Apostila de Bioquímica - Prática

1 a AULA

INTRODUÇÃO AO LABORATÓRIO LABORATÓRIO E SOLUÇÕES INSTRUÇÕES 1. Lembre-se Lembre-se que o laboratório laboratório é um lugar para trabalhos trabalhos sérios sérios e não para brincadeir brincadeiras. as. 2. Leia os guias guias das práticas práticas com antecedência antecedência para obter melhor aproeitamento aproeitamento das aulas. aulas. !. "eali#e "eali#e somente os e$perimentos e$perimentos indicados indicados na aula. aula. %ão é permitido permitido reali#ar aqueles aqueles não autori#ados. &. 'endo 'endo qualquer qualquer d(ida solicite aos pro)essores pro)essores os deidos deidos esclarecimentos. esclarecimentos. *. +ompare,a +ompare,a s aulas nos dias dias e nos laboratórios laboratórios designa designados dos para sua sua turma. . %ão é permitido permitido )umar ou consumir consumir alimentos alimentos durante durante as aulas aulas práticas. práticas. /. 0ara sua sua própria própria seguran,a seguran,a ista um guarda-pó guarda-pó aental3 ao entrar entrar no laboratório. laboratório. 4. %ão troque os reagentes reagentes de uma uma mesa mesa para outra. 5. %o )inal de cada aula limpe limpe todo todo o material material66 0asse 0asse água água de torneir torneira a nos tubos tubos e outros outros materiais utili#ados. As pipetas deem ser colocadas dentro das cubas. 17. 8uando houer houer quebra ou danos danos nos nos materiais materiais ou aparelhos aparelhos comunique comunique aos pro)esso pro)essores. res. 11. 11. 9e engolir engolir um pouco de ácido ácido lae rapidamente rapidamente a boca boca com bastante bastante água água e em seguida seguida com solu,ão de carbonato de sódio 2:.

PRINCÍPIOS DE TÉCNICA a. 0ipetas graduad graduadas as não deem ser sopradas sopradas ao ao )im do escoamento. escoamento. 0ortanto 0ortanto recomendarecomendase emprega empregarr o come, come,o o o #ero #ero33 e não não o )im da grad gradua ua,ã ,ão o para para disp dispen ensa sarr olume olumess pequenos. b. Uma mesma pipeta não pode ser ser usada usada para medir solu,;es solu,;es di)erentes di)erentes a não ser que que see um modo geral material de idro olumétrico e não olumétrico. >entre os olumétricos temos6 pipetas proetas e bal;es olumétricos. destinad nadas as a trans)er trans)erir ir determina determinados dos olumes olumes de l=quido. l=quido. ?á dois dois tipos6 tipos6 PIPETAS - 9ão desti graduados e olumétricos. %estas práticas só pipetas graduadas são usadas. @las têm olumes de 1 2 * e 17 ml e permitem escoar olumes ariáeis de l=quido de acordo com a sua gradua,ão diidida em décimos ou centésimos de ml. +ilindros ros graduado graduados3 s3 - 9ão 9ão de medi medida da olumétri olumétrica ca não muito rigo rigoros rosa a PROVETAS - +ilind graduadas para diersos olumes de l=quido6 2* *7 177 2*7 ... ml. 9ão bal; bal;es es a)er a)erid idos os a )im )im de cont conter erem em um olu olume me BALÕES BALÕES VOLUMÉ VOLUMÉTRIC TRICOS OS - 9ão determinado por um tra,o de re)erência *7 177 2*7 *77 ... ml3. 9ão usados no preparo de solu,;es que e$iUCD A LAE"A'F"B @ 9LUCG@9

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1 a AULA litro de solu,ão. M representada por 1 N ou N. 0ode haer m(ltiplos ou subm(ltiplos do peso molecular 6 2 N - & N - 71 N - 72 N etc. Uma solu,ão N de cloreto de sódio contém *4* g p.m.3 do sal em um litro. Uma solu,ão 2 N conterá 2$*4*g O 11/ g. Uma solu,ão 71 N conterá *4* g. 9olu,;es normais são aquelas que contém um equialente-grama do soluto por litro de solu,ão. 0odemos ter m(ltiplos e subm(ltiplos do equialente-grama6 1 % 2 % 71 %...  cálculo do equialente-grama depende da nature#a qu=mica do soluto. 9e um ácido calcula-se diidindo o peso molecular pelo n(mero de átomos de ? ioni#áeis. @$.6 sol. ?+l 1 % !* gl3P sol. ?+l 71 % !* gl3P sol. ? 29& 1 % 542 O &5 gl3.

