APLICACIÓN DEL MODELO CINÉTICO DE GOMPERTZ

 APLI  AP LICA CACI CIÓN ÓN DEL MO MODEL DELO O CI CINÉT NÉTIC ICO O DE GOMPERTZ  A LA IN INTER TERAC ACCI CIÓN ÓN DEL EFE EFECTO CTO DE LA TEMPERATURA SOBRE EL CRECIMIENTO DE LACTOCOCCUS LACTIS SUBSP SUBSP.. LACTIS  EN LECHE M.Sc. Blgo. Edgar Zárate Sarapura email: [email protected]

INTRODUCCIÓN es una bacteria ácido-láctica utilizada como cultivoo iniciador en productos lácteos fermentados. cultiv Lactococcus lactis subsp. lactis 

Se debe aprovechar el uso de bacterias probióticas como Lactococcus lactis subsp. lactis  que generan metabolitos (nisina) en los sustratos donde se reproducen que controlan el crecimiento de bacterias alterantes y patógenos específicos. Sin embargo su uso está determinado por el cabal conocimien conocimiento to de sus parámetros de crecimiento en circunstancias ambientales controladas para su máximo aprovechamiento. Por ello se hace necesario conocer la cinética de su crecimiento a diferentes temperaturas para lograr determinar el óptimo resultado mediante el uso de la microbiología predictiva implementada con modelos matemáticos primarios y  secundarios.

INTRODUCCIÓN El modelado matemático es una herramienta de gran g ran utilidad en tecnología de alimentos alimentos,, ya que permite analizar en forma cuantitativ cuantitativaa el comportamient comportamientoo microbiano en un determinado ambiente o sistema particular. La propiedad más importante de un modelo primario es que describa de forma adecuada el crecimiento de los microorganismos y permita obtener estimaciones precisas de los parámetros que caracterizan dicho crecimiento. La variabilidad de las estimaciones depende de la técnica usada para monitorear el crecimiento y del modelo usado. Para los modelos secundarios se han propuesto diferentes ecuaciones para expresar el crecimiento microbiano en función de la temperatura (Zwietering  et al. 1991). Los modelos más utilizados son el de Arrhenius y el de la raíz cuadrada. El modelo de la raíz cuadrada o modelo Ratkowzky et al. (1982) es una ecuación que describe la dependencia del crecimiento microbian microbianoo respecto a la temperatura, en condiciones por arriba de la temperatura óptima para el crecimiento microbiano.

INTRODUCCIÓN De todas los sustancias antimicrobianas producidas por las bacterias lácticas, las bacteriocinas aparecen como las más adecuadas desde un punto de vista tecnológico para ser utilizadas como conservantes de grado alimentario (de Vuyst y Vandame, 1994). En la actualidad la nisina es la única bacteriocina legalmente autorizada como conservante en aproximadamente 50 países (Delves-Broughton et al., 1996). La importancia del estudio radica en obtener respuestas como la tasa de crecimiento (µm ), fase de adaptación ( λ ), densidad poblacional máxima, tiempo para la formación de algún metabolito específico. Desde esta base científica se podrá desarrollar planes de explotación industrial de esta bacteria en diversas explotaciones biotecnológicas, desarrollo de proyectos de inversión en microbiología industrial, etc; quienes no tendrán necesidad de realizar la etapa exploratoria de evaluación del crecimiento ya que los resultados de éste estudio les entregan dicha información.

OBJETIVO

El estudio tuvo como objetivo principal aplicar el modelo cinético de Gompertz que se eligió para obtener el mejor ajuste a los valores poblacionales obtenidos experimentalmente para describir las curvas de crecimiento de Lactococcus lactis Subsp. Lactis, a cuatro temperaturas en estudio, dentro del rango de 10 a 40°C y a partir de las ecuaciones desarrolladas calcular los principales parámetros que describen el crecimiento microbiano (tiempo de adaptación, tasa máxima de crecimiento exponencial y tiempo de generación) a nivel del modelo primario y lograr finalmente, describir el comportamiento de estos parámetros, en función a la temperatura dentro del rango estudiado mediante el empleo de modelos secundarios

MATERIAL Y MÉTODO

Del medio y condiciones del cultivo.

Se utilizó como medio de cultivo la leche en polvo descremada, libre de inhibidores, reconstituida al 10% en agua. El medio de cultivo, convenientemente homogenizada, se esterilizó en autoclave a 121 °C durante 20 minutos y a 15 lb de presión.

