BACTERIILE LACTICE

BACTERIILE LACTICE

Bacteriile lactice sunt microorganisme Gram pozitive, capabile să producă

o

cantitate mai mare sau mai mică de acid lactic, prin degradarea diverselor substraturi: -

hexoze: bacteriile care degradează 95% din glucoză în acid lactic sunt denumite homolactice;

-

acidul malic: transformarea acidului malic in acid lactic, cunoscută sub numele de fermentaţie malolactică este un proces cu mari implicaţii compoziţionale şi organoleptice în vin.

Alte substraturi degradate de bacteriile lactice sunt: pentozele, acidul tartric, acidul citric, glicerolul. MORFOLOGIA BACTERIILOR LACTICE Structura generală a celulei bacteriene se apropie de aceea a celulei vegetale. Forma bacteriilor este un caracter destul de stabil, de aceea constituie unul dintre criteriile fundamentale ale clasificării acestor microorganisme. Bacteriile lactice se prezintă la microscop de forme variate. Astfel se disting: coci, de formă rotunjită sau ovală şi bacili sau bastonaşe, de formă cilindrică, mai mult sau mai puţin groase, uneori sinuoase. Cocii au diametrul de la 0,4 pana la 1,0µm, iar bacilii au grosimea de 0,5 µm şi 2-5 µm sau mai mult în lungime. Atunci când două celule de coci, rezultate în urma unei diviziuni, se separă imediat, apar la microscop drept coci izolaţi; când rămân alipite un anumit timp, apar ca grupări celulare caracteristice: diplococi (celule alipite câte două),streptococi (celule în şirag), sarcini (celule în aglomerări cubice), stafilococi ( celule în aglomerări neregulate). Bacilii, ca şi cocii, pot rămâne alipiţi după diviziune, formând diplobacili sau streptobacili, înlănţuiri prezentând aspect de filamente mai mult sau mai puţin lungi, mai mult sau mai puţin sinuoase. Lungimea filamentelor depinde de condiţiile de cultură, în special pH-ul mediului, temperatură, prezenţa alcoolului, viteza de multiplicare şi agitaţia lichidului. STRUCTURA CELULEI DE BACTERII LACTICE

Bacteriile sunt celule procariote. Ele se deosebesc esenţial de celulele eucariote (celulele vegetale şi animale) atât prin talia net inferioară, cât şi prin organizarea lor, caracterizată de absenţa membranei ce separă nucleul de citoplasmă şi prin mecanismul lor de diviziune. Marea varietate a bacteriilor se datorează mai curând diferenţelor în ceea ce priveşte metabolismul şi fiziologia lor decât deosebirilor morfologice. Structura tuturor celulelor bacteriene este foarte asemănătoare şi cuprinde trei elemente principale: învelişul celular, citoplasma şi nucleul. ÎNVELIŞUL CELULAR Învelişul celular cuprinde peretele şi membrana. Celula este delimitată de membrana citoplasmatică, dublată spre exterior de perete. Constituţia membranei este relativ constantă, în schimb a peretelui este mai variabilă şi permite diferenţierea unor grupe mari de bacterii. Între perete şi membrană, spaţiul periplasmic este un gel mai mult sau mai puţin fluid în care se deplasează proteina. Peretele care dublează membrana citoplasmaticăpoate fi el însuşi înconjurat de un înveliş exterior. De natură organică vâscoasă, ea este perfect delimitată, constituind capsula. Importanţa sa este adesea legata de condiţiile de cultură. La unele specii sau suşe, capsula polizaharidică, adesea groasă, participă la rezistenţa bacteriei contra unor agresiuni. PERETELE CELULAR Peretele este scheletul rigid al celulei; el dă celulei forma sa caracteristică sferică sau cilindrică. Foarte solid, el rezistă la presiunea osmotică intracelulară enormă, care poate varia între 5 şi 20 atmosfere. Plasată într-un mediu hipotonic, fară el, celula se sparge; de aceea este un element esenţial. Comportamentul celulelor în timpul testului colorat se explică prin structura peretelui: la Gram (+), peptiloglicanul este gros şi este singurul constituent, la cele Gram(-), el este mai subţire şi acoperit de membrana exterioară. Substraturile nutritive, ionii minerali, vitaminele, apa traversează liber peretele, la fel ca şi produşii metabolismului bacterian. De asemenea, peretele asigura alte funcţii importante în viaţa celulei: este suportul antigenelor specifice şi receptorilor bacteriofagilor. Constituentul principal şi caracteristic al peretelui celulei bacteriene este peptidoglicanul, care este o macromoleculă enormă ce înconjoară celula printr-o reţea de

lanţuri polizaharidice şi peptidice. Lanţurile polizaharidice, lineare, paralele sunt reunite între ele prin punţi peptidice. MEMBRANA CITOPLASMATICĂ Membrana celulei bacteriene are aceeaşi structură fundamantală ca şi celelalte membrane biologice, fiind un dublu strat fosfolipidic în care sunt inserate proteine. Membrana citolpasmatică este unul dintre elementele vitale ale celulei bacteriene. Alterarea sa încetineşte schimbul cu mediul şi împiedică menţinerea pH-ului intracelular. În special, mecanismele generatoare de energie care se derulează la nivel membranar sunt inhibate şi viabilitatea celulelor este afectată. Lipidele membranare constituie totalitatea lipidelor bacteriene (95-99%). Ele cuprind puţini acizi graşi liberi dar mai ales glicerofosfolipide. Acizii graşi din constituţia lipidelor au lanţuri carbonate de 10-20 atomi de carbon. Majoritatea sunt acizi cu 16-18 atomi de carbon, saturaţi sau nu. La bacteriile lactice există şi un acid ciclopropanic în C19 acidul lactobacilic. Acizii graşi posedă o catenă lungă hidrocarbonată şi o funcţie acid carboxilic terminală. Lungimea catenei, nesaturarea ei, conformaţia cis sau trans a dublelor legături şi, pentru bacteriile Gram pozitive, ramificarea izo sau anteizo caracterizează aceste molecule. Sinteza acizilor graşi este realizată prin condensări succesive ale malonil-CoA pe acidul acetic pentru catenele cu număe par de atomi de carbon şi pe acidul propionic pentru catenele cu număr impar de atomi de carbon. Acizii nesaturaţi sunt sintetizaţi la bacteriile anaerobe prin acţiunea unei dehidrataze asupra acidului hidroxidecanoic format prin adiţia unei unităţi malonil asupra acidului octanoic. Prelungirea progresivă a acestui acid conduce la acidul cis-vaccenic (C18), el însuşi precursor al acidului lactobalilic (C19). Această ultimă trecere dela un acid nesaturat la acidul ciclopropanic corespunzător se realizează prin metilarea dublei legături. Fosfolipidele cele mai abundente sunt constituite dintr-o moleculă de glicerol la cere o funcţie alcool primară şi funcţia alcool secundară sunt esterificate de acizii graşi. Cealaltă funcţie alcool primară este esterificată de acidul fosforic, el însuşi esterificat de o nouă moleculă de glicerol. Bacteriile lactice conţin, de asemenea, difosfatidil glicerol şi esteri aminaţi ai fosfatidil glicerolului cu alanina şi lizina. Conţinutul în fosfolipide al

