Analisis Microbiológico de Agua y Hielo para Consumo Humano

 

ANALISIS MICROBIOLÓGICO DE AGUA Y HIELO PARA CONSUMO HUMANO.  OBJETIVOS  Diferenciar los organismos coliformes totales de los microorganismos coliformes fecales.   Evaluar la calidad sanitaria de muestras de agua mediante la búsqueda de microorganismos coliformes totales, coliformes fecales y Escherichia coli . Organizar e interpretar los resultados.  

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GENERALIDADES  Debido a que un gran número de enfermedades son transmitidas por vía fecal-oral utilizando como vehículo los alimentos y el agua, es necesario contar con microorganismos que funcione como indicador de contaminación fecal. Estos deben de ser constantes, abundantes y exclusivos de la materia fecal, deben tener una sobrevivencia similar a la de los patógenos intestinales y debe de ser capaces de desarrollarse extraintestinalmente extraintestinalmente.. El grupo coliforme es constante, abundante y casi exclusivo de la materia fecal, sin embargo, las características de sobrevivencia y la capacidad para multiplicarse fuera del intestino también se observan en aguas potables, por lo que el grupo coliforme se utiliza como indicador de contaminación fecal en agua; conforme mayor sea el número de coliformes en agua, mayor será la probabilidad de estar frente a una contaminación reciente. Cuando los coliformes llegan a los alimentos, no sólo sobreviven, sino que se multiplican, por lo que en los alimentos el grupo coliforme coliforme adquiere un significado distinto distinto al que recibe en el agua. agua. En productos alimenticios que han recibido un tratamiento térmico (pasteurización, horneado, cocción, etc.), se utilizan util izan como indicadores de malas prácticas sanitarias. Los microorganismos coliformes constituyen un grupo heterogéneo con hábitat primordialmente intestinal para la mayoría de las especies que involucra. El grupo de bacterias coliformes totales comprende todos los bacilos Gram- negativos aerobios o anaerobios facultativos, no esporulados, que fermentan la lactosa con producción de gas en un lapso máximo de 48 h. a 35 C ± 1ºC. Este grupo esta conformado por 4 géneros principalmente: Enterobacter, Escherichia, Citrobacter y Klebsiella. Klebsiella.   °

El grupo de coliformes fecales, está constituido por bacterias Gram-negativas capaces de fermentar la lactosa con producción de gas a las 48 h. de incubación a 44.5 ± 0.1 C. Este grupo no incluye una especie determinada, sin embargo la más prominente es Escherichia coli . °

La demostración y el recuento de organismos coliformes, puede realizarse mediante el empleo de medios de cultivo líquidos y sólidos con características selectivas y diferenciales. dif erenciales. Escherichia coli

es un bacilo corto Gram negativo que se encuentra clasificado dentro de la familia Enterobacteriaceae (bacterias entéricas), existe como comensal en el intestino delgado de humanos y animales. Sin embargo, hay algunas cepas de E. coli patógenas que provocan enfermedades diarreicas. Estas E. coli se clasifican con base en las características que presentan sus factores de virulencia únicos, cada grupo provoca la enfermedad por un mecanismo diferente. Las propiedades de adherencia a las células epiteliales de los intestinos grueso y delgado son codificadas por genes situados en plásmidos. De manera similar las toxinas son mediadas por plásmidos o fagos. Este grupo de bacterias se encuentra constituido por las siguientes cepas: E. coli enterotoxigénica (ETEC), E. coli enteropatógena (EPEC), E. coli enterohemorrágica (EHEC), E. coli enteroinvasiva (EIEC), E. coli enteroagregativa (EAEC) E. coli enteroadherente difusa (DAEC). Existen otras cepas que

no han sido perfectamente caracterizadas; de las cepas anteriores, las 4 primeras están implicadas en  

intoxicaciones causadas por el consumo de agua y alimentos contaminados.

