Aplicaciones de La Electroforesis Capilar en La Industria Cervecera

APLICACIONES DE LA ELECTROFORESIS CAPILAR EN LA INDUSTRIA CERVECERA F. X. CASTAÑÉ SITJAS 1, M. VERA SOLER 1, C. ESCUDERO PÉREZ 2 S.A. DAMM - BARCELONA. INSTITUTO QUÍMICO DE SARRIÁ - BARCELONA. 1

2

RESUMEN

SUMMARY

La electroforesis capilar es una técnica de separación que se está utilizando cada vez más en los laboratorios de análisis, ya que ofrece grandes ventajas. Esta técnica tiene múltiples aplicaciones en la industria cervecera, especialmente en el análisis de sustancias iónicas o fácilmente ionizables. En el presente artículo se describen métodos adecuados para el análisis, mediante esta técnica, de aniones, cationes, ácidos orgánicos y azúcares en cerveza, en mosto y en aguas empleadas para su fabricación. Asimismo, también se han realizado los correspondientes ensayos para validar estos métodos en lo que respecta a precisión, exactitud, linealidad y recuperación, obteniéndose resultados satisfactorios que muestra que es una técnica eficaz y apropiada para este tipo de análisis.

The capillary electrophoresis is a separation technique which is more frequently used on all the analytical laboratories, because it has big advantages. It has numerous applications on the brewing industry, specially on the analysis of ionic compounds or easily ionizables ones. In this paper we describe the methods for the analysis , using this technique, of anions, cations, organic acids and sugars from beer, wort and production waters. We have also validated the methods according their accuracy, precision, linearity and recovery, obtaining satisfactory results.

INTRODUCCIÓN

tarse la muestra, por el extremo del capilar correspondiente al ánodo, el potencial hace que los analitos cargados positivamente (cationes) migren hacia el cátodo, primero los más cargados y de menor tamaño, y luego los menos cargados y de mayor tamaño, y poco antes de llegar al extremo del cátodo serán captados por el detector. Los analitos neutros no se verán influenciados por el potencial pero se moverán hacia el cátodo, arrastrados por el flujo electroosmótico, a la misma velocidad que éste, y por tanto, serán detectados después de los cationes. Por último, los analitos cargados negativamente (aniones) migrarán hacia el ánodo, pero el flujo electroosmótico puede arrastrarlos, a todos o a algunos de ellos, hacia el cátodo, siendo detectados, por tanto, al final del análisis, después de los analitos neutros, siendo los aniones más cargados y de menor tamaño los últimos en llegar. El orden de llegada al detector, y por tanto, el orden en el electroferograma será: cationes, neutros y aniones. Pero cuando lo que nos interesa analizar son aniones tenemos la posibilidad de invertir la polaridad del sistema (polaridad negativa), de manera que los analitos y el flujo electroosmótico ahora irán del cátodo al ánodo, y el orden de llegada será al revés: aniones, neutros y cationes.

QUÉ ES LA ELECTROFORESIS CAPILAR La electroforesis capilar es una técnica de separación que actualmente está adquiriendo cada vez mayor importancia en la industria alimentaria. Esta técnica se basa en la diferente movilidad (movilidad electroforética) de las sustancias en solución bajo la acción de un campo eléctrico. La separación de las sustancias se lleva a cabo en el interior de un tubo capilar, normalmente de sílice fundida, cuyas dimensiones oscilan entre 10-100 cm de longitud y 25-100 µm de diámetro interno, lleno de una solución tampón. Una fuente de alimentación de corriente continua suministra un elevado potencial (varias decenas de kV), y gracias a la conductividad eléctrica del tampón se origina una diferencia de potencial entre los extremos del capilar. Cada sustancia introducida en el capilar se desplaza por su interior a una velocidad que depende de su carga eléctrica global, su estructura y el potencial aplicado, que son los responsables principales de la separación. Los dos extremos del capilar se sumergen en dos viales que contienen el tampón. En estos viales también están sumergidos los electrodos conectados a la fuente de energía, que al aplicar el potencial crean un flujo de cargas positivas que van del ánodo al cátodo: el flujo electroosmótico. Al inyec-

La separación electroforética depende, en gran medida, de las cargas de los analitos, y por consiguiente, está muy influenciada por el pH del tampón, ya que cambios en el pH pueden convertir analitos neutros en cargados, y viceversa, variando así su movilidad. Esta técnica, por sus características de funcionamiento basadas en la carga de las moléculas, es adecuada para el análisis de sustancias iónicas o fácilmente ionizables, tales como cationes y aniones orgánicos e inorgánicos, ácidos orgánicos, azúcares o aminoácidos, siendo de las pocas técnicas que permiten el análisis de moléculas de elevado peso molecular, como las proteínas. Esto supone una gran variedad de compuestos, algunos de los cuales son estudiados en este artículo. Para establecer un método que permita separar y cuantificar una serie de analitos en una matriz determinada, se deben optimizar las diferentes condiciones que influyen en la separación, hasta obtener la selectividad y sensibilidad deseadas. Las principales condiciones a optimizar son el voltaje ➥

