Automatización del hemograma 2020

AUTOMATIZACIÓN DEL HEMOGRAMA Dra. Carolina Cucho Espinoza

Historia ■ Conteo de las células sanguíneas: Hemocitómetro. ■ Concentración de cianometahemoglobina.

la

■ Hematocrito: Tubo de Wintrobe. ■ Diferencial de los glóbulos blancos.

hemoglobina:

Método

Hematocrito Manual

Historia

Constantes Corpusculares ■ Wintrobe, en 1932: ■ Volumen corpuscular medio: Hto/Hematíes (fl) ■ Hemoglobina corpuscular media: Hb/Hematíes (pg). ■ Concentración de la hemoglobina corpuscular media: Hb/Hto (%).

Componentes básicos de un analizador hematológico ■

Diluidor: sistema que reduce la concentración de las células sanguíneas y las suspende en soluciones conductoras isotónicas para adecuarla a las capacidades de medida del dispositivo.

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Aspirador: sistema que toma la muestra diluida y la conduce hacia el dispositivo de medida.

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Sistema de fluidos: transporta las suspensiones celulares hacia el dispositivo de medida o la cámara de recuento.

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Cámara de recuento o dispositivo de medida: constituye la parte central o zona sensible del equipo, donde ocurren los fenómenos ópticos, eléctricos o ambos, medidos posteriormente.

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Transductor o detector: son los dispositivos que generan linealmente pulsos eléctricos cuando las células pasan la zona sensible, óptica o eléctrica, del equipo.

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Discriminador: discrimina los pulsos eléctricos generados por los transductores en correspondencia con el tipo celular medido.

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Amplificador: amplifica la señal eléctrica que sale del discriminador para su posterior procesamiento.

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Convertidor analógico-digital: convierte las señales eléctricas en digitales.

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Ordenador: procesa las señales digitales y las convierte en datos que serán mostrados en pantalla y que pueden ser impresos.

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La parte electrónica del equipo está compuesta por el amplificador, el convertidor y el ordenador.

PRINCIPIOS GENERALES DE DETECCIÓN UTILIZADOS POR LOS ANALIZADORES HEMATOLÓGICOS

Medida de la variación de impedancia o resistencia eléctrica (principio Coulter)

Medición de la cantidad de luz dispersada (método óptico)

Dispersión óptica

Dispersión óptica

Técnicas inmunológicas mediante anticuerpos monoclonales (Ac Mo) acoplados a fluorocromos (citometría de flujo) ■ En la técnica de citometría de flujo las células en suspensión se hacen pasar alineadamente una a una, por delante de un haz de luz láser monocromático, lo que causa su dispersión en diversos ángulos y la emisión de energía fluorescente, previo marcaje de las estructuras celulares con anticuerpos monoclonales acoplados a fluorocromos. La utilización de una fuente de luz láser, generalmente de argón, ofrece un rayo monocromático más intenso, más colimado y capaz de inducir la excitación de ciertos compuestos (fluorocromos) con la consecuente inducción de la señal fluorescente, lo que garantiza una medición fotométrica más exacta

La interacción de haz láser con cada célula marcada produce 2 tipos de señales: de dispersión y de fluorescencia. Para su detección, las señales de dispersión se dividen en 2 fracciones: fracción dispersa ángulo estrecho (0100) hacia adelante en o Forward Scatter (FSC), y fracción dispersa en ángulo de 900 con respecto al haz incidente o Side Scatter (SSC), las que serán recogidas por 2 detectores de dispersión colocados al efecto

Citometría de fujo ■ Las señales de fluorescencia serán recogidas por 3 detectores de fluorescencia en equipos de un solo láser y por un cuarto detector en equipos de 2 láseres. ■ Esta característica de la citometría de flujo la convierte en una poderosa técnica multiparamétrica al ofrecer simultáneamente varios parámetros sobre cada célula y la relación de estos parámetros con los de otra célula también analizada. ■ En la práctica médica hematológica e inmunológica, este principio encuentra aplicación en el conteo e identificación de subpoblaciones linfocitarias (inmunofenotipo), estudios de función plaquetaria, determinación de reticulocitos inmaduros y en la caracterización de las leucemias agudas y síndromes mieloproliferativos, entre otras

