AULA PRÁTICA 03-06- ANÁLISE MICROBIOLÓGICA DE ÁGUA 2010

UNIVERSIDADE TUIUTI DO PARANÁ

Curso: Biotecnologia – 4o período Professora : Maria Luiza F. Rodrigues Disciplina : Microbiologia Industrial

AULA PRÁTICA 03, 04, 05 E 06: ANÁLISE MICROBIOLÓGICA DA ÁGUA E INDICADORES

Amostragem :Para a análise microbiológica, as amostras devem ser tomadas do ponto representativo do sistema de distribuição ou do reservatório a ser examinado. TESTE PRESUNTIVO (COLIFORMES TOTAIS): Inocule uma série de três tubos contendo 10 ml, sendo 9 ml do meio Caldo Lauryl Sulfato Triptose (LST) ou Caldo Peptona e 1 ml da amostra de água. Incube a 37ºC por 48 horas. A presença de gás no tubo de Duhran, indica teste presuntivo positivo. Anote o número de testes positivos.

TESTE PARA O GRUPO DE COLIFORMES FECAIS: Transfira Transfira 1,0 mL de todos os tubos do teste presuntivo presuntivo que deram resultado resultado positivo para tubos contendo 9 ml do meio E.C (Escherichia coli ). ). Incube os tubos na estufa a 44,5 oC por 48 horas. A presença de gás no tubo de Duhran indica teste positivo. Anote os números de tubos positivos.

DIFERENCIAÇÃO DE BACTÉRIAS DO GRUPO COLIFORME: Inocule através da alça de platina, a partir de um dos tubos positivos de meio E.C, uma placa com meio EMB (Agar Eosina Azul de Metileno), meio SS e meio Mac Conkey. Incube as placas invertidas de 24-48 horas á 37 0C. Colônia típica: nucleada com ou sem brilho metálico. Colônia atípica: anucleada, opaca, rosada e de consistência gomosa. Colete uma colônia da placa e faça uma coloração de Gram.

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COMPOSIÇÃO DOS MEIOS DE CULTURA UTILIZADOS PARA ANÁLISE DE ÁGUAS Meio Caldo Lauryl Triptose Triptose...............................20g Lactose.................................5g Fosfato de potássio dibásico.............................2,75g Fosfato de potássio monobásico......................2,75g Cloreto de sódio....................5g Lauryl sulfato de sódio........0,1g Água destilada...............1000ml PH final = 6.8

Meio EC EMB Agar  Triptose...............................20g peptona...............................10g Lactose.................................5g Lactose.................................5g Fosfato de potássio Sacarose .............................5g dibásico.................................4g Fosfato de potássio Fosfato de potássio dibásico...................2g monobásico........................1,5g Eosina .............................13,5g Cloreto de sódio....................5g Azul de metileno............0,065g Sais biliares...........................5g Agar .....................................2g Água destilada...............1000ml Água PH final = 6.9 destilada...............1000ml PH final = 6.8

EMB agar: este meio é utilizado para a diferenciação de E. coli e Enterobacter aerogenes. Aspecto das colônias: Escherichia coli : colônias esverdeadas, com brilho metálico e geralmente com centro mais

escuro. Enterobacter aerogenes: colônias com aspecto mucóide, com o centro amarreonzado.

Patógenos que não fermentam a lactose: colônias transparentes.

SSA: este meio é seletivo para o isolamento de Salmonella e Shigella de alimentos ou outras fontes. Os microrganismos gram positivos e os coliformes são inibidos pela ação dos sais biliares. Aspecto das colônias: Salmonella e Shigella: organismos não fermentadores da lactose presentam colônias

incolores e transparentes. Escherichia coli : apresentam colônias de cor vermelha. Enterobacter  sp e Proteus sp: apresentam colônias de cor rosa, creme ou branca.

