Appunti Di Tossicologia - 2011-2012

2011-2012

Appunti di TOSSICOLOGIA

Maria Cristina Tomasini

Appunti di Tossicologia:  Tossicodipendenze  Antidoti  Mutagenesi  Cancerogenesi  Valutazione Sperimentale della Tossicità  Neurotossicità  Neurodegenerazione  Tossicologia del ciclo riproduttivo  Epatotossicità  Nefrotossicità  Tossicologia del Midollo Osseo  Tossicologia del Sistema Respiratorio  Fibre Minerali  Tossicità a carico della Cute  Tossicità dei Metalli  Insetticidi  Alcolismo

By Ale [email protected]

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Per ovvi motivi, tutti i link alle dispense e alle registrazioni sono stati Rimossi… Per poter scaricare il materiale didattico, inviate una richiesta dal vostro indirizzo @mail universitario a: [email protected]

Tengo a precisare che questi sono appunti universitari basati sulla personale rielaborazione delle registrazioni ottenute andando a lezione. Non costituiscono il materiale didattico e non possono di certo sostituire le lezioni frontali. Ho scritto questi appunti per me stesso, per studiare, e al contempo farmi qualche risata e sdrammatizzare la frustrazione dell’ascoltare per 2 o anche 3 volte le registrazioni. A volte uso un linguaggio a tratti scurrile, a volte schernisco compagni di corso. Se non vi piacciono nessuno vi obbliga a studiarvici sopra... E non mi prendo certo la responsabilità per eventuali errori concettuali che possono essere presenti e che hanno mandato a rotoli il vostro esame. Gli appunti non possono essere scaricati, e le richieste effettuate via email da un account universitario sono SOLO ed esclusivamente per le diapositive fornite a lezione. Spero che con questi appunti qualcuno possa apprezzare di più la Tossicologia; così come ho fatto io.

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LE TOSSICODIPENDENZE:

| Prima Parte

12-10-11

Parleremo della somministrazione di sostanze che agiscono a livello del sistema nervoso centrale. E che vengono definite in generale sostanze psicoattive. Queste sostanze erano note fin dall’antichità, in particolare venivano usate per riti “magici” e “religiosi”, per le loro proprietà di dare allucinazioni e quindi sentirsi in contatto con un’entità superiore (poveri idioti :P). In tempi moderni l’uso e l’abuso di queste sostanze è prettamente a scopo voluttuario, per trovare un modo di distaccarsi dalla Triste realtà circostante. In passato venivano usate prevalentemente le materie grezze, come l’Oppio o la Cocaina… Poi si è diffuso l’uso di derivati sintetici + attivi e spesso meno costosi. Queste sostanze vanno ad alterare la neurotrasmissione, in particolare i neurotrasmettitori interessati al tono dell’umore, gli stati sentimentali e affettivi; provocando alterazioni comportamentali appunto ricercate dal tossicodipendente. Dall’uso / abuso di queste sostanze ne scaturisce un tipo di La mia dipendenza psicologica.. ovvero.. si crea un legame coercitivo tra l’individuo e la sostanza d’abuso drrroogaaaaa il quale non ne riesce a fare a meno anche se si rende benissimo conto di tutte le gravi conseguenze che ne derivano. La dipendenza psicologica è caratterizzata dalla Compulsione, il cosiddetto Craving (la ricerca ad ogni costo, superando qualsiasi convinzione morale o religiosa, della sostanza d’abuso). L’individuo ha solo questo desiderio (un po’ come Gollum per l’anello di Frodo xD), e ne consegue che metterà da parte tutte le normali attività pur di soddisfarlo. Il fenomeno della Tolleranza.. che porta alla dipendenza fisica e la dipendenza psicologica generano la Tossicodipendenza. Come dicevamo, le modificazioni indotte da queste sostanze a livello del sn centrale, interessano alcuni tipi di neurotrasmettitori.. in particolare:   

NORADRENALINA SEROTONINA.. e DOPAMINA

La Dopamina è l’attore principalmente coinvolto nella sensazione di gratificazione.. Tutti e tre, controllano il Tono dell’umore, L’emotività e le Funzioni cognitive… Le sostanze d’abuso provocheranno quindi l’alterazioni di questi tre aspetti comportamentali. Una liberazione di Dopamina, in determinate aree del cervello, che sono raggruppate nel sistema limbico, è responsabile dell’instaurarsi nell’individuo di uno stato di euforia (piacere e gratificazione).. lo stesso che si prova quando si mangia qualcosa di buono.. quando si rumba come conigli.. ecc… Le sostanze d’abuso agiscono appunto in modo simile.. :P Un altro effetto ricercato nelle sostanze d’abuso è l’aumento dell’energia fisica e delle funzioni cognitive; tipiche di Cocaina e Amfetamine, che influenzano in positivo le performance fisiche e psichiche. Nel Pagina | 3

frattempo però ci sono anche alterazioni che portano a impulsività, aggressività.. in particolare quando si agisce sulla Serotonina, che può portare all’instaurarsi di comportamenti psicotici, fino ad arrivare a commettere azioni estreme su se stessi come il suicidio. Oltre alla sfera emotiva sono interessate delle funzioni fisiologiche come il ciclo sonnno-veglia; l’appetito ridotto, e le funzioni sessuali. Riassumendo.. Una sostanza che provochi tossicodipendenza è caratterizzata da:   

Tolleranza (aumento della dose per ottenere lo stesso effetto) Dipendenza fisica (adattamenti nella neurotrasmissione in seguito all’uso prolungato di queste sostanze che generano la cosiddrtta sindrome di astinenza in seguito alla brusca interruzione) Dipendenza psicologica “Addiction” e “Craving”

Questa classificazione di dipendenza è però un po’ obsoleta.. Al momento si preferisce parlare di “DEPENDANCE SYNDROME”… senza differenziare la dipendenza fisica da quella psichica perché forse nel passato si considerava più pericolosa la prima, in quanto generava una sindrome d’astinenza con crisi violente che potevano durare anche per periodi lunghi. In realtà, La dipendenza PSICHICA è molto pericolosa, in quanto le alterazioni del comportamento possono creare situazioni in cui l’individuo arreca danno a se o agli altri, e quindi, questo nuovo “Concetto” pone la dipendenza fisica a un livello inferiore… (bah...) Le caratteristiche principali che determinano questa sindrome sono: 

La salienza dello stimolo, → assumere la sostanza è l’obiettivo prioritario dell’esistenza (stile Terminator.. hihihi)

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L’ Impoverimento del repertorio comportamentale → le attività quotidiane sono solo rivolte solo alla ricerca della droga Compulsicità dell’uso (mancanza di controllo sull’assunzione della sostanza) Vulnerabilità alle recidive (facile ricadere nell’uso della sostanza) Dipendenza Fisica.

Su questo modello si basano i sistemi diagnostici attualmente in uso.. Alcune sostanze che vedremo daranno solo dipendenza Fisica.. altre daranno entrambe… Nel DSM-IV possiamo trovare tutte le definizioni, e le differenze tra uno stato di ABUSO e uno stato di DIPENDENZA.. Una stessa sostanza può provocare entrambe le condizioni.. prendiamo ad esempio l’Alcol… Un individuo ubriaco può causare incidenti e la morte di altre persone.. in questo caso si tratta di Abuso… Nel momento in cui l’alcol porta a svegliarsi la mattina con la voglia di calmare il delirium tremens.. allora si entra già nella Dipendenza… Le sostanze d’abuso sono state classificate in base all’incidenza d’abuso che possono provocare… Al primo posto c’è la:     

Cocainae e gli oppioidi con un buon 19,7% e 19,5%.... seguiti da Alcol 9,4% Sedativi 6,3% (barbiturici e Bzd) Stimoanti 5,6% e all’ultimo posto…. C’è la Cannabis 2,5%

Le droghe con un basso potere di dipendenza, sono spesso considerate droghe di iniziazione (la strada della perdizione :P).. questo processo si chiama Gating Drug. Alla fin fine è una considerazione molto generale.. perché in Italia e in altri stati si parte già da droghe per cavalli :P Tipo l’Eroina in età sempre più precoce. Pagina | 4

Sono stati sviluppati dei protocolli diagnostici per i medici per stabilire il livello di dipendenza… uno di questi protocolli.. l’SDS ..consiste in uno stupido questionario con 5 domande con punteggi da 0 a 3 .. (qualcuno effettivamente dava i numeri O_o) .. ce lo vedo un drogato che ha saltato la dose rispondere tranquillamente a: “Ti preoccupa l’idea di saltare una dose?” =_=” Le principali sostanze d’ABUSO sono:

Severity of Dependance Scale (SDS) 1) 2) 3) 4) 5)

Riesci a tenere sotto controllo l’uso di……? Ti preoccupa l’idea di saltare una dose? Ti preoccupa far uso di…….? Hai mai desiderato di poter smettere? Quanto hai trovato difficile smettere o stare senza?

 Psicostimolanti (amfetamine, cocaina e nicotina.. e anche la caffeina..)  Psichedelici allucinegeni (agiscono prevalentemente sulla serotonina e alterano le percezioni uditive, visive e olfattive... Abbiamo anche la Fenciclidina (un tempo usato come anestetico)  Deprimenti del SNC: Come Alcol, Oppioidi, barbiturici e BDZ  Deprimenti con proprietà allucinogene: Cannabis Mano a mano li faremo tutti…. Come agiscono queste droghe psicoattive?? → Si dice siano dei Rinforzatori del Comportamento.. Generano uno stato atto a ritrovare sensazioni di piacere e gratificazione. Esistono poi sostanze psicoattivo che possono però dare Rinforzo Negativo…A noi interessano però quelle che inducono lo stato di benessere

Passo indietro (by Dezfouli)… come detto prima, le sostanze d’abuso interferiscono sulla neurotrasmissione, quindi influenzano determinati stimoli naturali.. Creano le stesse sensazioni… come ad esempio:  Comportamento Alimentare  Comportamento Sessuale  Comportamento parentale (l’amore materno.. il comportamento primordiale nei confronti della prole.. e da soddisfazione e gratificazione per chi lo compie.. quindi anche questo rientra negli stimoli naturali a rinforzo positivo) Perché gli stimoli naturali danno questa sensazione di piacere?? →→ Perché vanno ad agire su alcun aree cerebrali che fanno parte del sistema limbico… costituito dalla corteccia prefrontale.. dal Talamo e Ipotalamo, dall’ippocampo, dall’amigdala.. dal nucleo accumbens e il bulbo olfattivo. In queste aree gli stimoli naturali aumentano la liberazione di uno dei 3 Pagina | 5

neurotrasmettitori.. come la Dopamina. Lo stesso fanno le sostanze d’abuso.. che mimano gli stimoli naturali e generano gli stessi rinforzi positivi. Il sistema dopaminergico racchiude i nuclei dei neuroni dopaminergici in alcune aree come la VTA (Ventral Tegmental Area). Ogni sistema neuronale è caratterizzato da zone dove sono concentrati i corpi cellulari di questi neuroni. Da queste zone partono tutte le terminazioni nervose che andranno a sinaptare neuroni che appartengono ad altre aree cerebrali, creando delle circuiterie per cui ogni neurone controlla quelli vicini. Dalla VTA partono le vie dopaminergiche che vanno a toccare tutte le altre aree cerebrali che costituiscono il sistema limbico. Dunque… il rilascio di DOPAMINA.. a livello presinaptico di queste terminazioni (grigie), è responsabile dei processi di gratificazione. La cosa si complica in quanto partono poi altri neuroni atti a controllare il sistema dopaminergico come quelli azzurrini → Gabaergici (segnale inibitorio). Fisiologicamente quindi l’effetto della dopamina è effimero.. e strettamente regolato. Le sostanze d’abuso possono invece determinare direttamente il rilascio di dopamina dalle terminazioni nervose dopaminergiche.. o agire Indirettamente.. inibendo la segnalazione inibitoria GABAergica.. :DD In questo grafico si vede l’effetto della morfina sulla liberazione di dopamina per dimostrare che gli oppioidi.. come altre sostanze d’abuso, aumentano la quantità di dopamina liberata.. Questi dati sono stati ottenuti tramite esperimenti di microdialisi nel ratto. La microdialisi è una tecnica sperimentale che permette di misurare direttamente nel cervello la liberazione dei neurotrasmettitori.. L’animale è vivo e anestetizzato; viene praticato un foro nell’osso della scatola cranica, attraverso il quale viene introdotta una canula che andrà in profondità fino a raggiungere l’area cerebrale di interesse.. Esistono degli opportuni atlanti dove ci sono elencate le sezioni del cervello dell’animale in questione, caratterizzate da 3 coordinate.. Attraverso uno strumento stereotassico è possibile individuare l’esatta sezione e procedere… La canula è collegata a un microperfusore, e il liquido cerebrale viene raccolto nella canula attraverso una membrana semipermeabile; in questo modo possimo analizzare le variazioni dei neurotrasmettitori. Tutte le sostanze d’abuso, agiscono aumentando la concentrazione di Dopamina (quante volte lo ripeterà?). I meccanismi sono molteplici.. e le sostanze d’abuso sono state riunite in 3 classi, a seconda del meccanismo d’azione.   

La prima Classe è data dai farmaci d’abuso, che attivano recettori accoppiati a Proteine G (recettori di tipo Metabotropo)→ oppioidi, Cannabinoidi, GHB (droga dello stupro), LSD, Mescalina La seconda Classe stimola recettori di tipo Ionotropo→ Nicotina, Alcol, ipnotici sedativi.. e psichedelici come Fenciclidina e Ketamina. La terza Classe Agisce bloccando i trasportatori dei neurotrasmettitori, aumentando la loro permanenza nello spazio sinaptico.. tra questi abbiamo→ la Cocaina, amfetamina e l’Ecstasy (MDM→ Metilen-di-ossi-metamfetamina).

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La PRIMA CLASSE, provoca generalmente un effetto di disinibizione sul neurone dopaminergico → tolgono il controllo inibitorio che normalmente c’è su questo neurone… Azione quindi INDIRETTA. La SECONDA CLASSE, Agisce sui recettori eccitatori, presenti a livello presinaptico della terminazione dopaminergica.. si ha depolarizzazione.. e aumenta la scarica dopaminergica da questi neuroni… Azione DIRETTA (nicotina). Alcol e Benzodiazepine agiscono sui recettori GABA-A togliendo il controllo inibitorio sul neurone dopaminergico (azione INDIRETTA).. La Ketamina e la Fenciclidina agiscono su un recettore che non sembra attivare direttamente il rilascio di dopamina….. mah…. La TERZA CLASSE, va a modificare i trasportatori dei neurotrasmettitori endogeni bloccandoli. Normalmente la dopamina verrebbe riassorbita nel neurone per poi essere riutilizzata… in questo caso permane più a lungo nello spazio sinaptico.

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LE TOSSICODIPENDENZE:

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Parte Seconda 17-10-11

Oggi partiamo con i TEST SPERIMENTALI per valutare sull’animale, se la sostanza d’abuso provoca dipendenza o meno. I test comportamentali rappresentano una larga fascia di sperimentazioni in-vivo.. a noi però interessa vedere il comportamento di un animale quando viene a contatto con una sostanza d’abuso. Se il comportamento dell’animale è cambiato a “operativo” (ovvero l’animale svolge una determinata azione che normalmente non svolgerebbe).. lo stimolo viene considerato un rinforzo positivo. Vediamo il modello della SELF-ADMINISTRATION: che significa → Autosomministrazione della sostanza (da parte dell’animale). La strumentazione per eseguire il test è costituita da una gabbia dove viene posto l’animale (libero di muoversi); in un lato c’è una leva.. collegata a un sistema che permette di erogare una quantità predeterminata di sostanza campione. La sostanza arriva all’animale tramite una pompa, collegata a un catetere che arriva alla sua giugulare. La soluzione quindi va direttamente in circolo. L’animale inizia a muoversi, esplora :P, e arriva alla levetta.. la spinge.. e gli arriva la sostanza.. Se questa dovesse determinare effetti spiacevoli, la seconda volta che il ratto tornerà, proverà le stesse sensazioni.. e sarà scoraggiato dal tornarci una terza volta.. Se eroghiamo una sostanza d’abuso, l’animale avrà una sensazione piacevole.. e cercherà quindi di riprovarla, tornando alla leva e spingendola.. l’animale impara quindi che ogni volta che preme la leva, ottiene un effetto piacevole. Da questo momento in poi, lo sperimentatore va a misurare il numero di volte che l’animale preme la leva nell’arco di un determinato tempo.. Mettendo a confronto i dati ottenuti con una sostanza che non da dipendenza (il Bianco) si può ricavare ricavare l’efficacia del rinforzo..ovvero possiamo quantificare le proprietà gratificanti del farmaco. Con questo sistema posso vedere inoltre se l’animale andrà incontro a crisi di astinenza.. Se smettessi di somministrare la sostanza, l’animale rimarrebbe senza scorte :P .. Se fosse diventato dipendente, l’animale inizierebbe ad assumere un comportamento molto particolare (nevrotico xD).. inizia a saltare.. e a scuotersi con le cosiddette “scosse da cane bagnato”… Si può anche valutare l’entità della crisi di astinenza controllando il numero di salti o scosse. La cosa interessante è che provando le sostanze sull’animale, si ottiene lo stesso ordine di dipendenza misurato nell’uomo.. (1°.Cocaina e amfetamine..2°morfina e oppiacei..3° etanolo…). Un altro esperimento è il CONDITIONED PLACE PREFERENCE; serve per misurare il grado di dipendenza psicologica che una sostanza provoca nell’animale. Si ha un’unica camera divisa in 2 compartimenti comunicanti. In uno, il ratto, viene a contatto con un veicolo per la sostanza d’abuso (bianco).. nell’altro viene a contatto con il veicolo + la sost d’abuso. Si può quindi misurare quanto tempo permane nel primo o nel secondo compartimento. Se l’animale permane per più di un tot di tempo nel compartimento dove c’è la sostanza d’abuso, significa che si Pagina | 8

è creata una sorta di dipendenza psicologica. Sul paviemento di questa zona, c’è inoltre una graticella elettrificata, decisamente poco piacevole. Questo permette di dimostrare che si è creato un rapporto coercitivo tra l’animale e la sostanza, in quanto questo è disposto a sopportare una scarica fastidiosa (che in condizioni normali eviterebbe) pur di stare a contatto con il tossico di cui è dipendente. Dunque, perché l’individuo assume sostanze psicoattive pur sapendo le conseguenze? → il tossico provoca un rinforzo positivo che porta a una ricerca ripetuta della sostanza per provare gli stessi effetti piacevoli. Questo comporta l’instaurarsi di processi adattativi (tolleranza) che causano la dipendenza fisica e la sindrome d’astinenza. Inoltre, qualsiasi tipo di sostanza d’abuso dopo il momento iniziale di euforia, provoca uno stato di malessere→ Anedonia (totale mancanza di provare piacere).. Sia lo stato di Benessere che lo stato di Malessere portano l’individuo a ricercare il tossico :-/ …Iniziamo le varie classi di Sostanze d’abuso…

GLI OPPIACEI 

| Deprimenti del SNC

MORFINA:

La morfina, può essere assunta sia per via orale che per via parenterale. Nel caso di somministrazioni orali si avrà il fenomeno del primo passaggio che ne riduce drasticamente i livelli plasmatici. Ad ogni modo una piccola parte potrà agire a livello del SNC dando tra i vari effetti, quello ricercato dai tossicodipendenti → l’ euforia. La morfina è anche in grado di superare la barriera transplacentare, diffondendosi anche nel feto.. (poveretto.. strafatto prima ancora di nascere :P). I composti più lipofili sono quelli che passano meglio la B.E.E., quindi Fentanil ed Eroina provocano degli effetti di “rash di euforia” più potenti di quelli della morfina. Oltre all’euforia, la morfina a lvl centrale da un effetto di analgesia, sedazione, miosi (costrizione della pupilla.. utile in caso di diagnosi di per overdose), Depressione respiratoria, depressione della tosse, nausea e vomito (a causa della stimolazione della chemioreceptor trigger zone) e rigidità muscolare a livello del tronco. A noi però non ce ne sbatte un ca…volo di tutto questo.. e ci interessa solo l’aspetto euforico :D Gli opioidi causano un aumento della conc di dopamina a lvl del sistema limbico. La figura rappresenta il neurone dopaminergico, il cui corpo cellulare si trova nella VTA, che manda la terminazione Dopaminergica nelle aree cerebrali del sistema limbico. Il neurone DA è controllato in senso (-) dai neuroni GABAergici. Gli oppioidi riducono al quantità di GABA liberato.. di conseguenza il neurone DA è Disinibito :D I recettori degli oppioidi si trovano sul neurone GABAergico sia a lvl presinaptico che a lvl del corpo cellulare. Cosa accade nelle due zone?? →

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A lvl del corpo cellulare gli opioidi stimolano il recettore μ legato a proteine Gi, e la subunità β/γ va ad attivare i canali del potassio, causando iperpolarizzazione della membrana → se la membrana è iperpolarizzata, il neurone GABAergico non riesce a trasmettere il segnale dal corpo cellulare alla terminazione, e il neurone non libera più GABA . A livello presinaptico invece, gli oppioidi stimolano sempre il recettore μ .. e sempre la subunità β/γ va a inibire la conduttanza del calcio → VOCC (→ Canali del calcio voltaggio dipendenti). Se il calcio non entra più nella terminazione.. non avremo più la migrazione delle vescicole contenenti GABA sulla membrana presinaptica.. e di conseguenza.. nessun rilascio di GABA  .

I principali effetti periferici degli oppioidi sono a carico del sistema cardiovascolare, con ipotensione (probabilmente dovuta a rilascio di istamina → Vasodilatazione).. e ci sono scarsi effetti per quanto riguarda la frequenza cardiaca. Gli effetti principali sul sistema gastrointestinale sono una diminuzione della motilità intestinale e delle secrezioni, con aumento del tono degli sfinteri → Stipsi Provocano inoltre una diminuzione della funzionalità renale e un aumento della secrezione dell’ormone Antidiuretico ADH. Sia gli effetti centrali che periferici possono andare incontro a Tolleranza… chi più chi meno.. Elevata Analgesia Euforia Sedazione Depressione Respiratoria Effetto antidiuretico Nausea e Vomito Effetto antitussivo

Moderata Bradicardia

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Minima o Assente Miosi Stipsi

Per la maggior parte degli effetti c’è un elevato grado di tolleranza.. → per mantenere la stessa risposta occorre quindi aumentare la dose :-/ Attualmente (2006) la situazione dell’uso di oppioidi (nell’UE) è di 4-5 casi ogni 1000 abitanti tra i 15 e i 64 anni. Tra tutti gli oppioidi l’eroina è quella più usata. Il dato preoccupante è che negli USA e in Canada c’è un uso sempre più frequente di oppioidi prescritti a scopo terapeutico/analgesico.. In particolare Ossicodone e Idrocodone. Questi farmaci sono diventati le principali sostanze di iniziazione.. prima di passare a quelle pesanti (Hanno superato perfino la Cannabis). Al momento in europa prevale invece l’uso dell’eroina.

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EROINA:

Dopo un’iniezione di Eroina per via e.v. abbiamo una serie di effetti tempo dipendenti (alcuni immediati, altri residui).   

Subito dopo l’iniezione l’eroina provoca velocemente un rash euforico molto forte, simile a un orgasmo a livello basso addominale; mentre a lvl mentale si ha uno stato di gratificazione e piacere. Dopo alcuni minuti inizia a instaurarsi uno stato di sedazione che dura circa un’ora durante il quale si registra una riduziuonedell’attività respiratoria. Col passare del tempo va diminuendo l’effetto euforizzante.. e si passa da uno stato di Anedonia fino all’eliminazione completa della sostanza con precipitazione nello stato di astinenza, che si Pagina | 10

verifica max dopo 72 ore… e che impiega una settimana per scomparire. Per evitare il passaggio allo stato di astinenza,il tossicodiepndente assume un’altra dose… =_=” Gli effetti della crisi di astinenza sono esattamente opposti agli effetti dell’eroina. Quindi avremo Midriasi, tachipnea e tachicardia, pelle d’oca (piloerezione), aumento della sudorazione, lacrimazione, aumento degli sbadigli O_o, aumento della pristalsi con vomito e diarrea. Associati a questi disturbi a livello periferico, abbiamo ansia, irritabilità, l’euforia diventa→ Disforia, Insonnia (perdita dell’effetto sedativo), dolori alle ossa e muscolari, aumento della sensibilità e.. Dipendenza… ricerca compulsiva della sostanza (→ Craving)… Per quanto riguarda la morte da Overdose da Eroina esistono ancora delle perplessità sulle cause precise…  

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Una delle prime ipotesi è l’edema polmonare acuto e Depressione Respiratoria Un’altra è l’encefaloleucoplachia sottocorticale.. formazione di lesioni precancerose biancastre.. osservate in questo caso a livello del tessuto nervoso.. sembra essere associato all’inalazione dei vapori di Eroina.. quello che viene chiamato “Chasing the Dragon” (→ Fumando oppio, si forma una scia di fumo particolare che assomiglia quasi alla coda di un drago…. Ok… solo a un drogato può sembrarlo =_=”) Un’altra causa può essere la rabdomiolisi (rottura delle fibre muscolari) dovuta alla compressione di uno o più arti durante un prolungato stato di incoscienza. Non c’è poi da dimenticarsi che con una via di somministrazione parenterale della droga, si è più soggetti a contrarre malattie in caso di poca sterilità.. (HIV e Epatite Virale)

RECUPERO DEL PAZIENTE EROINOMANE: Il processo è lungo e complesso.. possiamo fare interventi di tipo farmacologico e terapie di supporto psicologico… Intervento farmacologico significa usare un altro tipo di oppioide. I più diffusi sono il Metadone e la Buprenorfina, però si può usare anche la stessa eroina . Da 15 anni in svizzera stanno usando questo protocollo di recupero (eroina)… l’uso di eroina è strettamente controllato. Gli obiettivi della terapia sostitutiva possono essere a Breve termine o a Lungo termine. Lo scopo di quella a breve termine è convincere il tossicodipendente a iniziare il trattamento e alleviare i sintomi dovuti ad astinenza. C’è da sapere che per quanto le crisi di astinenza da metadone siano più leggere, la durata è molto più lunga (settimane)… per questo oltre il 40% dei tossicodipendenti abbandonano la terapia sostitutiva.. Lo scopo del trattamento a lungo termine è quindi trattenere il paziente nel programma di trattamento, ridurre le dosi, stabilizzare l’uso di eroina.. ecc… Il METADONE è uno dei farmaci oppioidi maggiormente usati per il recupero.. Ha azion μ agonista, ha attività analgesica, e viene somministrato in un’Unica dose Giornaliera.. di giorno in poi si riduce la dose iniziale di un max del 5%.. Il tasso di abbandono è di oltre il 40%. L’altro oppioide usato nella terapia è la BUPRENORFINA, agonista parziale dei recettori μ, ha una durata d’azione più lunga, e viene generalmente somministrato per via sublinguale o parenterale. La buprenorfina

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è più attiva.. e 8 mg sono paragonabili ai 40 del metadone. Avendo lunga emivita, la somministrazione è ogni 2-3 giorni. Altri oppioidi sono il NALOXONE e il NALTREXONE. Sono degli antagonisti del recettore per gli Oppioidi.. Hanno una struttura perfettamente complementare al recettore, di conseguenza non inducono cambi conformazionali tali da attivare una risposta biologica. Queste molecole riescono ad antagonizzare l’effetto della morfina o di altri agonisti dei recettori μ entro 1-2 minuti. L’intossicazione acutada oppioidi è caratterizzata da una:     

minore ferquenza respiratoria (2-3 atti al minuto) miosi Sedazione … → Coma.. Ipotensione … → Shock Ipotermia, ipotono muscolare, anuria.

Nel caso di individui tossicodipendenti, la somministrazione di questi farmaci scatena una crisi di astinenza. ….Vediamo ora altre sostanze….

GLI PSICOSTIMOLANTI

– Amfetamina | Cocaina | Caffeina | Nicotina

Queste sostanze sono ricercate dal tossicodipendente, in quanto aumentano le performance fisiche e psichiche, e rendono l’individuo più attivo e pronto per affrontare le attività quotidiane e non.. In questa categoria rientra anche la caffeina.. ad ogni modo, non rientra tra le sostanze proibite..idem per la nicotina. Come funziano queste sostanze? → iniziamo da Cocaina e Amfetamina. Hanno un meccanismo un po’ diverso, ma entrambe vanno ad aumentare la disponibilità sinaptica delle catecolamine. La COCAINA va ad agire sulla terminazione presinaptica del neurone DA, bloccando la pompa che permette il reuptake della Dopamina (e delle altre catecolamine) nella terminazione nervosa. In questo modo si ha l’aumento di disponibilità delle catecolamine a livello sinaptico → maggior risposta biologica. Le AMFETAMINE sono delle amine simpaticomimetiche indirette.. Queste molecole vengono portate all’interno della terminazione nervosa dallo stesso trasportatore delle catecolamine endogene.. a questo punto, le amfetamine vanno a bloccare il trasportatore che permette l’accumulo di Serotonina, Dopamina o Noradreinalina nelle vescicole. Queste quindi rimangono libere nel citoplasma.. quando le concentrazioni sono troppo elevate, le catecolamine escono per Inversione del canale a uniporto. 

AMFETAMINE:

Ne esitono vari derivati.. l’uso terapeutico è molto raro.. prevalentemente sono interessanti dal punto di vista tossicologico. Andando ad aumentare la quantità di Catecolamine endogene (NA,DA,5-HT) Pagina | 12

determinano un’azione stimolante a livello del SNC.. ricercata dal consumatore di amfetamine (altrimenti chiamato drogato :P). Quest’azione stimlante si trasforma nell’individuo in un: Aumento della vigilanza e della capacità di concentrazione, Aumento delle performance fisiche e mentali, Aumento dell’Eloquio verbale (socializzazione), Riduzione del senso della fatica, Effetto anoressizzante (meno fame).. Riduzione del Sonno. Tra gli effetti comportamentali abbiamo appunto l’euforia dovuta all’aumento della DA nei centri della gratificazione e ricompensa nel sistema limbico. Le amfetamine hanno un ottimo assorbimento per via Orale.. Si concentrano a livello del Cervello.. e anche Fegato e reni. Vengono metabolizzate ed eliminate per via renale. Per velocizzare l’eliminazione per via renale si può ricorrere all’acidificazione delle urine/sangue tramite infusione di cloruro d’ammonio. Viene assunta generalmente sottoforma di Pastiglie o Capsule.. ma anche per via endovenosa, e inalata sottoforma di polveri o vapori (dopo il riscaldamento). Le Amfetamine sono anche NEUROTOSSICHE. Effetto diretto di distruzione neuronale. Le aree più colpite sono 

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l’Ippocampo (del sistema limbico.. è maggiormente coinvolto nelle funzioni cognitive come Memorizzazione e apprendimento → LTP long term potenziation). Un danno a questo livello può causare compromissione permanente delle funzioni cognitive. Altri due nuclei colpiti sono il Caudato e il Putamen, che costituiscono lo Striato.. zona del cervello in cui arrivano le terminazioni dopaminergiche dalla Substantia Nigra che controllano e regolano l’attività di altri neurotrasmettitori come il GABA e Glutammato, e in questo modo controllano il movimento. → Un danno in queste aree causa quindi compromissione delle funzioni motorie; Lo stesso per i Nuclei talamici, sempre coinvolti nelle funzioni motorie.. Con compromissione delle funzioni somatosensoriali.

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LE TOSSICODIPENDENZE:

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Parte Terza

19-10-11

Le AMFETAMINE hanno uno scarsissimo impiego terapeutico, infatti gli unici usi sono rivolti verso i Narcolettici :D.. Si usa un derivato che da meno effetti collaterali→ il Modafinil. L’altro utilizzo, è per la sindrome da iperattività nei bambini e deficit dell’attenzione O_o” .. sembra un controsenso, ma l’amfetamina permette di concentrare l’attenzione del bambino su una determinata attività da svolgere. Dal punto di vista tossicologico, le amfetamine inducono Tolleranza, Dipendenza Fisica (soprattutto in caso di somministrazioni parenterali.. più raro per via orale).. e dipendenza Psicologica → “Craving” (la ricerca compulsiva della sostanza). Per quanto riguarda l’ulitizzo di amfetamine nel mondo abbiamo vari dati; prima di tutto c’è da dire che le amfetamine sono facilmente reperibili e a basso costo… L’amfetamina più reperibile è la MDMA → Metilendiossimetamfetamina (Ecstasy).   

Negli Stati uniti oltre 11 milioni di individui dai 12 anni in su hanno fatto uso di Ecstasy almeno una volta nella vita. In Europa: 8,5 milioni di adulti ne hanno fatto uso.. in particolare in Regno Unito e Spagna Anche l’Italia non scherza… → dai 50k agli 85k giovani (tra i 15 e 25 anni) fanno uso di Ecstasy ogni settimana in discoteca.

In base alle modalità di assunzione possiamo avere diversi effetti… Nel caso di una sola dose parliamo di “Fuga”; in caso di somministrazioni e.v. ripetute si raggiunge uno stato più profondo (dovuto al fatto che l’amfetamina arriva + velocemente al cervello) definito “Rush” → l’effetto basso addominale che mima l’orgasmo sessuale. Questi effetti euforizzanti vanno incontro a tolleranza, che si sviluppa abbastanza velocemente, nel giro di 4-6 ore. Lo stesso accade per l’effetto anoressizzante (calo dell’appetito). Tutti gli effetti che seguono a un uso cronico delle amfetamine, vanno a modificere alcuni aspetti dell’individuo, a cominciare dal: 

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Ritmo Sonno-Veglia →viene completamente alterato, in quanto queste sostanze determinano insonnia.. il corpo ovviamente non può superare indenne in eterno questo ritmo di iperattività, e ne consegue un crollo psico-fisico) Si evidenziano inoltre in questi individui dei Comportamenti Psicotici → Forme Maniacali.. manie di persecuzione.. ed è nota questa psicosi causata dall’amfetamina.. come se la pelle fosse invasa da insetti :S (bleah…) La mancanza di sonno e la minore assunzione di cibo, con il proseguire del tempo, porta a un Crollo psicofisico Totale.

Una OVERDOSE di Amfetamina, può causare gravi danni sia psichici/neurologici.. che a carico del sistema cardiovascolare (In quanto aumentano la disponibilità di NA, aumentando di conseguenza l’attività cardiaca)

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A livello cardiovascolare potremo quindi avere un’insorgenza di Aritmie Cardiache, Ipertensione (Soprattutto inizialmente per l’effetto vasocostrittore) che poi si trasforma in Ipotensione quando si ha il collasso circolatorio. La vasocostrizione a livello cutaneo determina impallidimento e cute fredda. A livello del SNC, l’effetto euforico è portato all’esasperazione.. seguito da tremori, aumento dell’irritabilità, insonnia (ormai insostenibile) fino ad arrivare a delle vere e proprie crisi convulsive ..e l’individuo perde la capacità di pensare in maniera coerente. L’overdose determina inoltre un aumento della temperatura corporea (ipertermia)… Immaginiamoci l’assunzione di amfetamina in una discoteca.. dove c’è molto caldo.. senso della sete ridotto.. (e se bevono.. certo non si tratterà di Acqua minerale naturale =_=”) → Si avrà uno stato di disidratazione, potenziato dall’assunzione di alcolici che andranno ad aumentare gli effetti dovuti alla depressione del snc.. queste

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persone vanno facilmente incontro al collasso.. e Morte…

Se venisse interrotta bruscamente l’assunzione di amfetamine, si andrebbe incontro a sindrome di astinenza che si sviluppa nell’arco di una giornata dalla sospensione. L’apice lo si raggiunge ne primi 2-4 giorni, e il malessere generale può durare per parecchi altri. E’ caratterizzata da un forte stato depressivo Sia fisico che Psichico, Irritabilità, ansia, fino ad arrivare a idee suicide. 

ECSTASY:

E’ la Metilen-diossi-metamfetamina (MDMA); la principale usata per sballarsi nei giovani. Ha lo stesso meccanismo d’azione delle amfetamine; ma.. questo derivato, sembra essere più affine per il trasportatore della Serotonina (5-HT), aumentando di conseguenza la sua disponibilità sinaptica. La serotonina è probabilmente il neurotrasmettitore che può interagire con il più gran numero di recettori.. e ogni anno escono nuovi sottotipi. La sua azione è quindi una delle più complesse, con svariati effetti, a seconda del recettore presente sulla cellula :-/ L’Ecstasy ha azione neurotossica, perché porta alla formazione di specie radicaliche dell’ossigeno (che distruggono la composizione della membrana cellulare, andando ad agire sui fosfolipidi e sulle proteine intracellulari – enzimi inclusi – e agiscono inotre sul DNA.) Come per le amfetamine in generale, ha effetti negativi sul sistema cardiovascolare, aumenta la temperatura corporea.. e la formazione di radicali a lvl epatico porta a Epatotossicità. La tossicità a carico del SNC prevede una insorgenza di vari effetti a livello temporale.. Le solite cose dette per le Amfetamine… :P … passiamo alla Cocaina :DD… 

COCAINA:

La sua origine naturale è una pianta, la Erithroxylon coca. L’assorbimento può avvenire per via orale (anche masticando le foglie di Coca), ma soprattutto la via più diffusa è la via intranasale, in cui vi è un rapidissimo assorbimento; quest’assunzione però comporterà a lungo andare seri danni. La cocaina è un vasocostrittore e l’uso ripetuto attraverso la via inalatoria porterà a necrosi della cartilagine del setto nasale. L’assorbimento per via parenterale è più lento.. proprio per il fatto che la cocaina provoca vasocostrizione. Nel caso la cocaina fosse assunta per via nasale, si parla di “snorting”, e si tratta della forma salificata: “cocaina cloridrato”. Alternativamente si parla del “crack”, in cui ha la forma di base libera, ottenuto riscaldando la forma salificata con bicarbonato; e può essere fumato. L’effetto di questo è molto più intenso e viene definito “Rush” a livello del SNC. Pagina | 15

Passa sia la BEE che la barriera placentare.. Ne consegue, che dati i suoi effetti vasocostrittori, possa ridurre l’irrorazione della placenta, e quindi l’apporto di ossigeno e altre sostanze da scambiare con il sangue fetale. Il meccanismo d’azione è sempre lo stesso → blocca i trasportatori a livello presinaptico delle catecolamine endogene (DA, 5-HT, NA). Gli effetti centrali della cocaina (euforia/gratificazione/eccitazione) sono principalmente dovuti all’aumento della concentrazione di Dopamina nel sistema limbico. Come per le Amfetamine riduce la necessità di cibo, e del sonno (causando quindi alterazioni del ciclo sonno veglia) Gli effetti periferici sono prevalentemente a carico del sistema cardiovascolare (dato che aumenta la disponibilità delle catecolamine).. quindi avremo un aumento della frequenza cardiaca, aumento della pressione arteriosa, alterazioni del ritmo cardiaco, ipertermia… per la vasocostrizione periferica→Pallore.. ritenzione urinaria… e.. midriasi. Negli USA si registra ogni anno un aumento progressivo dell’uso della cocaina, in particolare vi è un aumento del Crack; mentre in Europa c’è un andamento più stabile. Molto interessanto è il fatto che si possano stabilire i livelli di uso della cocaina in una popolazione tramite le analisi dell’inquinamento ambientale→ ovvero andando a dosare i livelli di cocaina e metaboliti nelle acque reflue delle grandi città. Lo studio ha rilevato l’incremento dei livelli di cocaina nelle acque di scarico proprio nei finesettimana, che va a confermare l’uso ricreativo di questa sostanza. La TOSSICITA’ ACUTA da Cocaina (Overdose) provoca dei sintomi a livello cardiovascolare e neurologico; con    

alterazione della perfusione cerebrale (vasocostrizione che può portare a ischemia e quindi a Ictus)… Infarto miocardico (con compromissione del ritmo cardiaco, della frequenza e della forza di contrazione).. psicosi tossiche (il cocainomane ha manie di persecuzione) Ma lo stato più grave è l’insorgenza di Convulsioni.. e la morte può intervenire per arresto cardiaco

Non esistono dei rimedi che vadano ad antagonizzare direttamente un recettore (in quanto la cocaina agisce su un trasportatore)… di conseguenza non si hanno a disposizione degli “antidoti” da somministrare in caso di overdose (come invece nel caso dell’eroina). La terapia è prettamente sintomatica… posso usare:  

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La Lidocaina → è un Antiaritmico (per cercare di riportare il ritmo cardiaco nella norma) Ca-Antagonisti → Riducendo la disponibilità di Ca a livello della cellula vanno a ridurre la forza di contrazione cardiaca quindi il lavoro.. e la frequenza.. causando anche una diminuzione della pressione. L’Aspirina → in genere usata come antiaggregante piastrinico (per evitare l’infarto acuto del miocardio) Le Benzodiazepine → ovviamente per la loro azione anticonvulsivante.