enterotoxigénica ETEC es reconocida como el agente causal de la diarrea del

Escherichia coli

viajero, la cual se caracteriza por diarreas acuosas con o sin fiebre. Este tipo de infecciones es muy frecuente en países subdesarrollados subdesarrollados y afecta principalmente a los niños niños.. Patogénesis: El microorganismo es capaz de producir dos tipos de toxina. Una toxina termolábil de aproximadamente 89 kDa cuya secuencia, antigenicidad y función es similar a la toxina del cólera, la otra toxina que produce es termoestable y es de bajo peso molecular (4 kDa) y es capaz de resistir temperaturas de ebullición hasta por 30 minutos. La infección puede ser adquirida por por el consumo de alimentos como como vegetales frescos (lechuga en ensaladas) y agua. La dosis infectiva para adultos ha sido calculada en aproximadamente 108 bacterias, por otra parte en jóvenes jóvenes y ancianos la dosis infectiva pue puede de ser más baja. E s cherichia coli coli enteropatógenaa ECEP. Es causa importante de diarrea en los lactantes particularmente en los países enteropatógen en vías de desarrollo. La ECEP se adhiere a las células de la mucosa del intestino delgado. Sus factores de virulencia favorecen la adhesión y en ocasiones penetra a las células mucosas. La infección por ECEP provoca diarrea acuosa generalmente autolimitada aunque en ocasiones puede ser crónica.  Patogénesis. El microorganismo produce dos proteínas: la intimina que es codificada por el gen eae y un factor de adherencia que es codificado por un plásmido, ambas proteínas permite su unión a los enterocitos y la destrucción de las microvellosidades intestinales. Las epidemias causadas por este microorganismo se deben al consumo de agua contaminada y productos cárnicos. En estudios con voluntarios se encontró que la dosis infectiva es de 10 6 microorganismos. La diarrea por ECEP se ha vinculado con múltiples serotipos específicos de E. coli los cuales cuales puede pueden n ser identificados mediante la tipificación del antígeno O (somático) y en ocasiones del antígeno H (flagelar). E s cherichia col colii

enteroinvasiva enteroinv asiva EIEC. Este microorganismo se encuentra estrechamente relacionado

con el género Shigella, produce una enfermedad similar a la shigelosis. La enfermedad se presenta comúnmente en niños de paí países ses subdes subdesarrollados arrollados y en personas que viajan a dichos lug lugares. ares. La EIEC provoca la enfermedad (diarrea disentérica invasiva) al invadir las células epiteliales de la mucosa intestinal.  A pesar de que la dosis infectiva para Shigella es de 10 a 100 microorganismos, en el caso de EIEC la dosis infectiva es de aproximadamente 10 6 bacterias. Algunas características importantes de este microorganismo que p permiten ermiten diferenciarlo de la c cepa epa típica de E. coli son: No utiliza la lactosa como fuente de carbono, no descarboxilan la lis lisina, ina, es inmóvil y anaerogenic anaerogenicos. os. La patogenicidad de este organismo se debe a su capacidad para invadir y destruir el epitelio del colon debido a que es capaz de evadir la lisis en los fagolisosomas. Escherichia coli

enterohemorrágica EHEC produce verotoxina, denominada así por su efecto

citotóxico sobre las células Vero, una línea de células renales de monoverde africano. Existen al menos dos variantes antigénicas de la toxina. La ECEH se ha asociado con colitis hemorrágica, una variedad grave de diarrea; y con e ell síndrome urémic urémico o hemolítico, enfermed enfermedad ad capaz de pr producir oducir insuficiencia renal aguda, anemia hemolítica microangiopática y trombocitopenia. La verotoxina tiene muchas propiedades similares a la toxina shiga producida por algunas cepas de Shigella dysenteriae tippo 1; De los serotipos de E. coli que producen la verotoxina el más común y el único que puede identificarse en muestras clínicas es el O157:H7. La E. coli O157:H7 no e emplea mplea sorbitol y es negativa a la prueba de MUG. Es la causa más común de esta infección es el consumo de carne sin cocina cocinarr o poco cocinada, particularmente carne picada procesada en grandes cantidades. Los casos de colitis hemorrágica y sus complicaciones asociadas pueden prevenirse mediante la cocción completa de la carne En la siguiente tabla se resumen algunas propiedades y síntomas causados por las cepas de

 

Escherichia coli antes descritas.

