Análisis de Proteínas en Albúmina de Huevo

 _____________________  _____________________________ ________________ _________________ _________________ _________________ ________________________________________ __________________________________________________________ ___________________________

Análisis de Proteínas en Albúmina de Huevo

Ortiz Vángelis 1; Tonato Diego2; Ullauri Andrés 3; Venegas Jordan4 1 ,2 ,3 ,4

 Escuela Politécnica Politécnica Nacional, Nacional, Facultad Facultad de Ingeniería Ingeniería Química Química y Agroindustria, Agroindustria, Quito,  Ecuador

Resumen: Las proteínas son biomoléculas de gran importancia, conformadas por monómeros llamados “aminoácidos” y

unidos mediante enlaces peptídicos. La ovoalbúmina es una proteína de cadena simple y de alto contenido proteico, motivo por el cual es posible analizar con facilidad sus propiedades en un laboratorio. La estabilidad de la espuma se determinó mediante el goteo de la formada por una clara de huevo sin aditivos, una con 10 g de sal comercial y otra con 10 mL de vinagre. Para la determinación e identificación de proteínas se utilizaron las reacciones de biuret, xantoproteica, y azufrados, así como la prueba de la coagulación; mediante el reconocimiento cualitativo del cambio en las propiedades físicas de la muestra, como la coloración o textura. Los volúmenes de albumen líquido recuperado tras los 30 minutos de espera fueron 20, 3,5 y 7,5 mL respectivamente. Las reacciones de reconocimiento dieron resultados positivos, en tanto que l a reacción de biuret generó en la mues tra una coloración morada, naranja en la xantoproteica y una tonalidad parcialmente negra en la de azufrados; mientras que se observó un cambio de color y textura en la prueba de coagulación. Se determinó que la estabilidad de la espuma aumentó cuando el albumen es batido en presencia de sal, debido al aumento de la solubilidad de las proteínas. Finalmente, se determinó la presencia de proteínas en todas las muestras, puesto que todas las reacciones de identificación adquirieron la coloración esperada.

Palabras clave: proteínas, ovoalbúmina, estabilidad de espuma, reacción de biuret, reacción xantoproteica, reacción de azufrados.

Analysis of Proteins in Egg Albumin Abstract: Proteins are biomolecules of great importance, formed by monomers called "amino acids" and linked by  peptide bonds. Ovalbumin is a simple chain protein with high pro teic content, which is why it is possible to analyze its properties in a laboratory in a better way. The foam stability measurement was determined by dripping an egg white sample without additives, one with 10 g of commercial salt and another with 10 ml of vinega. For the determination and identification of proteins the biuret, xanthoproteic, and sulfur reaction were performed, as well as the coagulation test; by qualitatively recognizing the change in the physical properties of the sample, such as color or texture. The volumes of liquid albumen recovered after the 30 minutes 20, 3.5 and 7.5 ml r espectively. The reactions of recognition gave positive results: the reaction of biuret generated in the sample a purple coloration, orange in the xanthoprotic one and a partially black tone in the sulfur reaction; while a change in color and texture was observed in the coagulation test. It was determined that the stability of the foam increased when the albumen is beaten in the  presence of salt, due to the increase in the solubility of the proteins. Finally, the presence of proteins in all the samples was determined, since all the identification reactions acquired the expected coloration. Keywords: proteins, ovalbumin, foam stability, biuret reaction, xanthoproteic reaction, sulfur reaction

1

1. INTRODUCCIÓN

Las proteínas son sustancias orgánicas nitrogenadas complejas, formados a partir de monómeros denominados aminoácidos. Estos polímeros lineales constan de 20 aminoácidos los cuales están unidos por enlaces peptídicos y  plegados de distintas maneras lo que les permite per mite realizar u na

 [email protected]  [email protected]

variedad de funciones (Berg et al, 2008, p. 25; Teijón y Garrido, p. 53, 2009). Además, desempeñan diversas funciones en todos los procesos biológicos, pueden funcionar como catalizadores, proporcionan apoyo mecánico, protección inmunológica, transportan y almacenan como es el caso de la hemoglobina con moléculas como el oxígeno, entre otras funciones (Berg et al, pp. 25-26, 2008).