La TOSSICITA’ CRONICA (che interviene con un uso prolungato e ripetuto della sostanza d’abuso) prevede stati di ansia e irritabilità, con stati psicotici e un aumento dell’aggressività (sia verso se stessi che verso gli altri).. una riduzione delle performance sessuali, e perforazione della parete cartilaginea del setto nasale

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(nel caso di “snorting”). Passando la barriera transplacentare provoca danni nel feto, e oltre a ridurre la perfusione può causare ritardo dello sviluppo fetale. In caso di assunzioni multiple in tempi brevi “binghing” avremo che la concentrazione plasmatica della cocaina è fluttuante, deterimnando degli stati on-off con momenti di picco, in cui vi è un’azione molto intensa. Quando finiscono le fluttuazioni significa che la concentrazione di cocaina sta calando.. quando sarà stata quasi completamente eliminata dall’organismo si arriverà a una fase di completa prostrazione definita “crash” → crollo psicofisico, che può durare anche numerose ore. La Tolleranza, insorge nel giro di 4h (più o meno come per l’amfetamina)… A cosa è dovuta?? → Si ipotizza una down-regulation dei trasportatori o dei Recettori per le catecolamine endogene. Va incontro a tolleranza quindi l’effetto euforizzante, e tutti gli effetti periferici.. I sintomi Psicotomimetici vanno incontro a Tolleranza Inversa → L’organismo diventa più sensibile al prolungarsi dell’uso della sostanza.. Ogni volta, la risposta biologica sarà più forte… questo per quanto riguarda: Impulsività, convulsioni, tensione… La Dipendenza psichica interviene provocando stati di ansia e irritabilità, inducendo il “craving”.. Anche per l’uso cronico della cocaina non c’è un rimedio.. ma occorre sempre un approccio sintomatico…   

Antidepressivi Carbamazepina → Anticonvulsivante Buprenorfina → (usata per il recupero dei tossicodipendenti).. non si sa ancora con quale meccanismo, ma si è rivelata utile per ridurre la sintomatologia da astinenza della cocaina.

In una nuova ricerca (beh.. non tanto nuova…) sembra stiano preparando un trattamento con anticorpi anti-cocaina, che ne impediscano il passaggio tramite la BEE a causa della formazione del complesso. 

CAFFEINA:

Continuiamo con gli psicostimolanti :D Ovviamente la caffeina non fa parte delle sostanze proibite, ma rientra comunque tra le sostanze d’abuso, in quanto crea nell’individuo un discreto stato di dipendenza.. (confermo :P) Viene assorbita velocemente per via orale.. attraversa la barriera ematoencefalica.. svolgendo così il suo effetto psicostimolante a livello del snc e supera anche la barriera placentare. Fa parte delle basi Xantiniche come la Teofillina e la Teobromina.. Questi composti hanno un meccanismo d’azione duplice.. Vanno ad agire come antagonisti dei recettori dell’Adenosina (neuro modulatore che agisce su svariati recettori – A1, A2, A3 –).. in particolare la caffeina inibisce gli effetti inibitori dell’adenosina mediati dai recettori A1 e A3 associati alla proteina Gi → che va a inibire l’adenilato ciclasi → quindi si ha una riduzione del cAMP… Inoltre, la stimolazione di questi recettori va a ridurre la conduttanza al Calcio e ad aprire i canali del Potassio, causando iperpolarizzazione. La Caffeina dunque fa esattamente il contrario… Il recettore non viene più stimolato.. quindi non si ha l’inibizione dell’adenilato ciclasi e dei canali del calcio.. Pagina | 17

e nemmeno l’attivazione dei canali del potassio. In poche parole, con la caffeina abbiamo un:   

Aumento del cAMP Aumento delle conduttanze del Ca++ (la cellula si arricchisce di calcio) Riduzione delle conduttanze del Potassio (la cellula si depolarizza più facilmente)

L’altro meccanismo d’azione è il Blocco dell’enzima deputato alla degradazione del cAMP → le Fosfodiesterasi. In questo modo si ha un aumento citoplasmatico del cAMP. Cosa fa il cAMP? → attiva la Protein Kinasi A.. che da inizio a un puttanaio di cascate enzimatiche (Parole di Gavi0lì :P).. In questo modo, la membrana cellulare è facilitata ad andare incontro a depolarizzazione.. quindi alla conduzione di uno stimolo nervoso.. A seconda della localizzazione di questi recettori nelle cellule dei vari tessuti, cambierà il tipo di effetto. Possiamo quindi dividerli in Effetti a livello Centrale e a Livello Periferico.. A livello centrale, abbiamo gli effetti che ci permettono di affermare che la caffeina genera dipendenza.. questo perché agisce come le altre sostanze d’abuso viste prima, generando un rinforzo positivo… Supera la BEE, portando indirettamente a un aumento della segnalazione dopaminergica nel sistema limbico.  

Aumento dell’attenzione, del senso di vigilanza, delle capacità memorizzanti E soprattutto riduzione del senso di stanchezza.

Dal 2004 non è più considerata una sostanza dopante (in ambito sportivo) ma ad ogni modo è stata inserita in un “programma di monitoraggio” per poterne valutare un uso improprio. Il Limite di conc è di 12 μg/mL nelle urine.. che corrisponde a una dose di 500 mg → 5-6 tazzine bevute insieme di caffè O_o” Per quanto riguarda gli Effetti Periferici, abbiamo: 

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Azioni a livello cardiaco (aumentando il cAMP .. aumentando le conduttanze del Calcio.. e riducendo quelle del potassio, si favorisce una maggiore forza di contrazione e della frequenza cardiaca) Vasodilatazione delle coronarie (quindi un aumento del sangue a livello cardiaco.. è logico che un cuore che lavora molto, abbia anche bisogno di un maggiore apporto di sangue–/→Ossigeno L’azione vasodilatatoria non si verifica a livello dei vasi cerebrali, in quanto si ha vasocostrizione.. (è per questo che in casi di emicrania è consigliabile prendersi un’aspirina e un caffè :P) Rilasciamento della muscolatura liscia bronchiale (effetto antiasmatico) Aumenta la secrezione acida dello stomaco E ha Effetto Diuretico.

Dal punto di vista tossicologico, la caffeina rientra nella formulazione di alcuni Integratori più o meno proibiti.. un esempio è l’ECA Stack… Non ammesso in molti paesi, perché contiene l’efedrina… Il cocktail si compone di: Efedrina, Caffeina e Aspirina. Il risultato dell’assunzione è l’incremento della termogenesi (per aumentato metabolismo dei grassi), incremento della lipolisi nelle cellule grasse e della sintesi proteica nelle cellule muscolari.. Si ha inoltre diminuzione del senso di fame e della Fatica…. I principali effetti collaterali si evidenziano a carico del sistema cardiovascolare.. con aumento della pressione , tachicardia.. associati ad effetti a livello centrale → agitzione, ansia, nervosismo e depressione. La caffeina determina un blanda sindrome d’astinenza.. l’interruzione può portare agli Pagina | 18

effetti opposti all’assunzione.. quindi si riduce la capacità di attenzione, e memorizzazione, una riduione delle prestazioni fisiche e motorie e vi è una parziale forma di “craving”.. ricerca (non compulsiva) della sostanza. …e ora.. per ultima.. la: 

NICOTINA:

Anche la nicotina ha come origine naturale una pianta, la Nicotiana Tabacum; è un agonista dei recettori Nicotinici che hanno preso questo nome proprio perché la nicotina è il loro miglior agonista….Questi recettori sono di tipo ionotropo, costituiti da 5 subunità, che formano una specie di imbuto a livello della membrana cellulare e l’interazione della nicotina con i siti recettoriali normalmente occupati dall’acetilcolina, porta all’apertura del canale ionico con il passaggio di sodio (verso l’interno) e di potassio (verso l’esterno)… questo determina depolarizzazione della membrana, a cui segue l’attivazione di altri canali voltaggio dipendenti come quello del calcio. La nicotina viene assorbita velocemente attraverso l’apparato respiratorio.. ma anche attraverso la mucosa orale e la pelle. Questo è un effetto sfavorevole.. perché la nicotina fa parte di alcuni pesticidi, quindi il contatto occasionale con questi, permette il suo assorbimento attraverso lo strato cutaneo… Passa la BEE e la barriera placentare.. e può passare anche nel latte.. Viene eliminata per via renale… Tossicità Acuta: si può parlare soprattutto di incidenti che possono accadere nei bambini, i quali possono ingoiare parti di sigaretta, assumendo in questo modo alte dosi di nicotina… o in caso di lunghe esposizioni e contatti con pesticidi che la contengono. La dose Letale si è calcolato essere tra i 40 e i 60 mg, assunti in una volta sola… quindi non c’è il rischio di intossicazione fumando una sigaretta, in quanto contiene circa 10 mg e permette un’assunzione sistemica di solo 1-2 attraverso il fumo inalato… I sintomi dell’intossicazione acuta che si verificano in brevissimo tempo dall’assunzione (15-30 min), sono:    

A livello gastrointestinale: Vomito (per stimolazione del CTZ ..poco protetta dalla BEE).. salivazione (effetto del sistema parasimpatico) e Dolori addominali. Cefale.. sonnolenza Disturbi visivi e uditivi Confusione mentale e debolezza...

→…Questi erano gli effetti più lievi… quelli più gravi sono: 

Blocco respiratorio dovuto in parte all’azione centrale della nicotina, che provoca il blocco della respirazione.. e in parte perché a livello della placca neuromuscolare, la stimolazione continua dei recettori nicotinici provoca la loro desensibilizzazione.. e quindi paralisi.. :-/

Il trattamento da un’intossicazione può essere di tipo sintomatico… quindi possiamo somministrare una benzodiazepina per alleviare le convulsioni.. Oppure posso indurre il vomito prima di un’eventuale assorbimento (solo se si è tempestivi) …. (¿… e iniettargli una dose di atropina o un fracco di oxibutinina?.. mah…) Se il paziente sopravvive alle prime 4 ore, si ha il pieno recupero dell’individuo intossicato… a meno che non ci siano stati gravi casi di ipossia..

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Tossicità Cronica: Quando fumiamo una sigaretta, ovviamente non introduciamo solo nicotina, ma anche un altro gran numero di sostanze.. ad esempio, catrame e monossido di carbonio. Per cui, i danni a livello dei vari organi sono dovuti a una sommatoria di effetti causata da questa miscela di composti :S Potremo avere: 

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Danni cardiovascolari, dovuti a:  un aumento del lavoro cardiaco (causato dalla nicotina)  Un ridotto apporto di ossigeno.. (dovuto al monossido di carbonio che lega saldamente l’emoglobina)  Un aumento dell’incidenza di aterosclerosi.. (quindi una maggiore facilità di sviluppare placche ateroma tose e Trombi) Danni Broncoplmonari dovuti sempre a questo mix di sostanze.. con  Infiammazioni croniche dei bronchi  Enfisema polmonare  Peggioramento dell’asma  In particolare, sono responsabili dell’instaurarsi di neoplasie in tutto l’apparato respiratorio

Fumare durante la gravidanza non è consigliabile… perché a causa dell’effetto vasocostrittore della nicotina si ha anche una ridotta perfusione del feto.. e questo determinerà un ritardo dello sviluppo fetale.. un maggior rischio di parto prematuro, un minor peso del neonato alla nascita.. che dipende dalla dose di nicotina.. in particolare, il minor apporto di ossigeno dal sangue materno, può determinare deficit intellettivi e fisici. La nicotina (come abbiano già visto) fa parte della Seconda Classe di sostanze d’abuso…va ad agire sui recettori nicotinici (ionotropi) presenti sui neuroni dopaminergici che dalla VTA proiettano alle varie aree del sistema limbico.. Di conseguenza aumenta direttamente la liberazione di Dopamina in queste zone. Dall’indagine del 2008, è emerso che in Italia fuma il 22% della popolazione, con un’età superiore ai 15 anni….Come si può andare incontro alla dipendenza da Nicotina?? → abbiamo 3 tipi di terapia… 1- Sostituire il fumo di sigaretta con altre forme di assunzione della nicotina.. come gomme da masticare.. cerotti transdermici a rilascio graduale….oppure Spray nasali o Inalatori… Questo primo approccio, permette di mantenere discrete concentrazioni di nicotina nel sangue, per evitare la crisi di astinenza.. questi 4 grafici rappresentano le curve di concentrazione plasmatica della nicotina, assunta mediante diversi veicoli... 2- Il secondo prevede l’uso del Bupropione.. è un antidepressivo atipico.. perché oltre a bloccare in modo blando il reuptake della noradrenalina e dopamina, è anche un agonista parziale dei recettori nicotinici.. Peccato che col passare del tempo si sia scoperto aumentare il rischio di Infarto =_=” 3- Alternativamente vi è il trattamento con la Vareniciclina che va a bloccare i recettori nicotinici α4β2→ quelli presenti sui neuroni dopaminergici nella VTA.. Ha un’efficacia superiore a quella del bupropione.. in compenso può dare degli effetti collaterali come il peggioramento di patologie psichiatriche preesistenti. Pagina | 20

GLI PSICHEDELICI –

LSD | Mescalina| Fenciclidina | Psilocibina

Altro gruppo… gli allucinogeni psichedelici… hanno tutti gli stessi effetti.. alterando nell’individuo la percezione di se stessi e della realtà esterna… Che hanno in comune tutte queste sostanze? → hanno una struttura chimica che si avvicina a quella della serotonina (5-HT).. →→→   

LSD.. Dietilamide dell’acido lisergico.. Prodotto di semisintesi.. Psilocibina e Psilocina…sono allucinogeni contenuti nei funghi del genere Psylocibe Mescalina.. ottenuta da un cactus che si trova in messico → Peyote.

Hotlinks:  

Registrazione Parte 1: Registrazione Parte 2:

2 Ore di Lezione ¼ Credito

Tutto il materiale fornito è ottenibile frequentando una normale lezione universitaria. Non mi prendo alcuna responsabilità sui contenuti e sulla loro diffusione. Il download è a vostro rischio e pericolo. Pagina | 21

TOSSICOLOGIA – TOSSICODIPENDENZE

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Parte Quarta

24-10-11

Riprendiamo gli Psichedelici e Allucinogeni.. L’effetto di queste sostanze è di alterare la percezione della realtà circostante.. Come funziano?? → Hanno un effetto simile alla 5-HT, e vanno a stimolare prevalentemente il sottotipo 5-HT-2A. Questo recettore è di tipo eccitatorio metabotropo, collegato a una Gprotein; la Gq → Quella che permette l’attivazione della Fosfolipasi C.. che produce DAG e IP3.. con conseguente aumento del Ca++ intracellulare per svuotamento dei depositi.. e attivazione della Protein Kinasi C.. che fosforila determinate proteine/enzimi… (il solito puttanaio di cascate enzimatiche :P)… A livello del SNC vengono attivate alcune aree cerebrali maggiormente coinvolte nell’area affettiva ed emotiva → Corteccia Cerebrale e Locus Coeruleus. Attraverso la stimolazione dei recettori presenti in queste aree, si ha l’alterazione di alcuni aspetti comportamentali; in primis il Tono dell’Umore, la temperatura corporea, il comportamento sessuale, il controllo della muscolatura e la percezione sensoriale. Le reazioni dovute alla somministrazione di un allucinogeno possono interessare le normali funzioni fisiologiche o riguardare gli aspetti emotivi e sensoriali. Le Variazioni Fisiologiche sono a livello Cardiocircolatorio (con aumento della pressione arteriosa e aumento della frequenza), Ipertermia, Vertigine, perdita dell’appetito, secchezza delle fauci, aumento della sudorazione, nausea, iperattività dei riflessi muscolari. Ma quello che ci interessa maggiormente sono le reazioni di tipo percettivo ed emotivo.. abbiamo, uno stato di confusione percettiva e cognitiva, con perdita del senso dei confini spaziotemporali, allucinazioni di tipo geometrico, flash di colori.. gli oggetti sono circondati da aloni luminosi e risultano amplificati i colori, rumori, odori. Quando un individuo assume allucinogeni si dice che inizi un “viaggio” definito “Trip”, in un mondo irreale… Da questo TRIP derivano delle sensazioni che possono essere piacevoli (se va bene) “Good TRIP” altrimenti sono esattamente l’opposto → “Bad Trip”. Un’altra caratteristica interessante degli allucinogeni è l’esperienza di FlashBack… ovvero, dopo che l’individuo ha fatto uso di allucinogeni per un certo tempo, e ha provato determinate sensazioni.. allo stop dell’assunzione si può verificare che l’individuo torni a provare quelle stesse sensazioni.. pur non essendo sotto l’effetto dello stupefacente. Nel DSM-IV, questo è definito come Disturbo Percettivo postallucinogeno. …Come compaiono questi Flashback?? → in genere basta un piccolo stimolo (anche insignificante).. come vedere i fanali di un’auto o le luci psichedeliche della discoteca.. Generalmente questi non sono positivi, ma fanno rivivere sensazioni di angoscia e di ansia. Gli altri tipi di “allucinogeni” sono le

Droghe Dissociative..

che danno una

sensazione di distacco dall’ambiente circostante e dal proprio corpo. Queste droghe sono nate (e alcune sono tutt’ora usate) come anestetici in chirurgia. Il capostipite è la Fenciclidina (PCP), nota anche come polvere d’angelo. L’altra è la Ketamina (chiamata anche Special K.. come i cereali :P).. ha una durata d’azione inferiore. Hanno un meccanismo d’azione completamente diverso dagli allucinogeni .. Agiscono in un sito specifico all’interno del recettore NMDA del Glutammato, alterando quindi la trasmissione eccitatoria glutammatergica. Questo recettore è molto complesso e possiede numerosi siti allosterici che modulano l’apertura del canale attraverso il quale passa il Calcio; tra di questi ci sono appunto i siti di interazione della Fenciclidina e Ketamina. In condizioni normali, il Pagina | 22

recettore stimolato dal glutammato si apre e fa passare il calcio.. In presenza di PCP e SpecialK, il passaggio dello ione è impedito. Queste sostanze sono Assunte in genere per via Inalatoria (via più rapida di assorbimento).. inoltre, dopo il metabolismo e l’escrezione per via intestinale, possono essere riassorbite (¿Circolo entero epatico → Glucuronazione/Glucuronidasi?).. prolungando il loro effetto. Antagonizzano non competitivamente il recettore NMDA, in quanto agiscono all’ INTERNO del recettore, in un altro sito rispetto al glutammato. Poiché il glutammato è implicato nella percezione del dolore, è logico che queste sostanze siano nate per la loro azione anestetica. Però questo recettore è anche coinvolto nella responsività all’ambiente esterno, apprendimento e memorizzazione. Proprio a causa del blocco di questo recettore, vengono alterati tutta una serie di meccanismi cognitivi. Gli effetti possono essere diversi a seconda della concentrazione della Dose. Per Bassi dosaggi, si ha un distacco dall’ambiente esterno, incapacità di colloquiare con gli altri, mancanza di coordinazione ed equilibrio. Ad Alte Dosi, gli effetti sono più intensi, quindi si arriva a una distorsione della percezione visiva,alterazioni del tono dell’umore, perdita della memoria, aumento degli atteggiamenti aggressivi verso se stessi e verso gli altri. Di tutte le sostanze psicostimolanti di questo genere, la Fenciclidina è l’unica che nelle prove sugli animali (test di auto somministrazione) da l’effetto d’abuso. Nell’uomo provoca prevalentemente uno stato di dipendenza psicologica “Craving” e in caso di cessata somministrazione, si verifica una sindrome di astinenza causata da perdita di memoria e un profondo stato depressivo, che dura anche parecchi mesi. Non esistono terapie antagoniste.. ma accorrono terapie di supporto come Benzodiazepiene (→ anticonvulsivanti), Neurolettici/antipsicotici e terapia psichiatrica/psicologica di supporto, che aiuti a recuperare le normali percezioni dell’ambiente esterno, in assenza di queste sostanze.

…..E chiudiamo così le Tossicodipendenzeeee‼….

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TOSSICOLOGIA – Gli ANTIDOTI

| 21:00 (delle registrazioni)

Adessso vediamo gli antidoti, ovvero le sostanze che possono essere usate in caso di intossicazioni… capitolo molto breve (per fortuna).. Alcune di queste sostanze hanno un meccanismo d’azione generale e sono quindi adatte per svariati tipi di intossicazione; altre invece sono specifiche per determinati tossici. Ovviamente un antidoto deve antagonizzare l’effetto del tossico. Una prima classe quindi può essere quella che ne PREVIENE L’ASSORBIMENTO: 

I più generici sono gli EMETICI, che inducendo il vomito permettono l’eliminazione del tossico ancora prima che questo possa essere assorbito a livello gastrointestinale. Un potente emetico è ad esempio la: o Polvere di ipecacuana che contiene l’ EMETINA, la quale stimola la CTZ, (chemio receptor trigger zone) zona che si trova sul pavimento del quarto ventricolo ed è scarsamente protetta dalla Barriera Emato Encefalica. Per cui riescono a raggiungerla molte sostanze tossiche di natura lipofila, che stimolandola inducono l’emesi, riducendo di conseguenza l’assorbimento di buona parte del tossico.

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L’eliminazione, oltre che attraverso il vomito, può avvenire nel tratto intestinale, utilizzando dei PURGANTI DRASTICI :P come ad esempio o Solfato Di Magnesio o di Sodio (purganti osmotici) che all’interno dell’intestino non vengono assorbiti, ma richiamano acqua.. l’aumento del volume del lume intestinale stimola le pareti della mucosa, provocando un aumento della peristalsi e favorendo l’evacuazione del contenuto intestinale (..bleah…)

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Poi abbiamo una serie di sostanze definite: ADSORBENTI/DILUENTI/INATTIVANTI; associato all’uso di queste sostanze vi può essere la gastrolusi (lavanda gastrica) o la catarsi (azione purgante) o Il Carbone Attivo noto come agente adsorbente, con una struttura molto porosa costituita da microcristalli di grafite che intrappola le sostanze tossiche.E’ opportuno utilizzarlo entro 30 minuti dall’intossicazione. E’ un antidoto quindi molto generico :D o L’Olio di Vaselina, è talmente lipofilo che attraversa il canale gastrointestinale senza essere assorbito; nel suo transito trascina però tutti i tossici di natura lipofila, impedendone l’assorbimento o L’Albume d’uovo sbattuto nel latte; che contiene delle proteine che vanno a formare dei proteinati insolubili con i metalli pesanti o con le sostanze caustiche. o L’Amido, può essere utilizzato in caso di intossicazioni con lo iodio, che lo complessa limitandone l’assorbimento. o Dimeticone, viene usato per le sostanze schiumogene come detergenti, riduce la tensione superficiale, facendo scoppiare le bolle della schiuma antagonizzando l’azione di queste sostanze. o Colestiramina, Usata per l’intossicazione da glicosidi cardiotonici (derivati digitalici). La colestiramina è una resina a scambio ionico che lega i glicosidi, formando un complesso insolubile, e impedendone (come al solito =_=”) l’assorbimento.

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Abbiamo anche gli antidoti che FORMANO COMPOSTI INSOLUBILI CON IL TOSSICO, anche questi possono essere seguiti da Gastrolusi o Catarsi. o Sali di Calcio: usati come antidoto per l’intossicazione da Acido Ossalico (presente in ambiente industriale e in alcuni vegetali come spinaci, pomodori.. e anche nel miele). I Sali di calcio provocano la formazione di Ossalato di Calcio, che precipita e che non viene assorbito. o Potassio Ferrocianuro, per l’intossicazione da rame (usato ad esempio in prodotti come fungicidi)..che forma il Rameferrocianuro (insolubile) o Solfato di Rame, è un antidoto utilizzato nelle ustioni da Fosforo. In questo genere di ustioni la ferita deve essere lavata molto bene, per poi essere trattata con il Solfato di Rame che forma una pellicola sulla zona lesa costituita da Fosfuro di Rame che è fluorescente, quindi al buio si possono evidenziare le tracce rimanenti, di modo da poterle asportare. o Solfato di Sodio, per formare aggregati insolubili con Piombo e Bario, in caso di intossicazioni da metalli pesanti.

Poi abbiamo le sostanze che INTERFERISCONO CON I PROCESSI DI BIOTRASFORMAZIONE: 



Ad esempio posso accelerare l’eliminazione del Cianuro dall’organismo attraverso il Tiosolfato; che in presenza di cianuro e un enzima chiamato Rodanasi (è una trans-sulfurasi..presente nei mitocondri..) forma il Solfocianato → che viene facilmente eliminato, ed è Molto MENO tossico. Qualsiasi sostanza appartenente alla classe degli Induttori Enzimatici, favorisce l’eliminazione del tossico, riducendo la sua emivita (questo è vero in parte… se il tossico viene bioattivato in seguito ai nostri processi metabolici, siamo nella pupù :P)

Un altro gruppo sono le sostanze che FACILITANO L’ELIMINAZIONE, in caso di intossicazione ad esempio da Amfetamine e Barbiturici. Basta sfruttare le loro caratteristiche di solubilità in ambiente acido o Basico. Basta quindi modulare il pH dell’ultrafiltraro renale :DD … Come facciamo?? → Aggiungiamo semplicemente una sostanza acida o basica :P  

NH4Cl o Acido Ascorbico, per facilitare l’eliminazione delle basi deboli.. come le Amfetamine.. NaHCO3 , per l’eliminazione di Acidi deboli come i Barbiturici

Un’altro meccanismo d’azione degli antidoti, è comportarsi da ANTAGONISTI RECETTORIALI su cui agiscono le sostanze tossiche: 

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Antagonisti COMPETITIVI: o Il Naloxone è un antagonista competitivo dei recettori μ stimolati dagli oppioidi. o Altrimenti, in caso di intossicazione da Benzodiazepine, possiamo agire con il Flumazenil Antagonisti NON COMPETITIVI: o Per antagonizzare l’azione tossica del Glutammato, bloccando il canale che fa passare il Calcio, usando le droghe di tipo dissociativo che abbiamo visto come Fenciclidina e Ketamina *_*

Esiste anche un meccanismo di ANTAGONISMO FUNZIONALE quando antagonizziamo l’azione del tossico attraverso un meccanismo che si oppone all’azione del tossico..

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Es: intossicazioni con insetticidi organofosforici.. Queste sostanze tossiche bloccano le acetil colinesterasi impedendo la degradazione dell’acetilColina, e potenziando enormemente la segnalazione del sistema parasimpatico… Posso intervenire in due modi: o Bloccare la stimolazione dei recettori muscarinici somministrando Atropina o Ripristinare il sito attivo dell’acetil-colinesterasi somministrando la Pralidossima, PRIMA che l’enzima vada incontro a un processo definito “aging”, ovvero prima che l’estere organo fosforico perda la catena alchilica. Se non si interviene tempestivamente, la somministrazione di pralidossima è inutile.

L’ultima classe di Antidoti è quella che attraverso una reazione chimica permette la formazione di prodotti meno tossici → FORMAZIONE DI COMPLESSI INERTI – Chelanti:  

 

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EDTA: Acido Etilendiammino tetracetico (sale calcico e/o sodico).. utilizzato per complessare metalli pesanti Dimecaprolo: è uno dei primi a essere utilizzato, quindi risale a molto tempo fa (seconda guerra mondiale).. era stato sintetizzato come antidoto per la protezione da gas arsenicali utilizzati durante il conflitto bellico.. Il problema è che ha di per se effetti tossici; per questo è stato sostituito dai moderni chelanti come appunto i derivati dell’EDTA. Deferossamina: che complessa il Ferro Idrossicobalamina: per le intossicazioni da cianuro, è l’antidoto di prima scelta. E’ la forma attiva della Vitamina B12.. va a legarsi allo ione cianuro, formando la Cianocobalamina che è un prodotto stabile e non tossico, che può essere eliminato con le urine. Penicillamina: in caso di intossicazioni da Rame e Piombo.. E’ ottenuta per idrolisi della penicillina , ha perso l’attività antimicrobica, e forma un complesso con questi metalli pesanti. In caso di intossicazioni da Eparina (un anticoagulante) che può causare fenomeni emorragici, possiamo complessarla con la Protamina → proteina di natura basica che interagisce con l’eparina di natura acida.. formando un complesso, e perdendo la sua attività anticoagulante…

…iniziamo ora un nuovo argomento…

MUTAGENESI Iniziamo dalla mutagenesi, per poi passare alla cancerogenesi.. Partiamo da qui perché prima dobbiamo vedere quali sono le sostanze che provocano delle mutazioni a livello del genoma. Dando origine a molteplici mutazioni può prendere il via un processo di cancerogenesi. Per mutagenesi si intende l’induzione di una modificazione a livello del codice genetico (nella successione delle basi puriniche e pirimidiniche). Questa mutazione può colpire una cellula somatica, o una cellula germinale, portando quindi a conseguenze diverse. Se la mutazione colpisce una cellula germinale, può dare origine a una malattia genetica (Es: Trisomia 21 → morbo di Down). Se invece la mutazione avviene a livello di cellule somatiche, e non porta alla sua morte, si ottiene una cellula anomala, che non porta necessariamente a un cancro.. ma ad ogni modo è una cellula con una prima alterazione, che può andare a interessare l’attività di una molecola, di un recettore, di un canale.. ecc… Nel caso più mutazioni si sommassero nella stessa cellula, si può arrivare a una condizione di crescita incontrollata, portando a costituire una massa tumorale.

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La mutazione può provocare una Sospensione del Prodotto Genico, ovvero l’impossibilità di produrre una determinata molecola o Può modulare la sua espressione, aumentandola o riducendola.. o infine dare origine a un prodotto di traduzione privo di attività. I fattori che possono influenzare l’induzione di un danno nel genoma sono svariati:      

La quantità di sostanza mutagena introdotta nell’organismo La Farmacocinetica e la distribuzione… La capacità metabolizzante del tessuto in cui la sostanza si concentra.. A volte infatti non è la sostanza in se a essere mutagena, ma un suo metabolita :-/ La Reattività dell’agente nei confronti dei bersagli cellulari.. La capacità delle cellule per Riparare al Danno La capacità del tessuto colpito di riconoscere e sopprimere la moltiplicazione di cellule con proprietà aberranti.

Quali sono le mutazioni che possono essere indotte dalla sostanza mutagena?? → ne abbiamo di vari tipi..



Mutazioni geniche PUNTIFORMI→ Modificazione di una Sola base nella sequenza del DNA 

Possiamo avere la SOSTITUZIONE di una base con un’altra…  Questo può coinvolgere la stessa classe di basi (es: sostituzione di una purina con un’altra purina). Il processo è definito: TRANSIZIONE.  Altrimenti si la TRANSVERSIONE, nel caso la base fosse sostituita da un’altra di classe diversa (Es: Timidina con Guanidina) Cosa comporta una mutazione di sostituzione?? → Dipende.. a volte può non comportare nulla.. in particolare se l’alterazione avviene sulla terza base della tripletta… Alternativamente si ha l’errata codifica della tripletta che potrà essere interpretata come un altro aminoacido, o un segnale di STOP. Il prodotto genico può essere ancora funzionante, o perdere la sua attività… avere un’emivita più basso.. o essere semplicemente una proteina tronca che verrà eliminata..



Un altro tipo di mutazione è quello di FRAME-SHIFT, ovvero Spostamento del modulo di lettura. Questo genere di mutazione è dovuto primariamente a:  Delezione di Nucleotidi o.. al contrario,  Addizione di questi. Questo comporta un danno molto esteso, in quanto il prodotto finale sarà completamente diverso da quello nativo...Ad ogni modo, l’addizione o la delezione di un’intera tripletta a volte non ha conseguenze.. specie in grandi geni come quello della distrofina.. I danni più ingenti sono provocati dall’addizione o dalla delezione di 1 o 2 coppie di nucleotidi.

Una mutazione allora può essere definita:   

SILENTE: quando l’alterazione di una tripletta porta alla formazione di una tripletta che codifica per lo stesso aminoacido (→ Gran botta di cul*) DI SENSO: Quando la tripletta alterata codifica per un aminoacido diverso.. DI NON SENSO: Quando la mutazione genera una tripletta di STOP.. portando alla produzione di una proteina tronca, destinata a essere eliminata. Pagina | 27

Quali sono i Meccanismi delle sostanze mutagene che possono provocare questo genere di danni?? → 



Analoghi delle basi (molecole con struttura molto simile a una base del DNA) possono essere inglobate nel DNA, dando origine a un appaiamento non corretto e a errori nel processo re plicativo. (Es: la 2-amino-purina è un’analogo dell’adenina e della guanina.. di conseguenza può appaiarsi durante il processo di trascrizione o replicazione sia a una Timina/Uracile che a una citosina) Alternativamente, Agenti Alchilanti agiscono direttamente sulla struttura chimica delle basi, andandole ad alchilare.. provocando ingombri sterici che possono impedire la replicazione… L’alchilazione può anche comportare la formazione di un legame covalente con la base vicina.. o con quella presente sull’altro filamento.



Vi sono poi gli Agenti Intercalanti (Es: Arancio di Acridina o Bromuro di Etidio) che grazie alla loro struttura planare, possono inserirsi tra le basi della doppia elica del DNA, creando delle interruzione nella sequenza delle basi, generando un occhiello, provocando uno spostamento del modulo di lettura.

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Mutazioni CROMOSOMICHE→ Vanno ad alterare il numero dei cromosomi o a modificare la loro struttura. Queste mutazioni sono anche definite aberrazioni.

o

Mutazioni del NUMERO: I cromosomi all’interno della cellula somatica sono, in condizioni normali, 23 coppie, mentre in un gamete sono 23. Una cellula che è andata incontro a mutazione cromosomica può essere ANEUPLOIDE, ovvero possedere un po’ di cromosomi in più.. o dei cromosomi in meno.. Un esempio caratteristico è quello della sindrome di Down → Trisomia del Cromosoma 21, dove possiamo vedere un cromosoma 21 in più. Pagina | 28

Una cellula che invece viene definita POLIPLOIDE, avrà un numero di cromosomi multiplo del numero originario di questi. Una cellula normale ha “n” cromosomi… quella poliploidi ne ha “2*n, 3*n ecc…” Tra Aneuploidia e Poliploidia, l’aberrazione più dannosa è l’aneuploidia… Questo perché viene turbato l’equilibrio genico nella cellula. Avere invece tutti i cromosomi moltiplicati anche 3 volte, permette di mantenere l’equilibrio :D o

Mutazioni della STRUTTURA: Possiamo avere la rottura in 2 punti del cromosoma… e l’INVERSIONE del segmento spezzato.. La cellula non ha perso materiale genico.. ma c’è stato un riarrangiamento.. Oppure, possiamo avere una TRASLOCAZIONE, tra due cromosomi non omologhi, che si scambiano parte del materiale genetico. Vi è anche il caso in cui si ha la perdita del materiale genetico per delezioni di interi segmenti di cromosoma.. In quest’altro caso, si ha invece una doppia replicazione di un segmento, che causa un aumento del materiale genetico. Quest’ultimo genere di mutazioni è molto più pericoloso, in quanto causa uno squilibrio genico.

Che effetti possono avere queste mutazioni?? → 

 

La mutazione può rimanere SILENTE, causando: o Una sostituzione di un aminoacido con un altro.. senza portare ad alterazioni della struttura o O semplicemente non alterando minimamente la proteina codificata.. La mutazione può essere incompatibile con la sopravvivenza della cellula… Si tratta quindi di una mutazione Letale :’( Infine, l’alterazione può modificare dei geni che controllano normalmente la proliferazione cellulare.. in particolare Proto-oncogeni / Geni soppressori del tumore

Hotlinks:    

Registrazione Parte 1: Registrazione Parte 2: Dispense Antidoti: Dispense Mutageni: Pagina | 29

CANCEROGENESI

| 25-10-11

Quand’è che il mutageno diventa cancerogeno??  vedremo ora il processo di cancerogenesi, attraverso il quale una cellula sana porterà alla formazione di una massa tumorale :-/ Il cancro è un’insieme eterogeneo di patologie, tutte caratterizzate dal fatto che le cellule sono sottoposte a una crescita incontrollata, dando origine a una massa tumorale che può invadere i tessuti circostanti. In alcuni casi, queste cellule possono anche arrivare al torrente circolatorio, raggiungendo altre sedi dell’organismo formando metastasi. Possiamo definire due diversi tipi di Cancerogenesi:  

MUTAZIONALE: è Causata da un cancerogeno genotossico.. ovvero un composto che causa un danno diretto al DNA EPIGENETICA: E’ provocata da un cancerogeno epigenetico → un composto che non è genotossico (non provoca direttamente danni/mutazioni al DNA).. in compenso è in grado di attivare i “geni del cancro”.. portando la cellula a una rapida moltiplicazione; e inibire i geni dell’apoptosi.

