Bacillus Thuringiensis

“Año del buen servicio al ciudadano”

UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS ESCUELA ACADEMICO PROFESIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS BIOLOGÍA CELULAR Y MOLECULAR “BACILLUS THURINGIENSIS: IMPORTANCIA EN EL CONTROL DE INSECTOS” DOCENTES: Dr. BLAS CERDAN, William Genaro Dr. MURO MOREY, Juan Cesar. Ms. PESANTES VERA, Manuel Fernando. Dr. SALDAÑA JIMENEZ, José Antonio. ESTUDIANTES:          

FASANANDO SANCHEZ, KENERITH LONGA NELGAR, RENATO LOPEZ ZAVALETA, ANGELICA MENDOZA CHIQUIPOMA, CARLOS PRADO VALDEZ, MICHAEL SALINAS MORALES, BRAYAN SANCHEZ BOBADILLA, BEATRIZ VALDIVIA AREDO, CHRISTIAN VARGAS VILLEGAS, HOMERO VÁSQUEZ VILLANUEVA, KATHERINE

CICLO: VI-Sección A, Mesa 4. Trujillo, 19 de octubre del 2017.

BACILLUS THURINGIENSIS: IMPORTANCIA EN EL CONTROL DE INSECTOS” Autor: Dr. William Genaro Blas Cerdán.

I.

INTRODUCCIÓN:

Por décadas se han utilizado indiscriminadamente insecticidas químicos, como compuestos organoclorados, organosfosforados, carbamatos, entre otros, que han provocado grandes problemas de contaminación de los productos agrícolas, suelos y agua. También han ocasionado un desequilibrio ecológico al no ser biodegradables y por tener un poder residual elevado; como consecuencia de ello, los insectos han desarrollado mecanismos de resistencia al soportar concentraciones de insecticidas cada vez mayores y más frecuentes. Esto ha llevado a buscar nuevas y mejores alternativas para controlar insectos plaga, como el empleo de diversos productos basados en diferentes organismos como virus, bacterias y hongos (Ortiz y Ortiz,1992) Los bioinsecticidas, ya sea organismos naturales o modificados genéticamente y/o los productos de sus genes usados para controlar a una población plaga son el más importante ejemplo del empleo de sistemas de control biológico. En la actualidad, Bacillus thuringiensis es, sin duda, el producto comercial de mayor difusión y uso a nivel internacional (Fietelson et al. 1992) B. thuringiensis es una bacteria del suelo Gram positiva: que produce inclusiones proteicas cristalinas durante el proceso de esporulación. Las proteínas que forman estas inclusiones se denominan delta-endotoxina (Aronson et. al. 1986) A la fecha se han identificado una gran cantidad de capas de B. thuringiensis con diferentes rango de acción insecticida. La mayoría de las cepas tienen actividad contra larvas de insectos lepidópteros, pero también se han encontrado cepas de la misma bacteria con actividad contra dípteros, coleópteros, acaros, platelmintos, protozoarios y nematodos. (Feitelson et. al, 1992) Comercialmente B. thuringiensis se usa desde hace muchos años en el control de las plagas agrícolas el cual presenta algunas ventajas bastantes significativas que le han permitido tener éxito sobre los insecticidas orgánicos; tales como: a) Es inofensivo al hombre, animales domésticos, flora y fauna silvestre, b) Su ataque es específico para el estado larvario del insecto y su uso no genera tolerancia a los mismos, c) Se puede mezclar con adhesivos para aumentar su acción biocida, d) Su degradación en el ambiente es rápida, por lo tanto no causa problemas de contaminación y e) Sus costos de producción se reducen, debido al avance tecnológico en las áreas de fermentación microbiológica y genética (Rodriguez et. al., 1991) Recientemente la clonación de los genes de las delta-endotoxinas ha permitido el planteamiento de nuevas estrategias para proteger a los cultivos del daño por insectos ya que varios grupos de investigación han logrado la expresión de estos genes en vegetales, obteniendo así plantas transgénicas. (Bravo y Quintero, 1993) El presente trabajo tuvo como objetivo realizar un estudio sobre las características morfológicas y fisiológicas de Bacillus thuringiensis y de la producción de delta-endotoxina, así como su aplicación en el control de insectos plaga.

II.

