analisis clinico

Manual de Análisis de Análisis Clínico I

PRÁCTICA Nª 05

I. -

OBJETIVOS Conocer el fundamento y los conceptos generales sobre la toma de muestras sanguíneas. Conocer el fundamento y las técnicas de recuento de glóbulos rojos y glóbulos blancos. Conocer el fundamento y las técnicas de determinación de hematocrito y velocidad de sedimentación sedimentación globular.

II. INTRODUCCIÓN La sangre para poder ser estudiada debe extraerse del organismo y en ocasiones fraccionarse en sus componentes fundamentales como plasma o suero. La extracción sanguínea puede realizarse por diversos métodos siendo los más empleados la punción venosa y la punción capilar. Al igual que cualquier otra técnica o práctica médica, la extracción sanguínea precisa de un adecuado control de calidad y que de ello depende muchas veces que el resultado del análisis de la muestra de sangre sea correcto. Se efectuará en ayunas o no dependiendo de la prueba a utilizar. Si se precisa obtener el plasma o estudiar algunas de las propiedades de la sangre o de alguno de los componentes celulares, en especial las plaquetas, es necesario añadir a la sangre recién extraída un anticoagulante. Para ello debe elegirse, el anticoagulante idóneo, procurando que exista una proporción adecuada entre éste y el volumen de sangre extraída. Los eritrocitos son células maduras que carecen de núcleo. El recuento se realiza para determinar el número de eritrocitos por mm 3 de sangre, utilizando para ello sangre con anticoagulante o sangre obtenida por función cutánea. Se pueden emplear métodos autonómicos o hemocitométricos.

Valores referencia: Unidades SI (célx 1012/l) Varones 4.5 a 5.5 Mujeres 4.0 a 5.0 Niños 4.2 a 5.2 Lactantes 3.8 a 5.2 Recién nacidos 5.0 a 6.0

Unid. Tradicionales (millones de células/mm3) 4.5 a 5.5 4.0 a 5.0 4.2 a 5.2 3.8 a 5.2 5.0 a 6.0

Nota: Las unidades tradicionales se escriben con ceros completos

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Variaciones Policitemia. Es el aumento del número de eritrocitos; puede presentarse en diarreas graves, intoxicaciones agudas y en personas que viven en gran altura. Oligocitemia. Es la disminución en el número de eritrocitos; se presenta en anemias, en la leucemia y después de hemorragia. El recuento del número de leucocitos o glóbulos blancos se expresa por mm 3 de sangre. La sangre se deposita en un líquido para diluir leucocitos, dejándolos intactos. En cambio los eritrocitos son destruidos por este líquido. Luego se cuentan los leucocitos en una cámara de recuento, por medio del microscopio, y se calcula el número que existe por mm 3 de sangre. Es importante conocer el número de leucocitos, pues este se altera en casos de enfermedades infecciosas. Existen técnicas autonómicas y hemocitométricas para el recuento de estos y son similares al recuento de G.R.

Valores referencia Grupos de edad Hombres y mujeres Niños de 1 año Recién nacidos Niños de 3 a 9 meses

Leucocitos / mm3 5,000 - 10,000 8,000 - 15,000 10,000 - 12,000 4,000 - 15,000

Variaciones Leucocitosis > 10,000 / mm3 Fisiológico: R.N., al final del embarazo, durante el trabajo de parto, luego de emociones internas Infecciosa: Cuando es originado generalmente por gérmenes piógenos (apendicitis) y algunas infecciones virales como rabia, hepatitis, también en necrosis, enfermedades del metabolismo, etc. Leucomoide > 30 millones / mm 3 Se halla mayormente en infecciones como meningitis, tosferina, mononucleosis infecciosa, tuberculosis y otros procesos graves Leucopenia < 5000 / mm3 Fisiológico. Se presenta en anemia perniciosa, mala nutrición, anemia aplástica Infecciosas. Se presenta en ciertas enfermedades infecciosas en las que disminuye la formación de glóbulos blancos, como sucede en algunos casos: Muy frecuente en fiebre tifoidea, salmonelosis y fiebre de malta (brucelosis). Un número disminuido de leucocitos (leucopenia ( leucopenia)) pueden aparecer en ciertas enfermedades:  Fallo de la médula ósea (por tumores, fibrosis, intoxicación, etc...)  Enfermedades autoinmunes (Lupus, etc...)  Enfermedades del hígado o riñón  Exposición a radiaciones  Presencia de sustancias citotóxicas

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Un número aumentado de leucocitos (leucocitosis (leucocitosis)) puede deberse a: Daño de tejidos en quemaduras Enfermedades infecciosas Enfermedades inflamatorias (por autoinmunidad-reumáticas o por alergia) Estrés Leucemia

ALTERACIONES DE LA MEDICIÓN PORLA ACTUACIÓN DE MEDICAMENTOS Pueden aumentar el número de leucocitos:  Alopurinol  Epinefrina o adrenalina  Cortisona  Cloroformo  Heparina  Quinina  Triamterene

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Pueden disminuir el número de leucocitos: Antibióticos Anticonvulsivantes Antihistamínicos Antitiroideos Arsenicales Barbitúricos Diuréticos Quimioterápicos Sulfonamidas

Determinación de hematocrito Definida como el volumen ocupado por los eritrocitos en una determinada cantidad de sangre. Generalmente se expresa como volumen de eritrocitos por 100 ml. de sangre (%). Es útil para el diagnóstico de anemia. Representa la proporción de glóbulos rojos en la sangre circulante y se expresa en volúmenes por ciento. Técnicas de determinación Técnica del Microhematocrito Microhematocrito Determinación de la velocidad de sedimentación globular (Ertitrosedimentación) Viene a ser la velocidad de caída de los eritrocitos en sangre con anticoagulante. La VSG depende de la velocidad de concentración del fibrinógeno, en menor grado de la globulina y de la diferencia existente entre la densidad del plasma y la masa globular. gl obular. Este examen mide la tendencia de los eritrocitos a sedimentar, a colocar sangre anticoagulada en un tubo en posición vertical. Se lee macroscópicamente a cabo de 1 hora la columna de plasma.

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Técnicas de determinación Técnica de Microsedimentación

MATERIALES Y MÉTODOS 1. Sangre venosa La sangre venosa es necesaria para la mayoría de las pruebas que requieran anticoagulación o cantidades mayores de sangre, plasma o suero de lo que podría proporcionar la sangre capilar. Materiales: - Aguja Nº 21 de 1 ½” - Aguja de vacutainer - Ligadura o torniquete de 25 a 30 cm de largo - Alcohol 70º - Algodón - Jeringas de 5 mL. - Tubos de prueba con EDTA-sequestrene - Tubos al vacío con anticoagulante EDTA (K 3), EDTA (Na2) u otro anticoagulante. - Agujas con dispositivo para extracción de sangre al vacío: - Nº 21 para adultos. - Nº 22 para niños y neonatos. De preferencia, ambas de bisel corto para evitar la coagulación - Gradilla - Guantes - Mascarillas - Marcador de vidrio - Lapiceros. Procedimiento OBTENCIÓN DE SANGRE CON JERINGA O EN TUBO DE PRUEBA a) La sangre venosa es normalmente obtenida de una de las venas de la fosa cubital. b) Aplicar el torniquete aproximadamente cuatro dedos por encima de la flexión del codo. Sujetar con un medio nudo, verificar que los elementos a utilizar estén listos y que el paciente este cómodo. c) Limpiar la zona con alcohol de 70º que puede ser iodado en un área de 2 pulgadas. d) El paciente deberá abrir y cerrar la mano durante unos segundos y después la mantendrá cerrada. Esto ayuda a mantener las venas superficiales. e) Se retira el estuche que protege la aguja de la jeringa y se coge de tal manera que el bisel se encuentre hacia arriba. f) Se coloca la aguja paralela a la vena, se perfora la piel haciendo avanzar la aguja 0.5 a 1 cm, en el tejido subcutáneo, luego se perfora la vena. g) Se aspira la jeringa hasta el volumen requerido. En caso de usar tubo de prueba se deja gotear hasta obtener el volumen deseado. h) Retirar el torniquete e indicar al paciente que deje de hacer puño. Se coloca algodón con escaso alcohol o sin él encima de la punción y se retira la aguja.

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i)

 j)

Retirar la jeringa y vaciar a los tubos de prueba con anticoagulante y una gota a la lámina portaobjetos puede ser utilizado para realizar el frotis. En caso de usar sólo aguja se retira la aguja. Agitar el tubo en círculos sobre la mesa para homogeneizar con el anticoagulante, en caso que se extraiga para exámenes hematológicos. Para exámenes bioquímicos se extrae en tubos de prueba y luego se centrífuga.

OBTENCIÓN DE SANGRE CAPILAR Cuando la cantidad de sangre que se precisa es muy pequeña o cuando por diferentes motivos no pueda practicarse una punción venosa, debe recurrirse a la punción capilar. Materiales - Lancetas descartables - Alcohol - Algodón - Marcador de vidrio - Lapiceros - Cuaderno de apuntes Procedimiento a) La sangre capilar se obtiene de la cara lateral del dedo medio o anular en los adultos y en el dedo gordo del pie o talón en los niños. b) Desinfectar la zona con alcohol de 70%, secar con algodón estéril. c) Usar gasa estéril para desechar la primera gota y recoger las siguientes. Evitar comprimir la extremidad para obtener sangre por que se altera la composición sanguínea. La gota que se forma, para el análisis, debe ser redonda, caso contrario, significa que la piel está húmeda, secar con gasa estéril. Recuento de eritrocitos: Método hemocitométrico Materiales: - Sangre capilar o venosa (con o sin anticoagulante) - Solución de Hayem - Pipeta de Thoma para G.R. - Sorbete - Papel higiénico o algodón - Cámara de Neubauer - Laminilla de Neubauer - Agitador mecánico - Microscopio - Contómetro Procedimiento Preparación para el recuento 1. Mezclar la sangre obtenida con el anticoagulante o tomar sangre capilar.

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-

2. Llenar la pipeta de glóbulos rojos con sangre hasta la marca de 0,5 para realizar una dilución de 1/200, y si se carga hasta 1, la dilución será 1/100. Limpiar la punta con gasa o papel absorbente. 3. Introducir la pipeta en el tubo o frasquito conteniendo diluyente (Hayem) y llenar de líquido de dilución hasta la marca de 101. 4. Se coloca en un rotador automático o se hace rotar manualmente de2 a 3 minutos. 5. Agitar bien la pipeta y descartar 3 a 4 gotas del tallo, luego colocar una gota pequeña cerca de un extremo de la cámara para que por capilaridad se llene exactamente. 6. Hacer el recuento con objetivo de 40x 7. Se puede realizar con la pipeta automática, se toma 20 µL (0,02mL) de sangre total con anticoagulante, o sangre capilar y se deposita en un tubo de 12 x 75 que contenga 4 ml de solución de Hayem (aquí se tiene una dilución de 1:200). Se deja reposar aproximadamente 5 minutos y se procede a cargar la cámara con la misma pipeta usando un nuevo tip. El inconveniente aquí es el gasto de reactivo (4 ml) pero las medidas son más exactas. Recuento - Cuéntese los eritrocitos situados en 5 pequeños cuadraditos del gran retículo central (cada cuadradito pequeño a su vez está subdividido en 16 pequeños cuadraditos, además se debe considerar los 4 pequeños cuadraditos ubicados en los extremos y 1 central). - Se incluyen al recuento las células que toquen los límites izquierdo y superior de los cuadrados, pero no aquellos que toquen los límites derecho e inferior. Anótese la cantidad hallada en cada uno de los cuadrados. Las diferencias entre las cifras mayor y menor no deberá exceder de 20. - Multiplíquese el total de G.R. contados por 10,000 con el objeto de obtener el número de eritrocitos por mm3 de sangre.

Cálculos ¿Por qué multiplicar por 10,000?, por lo siguiente: Dilución de la sangre: 1/200 Volumen total: 0.02 mm3, que resulta de multiplicar 0.00025 mm3 por 80 Factor 1/0.02 mm3 = 50 Glóbulos rojos/mm3 = total de glóbulos rojos contados por inversa de la dilución x Factor = Total de glóbulos rojos contados por 10,000 Otra forma de realizar los cálculos sería el siguiente No de hematíes x mm3 = hematíes contados en 5 cuadrados pequeños Altura x dilución x área REEMPLAZANDO: hematíes contados en 5 cuadrados pequeños 1/10 x 1/200 x 1/5

=

=

hematíes contados en 5 cuadrados pequeños

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1/10,000 = hematíes contados x 10,000 Nota 1). Cámara Cámara de de Neubauer Neubauer mejorada (hemocitómetro). 2). Pipeta de glóbulos rojos (de Thoma).- Presenta cerca del extremo superior, una marca de 101, inmediatamente continúa una dilatación (bulbo) que contiene una perlita roja mezcladora, luego sigue el tallo (extremo más largo), la cual está dividida en diez partes con dos marcas: 1 (acabando el bulbo) y 0.5 a la mitad mitad del tallo. Se utiliza al igual que para para los leucocitos leucocitos una boquilla para aspirar (sorbete). 3). Diluyente de glóbulos Rojos: Cloruro de Sodio al 0.9%. Diluyente de Hayem.

Recuento Total de Leucocitos Materiales: Técnica hemocitométrica anticoagulante) - Sangre capilar o venosa (con o sin anticoagulante) - Solución de Turk - Pipeta de Thoma para G.B. - Sorbete - Papel higiénico o algodón - Cámara de Neubauer - Laminilla de Neubauer - Agitador mecánico - Microscopio - Contómetro Procedimiento Preparación para el recuento - Emplear sangre venosa con anticoagulante o sangre obtenida por punción cutánea. - Utilizando la pipeta de Thoma, aspirar sangre hasta la marca 0.5 Limpiar la sangre excedente del extremo de la pipeta, con papel filtro o gasa, (cantidad) - Completar hasta la marca 11, con solución de Turk y mantener en posición horizontal Evitar la formación de burbujas (volumen) - Agitar la pipeta durante de 03 minutos, utilizando un agitador mecánico o cubriendo los extremos con los dedos de la mano. Utilizar guantes por bioseguridad parte del contenido de la pipeta (3 a 5 gotas) - Eliminar la cuarta parte Para permitir formar muestra del émbolo de la pipeta. - Cargar inmediatamente un lado de la cámara de Neubauer, colocando para ello una gota entre la superficie de la cámara y el cubreobjetos. Se debe evitar la sobrecarga. - Dejar en reposo durante 03 minutos. Para que sedimenten los G. R. en la base de la cámara.