Un mutageno può diventare un agente cancerogeno, a seconda delle alterazioni che induce o dei geni che attiva/inibisce. Le neoplasie possono essere anche classificate come: 



BENIGNE: Le cellule crescono incontrollate, ma più lentamente di una neoplasia maligna, sono infatti visibili poche figure mitotiche (poche cellule in mitosi), inoltre vanno a costruire un tessuto con un’architettura organizzata e simile al tessuto d’origine, ed è discretamente circoscritta. MALIGNE: Le cellule crescono più velocemente, sono visibili numerose figure mitotiche, con replicazione irregolare e perdita dell’architettura del tessuto originale. Non è circoscritta, e vi è l’infiltrazione rapida nei tessuti circostanti.

In genere la maggior parte dei tumori, hanno origine monoclonale.. ovvero derivano da una singola cellula che ha subito una mutazione.. Questo non vuole assolutamente dire che le cellule che ne deriveranno porteranno sicuramente alla tumorigenesi.. E’ solo un inizio.. Successivamente alla prima mutazione dovranno sommarsene altre.. Una sola quindi, non è sufficiente per generare una popolazione cellulare tumorale. Tra una mutazione e l’altra possono comunque passare anni.. Per questo è più probabile l’insorgenza di una neoplasia in età avanzata. Inoltre, in seguito al sommarsi delle mutazioni, la capacità proliferativa delle cellule sarà sempre più veloce. Le mutazioni ovviamente dovranno essere su quei geni regolatori della crescita cellulare; in positivo per quelli che favoriscono la proliferazione… in negativo per quelli che la inibiscono o che innescano il processo apoptotico. Molti cancerogeni, non lo sono di per se… ma richiedono una bioattivazione.. e in questo senso il nostro corpo è “un grande” nel fare dannni… Migliaia di anni di evoluzione per niente =_=”… In seguito a Danni al DNA, intervengono opportuni meccanismi di riparazione.. se sono efficienti.. non ci sarà alcun problema… Se il danno è troppo ingente, la cellulina si suiciderà per apoptosi… se siamo sfigati… la cellula replica il DNA.. che darà origine a un prodotto genico mutato… Questa alterazione può essere silente; e non dare particolari problemi… o portare a morte cellulare (e anche questo non è un male)… ma dato che la fortuna è cieca.. e la sfiga ci vede benissimo… si può anche avere l’Attivazione di PROTOONCOGENI e/o l’Inattivazione di ONCO-SOPPRESSORI. Pagina | 30

In condizioni fisiologiche, la crescita cellulare viene controllata da due famiglie di geni che sono appunto i Proto-oncogeni.. e i geni soppressori del tumore. Queste due famiglie lavorano in equilibrio, permettendo una crescita controllata della cellula. I PROTO-ONCOGENI sono geni che codificano per una proteina che va a stimolare la mitosi (proliferazione) e a inibire l’apoptosi (morte).. In seguito alla mutazione, si trasformano in ONCOGENI… che regolano fortemente in positivo la mitosi, e in in negativo i processi Apoptotici. Gli ONCO-SOPPRESSORI agiscono codificando per una proteina che inibisce il ciclo di replicazione cellulare.. mentre favorisce il processo apoptotico.. In seguito a Mutazione, perdono la loro attività, con la conseguente incapacità da parte della cellula di frenare la replicazione cellulare Il cancerogeno EPIGENETICO, interviene dopo l’avvenuta mutazione, favorendo la proliferazione delle cellule aberranti. I PROCANCEROGENI, sono un altro gruppo molto vario di sostanze che non provocano alterazioni dirette al DNA; ma possono favorire la bioattivazione di cancerogeni.. contribuendo sempre nella proliferazione cellulare. Tutti questi fattori, e il susseguirsi di mutazioni, favoriscono quindi una proliferazione incontrollata :’( Un esempio di Proto-Oncogene è quello che codifica per la Proteina RAS, che viene attivata a seguito dell’interazione dei fattori di crescita con i loro recettori cellulari. Questa proteina favorisce l’ingresso della cellula nel ciclo di replicazione cellulare. A seguito della mutazione → l’Oncogene, continuerà a produrre la proteina.. anche senza il segnale generato dai fattori di crescita.. Ed ecco che l’equilibrio inizia ad alterarsi. Se poi la mutazione va ad agire anche sui geni soppressori del tumore.. siamo nella miierda.. :P Un esempio di Onco-Soppressore è il gene che codifica per la p53 (definita anche Guardiano del Genoma); che blocca la mitosi e attiva l’apoptosi… I PROTO-ONCOGENI, in genere sono i geni per:  

I fattori di Crescita (Es: RAS); Le proteine G;

 

Le protein Kinasi; Per i fattori di Trascrizione Nucleari

Induttori dei proto-oncogeni sono ad es: gli IPA, le radiazioni, l’aflatossina.. che portano ad attivazione di RAS.. e alla cascata delle MAP-Kinasi Gli ONCO-SOPPRESSORI, codificano per: 

Proteine che inibiscono la progressione della cellula nel ciclo di divisione cellulare (es: p53, coinvolta in diversi check-point del ciclo replicativo… nell’induzione di apoptosi in caso di errori o mutazioni e nel processo di differenziamento cellulare). Pagina | 31

La p53 viene anche definita Guardiana del Genoma, perché fisiologicamente interviene nel bloccare la mitosi della cellula quando è sopravvenuto un danno al DNA.. cosa fa quindi?? → Rallenta la divisione cellulare.. in modo tale da dare tempo ai sistemi di riparazione cellulare di intervenire. Se la cellula riesce a riparare il danno.. questa può continuare la replicazione cellulare.. se invece non ci riesce, p53 la indirizza al patibolo… :D …No p53 – no Party…

I CANCEROGENI GENOTOSSICI possono essere: o

Attivazione indipendenti → Non hanno bisogno di essere bioattivati.. possiamo avere  Agenti Alchilanti  Metalli come Cromo e Nikel.. il cui meccanismo d’azione non è ancora del tutto chiaro… per il nikel si suppone che vada ad alterare l’azione della DNA polimerasi.  Isotopi radioattivi… che possono provocare un danno nelle sequenze di basi del DNA.

o

Attivazione dipendenti→ necessitano di bioattivazione da parte di enzimi come CYP450.. abbiamo:  Amine Aromatiche, trasformate in N-idrossilamine  IPA, Trasformati in epossidi..

Molti cancerogeni sono Organo o Specie specifici..  

Specie Specifici: avevamo visto l’acetamino-fluorene.. cancerogeno in varie specie animali.. ma non nella scimmia (in quanto non si forma il metabolita tossico) Organo Specifici:  come il Benzene, che da origine al metabolita cancerogeno nel midollo osseo..  Amine Aromatiche → cancerogene a livello dell’apparato urinario  Ecc…. (tossicologia Generale)

I CANCEROGENI EPIGENETICI sono tutte quelle sostanze che non sono mutagene, ma intervengono nella sequenza di eventi del processo neoplastico.  

Possono interferire con l’espressione o la repressione di determinati geni che regolano eventi come la proliferazione, differenziamento e apoptosi.. Possono alterare i meccanismi di trasduzione del segnale che regolano i processi del ciclo cellulare.

Secondo la teoria della Cancerogenesi chimica, i tre processi che porteranno alla formazione della massa tumorale maligna, sono la:   

INIZIAZIONE → la prima mutazione… Primo contatto con l’agente genotossico… La cellula è iniziata. PROMOZIONE → Espansione clonale della cellula iniziata (mutata).. facilita la crescita di cellule neoplastiche latenti. PROGRESSIONE → Intervengono altre mutazioni.. che portano alla progressione verso la formazione di una massa tumorale.

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In base alla teoria della cancerogenesi chimica, vi deve essere una successione temporale fissa tra l’assunzione di un cancerogeno genotossico, e un cancerogeno di tipo epigenetico (l’agente promotore). Prima.. il Genotossico… Poi, l’agente promotore.. Come si vede dallo schema, un singolo evento di mutagenesi, e l’assenza di un promotore, non porta alla tumorigenesi... Se invece vi è un primo contatto con il composto genotossico e successivamente a questo evento vi è il contatto progressivo con un promotore.. si potrà arrivare a tumorigenesi. Non vi è limite alla distanza di tempo tra l’evento mutageno e l’epigenetico. Ad ogni modo, occorre rispettare la tempistica… la continua esposizione a un epigenetico, senza che vi sia una mutazione.. non provoca nulla :P Infine, anche se venisse rispettata la successione temporale… occorre che l’esposizione all’epigenetico sia continua e prolungata per un certo periodo di tempo.. altrimenti l’effetto del promotore, non è necessario a sviluppare un processo irreversibile che porta a cancerogenesi. La proliferazione selettiva delle cellule iniziate è favorita dal fatto che i promotori aumentano la responsività e la produzione di fattori di crescita, di ormoni.. e di altre molecole che favoriscono la proliferazione cellulare. Viene inoltre diminuita la responsivita agli agenti inibitori della crescita e vengono perturbate le vie di trasduzione del segnale.. portando la cellula ad aumentare la sua attività proliferante e inibendo i processi apoptotici.

AGENTI EPIGENETICI: 

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

…Al primo posto troviamo:

Gli ORMONI →Es: Estrogeni coniugati e DietilSilbestrolo… Lo sono Per 2 motivi… 1) Hanno attività immunosoppressiva (specie glucocorticoidi), riducedndo la risposta immunitaria dell’organismo agli antigeni tumorali. 2) I loro recettori si trovano all’interno della cellula… Il complesso recettore-ormone successivamente entra nel nucleo… interagendo con zone responsive all’ormone.. attivando fattori di trascrizione, modulando l’espressione dei geni di quella cellula… sia in positivo, che in negativo.. Ovviamente.. tutti gli IMMUNOSOPPRESSORI → Es: azatioprina e ciclosporina A.. che, per l’appunto, agiscono inibendo la risposta immunitaria contro gli antigeni tumorali… SOSTANZE ALLO STATO SOLIDO: come materie plastiche.. ma in particolare, è molto noto l’Asbesto (amianto) usato in passato in campo edilizio… bandito successivamente dagli anni ’60.. questo perché le fibre di amianto vanno a depositarsi nell’epitelio dell’apparato respiratorio.. dando inizio a un processo infiammatorio… le cellule poi possono degenerare, andando incontro a uno sviluppo anomalo → MESOTELIOMA.. Un altro gruppo di epigenetici sono le DIOSSINE: Es: Tetraclorodibenzo-diossina.. Sono induttori del sistema microsomiale epatico.. quindi favoriscono la bioattivazione di un pro-cancerogeno, a cancerogeno terminale.. Pagina | 33

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Abbiamo poi gli ESTERI DEL FORBOLO: il capostipite (TPA) è una sostanza poco comune… (per fortuna).. si trova in una pianta molto velenosa, il “Croton Tiglium”.. Veniva usato come purgante drastico… ad ogni modo, bastano poche gocce per avere un’azione tossica a livello gastrointestinale, con forti diarree anche ematiche.. dolori addominali fino ad arrivare, a concentrazioni più elevate, alla morte. L’azione che si pensa abbiano gli esteri del forbolo, è quella di inibire le comunicazioni che si formano tra una cellula e l’altra (Gap Junctions).. che permettono anche alle cellule sane di trasferire alle cellule alterate, dei fattori che inibiscono la loro crescita.. Lo stesso vale per il DDT. Saccarina: E’ stato provato nell’animale.. ma non nell’uomo, che questa sostanza possa provocare cancro della vescica. Non ci sono però prove attendibili nell’uomo. Può essere quindi inserito tra i promotori.. anche se non c’è nulla di certo per quanto riguarda gli esseri umani. Vengono messi comunque dei limiti all’utilizzo di questo dolcificante.

Meccanismi di CO-CANCEROGENESI:     

Aumento della Bioattivazione (aumentano la probabilità che un pro-cancerogeno diventi un cancerogeno) → Induttori del CYP Minore detossificazione (Inibitori del CYP) Riduzione dei processi di riparazione del DNA. Aumento della proliferazione di cellule aberranti Riduzione degli scambi molecolari intra e intercellulari.

FATTORI CHE MODULANO LA CANCEROGENESI: La differenza di specie può influenzare l’azione di un cancerogeno.. Lo vediamo per l’ennesima volta → l’acetaminofluorene.. A seconda del tipo di metabolismo a cui è sottoposto, può essere un cancerogeno o meno… Nell’uomo e in molti altri mammiferi, il suo metabolismo, genera per N-idrossilazione il metabolita cancerogeno. Nella scimmia si ha invece l’idrossilazione aromatica che da origine a un metabolita non pericoloso. L’Età è naturalmente un altro fattore fondamentale.. più è giovane l’organismo che viene esposto all’agente cancerogeno.. più è favorita la proliferazione di cellule aberranti… in un organismo più vecchio, al contrario, la replicazione cellulare è più lenta. Ciò non toglie che gli effetti dei cancerogeni si risentono maggiormente con l’avanzare dell’età… questo perché sono necessarie più mutazioni per arrivare a un processo di tumorigenesi. Durante la pubertà si ha un’aumento della sintesi del DNA e un aumento della mitosi negli organi endocrino sensibili (es: organi genitali maschili e femminili) e questo comporta un aumento della probabilità di sviluppo di tumori proprio in questi distretti. L’esposizione di una donna incinta a un agente cancerogeno, può determinare il passaggio di questo nel feto per via transplacentare.. Il DES (Dietilsilbestrolo) era usato in passato nelle donne soggette a numerosi aborti spontanei.. si è però visto che nella prole femminile, anche dopo 20 anni si poteva sviluppare una forma tumorale a livello della cervice uterina. Altri fattori sono quelli immunitari.. Durante la fase di trasformazione delle cellule da normali a tumorali si formano degli antigeni… se si effettua un trattamento immunosoppressivo, viene a mancare la risposta anticorpale nei confronti dell’antigene tumorale. Pagina | 34

E infine… la dieta… esistono infatti alcuni alimenti che possono favorire lo sviluppo di tumori.. 

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L’efficacia dei cancerogeni può essere accresciuta da diete ricche di grassi, in quanto questi possono agire da agenti promotori.. ovviamente non tutti… Alcuni sono invece considerati protettivi come i 3-poli-insaturi. Diete ricche di carboidrati aumentano il rischio di carcinoma a livello dell’apparato gastrointestinale La vitamina A e derivati (Lycopene) sembra inibire la cancerogenesi in vari distretti.. come la ghiandola mammaria e la vescica.. Meccanismo d’azione non molto noto.. si suppone che queste sostanze permettano la formazione di ponti tra le cellule sane e quelle aberranti, incrementando la segnalazione cellulare. Vitamina C ed E.. probabilmente per l’azione antiossidante, possono essere protettive per determinati tipi di mutazione..

Valutazione della Cancerogenesi Passiamo ora alla parte sperimentale.. che ci permette di valutare in laboratorio, se la sostanza in esame è un cancerogeno di tipo genotossico o epigenetico. Lo schema sperimentale viene definito Decision Point Approach, ovvero si tratta di una valutazione sperimentale con approccio sequenziale. Prima si affronta la fase A, poi la B ecc.. fino alla E.. Ogni volta che si passa da un punto a un altro occorre però prendere una “decisione” → Es: “visti i risultati della fase A, come procedo?.. vado alla fase B, mi fermo? O posso anche saltare alla fase C?”. o

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La Fase A: si prefigge di analizzare e identificare la struttura chimica del composto con cui abbiamo a che fare. Esistono appositi software che permettono di analizzare la struttura, e compararla con quella di altri cancerogeni noti per identificare a priori se vi può essere un potenziale effetto dannoso per l’organismo. Attraverso questa analisi si può anche valutare se la sostanza in esame può richiedere una bioattivazione, e prevedere se i suoi metaboliti avranno un effetto tossico. La Fase B: è la fase che ci permette di valutare, attraverso esperimenti in vitro a breve termine su cellule animali, se la sostanza è mutagena (genotossica).. Esistono svariati Test da fare...  Test di riparazione del DNA in cellule di Mammifero: Andiamo a vedere come interviene la cellula nel riparare danni al DNA (nel caso la sostanza dimostrasse un effetto genotossico). In base alla capacità della cellula di ripararlo, possiamo risalire all’entità del danno. E’ una tecnica indiretta.. in quanto valutiamo l’attività riparatrice..  Test di mutagenesi nei batteri: Andiamo a vedere se queste sostanze inducono mutazioni in una popolazione di cellule batteriche.  Test di mutagenesi di Cellule di mammifero…  Test di integrità cromosomica: per valutare se sono state indotte mutazioni nella morfologia dei cromosomi.  Se per caso, dalla fase B viene fuori che la sostanza non è mutagena, non possiamo escludere che possa comunque promuovere la tumorigenesi. Passiamo quindi alla Fase C.. Se però i test danno esito negativo, passiamo direttamente alla Fase D… Pagina | 35

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La fase C: che permette di testare la sostanza e valutare se si tratta di un agente promotore (epigenetico).. si effettuano quindi test: o In VITRO (che permettono di usare meno animali, e sono più rapidi) .. e test.. o In VIVO (richiedono un maggior numero di animali.. e sono più lente)  Se otteniamo risultati positivi in questi Test, la sostanza in esame è potenzialmente pericolosa. Di conseguenza occorrono studi cronici a lungo termine… Si passa quindi alla Fase E. La Fase D: riguarda il passaggio alla sperimentazione in Vivo.. in quanto nella Fase B avevo effettuato test solo In Vitro per valutare l’effetto genotossico. I test di Fase D sono a Breve termine.  Un risultato positivo in più di uno di questi test, rappresenta una prova inequivocabile di cancerogenicità. Nel caso di un risultato positivo tra i test in Vitro + uno nei test in vivo, posso ritenere il composto molto sospetto, di conseguenza occorrono ulteriori accertamenti… passo quindi alla Fase E

La Fase E: Prevede Test in VIVO a Lungo Termine.

Hotlinks:  

Registrazione Parte 1: Registrazione Parte 2:

2 Ore di Lezione ¼ Credito

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Valutazione della Cancerogenesi – Test

| 07-11-11

FASE B – TEST IN VITRO A BREVE TERMINE – MUTAZIONI PUNTIFORMI: o

Test di Riparazione del DNA in cellule di Mammifero:

Questo test viene effettuato in colture di epatocici incubati con un nucleoside, radiomarcato con Trizio → 3H-Timidina. Questo tipo di test sono molto costosi.. sia per i reagenti.. che per lo smaltimento delle sostanze radioattive. Attraverso questo esperimento valutiamo l’entità del danno sul DNA, osservando la capacità di riparazione della cellula. In base all’entità della riparazione, posso risalire alla gravità del danno. La riparazione per taglio determina un nick (buco) di circa 30 nucleotidi, i quali verranno sostituiti con i nuovi presenti nel terreno da cultura.. tra cui anche quello radiomarcato. In base alla radioattività emessa dalle cellule, possiamo determinare se vi è stata la rottura o meno… nel grafico qui affianco, la cellula (A) rappresenta il “controllo negativo” non trattato con alcuna sostanza, la cellula (B) è il “controllo positivo”, in cui viene messa una sostanza nota cancerogena”; la cellula “C” rappresenta il nostro esperimento. Nella cellula di controllo negativo, in cui non vi è alcuna sostanza mutagena, la timidina triziata non viene inglobata nel DNA. Al contrario nella cellula B (il controllo positivo trattato con un cancerogeno noto) si vede l’aumento del nucleoside radiomarcato all’interno del nucleo; e ciò indica un danno nel genoma (c.v.d.). Se il pattern della Cellula C (il nostro esperimento) sarà simile a quello della B, significa che abbiamo a che fare con una sostanza che induce alterazioni nel DNA.

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Test di Mutagenesi Batterica – (Test di Ames):

Questo test viene fatto in cellule batteriche. E’ molto famoso, e molto utilizzato. Per questo esperimento, si adoperano dei batteri che sono già mutanti.. (hanno già al loro interno una mutazione) → sono incapaci di produrre l’Istidina. Se non riescono a produrre questo aminoacido, non riescono nemmeno a sopravvivere… Occorre quindi aggiungerla al terreno di colutra. Oltre a questa mutazione, ne hanno anche altre.. es: la loro membrana è più permeabile (→per favorire l’entrata del mutageno..) Il principio su cui si basa questo test, è la capacità di un mutageno di provocare una retromutazione (→ O_o” … ovvero.. la capacità del mutageno di annullare/revertire la mutazione… mistero della Fede….), In pratica.. se vi è una retromutazione, i batteri saranno nuovamente in grado di biosintetizzare l’Istidina. (… ahn si..??) Pagina | 37

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Come si opera sperimentalmente?? → o Abbiamo la nostra fiasca con i batteri mutati (es: di Salmonella Typhimurium) o Prepariamo un controllo Negativo (senza alcuna sostanza), un controllo Positivo (con un cancerogeno noto) e il campione in esame con la sostanza in esame. o Al preparato, si aggiunge un estratto di microsomi epatici (che contiene gli enzimi di metabolizzazione).. questa frazione viene aggiunta perché può essere che la sostanza in esame richieda una bioattivazione per espletare l’effetto cancerogeno… questo per evitare parte dei falsi negativi. o Verso i preparati in capsule petri.. e lascio crescere le colonie in un terreno PRIVO di Istidina…  I batteri che non hanno subito retromutazione… muoiono…  Se vi è retromutazione.. i batteri riescono a produrre nuovamente l’istidina.. quindi riescono a sopravvivere (miracolosamente).. formando delle colonie batteriche :D  Nello schema qui sopra si vedono 2 serie di Petri.. Nella prima non vi è l’aggiunta di microsomi epatici.. nella seconda Si… Se il test risulta Negativo alla Prima, ma positivo alla Seconda, significa che la sostanza in esame è cancerogena… ma per agire richiede una bioattivazione.  In base al numero di colonie che conto nella petri, posso risalire alla capacità mutagena della sostanza… (sono scettico.. ma prendiamolo per vero…. O_o)

o

Test di Mutagenesi di cellule di mammifero in Coltura:

Operiamo con linee cellulari stabilizzate → linee di Linfoma murino. In questo caso, andiamo a valutare l’azione mutagena della sostanza in esame osservando la funzionalità di un’enzima → l’ HGPRT. Questo enzima permette di incorporare le purine, all’interno della sequenza del DNA. Nelle colture di Linfoma Murino, aggiungo un analogo purinico → 8-azaguanina (tossica). L’analogo verrà inglobato solo in presenza dell’enzima HGPRT. Se ciò avviene, la cellula andrà incontro a Morte… 

Se la sostanza che vado a testare non è mutagena, l’enzima HGPRT funzia normalmente… viene introdotto l’analogo tossico nel DNA… e puff.. la cellula va incontro a morte :DD



Se la sostanza in esame è cancerogena, la mutazione può andare a interessare l’enzima HGPRT.. che non sarà più in grado di funzionare… Il DNA non incorporerà gli analoghi tossici… di conseguenza, le colture cellulari sopravviveranno.. → Altro mistero della Fede…

.. Fino ad ora abbiamo trattato mutazioni puntiformi… con il prossimo test, andiamo a valutare se la sostanza provoca mutazioni cromosomiche.

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FASE B – TEST IN VITRO A BREVE TERMINE – MUTAZIONI CROMOSOMICHE: o

Testo dei Micronuclei – Per la valutazione dell’integrità cromosomica:

Le mutazioni cromosomiche possono interessare il numero di cromosomi o la rottura di questi con perdita o acquisizione di materiale genetico. Il test dei micronuclei va a valutare, analizzando al microscopio le colture cellulari, se ci sono nella cellula (oltre al nucleo) dei micronuclei (organelli che si formano durante la mitosi).. che contengono del materiale cromosomico che non è stato equamente suddiviso tra le cellule figlie. Questi micronuclei possono contenere dei cromosomi interi.. o anche solo dei frammenti di questi, a seconda appunto del tipo di mutazione avvenuta. Guardando lo schema, la cellula iniziale con patrimonio genetico 2n, si divide.. (si forma il fuso mitotico…la cromatina si addenza… ecc.. ecc.. )si procede fino alla migrazione dei cromosomi ai poli della cellula, dove si formeranno i nuovi nuclei… Se tutto è andato bene, dovremmo avere un patrimonio genetico 2n e 2n.

………..

Se invece ci sono stati dei problemi (come in questo caso → –A–), vediamo che una delle due cellule figlie, avrà un normale numero di cromosomi…mentre l’altra avrà un nucleo privo di un cromosoma (2n-1). Può inoltre capitare, che il cromosoma presente nel micronucleo migri (prima della divisione) nel lato della cellula con patrimonio genetico sano… portando di conseguenza alla creazione di due forme aberranti =/ Nel caso –B– si osserva la formazione di micronuclei con frammenti di cromatidi. Otterremo quindi due cellule figlie con patrimonio genetico ridotto.. L’analisi si fa al microscopio; la presenza di un micronucleo evidenzia un’aberrazione cromosomica. Questo test viene generalmente effettuato su colture di linfociti umani, o eritrociti immaturi di topo. Nel caso degli eritrociti immaturi si effettua un primo trattamento con la sostanza in esame; dopo 6 ore l’animale viene sacrificato.. viene estratto il midollo osseo dal femore.. e si analizza sul vetrino la morfologia degli eritrociti.. Attraverso questo test possiamo anche definire se la sostanza è un veleno mitotico o una sostanza clastogena….  

Viene definita “sostanza clastogena”, una sostanza che provoca la frammentazione dei cromosomi (dando origine a micronuclei che contengono frammenti cromatidici) I veleni del fuso mitotico sono invece le sostanze che vanno a provocare un’anomalia nello scorrimento e nel trasporto dei cromosomi lungo il fuso mitotico, portando a micronuclei contenenti interi cromosomi… Pagina | 39

o

Test in cellule di Ovaio di Criceto Cinese:

Le cellule della linea CHO sono le Chinese Hamster Ovary (Cellule di Ovaio di Criceto Cinese), sono frequentemente usate perché hanno i cromosomi di notevoli dimensioni.. quindi facilmente analizzabili al microscopio. Queste cellule contengono in coltura un cariotipo stabile di 22 cromosomi.. se noi andiamo a testare delle sostanze su queste colture possiamo facilmente osservare al microscopio durante la mitosi, se vi sono anomalie nella spartizione dei cromosomi, o frammentazioni.. o

Test Dei cromatidi Fratelli – SCE = Sister Chromatid Exchange:

Questo test prevede che la sostanza in esame vada a provocare un taglio nei cromatidi del cromosoma.. e lo scambio di frammenti da un cromosoma all’altro..Questo tipo di test mi permette di valutare se la sostanza è potenzialmente genotossica.. Non vi è perdita o guadagno di materiale genetico.. sappiamo solo che la sostanza è in grado di fare dei tagli… quindi è potenzialmente pericolosa.. magari un’esposizione cronica può portare ad aberrazioni più gravi.. Il test (ripetiamolo) permette quindi di valutare la Potenzialità genotossica della sostanza in esame.  PUNTO DECISIONALE 1: Alla fine della Fase B, possiamo ottenere varie informazioni… Se nessuno dei test risulta positivo, la sostanza non è un mutageno genotossico… Però rimane un dubbio… potrebbe essere una sostanza epigenetica.. → Vado in Fase C. Se Alcuni hanno dato esito positivo, la sostanza è genotossica.. che dovrà poi essere provata in modelli complessi → l’animale vivo, tramite somministrazione sistemica. → Vado alla fase D

FASE C – TEST DI PROMOZIONE (PER AGENTI EPIGENETICI): o

Test di Induzione di Tumori Cutanei nel Topo (Test di Papilloma Cutaneo):

Questo test permette di valutare se la sostanza in esame è un Promotore.. ovvero se è in grado di indirizzare le cellule iniziate (mutate) verso una crescita incontrollata. Se la sostanza in esame è un epigenetico, prima di tutto dovrò pretrattare i miei animali da esperimento, con un composto di cui è nota l’attività mutagena. L’iniziatore utilizzato è il DMBA (di-metil-dibenzoantracene) è un IPA, che viene somministrato a dosi molto basse per evitare l’instaurarsi di una forma tumorale.. altrimenti non posso certo testare il mio epigenetico :P Successivamente tratto gli animali da laboratorio, esposti al mutageno, con la “sostanza X”; applicandola 23 volte la settimana per 2-3 mesi… a questo punto, andrò a valutare se sulla cute di questi animali si sono sviluppate delle forme tumorali (definite Papillomi cutanei). Andrò quindi a valutare quanti animali hanno sviluppato i papillomi, e quanti se ne sono formati su ogni animale.  PUNTO DECISIONALE 2: Gli agenti risultati positivi a questo/i test sono potenzialmente pericolosi.. di conseguenza occorre valutare l’uso cronico della sostanza in vivo… Vado alla FASE E… Pagina | 40

FASE D – TEST IN VIVO A BREVE TERMINE: o

Test di Induzione di Foci Preneoplastici nel Fegato di Ratto:

La sostanza in esame viene somministrata o per via orale, o per via intraperitoneale. L’applicazione può essere singola o ripetuta e si vanno a vedere nel giro di 12-13 settimane se si sono generati dei foci preneoplastici a livello del fegato. In caso positivo, si valuta il numero di foci presenti nel fegato e la superficie di questi per centimetro quadrato di tessuto. Alcuni cancerogeni noti che danno risultati positivi a questo test sono le Amine Aromatiche e le Nitrosoamine.. o

Test di Induzione di Adenomi Polmonari nel Topo:

La sostanza X viene somministrata per via intraperitoneale 3 volte la settimana, quindi si valuta in 3-4 mesi lo sviluppo di adenomi (noduli biancastri). Nel caso il test fosse positivo, si valuta come al solito il numero di adenomi ghiandolari e il numero di noduli per ogni animale. Alcune classi di cancerogeni che danno risultati positivi a questi test sono gli IPA, le Nitrosamine e tossine come l’aflatossina. o

Formazione di Carcinoma Mammario nel Ratto Femmina:

La sostanza viene somministrata o per via Orale o per via Endovenosa.. Si valuta quindi dopo 3-9 settimane (previo sacrificio dell’animale) quanti animali presentano adenocarcinomi e il numero di questi per ogni animale. Alcuni cancerogeni noti che danno esito positivo a questo test sono gli IPA, e le amine aromatiche. → Quindi.. conoscendo la struttura della sostanza in esame e la sua classe di appartenenza, possiamo già selezionare quali sono i test più opportuni da effettuare sull’animale.  PUNTO DECISIONALE 3: Se la sostanza risulta positiva a più di un test, si considera questa una Prova inequivocabile di cancerogenicità. Se otteniamo un risultato positivo in Vivo e in Vitro, la sostanza è considerata altamente sospetta, che magari richiede molto più tempo per agire (come ad esempio alcuni inquinanti ambientali).. quindi occorre valutare la sua attività in test in vivo a lungo termine  FASE E‼

FASE E – TEST DI CANCEROGENESI IN VIVO A LUNGO TERMINE: Si effettuano questi test quando i risultati ottenuti dalle fasi precedenti lasciano adito a dubbi, o quando si suppone che sia necessaria una prolungata esposizione cancerogeno o epigenetico affinchè si verifichi l’effetto tossico. 

Scelta degli Animali:

Gli animali usati per questi test sono di piccola taglia, come roditori (ratto o topo).. Si è calcolato che la latenza di risposta al cancerogeno è circa 1/8 della vita dell’animale.. per questo, è preferibile un animale la cui aspettativa di vita non superi i 3 anni :P.. Per animali come Ratto e Topo, il tempo di latenza oscilla Pagina | 41

tra i 3 e 5 mesi… SI usano animali giovani appena svezzati, in quanto sono più sensibili agli agenti cancerogeni.. (→ l’attività proliferativa delle cellule è maggiore). Gli studi effettuati sono molto lunghi, e molto costosi.. l’animale va tenuto in osservazione per 24 mesi nel ratto.. e dai 21 ai 24 mesi nel Topo. Ovviamente dobbiamo anche tenere conto del fatto che non tutti gli animali arriveranno vivi alla fine della sperimentazione.. magari per l’insorgenza di infezioni.. o semplicemente per morte naturale.. Si calcola che circa il 70-90% degli animali resti in vita fino alla fine del test. Si usano animali sia maschi che femmine.. circa una cinquantina… Essendo quindi parecchi, ed essendoci vari gruppi sperimentali, è opportuno che un esperto di statistica partecipi allo studio, in quanto i fattori da tenere in considerazione sono moltissimi. 

Quali dosi usare per testare il potenziale mutageno/epigenetico?

La dose non dovrebbe dare effetti tossici evidenti.. quindi dovrebbe essere ben più bassa della LD50… Si usa la MTD (→ Massima Dose Tollerata…) o i suoi sottomultipli… E’ il parametro numerico che definisce la tossicità subcronica, ed è quella concentrazione che causa un calo ponderale di un massimo del 10%. Ovviamente occorre valutare la relazione dose-risposta.. quindi avremo vari gruppi sperimentali; che andranno seguiti per 2 anni.. 

Come si somministra la sostanza in esame?

Sarebbe meglio somministrarla attraverso la via che mima l’esposizione umana.. quindi, se si tratta di una sostanza che si trova maggiormente nell’atmosfera, la via inalatoria è la preferibile… Certo.. se questa è in atmosfera può finire anche sulle piante e sugli animali.. quindi l’assunzione è anche orale… Alternativamente si può testare la sostanza anche per via cutanea… se si tratta di farmaci in fase di sperimentazione, è d’obbligo la via parenterale. 

Quali sono i Gruppi Sperimentali? o o o o

Sono: il Gruppo di Controllo (il più fortunato.. non è trattato con alcun tipo di sostanza :P) Il gruppo trattato solo con il Veicolo (il Bianco).. questo per valutare delle risposte di fondo come lo stress dell’animale.. Il Gruppo di Controllo Positivo, Trattato con un cancerogeno Noto a diverse concentrazioni E infine, i gruppi trattati con la Sostanza X a concentrazioni MTD incrementali..

Tutti i gruppi devono avere lo stesso numero di animali… Se calcoliamo minimo 30-40 animali per gruppo otteniamo → 120 – 160 animali da controllare…. Un bel lavoro neh?? :P Durante i 2 anni gli animali saranno sempre tenuti sotto controllo, e si andrà a valutare se c’è o meno lo sviluppo di forme tumorali.. Va osservato il numero di animali che presenta uno o più tipi di tumore nell’organismo… la frequenza con cui il tumore colpisce un determinato organo (questo per valutare ad esempio se la sostanza colpisce maggiormente gli epatociti rispetto ai polmoni o altri distretti dell’organismo).. Occorre anche valutare quanti sono gli animali che presentano più di un tumore e il numero di n° di tumori per animale. Questi test sono necessari per poter poi prevedere se la sostanza sarà cancerogena anche per l’uomo. Purtroppo però non forniscono informazioni circa il meccanismo d’azione della sostanza tumorigena, in quanto la cancerogenesi è lo stadio biologico finale. Pagina | 42

Ad ogni modo, se la sostanza in esame risulta cancerogena in più specie animali, ci sono anche alte probabilità che lo sia per l’uomo. Si possono verificare però anche casi in cui la sostanza risulta cancerogena nell’animale… ma che non lo sia per l’uomo.. (ad esempio la saccarina…) → gli animali quindi forniscono solo una Base nella valutazione del RISCHIO umano (ovvero la probabilità che la sostanza X causi gli stessi effetti nell’uomo). Alla valutazione del rischio segue la Gestione del rischio (→ovvero come possiamo intervenire per fare in modo che l’uomo sia salvaguardato dal contatto con queste sostanze pericolose). Per l’estrapolazione dei risultati nell’uomo occorre quindi conoscere i meccanismi d’azione, il metabolismo e la farmacocinetica della sostanza nell’animale e nell’uomo.. L’agenzia di Protenzione dell’ambiente (EPA) e l’agenzia internazionale di ricerca sul cancro (IARC) hanno stilato una classificazione dei cancerogeni per gruppo di appartenenza

Nel gruppo A sono indicati tutti i cancerogeni umani noti; nel gruppo E sono invece indicate tutte quelle sostanze di cui si è comprovata la non cancerogenicità. Nelle classificazioni intermedie vi sono le sostanze che hanno una buona probabilità di essere cancerogene anche nell’uomo, avendo dato risultati positivi nei test sugli animali.. o altrimenti vi sono tutte quelle sostanze di cui non sono stati ancora effettuati tutti i test e gli accertamenti necessari per poter essere catalogate. Secondo alcune stime del 2002, i tipi di cancro più diffusi sono: 

Nell’uomo: I. Tumore alla prostata II. Tumore a livello polmonare III. Cancro del colon e retto



Nella donna: I. Cancro della mammella II. Tumore a livello polmonare III. Cancro del colon e retto



Nella donna: I. Tumore a livello polmonare II. Cancro della mammella III. Cancro del colon e Retto

La mortalità è invece data da: 

Nell’uomo: I. Tumore a livello polmonare II. Tumore alla prostata III. Cancro del Colon e Retto

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DONNE

UOMINI

Queste sono curve che rappresentano la mortalità dei diversi tipi di tumore nella donna e nell’uomo dagli anni ’30 a oggi… Per quanto riguarda il tumore polmonare vediamo che per la donna, dagli anni ’60 a oggi, l’incidenza è in aumento.. questo perché la donna ha iniziato a fumare su larga scala, solo dagli anni ’50 in poi; mentre per l’uomo (che fumava da ben prima…) vi è un’ascesa repentina dagli anni ’30 ai ’90.

