Ayrampo Berberis Flexulosa

UNIVERSIDAD NACIONAL MAYOR DE SAN MARCOS Uni Un i ver sida si dad d d el Perú, Perú, DEC DECANA DE AM ÉRICA ICA

FACULTAD DE FARMACIA Y BIOQUÍMICA Departamento Académico de Química Básica y Aplicada

QUÍMICA ANALÍTICA INSTRUMENTAL

“Titulación de ácido ascórbico presente en Berberis flexulosa  “ayrampo”  “ayrampo” por Iodometría”

Profesora: Dra. Norma Angélica Carlos Casas

Alumnos: Chipana Luján, Jaime Roberto Limay De La Cruz, Edwin Carlos Suárez Su, Luis Alfredo Lima

2015

Proyecto de investigación de Química Analítica Instrumental Cuantificación de ácido ascórbico en extracto de Berberis Berberis flexulosa p or Iodometría

I.-Introducción Determinación de vitamina C El ácido ascórbico o vitamina C (C 6H8O6) se puede determinar por medio de una titulación yodométrica. La vitamina C es un agente reductor reductor suave su ave que reacciona rápidamente con el ión triyoduro, en esta práctica se genera un exceso exceso conocido de ion io n triyoduro ( I3 ) por reacción de yodato con yoduro, se deja reaccionar y luego el exceso de I3 - se titula por retroceso con una solución de tiosulfato. El método se basa en las siguientes reacciones: reacciones:

8I- + IO3- + 6H+ →3I3- + 3H2O

C6H8O6 + I3- + H2O → C6H8O7 + 2H+ + 3IÁcido ascórbico

ácido deshidroascórbico

I3- + 2(S2O3)-2 → 3I- + (S4O6)-2 Tiosulfato

tetrationato

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Volumetría de oxidación - reducción con yodo. El potencial estándar de reducción para la reacción: I 2 + 2e- 2I-  es 0.535 V. Las sustancias con potencial de reducción bastante inferior al del sistema yodo - yoduro son oxidadas por el I 2  y pueden valorarse con una solución patrón de yodo. Estas volumetrías redox llamadas yodimétricas o directas, se utilizan para determinar agentes reductores. El yoduro I-  se oxida a I2  ejerciendo una acción reductora sobre los sistemas fuertemente oxidantes con formación de una cantidad equivalente de yodo. El yodo liberado se titula con la solución valorada de tiosulfato de sodio Na 2S2O3. Estas volumetrías se llaman yodométricas o indirectas y se utilizan para determinar agentes oxidantes. 8.2.1.1 Volumetrías redox yodométricas o indirectas. Las reacciones generales para

determinar un agente oxidante (Ag. Oxidante) mediante volumetría yodométrica son: Ag. Oxidante + I - (exceso) Ag. Reductor + I 2

I2 + 2S 2O3= 2I- + 2S 4O6= El yoduro I - que se adiciona como NaI o KI, se encuentra en exceso y no es un a solución patrón. El I 2  formado en la primera reacción es equivalente a la cantidad de agente oxidante contenida en la muestra que se analiza. El I 2  liberado se titula con una solución patrón de un reductor, entre los cuales c uales el Na 2S2O3 es el más utilizado. Las valoraciones deben efectuarse en el menor tiempo posible con el fin de evitar que el I-  sea oxidado por el oxígeno del aire. Cuando sea necesario dejar la reacción durante algún tiempo, se debe desalojar el aire ai re del recipiente, para lo cual se utiliza un gas inerte como CO 2 o NO2. La adición de NaHCO 3 a la solución ácida que se valora, proporciona CO2. Las reacciones están afectadas además por la luz, por lo cual el erlenmeyer donde se realiza la titulación se coloca en la oscuridad. Como los vapores de yodo pueden perderse fácilmente, se acostumbra tapar el recipiente utilizando un tapón de vidrio. Cuando se determina un oxidante mediante reacciones con yodo, el punto final se alcanza cuando desaparece el color amarillo de la solución. Se aprecia mejor este punto si se añade una solución de almidón, que forma con el yodo un complejo de color azul oscuro. El punto final se alcanza cuando desaparece el color azul, al agregar un ligero exceso de Na 2S2O3. El indicador almidón se añade cuando se ha consumido la mayor parte del yodo. Si se añade demasiado pronto, el I- se absorbe sobre el indicador y se llega muy lentamente al punto final, siendo muy difícil detectarlo.

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Preparación y valoración de la solución patrón de tiosulfato de sodio.

La solución patrón se prepara por el método indirecto porque el tiosulfato de sodio es una sal higroscópica; se le agrega una pequeña cantidad de hidróxido de sodio, dada d ada la inestabilidad de la solución en medio ácido. El tiosulfato de sodio se valora con dicromato de potasio K2Cr2O7 en presencia de Ien medio ácido, titulando el yodo producido con tiosulfato. Las reacciones que ocurren, son:

Cr2O7= + 6 I- (exceso) + 14H+ 2Cr+3 + 3I2 + 7H2O I2 + 2S2O3= 2I- + S4O6= Para que la reacción entre el Cr 2O7= y el I- sea completa, se debe dejar en reposo por varios minutos. 8.2.1.2 Volumetrías redox yodimétrica o directa. La valoración yodimétrica o directa implica el uso de d e una solución patrón de triyoduro para valorar valo rar analitos reductores. Las soluciones de triyoduro se preparan disolviendo cristales de yodo en soluciones concentradas de KI y diluyendo en agua. En una solución que contiene exceso de iones I- el yodo existe esencialmente como iones I 3- o I2I- ; sin embargo para facilitar las ecuaciones y los cálculos puede considerarse que el yodo existe en forma molecular como I2. Es necesario que haya un exceso de KI para asegurar el desplazamiento de la reacción de disolución de I2 a I3- :

I2 (s) + I- I3Experimentalmente se ha comprobado que la proporción más adecuada de KI e I2 para la disolución de I 2 es 20g de KI por cada 12.7gr de I 2. La valoración de los analitos reductores se hace en medio ácido o n eutro. Los reductores fuertes como, los iones sulfuro, sulfito y tiosulfato se determinan en medio ácido. Los reductores un poco más débiles como los compuestos de arsénico (III) y antimonio (III) se determinan en medio neutro. Facultad de Farmacia y Bioquímica Universidad Univers idad Nacional Mayor M ayor de San Marcos

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Se utiliza como indicador el almidón, que forma un complejo de color azul en presencia de exceso de yodo. 8.2.1.2.1 Preparación y valoración de la solución tipo yodo. La solución tipo de yodo se prepara por el método indirecto, disolviendo el yodo en una solución de KI, valorando con solución patrón de tiosulfato de sodio y utilizando almidón como indicador. Las reacciones que ocurren en la valoración son:

I2 (s) + 2e- 2I2S2O3= 2e- + S4O6= Las soluciones de yodo son poco estables por la volatilidad del soluto, el ataque del yodo sobre muchos materiales orgánicos y la luz. 8.2.1.2.2 Determinación = SO3

de mediante volumetrías redox yodimétrica.

La muestra acidificada que contiene sulfito, se titula con la solución estandarizada de yodo. El yodo reacciona con el SO3=. El punto final de la valoración se reconoce por el color azul resultante de la reacción del primer exceso de yodo con el indicador de almidón. Las reacciones que ocurren en la valoración son:

SO3= + H2O -> 2H + + SO4= + 2eI2 (s) + 2e- -> 2IControl de corrosión en lodos de  perforación. La corrosión es el ataque

destructivo de un metal, causada por una reacción química o electroquímica entre un metal y su ambiente. Las causas principales de la corrosión en las operaciones de perforación son el oxígeno, el dióxido de carbono, y el ácido sulfihídrico contenidos en el lodo. Cualquiera que sea su mecanismo de entrada, el efecto corrosivo de esos gases es también una función de la cantidad de sales disueltas, del pH, de la temperatura y de la velocidad de flujo del fluido involucrado. Facultad de Farmacia y Bioquímica Universidad Nacional Mayor de San Marcos

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La corrosión origina fallas prematuras de la tubería de perforación (drill pipe), del revestimiento (Casing) o de cualquier otro equipo de acero empleado para perforar o completar pozos. La industria petrolera dispone de un importante número de productos químicos para impedir o minimizar el ataque corrosivo. Todas las formas de corrosión aumentan en presencia de oxígeno; los secuestrantes de oxígeno, sirven para reducir los efectos de la corrosión. Los sulfitos de amonio o de sodio se utilizan como depuradores de oxígeno en lodos base agua. El sulfito reacciona rápidamente con el oxígeno del lodo y lo elimina según la reacción:

2SO3= + O2 -> 2SO4= La tasa de bombeo del sulfito depende de la concentración de oxígeno presente en el lodo. Se recomienda mantener en el sistema un mínimo de 100ppm de sulfito.