BACILLUS THURINGIENSIS

2.1 Aislamiento Fue aislado y descrito por primera vez por Ishiivata en 1905, quien lo llamó “Bacilo de Soto”. En 1991, Berliner le da el nombre de Bacillus thuringensis (Fast, 1973) Heimpel(1958) y Angus(1960), lograron identificar por primera vez a B. thuringensis realizando pruebas bioquímicas en 1962. De Barjac y Bonnefoi diferenciaron algunas variedades dentro de la misma especie a través de ensayos serológicos, comparando anticuerpos de flagelares y Norris Burges (1965), se distinguen otras variedades de Bt utlizando patrones electroforéticos de la enzima entereasa (Burges, 1981) El aislamiento se hace a partir de muestras tomadas de suelos, estas muestras se inoculan en un medio nutritivo y selectivo (LB: “Caldo de Luria” con acetato de sodio) posteriormente se incuban a 60°C durante una hora, con el propósito de eliminar otras bacterias en estado vegetativo. Las esporas, usualmente resistentes a estas temperaturas, se inoculan en medio T3, para favorecer su germinación y recuperación. Este medio está constituido por triptona, triptosa, extracto de levadura, MnCl2 y agar, disueltos en una solución buffer fosfato a ph 6.8. Realizada la siembre se deja en incubación a 26°C por 24 horas y se procede a indentificar las cepas de Bt por su morfología colonial característica. Estas colonias son particularmente blancas y deprimidas con borde rugoso o forma estrellada. Las colonias seleccionadas se transfieren a un medio LB sólida y nuevamente se deja en incubación a 26°C hasta obtener completa esporulación.

Las colonias, productoras de cristales y esporas, son sometidas a un método de coloración rápido y simple, utilizando una solución de Azul brillante de Coomassie (0.25 gr de colorante, 50 ml de etanol, 7ml de ac. Acético y agua destilada); a través del cual y empleando el microscopio óptico, se puede distinguir los cristales que captan el color violeta y las esporas mantienen su apariencia blanca y elíptica (Ortiz y Ortiz, 1992)

2.2. Clasificación de cepas

El primer enfoque en la caracterización de cepas de B. thuringiensis, es la forma de la deltaendotoxina presente, y la clasificación de las mismas, se hace de acuerdo a los genes que portan cada una de las cepas.(Bravo y Lorence. 1993). Los genes codifican la delta-endotoxina, llamado Cry, se han clasificado en cinco grupos principales y varias subclases; en total se tiene una familia de 26 genes diferentes que codifican para estas proteínas, donde cada uno es altamente específico para un blanco determinado (tabla 1). Tabla 1. Clasificación de los genes de la delta-endotoxina y la forma del cristal biocida que expresan Genes Forman del cristal Blanco Cry I Bipirasidal Lepidópteros Cry II

Cuboidal

Lepidópteros y Dípteros

Cry III

Romboidal

Coleópteros

Cry IV

Ovoidal

Dípteros

Cry V

----------

nematodos

FUENTE: Feitelson et. al ., (1992) 2.3. Proteinas Cry Las proteínas Cry son un grupo de proteínas de inclusión paraesporal de B. thurigiensis que manifiestan una función tóxica frente a diferentes organismos. Estas proteínas pertenecen al grupo de δ- endotoxinas, cuya característica general es que son toxinas formadoras de poro

(PFT), cuyo foco de acción es la membrana de células epiteliales del intestino medio de insectos. Son toxinas muy específicas de especie, por lo que no todos los insectos son blanco para alguna de ellas. Además, se ha comprobado que son inocuas para vertebrados. Asimismo, con el fin de agrupar a esta familia de proteínas e introducir nuevos miembros que se descubran en un futuro, las proteínas Cry se han definido como: “cualquier proteína paraesporal de Bt que muestre un efecto tóxico hacia algún organismo, verificable por medio de bioensayos o cualquier proteína que muestre similitud con las proteínas Cry”. Actualmente se han encontrado toxinas Cry en otras especies de bacterias, como Clostridium bifermentans (clasificadas como Cry16A y Cry17A), con actividad frente a mosquitos. Por todas estas características, las proteínas Cry se han venido utilizando como bioinsecticidas para especies plaga y, además, se han usado para obtener plantas transgénicas resistentes a la especie que las ataca. En 1989, Hofte y Whiteley propusieron una nomenclatura y clasificación de las proteínas Cry basados en la similitud de su secuencia de aminoacidos y el rango de especificidad. En esos años, las proteínas Cry I, Cry II, Cry III,Cry IV eran las específicas contra lepidópteros, lepidópteros-dípteros, coleópteros y dípteros, respectivamente. Las clases V y VI, activas contra nematodos, fueron consideradas posteriormente en la clasificación por Feitelson y colaboradores en 1992. En 1998, Schnepf y colaboradores propusieron una nueva clasificación basada solamente en la similitud de secuencias primaria entre las proteínas Cry. La nomenclatura actual de las toxinas Cry las agrupa como: 1. proteínas tóxicas a lepidópteros grupos Cry1, Cry2 y Cry9; 2. toxinas activas contra coleópteros grupos Cry3, Cry7 y Cry8; 3. proteínas con actividad dual grupos Cry1B y Cry1I; 4. proteínas con actividad nematicida, grupos Cry5, Cry12, Cry13 y Cry14; 5. proteínas tóxicas a dípteros, grupos Cry2, Cry4, Cry10, Cry11, Cry16, Cry17, Cry19 y las Cyt. (Orietta Fernández -Larrea Vega, 2002) Hasta ahora, se han clonado y secuenciado más de 200 genes cry, cuyas proteínas Cry se han distribuido en 50 grupos y varios subgrupos. Cada uno de estos grupos presenta una toxicidad muy concreta a un determinado tipo de insecto, por lo que la clasificación de este tipo de proteínas está muy relacionada con su toxicidad. El aumento en el número de nuevos genes cry descubiertos hizo que la clasificación vigente hasta ese momento se quedara obsoleta. Esto desencadenó el diseño una nueva nomenclatura propuesta por Crickmore et al. en 1998, donde se utilizan nuevos criterios para este tipo de toxinas (Neil Crickmore, 2011): nombre genérico de la familia (Cry), seguido de un número arábigo que agrupa a las que comparten el 45% de identidad (Cry1, 2, 3, etc), a continuación le sigue una letra mayúscula donde aumenta la identidad entre 45 – 78% (Cry1A, Cry1B, etc), en tercer lugar se asigna una letra minúscula que corresponde a identidades de entre 78 - 95% (Cry1Aa, Cry1Ab, etc) y finalmente se utiliza de nuevo un número arábigo para identidades superiores al 95% (Cry1Aa1, Cry1Aa2, etc). La extraordinaria diversidad de estas proteínas insecticidas se cree que es debido a un alto grado de plasticidad genética. Muchos de estos genes están asociados a elementos transponibles que puede facilitar la amplificación del gen, lo que lleva a la evolución de nuevas toxinas. (Izquierdo R. Lucia, 2011)