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- Colocar la cámara sobre la platina del microscopio y enfocar a menor aumento (10X), localizando el retículo de la cámara. Aplicar normas de manejo del microscopio

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Recuento - Cuéntese los leucocitos situados en los 4 cuadrantes de los retículos externos de la cámara de Neubauer (cada cuadrado está subdividido en 16 cuadraditos). - Multiplíquese el total de G.R. contados por 50 con el objeto de obtener el número de eritrocitos por mm3 de sangre. - Se incluyen al recuento las células que toquen los límites izquierdo y superior de los cuadrados, pero no aquellos que toquen los límites derecho e inferior. Anótese la cantidad hallada en cada uno de los cuadrados. Las diferencias entre las cifras mayor y menor no deberá exceder de 10. El recuento deberá ser efectuado a menor aumento con objetos de 10X. Cálculos ¿Porqué multiplicar por 50?, por lo siguiente: sig uiente: Dilución de la sangre: 1/20 Volumen total: 0.4 mm3 Factor 1/0.4 mm3 = 2.5 Glóbulos blancos/mm 3 = total de glóbulos blancos contados por inversa de la dilución x Factor = Total de glóbulos rojos contados por 50.

Determinación del hematocrito:Técnica del Microhematocrito Materiales Sangre con o sin anticoagulante Microcapilares heparinizados heparinizados o no heparinizados Plastilina o mechero de Bunsen Gradilla Cronómetro Regla milimetrada Procedimiento Se emplea tubos capilares de 7 cm. de largo y 1 mm. de diámetro interior. Algunos capilares están cubiertos con heparina al 1/100. Otros no tiene y se utiliza sangre con anticoagulante. Se puede utilizar sangre venosa o capilar. El tubo se llena hasta 1 cm del extremo y este se cierra a llama o se tapona con plastilina. Se centrífuga a altas velocidades en centrífuga especial a 16.,500 rpm/3 minutos o a 10,000 rpm/5 minutos o a 3,000 rpm/30 minutos. Después se lee la proposición del volumen ocupado por los hematíes con una regla milimetrada con tabla de lectura para hematocrito o con el dispositivo que para tal fin acompaña a la centrífuga. Valores de referencia Varones Mujeres

40 – 50% 38 – 44%

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Niños (5 años) 38 – 44% Lactantes (3 meses) 37 – 42% Recién nacidos 50 – 58% Variaciones En una anemia crónica pos  – hemorragia, según Wintrobe, el volumen de eritrocitos sedimentados se reduce al 13%, en anemia perniciosa 8%, en la eritemia 60% y en la clorosis 25%. Su valor diagnóstico incluye la intensidad del luecopenia, leucocitosis, alteraciones en el número de trombocitos y aspectos sanguíneos. En general disminuye los valores de hematocrito en los casos de hemodilución tales como: la hidremia fisiológica del embarazo; al contrario de la hemoconcentración a consecuencia consecuencia de shock que dan a valores elevados, aparentemente patológicas.

B).-

Determinación de la velocidad de Sedimentación Globular (Ertitrosedimentación)

Materiales Técnica de Microsedimentación Sangre con o sin anticoagulante Microcapilres heparinizados o no heparinizados Plastilina o mechero de de Bunsen Gradilla Cronómetro Regla milimetrada Procedimiento Se emplea tubos capilares de 7 cm de largo 1 mm de diámetro interior. Algunos capilares están cubiertos con heparina al 1/100. Otros no tiene y se utilizan sangre con anticoagulante. Se puede utilizar sangre venosa o capilar. El tubo se llena hasta 1 cm del extremo y este se cierra a llama o se tapona con plastilina. Se deja en reposo en posición vertical vertical / 01hs. Después se lee la proporción del volumen ocupado por el plasma con una regla milimetrada. Valores de referencia Varones hasta 14 mm / h Mujeres hasta 20 mm / h

Variaciones Se modifica siempre y cuando exista un desequilibrio humoral que afecta a las proteínas plasmáticas acelerándose cuando aumenta la proporción fibrinógeno que ocurre los hematíes y los adhiere entre sí formando globulinas, otros factores son prácticamente despreciables.

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Se observa aumento en todas las enfermedades infecciosas agudas o crónicas en período de evolutivitas, en las afecciones purulentas, tumores malignos, fiebre reumática, enfermedades generativas, enfermedades de la sangre y del sistema hematopoyético, embarazo, etc. La eritrosedimentación también se encuentra aumentada por la ingestión de dextrano, penicilina y vitamina A. Se halla disminuida en la policitemia vera, en algunas afecciones hepáticas, etc.

Anexo N° 01 Información Sobre la Cámara de Recuento 1. Lo que es una cámara de conteo y dónde se utiliza La cámara de conteo es un aparato de vidrio óptico especial de precisión. Se utiliza para contar células u otras partículas en suspensiones bajo el microscopio. Las cámaras de conteo se utilizan principalmente para el análisis de sangre (conteo de leucocitos, eritrocitos, trombocitos) y conteo de pulgadas en el licor. Pero las cámaras de conteo sirven también para el conteo de bacterias y esporas del moho.

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2. Principio de construcción Todas las cámaras de conteo muestran el mismo principio de construcción.

En una placa base rectangular y gruesa de vidrio óptico especial, del tamaño de un porta-objetos, en el tercio medio se hallan cuatro ranuras longitudinales, que transcurren en paralelo con respecto a los laterales cortos. Las dos superficies laterales más grandes están sin trabajar y sirven para la rotulación. El puente central y los dos puentes exteriores están rectificados planos y pulidos. La superficie del puente central es más profunda que los dos puentes exteriores. En el puente central (fondo de la cámara) están grabadas las redes de conteo. Cuando se coloca un cubreobjeto sobre los puentes exteriores, entre la cara inferior del cubreobjeto y el puente central de la cámara de conteo se produce una ranura capilar.

3. Ejecución e identificación de las cámaras de conteo Ejecución

Ejecución simple - puente central sin dividir (una red de conteo)

Ejecución doble - puente central dividido (dos redes de conteo) Además, existen dos ejecuciones diferentes de división de redes: la normal y la de líneas claras: • En la ejecución normal, la red de conteo está directamente grabada en el vidrio. • En la ejecución de líneas claras, primero se recubre con rodio el fondo de la cámara y luego se raya la red de conteo en la capa de rodio. Mediante el desplazamiento del contraste, debajo del microscopio es posible la inversión de color, de manera que la red de conteo se puede ver opcionalmente en líneas claras u oscuras.

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Identificación En las dos superficies laterales, sin trabajar, de la cámara de conteo están impresas las siguientes indicaciones: • El sistema de la red de conteo • El nombre y la marca registrada del fabricante • La profundidad de la cámara en milímetros • La superficie del cuadrado más pequeño en mm 2 4. Fabricación y explicaciones de calidad Las cámaras de conteo son aparatos de precisión. Se utilizan principalmente en laboratorios médicos. En Alemania sólo pueden utilizarse las cámaras de conteo y los cubreobjetos oficialmente contrastados, en el extranjero pueden ser usados también sin contrastar. Todas las cámaras de conteo distribuidas por la empresa Marienfeld se fabrican de acuerdo con la disposición válida sobre el contraste y la norma DIN. Por esta razón, hay que distinguir entre cámaras de conteo clasificadas y cámaras de conteo susceptibles de ser contrastadas. Fabricación Por esta razón, sólo se pretende describir a grandes rasgos la fabricación de cámaras de conteo. El mecanizado comprende varias operaciones parciales, seguidas de los correspondientes controles rigurosos. El puente interior (fondo de la cámara) y los dos exteriores se rectifican y pulen. Gracias a este mecanizado se consiguen superficies especialmente planas y el puente interior (fondo de la cámara) enfrente de los puentes exteriores se rebaja exactamente en la profundidad de la cámara deseada. Después de estas operaciones de trabajo, en la máquina divisora se graba con un diamante la red de conteo correspondiente (sistema). Finalmente se efectúa la fase de impresión y secado al horno. Todas las cámaras de conteo se someten a un riguroso control final, que es regido por las exigencias de la norma DIN en vigor y las prescripciones de contraste. Exigencias en cuanto al control de calidad Las desviaciones de límites según la norma DIN 12847 son las siguientes: • Para la profundidad de la cámara en la zona de una red de conteo + 2 % del valor nominal • Para las distancias inferiores a 0,4 mm entre cualquieras líneas + 2 µm • Para las distancias superiores a 0,4 mm entre cualquieras líneas + 0,5 % del valor nominal • Para los ángulos de la distribución de red + 1 grado • El ancho de las marcas no podrá ser superior a 5 µm. La tolerancia de planeidad, según DIN 7184, parte 1, es la siguiente: • Para el fondo de la cámara en la zona de una red de conteo 2 µm • Para las superficies de apoyo en la zona de una red de conteo 2 µm • Para las láminas cubreobjetos 3µm (según DIN 58884) 5. Llenado de una cámara de conteo Desplazamiento del cubreobjeto

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Los puentes exteriores se humedecen con agua destilada y luego se coloca el cubreobjeto a suave presión desde delante sobre la cámara de conteo.

¡Atención: Peligro de rotura del cubreobjeto! La formación de líneas de interferencia (anillos de Newton) entre los puentes exteriores y el cubreobjeto indica que el cubreobjeto ha sido correctamente colocado. Alimentación Quitar del sacudidor la pipeta bien mezclada y rechazar las primeras gotas. Limpiar, secando, desde el exterior la pipeta y luego mantenerla inclinada hasta que se haya formado una pequeña gota en la punta de la misma. Esta gota se sitúa en el punto entre el cubreobjeto y la cámara de conteo. Por capilaridad se llena la hendedura entre el cubreobjeto y el fondo de la cámara. Antes de que la solución de sangre pueda hincharse en los bordes de la parte de la cámara, deberá haberse retirado de nuevo ya hacia un lado la punta de la pipeta. Si son visibles las burbujas de aire o si el líquido se hincha sobre los bordes en las ranuras, deberá limpiarse la cámara y alimentarse de nuevo.

Pipetas de mezclado de sangre utilizadas • Pipeta de leucocitos (perla blanca)

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• Pipeta de eritrocitos (perla roja)

6. Recuento de las partículas Técnica de conteo El recuento presupone un conocimiento exacto de las líneas límite de las cámaras de conteo utilizadas. Éstas se pueden ver en la ilustración. Para que las células, que están en o cerca de las líneas de limitación, no se cuenten dos veces o se sobrepasen en el conteo, hay que atenerse a determinadas reglas (p.ej., véase la ilustración derecha). Se cuentan todas las células dentro de una zona de medición definida. También se cuentan las células (marcadas en negro), que se apoyan o tocan en las 2 caras (I), p.ej. en la línea de medida izquierda y superior. Esto también es válido para el tipo de la operación de conteo propiamente dicha, que debe efectuarse en forma de meandro.

El recuento se efectúa en el ángulo superior izquierdo en dirección de la flecha.

Observaciones sobre el recuento

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a) En todos los conteos de cámaras, el diagrama del condensador en el microscopio deberá estar cerrado en gran parte. b) La diferencia de las células contadas en los cuadrados grandes y en los cuadrados de grupos no podrá ser superior a 10 células. c) En todos los conteos de células, han de realizarse dobles determinaciones. Después del recuento de la red de conteo superior, se recuenta como control también la red de conteo inferior. Ha de tenerse en cuenta que la cámara no esté resecada. Esto puede evitarse cuando la cámara inferior se llene justo poco antes del recuento y se recuente después del tiempo de sedimentación. d) La diferencia entre las sumas del recuento de ambas redes de conteo no podrá ser superior a 10 células. El valor medio de los conteos se aplica luego en una fórmula de cálculo o se multiplica por el factor correspondiente. 7. Cálculo Fórmula:

EJEMPLO: Cámara: Neubauer improved a) Leucocitos 1. Células recontadas 161 leucocitos 2. Superficie recontada 4 cuadrados ( = 4 × 1 mm² ) = 4 mm² 3. Profundidad de la cámara 0,1 mm 4. Dilución 1 : 20

b) Eritrocitos 1. Células recontadas 507 eritrocitos 2. Superficie recontada 5 cuadrados ( = 5 × 0,04 mm² ) = 0,2 mm² 3. Profundidad de la cámara 0,1 mm 4. Dilución 1 : 200

8. Limpieza de las cámaras de conteo Inmediatamente después del conteo realizado, se quita el cubreobjeto y la cámara de conteo se limpia con agua o - en caso de necesidad - con una solución limpiadora suave.

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A continuación, la cámara se seca con un paño blando o se lava con acetona. 9. Breve descripción de la cámara de conteo Neubauer-improved Los diferentes sistemas de cámaras de conteo se diferencian por la ejecución de la red de conteo y la profundidad de la cámara. La red de conteo está compuesta de una división de red cuadrada que sólo queda visible con el microscopio (aprox. 100 aumentos). A continuación se pretende describir la cámara de conteo Neubauer-improved más utilizada: Cuadrado grande : 1 mm² Cuadrado de grupos : 0,04 mm² Cuadrado pequeño : 0,025 mm² La profundidad de la cámara es de 0,100 mm. La división de red de esta cámara muestra 3 cuadrados grandes 3 veces de una superficie de 1 mm 2, respectivamente. Los 4 cuadrados rectangulares se utilizan para el conteo de los leucocitos. El gran cuadrado en el centro está adicionalmente dividido en 5 cuadrados en grupos de 5 con una longitud lateral de 0,2 mm, respectivamente, y un contenido de superficie de 0,04 mm 2. A su vez, los cuadrados de los grupos están subdivididos en 16 cuadrados pequeños de 0,0025 mm2 cada uno. Cinco de estos cuadrados de grupos son utilizados en el conteo de eritrocitos. Merece especial atención el hecho de que la cámara muestre triples líneas límite por todos los lados, de las cuales la línea central (!) ha de considerarse la línea de medida propiamente dicha. Esto es importante para valorar si las células que están en la zona límite, han de ser o no contadas también. 10. Por qué cámaras de recuento ocupan su puesto en el laboratorio a pesar de contadores eléctricos • En laboratorios menores no vale la pena la compra de aparatos electrónicos caros. • Se usan las cámaras de recuento para p.ej. el recuento de células de licor ó de efusiones, recuento de huevos de verme, bacterias y esporas del moho. • Para el recuento de pocos trombocitos los instrumentos electrónicos son menos exactos que las cámaras de recuento. En la práctica ocurren aplicaciones incorrectas como sigue: • La cámara de recuento no estaba limpiada • El cubre-objeto no está puesto correctamente (ningunos anillos de interferencia) • Hay burbujas de aire en el relleno de la cámara • La cámara está sobrellenada • El tiempo de sedimentación era demasiado corto contadores eléctricos • En laboratorios mayores se usan (gastos altos de inversión) •Desventaja: Con frecuencia se distinguen los tipos de células por tamaños. Resultan errores en los contadores eléctricos a causa de partículas de polvo ó hilachas. •Ventaja: Tienen la ventaja de la evaluación rápida y el error estadístico menor con el recuento de

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muchas

partículas.