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Clasificación taxonómica División: Magnoliophyta Clase: Magnoliopsida Subclase. Magnolidae Orden: Ranunculales Familia: Berberidaceae Género: Berberis Especie: Berberis flexulosa  R. & P. Nombre vulgar: ayrampo

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II.- Obejtivo Determinar la cantidad de ácido ascórbico presente en el extracto de Berberis  flexulosa “ayrampo”

III.- Materiales, reactivos

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IV.- Metodología

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V. Resultados Preparación de soluciones Para KIO3 0,01 N (PM=214,001 g/mol)

Se pesó 0,1071 g en balanza analítica, se agregó esta masa a una fiola de 50 mL y se enrasó con agua destilada c.s.p. 50 mL.

0,1071 g de KIO3

Para Na2S2O3.5H2O 0,01 N (PM=248,18g/mol)

Se pesó 0,2142 g de Na 2S2O3.5H2O en balanza analítica, se agregó a una fiola de 100 mL y se agregó agua destilada c.s.p. 100 mL. 0,2142 g de Na2S2O3.5H2O

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Para KI 0,01 N (PM=166 g/mol)

Se pesó 0,1661 g de KI en balanza analítica, se agregó a una fiola de 100 mL y se agregó agua destilada c.s.p. 100 mL. 0,1661 g de KI

Para almidón al 1%

Se pesó 1,0002 g de almidón en balanza analítica y se agregó en una fiola de 100 mL y se agregó agua destilada c.s.p. 100 mL. 1,0002 g de almidón

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Estandarización de Na2S2O3 con KIO3

Na2S2O3 + 2 KIO3 = K2S2O3 + 2 NaIO3

Na2S2O3

Gasto: 10,3 mL

 1g de KI  10 mL KIO3 0,01 N  3mL H2SO4 

2mL de almidón 1%

#mEq Na2S2O3 = #mEq KIO3 10,3mL x N = 10mL x 0,01 N N Na2S2O3 = 0,0097 N

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Titulación de ácido ascórbico con Na2S2O3 y KIO3

Ecuaciones en la t it ulación + + + C6H8O6 + 4KI + 8H → C6H12O6 + 4K  + 4I  + 4H

6 Na2S2O3 + 2 I3 → 3 Na2S4O6 + 6 NaI

Na2S2O3

Gasto: 6,5 mL

 3mL de extracto  10 mL KI 0,01 N  3mL H2SO4 

2mL de almidón 1%

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PM ácido ascórbico = 176,126 g/mol………PEq=88,65………PmEq=0,08865

#mEq Na2S2O3 = #mEq I2 = #mEq M.P. 6, 5 mL x 0, 0097 N =

 á ó   ,

g ácido ascórbico = 5,5893 x 10

-3

g

Cantidad de ácido ascórbico en mg/100mL X_________100mL 5, 5893 mg________3mL

La iodatometría o método iodométrico indirecto se fundamenta en la reacción de un oxidante con el KI yoduro de potasio reductor para generar yodo que se hace soluble -

con la formación del poliyoduro triyoduro: I2 (s) + I

→ I3-

Es este triyoduro el cual es titulado por el tiosulfato, de manera que como el yodo generado es proporcional a la cantidad de muestra oxidante se puede determinar la equivalencia: #mEq Na 2S2O3 = #mEq I2 = #mEq M.P.

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VI.- Discusión

VII.- Conclusiones

VIII.- Referencias bibliográficas

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IX.- Anexos

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Universidad del Perú, DECANA DE AMÉRICA FACULTAD DE FARMACIA Y BIOQUÍMICA ESCUELA ACADEMICO PROFESIONAL DE FARMACIA Y BIOQUÍMICA

QUÍMICA ANALÍTICA INSTRUMENTAL

IDENTIFICACION DE ANTIOCIANINAS POR EL MÉTODO DE HPLC  Auto res:  RODRIGUEZ

CORDOVA, Angello Gonzalo  FERNANDEZ TELLO, Jose Oswaldo  MENDDOZA VILCHEZ, Mayra Lucia  TEVES GUZMAN, Katerin  ROJAS VÁSQUEZ, Victor Docente:  Dr.

CARLOS CASAS, Norma

Lima – Lima – Perú 2015

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INDICE IDENTIFICACION DE ANTIOCIANINAS POR EL METODO DE HPLC...................... 3 INTRODUCCION ..................................................................................................... 3 OBJETIVOS............................................................................................................. 3 MARCO TEÓRICO .................................................................................................. 4 I.

Berberis flexuosa R. & P. ............................................................................... 4

II. ANTOCIANINAS ............................................................................................ 5 III. HPLC .......................................................................................................... 5 METODOLOGIA ...................................................................................................... 6 I. SOLVENTES.................................................................................................. 6 II. COLUMNAS ................................................................................................... 6 III. DETERMINACIÓN DE LAS ANTOCIANINAS POR CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTA RESOLUCIÓN (HPLC-PDA) ................................................. 8 IV. DETERMINACIÓN DE LAS ANTOCIANINAS POR CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTA RESOLUCIÓN (HPLC-MS/MS) ............................................. 9 RESULTADOS ...................................................................................................... 10 CONCLUSIONES .................................................................................................. 12  ANEXOS ................................................................................................................ 13 FICHA DE CLASIFICACION TAXONÓMICA DE LA MUESTRA VEGETAL ...13 REFERENCIAS BIB LIOGRÁFICAS ...................................................................... 14

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IDENTIFICACION DE ANTIOCIANINAS POR EL METODO DE HPLC INTRODUCCION Las antocianinas pertenecen a un gran y muy distribuido grupo de metabolitos secundarios, que se conocen colectivamente como flavonoides. Las antocianinas naturales más comunes son las 3-O-glicósidos y las 3,5 di-O-glicósidos. Las antocianinas son los componentes que otorgan a las plantas colores rojos, azules, morados, particularmente en partes como frutos, flores y hojas . Estos pigmentos fueron consumidos por los hombres a lo largo de incontables generaciones sin causar aparentemente ningún efecto tóxico. El interés por las antocianinas se ha incrementado debido a su potencial uso como colorantes naturales y por sus potenciales beneficios en la salud. Últimamente, la seguridad de los pigmentos sintéticos ha sido cuestionada, conduciendo a la reducción en el número de colorantes permitidos. Las antocianinas son pigmentos solubles en agua, lo que facilita su incorporación en los sistemas acuosos alimentarios. Estas cualidades hacen que estos colorantes naturales sean atractivos como pigmentos naturales inocuos con considerable potencial en la industria alimentaria de productos con un rango de pH ácido. Además de su color, se ha reportado que las antocianinas tienen beneficios para la salud como potentes antioxidantes y pueden incrementar la agudeza visual. Se ha observado también que poseen actividad antineoplásica, vasotónica, vasoprotectora, anti - inflamatoria y hepatoprotectora. En el Perú existen muchas especies silvestres, una de ellas es Lechler, que crece especialmente alrededor de los campos de cultivo a manera de protección, debido a sus espinas grandes y filudas, sus flores son amarillas y sus frutos morados. Existe información sobre esta especie en Perú desde tiempos de la conquista; especialmente, el cronista Bernabé Cobo describió a esta planta con el nombre común de quiscaquisca, que significa planta espinosa, con unas pequeñas flores amarillas y espinas filudas , cuyos frutos dan un suave color morado cuando son usados como colorante. Asimismo, algunas tradiciones orales, sugieren que estos frutos eran usados por las ñustas durante el Incanato para lavar y cuidar sus cabellos a manera de un champú colorante natural. Miranda A, Martín O. Cromatografía Líquida (HPLC). [WebSite] [Disponible en: http://www.ucm.es/data/cont/docs/650-2013-12-02-gases%20l%C3%ADquidos.pdf] [Citado el 24 de noviembre 2015]

OBJETIVOS

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Determinación e identificación de antocianinas del ayrampo por el método de HPLC.   Identificación de tipos de antocianinas utilizando los métodos de (HPLCMS/MS) y (HPLC-PDA). 

MARCO TEÓRICO

I.

Berberis flexuosa  R. & P.