III.

LA DELTA ENDOTOXINA

3.1. Modo de acción El ciclo infectivo se puede dividir en las siguientes etapas: 1. Primero, una larva ingiere las esporas y los cristales de B. thurigiensis que se encuentran presentes en su alimento habitual. 2. A continuación, las esporas y cristales viajan a lo largo del aparato digestivo de la larva, hasta llegar al intestino medio. Allí, los cristales se disuelven a causa del pH del medio, que se caracteriza por ser alcalino en los lepidópteros, en torno a pH = 10. A veces, las diferencias en el grado de solubilización de este tipo de proteínas puede explicar el grado de toxicidad de cada una de las toxinas Cry en cada especie de insecto (Schnepf et al. 1998). 3. En este momento, las pro-toxinas están de forma soluble en el medio y hace que, por digestión proteolítica mediante la acción de proteasas del intestino del tipo tripsina y quimiotripsina, se active la proteína y pase a ser la toxina activada. Para que esto suceda, los enzimas deben cortar unos 30 aminoácidos del amino-terminal y una parte variable del extremo carboxi-terminal de la protoxina, lo cual normalmente ocurre de forma progresiva, cortando fragmentos de unos 10 kDa (Schnepf et al. 1998). 4. La toxina activa, se une a los receptores de naturaleza glicoproteína (cuyo peso está en torno a 120- 180 kDa) presentes en las microvellosidades de las células epiteliales del intestino medio. 4.1. El primer receptor (ej: Cadherina), se encarga de realizar un corte proteolítico a la toxina eliminando una hélice α. Esta característica hace que esta proteína se una con mucha afinidad al siguiente receptor. 4.2. La unión de la toxina a un segundo receptor, hace que se formen poros de unos 0,6 nm de radio en las células epiteliales de las microvellosidades que hace que éstas rápidamente se hinchen y pierdan funcionalidad debido a que se produce un intercambio de fluidos entre la luz intestinal y la cavidad hemocélica, que produce un choque osmótico. Estos receptores son claves para la actividad de las proteínas Cry, ya que son específicos de cada toxina y el número de ellos en el epitelio es importante para la acción de las mismas. 5. La lisis celular producida por estas toxinas puede ser suficiente para matar a la larva. Aun así, las esporas pasan a la hemolinfa aprovechando las lesiones que ocasiona la toxina, produciéndose así septicemia debido a que se produce la germinación de las esporas en esta zona y además, ya en forma de bacteria, se puede reproducir de manera muy activa en este fluido (van Frankenhuyzen 1993), debido a que se encuentra en un ambiente lo suficientemente favorable como para germinar. A nivel de microscopía, se puede diferenciar la fase de espora a la de bacteria porque esta última pierde la refringencia. Finalmente, estas bacterias vuelven al medio exterior, donde comenzará de nuevo el ciclo infectivo. (Izquierdo R. Lucia, 2011) El primer síntoma detectado es la parálisis muscular del intestino, esto desemboca en que la larva deja de alimentarse. A continuación, se produce un rápido aumento del pH y de la concentración de K+ en la hemolinfa, que hace que la larva ralentice todos sus movimientos. En este momento es cuando empieza un transcurso de vómitos, diarrea y después la parálisis intestinal se convierte en generalizada. Además, desaparecen los movimientos reflejos y la