EXPERIÊNCIA ' PESA(EM E PREPARAÇÃO DE SOLUÇÃO 0reparar 2* ml de uma solu,ão de cloreto de sódio 27 : p.

TÉCNICA +oloque todos os pesos da balan,a em #ero.  ponteiro dee estar no centro posi,ão de equil=brio. 9obre o prato coloque um béquer. bsere que o ponteiro deslocou-se para cima. Noa os pesos das escalas até restabelecer o equil=brio. 0or e$emplo se o béquer pesou 4 g o peso da escala de 17177 g deerá estar em 7 e o da escala 117 g em 4.  Anote o peso do béquer6 QQQQQQQQQQ   Ao peso do béquer some a quantidade de %a+l necessária para se preparar 2* ml da solu,ão a 27 : p.  Anote o resultado do cálculo béquer R %a+l6 QQQQQQQQQQQ  >esloque os pesos da balan,a até obter o total calculado. bsere que o equil=brio da balan,a )oi des)eito. 0ara restabelecê-lo adicione %a+l ao béquer. 'emos assim pesada a quantidade de sal necessária para se preparar os 2* ml da solu,ão a 27:.

Pre$ara)*" +a %",-)*"  Ao cloreto de sódio contido no béquer istribuir em quatro béquers marcados6 Eéquer 1 e 26 2* ml de água destilada Eéquer ! e &6 2* ml de sol. tampão acetato 71 % p? *. Nedir com papel indicador o p? apro$imado dos l=quidos dos & béquers. Anotar o resultado no quadro a seguir.  Aos béquers 1 e ! adicionar em cada uma gota de ?+l concentrado.  Aos béquers 2 e & adicionar em cada uma gota de sol. %a? *7:. Nisturar por lee agita,ão. Nedir com papel indicador o p? dos l=quidos em cada béquer e anotar.

B./-er

$0 ini#ia,

$0 a$1% 0C,

$0 a$1% NaO0

2 3 4 5

Easeado nos resultados da tabela o que concluiuT

B%'">UCD A LAE"A'F"B @ 9LUCG@9

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2 a AULA

AMINO6CIDOS 27 REAÇÃO XANTOPROTÉICA 0esquisa de 'irosina e 'ripto)ano @sta rea,ão é positia com compostos portadores de radicais aromáticos substitu=dos. %as prote=nas estes radicais aparecem na tirosina e no tripto)ano.

'irosina

'ripto)ano

s radicais aromáticos destes aminoácidos reagem com o ácido n=trico )ormando nitroderiados que em meio alcalino são alaraneido  sua nature#a protéica as en#imas são sens=eis  a,ão de temperaturas eleadas que podem destruir a )un,ão catal=tica do seu centro atio. +olocar num tubo ! ml de água destilada e ! gotas de urease. Agitar. +olocar em banho maria )erente por ! minutos. @s)riar em água corrente. @m outro tubo pipetar 2 ml de uréia tamponada e "A'9

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* a AULA

47 TESTE DE SELIistin,ão entre aldoses e cetoses. %as condi,;es do teste as cetohe$oses trans)ormam-se nos deriados do )ur)ural mais rapidamente que as aldohe$oses. @m conseqIência nas re)eridas condi,;es e sendo curto o tempo de incuba,ão o resorcinol )orma um produto colorido apenas com as cetohe$oses. %o entanto prolongando-se o tempo de incuba,ão as aldoses reagem de maneira semelhante.

TÉCNICA Narcar & tubos e colocar em cada um ! ml do reatio de 9eli]ano)) ?+l com resorcinol3.  Ao tubo 1 adicionar 1 ml de solu,ão de )rutose  Ao tubo 2 adicionar 1 ml de solu,ão de glicose  Ao tubo ! adicionar 1 ml de solu,ão de sacarose  Ao tubo & adicionar 1 ml de água destilada tubo controle3 +olocar todos os tubos ao mesmo tempo no banho-maria )erente e cronometrar o aparecimento de colora,ão ermelha. Anotar os resultados na seguinte tabela6 1 min

2 min

& min

 min

Jrutose [licose 9acarose  Vgua 8ual é o melhor tempo para di)erenciar entre a )rutose e a glicose T 8uem dos dois monossacar=deos é a cetose T 0or que a sacarose reageT

57 TESTE DE BENEDICT "ea,ão para identi)icar carboidratos redutores. s monossacar=deos e alguns dissacar=deos possuem em suas estruturas grupos alde=do ou cetona lires ou hidratados. @stes poderão redu#ir certos =ons metálicos contidos em reagentes especiais. A maioria destes reagentes contém sais de cobre e são usados para pesquisa de a,(cares redutores. Um destes reagentes é o de BENEDICT que contém sul)ato c(prico carbonato de sódio e citrato de sódio. @ste (ltimo composto produ# um comple$o a#ul com cobre dialente e isto eita a )orma,ão de hidró$ido c(prico insol(el no meio alcalino6