Arbusto conocido del centro del Perú, de la vertiente del Pacífico y de valles interandinos, en ambientes semixéricos. El tipo de esta especie fue recolectada en la cuenca alta del río Huaura, una zona escasamente herborizada. Otras poblaciones provienen de las cuencas del Santa, Palca y Rimac. Una de las poblaciones es conocida de las laderas con bosques perennifolios en las alturas de Lima. Estas laderas incluyen varios endemismos y deberían recibir atención para su conservación.

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Imagen 01. Muestra de herbario de Berberis flexuosa R. & P.

II.

ANTOCIANINAS

Las antocianinas representan el grupo más importante de pigmentos hidrosolubles detectables en la región visible por el ojo humano. Estos pigmentos son responsables de la gama de colores que abarcan desde el rojo hasta el azul en varias frutas, vegetales y cereales, acumulados en las vacuolas de la célula. Las antocianinas poseen diferentes funciones en la planta como son la atracción de polinizadores para la posterior dispersión de semillas y la protección de la planta contra los efectos de la radiación ultravioleta y contra la contaminación viral y microbiana. Diversos estudios presentan evidencia científica que los extractos ricos en antocianinas pueden mejorar la agudeza visual, mostrar actividad antioxidante, atrapar radicales y actuar como agentes quimioprotectores. Las antocianinas también juegan un papel en las propiedades antidiabéticas tales como control de lípidos, secreción de insulina y efectos vasoprotectivos. Las propiedades funcionales de las antocianinas abren una nueva perspectiva para la obtención de productos coloreados con valor agregado para el consumo humano. El objetivo de esta revisión es ofrecer un panorama actualizado de las propiedades funcionales de las antocianinas, de su potencial como ingredientes alimenticios y su impacto sobre la salud.

Imagen 02.  Tipos de antocianinas

III.

HPLC

La cromatografía líquida (HPLC), es una técnica utilizada para separar los componentes de una mezcla. Consiste en una fase estacionaria no polar (columna) y una fase móvil. La fase estacionaria es apolar. La fase móvil actúa de portador de la muestra. La muestra en solución es inyectada en la fase móvil. Los componentes de

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la solución emigran de acuerdo a las interacciones no covalentes de los compuestos con la columna. Estas interacciones químicas, determinan la separación de los contenidos en la muestra. La utilización de los diferentes detectores dependerá de la naturaleza de los compuestos a determinar.

METODOLOGIA

I.

SOLVENTES

Los frutos secos congelados de Lechler (2,996 g) fueron separados de sus semillas; siendo licuados con una solución agua /acetona (30:70 v/v) y luego se filtró usando un embudo buchner. La torta residual del filtrado fue nuevamente re-extraída con la solución agua /acetona (30: 70 v/v) hasta obtener una solución clara. Los filtrados fueron combinados, llevados a una pera de decantación, agregándose cloroformo. La porción acuosa (parte superior) fue colectada y colocada en un rotavapor Büchi a 40ºC durante 5 a 10 minutos, hasta que la acetona residual se evapora. El extracto acuoso fue llevado hasta un volumen conocido (100mL) usando agua destilada. Se extraen con metanol y los extractos resultantes se tratan con 0.1 % HCL. Los compuestos no polares y flavonoides se separan mediante tratamientos sucesivos con éter de petróleo y acetato de etilo. La solución resultante se analiza en una columna Bondapak C 18 (30 cm x 8 mm d.i.) usando una fase móvil compuesta de agua/ ácido acético/ metanol (71: 10:10) a un flujo de 1.5 mL/ min y la detección se realiza a 530 nm. La delfidina 3.5 diglucósido y la malvidina glucósido fueron los pigmentos mayoritarios encontrados en las cáscaras de uvas, para un 69 % del contenido total de las antocianinas. Este método puede ser usado para determinar el contenido de antocianinas en cualquier tipo de fruto o alimento. El HPLC es el método más común para realizar el análisis de antocianinas. La muestra fue semipurificada usando un cartucho C-18 y la fracción fenólica (conteniendo antocianinas) fue eluida con metanol acidificado con HCl 1%; se evaporó el metanol en un rotavapor Büchi, se utilizó agua acidificada con HCl 0,01% para lograr un volumen conocido y se filtró usando un filtro de polipropileno Whatman de 0,45 m antes de la inyección en el equipo HPLC.

II.

COLUMNAS

Para el estudio, caracterización y determinación de Antocianinas se utiliza una Columna de fase reversa (C18). Esto porque la fase estacionaria debe de ser apolar, las antocianinas que se reconocen en este estudio son del mismo carácter (apolar). La cromatografía en fase reversa (RPC) permite separar moléculas en base a su polaridad. El principio de la cromatografía en fase reversa es semejante al de la cromatografía en capa fina. Aquí la fase estacionaria es una matriz apolar. Por lo UNMSM – FACULTAD DE FARMACIA Y BIOQUIMICA

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tanto, para este tipo de cromatografías se emplean mezclas de solventes polares, tales como agua, acetonitrilo, acetato de etilo, acetona y alcoholes alifáticos. En virtud de lo anterior, este tipo de cromatografía ha sido también llamada como cromatografía de interacción hidrofóbica (HIC). En general, este último término se ha empleado para referirse a las aplicaciones en las que se emplean sustituyentes y matrices compatibles con fluidos biológicos. El sistema C18-HPLC requiere una mezcladora de solventes, un inyector, y una bomba que inyectan líquido a la columna. Generalmente las columnas de sílica requieren alta presión para que el flujo de líquido sea adecuado, la mezcladora se requiere para variar la proporción de solvente en la fase móvil y el inyector permite la aplicación de la muestra. Es importante distinguir entre dos formatos de fase con enlace distinto. El formato C18 de tipo monomérico incorpora enlaces de cadenas alquil C18 a un único átomo de sílice sobre la estructura del gel de sílice. Las columnas de tipo monomérico como son las COSMOSIL C18-MS-II y la serie MS tiene una excelente reproducibilidad de síntesis, muy buena reproducibilidad lote a lote y cortos periodos de tiempo para la estabilización de la fase móvil. Por otro lado el formato C18 polimérico incorpora un proceso de silanización trifuncional por el que el grupo octadecil se une a 2 o 3 átomos de sílice sobre la estructura del gel de sílice. Esto aumenta el efecto de la silanización lo que proporciona una estabilidad de columna mucho mayor, particularmente en condiciones ácidas de la fase móvil. La capacidad de reconocimiento estérico también es mucho mayor que las de las columnas C18 del tipo de silanización monofuncional. COSMOSIL ofrece el formato polimérico en ls AR-II y la serie completa AR-300. En este caso se utilizaría una columna de fase reversa (Supelco AscentisTMC18 25cmx4.6mm, 10μm), debido a su facilidad de mantenimiento y bajo costo.

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Imagen 03. Descripcion de C18

III.

Imagen 04.  C-18

DETERMINACIÓN DE LAS ANTOCIANINAS POR CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTA RESOLUCIÓN (HPLCPDA)

El HPLC es el método más común para realizar el análisis de antocianinas. La separación real de cada componente en la muestra se realiza dentro de una columna, sin embargo esta separación tiene que ser “registrada” para que seamos capaces de verlo. Los detectores se utilizan para este propósito. Los componentes separados se controlan y se expresan electrónicamente. No hay detector universal que puede controlar todos los compuestos y hay muchos detectores utilizados para el análisis LC. Los detectores UV, VIS, y PDA se clasifican como detectores de absorbancia. Proporcionan una buena sensibilidad para que compuestos que absorbe la luz a nivel ~ pg. Son fáciles de operar y proporcionar una buena estabilidad. El detector PDA detecta un espectro completo de forma simultánea. Detectores UV y VIS visualizar el resultado obtenido en dos dimensiones (intensidad de la luz y el tiempo), pero PDA añade la tercera dimensión (longitud de onda). Esto es conveniente para determinar la longitud de onda más adecuada sin repetir los análisis. La muestra fue semipurificada usando un cartucho C-18 y la fracción fenólica (conteniendo antocianinas) fue eluida con metanol acidificado con HCl 1%; se evaporó el metanol en un rotavapor Büchi, se utilizó agua acidificada con HCl 0,01% para lograr un volumen conocido y se filtró usando un filtro de polipropileno Whatman de 0,45 m antes de la inyección en el equipo HPLC. La separación de las antocianinas se llevó a cabo en una columna C-18Waters Symmetry (4,6mm x 150mm, 3,5m) usando un sistema HPLC que constaba de un UNMSM – FACULTAD DE FARMACIA Y BIOQUIMICA