Durante

el

recuento

resulta

el

error

estadístico

Fórmula: error estadístico = 1 : n con n = 100 de células contadas 1:100 = 0,1 = 10 % con n = 10.000 células contadas 1:10.000 = 0, 01 = 1 %

CUESTIONARIO 1. Mencione las ventajas y desventajas de la extracción sanguínea venosa y capilar. 2. Esquematice las zonas de punción adecuada para la extracción sanguínea venosa y capilar. 3. Investigue porque se forma hematomas después de la extracción sanguínea. 4. Mencione otros métodos para la determinación de hematíes y las variaciones en el recuento con respecto a los valores referenciales. 5. ¿Qué sucede con la sangre cuando entran en contacto con la solución de Hayen? Explique. 6. Explique cuando ocurre la polisemia. 7. Mencione en que tipos de enfermedades varían los valores de la VSG. 8. Refiérase a las aplicaciones del método automático en hematología.

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PRÁCTICA N° 06

I. -

OBJETIVOS Conocer las diferentes técnicas que se aplican en la determinación del hemograma. Desarrollar las actividades y destrezas del alumno, en el manejo de las técnicas. Que el alumno tenga la suficiente capacidad de interpretación de los resultados.

II. INTRODUCCIÓN El hemograma es un análisis de sangre en el que se mide en global y en porcentajes los tres tipos básicos de células que contiene la sangre, las denominadas tres series celulares sanguíneas:Serie eritrocitaria o serie roja, serie leucocitaria o serie blanca y serie plaquetaria Cada una de estas series tiene unas funciones determinadas, y estas funciones se verán perturbadas si existe alguna alteración en la cantidad o características de las células que las componen. La serie roja está compuesta por los hematíes o glóbulos rojos. Su función primordial es transportar el oxígeno desde los pulmones (a donde llega a través de la respiración) a todas las células y tejidos del organismo. En el hemograma se cuantifica el número de hematíes, el hematocrito, la hemoglobina y los índices eritrocitarios: El hematocrito mide el porcentaje de hematíes en el volumen total de la sangre.   La hemoglobina es una molécula que forma parte del hematíe, y que es la que transporta el oxígeno y el dióxido de carbono; se mide su concentración en sangre. Los índices eritrocitarios proporcionan información sobre el tamaño (VCM), la cantidad (HCM)  y la concentración (CHCM) de hemoglobina de los hematíes; el más usado es el VCM o volumen corpuscular medio. Todos estos valores varían dentro de la normalidad según la edad y el sexo. La serie blanca está formada por los leucocitos o glóbulos blancos. Sus funciones principales son la defensa del organismo ante las infecciones y la reacción frente a sustancias extrañas. El recuento de leucocitos tiene dos componentes. Uno es la cifra total de leucocitos en 1 mm 3 de sangre venosa; el otro, la fórmula leucocitaria, mide el porcentaje de cada tipo de leucocitos, que son: segmentados o neutrófilos, monocitos, linfocitos, eosinófilos y basófilos. El aumento del porcentaje de un tipo de leucocitos conlleva disminución en el porcentaje de otros. Estos valores varían dentro de la normalidad según la edad. La serie plaquetaria compuesta por plaquetas o trombocitos, se relaciona con los procesos de coagulación sanguínea. En el hemograma se cuantifica el número de plaquetas y el volumen plaquetario medio (VPM). El VPM proporciona información sobre el tamaño de las plaquetas. El recuento de plaquetas también varía con la edad.

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Manual de Análisis Clínico I

Como realizar la prueba. Esta prueba no precisa ayuno previo. Previa desinfección se extraen en torno a 5 cc de sangre venosa, generalmente de una vena de la flexura del codo. Tras terminar la extracción y retirar la aguja, se aplica presión en el punto de punción durante unos minutos. Posteriormente se comprueba que no haya hemorragia en dicho punto. Utilidad El hemograma es una prueba que sirve para orientar hacia el diagnóstico de diversas enfermedades que se han sospechado por la historia clínica y la exploración física. A veces, los datos que nos da son suficientes para confirmar o descartar la enfermedad sospechada, pero con frecuencia se necesita utilizar otras pruebas diagnósticas que aporten más información. Factores que interfieren en los resultados  Serie roja: Alteración en el tamaño de los hematíes.  Un número muy alto de leucocitos.   Hemodilución: aumento de la cantidad proporcional de agua en la sangre.  Deshidratación: pérdida de agua del organismo, que se refleja en la sangre.  Embarazo: porque se produce hemodilución. Residencia a gran altitud: por ejemplo, la gente que vive en el altiplano andino.   Hemorragia inmediatamente previa a la prueba. Medicamentos.   Serie blanca:  La ingestión de algunos alimentos, la actividad física y el estrés pueden aumentar el número de leucocitos. Durante el último mes de embarazo y en el parto, puede aumentar la cifra de  leucocitos. Las personas a las que se les ha extirpado el bazo pueden tener una elevación leve  y persistente de la cifra de leucocitos.  Medicamentos, que pueden aumentar o disminuir los niveles.  Serie plaquetaria:  La residencia a gran altitud puede aumentar los niveles de plaquetas. El ejercicio muy intenso puede aumentar el número de plaquetas.  Medicamentos, que pueden aumentar o disminuir las cifras.  III. MATERIALES Y METODOS Se basarán en las siguientes metodologías: 1. Recuento de Glóbulos Rojos: Método hemocitométrico 2. Recuento de Glóbulos Blancos: Método hemocitométrico 3. Recuento de Plaquetas: Recuento en Lámina Porta Objetos 4. Fórmula Leucocitaria: Recuento hemocitométrico 5. Determinación del hematocrito: Técnica del Microhematocrito 6. Determinación de la hemoglobina: Técnica de la cianometahemoglobina

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7. Índices hematológicos: VCM, HCM y CHCM

RECUENTO DIFERENCIAL DE LEUCOCITOS (FORMULA LEUCOCITARIA) OBJETIVOS Conocer, diferenciar y resaltar las funciones de los diversos leucocitos.

INTRODUCCION La fórmula leucocitaria tiene por objetivo determinar los porcentajes de las distintas clases de leucocitos normales y anormales en la sangre. A partir de los porcentajes puede incluso calcularse el número real de cada clase de leucocitos por mm3 de sangre (valor absoluto), conociéndose el total de leucocitos.Por ejemplo:Si se tiene 60% de neutrófilos segmentados y el recuento total de leucocitos total es de 20 000, entonces la cifra absoluta de neutrófilos segmentados sería: 60/100 x 20 000 = 12 000 (valor absoluto) Valores de referencia absolutos de neutrófilos segmentados = 3000 - 5000 Conclusión: Los valores relativos sólo nos sirven cuando los valores totales de leucocitos se encuentran dentro del valor normal. En caso contrario (leucocitosis o leucopenia) se debe emplear la fórmula para obtener el valor real, y así determinar que elemento celular se encuentra fuera del rango nor- mal, sea elevado o disminuido.

PROCEDIMIENTO 1. Preparación del frotis por el método de los dos

portaobjetos Consiste en la extensión de una gota de sangre sobre un portaobjeto (25 x 75), empleando el canto biselado de otro portaobjeto de igual dimensión.

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MATERIALES 

Lancetas descartables  Alcohol 70°  Algodón  Portaobjetos limpios y desengrasados (25 x 75 mm).

PROCEDIMIENTO 

Una vez extraída la sangre con cualquiera de las metodologías, se coloca una pequeña gota de sangre (5mL) (aprox. 3 mm de diámetro) sobre un portaobjeto a 2 cm aproximadamente de uno de los extremos.  Colocar el canto de otro portaobjeto esmerilado sobre la superficie del primer portaobjeto (en la que se encuentra la gota de sangre) formando un ángulo de 45º.  Deslizar suavemente y a velocidad moderada el portaobjeto sobre el otro en sentido longitudinal, hasta que la gota de sangre quede bien extendida sobre la superficie del primer portaobjeto.  El grosor del frotis sanguíneo puede variar según sea el ángulo que formen entre sí ambos portaobjetos. Así, si es superior a 45º, la extensión obtenida será gruesa y corta, si es inferior a 45º será larga y fina. El secado del frotis es a temperatura ambiente y en posición horizontal. Zona excesivamente gruesa: Se halla en la región inmediata al punto de partida de la extensión (cabeza). En ella se aprecia siempre un aumento de linfocitos. Zona excesivamente fina: Corresponde al final de la extensión y termina en un área donde las células adoptan una posición acartonada (barbas). En esta región existe un exceso de granulocitos y monocitos.

ella existe un reparto equilibrado de células.

2. COLORACIONES USADAS Una vez seco el frotis, se procede a la tinción hematológica con el colorante de Romanowsky, constituido por la mezcla de eosina y azul de metileno. Dentro de éstas tenemos: 

Colorante de Giemsa.  Colorante de May-Grunwald.

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

Colorante de Wright.  Colorante de Leishman No todos los leucocitos (G.B.) que circulan en la sangre son idénticos. Existen 5 tipos principales que se diferencian por el tamaño, la forma del núcleo y el color de los gránulos del citoplasma.La proporción o porcentaje de cada tipo de leucocitos es importante para el diagnóstico. Esta proporción o porcentaje se denomina: fórmula leucocitaria. Para trabajar esta fórmula se cuentan 100 leucocitos y se anota el número que se ha encontrado de cada tipo de ellos. -

Los colorantes más usados son:

Para el estudio de las células sanguíneas utilizar el 3 y 4, mientras que para estudio de hemoparásitos utilizar el 1. El 2 utilizar para casos especiales en que se desee observar con mayor claridad y especificidad los gránulos de los neutrófilos.

Valores de Referencia Eosinófilos

1 - 4%

Basófilos

0 - 1%

Neutrófilos: Abastonados (cayado)

2 - 5%

Segmentados

45 - 65%

Linfocitos

20 - 45%

Monocitos

4 - 8%

Factores de error 

Frotis mal elaborado  Tiempo inadecuado de exposición al colorante. 3. Utilización de materiales sucios y/o húmedos.

3. TINCIÓN CON COLORANTE DE WRIGHT Fundamento

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Manual de Análisis Clínico I

El colorante de Wright va a permitir suministrar un medio para estudiar la sangre y determinar las variaciones y anormalidades de estructura, forma y tamaño de los eritrocitos, su contenido de hemoglobina y sus propiedades de coloración. La información obtenida de un frotis de sangre periférica depende en gran parte de la calidad del extendido y la coloración.

MATERIALES 

Colorante de Wright   Frasco gotero.  Solución amortiguada tamponada  Agua tamponada

PROCEDIMIENTO 1. Una vez obtenido el frotis sanguíneo, se le dejará secar entre 15 y 20 minutos. 2. Luego se coloca la preparación en un soporte y se cubre con el colorante de Wright, dejándolo por espacio de 5 minutos. 3. Posteriormente se añade solución amortiguada tamponada en partes iguales hasta obtener un brillo metálico, dejando 6 minutos adicionales. 4. Finalmente se lava con agua corriente y se deja se car. 5. Se coloca en el microscopio y, con pequeño aumento, se revisa la calidad de la coloración, la cantidad aproximada de glóbulos blancos y se escoge el s itio para iniciar el recuento. Se coloca una gota de aceite de inmersión y se enfoca a un aumento de 100x 6. La forma de los glóbulos rojos se examinará detenidamente observando además del color (cantidad de hemoglobina), presencia de plaquetas, su agrupación y distribución.

CUESTIONARIO. 1. Mencione las variaciones en el recuento diferencial de leucocitos en relación a los valores de referencia de los mismos. 2. Mencione las funciones que cumplen cada uno de los leucocitos.

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PRÁCTICA N° 07

I. -

OBJETIVOS Conocer el fundamento y las técnicas para determinar las diferentes fases de la hemostasia. Desarrollar actividades y destrezas del estudiante.

II.

INTRODUCCIÓN

Si por alguna razón se produce la ruptura de un vaso sanguíneo, es decir una solución de continuidad en el endotelio vascular, se producirá la pérdida de la sangre (hemorragia). El organismo pone en movimiento una serie de mecanismos encargados de detener el sangrado; esta respuesta se llama hemostasia. Fases Técnicas a. Fase vascular Tiempo de sangría b. Fase plaquetaria Recuento de plaquetas Hemorragia  HEMOSTASIA Intrínseca Tiempo de tromboplastina c. Fase de coagulación Tiempo de coagulación Extrínseca Tiempo de protrombina d. Fase de fibrinolisis Prueba de fibrinolisis 2. TOMA DE MUESTRAS Consideraciones generales 1. Uso de los anticoagulantes indicados; el tipo y la proporción del anticoagulante deben ser evaluados previamente para cada muestra. 2. La sangre; y luego de su centrifugación, el plasma; obtenido son activados por contacto con el vidrio. Esto puede alterar algunas pruebas por ello se sugiere usar recipientes de superficie “no humedecibles”, como vidrio o plástico siliconado.

3. El material de vidrio debe lavarse con detergente y luego ser puesto en mezcla sulfocrómica por lo menos durante seis horas. Luego debe ser enjuagada con agua destilada varias veces, que residuos de proteínas deben contener sustancias tromboplásticas que activan el mecanismo de coagulación. 4. Las pruebas deben realizarse lo antes posible y de haber demora, éstas se podrán en refrigeración a 4º C, para ser procesadas después. 5. Las pruebas se realizan por duplicado, haciendo uso de controles normales. 6. Las muestras controles serán obtenidos usando la misma técnica empleada para obtener la muestra problema. 7. Los promedios no deben diferir del 10% entre sí.

