Analyse Microbiologique d'Eau

1. Introduction : L’eau est l’élément le plus demandé et le plus essentiel dans la vie. On l’utilise quotidiennement pour différentes applications, par exemple l’alimentation et le lavage des aliments ou de matériels… Et pour ces buts ou d’autres l’eau doit représente des qualités microbiologique et physico-chimiques satisfaisantes. Dans cette TP nous sommes plus intéressants par le recherche dans l’échelle microbiologique, l’orientation de TP été vers : la réalisation des analyses sur l’eau, le rechercher des différents types des germes, la comparaison entre les germes présent dans deux types d’eau (eau potable (de robinet) et l’eau pollué) en plus l’identification des germes. Notre groupe a été choisi pour les recherches dans l’eau pollué. Les germes visés pour la recherche sont : -les germes aérobies mésophiles et psychrophiles dans le milieu PCA gélosé : cette recherche indique plusieurs critères ; l’origine de cette eau, les traitements qu’il a subi. C’est à dire une évaluation de cette eau, un indicateur de la qualité générale et de la stabilité. La recherche des germes à 20°C indique la recherche des germes pathogènes ou résistants. -les coliformes totaux à 30°c dans le milieu BCPL : permet de signalé une contamination fécale d’origine animale, c'est-à-dire une évaluation de risque de présence des germes pathogènes. -les streptococcus type D dans le milieu Rothe : c’est une recherche d’un germe pathogène. Pour l’évaluation des risques sanitaires de cette eau.

2. Matériel et méthodes : a.matériel : Les verreries : Tube à essais, boite de pétri, des portoirs à tubes, flacons, pipettes pasteur, pipettes à 5ml et à 1ml, des lames, des lamelles, cloche de Durham. (Tout le matériel doit être stérile). Les appareils : Microscopes, Compteur colonie, incubateur, bec bunsen. Les milieux de cultures utilisés : 

Représenté dans l’annexe I

Les indicateurs chimiques : Rouge de méthyle, réactif de Vogs-Proskauer, le réactif de Kovacs. 1

d. méthodes d’analyse : 1. le premier jour : Pour la recherche des FAMT/FAPT : On a réalisé des dilutions à partir de

la solution mère. Trois tubes contiennent 9 ml d’eau

physiologique stérile préparées par l’enseignant, avec une pipette stérile de 1 ml on ajout 1 ml à partir de flacon qui contient la solution mère et met dans le premier tube «c’est le tube de dilution (10-1) », après une homogénéisation été réalisée. Avec la mémé pipette on a prend 1 ml à partir de tube de dilution (10-1) et met dans le deuxième tube « c’est le tube de dilution (10-2) ». Avec la mémé pipette on a prend 1 ml à partir de tube de dilution (10-2) et met dans le troisième tube « c’est le tube de dilution (10-3) ». Après On a met 1 ml de solution de dernier tube de dilution (10-3) dans chaque boites pétri. Après on a collé les boites par 10 à 15 ml de milieu PCA préparé et liquidifié par l’enseignant et on a effectué des mouvements en forme de ∞ pour bien mélanger l’inoculum, après la solidification de milieu on a incubé les boites à 30°C et 20°C pendant 72 heures. (Selon le schéma 1).

Eau à analysé 10-1

10-2

10-3

1 ml

1 ml

PCA PCA

Incubation à 37°C et à 20°C.

10-2

37°C

EP2

2

10-3

20°C

EP2

Pour la recherche des coliformes totaux : La méthode utilisée c’est « 333 », dans la quelle, on a utilisé neuf tubes remplies (9 ml) par le milieu BCPL et chaque tube contient une cloche de Durham préparé par l’enseignant, par différents concentrations, trois tubes doubles concentrés (D/C) et six simple concentrés (S/C). Pour les trois tubes doubles concentrés on a ajouté 10 ml d’eau à partir de la solution à analysée, On a ajouté 1 ml de la même solution dans trois tubes simples concentrés et 0.1 ml (=trois gouttes par pipettes pasteur) de la solution mère dans les trois tubes simples concentrés qui restes. Il faut bien mélanger les tubes et chasser le gaz dans les cloches. Après on a l’incubation à 37°C pendant 24 à 48 h. (Selon le schéma 2).