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módulo de separación Waters 2695, equipado con un detector con arreglo de fotodiodos (PDA) Waters 2996, un software Empower y un automuestreadorWaters 717 plus. El rango de flujo fue de 0,8 mL/min; la fase móvil: A, ácido fórmico al 10% en agua grado HPLC; B, acetonitrilo; la gradiente utilizada fue: 0-1 min 95% A y 5% de B; 2 min 90% A y 10% B; 20 min 80%Ay 20% B y a los 25 min 95%Ay 5% B. Se realizó una detección simultánea a las longitudes de onda: 520 nm para antocianinas, 280 nm para compuestos fenólicos y a 320 nm para ácidos cinámicos. La identificación de los picos de las antocianinas fue realizado en base a la comparación de los cromatogramas y tiempos de retención de los extractos concentrados de antocianinas de las especies (Vistis vinifera) y (Zea mays), corridos bajo las mismas condiciones especificadas anteriormente. Previamente, se utilizó un espectrofotómetro UV- visible Hewllet Packard 8453; las mediciones fueron realizadas a 520 (máxima longitud de onda determinada) y a 700 nm. (CARACTERIZACIÓN DE LAS ANTOCIANINAS DE LOS FRUTOS Berberis boliviana Lechler. Universidad Nacional de San Antonio Abad del Cusco, Av. De La Cultura 733, Cusco, Perú. )

IV.

DETERMINACIÓN DE LAS ANTOCIANINAS POR CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTA RESOLUCIÓN (HPLCMS/MS)

La espectrometría de masas se basa en la medida directa de la relación de la masa con el número de cargas elementales positiva o negativa de los iones (mz) en la fase gaseosa obtenida de la sustancia a analizar. Esta relación se expresa en unidades de masa atómica (u), (1u= la doceava parte de la masa de un átomo de carbono 12) o en daltons (1 Da= a la masa del átomo de hidrógeno). En este estudio se han utilizado, el análisis del ion precursor, análisis del producto iónico, análisis de pérdida neutral común y la monitorización selectiva de reacción, que son parte de la espectrometría de masas tandem (MS-MS), la cual tiene la ventaja de lograr dos separaciones de los componentes de la muestra, siendo ambas separaciones iónicas; debido a esta especificidad, esta técnica es usada para lograr análisis cuantitativos de analitos en mezclas simples en cuestión de minutos sin necesidad de una separación cromatográfica u otro tratamiento químico que elimine interferentes. La caracterización de cada una de las antocianinas se realizó utilizando la monitorización selectiva de reacción (SRM), y el análisis del ion precursor, el cual detecta todos los iones precursores en una muestra que se fragmenta como un producto iónico común en tanto que el análisis de pérdida neutral común detecta aquellos iones precursores que se fragmentan para producir iones con una diferencia común en producida por la pérdida de un fragmento característico de un producto o de una familia de compuestos . La separación de las antocianinas fue llevada a cabo en una columna C-18 Waters Symmetry (4,6 x 75 mm, 3,5m); se usó un túnel de triple cuadrupolo (Quattro Ultima, Micromass, UK Limited, Manchester, UK). El rango de flujo del HPLC se estableció en 1 mL/min, la fase móvil: A, ácido fórmico al 10%; B, acetonitrilo; la gradiente usada; 0-20 min, UNMSM – FACULTAD DE FARMACIA Y BIOQUIMICA

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100%-85% A; 20-25 min, 85%-100% A. El espectro de absorción de las antocianinas fue realizado en el rango 200 – 600 nm. Los espectros de masas fueron obtenidos usando la Monitorización Selectiva de Iones (SIM). Aproximadamente 100 L del eluato del HPLC fueron separados por una microválvula y se depositaron en la fuente ESI. El cuadrupolo fue operado según las siguientes condiciones: Voltaje capilar 3,2 kV, voltaje de cono 35 V, RF lense 1,50 V, temperatura del gas de desolvación 500ºC con un flujo de 269 L/h, temperatura de la fuente 105ºC, presión de colisión de gas (argón) 7 psi; la energía de colisión fue establecida en 25 eV. En algunos casos en los que los pesos moleculares son idénticos y no se puede distinguir entre uno y otro, es necesario acudir a un método que nos pueda aclarar la identidad de las sustancias; por ejemplo, tanto glucosa como galactosa, son azúcares presentes en una gran cantidad de antocianinas, tienen el mismo peso molecular, por lo que a través de un espectro de masas es imposible diferenciarlos, en nuestro caso la diferenciación fue posible gracias al análisis HPLC utilizando extractos concentrados de antocianinas de variedades conocidas y cuyos perfiles antociánicos están bien establecidos, constituyendo éste un método rápido, sencillo y barato de identificación.

RESULTADOS Al someter el hidrolizado a un análisis HPLC, se verificó la presencia de 5 aglicones; simultáneamente, se realizó la hidrólisis y posterior análisis HPLC de un extracto concentrado de antocianinas, Vitis vinifera (Uva) para tener patrones de comparación que nos ayuden a identificar los picos del cromatograma. Todas las muestras fueron analizadas bajo las mismas condiciones. Al comparar los cromatogramas (figura 1), el perfil de elución de las antocianidinas presentes Berberis flexuosa R. & P. coincide exactamente con los frutos de Vitis vinífera, que es una fuente muy conocida y bien estudiada de 5 aglicones: cianidina, delfinidina, malvidina, peonidina y petunidina. Asimismo, se pudieron identificar sólo 5 antocianinas como se muestra en el cromatograma, estas son: delfinidina-3glucósido, cianidina-3-glucósido, petunidina-3-glucósido, peonidina-3-glucósido y malvidina-3-glucósido. Berberis flexuosa R. & P.

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Vitis vinífera

Imagen 05. Cromatogramas de comparación obtenidos a 520nm de las especies Berberis flexuosa R. & P. y Vitis vinífera obtenidos luego de haber realizado la hidrólisis ácida correspondiente. En la especie Vitis vinífera, se encuentran 5 antocianidinas.

En la determinación de antocianinas por cromatografía líquida de alta resolución (HPLC-PDA) se obtuvieron cromatogramas a diferentes longitudes de onda, 280nm, 320nm y 520nm con la finalidad de determinar antocianinas, como se muestra en la figura 2. Al comparar los cromatogramas (B) y (C) de la figura 2, correspondientes a 520 nm y 280 nm, respectivamente, se verifica que las antocianinas serían los únicos compuestos fenólicos presentes en los frutos de Berberis flexuosa R. & P., debido a que no existen diferencias significativas entre ambos cromatogramas; este hecho es sumamente importante debido a que se trataría de una fuente natural de composición exclusivamente antociánica.

Imagen 06. Los cromatogramas obtenidos a diferentes longitudes de onda, nos muestra que las antocianinas presentes en los frutos de Berberis flexuosa R. & P, están casi puras, debido a que a 280nm (C),que es longitud de onda a la cual se pueden identificar otros

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componentes fenólicos sólo aparecen las antocianinas, por lo que se puede considerar a estos frutos como una fuente casi pura de antocianinas.

CONCLUSIONES   

Se obtuvo antiocianinas del ayrampu por el método de HPLC Se demostró y cuantifico las antiocianinas del ayrampu por los métodos de HPLC- MS/MS y HPLC-PDA. Se comparó las antiocianinas del ayrampu con la uva por el método de HPLCMS/MS.