bacteriilor variază în funcţie de stadiul de creştere şi de condiţiile de cultură. Glicolipidele, în general glicozide ale digliceridelor, se formează prin legătură ozidică la nivelul funcţiei alcool primare a unei gliceride cu un mono sau dizaharid – glucoză, fructoză, ramnoză. Proteinele sunt de două feluri: proteine intriseci (70%), care fac parte complet din membrană şi proteine periferice (30%). Primele sunt integrate în lipide prin partea lor hidrofobă. Partea lor hidrofilă iese la suprafaţă la interior sau la exterior. Proteinele periferice sunt legate prin interacţiuni slabe de proteinele integrate sau de lipide. La interiorul dublului strat, proteinele sunt relativ mobile lateral. Fluiditatea membranei este legată de constituţia sa în acizi graşi. Astfel, de exemplu, bacteriile se pot adapta la o diminuare a temperaturii crescînd proporţia de acizi graşi nesaturaţi. CITOPLASMA Citoplasma conţine enzimele metabolismului bacterian, dar reprezintă şi sediul sintezei proteinelor. Ansamblul metabolismului, reacţii de degradare şi de sinteză se realizează în mod programat, în funcţie de schimburile cu mediul exterior pentru a produce energia necesară creşterii. La microscopul electronic cu transmisie, interiorul unei celule bacteriene apare granulos. Acest aspect este dat de ribozomi, care au un rol esenţial în sinteza proteinelor, ei asigurând traducerea codului genetic. Ribozomii sunt formaţi din două subunităţi de talie diferită, 50 S şi 30 S. Ribozomul asamblat are o constantă de sedimentare de 70 S (Svedberg). Subunitatea 30 S conţine o moleculă de ARN ribozomal 16 S (1542 nucleotide) şi 21 molecule de proteine diferite. Masa moleculară a acestui ansamblu este de 900 Da. Subunitatea 50 S conţine două molecule de ARN ribozomal, molecula 23 S şi molecula 5 S de 2904 şi 120 nucleotide. Ea conţine, de aemenea, 35 proteine şi are o masă moleculară de 1600 kDa. NUCLEUL ŞI MATERIALUL GENETIC Cromozomul bacterian este reprezentat de o singură moleculă de ADN, de formă circulară şi de talie diferită, în funcţie de specie: 2400 kilobaze la Lactobacillus plantarum, 1400 kilobaze la Leuconostoc oenos, 1200 kilobaze la Pediococcus pentosaceus. Cromozomul nu este separat de citoplasmă printr-o membrană. El este localizat în partea centrală a celulei dar pare ataşat în mai multe de membrana

citoplasmatică, în special la nivelul mezozomului. Pot exista mai multe nuclee în celulă deoarece diviziunea nucleului şi a celulei nu sunt sincrone. Secvenţa nucleotidică după care sunt asamblate cele patru nucleotide caracterizate de cele patru baze A, T, G şi C constituie suportul genetic care este decodat în timpul traducerii. Cromozomul codifică majoritatea informaţiilor privind funcţiile vitale ale celulei, dar o serie de funcţii, mai mult sau mai puţin vitale, sunt determinate de plasmide, mici molecule de ADN circulare, complet independente de cromozom. Ele sunt în număr şi talie variabile după speciile şi suşele de bacterii şi determină, în general, funcţii ca alimentaţia anumitor zaharuri, hidroliza proteinelor, rezistenţa la fagi, la antibiotice, la metale grele etc. Plasmidele se divizează după aceleşi principiu de replicare ca şi cromozomul sau în moduri mai specifice dar în orice caz în mod total independent. Una dintre caracteristicile plasmidelor este instabilitatea lor astfel încât anumite caractere fenotipice pot fi pierdute spontan în cursul generaţiilor, dar adesea există mai multe copii pe celulă ale unor plasmide CLASIFICAREA BACTERIILOR LACTICE Taxonomia are drept scop identificarea, descrierea şi clasarea microorganismelor. Clasificarea se face după mai multe niveluri ierarhice, nivelul cel mai înalt fiind regnul, în timp ce nivelul de bază este specia. Taxonomia operează cu caractere fenotipice sau moleculare. Fenotipul cuprinde ansamblul caracterelor morfologice, fiziologice, biochimice, imunologice şi compoziţia unor constituenţi celulari. Progresele biologiei moleculare furnizează în prezent noi criterii de clasificare bazate pe analiza genomului. Taxonomia moleculară presupune clasificarea microorganismelor după similitudinea genomului lor. Taxonomia fenotipică este utilizată, în mod clasic, pentru clasificarea microorganismelor până la nivel de specie, în timp ce taxonomia moleculară permite o diferenţiere a suşelor, deosebit de utilă în contextul folosirii în industria vinicolă a unor suşe de bacterii sau de levuri selecţionate. Bacteriile lactice aparţin diviziunii bacteriilor Gram pozitive, care se împart ţn doua

subdiviziuni, numite Phylum, ţn funcţie de procentajul guaninei şi citozinei în raport cu ansamblul bazelor moleculei de ADN. Cele două subdiviziuni sunt: Clostridium, pentru care (G +C) % este mai mic de 50 % şi Actinomycetes, la care (G +C) % este mai mare de 50 %. Majoritatea genurilor din care fac parte bacteriile lactice aparţin subdiviziunii Clostridium. Subdiviziunea Actinomycetes cuprinde şi ea o serie de genuri de bacterii lactice importante pentru industria alimentară. Bacteriile lactice ale vinului aparţin genurilor Lactobacillus, Leuconostoc şi Pediococcus. Cele trei genuri: Lactobacillus, Leuconostoc si Pediococcus sunt foarte apropiate din punc de vedere filogenetic. Totuşi, morfologia şi gruparea celulelor lor permit diferenţierea clară a acestora, dar unele specii ale fiecărui gen prezintă numeroase caractere metabolice identice: unele specii de Lactobacillus şi Leuconostoc au aceeaşi capacitate de a asimila numeroase substraturi. Diferenţierea speciilor de bacterii lactice se bazează pe morfologia lor şi pe caracterul homofermentativ sau heterofermentativ al acestora. Bacteriile homofermentative produc peste 85% din acidul lactic pornind de la glucoză. Bacteriile heterofermentative produc, în afară de acid lactic, CO2, alcool etilic şi acid acetic. Dintre coci, speciile genului Pediococcus sunt homofermentative, iar cele ale genului Leuconostoc sunt heterofermentative. Lactobacilii pot prezenta ambele componente şi sunt împarţiţi ţn trei grupe: strict homofermentativi (grupa I, care n-a fost niciodată identificată în vin); heterofermentativi facultativ (grupa a II-a); heterofermentativi obligatoriu (grupa a III-a).Principalele specii de bacterii lactice întâlnite în must şi vin Lactobacilii homofermentativi strict nu fermentează pentozele şi formează, pornind de la o moleculă de glucoză, două molecule de acid lactic pe calea Embden-Meyerhoff. La heterofermentativii facultativ, din glucoză rezultă, de asemenea, două molecule de acid lactic, dar pentozele sunt metabolizate şn acid lactic şi acid acetic pe calea heterofermentativă a pentozofosfaţilor. Bacteriile heterofermentative obligatoriu nu posedă fructozo-1,6-difosfat-aldolaza, caracteristică pentru calea Embden-Meyerhoff. Ele metabolizează glucoza pe calea pentozofosfaţilor în CO2, acid lactic, acid acetic şi alcool atilic; pentozele sunt transformate în acid lactic şi acid acetic, ca şi în cazul bacteriilor din grupa a II-a.

Tabelul 5.1. Coci

Homofermentativi Heterofermentativi

Bacili

Heterofermentativi (grupa a II-a) Heterofermentativi

facultativ obligatoriu

(grupa a III-a)

Pediococcus damnosus Pediococcus pentosaceus Leuconostoc oenos Leuconostoc mesenteroides Leuconostoc gracile Lactobacillus casei Lactobacillus plantarum Lactobacillus hilgardii Lactobacillus fructivorans Lactobacillus brevis

În ultimii ani, pentru specia Leuconostoc oenos s-a propus o nouă denumire: Oenococcus oeni, pentru moment singura specie a genului Oenococcus. Determinarea genului bacteriilor lactice izolate din vin Morfologie

Celule rotunjite

Celule alungite

Coci Aranjarea celulelor Fermentarea glocozei

Perechi sau şiraguri Heterofermentativă

Tetrade Homofermentativă

Bacili Perechi sau lănţişoare Heterofermentativă sau

Izomerul acidului lactic Genul

D Leuconostoc

L sau D, L Pediococcus

homofermentativă L, D sau D, L Lactobacillus

(Oenococcus) DEZVOLTAREA BACTERIILOR LACTICE ÎN VIN

REPRODUCEREA BACTERIILOR LACTICE Bacteriile lactice, asemenea tuturor bacteriilor, se înmulţesc prin sciziparitate, dintr-o celelă mamă formându-se două celule fiice identice. Multiplicarea unei celule bacteriene presupune, pe de o parte, diviziunea materialului nucleic, pe de altă parte un ansamblu de sinteze pentru formarea noiler învelişuri celulare şi a elementelor citolpasmice, în special ribozomii şi enzimele. Materialul genetic se transmite de la celula mamă la celulele fiice după replicarea cromozomului

în

doi

cromozomi

fii,

aceasta

făcându-se

după

modul

semiconservativ,fiecare cromozom fiu cuprinzând o catenă a cromozomului parental. Cealaltă catenă este sintetizată de ADN-polimerază, care utilizează nucleotidele purtând bazele A, T, G şi C după regula apariţiei bazelor complementare, rezultând astfel o catenă complementară. Acest proces asigură conservarea patrimoniului genetic în descendenţă, cei doi nuclei fii fiind strict identici cu nucleul celulei mamă.