Eau à analysé

10 ml

Double concentré

1 ml

0.1 ml

simple concentré

simple concentré

L’incubation à 37°C pendant 24 à 48 h. Pour la recherche des streptococcus type D : La méthode utilisée c’est « 511 », dans la quelle, on a utilisé septe tubes remplies (9 ml) par le milieu Rothe préparé par l’enseignant, par différents concentrations, cinq tubes doubles concentrés (D/C) et deux tubes sont simple concentrés (S/C).

3

Pour cinq tubes doubles concentrés on a ajouté 10 ml d’eau à partir de la solution à analysée, On a ajouté 1 ml de la même solution dans un tube simple concentré et 0.1 ml (=trois gouttes par pipettes pasteur) de la solution mère dans un tube simple concentré qui reste. Après on a l’incubation à 30°C pendant 24 à 48 h. (Selon le schéma 3).

Eau à analysé

10 ml

0.1 ml

1 ml

Double concentré

simple concentré

Incubation à 30°C pendant 24 à 48 h 2. le deuxième jour : 

On a fait la lecture des résultats et le dénombrement sur touts les milieux à l’aide des tableaux de l’indice NPP.



On a essai d’observer les germes présent dans le milieu Rothe à l’aide de microscope photonique.



A partir de milieu BCPL (seulement les tubes positifs et de préférence les tubes doubles concentrés positifs) on a fait un repiquage sur le milieu BCPL gélosé pour but de séparer les colonies produites pour être facile à identifie, ce repiquage faite par culture en surface, on a met la pipette pasteur dans le milieu BCPL et faire des stries sur la gélose collé déjà sur les boites et refroidie, l’inoculum été ensemencé à 30°C pendant 24. (Selon le schéma 4).

4

Tube +

BCPL

37°C

EP2

Incubation à 37°C pendant 24h. 3. le troisième jour : 

On a essai une autre fois d’observer les germes présent dans le milieu Rothe à l’aide de microscope photonique.



A partir de milieu BCPL gélosé on a prend une colonie par la pipette pasteur et met dans trois différents tubes par différent mode d’ensemencement, le premier tube est collé par le milieu citrate de Simmons (solidifié en position inclinée) l’ ensemencement fait par des stries sur la surface de la pente par pipettes pasteur, le deuxième est collé par le milieu Kigler-Hajana (solidifié en position semi-inclinée) l’ ensemencement fait par piqure centre (dans le culot) après des stries sur la surface de la pente par pipettes pasteur, le troisième tube est remplis par le milieu Clark et Lubs (milieu liquide) l’ ensemencement fait par l’entrée de la pipettes pasteur dans le milieu, les trois tubes sont pour but d’identification biochimique de la colonie sélectionnée, les trois tubes sont ensuite incubées à 30°C pendant 24h. (Selon le schéma 5).

5

Milieu Citrate de Simmons

Milieu KiglerHajana

Milieu Clark et Lubs

L’eau peptonée

Incubation à 37°C pendant 24h. 4. le quatrième jour : 

On fait la lecture des résultats sur le milieu PCA (lecture après 72h).



La lecture directe de résultat sur le milieu Citrate de Simmon et de milieu Kigler-Hajana.



On a divisé la culture de milieu Clark et Lubs dans deux tubes, dans le premier tube on a ajouté des gouttes de solution rouge de méthyle, dans le deuxième tube on a ajouté des goutte de αnaphtol(VP1) et des gouttes de solution de soude à 16% (VP2). le principe de ces réactifs dans l’annexe II.