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 ANEXOS FICHA DE CLASIFICACION TAXONÓMICA DE LA MUESTRA VEGETAL

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REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS Miranda A, Martín O. Cromatografía Líquida (HPLC). [WebSite] [Disponible en: http://www.ucm.es/data/cont/docs/650-2013-12-02gases%20l%C3%ADquidos.pdf] [Citado el 24 de noviembre 2015] Esquivel Soto. CROMATOGRAFÍA DE  Leal Guadarrama, FASE REVERSA. UNAM 2004. [WebSite] [Disponible en: http://www.ibt.unam.mx/computo/pdfs/met/cromatografia_de_fase_reversa. pdf] [Citado el 24 de noviembre 2015]  López Ramírez, Winston Quiñones, Fernando Echeverri. PERFIL CROMATOGRÁFICO DE LAS ANTOCIANINAS PRESENTES EN ALGUNOS FRUTOS COLOMBIANOS. Scientia et Technica Año XIII, No 33, Mayo de 2007   Aguilera Ortíz, Reza Vargas, Chew Madinaveitia, Meza Velázquez. PROPIEDADES FUNCIONALES DE LAS ANTOCIANINAS. Facultad de Ciencias Químicas. Universidad Juárez del Estado de Durango. Av. Artículo 123 s/n. Fracc. Filadelfia. 35010. Gómez Palacio, Durango, México.  GARZÓN G, LAS ANTOCIANINAS COMO COLORANTES NATURALES Y COMPUESTOS BIOACTIVOS. Acta biol. Colomb., Vol. 13 No. 3, 2008.  Biswas, G; Sarkar, S.; Chatterjee, T.K.; Mukherjee, S.P. Determination of anthocyanins in fruits of Vitis vinifera by HPLC. J. Inst- Chem. 65 (2): p. 52, 1993.  Bakker, J; Bridle, P; Bellworthy, SJ. Strawberry juice colour: a study of the quantitative and qualitative pigment composition of juices from 39 genotypes. J. Sci. Food. Agric. 64 (1): p. 31-37, 1994.  Gao, L.; Mazza, G. Characterization of acetylated anthocyanins in lowbush blueberries .J. Liq. Chromatogr. 18 (2): p. 245- 259, 1995.   Berberidaceae endémicas del Perú. Rev. peru. biol. Número especial 13(2): 171s - 173s (Diciembre 2006). Carmen Ulloa Ulloa , Abundio Sagástegui e Isidoro Sánchez. El libro rojo de las plantas endémicas del Perú. Ed.: Blanca León et al. Facultad de Ciencias Biológicas UNMSM 

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“Farmacia y bioquímica carrera a la vanguardia de las ciencias de la salud, el conocimiento libera nuestras capacidades y la bu ena enseñanza se reflejará en nuestro liderazgo profesional”

ANÁLISIS POR ESPECTROSCOPÍA DE ABSORCIÓN ATÓMICA DE Berberis flexuosa Curso: QUÍMICA ANALÍTICA INSTRUMETAL Dra. Norma Angélica Carlos Casas

Arredondo Nuñez, Annsy Camila López Chagua Ayrlton Jhonny Ocros Meza Katherine Pamela Quispe Molina, Brayanm Giancarlos Ysmael Serrano Cervantes Lisbet Karina 1

ANÁLISIS POR ESPECTROSTROSCOPÍA DE ABSORCIÓN ATÓMICA EN MUESTRA HIDROALCOHOLICA DE Berberis Flexuosa ANALYSIS BY SPECTROSTROSCOPY ATOMIC ABSORPTION IN HYDROALCOHOLIC SAMPLE OF  Berberis Flexuosa INTRODUCCIÓN a espectroscopia de absorción atómica es un método de detección y la determinación de elementos químicos,  particularmente de elementos metálicos. Los compuestos para, para su examen, se tienen que romper en los átomos que los constituyen 1.

L

En este caso se usara este tipo de espectroscopia  para la determinación y cuantificación de calcio en una muestra de  Berberis Flexuosa  más conocida como (Ayrampo). La  Berberis Flexuosa es un arbusto silvestre que se desarrolla en algunas zonas altoandinas entre los 2500 y 4500 msnm. En la época incaica fue utilizada como una planta con múltiples funciones y usos, principalmente en la medicina tradicional. Es un arbusto rústico de  porte leñoso que crece en difícil condiciones de suelo, agua y temperatura. Se cosecha entre los meses de abril, mayo y junio, cuando presenta un color guindo o lila muy oscuro y suave. Los frutos maduros se comen crudos y con ellos se  preparan bebidas y mazamorras. Es una importante fuente de minerales y vitaminas. Asimismo, es un efectivo febrífugo, laxante y tónico. La infusión de las hojas se utiliza contra el nerviosismo. La infusión de las flores actúa contra el cansancio y la anemia. La infusión de la raíz combate la disentería amebiana. La infusión de la raíz machacada estimula la retención de orina 2. El método oficial del AOAC 985.35 para cuantificar el contenido de calcio en alimentos utiliza la técnica de espectrometría de absorción atómica con llama la cual se basa en la destrucción de la materia orgánica por vía seca hasta lograr la digestión del alimento para  posteriormente solvatar los residuos con ácido nítrico diluido para la posterior determinación

del o los analitos por Espectrofotometría de Absorción Atómica con llama 3. Con dicho método se evaluó el contenido de este mineral en la  Berberis Flexuosa conocida como Ayrampo. El calcio es un macro mineral indispensable  para la formación de huesos y dientes, la contracción muscular y el funcionamiento del sistema nervioso; también interviene en la coagulación de la sangre y en la actividad de algunas enzimas. Sin embargo, la mayoría del calcio en el organismo se encuentra en los huesos y en los dientes. Una manera de prevenir la deficiencia de calcio en el organismo es por medio de una dieta rica en alimentos que lo contengan, por ejemplo, productos lácteos (quesos, yogurt), espinacas, mostaza, rábano,  brócoli, frijoles y ajonjolí 4.

MATERIALES Y MÉTODOS Materiales y reactivos: 

100 gr. de fruto seco de Ayrampo



1L de Etanol de 70°



Ácido nítrico al 65%



Cloruro de potasio al 25 %



Espectrofotómetro de absorción atómica Shimadzu AA 7000 con llama de óxido nitroso/acetileno



Patrón de 1000 mg/L de calcio



Pipeta de 10 mL.



Balones aforados ( 20 mL , 250 mL , 500 mL )



Bureta de 10 mL



Bureta de 50 mL

Métodos 2

La muestra fue recolectada del departamento de Ayacucho (Perú), y llevada al laboratorio para  preparar el extracto. Se pesó 100 g del fruto seco Ayrampo, el cual fue sometido a extracciones en maceración con etanol de 96 o, a temperatura de 25 ºC en un recipiente de vidrio cerrado y protegido de la luz por una semana;  posteriormente se licuó y se dejó por una semana adicional; se separó la solución etanólica del respectivo marco mediante filtración. Por último, se recolectaron todos los filtrados en un solo recipiente. 5 La parte experimental consistió en siete ensayos en los cuales se corrieron las muestras patrón (curva de calibración), los estándares y las muestras naturales (matriz de agua cruda y tratada) y el registro de los resultados para cada grupo de ensayos. 5

se le adiciona ácido nítrico al 65% y cloruro de potasio al 25 %, al igual que a las muestras estándares o muestras preparadas, las muestras se van a leer en el espectrofotómetro de absorción atómica Shimadzu AA 7000 con llama de óxido nitrosoacetileno. 5 3. Preparación de soluciones 



1. Fundamento del método

Se basa en la destrucción de la materia orgánica por vía seca hasta lograr la digestión del alimento (Ayrampo) para  posteriormente solvatar los residuos con ácido nítrico diluido para la posterior determinación del analito por Espectrofotometría de Absorción 3 Atómica con llama.



2.  Método de análisis

El método de análisis para la determinación de calcio espectrofotómetro de absorción atómica. Para la realización de este trabajo, se inició con una revisión documental del método, posteriormente se hicieron ensayos con patrones y muestras con el objeto de operar el equipo 5 adecuadamente. 2.1 Procedimiento estándar

Se prepararán sustancias patrón para la curva de calibración de calcio a las cuales se le agregara ácido nítrico al 65% para la conservación de la muestra y cloruro de potasio al 25% para evitar las interferencias de otros analitos en la lectura de las muestras, a la muestra (muestra natural) que se le va a medir calcio



Solución de cloruro de Potasio (KCl): El cloruro de potasio se  prepara disolviendo 25 g de cloruro de potasio sólido, en agua desionizada y se afora en un balón aforado de 100 mL. Solución madre de Calcio de 500 mg/L: Esta solución se prepara tomando 10 mL del patrón de 1000mg/L de Calcio con una pipeta aforada de 10 mL, el cual se lleva a un balón aforado de 20 mL y se afora con agua desionizada. Solución madre de Calcio de 20 mg/L: Esta solución se prepara tomando 5 mL de la solución de 1000 mg/L de calcio por medio de una pipeta aforada de 5 mL, el cual se lleva a un balón aforado de 250 mL se le adiciona 2,5 mL de ácido nítrico al 65% y se afora con agua desionizada. Solución madre de Calcio de 12,5 mg/L : Esta solución se prepara tomando 12,5 mL de la solución de 500 mg/L de calcio por medio de una bureta de 10 mL, el cual se lleva a un balón aforado de 500 mL y se le adiciona 5 mL de ácido nítrico al 65% y se afora con agua desionizada.