CERVEZA Y MALTA

– 47 –

XL (4), 160, 2003, 47-54

aplicado, la temperatura del capilar, el volumen de muestra inyectado, la longitud del capilar, el tampón y el pH del tampón. El tampón y su pH son posiblemente los factores más importantes a considerar, y de su correcta elección depende, en gran parte, el éxito de la separación, ya que para poder separar dos analitos similares, el pH del tampón debe encontrarse entre el valor de pKa de uno y el del otro, y de esta manera se consigue que uno esté ionizado y el otro no. La electroforesis capilar puede llegar a límites de detección de mg/l a µg/l, dependiendo del tipo de detector utilizado. El detector UV-Visible, que es el que nosotros utilizaremos, está en el rango de mg/l, y requiere que los analitos tengan capacidad de absorber la luz de esta zona del espectro (UV-Visible). Pero si esta condición no se da en los analitos, como pasa en nuestro caso, se puede hacer una detección por fotometría indirecta, en la que el tampón es el que absorbe y lo que se detecta es la disminución de absorción cada vez que un analito pasa por la zona de detección.

Es una técnica joven en la que se están continuamente desarrollando nuevos métodos y cuya principal ventaja consiste en el bajo coste invertido en el análisis, comparado con otras técnicas.

APLICACIONES EN LA INDUSTRIA CERVECERA EQUIPOS Y MATERIAL La electroforesis capilar cuenta con muchas aplicaciones en la industria alimentaria. Hasta la fecha se han realizado varias investigaciones que muestran como esta técnica puede utilizase para la determinación de aniones, cationes, ácidos orgánicos, azúcares, aminoácidos, proteínas, colorantes, edulcorantes, flavonoides y vitaminas en alimentos. De todas ellas cabe destacar los trabajos realizados por T. Soga et al., en los cuales mediante la utilización del tampón de ácido 2,6-piridindicarboxílico y bromuro de cetiltrimetilamonio (CTAB) se consigue una correlación de hasta 0,999 entre la electroforesis capilar y otros métodos de separación cromatográfica. Concretamente, vemos como en el sector del vino se ha determinado el sulfito, con las siguientes condiciones:

Todos los experimentos se han llevado a cabo utilizando un equipo de Electroforesis Capilar (CE) de Agilent Technologies (Waldbronn, Alemania), que incluye la unidad de CE, con un detector UV-Vis diode array, y el software Chemstation para el control del sistema, adquisición de datos y procesado de datos. El agua utilizada ha sido previamente tratada mediante un sistema purificador Milli-Q, de Millipore (Bedford, USA). MÉTODOS A continuación se presentan cuatro métodos de análisis por electroforesis capilar de aplicación en la industria cervecera.

– capilar de sílice fundida 1 = 72 cm, id = 75 µm – tampón Organic Acids Buffer for HPCE (pH=5,6) de Agilent Technologies – inyección: 100 mbars, V = -25 kV, T = 20° C – detección: λ señal = 350 nm (Bw: 20 nm), λ ref = 200 nm (Bw: 10 nm)

1. ANIONES EN AGUAS Y CERVEZA 1.1. Método Este método permite cuantificar la concentración a la que se encuentran los principales aniones (cloruros, nitratos, sulfatos y fosfatos) en la cerveza y en las aguas utilizadas para su fabricación.

También se ha determinado la concentración de los ácidos caproico y caprílico, con las mismas condiciones descritas antes pero con tampón de 5mM ácido 2,6-piridindicarboxílico y 0,5mM bromuro de cetiltrimetilamonio (CTAB) a pH de 5,6.

1.1.1. Preparación de la muestra

De forma análoga, en la industria cervecera encontramos múltiples aplicaciones de la electroforesis capilar, especialmente para el análisis de sustancias iónicas o fácilmente ionizables. Se obtienen muy buenos resultados en la utilización de esta técnica para la cuantificación de los diferentes aniones inorgánicos y cationes, especialmente útil en el control de cervezas y aguas que son materia prima para la fabricación de la cerveza. También es una aplicación de gran interés la determinación de los ácidos orgánicos presentes en la cerveza, ya que permite elaborar una relación de las rutas metabólicas durante el transcurso de la fermentación y una correlación de éstas con el aroma y sabor final de la cerveza. La cuantificación de los azúcares presentes en el mosto y cervezas, que era realizada habitualmente por HPLC, también se puede resolver por electroforesis capilar, siendo ésta una forma fiable y de bajo coste para evaluar un perfil elemental del mosto. Además, la cuantificación de ciertas sustancias, como el calcio y el oxalato, es de gran utilidad debido a su relación con la estabilidad de la cerveza.

Las muestras de agua no requieren de ningún tratamiento previo a su inyección en el sistema de electroforesis capilar. Sin embargo, en las aguas de algún pozo, en las descalcificadas o en las de red, se ha observado que su alto contenido en algunos de los aniones da lugar a picos excesivamente grandes que se superponen entre ellos o que incluso llegan a eclipsar picos contiguos de otros aniones que se encuentran en menor concentración, impidiendo su cuantificación. Por este motivo conviene, en algunos casos, diluir estas muestras con agua ultrapura, siendo conscientes de que esto supondrá un aumento de los límites de cuantificación y de la incertidumbre en los resultados obtenidos del análisis. Por tanto, las muestras se diluyen desde 1:1 hasta, a veces, 1:10, en aquellas aguas muy salinas. Conviene, por consiguiente, un método robusto para minimizar esta incertidumbre, y tener en cuenta que se debe diluir siempre lo mínimo posible. Las muestras de cerveza se desgasifican antes de realizar el análisis, y luego se diluyen o no, en función de la concentración de sus sales.