Questi sono invece dati epidemiologici per il tumore intestinale (colon retto). Abbiamo sia per la popolazione maschile che quella femminile due trend, che vanno dagli anni ’80 a oggi, valutati nella nostra regione (Emilia Romagna) e in Italia… L’andamento nella popolazione femminile è in discesa, ed è sovrapponibile all’andamento generale in Italia… questo è dovuto anche al fatto che c’è una maggiore prevenzione.. Per quanto riguarda la popolazione maschile, abbiamo un trend più stabile, sempre sovrapponibile con la situazione in italia… Questo è l’ennesimo grafico… riguarda la mortalità per tumore del colon-retto negli USA, in funzione dell’età… Il grafico conferma pienamente la teoria che presuppone che sia necessario un sommarsi di molteplici mutazioni prima dello sviluppo di una massa tumorale.. E finalmente è finito il capitolo “Cancerogenesi”… inizia la valutazione della tossicità…

VALUTAZIONE SPERIMENTALE DELLA TOSSICITA’

| Parte 1

Qual è il protocollo da seguire per effettuare le prove tossicologiche? Prima di tutto, noi abbiamo di fronte una sostanza nuova… La prima cosa da fare in assoluto è Identificarla :P..→ individuare la struttura chimica e le sue caratteristiche chimico-fisiche :P Occorre anche verificare la presenza di enantiomeri, in quanto gli enzimi presentano una certa selettività per determinati enantiomeri rispetto ad altri… Ci possono essere casi in cui un enantiomero ha attività tossica e l’altro no… (ad esempio la Talidomide). Successivamente si va a stabilire il Grado di Purezza.. in particolare quando si ha a che fare con sostanze d’abuso in forme farmaceutiche come polveri o compresse… Occorre determinare quindi la percentuale di sostanza attiva, e le impurezze e gli eventuali prodotti di degradazione… Si analizza in seguito la Stabilità… alla luce (se è fotosensibile), al Calore (se termolabile).. si valuta la sensibilità all’ossidazione.. Queste analisi vengono in particolare fatte per i farmaci.. per poter garantire un’ottimale conservazione della sostanza. Poi si valutano altre caratteristiche come il grado di solubilità, la lipofilia/idrofilia, la tensione di

vapore (se è alta evapora facilmente), la reattività chimica (in particolare se da origine a specie radicaliche particolarmente reattive), e la stabilità a pH fisiologico… ecc… Infine, se si tratta di Farmaci, la Formulazione con la quale viene presentata. Nello studio e nell’identificazione delle sostanze, vengono in aiuto le banche dati, dove sono classificate tutte le sostanze tossiche note, permettendoci di confrontare le strutture e identificare analogie. Questo studio viene chiamato “studio previsionale” perché posso prevedere la tossicità della sostanza nei confronti di un determinato organo o tessuto. Esistono delle normative emesse dagli organi preposti al controllo della salute pubblica che permettono al cittadino di essere salvaguardato contro le varie sostanze tossiche… Queste normative riguardano delle classi specifiche di sostanze o dei composti chimici in generale. Es: ci sono normative per Farmaci, Pesticidi, Fertilizzanti e tutti gli altri composti che fanno riferimento ad altre normative sui composti chimici… Tutte queste classi di composti richiedono un’autorizzazione per l’utilizzo da parte dell’uomo… Es: per i farmaci si richiede che vengano presentati agli organi preposti tutti i risultati tossicologici. E’ necessario quindi effettuare test di Tossicità Acuta, sub-acuta e sub-cronica, cronica.. mutagenesi, teratogenesi e fertilità e riproduttività dell’organismo… → Questi sono i principali, per poter ottenere l’autorizzazione all’immissione in commercio. I pesticidi richiedono anch’essi la presentazione delle stesse prove tossicologiche… Idem per i fertilizzanti.. e per tutti i composti chimici che non rientrano nelle categorie sopra citate.. Per sostanze alimentari, cosmetici o altri prodotti di consumo non sono richieste le prove tossicologiche, mentre è richiesta però la conoscenza, da parte di chi li produce, degli effetti tossici che possono avere gli svariati composti.

Hotlinks:   

Registrazione Parte 1: Registrazione Parte 2: Dispense: Pagina | 45

VALUTAZIONE SPERIMENTALE DELLA TOSSICITA’ | 08/11/11 |Parte 2 Qual è l’elemento necessario per effettuare le prove tossicologiche?? → L’animale da laboratorio :P Non si può farne assolutamente a meno.. Possiamo ridurne il numero utilizzato ma non possiamo evitare di fare test su di esso. Certo, le prove in vitro ci permettono di ottenere molte informazioni riguardo l’aspetto meccanicistico della sostanza.. ma non potremo mai avere delle risposte tossicologiche.. Occorre anche l’animale in toto. Naturalmente esistono numerose leggi che regolamentino l’uso di questi animali… Per poterli usare in una ricerca, occorre prima ottenere l’autorizzazione dagli enti opportuni, dimostrando l’essenzialità del loro utilizzo, e dichiarando il numero che si prevede di utilizzare per il progetto.. L’uso degli animali ovviamente ha senso solo se i dati possono essere trasferiti all’uomo… Generalmente si inizia con animali di piccola taglia (ratti, topi, criceti).. poi per altri tipi di esperimenti possono essere necassi animali di più grossa taglia fino ad arrivare a pecore, maiali, primati.. Ovviamente l’uso di primati non è così comune.. e solo particolari ditte farmaceutiche o enti dell’OMS possono avere l’autorizzazione ad usarli.. anche perché richiedono un maggior numero di cure, apposite strutture e sono molto più costosi e difficili da gestire. Si utilizzano animali giovani che hanno raggiunto la maturità sessuale, quindi di 6-8 settimane per ratti e topi.. devono essere sani (specific germ free), ovviamente per fare in modo che rimangano sani devono anche essere stabulati in condizioni controllate di temperatura, umidità.. e devono inoltre essere rispettati i cicli circadiani (ritmo giorno/notte). Inoltre, prima di effettuare una sperimentazione, occorre che l’animale si abitui al nuovo ambiente per una settimana. Questo è molto importante per ridurre i fattori di stress che potrebbero alterare i risultati della valutazione dell’animale.. in particolare nei test di tipo comportamentale. Come viene somministrata la sostanza in esame? → Bisogna cercare di mimare il più possibile la via che si pensa sia usata dall’uomo, o con la quale questo ne verrà in contatto. Viene quasi sempre presa in considerazione la via orale… uhm… e come facciamo a ficcargliela in bocca?? → ci sono 2 metodi: 

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Gliela diamo mescolata con il cibo o con l’acqua → il problema di questo metodo è che non possiamo conoscere l’esatto dosaggio che entrerà in circolo nell’animale.. il vantaggio è che questo tipo di assunzione è quello che si avvicina maggiormente a quella umana :D Usiamo un sondino gastrico → in questo caso, siamo sicuri di dare la dose esatta.. l’unico problema deriva dalla capacità del ricercatore di imbroccare la via giusta… Finire nella trachea del povero topolino invece che giù per l’esofago, non è piacevole..

Esistono poi altre vie di somministrazione… se si pensa che l’uomo possa entrare in contatto con il cancerogeno attraverso la cute, si effettueranno test per via transcutanea applicando la sostanza sulla cute rasata del ratto o del topo.. generalmente si sceglie la nuca, di modo che l’animale non riesca a togliere il cerottino transdermico o a grattarsi… in caso di esperimenti sul coniglio, le orecchie sono le predilette. Se si stanno testando sostanze che andranno a costituire dei farmaci, si adopera anche la via parenterale (endovenosa, intraperitoneale, intramuscolo ecc..)… Pagina | 46

L’ultima via di somministrazione possibile è quella inalatoria.. Per questo tipo di via occorrono delle apposite camere inalatorie (a cui l’animale dovrà prima abituarsi) o delle mascherine O_o”.. Questo test è più costoso degli altri… Cosa andiamo a valutare nell’animale dopo la somministrazione della sostanza in esaame?? o

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Prima di tutto le manifestazioni esterne:  Condizioni del Pelo (se liscio, arruffato.. se ci sono zone di alopecia…)  Lo stato della cute (se rosea o pallido/cianotico)  Presenza di lesioni o irritazioni cutanee  Lo stato dell’occhio:  se la pupilla è in stato di miosi o midriasi.. e già questo ci può dire se la sostanza è andata ad agire sul sistema nervoso autono Simpatico o Parasimpatico…)  Se vi è un aumento della lacrimazione.. associata a congiuntive arrossate… o se è dovuta a un aumento del controllo parasimpatico Andiamo a valutare la sua attività motoria:  Se normale…se sbanda.. se è agitato, se è esplorativo, o se si rannicchia in un angolo della gabbia..  Andiamo anche a osservare se esegue movimenti ripetitivi stereotipati, se ci sono tremori.. o mancanza di coordinazione (atassia)  Valutiamo i Riflessi difensivi, ponendolo su un piano inclinato. Valutiamo le funzioni sensoriali, come:  le reazioni a stimoli luminosi.. acustici o tattili Osserviamo le funzioni autonome:  la temperatura corporea (quindi se la sostanza è pirogena o meno),  le secrezioni,  la respirazione (ipopnea o apnea o normale).. Andiamo inoltre a valutare le manifestazioni a livello centrale:  Il comportamento dell’animale durante il sonno  I comportamenti aggressivi nei confronti dei compagni o allo sperimentatore  Reazioni all’alimentazione e al trattamento..

.. e per non finire.. oltre a tutta questa sfilza di parametri generali, che richiedono un occhio allenato dello sperimentatore… andiamo a:    

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pesare ogni giorno l’animale e valutiamo la quantità di cibo che assume ogni giorno Osserviamo lo stato della cornea …Facciamo un prelievo di sangue per effettuare esami ematochimici, andando a verificare i globuli bianchi, rossi, l’emoglobina.. la funzione piastrinica… insomma.. gli stessi esami compiuti sull’uomo.. Valutiamo anche lo stato elettrolitico.. La funzionalità renale ed epatica…

Non è finita… questo tipo di test vengono fatti sull’animale vivo… alla fine del trattamento.. l’animale viene immolato :P e si fa un approfondito esame microscopico.. andiamo a pesare gli organi e a vedere lo stato di questi tramite esami istologici..

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Questi tipi di sperimentazioni, per valutare la tossicità di una sostanza, sono standardizzati. Ogni laboratorio si basa su dei protocolli riconosciuti a livello internazionale, stabiliti dall’organizzazione per la cooperazione Economica e lo Sviluppo. In queste metodiche, viene deciso il numero di animali necessari per ottenere dati attendibili dalla sperimentazione.. a seconda che si vogliano effettuare prove di tossicità acuta, sub-acuta.. cronica ecc ecc… Viene anche stabilito il numero di dosi e quali dosi utilizzare.. viene stabilito come procedere nella ricerca: quali protocolli seguire… e, alla fine della sperimentazione, come vanno organizzati e interpretati i dati ottenuti basandosi su modelli statistici. Questi dati, devono essere RIPRODUCIBILI… se non lo sono (anche tenendo conto della variabilità biologica).. c’è qualcosa che non va… :P …Niente riproducibilità.. niente attendibilità U_u Un laboratorio che fa una sperimentazione viene riconosciuto a livello internazionale se rispetta le regole di buona pratica di laboratorio (GLP).. Questa certificazione viene assegnata se sono rispettati dei principi come: 

  

Il personale che ha accesso al laboratorio è un personale autorizzato e preparato, con la presenza di un responsabile che garantisca che gli esperimenti effettuati seguano i protocolli standard, in un ambiente controllato.. Le atrezzature devono essere controllate e le apparecchiature costantemente funzionanti e tarate.. Gli stabulari devono garantire una buona qualità di vita dell’animale Le sostanze devono essere opportunamente conservate, in condizioni controllate di umidità e temperatura.. vi devono essere inoltre armadi di sicurezza per i solventi e composti radioattivi.

Quali sono le tappe da seguire per valutare la tossicità? Dopo la valutazione della struttura chimica e delle caratteristiche chimico fisiche della molecola, occorre valutare la TOSSICOCINETICA.. ovvero come la sostanza viene assorbita, come si distribuisce e come viene biotrasformata.. e infine, le vie di eliminazione… A questo punto si può passare a valutare la TOSSICITA’ ACUTA → ovvero l’effetto tossico immediato che ha una dose di sostanza in esame sull’organismo.. e viene espressa con l’ LD50 (Dose Letale nel 50% degli animali). Questo parametro può essere calcolato a seconda della via di somministrazione del tossico. Quindi avremo una LD50-orale, una LD50-cutanea e una LD50-inalatoria. Andiamo poi a valutare il grado di irritazione cutanea, oculare e faremo test allergologici; per vedere se provoca sensibilizzazione. Se la sostanza non da esiti positivi per la tossicità acuta, non possiamo escludere che li possa dare in test a breve termine. Questi test sono medio lunghi, e richiedono da 2-3 mesi fino a un anno di osservazione. Si passa infine ai test a lungo termine che richiedono tempi di osservazione di quasi 2 anni…in questa fase abbiamo anche le prove di cancerogenesi e teratogenesi.. (ma quante cacchio di volte dobbiamo ripetere le stesse cose??)

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TOSSICITA’ ACUTA: Permette di stabilire qual è l’effetto tossico di una determinata sostanza, e quale organo o tessuto essa colpisce.. Come abbiamo già detto e ridetto, un parametro fondamentale per la tossicità acuta è l’ LD50. Es: Il monossido di carbonio colpisce gli eritrociti, impedendo all’emoglobina di legare l’ossigeno; l’effetto tossico specifico è inibire il trasporto dell’ossigeno.. quindi provocare anossia (ridotto apporto di ossigeno ai tessuti) Come si effettua una misurazione della tossicità Acuta?? La sostanza in esame viene somministrata nell’animale (in un’unica dose o in più dosi) nell’arco di 24 ore.. Il tempo di osservazione è di 2 settimane. Nell’arco di questo periodo andiamo a effettuare le osservazioni viste precedentemente (→ Peso l’animale, segni e manifestazioni esterne.. esami ematochimici, si considera il fabbisogno di cibo…). Alla fine della “Luna di Miele” l’animale viene sacrificato, e si effettua un’analisi macroscopica e microscopica dei tessuti e degli organi. L’OECD ha stabilito che per questo test siano usati 5 animali Maschi e 5 Femmine.. E’ bene usare più di una specie; la via di somministrazione è sempre quella orale.. più quella prevista per l’assunzione da parte dell’uomo. Occorre testare almeno 3 dosi.. La curva che si ottiene è una sigmoide: in ascissa abbiamo la dose somministrata espressa in mg/kg di peso corporeo mentre in ordinata abbiamo il tasso di mortalità.. Conoscendo la LD50 possiamo inquadrare la classe di tossicità di una sostanza: I valori ottenuti nell’animale possono essere estrapolati all’uomo tramite modelli matematici che permettono di prevedere quale potrebbe essere la dose pericolosa per l’uomo. Più è bassa la LD50 più il composto è tossico… In quanto basta una piccolissima dose per determinare la morte nel 50% degli animali. L’etanolo ad esempio è una sostanza debolmente tossica..dal punto di vista della tossicità acuta.. è opportuno non confondere l’acuta con la cronica, in quanto i danni causati dal consumo di alcol a lungo termine sono decisamente gravi. Quasi tutte le sostanze, in particolare quelle d’abuso presentano due distinti quadri di tossicità. Anche se una sostanza è considerata debolmente tossica con una esposizione acuta.. non vuol dire che non possa dare effetti deleteri con un’esposizione cronica. Pagina | 49

Nei 14 giorni di osservazione dell’animale, potremo notare svariati segni e manifestazioni; che possono essere indice di un problema a livello di un’organo o di un apparato. Ad esempio, possiamo evidenziare un danno al sistema nervoso autonomo osservando il grado di secrezioni, il rilasciamento della membrana nittitante (segno clinico che si vede solo nel gatto, che presenta una terza palpebra..soggetta a controllo ortosimpatico) La coda alla Straub è un segno clinico che indica un danno a livello muscolare.. è una particolare posizione della coda in seguito a somministrazione di morfina.. L’opistotono è una curvatura anomala della schiena, in seguito a intossicazioni da tetano e da cianuro.

TOSSICITA’ SUB-ACUTA: Il parametro quantitativo è l’ MTD (Massima Dose Tollerata), è la quantità di sostanza che provoca un calo ponderale di non più del 10% del peso dell’animale. . Il trattamento è di 28 giorni nel ratto… Le dosi usate per i test di tossicità sub-acuta sono sottomultipli della LD10

TOSSICITA’ CRONICA: Richiede una sperimentazione molto più lunga; In seguito ai test di tossicità cronica andremo a calcolare la→ NOEL (No Observed Effect Level). E’ la dose alla quale non si osservano effetti tossici nell’animale. Il dato poi dovrà essere estrapolato per l’uomo.. Andremo quindi a valutare il RISCHIO umano; che può essere identificato con il dosaggio ADI (Acceptable Daily Intake → Assunzione giornaliera Accettabile).. ovvero il dosaggio che può essere assunto giornalmente e cronicamente senza manifestare alcun effetto tossico. La VSD è invece la Virtually Safe Dose (dose virtualmente sicura).. ed è una precisazione che viene fatta nel calcolo del rischio umano. Viene generalmente applicata per sostanze di tipo cancerogeno genotossico. Per queste sostanze è infatti molto difficile stabilire un livello soglia, in quanto sono Sempre dannose… Questo parametro garantisce un rischio socialmente accettabile. Perché fare studi di tossicità cronica?? → Alcune sostanze tendono ad accumularsi nell’organismo determinando un effetto tossico dopo un certo periodo di tempo. E’ molto importante quindi tenere in considerazione l’accumulo in determinati distretti dell’organismo come il tessuto adiposo.. In alcuni casi, l’effetto tossico si manifesta solo in seguito a un calo ponderale dell’animale.. che porta all’entrata in circolo del tossico.. :-/ Pagina | 50

Può anche verificarsi che il danno causato alla sostanza tra una dose e la successiva sia reversibile.. e quindi non evidente… Se però eseguiamo uno studio che dura molto tempo, ravvicinando le dosi, andiamo a provocare un danno che ha perso la sua reversibilità. I tempi (come ripetuto ormai 3 milioni di volte) sono molto più lunghi.. 18 mesi nel topo.. 24 nel ratto.. i dosaggi utilizzati sono più bassi della MTD.. Osservando quindi tutta la serie di test fatti fino ad ora possiamo notare che la dose va via via sempre più diminuendo… → partiamo da una LD50 (e superiori) per poi passare a una LD10 e a una MTD.. e da quest’ultima andremo poi a ricavare le dosi per i test di tossicità cronica.. O_o Più si allunga l’esposizione al tossico.. più si abbassa la dose somministrata.. questo perché dobbiamo osservare cosa accade nell’animale in caso di esposizione prolungata a piccole dosi… Se crepa prima del previsto… arriviamo alla fine dei 2 anni con solo degli scheletri nello stabulario =_=”

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VALUTAZIONE SPERIMENTALE DELLA TOSSICITA’ | 09/11/11 |Parte 3 A questo punto, dobbiamo estrapolare il dato all’uomo (era anche ora….) Come facciamo?? → Per l’uomo si valuta il RISCHIO, ovvero la probabilità che la sostanza in esame testata sull’animale, provochi gli stessi effetti tossici anche nell’uomo… Non esiste il rischio “Zero”… C’è sempre la possibilità che la sostanza manifesti effetti tossici. Per questo, si cerca di individuare il Rischio socialmente Accettabile… appunto, valutando il Rischio (che casinoo…O_o) Lo step successivo è la “Gestione del Rischio”. La Valutazione del rischio può essere riassunta in 3 Verbi:   

Identificare: dal Punto di vista chimico fisico la sostanza in esame Descrivere: i suoi effetti tossici Misurare: l’effetto della tossicità (effettuato tramite la LD50 l’MTD e la NOEL)

La gestione del Rischio risponde al “come affrontare la presenza di una sostanza tossica nell’ambiente?”.. occorre attuare delle normative, per ridurre il rischio per la popolazione.. Anche questa lo possiamo riassumere in 3 verbi:   

Valutare: (tutto quello visto fino ad ora) Decidere: le misure da attuare per ridurre il rischio per la popolazione Attuare: quanto è stato deciso :P

Ora, dal punto di vista pratico, come si valuta la pericolosità della sostanza tossica nei confronti dell’organismo umano? → Partiamo dal NOEL (la dose che non dava alcun effetto tossico nell’animale) molto più bassa della MTD ed estremamente più bassa della LD50 … Per l’uomo dobbiamo calcolare una dose che sia ancora più bassa del Noel perché va considerato che il nostro organismo è molto più sensibile per le sostanze tossiche. Questo valore si identifica nell’ADI, la dose che l’uomo può assumere per tutta la durata della sua vita senza che vi siano effetti tossici nel suo organismo… Tutto questo, sulla base delle conoscenze al momento disponibili.. :P

o L’ADI si ottiene dividendo il NOEL per SF:

𝐴𝐷𝐼 = 𝑁𝑂𝐸𝐿⁄𝑆𝐹

SF sta per Fattore di Sicurezza, ed è variabile… Più è alto il suo valore, più la sostanza rischia di essere pericolosa… Se invece l’SF è basso, la sostanza non è generalmente considerata estremamente pericolosa.. L’SF può essere 10, 100, 1000… Generalmente si tende a usare un SF alto per tutte le sostanze che oltre a essere ritenute pericolose, non hanno un gran numero di test alle spalle, o su cui non si hanno dati completi. Il NOEL è una dose SOGLIA, l’ADI è una soglia di Sicurezza… Tutto quello visto fino ad ora, è valido per quelle sostanze di cui è conosciuta la curva “Dose – Risposta”… Es: per gli additivi alimentari, pesticidi, inquinanti.. ecc… Invece, per tutte quelle sostanze di cui non si riesce a ottenere una curva del genere occorre fare ricorso alla VSD: Dose virtualmente Sicura.. questo vale in particolare per i Mutageni genotossici. L’FDA e l’EPA hanno stabilito che è considerabile rischio socialmente accettabile un rischio di 1 evento su un milione. Pagina | 52

NEUROTOSSICITA’

|Parte 1

Il sistema nervoso lo possiamo dividere in Sistema Nervoso Centrale e Sistema nervoso Periferico; quest’ultimo è a sua volta diviso in: Autonomo (Simpatico e parasimpatico), Somatico e sistema nervoso a livello intestinale (sistema con una propria autonomia). Cosa succede quando un’informazione proveniente dall’esterno raggiunge attraverso le fibre afferenti il SNC? → i segnali vengono integrati a livello centrale, quindi attraverso delle fibre efferenti che innervano i diversi tessuti verranno trasferiti gli stimoli di risposta. Come fa il segnale a viaggiare dalla Periferia al Centro e ……. Viceversa? → il segnale viaggia attraverso le fibre nervose (dendriti e assoni → i componenti principali delle fibre nervose).. il segnale passa da una fibra nervosa all’altra attraverso delle sostanze chimiche → i Neurotrasmettitori. Il neurone è costituito dal Pirenoforo (o Corpo Cellulare), da cui si diramano delle collaterali che presentano una ramificazione arborea → I Dendriti, la sede di arrivo dell’impulso nervoso, in quanto entreranno poi in sinapsi con gli assoni provenienti dai neuroni circostanti. Dal pirenoforo parte inoltre la collaterale più lunga, che termina sinaptando con un tessuto o con i dendriti di altre cellule nervose. Il passaggio dell’informazione tra un neurone e il successivo avviene a livello della sinapsi.. Il neurotrasmettitore viene liberato dalla porzione presinaptica (dopo l’assone) e andrà a interagire con gli opportuni recettori nella porzione postsinaptica.. Questa interazione genererà, tramite un meccanismo di trasduzione, un segnale che si riflette in una modificazione della funzione cellulare. I neuroni non sono gli unici ad essere colpiti dalle sostanze tossiche, ci sono anche le cellule gliali, molto importanti nel controllo della trasmissione nervosa; sono coinvolte nel turnover dei neurotrasmettitori, e sono implicate nella progressione delle malattie neurodegenerative. Esistono numerosi tipi di cellule Gliali, almeno 4 tipi: 



 

Oligodendrociti: Partecipano alla formazione della guaina mielinica che circonda l’assone, il quale non è un neurite scoperto, ma è protetto appunto da questa guaina, che permette una più veloce trasmissione del segnale nervoso. Microglia: è interessante soprattutto per il suo intervento nei processi neuro-infiammatori. Quando c’è un danno a livello neuronale, le cellule della microglia vengono convogliate nella zona interessata, e hanno prevalentemente funzione fagocitaria (fagocitano i detriti cellulari→ agiscono come scavenger) Cellule Ependimali: Vanno a rivestire le cavità del SNC (i 4 ventricoli) e il canale attraverso cui passa il midollo spinale. Sono inoltre una sorgente di cellule neuronali staminali. Astrociti: il nome deriva dal fatto che hanno questa particolare struttura a ramificazioni… Funzionano da supporto per le cellule nervose, e hanno anche la proprietà di produrre dei fattori neurotrofici, permettendo la rigenerazione di fibre danneggiate… Gli astrociti vanno a Pagina | 53

costituire anche parte della BEE.. e sono in grado di partecipare al turnover dei neurotrasmettitori (Glutammato e GABA). La microglia è coinvolta nella sclerosi laterale amiotrofica, questa malattia è una malattia neurodegenerativa che interessa i motoneuroni. Il primo motoneurone è quello che dalla corteccia cerebrale va al midollo spinale, e il secondo motoneurone va dal midollo spinale alla fibra muscolare. Un danno ai 2 motoneuroni fa si che il muscolo non riceva il segnale → il muscolo quindi perde la capacità di contrarsi :/ Nell’immagine si vede com’è la situazione in un tessuto che non ha subito alcun tipo di danno, le cellule della microglia sono in uno stato inattivo di riposo. Questo stadio può essere riconosciuto dalla morfologia ramificata delle cellule. Quando vi è un danno, il motoneurone produce delle sostanze che vanno a richiamare e ad attivare le cellule microgliali, sia quelle vicine che quelle più lontane dalla zona lesa… Nel momento in cui si attivano, la forma ramificata viene persa e le cellule gliali assumono una morfologia ameboidea.

… ……….

Le cellule gliali oltre a fagocitare i detriti cellulari secernono glutammato (responsabile di fenomeni citotossici).. gli astrociti circostanti il neurone cercano di rimediare al danno, producendo fattori neurotrofici e neuro protettivi. Per evidenziare i neuroni si utilizzano tecniche di immunocitochimica (prevedono l’interazione di un’antigene con un anticorpo); in questo modo possiamo osservare la morfologia delle cellule e verificare se vi sono stati dei danni macroscopici Es: rottura di arborizzazione, aumento del volume del corpo cellulare, raggrinzimento (tipico delle cellule apoptotiche).. In questo modo possiamo anche contare le cellule presente :D. L’anticorpo usato (nella figura qui affianco) riconosce come antigene una proteina del citoscheletro; la MAP-2 (microtubule associated Protein); questa proteina è presente SOLO nelle cellule nervose. La colorazione fluorescente rossa è data da un Anticorpo che riconosce l’Anticorpo Anti-MAP2 :D che viene definito Anticorpo Secondario. Questo è legato a un fluoroforo, come la rodamina (rosso) o alla fluoresceina isotiocianato (verde).. Gli astrociti invece vengono identificati usando un anticorpo per la proteina GFAP (Glial fibrillary acidic protein). Anche questa è una proteina che compone il citoscheletro e il complesso Anticorpo-GFAP viene evidenziato tramite un anticorpo secondario legato a un fluoroforo come il FITC (Fluoresceina Iso Tiocianato) ecc… Gli astrociti hanno delle ramificazioni molto lunghe, con un corpo cellulare abbastanza ridotto, formando una rete di supporto per i neuroni. Pagina | 54

La microglia può essere messa in evidenza con l’anticorpo per la proteina OX-42 e gli oligodendrociti con l’anticorpo specifico per la proteina di membrana NG2. Il tessuto nervoso cerebrale presenta delle peculiarità che non hanno gli altri tessuti e che lo rendono più o meno sensibile ai tossici: 

 



Presenta la BEE → il sangue che arriva al tessuto cerebrale non riesce a trasferire tutte le sostanze trasportate nel tessuto nervoso.. questa barriera permette soprattutto il passaggio delle sostanze lipofile, mentre riduce il transito di quelle polari. Le sostanze tossiche polari ad ogni modo, possono sempre raggiungere il cervello tramite il Liquor, in quanto la barriera ematoliquorale è molto meno selettiva della BEE..  Ha un metabolismo molto attivo, di tipo aerobico. Queste cellule sono quindi sono più sensibili quando vi è un calo dell’ossigeno (in condizioni di Anossia). La morfologia è molto diversa da quella delle altre cellule.. Le lunghe ramificazioni con terminazioni molto sottili sono più soggette a una rottura.. venendo a mancare la comunicazione con il corpo cellulare. Le cellule comunicano l’una con l’altra attraverso la produzone e liberazione di neurotrasmettitori… Quindi, una sostanza tossica che altera la trasmissione sinaptica, può provocare seri danni alle cellule.

Quali sono i principali danni causati dalle sostanze tossiche alle funzioni del sistema nervoso centrale? →  

 

Possiamo avere un’alterazione della funzione sensoriale.. quindi riduzione della sensibilità nei confronti degli stimoli esterni Alterazioni della funzione motoria.. possiamo avere 2 casi: o Perdita della capacità del muscolo di contrarsi.. che provoca debolezza muscolare, atassia, perdita della coordinazione fino a paralisi.. o Oppure, caso inverso, il motoneurone è ipersollecitato; quindi il muscolo è costantemente cottratto.. partiamo da una forma lieve di tremore fino a una vera e propria convulsione.. Alterazioni delle risposte fisiologche mediate da neurotrasmettitori come NA, 5-HT, DA, GABA… ecc.. andando a modificare la temperatura corporea, i centri della fame, e i cicli sonno-veglia. Alterazione della reattività del SNC.. queste reazioni le provocano prevalentemente le sostanze d’abuso.. possiamo avere 2 fenomeni: o stati di irritabilità, eccitazione.. euforia.. o oppure il contrario, con stati di depressione, apatia.. letargia… I neurotrasmettitori coinvolti sono il Glutammato, GABA, 5-HT.. DA…



Infine, il danno può essere a livello delle funzioni cognitive… in particolare possiamo avere danni a livello dell’ippocampo o della corteccia cerebrale, con perdita della memoria a breve termine e a lungo termine.. e difficoltà di apprendimento ed elaborazione…

Le sostanze tossiche possono anche essere catalogate a seconda dei danni che inducono. Alcune possono distruggere completamente il neurone, altre possono causare solo danni parziali. In questo caso, la riparazione è più semplice.. :D

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Possiamo parlare di: 

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Neuronopatie: quando la sostanza tossica colpisce e degrada tutto il neurone.. questo tipo di danno porta al 100 % alla morte cellulare.. Assonopatia: per danni che riguardano la parte terminale del neurite più lungo (l’assone).. questo tipo di danno generalmente parte dall’estremità e risale verso il pirenoforo.. per questo viene anche definita morte retrograda. Se non interviene tempestivamente un sistema di riparazione, il neurone è destinato a degenerare :’( Mielinopatia: quando il danno è agli oligodendrociti.. questo provoca la perdita della guaina mielinica in alcuni punti dell’assone.. rallentando la trasmissione dello stimolo nervoso… Danno sulla neurotrasmissione: quando viene alterato il turnover dei neurotrasmettitori…

NEURONOPATIA: Come già detto, conduce irrimediabilmente a morte cellulare. La microglia interviene successivamente per ripulire la zona danneggiata di tutti i detriti cellulari.. Questa zona (ora libera) viene riempita dalle cellule gliali, che proliferano, formando una gliosi (→ una formazione anomala di glia, in una zona dove prima c’era tessuto nervoso). La gliosi determina quindi perdita delle capacità funzionali della porzione colpita dal danno :-/ Abbiamo le sostanze o i mezzi che provocano ANOSSIA:   

Cianuri Monossido di carbonio L’annegamento

Un ridotto apporto di ossigeno causa una ridotta produzione di energia da parte dei mitocondri… No Energia, No ATP… la cellula nervosa non funzia più… :P Niente ATP.. niente Sodio Potassio ATPasi… si ha quindi l’aumento del Calcio Citoplasmatico.. e un massiccio rilascio di glutammato nelle sinapsi neuronali… che al di sopra delle concentrazioni fisiologiche, provoca eccito tossicità.. che porta infine a morte cellulare per Necrosi, apoptosi o autofagia. Possiamo aggiungere alla lista quindi anche gli: 

EAA: Aminoacidi Eccitatori (Es: Glutammato, Aspartato) Il glutammato però può essere introdotto nell’organismo anche con altre modalità, quindi non solo in caso di anossia, ma anche ingerendo cibi particolarmente speziati :S .. definita anche “Sindrome da Ristorante Cinese” :P ovviamente, l’esito dell’intossicazione non è la morte, ma colpisce le mucose orali, con arrossamenti .. prurito..

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Tra le altre sostanze che determinano Neuropatia abbiamo: 

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Metanolo: Clamoroso il caso di alcuni anni fa del vino adulterato con il metanolo… Questo alcol subisce all’interno dell’organismo lo stesso metabolismo dell’etanolo.. quindi prima l’alcol deidrogenasi lo converte in formaldeide poi questa viene convertita ad acido formico per l’azione dell’aldeide deidrogenasi… L’acido Formico è deleterio in particolare per le fibre del nervo ottico XD In elevate quantità può causare cecità. MetilMercurio: E’ la forma organica del mercurio, ovvero la più tossica, in quanto supera la BEE che è un piacere :P .. Questa sostanza è ancora presente nei pesticidi, può essere emessa nell’ambiente dagli impianti industriali, e nel passato ha provocato seri danni nella baia di Minamata in seguito a pesce contaminato.. o ad es in Iraq, a causa di cereali contaminati con i pesticidi. Il metilmercurio causa intossicazioni acute e croniche.. Quest’ultime si ripercuotono in particolare sui bambini nati da madri che durante la gestazione sono entrate in contatto con questa sostanza. MPTP: E’ una sostanza tossica usata sperimentalmente per ricreare in laboratorio un modello animale di Morbo di Parkinson, in cui muoiono i neuroni DA nella substantia nigra. Questo modello sperimentale viene usato attualmente per sperimentare composti nuovi, e in particolare verificare la loro azione neuroprotettiva per rallentare il danno causato dalla sostanza tossica :D

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NEUROTOSSICITA’ – NEURONOPATIA

| 14/11/11

|Parte 2

Partiamo ora di prima mattina con questa “bellissima” immagine… O_o…. Avevamo visto ieri il Metilmercurio come sostanza che provoca neuropatia.. Questa sostanza è dannosa perché ha molteplici meccanismi d’azione→ Nell’immagine possiamo vedere 2 cellule del SNC; un Neurone e un Astrocita.. e quest’ultimo sembra essere quello maggiormente coinvolto nel danno provocato dal MetilMercurio. 



Le Linee Rosse: Fanno vedere i meccanismi stimolati dal MM*→ o Prima di tutto va ad aumentare i radicali liberi dell’ossigeno (ROS), provocando stress ossidativo e causando quindi un danno a livello delle proteine, dei fosfolipidi di membrana e del DNA. L’aumento delle specie radicaliche avviene per via diretta… o Indiretta, incrementando l’azione della FospolipasiA2 (cPLA2) che produce Acido Arachidonico (AA) che a sua volta incrementa i ROS. o I ROS e l’AA provocano un aumento di alcune proteine come C-fos (gene espresso per primo in caso di effetti tossici) e NF-Kb (che attiva la trascrizione di proteine che portano a morte cellulare). Le Linee Verdi: Rappresentano ciò che il MM* va a inibire portando a un danno nella cellula  o Il MM* aumenta il glutammato nello spazio extracellulare in quanto blocca il reuptake di questo neurotrasmettitore all’interno degli astrociti (→che, ricordiamolo, partecipano al Turnover dei neurotrasmettitori). Se il glutammato rimane nello spazio extracellulare, aumentando la sua concentrazione, aumenta la sua interazione con i recettori NMDA provocando eccito tossicità (aumento del Ca++ intracellulare… ecc…come al solito) o Il MM* riduce la disponibilità del GSH (glutatione in forma ridotta).. una delle principali difese antiossidanti dell’organismo. Come fa a ridurla?? → Il GSH è un tripeptide costituito da Glutammato-Cysteina-Glicina per cui, per sintetizzarlo, occorrono questi 3 aa… il MM*  → riduce l’entrata del Glutammato nell’astrocità.  → impedisce il trasporto dentro l’astrocita del precursore per la Cisteina Meno aminoacidi a disposizione, Meno GSH prodotto :-/ Meno attività antiossidante. o Il MM* interagisce inoltre con i gruppi –SH delle proteine, causando danni al citoscheletro di qualsiasi cellula Pagina | 58

L’Eccitotossicità (già vista in TossicoDinamica), riguarda il SNC… Il glutammato presente nello spazio extracellulare va a stimolare i recettori Postsinaptici Aumentando:  

Tramite i recettori NMDA: la concentrazione citoplasmatica di Ca++ nella Cellula.. Attraverso gli AMPA e Kainato: la concentrazione di Na+ ..questo provoca depolarizzazione.. e quindi l’apertura dei canali del Ca voltaggio dipendenti (VOCC). Si ha quindi un ulteriore aumento del Ca intracellulare, provocando un danno a livello di mitocondri, reticolo endoplasmatico, sistema lisosomiale… che porterà alla fine a diversi tipi di morte cellulare.. principalmente: Apoptosi, Necrosi o Autofagia (auto digestione della cellula).

Un’altra molecola vista ieri che causa Neuropatia è

l’MPTP,

usata per creare in vivo un modello di

Parkinson. Il meccanismo di tossicità è rappresentato in figura → → L’MPTP, attraverso la circolazione sistemica arriva a livello Centrale; la sua struttura gli permette di attraversare facilmente la BEE. Da notare che l’MPTP è il Precursore della tossina vera e propria… se si usasse direttamente quella, il tossico (polare) non arriverebbe mai nel sito d’azione (la substantia nigra). Una volta superata la BEE, l’MPTP incontra gli astrociti, i quali lo trasformano ad opera delle MAO-B in ione Diidropiridinio che poi viene ulteriormente ossidato a ione Piridinio (MPP+ →il metabolita tossico). L’ MPP+ arriva nel sito d’azione sfruttando i trasportatori della dopamina presenti nella substantia nigra; e si lega a un pigmento chiamato neuromelanina (il pigmento che da la corolazione più scura a questa area cerebrale)… Il danno provocato incide sulla catena di trasporto degli elettroni, a livello dei mitocondri, bloccandola… Si ha quindi blocco della sintesi di ATP con conseguente danno e morte cellulare. Per ricreare in laboratorio altri modelli del morbo di parkinson oltre all’MPTP può essere usata in laboratorio anche la 6-Idrossi-Dopamina. E’ un analogo tossico della Dopamina, e agisce anch’essa a livello mitocondriale, bloccando la catena di trasporto degli elettroni. Abbiamo poi i Derivati Organici dello Stagno, che possono provocare differenti danni a livello neuronale. 

TRIMETIL-STAGNO: è responsabile di neuropatia. Ha un molteplice meccanismo d’azione.. è abbastanza selettivo per la zona cerebrale che va a colpire, in quanto si lega a una proteina presente all’interno di alcuni neuroni → la Stannina. Principalmente colpisce l’Ippocampo (area importante per l’apprendimento e la memoria) provocando un danno di tipo cognitivo. il TMS provoca un aumento del calcio intracellulare, che causa una conseguente estrusione del glutammato.. il quale (se in eccesso) provoca eccitotossicità.. → Danno e morte cellulare. Oltre al TMS abbiamo anche il… Pagina | 59

 

TRIETIL-STAGNO: che indirizza la sua tossicità verso il rivestimento mielinico dell’assone.. mentre il TRIBUTIL-STAGNO: provoca danni principalmente a livello del sistema immunitario.