4. Preparación de patrones para la curva de calibración:

Para la validación del calcio se  prepararon una serie de patrones de concentraciones conocidas para la curva de calibración: 3

Se prepararon una serie de muestras  patrón de diferentes concentraciones a  partir de una solución madre de calcio,  para realizar un análisis de linealidad,  para definir el rango óptimo de concentración de la curva de calibración. Para esto se realizaron unos ensayos para definir estos valores de concentración. El  procedimiento para la preparación de las soluciones patrón para la curva de calibración se muestra a continuación: 











Patrón de 0,0 mg/L blanco de reactivos: Esta solución contiene agua desionizada más los reactivos, como son 2,5 mL de cloruro de  potasio (KCl) al 25%, 2,5 mL ácido nítrico al 65% y se afora en un balón de 250 mL. Patrón de 0,75 mg/L: Se tomaron 15 mL de solución madre de Calcio en un balón aforado de 250 mL, se le adiciona 2,5 mL de cloruro de  potasio (KCl) al 25%, 2,5 mL ácido nítrico al 65% y se afora. Patrón de 1,00 mg/L: Se tomaron 20 mL de solución madre de 12,5 mg/L de Calcio en un balón aforado de 250 mL, se le adiciona 2,5 mL de cloruro de potasio (KCl) al 25%, 2,5 mL ácido nítrico al 65% y se afora. Patrón de 1,50 mg/L: Se tomaron 30 mL de solución madre de 12,5 mg/L de Calcio en un balón aforado de 250 mL, se le adiciona 2,5 mL de cloruro de potasio (KCl) al 25%, 2,5 mL ácido nítrico al 65% y se afora. Patrón de 2,00 mg/L: Se tomaron 40 mL de solución madre de 12,5 mg/L de Calcio en un balón aforado de 250 mL, se le adiciona 2,5 mL de cloruro de potasio (KCl) al 25%, 2,5 mL ácido nítrico al 65% y se afora. Patrón de 3,00mg/L: Se tomaron 60 mL de solución madre de12,5 mg/L de Calcio en un balón aforado de 250 mL, se le adiciona 2,5 mL de cloruro de potasio (KCl) al 25%, 2,5 mL ácido nítrico al 65% y se afora.

Patrón de 4,00 mg/L: Se tomaron 80 mL de solución madre de 12,5 mg/L de Calcio en un balón aforado de 250 mL, se le adiciona 2,5 mL de cloruro de  potasio (KCl) al 25%, 2,5 mL ácido nítrico al 65% y se afora. 

 Nota: Todos los volúmenes para la  preparación de los patrones se midieron con una bureta de 10 mL y de 50 mL; menos los del cloruro de potasio y ácido nítrico que se toman con una pipeta graduada. 5.  Muestra de análisis

Preparación de las soluciones estándar  para el calcio: Se prepararan una serie de muestras estándar a partir de una solución madre de 12,5 mg/L de calcio, esta es la misma solución madre utilizada en la preparación de las soluciones patrón, los estándares se utilizaran para la corroboración del método, ya que con el estándar de concentración baja se calcula el límite de detección del método, para la determinación del calcio por espectroscopia de absorción atómica de llama y con los otros dos estándares se verificara el 50% y el 90% de las concentraciones de las soluciones patrón (soluciones de la curva de calibración). Para esto se realizaron unos ensayos para definir estos valores de concentración. El  procedimiento para la preparación de las soluciones estándar se muestra a continuación5 



Estándar de 0,5 mg/L: Se tomaron 10 mL de solución madre de 12,5 mg/L de Calcio en un balón aforado de 250 mL, se le adiciona 2,5 mL ácido nítrico al 65%, 2,5 mL cloruro de potasio al 25% y se afora a 250 mL Estándar de 1,8 mg/L: Se tomaron 36 mL de solución madre de 12,5 mg/L de Calcio en un balón aforado de 250 mL, se le adiciona 2,5 mL ácido nítrico al

4



65%, 2,5 mL cloruro de potasio al 25% y se afora a 250 mL. Estándar de 3,6 mg/L: Se tomaron 72 mL de solución madre de 12,5 mg/L de Calcio en un balón aforado de 250 mL, se le adiciona 2,5 mL ácido nítrico al 65%, 2,5 mL de cloruro de potasio al 25% y se afora.

6.  Digestión de la muestra

Moler y homogeneizar la muestra. 3 Si la digestión es muy fuerte puede  presentarse pérdida de muestra y por consiguiente de analito o se puede  presentar sequedad de la muestra y el analito queda adherido al envase contenedor y se ocasione disminución en su concentración. 6 7. Medición por Espectrofotometría de Absorción Atómica: Antes de realizar la determinación de la muestra mediante Absorción atómica debemos verificar el buen funcionamiento del equipo a utilizar. Para ello debemos calibrar el equipo 8. Parámetros instrumentales para la determinación de Calcio Longitud de Onda (λ): 422.7 nm. 

Ancho de Banda: 0.5 nm. Corriente de lámpara (CH): 100% uso normal. Corrección de Fondo: Ninguno Tipo de llama recomendada: Óxido Nitroso/Acetileno*. Intervalo flujo de combustible: 4.0 a 4.4 L/min. *Se recomienda la utilización de este tipo de llama puesto que este elemento (calcio - Ca) tiene un punto de ebullición muy alto y puede formar óxidos con el aire muy estables y difíciles de disociar,  por lo que este tipo de llama provee una temperatura entre (2500 a 3100) °C capaz de romper los enlaces formados  por este elemento y el aire (oxigeno) y así poder cuantificar calcio en su estado iónico elemental. 6  

 



9.  Metodología utilizada en Cenprofarma

Como no se sabía la concentración del ayrampo se tomó 1 ml del extracto filtrado y de ahí se ahí se llevó a una fiola de 50 ml y se agregó el supresor, que en este caso fue el cloruro de lantano (LaCl) al 0,1%, para eliminar la interferencia con otros metales y de ahí se procedió a leer en el equipo. Se hizo la curva de calibración, la cual se trabajó a partir de una solución madre de 1000 ppm se preparó concentraciones 0,5ppm, 1ppm, 2ppm y 4ppm dándonos un coeficiente de relación de 0,99 lo que indicaba que la curva pasa. Primero se lee el blanco que fue el cloruro de lantano al 0,1% luego pasa cada estándar y sale la curva de calibración. Una vez que se tenga la muestra  preparada se lee en el equipo y te sale la concentración de la muestra problema el cual fue 0,650 ppm de acuerdo a eso se realiza los cálculos (se pesó 1ml y se llevó a una fiola de 50 ml) haciendo los cálculos sale 32,5 µg de calcio/ml de extracto. Se utilizó estándar de calcio puro y el diluyente para todos fue cloruro de lantano El espectrofotómetro de absorción atómica utilizado fue de marca Perkin Elmer Para que se produzca la flama se necesita acetileno-aire combustible comburente para que se produzca la atomización de la muestra.

RESULTADOS 5

PRUEBA

ESPECIFI CACIÓN

MÉTODO

ascórbico, componente que participa en el metabolismo activo del calcio que contribuirá en su retención 7.

RESULTADO



-

3,25 mg

CUANTIFICACIÓN:

ABSORCIÓN

CALCIO

ATÓMICA

Ca/100ml de extracto etanólico de Ayrampo

Tabla 1. Resultados de la cuantificación de calcio por el

método de espectroscopia de absorción atómica de la muestra preparada.

DISCUSIÓN 

El proyecto partió de 10ml de muestra macerada en dilución hidroalcólica, el cual se sometió a análisis obteniéndose como resultado de una espectroscopia de absorción atómica una concentración de 3.25mg/100mL de Ca. Se sabe que dicha maceración partió de 100gr. de muestra seca, la cual fue llevada a 1 litro de alcohol de 76° por 4 días, además se puede inferir que la distribución de estos metales contenidos en la planta se distribuyeron en el solvente de manera homogénea; además este valor obtenido no supone como referente al contenido total de calcio de la  planta, ya que solo se sometió a estudio  parte de dicho macerado; por tanto el resultado obtenido de 3,25mg/100ml de Ca total en la alícuota se aproximó tomando como referente el volumen total del macerado, es decir, si una alícuota de 10 ml de muestra contiene 0,325mg de Ca, así 1 litro contendrá 32mg de Ca, esto es en 100mg de muestra total. El intervalo de alimentos presuntos como ricos en concentración de calcio llegan entre 44 a 500 mg/100gr de porción consumida 8 así la muestra en estudio no puede ser considerada como fuente enriquecida de Ca; sin embargo más que presencia de solo calcio para la clasificación del alimento también es debe dar la evaluación de la  presencia conjunta en el alimento del ácido

En el presente estudio se partió de una muestra macerada en solución hidroalcóholica, alternativamente el tratamiento se podría haber presentado por un  procedimiento por el método AOAC, para ello se debe partir de una muestra seca molida y homogénea, la cual pasará por un tratamiento de mufla a una temperatura 100°C y luego llevado a 525°C. Luego de ello se pasará la digestión de las cenizas que se hará con HNO 3 65% y KCl al 25% 6; aquí se pretende eliminar todo material orgánico presente, quedando solo residuos de los minerales en la muestra, así se eliminaría casi en su totalidad los interferentes que hubiesen necesitado una  preparación más trabajosa del placebo. Asimismo, se tiene entendido que el medio hidro-alcólico en un estudio por espectroscopia de absorción atómica no es óptimo por no decir que no es dable 9; sin embargo, si la muestra fue llevada a análisis en esas condiciones se concluye que el tratamiento posterior a la muestra en maceración logró darle las condiciones adecuadas para dicha lectura.