În urma sintezei porţiunilor de membrană şi a peretelui, în mijlocul celulei se formează un sept care separă treptat celula mamă în două celule fiice, în care se repartizează materialul genetic şi ceilalţi constituenţi celulari. Atunci când septul este complet format, cele două celule fiice se despart. Diviziunea celulei şi diviziunea nucleului nu sunt sincrone, replicarea fiind mai rapidă. În plus, ciclul de replicare poate începe chiar înainte de terminarea ciclului precedent, din acest motiv celulele bacteriene în fază de creştere activă conţin mai mult de un cromozom într-o celulă. În cursul diviziunii, plasmidele, mult mai mici decât cromozomul, nu sunt întotdeauna corect repartizate între celule după replicarea lor, de unde rezultă instabilitatea lor în cursul generaţiilor. FACTORII CARE INFLUENŢEAZĂ DEZVOLTAREA BACTERIILOR LACTICE pH-ul. Este un factor primordial al calităţii vinului. Aciditatea reală are un efect selectiv şi realizează o dublă triere: a speciilor de bacterii şi a constituenţilor susceptibili de a fi descompuşi. Se numeşte pH-prag valoarea pH-ului începând de la care bacteriile se dezvoltă şi pot fi atacate diverse substraturi. Suşele apte de a produce o fermentaţie malolactică pură se caracterizează prin valorile pH-ului prag de asimilare a acidului malic şi zaharurilor. Pentru coci, bacteriile cele mai convenabile pentru această transformare, pH-ul-prag pentru acid malic este inferior celui pentru zaharuri. În zona cuprinsă între cele două valori pH, bacteriile degradează acidul malic fără a fermenta cantităţi importante de zaharuri, deci fără a produce aciditate volatilă. Cu cât acest interval este mai mare, cu atât suşa este mai convenabilă pentru vinificare. Dimpotrivă, în cazul bacililor, pH-ul-prag pentru zaharuri este mai mic decât cel pentru acidul malic. Aceştia din urmă nu garantează o fermentaţie malolactică fără riscul de a produce aciditate volatilă. Bacteriile lactice prezintă un pH optim şi valori limite care influenţeazăcreşterea. pHul optim pentru multiplicarea bacteriilor lactice este cuprins între 4,2 şi 4,5, valori mult mai mari faţă de cele întâlnite în vin. La valori ale pH-ului cuprinse între 3,0 ţi 4,0 bacteriile lactice se dezvoltă cu atât mai uşor iar fermentaţia malolactică se declanşează cu atât mai repede cu cât valoarea este mai mare. pH-ul limită absolut are valoarea aproximativă de 2,9, valoare sub care fermentaţia malolactică, în mod natural, nu mai este posibilă. În aceste condiţii, bacteriile lactice nu

pot îndeplini principala lor misiune în vin – degradarea acidului malic – în vinurile foarte acide, adică exact acolo unde este cea mai mare nevoie de ele. Oprirea creşterii, determinată de aciditatea mediului, intervine atunci când pH-ul intracelular atinge o limită. Fracţiunea acizilor, care penetrează liber sub formă nedisociată, este disociată în interiorul celulei, antrenând o diminuare a pH-ului. Prin urmare, activitatea enzimelor intracelulare este mai mult sau mai puţin inhibată după pHul lor optimal de activitate. Limita inferioară tolerată pentru pHi variază ţn funcţie de specie, fiind cuprinsă între 4,7 (Lactobacillus plantarum) şi 5,5 (Leuconostoc mesenteroides). Mecanismele de adaptare a bacteriilor lactice la aciditate nu sunt cunoscute, dar ele participă activ la selecţia naturală a speciilor de vin. Vinurile cu pH ridicat prezintă o microfloră lactică nu doat mai abudentă dar şi mult mai variatădecât vinurile acide. Aceste vinuri sunt mai fragile pe plan microbiologic deoarece, printre aceste bacterii, unele sunt bacterii de contaminare. Aşa cum facilitează creşterea lor, pHul ridicat favorizează şi supravieţuirea bacteriilor în vin, putând apărea alterări ale vinului la mai multe luni sau chiar mai mulţi ani după vinificare. Temperatura. În mediul de cultură în laborator, bacteriile lactice izolate din vin sunt mezofile, multiplicându-se la temperaturi cuprinse între 15 şi 45°C, dar temperatura optimă de creştere este cuprinsă între 20 şi 37°C. În condiţiile unui mediu alcoolizat, cum este vinul, intervalul celor mai convenabile temperaturi pentru bacterii este mai mic, fiind cuprins între 20-23°C, iar când tăria alcoolică a vinului este mai mare de 13-14% vol, temperatura optimă de creştere a bacteriilor lactice scade. Pe măsura scăderii temperaturii, viteza de creştere devine mai lentă, încetând complet atunci când temperatura este mai mică de 15°C. Pentru declanşarea fermentaţiei malolactice, vinul trebuie păstrat la o temperatură de aproximativ 20°C. Temperaturile excesive, de peste 25°C, inhibă formarea biomasei bacteriene, încetinind fermentaţia malolactică şi cresc riscurile de deviaţii şi de creştere a acidităţii volatile. La temperaturi mai mici de 18°C, fermentaţia malolactică se declanşează mai greu, totuşi o fermentaţie malolactică demarată poate continua, chiar dacă într-un ritm mult mai lent, şi la temperatură mai mică, de ordinul a 10-15°C, deoarece biomasa bacteriană era deja constituită atunci când temperatura a devenit improprie pentru creşterea acesteia. Gerbaux V. a constatat ce la 12°C fermentaţia

malolactică nu s-a terminat nici în 80 de zile. Aerarea. O aerare moderată a vinului favorizează declanşarea mai rapidă a fermentaţiei malolactice, dar rolul oxigenului asupra creşterii bacteriilor lactice nu este foarte clar, acestea având un comportament diferit faţă de oxigen, în funcţie de specie. Unele pot fi indiferente la prezenţa oxigenului, unele se pot acomoda mai bine în absenţa sa, unele pot tolera oxigenul la presiunea parţială din aer dar sunt incapabile sa-l utilizeze, altele pot necesita mici conţinuturi în oxigen pentru o creştere mai bună. În plus, unele suşe pot avea un comprtament variabil, în funcţie de mediu. În mediu de cultură de laborator creşterea este activă sub atmosferă inertă CO2 + N2. Alcoolul etilic. Bacteriile lactice sunt sensibile la alcoolul etilic, ca majoritatea microorganismelor, de altfel. Multiplicarea lor este, în mod evident, jenată la conţinuturi în alcool de peste 10% vol., dar rezultatele variază foarte mult, în funcţie de specie şi de suşă. În general,cocii sunt mai sensibili la etanol decât bacilii. La o tărie alcoolică de 13% vol., lactobacilii rezistă în proporţie de peste 50%, în timp ce cocii rezistă numai în proporţie de 14%. Unii lactobacili sunt foarte toleranţi la alcool, fiind capabili să se dezvolte chiar într-un vin de desert, de 18 sau 20% vol., predispus astfel la alterarea prin înăcrire lactică sau fermentaţie propionică. Suşele de Leuconostoc oenos, principala specie responsabilă de fermentaţia malolactică rezistă până la 13-14% vol. alcool. Toleranţa bacteriilor lactice la alcool este foarte importantă, deoarece ele trebuie să se multiplice şi să realizeze fermentaţia malolactică într-un mediu bogat în alcool, în multe cazuri la conţinuturi mai mari de 10% vol. Deasemenea, predispoziţia vinurilor la alterări microbiene este legată de toleranţa bacteriilor lactice la alcool, ceea ce pune mai bine în evidenţă necesitatea derulării în bune condiţii a fermentaţiei alcoolice, în special pentru evitarea opririlor premature ale fermentaţiei. Condiţiile de nutriţie ale bacteriilor. Bacteriile lactice au axigenţe nutriţionale mult mai mari decât levurile, în special faţă de aminoacizi, mai ales că ele nu au, ca levurile, capacitatea de a sintetiza elementele de care au nevoie. În general, în vin se găsesc cantităţi suficiente de diverse vitamine din grupa B, care acţionează ca factori de creştere, dar o suplimentare este binevenită. Auxotrofia (adică posibilitatea de a sintetiza factorul de creştere sau aminoacidul lipsă) nu există la bacteriile lactice ale vinului, cărora le sunt absolut indispensabile o bază azotată, patru