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EXPLORACIÓN DE LA HEMOSTASIA INTRODUCCIÓN La exploración global de la hemostasia sanguínea puede realizarse mediantevarias pruebas que miden el tiempo que tarda en coagular la sangre o elplasma. No sirve para el diagnóstico del déficit de un factor en particular, perosuministra una idea general sobre el estado de la vía intrínseca y de la víacomún. Para ello existe un conjunto de principios elementales y comunes a todas las técnicas que es preciso conocer para evitar errores en las determinaciones. Limpieza del material de vidrio Las pipetas y los tubos de hemólisis deben estar muy limpios. Los restos de detergente o de plasma influyen sensiblemente en el análisis. Disolución y conservación de los reactivos Para disolver los reactivos deben emplearse agua bidestilada procurando no agitar (evitar la formación de espuma y burbujas). Cuando se emplee plasma control, el tiempo indicado por las diferentes firmas comerciales debe ser respetado. Los reactivos que deben conservarse a unos 4 ºC se guardarán en la nevera. Si existe algún tiempo de caducidad, éste viene siempre indicado en el lote correspondiente. Asimismo, la estabilidad de los reactivos una vez disuelto se está indicada en cada una de las correspondientes metodologías de trabajo. Antes de su empleo, los reactivos deben estabilizarse a la temperatura indicada en la normativa correspondiente. OBTENCIÓN DEL PLASMA A una parte de citrato trisódico estéril 0,1 mol/L se le añade nueve partes desangre (1/10). La punción debe ser directa en la vena. No debe aspirar se violentamente para evitar la formación de espuma y con ello la existencia de un cierto grado de hemólisis, lo que haría inservible el plasma para la realización de las diferentes pruebas. Una vez extraída la sangre, se centrifuga durante 15 minutos a 3500 rpm. El plasma sobrenadante se trasvasa cuidadosamente a otro tubo de hemólisis y puede conservarse hasta cuatro horas a 4 ºC antes de su utilización Tiempo de incubación El tiempo de incubación del plasma con los reactivos correspondientes debe ser muy exacto y la temperatura siempre a 37 ºC. Cuando no se empleen métodos automatizados, el tiempo se medirá mediante un cronómetro, el cual debe dispararse simultáneamente con la adición del reactivo y pararse en el instante en que se inicia la coagulación. Causas de error En la obtención del plasma  –  Estasis venosa prolongada. Favorece la fibrinólisis local.  –  Punción venosa inadecuada.  –  Dilución errónea del plasma. Proporción de sangre-anticoagulante inexacta. Esta proporción (una parte de citrato trisódico + nueve partes de sangre)debe mantenerse con toda exactitud.

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 –  Tiempo de centrifugación inadecuado.  –  Presencia de hemólisis en el plasma.  –  Conservación prolongada del plasma antes de realizar la prueba. Ello conduce a un descenso de la actividad de los factores lábiles (V y VIII) y, por tanto, el plasma debe ser analizado dentro de las dos o cuatro horas de practicada la extracción. En la realización de la técnica  –  Errores de pipeteo.  –  Empleo de los reactivos inadecuados o caducados.  –  Empleo de los reactivos mal preparados.  –  Empleo de una temperatura inadecuada.  –  Tiempos de incubación inexactos.  –  Empleo de agua no destilada. III. MATERIALES Y METODOS 3.1. Tiempo de Sangría Principio. Es definido como el tiempo que transcurre entre la producción del sangrado por la incisión estandarizada realizada en los pequeños vasos superficiales y la terminación de dicho sangrado mediante la producción del tapón plaquetario. Técnicas: Método de Duke Materiales: - Lanceta estéril - Papel filtro - Alcohol yodado - Cronómetro Procedimiento - Limpiar el lóbulo de la oreja con alcohol yodado sin presionar - Practicar la incisión no más de 4 mm con una lanceta - Cada 30 segundos absorber la gota de sangre que se forma con un papel filtro, sin tocar la oreja, hasta que deje de salir sangre. Observaciones Si el tiempo de sangrado se prolonga examine una extensión de sangreteñida según el método de Romanowski para observar si las plaquetasson escasas. Valores de referencia 1 a 4 minutos Interpretación El tiempo de sangría por este método es la mejor valoración de la funciónplaquetaria. La prolongación del tiempo en esta prueba se encuentra entrombocitopenias o las enfermedades de alteración funcional de las plaquetas,como son la enfermedad de Von Willebrand, la tromboastenia de Glasmann,el Síndrome de Bernard-Soulier, la enfermedad de Storage Pool y

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otras. Midein vivo la adhesión, la agregación y la liberación plaquetaria como respuestadel organismo a la lesión vascular. Al realizar esta prueba, debe tenerse siempre en cuenta que la ingesta previade ácido acetilsalicílico puede alterar los resultados. 3.2. Tiempo de coagulación Principio. La sangre al ser extraída sin mayor contaminación con tromboplastina tisular es capaz de coagular cuando se deposita en un tubo de vidrio. El tiempo que tarda este proceso está en relación con el sistema de procaoagulantes e inhibidores fisiológicos y adquiridos que influyen en la formación del coágulo. Técnicas: Método de Burker



Lámina portaobjetos

Materiales - Sangre capilar - Lancetas estériles - Láminas Portaobjetos - Alcohol yodado Procedimiento - Desinfectar el pulpejo del dedo y secarlo con algodón estéril - Practicar la punción con lanceta descartable, eliminar la primera gota - Colocar 03 gotas de sangre en el portaobjetos y tomar el tiempo - Cada 15 a 30 segundos examinar la formación del coágulo con la punta de la lanceta. El punto final, es la formación de un hilo de fibrina que se adhiere a la punta de la lanceta. Valores de Referencia Burker

2 a 4 minutos

Se considera alargado el tiempo de coagulación, cuando difiere en más de 2 minutos del límite superior establecido en cada laboratorio. Interpretación Se observa una reducción del tiempo de coagulación después de hemorragias, esplenectomía, cardiopatía descompensada y anestesia general. Se encuentra aumentado en la afibrinogenemia, hipofibrinogenemia, hemofilia, trombocitopenia, trombocitopatía, déficit acentuado de los factores II, V y X, después del tratamiento con heparina y por hipocalcemia consecutiva a transfusiones reiteradas. También aumenta por la ingestión de anticoagulantes y tetraciclinas. 4.

Recuento de Plaquetas Principio. El contaje de plaquetas se realiza directamente en el microscopio de contraste de fases, previa lisis de los hematíes. También se pueden contar en láminas coloreadas mediante la técnica Wright.

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Técnicas: Recuento en láminas portaobjetos Técnica hemocitométrica Toma de Muestra Se realiza por punción venosa mediante el empleo de jeringa descartable obteniéndose 2 mL. de sangre. A continuación depositar una gota mediana de sangre s obre la lámina portaobjetos; proceder a realizar el frotis sanguíneo. Retirar la aguja de la jeringa y en seguida depositar el contenido de sangre en un frasco con EDTA de secado, tapar y rotar nuevamente la base del frasco hasta la disolución del anticoagulante. Materiales: - Sangre capilar o venosa - Cámara de Neubauer - Pipeta de Thoma para G. R. - Placas Petri - Diluyente: Solución de procaína Solución de procaína: Clorhidrato de Procaína 3g. NaCl 200 mg. Agua destilada csp 100 mL. Conservar en frasco oscuro a 4º C. Disolver, filtrar y guardar por refrigeración hasta por 2 semanas - Anticoagulante EDTA Procedimiento 1. Disponer 0.38 mL. de solución de procaína en tubos de plástico de 12 x 75 mm. 2. Agregar 0.02 mL. (20 µL.) de sangre anticoagulada con EDTA. 3. Mezclar por agitación. 4. Reposo a temperatura ambiente por 15 a 20 minutos. 5. Cargar en cámara de Neubauer en ambiente húmedo. 6. Reposo a temperatura ambiente de 15 a 20 minutos. 7. realizar el recuento de 5 cuadrados grandes en el retículo de Thoma y multiplicar x 1000. Recuento en láminas portaobjetos. Materiales: - Aceite de inmersión. - Agua taponada. - Colorante de Wright. Polvo colorante de wright. 2 g. Alcohol metilico. 1,000 mL. Preparación: Colocar el colorante en un mortero al cual se va agregando pequeñas cantidades de metanol hasta disolución total. El colorante así preparado debe dejarse madurar por lo menos 5 días. Se filtra antes de usar. Procedimiento: - Colorear el frotis sanguíneo con colorante de Wright por 1’.

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-

Agregar agua taponada y controlar 9’.

Lavar con agua corriente. Secar. Echar aceite de cedro en ambos bordes de la lámina y contar el número total de 5 campos en cada borde, teniendo cuidado de que en ellos las plaquetas no estén aglomeradas. El recuento realizado debe multiplicarse por 1,000.

Nota: Ambos recuentos en cámara y en lámina deben guardar relación; se saca un promedio y éste es el valor que se reporta. Valores de Referencia: V.N: 150,000 a 400,000/ mm3 Causas más frecuentes de contaminación en las muestras Hemólisis. Las muestras parcialmente hemolizadas contienen fragmentos del estroma de hematíes, los que producirían un recuento falsamente aumentados. Fragmentos citoplasmáticos celulares. Como los presentes en leucemias pueden interferir en el recuento. Valores de Referencia 150,000 a 400,000 plaquetas / mm3 Interpretación Trombocitosis. Se denomina así al aumento de plaquetas por mm 3 su importancia diagnóstica es escasa, acompaña a estados infecciosos agudos, como escarlatina, fiebre reumática, diversos tipos de septicemia, leucemia mieloide crónica, clorosis, etc. Trombopenia. Es la disminución más o menos acentuada del número de plaquetas; posee importancia diagnóstica. Se observa en la anemia perniciosa, anemia aplástica, leucemia aguda o linfática crónica y algunas veces, al comienzo de enfermedades infecciosas agudas (tifoidea, paludismo, neumonía). Puede ser provocado por antibióticos como el cloranfenicol, la estreptomicina, analgésicos como la antipirina y el salicilato de sodio y la sulfonamida, derivados sulfamídicos, etc. CUESTIONARIO 1. ¿Qué es la hemofílica? Explique las causas que conllevan a esta patología. 2. Esquematice la megacariopoyesis.

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PRÁCTICA N° 09

DETERMINACION DE UREA MÉTODO CINÉTICO OBJETIVOS   

Aplicar el manejo adecuado de la técnica para la determinación de urea en una muestra biológica Establecer los valores de referencia de la urea y comparar con el valor de nuestra muestra problema a analizar. Definir cuáles son las principales patologías que se presentan si tenemos valores altos o bajos de urea en una muestra biológica.

a. DETERMINACIÓN CUANTITATIVA DE UREA EN SANGRE. FUNDAMENTO DEL MÉTODO: La ureasa descompone especialmente a la urea produciendo dióxido de carbono y amoniaco; esta reacciona con fenol e hipoclorito en medio alcalino produciendo azul de indofenol que se determina colorimétricamente. PROCEDIMIENTO: TÉCNICA EN SUERO O PLASMA: En tres tubos de foto colorímetro marcados B (blanco), S (Standard) y D (desconocido) colocar una o dos gotas de agua y agregar. B S D Standard 20 µl Suero o Plasma 20 µl Ureasa 1 gota 1 gota 1 gota Mezclar por agitación suave e incubar 5 minutos a 37ºC luego agregar Reactivo 1 1 ml 1 ml 1 ml Reactivo 2 1 ml 1 ml 1 ml Mezclar por agitación suave e incubar 5 minutos a 37ºC. Luego agregar. Agua destilada 10 ml 10 ml 10 ml Mezclar por inversión y retirar del baño. Después de 10 minutos leer en foto colorímetro con filtro verde (510 – 550 nm) o en espectrofotómetro a 540 nm, llevando a cero con el blanco. VALORES REFERENCIALES: 0.20 – O.45 g/L.

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Manual de Análisis Clínico I

INTERPRETACION. Su aumento, se interpreta generalmente como una posible disfunción renal, no se deja de lado al hecho que los valores séricos de urea están relacionados con la dieta y el metabolismo proteico. c. DETERMINACIÓN DE GLUCOSA EN SANGRE FUNDAMENTO. La glucosa se oxida enzimáticamente por la glucosa oxidasa a ácido glucónico y agua oxigenada; agua oxigenada en presencia de peroxidasa produce la copulación oxidativa del fenol con la 4- aminoferazona (4-AF) dando lugar a la formación de un cromógeno rojo cereza con observancia máxima a 505 nm.

PROCEDIMIENTO Entre tubos de ensayo, marcados B(Blanco) S(Estándar) y D(Desconocido). colocar. B S D STANDAR 20 µL MUESTRA 20 µL REACTIVO DE TRABAJO 2 µL 2 µL 2 µL Incubar por 10 minutos en Baño María a 37º C, luego leer en espectrofotómetro a 505 nm. calibrando el aparato a cero con el blanco. VALOR DE REFERENCIA En suero 0,70 – 1.10 g/L. INTERPRETACION DIABETES MELLITUS: Síndrome caracterizado por una secreción anormal de insulina, que se refleja en una tendencia a la hiperglicemia, asociado con glucosuria. d. DETERMINACIÓN DE CREATITINA FUNDAMENTO DEL METODO La creatinina y otros compuestos de la muestra reaccionan con ácido pícrico en medio alcalino dando un complejo coloreado, rojo que se cuantifica mediante lectura fotométrica. La determinación de creatinina puede llevarse a cabo por medio de una técnica de punto final, o por una técnica cinética eliminándose en ambas el color que se debe a los cromógenos no creatinina. En el primer caso, la adición de ácido o al medio, destruye el picrato de creatinina pero no el color formado por los de más compuestos. Por lo tanto la diferencia entre la lectura fotométrica antes y después del agregado de ácido, permite cuantificar la creatinina en forma específica. En la técnica cinética, los cromógenos no creatinina, reaccionan dentro de los primeros 302 de iniciada la reacción, que se comporta como cinética de primer orden para la creatinina. De manera dentro de los 30” y los 5 segundos posteriores al inicio de la reacción, el incremento de color se debe exclusivamente a la creatinina. LA CREATININA DIRECTA Elimina la interferencia dada por proteínas, mediante el empleo de un bloqueador de sitios reactivos (La 5 – Dimetil Animo Naftalen Sulfonamida o DANS) determinando creatinina en forma cinética o de punto final, con resultados comparables a los de los métodos de referencia.

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PROCEDIMIENTO En tres tubos de ensayo marcados B(blanco), S (standard) y D (desconocido), colocar. B S D(suero) Desproteinizado ----3 ml Estándar --0.5 ml --Agua destilada 1 ml 0.5 ml --Reactivo 1 2 ml 2 ml --Reactivo 2 0.5 ml 0.5 ml 0.5 ml Se mezcló por inversión, se incubó 20 minutos a temperatura ambiente. Luego leer en fotocolorímetro con filtro verde (500 a 540 nm.), se llevó a cero el aparato con agua destilada. Reactivos: Reactivo 1 : ácido pícrico 41.4 mol/L Reactivo 2 : buffer glicina/NaOH 1mol/L, PH final 12.4 Reactivo 3 : solución de creatinina 20mg/L Cálculos: Creatinina en suero (mg/L) = D x F; F= 20mg/L Valores de Referencia: Creatinina: 0.8 – 1.4mg/100mL. CUESTIONARIO 1. ¿Qué es el estándar y cuál es su aplicación? 2. ¿Qué pruebas bioquímicas se realizan para diagnosticar enfermedades hepáticas, cardiovasculares, metabólicas y pancreáticas?

