Analyse Bactériologique

 

ANALYSE BACTERIOLOGIQUE D’UNE DENREE ALIMENTAIRE La prise d’essai: A -Bcas viande). -casdedeproduit produitsolide(exemple: liquide(exemple: jus).  

 

Références •

Norme NF Vdes 08- 010 :règles pour la préparation dilutions engénérales vue de l’examen microbiologique. • Norme NF EN ISO 6887-1 relative à la suspension mère et dilutions décimales;1.règle générale. • Norme NF V 08- 057- 2 Microbiologie alimentaire Directives générales générales pour la préparation des dilutions en vue de l’examen microbiologique. • Norme XP V 08 – 102 relative aux règles générales pour le comptage des colonies et l’expression des résultats. • Norme NF ISO 7218 :règles générales pour les examens microbiologiques. • Norme NF ISO 17025 relative aux prescriptions générales concernant la compétence laboratoire laboratoires s d’étalonnage et d’essais.des

 

A- Cas de produit solide. Peser dans un sachet stérile 3× 25 gr du produit à analyser aseptiquement.

25 gr 

BALANCE

La 1ère pesée servira au contrôle bactériologique. La seconde servira à la recherche des Salmonella et des shigella. La troisième servira à la recherche de Listéria.

 

La prise d’essai pour une analyse bactériologique classique: Verser le TSE dans le sachet stérile contenant 25 gr de produit à analyser. Broyer l’aliment 6 à 8 minutes. Verser le contenu dans le flacon de TSE.

BROYEUR  DE TYPE 

STOMACHER 

TSE 225 ml

(suspension mère) 10ˉ¹

 

La prise d’essai pour la recherche des Salmonella et des Listéria. Verser l’Eau Peptonée Tamponnée(Salmonella) et le bouillon Fraser(Listéria) dans le sachet stérile contenant 25 gr de produit à analyser. Broyer l’aliment 6 à 8 minutes. Verser le contenu dans les flacons respectives.

BROYEUR  DE TYPE  STOMACHER 

225 ml Eau Peptonée tamponnée

225 ml Bouillon Fraser 

 

B – Cas de produit liquide: Faire un mélanger de 3 à 5 unités du produit à analyser. JUS JUS JUS

JUS JUS

+1 Suspension mère

 

La prise d’essai pour les recherches des Salmonella et des Listéria. Prélever  2×25 ml de la

25 ml

25 ml

5 ml

Suspension mère.. mère

+1

Eau peptonnée FRASER

Listéria

tamponnée

Salmonella

 

PREPARATION DES DILUTIONS DECIMALES a - cas de produit solide. b - cas de produit liquide.

 

a - Cas de produit solide: Introduire 1 ml de la suspension 10ˉ¹ dans 9 ml de TSE. Mélanger,puis Mélanger ,puis prélever 1 ml de la dilution 10ˉ² et l’introduire l’introdui re ensuite dans 9 ml de TSE TSE. 1 ml

1 ml

1 ml 10ˉ²

10ˉ¹

Suspension

mère

9 ml de TSE

10ˉ³

 

b - Cas de produit liquide: Introduire 1 ml de la suspension +1 dans 9 ml de TSE. Mélanger,puis prélever 1 ml de la dilution 10ˉ¹ 10ˉ¹ et l’introduire ensuite dans 9 ml de TSE,mélanger, puis prélever 1 ml de la dilution 10ˉ² et l’introduire ensuite dans 9 ml de TSE pour obtenir obtenir la dilution 10³.

1 ml

1 ml 1 ml

1 ml 9 ml de TSE

9 ml de TSE

10ˉ³ 10ˉ¹

+1 suspension

Solution mère

10ˉ²

mère  

PARAMETRES RECHERCHES • • • • • • • •

Recherche et dénombrement des microorganismes totaux (Flore mésophile). Recherche et dénombrement des levures et moisissures. Recherche et dénombrement des Coliformes, Coliformes thermo tolérants et EscherichiaColi. Recherche et dénombrement des Anaérobies Sulfito – Réducteurs à 46°C. Recherche et dénombrement de Clostridium Perfringens à 37°C. Recherche et dénombrement des Staphylococcus aureus. Recherche des salmonelles. Recherche de Listéria.