En este artículo se describen los métodos para el análisis de aniones, cationes, ácidos orgánicos y azúcares, en cerveza, en el mosto y en las aguas empleadas para su fabricación, así como los resultados obtenidos en las validaciones realizadas de dichos métodos. CERVEZA Y MALTA

1.1.2. Patrones Se preparan soluciones patrón de concentración 1000 mg/l, en agua ultrapura, con las sales de cada uno de los aniones ➥

– 48 –

XL (4), 160, 2003, 47-54

a analizar: cloruro de sodio (NaCl), nitrato de potasio (KNO3), sulfato de sodio decahidrato (Na2SO4.10H2O) y fosfato de dihidrogenopotasio (KH2PO4). A partir de estas soluciones se preparan, por dilución, las soluciones patrón que se utilizarán para la cuantificación de las muestras, mediante recta de calibración. Estas soluciones patrón contienen todos los aniones a analizar y corresponden a las concentraciones de 5, 10, 25, 50 y 100 mg/l.

tiene una forma ancha y poco simétrica que en algunas ocasiones puede hacer algo más difícil su cuantificación. Esto es debido a que el método está adaptado para el análisis de los aniones cloruros, sulfato y nitrato, que se pueden determinar satisfactoriamente con un tiempo de análisis de tan sólo 4 minutos. Alargando el tiempo de análisis hasta 10 minutos el anión fosfato también se determina. Los ensayos de precisión, recuperación, exactitud y linealidad estudiados muestran que el método es totalmente válido para estas determinaciones. Otra opción sería analizar los cloruros, sulfatos y nitratos siguiendo este método, y analizar el fosfato mediante otro método más específico para este anión, para acortar tiempos de análisis.

Para la cuantificación del nitrato en cerveza, debido a la baja concentración en que se encuentra, la concentración de este anión en los patrones será de 1, 2, 5, 10 y 20 mg/l. 1.1.3. Condiciones electroforéticas Para la separación y análisis de los aniones, las condiciones son las siguientes: • Capilar: capilar de sílice fundida de 48,5 cm de longitud efectiva y 50 µm de diámetro interno, con celda de detección de burbuja de 150 µm (p/n: G1600-60232) de Agilent Technologies • Tampón: Inorganic Anion Buffer for HPCE, pH 7.7 (p/n: 8500-6797) de Agilent Technologies • Inyección: 200 mbar (50mbar*4seg) • Polaridad: negativa (para que los aniones, que son los analitos, salgan en primer lugar) • Voltaje: 25 kV • Temperatura: 30° C • Detección: fotometría indirecta, tomando como señal λ = 350 nm (Bw: 80 nm) y como referencia λ = 245 nm (Bw: 10 nm), ya que los analitos no absorben en el UV-Visible, pero el tampón sí, y por tanto cuantificamos la disminución de la absorción al pasar los analitos por la zona de detección.

Electroferograma obtenido a partir de una muestra de cerveza diluida 1:10.

Antes de cada inyección se hace fluir tampón durante 3 minutos por el capilar, para acondicionarlo. El análisis durará unos 10 minutos.

Se ha realizado una validación del método a partir de patrones de los analitos y muestras de cerveza y agua de red, calculándose los parámetros de precisión, exactitud, linealidad en el rango de concentraciones de trabajo y recuperación de patrón añadido a la muestra para comprobar que la matriz no interfiere en el resultado. Los resultados obtenidos en la validación se muestran en las siguientes tablas: % Recuperación: El estudio de la recuperación de cada anión en la matriz real se ha llevado a cabo mediante la adición a tres alícuotas de 5 ml de muestra, de 100, 250 y 500 µl de un patrón que contiene los cuatro aniones estudiados en una concentración tal que las concentraciones finales de estas alícuotas con la adición sean un 20%, un 50% y un 100% superiores, respectivamente, a la concentración original de cada anión en la muestra. Después a estas alícuotas con adición se les realiza la misma dilución que a las de muestra sin adición y se analizan del mismo modo. Los resultados que se muestran en las tablas son los promedios de los porcentajes de recuperación obtenidos con cada adición. En todos estos aniones la recuperación supera el 90%, indicando esto que, tanto en la cerveza como en las aguas estudiadas, la matriz no interfiere en el análisis de dichos aniones y que, por tanto, la calibración puede realizarse mediante recta de patrones externa.

Electroferograma obtenido a partir de una muestra de cerveza diluida 1:10.