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PRACTICA N° 10

I. OBJETIVOS - Conocer el fundamento, las técnicas serológicas y su aplicación en el diagnóstico de diferentes enfermedades. - Conocer el fundamento e importancia de la aplicación de la prueba de Widal y Reagina plasmática rápida.

II. INTRODUCCIÓN El diagnóstico de una enfermedad puede realizarse utilizando métodos directos: microbiológicos, serológicos y molecular e indirectos: serológicos/inmunológicos. La aplicación de las diferentes técnicas en el diagnóstico depende de factores principalmente como sensibilidad, especificidad y valor predictivo; sin embargo otros factores influyen notablemente en su aplicación tales como el tiempo de ejecución y el costo que ocasiona dichos diagnósticos que finalmente son determinantes principalmente en países en vías de desarrollo como es nuestro Perú. Como toda técnica inmunoquímica se basa en reacciones específicas antígeno-Anticuerpo, que en estos casos es de tipo primario (directo), consiste en buscar antígenos y el tipo secundario (indirecto) se basa en la búsqueda de anticuerpos.

DIAGNÓSTICO DE UNA ENFERMEDAD

DIRECTO

Microbiológico

Hemocultivo Coprocultivo Mielocultivo Bilicultivo Cultivo celular

Molecular

PCR Sondas A. N. Norther Blot Souther Blot

INDIRECTO

Serológico

Serológico

- Aglutinación - Precipitación - Inmunodifusión - Fijación de complem. - Inmunoelectroforesis - Inmunofluorescencia - ELISA - RIA

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Serológico: - Aglutinación - Precipitación - Inmunodifusión - Fijación de complem. - Inmunoelectroforesis - Inmunofluorescencia - ELISA - RIA - Western-Blot

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El desarrollo de la biología molecular y la producción de anticuerpos monoclonales, ha permitido disponer, en los últimos años, de reactivos de diagnóstico de gran sensibilidad y especificidad, incluso en forma de KITS, de fácil y sencilla realización e interpretación. De entre todos los métodos actualmente disponibles, destacaremos en este capítulo, por una parte, aquellos que presentan las mayores posibilidades para llevar a cabo estudios serológicos a gran escala y pueden ser realizados sin necesidad de grandes medios técnicos. Sensibilidad de las diferentes técnicas para la detección de anticuerpos ( g/ml) MÉTODO SENSIBILIDAD ( g/ml) Precipitación en gel 30 Precipitación en anillo 18 Aglutinación bacteriana 0,05 Fijación de complemento 0,05 Hemaglutinación pasiva 0,01 Inhibición de la hemaglutinación 0,005 Inmunofluorescencia 0,005 ELISA 0,0005 Neutralización bacteriana 0,00005 PRUEBAS SEROLOGICAS Basada en la capacidad que tiene el organismo humano de responder frente a una agresión microbiana formando anticuerpos específicos (IgG, IgM) contra los antígenos microbianos, situación que puede ser detectada y servir de ayuda diagnóstica. Por otro lado, es factible detectar la presencia de antígenos en los fluidos biológicos para todos estos casos se han diseñado una variedad de puebas. Entre las pruebas serológicas más comunes tenemos: Aglutinación, precipitación, inmunofluorescencia, turbidimetría, Inmunoensayo (RIA, EIA, EQL, WB). a). Aglutinación. Tipos: Directa Indirecta (pasiva): Antígeno Aglutinación Reversa: Anticuerpo Inhibición de la Hemaglutinación b). Precipitación. Tipos: Precipitación en fase líquida. Precipitación en fase sólida (inmunodifusión). Inmunofisión simple Inmunodifusión doble Microfloculación c). Inmunofluorescencia. Tipos:

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Inmunofluorescencia Directa: Anticuerpo marcado + antígeno Inmunofluorescencia Indirecta: Anti-anticuerpo marcado + (anticuerpo + antígeno) d).- Enzimoinmunoanálisis (EIA). Tipos: ELISA Directa.- Para la Detección de antígenos ELISA Indirecta.- Para la detección de anticuerpos ELISA de competición.- Para la detección de anticuerpos e).- Western Blotting. (inmunoelectrotransferencia o westerblot) III. Ejemplos de reacciones serológicas. A.1.- Reacciones de aglutinación para enfermedades febriles. Reacción de Widal. Es una reacción serológica que se emplea para el diagnóstico de las infecciones líticas y paralíticas A y B. Como las salmonellas infectantes tienen ambos antígenos (O y H) es necesario determinar en el suero del paciente el nivel de los anticuerpos correspondientes a cada uno de ellos, para certificar la existencia de la enfermedad y evaluar su curso. Reacción de Huddleson. Se emplea para el diagnóstico de la brucelosis; se detectan los anticuerpos producidos por cualquiera de las tres especies de Brucella (B. abortus, B. suis y B. melitensis). Reacción de Weil-Felix. Se emplea para la detección de las enfermedades por richettsia (Tifus exantemático). En este caso el antígeno no es la misma rickettsia infectante, sino la cepa de Proteus OX19, ya que ambas tienen algunas fraciones antigénicas comunes. Existen 6 tipos de antígenos: 1.- Antígeno típico H (Flagelar) 2.- Antígeno típico O (Somático) 3.- Antígeno paratípico A 4.- Antígeno paratípico B 5.- Antígeno Brucella 6.- Antígeno Proteus OX19 Procedimiento a. Prueba cualitativa - Se utiliza una lámina excavada o una lámina de vidrio cuadrado de 15cm de lado dividida en 36 cuadrados pequeños. - Se pone las siguientes marcas, en la parte superior: O, H, A, B, Br. OX que corresponden a cada uno de los antígenos enumerados anteriormente. - Se coloca una gota del suero del paciente en cada uno de los 6 cuadrados. - Se coloca una gota de antígeno sobre la del suero en el cuadrado respectivo y se mezclan. - Después de un reposo de 1 a 3 minutos se observa el resultado: 1. POSITIVO Cuando hay aglutinación visible a simple vista. 2. NEGATIVO cuando las mezclas permanecen homogéneas. b.- Prueba cuantitativa Titulación: se lleva a cabo sólo en el antígeno que dio aglutinación con la prueba cualitativa.

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En 5 cuadrados diferentes se colocan cantidades decrecientes de suero problema, utilizando una pipeta de 0.2 cc. Luego se agrega una gota de antígeno, se mezcla y se lee. En la gráfica puede verse la cantidad de suero usada y el título que le corresponde. Tubo N° Suero Problema (ml) Antígeno Título 1 0.08 1/20 01 Gota 2 0.04 1/40 01 Gota 3 0.02 1/80 01 Gota 4 0.01 1/160 01 Gota 5 0.005 1/320 01 Gota Cuando la aglutinación persiste hasta el título de 1/320 se hacen diluciones al décimo del severo problema (0.1 cc de suero y 0.9 cc de solución salina). Se procede igual como indica el cuadro y el resultado se multiplica por 10. VALORES NORMALES Reacciones Antígeno  –  Anticuerpo Anti – Típhico H Valor diagnóstico Anti – Típhico O Valor diagnóstico Anti – Típhico A Valor diagnóstico Anti – Típhico B Valor diagnóstico Brucellas Valor diagnóstico Proteus OX19 Valor diagnóstico B.-

1:128 1:160 1:80 1:80 1:80 1:80

REACCIONES SEROLOGICAS EN LA CLINICA Prueba de VDRL: Venereal Disease Research Laboratory Se llama así a la reacción de floculacion adaptada por la Venereal Disease Research Laboratory de Estados Unidos en la que se utiliza antígeno la cardiolipina, con la cual se efectúan pruebas para un diagnóstico presuntivo de sífilis. Reactivos Antígeno VDRL Diluyente de solución salina tamponada Técnica 1.- Prueba cualitativa a. Preparación del suero - El suero se obtiene a partir de sangre coagulada y posteriormente centrifugada. - Llevar el suero claro al baño de agua a 56° C por 30 minutos con el objeto de inactivar el complemento. b. Preparación del antígeno - Pipetear 0.4 mL. de la solución salina tamponada en el fondo del frasquito pequeño. - Añadir 0.5 mL de antígeno girando el frasquito continuamente sobre una superficie plana. - Añadir 4.5 mL. de solución salina tamponada, luego agitar de arriba  – abajo repetidas veces. c. Prueba - Colocar una gota de suero inactivo en una excavación de lámina.

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-

2.-

Agregar una gota de suspensión de antígeno Llevar al agitador por el espacio de 5 minutos. d. Resultados - Grumos medios y grandes REACTOR ( R) - Grumos pequeños DEBIL REACTOR (DR) - Sin grumos o aspereza ligera NO REACTOR (NR)

Prueba cuantitativa Todos los sueros que resulten Reactor y Débil reactor en la reacción cualitativa debe analizarse cuantitativamente. 1.- Prepara diluciones del suero problema a: 1/2, 1/4, 1/8, 1/16, 1/32, 1/64, de la siguiente manera. - A cada tubo número de 6 colocar 0.5 cc de suero fisiológico. - Agregar 0.5 cc del suero del paciente al primer tubo y mezclar bien. - Transferir de primer tubo al segundo y previa mezcla transferir 0.5 cc el segundo al tercero y así sucesivamente hasta el sexto tubo. Al final se elimina los 0.5 cc sobrantes. 2.- Colocar 0.05 cc de cada dilución de una excavación de la lámina es decir de la dilución ½, tomar 0.05 cc y colocarlo en una excavación y así sucesivamente. 3.- Agregar con la ayuda de una hipodérmica con aguja N° 10 un agota de antígeno en cada dilución. 4.- Realizar movimientos de rotación a más o menos 120 RPM durante 4´. 5.- Realizar la lectura con ayuda del microscopio y observar la presencia o ausencia de floculación. 6.- Para el resultado se toma en cuenta la última dilución que presenta aglutinación. CUESTIONARIO 1. Explique el fundamento de la prueba de ELISA y sus aplicaciones. 2. Explique el fundamento de la prueba de RPR. 3. Mencione las diferencias entre una prueba serológica e inmunológica.

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PRÁCTICA N° 11

I. OBJETIVOS  Conocer el fundamento, las técnicas serológicas y su aplicación en el diagnóstico de diferentes enfermedades.  Conocer el fundamento e importancia de la determinación del grupo sanguíneo  Conocer el fundamento del diagnóstico de embarazo II. INTRODUCCIÓN DETERMINACIÓN DE GRUPO SANGUÍNEO ABO Y FACTOR RHESUS Cuando se producen anticuerpos en respuesta a glóbulos rojos producidos por individuos de su misma especie se habla de isoanticuerpos o isoantígenos. Tal es el caso de la presencia de isoantígenos en los glóbulos rojos del hombre controlados genéticamente y transmitidos a través de los cromosomas; de acuerdo a esto se han establecido en el hombre la presencia de diferentes grupos sanguíneos. Igualmente en el suero se contratarán anticuerpos contra los ausentes. Si colocamos glóbulos rojos frente a antisueros conocidos podemos identificar los antígenos presentes por la presencia de una reacción de aglutinación. Sin embargo no basta sólo una identificación del grupo sanguíneo tanto del donante como del receptor, es necesario enfrentar el suero del paciente con los glóbulos rojos de donante para tener la seguridad que no hubo error y excluir algunas irregularidades de la reacción que se produce a veces. En el año de 1900 Karl Landststeiner establece el sistema AB() para la clasificación de la sangre, años después se llegó a establecer el AB, A1 (Ag. fuerte). A2 (Ag débil ). A3. ...., Am.. Posteriormente se estableció muchos grupos: ABO, MNSs, P, Rh, Lutheran, Kell, Lewis, Daffv, Kidd, Auberg, Xg, Doombrok Grupo Sanguíneo ABO.- En los glóbulos rojos. los determinantes antigénicos, están a nivel de la membrana celular; los cuales se tratan de aminoazúcares: glucosamina y galactosamina, los que ligados a proteínas (por que son haptenos) adquieren la capacidad antigénica. Características de los cuatro tipos sanguíneos: ABO Grupo Sanguíneo G.R.: Antígenos Suero/Plasma: Anticuerpo "A" A Anti- A "B" B Anti- B "AB” AyB -"O" --Anti- A y Anti-B Factor Rhesus.- En el Año de 1940 Landsteiner - Wiener descubrieron el Factor Rh, cuando estudiaban la sangre de los monos Macaccus rhesus, el cual también presentaba el 85% de la población humana. El estudio del factor Rh es muy importante para las transfusiones sanguíneas,

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ya que es un poderoso antígeno, que cuando se realiza una transfusión sanguínea incompatible, ocasionará grandes problemas post- transfusionales; así también en incompatibilidad de sangre Rh (-) de la madre y el feto Rh (+), proceso conocido como eritroblastosis feta III. DETERMINACIÓN DEL GRUPO SANGUÍNEO ABO Y FACTOR RHESUS GRUPO SANGUÍNEO ABO Materiales  Suero Anti  – A monoclonal o policlonal.  Suero anti - B monoclonal o policlonal.  Suero anti AB monoclonal o policlonal.  Lectin  Centrifuga  Gradilla de tubos  Reactivos de eritrocitos A1. By O en suspensión al 5% en Sol Salina  Fisiológica  Tubos de 10 x 15 mm.  Pipetas Pasteur  Lámparas  Lente de magnificación Procedimiento Fase celular Colocar una gota de anti  – A en un tubo de ensayo, rotulado y limpio. Colocar una gota de anti  – B en un tubo de ensayo, rotulado y limpio. Colocar una gota de anti  – AB en un tubo de ensayo, rotulado y limpio Agregar a cada tubo un agota de suspensión al 5% (en solución salina) de los Eritrocitos o hematíes en evaluar. Mezclar el contenido de los tubos y centrifugue por 15 segundos a 3400rpm. ó 1000 rpm por 1 minuto. Re suspenda nuevamente los botones celulares y examinar si existe aglutinación, inclinar el tubo hasta la posición horizontal y leerlo contra un fondo bien iluminado. Leer, interpretar y registrar los resultados según patrón. Tubo en mano. Patrón de lectura: Una cruz: aglutinación homogénea. Dos Cruces: grumos irregulares, sobrenadante transparente. Nota: si es grupo A usar lecitina A1. Seguir el mismo procedimiento anterior. Interpretación o Si hay aglutinación indica presencia del antígeno correspondiente al suero utilizado Si no hay aglutinación indica la ausencia del antígeno correspondiente al suero o utilizado. Fase Sérica En tres tubos rotulados como A, B y O agregar dos gotas de suero a cada tubo. Agregar una gota de hematíes conocidos de A al tubo marcado A.