larva finalmente muere, originándose unas manchas oscuras en el tegumento. (Izquierdo R. Lucia, 2011) Cuando la protoxina entra al tracto digestivo de la larva, esta es solubilizada en el ambiente alcalino del interior del intestino y es procesada a la forma toxica, por acción de los protozoos. El siguiente paso es la unión de la toxina al receptor presente en la membrana intestinal del insecto susceptible. Experimentos realizados con diferentes toxinas y diferentes insectos blanco, han demostrado que existe una correlación estricta entre unión de las toxinas al receptor del insecto blanco y la toxicidad (Van Rie et. at .. 1990). Aunque se ha reportado un papel muy importante del receptor en la toxicidad; en algunos casos no es suficiente para matar al insecto, lo que sugieren que existen otros factores involucrados en el mecanismo de acción de la toxina (Wolferoberger, 1990). Se han encontrado que los receptores son diferentes en cada tipo de insectos, lo mismo que su número y la eficiencia de unión entre la toxina y el receptor. Hasta el momento se conoce muy poco sobre la naturaleza bioquímica del receptor y su papel fisiológico dentro del intestino larvario. El modelo aceptado a la fecha es que en la membrana del insecto existen diferentes proteínas que pueden funcionar como receptor de las toxinas de B. thuringiensis y que diferente insectos pueden tener varios receptores en diferente cantidad que son reconocidos especialmente por diferentes toxinas. De esta manera se explica la alta especificidad de acción de la delta-endotoxina. La toxina de B. thuringiensis ejerce su acción biocida desde la microvellosidad apical y esta no se internaliza, como lo demuestran estudios inmuoacidoquimicos. (Bravo y Lorence, 1993). En cuanto al efecto que produce la toxina en la membrana intestinal del insecto se ha propuesto que altera el transporte de iones potasio de las células epiteliales (Sacchi et. al ., 1986). Mediante el uso de bloqueadores de canales de potasio. (calcio y bario). Se ha demostrado que se puedes revertir y prevenir el efecto de la toxina en un sistema in vitro a base de células epiteliales.(Crawford y Harvey. 1998). Recientemente se ha logrado incorporar diferentes delta-endotoxinas en bicapas planas sintéticas, esto demostró que la toxina es capaz de incorporarse en membrana en ausencia del receptor y que induce la formación de un poro selectivo (Slatin el. At., 1990). Por otro lado, no ha logrado incorporar a la toxina de B. thuringiensis en liposomas sisnteticos, en donde también se ha visto que altera la permeabilidad de las membranas ( Yunovits y Yawetz, 1988). Todos estos estudios demuestran que la toxina es capaz de interaccionar con membranas y afectar su permeabilidad a diferentes iones. Al receptor se le ha dado un papel de catalizador en la interacción de la toxina con la membrana intestinal. El modelo de acción aceptado es el siguiente: se propone que la unión de la toxina al receptor disparara un cambio conformacional que induce la integración de la toxina en la membrana. La inserción en la membrana es rápida y la toxina no puede ser desplazada por otras toxinas que comparten el mismo tipo de receptor, ya que la unión es irreversible. El extremo amino terminal de la toxina de B. thuringiensis, se inserta en la membrana y estaría encargado de la formación del poro. (Bravo y Lorence, 1993).

3.2. Desarrollo de la resistencia: La toxina B. thuringiensis tiene un tiempo de permanencia muy corto en el medio ambiente, esto aunado a que es altamente especifico, ha permitido que se desarrollen pocos insectos resistentes a este insecticida. Sin embargo Mac- Gaughey en 1985, encontró que Plodia interpuctella fue capaz de presentar resistencia a productos derivados de B. thuringiensis en varias generaciones; concluyendo que esta se hereda en forma recesiva (Bravo y Quintero, 1993). El mecanismo de resistencia a nivel molecular, se presenta con alteraciones en el receptor de la toxina en el intestino del insecto. Se ha reportado que una disminución en la afinidad del receptor por alguna delta-endotoxina, puede provocar resistencia hacia la misma. Sin embargo como en un mismo insecto existen distintos receptores para diferentes delta-endotoxinas, un insecto que puede desarrollar resistencia contra una toxina y seguir siendo igualmente o más sensible a una segunda delta- endotoxina (Van Rie et. al., 1990). Se ha sugerido que la aplicación a campos de cultivo con productos de B. thuringiensis debe estar constituido por dos o más tipos diferentes de delta-endotoxina, que actúen sobre el mismo insecto pero que se unan a diferente receptor siendo una buena alternativa para demorar el desarrollo de resistencia. Otra propuesta ha sido la rotación de insecticidas químicos con productos basados en B. thuringiensis. Con la misma idea se ha propuesto el uso alternado de diferentes insecticidas que contengan diferentes delta endotoxinas pero que se unan a diferentes receptores (Fox, 1991). IV. USO COMO BIOINSECTICIDA Se estima que a nivel mundial el 15% de las perdidas en agricultura se debe únicamente al ataque de insectos, aunque en algunos países es mucho mayor; como es el caso de México, donde estudios realizados por la FAO han llegado a establecer que las pérdidas ocasionadas por el ataque de insectos es de 20 -30%; de allí el gran interés en desarrollar insecticidas efectivos en l control de insectos plaga (Altieri; 1988). Desde hace varios años los países industrializados han iniciado la búsqueda de sistemas de control biológico menos tóxicos para el hombre y el ecosistema en general., de mayor eficiencia y especialidad. Esto significa que habrá un crecimiento muy importante de nuevos productos, entre los cuales los bioinsecticidas tendrán una participación muy relevante; siendo B. thuringiensis el producto comercial de mayor difusión y uso mundial. En 1990 el mercado de B. thuringiensis era de 105 millones de dólares y se estima que esta cifra se duplicara en el año 2000, este crecimiento indica las grande expectativas que se tiene para B. thuringiensis (Feitelson, et. al., 1992). 4.1 Espectro de accion en el control de plagas Se han identificado una gran cantidad de cepas de B. thuringiensis con diferente rango de acción insecticida, la mayoría de cepas tienen actividad contra lepidópteros, pero también se han encontrado cepas con actividad contra dípteros, coleópteros, ácaros, platelmintos y nematodos (Feitelson, et, al, 1992). En la tabla 2, se muestra el espectro de acción de B. thuringiensis contra insectos plaga.