4. Résultat et discutions : Pour la recherche des FAMT/FAPT : On a fait la lecture sur les boites qui contiennent le milieu PCA après 72h seulement la boite incubée à 30°C contient des colonies, trop chargé, pour facilite la lecture on a divisé la boite en quatre, on a estimée le nombre des colonies présentent d’un quart, il est de 145 colonies à peut prés. Alors le nombre des bactéries dans 1ml de solution égale : 6

N = (150 ×4) ×102 = 60000 UFC/ml. Donc le nombre des bactéries aérobies mésophiles totale présentent dans cette eau égale 60000 bactéries par un millilitre. (Schéma 6).

150 colonies

PCA

10-2

37°C

EP2

Pour le dénombrement des coliformes totaux : Le dénombrement se fait à partir des tubes s tubes dits positives sont : 

Les tubes à virage de couleur (couleur jaune).



présentent un dégagement de gaz (les cloches rempliées par le gaz).

Par la méthode NPP on a estimée le nombre des coliformes totaux présentent dans l’eau, la méthode de calcule est la suivante :

+

3×10

3×1

3×0.1

D/C

S/C

S/C

+ 3

+

+

+

+

3

+

+ 3

7

+

Le nombre 333 correspond à > 1100 dans le tableau NPP. Donc le nombre des bactéries calculés égale : (1100 × 10) = >11000 bactéries dans 100ml. L’identification biochimique des coliformes: Les souches pressentant dans le La boite appartient à la famille d’entérobactérie les tests suivants utilisés pour l’identification des genres de cette famille, notre colonie choisis présente les caractères suivants : Indole

RM

VP

Citrate

Escherichia coli

+

+

-

-

Enterobacter

-

-

+

-

Klebsiella

-

-

+

-

citrobacter

-

+

-

+



la réaction d’ RM : cette réaction rendre la teinture de milieu en rouge, montre que le pH de milieu est inférieur à 4.5, Donc RM positive.



La réaction VP : dans notre cas cette réaction ne produise pas une coloration rouge à la surface de tube (la coloré été jaune foncé), indiqué l’absence d’acétoïne. Donc VP négative.



Indole : l’apparition d’un anneau rouge en surface par l’ajout de réactif de Kovacs, indique la présence d’indole. Avec la colonie choisis l’anneau rouge n’apparaisse pas. Donc indole négatif.



Citrate : l’utilisation (dégradation) de citrate traduit par l’alcalinisation de milieu et changement de couleur vers le bleu, notre milieu reste vert donc la souche sélectionnée n’utilise pas le citrate. Donc elle est citrate négatif.



Lactose, glucose, H2S, gaz : la lecture directe sur le milieu après 24h d’incubation, donne les résultats suivantes : dans le culot, le virage au jaune traduit par une acidification due à l’utilisation du glucose (glucose+), l’apparition de bulles dans le culot traduit par la production de gaz (gaz+), un noircissement du à la formation de sulfure de fer (H2S+), dans la pente le virage au jaune due à la persistante de l’acidification( la souche utilise le glucose qui est en faible quantité, après elle utilise le lactose), donc lactose (+).

À partir de ces résultats les caractères de cette souche sont similaires avec sels d’Escherichia coli, donc on peut dire que la souche choisis est Escherichia coli.

8

Recherche des streptococcus groupe D: Les tubes dits positifs sont les tubes présentant un trouble microbien La lecture sur le milieu Rothe après 24h à 30°C est la suivante :

+

+

5×10

1×1

1×0.1

D/C

S/C

S/C

_

_

0

0

+

+

_

4

Le nombre « 400 » correspond à 15 dans le tableau NPP. Donc le nombre des bactéries égale : 15 bactéries dans 100ml.