+uprocitrato +u2R3 9ob a,ão de um agente redutor o cobre dialente é redu#ido a cobre monoalente que não pode )ormar um comple$o sol(el com o citrato. +onseqIentemente o cobre precipita sob a )orma de hidró$ido cuproso de cor amarela. 0or aquecimento o hidró$ido cuproso passa a ó$ido cuproso de cor ermelha6 redutor 2R

+uprocitrato +u 3 sol(el a#ul

+A"EB>"A'9

→

calor R

hidró$ido cuproso +u 3 insol(el amarelo

→

  ó$ido cuproso+uR3 insol(el ermelho

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* a AULA

TÉCNICA Narcar & tubos e colocar em cada um ! ml do reatio de Eenedict.  Ao tubo 1 adicionar 1 ml de solu,ão de glicose  Ao tubo 2 adicionar 1 ml de solu,ão de )rutose  Ao tubo ! adicionar 1 ml de solu,ão de sacarose  Ao tubo & adicionar 1 ml de água destilada tubo controle3 +olocar todos os tubos no banho-maria )erente por ! min. "etirar os tubos e anotar os resultados em )orma de tabela.  que concluiu T

=7 TESTE DE IODO Bdenti)ica,ão de polissacar=deos.  Alguns polissacar=deos reagem com iodo )ormando produtos coloridos. +om o amido a cor  é a#ul com o glicogênio é castanho-aermelhado. s monossacar=deos não reagem. %o amido é a )ra,ão não rami)icada amilose3 que é responsáel pela )orma,ão do comple$o da cor a#ulP a amilopectina reage de )orma semelhante ao glicogênio.

TÉCNICA Narcar ! tubos e distribuir neles6 'ubo 1 - 2 ml de amido 1 : 'ubo 2 - 2 ml de glicose 1 : 'ubo ! - 2 ml de água destilada tubo controle3  Aos ! tubos adicionar duas gotas da solu,ão de Lugol. @ste reatio é uma solu,ão de poliiodetos produ#idos por dissolu,ão de iodo metálico numa solu,ão de iodeto de potássio e ele reage como se )osse iodo elementar. Anotar os resultados em )orma de tabela.

REVERSÃO DA REAÇÃO DO IODO PELO CALOR +olocar o tubo 1 do ensaio anterior no banho-maria )erente por alguns minutos até o desaparecimento da cor a#ul. "es)riar em água corrente.  que obserou T  A cadeia da amilose )ra,ão não rami)icada do amido3 tem a con)orma,ão de uma hélice que absore o iodo no interior da espiral. @ste comple$o )orma-se por intera,;es )racas que podem ser des)eitas pelo calor.

+A"EB>"A'9

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 a AULA

0IDRÓLISE DO AMIDO  ai+" quando tratado por um ácido a quente so)re uma hidrólise sucessia dando árias de$trinas e como produtos )inais maltose e glicose.  As de$trinas têm tamanhos di)erentes mas conseram em princ=pio a estrutura em hélice do amido. @m consequência as de$trinas absorem o iodo e sua rea,ão com o reatio de L-&", gera solu,;es coloridasP as di)eren,as de colora,ão permitem classi)icar as di)erentes de$trinas.  reatio de L-&", é uma solu,ão de poli-iodetos produ#idos por  dissolu,ão de iodo metálico numa solu,ão de iodeto de potássio e ele reage como se )osse iodo elementar3. As cores obseradas são as seguintes6  ANB>  ANBL>@^'"B%A @"B'">@^'"B%A  A+"B>@^'"B%A

cor a#ul cor ro$a cor alaran@%'BJB+A>9

"ea,ão de Eenedict

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/ a AULA

LIPÍDIOS 27 SAPONIFICAÇÃO +olocar num tubo de ensaio grande 2* $ 277 mm3 cerca de 7* g de gordura animal e adicionar 17 ml de solu,ão alcoólica de _? 7* % e$tremamente corrosia não aspirar com a boca usar pipeta de 17 ml3.  Adaptar ao tubo de ensaio um tubo condensador cheio de água de torneira que irá minimi#ar a eapora,ão do álcool. +olocar o conVEIS POR REDISSOLUÇÃO DOS 6CIDOS (RAXOS LIVRES7  Adicionar ao tubo da e$periência 2 que contém a maior parte dos ácidos gra$os isolados 17 ml de água destilada e * ml de solu,ão alcoólica de _? 7* % e$tremamente corrosia não aspirar com a boca usar pipeta de 17 ml3. Lear ao banho maria por ! minutos.  Agitar. bserar a )orma,ão de espumas. +onserar o conte(do do tubo para a e$periência seguinte.