 

RECHERCHE ET DENOMREMENT DES MICROORGANISMES PAR COMPTAGE DES COLONIES OBTENUES A 30 °C, DANS LES DENREES ALIMENTAIRES. Milieu utilisé: Gélose PCA

 

Références  Norme NF 08 – 051 relative au dénombrement des micro– organismes – méthode par comptage des colonies obtenues à 30°C. • Norme XP V 08 – 102 relative aux a ux règles générales pour le

•

comptage et l’expression des résultats. Norme NF des V 08colonies – 002:Microbiologie alimentaire – Directives générales pour les examens microbiologiques. • Norme NF V- 057- 2 Microbiologie alimentaire - Directives générales pour la préparation des dilutions en vue de l’examen •

microbiologique. Norme NF ISO 7218:règles générales pour les examens microbiologiques. • Norme NF ISO 17025 relative aux prescriptions générales concernant la compétence des laboratoires d’étalonnage et •

d’essais.

 

Inoculer les boites de pétri avec 1 ml des différentes dilutions. 1

1

ml

1 ml

10ˉ¹

1

ml

1 ml

10ˉ²

ml

1 ml

10ˉ³

 

Couler la gélose PCA ≈ 15 ml refroidie ≈ 45°C. Mélanger et laisser solidifier.  PCA

PCA

10ˉ¹

10ˉ²

10ˉ³

 

Couler une deuxième couche de gélose blanche ≈ 4 ml. Laisser solidifier. GELOSE

GELOSE

BLANCHE

BLANCHE

10ˉ¹

10ˉ²

10ˉ³

 

Incuber les boites couvercle en bas 72 ±3h à 30°C. 

Incuber 72h à 30°C

 

RECHERCHE ET DENOMREMENT DES MICROORGANISMES PAR COMPTAGE DES COLONIES OBTENUES A 30 °C, DANS LES DENREES ALIMENTAIRES.

1ère Lecture après 24h d’incubation

 

Dénombrer les colonies de formes formes lenticulaires qui poussent en masse et noter les dilutions correspondantes. Tenir compte des boites ayant un nombre compris entre 15 et 300.

Germes totaux

Germes totaux

 

RECHERCHE ET DENOMREMENT DES MICROORGANISMES PAR COMPTAGE DES COLONIES OBTENUES A 30 °C, DANS LES DENREES ALIMENTAIRES.

2ème Lecture après 48h d’incubation

 

Dénombrer les colonies de formes formes lenticulaires qui poussent en masse et noter les dilutions diluti ons correspondantes. Tenir compte des boites ayant un nombre compris entre 15 et 300.

Germes totaux

Germes totaux

 

RECHERCHE ET DENOMREMENT DES MICROORGANISMES PAR COMPTAGE DES COLONIES OBTENUES A 30 °C, DANS LES DENREES ALIMENTAIRES.

3ème Lecture après 72h d’incubation

 

Dénombrer les colonies de formes formes lenticulaires qui poussent en masse et noter les dilutions diluti ons correspondantes. Tenir compte des boites ayant un nombre compris entre 15 et 300.

Germes totaux

Germes totaux

 

Lecture et interprétation: Retenir 2 dilutions successives ( plus fortes dilutions) oū le nombre de colonies dénombréess soit : 15 ≤ c ≤ 300. dénombrée Appliquer cette formule:

∑ c  N 1,1 x d 

∑c :

c + c (c = nombre de 1 ère 2 1 colonies de la 1 dilution et c = nombre 2 ).  de colonies de la 2ème dilution ).  d : le taux de dilution de la 1ère boite retenue.

N

= nombre de

micro-organismes /gr ou ml  

RECHERCHE DES COLIFORMES PAR COMPTAGE DES COLONIES A 30°,35° OU 37° C DANS LES DENREES ALIMENTAIRES.