Ora vediamo i danni provocati dall’ ANOSSIA.. prima di tutto.. abbiamo diverse categorie di questa… 

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ANOSSIA ANOSSICA: si ha quando pur avendo un flusso sanguigno adeguato, vi è un ridotto apporto di ossigeno ai neuroni. Ciò che provoca questo tipo di anossia sono sostanze come il: o Monossido di Carbonio: che si lega con affinità superiore dell’O2 All’Emoglobina. o Il Piombo: Agisce sia causando un’alterata sintesi dell’eme (il gruppo prostetico dell’Hb).. compromettendo la capacità di questa di trasportare l’Ossigeno.. Agisce inoltre alterando la morfologia degli eritrociti rendendoli più fragili.. e diminuendo la capacità di trasporto di O2 ANOSSIA ISCHEMICA: occorre quando vi è un ridotto afflusso di sangue alle cellule del SNC. Questo può essere dovuto a vari motivi come: restringimento di vasi cerebrali, formazione di occlusioni o trombi… ANOSSIA CITOTOSSICA: Avviene quando l’afflusso e il trasporto di ossigeno è normale.. ma la cellula è così rintronata da non sapere come usarlo… → il tossico agisce sulle vie della respirazione cellulare, impedendo lo sfruttamento dell’ossigeno per la produzione di ATP. Tra le sostanze che causano anossia citotossica abbiamo i: o Fenoli: che sono i disaccoppianti.. alterano la differenza di potenziale che si forma a cavallo della membrana dei mitocondri.. e i o Cianuri: che bloccano la catena di trasporto degli elettroni.

Non tutte le cellule del SNC reagiscono allo stesso modo a una carenza di ossigeno… Alcune sopravvivono più facilmente.. altre sono più sensibili. Abbiamo quindi una scala di sensibilità e un ordine di morte cellulare. Tutto questo dipende in buona parte dal tipo di metabolismo che avviene in queste cellule. I. II. III. IV. V.

Al primo posto in sensibilità abbiamo i Neuroni.. che sono i più soggetti a morte cellulare.. Poi ci sono gli Oligodendrociti (che formano la guaina mielinica.. ) quindi avremo un danno al rivestimento degli assoni.. Seguono gli Astrociti La microglia.. E infine le cellule endoteliali dei vasi cerebrali…

Come inizia e come progredisce il danno causato dalla carenza di ossigeno?? → Il primo segno che deriva da una carenza di ossigeno è una mancata produzione di ATP. Questo si ripercuote sui sitemi enzimatici cellulari.. in particolare sulle pompe protoniche di membrana, come la Na+/K+ ATPasi che permette di mantenere una differenza di potenziale tra l’esterno e l’interno della cellula.. Il blocco di questa pompa protonica provoca un aumento intracellulare del sodio.. il quale per osmolarità si trascina dietro l’acqua… eee…. Kaboommm.. la cellula inizia a gonfiarsi (Swelling) fino ad arrivare alla lisi cellulare… A causa dell’aumento del Sodio, il potenziale interno della cellula tende ad assumere valori più positivi.. passa da 10 a 30 mV nelle terminazioni e nel corpo cellulare delle regioni colpite da ischemia.. (la cellula è quindi più facilmente eccitabile..) → ne consegue che verranno attivati anche più facilmente i canali del calcio voltaggio dipendenti, favorendo un’entrata di questo nella cellula… Un aumento del Calcio provoca una massiccia esocitosi del glutammato… con conseguente stimolazione dei suoi recettori… che si conclude con la tipica eccito-tossicità… Danno e morte cellulare….

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Da una semplice carenza di ossigeno.. abbiamo un’espansione abnorme del danno O_o”

Questa è la cellula.. divisa in 3 sezioni per evidenziare i punti che favoriscono l’aumeto del calcio intracellulare. Nella prima abbiamo i recettori del Glutammato.. che una volta attivati favoriscono l’entrata del calcio nella cellula. Il calcio viene inoltre rilasciato dai depositi (mitocondri e reticolo endoplasmatico).. e infine tutti gli altri tipi di canali che favoriscono l’entrata del calcio quando la membrana si depolarizza (ad es per l’apertura dei canali del sodio). Un aumento del calcio intracellulare, va ad attivare diversi enzimi, tra cui:      

le Calpaine: sono delle proteasi.. che vanno a degradare altre proteine ed enzimi cellulari; la PLA2: che produce Acido Arachidonico e Radicali liberi dell’ossigeno le Caspasi: sono altre proteasi, coinvolte nella morte apoptotica.. Le CAMK: sono delle chinasi attivate dalla calmodulina che a loro volta fosforilano altri enzimi Le Endonucleasi: che tagliano il DNA, causando la sua frammentazione Alterano i sistemi di trasporto delle membrane come la Na+/K+ ATPasi, e tutti gli altri scambiatori per gli ioni Ca++

Le conseguenze dell’attivazione di tutti questi enzimi avrà un pataccaio di conseguenze: Danno ai mitocondri, alterata permeabilità della membrana (che può portare al rigonfiamento e alla lisi della cellula), rottura del citoscheletro (es: il MetilMercurio), Produzione di ROS e Nitrossido (che a sua volta genera radicali dell’azoto), frammentazione del DNA.. rigonfiamento e alterato funzionamento del reticolo endoplasmatico (dove avviene la sintesi proteica.. quindi si ha anche alterazione della sintesi proteica).. e infine, abbassamento del pH cellulare.  Conseguena finale??  MORTE della Cellula…

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ASSONOPATIA: In questo caso, il danno è limitato al neurite più lungo→ l’assone… In genere questo danno parte dalla terminazione presinaptica e poi, con andamento retrogrado, risale l’assone verso il corpo cellulare. Normalmente la maggior densità di enzimi responsabili del catabolismo e della rimozione delle sostanze di scarto, sono a livello del corpo cellulare.. per cui da questo, alla terminazione, c’è uno spostamento di vescicole contenenti gli enzimi necessari.. Se a causa di danni all’assone viene bloccata la comunicazione tra il corpo cellulare e la terminazione, questa non è più in grado di sopravvivere.. Se il danno interessa i neuroni del SNC, raramente vi si può porre rimedio… Se invece interessa gli assoni dei neuroni del sistema periferico la riparazione è più facile e avviene ad opera di cellule di origine gliale, simili agli oligodendrociti, che rimuovono i detriti cellulari e rigenerano la parte danneggiata. Alcuni tossici noti che determinano Assonopatia sono: 

Il n-Esano e il ButilMetilChetone… Il n-Esano è presente soprattutto nelle fabbriche di scarpe, perché è un componente delle colle adoperate. Il ButilMetilchetone è invece un additivo che si trova nell’inchiostro per le stampanti.. Agiscono alterando la funzione dei Neurofilamenti (sono dei componenti del citoscheletro delle cellule nervose). Questa modificazione funzionale può interessare delle fibre nervose di tipo sensitivo.. o delle fibre di tipo motorio. Ecco che allora il danno può essere di natura sensoriale o motoria. Come Agiscono?? →→ Di per se, non sono i responsabili dell’azione tossica.. ma richiedono la bioattivazione a Esandione in grado di formare legami crociati covalenti tra i neurofilamenti… compromettendo la la loro plasticità, e determinando la perdita della funzione di trasporto di organelli e vescicole da e verso il corpo cellulare… Questi tossici sono particolarmente subdoli, in quanto è difficile diagnosticare l’intossicazione… Inizialmente se il danno interessa le fibre nervose sensitive si avverte formicolio e lieve perdita di sensibilità a mani e piedi.. successivamente il danno si estende anche alle fibre motorie, causando debolezza muscolare.. crampi, fino ad arrivare all’atassia e a perdita della capacità motoria di arti Superiori e inferiori.



Anche gli Alcaloidi della Vinca, la Colchicina e il Taxolo, determinano la perdita di funzionalità del citoscheletro. o La Vincristina è usata come antitumorale.. impedisce la formazione del fuso mitotico. o La Colchicina viene usata come AntiGotta.. ha un meccanismo d’azione simile alla vincristina.. impedisce la migrazione dei leucociti verso la zona infiammata e blocca l’attività macrofagica. Come fanno in maniera specifica a compromettere l’azione dei microtubuli?? → Vanno a legare ai monomeri dei microtubuli (la Tubulina), depolimerizzando o impedendo la polimerizzazione dei microtubuli :D o Il Taxolo invece fa esattamente il contrario.. impedisce la depolimerizzazione del microtubulo

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Poi abbiamo altre sostanze che causano assonopatie come:   



Solfuro di Carbonio Solventi organici Tri-orto-cresilfosato (TOCP): noto per un episodio particolarmente importante avvenuto quasi 100 anni fa.. il TOCP è un composto organofosforico, responsabile di una patologia a livello neuronale conosciuta come neuropatia distale centro-periferica o con la sigla OPIDN. Questo tipo di neuropatia provoca perdita progressiva delle funzioni sensoriali e motorie (che inizia dalle estremità con semplici formicolii).. fino ad arrivare ad atassia e paralisi. Questa sostanza agisce fosforilando e inattivando l’enzima NTE (neuropathy target esterase → la cui azione a livello centrale non è ancora chiaramente conosciuta; ad ogni modo deve essere importante per la funzione motoria). Viene ricordato perché tra gli anni ’20 e gli anni ’30 negli USA, ci furono molti casi di intossicazione in seguito ad adulterazione di una bevanda molto apprezzata all’epoca → il Ginger Jake; preparato a base di estratti di zenzero. Nell’adulterazione fu usato l’olio di lindo che conteneva il TOCP :S Idrocarburi Ciclici clorurati: tra cui ricordiamo soprattutto il DDT.. sostanza usata nel passato come insetticida.. uscita dal commercio negli anni ’70, ma ancora presente nell’ambiente. Il DDT è una sostanza eccitante, che porta a condizione di tremore e convulsioni. Agisce in diversi modi diversi: o Diminuisce la permeabilità al potassio, riducendo di conseguenza la ripolarizzazione della membrana plasmatica.. e il potenziale d’azione si annulla; o Induce modificazioni a livello dei canali del sodio rendendo più lenta la loro chiusura. Questo comporta che il potenziale d’azione permanga per più tempo. o Inibisce inoltre le pompe come la Na/K ATPasi che dovrebbe aiutare a ripristinare la differenza di potenziale a cavallo della membrana. Tutto ciò rende la cellula meno propensa a ripolarizzarsi.. quindi più soggetta a rispondere in modo abnorme a degli stimoli che nella norma non dovrebbero causare problemi. o Il DDT aumenta il legame del Ca con la calmodulina, determinando rilascio dei neurotrasmettitori, tra i quali anche quelli eccitatori.

L’ultimo capitolo che affrontiamo riguarda gli EFFETTI dei tossici SULLA NEUROTRASMISSIONE: i punti di attacco sono diversi..   

possiamo avere una sostanza tossica che altera la trasduzione del segnale per blocco o aumento della stimolazione dei recettori che permettono la comunicazione tra un neurone e l’altro. Il secondo punto di attacco è andare a modificare l’eccitabilità di queste cellule alterando la permeabilità ionica (Es: Tossine algali e la tetradotossina.. o la tossina degli scorpioni) Alternativamente l’alterazione della neurotrasmissione può essere dovuta a sostanze tossiche che interferiscono nei meccanismi di esocitosi, impedendo la liberazione delle vescicole contenenti i neurotrasmettitori endogeni (es: Tossina Botulinica e Tetanica) Pagina | 63



Infine, abbiamo le sostanze che alterano i meccanismi di degradazione dei neurotrasmettitori.. come gli Esteri organo fosforici che bloccano le AcetilColinesterasi.. provocando un incremento dell’ACh nelle sinapsi.

Vediamo alcuni esempi: La nicotina interagisce con i recettori nicotinici, determinando una risposta eccitatoria.. Il piombo invece blocca il recettore nicotinico… Alcune sostanze, presenti spesso in alghe tossiche, come l’acido cainico (alga rossa), l’acido Domoico (alga verde) o l’acido Ibotenico (amanita), vanno ad agire sui recettori del glutammato, attivandoli. Questo determina una risposta eccitatoria. La ketamina blocca invece i recettori del glutammato.. riducendo la comunicazione neuronale. Prendendo invece in considerazione il recettore GABA-A, che possiede il maggior numero di siti allosterici, troviamo i barbiturici e le benzodiazepine.. (ipnotici sedativi)… modulano l’apertura dei canali del cloro determinando iperpolarizzazione e potenziando l’azione del GABA su questi recettori. La Bicucullina e le Clorotossine vanno invece a bloccare i siti che si trovano sul recettore GABA-A, riducendo l’attività inibitoria del GABA.. e determinando quindi un effetto opposto a barbiturici e benzodiazepine inducendo uno stato di iper-eccitabilità. Questo schema rappresenta il meccanismo d’azione di varie tossine che agiscono sui canali del sodio. La tetradotossina blocca i canali del sodio, inibendo l’insorgenza del potenziale d’azione→ si ha quindi Paralisi. Le tossine degli scorpioni o di alcuni ragni vanno a impedire che il canale del sodio passi allo stato inattivo.. determinando un aumento dell’eccitabilità neuronale..

Hotlinks:  

Registrazione: Dispense: Pagina | 64

NEUROTOSSICITA’ – ASSONOPATIE

| 15/11/11

| Parte3

Sostanze Tossiche che interferiscono con i sistemi di Esocitosi: Di questo gruppo di sostanze, andremo a vedere la Tossina botulinica e la tossina tetanica. Queste tossine hanno come target comune il motoneurone spinale; in particolare agiscono sulla sinapsi frapposta al motoneurone spinale e la fibra muscolare scheletrica. Il neurotrasmettitore che in condizioni fisiologiche viene liberato è l’ACh, che va a interagire con i recettori nicotinici che si trovano sulla fibra muscolare, determinando contrazione. 

TOSSINA BOTULINICA:

Agisce come una Proteasi nei confronti di proteine indispensabili per far avvenire la fusione delle vescicole, contenenti i neurotrasmettitori, con la membrana presinaptica. Quando arriva il potenziale d’azione lungo la membrana dell’assone del motoneurone spinale, la depolarizzazione provoca l’apertura dei canali del Ca2+ Voltaggio dipendenti.. Il conseguente aumento del calcio intracellulare comporta la migrazione delle vescicole dal citoplasma verso la membrana presinaptica… A questo punto, come può avvenire la fusione? → Avviene l’interazione tra due proteine che si trovano sulla membrana della vescicola (Sinaptotagmina e Sinaptobrevina, chiamata anche VAMP→ proteina della membrana vescicolare) e due proteine presenti sulla membrana presinaptica (Sintaxina e Snap25).. Questo sistema permette un ancoraggio della vesciolca alla membrana presinaptica favorendo la fusione e la liberazione del neurotrasmettitore nella sinapsi.. La tossina botulinica va ad agire appunto su queste proteine tagliandole :’( .. come si vede nella figuraaa → → Le lettere “G”, “B”, “D” ecc… stanno a indicare che esistono più tipi di tossine botuliniche che hanno come target differenti sezioni delle proteine di membrana. La mancata interazione tra la vescicola e la membrana presinaptica impedisce la fuoriuscita dell’ACh → la fibra muscolare non riceve alcun segnale dal motoneurone → si ha quindi l’inibizione della contrazione muscolare → da cui seguirà un tipo di Paralisi definita “flaccida”. Che può essere distinta da quella causata dalla: 

TOSSINA TETANICA:

La tossina del clostridium tetani come agisce invece?? → Questa tossina arriva a livello del sistema nervoso centrale e penetra all’interno dei motoneuroni spinali che vanno a sinaptare con le fibre muscolari. Al contrario della tossina botulinica però, risale con andamento anterogrado l’assone del motoneurone, arriva al pirenoforo, viene quindi ceduta all’esterno nello spazio sinaptico tra il motoneurone e gli interneuroni inibitori.. e penetra in essi.. A questo punto attacca le proteine fusogene presenti sulla membrana vescicolare impedendo la fuoriuscita del neurotrasmettitore inibitorio (Glicina o GABA) nella sinapsi dell’interneurone.. Pagina | 65

Questo comporta la perdita di regolazione inibitoria sul motoneurone, che continua a liberare ACh mantenendo stimolata la fibra muscolare O_o”. Cosa accade quindi?? → Il recettore nicotinico (costantemente stimolato) andrà incontro a desensibilizzazione, e non risponderà più. La paralisi che ne deriva sarà una Paralisi “Spastica”. Queste tossine sono potenzialmente letali, tutto dipende dalla sede d’azione. Se la tossina colpisce l’apparato respiratorio si andrà incontro a morte per blocco della respirazione.. Un’altra classe di sostanze tossiche che vanno ad agire sulla Neurotrasmissione sono gli: 

ESTERI ORGANOFOSFORICI:

Come abbiamo già ripetuto 10mila milioni di volte, vanno a fosforilare le Acetilcolinesterasi, impedendo la degradazione dell’ACh, al quale andrà a iperstimolare sia i recettori di tipo nicotinico che quelli di tipo muscarinico. Gli esteriorganofosforici passano molto facilmente la BEE, ma non solo.. penetrano facilmente per via transcutanea. La sintomatologia un’accentuazione di tutti gli effetti del sistema colinergico.. quindi un:       

Aumento di tutte le secrezioni, Miosi (con incapacità di mettere a fuoco gli oggetti) Aumento della peristalsi gastrointestinale (con conseguente nausea, vomito ed evacuazione intestinale) Contrazione della muscolatura bronchiale Rallentamento della frequenza cardiaca (bradicardia) e ipotensione. Paralisi.. (per desensibilizzazione del recettore nicotinico). A livello centrale si hanno tutti gli effetti che possono derivare da un aumento dell’ACh nelle sinapsi come irrequietezza, nervosismo, tremori, confusione mentale ecc…

La sigla SLUDGE (polvere :P) aiuta a ricordare gli effetti causati dagli esteri organo fosforici :D Salivazione, Lacrimazione, ↑Urina, Defecazione, Anomalie Gastrointestinali, Emesi.

L’ultimo tipo di patologie che trattiamo, causate da sostanze tossiche del snc, sono le MIELINOPATIE. Queste, possono essere di 2 tipi:  

La Demielinizzazione: come dice il termine, indica che c’è un danno grave alle cellule gliali (oligodendrociti o cell di Schwann per il sn periferico) che rivestono l’assone. L’Edema intramielinico: è invece un danno che provoca un rigonfiamento dovuto a un accumulo di liquidi nella cellula gliale che riveste l’assone.

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Cosa comporta una mielinopatia?? → Semplicemente dei disturbi nella trasmissione del segnale nervoso. Questo perché il rivestimento mielinico permette una conduzione veloce, in quanto l’impulso elettrico non passa nello strato isolante della guaina mielinica ma salta da un punto scoperto all’altro :D Se viene a mancare il rivestimento mielinico, la conduzione è estremamente più lenta.. rallentando la trasmissione degli stimoli. Le sostanze Note Mielinotossiche sono: 

  

I Derivati organici dello Stagno o TrietilStagno → edema intramielinico. L’aumento di liquidi all’interno della cellula gliale è dovuto a un’alterato scambio ionico a livello della membrana cellulare.. Probabilmente dovuto a un’aumentata permeabilità al Sodio.. che si porta dietro l’Acqua :D Il Piombo → Provoca la morte di queste cellule.. con totale perdita del rivestamento Esaclorofene → usato un tempo come antisettico, provoca edema, seguito da lisi cellulare  Tellurio → è un metalloide, usato in alcune leghe e come semiconduttore… ha una tossicità diretta nei confronti del rivestimento mielinico sul sn periferico (cellule di Schwann).

E finalmente finiamo il capitolo dei danni causati dai tossici sul SN Centraleeee :DDD

=_=” ho esultato troppo in fretta.. ora ci occupiamo della NEURODEGENERAZIONE… le modalità con cui la sfigatissima cellulina nervosa muore… Queste modalità alla fin fine sono abbastanza generali.. e possono riguardare qualsiasi cellula dell’organismo.. Fino a 5-6 anni fa si pensava che i tipi di morte cellulare fossero stanzialmente 2: La necrosi e L’apoptosi. Oggi invece possiamo affermare che esistono diversi altri tipi di morte cellulare… e in particolare, l’apoptosi (processo caspasi dipendente), non è l’unico tipo di “suicidio” che richiede un programma genico specifico.. ma esistono altre morti programmate :D Anche la Necrosi.. che si credeva fosse un tipo di morte passiva e non fisiologica, prevede in realtà dei processi attivi programmati dalla cellula U_u Secondo un recente articolo: “Necrosis, a well-orchestrated form of cell demise” esistono altre forme di morte attiva che coinvolgono altri enzimi come la Calpaine o di fattori di trascrizione che agiscono sul nucleo, programmati nella loro funzione dalla cellula stessa. La necrosi è generalmente causata da gravi traumi, sia di tipo chimico che di tipo fisico e interessa più cellule contemporaneamente (ampie aree di tessuto). Inoltre, è sempre accompagnata da un processo di tipo infiammatorio. In questo processo, nelle cellule, vi è l’alterazione dell’omeostasi ionica e conseguente richiamo di acqua “→swelling” che provoca un rigonfiamento cellulare fino ad arrivare a lisi cellulare. A questo punto, tutti i mediatori dell’infiammazione della cellula in necrosi, si disperdono nell’ambiente circostante e vanno a intaccare le altre cellule.. ed ecco che il processo si dirama a tutto il tessuto. La Necrosi si Differenzia dall’apoptosi in quanto quest’ultima è stata definita Morte cellulare Programmata. Ogni cellula contiene all’interno del suo genoma delle informazioni/istruzione → geni di morte, che se attivati permettono di mandare al patibolo la cellulina senza alcun rischio per le altre circostanti e il tessuto. Inoltre non sono coinvolti processi infiammatori. Dal punto di vista morfologico c’è un andamento completamente diverso da quello osservato nella Necrosi (rigonfiamento e lisi). Nell’apoptosi la cellula non si rigonfia, ma si contrae… il termine usato maggiormente è “shrinkage” cioè raggrinzimento. In seguito a questa contrazione, che interessa anche gli organelli della cellula e la cromatina a livello del nucleo, si staccano delle vescicole contenenti materiale citoplasmatico e Pagina | 67

nucleare.. Questi, sono definiti: “CORPI APOPTOTICI”, e verranno poi fagocitati dai macrofagi in modo tale da ripulire la zona. In questo schema sono riassunti i vari tipi di morte che prevedono dei processi di tipo attivo.. Lo “Stimolo di Morte” può essere dovuto a vari fattori: 

    

in seguito all’interazione di substrati endogeni con i “Death receptors → Recettori di Morte” All’attivazione di Proto-oncogeni Presenza di Farmaci Citotossici come alcuni antitumorali Le radiazioni, tra cui quelle UV L’Ipossia E l’Assenza di Fattori di crescita (presenti in ogni tessuto.. e necessari per la proliferazione delle cellule di quel tessuto)

Questo stimolo di morte… può provocare nella cellula morte per Necrosi.. o morte per Apoptosi… Esistono però anche stadi intermedi che sono:   



la Catastrofe Mitotica: Il fisiologico proseguimento di ciò che consegue alla distruzione del fuso mitotico→ la cellula va incontro morte la Morte cellulare rallentata: E’ una morte ritardata che interviene quando le caspasi non sono in grado di funzionare.. quindi vengono in aiuto altri enzimi che portano avanti il processo di morte. La Paraptosi prevede che si abbia la formazione di vacuoli citoplasmatici.. c’è una compromissione del funzionamento del reticolo endoplasmatico e dei mitocondri, con rigonfiamento degli organelli.. il processo è caspasi indipendente. E infine l’autofagia. Questo processo è invece una attivazione dei sistemi lisosomiali della cellula che intervengono nella sua stessa digestione

Qui abbiamo rappresentato il processo apoptotico.. Partiamo da una cellula normale, con la sua membrana integra, che inizia a raggrinzirsi.. gli organelli si spezzano e si dividono in frammenti, la membrana cellulare inizia a invaginarsi dando origine a delle cristae, dalle quali si staccano i corpi apoptotici (vescicole) contenenti frammenti di organelli e contenuto nucleare. Dal distacco dei corpi apoptotici entrano in funzione i macrofagi che ripuliscono la zona fagocitandoli.

Fino ad ora abbiamo parlato di un programma genico ben determinato nella cellula che va incontro ad apoptosi.. questo programma prevede il coinvolgimento di più geni diversi.

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I geni essenziali affinchè avvenga questo processo sono: 

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



I geni della competenza: Sono Positivi o Negativi (→ Pro-apoptotici o Anti-apoptotici) tra questi ritroviamo: o P-53 (+): permette alla cellula di bloccare la divisione cellulare in caso di danni al dna, dando modo ai sistemi di riparazione di intervenire. Nel caso il danno non fosse riparato P53 indirizza la cellula verso la morte cellulare per apoptosi. o FAS (+): E’ un ligando di morte… è una di quelle proteine riconosciute dai recettori di morte (death receptors) o RAS (-): E’ una proteina che porta la cellula verso un processo di proliferazione e si oppone alla morte per apoptosi I geni regolatori della morte: Appartengono a una grossa famiglia, chiamata BCL2, che comprende parecchi membri… e anch’essi possono essere Pro-apoptotici o Anti-apoptotici. Se nella cellula esiste un equilibrio tra Pro e Anti.. allora si divide e si moltiplica senza alcun danno… ma se un qualsiasi evento esterno, va a perturbare l’equilibrio.. portando a un aumento dei proapoptotici, la cellula viene indirizzata verso questo processo. I geni esecutori del programma di morte: o Sono le Caspasi → proteasi che hanno il compito di tagliare le proteine della cellula (proteine di membrana, enzimi… ecc…) portando a una distruzione graduale della cellula. o Oltre alle caspasi ci sono altre proteasi come le Calpaine, o e la tTG che è una transglutamminasi. E I geni della fagocitosi: una volta iniziato il processo apoptotico, è anche essenziale l’intervento dei macrofagi.. ecco quindi che entrano in funzione delle proteine codificate dai geni della fagocitosi che vengono esposte sulla membrana e hanno la funzione di segnalare ai macrofagi quali cellule o quali detriti cellulari vanno fagocitati.. tra questi abbiamo: o Il recettore per le Asialoglicoproteine.. queste glicoproteine di membrana hanno perso l’acido sialico, quindi sono andate incontro a un processo di invecchiamento e richiamano la presenza dei macrofagi. o Il recettore per la Vitronectina.. questa è una glicoproteina di adesione delle cellule, e anch’essa favorisce la fagocitosi dei corpi apoptotici.. o CD36: è un’α-glicoproteina che si trova sulle piastrine come per la Trombosporina.. o Recettore della Fosfatidilserina.. (il più importante..) La forfatidilserina.. che generalmente si trova rivolta verso l’interno della membrana cellulare, durante l’apoptosi viene esposta sulla faccia esterna della membrana plasmatica. Questa migrazione è caratteristica di tutti i processi apoptotici.. E’ molto importante, in quanto è un indice del processo apoptotico che può essere valutato sperimentalmente attraverso una tecnica immunocitochimica e l’uso di sostanze fluorescenti che vanno a legarsi alla fosfatidilserina. Le cellule che al microscopio a fluorescenza appaiono colorate (→ verdi, con fluoresceina isotiocianato) sono quelle andate incontro ad apoptosi o che hanno iniziato il processo.

Dal punto di vista biochimico, cosa accade?? →  

abbiamo un aumento del calcio intracellulare L’attivazione di proteasi come le Caspasi (che fanno parte delle CysteinProteasi..) ad opera di stimoli esterni (come i ligandi di morte) o interni (generalmente molecole liberate dai mitocondri. La liberazione dipende dall’alterata permeabilità della loro membrana, e la sostanza principale è il Citocromo C)

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 

Le

Le caspasi poi andranno ad attivare altri enzimi come le Endonucleasi che frammentano il DNA cellulare. Poi abbiamo alterazioni delle permeabilità ionica della membrana e spostamento di proteine citoplasmatiche su di essa.

CASPASI

appartengono a una famiglia molto numerosa, e il termine deriva da “Cysteine-requiring

ASpartate proteASE” → sono quindi proteasi che richiedono la presenza di Cysteina, e vanno a tagliare il substrato proteico a livello dell’Acido Aspartico. Le proteasi di questa famiglia non hanno tutte la stessa funzione.. esistono le:   

Caspasi attivatrici dell’apoptosi: che danno il via al processo apoptotico.. permettendo l’attivazione delle…→ Caspasi Esecutrici: Che vanno a tagliare le proteine funzionali delle cellule. Esistono poi le… Caspasi che intervengono nel processo infiammatorio…

L’attivazione delle Caspasi è un processo a cascata; basta che una sola sia attiva, per dare origine a una cascata enzimatica che si estende, coinvolgendo sempre più enzimi appartenenti a questa “grande famiglia”. Le caspasi hanno inoltre la peculiare capacità di autoattivarsi.. L’attivazione avviene per distacco dell’estremità amino-terminale e per il successivo taglio di una porzione carbossi-terminale che da origine a un dimero costituito da una subunità piccola e una grande. Questo dimero è un componente della caspasi Attiva.. Al momento sembra che per essere pienamente attiva, la caspasi debba diventare un tetramero costituito da due subunità grandi e due subunità piccole. Come già detto prima, la Via di attivazione delle Caspasi può essere INTRINSECA o ESTRINSECA. 

La via Estrinseca:

è quella guidata dai

Ligandi di Morte. Viene anche chiamata “Via indotta dal segnale di Morte e mediata dai Recettori di Morte”. In questa ↓ immagine abbiamo la cellula target (bersaglio dei Linfociti T Killer)

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che espone i recettori di morte (FAS protein).. Il Linfocita T invece ha esposti sulla membrana plasmatica i Ligandi di Morte (FAS Ligand). L’interazione Ligando-Recettore richiama le Pro-caspasi (inattive) e una proteina adattatrice, che favorisce la formazione del un complesso [Pro-Caspasi– Recettore Attivato]. A questo punto le pro-caspasi vengono opportunamente tagliate nelle porzioni amino e carbossi terminali, dando origine al dimero e tetramero attivo con proprietà proteasica. Alternativamente, c’è il meccanismo di morte Intrinseca…. 

La via Intrinseca:

prevede invece che il segnale parta dall’interno della cellula, in particolare

dai mitocondri che hanno subito un danno che ha causato un’alterazione della permeabilità di membrana. L’aumentata permeabilità consente il passaggio del Citocromo C che, in presenza di una proteina adattatrice, interagisce con le Pro-Caspasi-9 formando un complesso. Verrà a questo punto indotto un taglio delle porzioni carbossi e amino terminali generando le Caspasi-9 attive che proseguiranno nel processo di cascate enzimatiche che porteranno all’attivazione di altre caspasi.. Come la Caspasi-3.. una delle principali Caspasi-Esecutrici :D

Le

BCL-2

sono quella grande famiglia di proteine che fungono da pro-apoptotiche e anti-apoptotiche.

Sono normalmente presenti nella cellula e in un determinato equilibrio.  

Tra le Pro-Apoptotiche abbiamo: Tra le Anti-Apoptotiche:

Bad Bcl-2

Bax Bak Bcl-XL

Se una qualsiasi sostanza o uno stimolo meccanico va ad alterare l’equilibrio tra queste proteine, la cellula proseguirà verso l’evento favorito dalla classe proteica in maggioranza.

Hotlinks:   

Registrazione Parte 1: Registrazione Parte 2: Dispense:

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NEURODEGENERAZIONE

| 16/11/11

| Parte2

Tra i fattori che possono alterare l’equilibrio tra molecole PRO-apoptotiche e ANTIapoptotiche, abbiamo la condizione di assenza di fattori di crescita. La loro presenza normalmente permette la sopravvivenza e la proliferazione normale della cellula… La loro assenza porta a una prevalenza del segnale proapoptotico. PRESENZA DEI FATTORI TROFICI: La stimolazione del recettore del fattore trofico va ad attivare all’interno della Membrana mitocondriale cellula una cascata di kinasi che trova come ultimo elemento di fosforilazione “BAD” (fattore pro-apoptotico). A seguito della fosforilazione, BAD viene complessato con una proteina e reso inattivo.. A questo punto le …….. due subunità [Bcl-2 | Bcl-XL], non più bloccate da BAD, possono ……… dimerizzare. Il dimero ha attività ANTI-Apoptotica, e inibisce l’attivazione del Dimero [BAX-BAX] con attività Propapoptotica… Questo impedisce la fuoriuscita del Citocromo C dal mitocondrio  .

MANCANZA DEI FATTORI TROFICI: In caso di assenza dei fattori di crescita, non abbiamo la cascata di fosforilazioni che permettono l’inattivazione del fattore ProApoptotico BAD. Di conseguenza non si può formare il dimero [Bcl-2 | Bcl-XL] con attività antiapoptotica. A questo punto, sulla membrana esterna del mitocondrio possiamo trovare i fattori Pro-apoptotici Bax, nella forma dimerica attiva che permette un passaggio di ioni attraverso la membrana esterna del mitocondrio. Questo altera la permeabilità della membrana mitocondriale favorendo il passaggio del Citocromo C nel citoplasma e dando il via al processo di attivazione delle Caspasi…  Il Citocromo C incontra una proteina adattatrice che favorisce l’interazione con la Procaspasi 9. Una volta formato il complesso si procede verso l’attivazione della a caspasi 9 (caspasi iniziatrice).. la quale procede verso la cascata di reazioni che porta all’attivazione di tutte le altre caspasi come la caspasi-3 (caspasi esecutrice).

Bene.. ora.. nuovo argomentooo! I modelli sperimentali che possono essere usati in laboratorio per testare nuovi composti e valutarne l’attività citotossica attraverso meccanismi di tipo necrotico o apoptotico… Pagina | 72

CREAZIONE DI MODELLI IN VITRO DI MORTE NEURONALE Per testare una nuova sostanza possiamo usare svariati modelli in vitro. Possiamo partire da quello che si avvicina maggiormente al modello in-vivo .. ed è ad esempio costituito da fettine del tessuto che si vuole esaminare. La fettina è ottenuta tramite un microtomo, che taglia in modo molto preciso… Si ottiene in questa maniera un modello isolato, ma molto simile a quello animale, in cui vi sono più popolazioni cellulari a contatto tra di loro…. Se si vuole scendere ancora più nello specifico e avere una sola popolazione cellulare, occorre creare delle colture cellulari che permettono di avere un monostrato omogeneo di cellule. Il monostrato rende uniforme l’assorbimento della sostanza da testare… al contrario, in una fettina tissutale occorre dar modo alla sostanza di penetrare e raggiungere anche le cellule più interne. Nel caso si trattasse di neuroni, possiamo creare modelli in cui sono isolate solo le terminazioni di questi (→Sinaptosomi). I sinaptosomi sono ottenuti dal tessuto neuronale in seguito a operazioni di omogeneizzazione del tessuto e centrifugazioni… che portano alla formazione di una sospensione di vescicole, ciascuna costituita da una terminazione nervosa che si è richiusa su se stessa… Le colture cellulari ottenute possono essere primarie o secondarie… Le colture primarie sono ottenute in un unico passaggio, dal tessuto alla coltura.. sono le più delicate da mantenere, e non hanno tempi di sopravvivenza molto lunghi.. di conseguenza i test sperimentali vanno effettuati entro poco tempo dalla preparazione. Le colture secondarie invece si ottengono da passaggi successivi.. e generalmente derivano da cellule di tessuti in grado di proliferare.. Ad es: in caso di cellule gliali.. o ancora meglio, per linee cellulari immortalizzate… I neuroni al contrario non possono proliferare.. di conseguenza potranno generare solo Colture Primarie… E possiamo prepararle a partire da differenti aree cerebrali… come la Corteccia cerebrale.. l’ippocampo, il cervelletto o i neuroni mesencefalici.. Questi ultimi sono presi dal mesencefalo durante lo stadio di gravidanza dell’animale quando non si sono ancora del tutto differenziate le cellule.. In questo modo otteniamo neuroni dopaminergici, che andranno poi a costituire la Substantia Nigra.. Questo generalmente costituisce un modello in vitro per testare sostanze che vanno ad agire come neuroprotettivi per la patologia del parkinson. Le colture cellulari di corteccia e Ippocampo sono prevalentemente usate per valutare l’azione neuroprotettiva di una sostanza per patologie che coinvolgono queste aree cerebrali ad esempio in caso di deficit cognitivi e di perdita della memoria.. Queste colture sono generalmente preparate partendo dall’animale appena nato o, ancora meglio, prima della sua nascita.. in questo modo non è ancora completata la differenziazione e l’attecchimento nel terreno da coltura è sicuramente migliore. Le colture mesencefaliche ad esempio, sono perparate da embrioni di 14 giorni/(su 21) .. si prendono i feti (piccolissimi), si taglia loro la testa, si apre la scatola cranica e attraverso un microscopio da dissezione si preleva l’area cerebrale che corrisponde al mesencefalo… L’estrazione dal ratto appena nato è certamente meno complicata :D Su queste colture cellulari possiamo effettuare valutazioni di tipo: 



Morfologico: Andiamo a vedere quale tipo di cellula è presente, e se questa ha subito delle alterazioni nella sua struttura.. ad esempio nell’elongation assonale o dei neuriti.. o se c’è stato un rigonfiamento nel pirenoforo e quindi se vi è in atto un processo necrotico.. Neurochimico: Valutiamo se vengono liberati neurotrasmettitori e determiniamo le concentrazioni di questi.. quindi possiamo identificare la presenza di danni nella neurotrasmissione.

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

Elettro-fisiologico: Attraverso tecniche di patch-clamp.. andiamo a osservare parti della membrana plasmatica delle cellule e valutiamo le conduttanze ioniche…

Le colture cellulari rappresentano un ottimo modello sperimentale, in quanto siamo sicuri che dopo un determinato periodo di tempo (circa una settimana) queste svilupperanno gli stessi sistemi enzimatici e le stesse caratteristiche elettrofisiologiche delle cellule di origine in-vivo. Quando si preparano colture cellulari di corteccia cerebrale di

ratto, si usano animali appena nati (1 giorno)… e in appropriate condizioni di coltura sopravvivono per 2 settimane. Considerando che occorre far passare una settimana di crescita in-vitro, non rimane molto tempo per lavorarci sopra ed eseguire i vari test :P All’interno di queste colture generalmente rimane sempre una piccola percentuale di glia che ci si porta dietro effettuando i vari passaggi di omogeneizzazione.. L’unico modo per eliminarla è trattare il campione contenente le popolazioni cellulari (costituite da neuroni glutammatergici e neuroni GABAergici) con un inibitore della crescita gliale. Con questo modello sperimentale possiamo ad esempio testare se una sostanza va a influenzare la neurotrasmissione eccitatoria o la neurotrasmissione inibitoria.. o o

Glutammato GABA

→ →

Neurotrasmettitore eccitatorio Neurotrasmettitore inibitorio)

Queste sono fotografie fatte attraverso un microscopio a contrasto di fase, con due ingrandimenti diversi, dove si vedono le colture cellulari trascorsi 6-7 giorni, quando ormai si è sviluppata una rete neuronale. All’inizio, quando si effettua la semina, si possono osservare solo delle piccole sferette distribuite sul terreno di colutra. Su queste colture cellulari possiamo inoltre valutare la neurodegenerazione causata da determinate sostanze… o valutare l’effetto neuroprotettivo di nuovi composti a scopo terapeutico. Se su questo modello in-vitro si osservano risultati positivi, allora si può continuare la ricerca su modelli in-vivo. Nelle malattie neurodegenerative (parkinson, Alzheimer, Huntington ecc) e in eventi acuti di ischemia e ipossia (stroke) l’elemento comune che porta sempre alla morte cellulare è l’eccitotossicità.. che.. ripetiamolo per la centimilionesima volta.. è causata da un’eccessiva liberazione del glutammato, che stimola i suoi recettori (NMDA, AMPA e Kainato) portando a un aumento della concentrazione di Ca ++ citoplasmatico… il quale, in eccesso, da origine a un puttanaio di cascate enzimatiche.. che si concludono con la morte neuronale… Basandoci su questo elemento comune, possiamo ricreare in-vitro, una situazione di danno simile a quella in-vivo :D → basta ad esempio sottoporre le colture cellulari a un’elevata concentrazione di glutammato… superiore ai limiti fisiologici accettati dalla cellula → dai 30 μmol ai 100 fino a 500 μmol… per un periodo che può variare dai 10 minuti o anche 24 ore.. dipende dall’entità di danno che si vuole ricreare. Generalmente si preferisce creare un danno che sia sperimentalmente visibile e valutabile, ma che permetta anche alla sostanza con attività neuroprotettiva, di far recuperare queste cellule. Ovviamente, Il trattamento con la sostanza in esame va effettuato PRIMA di esporre le colture cellulari al Glutammato e creare il danno. Pagina | 74

Per mimare meglio un modello ischemico possiamo mettere le cellule in condizione di assenza di ossigeno. → Pongo le cellule in un terreno da coltura privo di glucosio (per 15 minuti) e poi senza ossigeno (per altri 60 minuti)… Il neuroprotettivo va somministrato circa 30 minuti prima dello stimolo tossico.