vitamine şi 18 aminoacizi. Nevoile de energie ale bacteriilor lactice sunt asigurate de zaharurile reziduale existente în vin la sfârşitul fermentaţiei alcoolice. Bacteriile lactice nu posedă proteaze, proteinele nefiind o sursă de azot pentru ele. În ultimii ani, s-au obţinut noi adjuvanţi oenologici de origine levuriană, care au un important efect de simulare a fermentaţiei alcoolice şi fermentaţiei malolactice. Aceste preparate obţinute prin autoliza celulelor levuriene, constituite din macromolecule – în special, manoproteine – antrenează, pe de o parte, o scurtare a fazei de latenţă a cerşterii bacteriene şi, pe de altă parte, o creştere importantă a cantităţii de biomasă produsă, de 21- 47%, după conţinutul mediului în zaharuri reducătoare. Rolul de activator al macromoleculelor levurilor faţă de creşterea bacteriilor din specia Oenococcus oeni se datorează dublei lor acţiuni: de detoxifiere a mediului şi de îmbogăţire a lui în nutrienţi asimilabili de către bacteriile lactice. Anhidrida sulfuroasă. Folosirea SO2 în faza prefermentativă este o practică larg răspândită în industria vinicolă, iar rolul său inhibitor asupra bacteriilor şi fermentaţiei malolactice este cunoscut de multă vreme. Bacteriile sunt mult mai sensibile la acţiunea SO2 decât levurile. Multă vreme s-a crezut că numai SO2 liber are acţiune antibacteriană, forma combinată fiind inofensivă. Acest lucru este valabil în cazul levurilor, datorită formării acidului aldehidosulfuros, dar nu şi în cazul bacteriilor lactice, în special al celor heterofermentative, care în cursul dezvoltării lor înrt-un mediu dulce, în prezenţa acidului aldehidosulfuros sunt capabile să metabolizeze acetaldehida, eliberând astfel acidul sulfuros. Prin acest mecanism, SO2 combinat devine activ asupra bacteriilor, deşi are un efect antibacterian de 5-10 ori mai slab decât SO2 liber, dar trebuie să se ţină seama de faptul că este de 9-10 ori mai abundent în vin. Acţiunea inhibitoare a SO2 asupra bacteriilor lactice este direct proporţională cu doza utilizată. Gerbaux V. a prezentat datele unei experienţe privind influenţa SO2 asupra fermentaţiei malolactice, adoptând trei niveluri de sulfitare: martor, 40mg/l şi 80 mg/l, stabilite în faza prefermentativă. După fermentaţia alcoolică, vinul a fost însămânţat cu o cultură de bacterii liofilizate. La temperatura de 18°C, în varianta martor, fermentaţia malolactică s-a încheiat într-o lună, varianta sulfitată cu 40 mg/l a prezentat o întârziere

de 15 zile, iar varianta sulfitată cu 80 mg/l, fermentaţia malolactică s-a încheiat după 115 zile. Eficacitatea acţiunii antiseptice şi antioxidante a SO2 depinde în mare măsură de pH. Forma activă, SO2 molecular, depinde de concentraţia în SO2 liber şi pH. Utilizând formula lui Sudraud şi Chauvet, se calculează procentajul de SO2 molecular în funcţie de pH. De exemplu, la pH 3,2 acest procent este de 3,91 %, la pH 3,5 este de 2,00 % iar la pH 3,8 este de numai 1,01 %. Aceste cifre demonstrează clar influenţa pH-ului, mai ales că este nevoie de patru ori mai mult SO2 liber la pH 3,8 decât la pH 3,2 pentru a obţine aceeaşi eficacitate. Mecanismul de acţiune al SO2 a fost studiat la levuri, dar este foarte probabil ca el să fie de acelaşi tip la bacterii. Astfel, SO2 penetrează sub formă moleculară în celulă prin difuzie. În citoplasmă, unde pH-ul este mai ridicat, el disociază şi reacţionează cu molecule biologice esenţiale: proteine enzimatice la nivelul punţilor disulfură, coenzime, vitamine, ceea ce are drept rezultat oprirea creşterii şi, în final, moartea celulei. În plus, efectului asupra creşterii celulare, i se adaugă acţiunea inhibitoare a SO2 asupra activităţii enzimei malolactice a celulelor de Leuconostoc. Speciile de bacterii lactice au sensibilităţi diferite la acţiunea SO2, cocii fiind mai puţin rezistenţi decât bacilii. O doză de 5 mg/l SO2 liber este suficientă pentru a elimina un mare număr de bacterii, 100 mg/l le distrug complet. Eficacitatea acţiunii antibacteriene a SO2 depinde şi de momentul sulfitării. Astfel, o doză de 10 mg/l SO2 liber adăugată în faza de latenţă diminuează populaţia bacteriană cu 75%; sub formă de combinaţie sulfitică, aceeaşi doză întârzie multiplicarea şi blochează fermentaţia malolactică; adăugată în timpul fazei exponenţiale, aceeaşi doză are o eficacitate scăzută.

Tabel Acţiunea bactericidă directă a diverselor forme de SO2 Speciile de bacterii

pH

Procentul de celule rămase variabile după câteva minute de Anhidridă

contact. Doza utilizată: 30 mg/l Acid piruvic Acid aldehido-

Pediococcus

3,0

sulfuroasă 0

sulfuros 0

sulfuros 0

cerevisiae

3,2

0

0

48

3,4 3,0

15 0

75 33

75 63

3,2

0

56

79

3,4 3,0

0 10

70 66

87 96

3,2

23

88

76

Lactobacillus

3,4 3,0

33 5

82 13

85 35

hilgardii

3,2

6

100

37

3,4

8

75

68

Leuconostoc oenos

Streptobacterium

Fig. 5.1. a Pediococcus cerevisiae

b Leuconostoc oenos

Alţi factori care influenţează dezvoltarea bacteriilor lactice. O componentă importantă a vinurilor roşii, în care fermentaţia malolactică este un proces esenţial, este fracţiunea polifenolică. Cercetările efectuate până în prezent arată că acţiunea polifenolilor asupra creşterii bacteriilor lactice nu este uniformă, unii având un efect inhibitor, alţii, dimpotrivă având un efect simulativ. Cercetările au fost efectuate, în majoritatea cazurilor, asupra speciei Leuconostoc oenos, dar se presupune că rezultatele sunt valabile şi pentru celelalte bacterii lactice din vin. Taninurile oenologice, atât cele provenite din struguri, cât şi cele din lemnul de stejar, au un efect antibacterian recunoscut, de aceea în vinurile taninoase, obţinute prin maceraţii lungi sau prin adaosuri de tanin exogen şi în cele păstrate în barrique, fermentaţia malolactică demarează cu întârziere. Favorizând creşterea bacteriilor, acidul galic şi antocianii stimulează fermentaţia malolactică. Cei doi constituenţi sunt metabolizaţi de bacterii. Transformarea antocianilor pare să inplice activitatea β-glucozidazei, care eliberează fracţiunea aglicon şi glucoza,

aceasta fiind metabolizată de bacterii. Unii subproduşi ai metabolismului levurian, ca acidul capric, acidul lauric, acidul palmitoleic sunt inhibitori ai creşterii bacteriilor lactice. De asemenea, chiar acidul lactic şi acidul succinic exercită o uşoară inhibiţie a bacteriilor lactice. 80-100 mg/l anioni organici conţinuţi în vin fac mediul mai puţin favorabil pentru fermentaţia malolactică. În ultimii ani, cunoaşte o extindere în industria vinicolă lizozina, o enzimă extrasă din albuşul de ou, având o acţiune litică asupra peretului celulei bacteriei lactice. Spre deosebire de SO2, eficacitatea lizozimei creşte o dată cu pH-ul iar incidenţa organoleptică este nulă. Lizozima poate fi folosită pentru inhibarea fermentaţiei malolactice la vinurile albe (în doze cuprinse între 250-500 mg/l), pentru evitarea înăcririi lactice, în cazul finalurilor de fermentaţie dificile şi pentru stabilizarea vinurilor roşii după fermentaţia malolactică (în doză de 125-250 mg/l). Un alt factor care influenţează creşterea bacteriilor lactice este antagonismul levuri/bacterii. Acest antagonism se manifestă atât printr-o competiţie nutriţională cât şi prin producerea de către levuri a unor compuşi inhibitori pentru bacteriile lactice – alcool etilic, SO2, acizi graşi. Aşadar, pe ansamblu, în vin există factori care simulează şi factori care inhibă activitatea bacteriilor lactice. Factorii care condiţionează creşterea bacteriilor lactice în vin -

FACTORI LIMITATIVI Temperatura vinului < 15°C

-

FACTORI FAVORIZANŢI Temperatura vinului între 16 şi 18°C

-

Aciditate ridicată pH < 3

-

Aciditate slabă pH > 3,2

-

Tărie alcoolică ridicată > 12% vol.