Tabla 2. Espectro de acción de Bacillus truringiensis contra insectos plaga. INSECTO PLAGA PLANTA HOSPEDERA Nombre Cientifico Nombre Comun Agrotis sp. Gusano cortador Algodón, cereales, crucíferas, curcubitaceas, tabaco. Alsophila sp. Anticarcia sp. Autographa sp. Batrachedra comosaea Copitarsia sp.

Gusano de cancer Gusano terciopelo Gusano medidor

Desmia sp. Diatrea sp.

Enrollador Gusano barrenador

Gusano corazón de col

Diphania sp. Perforador del melon Eudamus sp. Enrollador de hoja Keiferia sp Gusano aguja Ostrinia nubalis Gusano barrenador maiz Scrobipalpula sp. Gusano cogollero Fuente: Bravo y Quintero (1993) 4.2 Proceso de produccion

Ornamentales Soya, Albahaca Alfalfa Piña Cruciferas, garbanzo, fresa, melon, pepino, sandia. Vid Caña de azucar, cereales, bocoli, berenjena, maiz Cucubitaceas Frijol, papas Tomate Maiz Tomate

El proceso de producción de B. truhingiensis puede dividirse en las siguientes etapas: a) Fermentación, b) Separación de esporas y cristales, c) Secado, d) Formulación y e) Envasado.

A nivel industrial el proceso de producción se lleva a cabo generalmente en lotes (batch). La fermentación se realiza en bioreactores comerciales con control de temperatura, pH y otro parámetro el cultivo se hace por lo general sumergido por lo general con una duración de 40 horas (Bravo y Lorence, 1993).

La composición de un medio típico y las condiciones experimentales de B. thuringiensis se muestran en la tabla 3. Tabla 3. Composición de un medio de cultivo típico y condiciones experimentales recomendadas para obtener altos rendimientos de Bacillus thuringiensis COMPOSICION DEL MEDIO DE CULTIVO (g/L) Glucosa (30) Licor macerado de maiz (5) Peptona de soya (2) Extracto de levadura (4.5) KCl (3) (NH4)2 SO4 CaCL2H2O (0.036) FeSO4 . 7H2O (0.0135) H3PO4 (7ml) CuSO4 . 5H2O (0.0075) ZnSO4 . 7H2O (0.0075) MnSO4 . 4H2O (0.04) Fuente. Bravo y Quintero (1993).

CONDICIONES EXPERIMENTALES Fermentador de 500 L Temperatura 32°C pH 6.2 – 7.4 Aireacion 3 vvm Agitacion 120-160rpm Tiempo de cultivo 60h Rendimiento 4 x10 ucf/mL

La separación de las especies y los cristales se lleva a cabo comúnmente mediante un proceso de centrifugación. Dada la termoestabilidad del producto, el proceso de secado se realiza preferentamente en un secador por aspersión. La mezcla de los ingredientes de las formulaciones solidas se lleva a cabo por lo general en tambores rotatorios o en mezcladores tipo “y”; para el caso de formulaciones líquidas, la mezcla de los ingredientes de la formulación se hace en tanques agitados ( Bravo y Lorence, 1993). Pustzal. Et al (1991), encontraron que el mecanismo principal de inactivación de los cristales de B. thuringiensis causada por la luz solar es el proceso de fotosensibilización; dicho proceso involucra la presencia de un cromóforo (absorbido dentro o en la superficie del cristal). Estos autores demostraron que los cristales son más estables a la luz solar, mientras menos tiempo están en contacto con el medio de cultivo; con estos resultados proponen que un mecanismo adecuado para aumentar la estabilidad de los cristales a la inactivación causada por la luz es centrifugar a las células de B. thuringiensis de que éstas liberen las esporas y los cristales, lavar con agua para eliminar los residuos de medio de cultivo y causar la citólisis por agitación en medio acuoso con 50% v/v de glicerol. 4.3. Formulaciones Los productos comerciales de B. thuringiensis se presentan como formulaciones solidas o liquidas. Las formulaciones solidas pueden ser polvos mojables i granulados dispersables, obtenidos al mezclar las esporas y cristales proteicos de B. Thuringiensis, con materiales inertes como minerales orgánicos, tales como: Borosilicatos, carbonatos, sulfatos, fosfatos, o con materiales biológicos como la mazorca de maíz y cascara de nuez. Estas formulaciones pueden incluir adyuvantes para la dispersión, agentes estabilizantes, otros aditivos y