Come si Determina Sperimentalmente la morte cellulare?? → Possiamo valutarla attraverso diversi tipi di saggi:

SAGGI ASPECIFICI: Non sono in grado di distinguere se il tipo di morte è apoptotica o necrotica… possiamo usare:

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Coloranti intravitali (Vital Dyes)..ovvero delle sostanze chimiche molto polari, in grado di penetrare la cellula solo quando questa ha la membrana cellulare danneggiata.. Alcuni di questi coloranti sono il Propidio Ioduro e il Trypan Blu

Questo ↑ è un esempio di cellule trattate con Propidio ioduro (fluorescente).. Nel preparato di controllo, le cellule colorate sono poche… Negli altri due, sottoposti a insulti come l’aggiunta di glutammato, si nota che il numero di corpi cellulari danneggiati è ben maggiore. Andando a contare il numero di cellule colorate dal propidio ioduro, possiamo determinare la percentuale di cellule morte nel preparato in seguito a un determinato tipo di insulto.. Più è alta la percentuale di cellule positive al propidio ioduro, maggiore è il danno cellulare… 

Saggio dell’MTT: E’ una valutazione dell’entità di sopravvivenza cellulare.. Ovvero, alla fine dell’espirimento mi permette di valutare quante cellule VIVE sono rimaste rispetto al totale. Il test si effettua determinando l’attività delle deidrogenasi mitocondriali.. L’ MTT è una polvere gialla, che viene disciolta e messa a contatto con le colture cellulari.. Se vi è attività enzimatica nei mitocondri, la cellula è viva… in tal caso le deidrogenasi mitocondriali trasformeranno l’MTT in un composto di colore blu-violaceo insolubile in acqua (formazano). Il test è abbastanza veloce… bastano 5-10 minuti per poter osservare dei puntini blu sulla superficie delle cellule. Ad ogni modo, per valutare in modo oggettivo la % di cellule vive occorre usare uno spettrofotometro Si porta in soluzione il sale insolubile dell’MTT aggiungendo isopropanolo acidificato.. la soluzione ottenuta viene quindi aspirata e si determina l’assorbanza a 570 nm. Più è scura la soluzione (→maggiore è l’assorbanza), maggiore è il numero di cellule sopravvissute…  Ovviamente, per fare le valutazioni, occorre un preparato di controllo.

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Test di Rilascio della Lattico Deidrogenasi: Fornisce un indice di MORTE cellulare… in questo caso il parametro di assorbanza che vado a valutare aumenta all’aumentare della morte cellulare. La Lattico deidrogenasi è un enzima presente all’interno di tutte le cellule… Quando però vi è un danno, che causa un’alterazione della permeabilità della membrana, la LDH viene rilasciata nell’ambiente extracellulare. Con questo test quindi valuto la quantità di LDH rilasciata a causa della degenerazione cellulare. Per effettuarlo generalmente si usa un KIT già pronto che contiene: il substrato per la Lattico Deidrogenasi (→il lattato) e il sale di tetrazolio (di colore giallo).. Il lattato, in presenza dell’LDH verrà trasformato in Piruvato, con riduzione del NAD+ a NADH + H+ .. catalizzata la trasformazione del sale tetrazolio a un sale di Formazano di colore Rosso. A questo punto misuro alla lunghezza d’onda di 492 nm con lo spettrofotometro l’assorbanza… e traggo le logiche conclusioni :P

SAGGI SPECIFICI: Permettono di valutare in modo specifico la morte per APOPTOSI. 

TEST con Hoechst 33258: Come sappiamo, quando la morte incorre per apoptosi, vi è la frammentazione dei vari organelli e della cromatina nucleare la quale si addensa all’interno delle vescicole. Possiamo quindi determinare la morte per apoptosi attraverso la misura morfologica, di quanto questa si è condensata… Prima di eseguire il test, occorre fissare le colture cellulari con la paraformaldeide. A questo punto subiscono vari trattamenti, tra cui l’incubazione con un colorante nucleare fluorescente chiamato Hoechst 33258 che lega il DNA delle cellule. A questo punto si effettua un labaggio e, attraverso il microscopio a fluorescenza, si può ora evidenziare se la cromatina è distribuita omogeneamente nel nucleo o se si è addensata. I puntini grandi azzurri nelle immagini sono i nuclei che hanno assunto la colorazione del colorante nucleare e la cui cromatina è omogenea.. Quelli più piccoli rappresentano invece i nuclei la cui cromatina è condensata.. il campione A, è il preparato di controllo, e infatti si osservano prevalentemente nuclei con una cromatina non addensata… B e C sono invece colture cellulari esposte a un insulto citotossico (30 μmol e 100 μmoli di glutammato). D è l’ingrandimento di una cellula in apoptosi, dove può essere chiaramente distinta la frammentazione della cellula in vescicole (corpi apoptotici) contenenti frammenti di

A

B

organelli e la cromatina addensata con questa tipica colorazione più luminosa. Per la valutazione quantitativa, il lavoro è leggermente

D

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C

complicato… occorre prendere ogni riquadro del preparato.. e andare a contare tutti i nuclei colorati uniformemente.. e tutte le cellule con la cromatina addensata.. A questo punto posso calcolare la percentuale di cellule andate in apoptosi… O_o

A

In quest’altro campione, il danno è causato dalla deprivazione di ossigeno e glucosio per un’ora… anche in questo caso, il preparato di controllo presenta la maggior parte dei nuclei con una colorazione uniforme, mentre nelle cellule trattate, aumenta il numero dei nuclei la cui cromatina si è condensata. Determinazione dell’attività delle Caspasi: Questi enzimi sono gli iniziatori e gli esecutori del danno apoptotico. La loro attività può essere misurata in due modi: o Valutando l’attività proteasica con un saggio biochimico o Valutando la loro concentrazione attraverso tecniche immunocitochimiche

B

Fortunatamente esistono dei kit già belli pronti… con tutti i substrati necessari all’esperimento :D

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Valutazione dell’attività della Caspasi-3

Saggio Biochimico:

La caspasi-3, come tutte le altre caspasi, va a tagliare un substrato proteico in corrispondenza di un residuo di acido aspartico. Il substrato fornito nel Kit è chiamato DEVD e rappresenta la sequenza polinucleotidica (Asp-Glu-Val-Asp). Occorre però un sistema per evidenziare il taglio in questa seguenza aminoacidica.. → il subsrato colorimetrico fornito è quindi il peptide DEVD con legato all’ultimo aspartato la para-nitro-Anilina. Se la caspasi è attiva, andrà a tagliare il polipeptide in corrispondenza del legame tra Aspartato e p-nitro-anilina la quale, nella forma libera, può essere determinata con un’analisi spettrofotometrica a 405 nm… Maggiore è l’assorbanza, maggiore è l’attività e la concentrazione delle caspasi nella cellula… di conseguenza,il processo di morte è apoptotico.

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Test Dell’Annessina V – FosfatidilSerina

Saggio Biochimico:

Durante l’apoptosi si ha l’esposizione della FosfatidilSerina sulla membrana esterna della cellula. Per valutare se è effettivamente avvenuto questo processo, Aggiungiamo l’Annessina-V-FITC… Questa molecola è altamente selettiva per la Fosfatidil-Serina; il legame lo possiamo evidenziare attraverso il fluoroforo coniugato All’annessina-5 → La Fluoresceina IsoTiocianato (FITC). Il preparato A è il controllo… B e C sono le colture cellulari esposte a un determinato insulto.. Come si può vedere, sono evidenziati degli spot fluorescenti, che rappresentano le cellule in apoptosi (che hanno esposto la fosfatidilSerina…) La fluorescenza verde è data dal FITC.. Sullo stesso preparato è inoltre stato fatto un trattamento con Propidio Ioduro (seconda colonna) per valutare una morte generalizzata.

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Valutazione Dell’entità del danno tramite analisi morfologica della cellula Tecnica Immunocitochimica: Queste nelle immagini sono delle colture di neuroni della corteccia cerebrale; quelle a sinistra sono le colture di controllo.. quelle a Destra sono state invece sottoposte a un danno ischemico (deprivazione di Glucosio e Ossigeno) per 60 minuti. Tra i due preparati si può osservare una notevole differenza… In quello soggetto a ischemia si nota che il numero di cellule è decisamente inferiore, inoltre si può osservare una frammentazione dei neuriti (in particolar modo degli assoni). Per ottenere queste immagini e poter così valutare la morfologia delle colture cellulari, sono stati usati dei marcatori del citoscheletro neuronale (Anticorpi anti-MAP. Dal punto di vista qualitativo, quindi, possiamo facilmente dimostrare che vi è un danno neuronale.. Occorre però quantificare l’entità del danno. Per farlo, si usano dei software adeguati, e inquadrando la zona del neurite frammentato si contano (per una determinata lunghezza) quanti frammenti si sono formati. Maggiore è il numero di frammentazioni.. maggiore è il danno quantitativamente valutato sulla morfologia della cellula… Anche questo quindi è un metodo abbastanza… palloso…

Applicare un solo metodo di quelli descritti, non permette di valutare appieno la tossicità o le proprietà neuroprotettive di una sostanza in esame. Occorre associare tra di loro questi metodi. Ecco che allora si può ottenere un quadro generale dell’attività di quella sostanza.. Quindi.. associando la misura della Lattico Deidrogenasi.. associando il test dell’MTT, valutando il numero di nuclei con la cromatina condensata, l’attività delle caspasi.. e la presenza di legame con l’annessina-v si può ottenere un quadro complessivo di come si comporta uno dei composti in esame.

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NEURODEGENERAZIONE

| 21/11/11

| Parte3

L’ultima parte che rimaneva era questa diapositiva… Queste sono colture di neuroni mesencefalici → abbiamo quindi una popolazione cellulare con un’alta % di Neuroni dopaminergici.. che in vivo andrebbero a costituire la substantia nigra.. è quindi un ottimo modello sperimentale per testare nuovi composti con attività neuroprotettiva in patologie come il Parkinson. In questo modello sperimentale, la morte è indotta dal Glutammato.. Per evidenziare lo stato dei neuroni viene usata una tecnica immunocitochimica che prevede l’uso di un anticorpo per la Tyrosin-Idrossilasi, che è un enzima necessario alla sintesi della Dopamina. Nel preparato (A) si vede che i neuroni sono belli Attivi e Vitali :P Dopo l’insulto con il glutammato si osserva nel preparato (B) il drastico calo di fluorescenza… Attraverso questa tecnica posso evidenziare selettivamente i neuroni dopaminergici e valutare il loro stato. FINE della Morte Cellulareeeeee.. passiamo ora alla → →

TOSSICOLOGIA DEL CICLO RIPRODUTTIVO Il cliclo riproduttivo parte dalla fecondazione dell’ovocita da parte dello spermatozoo.. si ha la formazione dello zigote… una prima divisione cellulare definita segmentazione, con formazione di un primo abbozzo embrionale chiamato Blastocisti. Questa è un ammasso di cellule che andrà poi a impiantarsi nella mucosa uterina.. affinchè ciò avvenga è necessario che vi sia un equilibrio di produzione di estrogeni e progestinici. Questo è già un primo punto di attacco delle sostanze tossiche, che in questo caso provocano una immediata interruzione della gravidanza. Se tutto va bene, inizia una fase di intensa proliferazione cellulare e differenziazione che corrisponde all’organogenesi e dura i primi 3 mesi della gravidanza. Questo periodo è il più delicato; se vi è il contatto con una sostanza tossica teratogena il danno provoca sicuramente un danno nello sviluppo. Dopo il primo trimestre alcuni organi o apparati continuano a svilupparsi e differenziarsi.. Come il SNC e il Sistema riproduttivo. E sono suscettibili a un danno anche nei mesi successivi :-/ (Anche dopo la nascita O_o) Durante il periodo fetale non è ancora completa la maturazione istologica e funzionale.. e l’organismo è più suscettibile a quei tossici che vanno ad alterare lo sviluppo funzionale (produzione enzimatica, di ormoni.. ecc)… I danni in questo periodo generalmente non provocano malformazioni dell’organo.. ma comprometteranno l’attività di determinati organi. Pagina | 79

Alla fine del periodo fetale c’è la nascita (parto) e lo sviluppo postnatale.. Alcuni organi continuano a svilupparsi anche in questi mesi, percìò anche l’allattamento può essere un veicolo di trasmissione di sostanxe tossiche dalla madre al figlio.. che possono principalmente compromettere lo sviluppo del SNC. La Gametogenesi è posta sullo stesso livello dell’organogenesi. Nell’organismo femminile, il numero di ovociti è predeterminato alla nascita.. Nell’organismo maschile si ha invece lo sviluppo dell’epitelio seminifero che darà origine agli spermatogoni.. e dalla pubertà per tutto il resto della vita sarà in grado di produrre spermatozoi. In genere, le sostanze teratogene sono tossiche per l’organismo che si sta formando, ma che non presentano evidenti effetti tossici per l’organismo materno. Gli effetti che possono avere sono: 

Embrioletali: Incompatibili con la vita.. la gravidanza viene interrotta per: o Riassorbimento: Se la blastocisti non si impianta nell’utero materno, può essere riassorbita nella mucosa uterina o Aborto Spontaneo: si commenta da solo… o Nascita di un feto morto…



Embriotossici: Permettono la nascita del nuovo organismo.. ma possono causare anomalie e malformazioni: o Strutturali o o Funzionali

Cosa può fare da filtro tra tutto ciò che la madre assume e l’organismo fetale?? → La PLACENTA. E’ una struttura in parte materna e in parte fetale che dovrebbe proteggere l’organismo che sta nascendo da tutto ciò che può finire nel sangue materno.. La barriera Placentare non è una vera e propria barriera… è solo una doppia membrana di cellule che separano il sangue materno da quello fetale… di conseguenza, sostanze abbastanza lipofile, o per trasporto attivo o diffusione passiva possono penetrarla.. insomma.. serve a ben poco.. Ad esempio, l’alcol provoca la FAS → Sindrome Alcolica Fetale, con alterazioni strutturali in particolare malformazioni cranio facciali, cardiache, oculari.. malformazione ai reni ecc… (senza considerare la precoce tossicodipendenza e crisi di astinenza O_o). Esistono poi di noto effetto teratogeno alcuni farmaci, ormoni, il fumo delle sigarette, alcuni virus come la rosolia.. metalli pesanti come Piombo e mercurio… ecc… La Barriera placentare non si comporta nello stesso modo durante tutta la gravidanza… Nel primo trimestre di gravidanza la struttura della barriera non è ancora del tutto sviluppata, di consegeunza più facile il passaggio di sostanze particolarmente pericolose per il feto a causa della aumentata permeabilità.

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La placenta raggiunge l’apice della sua efficienza attorno al Quinto mese di gravidanza, con un’ampia superficie di scambio e un maggiore spessore.. Dopo il Sesto mese, la placenta inizia a invecchiare e ad assottigliarsi rendendo più facile il passaggio delle sostanze. Ad ogni modo, nell’ultimo periodo della gravidanza una sostanza non andrà a determinare una malformazione strutturale ma più facilmente andrà a creare alterazioni funzionali. Come già detto.. il passaggio delle sostanze può avvenire:  

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Attraverso le regole della diffusione passiva Attraverso meccanismi di trasporto Attivo o Per le sostanze che non soddisfano i requisiti per passare facilmente attraverso le membrane biologiche.. come ad esempio gli Aminoacidi, il Glucosio.. alcuni tipi di lipidi e le vitamine. o Sempre attraverso i sistemi di trasporto attivo, il feto elimina i prodotti del catabolismo che passeranno poi nel sangue materno per essere eliminati. Trasporto per Endocitosi o Per sostanze endogene molto grosse come la transferrina o le immunoglobuline materne.

I fattori che Influenzano il Trasporto delle sostanze sono: 

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Coefficiente di ripartizione olio/acqua → se ad esempio durante il parto vengono dati degli anestetici per ridurre il dolore, alcuni di questi passeranno nel sangue fetale, provocando uno stato di sedazione del neonato al momento della nascita.. Grado di ionizzazione → Inoltre gli anestetici locali sono spesso di natura basica..quindi tendono ad accumularsi nel sangue fetale perché questo è leggermente più acido di quello materno (a pH acido le basi si trovano in una forma più polarizzata, quindi meno permeabili alle membrane plasmatiche) Il Peso Molecolare → Può anch’esso influenzare il passaggio delle sostanze.. Molecole ad elevato PM non riescono ad attraversare la placenta… Questo può essere sfruttato in terapia.. Ad esempio, se si dovesse somministrare un anticoagulante, non si può certo optare per il warfarin (di noto effetto teratogeno) ma è meglio usare l’eparina con un PM molto elevato. Il Flusso sanguigno → durante la gravidanza varia notevolemente.. Maggiore è il flusso e la perfusione, maggiore è la possibilità che una sostanza penetri la barriera placentare. Il Legame alle proteine plasmatiche → influenza notevolmente il passaggio di alcuni composti dal sangue materno a quello fetale. I farmaci complessati con le proteine plasmatiche materne non superano facilmente la barriera placentare.. come ad esempio alcuni chemioterapici come i sulfamidici.. La memantina (antiepilettico).. alcuni anestetici locali L’Invecchiamento della placenta → Avviene dopo il quinto mese di gravidanza… e si ha un aumento della perfusione e un minor spessore Il Fumo di sigaretta → contiene la nicotina, la quale determina vasocostrizione.. quindi può causare una riduzione dell’irrorazione placentare, compromettendo l’ossigenazione e la nutrizione del feto.

Infine, dobbiamo considerare che il feto può venire a contatto con svariati farmaci.. Sia per problematiche riguardanti lo sviluppo fetale, che per terapie croniche che la madre deve continuare anche durante la gravidanza.. Le casistiche di interventi farmacologici sul feto sono limitate: 

Possiamo avere casi di infezioni intrauterine.. con somministrazione di antibiotici per impedire che l’infezione possa compromettere lo sviluppo della gravidanza Pagina | 81

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Possono essere somministrati glucocorticoidi, quando si prevede un parto pretermine.. Queste sostanze facilitano la maturazione polmonare. Oppure, quando si prevedono particolari condizioni di ittero, si somministra fenobarbital.. che agisce come induttore enzimatico abbassando la bilirubinemia

L’altra grossa problematica, è l’intervento terapeutico sulla madre… Quindi occorre valutare cosa sia meno rischioso per il feto e per la madre… Ad esempio, molti farmaci antiepilettici sono potenzialmente teratogeni… è però anche vero che una crisi epilettica potrebbe essere ancora più dannosa per il feto..     

In caso di terapie anticoagulanti va preferità l’eparina.. evitare assolutamente il warfarin In caso di diabete di tipo II (insulino indipendente) bisogna sospendere l’uso degli ipoglicemizzanti orali, e passare all’uso di insulina Nella terapia dell’insufficienza cardiaca, i digitalici possono causare contrazioni della muscolatura liscia uterina (a causa della loro azione sul nervo vago) E’ sconsigliato l’uso di antiemetici nel primo trimestre di gravidanza Gli analgesici (FANS) vanno a inibire la sintesi di prostaglandine… questo può causare un aumento del travaglio e del tempo di sanguinamento.. quindi è opportuno usarli con moderazione, specie nell’ultimo trimestre di gravidanza..

Principi della Teratogenesi: La sensibilità di un organismo verso un agente teratogeno può dipendere:  



Dal genotipo dell’embrione →Fattori ereditari come Carenze di enzimi.. magari necessari alla bioinattivazione di composti tossici che passano dalla madre al feto Da Fattori ambientali esterni → Come il tipo di alimentazione della madre (es introduzione di acido folico.. necessario per un corretto sviluppo del tubo neurale..) e le Malattie di questa→ ad es di tipo cardiocircolatorio, che possono andare a compromettere la permeabilità della placenta.. Dallo stadio di sviluppo dell’embrione nel momento in cui è esposto al tossico. → L’organogenesi avviene nel primo trimestre e ogni organo ha un periodo cruciale per lo sviluppo.. Se un teratogeno che colpisce l’occhio enra in contatto con il feto quando il periodo di sviluppo di quest’organo è terminato, la sostanza non è in grado di provocare malformazioni..

Gli agenti teratogeni agiscono con specifici responsabili dei loro effetti tossici: Esistono diversi meccanismi di teratogenesi… Ci sono sostanze ad es che:   

accelerano l’apoptosi di determinate classi di cellule, bloccano la migrazione di cellule da una parte all’altra dell’embrione. Alterano la sintesi di enzimi necessari per lo svilupo funzionale dell’organo…

Per pasare attraverso la BEE i teratogeni devono avere caratteristiche chimico fisiche idonee.. Le principali manifestazioni di uno sviluppo anomalo sono:    

La morte, se l’alterazione è incompatibile con la vita Insorgenza di malformazioni strutturali macroscopiche Ritardo della Crescita→il feto nasce con organi non completamente sviluppati o vi è ritardo nel loro sviluppo nel periodo postnatale Deficit Funzionali degli organi. Pagina | 82

Lo sviluppo di un effetto dannoso da parte di un teratogeno è generalmente dose dipendente Il teratogeno può essere organospecifico.. o può colpire più organi.. e può essere Specie-specifico… questo può essere un problema.. specie negli esperimenti di tossicità a lungo termine. Questa è una blastocisti→ Un primo abbozzo embrionale che si forma dopo circa 7-8 giorni dalla fecondazione dell’ovulo. Deriva dallo zigote che va allo stadio di morula.. da questa quindi si origina il trofoblasto (→struttura che ancora la blastocisti alla mucosa uterina). Le cellule della blastocisti iniziano a differenziarsi, formando dei foglietti; i primi due sono:  

l’epiblasto: che darà origine all’ectoderma.. da cui si svilupperà il sistema nervoso centrale e l’epidermide l’ipoblasto: da cui si originerà l’endoderma.. che porterà alla formazione di fegato, pancreas, apparato gastrointestinale.. apparato respiratorio ecc…

Successivamente alla formazione di questi 2 fogietti, vi è una migrazione delle cellule dell’epiblasto che andranno a costituire tra l’ipoblasto e l’epiblasto il terzo foglietto che originerà il Mesoderma.. dal quale derivano la struttura ossea, le cartilagini, derma l’apparato escretore.. l’apparato circolatorio e il tessuto muscolare. Periodi critici per l’induzione del Danno: 

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Il Primo periodo: Preimpianto/Impianto, è il periodo in cui il primo abbozzo embrionale scende attraverso l’ovidotto per raggiungere l’utero e successivamente impiantarsi. Ciò che lo trasporta è il movimento della muscolatura e delle ciglia delle cellule dell’epitelio uterino. o In questa fase, qualsiasi sostanza che modifica la contrazione muscolare (es: Miorilassanti e Nicotina) va a compromettere la discesa dell’embrione e il suo impianto nella mucosa uterina. L’esito di questo danno è la morte → interruzione della gravidanza. o L’impianto è sotto controllo ormonale, quindi vi deve essere un’adeguata proporzione di concentrazione tra estrogeni e progestinici…. Sostanze che alterano la produzione ormonale, compromettono l’impianto.. Questa categoria di composti viene anche definita Endocrin Disrupters → Sostanze che compromettono la funzione ormonale.. tra questi abbiamo il DDT o Per favorire l’attecchiemento dell’embrione nella parete uterina avviene un’alterazione della permeabilità vasale dell’endometrio che è mediata dalle prostaglandine (hanno azione vasodilatatoria)… Sostanze che alterano la produzione delle prostaglandine come ad esempio i FANS possono compromettere la gravidanza.. L’ Organogenesi: Prevede che le cellule siano in continua proliferazione.. Alcune popolazioni cellulari si formano in una zona dell’embrione e sono destinate a migrare in un’altra posizione definitiva. Determinate sostanze possono alterare questo processo di migrazione determinando malformazioni strutturali a uno o più organi. Stadio Fetale: (dopo i 3 mesei) i danni che avvengono in questo periodo determinano alterazioni funzionali. Essendo il SNC quello più tardivo nello sviluppo, è anche quello più suscettibile all’azione dei teratogeni. Pericolosi sono il Mercurio e altri metalli pesanti come il Piombo.. e l’Etanolo. Suscettibili a danni strutturali in questa fase sono gli organi riproduttivi.. alcune sostanze note sono alcuni inquinanti ambientali come DDT e il Dietilsilbestrolo.. o la finasteride. Il Dietilsilbestrolo è un ormone usato in passato per trattare le donne soggette a numerosi aborti spontanei favorendo la Pagina | 83

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gravidanza. Questo però si è scoperto provocare nell’organismo femminile nato, tumori dopo 20 anni dall’esposizione.. Periodo postnatale: La pericolosità sta nel fatto che alcuni organi e strutture non sono ancora complete, soprattutto dal punto di vista funzionale.. e determinate sostanze tossiche possono raggiungere il neonato attraverso il latte materno determinando alcune alterazioni funzionali e altre piccole anomalie.

Questa immagine rappresenta il periodo cruciale di sviluppo degli organi durante l’embriogenesi. Come sono nate le prove di teratogenesi, ora obbligatoriamente richieste per l’autorizzazione all’immmissione in commercio di un nuovo farmaco ?? Possiamo dire “grazie” alla TALIDOMIDE: Farmaco ipnotico sedativo commerciato alla fine degli anni ’50.. teratogeno nel 100% dei casi.. All’epoca tra l’altro era anche spacciato come farmaco sicuro per le donne in gravidanza. All’epoca non erano previste le prove tossicologiche di tipo cronico, ma solo quelle di tossicità acuta. Dopo 1 anno dall’inizio della vendita della Talidomide, come si può vedere dal grafico, si ha la nascita di bambini con malformazioni strutturali agli arti superiori e inferiori → Bambini focomelici. Oltre alla focomelia, i bambini presentavano malformazioni alle orecchie, ai nervi cranici, alle mani e stenosi ano-rettale. Dopo questo evento sono stati programmati e decisi a livello internazionale studi di tossicità cronica e prove di teratogenesi.

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Altri farmaci che hanno dimostrato attività teratogena sono:      

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Warfarin: E’ un Anticoagulante orale.. provoca malformazioni a livello facciale, ritardo nella crescita, difetti negli arti e al SNC.. I corticosteroisi: Determinano dei danni di tipo funzionale; palatoschisi e cataratta Androgeni: possoo causare mascolinizzazione nella femmina mentre gli.. Estrogeni: possono causare atrofia testicolare nel maschio.. Dietilsilbestrolo: Causa cancro della cervice 20 anni dopo l’esposizione dell’organismo femminile al teratogeno Antiepilettici/Anticonvulsivanti: o Fenitoina: Provoca la mancata congiunzione del labbro con il palato, una crescita anomala del cranio (microcefalia) e ritardo mentale.. o Acido Valproico: provoca la Spina Bifida.. (diramazione a 2 punte della colonna vertebrale) e difetti nella formazione del tubo neurale.. Farmaci Citotossici /→ Antitumorali: o Metotrexato: antagonista dell’acido folico.. Antibiotici: o Aminoglicosidici: Sono pericolosi perché danneggiano l’ottavo paio di nervi cranici, compromettendo l’udito del futuro nascituro. o Tetracicline: Vanno a depositarsi sulla struttura ossea.. determinando una ridotta crescita ossea.. e a livello dentale un anomalo sviluppo dei denti con caratteristica colorazione… Etanolo: è un teratogeno noto Retinoidi: Sono i derivati dell’acido retinoico (vitamina A) e sono usati in campo dermatologico per malattie come la psoriasi ed eczemi più o meno gravi.. Sono preparati a uso topico, e si depositano nel tessuto sottocutaneo… Occorre molto tempo prima che vengano eliminati dall’organismo. Per questo è consigliato a donne che hanno subito questi trattamenti, di aspettare almeno 2 anni prima di sostenere una gravidanza... O_o” Tra i vari effetti, possono provocare Idrocefalo (aumento della quantità di liquor all’interno delle cavità cerebrali (ventricoli) e nello spazio subaracnoideo (che circonda il midollo spinale). Inibitori ACE: Sono responsabili di un ridotto sviluppo renale.. inibiscono la produzione di angiotensina, indispensabile non solo nel mantenimento della pressione arteriosa, ma anche nello sviluppo di questi organi. Metilmercurio e altri metalli pesanti..

MECCANISMI D’AZIONE DEI TERATOGENI:   

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(quante volte li ripetiamo!?!)

Induzione o accelerazione dell’Apoptosi in determinate popolazioni cellulari → Es: Na-Arsenito, è un derivato dell’arsenico, che attiva le caspasi esecutrici di tipo 3. Produzione di ROS → stresso ossidativo→ danni ai lipidi di membrana (lipoperossidazione), alle proteine cellulari, e al DNA. Compromissione della migrazione cellulare… Ad es: le cellule delle creste neurali migrano e vanno a costituire la struttura ossea cranio-facciale e i setti cardiaci.. Sostanze che alterano questa migrazione possono causare difetti morfologici. I Retinoidi agiscono proprio con questo meccanismo. Alterata espressione di geni che controllano lo sviluppo embrionale: o L’acido valproico: va a compromettere l’espressione di geni che codificano per la specificazione delle vertebre Pagina | 85

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Inibizione di attività enzimatiche: come il Metotrexato (antitumorale) che inibisce la diidrofolico reduttasi deteminando una carenza di acido folico. Alterazione delle vie di trasduzione del segnale… E poi.. abbiamo i composti che vanno ad alterare l’apporto energetico delle cellule..

METODI DI STUDIO DELLA TERATOGENESI: Esistono 2 diversi approcci sperimentali per lo studio degli effetti teratogeni dei farmaci.. o delle sostanze chimiche in generale tra cui rientrano (fitofarmaci (pesticidi), additivi alimentari e sostanze chimiche ad uso industriale). Generalmente la sostanza in esame viene somministrata per via orale (sondino gastrico o mescolato al cibo e all’acqua) e si eseguono 3 dosaggi:   

Il più alto è la MTD (calcolata con prove di tossicità subacuta e subcronica.. che provoca calo ponderale non superiore al 10%) La dose intermedia è la media tra NOEL e MTD. Il dosaggio più basso è quello che nell’animale non ha dimostrato alcun effetto tossico → NOEL

Quando si procede nell’effettuare queste prove, si valutano 3 preiodi diversi: 

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Fase 1: Si valutano le capacità riproduttive dell’animale (periodo preaccoppiamento).. La sostanza viene quindi somministrata al maschio e alla femmina prima che si diano alla pazza gioia… In questo modo possiamo valutare come la sostanza X incida sulla loro fertilità Fase 2: Si valutano gli effetti della sostanza in esame durante la gravidanza Fase 3: Valuta gli effetti dell’esposizione nel periodo peri-post natale (durante l’allattamento fino allo svezzamento)

FASE 1:

In genere si parte con un numero di animali pari a 25 maschi e 25 femmine. I maschi vengono trattati per 60-70 giorni prima dell’accoppiamento, per poter osservare eventuali alterazioni nella spermatogenesi. Le femmine vengono invece trattate 14 giorni prima dell’accoppiamento. Ovviamente per eseguire il test, dovremo far accoppiare un animale trattato con uno non trattato. Il giorno successivo alla “luna di miele :P” si valuta se c’è stato l’accoppiamento (→ si fa uno striscio vaginale e si osserva se vi sono spermatozoi). A questo punto, se la femmina risulta gravida si va a vedere se riesce a portare avanti la gravidanza. Alcune di queste femmine saranno sacrificate al 15° giorno di gestazione per verificare cosa accade nel primo periodo di organogenesi. Successivamente si aspetta la fine della gravidanza per vedere se la femmina riesce a partorire, quanti animaletti nascono.. e soprattutto, se sono vivi.

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Da questa sperimentazione di fase 1 si va a valutare:  

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L’indice di accoppiamento (→ si valuta con lo striscio vaginale, e andremo a vedere quanti animali maschi trattati sono stati in grado di fecondare la femmina) L’indice di fertilità o Per i maschi: la Percentuale che ha indotto la gravidanza o Per le femmine: La percentuale risultata gravida. L’Indice di Fecondità: La capacità di produrre prole viva al termine della gravidanza. L’indice di vitalità: la percentuale di animali nati vivi, che riesce a sopravvivere al periodo postnatale: 4, 12 e 14 giorni.. L’indice di lattazione: rappresenta la percentuale di animali nati vivi che sopravvivono fino alla fine dell’allattamento (intorno al 21° giorno).

FASE 2:

In questo caso i test si effettuano solo sulle femmine, che vengono trattate per il periodo compreso tra l’impianto e l’organogenesi (dal 6° al 15° giorno di gestazione). Gli animali utilizzati possono essere roditori o conigli. Il composto viene somministrato tramite sondino gastrico (→ per essere sicuri della dose a cui l’animale viene esposto). Un giorno prima della nascita, gli animali vengono sacrificati ed esaminati i feti vivi Da questa sperimentazione di fase 2 si va a valutare:   

Se vi sono malformazioni strutturali nei feti o se vi sono danni istologici. La vitalità (il n° di nati vivi) Il peso e il sesso degli animali nati (Es: le diossine portano a un aumento nello sviluppo di organismi maschili rispetto ai femminili…. O_o)

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FASE 3:

Valutiamo cosa accade nel periodo dell’allattamento; per cui la femmina viene trattata dal 15° giorno di gravidanza fino al 21° dopo il parto. Allo svezzamento figli e madri vengono sacrificati.. Da questa sperimentazione di fase 2 si va a valutare :   

La percentuale di Nati vivi rispetto ai Morti Se vi è stato un ritardo nel parto Il peso dei nati vivi Pagina | 87

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La curva ponderale dell’animale nel periodo postnatale.. (→ valutiamo se l’animale presenta una crescita ponderale o meno durante l’allattamento) I Segni di maturità fisica dei piccoli (quando iniziano a mettere i denti, la comparsa del pelo→7°-8° giorno, e l’apertura degli occhi) Il Comportamento dei piccoli… o esistono dei test come l’ Homing Behavior → la capacità degli animali nati di riconoscere la mamma.. indice di maturazione cognitiva dell’animale.. o Si valuta l’emissione di ultrasuoni come forma di comunicazione per attirare l’attenzione della madre..→ questo rappresenta un dato di “emotività” dell’animale..

Quelle viste fino ad ora sono prove sperimentali eseguite sulla generazione Parentale e la Filiale 1. Ora vediamo un Approccio Sperimentale Multigenerazionale adottato quando occorre testare sostanze chimiche diverse dai farmaci.

Si parte dalla prima generazione.. sia maschi che femmine vengono trattati per 70 giorni con il composto chimico in esame. Dopo l’accoppiamento si portano avanti le femmine gravide e alla nascita parte della prole viene sacrificata allo svezzamento.. l’altra parte viene esaminata durante il periodo dell’allattamento… La “fortunata” inizierà una nuova fase di accoppiamento… (come da schema) .. Alla fine dell’esperimento tutti gli animali saranno sacrificati, e ci ritroveremo a esaminare il prodotto di 3 generazioni.. si osserva quindi la presenza di danni morfologici istologici o funzionali.

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In tutte queste 3 generazioni andremo a valutare:        

L’Indice di fertilità → la capacità di indurre gravidanze L’indice di Fecondità (o gestazione)→ la capacità di mettere al mondo prole viva L’indice di Vitalità La Lunghezza di gravidanza e parto.. Il Peso La Crescita ponderale durante l’allattamento I segni di maturazione E il comportamento…

Facendo queste valutazioni alla fine di ogni generazione possiamo capire se la sostanza ha agito fin dalla prima… o se richiede più tempo per accumularsi nell’organismo o dare effetti nelle generazioni successive. Determiniamo quindi la latenza necessaria alla sostanza per dare l’effetto teratogeno.