-

Tărie alcoolică scăzută < 12°C

-

Prezenţa SO2 > 50 mg/l

-

Absenţa SO2

-

Aerare foarte intensă

-

Prezenţa CO2

-

Conţinut insuficient în nutrienţi sau

-

Conţinutul

calitate slabă a nutrienţilor -

Absenţa

factorilor

de

creştere

(unii

-

Prezenţa factorilor de creştere

-

Prezenţa

Prezenţa inhibitorilor (produşi secundari ai

fermentaţiei

-

nutrienţilor

alcoolice,

pesticide,

activatorilor

(macromolecule

levuriene, din struguri) -

compuşi fenolici) -

calitatea

favorabile

aminoacizi, vitamine) -

şi

Însămânţarea

cu bacterii

selecţionate,

“pied de cuve”

Însămânţare naturală insuficientă (crame

-

Volume mari

noi)

-

Maceraţie carbonică, maturare pe drojdii,

Volume mici

maceraţie peliculară

-

Termovinificare, deburbare intensă

-

Contaminări virale: bacteriofagi

Acţiunea bacteriofagilor. Bacteriofagii sunt virusuri care atacă bacteriile, pentru a se multiplica. Bacteriofagii păstrează caracteristicile generale ale virusurilor, având o structură foarte simplă. În timp ce bacteriile posedă atât ADN cât şi ARN, bacteriofagii conţin un singur tip de acid nucleic, care poate fi ori ADN, ori ARN. Un bacteriofag este alcătuit dintr-o porţiune numită cap care se continuă cu o coadă la sfârşitul căreia se află o placă bazală prevăzută cu nişte proeminenţe numite spiculi sau fibrile. Parazitarea bacteriilor de către bacteriofagi se produce după un mecanism care reprezintă ciclul de viaţă al bacteriofagului. Acest proces implică două căi : o cale lisogenă şi o cale litică. Calea lisogenă include mai multe momente: m1 – fixarea bacteriofagului în celula bacteriei şi infectarea ADN-ului; m2 – circulaţia ADN-bacteriofagului în celula bacteriei; m3 – integrarea ADN-ului fagic în interiorul cromozomului bacterian; m4 – diviziunea celulară; m5 – producerea de noi copii de AND viral cu cromozomul bacterian. Calea litică include, de asemenea, mai multe momente: m1 – inducţia; m2 – sinteza proteinelor virale necesare formării de noi virusuri; m3 – înmulţirea rapidă a ADN viral liber şi încapsidarea lui în noi particule virale; m4 – perforarea celulei bacteriene şi eliberarea unui număr mare de noi bacteriofagi, care reiau ciclul de distrugere a bacteriilor. Prezenţa receptorilor la suprafaţa bacteriei determină posibilitatea asocierii între fag şi bacterie. Bacteriofagul trebuie să infecteze o bacterie pentru a se multiplica. În interiorul celulei, el utilizează propriul său genom drept cod şi echipamentul enzimatic al celulei pentru a asigura sintezele. Din punct de vedere al agerivităţii faţă de bacterii, bacteriofagii sunt de două tipuri: temperaţi – bacteriofagi al căror genom rămâne integrat sub formă de profag în cromozomul bacterian, este replicat şi transmis celulelor fiice, rămânând în stare de latenţă, şi stabilind astfel un echilibru cu bacteria gazdă, care va fi spart la un moment dat; virulenţi – bacteriofagi care se multiplică în numeroase copii eliberate în mediu

după liza celulei gazdă, fiecare virus infectând în continuare altă bacterie, până la distrugerea totală a culturii de bacterii. Bacteriofagii pot îndeplini fie rol pozitiv fie rol negativ, în funcţie de bacteriile pe care le atacă. Principalele consecinţe oenologice ale unui atac de bacteriofagi asupra bacteriilor lactice sunt termenele mai lungi de realizare a fermentaţiei malolactice şi creşterea riscului de dezvoltare a unor populaţii nedorite de Pediococcus. Evoluţia populaţiei de bacterii lactice în timpul vinificaţiei Populaţia iniţială de bacterii lactice în must este cuprinsă, de regulă, între 10 2 - 104 celule/ml. Numărul depinde în primul rând, de condiţiile de maturare a strugurilor, cel puţin pentru primele cantităţi de struguri care intră în fluxul de vinificare. Atunci când strugurii se maturizează în condiţii de căldură şi precipitaţii puţine, bacteriile lactice sunt prezente chiar pe strugurii proaspeţi, dar sunt foarte rare pe strugurii spălaţi de ploi. Flora iniţială, destul de slabă, este completată de bacteriile care provin de pe echipamentele şi utilajele tehnologice. În musturile obţinute din struguri cu o stare avansată de maturare, în care pH-ul este, în general, mai ridicat, nivelul populaţiei este, de asemenea mai mare. De exemplu, când pH-ul este mai mare de 3,6 populaţia de bacterii lactice atinge 104 celule/ml. Bacteriile lactice izolate de pe srtuguri, înainte de recoltare, aparţin speciilor Lactobacillus plantarum, Lactobacillus hilgardii şi Lactobacillus casei. Specia Leuconostoc oenos, care mai târziudevine cea mai importantă, este puţin prezentă la debutul vinificaţiei. Mustul de struguri, imediat după introducerea în cisternă, conţine o microfloră foarte variată, constituită în general din 8 specii de lactobacili şi coci obişnuiţi: Lactobacillus plantarum, Lactobacillus casei, Lactobacillus hilgardii, Lactobacillus brevis, Pediococcus damnosus, Pediococcus pentosaceus, Leuconostoc mesenteroides, Leuconostoc oenos. În primele zile ale fermentaţiei alcoolice, atât levurile cât şi bacteriile se multiplică, dar primele, mai bine adaptate şi mai numeroase, în special atunci când se folosesc levuri selecţionate, invadează rapid mediul, în timp ce creşterea bacteriilor este limitată, atingând maximum 104 – 105 celule/ml. Acest nivel depinde mult de pH şi de doza de sulfitare aplicată mustuielii, factori care exercită o puternică acţiune selectivă asupra

microflorei bacteriene lactice. Marea diversitate a speciiolr prezente în mod natural în must tinde să se reducă selectiv în cursul fermentaţiei alcoolice, menţinânduse doar suşele cele mai rezistente la mediul alcoolizat şi care aparţin, în general, speciei Leuconostoc oenos. În timpul fermentaţiei alcoolice, atunci când acesta este în plină derulare şi până la sfârşitul ei, populaţia de bacterii lactice regresează până la 102 – 103 celule/ml, nivel care se menţine o perioadă mai lungă de timp, denumită faza de latenţă, a cărei durată este variabilă. În condiţii optime ea durează numai câteva zile, dar se poate prelungi până la câteva săptămâni sau chiar luni, când condiţiile de mediu sunt defavorabile bacteriilor, ceea ce are drept consecinţă o mare întârziere a demarării fermentaţiei malolactice, uneori chiar până în primăvara următoare. Mustul în plină fermentaţie prezintă un mediu ostil bacteriilor lactice, la acţiunea selectivă a pH-ului şi a SO2 adăugându-se acţiunea inhibitoare a alcoolului. În aceste condiţii, se produce o selecţie naturală progresivă a speciilor de bacterii lactice. Astfel, dispar pe rând lactobacilii homofermentativi, cei heterofermentativi, apoi pediococii şi Leuconostoc mesenteroides, lăsând locul exclusiv speciei Leuconostoc oenos. În anumite situaţii, când fermentaţia alcoolică se derulează cu dificultate, pot supravieţui în număr foarte mic, de ordinul a 10 – 102 celule/ml şi alte specii de contaminare, care se pot înmulţi mai târziu, după vinificare, dacă vinul nu este protejat antiseptic, producând diverse maladii. După faza de latenţă urmează faza de creştere, când populaţia bacteriană ajunge până la 107 celule/ml, durata ei depinzând, în mod esenţial, de compoziţia fizico-chimică a mediului. Faza de creştere este urmată de faza staţionară, a cărei durată depinde de nivelul populaţiei şi, în final, faza de declin. Metabolizarea acidului malic începe în timpul fazei de creştere a populaţiei bacteriene, când densitatea acesteia ajunge la 106 celule/ml şi continuă până la dispariţia sa totală, putând dura câteva săptămâni sau chiar luni, în funcţie, în primul rând, de temperatură. În unele cazuri, când condiţiile de mediu sunt foarte favorabile, iar cantitatea de acid malic este scăzută, fermentaţia malolactică se poate încheia chiar înainte de sfârşitul fazei de creştere. În aceste condiţii, populaţia bacteriană poate depăşii 108 celule/ml. După fermentaţia malolactică, dacă vinul nu este sulfitat, rămâne o populaţie