McConkey agar: este meio é seletivo para bactérias gram negativas e serve para o isolamento de coliformes, Salmonella e Shigella de alimentos e outras fontes. Aspecto das colônias: Qualquer organismo capaz de fermentar a lactose com a produção de ácidos, forma colônias vermelhas em meio agar McConkey (agar vermelho neutro-sais biliares), devido à viragem do indicador em pH baixo.

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Resultados Após o crescimento das colônias nos meios seletivos descritos acima (48 horas), faça a coloração de gram com as culturas para notar as formas celulares e anote na tabela abaixo as suas observações. Resultados obtidos após 48 horas de crescimento em meio seletivo Meios seletivos

Aspecto das colônias

Observações

EMB SSA McConkey

Características dos microrganismos nos meios EMB, SSA e MacConkey Microrganismo

Meio EMB

Meio SSA

Escherichia coli 

Colônias pequenas, de cor  Colônias verde metálico brilhante

Meio MacConkey pequenas Colônias de cor rosa-

redondas de cor rósea

avermelhada

pois

fermentam a lactose Enterobacter 

Colônias

aerogenes

nucleadas e espalhadas, de cremoso de cor rósea

avermelhada

cor rosa escuro

fermentam a lactose

Salmonella sp

Colônias

grandes, Colônias

pequenas

de aspecto Colônias de cor rosapois

e Colônias transparentes Colônias transparentes ou

transparentes

que podem apresentar  amareladas

pois

não

núcleo central de cor  fermentam a lactose preta Klebsiella sp

Colônias grandes, gomosas, Colônias

gomosas, Colônias de cor rosa-

com núcleo central escuro espalhadas, que se espalham na placa Serratia

Colônia

marcerans

gomosas,

roxo

Colônias

planas, pequenas

transparentes

rósea a alaranjado

azuladas, Colônias

cresciemnto espalhado Proteus morgani 

de

pois

fermentam a lactose

pequenas, Colônias transparentes ou

com transparentes leitosas e Colônias

cor  avermelhada

ou amareladas

pois

não

fermentam a lactose espalhadas Colônias transparentes ou

transparentes

que amareladas

pois

não

podem ter o núcleo fermentam a lactose mais escuro

COLORAÇÃO DE GRAM 1 - Introdução 3

A coloração de Gram é um método de coloração de bactérias desenvolvido pelo médico dinamarquês Hans Christian Joachim Gram (1853 - 1838), em 1884, e que consiste no tratamento sucessivo de um esfregaço bacteriano, fixado pelo calor, com os reagentes cristal violeta, lugol, etanol-acetona e fucsina básica. Essa técnica permite a separação de amostras bacterianas em Gram-positivas e Gram-negativas e a determinação da morfologia e do tamanho das amostras analisadas. O método da coloração de Gram é baseado na capacidade das paredes celulares de bactérias Gram-positivas de reterem o corante cristal violeta no citoplasma durante um tratamento com etanol-acetona enquanto que as paredes celulares de bactérias Gram-negativas não o fazem. A coloração de Gram é um dos mais importantes métodos de coloração utilizados em laboratórios de microbiologia e de análises clínicas, sendo quase sempre o primeiro passo para a caracterização de amostras de bactérias. A técnica tem importância clínica uma vez que muitas das bactérias associadas a infecções são prontamente observadas e caracterizadas como Gram-positivas ou Gram-negativas em esfregaços de pus ou de fluidos orgânicos. Essa informação permite ao clínico monitorar a infecção até que dados de cultura estejam disponíveis. É possível a análise de vários esfregaços por lâmina, o que facilita a comparação de espécimes clínicos. As lâminas podem ser montadas de forma permanente e preservadas como documentação.