MATERIAL Y MÉTODO De la obtención de las curvas y parámetros del crecimiento

Se utilizaron 180 tubos de vidrio con tapa rosca, estériles y con capacidad para 25 mL, en los cuales se dispensaron 10 mL de leche reconstituida estéril. El total de tubos fueron divididos en 4 grupos experimentales de 45 tubos cada uno y cada grupo se incubó, en forma correspondiente, a las temperaturas 10, 20, 30 y 40 °C con una variación de ± 0,1°C, lo cual se consiguió utilizando un baño de circulación termorregulado con refrigeración, marca Mettler Modelo 3422  A cada uno de los tubos se les inoculó con 0.1 mL de cultivo logarítmico de Lactococcus lactis Subsp. Lactis, proveniente de una suspensión de células en suero fisiológico, con un nivel 0.5 de la escala de MacFarland.

MATERIAL Y MÉTODO De la obtención de las curvas y parámetros del crecimiento

Para cada temperatura se incubaron 45 tubos en las condiciones descritas y dependiendo de la relación tiempo-temperatura en estudio, fueron retirados del baño 3 tubos, tomándose de inmediato alícuotas de 1.0 mL de cada uno de ellos para medir por duplicado las UFC/mL del L. lactis, utilizando el método de siembra por incorporación en Agar M-17 con glicerofosfato y lactosa al 10%, en forma tal de obtener una representación de toda la curva de crecimiento, fase de adaptación, de crecimiento exponencial y comienzo de la fase estacionaria, durante un periodo de 24, 48 y 24 horas, para 10 ºC, 20 ºC, 30 ºC y 40 ºC, respectivamente y  en los cuales se obtuvieron las iteraciones a intervalos convenientes para cada caso.

MATERIAL Y MÉTODO Del análisis del modelo primario

Los datos del crecimiento (UFC/mL) para cada temperatura fueron incorporados como variable dependiente en el modelo de crecimiento de Gompertz de cuatro parámetros, mientras que el tiempo de incubación (t) se incorporó como variable independiente. Luego se introdujo la ecuación correspondiente al modelo descrito y sus  variables al computador utilizando el Programa Curve expert 1.0 y se efectuó el proceso analítico hasta encontrar el punto de convergencia, en el cual los parámetros de regresión (A, C, b y M) consiguen una magnitud apropiada, ajustando de la mejor forma posible la relación entre las  variables.

MATERIAL Y MÉTODO Del análisis del modelo primario Modelo de Gompertz:

log N=A+C.exp[-exp (-b(Tiempo - M))]

Donde: logN: es el logaritmo común de poblaciones bacterianas (UFC/mL). Tiempo: Es el periodo de incubación, es la variable independiente (horas).  A, C, b y M: son los parámetros de ajuste del modelo y representan a la curva de crecimiento por todo el ciclo computacional iterativo:  A es el logaritmo común de la población inicial en UFC/ml (inóculo), C es el logaritmo común de la diferencia entre la población inicial y final en la fase estacionaria; b representa la pendiente de la curva y describe la tasa de crecimiento; y  M es el tiempo en el cual la tasa de crecimiento es de mayor magnitud.

MATERIAL Y MÉTODO Del análisis del modelo primario Utilizando los parámetros de ajuste del modelo de Gompertz, se calcularon la fase de adaptación ( λ ), la tasa máxima de crecimiento exponencial (µmáx ) y el tiempo de generación (Tg), como descriptores microbiológicos a ser utilizados para efectos de predicción de la población en un tiempo dado y en cada temperatura incluida en el rango de estudio (10-40 °C), a tal efecto, se utilizaron las siguientes expresiones matemáticas: Fase de latencia o adaptación ( λ ): ( λ )= M – 1/ B+ ((log N – A)/((b × C)/exp(1)))

 Tasa específica de crecimiento (µm): [log (UFC/mL)/h] = b × C/exp (1)  Tiempo de generación (Tg): [h] = exp(1) × log (2)/b× C

MATERIAL Y MÉTODO Del análisis con el modelo secundario

La fase de adaptación ( λ ), tasa máxima de crecimiento exponencial (µm ) y  tiempo de generación (Tg  ) fueron incorporados a los modelos secundarios que mejor ajustaron sus valores en todo el rango térmico estudiado y  en los cuales se integraron los datos provenientes de todas las temperaturas en estudio. Se utilizó el modelo hiperbólico para modelar la fase de adaptación, el cual modela el logaritmo neperiano de la fase de adaptación ( λ ) = p / (Temperatura – q)) donde p y q representan los parámetros de ajuste de la ecuación.

MATERIAL Y MÉTODO Del análisis con el modelo secundario

Para modelar el efecto de la temperatura sobre la tasa específica de crecimiento (µm ) se utilizó el modelo de la raíz cuadrada, modificada por Ratkowsky para su uso incluso más allá de la temperatura óptima de crecimiento. La ecuación de regresión no lineal utilizada en el proceso iterativo hasta lograr la menor suma de residuales, fue la siguiente:

√µm= (bx(Temp.- Tmin )) x (1-exp(c*Temp. - Tmax )) donde b y  c son los parámetros de regresión del modelo; y  Tmin y Tmax corresponden a las temperaturas mínima y máximas a las cuales puede crecer la cepa de L. lactis estudiada, siendo ajustados también por el modelo.