=7 FORMAÇÃO DE SABÕES INSOL>VEIS 'omar 2 tubos de ensaio e pipetar em cada um 2 ml da solu,ão de sab;es sol(eis obtida na e$periência anterior. Ao primeiro adicionar 17 gotas de solu,ão de cloreto de cálcio *: e ao segundo 17 gotas de solu,ão de acetato de chumbo 17 :. bserar a )orma,ão de precipitados sab;es insol(eis de cálcio e chumbo além dos respectios hidró$idos3.

?7 REAÇÃO DO COLESTEROL COM O REATIVO DE LIEBERMAN'BURC0ARD +olocar 1 ml de uma solu,ão dilu=da de colesterol em um tubo de ensaio limpo e seco.  Adicionar 17 gotas de anidrido acético e ! gotas de ácido sul)(rico concentrado os dois reatios são e$tremamente corrosios não aspirar com a boca usar pipeta de 17 ml3. bserar após alguns minutos o aparecimento de uma colora,ão eserdeada. @sta rea,ão de

LB0Z>B9

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/ a AULA mecanismo o$idatio identi)ica os esteróides que possuem dupla liga,ão entre os carbonos * e  anéis A e E3 como o colesterol.

+L@9'@"L

LB0Z>B9

+V'B% +A"E`%B+ 0@%'A@%ZLB+

17

4 a AULA

IDENTIFICAÇÃO DE 6CIDOS NUCLÉICOS s ácidos nucléicos presentes num tecido especialmente o >%A3 podem estar  )irmemente ligados a cátions ou a prote=nas catiSnicas tais como histonas e protaminas.  Assim estas prote=nas estarão presentes etermina,;es quantitatias )oram procedidas usando esta rea,ão con)orme 9chneider  ?oogebom e >ische  9ch]art# 15!/3. R ?+l "ibose

→

R orcinol Jur)ural

→

>eriado 'ri)enilmetano

%o passado a rea,ão da di)enilamina com deso$irribose )oi muito utili#ada para identi)icar e determinar quantitatiamente o DNA rea,ão descrita por >ische em 15!7 e mais usada na sua ersão modi)icada por Eurton em 15*3.  >%A em meio ácido é hidroli#ado libertando deso$irribose e esta atraés do seu grupamento +? lire reage com a di)enilamina com )orma,ão de composto de cor a#ul com absor,ão a 77 nm.

TÉCNICA 1. bten,ão de homogenato de )=gado de rato. 2. @$tra,ão de ácidos nucleicos do homogenato. !. Bdenti)ica,ão de DNA no e$trato ácido pela rea,ão da di)enilamina. &. Bdenti)ica,ão de RNA no e$trato ácido pela rea,ão do orcinol.

PROCEDIMENTO 27

O@!en)*" +e e!ra!" #i+" +e #i+"% n-#,.i#"%7

1.1. ?omogeni#ar o )=gado de um rato em noe olumes de sol. ácido c=trico 2:. 0ipetar 2 ml do homogenato num tubo de centr=)uga e adicionar 1 ml de sol. ácido tricloroacético 27 :. Agitar. >ei$ar em repouso por 17 minutos. 1.2. +entri)ugar a 2777 rpm por 17 minutos. >espre#ar o sobrenadante. 1.!. Ao sedimento ácidos nucleicos e prote=nas3 ecantar o sobrenadante para um tubo de ensaio limpo o sobrenadante conterá quase todo "%A e >%A e$istente nos 2 ml de homogenato usados inicialmente3.

37 I+en!ii#a)*" +"% #i+"% n-#,ei#"% n" e!ra!" #i+"7 2.1. I+en!ii#a)*" +" DNA. 0ipetar num tubo de ensaio 2 ml do sobrenadante da etapa 1.* e em outro tubo 2 ml de água destilada Eranco3. Adicionar aos dois tubos 2 ml do reatio da di)enilamina corrosio não aspirar com a boca usar pipeta de 17 ml3.  Agitar. Aquecer os dois tubos a 177o + por 17 minutos.  que obserouT 2.2. I+en!ii#a)*" +" RNA. 0ipetar num tubo de ensaio 72 ml do sobrenadante da etapa 1.* e em outro tubo 72 ml de água destilada Eranco3. Adicionar aos dois tubos 74 ml de água destilada e 2 ml do reatio de orcinol corrosio não aspirar com a boca usar  pipeta de 17 ml3. Agitar. Lear ao banho maria )erente por 17 minutos.  que obserouT

B>@%'BJB+ACD >@ V+B>9 %U+LMB+9

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