Para evitar errores, tienen dos mecanismos: ■ Enfoque hidrodinámico. Logra que las células disueltas en la corriente salina transportadora penetren en la cámara de medición de forma cónica estrechada hasta unos 20 mm. ■ Flujo de barrido Consiste en el flujo perpendicular de una corriente estacionaria de diluyente por detrás de las aberturas destinadas al recuento celular para evitar que dichas células sean removidas de la zona de detección una vez atravesada

Principio de detección Principio de detección Citometría de flujo, citoquímica fluorescente

WBC, WBC 5 DIFF, NRBC, RET

Detección por corriente directa

RBC, PLT

Método de Hemoglobina-SLS - Colorimetría

Hemoglobina

Método de radiofrecuencia/corriente directa

HPC (células pluripotenciales hematopoyéticas)

Hemoglobina C A

B

Blood Cells

Aperture Critical Zone

• Reactivo libre de cianuro • Amigable al medio ambiente • Mejores resultados de hemoglobina para muestras • con conteo de leucocitos altos • con lipemias • con proteínas anormales

Señal C

Fe 3+

Fe 2+

SLS

Señal A

Señal B

Fe 3+

Hematocrito Medido directamente

 Volumen constante  Detección de la altura de pulsos

cumulativos: El hematocrito es medido sumando el volumen de cada que pasa por la abertura

= Pulso generado de RBC

(Volumen conocido) célula

Método de Citometría de Flujo • Láser Semiconductor ■ ■ ■ ■ ■ ■ ■

Vida larga Larga estabilidad Consumo bajo de energía Bajo costo Arrancado rápido Compacto 633 nm

Citometría de Flujo Fluorescente

Método de Citometría de Flujo Signos del método de citometría Información de flujo Luz dispersa frontal

Volumen celular

Luz dispersa lateral

Contenido celular (núcleo, presencia de gránulos, etc)

Luz fluorescente lateral

Contenido de ARN y ADN

Volumen corpuscular medio ■ El valor de este parámetro puede ser obtenido a partir del histograma de distribución de volumen de los eritrocitos o medido directamente mediante la técnica de dispersión de la luz láser, lo que ha significado un notable avance.

RDW

RDW-SD no es afectado por el VCM Hombre: 39,9 - 46,3 fL Mujer: 36,9 - 50,2 fL

RDW-CV dependiente del valor de VCM Hombre: 11,9 - 12,9% Mujer: 11,6 - 14,7%

Otros parámetros ■ Hemoglobina corpuscular media (HCM): es el valor promedio de la hemoglobina contenida en cada eritrocito. Sus valores de referencia son de 28-32 pg. Se calcula a partir del valor de hemoglobina y del recuento de eritrocitos. ■ Concentración de hemoglobina corpuscular media (CHCM): se refiere a la concentración promedio de hemoglobina por mililitro (mL) de eritrocitos. En adultos, los valores de referencia son 32-36 %. Puede ser calculada utilizando los valores de hemoglobina y de hematocrito o medida directamente mediante luz láser y su grado dispersión. ■ A partir de su medición directa se obtiene el histograma de distribución de eritrocitos según su concentración de hemoglobina corpuscular media y la amplitud de distribución de los hematíes (ADH) según su concentración de hemoglobina, conocida por sus siglas en ingles como HDW (haemoglobin distribution width).

HDW : Amplitud de desviación de la concentración de Hb. ■ En el histograma de la CHCM, el desvío de la curva normal se da como HDW o índice de anisocromía de los eritrocitos o grado de variación de la Concentración de Hb en los eritrocitos.■ Este histograma puede detectar y cuantificar eritrocitos hiperdensos lo cual es una gran ayuda en el diagnóstico de la esferocitosis. ■ En la esferocitosis se aprecia un histograma de la CHCM hacia la derecha y un histograma de los volúmenes a la izquierda

Alertas o Interferencias

Recuento de Reticulocitos automatizado 1.- Por absorción de luz.■ Sustancias como la oxacina 750 se incorpora al ARN de los reticulocitos y alteran la absorción de luz lo que no ocurre con los eritrocitos maduros.

2.Por Fluorescencia (luminosidad). ■ Fluorocromo como la auramina o el Tiazol naranja se unen a las bases nitrogenadas del ARN de los reticulocitos y emiten una luz que es captada por un fotodetector.

Subtipos de reticulocitos : Para evaluar la eritropoyesis medular. ■ La oxacina 750 es específica para el ARN m de los reticulocitos. ■ Según la cantidad de luz absorbida se puede diferenciar tres tipos de reticulocitos. Fracción de reticulocitos inmaduros (IFR). ■ Tipo I (H) .- Alta carga de ARN.- los más inmaduros. Indican salida prematura de la médula ósea. ■ Tipo II (M) .- Moderada carga de ARN ■ Tipo III (L).- Baja carga de ARN .- los más maduros.