MATERIAL Y MÉTODO Del análisis con el modelo secundario

El tiempo de generación o tiempo de doblaje, fue descrito por un modelo hiperbólico, cuya ecuación describe la interacción de la curva de crecimiento con la temperatura y fue similar a la utilizada para la fase de adaptación;  Tg = p / (Temperatura – q) donde p representa la disminución del tiempo de generación en la medida en que se aumenta la temperatura y q representa la temperatura a la cual el tiempo de generación es infinito. Obtenidos todos los puntos experimentales, se efectuó el análisis de regresión no lineal correspondiente a todos los modelos secundarios descritos hasta obtener el mejor ajuste, con lo cual se obtuvo los descriptores de crecimiento definitivos que resultan válidos a cualquier temperatura dentro del rango entre los 10 y 40 °C.

MATERIAL Y MÉTODO Técnicas estadísticas

Los ajustes de las curvas de crecimiento al modelo de Gompertz y raíz cuadrada se utilizaron mecanismos de regresión lineal en SPSS 12.0. Una vez ajustada la recta de regresión a los datos observados log (UFC/mL), se dispuso de una medida que valore la bondad de ajuste realizado y que permita decidir si el ajuste lineal es suficiente o se deben buscar modelos alternativos, por lo que se determinó el Coeficiente de correlación que mide la proporción de variabilidad total de la variable dependiente, respecto a su media que es explicado por el modelo de regresión. Las diferencias significativas entre los parámetros de crecimiento obtenidas a diferentes temperaturas se obtuvieron a través del análisis de  varianza [ F(n=3; α=0.05) ]. Las comparaciones entre datos de origen y estimados por lo modelos se diferenciaron a través del diseño estadístico t-Student (p≤0.05).

RESULTADOS La leche reconstituida al 12% permitió el crecimiento favorable a temperaturas de 10, 20, 30 y 40 ºC. La temperatura óptima de crecimiento se estimó a 30 ºC en donde se establecen 29.77 duplicaciones (n) y una tasa relativa (r) de 2.48. Existe diferencia estadísticamente significativa entre las respuestas del crecimiento a las temperaturas empleadas, siendo este factor la causa del aceleramiento o retardo del crecimiento. (p=1,6014E-15). Ver cuadro 1.

RESULTADOS Utilizando el modelo primario de Gompertz se obtuvieron los parámetros de ajuste A, C, b y M, agrupados por temperaturas de 10, 20, 30 y 40 ºC. Se observa que en la medida que se incrementa la temperatura los parámetros b y C se incrementan, en tanto que M disminuye, excepto cuando el cultivo se expone a la temperatura de 40 ºC que hace que el parámetro b y C disminuya y M aumente. Existe efecto estadísticamente significativo de las temperaturas sobre los parámetros de crecimiento. (p= 8,94E-09). Ver cuadro 2.

RESULTADOS Existe una elevada correlación (r ) indicando la bondad del modelo primario de Gompertz que ajusta los datos experimentales para describir el comportamiento del crecimiento de Lactococcus lactis Subsp. Lactis  y que la relación de la sumatoria de los Residuales y el número de iteraciones indica que el error es bastante aceptable. Ver cuadro 3.

RESULTADOS La fase de latencia ( λ ) y el tiempo de generación (Tg) se hacen mínimos en la medida que la temperatura se incrementa. Excepto, cuando la temperatura alcanza el valor de 40 ºC, mientras que la tasa máxima de crecimiento exponencial (µ max ) muestra un comportamiento inverso. Ver cuadro 4.

RESULTADO Se determinaron los estimadores p y q de los modelos secundarios para la fase de adaptación ( λ ) y tiempo de generación (Tg  ), los cuales fueron incorporados al modelo correspondiente para la predicción de los parámetros microbiológicos en función de la temperatura. Se establecieron las siguientes ecuaciones de predicción: ( λ )= 31.55 /(Temperatura-4.02) y   Tg = 14.19/(Temperatura-7.42)  Aplicando los modelos secundarios se estimaron los tiempos de la fase de adaptación y generación. El coeficiente de correlación obtenido para el tiempo de adaptación es de r = 0.94, y para el tiempo de generación (r ) = 0.91.

RESULTADOS Los valores de los residuales indican un error muy bajo y por lo tanto un buen ajuste de los datos. No se encontró diferencia significativa (p>0.05) entre el valor de origen y el estimado, para ambos parámetros de crecimiento. Ver cuadro 5.