5. Conclusion : A partir des analyses qu’on les fait, on peut évaluer la qualité de cette eau. Le nombre énorme de FAMT indique que cette eau ne subi aucun traitement. Encore les résultats d’analyses de coliformes confirment la pollution et la contamination (d’origine animale) de cette eau, l’identification de genre E.coli et la présence des streptococcus affirme la présence des germes pathogènes dans l’eau. La conclusion des analyses induisent que l’eau analysé est impropre à la consommation par ce que il est contaminé, donc il faut prend des précautions lors de la manipulation de cette eau. Autre information sont acquises dans cette TP par exemple : L’application des certains techniques tel que le prélèvement, l’ensemencement, le collage des boites, l’incubation, le repiquage, la réalisation des tests biochimiques et quelques techniques de lavage et de stérilisation des matériels. Aussi l’évaluation des risques sur le manipulateur.

9

Annexe I : Tableau représente les milieux de cultures utilisées et leurs compositions.

Le milieu La composition Milieu PCA gélosé Peptone (plate count Extrait de levure agar) Glucose Gélose

pH

Remarque

5g 2.5 g 1g 15g

7.2

Milieu BCPL (bouillon lactosé au pourpre de bromocrésol) Milieu Rothe (bouillon)

Peptone Extrait de viande Lactose Pourpre de bromocrésol

5g 3g 10 g 25 mg

7

Peptone Glucose Chlorure de sodium Phosphate bipotassique Phosphate monopotassique Azide de sodium

20 g 5g 5g 2.7 g 2.7 g 0.2 g

7

Milieu Simmons (gélose au citrate de Simmons)

Sulfate de magnésium Phosphate monoammonique Phosphate dipotassique Citrate de sodium Chlorure de sodium Bleu de bromothymol gélose Peptone Extrait de viande Extrait de levure Lactose Glucose Sulfate ferreux Chlorure de sodium Hyposulfite de sodium Rouge de phénl gélose Peptone Phosphate dipotassique Glucose Peptone exempte d’indole Chlorure de sodium

0.2g 1g 1g 2g 5g 80mg 12g 20g 3g 3g 10g 1g 0.3g 5g 0.3g 2.5mg 15g 10g 2g 5g 15g 5g

6.8

Solidifier en position inclinée

7.4

Solidifié en position semiinclinée

Milieu KliglerHajana (milieu lactose-glucoseSH2 de KliglerHajana)

Milieu Clark et Lubs L’eau peptonée

7

7.2

Annexe II : le principe des milieux d’identification. 10

Milieu Simmons :

C’est un milieu gélosé incliné contenant un indicateur coloré (Bleu de bromothymol). Le citrate est la seule source de carbone, la croissance cellulaire est accompagner fréquemment d’une alcalisation qui se traduit par le virage de milieu au bleu, donc citrate(+). Recherche d’indole :

L’indole est issu de l’hydrolyse du tryptophane. Après culture de 24h sur l’eau peptonée, l’indole est caractérisé par le réactif de Kovacs. Quelques gouttes de réactif sont ajoutées au milieu : après agitation, la présence d’indole se manifeste par apparition d’un anneau rouge en surface. Milieu Kligler-Hajana :

C’est un milieu gélosé semi-incliné, combiné, il permet la lecture des plusieurs caractères : utilisation du glucose, avec ou sans gaz, utilisation du lactose, production de H2S. Les principaux résultats : Zone du tube

Caractère recherché

aspect

Culot

glucose

Inchangé

Glucose -

Jaune

Glucose +

Jaune

Lactose -

rose

Lactose +

bulle

Gaz +

Inchangé

Gaz -

Noir

H2S +

Inchangé

H2S -

(anaérobiose) Pente (aérobiose)

Culot

lactose

Gaz en glucose

ou jonction culotpente

H2S

Conclusion

Milieu Clark et Lubs :

Permet d’établir la voie de fermentation subie par le germe cultivé. Soit la fermentation d’acides mixtes ou la fermentation butane-indole. Les réactions sont suivis par les deux réactifs ; Rouge de méthyle et de Vogs-Proskauer. La lecture des résultats : La réaction

teinte

L’indication

Résultat

RM

Rouge

pH6

RM+

Rouge

Présence d’acétoïne

VP+

aucune

Absence d’acétoïne

VP-

VP

11

12