Propiedades y síntomas causados por algunas cepas de de E s che cherichia richia col coli  i   patógenas  Toxina  Invasiva   Intiminas   

ETEC  Lábil/estable 

EPEC  - 

EHEC  Shiga o vero 

EIEC  - 

- 

- 

- 

+ 

- 

+ 

+ 

- 

 

 

 

-

 Aspecto de las heces  Presencia de leucocitos en heces  Fiebre 

 Aguadas 

 Aguadas  Aguadas muy Mucoides y sanguinolentas  sanguinolentas  sanguinolentas 

- 

- 

- 

+ 

baja 

+ 

- 

+ 

Intestino involucrado  Dosis infectiva  Serotipos 

+

 

Enterohemolisina -

-

Colon y parte baja del delgado   Alta 

Delgado 

Delgado 

Colon 

 Alta 

 Alta  O26, O111 y otros 

baja  O157:H7, O26, O111 y otros  Varios 

varios  

Dependiendo del contenido de los microorganismos coliformes en la matriz agua que se analice, se usan diferentes métodos: 1. Determinación de bacterias coliformes, coliformes fecales y Escherichia coli  por   por la técnica del Número Más Probable (NMP) 2. Recuento de bacterias coliformes totales y Escherichia coli   por filtración por membrana

1. DETERMINACIÓN DE BACTERIAS BACTERIAS COLIFORMES, COLIFORMES FECALES FECALES Y E S C H E R I C HI H I A C O L I POR LA TÉCNICA DE NÚMERO MÁS PROBABLE (NMP)  FUNDAMENTO   La determinación de microorganismos coliformes totales por el método del Número más Probable (NMP), se fundamenta en la capacidad de este grupo microbiano microbiano de fermentar la lactosa con producción de ácido y gas al incubarlos a 35 C ± 1°C durante 48 h., utilizando un medio de cultivo que contenga sales biliares. Esta deter determinación minación consta de dos fases, la fase presuntiv presuntiva a y la fase confirmativa. °

En la fase presuntiva presuntiva el medio de cultivo que se utiliza es el caldo lauril s sulfato ulfato de sodio el cual permite la recuperación de los microorganismos dañados que se encuentres presentes en la muestra y que sean capaces de utilizar a la lactosa como fuente de carbono. Durante la fase confirmativa se emplea como medio de cultivo caldo lactosado bilis verde brillante el cual es selectivo y solo permite el desarrollo de aquellos microorganismos capaces de tolerar tanto las sales biliares como el verde brillante. La determinación del número más probable de microorganismos coliformes fecales se realiza a partir de los tubos positivos de la prueba presuntiva y se fundamenta en la capacidad de las bacterias para fermentar la lactosa y producir gas cuando son incubados a una temperatura de 44.5 ± 0.1°C por un periodo de 24 a 48 h.

La búsqueda de Escherichia coli se realiza a partir de los tubos positivos de caldo EC, los cuales se  

siembran por agotamiento en medios m edios selectivos y diferenciales (Agar Mac Conkey, Agar eosina azul de metileno) y posteriormente realizando las pruebas bioquímicas básicas (IMViC) a las colonias típicas. Principio del método  El método se basa en la propiedad que tienen los microorganismos denominados denominados coliformes de fermentar la lactosa con producción de ácido y desprendimiento de gas a una temperatura entre 35ºC ± 2 °C e incubados durante un periodo comprendido entre 24h a 48h. Consiste en un ensayo de dos fases, una presuntiva en caldo lauril sulfato triptosa y otra confirmativa.

Materiales, equipos y r ea eactivos  Equipos:  Estufa de cultivo regulada a 35 ± 2ºC Contador de colonias con lente amplificador de imagen Homogeneizador de tubos Vortex Microondas Balanza de precisión 3000 ± 0,1g  Autoclave Baño Maria ó estufa de cultivo regulados r egulados a 44,5 ºC. Incinerador de asas de inoculación

Materiales Frascos de vidrio tapa rosca de 250 ml Frascos de vidrio tapa rosca de 500 ml

Pipetas graduadas de 1 ml Pipeteador Cajas Petri de vidrio esteriles Tubos de cultivo de 160 x 16 mm con tapa rosca Tubos Durham de 50 mm x 5 mm  Asas de inoculación Marcador indeleble Gradillas

Medios de cultivo y r ea eactivos    Solución reguladora de fosfatos (Fosfato Butter ff  ield)



Solución madr e

Composición

Cantidad

Dihidrogenofosfato Dihidrogeno fosfato de potasio

34 g

 Agua destilada

1L

Preparación: Disolver el dihidrógeno fosfato de potasio en 500 ml de agua y ajustar el pH a 7,20 con NaOH 1N o HCl 1N. Completar a 1 litro con agua destilada y mezcla bien. Transferir la solución preparada a frascos de vidrio con tapa rosca. Mantener la solución preparada y estéril en refrigeración. refrigeración.