2 - Descrição da técnica O método consiste no tratamento de uma amostra de uma cultura bacteriana crescida em meio sólido ou líquido, com um corante primário, o cristal violeta, seguido de tratamento com um fixador, o lugol. Tanto bactérias Gram-positivas quanto Gram-negativas absorvem de maneira idêntica o corante primário e o fixador, adquirindo uma coloração violeta devido à formação de um complexo cristal violeta-iodo, insolúvel, em seus citoplasmas. Segue-se um tratamento com um solvente orgânico, o etanol-acetona (1:1 v:v). O solvente dissolve a porção lipídica das membranas externas das bactérias Gram-negativas e o complexo cristal violeta-iodo é removido, descorando as células. Por outro lado, o solvente desidrata as espessas paredes celulares das bactérias Gram-positivas e provoca a contração dos poros do peptidoglicano, tornando-as impermeáveis ao complexo; o corante primário é retido e as células permanecem coradas. A etapa da descoloração é crítica, pois a exposição prolongada ao solvente irá provocar a remoção do cristal violeta dos dois tipos de bactérias, podendo produzir resultados falsos. A retenção ou não do corante primário é, portanto, dependente das propriedades físicas e químicas das paredes celulares bacterianas tais como espessura, densidade, porosidade e integridade. Em seguida, a amostra é tratada 4

com um corante secundário, a fucsina básica. Ao microscópio, as células Gram-positivas aparecerão coradas em violeta escuro e as Gram-negativas em vermelho ou rosa escuro. Células de bactérias Gram-positivas, células velhas, mortas ou com envelopes danificados por agentes físicos ou químicos, tendem a perder o cristal violeta e uma mesma amostra bacteriana pode exibir parte ou todas as células coradas como Gram-negativas. Portanto, o uso de material fresco é importante. Por outro lado, resultados do tipo "falso Gram-positivo" só são obtidos se o tratamento com etanol-acetona for omitido. O corante cristal violeta pode ser substituído, com os mesmos resultados, pelo azul de metileno e a fucsina básica pode ser substituída pelo corante vermelho safranina. A fucsina cora muitas bactérias Gram-negativas mais intensamente que a safranina, que por  sua vez não cora prontamente algumas espécies de bactérias. O solvente etanol-acetona pode ser substituído por álcool 95%. A técnica da coloração de Gram não é infalível e podese fazer o teste do hidróxido de potássio (KOH). Em uma lâmina de microscopia adicionam-se duas gotas de uma solução de KOH a 3%. Com o auxílio de uma alça de semeadura coletase uma colônia isolada da bactéria e mistura-se com a solução de KOH na lâmina por 30 segundos. Se a bactéria for verdadeiramente Gram-negativa, o KOH irá romper sua parede celular e liberar seu DNA que será observado como fios viscosos. Se a bactéria for Grampositiva não haverá a formação de fios.

3 - Procedimentos 3.1 - Preparo do esfregaço Suspender uma pequena porção da amostra bacteriana a ser corada em uma gota de água ou solução salina 0,85%, sobre uma lâmina de microscópio, espalhando a gota. Este procedimento deve ser feito com um alça bacteriológica flambada ou um palito de madeira esterilizado. Deixar o material secar e, em seguida, fixá-lo com calor, flambando rapidamente a lâmina acima da chama de um bico de Bunsen.

3.2 - Aplicação do corante primário Cobrir toda a sua superfície da lâmina com o corante cristal violeta; deixar em repouso por um minuto. Remover o corante da lâmina com água destilada, com auxílio de um contagotas.

3.3 - Aplicação do fixador  Cobrir toda a sua superfície da lâmina com lugol; deixar em repouso por um minuto. Remover o fixador da lâmina com água destilada, com auxílio de um conta-gotas. 5

3.4 - Descoloração Com a lâmina inclinada, despejar algumas gotas de álcool-acetona 1:1 v:v (descolorizador) para remover o complexo cristal violeta-lugol de células Gram-negativas. Este procedimento deve ser realizado até o momento que não desprenda mais a cor violeta do esfregaço.

3.5 - Aplicação do corante secundário Cobrir toda a sua superfície da lâmina com o corante fucsina básica (safranina); deixar em repouso por um minuto. Enxaguar a lâmina com água, com auxílio de um contagotas, e tocar as bordas com papel absorvente para remoção do excesso de água.

3.6 - Microscopia Examinar a amostra ao microscópio óptico.

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