1.2. Resultados Los tiempos de migración promedio de los aniones analizados han sido los siguientes: Anión cloruro sulfato nitrato fosfato

Precisión:

tM 2,82 2,95 3,16 7,84

La precisión del método para cada anión se ha determinado a partir del análisis de 10 alícuotas procedentes de la misma muestra, calculándose el coeficiente de variación entre las concentraciones obtenidas en cada alícuota. Según los coeficientes de variación máximos aceptados por Kolthoff y Horwitz para cada orden de concentración de analito en las muestras, el método cumple los requisitos de

min min min min

Se observa que el pico correspondiente al fosfato tiene un tiempo de migración mucho mayor que los otros aniones y CERVEZA Y MALTA

➥

– 49 –

XL (4), 160, 2003, 47-54

2. CATIONES EN AGUAS Y CERVEZA 2.1. Método Siguiendo este método se cuantifica la concentración a la que se encuentran los cationes sodio, potasio, calcio y magnesio, en la cerveza y en las aguas utilizadas para su fabricación. Del mismo modo, también se comprueba la ausencia del catión amonio, tanto en la cerveza como en las aguas. 2.1.1. Preparación de la muestra Las muestras de agua no requieren de ningún tratamiento previo a su inyección en el sistema de electroforesis capilar. Sin embargo, al igual que en el método para la determinación de los aniones, algunas de las aguas presentan un alto contenido en algunos cationes, lo que hace necesario diluir las muestras con agua ultrapura para evitar que los picos del electroferograma se solapen. Normalmente, una dilución 1:5 es suficiente, como en el caso del análisis de muestras de agua de red que ha dado lugar a la tabla de resultados presentada más adelante, pero en aguas como las descalcificadas, que tiene una alta concentración en sodio, o las de pozo, pueden ser necesarias diluciones mayores, y en aguas como las osmotizadas y las mezcladas no suele ser necesario realizar ninguna dilución. Así pues, se precisa un planteamiento previo al tratamiento de muestra.

precisión exigidos, manteniendo una buena repetitividad con todos los aniones estudiados. En el caso del fosfato, su ausencia en agua de red no ha permitido el cálculo de este parámetro en esta matriz. En cervezas sí que se ha podido calcular, ya que en ellas sí que encontramos este anión, procedente de la materia mineral de otras materias primas empleadas en su elaboración. Linealidad: La linealidad en el rango de concentraciones trabajo se obtiene mediante el cálculo del coeficiente de regresión cuadrado de la recta de calibración de cada anión. Este coeficiente deberá ser mayor de 0,99 para que se considere que la relación entre las concentraciones y las áreas de pico es lineal.

Las muestras de cerveza se desgasifican antes de realizar el análisis, y luego se diluyen 1:5 con agua ultrapura, por el mismo motivo que en las aguas. 2.1.2. Patrones Se preparan soluciones patrón de concentración 1000 mg/l, en agua ultrapura, con las sales cloruro de cada uno de los cationes a analizar: cloruro de sodio (NaCl), cloruro de potasio (KCl), cloruro de calcio (CaCl2), cloruro de magnesio (MgCl2) y cloruro de amonio (NH4Cl). A partir de estas soluciones se preparan, por dilución, las soluciones patrón que se utilizarán para la cuantificación de las muestras, mediante recta de calibración. Estas soluciones patrón contienen todos los cationes a analizar y corresponden a las concentraciones de 5, 10, 25, 50 y 100 mg/l.

Exactitud: La exactitud del método se ha calculado a partir del error relativo entre la concentración de los patrones obtenida por la cantidad pesada, y la concentración calculada de cada uno de estos patrones mediante la interpolación en las rectas de calibración obtenidas. En las tablas se muestra el % error relativo promedio para cada anión. Para las concentraciones de los límites inferior y superior de cada anión, se ha comprobado que cumplen el test de la t de Student para un intérvalo de confianza del 95%, calculando la t experimental según la siguiente fórmula: texp= (Xp– Xc *√n)/SR. Puesto que las concentraciones de los límites son las que suelen presentar una mayor distorsión, podemos decir que el método cumple los requisitos de exactitud en todo el rango de concentraciones de trabajo.

2.1.3. Condiciones electroforéticas Para la separación y análisis de los cationes, las condiciones son las siguientes: • Capilar: capilar de sílice fundida de 48,5 cm de longitud efectiva y 50 µm de diámetro interno, con celda de detección de burbuja de 150 µm (p/n: G1600-60232) de Agilent Technologies • Tampón: Cation Buffer for HPCE (p/n: 5064-8203) de Agilent Technologies • Inyección: 200 mbar (50mbar*4seg) • Polaridad: positiva • Voltaje: 30 kV • Temperatura: 30° C • Detección: fotometría indirecta, tomando como señal λ = 340 nm (Bw: 80 nm) y como referencia λ = 210 nm (Bw: 20 nm).

Rango de trabajo: El rango de trabajo es el intervalo de concentraciones entre el patrón de menor concentración y el de mayor concentración. La concentración de las muestras analizadas (una vez hecha la correspondiente dilución) debe encontrarse dentro de este rango de trabajo, para que su concentración pueda calcularse por interpolación en la recta. El método permite bajar el rango de concentraciones de trabajo siempre que sea necesario, sin sobrepasar los límites de cuantificación, que son de 1 mg/l para nitratos y sulfatos, de 3 mg/l para cloruros y de 5 mg/l para fosfatos. Esto se ha realizado sin problemas para la determinación del nitrato (NO3-) en algunos tipos de aguas y cervezas, bajándose el rango a 1-20 mg/l, ya que en ellas este anión está ausente o en concentraciones extremadamente bajas.