 _________________________________________________________________________________________________________________________

En el presente trabajo se analiza la albumina, la cual es una  proteína conformada por 610 aminoácidos formando una cadena peptídica simple que se encuentra doblada sobre sí misma en varias capas y tiene un peso molecular de aproximadamente 66,248; por lo tanto, su contenido proteico es alto. Se la puede encontrar en la ovoalbúmina del huevo (clara del huevo) y en las secreciones de un caracol (Peters, 1995, pp. 1-2). A partir de la albumina se puede hacer espuma mediante la deshidratación y estiramiento de la misma, dando lugar a un proceso de desnaturalización por agitación mecánica, es decir, se incorpora gas a la dispersión proteica (Gil, 2010, p.92). La desnaturalización se da fácilmente debido a las fuerzas débiles de los enlaces peptídicos que forman la  proteína, y son alterados por un cambio de pH, temperatura o disolventes. De esta manera, la hidrolisis de una proteína es realizada de forma parcial por ácidos, bases o enzimas dando lugar a moléculas más pequeñas (Teijón y Garrido, pp. 53 -54, 2009). Para la identificación de las proteínas se tienen varios métodos ya sean cualitativos o cuantitativos, es fundamental la concentración puesto que esto define la estructura de una  proteína, la actividad de una enzima o el contenido proteínico de un alimento. Entre las técnicas más representativas se encuentra el uso de reactivo de Biuret para su análisis cualitativo y para su cuantificación se realiza espectrofotometría UV-VIS en un máximo de absorción de 540 nm (UNAM, 2005, p.45). Además, se puede encontrar otras técnicas de identificación como: la reacción xantoproteica, la reacción de azufrados, millón, ninhidrina, coagulación por calor, entre otras (Donnersberger y Lesak, 2002, p. 385).

2. METODOLOGÍA En el desarrollo de la experimentación de estabilidad de las espumas, se utilizaron tres huevos de gallina, los cuales, fueron quebrados y se separó sus claras de las yemas. Cada yema se  batió constantemente hasta conseguir una espuma estable, para  posterior añadir las sustancias de acuerdo con la Tabla 1. Tabla 1. Sustancias aplicadas a cada muestra en la prueba de goteo Muestra

Sustancia

Cantidad

1

-

-

2

Sal

10 g

3

Vinagre

1 mL

Cada espuma fue colocada en un embudo sobre una probeta  para la realización de la prueba de goteo. Al cronometrar 30 minutos se midió el volumen conseguido de cada muestra. En las siguientes pruebas se utilizó únicamente la clara de un huevo de gallina. En la prueba de la reacción de Biuret, se colocó 3 mL de albúmina en un tubo de ensayo y se añadió 2 mL de NaOH al 20 %. A continuación, se adicionó 5 gotas de CuSO 4 1 % y se esperó su respectiva coloración característica.

Para la coagulación de proteínas, se añadieron 10 gotas de solución de CH 3COOH al 50 % en 3 mL de albúmina y se  procedió a calentar a la llama del mechero. En la reacción xantoproteica, se colocaron 3 mL de albúmina y 2 mL de solución de HNO 3 50 % en un tubo de ensayo para  posterior calentar la mezcla a la llama y enfriar en agua. Después, se añadió 10 gotas de la solución de NaOH 40% y se observó su tonalidad. Con la última prueba, la reacción de azufrados se adicionó en un tubo de ensayo: 3 mL de albúmina y 2 mL de NaOH al 20 %, y se calentó con el mechero hasta ebullición. Se colocaron inmediatamente 10 gotas de Pb(CH 3COO) 2 5 % y se apreció su coloración.

3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN En la primera parte de la experimentación, se obtuvo diferentes volúmenes en cada probeta debido a las distintas combinaciones que tenía la espuma de la clara del huevo de gallina, tal como se indica en la Tabla 2. Tabla 2. Volúmenes registrados en la Prueba de goteo de albúmina de huevo.

N° de Bureta

Contenido

Volumen obtenido (mL)

1

Testigo

20

2

Sal

3,5

3

Vinagre

7,5

Se puede apreciar que en cada muestra el valor del volumen recuperado variaba según su contenido. Por lo que es necesario mencionar que la albúmina de huevo posee una estructura conformacional nativa en tercera dimensión y ocupa aproximadamente el 60 % de espacio del huevo. Es la fuente  principal de proteínas y de riboflavina. (Arzeni, 2014, p. 3). Las proteínas al ser biomoléculas de gran tamaño, que cumplen con una función determinada, cualquier alteración  provocada sea física o quí mica dentro de su estructura lle ga a  perder su nivel conformacional o también llamado desnaturalización. (Goñi y Macarulla, 1994, p. 114). En el caso de la primera muestra, donde únicamente se hallaba la muestra testigo presentó un volumen de 20 mL porque su alteración estructural solamente fue física por el batido del albumen. En la segunda muestra, la espuma de huevo tenía una combinación de 10 g de sal con albumen, se obtuvo un volumen muy reducido de 3,5 mL. Ofelia (2005) explica que las sales en presencia de proteínas alteran las interacciones electrostáticas por sus cationes que tienen afinidad con ciertos grupos que poseen las proteínas aumentando el proceso de solubilización de las mismas por la ionización generada. (Ofelia, 2005, p. 40). Para la tercera muestra, la mezcla de la espuma de huevo se conformaba por vinagre con albumen y se obtuvo un volumen de 7,5 mL. López (2013) menciona que las proteínas según el