Solución diluida de trabajo  Composición Solución Madre

Cantidad 1,25 ml

 Agua destilada

1L

Preparación: Tomar los 1.25 ml de solución madre y llevar a 1 litro con agua destilada Transferir la solución preparada a frascos de vidrio con tapa rosca y esterilizar a 121ºC durante 15 minutos. Mantener la solución preparada y estéril en refriger refrigeración ación

Caldo Lauril sulfato-triptosa  Composición Triptona

Cantidad 20 g

 

Lactosa

5g

Bile Salts N°3

1,5 g

Di-Potasio fosfato

4g

Mono-potasio fosfato

1,5 g

Cloruro de sodio

5g

 Agua destilada

1L

Preparación: Disolver los componentes en el agua destilada y ajustar el pH a 6,9 ±0,2, distribuir de a 10 ml en tubos de cultivo con tapa rosca, colocar los tubos Durhan invertidos y tapar Esterilizar en autoclave a 121 ºC durante 15 minutos dejar enfriar y almacenar en refrigeración

Caldo Verde brillante-bilis lactosa al 2%   Composición

Cantidad

Peptona

10 g

Lactosa

10 g

Ox-Bile (purificado) (purificado )

20 g

Brillante Green

0,0133

 Agua destilada

1L

Preparación: Disolver los componentes en el agua destilada y ajustar el pH a 7,4 ±0,2, distribuir de a 10 ml en tubos de cultivo con tapa rosca, colocar los tubos Durhan invertidos y tapar Esterilizar en autoclave a 121 ºC durante 15 minutos dejar enfriar y almacenar en refrigeración

Caldo E. Coli (EC)  Composición

Cantidad

Tryptosa Lactosa

20 g 5g

Cloruro de sodio

5g

Dipotasio hidrogenofosfa hidrogenofosfato to

2,75 g

Potasio digihidrogen digihidrogenofosfato ofosfato

2,75

Sodio Lauril Sulfato

0,1 g

 Agua destilada

1L

Preparación: Disolver los componentes en el agua destilada y ajustar el pH a 6,8 ±0,2, distribuir de a 10 ml en tubos de cultivo con tapa rosca, colocar los tubos Durhan invertidos y tapar Esterilizar en autoclave a 121 ºC durante 15 minutos dejar enfriar y almacenar en refrigeración

Agar-violeta cristal-rojo neutro bilis lactosa  Composición

Cantidad

Extracto de levadura Peptona

3g 7g

Cloruro de sodio

5g

Bile salts N°3

1,5 g

Lactosa

10 g

Rojo neutro

0,03 g

Cristal violeta

0,002 g

 Agar

12 g

 Agua destilada

1L

Preparación: Disolver los componentes en el agua destilada y ajustar el pH a 7,4 ±0,2, llevar a ebullición hasta disolver por completo, no esterilizar, enriar hasta 50°C mezclar bien verter en placas, dejar enfriar y almacenar en refrigeración

Agua triptonada al 1 %   Composición Nitrógeno total

Cantidad 12,7 g

 Amonio nitrógeno nitrógeno

3,7 g

Cloruro de sodio

5g

Tryptona

1g

 Agua destilada

1L

Preparación:  

Disolver los componentes en el agua destilada y ajustar el pH a 7,3 ± 0,2, distribuir de a 5 ml en tubos para cultivo Esterilizar en autoclave a 121 ºC durante 15 minutos dejar enfriar y almacenar en refrigeración.

Reactivo de Kovacs  Composición p-dimetil amino benzaldehído

Cantidad 5g

HCl p.a.