CONCLUSIÓN 





Es importante la determinación y cuantificación del Calcio en especies vegetales que posiblemente tengan un contenido óptimo de calcio para así  poder aprovechar las ventajas de este mineral al consumir plantas como la conocida como  Berberis Flexuosa Ayrampo. Se determinó y cuantifico el calcio por espectroscopia de absorción atómica en la muestra de  Berberis Flexuosa  que tiene un valor de 3,25 mg Ca/100Ml de extracto etanólico. Al determinar la existencia de calcio en la  Berberis Flexuosa es posible aprovechar estos datos para así poder 6

generar un mayor consumo de esta  planta.

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 1. Frederic Walton H. Reyes J. Análisis químico e instrumental moderno.Barcelona:Reverte; 2005 . Pág 98 2. Características del Ayrampo.(Sitio web). (Citado el 20 de noviembre del 2015). Disponible en: http://www.fao.org/fileadmin/templates/ aiq2013/res/es/recetarioandino.pdf  3. Procedimiento para determinación de sodio, potasio y calcio en alimentos. (Sitio web). (Citado el 20 de noviembre del 2015). Disponible en: http://www.ispch.cl/sites/default/files/do cumento_tecnico/2010/03/PRT-711.02012%20V1%20%20Determinacion%20  Na-K%20y%20Ca.pdf  4. GUIAS ALIMENTARIAS PARA LA EDUCACION NUTRICIONAL EN COSTA RICA (CALCIO). (Sitio web). (Citado el 20 de noviembre del 2015). Disponible en: http://www.ministeriodesalud.go.cr/gest ores_en_salud/guiasalimentarias/calcio.p df  5. Londoño P.D. Validación del método de determinación de calcio y magnesio por espectroscopia de absorción atómica de llama para el laboratorio de análisis de aguas y alimentos de la Universidad Tecnológica de Pereira. Universidad Tecnológica de Pereira Facultad de Tecnología Escuela de Química. 2013. Pág 34-48. 6. Gómez H. D. Validación de la metodología por el método estándar 3111ª – absorción atómica para el análisis de metales pesados en muestras de aguas y aguas residuales. Universidad tecnológica de Pereira. Facultad de Tecnologías Escuela de Tecnología Química. 2011. Pág.59 7. Fernández A, Sosa P, Setton D. Calcio y nutrición. Buenos Aires: Sociedad Argentina de Pediatría; 2011 Julio

(actualizado Jul 2011) Disponible en: http://www.sap.org.ar/docs/calcio.pdf  8. Standard Tables of Food Composition in Japan Fifth Revised Edition. (2001).  Journal for the Integrated Study of  Dietary Habits, 12(2), Pág.86-89.

9. Anon, 2015. (Sitio Web). (Citado el: 23 de noviembre del 2015). Disponible en: http://rua.ua.es/dspace/bitstream/10045/ 8252/4/T7Abasorc.pdf 

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UNIVERSIDAD NACIONAL MAYOR DE SAN MARCOS Universidad del Perú, DECANA DE AM ÉRICA

FACULTAD DE FARMACIA Y BIOQUÍMICA

DEPARTAMENTO ACADÉMICO DE QUÍMICA BÁSICA Y APLICADA

ANALISIS ESPECTRAL UV PARA

ANTOCIANINAS USANDO REACTIVOS DE DE SPLAZAMIENTO Alumnos:  

Sand ra Ivonne Irkñampa Gallardo Pedro Alejand ro Mesías Sánchez 

Deidy Ramírez Garibay Grup o: 

Miércoles 2

a

6 pm

Prof esor: 

Norma Carlos Cas as

2015

OBJETIVOS

Determinar

los diferentes desplazamientos de bandas a través de los diferentes solventes utilizados.

Corroborar

los diferentes desplazamientos batocrómicos e hipsocromicos brindada por la bibliografía utilizada.

Introducción

Las antocianinas son compuestos fenólicos del grupo de los flavonoides. Se encuentran en la naturaleza, en algunos frutos que van del color rojo al azul como los arándanos, las cerezas, las ciruelas o las uvas. Estos compuestos actúan, por ejemplo, en el organismo humano como protectores de los capilares de la retina, desempeñando un papel fundamental en la buena conservación de la vista. Además parecen tener entre otras, propiedades antivirales y hemostáticas, por lo que pueden desempeñar un papel positivo frente a infecciones así como detener sangramientos en el ser humano. Protegen al corazón de enfermedades cardiovasculares y tienen como el resto de los flavonoides, un valor antioxidante (1). Su fórmula básica está conformada por dos anillos aromáticos unidos por una estructura de tres carbonos. En su forma natural, esta estructura se encuentra esterificada a uno o varios azúcares, en cuyo caso se denominan antocianinas simples. Si además del azúcar en la molécula existe un radical acilo, entonces son antocianinas aciladas (2). El presente trabajo es una reseña bibliográfica sobre las características espectroscópicas de las antocianinas en la zona visible del espectro de absorción así como diversos métodos espectroscópicos (UVVisible); esta técnica es usada para identificar el tipo de flavonoides o el modelo de oxigenación. Este último puede además ser mejor definido por el uso de reactivos de desplazamientos los cuales, como su nombre lo indica provocan el desplazamiento de las bandas de absorción. Los espectros de los flavonoides son determinados usualmente en solución metanólica.

METODOLOGÍA

1. MATERIALES INSTRUMENTOS • • • • • • •

Fiola de100 ml Fiola de 25 ml Pipetas de 5ml y 1 ml Espectrofotómetro Uv –vis Celdas de vidrio Celdas de cuarzo para Uv - visible Agua destilada

SOLVENTES • • • •

Cloruro de aluminio Metanol HCl 1N Metoxido de sodio

PARTE EXPERIMENTAL

1. EXTRACCIÓN DE ANTOCIANINAS

Para la extracción de antocianinas del fruto de Berberis flexuosa más conocida como “ayrampo” se pesó 100 g para macerarlo en etanol 76° se dejó reposar por 2 días, se redujo el tamaño para maximizar el nivel de extracción, se procedió a filtrar el licuado, conservando el extracto en frascos ambar y cubiertos alejados de la luz, para que las antocianinas no se desnaturalicen por la presencia de éstas.

Extracto de Berberis flexuosa

Para obtener una mejor resolución en el espectrofotómetro, se llevó acabo la extracción de alcohol del extracto hidroalcohólico, lo cual primero se utilizó una secadora para poder eliminar menores proporciones de humedad, luego se llevó el extracto a la estufa a una temperatura de 30 °C durante 24 horas.

Extracto en estufa a 30°C

Secadora

Se obtuvo un extracto con un porcentaje bajo de etanol

Extracto con mínima proporción de etanol en su composición

2. CARACTERIZACIÓN DE ANTOCIANINAS POR MÉTODOS ESPECTROFOTOMÉTRICOS

Se empleó el espectrofotómetro marca Genesys 100S UV-Vis haciendo uso de celdas de cuarzo, con la ayuda de un Software Visionlite.

Espectrofotómetro marca Genesys modelo 100S UVVisible

Se preparó las siguientes soluciones de reserva: 

EXTRACTO CON METANOL: Se midió un volumen 0.1 ml del extracto seco de flavonoide y se disolvió en 10 ml de metanol, llevará por nombre Reserva Matri z.

Metanol



METÓXIDO DE SODIO: El siguiente reactivo utilizado fue metóxido de sodio, durante su preparación se pesó 0.624 g de Na metálico recién cortado y se disolvió en 25 ml de metanol.

Solución de metóxido de sodio



TRICLORURO DE ALUMINIO: Se Agregó 5.067 gr de AlCl3 anhidro en 100 ml de metanol.