 _________________________________________________________________________________________________________________________

tipo de disolvente como por ejemplo el ácido acético, reducen su solubilización pero aumentan su precipitado, ya que existe una mayor interacción molecular gracias a su pequeña constante dieléctrica que caracteriza la polarización o coacción entre distintas moléculas. (López, 2013, p. 26). Es por esta razón que se obtuvo un mayor volumen en la tercera muestra comparada con la segunda porque la fuerza de interacción entre las moléculas fue mayor lo cual permitió recuperar un mayor contenido de albumina de huevo por el proceso de  precipitado que disminuía su estabilidad y provocaba que el líquido contenido pueda expandirse con mayor facilidad.

de temperatura empiezan a desenrollarse para enlazarse entre sí formándose una consistencia dura del albumen, tal como se indica en la Figura 2. Es por esto, que uno de los factores más influyentes en las proteínas es la temperatura porque afecta su estructura inicial (líquida) a una nueva estructura final (sólida). (Goña y Macarulli, 1994, p. 115).

Para la segunda parte de la experimentación se obtuvo los siguientes resultados, tal como se indica en la Tabla 3. Tabla 3. Resultados registrados de distintas reacciones de coloración para la albúmina de huevo

Tipo de Reacción

Coloración

Resultado (positivo/negativo)

Reacción Biuret Coagulación Reacción Xantoproteica Reacción de Azufrados

Violeta Blanca Amarilla Negra

Positivo Positivo Positivo Positivo

Wharton (1972) indica que la reacción de Biuret se caracteriza  por la coloración violeta que se genera por la respuesta de los iones peptídicos de las proteínas con los iones del sulfato y que al menos necesita dos uniones de este tipo para llegar a la coloración mencionada. Además, otro factor influyente es la concentración proteica de la reacción. (Wharton, 1972). Por lo tanto, la muestra al cumplir los parámetros de concentración como de interacción entre compuestos se logró apreciar la coloración violeta indicada en la Figura 1.

F igur a 2. Coagulación de la proteína de huevo.

Montilla (2012) menciona que en la reacción Xantoproteica inicialmente se produce un precipitado de color blanco que cambia al amarillo por adición de ácido nítrico y de NaOH en la muestra. Solo puede darse estas características en ciertas  proteínas que tienen grupos de hidrocarburos aromáticos para obtener compuestos nitrados que en un tratamiento de ácido nítrico concentrado al 50 % actúa con la Tirosina contenida en la clara del huevo, por lo que presenta una coloración amarilla como se indica en la Figura 3 y que puede tornarse anaranjada cuando la proteína se encuentra en un medio alcalino más fuerte. (Montilla, 2012).

F igur a 1. Reacción de Biuret.

Goñi y Macarulli (1994) indican que en la coagulación, la clara del huevo pasa de una estructura transparente y semilíquida a una masa sólida y blanca, ya que las proteínas por el aumento

F igura 3. Reacción Xantoproteica.

 _________________________________________________________________________________________________________________________

La reacción de azufrados se basa en una reacción de separación entre el azufre y las proteínas mediante un álcali o NaOH, que al adicionar una pequeña cantidad de acetato de plomo forma un precipitado negruzco de sulfuro de plomo como se indica en la Figura 4. Esta muestra no presentaba inicialmente el color negro característico por lo que fue necesario esperar más tiempo que en las demás muestras para apreciar con mayor claridad el precipitado mencionado. (Flores, 2010).

La reacción de Biuret permite determinar la concentración de una proteína en la muestra, mediante el cambio en su coloración al ponerse en contacto con los reactivos que lo componen. Es por este motivo que la coloración morada adquirida por la muestra de huevo permitió concluir la  presencia proteínas, dando la prueba como positiva. El proceso de coagulación induce a que la p roteína en su estado inicial de estructuras proteicas grandes enrolladas se desenrollen por el aumento de temperatura, para enlazarse de forma simple y formar una nueva estructura final proteica diferente. Este hecho se evidenció en la prueba al fuego, puesto que su textura y coloración cambió al exponerse a este cambio de temperatura. La reacción xantoproteica permite identificar a la proteína  brindando un color amarillo con anaranjado, debido a la interacción entre el ácido nítrico concentrado y la proteína. Esta prueba resulta positiva, puesto que el color adquirido por la muestra es el esperado para esta reacción. La reacción de azufrados forma un precipitado de sulfuro de  plomo como consecuencia de la adición de acetato de plomo, el cual se caracteriza por su coloración color negra. La adición de un álcali permite una separación de las proteínas más sencillas. Al realizar la prueba en la muestra se observó una coloraciónparcialmente negruzca, lo cual puede deberse a la adición insuficiente de los reactivos.