25 ml

 Alcohol tetraamilico tetraamilico

75 ml

Preparación: Disolver el pDimetil amino benzaldehído en el alcohol tetramilico y añadir el ácido clorhídrico Conservar en frasco color ámbar y almacenar en rerigeración..

Caldo MR-VP  Composición

Cantidad

Peptona tamponada

7g

Fosfato dipotásico

5g

Dextrosa

5g

Fosfato sódico

1g

 Agua destilada

1L

Preparación: Disolver los componentes en el agua destilada y ajustar el pH a 6,90±0,2, distribuir de a 5 ml en tubos para cultivo Esterilizar en autoclave a 121 ºC durante 15 minutos dejar enfriar y almacenar en refrigeración.

Agar Citrato Simmons  Composición

Cantidad

Sulfato de magnesio Dihidrogenofosfato Dihidrogeno fosfato de amonio

7g 5g

Fosfato sódico de amonio

5g

Citrato sódico tribásico

1g

 Agua destilada

1L

Preparación: Disolver los componentes en el agua destilada y ajustar el pH a 7,00±0,2, llevar a ebullición hasta disolución completa, Mezclar bien y distribuir en tubos de cultivo con tapa rosca, esterilizar en autoclave a 121 ºC durante 15 minutos Dejar solidificar los tubos en posición inclinada y guardar en refrigeración.

Preparación indicadora indicadora de rojo de metilo Composición

Cantidad

Rojo de metilo

0,04 g

Etanol absoluto

60 ml

 Agua destilada

40 ml

Preparación: Disolver el rojo de metilo en el etanol absoluto y añadir el agua destilada, ajustar el pH a 5,00 aproximadamente (La solución deberá tener un color anaranjado)  Almacenar en refrigeración refrigeración..

Solución al 5% de Alfa naftol Composición  Alfa Naftol

Cantidad 5g

Etanol absoluto

100 ml

Preparación: Disolver el alfa naftol en el etanol absoluto, almacenar en refrigeración refrigeración

Solución al 40% de KOH Composición KOH  Agua destilada

Preparación: Disolver el hidróxido de potasio en el agua destilada, almacenar en refrigeración.

Pr ocedimiento 

Cantidad 40 g 100 ml

 

 

Preparación

de muestras y de las d diluciones iluciones

Con el fin de asegurar un reparto uniforme de los microorganismos, mezclar mezclar cuidadosamentre la muestra, invirtiendo el recipiente que la contiene varias veces. Si el recipiente está complementamente lleno, transferir a otro recipiente estéril y continuar con el procedimiento. 1°. Lavar el envase en el que está contenida la muestra. En el caso de los hielos, dejar que retorne a su estado líquido a temperatura ambiente. 2°. Tomar 25 ml de muestra y colocar en un frasco que contenga 225 ml de diluyente. 3°. Se toma 1 ml de la primer dilución (10-1=0.1) colocándolo a un tubo que tiene 9 ml del diluyente, obteniéndose de esta manera la dilución 10-2=0.01, la misma que se homogeneiza cuidadosamente con ayuda del vortex. 4°. De la dilución obtenida (10-2=0.01), se transfiere 1 ml a otro tubo conteniendo 9 ml del diluyente, obteniéndose así la dilución 10-3 =0,001.

Prueba pr esuntiva 1°. Se inocula cada uno de los tres tr es tubos que contiene caldo lauril sulfato y tubos Durham invertidos con 1,0 ml de la dilución 101 = 0,1 0,1.. 2°. Se repite la misma operación con las diluciones 10-2 y 10-3 3°. Se incuban a 35°±2°C por un periodo de 24  – 48 h y se hace la lectura de prueba: Observar la formación de gas en los tubos en los tubos de fermentación. Anotar los tubos en los que se ve presencia de gas al cabo de 24 h, incubar los negativos 24 h adicionales.La ausencia de gas a las 48 h significa prueba presuntiva es negativa para coliformes. Si existe formación de gas en los tubos, registrar el número de tubos positivos de cada dilución.

Prueba confirmativa para coliformes totales  1°. De cada uno de los tubos con caldo lauril sulfato que han producido gas se hace una toma, con un asa de inoculación, y se inocula en tubos con caldo de verde brillante bilis, lactosa y tubos de Durham invertidos. 2°. Se incuban a 35 ± 2 °C de 24 a 48 h. La formación de gas confirma la presencia de bacterias coliformes, se anota entonces el número de tubos cuya reacción es positiva.