RESULTADOS La tasa de crecimiento se modeló utilizando la ecuación de la raíz cuadrada de Ratkowsky, que para su ejecución se estimaron previamente los valores para los cuatro parámetros o estimadores: b= 0.042, c= 4.39, Tmin= 0.05 y Tmax = 56.5. √ìmax = (0.042*(T- 4.00))* (1 –  exp (0.05* (T  –  53.01)))

Los resultados estimados para la tasa específica de crecimiento según el modelo secundario no se diferencian estadísticamente del estimado por el modelo primario de Gompertz.

RESULTADOS Se puede inferir que el uso del modelo secundario de la raíz cuadrada predice la tasa de crecimiento máximo de Lactococcus lactis Subs. Lactis  en leche reconstituida al 12%, a temperaturas diferentes a las experimentadas, en forma directa. Ver cuadro 6.

DISCUSIÓN

Se utilizó leche descremada al 12% como sustrato natural para el crecimiento de Lactococcus lactis Subs. Lactis obteniendo óptimos resultados aún a temperatura de 10 ºC. El aporte del 12% de sòlidos totales en la leche permite el crecimiento, del mismo modo que encontró Faría (2002) que determinó que el adicionamiento de 12 a 15% de sólidos totales de la leche, permite cultivos con densidades poblacionales de 106 a 109, producidos en un periodo de tiempo de 48 horas y expuestos a temperaturas de 35 ºC.

DISCUSIÓN

La fase de latencia a 10 ºC es muy extensa culminando a las 17,43 horas. Durante el tiempo de adaptación muchas células bacterianas contenidas en el inóculo pueden morir y sólo las que sobrevivieron establecieron la curva de crecimiento cuya tasa de crecimiento total fue de 0.08 logUFC/mL/h; mientras que las temperaturas de 20, 30 ºC establecieron mayores tasas de crecimiento. Cabe mencionar que a la temperatura de 40 ºC se produce una disminución de la tasa de crecimiento en relación a la de 20 y 30 ºC, debido probablemente a que muchas actividades metabólicas de la bacteria no se ejecutan eficientemente y la bacteria entra en un proceso de declive o muerte celular. Chacon (1992) encontró resultados similares estableciendo que los mejores aislamientos del género Lactococcus se efectúa a los 30 ºC y la tasa de crecimiento general de 0,24 Log UFC/mL/h. (Cuadro 1).

DISCUSIÓN

DISCUSIÓN

El modelo de Gompertz ajustó las curvas de crecimiento en forma eficiente, utilizando la mayor cantidad de iteraciones estimando un crecimiento idealizado basado en los datos experimentales. El estudio reporta que la temperatura óptima es de 30 ºC, en donde el crecimiento logarítmico es de 0,51 Log UFC/mL/h y el tiempo para alcanzar el máximo crecimiento fue de 2,98 horas. Además se puede apreciar como los  valores del r2 son elevados, lo cual indica la bondad del modelo para el ajuste de los datos analizados, más aún cuando el análisis de los residuales es muy pequeño indicando que el error experimental es mínimo. Las otras temperaturas ofrecieron menores valores debido a que afectan de alguna forma la cinética de crecimiento. Estos valores son aproximados a los reportados por  Valbuena y col. (2005) que para el parámetro b es 0.32 y 4.21 para M. (Cuadro 2).

DISCUSIÓN

DISCUSIÓN Observando los gráficos de las curvas de crecimiento se establece que la fase de adaptación, considerando que es la proyección de una línea recta tangencial a la línea de crecimiento exponencial, hasta el eje de las ordenadas (tiempo), reflejan que en todos los casos la cantidad del inóculo o población inicial fue apropiada y que dependiendo del incremento de la temperatura el tiempo de adaptación disminuye, excepto para 40 ºC, en el cual se incrementa. Respuestas parecidas tienen los parámetros tasa específica del crecimiento (µmax) y el tiempo generacional (tg). Se destaca que la mejor expresión del crecimiento es a los 30 ºC en los cuales se registra un tiempo de adaptación de 1,608 horas, tasa de crecimiento logarítmico de 1,09 Log UFC/mL/h y que el tiempo que requiere para duplicarse es de 0,27 horas.

DISCUSIÓN  Todos los valores de los parámetros cinéticos del crecimiento hallados mediante las ecuaciones propuestas se corroboran gráficamente que corresponden a la realidad. Las figuras 1, 2, 3 y 4 permiten apreciar lo mencionado anteriormente. Comparativamente encontramos que Lade (2006) reporta valores de 1,89 h, 1,16 Log UFC/mL/h y 0,22 h, respectivamente. Asimismo, Cayré (2007) halló para los mismos parámetros y en forma respectiva los siguientes valores, 1,78 h, 1.35 Log  UFC/mL/h y 0,19 h. Estos datos permite afirmar que los ensayos realizados ofrecen respuestas fisiológicas bastantes homogéneas de Lactococcus lactis Subs.. Lactis  dentro su temperatura óptima de crecimiento.

DISCUSIÓN

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