F igura 4. Reacción de proteínas con azufrados.

Por lo tanto, dependiendo de la aplicación de las diferentes reacciones para el albumen de huevo, se puede presentar una notoria diferenciación de sus características, una de ellas es la coloración. En el caso de la reacción Biuret, presenta un col or violeta; en la reacción Xantoproteica, el color amarillo; y en l a Reacción de Azufrados, el color negro. Se debe a los distintos compuestos empleados que interaccionan de una manera  particular con las proteínas brindando un color particular y así  poder detectar el contenido proteico de las muestras registradas. Otra característica es el cambio de su forma estructural, que se ve afectada por el contacto de la muestra con una temperatura más elevada obteniendo así una consistencia diferente a la inicial.

4. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES 4.1 CONCLUSIONES La albúmina de huevo está conformada por cadenas proteícas extensas que fácilmente pueden desnaturalizarse. Por lo tanto, en la prueba de goteo realizada para la recolección de albumen de huevo, se obtuvieron: 20 mL en el cual influyó únicamente el factor físico, 3,5 mL en presencia de sal, y 7,5 mL en aquella con ácido acético. En comparación con la primera prueba, el segundo experimento generó menor volumen debido al aumento de la solubilidad de las proteínas por efecto de la sal.

Las diversas reacciones que se emplean para las proteínas tienen por objetivo determinar la concentración proteica de cada muestra si presentan ciertas condiciones, debido a que las  proteínas en presencia de diferentes compuestos tienden a comportarse de manera característica. A su vez, la textura de la muestra varía con la temperatura, ya que es otro agente que influye en la desnaturalización proteica, lo cual indica ser otro  parámetro útil en el análisis de proteínas.

4.2 RECOMENDACIONES Se sugiere realizar el análisis de la estabilidad de la espuma de huevo al agregar una base débil antes de realizar el batido, con el fin de compararla con aquella formada en presencia de ácido. Se sugiere utilizar otros solventes orgánicos, como el etanol,  para reconocimiento proteico ya que incrementan la atracción de cargas opuestas, disminuyen la ionización y formar  precipitados característicos. Se sugiere utilizar otro método de separación de proteínas como el de cromatografía de afinidad que incluye diálisis, electroforesis e isoelectroenfoque. La separación de las  proteínas por su tamaño ocurre en la diálisis, por su carga neta en la electroforesis y de acuerdo a su punto isoeléctrico en el isoelectroenfoque.

 _________________________________________________________________________________________________________________________

REFERENCIAS Arzeni, C. (2014).  Modificación molecular y funcional de  proteínas de clara de huevo mediante ultrasonidos de alta intensidad: aplicación de esta tecnología al diseño de nanovehículos para ácido fólico. Buenos Aires, Argentina: Universidad de Buenos Aires. Berg, J., Stryer, L. y Tymoczko, J. (2008).  Bioquímica. Barcelona, España: Editorial Reverté. Donnersberger, A. y Lesak, A. (2002). Libro de laboratorio de anatomía y fisiología. Barcelona, España: Editorial Paidotribo. Flores, R. (2010).  Reconocimiento de aminoácidos que contienen azufre en las proteínas . Recuperado de: https://es.scribd.com/doc/68940573/Reconocimiento-deAminoacidos-Que-Contienen-Azufre-en-Las-Proteinas Gil, A. (2010). Tratado de Nutrición: Composición y Calidad de los Alimentos. Madrid, España: Editorial P anamericana. Goñi, F. y Macarulla, J.  Bioquímica Humana  (Segunda edición). Barcelona, España: Editorial Reverté. López, L. Química de los alimentos. Recuperado de: http://www.qo.fcen.uba.ar/quimor/wp-content/uploads/309%20clase%20proteinas%202013%20a(1).pdf Montilla. (2012).  Proteínas. Recuperado de: http://www.euroschool.lu/prof.montilla/ficheroactivi/activida desbio4_6/PPROTEINAS Ofelia, C. (2005).  Apuntes de Bioquímica vegetal.  (Primera edición). México D.F, México. Peters, T. (1995). All About Albumin: Biochemistry, Genetics, and Medical Applications.  San Diego, Estados Unidos: Academic Press. Teijón, J. y Garrido, A. (2009).  Bioquímica estructural. Conceptos y tests. Madrid, España: Editorial Tébar UNAM. (2005). Manual de Practicas Biología Molecular de la Célula I . México D.F., México: Publidisa. Wharton. (1972).  Reacción de Biuret . Recuperado de: https://es.scribd.com/doc/62055042/Reaccion-de-Biuret