Prueba confirmativa para coliforme f ecales  1°. De cada uno de los tubos con caldo lauril sulfato que han producido gas se hace una toma con un asa de inoculación y se inocula en tubos con caldo de E. Coli (EC) con tubos Durham invertidos (atemperados (atemperados previamente a 44.5 ºC por 30 min). 2°. Los tubos sembrados se incuban a 44.5 °C por 24h. 3°. La presencia de gas indica una prueba presuntiva para coliformes fecales, se anota entonces el número de tubos cuya reacción es positiva.

Cálculo (NMP) de coliformes Se indica el número más probable adecuado al número de tubos positivos basándose en la tabla del NMP. Ejemplo: Si el resultado fuera.   3 tubos + en la dilución 1:10   1 tubo + en la dilución 1:100   0 tubos + en la dilución 1:1000 





La tabla da como resultado NMP=43 coliformes/ml de agua

Pruebas confirmativas para E. Coli 1°. De cada tubo que contiene caldo E. coli con formación de gas se extrae una porción con el asa de inoculación y se siembra por agotamiento sobre la superficie de placas de agar selectivo (Agar

 

Violeta cristalrojo neutrobilislactosa). Es esencial que una porción de la placa muestre colonias bien aisladas. 2°. Se incuban las placas a 35 °C ± 2 °C por un periodo de 18 a 24 h y luego se examina las colonias sospechosas de E. coli. 3°. Se pican dos colonias típicas de cada placa para realizar las pruebas bioquímicas IMVIC. 

Pruebas IMVIC Se hacen los ensayos de indol, rojo de metilo, medio de Voges  Proskauer y citrato con las colonias desarrolladas en el agar.

Prueba de rojo de metilo Se inocula un tubo que contiene caldo MR  VP VP,, se incuba durante 48 h a la temperat temperatura ura de °C y se añaden a cada tubo cinco gotas de indicador rojo de metilo. Prueba positiva = color rojo Prueba negativa = color amarillo

35°C ± 2

Prueba de Voges Pr oskauer   Se incuba un tubo que contenga 5 ml de caldo MR  VP a 35 °C ± 2 °C durante 48 ± 2 hrs; luego asépticamente y a temperatura a ambiente, mbiente, se trans transfiere fiere a un tub tubo o de ensayo 1 ml del cultiv cultivo o incubado y se agregan agregan 0,6 ml de la soluc solución ión de alfanaftol y 0,2 ml de la solución solución de KOH al 40 %, agitando luego de la adición de cada solución. Leer el resultado a partir de los 15 min hasta un periodo máximo de 2 h de haber agregado los reactivos Prueba positiva = color rosado Prueba negativa = corlor pardo

Prueba de indol Se inocula un tubo que contenga agua triptonada (Caldo triptona). Despues de 48 h de incubación a una temperatura de 35±2°C. Añadir 0,2 a 0,3 ml del reactivos de Kovacs, para la investigación del Indol, mezclar bien y examinar Prueba positiva = formación de un anillo color rojo (anillo o solución alcoólica) Prueba negativa = se mantiene el color del reactivo

Prueba Citrato Inocular en el medio Agar Citrato Simmons, incubar a 35°C ± 2°C durante 25 días. La coloración azul del medio indica una reacción positiva. Prueba positiva = color azul Prueba negativa = color verde

Interpretación de resultados Todos los tubos que fermentan lactosa con producción de gas a 35 °C ± 2 °C en 48 h y son bacilos Gramnegativos, cuyas cuyas pruebas IMVIC s sean ean de acue acuerdo rdo al cuadro, "++ "++"" (Biotipo I) o "+" (Biotipo II), son considerados E. Coli, según la tabla Indol Rojo de metilo Vo Voges ges Proskauer Citrato Tipo  + +   E. coli típico   +   E. coli atípico  +   +

+ +  

  + +

+ + + +

Típico intermedio  Atípico intermedio  E. aerogenes típico  E. aerogenes atípico 

Expresión de r esultados:   