Antes de cada inyección se hace fluir tampón durante 3 minutos por el capilar, para acondicionarlo. El análisis durará 5 minutos. 2.1.4. Método específico para el potasio En aquellas aguas con un contenido muy bajo en potasio, este catión se determina siguiendo un método de electroforesis capilar diferente específico para el potasio, que es más sensible a este catión, para hacer posible su cuantificación (siempre que su concentración sea superior al límite de cuantificación que es de 2 mg/l). En este caso, la mues-

Estos resultados de la validación indican que el método ofrece resultados fiables y es válido para la determinación de la concentración de cloruros, sulfatos, nitratos y fosfatos en cerveza y en aguas. Hay que tener presente que las muestras se deben diluir lo mínimo posible. CERVEZA Y MALTA

➥

– 50 –

XL (4), 160, 2003, 47-54

El análisis de cada inyección dura 5 minutos, pero se puede observar cómo en menos de 3 minutos (más los 3 minutos de acondicionamiento del capilar) se obtiene el análisis de cinco cationes. Con el método específico para el potasio, éste tiene un tiempo de migración promedio de 1,255 minutos.

tra no se diluye, ya que el método está pensado para que ningún otro catión interfiera con el pico del potasio, y siendo la concentración de potasio tan baja, si se diluyese la muestra no sería posible cuantificarlo. Para hacer la recta de calibración se preparan patrones de potasio solamente, de 5, 10, 25, 50 y 100 mg/l en agua ultrapura, a partir de la solución patrón de 1000 mg/l.

En cerveza:

Para la separación y análisis electroforéticos, se utiliza el mismo capilar que para los cationes, y un tampón de preparación propia 10 mM para-aminopiridina y 5 mM 18Crown, ajustado a pH de 6,1 con ácido fosfórico. Las condiciones electroforéticas son: inyección de 700 mbar (50mbar*14seg), polaridad positiva, voltaje de 30 kV, temperatura de 25° C y detección por fotometría indirecta, tomando como señal λ = 340 nm (Bw: 80 nm) y como referencia la λ = 210 nm (Bw: 20 nm). Antes de cada inyección se hace fluir tampón durante 3 minutos por el capilar, para acondicionarlo, y el análisis durará 3,8 minutos.

En agua de red:

2.2. Resultados

Siguiendo la misma pauta que en el método de los aniones, se ha realizado una validación del método a partir de patrones de los analitos y muestras de cerveza y agua de red, calculándose los parámetros de precisión, exactitud, linealidad en el rango de concentraciones de trabajo y recuperación del patrón añadido a la muestra. Los resultados obtenidos se están en las tablas que se muestran en esta página. En el agua de red analizada, el potasio se ha encontrado en concentraciones no cuantificables, es decir, por debajo de su límite de cuantificación, que con este método es de 2 mg/l. Por este motivo, a pesar de haber sido analizado siguiendo el método específico para el potasio, que es más sensible para este catión, no se ha detectado pico correspondiente al potasio que pudiese distinguirse bien del ruido de fondo. El cálculo de la precisión, en este caso se ha realizado mediante el análisis de 10 alícuotas del agua de red a la que se le había adicionado patrón de potasio de forma que su concentración final fuera de 5 mg/l.

Electroferograma obtenido a partir de una muestra de cerveza diluida 1:5.

El estudio de la recuperación muestra que la matriz no interfiere en el análisis de estos cationes, siendo las recuperaciones medias de entre un 96,4% y un 99,9%. Las rectas de calibración tienen unos coeficientes de regresión cuadrados superiores a 0,999 , lo cual indica una buena linealidad en el rango de concentraciones de trabajo de estos cationes, y los coeficientes de variación están dentro de los máximos aceptados por Kolthoff y Horwitz para su orden de concentración, indicando esto una buena repetitividad del método con todos los cationes estudiados. Respecto a la exactitud, cumple satisfactoriamente el test de Student para un intérvalo de confianza del 95% en todos los cationes estudiados, excepto en el sodio y en el potasio en cerveza, en los que el test no se ha cumplido para las concentraciones más bajas. En el caso del potasio, esto queda solucionado al determinarlo mediante el método específico para él, tal como se ha hecho en el análisis de las muestras de aguas. Y en el caso del sodio, esto coincide con la mayor variabilidad que ha presentado este catión en el análisis de las aguas, pudiendo estar ambos hechos relacionados con el aumento de error que se genera al diluir las muestras. No se debe despreciar el hecho de que en las concentraciones altas el sodio sí que cumple el test de Student, y de que, además, cuenta con un error relativo bajo, pudiéndose considerar, en conjunto, como un resultado aceptable. En el caso de que interese obtener resultados de mayor exactitud en este catión, se puede optimizar el método para este fin, disminuyendo el volumen de inyección para no tener que diluir las muestras o bajando el voltaje aplicado para aumentar la separación

Electroferograma obtenido a partir de una muestra de agua diluida 1:5.

Los tiempos de migración promedio de los cationes analizados han sido los siguientes: Catión amonio potasio sodio calcio magnesio CERVEZA Y MALTA

tM 1,43 1,57 1,85 2,00 2,11

min min min min min

➥

– 51 –

XL (4), 160, 2003, 47-54

entre los picos y así evitar que se solapen, aún a costa de aumentar el tiempo de análisis. Los límites de cuantificación alcanzados con este método son de 5 mg/l para el sodio y de 1-2 mg/l para el calcio y para el magnesio.

bién se puede hacer una dilución 1:10, para muestras que tengan una alta concentración de alguno de estos ácidos.