surfactantes. Los productos son aplicados a plantas, suelo, agua o a granos almacenados por aspersión o espolvoreó (pusztal et. Al., 1991). Las formulaciones liquidas pueden ser de base acuosa o no acuosa y se emplea como espumas, geles, suspensiones o concentraciones emulsionantes. Los ingredientes pueden incluir agentes geológicos, surfactantes, emulsionantes, dispersantes y polímeros. Un ingrediente común en ambos tipos de formulaciones liquidas o sólidas, son la foto protectores ya que la inactivación de las preparaciones de B. thuringiensis por la acción de la luz solar es un problema que afecta la eficacia de estos bioinsenticidas (pusztal et. Al., 1991). La mayoría de los productos comerciales B. thurigiensis se presentan en forma de polvos humectante y de suspensiones emulsionables. La variedad de B. thurigiensis mas usada como base de las formulaciones destinadas al combate de lepidópteros es la kursati; mientras que para el combate de moscas y mosquitos se usan preparaciones a base de la variedad Israeliensis, así como la variedad tenebrionis es la base de productos contra coleópteros. El uso de diferentes unidades (esporas /ml., gr. De biomasa/L., gr. De células/gr. De glucosa) para describir la potencia y actividad de los productos analizados, dificulta la comparación de los mismos, (Bravo y Lorence, 1993). Tabla 4. Productos comerciales producidos a partir de diferentes variedades de Bacillus thuringiensis. PRODUCTO VARIEDAD OBJETIVO 1 Kurstaki/ H3 Larvas lepidodpteros 𝐷𝑖𝑝𝑒𝑙 2𝑥 Kurstaki/ H3 Larvas lepidodpteros 𝐷𝑖𝑝𝑒𝑙 8𝐿2 1 Kurstaki/ H3 Larvas lepidodpteros 𝐷𝑖𝑝𝑒𝑙 𝑊𝑃 3 Kurstaki/ H3 Larvas lepidodpteros 𝐷𝑖𝑝𝑒𝑙10𝐺 4 Israeliensis/ H14 Larvas dipteros 𝑉𝑒𝑐𝑡𝑜𝑏𝑎𝑐𝐴𝑆 3 Israeliensis/ H14 Larvas dipteros 𝑉𝑒𝑐𝑡𝑜𝑏𝑎𝑐 12𝐴𝑆 Israeliensis/ H14 Larvas dipteros 𝑉𝑒𝑐𝑡𝑜𝑏𝑎𝑐 63 4 Israeliensis/ H14 Larvas dipteros 𝐺𝑛𝑎𝑡𝑟𝑜 1 Kurstaki/ H3 Larvas lepidodpteros 𝐵𝑖𝑜𝑏𝑖𝑡 𝐹𝐶 4 1 Kurstaki/ H3 Larvas lepidodpteros 𝐵𝑖𝑜𝑏𝑖𝑡 𝑊𝑃 Kurstaki/ H3 Larvas lepidodpteros 𝐹𝑜𝑟𝑎𝑦 488 𝐹𝐶 2 2 Tenebrionis/ 8a 8b Larvas coleopteros 𝑁𝑜𝑣𝑜𝑑𝑜𝑟 𝐹𝐶 Israeliensis/ H14 Larvas dipteros 𝑆𝑘𝑒𝑒𝑡𝑎𝑙 𝐹𝐶 2 4 Kurstaki/ H3 Larvas lepidodpteros 𝐿𝑎𝑟𝑣𝑜 − 𝐵𝑡 Kurstaki/ SA- 11 Larvas lepidodpteros 𝐽𝑎𝑣𝑒𝑙𝑖𝑛 𝑊𝐺 3 1 Kurstaki/ 11a 11b Larvas lepidodpteros 𝑇ℎ𝑢𝑟𝑖𝑐𝑖𝑑𝑒 𝑃𝐻 Tenebrionis/ 8a 8b Larvas coleopteros 𝑇𝑟𝑖𝑑𝑒𝑛𝑡 𝐼𝐼 4 1 Kurstaki/ E6 2371 Larvas lepidodpteros 𝐶𝑢𝑡𝑙𝑎𝑠𝑠 1.Polvo humectable 2. Concentrado diluible 3. Granulo dispersable 4. Suspension acuosa Fuente: bravo y quintero (1993) V.