  Los resultados son expresados por el Numero Mas Probable por gramo ó ml (NMP/g ó ml)  ANEXO 1 Número Más Probable (NMP) por 1 gramo usando 3 tubos de diluciones: 1:10, 1:100, 1:100 1:10 1:100 1:1000 NMP 1:10 1:100 1:1000 NMP 1:10 1:100 1:1000 NMP 1:10 1:100 1:1000 1:1000 NMP  0

0

0

1100  FUENTE: AOAC Oficial Method Method 966.24 Coliform Group a and nd Escherichia co colili in Tree Nut Meats 1997

Ob jetivo  Establecer un procedimiento para el recuento de bacterias coliformes totales y Escherichia coli mediante filtración por membranas   DCN Discos de cartón nutriente, son bases nutrientes en seco, estériles y almacenables durante 1  –  2 años a temperatura ambiente, y pueden utilizarse en cuanto se los humecta   DCN Colichrom Para la identificación rápida selectiva selectiva y cuantitativa de E. coli y Coliformes en aguas, alimentos u otros materiales de análisis en menos de 24 horas. El medio tiene aditivos cromogénicos para la diferenciación óptica de las colonias   TERGITOL TTC NPS Discos de carton nu nutriente triente p para ara la identificación identificación rápida rápida selectiva y cuantitativa cuantitativa de E. coli y coliformes en aguas, alimentos u otros materiales de análisis en menos de 24 horas. El medio tiene aditivos cromogénicos para la identificación identificación óptica óptica de las colonias.







Principio del método 

Mediante la filtración a través de una membrana se logra retener la carga microbiana existente en la muestra y al colocar esta membrana sobre una base de agar o DCN se logra el desarrollo y la formación de colonias visibles.

Materiales, equipos y r eeaactivos  Equipos:

·

Estuf Estufa a de incubación regulada a 37 C ± 2 C

·

Equipo para filtración filtrac ión por membrana

·

Contador de colonias (RE051)

 

Mate r iale s:

·

Frascos estériles

·

Cajas de petri

·

Pipetas graduadas de 10 ml y 1 ml

·

Marcador indeleble

Medios de cultivo y r eactivos 

·

Agua destilada esteril

·

DCN “Colichrom” o "TERGITOL TTC NPS"

·

Membranas filtrantes filtrante s blancas reticuladas de 0,45 μm, estéril es tériles es

Pr oc ocedimiento  1°. 2°. 3°. 4°. 5°. 6°. 7°.

Realizar la preparación y homogeneización de las muestras Preparar el equipo de filtración Conectar la manguera de la bomba de vacío a un matraz kitazato Colocar el embudo para filtración Sobre este colocar el filtro metálico que soporta la membrana filtrante Con una pinza estéril colocar la membrana filtrante  filtrante  Finalmente colocar el vaso graduado donde se deposita la muestra el mismo que se sostiene con una pinza. 8°. Filtrar 100 ml de la muestra a analizar, enjuagar con agua esterilizada o agua de peptona y succionar cuidadosamente cuidadosamente hasta que no quede resto alguno. 9°. Retirar el filtro de membrana, colocarlo encima del DCN Colichrom preparado de la siguiente manera: ·  Sacar de su envase las cajas petri que contienen contienen disco disco de cartón nutriente nutriente (DCN). Humectar el DCN en la caja petri con 3 a 3,5 ml de agua destilada estéril, cuando la humectación es optima, se nota a simple vista la saturación del líquido. · 

Te Tener ner cuidado de que no se formen burbujas burbujas de aire entre la membrana y el medio medio de cultivo

Incubación  Realizar la incubación de la caja petri invertidas a 37 ºC ± 2ºC durante 16 a 24 hr Recuento y cálculo de colonias 

Las colonias pueden contarse entre las 16 y 24 horas de incubación. Para facilitar el recuento se utilizara un contador de colonias, siendo las colonias de las siguientes características: · Bac Bacterias terias Coliformes : Colonias rojas ·

E. Coli: Colonias az azules ules

Expresión de r esultados 

El recuento se expr e xpresara esara en unidades unidades formado f ormadoras ras de colonias colonias por 100 ml. (UFC/100ml.) (UFC/100ml.) calculado c alculado.. No tener en cuenta más de dos cifras significativas.