bacteriană destul de numeroasă, de până la 105 celule/ml, numărul fiind cu atât mai mare cu cât cantitatea de acid malic a fost mai mică şi durata fermentaţiei malolactice mai scurtă. În aceste condiţii, sulfitarea practicată la sfârşitul fermentaţiei malolactice are drept scop accelerarea fazei de declin a bacteriilor, deoarece bacteriile rămase pot metaboliza alte substraturi, punând în pericol stabilitatea biologică a vinului. Pentru asigurarea stabilităţii biologice a vinului se impune eliminarea întregii încărcături microbiene, imediat după fermentaţia malolactică. Măsura cea mai simplă şi cea mai frecventă constă în ajustarea dozei de SO2 liber până la 30 – 40 mg/l. Deşi această doză este foarte eficientă, eliminând aproape în totalitate microorganismele vii, în vin rămân celulele moarte care prin descompunere pot comunica defecte de gust şi miros. De aceea, se recomandă şi altă metodă pentru stabilizarea biologică a vinurilor, constând în microfiltrarea cu membrane de porozitare 0,4 – 0,5 µm, care elimină tate microorganismele, vii şi moarte, din vin. Fenomene de antagonism în care sunt implicate bacteriile lactice Predominanţa speciei Leuconostoc oenos la sfârşitul fermentaţiei alcoolice şi în timpul fermentaţiei malolactice este rezultatul mai multor interacţiuni între microorganismele vinului: pe de o parte, între levuri şi bacterii, pe de altă parte între diferitele specii de bacterii. Interacţiunile între levuri şi bacterii implică mai multe mecanisme bazate pe competiţia nutriţională şi pe acţiunile unor produşi ai metabolismului celor două familii de microorganisme. Competiţia dintre levuri şi bacterii este inegală încă de la obţinerea mustului. Datorită superiorităţii lor numerice – mai ales atunci când mustul este însămânţat cu levuri selecţionate – şi rezistenţei mai mari la acţiunea SO2, levurile pun rapid stăpânire pe mediu. În timpul creşterii rapide, la începutul fermentaţiei, levurile epuizează rapid mediul în unii aminoacizi, generând carenţe nutriţionale care îngreunează multiplicarea bacteriilor. Acest dezavantaj este totuşi tranzitoriu, deoarece în câteva zile mediul este îmbogăţit din nou în aminoacizi, care sunt excretaţi de levuri sau eliberaţi după autoliza lor. La sfârşitul fermentaţiei alcoolice, graţie metabolismului levurian, mediul prezintă o bogăţie şi o diversitate în aminoacizi care garantează nutriţia bacteriilor. Curbele de evoluţie a

levurilor şi bacteriilor demonstrează clar ansamblul acestor fenomene: inhibarea bacteriilor în timpul fazei de creştere a levurilor şi simularea lor în tipmul fazei de dfeclin a levurilor. În primele 3 – 4 zile de fermentaţie, alcoolul nu este un inhibitor pentru bacteriile lactice; de altfel, în concentraţii mici, până la 5-6 % vol., el este un activator al creşterii bacteriene. În aceste condiţii, alţi produşi ai metabolismului levurian sunt implicaţi în inhibarea creşterii bacteriilor lactice, aceştia fiind acizii hexanoic, octanoic, decanoic şi dodecanoic, care alterează membrana bacteriană. Antagonismul dintre levuri şi bacteriile lactice se manifestă şi la sfârşitul fermentaţiei alcoolice, dar de această dată în favoarea bacteriilor lactice, populaţia levuriană fiind în declin iar cea bacteriană în creştere. Bacteriile accelerează faza de declin a levurilor, prin activităţi enzimatice responsabile de hidroliza peretelui levurian, antrenând liza întregii celule. Autoliza celulelor de levuri eliberează o serie de macromolecule – peptide, polizaharide, manoproteine – care au o importantă acţiune stimulatoare asupra bacteriilor lactice, ameliorând „fermentescibilitatea” malolactică a vinului, prin efectul lor adsorbant asupra acizilor graşi, reazilând o veritabilă detoxifiere a mediului. Succesiunea speciilor bacteriene în timpul fermentaţiei alcoolice poate fi explicată prin sensibilităţile diferite ale bacteriilor la interacţiunile cu levurile, dar şi prin existenţa simultană a unor interacţiuni între bacteriile lactice. Ca şi alte microorganisme, ele pot, într-adevăr, sintetiza şi elibera diverse substanţe cu activitate antimicrobiană. Aceste substanţe sunt simple – peroxidul de hidrogen, unii acizi organici – sau mai complexe. Astfel, bacteriile pot produce bacteriocine, o clasă de molecule proteice a căror activitate bactericidă are în general un spectru de acţiune îngust. Studiile fundamentale şi aplicate asupra bacteriocinelor au arătat că există o gamă largă de substanţe produse de o mare varietate de lactobacili şi coci. Până în prezent au fost puse în evidenţă două bacteriocine: brevicina, elaborată de o suşă de Lactobacillus brevis şi cazeicina, elaborată de o suşă de Lactobacillus casei. Brevicina are un spectru larg de activitate, inhibând, în afară de Lactobacillus brevis, suşe de Leuconostoc oenos şi Pediococcus damnosus. Cazeicina, dimpotrivă, este activată doar asupra speciei Lactobacillus casei. Brevicina este o mică moleculă proteică

termostabilă şi stabilă într-o gamă largă de pH. Cazeicina este mai puţin stabilă şi de o greutate moleculară net superioară (40-42 kDa). Rammelsberg M. şi Radler F., au observat o activitate a unei suşe de Lactobacillus plantarum faţă de numeroase bacterii din specii variate, lactobacili şi coci, în special Leuconostoc oenos. S-a demonstrat şi producerea unei proteine bactericide faţă de mai multe suşe de Lactobacillus hilgardii, Pediocaccus pentosaceus şi Leuconostoc oenos. Această bacteriocină, produsă în cantitate mare în sucul de struguri de către o suşă de Pediococcus pentosaceus este stabilă în condiţiile de aciditate şi la conţinuturile în alcool etilic din vin. Scopul lucrării Lucrarea are ca scop monitorizarea desfăşurării procesului de fermentaţie malolactică, prin îndeplinirea următoarelor obiective: - estimarea degradării acidului malic prin cromatografie pe hârtie (metoda Michaud) şi prin dozare enzimatică; - dozarea enzimatică a acidului lactic produs în urma fermentaţiei malolactice - monitorizarea evoluţiei populaţiei bacteriene în decursul fermentaţiei malolactice prin metode de numărare directe (cu camera Thoma) şi indirecte (prin examen cultural) Introducere Fermentaţia malolactică este un proces de dezacidifiere biologică a vinului şi constă în degradarea acidului malic din vin în acid lactic şi CO2, conform următoarei reacţii: HOOC – CH2 – CHOH – COOH acid malic

