Colonies typiques et les colonies atypiques

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acide aminés libres et de l’extrait de levure. L’association de ces 2 constituants fournie au milieu de nombreux facteurs de croissance. Incubation L’incubation se fait à 37°C pendant 12 heures. Pour Ecoli  Ensemencement Ensemencement sur eau peptonnée exempte d’indole L’eau peptonée exempte d’indole permet la culture des germes ne présentant pas d’exigences  particulières. Ce milieu est surtout employé au cours du test de Mackenzie pour l’i dentification d’ Escherichia  Escherichia coli par coli par la production production d’indole. Incubation  L’incubation se fait cette fois-ci au bain marie à 44°C pendant 21 heures.  Lecture Après incubation des tubes inoculés, la présence d’indole est indiquée par l’apparition d’une couleur rouge dans la phase alcoolique du réactif de Kovacs, ajouté à raison de 0,5 ml par tube. Pour les bactéries coliformes : Etalement d’une aliquote de la culture sur un papier fil tre imbibé de 2 gouttes du  réactif à l’oxydase. l’oxydase. L’appariation d’une coloration bleue/violet foncée dans les 30 secondes indique une  réaction positive, les colonies suspectes ne présentent pas cette coloration car elles sont oxydase-. 

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C olim li métrie tri e par fi ltrati ltrati on : T est confi confi r matif 

Colonies typiques et les colonies atypiques

Isolement sur milieu TSA Et incubation à 37°C/24 heures

Pour E coli :

Pour les bactéries coliformes : Etalement d’une partie de la culture sur un papier imprégné avec 2 gouttes du réactif de l’oxydase

Ensemencement sur eau peptonée exempte d’indole Incubation à 44°C/24heurs

Réaction de Kovacs

l’absence d’une coloration bleu/violet

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 2.4 R echerche herche et déno nom mbr ement des Strep Streptocoques ues féc fécaux en mili eux liquid liquide es dans les les eaux brute brutess Les Streptocoques fécaux ou Streptocoques du groupe D de la classification de Lancefield , se présentent sous forme de coccie à Gram + , shériques à ovoïdes formant des chaînettes , ne possédant pas de catalase cat alase mais possédant l’antigène du groupe D. Ils sont capables de se développer en 24 à 48 heures à 37°C sur un milieu sélectif à l’azoture de sodium en donnant des colonies caractéristiques réduisant le TTC et qui de plus hydrolysent l’esculine en 48 heures à 44°C après repiquage d’une colonie sur une   gélose  biliée à l’esculine. Leur recherche et leur dénombrement peut se faire de la même manière que pour les coliformes, coliformes, c’est à dire à l’aide de deux méthodes distinctes selon la disponibilité ou non d’une rampe de filtration et seuls les milieux de culture changent.

 Mét  Métho hod de de reche recherr che en mi lieu lieu liquid liquide e Tout comme la méthode de recherche des coliformes en milieu liquide, celle de la recherche et le dénombrement des Streptocoques fécaux fait appel à deux tests consécutifs à savoir :  le test de présomption  le test de confirmation : réservé à la confirmation réelle des Streptocoques Streptocoques fécaux à partir partir des tubes positifs du test de présomption .

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

T est de de confi confirr mati ati on .

Le test de confirmation est basé sur la confirmation des Streptocoques fécaux éventuellement présents dans le test de présomption. Les tubes de ROTHE trouvés tro uvés positifs feront donc l’objet d’un repiquage à l’ aide d’une öse  bouclée dans tube contenant le milieu LITSKY LITSKY EVA, comme l’indique le schéma n°6. Bien mélanger le milieu et l’inoculum l’ inoculum . Incubation : L’incubation se fait cette fois-ci fois-ci à 37°C, pendant 24 heures . Lecture : Sont considérés comme positifs , les tubes présentant à la fois foi s :  un trouble microbien, et  une pastille violette (blanchâtre) au fond des tubes.

La lecture finale s’effectue également selon les prescriptions de la ta ble du NPP qui figure en annexe.

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 Strep  Streptométri e : Test Test de préso résom mpti on

Eau à Analyser

3 X 10 ml

3 X 1 ml

3 X 0,1 ml

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 Strep  Streptométri e : Test Test de confir mation

Repiquage sur milieu Eva -litsky

Repiquage sur milieu Eva-litsky

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Schéma n°6

2.5 Recherche et dénombrement des entérocoques intestinaux dans les eaux traitées

La streptométrie par filtration est tout comme la colimétrie par filtration une méthode rapide, simple, normalisée mais nécessitant la disponibilité d’une rampe de filtration. 

T est de de pr pr ésomp ésomptition on



Tout d’abord, il faudrait stériliser un entonnoir à l’aide d’un bec bunsen.



Le refroidir soit avec l’eau à analyser ou bien avec de l’eau distillée stérile.



Mettre en place de façon aseptique une membrane de 0,45 µ entre la membrane poreuse et l’entonnoir à l’aide d’une pince pinc e stérile.



Fixer ce dernier avec la pince correspondante.



Remplir de façon aseptique l’entonnoir avec 100 ml d’eau à anal yser.



Actionner la pompe à vide pour permettre le passa ge de l’eau à travers la membrane. m embrane. Retirer ensuite la membrane à l’aide d’une d’u ne pince stérile et la placer dans une boite de Pétri

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 Strep  Streptométr ie par filt fi ltrat ration ion : Test Test de préso résom mpti on

Filtration de 100 ml d’eau Eau à Analyser

Entonnoir Membrane 0,45µ

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L’incubation L’incubation se fait cette fois-ci à 44°C, pendant 2 heures. Lecture : Considérer comme positives, toutes les colonies donnant une couleur brune à noire dans le milieu. Les compter comme entérocoques intestinaux, et rapporter le total des colonies à 100 ml d’eau à analyser à analyser (Nombre de colonies typiques confirmées en/100ml)

 Strep  Streptométri e par filtrat filtrati on : Test Test de préso résom mption

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 2.6 R echerche herche et déno nom mbr ement des s pores d’Anaérobies d’Anaérobies Sulfito-Réducteurs Les anaérobies sulfito-réducteurs (ASR) se présentent sous forme de bactéries Gram +, se développant en 24 à 48 heures sur une gélose Viande Foie en donnant des colonies typiques réduisant le sulfite de sodium (Na2SO3) qui se trouve dans le milieu, en sulfure qui en présence de Fe2+ donne FeS (sulfure de fer ) de couleur noire. noire. Les spores des ASR constituent généralement des indices de contamination ancienne. A partir de l’eau à analyser  :  : 

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 prendre environ 25 ml dans un tube stérile, qui sera par la suite soumis à un chauffage de l’ordre de 80°C 80 °C pendant 8 à 10 minutes, dans le but de détruire toutes les formes végétatives des ASR éventuellement présentes. Après chauffage, refroidir immédiatement le tube en question, sous l’eau de robinet. Mettre en place de façon aseptique une membrane de 0,2 µ entre la membrane  poreuse et l’entonnoir à l’aide d’une pince stérile.

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Chauffage à 80°C, 10 minutes au bain marie. Refroidissement brutal sous sous l’eau de robinet Puis Filtration de 100 ml d’eau Eau à Analyser

Entonnoir Membrane 0,2µ