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Agregar una gota de hematíes conocidos de B al tubo marcado B. Agregar una gota de hematíes conocidos de O al tubo marcado O. Mezclar suavemente el contenido de los tubos y centrifugar durante 15 s egundos a 3400 rpm. ó 1000 rpm por 1 minuto. Resuspender suavemente los botones celulares y detectar la existencia de aglutinación, inclinándolo hasta la posición horizontal y leerlo contra un fondo bien il uminado. Leer, interpretar e informar tubo en mano, según patrón. Interpretación Si hay aglutinación indica presencia del anticuerpo correspondiente a la o suspensión de hematíes utilizado. Si no hay aglutinación indica la ausencia del anticuerpo correspondiente a la o suspensión de hematíes utilizado. FACTOR RH Materiales y equipos:  Suero anti – D.  Albumina (control Rh)  Tubos 10 x 75 mm.  Hematíes lavados al 5% en solución salina fisiológica.  Pipetas Pasteur. Procedimiento: Colocar una gota de suero anti  – D en un tubo de ensayo, limpio y rotulado. Colocar una gota de albumina (control Rh) en otro tubo de ensayo, limpio y rotulado. Agregar a cada tubo una gota de la suspensión al 5% (en solución salina fisiológica) de los En trocitos a examinar. Mezclar suavemente y certificar por 15 segundos 3400 rpm. Desprender el botón de células del fondo del tubo agentándolo suavemente, inclinarlo hacia a posición horizontal y leerlo contra un fondo bien iluminado para apreciar la aglutinación. Anotar inmediatamente, tubo en mano, los resultados de la aglutinación según patrón. Informar en cruces de 0 a 4. Interpretación: Si hay aglutinación indica presencia del antígeno D correspondiente a un RH positivo. Si hay aglutinación indica ausencia del antígeno D correspondiente a un RH negativo, debe ser confirmado por el test del variante Du.

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Nota:

El control RH en todos los casos no debe aglutinar por ser un control serológico negativo.

DIAGNÓSTICO DE EMBARAZO Las pruebas de embarazo detectan la presencia en orina de hormona de Gonadotrofina Corionica humana (GCH)producida por el tejido trofoblástico placentario durante la gestación o por tumores de origen trofoblástico en hombres y mujeres. En la práctica diaria las pruebas que se utilizan mayormente se basan en la inhibición de la hemaglutinación o del látex. Comercialmente existen conjuntos de reactivos (Sed) del diversas marcas para realizar en tubos o en láminas, como la Gravindex. Pergnosticon. Planotest. Gamma. Fundamento. Se necesitan glóbulos rojos partículas de látex cubiertas con GCH (servirán de antígeno y un suero anti GCH) (Anticuerpos contra GCH). Cuando la orina no contiene GCH al mezclarse con el suero GCH no sucede nada, pero al añadir los glóbulos rojos o las partículas de látex cubiertos con GCH sucede una reacción antígeno anticuerpo visualizándose una aglutinación (Prueba negativa). La orina contiene GCH al reaccionar con el suero anti GCH lo neutraliza. Pero no se visualiza y finalmente al agregar los glóbulos rojos o las partículas de látex no sucede ninguna reacción (prueba positiva). Procedimiento en placa: Prueba de Latex Seguir las indicaciones de cada fabricante para la obtención de buenos resultados. El procedimiento usual en lámina es como sigue: 1. La muestra de orina debe ser tomada como para examen de orina completa y de preferencias procesar antes de las 12 horas, en caso contrario refrigerarse hasta por 24 horas. 2. Con un dispensador descartable colocar una gota de orina en una lámina de fondo oscuro. 3. Añadir una gota de suero anti GCH, mezclar y luego oscilar la lámina circularmente por 30 segundos. 4. Añadir una gota de partículas de látex cubiertas con GCH, mezclar luego oscilar la lámina por 2 minutos y observar la presencia de aglutinación. Resultados:

Aglutinación: Negativo (no existe gestación) No Aglutinación: Positivo (gestación)

Test rápido de ELISA en Micropaca: Beta-Gonadotropina coriónica humana (Test Cualitativo). Antes de proceder con el análisis atemperar los reactivos, controles y muestras a 20- 27ºC. 1. Rotule la microplaca para cada suero de referencia, controles y muestras de cada pa ciente. Se recomienda utilizar tips nuevos para cada muestra, los cuales vienen dentro de la bolsa de alumnio almacenados a una temperatura de 2 a 8 ºC 2. Poner una gota con la micropipeta de 0.025 mL (25µL) del frasco de suero de referencia, control y de la muestra en la microplaca.

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3. Luego añada dos gotas de la solución HCG-enzima a todos los ensayos 4. Gire con movimientos de rotación la microplaca por el espacio de 5 a 10 segundos y mezcle, e incube a temperatura de 20 a 27 ºC por 10 minutos. 5. Deseche el contenido de la microplaca por decantación o aspiración. Si utiliza la decantación deseche el residuo de la microplaca con papel absorbente. 6. Finalmente a los tips utilizados en los ensayos, lave de dos a tres ceces con agua fría. 7. Luego añada 2 gotas de la solución sustrato a todas las muestras. No mueva la placa despues de la adición del sustrato. 8. Incube a una temperatura de 20  – 27 ºC por 5 minutos Interpretación Si el color se evidencia de menos intensidad que el del calibrador B se considera negativo (< 25mIU/mL.) Si el color se evidencia de mas intensidad que el del calibrador B s e consdera positivo (≥25mIU/mL.)

CUESTIONARIO ¿Porque es importante el estudio de los grupos sanguineos ABO? Explique Refiérase sobre los efectos adversos de la transfusión sanguínea.

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PRÁCTICA N° 12

I. OBJETIVOS  Conocer el fundamento, conceptos generales y manejo de las diferentes técnicas de análisis de muestras de orina que se manejan en el examen completo de orina..  Interpretar los resultados obtenidos de las muestras analizadas.

III. INTRODUCCIÓN Es un conjunto de exámenes realizados en una muestra de orina que nos permita obtener una información cualitativa, cuantitativa o semicuantitativa de los componentes de la orina. OBTENCION DE MUESTRAS Para las pruebas cualitativas ordinarias se puede emplear en muestra tomada en cualquier. El momento en que se obtiene una muestra de orina deben ser el adecuado al tipo de examen que se va realizar. En lo posible se debe tener en cuenta ciertas recomendaciones para la obtención de la muestra de orina que va permitir obtener datos más precisos. La técnica recomendada para este tipo de análisis es la llamada “chorro intermedio” que consiste en desechar el chorro inicial a fin de

eliminar la flora microbiana residente en la uretra y tomar el chorro intermedio en un frasco de vidrio de boca ancha, limpio, seco y estéril. La calidad del análisis depende en las condiciones que se toma, se almacena y se procesa la muestra, razón por la cual se debe tener en cuenta los siguientes aspectos: a).- Hora de recolección. De preferencia la primera orina de la mañana, debido a que los diferentes elementos, que se encuentran en la orina estarán más concentrados. b).- Evitar la contaminación. Indicando al paciente el lavado externo de los genitales con agua y  jabón común, no es aconsejable el uso de antisépticos. El paciente de origen rural, y personas que carecen de hábitos de higiene la contaminación externa de la orina es muy frecuente, lo que ocasiona cambios en cuanto al aspecto físico de la orina. c).- Inicio del examen. La descomposición de la orina es especialmente rápida en ambientes cálidos. Es preferible el examen inmediato. d).- Toma de datos del paciente. Datos que permitan identificar la muestra, además de otros que puedan ayudar a determinar la patología. Los conservadores, en general son poco satisfactorios. Se emplean lo siguiente: Toluol.- 2 mL de toluol por 100 mL. de orina Timol.- un pequeño fragmento flotante conserva la orina por varios días. Formalina.- se emplea una gota por cada 30 ml. de orina. La formalina en concentraciones demasiadas altas precipita las proteínas. Es un agente fuerte y puede reducir el cobre o bismuto en las pruebas para glucosa.

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Acido bórico.- una cucharadita de polvo (0.3 g.) retardará la descomposición de 120 ml. de orina. Permite el crecimiento de hongos y precipita los cristales de ácido úrico. EXAMENES A PRACTICARSE 1. EXAMEN FISICO Volumen - Este parámetro es influenciado por múltiples condiciones como son tamaño del paciente, tipo de alimentación, actividad física, disponibilidad de agua, temperatura y humedad ambiental entre otros. En personas adultas normales se estima que se producen aproximadamente de 600 a 2500 mL. de orina cada 24 horas. - El volumen de orina se debe determinar en los casos en los que clínicamente se observe poliuria y polidipsia, proteinuria y para evaluar la perfusión renal en pacientes en estado de choque. - El volumen se toma iniciando con una vejiga vacía, para lo cual a las 0 horas se indica al paciente que miccione la orina y se desecha, las siguientes micciones se recolectan en un frasco los suficientemente grande, luego a las 24 horas se le indica que miccione, el cual se recolecta. Color - Determinar el color de la orina puede ser subjetivo en algunos casos, ya que puede existir enfermedad aunque el color sea normal y está influenciado por la presencia de pigmentos tanto endógenos como exógenos y aunque el conocer el color nos puede indicar una anormalidad, esta información puede ser muy inespecífica. El color de la orina es muy importante en los casos de determinaciones analíticas colorimétricas. La intensidad del color está directamente relacionada con la gravedad específica. Se debe considerar también la administración de medicamentos, dieta y medio ambiente. - El color normal de la orina es de amarillo claro a ambarino, color que esta dado principalmente por 2 pigmentos que son el urocromo y la urobilina. - El color se determina colocando 10 mL de orina en un tubo de prueba, luego del cual se realiza la observación. Olor  –  Normal: Suigéneris  –  La detección de olores anormales es indicativa de un estudio más profundo del paciente, aunque es muy inespecífico para la determinación de algún padecimiento.  –  La determinación del olor es poco frecuente sin embargo su determinación podría permitir facilitar el diagnóstico presuntivo.

Aspecto - Se refiere a la claridad o turbidez que pueda presentar la orina, pudiendo ser: Límpido, Ligeramente turbio, Turbio y Muy turbio. - En la mayoría de las especies es translucida, aunque tiende a ser ligeramente turbia a medida que es más concentrada. - Las alteraciones producidas in vitro principalmente por el aumento de la temperatura y pH, pueden causar la disminución en la transparencia. - La causa de la turbidez de la orina se debe explicar en base a los hallazgos del estudio del sedimento urinario, pero los problemas más comúnmente asociados a la turbidez de la orina

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pueden ser: cristales, eritrocitos, semen, bacterias y levaduras, contaminantes, lípido, moco, etc. - Su determinación se realiza, colocando 10 mL de orina en un tubo de prueba, luego realizar la observación Reacción (pH) - Se puede usar papel tornasol, el papel de nitracina o cualquier otro indicador de pH. - Normal: 4.5 a 6.5. - Su determinación se realiza a través de tiras reactivas Densidad - La densidad puede ser medida mediante el refractómetro, cintas de inmersión y el Urinómetro o Urodensímetro. - Normal: 1,010 a 1,030. 2. EXAMEN QUÍMICO El análisis de orina de rutina incluye pruebas químicas para pH, proteínas, glucosa, cetonas y sangre oculta. Algunos laboratorios también incluyen pruebas de bilirrubina, urobilinógeno y nitrito, según el tipo de tira reactiva que utilice. Desde la introducción de tiras reactivas simples y múltiples, cintas de prueba y tabletas, el examen químico de la orina se ha convertido en un procedimiento sensible y rápido. Actualmente es posible analizar hasta nueve pruebas diferentes en menos de 60 segundos. Existen dos marcas básicas de tiras reactivas y cada una posee tiras reactivas con posibilidad de medir desde una hasta nueve reacciones diferentes. a) Proteínas b) Glucosa c) Acetona d) Bilirrubina e) Urobilina 3. EXAMEN MICROSCÓPICO DE SEDIMENTO URINARIO El examen microscópico constituye una parte vital del análisis de orina de rutina. Es una herramienta diagnóstica valiosa para la detección y evaluación de trastornos renales y del tracto urinario, así como de las enfermedades sistémicas. El valor del examen microscópico depende de dos factores fundamentales: el examen de una muestra adecuada y el conocimiento de la persona que realiza el estudio. La mejor muestra para el análisis de orina de rutina es la primera micción de la mañana. Los cilindros y hematíes tienden a disolverse o lisarse en muestras de bajo peso específico o de pH alcalino, la primera orina de la mañana por lo general proporciona el medio concentrado y ácido necesario para mantener estas estructuras. El sedimento debe examinarse lo antes posible para su recolección, pero si no es posible hacer el examen en forma inmediata, puede refrigerarse la muestra durante unas horas. PREPARACIÓN DEL SEDIMENTO Y USO DEL MICROSCÓPIO El examen microscópico debe hacerse en una muestra centrifugada (si el volumen de la muestra es demasiado pequeño como para centrifugarlo, por Ej. sólo unas pocas gotas, aquélla se examina directamente, pero se señala en el informe que los resultados se obtuvieron de una muestra sin centrifugar). Se mezcla la muestra y se colocan aproximadamente 10-15 mL. de orina en un tubo

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de centrifugación, se centrífuga a 2000 r.p.m. durante 5 minutos. Se elimina el líquido sobrenadante (éste puede usarse para pruebas confirmatorias de proteínas), y se suspende el sedimento en la orina que baja por las caras del tubo (algunos laboratorios dejan exactamente 1 mL de sedimento y de sobrenadante en el tubo). Se dan golpecitos en la parte inferior del tubo para mezclar el sedimento, se coloca una gota de éste en un portaobjeto limpio o en una cámara de conteo, se cubre con un cubreobjeto y se examina inmediatamente. La primera regla para el examen del sedimento urinario sin tinción con el microscopio de campo claro es que debe usarse luz amortiguada para dar un contraste adecuado. Esto se logra cerrando parcialmente al iris del diafragma y ajustando luego el condensador hacia abajo hasta lograr el contraste óptimo. Si hay demasiada luz algunas estructuras se pasarán por alto. La segunda regla es que el micrómetro debe ser continuamente ajustado haciendo movimientos hacia arriba y hacia abajo para poder ver la profundidad del objeto, así como otras estructuras que puedan encantarse en un plano focal diferente. Primero el examen debe hacerse con magnificación de poco aumento (10X). Se registra el portaobjetos en busca de cilindros, cristales y elementos que se presentan un unos pocos campos. Cuando sea necesario delinear las estructuras se pasa a la lente de m ayor aumento (40X). A. ELEMENTOS NO ORGANIZADOS CRISTALES Por lo general no se encuentran cristales en la orina recién emitida, pero aparecen dejándola reposar durante un tiempo. Cuando la orina esta sobresaturada con un compuesto cristalino particular, o cuando las propiedades de solubilidad de éste se encuentran alteradas, el resultado es la formación de cristales. En algunos casos esta precipitación se produce en el riñón o en el tracto urinario, y puede dar lugar a la formación de cálculos urinarios (piedras). Muchos de los cristales que se encuentran en la orina poseen escasa significación clínica, excepto en casos de trastornos metabólicos, de formación de cálculos y en aquellos en que sea necesario regular la medicación. Entre los cristales de mayor importancia se encuentran la cistina, la tirosina, la leucina, el colesterol y las sulfamidas. Los cristales pueden identificarse por su aspecto y, si fuera necesario, por sus características de solubilidad. Como la formación de los cristales suele ser dependiente del pH, es útil conocer el pH de la orina al efectuar el examen microscópico. CRISTALES EN ORINAS ÁCIDAS Los cristales que se encuentran comúnmente en las orinas ácidas son el ácido úrico, oxalato de calcio y los uratos amorfos. Con menos frecuencia hay cristales de sulfato de calcio, uratos de sodio, ácido hipúrico, leucina, tirosina, colesterol y sulfamida. a). CRISTALES DE ÁCIDO ÚRICO Los cristales de ácido úrico pueden aparecer con muy diversas formas, las más características son el diamante o el prisma rómbico y la roseta, constituida por muchos cristales arracimados. En ocasiones pueden tener seis caras, y en estos casos se identifican a veces en forma errónea como cristales de cistina (que son incoloros). Los cristales de ácido úrico con frecuencia están teñidos por los pigmentos urinarios y en consecuencia tienen color amarillo o rojo-castaño. El color por lo general depende del grosor del cristal, por eso cristales muy delgados pueden ser incoloros.