FORWARD LIGHT SCATTER

Canal Reticulocitos

RBC

FLUORESCENCE

Dispersograma reticulocitos Forward Scatter LFR RBC-O

MFR

HFR

WBC IRF RET

f-PLT

Fluorescence

Fracción de reticulocitos inmaduros ■ Contaje de Reticulocitos = Porcentaje de producción de eritrocitos (Cuantos) ■

IRF = Porcentaje de cambio en la producción de eritrocitos (Que tan rápido)

IRF- Utilidad ■ IRF medida sensible de la actividad de la médula ósea – Actividad eritropoyética – Clasificación de las anemias o monitoreo del tratamiento de las anemias – Monitoreo de la administración de Eritropoyetina – Monitoreo del éxito de los trasplantes renales

Plaquetas ■ Plaquetas (PLT): se refiere al recuento global de plaquetas realizado de forma automatizada. Sus valores de referencia varían en relación con la técnica utilizada para su recuento, aunque generalmente fluctúan de 150 a 400 × 109/L.4 ■ Volumen medio plaquetario (VPM): indicador del tamaño de las plaquetas y muestra una relación inversa no lineal con el número de estas. Se deriva directamente del análisis de la curva de distribución de volumen de las plaquetas 

Plaquetas ■ Componente medio plaquetario o concentración media de plaquetas (CPM): es un indicador del grado de activación plaquetaria y una variable clínica útil en el estudio y seguimiento de pacientes con riesgo de trombosis (dialisados, diabéticos, fumadores, angina inestable, mujeres embarazadas), ya que la activación plaquetaria esta implicada en esta enfermedad. ■ Plaquetas reticuladas (PR): las PR son las más jóvenes de la sangre periférica con un contenido de ARN superior a las demás. Son detectadas mediante la aplicación del método inmunológico. Las plaquetas se tiñen con ARN fluorescente (auramina O) y la intensidad de fluorescencia determina el contenido del ARN de la plaqueta. El porcentaje normal de PR es de 0,98 ± 0,41 %.

Comportamiento de los parámetros plaquetarios en diferentes enfermedades

Canal del diferencial  Los equipos de la serie X analizan dispersión y fluorescencia lateral en este canal.  Dispersión lateral detecta la complejidad de la lobularidad del núcleo y de los gránulos dentro del citoplasma  La fluorescencia lateral depende de la concentración de ARN y ADN

GLOBULOS BLANCOS

¿Por qué luz de lámpara de tungsteno es mejor que el láser? Laser es una luz monocromática concentrada.

Con su lampara de tungstenio el banco óptico cubre todas las longitudes de onda

Una longitud de onda

Multi longitude de onda

Screening deficiente

Screening en alta definición (Se explora la complejidad de la célula)

Diferencial de leucocitos

Emitted Light

Transmitted Light

Absorbed Light Diffracted Light

Diferencial de Leucocitos

Absorbance (Optical) Transfer time 440 pics (175µs)

Counting and Volume (Impedance)

Total de medidas de conteo: 12 rebanadas

Diferencial de leucocitos

Cell

Lymphocytes

Aspect

Volume

Lost light (Absorbance + diffraction)

Small

Very Low

Big

Low

Medium

Medium

Medium

High (granulations)

Monocytes

Neutrophils Eosinophils

NRBC

La diferenciación de los eritroblastos se realiza por volumen y absorbancia.

Muestra negativa

Muestra positiva

Análisis adaptativo de grupos poblacionales SFl Centroide inicial Monocitos Centroide inicial Linfocitos

Centroide inicial Fantasmas

Centroide inicial Neutrófilos + Baso Centroide inicial Eosinófilos SSc

Información RNA/DNA

Posición de células anormales en el dispersograma Promielo Mielo Blasto Meta Banda

Estructura interna

Linfocito atípico

Canal IMI (inmaduros) Lípido - Colesterol - Fosfolípido - Glicolípido Super surfactante Aminoácido

WBC maduro

WBC inmaduro

Método de detección- Canal IMI Corriente directa

Radio frecuencia

Mide tamaño

Mide densidad celular

Criterios para la Realización de Láminas

Sysmex Serie XN

Analizadores hematológicos que también pueden realizar los análisis de fluidos corporales…