El análisis del amonio se realiza con el único objetivo de comprobar su ausencia, tanto en las aguas como en la cerveza. Igualmente, se ha estudiado su recuperación, su exactitud y su linealidad en el rango de concentraciones de trabajo (de 5 a 100 mg/l), mediante patrones, para tener la certeza de que el análisis de este catión es fiable. En ambas matrices se han obtenido unos resultados satisfactorios, con recuperaciones superiores al 90%, coeficiente de regresión cuadrado superior a 0,99 y una buena exactitud que cumple el test de Student para un intérvalo de confianza del 95%. Hay que señalar que en las muestras de cerveza aparece un pico en el electroferograma muy cerca del correspondiente al amonio, pero con un tiempo de migración de 1,38 minutos, menor que el del amonio, que es de 1,43 minutos. Este pico proviene de otros componentes de la matriz de la cerveza, y no tiene nada que ver con el amonio, por lo que en este caso hay que fijarse cuidadosamente en los tiempos de migración para que no haya confusiones. En el estudio de la recuperación se pueden distinguir estos dos picos consecutivos en el electroferograma: el primero es el de la matriz y el segundo el del amonio añadido a la muestra.

Se preparan soluciones patrón de concentración 1000 mg/l, en agua ultrapura, con cada uno de los ácidos orgánicos libres, o sus correspondientes sales de sodio, que suelen encontrarse en la cerveza: ácido oxálico, ácido málico, ácido cítrico, ácido succínico, ácido láctico, piruvato de sodio y acetato de sodio. A partir de estas soluciones se preparan, por dilución, las soluciones patrón que se utilizarán para la cuantificación de las muestras, mediante recta de calibración. Estas soluciones patrón contienen todos los ácidos orgánicos a analizar y corresponden a las concentraciones de 5, 10, 25, 50 y 100 mg/l.

3.1.2. Patrones.

3.1.3. Condiciones electroforéticas. Para la separación y análisis de los ácidos orgánicos, las condiciones son las siguientes: • Capilar: capilar de sílice fundida de 48,5 cm de longitud efectiva y 50 µm de diámetro interno, con celda de detección de burbuja de 150 µm (p/n: G1600-60232) de Agilent Technologies • Tampón: Organic Acids Buffer for HPCE (p/n: 8500-6785) de Agilent Technologies • Inyección: 100 mbar (50mbar*2seg) • Polaridad: negativa • Voltaje: 20 kV • Temperatura: 30° C • Detección: por fotometría indirecta, tomando como señal λ = 350 nm (Bw: 80 nm) y como referencia λ = 220 nm (Bw: 10 nm). Antes de cada inyección se hace fluir tampón durante 4 minutos por el capilar, para acondicionarlo. El análisis durará unos 7 minutos. 3.2. Resultados Los tiempos de migración promedio de los ácidos orgánicos analizados han sido los siguientes: Ácido Orgánico

Electroferograma obtenido a partir de una muestra de cerveza con una adición de amonio, potasio, sodio, calcio y magnesio de 51.2, 500, 60, 32.5 y 100 mg/l respectivamente, y diluida 1:5.

ácido ácido ácido ácido ácido ácido ácido

Los resultados de la validación indican que estos métodos ofrecen resultados fiables y son válidos para la determinación de la concentración de potasio, sodio, calcio y magnesio en cerveza y en aguas, teniendo en cuenta que para llegar a una mayor exactitud en el sodio debe optimizarse el método para este fin específico, al igual que se ha hecho con el potasio, estableciendo un método específico más sensible para este catión que permite determinarlo a concentraciones más bajas. Al igual que en el método de los aniones, para evitar aumentos en la variabilidad, conviene diluir las muestras lo mínimo posible.

oxálico málico cítrico succínico pirúvico acético láctico

tM 2,00 2,45 2,51 2,66 2,82 3,02 3,12

min min min min min min min

3. ÁCIDOS ORGÁNICOS EN CERVEZA 3.1. Método Este método nos permite determinar de forma rápida los principales ácidos orgánicos que suelen encontrarse en la cerveza ya elaborada. 3.1.1. Preparación de la muestra Las muestras de cerveza se desgasifican antes de realizar el análisis, y se diluyen 1:5 y 1:2 con agua ultrapura, para poder cuantificar correctamente todos los analitos sin que se solapen y por encima del límite de cuantificación. TamCERVEZA Y MALTA

Electroferograma obtenido a partir de una muestra de cerveza diluída 1:5. ➥ – 52 –

XL (4), 160, 2003, 47-54

Con este método, el análisis de cada inyección dura 7 minutos (más los 4 minutos de acondicionamiento del capilar), sin embargo, en vista de los tiempos de migración de los analitos, este tiempo se podría reducir a 5 minutos. Se ha dejado en 7 minutos ante la posibilidad de que alguno de los picos que salen después del láctico pudiera ser de interés.

4.1.1. Preparación de la muestra Antes de realizar el análisis, las muestras de mosto deben centrifugarse. El sobrenadante se debe pasar a través de un cartucho Sep-Pak C18 y a continuación a través de un filtro de 0,45 µm. Debido a la alta concentración a que se encuentran algunos azúcares en este tipo de mostos, las muestras se diluirán 1:100 con agua ultrapura, con el objetivo de que los picos no se solapen entre ellos y de que los azúcares mayoritarios no eclipsen a los minoritarios. En algunos casos puede ser necesario realizar también una dilución 1:25 para facilitar la cuantificación de la fructosa y la sacarosa, que son los azúcares minoritarios.