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Cristales de Ácido Úrico. En la orina ácida pueden adoptar múltiples formas: cuadros romboidales, rosetas, pesas, barriles, bastones.

Cristales de Ácido Úrico. En la orina ácida pueden adoptar múltiples formas: cuadros romb oidales, rosetas, pesas, barriles, bastones. b). CRISTALES DE OXALATO DE CALCIO Éstos son incoloros, de forma octaédrica o de "sobre"; parecen cuadrados pequeños cruzados por líneas diagonales que se interceptan. Raras veces se presentan como esferas ovales o discos bicóncavos, que tienen forma de pesas de gimnasia cuando se los ve en incidencia lateral. Estos cristales pueden variar de tamaño, de modo que a veces son sólo escasamente discernibles bajo magnificación de alto poder. Al enfocar un típico cristal de oxalato de calcio el observador ve la "X" del cristal sobresaliendo en el campo.

Cristales de oxalato de calcio. Son incoloros y muy birrefringentes. Es característica su forma en sobre de carta

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Cristales de oxalato de calcio. Son incoloros y muy birrefringentes. Es característica su forma en sobre de carta. Se observan varias células epiteliales planas. c). URATO AMORFO Con frecuencia hay en la orina sales de urato (sodio, potasio, magnesio y calcio) en una forma no cristalina, amorfa. Estos uratos amorfos tienen aspecto granular y color amarillo-rojo, son solubles en alcalosis y a 60º C de temperatura. Carecen de significación clínica.

Uratos amorfos. Numerosas imágenes en forma de grumo que en parte se aglomeran y forman pseudocilindros d). CRISTALES DE ÁCIDO HUPÚRICO Son prismas o placas elongadas amarillo-castaño o incoloras. Pueden ser tan delgados que parecen agujas, y con frecuencia están agrupados. Son más solubles en agua y en éter que los cristales de ácido úrico. Se observan con escasa frecuencia en la orina y prácticamente carecen de significación. e). URATOS DE SODIO Pueden existir como sustancias amorfas o como cristales. Los cristales de urato de sodio son agujas o prismas delgados, incoloros o amarillentos que se presentan en grupos o racimos. Son solubles a temperatura de 60 ºC y sólo ligeramente solubles en ácido acético. Los uratos carecen de significación clínica.  f). CRISTALES DE SULFATO DE CALCIO Son agujas o prismas largos, delgados e incoloros, de aspecto idéntico al de los cristales de fosfato de calcio. El pH de la orina ayuda a diferenciar estos dos tipos de cristales; el sulfato de calcio se encuentra en orinas ácidas mientras que el hallazgo de fosfato de calcio es habitual en orinas alcalinas. El sulfato es también extremadamente soluble en ácido acético. Es raro ver cristales de sulfato de calcio en la orina, carecen de significación clínica.

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g). CRISTALES DE CISTINA Son placas hexagonales, refringentes e incoloras cuyos lados pueden ser iguales o no. Pueden aparecer en forma aislada, unos sobre otros, o en acúmulos. Con frecuencia poseen un aspecto estratificado o laminado. La presencia de cristales de cistina en la orina siempre tiene importancia aparecen en pacientes con cistinosis o cistinuria congénitas y pueden formar cálculos.

Cristales de cistina. Se reconocen por su característica forma hexagonal, incoloros y de variable tamaño que en ocasiones se superponen.

Cristales de cistina. Se reconocen por su característica forma hexagonal, incoloros y de variable tamaño que en ocasiones se superponen

h). LEUCINA Los cristales de leucina son esferoides oleosos, altamente refractarios, de color amarillo o castaño con estriaciones radiales y concéntricas. Es probable que estén formados puramente por leucina, ya que la leucina pura cristaliza en forma de placas. La leucina es soluble en ácido acético caliente, alcohol caliente y álcalis; es insoluble en ácido clorhídrico. i). TIROSINA Los cristales de tirosina son agujas muy finas, altamente refringentes, que aparecen en grupos o acúmulos. Los acúmulos de agujas con frecuencia parecen de color, sobre todo en el centro, pero pueden tomar una coloración amarilla en presencia de bilirrubina. Los cristales de tirosina son solubles en hidróxido de amonio y en ácido clorhídrico, pero insoluble en ácido acético  j). COLESTEROL

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Los cristales de colesterol son placas de gran tamaño, planas y transparentes, con ángulos mellados. Son solubles en cloroformo, éter y alcohol caliente. A veces se encentran formando una película en la superficie de la orina en lugar de encontrarse en el sedimento. K). CRISTALES DE SULFAMIDAS Y OTROS FÁRMACOS Cuando se introdujo en terapéutica el uso de las sulfamidas aparecieron muchos problemas por daño renal como consecuencia de la precipitación del fármaco. Las nuevas sulfamidas son mucho más solubles, aún en medios ácidos; por eso en la actualidad raramente se forman cristales en la orina. La mayoría de las sulfamidas precipitan en forma de grupos de agujas, por lo general con una unión excéntrica; su color puede ser claro o castaño. CRISTALES EN ORINAS ALCALINAS Entre los cristales que pueden encontrarse en orinas alcalinas se incluyen los siguientes: fosfato triple (fosfato amónico-magnésico), fosfatos amorfos, carbonatos de calcio, fosfato de calcio y biuratos de amonio, también denominados uratos de amonio. a). FOSFATO TRIPLE  Los cristales de fosfato (fosfato amónico-magnésico) pueden existir en orinas neutras y en orinas alcalinas. Son prismas incoloros de tres a seis caras que con frecuencia tienen extremos oblicuos. El fosfato amónico-magnésico a veces puede precipitar formando cristales plumosos o con aspecto de helecho. Los cristales de fosfato triple son solubles en ácido acético.

Cristales de fosfato triple. Se aprecian como formas incoloras en "tapa de ataúd" en la orina alcalina Cristales de Fosfatos Han sido causa de debate sobre la significación clínica de estos en la orina. En la práctica solo el fosfato de amonio y magnesio ha sido estimado como significativo. Esto hace suponer una infección con una bacteria productora de ureasa como el proteus. b). FOSFATO AMORFO Las sales de fosfato con frecuencia están presentes en la orina en forma no cristalina, es decir, como sustancias amorfas. Estas partículas granulares carecen de una forma definida y por lo general a simple vista son indistinguibles de los uratos amorfos. El pH de la orina, así como sus propiedades de solubilidad ayudan a distinguir entre estos depósitos amorfos, los fosfatos amorfos son solubles en ácido acético mientras que los uratos amorfos no lo son. Los fosfatos amorfos carecen de significación clínica.

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Fosfatos de Amonio y Magnesio: Observe la típica forma de "ataud" qu e presentan. c). FOSFATO DE CALCIO Los cristales de calcio son prismas largos, delgados e incoloros con un extremo puntiagudo, ordenados formando rosetas o estrellas (fosfatos estelares), o en forma de agujas. Pueden también formar granulares, de gran tamaño, delgadas e irregulares, flotantes en la superficie de la orina. Los cristales de fosfato de calcio son solubles en ácido acético diluido. d). CARBONATO DE CALCIO Los cristales de carbonato de calcio son pequeños e incoloros, aparecen con forma esférica o de pesas de gimnasia, o en masas granulares de gran tamaño. Tienen mayor tamaño que las masas de las sustancias amorfas, y cuando aparecen en acúmulos parecen tener color oscuro. En la masa de cristales de carbonato de calcio, contrariamente a lo que ocurre con los acúmulos de fosfatos amorfos, existe conexión de los cristales a nivel de sus bordes.

Los Cristales de Carbonato de Calcio son hallados solos o unidos. e). BIURATO DE AMONIO Los cristales de biurato de amonio, o simplemente de urato de amonio, se encuentran en orinas alcalinas y neutras y ocasionalmente en orinas ácidas. Los cristales de biurato de amonio, son cuerpos esféricos de color amarillo castaño con espículas largas e irregulares. Su aspecto con frecuencia se describe con el término de "estramonio". Los cristales de biurato de amonio pueden existir como esferoides de color amarillo castaño sin espículas, aunque esta forma no es muy común. En la figura 4 se observan cristales hallados en orinas alcalinas. B. ELEMENTOS ORGANIZADOS CÉLULAS

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Entre las células que pueden estar presentes en la orina se encuentran eritrocitos (hematíes o glóbulos rojos), leucocitos (glóbulos blancos) y células epiteliales provenientes de cualquier punto del tracto urinario, desde los túbulos hasta la uretra, o como contaminantes procedentes de vagina o vulva. a). ERITROCITOS Los hematíes presentes en la orina pueden provenir de cualquier punto del tracto urinario, desde el glomérulo hasta el meato urinario, y en la mujer constituyen a veces contaminación menstrual. Pueden aparecer en diversas formas, según el medio de la orina. Cuando la muestra de orina es fresca, los hematíes presentan aspecto normal de color pálido o amarillento, son discos uniformes bicóncavos de aproximadamente 7 um de diámetro y 2 um de grosor. Carecen de núcleo y cuando se observan en incidencia lateral tienen el aspecto de vidrio de reloj. En las orinas diluidas o hipotónicas, los hematíes se hinchan y pueden lisarse, liberando de este modo su contenido de hemoglobina en la orina. Las células lisadas, que forman como corpúsculos fantasmas o eritrocitos acrómicos, son círculos tenues incoloros (se trata en realidad de las membranas del eritrocito vacío), también se produce lisis en orinas alcalinas. En las orinas hipertónicas hay crenación de los hematíes, que se parecen a veces a gránulos. En ocasiones pueden verse en el sedimento urinario hematíes microcíticos.

Células Rojas o Eritrocitos. Note la forma bicóncava de los mismos.

Eritrocitos eumorficos, característicos discos redondos con doble contorno.

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Hematíes eumorficos y dismorficos presentes en el mismo campo. Las alteraciones morfológicas en la membrana celular marcan la diferencia.

Eritrocitos dismorficos. Acantocitos, con su clásica forma de anillos y evaginaciones.

Eritrocito dismorfico. Acantocito. La microscopia electrónica de barrido permite evidenciar sus características evaginaciones.

Glóbulos Rojos Crenados o Crenocitos: su forma es de "estrella" con la membrana arrugada.

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b). LEUCOCITOS Los glóbulos blancos pueden entrar en cualquier punto del tracto urinario desde el glomérulo hasta la uretra. En promedio, la orina normal puede contener hasta 2 glóbulos blancos/campo de gran aumento. Los leucocitos tienen un diámetro aproximado de 10-12m ; en consecuencia son de mayor tamaño que los eritrocitos pero más pequeños que las células del epitelio renal. Los eritrocitos tienen por lo general forma esférica y color gris oscuro o amarillo verdoso. Puede aparecer en forma aislada o en acúmulos. La mayoría de los leucocitos de la orina son neutrófilos, y habitualmente se les identifica por sus gránulos característicos o por las lobulaciones del núcleo.

Células Blancas o Leucocitos. El centro es más granuloso por la pr esencia del núcleo.

Leucocitos. Se reconocen por su tamaño y su núcleo segmentado. Obsérvese la presencia de abundantes levaduras.

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Leucocitos. Se reconocen por su tamaño mayor a los hematíes y menor a las células epiteliales y su núcleo cargado de granulaciones c). CÉLULAS EPITELIALES Las células epiteliales presentes en la orina pueden provenir de cualquier sitio del tracto urinario, desde los túbulos contorneados proximales hasta la uretra, o la vagina. Normalmente pueden encontrarse algunas células epiteliales en la orina como consecuencia del desprendimiento normal de células viejas. Un incremento marcado indica inflamación de la porción del tracto urinario de donde proceden. Es muy difícil hacer la distinción del sitio de origen de las células epiteliales. Por esta razón muchos laboratorios informan su presencia sin intentar diferenciarlas. En los casos en que la distinción es posible pueden reconocerse tres tipos fundamentales de células epiteliales: tubulares, de transición y pavimentosas. c.1). CÉLULAS EPITELIALES DEL TÚBULO RENAL Las células de los túbulos renales son ligeramente más grandes que los leucocitos y poseen un núcleo grande y redondeado. Pueden ser planas, cúbicas o cilíndricas. La presencia de un número elevado de células epiteliales tubulares sugiere daño tubular, que puede producirse en enfermedades como píelonefritis, necrosis tubular aguda, intoxicación por salicilatos, y en el rechazo del riñón transplantado.

Célula de epitelio tubular. Se reconocen por su tamaño y su núcleo gr ande y redondo. c.2). CÉLULAS EPITELIALES DE TRANSICIÓN Son de dos a cuatro veces más grandes que los leucocitos. Pueden ser redondeadas. Piriformes o con proyecciones apendiculares. En ocasiones poseen dos núcleos. Las células de transición revisten el tracto urinario desde la pelvis renal hasta la porción proximal de la uretra.