 

Références  •

Norme NF V 08-051:dénombrement par comptage des colonies,m colonies,méthode éthodedes de coliformes routine. • Norme NF V 08-017:dénombrement des coliformes fécaux et d’Eschérichia Coli(annexe NF V 08-015 et NF V08-016). •

Norme NFmicrobiologiques. ISO 7218:règles générales pour les examens • Norme NF V 08- 010 :règles générales pour la préparation des dilutions en vue de l’examen microbiologique. • Norme XP V 08-102:règles générales pour le comptage des colonies et l’expressi l’expression on des résultats:cas des dénombrements en milieu solide. • Norme NF ISO 17025 relative aux prescriptions générales concernant laboratoires laboratoire s d’étalonnage la compétence et d’essais.des

 

Milieu utilisé: VRBL: (gélose au cristal  Violet et au Rouge neutre,  Biliée et Lactosée). actosée).  

 

Inoculer la série de boites avec 1 ml des différentes dilutions. 1

1

1 ml

ml

10ˉ¹ 10ˉ¹

1 ml

ml

10ˉ²² 10ˉ

1

1 ml

ml

10ˉ³³ 10ˉ

 

Couler une couche de gélose de VRBL ≈ 15 ml, refroidie à la température ≈ 45± 1 °C. Mélanger et laisser solidifier.

VRBL

VRBL

 

 Incuber

la série de boites 24 ± 2 h à 30°,35° ou 37°C pour la recherche des coliformes.

24 ± 2 h à 37°C

24 ± 2 h à 37°C

24 ± 2 h à 37°C

 

Dénombrer les colonies rouges qui poussent poussent en masse , noter la dilution correspondante. Tenir compte des boites ayant un nombre compris entre 15 et 150. Colonies rouges 

Colonies rouges

 

Lecture et interprétation: Retenir 2 dilutions successives ( plus fortes dilutions) oū le nombre de colonies dénombrées soit : 15 ≤ c ≤ 150. Appliquer cette formule:

∑ c  N 1,1 x d 

∑c :

c + c (c = nombre de 1 ère 2 1 colonies de la 1 dilution et c = nombre de colonies de la 2ème dilution 2retenues).  retenues).  d : le taux de dilution de la 1ère boite retenue.

N

nombre de

 

RECHERCHE ETDES DENOMBREMENT COLIFORMES THERMOTOLERANTS ET ESCERICHIA COLI DANS LES DENREES ALIMENTAIRES.

 

Milieu utilisé: VRBL: (gélose au cristal  Violet et au Rouge neutre,  Biliée et Lactosée). actosée).  

 

Inoculer la série de boites avec 1 ml des différentes dilutions. 1

1

1 ml

ml

10ˉ¹¹ 10ˉ

1 ml

ml

10ˉ²² 10ˉ

1

1 ml

ml

10ˉ³³ 10ˉ

 

Couler une couche de gélose de VRBL ≈ 15 ml, refroidie à la température ≈ 45± 1 °C. Mélanger et laisser solidifier.

VRBL

VRBL

 

Incuber la série de boites 24 ± 2 h à 44°C.

24 ± 2 h à 44°C

24 ± 2 h à 44°C

24 ± 2 h à 44°C

 

Dénombrer les colonies rouges qui poussent poussent en masse , noter la dilution correspondante. Tenir compte des boites ayant un nombre compris entre 15 et 150. Colonies rouges 

Colonies rouges

 

LECTURE ET INTERPRETATION Comptage des coliformes termotholérants.

 

Retenir 2 dilutions successives ( plus fortes dilutions) oū le nombre de colonies dénombréess soit : 15 ≤ c ≤ 150. dénombrée Appliquer cette formule:

∑c :

N

∑ c  1,1 x d 

c + c (c = nombre de 1 ère 2 1 colonies de la 1 dilution et c = nombre 2 ).  de colonies de la 2ème dilution ).  d : le taux de dilution de la 1ère boite retenue.

 = nombre de coliformes

N

termotholérants /gr ou ml.

 

Recherche et dénombrement d’Escerichia Coli:

 

Repiquer 3 à 5 colonies caractéristiques sur le milieu Urée Indole.

 

Ensemencer le milieu Urée Indole.

 

Incuber le milieu Urée Indole ensemencé 24 h à 37°C.

UREE

 

Lecture du milieu Urée Indole. Production d’indole = formation

KOVACS

KOVACS

d’un anneau rouge.

indole   indole

E.Coli: urée -

indole

-

Indole +  

Lecture et interprétation.  Formule:

a =

b

x

c

A b : Nombre de colonies caractéristiques indole + c :

A : a :

Nombre total de colonies caractéristiques sur  la boite. Nombre de colonies caractéristiques repiqués. Nombre d’Escherichia Coli identifiés.