Siguiendo la misma pauta que en los métodos anteriores, se ha realizado una validación del método a partir de patrones de los analitos y muestras de cerveza, calculándose los parámetros de precisión, exactitud, linealidad en el rango de concentraciones de trabajo y recuperación del patrón añadido a la muestra. Los resultados obtenidos en la validación se muestran en la siguiente tabla:

4.1.2. Patrones Se preparan soluciones patrón de concentración 1000 mg/l, en agua ultrapura, con cada uno de los azúcares a analizar: glucosa, fructosa, sacarosa, maltosa y maltotriosa. A partir de estas soluciones se preparan, por dilución, las soluciones patrón que se utilizarán para la cuantificación de las muestras, mediante recta de calibración. Estas soluciones patrón contienen todos los azúcares a analizar y corresponden a las concentraciones de 50, 100, 250, 500 y 750 mg/l. 4.1.3. Condiciones electroforéticas Para la separación y análisis de los azúcares, las condiciones son las siguientes:

Excepto en el caso del ácido acético, los resultados obtenidos en recuperación, precisión y linealidad son satisfactorios, cumpliendo los límites de aceptación mencionados antes. En lo que se refiere a exactitud, el ácido oxálico ha dado un error relativo medio algo alto, debido a que su factor de respuesta es muy pequeño. Sin embargo, este ácido cumple el test de Student para un intérvalo de confianza del 95%, tanto en la concentración alta como en la baja. Hay que señalar que los ácidos cítrico, succínico, pirúvico y acético, cumplen este test de Student en las concentraciones altas, pero no en las más bajas, a pesar de que sus errores relativos no son muy grandes. Teniendo en cuenta que esta concentración que sufre más distorsión corresponde al límite inferior del rango de trabajo, 5 mg/l, y todos los ácidos estudiados se han encontrado a concentraciones superiores a los 25 mg/l, se puede considerar que esto no supondrá un inconveniente para realizar el análisis de estos ácidos de forma satisfactoria. Los límites de cuantificación alcanzados con este método son de 2-3 mg/l para el málico y el cítrico, y de 4-5 mg/l para los otros, siendo estos límites ampliamente superados por las concentraciones a las que estos ácidos suelen encontrarse en la cerveza.

• Capilar: capilar de sílice fundida de 56 cm de longitud efectiva y 50 µm de diámetro interno, con celda de detección de burbuja de 150 µm (p/n: G1600-61232) de Agilent Technologies • Tampón: 20 mM ácido 2,6-piridindicarboxílico y 0,5 mM bromuro de cetiltrimetilamonio (CTAB), ajustado a pH=12,3 con hidróxido de sodio 1N. • Inyección: 200 mbar (50mbar*4seg) • Polaridad: negativa • Voltaje: 10 kV • Temperatura: 20° C • Detección: por fotometría indirecta, tomando como señal λ = 350 nm (Bw: 80 nm) y como referencia λ = 275 nm (Bw: 30 nm). Antes de cada inyección se hace fluir tampón durante 3 minutos por el capilar, para acondicionarlo. El análisis durará unos 45 minutos. 4.2. Resultados Los tiempos de migración promedio de los azúcares analizados han sido los siguientes:

El ácido acético debe de analizarse mediante otro método, ya que los resultados obtenidos de este ácido no son tan buenos como los de los otros, debido a que en los patrones más concentrados su cuantificación se ve notablemente dificultada por lo que puede ser un desdoblamiento del pico o un pico interferente. Esto, sin embargo, no ocurre en las muestras de cerveza, en las que el pico del acético se puede distinguir con claridad y se cuantifica sin dificultad.

Azúcar fructosa glucosa maltosa maltotriosa sacarosa

tM 24,11 25,63 26,27 26,69 33,65

min min min min min

A la vista de los resultados obtenidos, podemos concluir que este método permite determinar las concentraciones a la que se encuentran los ácidos oxálico, málico, cítrico, succínico, pirúvico y láctico en la cerveza, de manera simultánea en menos de 7 minutos de análisis. A pesar de que en algunos de estos ácidos el método pierde algo de exactitud en las concentraciones más bajas, esto no supone problema a la hora de evaluar los productos metabólicos de la fermentación para correlacionarlos con el sabor de la cerveza. 4. AZÚCARES EN MOSTO 4.1. Método Este método permite determinar la concentración a la que se encuentran los azúcares presentes en el mosto generado en el proceso de elaboración de la cerveza y que acabará dando lugar a la cerveza. CERVEZA Y MALTA

Electroferograma obtenido a partir del patrón que contiene los cinco azúcares a 250 mg/l. ➥ – 53 –

XL (4), 160, 2003, 47-54

CONCLUSIONES Los resultados presentados en este artículo demuestran que la electroforesis capilar permite una buena linealidad y repetitividad en sus métodos de análisis, y alcanza límites de cuantificación suficientemente bajos, de entre 1 y 5 mg/l en aniones, cationes y ácidos orgánicos. Comparándola con otras técnicas habitualmente utilizadas para este tipo de análisis, como el HPLC, las volumetrías y las colorimetrías, la electroforesis capilar ofrece grandes ventajas: • Rapidez, con tiempos de análisis muy cortos y análisis simultáneo de varios compuestos en una misma inyección, siendo capaz de determinar 4 aniones en 10 minutos, 5 cationes en 3 minutos y 7 ácidos orgánicos en menos de 5 minutos. • Sencillez, ya que prácticamente no requiere preparación de la muestra, a diferencia de otras técnicas como HPLC o las colorimetrías. • Alto grado de automatización. • Prácticamente no tiene problemas de interferencia de la matriz. • No genera residuos tóxicos ni perjudiciales para el medio ambiente, al contrario que el HPLC, que genera grandes cantidades de residuos de costosa y difícil eliminación. • Bajo coste, gracias a su automatización, a que consume muy poca cantidad de reactivos y a que no genera residuos tóxicos.