Tricloruro de aluminio (AlCl3) al 5% en metanol



ÁCIDO CLORHÍDRICO: Se utilizó una solución de 1N de HCl.

HCl 1N

3. ANÁLISIS ESPECTRAL 

Se preparan 2 celdas de cuarzo una usada para la muestra matriz antes de su uso se lava con unos pocos ml de la solución de reserva matriz y para la solución blanco se vierte 10 ml de metanol, el espectro muestra un pico a 535 nm con una absorción de 0.755.

Medición de volumen de flavonoide Medición de metanol 

Un tubo de ensayo A contiene la reserva matriz, a esta se le agrega 3 gotas de la solución de metóxido de sodio, y el tubo de ensayo B es preparada para usarla como blanco, se lavó una celda con el contenido del tubo A y se vertió procurando que no enrace, el contenido del tubo B se destinó para la celda blanco y se procedió a la caracterización a 525 nm y con una absorción 0.354.

Adición de 3 gotas de solución de metóxido de sodio a la reserva matriz.



De la reserva matriz se vierte 6 ml a un tubo de ensayo y se agregan 3 gotas de la solución de tricloruro de aluminio y se lava una celda destinada para la muestra, y a la celda para el blanco se lava con la misma proporción 6 ml de metanol y 3 gotas de tricloruro de aluminio, vertiendo el contenido procurando que no enrace, se caracterizó a una longitud de onda 555 nm y a una absorción 0.615A.



Inmediatamente después de haber realizado el método espectroscópico, agregar a ambas celdas tanto blanco como muestra tres gotas de HCl, agitar cuidadosamente y secar con papel tisú, se caracterizó a 525 nm y a una absorción de 0.64A.

RESULTADOS Como consecuencia de las interacciones soluto– disolvente se originan con frecuencia desplazamientos espectrales, ensanchamientos de bandas y otros fenómenos que pueden provocar desviaciones en la ley de Beer. En este sentido, no es posible hacer predicciones de forma general. Únicamente mencionar algunos términos relacionados con los desplazamientos espectrales: desplazamiento batocrómico o desplazamiento hacia el rojo, consiste en un desplazamiento del máximo de absorción hacia longitudes de onda mayores (este efecto suele producirse en disolventes de alta constante dieléctrica). Desplazamiento hipsocrómico o desplazamiento hacia el azul, es el desplazamiento hacia longitudes de onda más cortas.

1. Se aplicó la técnica a la Reserva Matriz solución o.1 ml de flavonoide en 10 ml de metanol , se muestra un pico a 535 nm con una absorbancia 0.755A. El metanol tiene una constante dieléctrica ε=32.7 menos que el agua, es menos polar y el grupo CH3 es más grande y ocasiona mayor aglomeración que el segundo H del agua.

2. Se aplicó la técnica ahora con el reactivo metóxido de sodio , compuesto que resulta al reaccionar metanol con sodio, su comportamiento es completamente diferente al acetato sódico un compuesto polar formado por iones sodio e iones acetato, esta sal es estable frente al agua, en la que simplemente se disocia en sus iones, el metilato sódico o metóxido de sodio es descompuesto por el agua dando metanol e hidróxido de sodio. Muestra un pico a una longitud de onda 525 nm con una absorbancia 0.354 A. Tiene un desplazamiento hipsocrómico.

3. Ahora se caracterizaría con el reactivo Tricloruro de aluminio , al tricloruro de aluminio (AlCl3) tiene una estructura espacial trigonal, siendo simétrica y por lo tanto apolar. Una molécula covalente será polar, en el caso de que, teniendo enlaces covalentes polares, no posee una simetría, por lo que no se anularan los momentos dipolares de cada uno de sus enlaces y la molécula global tendrá un momento dipolar permanente. Por el contrario, si la molécula posee simetría, se anularán sus momentos dipolares y será apolar. Se observó un desplazamiento hacia el rojo o desplazamiento batocrómico, que sólo se da en disolventes con alta constante dieléctrica, lo cual difiere con las características del solvente. Muestra un pico a 555 nm y una absorbancia 0.615 A.

4. Una vez realizada la espectrofotometría con el disolvente AlCl3, ahora se le agregarían 3 gotas de HCl tanto a la celda de la muestra como a la celda blanco, se homogenizó y se llevó a barrido, la banda se desplazó a 535 nm con una absorbancia 0.640 A. Con un desplazamiento hipsocrómico.

Discusiones:

El método más usual para un análisis preliminar de la estructura de un flavonoide es quizás la absorción UV-Vis, esta técnica es usada tanta para identificar el tipo de flavonoide como el modelo de oxigenación. Este último puede además ser mejor definido por el uso de reactivos de desplazamiento de los cuales, como su nombre lo indica, provoca el desplazamiento de las bandas de absorción. Las antocianinas presentan el máximo de absorción cerca de 500-550nm, muy similar a los de sus agliconas 1. Esto se comprueba en la parte experimental ya que al poner el extracto en un metanol se observó un pico de 535nm.Notese que esos valores cambian con el solvente, son menores en agua que en metanol y sufren un corrimiento del máximo de absorción a mayores longitudes de onda en medio acido 2. En el presenta trabajo se le agrego 3 gotas de HCl concentrado a la solución de AlCl 3 observándose una longitud de onda de 535nm, el cual presentaba un pico parecido cuando estuvo en etanol el extracto. Por ejemplo la cianidina-3-ramnosida absorbe a 507,523,535 y 545 nm en agua ,metanol, etanol y etanol-ácido clorhídrico, respectivamente .Al aumentar el número de OH conjugados con el sistema insaturado el máximo de absorción también se desplaza a mayor longitud de onda. Este comportamiento a su vez se observa cuando se alcaliniza la solución. El espectro UV de compuestos que no contienen al menos dos grupos OH en posición orto, así como aquellos que no pueden formar quelatos entre el carbonilo C-4 y un OH libre en C-5 o C-3 , no son afectados por la adición de cloruro de aluminio, que provoca la formación de complejos amarillos estables como los que se identificaron en la figura 1.Estos complejos producen un corrimiento a mayores longitudes de onda de la Banda I de 20 a 45 nm y un poco menor para la Banda II(10-20nm).

Figura 1

Los OH libres también causan un desplazamiento batocromico en soluciones alcalinas y este es mayor en la medida que aumente la conjugación a través del sistema enona, como por ejemplo aquellos que estén en la posición 4’.La ionización de los OH en C-3 y C-4 dan lugar a un corrimiento de la Banda I pero no afecta la Banda II 3 . En el laboratorio se agregó 1,25g de AlCl3 anhidro reactivo a 25 ml de etanol, de esta solución se agregaron 3 gotas a 2-3ml del extracto de Ayrampo que estaba en 10 ml de metanol. Se pudo observar un desplazamiento batocrómico (en el cual la longitud de onda de absorción de una sustancia se desplaza hacia longitudes de onda mayores) en este caso de 555nm. El metoxido de sodio causa ionización de todos los grupos hidroxilos, la degradación del espectro con el tiempo es un buen indicador de la presencia de grupos sensibles a álcalis 4  .Al adicionar dos gotas de NaOMe al extracto de Ayrampo con MeOH, se observó un pico de 525nm, viéndose un desplazamiento de 535 nm a 525nm.Al cabo de tiempo si se la vio la degradación del espectro lo cual indica la presencia de grupos a álcalis. El acetato de sodio, causa significativamente ionización de únicamente el grupo hidroxilo más acido del flavonoide y es usado básicamente para detectar la presencia de un grupo 7-hidroxilo libre5.En la parte experimental al agregar este reactivo a nuestro extracto con metanol pudimos observar ruidos los cuales no pertenecen a las antocianinas pero se estableció un posible pico el cual fue a 305nm.

Figura 2

CONCLUSIONES

1. Las antocianinas presentan el máximo de absorción cerca de 500550nm, las cuales tuvieron un movimiento batocrómico o hipsocrómico al momento de añadir los reactivos conocidos como también como solventes. Los cuales determinaron un desplazamiento a nivel de la banda de absorción. Las cuales varían con el pH del medio y esto permite la determinación de antocianinas.

2. Nuestro extracto muestra un pico con el metanol a 535 nm con una absorbancia 0.755 A ; con el reactivo metóxido de sodio muestra un pico a 525 nm con una absorbancia 0.354 A ; con el tricloruro de aluminio muestra un pico a 555 nm y una absorbancia 0.615 A y al agregarle HCl la banda se desplazó a 535 nm con una absorbancia 0.640 A.