ORGANISMOS ENDOOXINA

TRANSFORMADORES

CON

GENES

DE

LA DELTA-

5.1 Plantas transgénicas Los genes Cry de Bacillus thuringiensis se convirtieron en los candidatos ideales para transformar plantas, debido a que para obtener actividad insecticida se requiere solo de la expresión de una sola proteína de delta-endotoxina. (Vaeck et. al. 1987) La ingeniería genética desarrolló muchas especies de plantas que expresan genes cry de B. thuringiensis y las convirtió así en “plantas insecticidas”. Comúnmente se hace referencia a este tipo de plantas como “plantas o cultivos Bt” (por ejemplo, maíz Bt, algodón Bt, etc.). (D.Sauka y G. Benintende, 2008) El primer grupo que tuvo éxito en la transformación de plantas con este gen fue la compañía Plant Genetic Systems in 1987, logrando la transformación en tabaco con la porción tóxica del gen Cry IA (b), utilizando un promotor fusionado al gen de la toxina con el gen de resistencia a la Kanamicina con el propósito de facilitar la selección de las transformantes (Vaeck et. al. 1987) Desde entonces, al menos diez tipos de genes Cry distintos se introdujeron en 26 especies vegetales: cry1Aa, cry1Ab, cry1Ac, cry1Ba, cry1Ca, cry1H, cry2Aa, cry3A, cry6A y cry9C. (D.Sauka y G. Benintende, 2008) El segundo reporte de transformación de plantas con genes E. thuringiensis fue de la compañía Mosanto, con la expresión del fragmento tóxico del gen Cry IA (b) en tomate. Para la expresión de este gen se utilizó el promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor. En el mismo año la compañía Agracetus reportó la expresión del gen Cry IA (b) en tabaco utilizando también el promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor, pero unido a una secuencia líder del virus del mosaico de alfalfa. (Fischhoff et al. ,1987) Actualmente se han transformado otras plantas como papa y algodón: y se están realizando esfuerzos para transformar otras, como se muestra en la Tabla 5. Tambien se han utilizado otros genes como el Cry IA (c) y Cry IIIA. Tabla 5. Plantas transformadas con genes de Bacilus t. que han sido llevadas a nivel de campo. PRODUCTOS ALIMENTOS BÁSICOS INDUSTRIALES Abeto Arroz Alamo Maiz Algodón Papa Caña de azucar Petunia Remolacha Tabaco Girasol FUENTE: Perlak et. al. (1991)

FRUTAS Nuez Uva Manzana

HORTALIZAS Tomate

Agrobacterium tumefaciens, es el sistema biológico más usado en la transformación de plantas superiores esta bacteria es capaz de transferir un elemento móvil de su plásmido Ti

dentro del genoma de la planta hospedera. Se ha comprobado que casi todo el ADN-T del plásmido, a excepción de 25 pares de bases de cada extremo, pueden reemplazarse por un ADN foráneo sin que pierda la capacidad de integración al genoma de la planta (Reed y Rhem, 1994)

5.1.1. Ventajas Sin duda la ventaja más importante es la económica, ya que como la toxina se expresa constantemente en la planta, no es necesario hacer explicaciones de insecticidas; por lo que los costos en mantenimiento de los cultivos se reducen considerablemente. Una segunda ventaja es que no se daña el medio ambiente, pues la toxina está contenida dentro de la planta y no es lavada por la lluvia, por ello no existe ningún peligro de contaminación de suelos y ríos. Además es efectivo y también se protegen partes de la planta que antes eran casi imposible de hacerlo, por ejemplo la raíz, por último, sólo ataca a los insectos parásitos (Bravo y Quintero, 1993) . El empleo de este tipo de plantas posee la ventaja de reducir la necesidad de aplicar insecticidas y de proveer una protección duradera a lo largo de la temporada de cultivo. Otra característica muy importante que poseen es que los únicos insectos expuestos a la toxina son aquellos que se encuentran alimentándose de los cultivos y no otros. No obstante, la mayor ventaja de estas plantas Bt es que brindan a los agricultores una alternativa al uso de pesticidas químicos tradicionales y constituyen una herramienta para el control de plagas de importancia económica que son difíciles de controlar por los primeros. Todas estas ventajas se verían reflejadas finalmente en beneficios enormes para la producción de alimentos y en una calidad medioambiental mejor en todo el mundo. (D.Sauka y G. Benintende, 2008) 5.1.2. Desventajas