Electroferograma obtenido a partir de una muestra de mosto diluida 1:100.

Siguiendo la misma pauta que en los métodos anteriores, se ha realizado una validación del método a partir de patrones de los analitos y muestras de mosto, calculándose los parámetros de precisión, exactitud, linealidad en el rango de concentraciones de trabajo y recuperación del patrón añadido a la muestra. Los resultados obtenidos en la validación se muestran en la siguiente tabla:

Por tanto, la conclusión es que la electroforesis capilar es una técnica rápida, sencilla y de bajo coste, fácilmente adaptable a las exigencias analíticas de la industria cervecera. BIBLIOGRAFÍA DABRIO, M.V. et al. “Cromatografía y electroforesis en columna”. Springer. 2000. SOGA, T., WAKAURA, M “Determination of Inorganic and Organic Anions in Beer and Wort by Capillary Electrophoresis”. J.Am.Soc.Brew.Chem. 55 (2), 44-46, 1997

El estudio de la recuperación muestra que la matriz no interfiere en el análisis de estos azúcares, siendo todas las recuperaciones medias superiores a un 90%. Las rectas de calibración tienen unos coeficientes de regresión cuadrados superiores a 0,99, lo cual indica una buena linealidad en el rango de concentraciones de trabajo de estos azúcares. Respecto a la exactitud, cumple satisfactoriamente el test de Student para un intérvalo de confianza del 95% en los cinco azúcares estudiados, excepto en la maltotriosa, en la que el test no se ha cumplido para las concentraciones más bajas, coincidiendo también con la obtención de un mayor error relativo medio en este mismo azúcar. Esto es debido a que el pico correspondiente a la maltotriosa está muy cercano al de la maltosa, produciendo esto un ligero error en su determinación, despreciable a concentraciones medias y altas, pero algo más significativo en las más bajas. Sin embargo, esto no afectará a la correcta determinación de la maltotriosa, ya que este es un azúcar mayoritario en los mostos y normalmente lo encontramos a concentraciones bastante altas. Los cinco azúcares cumplen los requisitos de precisión exigidos para su orden de concentración, aunque la maltotriosa y la sacarosa están en el límite, debido a la proximidad entre el pico de la maltotriosa y el de la maltosa, y al elevado tiempo de migración de la sacarosa, que implica una mayor variabilidad. Una menor dilución de la muestra, por ejemplo 1:25, permitirá una mejor cuantificación de los dos azúcares minoritarios, fructosa y sacarosa, y por tanto, al ser sus picos más grandes, se obtendrá mayor precisión y exactitud en sus resultados.

SOGA, T. “Analysis of Inorganic and Organic Anions by Capillary Zone Eletrophoresis”. Hewlett-Packard Application Note, Publication Number 12-5965-5744E, 1996. SOGA, T., ROSS, G.A. “Capillary Electrophoretic Determination of Inorganic and Organic Anions using 2,6-pyridinedicarboxylic acid: Effect of Electrolyte’s Complexing Ability”. J. Chromatogr. A, 767 (1997) 223-230. SOGA, T. “Simultaneous Analysis of Inorganic Anions, Organic Acids, Amino Acids and Carbohidrates using the Agilent Basic Anion Buffer”. Agilent Technologies Application Note, Publication Number 5968-7715E, 2000. SOGA, T., SERWE, M. “Rapid Monitoring of Carbohydrates in Food with Capillary Electrophoresis”. Agilent Technologies Application Note, Publication Number 5968-69855E, 1999. SOGA, T. “Capillary Zone Electrophoresis of Carbohydrates by Borate Complexation Utilizing EOF Reversal”. Hewlett-Packard Application Note, Publication Number 12-5964-1817E, 1995. SOGA, T. “Protein Characterization by Peptide Mapping Using Capillary Electrophoresis”. Hewlett-Packard Application Note, Publication Number 5962-9801E, 1993. HEIGER, D., WEINBERGER, R. “Determination of Small Ions by Capillary Zone Electrophoresis with Indirect Photometric Detection”. Hewlett-Packard Application Note, Publication Number 12-5963-1138E, 1994.

Los resultados obtenidos muestran que el método permite una correcta cuantificación de estos cinco azúcares (fructosa, glucosa, maltosa, maltotriosa y sacarosa) en los mostos.

CERVEZA Y MALTA

ROSS, G.A. “Instrumental Validation in Capillary Electrophoresis and Checkpoints for Method Validation” Accred. Qual. Assur. (1997) 2:275-284. – 54 –

XL (4), 160, 2003, 47-54