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MALFORMAZIONI:

Sono un sacco le diverse malformazioni che possono essere valutate… 

ESTERNE – (macroscopiche e Visibili) a livello di: o Testa:  grandezza del cranio (microcefalia o macrocefalia)  Sviluppo delle orecchie (valutiamo se ci sono entrambe.. e come sono)  Occhi  Bocca.. (si valuta ad esempio il labbro leporino)  Palatoschisi  Malformazioni nel naso  Presenza della lingua e sua morfologia o Arti:  focomelia o mancanza totale dell’arto..  polidattilia, mancanza di dita.. fusione tra queste.. o Coda: Più corta.. più lunga.. arrotondata (a cavatappi)…

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VISCERALI – (degli organi interni) a livello di: o Testa:  Ventricoli cerebrali  Bulbi olfattori  Cavità nasali o Apparato cardiocircolatorio: Cuore, aorta carotidi e altri vasi o Polmoni, fegato, stomaco o Reni ureteri gonadi

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SCHELETRICHE, a livello di: o Cranio o Vertebre (sottili, ravvicinate), sterno e costole (in sovrannumero, fuse, ascuate.. o assenti) o Ossa lunghe, corte e falangi (si valuta la lunghezza)

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Per studiare i meccanismi d’azione delle sostanze teratogene possiamo fare test in vitro… Non vanno assolutamente a sostituire le prove in vivo a lungo termine sugli animali. Usiamo delle colture cellulari embrionali.. sulle quali valutiamo:   

La sintesi proteica L’adesione al terreno di coltura Modificazioni della differenziazione cellulare o l’eventuale morte L’approcciò sarà di tipo biochimico o morfologico. Questo è l’effetto provocato dal metilmercurio sulle cellule del sistema nervoso centrale durante la gravidanza alla concentrazione di 8 mg/kg..

frammentazioni Assonopatia.

nelle

Prima di tutto, riduce il numero delle cellule (morte cellulare), inoltre va ad alterare il citoscheletro delle cellule compromettendo la crescita dei neuriti e provocando delle terminazioni delle cellule nervose →

Questo è un altro esempio di trattamento con MeHg sempre 8 mg/kg, che causa morte di tipo apoptotico nelle colture di cellule nervose… A sinistra c’è il preparato di controllo.. dove i nuclei sono uniformemente colorati con quel colorante che mette in evidenza lo stato della cromatina nucelare (Hoechst 33258).. A destra c’è il preparato ottenuto dai cervelli degli animali nati dalla madre trattata con MeHg… Si può vedere un gran numero di nuclei che presentano condensazione della cromatina (quindi evidenziano cellule andate incontro ad apoptosi). Possiamo poi effettuare il saggio MTT che permette di valutare l’attività mitocondriale e quindi, indirettamente, il numero di cellule vive.. :D Ora rimane il problema più importante.. l’estrapolazione dei dati sull’uomo.. ebbene… OGNI MANIFESTAZIONE DI TOSSICITA’ DELLO SVILUPPO NEGLI ANIMALI E’ INDICATIVA DI UNA POSSIBILE TOSSICITA’ NELL’UOMO. Dalle prove sull’animale possiamo quindi dire: “La sostanza è teratogena nell’animale… POTREBBE esserlo anche nell’uomo” → quindi è bene non somministrarla durante la gravidanza… Una sostanza che non risulta teratogena nell’animale.. non è detto che non lo sia per l’uomo…

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EPATOTOSSICITA’ Il fegato è uno degli organi maggiormente colpito da sostanze tossiche perché attraverso di esso passa una gran quantità di sangue, in quanto è il principale organo deputato a svolgere azioni di biotrasformazione. Alcune sostanze possono essere di per se non tossiche… ma successivamente essere biotrasformate a composti tossici per il fegato o per altri distretti dell’organismo. I principali tossici del fegato sono i radicali prodotti durante la biotrasformazione, che agiscono direttamente nel luogo in cui si sono formati. Il fegato è anche deputato all’eliminazione… in esso viene prodotta la bile, e questo sistema può essere un punto di bersagli delle sostanze tossiche che vanno ad alterare il flusso bliliare riducendo l’eliminazione dei tossici e causando un accumulo di bilirubina nel sangue → Ittero (se va bene) … Se vi è un totale arresto della circolazione biliare la sistuazione diventa più grave, in quanto vi è un completo passaggio dei liquidi biliari nel sangue. Questo organo ha anche funzioni di immagazzinamento; è sede di deposito per glicogeno, grassi e vitamine liposolubili. E’ sede di sintesi proteica, produzione di macrofagi e inattivazione di tossine… Il fegato è dotato di una rete vascolare molto complessa che permette di delimitare le unità morfologiche e funzionali di questa ghiandola. Il sangue entra nel fegato dalla parte inferiore, attraverso due vie passanti per l’Ilo:  La vena porta (PV), che convoglia quasi tutto il sangue derivante dall’apparato gastrointestinale.  E l’arteria Epatica (HA). All’interno del fegato queste 2 vie si diramano, e formano tutti i vari capillari che convogliano nei sinusoidi. Sempre attraverso l’Ilo fuoriesce il dotto epatico dove scorre la Bile, in cui convoglia tutta quella derivante dai canalicoli epatici. Il sangue fuoriesce dal fegato attraverso la Vena Epatica, nella parte superiore della ghiandola (IVC) e raccoglie il sangue raccolto dalle vene centrolobulari. A delimitare le unità morfologiche del fegato (lobuli epatici) abbiamo una formazione di vasi definita triade. Un ramo della Vena porta, un ramo dell’arteria epatica e un ramo del Dotto biliare, circondati da tessuto

connettivo. La triade è definita anche spazio portale, ed è caratteristica del tessuto epatico.

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Questa è una sezione del tessuto del parenchima epatico; I sinusoidi ricevono il sngue in parte dalla vena porta, in parte dall’arteria epatica.. I sinusoidi poi riversano il sangue nella vena centrolobulare che si trova appunto al centro del lobulo epatico.. Il sangue poi confluisce nella vena epatica che fuoriesce dal fegato.. In base alla disposizione dei vasi sanguigni possiamo delimitare le unità morfologiche e le unità funzionali del fegato. L’unità morfologica, come già detto, è il lobulo epatico → una struttura generalmente esagonale, delimitata ai sei vertici dalle triadi o spazi portali. Gli epatociti tendono a disporsi a raggiera; al centro dell’esagono troviamo la vena centrolobulare.

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EPATOTOSSICITA’

| 22/11/11

|Parte 2

L’unità Funzionale è costituita dall’Acino Epatico. E’ una struttura di forma romboidale, dove 2 vertici sono costituiti dalle vene centrolubulari e gli altri due sono costituiti dalle triadi. Tra gli epatociti che costituiscono l’acino epatico possiamo differenziare 3 zone. La differenza nella funzionalità di questi epatociti risiede nel fatto che la zona più vicina all’arteria epatica (Zona 1) è la più ossigenata, quindi è anche quella funzionalmente più attiva -> e gli epatociti svolgono un maggior numero di funzioni. Se ci spostiamo verso gli epatociti più centrali (Zona 2 / Zona 3) troviamo cellule irrorate dai sinusoidi in cui il sangue arterioso si è mescolato con quello proveniente dalla vena porta. Queste cellule quindi ricevono un minor apporto di ossigeno e intervengono principalmente nei processi di bioattivazione o bioinattivazione. Queste zone ci permettono anche di definire la suscettibilità degli epatociti nei confronti di un danno esterno causato ad esempio da una situazione di anossia.. Gli epatociti che risentiranno maggiormente di un calo dell’ossigeno saranno quelli più distanti dall’arteria epatica. L’acino epatico viene catalogato come unità funzionale, perché all’interno di questa struttura (delineata teoricamente) vi è una diversa funzionalità delle cellule epatiche, la quale è correlata all’apporto di ossigeno. Il fegato, come sappiamo, è anche deputato all’eliminazione delle sostanze tramite via biliare… La bile, che viene riversata dagli epatociti all’interno dei canalicoli biliari, raggiunge il dotto epatico e da qui può essere immagazzinata all’interno della Cistifellea (o Colecisti) il cui compito è quello di concentrare ulteriormente la bile. Successivamente, dalla cistifellea la bile scende lungo il dotto epatico comune e si riversa all’interno dell’intestino. La secrezione non avviene in modo continuo ma solo all’apertura dello sfintere di Oddi. L’apertura di questo avviene in presenza di un peptide, la colecistochinina, la quale viene prodotta quando il contenuto intestinale è ricco di sostanze grasse. Alcuni tossici possono bloccare questo meccanismo di escrezione causando un riversamento della bile nel tessuto epatico, che passerà poi al sangue causando Ittero (uno dei principali segni di danni al fegato). Alcune sostanze eliminate con la bile possono poi essere riassorbite a livello intestinale. Questo meccanismo prende il nome di Circolo Enteroepatico. Questo meccanismo da un lato è utile per Pagina | 93

recuperare sostanze di cui l’organismo ha ancora bisogno (Es: Vitamina B12, D3, Acido Folico ed Estrogeni), d’altro canto possono essere riassorbiti dei metaboliti tossici ..aumentando la loro emivita nell’organismo. In genere si tratta di metaboliti coniugati con acido glucuronico, che successivamente incontrano le βglucuronidasi (prodotte dalla flora batterica a livello intestinale) che idrolizzano il legame, rendendo nuovamente biodisponibile il metabolita escreto. Alcuni tossici che sfruttano questo meccanismo sono i:  

Bifenili clorurati (policlorobifenili), E i Metalli organici come gli Organostannici.

Le sostanze che arrivano al fegato passante per la Vena porta sono generalmente quelle assunte per via orale (quindi assorbite dal sistema gastrointestinale). Le sostanze assunte per via parenterale, generalmente raggiungeranno il fegato passando dall’arteria epatica. Dai sinusoidi, in cui confluisce il sangue proveniente dalla vena porta e dall’arteria epatica, le sostanze passano negli epatociti… e il loro passaggio è abbastanza facilitato, perché l’endotelio dei capillari dei sinusoidi è particolarmente fenestrato (vi sono spazi ampi tra una cellula endoteliale e l’altra). Gli epatociti inoltre sono dotati di una membrana che presenta delle estroflessioni (microvilli) che aumentano la superficie di contatto e quindi la capacità di assorbimento. Negli epatociti le sostanze possono essere biotrasformate da parte degli enzimi del sistema microsomiale epatico. Queste reazioni possono portare a bioattivazione o bioinattivazione della sostanza. I metaboliti formati possono a questo punto seguire la via biliare (escrezione) oppure passare nella vena centro lobulare, uscire dal fegato attraverso la vena epatica e quindi andare in circolo.

Quali sono i siti più soggetti a un danno?? 

Membrana Plasmatica:

I tossici possono andare a modificare il trasporto ionico della membrana.. quindi la sua permeabilità. Se viene alterato l’equilibrio osmotico ai due lati di questa potremo avere una modificazione del volume di queste cellule con un conseguente rigonfiamento che può portare a lisi (Morte). Questo tipo di Danno a livello della membrana viene attuato ad esempio da: o o

o

Etanolo Tetracloruro di carbonio (CCl4) – Da origine a metaboliti tossici come il Radicale Tricloro Metilene che porta alla produzione del fosgene che altera la struttura della membrana.. Come?? -> Il Radicale causa la Lipoperossidazione dei lipidi di membrana e quindi degradazione della struttura fosfolipidica. Mercurio: Lega i gruppi –SH delle porteine, causando un’alterazione della struttura proteica della membrana cellulare.

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Mitocondri:

I tossici diminuiscono la produzione di ATP alterando la permeabilità mitocondriale o agendo su determinati passaggi nel processo di fosforilazione ossidativa.. Alcuni esempi di tossici sono: o o o 

Dicloroetilene, Fosforo Tetracloruro di carbonio…(CCl4) -> Insomma, è onnipresente xD

Reticolo endoplasmatico:

Nel reticolo endoplasmatico vi sono gli enzimi del sistema microsomiale epatico.. i tossici che agiscono a questo livello possono alterare processi di biotrasformazione.. O essere metabolizzati in sostanze tossiche: o

o

o



Paracetamolo: Se si superano i dosaggi tollerati, può dare origine a un composto altamente elettrofilo che potrà poi reagire con i nucleofili presenti nella cellula (Es: DNA e Proteine) causando morte cellulare.. Bromobenzene: Viene trasformato in due specie epossidiche, una delle quali particolarmente tossica che andrà a reagire con le macromolecole cellulari (Proteine, Dna Ecc..) Tetracloruro di Carbonio: Oltre alla solita sfilza di reazioni causata dalla produzione di radicali e Fosgene (lipoperossidazione), il (CCl4) causa un accumulo dei grassi a livello epatico (Steatosi).. questo grasso andrà a sostituire la porzione funzionale di tessuto epatico. Il (CCl4) inoltre inibisce le pompe del calcio che favoriscono la sua estrusione nello spazio extracellulare…

Nucleo:

Abbiamo agenti con azione genotossica come: o

o

Aflatossina B1: Micotossina contaminante prevalentemente i cereali che richiede una bioattivazione per la formazione del metabolita tossico che va a legare le basi puriniche del DNA (in particolare la Guanina) impedendo la replicazione.. Nitrosamine: Anche queste si comportano come agenti alchilanti delle basi del DNA provocando alterazioni nella replicazione di questo

Quali sono le patologie che seguono a un danno a livello del fegato?? … Possiamo avere: 

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Disturbi del Metabolismo epatico.. o se interessano i lipidi, porteranno a Steatosi o Se riguardano la biosintesi dell’EME, possono insorgere delle patologie (abbastanza rare) chiamate Porfirie, che provocano l’aumento nel sangue degli intermedi necessari alla sintesi dell’EME (porfirinogeni) che vanno a determinare un danno al fegato Colestasi: Ovvero un danno a livello del meccanismo di eliminazione biliare. Possiamo avere un rallentamento o un blocco del flusso della bile attraverso il canale.. causando un aumento di questa nel tessuto epatico, e quindi nel sangue. Epatite: Infiammazione a livello del fegato che può essere Acuta o Cronica. La forma acuta provoca un danno… se il fegato non è in grado di riparare questo insulto la forma cronicizza, portando alla sostituzione del tessuto epatico danneggiato con tessuto fibroso.. e questo processo può continuare fino all’instaurarsi della cirrosi (una delle forme più gravi) Pagina | 95

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Necrosi: Distruzione del tessuto epatico, che può portare anch’essa a cirrosi.. Stress Ossidativo: Dovuto a sostanze tossiche che causano l’aumento dei ROS Cancerogenesi: Sostanze genotossiche o metaboliti bioattivati che vanno ad alterare il DNA

E ora.. rivediamoli uno per uno… =_=” 

STEATOSI:

E’ l’accumolo di trigliceridi nel tessuto epatico, e ne sono responsabili principalmente l’alcol, tetracloruro di carbonio, fosforo, nitrosamine, alcuni farmaci come le tetracicline, paracetamolo e le aflatossine. Queste immagini rappresentano la diversa formazione di grasso all’interno del tessuto epatco.. Nella prima immagine possiamo osservare un tipo di steatosi di tipo micro vescicolare (piccole vescicole di grasso tra gli epatociti)… Nella seconda immagine, possiamo osservare un tipo di steatosi macrovescicolare con ampia perdita di funzionalità del sistema epatico. Come mai si può instaurare uno stato di steatosi a livello epatico? Il fegato produce acidi grassi in quantità superiore alla sua capacità di eliminazione.. di conseguenza avremo un loro accumulo.. I trigliceridi possono aumentare perché:    

Il fegato aumenta la loro sintesi Vi è un Aumento del trasporto dai depositi.. O alternativamente un ridotto catabolismo di questi. Ridotta produzione di VLDL

I trigliceridi possono essere allontanati dal fegato attraverso: 

La Produzione di VLDL (Lipoproteine a bassissima densità) formate da porzioni di trigiceridi, colesterolo, fosfolipidi e proteine. Una minore produzione di queste apolipoproteine può essere dovuta a: o una ridotta sintesi proteica (magari per malnutrizione o altre patologie) o Un minor apporto di fosfolipidi o Presenza di sostanze che riducono la secrezione delle VLDL

Le sostanze maggiormente implicate nella steatosi sono: -

L’Etanolo: Agisce aumentando la sintesi di acidi grassi a livello epatico Il CCL4 : Va a impedire il catabolismo degli acidi grassi a livello mitocondriale, e inoltre compromette la sintesi proteica determinando una ridotta produzione di VLDL Le tetracicline: influenzano l’eliminazione delle VLDL

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PORFIRIE:

E’ una patologia abbastanza rara, causata da una alterazione della biosintesi dell’eme. I precursori della sua sintesi sono le Porfirine.. determinate carenze enzimatiche possono quindi provocare un accumulo di precursori senza portare alla sintesi della molecola finita. Una prima causa può essere qundi dovuta a carenze enzimatiche geneticamente determinate. Poi ci sono sostanze come i policlorobifenili, le diossine e l’etanolo che sono induttori del sistema microsomiale epatico, e provocano un aumento dell’attività di uno degli enzimi che agiscono a monte della biosintesi dell’eme… provocando quindi un aumento di intermedi porfirinici.. Esistono molti tipi di porfirie… Noi ne vediamo solo 1 … :P .. La porfiria cutanea tardiva è caratterizzata da un’aumentata sensibilità della pelle alla luce, con formazione di erosioni e bolle che si trasformano in croste o piccole cisti.. 

COLESTASI:

E’ un tipo di patologia che colpisce il fegato in seguito a un blocco o rallentamento del flusso biliare.. può essere determinata da un aumento della viscosità della bile.. La fluidità può diminuire a tal punto da determinare la formazione di precipitati, che a seconda della grandezza possono occludere i canali biliari.. se ciò accade, la bile non trova altra via d’uscita che tornare ai canalicoli biliari per riversarsi negli epatociti e da questi nel sangue e tessuti portando a ittero. Alcune sostanze che provocano la colestasi sono: 

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Gli Isotiocianati: che danno origine a dei metaboliti che provocano una degenerazione delle giunzioni occludenti (le giunzioni che tengono uniti gli epatociti).. Queste strutture permettono la formazione del canalicolo biliare (che non è come nel vaso sanguigno delimitato da un endotelio, ma è semplicemente uno spazio tra gli epatociti).. La degenerazione delle giunzioni provoca la perdita di adesività tra un epatocita e l’altro, e quindi la bile dal canalicolo biliare fluisce anche tra le cellule degli altri epatociti.. Gli Ormoni Anabolizzanti: inibiscono il trasporto degli acidi biliari dagli epatociti ai canalicoli biliari determinando un’alterazione del flusso biliare.. I Farmaci Neurolettici: inibiscono la pompa di secrezione dei Sali biliari impedendo a questi di riversarsi nei canalicoli biliari e determinando un rallentamento del flusso biliare..

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EPATOTOSSICITA’ 

| 25/11/11

|Parte 3

EPATITE:

E’ un processo infiammatorio che porta alla distruzione degli epatociti, e può essere di tipo Acuto (significa che può revertire.. e le cellule possono essere recuperate) o Cronico (se il processo infiammatorio prosegue con continua degenerazione degli epatociti e sostituzione con tessuto fibroso).. Un’epatite cronica può degenerare in cirrosi.. la quale può in seguito portare a carcinoma epatico. L’ Alotano (un gas anestetico), è un esempio di farmaco che può causare epatite con meccanismo d’azione immunitario.. Questo evento è comunque abbastanza raro, ma ha un tasso di mortalità del 50%.. Un metabolita di questo farmaco si comporta da antigene e provoca una risposta da parte dell’organismo che porta a un’infiammazione del fegato e alla morte degli epatociti sensibilizzati. 

NECROSI:

E’ un tipo di morte cellulare accompagnata da fenomeni di tipo infiammatorio, caratterizzata dal fatto che la cellula si rigonfi per l’aumento del contenuto acquoso con conseguente lisi e rilascio di tutto il contenuto cellulare nello spazio circostante. La necrosi Epatica può essere: 

Localizzata (Focale o zonale): I metaboliti di alcune sostanze tossiche una volta formati, sono talmente reattivi che reagiscono nello stesso posto in cui si sono generati e non vengono trasportati in altri comparti. Alcuni esempi di tossici sono: o CCl4 → *R-Triclorometilene → Fosgene o Paracetamolo → (↓% di metabolita reattivo) La zona maggiormente colpita da questo tipo di necrosi è quella centrolobulare (gli epatociti che si trovano immediatamente attorno alla vena centrolobulare… e ricordiamolo.. sono gli epatociti classificati nella “Zona3” → quelli maggiormente suscettibili a carenze di ossigeno)

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Diffusa o Massiva: Tende a diffondersi nel tessuto circostante, e anche molto lontano dalla zona di produzione del metabolita tossico.. Un esempio è la: o Galattosamina: E’ uno zucchero che origina metaboliti tossici che compromettono la trascrizione genica degli epatociti e riducono la sintesi proteica.

Questi 3 tossici possono essere usati sperimentalmente per creare un modello di insufficienza epatica acuta. Se vi è Necrosi.. abbiamo la liberazione di enzimi (glutammato-piruvato transaminasi, glutammato-ossalato transaminasi o glutammato deidrogenasi) che possono essere rilevati con opportuni saggi. 

CIRROSI:

E’ una degnerazione degli epatociti con inefficace tentativo da parte del fegato di rigenerare il tessuto danneggiato. La rigenerazione inefficiente provoca la formazione di noduli di epatociti inglobati in una rete di tessuto fibrotico. Questa struttura provoca alterazioni nel letto vascolare. Dal punto di vista clinico, si ha una perdita di funzionalità quindi alterato metabolismo, incapacità di eliminare sostanze e Ittero.. Danni al sistema di coagulazione e Ipertensione portale che causa dilatazioni dei vasi sanguigni a livello gastrico/esofageo con formazione di varici che possono rompersi e causare emorragie Pagina | 98

gastroesofagee.. Abbiamo poi, ingorssamento della milza (splenomegalia).. Accumulo di liquido nella cavità peritoneale (lascite) ed encefalopatia (il danno iniziato nel fegato si ripercuote a livello del snc)… Un uso cronico di Etanolo è la principale causa di cirrosi… Questo perché provoca un danno diretto (per la produzione di acetaldeide) e indiretto, in quanto compromette l’assorbimento a livello intestinale di vitamine (Vit K e Vit C.. Tiamina) Acido folico, Ferro, Magnesio, Potassio… Questo mal assorbimento provoca carenze nutrizionali che indirettamente portano a un danno epatico. 

ENCEFALOPATIA EPATICA:

E’ una patologia che si sviluppa per gradi; la sintomatologia diventa mano a mano più grave con il passare del tempo. Il fegato (non più funzionante) non riesce a metabolizzare le proteine, e alcuni prodotti del catabolismo, come l’ammoniaca, non vengono biotrasformati (ad es: in urea). L’ammoniaca dal fegato raggiunge il cervello superando la BEE, provocando alterazioni nella neurotrasmissione, e generando neurotrasmettitori con effetto neurotossico sedativo. Se andiamo a guardare i sintomi psichiatrici infatti possiamo osservare inizialmente disturbi dell’umore e del sonno… Nella fase 2 un aumento della sonnolenza (viene potenziata l’azione del GABA → quindi minore eccitabilità dei neuroni del snc).. i sintomi proseguono fino ad arrivare a incoscienza.. Dal punto di vista neurologico un primo segno è il “tremore a battito d’ali” → un movimento del polso che sembra lo sbattere di un’ala e prende il nome di “Asterixis”. L’individuo ha inoltre difficoltà a parlare.. successivamente si arriva a una perdita di coordinazione motoria (atassia), riflessi ridotti… Compare il nistagmo (movimento ondulatorio dei bulbi oculari) fino ad arrivare al coma. 

RADICALI LIBERI e STRESS OSSIDATIVO:

Normalmente le cellule creano un equilibrio tra la produzione di radicali e i sistemi per arginarli (es: superossido dismutasi, catalasi, glutatione riduttasi). Se questi sistemi falliscono nell’antagonizzare l’azione dei radicali liberi, questi danneggeranno i sistemi biologici. Alcuni tossici che provocano questo squilibrio sono gli:    

Idrocarburi Alogenati: CCl4, Bromobenzene Alcoli: Etanolo, isopropanolo Idroperossidi Erbicidi: Paraquat ed esteri organofosforici..

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CANCEROGENESI:

Nel fegato è facile che possano transitare sostanze con azione genotossica o epigenetica. I principali tipi di cancro che interessano il fegato sono:   

il Carcinoma Epatocellulare (il più comune) L’Angiosarcoma (che interessa il tessuto connettivo e l’endotelio dei sinusoidi) L’Angiocarcinoma (che interessa le vie biliari)

I principali agenti genotossici, la cui azione a livello del fegato è comprovata in test in vivo su animali sono:     

L’Aflatossina B1 (→Formazione di un metabolita epossidico responsabile dell’alchilazione delle basi puriniche del DNA) Alcaloidi pirrolizidinici (Sono dei fitocomposti tossici, che si trovano in tantissime specie vegetali… possono andare a contaminare la produzione del miele o i cereali…) Cloruro di Vinile Derivati dell’arsenico Nitrosamine.. ecc..

Agenti con azione epigenetica sono:  

Diossine, PoliCloro Bifenili Ormoni steroidei → riducono la risposta anticorpale dell’organismo verso le cellule tumorali..

TETRACLORURO DI CARBONIO: E’ uno degli agenti genotossici più studiati… Agisce nel luogo in cui viene prodotto a causa della reattività dei suoi metaboliti; e colpisce maggiormente le cellule epatiche della zona centrolobulare in cui vi è un minore apporto di ossigeno. Il CCl4 viene trasformato dal P450 in Radicale Triclorometilico.. In presenza di ossigeno (zona 1) viene trasformato in fosgene (che reagisce con le proteine cellulari)… in carenza di ossigeno (zona centrolobulare) attacca i lipidi e da il via al processo di lipoperossidazione che porta alla produzione dell’aldeide malonica responsabile della tossicità anche in altri tessuti. Il danno quindi parte a livello epatico per poi diffondersi. BROMOBENZENE: E’ pericoloso perché da origine a 2 epossidi… Il 2,3 è quello meno pericoloso perché viene trasformato in bromofenolo che viene successivamente inattivato… Il più pericoloso è il 3,4 che interagisce con le macromolecole delle cellule epatiche… L’unico modo per disattivarlo consiste nel coniugarlo con il glutatione o attraverso l’epossido idrolasi o riarrangiamenti interni PARACETAMOLO: Viene metabolizzato in seguito all’introduzione di un gruppo solforico nella molecola o attraverso la coniugazione con acido glucuronico.. La piccola percentuale di acetaminofene che non viene trasformata da questi due meccanismi da origine all’intermedio altamente reattivo (elettrofilo) che andrà a reagire con i nucleofili presenti nella cellula (DNA e Proteine). L’unico modo per disattivare questa specie elettrofila è la coniugazione con il glutatione. Poiché il glutatione deve essere a disposizione anche per altre molecole, può essere che questo non sia disponibile per arginare gli effetti del metabolita tossico. Pagina | 100

AFLATOSSINA B1 Porta alla produzione attraverso il sistema microsomiale epatico di una specie epossidica altamente reattiva.. Può essere allontanato dal glutatione.. o reagire con l’acqua.. o altrimenti, alchila le basi del DNA (in particolare la guanina) provocando l’effetto genotossico.

Il fegato è particolarmente vulnerabile alla tossicità prodotta dai metaboliti reattivi perche e il sito principale del metabolismo degli xenobiotici. Fine Dell’Epatotossicità…alleluja

NEFROTOSSICITA’ L’unità funzionale del rene è il Nefrone, costituito dal corpuscolo e dal tubulo renale. Il corpuscolo renale è a sua volta costituito dal glomerulo e dalla capsula di Bowman; Il glomerulo è un ciuffo di capillari definito rete mirabilis, proveniente da una arteriola afferente che confluiscono in una arteriola efferente più piccola. Il tubulo renale fa seguito al glomerulo e si può dividere in 3 porzioni: Tubulo contorto Prossimale, l’Ansa di Henle e il Tubulo contorto Distale. La principale funzione del rene è quella di ultrafiltrare tutto il sangue che vi passa attraverso. Le altre importanti funzioni sono: il riassorbimento in quanto, il nostro corpo non può permettersi di lasciarsi sfuggire certe sostanze :P (es: il glucosio), e la secrezione che è un ulteriore sistema di eliminazione di alcune sostanze che non vengono ultrafiltrate. I tossici possono quindi compromettere queste 3 funzioni del rene danneggiando le membrane che permettono il passaggio delle sostanze. Un danno a livello del GLOMERULO, significa andare a modificare gli strati che separano il sangue dall’ultrafiltrato.. In condizioni normali, quando il sangue arriva al glomerulo attraverso l’arteriola afferente le sostanze passano nell’ultrafiltrato penetrando varie membrane… Il primo strato è costituito dall’endotelio dei capillari della rete mirabilis (endotelio dotato di fenestrature abbastanza ampie). Il secondo strato è costituito dalla membrana basale (non è continua) e il terzo è lo strato delle cellule epiteliali renali (i podociti). Un’alterazione di questi strati cellulari provoca un aumento della permeabilità.. Normalmente proteine con peso superiore a 60K D non vengono ultrafiltrate, in casi patologici.. sì…

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Per quanto riguarda i processi di riassorbimento e secrezione tubulare, questa è un’immagine riassuntiva di ciò che succede a livello del tubulo renale. Nella parte iniziale del tubulo prossimale avviene il riassorbimento del 90% dell’acqua dell’ultrafiltrato.. Avviene inoltre il riassorbimento del sodio del bicarbonato e del glucosio (e altre sostanze), ad opera di opportuni sistemi di trasporto attivo.. Nell’epitelio possiamo trovare delle cellule ciliate che permettono di aumentare la superficie di contatto.. se i tossici alterano questa struttura morfologica, viene compromessa la capacità di riassorbiment, compresi i sistemi di trasporto attivo.. → Un danno anossico, ad esempio, causa un calo dell’ATP e quindi l’incapacità da parte dei sistemi di trasporto di funzionare correttamente. Nell’ultra filtrato troveremo quindi una maggior quantità di acqua, glucosio e altre sostanze come Proteine che normalmente verrebbero riassorbite.. Nella parte dell’Ansa di Henle (zona Midollare interna) avviene un intenso trasporto attivo.. Nella parte ascendente vengono trasportati attivamente vari ioni, in modo da garantire il gradiente osmotico necessario per riassorbire l’acqua dal tratto discendente dell’ansa.. Alcune condizioni di intossicazione possono compromettere il sistema di trasporto ionico nel tratto ascendente (in particolare uno stato di anossia) bloccando di conseguenza il riassorbimento dell’acqua. Anche nel tubulo contorto distale sono presenti questi sistemi di trasporto attivo… Nel dotto collettore il riassorbimento è prevalentemente permesso dall’azione dell’ormone antidiuretico o dai mineralcorticoidi (ecc..).. I tossici che rendono inefficace l’azione di questi ormoni vanno ulteriormente ad alterare il riassorbimento… Un indice di danno renale è l’alterazione della Clearance (volume di plasma depurato da una sostanza nell’unità di tempo).. Se il rene non garantisce una ultrafiltrazione ottimale, la clearance sarà ridotta.. QUALI SONO I FATTORI CHE INFLUENZANO LA SENSIBILITA’ DEL RENE AD AGENTI TOSSICI ??? In primis, il fatto che attraverso il rene passa costantemente una grande quantità di sangue.. La zona corticale è quella maggiormente irrorata.. e di conseguenza è la più soggetta all’azione dei tossici. C’è però da dire che queste sostanze passano rapidamente attraverso la corticale.. Nella zona midollare invece, l’apporto di sangue è minore, ma lo è anche il flusso sanguigno.. per cui i tossici hanno più tempo per penetrare il tessuto, accumularsi ed espletare il loro effetto… Nel tubulo renale, a causa del processo di riassorbimento, i tossici possono concentrarsi.. ciò significa che se prima questi avevano nel circolo sanguigno una concentrazione pari al Volume di Distribuzione.. (estremamente bassa) e quindi incapaci di dare un’azione tossica… in seguito all’ultrafiltrazione possono raggiungere concentrazioni più elevate, in grado di causare danni Alcuni metaboliti tossici ultrafiltrati, possono essere successivamente riassorbiti.. e questo determina un aumento della latenza dell’effetto.. Pagina | 102

Inoltre il rene produce enzimi in grado di metabolizzare svariate sostanze chimiche… Questo può causare la bioattivazione di composti tossici.. (Es: Paracetamolo, Bromobenzene, CCl4…) QUALI SONO I SITI D’AZIONE DEGLI AGENTI NEFROTOSSICI?? 

Il Glomerulo → Il danno è causato dall’alterazione del triplice strato di membrane che determina un aumento della permeabilità.. Alcuni tossici che agisono a questo livello sono: o Solventi organici o Idrocarburi volatili La principale patologia che può interessare il glomerulo è la Glomerulo nefrite.. è un’infiammazione causata da un agente estraneo che stimola la risposta immunitaria, con formazione del complesso antigene–anticorpo che si lega alla membrana basale causando un ispessimento di questa.

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Il tubulo Prossimale → Alcuni tossici che agiscono a questo livello sono i: o Metalli pesanti (cromo, Mercurio, Cadmio) o Antibiotici (aminoglicosidi) o Antineoplastici (es: Cisplatino) o Idrocarburi alogenati (Cloroformio e CCl4) o Micotossine (Aflatossina) Il tubulo contorto Distale.. → Tra i tossici che agiscono a questo livello abbiamo: o Antineoplastici (Cisplatino) o Amfotericina B (farmaco antimicotico.. interagisce con gli steroli di membrana formando un canale e provocando la fuoriuscita del contenuto cellulare → Morte..)

QUALI SONO GLI INDICATORI BIOCHIMICI DI NEFROTOSSICITA’? 

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Proteinuria: Riscontro di proteine (che non dovrebbero essere presenti) nelle urine… Se troviamo proteine ad alto peso molecolare come l’albumina, il danno è quasi sicuramente a livello del glomerulo renale.. se troviamo proteine a basso peso molecolare, significa che a livello del tubulo prossimale vi è un danno nei meccanismi di riassorbimento.. Enzimuria: Presenza di enzimi (che normalmente dovrebbero essere presenti all’interno delle cellule) nelle urine… La loro presenza significa generalmente un danno a livello dell’endotelio.. tra questi enzimi troviamo: o Alanina Amminotransferasi (ALT), o Lattato deidrogenasi (LDH) → Indice di morte cellulare, o N-acetil galattosidasi, beta-galattosidasi Ci sono poi enzimi specifici che indicano un danno tubulare di superficie come: o Alanina Aminopeptidasi (AAP) → che si origina nell’orletto a spazzola del tubulo prossimale

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Poi ci sono Indicatori di danno tubulare aspecifico (origine lisosomiale): o N-acetil-beta-glucosamidasi (NAG) Glicosuria: Il riscontro di Glucosio in condizioni di normoglicemia, significa che vi sono dei problemi nei sistemi di riassorbimento..

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Poi abbiamo altri parametri fisiologici che possiamo valutare come: 

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Azotemi e Uremia: Valutiamo la presenza di prodotti del catabolismo proteico che normalmente non dovrebbero essere presenti, ma eliminati attraverso la bile.. o Urea, Creatinina, Acido urico, Aminoacidi, Creatina… se abbiamo alti valori di queste sostanze, significa che il rene non è capace di eliminarle.. quindi abbiamo una ridotta funzionalità renale… Variazioni del volume Urinario: o Poliuria: (→ il volume di urina prodotta aumenta…) questo è indice di problemi relativi ai sistemi di riassorbimento dell’acqua lungo il tubulo renale.. può essere causato da:  Aminoglicosidi  Derivati dell’acido Salicilico.. o Oliguria (scarso volume di Urina).. ne possono essere responsabili:  CCL4  Merurio inorganico  Sulfamidici  Calcoli renali o Anuria (completa mancanza di produzione di Urina).. significa che vi è un danno nella filtrazione glomerulare tale da determinare blocco renale… Ematuria o Emoglobinuria: (→ presenza di eritrociti o emoglobina nelle urine)… Presenza di Precipitati: Possono essere dovuti alla formazione di: o Cristalli di ossalato.. il cui principale responsabile è l’etilen Glicole (antigelo) metabolizzato ad acido ossalico… che precipita ad ossalato di calcio.. o Cristalli di Urati: dovuti alla rpecipitazione delle mercaptopurine (farmaci antitumorali) o Cristalli di Fosfati.. La formazione dei precipitati dipende considerevolmente dal pH delle urine

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o Possiamo poi avere cristalli generati da precipitati di Farmaci come i Sulfamidici Clearance (ovviamente)… Forse è il parametro migliore per valutare la funzionalità renale (Creatinina e Urea)… Se si riduce la clearance.. significa che il rene non lavora efficientemente..

Questo è un riassunto di dove agiscono le sostanze tossiche a livello renale.. Abbiamo il Glomerulo (2) e la Capsula del Bowmann (1) che insieme costituiscono il corpuscolo di Malpighi. Le principali sostanze tossiche che possono provocare danni a questo livello sono: Solventi orgnici, idrocarburi alogenati.. Poi abbiamo il tubulo prossimale (3) e i tossici che lo colpiscono sono idrocarburi, idrocarburi alogenati, alcoli polivalenti (dietilen glicole), Metalli pesanti e inquinanti ambientali (esa-cloro-butadiene, Paraquat e l’acido 2,4,5 tricloro fenossiacetico).. Sull’ansa di Henle (4) e sul tubulo contorto distale (5) agiscono prevalentemente i metalli pesanti tra cui il Rame. Pagina | 104

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I METALLI:

Possono agire, a basse dosi o ad alte dosi…

A Basse dosi sono: Responsabili dell’aumento del volume di urina prodotta (compromettono quindi il processo di riassorbimento dell’acqua), sono responsabili dell’aumento degli aminoacidi nell’urina (danno nel riassorbimento degli aminoacidi).. Determinano inoltre glicosuria (quindi danno nel riassorbimento del glucosio) Ad Alte dosi: i Danni causati sono più gravi… si arriva a uno stato di ridotta produzione di urina fino a blocco renale.. che porta a uno stato di incoscienza.. coma.. e Morte… Tra i metalli pesanti abbiamo Il Mercurio.. nel rene la forma più tossica è quella più polare.. (→ Inorganica).. Può provocare sia effetti acuti (con danno alle cellule dell’epitelio renale a causa dell’alterata funzionalità dei mitocondri e produzione di ROS che porteranno a una morte per apoptosi o necrosi..) che danni cronici (quando viene stimolata una risposta anticorpale con formazione di complessi antigene-anticorpo che causa una glomerulonefrite dovuta a un’esposizione cronica) Il Piombo e il Cadmio, agiscono a livello del tubulo prossimale provocando morte per compromissione della respirazione cellulare… Questo danno può dare origine a una forma di ridotta funzionalità tubulare che è reversibile. In caso di esposizione cronica il PIOMBO provoca un tipo di nefropatia caratterizzata da Sclerosi vascolare (indurimento dei vasi del rene), atrofia delle cellule tubolari, Formazione di tessuto fibrotico e sclerosi glomerulare.. il CADMIO ha tantissime azioni tossiche a livello dell’apparato riproduttivo, polmonare e renale.. In quest’ultimo caso è particolarmente pericoloso quando è legato alle metallo tioneine.. L’organismo si difende dall’azione dei metalli pesanti grazie a queste proteine che li complessano e li rendono meno tossici favorendo la loro eliminazione… Per il cadmio è diverso… Questo metallo può essere inattivato a livello epatico dal glutatione o complessato con le metallotioneine… Il complesso ritorna qundi in circolo… arriva al rene.. viene ultrafiltrato… eeeee……?? Vine assorbito dalle cellule del tubulo O_o … Gli enzimi lisosomiali presenti in queste cellule tagliano tra il cadmio e la metallotioneina… il cadmio torna in forma libera, provocando effetti tossici…

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NEFROTOSSICITA’ 

| 28/11/11

|Parte 2

IDROCARBURI ALOGENATI:

L’esposizione con questi agenti può avvenire in un contesto industriale.. o come inquinanti ambientali… L’esposizione a basse concentrazioni determina Proteinuria (aumento della permeabilità delle membrane), Poliuria (danni ai sistemi di riassorbimento nel tubulo prossimale e nell’ansa di Henle) e Glicosuria (danno nei processi di trasporto attivo a livello del tubulo prossimale) L’esposizione ad alte concentrazioni (o per contatto, o per accumulo) detemina blocco dell’ultrafiltrazione renale con conseguente perdita di funzionalità fino ad arrivare a coma e morte… Il CLOROFORMIO rientra in questa categoria.. i suoi effetti però variano anche a seconda della specie e del sesso dell’organismo.. Questo è dovuto al fatto che i metaboliti del cloroformio (responsabili dell’azione nefrotossica) possono cambiare a seconda del sesso dell’organismo. Maschi e femmine possono infatti presentare differenze nella concentrazione o nel tipo di enzimi deputati alle biotrasformazioni. E’ accertato che il cloroformio esercita una maggiore azione nefrotossica nel maschio rispetto a una femmina.