Células de epitelio transicional, formando agrupaciones

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c.3). CÉLULAS EPITELIALES PAVIMENTOSAS O ESCAMOSAS Las células epiteliales pavimentosas se reconocen fácilmente por ser de gran tamaño, planas y de forma irregular. Contienen núcleos centrales pequeños y abundante citoplasma. El borde presenta a menudo pliegues, y la célula puede estar enrollada en un cilindro. Las células epiteliales pavimentosas provienen principalmente de la uretra y de la vagina. Muchas de las que se encuentran en la orina de la mujer son el resultado de la contaminación vaginal o vulvar y en esos casos poseen escaso significado diagnóstico.

Células de epitelio plano. Cuerpo celular grande e irregular, en ocasiones plegado, con núcleo pequeño y redondo. Forman a menudo agrupaciones, como en este caso. CILINDROS Los cilindros urinarios se forman en la luz de los túbulos del riñón, reciben ese nombre porque son moldeados en los túbulos. Pueden formarse por precipitación o gelificación de la mucoproteína de Tamm-Horsfall, por agrupamiento de célula o de otros materiales dentro de una matriz proteica, por adherencia de células o de material a la matriz, o por coaglutinación de material en el interior de la luz tubular. Los túbulos renales secretan una mucoproteína denominada de Tamm-Horsfall que, según se cree, forma la matriz de todos los cilindros. Algunos cilindros pueden contener también proteínas plasmáticas, pero por lo general éstas están confinadas en los gránulos del cilindro. En los cilindros céreos las proteínas plasmáticas están presentes en la distribución homogénea. os cilindros poseen caras casi paralelas y extremos redondeados o romos; varían en forma y tamaño de acuerdo con lo túbulos donde se forman. Pueden ser contorneados, rectos o curvos; su longitud es variable. Los cilindros anchos, que pueden tener un diámetro de dos a seis veces superior al de los cilindros comunes, se forman en los túbulos dilatados o atrofiados por procesos patológicos, o en túbulos colectores. Los cilindros anchos con frecuencia se denominan cilindros de la insuficiencia renal. a). CILINDROS HIALINOS Son los que se observan con mayor frecuencia en la orina. Están formados por la proteína de Tamm-Horsfall gelificada y pueden contener algunas inclusiones que se incorporan estando el cilindro en el riñón. Como están formados solamente por proteína, tienen un índice de refracción muy bajo y deben ser buscados con luz de baja intensidad. Son incoloros, homogéneos y transparentes y por lo general tienen extremos redondeados.

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Cilindro hialino, largo y arrollado, atraviesa todo el campo. Estos cilindros son homogéneos, incoloros, transparentes y poco refringentes, por lo que son fáciles de omitir.

Cilindro hialino, largo y arrollado, atraviesa todo el campo. Estos cilindros son homogéneos, incoloros, transparentes y poco refringentes, por lo que son fáciles de omitir.

Cilindros Hialinos de delicada apariencia y tamaño pequeño. b). CILINDROS ERITROCITARIOS La presencia de cilindros eritrocitarios significa hematuria de origen renal; son siempre patológicos. Son por lo general diagnóstico de enfermedad glomerular; se encuentran en la glomérulonefritis aguda, en la nefritis lúpica y otros padecimientos. Los cilindros eritrocitarios pueden tener color castaño o ser casi incoloros. Pueden estar formados por pocos glóbulos rojos en una matriz proteica, o bien por muchas células aglomeradas sin matriz visible. Si los hematíes se encuentran intactos y su forma puede detectarse se denominan cilindros eritrocitarios. Si se produce degeneración del cilindro y éste pasa a ser un cilindro granuloso de color castaño rojizo, se trata de un cilindro hemaglobínico o hemático.

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Cilindro eritrocitario. Se componen de eritrocitos adheridos a una matriz hialina. Se pr esenta en el contexto de una hematuria microscópica, confirmando su origen glomerular.

Cilindro eritrocitario, muy denso, lo que explica su color pardo tan oscuro. Se acompaña de eritrocitos, leucocitos y células de epitelio plano.

Cilindro eritrocitario. Muy denso y de color rojizo. Se presenta en el contexto de una hematuria microscópica, confirmando su origen glomerular.

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Cilindro eritrocitario. Muy denso y de color ligeramente rojizo. Se componen de eritrocitos adheridos a una matriz hialina. Se presenta rodeado de hematíes.

c). CILINDROS LEUCOCITARIOS La mayoría de los leucocitos que aparecen en los cilindros son neutrófilos polimorfonucleares. En el cilindro puede haber unos pocos leucocitos o bien puede estar formado por muchas células. Si las células se encuentran aún intactas pueden observarse los núcleos con claridad, pero al comenzar la degeneración de los elementos celulares las membranas desaparecen y el cilindro adquiere un aspecto granular.

Cilindro leucocitario. Se observa a su alrededor algunos leucocitos, eritrocitos, bacterias y filamentos de moco.

Cilindro leucocitario largo y un pequeño fragmento del mismo cilindro. Se observa a su alrededor algunos leucocitos y eritrocitos.

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Cilindro leucocitario. De pequeño tamaño. Se componen de leucocitos adheridos a una matriz hialina, confirmando su origen glomerular. d). CILINDROS GRANULOSOS Los cilindros granulosos pueden formarse a partir de la degeneración de cilindros celulares, o bien por la agregación directa séricas en una matriz de mucoproteína de Tamm-Horsfall. Inicialmente los gránulos son de gran tamaño y su aspecto es tosco, pero si la orina permanece en reposo durante un tiempo prolongado se destruyen y se forman gránulos de aspecto más delicado.

Cilindro granuloso. Suelen ser más grandes que los hialinos y presentar inclusiones granulares. Se observan hematíes a su alrededor.

Cilindro granuloso. Suelen ser más grandes que los hialinos y presentar inclusiones granulares.Se observan detritus a su alrededor.

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Cilindro granuloso. Ancho y denso. Suelen ser más grandes que los hialinos y presentar inclusiones granulares e). CILINDROS DE CÉLULAS EPITELIALES Los cilindros epiteliales se forman como consecuencia de la estasis urinaria y de la descamación de células del epitelio tubular. Las células epiteliales pueden estar ordenadas en el cilindro en hileras paralelas o carecer de ordenación, varían en tamaño, forma y estadio de degeneración. Se piensa que las células que aparecen en hileras paralelas provienen del mismo segmento tubular, mientras que las que no tienen ordenación provienen de diferentes porciones del túbulo.

Cilindro epitelial. Células de epitelio tubular adheridos a una matriz hialina.

Cilindro epitelial. Células de epitelio tubular adheridos a una matriz hialina. Llama la atención el contorno marginal policiclico producido por las células de epitelio tubular. f). CILINDROS CÉREOS

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Éstos poseen un índice de refracción muy elevado, son amarillos, grises o incoloros y tienen un aspecto uniforme y homogéneo. Con frecuencia aparecen como cilindros anchos y cortos de extremos romos o cortados, y a menudo sus bordes son serrados o de aspecto resquebrajado. Se ha postulado que pueden formarse a partir de la degeneración de cilindros granulosos.

Cilindro céreo. Más anchos que los hialinos, con mayor refringencia. Presenta muescas o hendiduras finas en sus bordes, que se dirigen perpendicularmente al eje longitudinal del cilindro.

Cilindro céreo. Más anchos que los hialinos, con mayor refringencia. Presenta muescas o hendiduras finas en sus bordes, que se dirigen perpendicularmente al eje longitudinal del cilindro.

g). CILINDROS GRASOS Son aquellos que incorporaron gotitas de grasa libre o bien cuerpos ovales grasos. Pueden contener sólo unas pocas gotitas de grasa de diferente tamaño. Si la grasa es colesterol, las gotitas serán anisotrópicas, formadas por triglicéridos, no polarizan la luz. h). PSEUDOCILINDROS O CILINDROIDES.- Provienen de las partes bajas de las vía urinarias y están constituidas por moco, abundan en las inflamaciones superficiales; no tienen mucha importancia clínica, observándoseles después de la anestesia con éter o después de ejercicios violentos, en las enfermedades febriles y en diversos procesos irritativos del riñón.

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Pseudocilindro o cuerpo cilindroide. Con forma de banda longitudinal, acaban en punta por los extremos o se disponen en filamentos. C. ELEMENTOS EXTRAÑOS Otras estructuras que pueden aparecer en la orina son: bacterias , hongos, cilindroides, espermatozoides, moco y grasa. a). BACTERIAS Normalmente en la orina a nivel renal y vesical no existen bacterias, pero puede contaminarse por bacterias presentes en la uretra, en la vagina o procedentes de fuentes externas. Cuando una muestra de orina fresca correctamente recolectada contiene gran número de bacterias, y en especial cuando esto se acompaña de muchos leucocitos, por lo general es índice de infección del tracto urinario. La presencia de bacterias se informa de acuerdo a su número (pocas, moderada cantidad, etc.) pero en el examen de rutina no se realizan estudios para identificar el organismo exacto. Sin embargo cabe señalar que las bacterias mas frecuentes son las enterobacterias como Escherichia coli, así también no debemos olvidar de Gardnerella vaginalis, Neisseria gonorhoeae, entre otros. b). HONGOS Las células micóticas son uniformes, incoloras, por lo general de forma ovoide con pared de doble refringencia. Pueden tener diferente tamaño y con frecuencia muestran gemación. A veces se las puede confundir con glóbulos rojos pero, a diferencia de éstos, no son solubles en ácido ni álcalis y no se tiñen con eosina. c). ESPERMATOZOIDES Pueden existir espermatozoides en la orina masculina después de convulsiones epilépticas, poluciones nocturnas, enfermedades de los órganos genitales y en la espermatorrea. Pueden también observarse en orinas de ambos sexos después del coito. Los espermatozoides tienen cuerpo oval y cola larga, delgada y delicada. d). FILAMENTOS DE MOCO Son estructuras de forma acintada, largas, delgadas y ondulantes que pueden mostrar tenues estriaciones longitudinales. Algunos de los filamentos más anchos pueden confundirse con cilindroides o cilindros hialinos. Los filamentos espesos tienden a incorporar leucocitos. e). CUERPOS OVALES GRASOS Y GOTITAS DE GRASA LIBRE En la orina puede existir grasa en forma de gotitas o glóbulos libres, en el interior de células en proceso de degeneración o necróticas (cuerpos ovales grasos) o incorporada en cilindros. Por lo común los cuerpos ovales grasos se definen como células del túbulo renal que contienen gotitas de grasa altamente refringentes. Su presencia se debe a la incorporación de grasa filtrada a través del glomérulo en el interior de la célula o la degeneración grasa de células tubulares.

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Los lípidos pueden aparecer en la orina también como gotitas de grasa libre, que con frecuencia varían de tamaño por coalescencia de los glóbulos. Las gotitas de grasa son altamente refringentes, de forma globular y con frecuencia de color amarillo-castaño, aunque con poco aumento o con luz atenuada pueden ser negros debido a su elevado índice de refracción.

Inclusiones lipidicas que al ser observadas con luz polarizada muestran la característica Cruz de Malta f). ARTIFICIOS Una variedad de objetos extraños pueden encontrarse en la muestra de orina durante la recolección, al transportarla, mientras se realiza el estudio o estando sobre el portaobjetos. g). CRITALES DE ALMIDÓN Aparecen con frecuencia en la orina. Tienen forma redondeada u oval, son altamente refringentes y de tamaño variable. El tipo de almidón más común que se observa en la orina es el de maíz, posiblemente porque algunas marcas de talco lo contienen. Los cristales de almidón de maíz (maicena) son casi hexagonales y presentan en el centro una indentación irregular. h). FIBRAS Las fibras de tela son sin duda, el tipo de cuerpo extraño que se observa con mayor frecuencia en la orina. Provienen de ropas, pañales, papel higiénico, o pueden ser hilachas del aire. Las fibras largas y planas se reconocen con facilidad, pero las cortas y aproximadamente del mismo tamaño que los cilindros pueden ser confundidas con éstos, incluso por algunos "expertos en el análisis de orina". i). GOTITAS DE ACEITE Las gotitas de aceite en la orina son consecuencia de la contaminación por lubricantes. Tienen forma esférica y tamaño variable.  j). ESTRUCTURAS DIVERSAS Entre los demás tipos de material extraño que puede encontrarse en el sedimento pueden mencionarse: cabellos, fragmentos de vidrio, así como marcas o rayas en el portaobjetos, burbujas de aire, gránulos de polen y partículas de talco, por lo general formadas por silicatos; tienen, por lo tanto, formas anguladas. La orina puede estar contaminada por materia fecal, en consecuencia puede contener fibras de vegetales, fibras de músculo y hebras de tejido. Deben reconocerse estas estructuras como contaminación fecal. k). PARÁSITOS

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Ocasionalmente pueden encontrarse parásitos en la orina, sea porque ocupan el tracto urinario, sea como resultado de contaminación; el parásito que mas a menudo se observa en la orina es la Trichomonas vaginalis, Trichomonas hominis que tienen aproximadamente el mismo tamaño de un leucocito grande. En el extendido mojado y sin tinción su presencia no debe informarse a menos que tenga movilidad. Pueden encontrarse huevos, larvas y en ocasiones también el adulto hembra del Enterobius vermicularis (" oxiuro"), quizá incluso con más frecuencia que los que se creía. Los huevos tienen forma muy característica; una de sus caras es plana y otra redondeada, a través de su cáscara transparente se puede observar, por lo general, la larva en desarrollo. El Schistosoma haematobium es un gusano trematodo que habita en las venas de la pared de la vejiga. El adulto deposita sus huevos en los capilares de la mucosa. Alrededor de los huevos se forman abscesos. En la orina pueden encontrarse huevos acompañados de hematíes y leucocitos. También es frecuente encontrar las levaduras Candida albicans. Todos estos parásitos son patógenos y no es normal encontrarlos en la orina.

Tricomonas. Se trata de estructuras redondas u ovaladas que disponen de cuatro flagelos en uno de los polos, generalmente móviles. Su tamaño es aproximadamente 2 a 3 veces mayor que el de los leucocitos IV. Nota Presentar los resultados, discusiones, conclusiones, recomendaciones y anexos en tablas, cuadros y/o gráficos, flujogramas, fotos, organizadores gráficos, según crea conveniente. Presentar las referencias bibliográficas. En este proceso el estudiante pondrá en práctica sus capacidades de comprensión, pensamiento crítico y pensamiento resolutivo. Así mismo sus valores y destrezas.

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