CH3 – CHOH – COOH + CO2 acid lactic

dioxid de carbon

Din această reacţie reiese că prin decarboxilarea acidului malic, care este un acid dicarboxilic (cu două funcţii acide), se formează acid lactic, care este acid monocarboxilic (cu o singură funcţie acidă) şi CO2. Odată cu îndepărtarea uneia din funcţiile acide, se reduce şi jumătate din aciditatea imprimată de acidul malic. Plusul de calitate care apare după desăvârşirea fermentaţiei malolactice nu se datorează numai reducerii acidităţii, ci şi formării acidului lactic, care impresionează mai plăcut papilele gustative, spre deosebire de acidul malic, care imprimă o aciditate crudă şi o anumită nuanţă de verdeaţă. Dacă se derulează în condiţii optime, fermentaţia malolactică prezintă efecte importante

asupra calităţii vinului şi anume: • reduce aciditatea vinului şi măreşte uşor pH-ul; • creşte stabilitatea biologică a vinului, asigurând evitarea unei eventuale fermentaţii malolactice nedorite în vinurile îmbuteliate; • modifică aroma şi gustul vinului, mărindu-i complexitatea. Bacteriile lactice produc mici cantităţi de acetoină, din care o parte poate fi oxidată în diacetil, substanţă cu miros specific de unt. Creşterea concentraţiei de diacetil reprezintă una dintre cele mai importante contribuţii ale bacteriilor lactice la aroma vinului. În concentraţii mari, aceasta conferă vinului o aromă puternică de unt, în timp ce în concentraţii mici, diacetilul contribuie la aroma de nuci, de drojdii sau de caramel. Ca urmare a scăderii acidităţii, culoarea vinurilor roşii seci se modifică, devenind mai puţin aprinsă. Aroma vinurilor fermentate malolactic se modifică şi ea. Astfel gustul acerb, dur, determinat de aciditate şi taninuri dispare treptat, fiind înlocuit de un gust mai fin şi mai catifelat datorat eliberării de către bacteriile lactice în vin a unor polizaharide, aminoacizi, acizi nucleici. În ansamblu, vinurile după fermentaţia malolactică devin mai armonioase, mai pline şi mai evoluate. Declanşarea şi desăvârşirea procesului de fermentaţie malolactică se datorează bacteriilor lactice din genurile: Lactobacillus, Leuconostoc şi Pediococcus. Fermentaţia malolactică evoluează diferit în vinurile albe şi roşii. Dacă la vinurile roşii seci, fermentaţia malolactică trebuie privită ca o operaţie integrată în tehnologia de elaborare a vinurilor roşii, la vinurile albe demidulci şi dulci trebuie privită ca un „promotor de defecte”, putând conduce la borşire sau manitare. Parte experimentală I. Estimarea acidului malic prin cromatografie pe hârtie Principiul metodei Se bazează pe solubilitatea diferită a acizilor faţă de anumiţi solvenţi, când aceştia străbat prin capilaritate un suport solid-hârtia. Antrenarea şi separarea acizilor organici din vin se face cu ajutorul amestecului butanoln-acid acetic-apă, iar punerea în evidenţă prin intermediul albastrului de bromfenol. După

apariţia petelor de acizi, ce apar galbene pe un fond albastru, se observă următoarea poziţionare: • acidul tartric aproape de linia de start; • acidul malic în centru; • acidul lactic şi succinic la partea superioară. Prin comparare cu soluţii etalon de acid malic se poate aprecia conţinutul de acid malic în vin. Reactivi • soluţie albastru de bromfenol în n-butanol 0,1 %; • acid acetic-apă 1:1 (volume); • acid malic 0,5 g/100 ml: într-un balon cotat de 100 ml se aduc 0,5 g acid malic, 85 ml apă şi alcool etilic 96 % vol până la semn. Mod de lucru Pe o fâşie de hârtie cromatografică, cu înălţimea de circa 20 cm şi lăţimea corespunzătoare numărului de probe de vinuri şi de probe etalon, se trasează o linie cu creionul la 4 cm de marginea inferioară pe care se punctează la 3 cm de marginea laterală poziţiile unde urmează să depunem probele, distanţate cu 2 sau 3 cm. Cu ajutorul unei micropipete se depune 1 μl din soluţiile etalon cu 1, 2, 3, 4 şi 5 g/l acid malic, apoi 1 şi 3 μl din probele de vinuri (după fiecare depunere de 1 μl pata se usucă, după care urmează o nouă depunere). În acest caz petele de pe hârtie trebuie să aibă un diametru de circa 5 mm. În funcţie de concentraţia în acizi a vinului se depun circa 5 pete pentru fiecare probă, având grijă ca hârtia să fie uscată când se depune o nouă pată de vin. Într-o capsulă Petri cu diametrul corespunzător se aduce solventul format din 50 ml butanol cu indicator şi 20 ml acid acetic diluat (1:1), se plasează cilindrul de hârtie şi se acoperă etanş cu un clopot de sticlă. Când solventul a ajuns la circa 2 cm de marginea superioară (circa 3 ore) se scoate hârtia şi se usucă în aer liber sau în nişă. Se apreciază conţinutul de acid malic, respectiv evoluţia fermentaţiei malolactice în vinuri. II. Dozarea enzimatică a acidului L-malic Principiu Acidul L-malic este oxidat la oxaloacetat de către NAD+ în prezenţa L-malat dehidrogenazei (L-MDH):

L-MDH L-malat + NAD+

(1)

Oxaloacetat + NADH + H+

Dacă reacţia este catalizată de enzima glutamat-oxaloacetat-transaminază (GOT), oxaloacetatul este transformat în L-aspartat în prezenţa L-glutamatului. L-MDH (2)

Oxaloacetat + L-glutamat

L-aspartat + 2-oxoglutarat

Compoziţia kitului 1. Sticla 1 cu 30 ml soluţie, formată din: tampon glicilglicină (pH 10); acid L-glutamic (440 mg). 2. Sticla 2 cu 210 mg NAD, liofilizat. 3. Sticla 3 cu 0,4 ml suspensie glutamat-oxaloacetat-transaminază (GOT), 160 U. 4. Sticla 4 cu 0,4 ml soluţie L-malat dehidrogenază, 2400 U. 5. Soluţie de control pentru analiza acidului L-malic. Se foloseşte nediluată. Soluţiile ce urmează a fi folosite se pregătesc astfel: 1. Se foloseşte conţinutul sticlelor 1, 3 şi 4 nediluat. 2. Se dizolvă conţinutul sticlei 2 cu 6 ml apă bidistilată. În procedeul de lucru am utilizat o lungime de undă de 365 nm, cuve de sticlă cu lungimea de 1 cm, o temperatură cuprinsă între 20-25 0 C, iar citirea la spectrofotometru se face faţă de aer (fără cuvă) Pipetare Blank Probă Soluţia 1 1,000 ml 1,000 ml Soluţia 2 0,200 ml 0,200 ml Suspensie 3 0,010 ml 0,010 ml Probă 0,100 ml Apă bidistilată 1,000 ml 0,900 ml Se amestecă şi se citesc absorbanţele soluţiilor (A1) după aproximativ 3 minute. Se începe reacţia prin adăugarea: Soluţie 4 0,010 ml 0,010 ml Apoi se amestecă şi se aşteaptă până la terminarea reacţiei (aprox. 5-10 minute), după care se citesc absorbanţele blankului şi ale probei (A2). Se determină diferenţele de absorbanţe (A2-A1) atât pentru blank, cât şi pentru probă. Apoi se scade diferenţa obţinută pentru blank din diferenţa obţinută pentru probă şi se obţine ΔA. ΔA = (A2-A1) proba - (A2-A1) blank

Pentru obţinerea unor rezultate precise, diferenţele de absorbanţă obţinute trebuie să fie de cel puţin 0,100 unităţi absorbanţă. Pentru calcularea conţinutului de acid L-malic din vin, se utilizează următoarea formulă: c = 2,977 / ε ∙ ΔA acid

L - malic

[g acid L-malic/l soluţie probă]

unde: ε = coeficientul de extincţie al NADH la lungimea de undă utilizată = 3,4 [l x mmol-1 x cm-1] ΔA = diferenţa de absorbanţă În cazul în care probele au fost diluate, rezultatele trebuie înmulţite cu factorul de diluţie III. Dozarea enzimatică a acidului L-lactic Principiu Acidul L-lactic este oxidat la piruvat de către NAD+ în prezenţa enzimei L-lactat dehidrogenază (L-LDH). Compoziţia kitului 1. Sticla 1 cu 30 ml soluţie, formată din: tampon glicilglicină (pH 10); acid L-glutamic (440 mg). 2. Sticla 2 cu 210 mg NAD, liofilizat. 3. Sticla 3 cu 0,7 ml suspensie glutamat-piruvat-transaminază (GPT). 4. Sticla 4 cu 0,7 ml soluţie L-lactat dehidrogenază, 3800 U. 5. Soluţie de control pentru analiza acidului L-lactic. Se foloseşte nediluată. Soluţiile ce urmează a fi utilizate se pregătesc astfel: 1. Se foloseşte conţinutul sticlelor 1, 3 şi 4 nediluat. 2. Se dizolvă conţinutul sticlei 2 cu 6 ml apă bidistilată. În procedeul de lucru am utilizat o lungime de undă de 365 nm, cuve de sticlă cu lungimea de 1 cm, o temperatură cuprinsă între 20-25 0 C, iar citirea la spectrofotometru se face faţă de aer (fără cuvă). Pipetare Blank Probă Soluţia 1 1,000 ml 1,000 ml Soluţia 2 0,200 ml 0,200 ml Suspensia 3 0,020 ml 0,020 ml Probă 0,100 ml Apă bidistilată 1,000 ml 0,900 ml Toate aceste soluţii se amestecă şi după aproximativ 5 minute se citesc absorbanţele soluţiilor (A1). Apoi se mai adaugă şi ultima soluţie.