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Nel maschio causa necrosi a livello renale.. nella femmina provoca maggiormente necrosi del tessuto epatico.. Il cloroformio viene trasformato in tricloro metanolo dagli enzimi microsomiali e questo, per perdita di HCl, viene convertito a Fosgene.. quest’ultimo, se supera le concentrazioni soglia, può svolgere l’azione tossica a livello delle cellule del tubulo renale… Oltre la concentrazione soglia i meccanismi di difesa e neutralizzazione della cellula non riescono a disattivare il metabolita… I sistemi di inattivazione sono in questo caso la coniugazione con la Cysteina.. la coniugazione con il Glutatione o l’idrolisi con formazione di CO2 e HCl. L’ESACLOROBUTADIENE è responsabile dell’azione tossica a livello del tubulo prossimale.. viene utilizzato soprattutto come pesticida/erbicida o antiparassitario.. o in ambito industriale come scambiatore di calore.. La particolarità di questo tossico è che la forma coniugata con il Glutatione (Glutammato-Cisteina-Glicina) subisce l’azione di due enzimi che tagliano i legami della cisteina con glicina e glutammato… rimane quindi un Cystein-Coniugato; substrato ideale per l’enzima β-Liasi che idrolizza il legame dell’esaclorobutadiene con l’atomo di zolfo (della cisteina) .. e quindi?? Si forma un tiolo responsabile della nefrotossicità.. Quindi.. generalmente il legame con il Glutatione permette l’inattivazione e l’eliminazione delle diverse sostanze.. in questo caso è però il responsabile della bioattivazione del tossico :P Un sistema per l’eliminazione del Cystein-coniugato sarebbe la N-Acetilazione… Sistema che funziona fino a quando non viene saturato. Pagina | 106

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FARMACI:

Sono svariate le classi farmacologiche che possono provocare danni a livello renale portando a insufficienza acuta o cronica… Può essere inoltre di tipo funzionale (quando il tessuto renale rimane intatto) od organica (quando il tessuto renale viene danneggiato). Nel caso dell’insufficienza acuta, questa si presenta in breve tempo e spesso è reversibile alla sospensione della somministrazione del farmaco.. L’insufficienza cronica dura più a lungo e spesso è un processo irreversibile… Le persone più suscettibili a un’insufficienza renale da farmaci sono le persone anziane (che hanno già di per se una funzionalità renale ridotta rispetto a una persona più giovane). I farmaci che possono determinare insufficienza renale sono:  Insufficienza renale Funzionale: o FANS: Probabilmente a causa dell’inibizione delle ciclossigenasi che permettono la sintesi delle prostaglandine (→ hanno effetto vasodilatatorio.. la prevalenza di sostanze endogene con effetto vasocostrittore può generare episodi ischemici..) Assunzioni croniche di farmaci come Aspirina, ibuprofene, naproxene, paracetamolo.. ad alte dosi e per lunghi periodi (>3 anni) determinano nefropatia cronica con necrosi della zona Papillare e Midollare (ansa di henle + dotti collettori) o ANTI-IPERTENSIVI: come gli ACE-inibitori.. che impediscono la produzione di angiotensina.. questi farmaci, se somministrati in condizione di stenosi renale possono aggravare la situazione e compromettere la funzionalità renale  Insufficienza renale Organica: o AMINOGLICOSIDI: o AMFOTERICINA B: interagisce con gli steroli di membrana generando dei pori che fanno fuoriuscire il contenuto cellulare o ANTIVIRALI o FARMACI ANTITUMORALI CITOTOSSICI (come ad esempio il cisplatino→ ha azione genotossica e necrotica) o IMMUNOSOPPRESSORI (come la Ciclosporina A) o MEZZI DI CONTRASTO IODATI PARACETAMOLO: Nel rene trova una via metabolica in più rispetto agli altri organi, per produrre dei metaboliti tossici.. (nel fegato, per azione del CYP450, veniva trasformato in un metabolita tossico)… Il paracetamolo che non viene allontanato per glucurono-coniugazione o solfato-coniugazione viene metabolizzato dalle prostaglandino sintetasi che portano alla formazione di un intermedio radicalico altamente reattivo.. Questo reagisce con i nucleofili cellulari provocando danni a proteine e DNA. Sempre per azione delle prostaglano sintetasi può essere convertito nel metabolita tossico generato dal fegato.. O_o” Provoca l’aumento dei prototti del catabolismo delle proteine, la riduzione dell’ultrafiltrazione glomerulare… Provoca inoltre poliuria (danni quindi nel riassorbimento) glicosuria e proteinuria. Pagina | 107

AMINOGLICOSIDI: Sono antibiotici battericidi, inibiscono la sintesi proteica interagendo con la subunità ribosomiale di tipo 30S. Onltre alla Ototossicità, sono pericolosi appunto per la loro tossicità a livello renale… La tossicità di queste molecole è proporzionale al numero di gruppi aminici presenti nella molecola… Streptomicina < Tobramicina < amikacina < neomicina A livello del tubulo renale vanno a interagire con i fosfolipidi presenti sulle membrane cellulari, penetrano nella cellula.. arrivano ai lisosomi e ne causano la rottura… con conseguente fuoriuscita degli enzimi presenti in essi… Questo causerà l’autodigestione delle proteine cellulari con conseguente morte.. Inoltre, gli aminoglicosidi, agiscono sulla sodio potassio ATPasi alterando gli equilibri ionici portando a un rigonfiamento cellulare .. alterano la funzionalità mitocondriale, i sistemi di trasduzione del segnale e l’omepstasi del calcio… Fine della Nefrotossicitààààààà

TOSSICOLOGIA DEL MIDOLLO OSSEO Parleremo dei danni causati alla parte corpuscolare del sangue (eritrociti, leucociti, piatrine ecc..)… Le cellule ematiche originano (nell’adulto) da opportune cellule staminali presenti nel midollo osseo. Nell’organismo fetale, inizialmente, le cellule ematiche vengono prodotte da precursori nella milza e nel fegato… Intorno al quinto mese di gravidanza il midollo osseo fetale inizia a essere funzionante e a produrre cellule staminali che si differenzieranno nei diversi elementi corpuscolari del sangue… Le cellule staminali sono inattive… Entreranno in uno stato di differenziazione in seguito a degli stimoli endogeni da parte di mediatori chimici (Es: EPO). Gli stimoli possono portare ad esempio alla produzione dei precursori dei linfociti (→ il Linfoblasti) che formano delle colonie che si sviluppano nello stroma midollare.. i linfoblasti si svilupperanno poi in Linfociti T e B (cellule responsabili della risposta immunitaria citotossica e anticorpale)… Dagli Eritrobalsti arriveremo (in vari stadi) ai reticolociti che si differenzieranno infine in eritrociti.. Le piastrine originano dai megacarioblasti… ecc ecc ecc…. O_o I fattori responsabili della differenziazione delle cellule staminali sono:    

l’Eritropoietina (prodotta a livello renale) Fattore di stimolazione dei granulociti Fattore di stimolazione dei monociti/macrofagi Interleuchine.. che possono agire in maniera diretta o indiretta… o interleuchina 1 e TNF hanno azione indiretta (vanno a stimolare cellule dello stroma midollare che a loro volta produrranno i mediatori chimici specifici per le cellule staminali..) o L’Interleuchina 7 stimola la produzione dei precursori dei linfociti B eT o E Le interleuchine 2, 4, 5, 6 agiscono su tutti i precursori…

E’ palese quindi capire a che livello possono agire le sostanze tossiche… Pagina | 108

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VIA DIRETTA: I tossici possono agiscono sull cellule staminali pluripotenti o sulle cellule figlie..

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VIA INDIRETTA: Alterano il controllo dei mediatori chimici responsabili della differenziazione delle cellule staminali..

L’EMOGLOBINA: E’ il componente principale degli eritrociti (globuli rossi maturi) e costituisce circa il 30% della loro massa.. E’ una proteina ad elevato peso molecolare (67k D) ed è costituita da 4 catene polipeptidiche (2 β e 2 α). All’interno di ognuna di queste catene si trova il gruppo prostetico EME costituito da un anello porfirinico al cui interno vi è complessato il Fe+2→ condizione necessaria per legare l’ossigeno e trasportarlo ai tessuti.. Ci sono vari fattori che influenzano il legame tra l’emoglobina e l’ossigeno, tra cui: 

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il pH cellulare: Una condizione di abbassamento del pH determina una maggiore facilità di rilascio dell’ossigeno (EFFETTO BOHR) → → La pressione parziale dell’Ossigeno: a livello dei polmoni è più elevata.. quindi è anche più elevata l’affinità… a livello dei tessuti periferici la pressione parziale si abbassa (e di conseguenza anche l’affinità)…

In seguito all’azione di tossici metemoglobinizzanti possiamo avere la formazione di METEMOGLOBINA (ossidazione del ferro del gruppo eme da 2+ a 3+, incapace quindi di legare l’ossigeno). La metemoglobinemia presenta quindi una sintomatologia tipica dello scarso apporto di ossigeno ai tessuti.. primo fra tutti:  La CIANOSI: Tipica colorazione bluastra delle mucose, che si presenta quando almeno 1/3 dell’emoglobina non è ossigenata..  Vertigini e Disorientamento .. le capacità del SNC sono ovviamente compromesse  Debolezza muscolare  Perdita di consapevolezza, intorno al 50%, fino ad arrivare a…  Morte.. per concentrazioni pari a circa il 70% Nel sangue è normale la formazione di una piccola percentuale di metemoglobina, in quanto siamo pur sempre immersi in un mare di sostanze ossidanti.. Queste concentrazioni comunque rimangono basse (sotto l’1%) grazie all’azione dell’enzima Metemoglobina Reduttasi (NADH-Dipendente) che riduce il ferro dell’eme nuovamente a 2+. L’ossidazione del ferro da +2 a +3 può avvenire attraverso 2 processi: -

Ossidazione diretta: Avviene una reazione di ossidoriduzione, in cui una specie (il ferro) si ossida..mentre l’altra si riduce. Co-Ossidazione o Ossidazione Accoppiata: L’emoglobina e un’altra sostanza, in presenza di ossigeno si ossidano contemporaneamente. Pagina | 109

I tossici che possono portare alla formazione di metaemoglobina per ossidazione diretta sono: o o o o

L’Acqua ossigenata, L’ozono E quasi tutti gli ossidi dell’azoto (NOx) Il rame, cromati

o o o

I Clorati e Perclorati I Nitrati e I Chinoni

Le sostanze che inducono ossidazione accoppiata possono agire per via:  

Diretta → Sono già attive.. e in presenza di ossigeno si ossidano insieme al ferro… o NaNO2 .. che viene ossidato a NaNO3 insieme all’emoglobina Indiretta → Richiedono un’attivazione metabolica… è necessaria quindi la presenza di opportuni enzimi. Più i metaboliti tossici sono stabili.. più elevata sarà la latenza dei cicli di Co-ossidazione.. Perché!?!? O_o Il composto di partenza viene bioattivato.. e verrà ossidato insieme al ferro dell’emoglobina… Successivamente verrà riconvertito al composto di partenza (Ah davvero?? O_o) e in questo modo si formerà un ciclo che fornisce continuamente metabolita tossico che può espletare la sua attività metaemoglobinizzante fino alla sua degradazione.. Tra i tossici che presentano questo meccanismo abbiamo: o Amine aromatiche (e tutti i nitro e azocomposti aromatici) come l’Anilina che origina un ciclo che perdura per molto tempo.. l’intossicazione da anilina generalmente avviene per inalazione di vapori o assorbimento cutaneo nelle industrie calzaturiere, in quelle che producono gomme e quelle farmaceutiche..

In caso di intossicazine da sostanze metemoglobinizzanti, l’antidoto è il blu di metilene che non agisce come tale, ma deve prima essere ridotto a Blu di Leucometilene. Questa riduzione avviene attraverso l’azione della metemoglobina reduttasi NADPH dipendente.. Il blu di leucometilene è il responsabile della riduzione del Ferro 3+ a Ferro 2+… ripristinando così l’emoblobina normale… Una somministrazione per via endovenosa di 2 mg/kg provoca un calo della metemoglobina nel sangue da un 30% a un 5-8%.. 

MONOSSIDO DI CARBONIO

E’ un altro tossico importante, provoca la produzione di carbossiemoglobina (color rosso ciliegia :P) e impedisce il legame dell’ossigeno al Ferro del gruppo eme in quanto ha un’affinità 250 volte superiore. L’intossicazione da una sintomatologia graduale.. gli stati più gravi si raggiungono con un 50-60% di carbossiemoglobina formata con uno stato comatoso e e possibilità di convulsioni.. fino ad arrivare a collasso circolatorio e morte… La terapia attuabile per antagonizzare l’azione del CO è usare una camera iperbarica, in cui viene aumentata la pressione parziale dell’ossigeno ed è così facilitato il distacco del CO dall’emoglobina.. Pagina | 110

In condizioni normali di pressione dell’ossigeno, il T/2 del monossido di carbonio è di 320 minuti… quindi occorreranno all’incirca 26 ore per la completa eliminazione del C=O dal sangue… Il tempo di dimezzamento si riduce a “soli” 80 minuti in un’atmosfera di SOLO ossigeno a pressione ambientale… (il tempo ricihesto per una completa eliminazione si riduce quindi a 6-7 ore)… Infine.. in camera iperbarica a 3 atm con solo ossigeno, il T/2 del C=O si riduce a 23 min ( quindi ne occorrono 115 per la sua completa eliminazione… Non male :P) TIPI DI DANNI A LIVELLO EMATICO:      

   

Anemie: ovvero la riduzione degli eritrociti nel sangue… Leucocitopenie: riduzione dei leucociti nel sangue Trombocitopenie: diminuzione delle piastrine.. Granulocitopenia: riduzione dei granulociti nel sangue Linfocitopenia: riduzione dei linfociti nel sangue Pancitopenia: riduzione di tutti gli elementi corpuscolari del sangue… è genralmente causata da sostanze tossiche come il benzene, radiazioni ionizzanti… lindano e clordano (pesticidi organoclorurati), mostarde azotate (antineoplastici), arsenico, cloramfenicolo e Sali d’oro… Agranulocitosi: mancanza di granulociti nel sangue Anemia aplastica: conseguente alla pancitopenia… è una patologia molto rara, caratterizzata da una riduzione di tutti gli elementi cellulari del sangue Anemia emolitica: provocata dall’emolisi degli eritrociti Leucemia: tumore delle cellule del sangue, in cui vi è una iperproliferazione incontrollata delle cellule staminali nel midollo osseo.

 BENZENE: Ha un quadro metabolico abbastanza complicato… Gli effetti ematotossici del benzene derivano dal fatto che i suoi metaboliti vanno a legarsi alle biomolecole cellulari (proteine, DNA e RNA) provocando un’inibizione della sintesi del DNA e quindi inibizione della proliferazione cellulare a livello delle staminali nel midollo osseo… → provoca quindi MIELODEPRESSIONE. Agisce inoltre sullo stroma midollare riducendo gli stimoli che possono indirizzare alla differenziazione delle colonie di precursori.. La tossicità del benzene prosegue per stadi… Inizialmente abbiamo anemia…. Successivamente all’aumentare della concentrazione passiamo ad effetti sugli altri elementi figurati del sangue fino ad arrivare alla pancitopenia.. Il danno più grave (dovuto a esposizione prolungata ad alte concentrazioni) è la leucemia.. i meccanismi che portano a essa non sono ancora ben chiari.. (si pensa abbia effetto clastogeno)

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METABOLISMO DEL BENZENE:

I metaboliti cerchiati sono quelli maggiormente implicati nell’azione tossica… Dal benzene si ottengono un metabolita epossidico e un fenolo.. La forma epossidica è quella che potrebbe essere allontananta e inattivata per coniugazione con glutatione.. se però questo sistema non è efficiente, l’epossido darà origine all’aldeide muconica (altamente tossica) responsabile della mielodepressione.. Il fenolo porta invece alla produzione di idro e benzo chinoni (→ altri metaboliti emato tossici).. il fenolo può essere inattivato per coniugazione con acido glucuronico o con solfato.. se queste vie di neutralizzazione non sono sufficienti, darà origine a una specie catecolica (che può essere anch’essa inattivata per coniugazione con acido glucuronico o solfato) e a una specie idrochinonica… Se i sistemi di neutralizzazione non funzionano in modo efficiente, il metabolismo proseguirà alla formazione di benzochinoni e idrochinoni di cui è accertato l’effetto mielotossico (→per legame alle biomolecole cellulari).

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TOSSICOLOGIA DEL SISTEMA RESPIRATORIO La regione naso faringea è la porzione di protezione da agenti tossici che vengono inalati o aspirati. Grazie alla presenza di cellule ciliate e alla produzione di muco, possono essere trattenute le particelle con dimensioni superiori ai 5-10 μm.. successivamente verranno trasportate all’esofago per essere poi eliminate.. Questa regione è costituita da un epitelio molto vascolarizzato e quindi un’altra funzione è quella di scaldare l’aria proveniente dall’esterno e umidificarla.. In questa regione vengono inoltre trattenuti i gas particolarmente idrosolubili (come l’anidride solforosa)… sono inoltre presenti le cellule olfattorie che permettono l’elaborazione degli odori… ne consegue che sostanze tossiche che vanno a danneggiare questo epitelio causano un’alterazione della percezione olfattiva… Infine queste cellule hanno anche capacita metaboliche… Dalla zona nasofaringea arriviamo alla porzione tracheo-bronchiale (compresa tra la trachea e i bronchioli di transizione)… possiamo dividere l’epitelio in varie sezioni… ognuna di quelle numerate viene detta generazione (sono le zone in cui si formano nuove ramificazioni).. la regione tracheobronchiale va quindi dalla 0 alla 15.. in questa zona abbiamo un epitelio di tipo mucociliato, che permette di trattenere particelle per poi farle risalire fino all’esofago.. abbiamo inoltre cellule mucosecretorie, responsabili della produzione di muco (che ha il compito di intercettare e bloccare le particelle portate dal flusso dell’aria)… Possiamo trovare poi le cellule non ciliate definite cellule “Clara” e si trovano nei bronchioli… hanno un’intensa attivbità metabolizzante e producono muco.. Ovviamente sono presenti anche cellule muscolari che permettono attraverso meccanismi di rilasciamento e contrazione di facilitare il passaggio dell’aria.. Sono presenti poi mastociti e granulociti, che si attivano in caso di processi allergici o infiammatori... Tra i tossici che sono attivi nella regione tracheo-bronchiale abbiamo l’anidride solforosa e le sostanze presenti nel fumo di sigaretta.. che riducono le capacità protettive di questo epitelio.. e quindi la Clearance mucociliare.

Successivamente passiamo alla regione polmonare, la cui principale funzione è lo scambio dei gas… in questa porzione avviene maggiormente l’assorbimento delle sostanze tossiche se queste presentano opportune caratteristiche chimico fisiche come Piccole dimensioni e scarsa idrosolubilità…

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I bronchioli terminali portano agli alveoli che sono a stretto contatto con una rete di capillari. Il sangue che trasporta attraverso gli eritrociti i gas come la CO2 quando arrivano a livello alveolare vengono scambiati con l’ossigeno grazie allo stretto contatto che vi è tra la membrana degli alveoli e l’endotelio dei capillari. Questa doppia membrana in particolare quella che costituisce gli alveoli, è costituita da cellule di 2 tipi: 

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Pneumociti di tipo 1: che costituiscono lo strato sottile che crea la barriera tra sangue e aria.. inoltre hanno una funzione strutturale Pneumociti di tipo 2: Producono un tensioattivo polmonare che impedisce il collasso degli alveoli al momento dell’espirazione.. e rigenerano le cellule di tipo 1 quando queste vengono danneggiate…

Sempre a questo livello possiamo poi trovare cellule connettive e macrofagi, la cui principale funzione è di spazzini :P (fagocitano particelle estranee che sono riuscite ad arrivare a livello alveolare). La funzione di scambio dei gas dipende da 3 fattori:   

La Ventilazione polmonare: La quantità d’aria che attraversa le vie respiratorie.. La perfusione polmonare: l’irrorazione dei polmoni Diffusione polmonare: diffusione del gas attraverso lo strato delle cellule endoteliali e pneumociti..

Hotlinks:    

Registrazione Parte 1: Registrazione Parte 2: Dispense Midollo oxx: Dispense Sist Resp:

2 Ore di Lezione

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TOSSICOLOGIA DEL SISTEMA RESPIRATORIO 

| 29/11/11

Parte 2

VENTILAZIONE POLMONARE:

E’ il volume d’aria che il polmone può contenere, e dipende dalla elasticità del tessuto polmonare. Per poter vedere danni a livello della ventilazione polmonare occorre poter calcolare il Volume Respiratorio -> attraverso uno strumento chiamato Spirometro. All’interno di questo viene soffiata l’aria proveniente dal polmone.. e possiamo ricavare diversi volumi… Il Volume Corrente è il volume d’aria espirato in condizioni di riposo (nell’adulto è pari a circa 500 mL).. Possiamo poi calcolare la Capacità Vitale: → il volume d’aria emesso in condizioni forzate (l’individuo butta fuori aria fino ai limiti del possibile :P) .. generalmente è pari a 4500 mL Ciò che rimane nel polmone dopo la forzata espirazione si chiama Volume Residuo (1500 mL) La somma della capacità vitale + il volume residuo fornisce la capacità Polmonare TOTALE. Viene definita capacità funzionale residua il volume d’aria che rimane dopo l’espirazione a riposo.. Variazioni in tutti questi volumi possono essere segnali di un danno a livello della ventilazione polmonare dovuto a perdita di elasticità. Cosa può creare questo tipo di danno?? 

La sostituzione delle cellule polmonari normalmente presenti con Tessuto fibroso… a causa di: o Fibre Minerali: come Asbesto (amianto), Silicio o Polmonite In questi casi abbiamo una riduzione della capacità vitale e della capacità polmonare Totale..

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Patologie ostruttive che impediscono il normale flusso di aria attraverso le vie respiratorie come: o Broncospasmi dovuti all’ASMA.. Questa patologia determina un Aumento del Volume Residuo (a causa delle ostruzioni più di un certo quantitativo di aria non riesce a essere emessa…)

L’apparato respiratorio è il primo a venire a contatto con le sostanze esogene presenti nell’aria.. Attraverso la via nasale e la bocca possono essere inalati vapori o particolati. La superficie di assorbimento e scambio di questo sistema è vastissima.. I tossici inalati possono non agire nel distretto in cui vengono assorbiti, ma possono distribuirsi a livello sistemico e dare effetti anche in altri organi.. Ad esempio, alcuni solventi inalati possono determinare epatotossicità, nefrotossicità e neurotossicità). Pagina | 115

Ci sono poi sostanze che possono essere assorbite attraverso altre vie (come quella cutanea).. per poi accumularsi a livello polmonare esercitando qui l’azione tossica… Un esempio è il “Paraquat” (fa parte dei fitofarmaci → è un erbicida) provoca necrosi tissutale per formazione di radicali liberi. Il sistema respiratorio si difende dalle sostanze tossiche attraverso un sistema di clearance meccanica (dovuto alle cellule mucociliari) e alla presenza di macrofagi (soprattutto a livello alveolare). I tossici possono essere:  Dei gas o vapori che attraverso la via inalatoria superano lo spazio morto respiratorio e vengono assorbiti a livello alveolare grazie alla vasta superficie di scambio; passano quindi nel sangue e si distribuiscono nell’organismo..  Particelle sospese: o Aerosol (Sospensione di particelle liquide) o Nebulizzati (Sospensione di particelle solide) o Polveri (particelle solide) o Fumi o Smog (ha una composizione molto variabile e si genera per irradiazione dei ……………………. prodotti di combustione nell’atmosfera) GAS E VAPORI… L’assorbimento dipende: 

 

Dall’anatomia delle vie respiratorie: A causa della diversa morfologia e del calibro delle zone del tratto respiratorio, cambiano i movimenti delle particelle inalate. E questo cambia la probabilità che le particelle possano scontrarsi tra di loro depositarsi.. e quindi non raggiungere gli alveoli.. Dalla via di Introduzione: Le sostanze inalate vengono maggiormente intercettate e filtrate rispetto a quelle respirate.. Dalla frequenza e profondità degli atti respiratori..

I gas introdotti nell’organismo possono avere differenti caratteristiche chimico fisiche…   

I gas Idrosolubili sono quelli che si depositano più facilmente nel muco e sulle pareti del tratto respiratorio.. non riuscendo quindi ad arrivare a livello alveolare.. I gas poco solubili come l’ozono e gli ossidi d’azoto hanno scarse possibilità di potersi depositare, e quindi penetrano più facilmente negli strati più profondi. I gas NON solubili in acqua, come il monossido di carbonio, arrivano facilmente allo spazio alveolare per poi passare al sangue…

Esistono varie modalità di deposizione di PARTICELLE LIQUIDE E SOLIDE e dipendono ovviamente dall’anatomia del tratto respiratorio e dalla loro Dimensione. In particolare è importante differenziare diametro e Lunghezza delle particelle, in quanto alcuni tossici del tratto respiratorio sono costituiti da fibre. Più lunghe sono le fibre, più queste riusciranno a depositarsi nel tratto respiratorio… Le fibre, trasportate dall’aria, attraverso movimenti oscillatori (specie nelle zone più alte Pagina | 116

del tratto respiratorio) vengono INTERCETTATE e si depositano sull’epitelio. Avremo invece L’IMPATTAZIONE Quando si ha il deposito di particelle nella zona naso-farnigea.. Essendo il calibro più elevato, queste particelle sono sottoposte a dei bruschi cambi direzionali.. sbattono contro le pareti delle vie superiori e si impattano depositandosi in questa zona… questo tipo di particelle ha un diametro che va dai 5 ai 30 μm… Man mano che scendiamo alle vie più profonde si riduce il calibro delle vie aeree e quindi la possibilità che vi siano cambi direzionali.. inoltre si riduce anche la velocità del flusso d’aria.. La modalità di deposito cambia a SEDIMENTAZIONE. Si ha questo tipo di deposito nella regione tracheo-bronchiale per particelle con dimensioni comprese tra 1 e 5 μm. A livello Alveolare arrivano le particelle con diametro inferiore a 1 μm. Queste hanno la possibilità di DIFFONDERE attraverso l’epitelio ed essere assorbite.. Gli agenti tossici possono determinare a livello polmonare una risposta con:  

   

Broncocostrizione (riduzione del calibro delle vie aeree con ridotta quantità di aria che raggiunge i polmoni e di conseguenza anche gli altri tessuti dell’organismo) Edema delle vie Aeree (interviene un processo infiammatorio con vasodilatazione e aumento della permeabilità vasale … di conseguenza si ha versamento di liquidi negli spazi interstiziali con edema e ostruzione delle vie aeree) Reazioni Allergiche Enfisema (Dilatazione degli spazi alveolari con distruzione dei setti alveolari) Fibrosi (sostituzione di cellule epiteliali con fibroblasti.. e conseguente perdita di elasticità del tessuto polmonare) Neoplasie (come il mesotelioma causato dall’amianto)

BRONCOCOSTRIZIONE: Le sostanze che inducono bronco-costrizione provocano una stimolazione delle terminazioni nervose vagali con conseguente contrazione della muscolatura liscia.. Principalmente sono: L’Anidride Solforosa, L’Aldeide Formica, il Biossido D’azoto e l’Ozono.. La sintomatologia è simile a quella asmatica → Tosse, respirazione irregolare, e senso di soffocamento. Nelle persone che soffrono già di asma, il contatto con queste sostanze irritanti provoca un aggravamento della sintomatologia. EDEMA DELLE VIE AEREE: A causa del versamento di liquidi si ha un accumulo di questi a livello alveolare.. Questo può portare a una riduzione della diffusione polmonare (quindi una compromissione dello scambio dei gas a livello degli alveoli) oppure una riduzione della possibilità da parte dell’aria di passare attraverso le vie respiratorie. Provocano Edema polmonare: Il Fosgene (come tale o come prodotto di metabolismo del cloroformio), il Cloro, L’anidride solforosa e l’Ozono (è onnipresente)

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LE REAZIONI ALLERGICHE: prevedono la stimolazione di una risposta immunitaria da parte dei linfociti B che producono immunoglobuline di tipo E, che determinano la degranulazione dei mastociti con liberazione dei mediatori dell’infiammazioen tra cui istamina, leucotrieni, ecc.. Gli individui che sono più sensibili nei confronti dei fenomeni allergici richiederanno una minore concentrazione di sostanze allergizzanti per avere questo tipo di risposta. ENFISEMA POLMONARE: Distruzione dei setti alveolari con dilatazione degli alveoli e compromissione della superficie di scambio dei gas. Il polmone in questo caso è rilasciato e disteso.. incapace di svolgere la propria funzione.. Il Fumo di Sigaretta è la principale causa di Enfisema.. determina una risposta infiammatoria.. e la produzione da parte dei neutrofili e macrofagi alveolari di elastasi che degrada l’elastina tissutale e riduce la capacità elastica del polmone.. Generalmente sono presenti delle antiproteasi che impediscono questo fenomeno. FIBROSI: in particolare è causata da: Fibre minerali, che vengono depositate sulle pareti dell’epitelio respiratorio.. richiamano i macrofagi, che rilasciano mediatori dell’infiammazione, enzimi lisosomiali e radicali liberi dell’ossigeno provocando un danno alle cellule dell’epitelio.. alle cellule mesoteliali (che rivestono la pleura) e provocando una sostituzione con fibroblasti (→ e conseguente perdita di elasticità). NEOPLASIE: Hanno una latenza di comparsa che varia tra i 20 e i 40 anni..sono implicati in questo processo: I Componenti del Fumo di Sicaretta (come gli IPA.. che in seguito alla formazione di metaboliti epossidici attaccano le biomolecole della cellula determinando alterazioni nella loro funzionalità).. I radicali liberi dell’Ossigeno e altre specie radicaliche, Fibre dell’Asbesto (ha sia effetto genotossico che epigenetico).. Metalli come Arsenico, Berillio, Cadmio, Cromo e Nichel e Radiazioni Ionizzanti. E ora vediamo i singoli tossici =_=

OZONO (O3) : E’ estremamente pericoloso per l’apparato respiratorio.. Quando viene inalato circa il 50% rimane nelle regioni superiori (naso faringea).. il rimanente può arrivare ai bronchi e alveoli… A livello naso/faringe provoca principalmente irritazioni con stimolazione delle fibre vagali e conseguente tosse.. Provoca inoltre un danno all’epitelio mucociliare (desquamazione) andando a ridurre la clearance meccanica dei polmoni impedendo la corretta eliminazione delle particelle.. Provoca inoltre una degenerazione degli peneumociti di tipo 1 riducendo lo scambio dei gas a livello alveolare. Provoca fibrosi polmonare che riduce le capacità elastiche del tessuto.. L’ozono è un forte ossidante, e in seguito a ozonolisi può dare origine a potenti radicali liberi dell’ossigeno che provocano lipoperossidazione e distruzione della membrana cellulare.

OSSIDI D’AZOTO:

NO2 → Biossido D’Azoto...

Anche questo riesce a raggiungere in parte gli epiteli delle vie più profonde danneggiando le cellule presenti.. Le mucociliate favoriscono l’espulsione delle sostanze depositate, le cellule clara si occupano del metabolismo e della secrezione di muco, gli penumociti di tipo 1 costituiscono la membrana che permette la diffusione.. e i macrofagi permettono di eliminare sostanze esogene e patogeni… Un danno a queste cellule determinerà una maggiore suscettibilità a sviluppare infezioni.. un’esposizione cronica causa Enfisema.. Anche per l’NO2 l’effetto tossico è causato dalle sue prorietà ossidanti e produzione di radicali liberi. Pagina | 118

OSSIDI Di ZOLFO:

SO2 → Anidride Solforosa…

Ha un potente effetto irritante, soprattutto a livello delle vie aeree superiori.. provoca una sensazione di bruciore alle mucose e agli occhi (per reazione con l’acqua) provocando lacrimazione, tosse e starnuti. L’anidride solforosa provoca un aumento della produzione di muco e una diminuzione dell’attività delle cellule mucocilaite. Un’esposizione cronica (sempr eper l’effetto sui macrofagi) determina un magggior rischio di infezioni , lo sviluppo di bronchiti croniche e asma bronchiale..

MONOSSIDO DI CARBONIO:

CO ...

Ormai lo abbiamo visto decine di volte O_o”… E’ più affine all’emoglobina rispetto all’ossigeno di circa 250 volte… La cinetica di questa competizione è espressa dall’equazione di Haldan, dove vengono messi in relazione 2 rapporti.. l’emoglobina legata al monossido di carbonio (carbossiemoglobina) e quella legata all’ossigeno (ossiemoglobina).. Questo rapporto dipende da un fattore “M” .. per la pressione parziale del monossido di carbonio su quella dell’ossigeno…. Nel sangue umano si è calcolato un M pari a 245.. questo vuol dire che se consideriamo le concentrazioni di ossigeno nell’atmosfera pari al 21%.. e aggiungiamo una piccola percentuale di CO→ 0,1 % .. risulta che la percentuale di carbossiemoglobina formata è circa 50% O_o.. (al 50-60% determina coma e convulsioni)... Secondo alcuni esami effettuati, in un individuo normale la percentuale di COHb è pari all’1%... In un forte fumatore (30 sigarette al giorno) va da un 5 a un 10%... I taxisti a NYC.. 13% O_o… i vigili urbani di firenze…. 18%... O_o”

PARTICOLATO:

PM10 ...

Costituisce tutte le particelle presenti nell’atmosfera con un diametro inferiore a 10 μm e viene considerato un valore di riferimento dell’inquinamento… Ultimamente si tende però a valutare il PM2,5 che costituisce il 60% del PM10… Ha una composizione variabile e trae origine da composti naturali (come pollini, spore… ) e antropogenici derivanti da industrie, gas di scarico delle automobili.. riscaldamento domestico.. (come Metalli pesanti, silicati, nitrati, solfati, IPA) Queste particelle inalate, a livello polmonare, provocano dei processi infiammatori con rilascio di mediatori chimici dell’infiammazione che agiscono poi a livello vasale determinando vasodilatazione e aumento della permeabilità (edema) influenzando infine anche l’attività cardiaca. Il particolato determina quindi un aggravamento della condizione di salute in pazienti che hanno già dei problemi all’apparato respiratorio o cardiocircolatorio. Questa è una lista delle polveri.. con relativi effetti… Dovrei impararmeli??...ah te pol cantar in aramaico.. → tutti danno origine a Fibrosi.. basta sapere questo :P

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PARAQUAT: E’ un agente utilizzato in campo agricolo come erbicida. Può essere sia inalato che ingerito accidentalmente.. Lo si può ritrovare in piccole concentrazioni anche in frutta, verdura e carne.. Richiede una bioattivazione da parte di una reduttasi microsomiale NADPH dipendente, che porta alla formazione di una specie radicalica, che in presenza di ossigeno molecolare (O2) produce l’anione superossido, che per azione della superossido dismutasi darà origine all’acqua ossigenata (H2O2) che procederà alla formazione del radicale ossidrilico..Se i meccanismi che si occupano della degradazione delle specie radicaliche non sono pienamente efficienti, si avrà un danno sul tessuto polmonare e morte cellulare per necrosi; e infine l’attivazione di sistemi di riparazione che porteranno a fibrosi alveolare. Fine del sistema Respiratorioooo! :D

FIBRE MINERALI

| Parte 1

Le fibre minerali interessano principalmente l’apparato respiratorio… (=_=” eh… speravi di essertela cavata…)… L’asbesto è una delle principali ancora presenti, pressochè ovunque.. (anche Al Sant’Anna :P).. provoca circa 3K vittime ogni anno, e quasi la metà muore a causa di mesotelioma della pleura. Ormai sono più di 20 anni che l’amianto è stato bandito, ciononostante permane nell’ambiente (32 milioni di tonnellate scarse..) svolgendo il suo effetto dannoso.. oltre a provocare mesotelioma a livello della pleura può causare tumore anche in altri distretti dell’organismo… → A livello della Laringe, Ovaio e Testicoli, A livello peritoneale, colon-retto … insomma.. e praticamente tutto il sistema gastrointestinale … I soggetti più a rischio sono i lavoratori che producevano o trattavano l’amianto… e le loro famiglie, che potevano entrare in contatto con le fibre che si depositavano sui loro indumentoi di lavoro… Il periodo di latenza è lunghissimo (20-40 anni..) ed è stato stimato che fino al 2015 vi sarà un aumento dell’incidenza.. E’ una patologia abbastanza difficile da trattre e ha un tasso di mortalità dell’80%. Le fibre minerali sono resistenti agli acidi, flessibili, molto resistenti al calore.. ottimi isolanti.. quindi è normale il loro largo impiego sia in passato che ai giorni d’oggi. Possono essere di origine naturale o Sintetica. Tra quelle di origine naturale abbiamo: L’ ASBESTO.. termine generale per identificare diversi tipi di fibre come l’asbesto crisolito (asbesto bianco) e l’asbesto crocidolite (asbesto blu) ecc… IL GESSO: che ha la fortuna di essere idrosolubile, per cui ha una persistenza breve nell’organismo. Le fibre minerali sintetiche (quelle attualmente più usate) sono ottenute per fusione di materiale inorganico come vetro, rocce basaltiche, ceramiche ecc.. ottenendo così fibre di vetro, lana di roccia, lana minerale e fibre ceramiche… sono più resistenti e hanno una struttura più compatta.. Hotlinks: 

Registrazione: Pagina | 120

FIBRE MINERALI Le fibre minerali hanno una composizione molto eterogenea costituite da vari tipi di ossidi… → → Il componente principale di quasi tutte è l’Ossido di Silicio..

| 30/11/11 Componente principale (%) SiO2 Al2O3 B2O3 Na2O K2O MgO CaO Fe2O3

Fibre di vetro 55 ÷ 68 0 ÷ 15 3 ÷ 12 0 ÷ 18 0÷3 0÷5 2 ÷ 21 0,1 ÷ 0,6

Le fibre sintetiche, essendo molto compatte, subiscono al taglio una rottura trasversale.. al contrario, le fibre naturali subiscono una rottura lungo tutta la lunghezza della fibra . La maggiore cancerogenicità è dovuta anche a questo.

Parte 2

Fibre Ceramiche 3 ÷ 54 35 ÷ 95

Lana Minerale 34 ÷ 52 5 ÷ 15

0,2 ÷ 0,5