Una de las dificultades, es obtener niveles de expresión de la toxinas suficientemente altos para matar a diferentes tipos de larvas; se ha reportado que no todos los insectos son igualmente susceptibles a determinadas delta-endotoxinas, por lo que una dosis muy baja podría no afectar a una plaga más tolerante. Otra desventaja importante es el desarrollo de insectos resistentes. Por último, los cultivos que expresan proteínas de delta-endotoxina son organismos transgénicos y el proceso de registro para su comercialización es muy lento y costoso, lo que resulta un gran obstáculo (Bravo y Quintero. 1993) . Poseen la gran desventaja que radica en la posible generación de resistencia en ciertas poblaciones naturales de insectos que se alimentan de ellas. Este fenómeno determinaría la inutilización de determinadas proteínas Cry para su control, ya sea mediante su empleo en plantas transgénicas o con los bioinsecticidas que los contengan. (D.Sauka y G. Benintende, 2008) Actualmente existen una gran cantidad de plantas que han sido transformadas con genes de delta-endotoxina, pero ninguna se ha liberado para su comercialización, pues se requiere probar que efectivamente la delta-endotoxina no es tóxica para el hombre u otros animales. Hasta el momento los estudios de toxicología con protoxinas no han mostrado efecto alguno (Goldburg y Tjaden, 1990) . 5.2 Bacterias transgénicas Muchas bacterias del suelo han sido transformadas con los genes B. thuringiensis. El uso de estas bacterias transgenicas han permitido extender el rango de distribucion de la deltaendotoxina al habitar otros nichos ecologicos: como es el caso de Clavibacter xyli, bacteria endofita que crece en el tejido vascular del maiz y de otras plantas, o Pseudomonas y Agrobacterium, bacterias que crecen en la zona de la rizosfera y Bradyrhizobium que además de crecer en la rizosfera, coloniza las raices en una relacion simbiotica con la planta formando nuevas estructuras denominadas nódulos, dentro de estos la bacteria se reproduce y fija el nitrogeno. Se ha demostrado que Bradyrhizobium transformada con el gen de la deltaendotoxina produce nódulos que son resistentes al ataque de larvas de Rivella angulata, lo que estos insectos preferencialmente se alimentan de las zonas noduladas y no del resto de la raiz (Nambiar et. al,1990) El utilizar otras bacterias como vehiculos portadores de la proteina insecticida ha resultado de gran eficacia, ya que ademas de proveer constantemente de esta proteina a las plantas, presentan una ventaja respecto a Bacillus thuringiensis, pues este no sobrevive muy bien en el suelo y además el cristal es rapidamente inactivado en el ambiente, especificamente por la luz ultravioleta de los rayos solares (Pusztal et. ak.,1991) La compañía Mycogen ha desarrollado una estrategia denominada encapsulacion de celulas muertas, para evitar la degradacion de la toxina y aumentar su permanencia en el ambiente. Su técnica consiste en utilizar Pseudomonas transformadas con el gen de delta-endotoxina para producir los cristales insecticidas en fermentadores; como esta bacteria no esporula, los cristales no son liberados al medio de cultivo. Al final de la fermentacion agregan un fijador que mata a las células conteniendo la proteina insecticida. Actualmente constituye el unico

producto transgenico portador de genes de B. thuringiensis que ha sido aceptado comercialmente. (Bravo y Quintero, 1993)

5.3 Virus portadores del gen de la delta – endotoxina Los agentes Cry han sido utilizados para aumentar la patogenicidad de ciertos virus que atacan a insectos. Los baculovirus son patógenos específicos de insectos, cuyo principal problema es que los matan lentamente, por lo que no son considerados como una herramienta eficaz en el control de insectos plaga. Los genes Cry IA (b) y Cry IA (c) fueron introducidos en el genoma del virus de Autographa californica, bajo el control del promotor tardío de la proteína polihedrina (Martens. Et al., 1990). La deltaendotoxina se expresa muy bien en las células de los insectos infectados con los virus transgénicos; sin embargo no se tiene una patogenicidad mayor del virus, debido a que el sitio de expresión no es el sitio de acción, pero se ha propuesto que como el virus induce la expresión de la toxina en la larva infectada, cuando este muere deja restos de la toxina en la superficie de la planta y puede tener un efecto importante en la población de insectos plaga (Bravo y Quintero, 1993). VI. 

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CONCLUSIONES

El espectro de acción de las diferentes delta-endotoxinas de B. thuringiensis es bastante amplio, encontrándose actividad contra lepidópteros, dípteros, coleópteros, ácaros, platelmintos y nematodos. Es posible encontrar en un futuro nuevas toxinas con diferentes espectros de acción. B. thuringiensis ofrece ventajas muy importantes como insecticida porque es seguro para el hombre y no contamina el medio ambiente. Con las técnicas de ingeniería genética se desarrollarán nuevos productos con mejor distribución y calidad del insecticida, ya que se podrán diseñar nuevas combinaciones de delta-endotoxinas que permitirán el control de un mayor número de insectos plaga. Las plantas transgénicas serán el medio más eficiente y económico para distribuir ña toxina de B. thuringiensis; sin embargo éstas no estarán en el mercado hasta fines de los años noventa. VII.

REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS

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Pusztal M., M. Fast and R. Carey. (1991) The mechanism of sunlight-mediated inactivation of Bacillus thuringiensis crystals. Biochem J.: 273: 43-47.