Soluţia 4 0,020 ml 0,020 ml După adăugarea ultimei soluţii amestecul se agită, iar după aproximativ 30 minute se citesc absorbanţele blankului şi ale probei (A2), imediat una după alta. Se determină diferenţele de absorbanţe, (A2 – A1) atât pentru blank, cât şi pentru probă, după care se scade diferenţa obţinută pentru blank din diferenţa obţinută pentru probă şi vom obţine ΔA. ΔA = (A2 – A1) proba - (A2 – A1) blank Pentru calculul conţinutului de acid L-lactic din vin, se utilizează următoarea formulă: c = 2,018 / ε ∙ ΔA acid

L -lactic

[g acid L-lactic/l soluţie probă]

În cazul în care probele de vin au fost diluate, pentru ca rezultatele să fie corecte, acestea trebuie înmulţite cu factorul de diluţie. III. Numărarea bacteriilor lactice cu ajutorul camerei de numărat Thoma Camera de numărat THOMA este o lamă de sticlă cu trei platforme, dintre care platforma centrală este denivelată faţă de celelalte două cu 0,10 mm. Pe platforma centrală este gravată o reţea de linii perpendiculare care delimitează o anumită suprafaţă divizată de către linii perpendiculare de formă pătratică. Suprafaţa platformei este de 1 mm2, iar suprafaţa unei microcelule este de 1/400 mm2. Mod de lucru Pentru determinarea numărului de bacterii lactice, pe platforma centrală se pune o picătură de de vin, după care se acoperă cu o lamelă. Preparatul astfel obţinut se fixează pe platina microscopului cu ajutorul unor cleme şi apoi se examinează cu obiectiv de 45x şi ocular de 10x. Într-un câmp microscopic se observă 16 microcelule, se numără celulele de bacterii lactice de pe 10 câmpuri microscopice diferite şi se calculează numărul mediu de celule de bacterii lactice de pe fiecare microcelulă. Cunoscând suprafaţa unei microcelule şi denivelarea platformei, se poate calcula volumul microcelulei: V = 1/400 x 1/10 = 1/4000 mm3 În funcţie de volumul unei microcelule şi de gradul de diluţie al probei, se calculează numărul de celule de bacterii / ml vin:

N = n x 4000 x 1000 x k unde : N = numărul de celule de bacterii / ml vin; n = numărul mediu de celule de bacterii de pe microcelule; 4000 = inversul volumului, [mm3]; 1000 = factorul de transformare din mm3 în cm3; k = factorul de diluţie; IV. Numărarea coloniilor de bacterii lactice prin examen cultural Din probele de vin şi din diluţiile decimale ale acestora, se inoculează căte 1 ml în cutii Petri sterile, şi se face omogenizarea cu mediu MRS agar fluidificat şi răcit la 45 0 C După însămânţare, cutiile se introduc în termostat la temperatura de 37 0 C, timp de 4872

ore. După termostatare, se numără coloniile de pe fiecere placă Petri şi se estimează

numărul total de bacterii lactice cu formula UFC/ml vin = ∑ n* d/ N unde n- numărul de colonii de bacterii lactice formate d- diluţia probelor inoculate N- numarul de plăci Petri luate în considerare Rezultate şi discuţii În cadrul primului experiment, de estimare a acidului malic prin cromatografie pe hârtie, s-au analizat mai multe probe de vin pentru a urmări desfăşurarea fermentaţiei malolactice la diferite momente de timp. Fig. 1 Acid malic-Oporto-Merlot- Băbească neagră-Burgund-Cabernet SauvignonCadarcă-Blauerzweigelt

19.04.2007

Fig. 2 Acid malic-Oporto-Merlot- Băbească neagră-Burgund-Cabernet SauvignonCadarcă-Blauerzweigelt 28.04.2007 Fig. 3 Acid malic-Oporto-Merlot-Burgund-Cabernet Sauvignon-SangioveseBlauerzweigelt 05.05.2007

Figura 1

Figura 2

Figura 3 În figura 1 se poate observa că singurul vin care şi-a terminat fermentaţia malolactică este cel obţinut din soiul Cadarcă, deoarece se separă doar acid tartric şi acid lactic. În cazul vinului obţinut din soiul Băbească neagră, putem spune că fermentaţia malolactică este în plină desfăşurare, deoarece se separă atât acid malic, cât şi acid lactic. În figura 2, în care am urmărit stadiul fermentaţiei malolactice a vinurilor după 9 zile, putem constata că de data aceasta şi vinul obţinut din soiul Băbească neagră (inoculat cu bacterii lactice selecţionate) şi-a finalizat fermentaţia malolactică. În acest caz se separă doar acid lactic, ceea ce înseamnă că acidul malic s-a transformat integral în acid lactic. În figura 3 am urmărit desfăşurarea fermentaţiei malolactice a unor probe de vin, după ce acestea au fost însămânţate cu un preparat comercial INOFLORE R (ce contine specia Leuconostoc oenos) şi au fost lăsate la fermentat timp de 7 zile. Se poate observa că, în acest caz, doar o singură probă de vin şi-a încheiat procesul de fermentaţie malolactică şi anume, proba obţinută din soiul Merlot, la care se separă doar acid tartric şi acid lactic. În cadrul experimentului legat de dozarea enzimatică a acidului L-malic şi L-lactic, am dozat conţinutul de acid malic şi lactic din mai multe probe de vin. La vinul obţinut din soiul Băbească neagră, înainte de fermentaţia malolactică, rezultatul este următorul: conţinutul de acid malic Băbească neagră = 0,730 g/l La vinul obţinut din soiul Băbească neagră, după fermentaţia malolactică, am obţinut

următorul rezultat: conţinutul de acid lactic Băbească neagră = 1,051 g/l De asemeni, am monitorizat evoluţia populaţiei bacteriene înainte de fermentaţie malolactică, prin însămânţarea probelor de vin nefermentate malolactic pe mediu MRS agar şi numărarea coloniilor de bacterii lactice. Astfel, s-au obţinut următoarele rezultate, care pot fi observate şi din figurile de mai jos: Băbească neagră – număr mic de colonii de bacterii lactice Cabernet Sauvignon – număr mediu de colonii de bacterii lactice Merlot, Cadarcă- număr mare de colonii de baterii lactice Băbească neagră

Cabernet Sauvignon

Merlot

Cadarcă

Figura 4 Dezvoltarea coloniilor de bacterii lactice pe mediu MRS agar În cazul numărării bacteriilor lactice din probele de vin, prin intermediul camerei Thoma, am obţinut următoarele rezultate: Probele de vinuri Numărul de bacterii lactice

Băbească neagră 5∙106 cel/ml

Cabernet Sauvignon 7∙106 cel/ml

Merlot

Cadarcă

17∙106 cel/ml

23∙106 cel/ml

Concluzii În concluzie, putem spune că momentul finalizării fermentaţiei malolactice diferă în funcţie de tipul de vin şi de soiul de struguri din care a fost obţinut vinul respectiv. Momentul

desăvârşirii fermentaţiei malolactice este influenţat de temperatură, pH, aciditatea totală, concentraţia alcoolică, conţinutul în bioxid liber şi total al vinului. De asemeni, momentul terminării fermentaţiei malolactice, depinde şi de varianta de fermentare: spontană sau dirijată (cu bacterii lactice selecţionate). De remarcat, este faptul că vinul Băbească neagră, deşi are o microfloră indigenă, destul de redusă, reuseşte să fermenteze malolactic mult mai repede, comparativ cu celelalte vinuri. Acest lucru se întămplă, deoarece a fost inoculat cu bacterii lactice selecţionate, care au reuşit sa degradeze total acidul malic. În varianta fermentaţiei malolactice spontane (cu microfloră indigenă), acest vin nu reuşeşte să fermenteze malolactic. Determinând cu precizie, concentraţiile de acid malic şi lactic din vinuri şi totodată printr-o utilizare judicioasă a culturilor starter de bacterii malolactice, putem iniţia şi finaliza o fermentaţie malolactică în condiţii de siguranţă, mărind stabilitatea microbiologică a vinului şi îmbunataţind profilul senzorial al acestuia.