 

dilutions successives Retenir 2 dilutions ( plus fortes dilutions) oū le nombre de colonies dénombrées soit : 15 ≤ c ≤ 150. Appliquer cette formule:  

N

∑a=

∑

a 1,1 x d Nombre d’Escherichia Coli identifiés.  

d : le taux de dilution c correspondant orrespondant à la 1ére dilution retenue.

N = nombre d’Escherichia Coli /gr ou ml.

 

HERCHE DES SALMONEL DANS LES DENREES ALIMENTAIRES.

 

Références  •

•

Norme NF V 08 6- 052 relative à la méthode méthode de routine pour la recherche des Salmonella.

Norme EN 12824 relative à la recherche des Salmonella. • Norme NF ISO 17025 relative aux prescriptions générales concernant la compétence des laboratoires d’étalonnage et d’essais.

 

A - Cas de produit solide: Verser l’Eau Peptonée Tamponnée dans le sachet stérile contenant 25 gr de produit. Broyer l’aliment. Verser le contenu dans le flacon d’E.P.Tamponnée.

Eau

BROYEUR 

peptonnée

DE TYPE 

tamponnée

STOMACHER 

flacon de 225 ml

 

B - Cas de produit liquide. 25 ml 1

Introduire dans 225 ml d’Eau Peptonée Tamponnée

ml

Prélever  25 ml de la Suspension mère

Eau

(+1)

peptonnée tamponnée

+1

 

Étape de pré enrichissement: Incuber la solution ensemencée d’Eau Peptonée Tamponnée 16-20h à 37°C. Eau peptonnée tamponnée

INCUBER 16- 20h à 37°C

 

Étape d’enrichissement: d’enrichissement: Ensemencerr les bouillons de Rappaport Vassiliadis et Ensemence de sélénite à partir de la solution pré enrichie. 2 ml

0,1 ml

Bouillon

Bouillon

Rappaport

sélénite

Vassiliadis

SFB

RAPPAPORT

S/C

Eau

Incuber 18- 24h à 42°C

peptonnée tamponnée

Solution pré enrichie

Incuber 18- 24h à 37°C

 

Étape d’isolement: Milieux utilisés: Gélose Hektoen  Gélose au Vert Brillant et au Rouge

de Phénol.  

Isoler par des stries : a- Ensemencer une boite de gélose gélose Hektoen à partir du tube b- Ensemencer une boite de SFB. gé lose gélose au Vert Brillant et au rouge de phénol à partir du tube de Rappaport Vassiliadis.  Anse de platine SFB S/C

37°C

RAPPAPORT

42°C

18-24 h à 37 C  

Repiquer 5 colonies typiques de Salmonella sur le milieu TSI. Colonies ayant un contour régulier. Colonies ayant la couleur du milieu ,parfois avec ou sans centre noir sur la gélose Hektoen. Colonies de couleur rose sur la gélose V.BR.RP

.

.

.

 

Repiquer 5 colonies typiques de Salmonella sur le milieu TSI. Stries Anse de platine

faire une piqûre centrale.

Isoler par  des stries

Incuber 24h à 37°C  

Aspect d’un TSI de Salmonella.

TSI H2S

+

Gaz

+

TSI

H2S + Gaz

TSI

H2S Gaz

+

Pente

Pente

Pente

Rouge

Rouge

Rouge

Culot Noir 

Culot  Culot  Jaune

Culot  Culot  Jaune

Autres Salmonella

S.Typhi

S.Paratyphi A

 

Ensemencer une galerie biochimique. CITRATE DE SIMMONS CLARK ET LUBS

.

TEMOIN LDC ODC ADH ONPG UREE GN

 

Lecture de la galerie biochimique.

CLARK ET LUBS

Citrate de SIMMONS + RM

KOVACS

VP2 VP1

.

TEMOIN LDC ODC ADH ONPG UREE GN

-

+

-

 

Lecture de l’indole et de la TDA. UREE 2 gouttes de réactif  KOVACS

Pas de formation d’anneau rouge.

1 goutte de réactif TDA

Pas de virage.