Aminoacizi-naturali

- referat BIOCHIMIE -

Introducere

Aminoacizii sunt unităţi constituente ale proteinelor. Dintre toţi aminoacizii existenţi în natură, o clasă specială o constituie cea a α-aminoacizilor, întâlniţi şi sub titulatura de „aminoacizi naturali”. În mod curent, aminoacizii sunt prescurtaţi printr-un simbol din trei litere, dar  au fost adoptate şi simboluri dintr-o singură literă pentru a facilita compararea secvenţelor de aminoacizi ale proteinelor omoloage. (tabel 1) Tabel 1. Simbolurile aminoacizilor Nr.

Simbol

cu

Simbol cu o

Aminoacid crt.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22

Alanină Arginină Asparagină Acid aspartic Cisteină Glutamină Acid glutamic Glicină Histidină Izoleucină Leucină Lizină Metionină Fenilalanină Prolină Serină Treonină Triptofan Tirozină Valină *Asn şi/sau Asp *Gln şi/sau Glu

trei litere

literă

Ala Arg Asn Asp Cys Gln Glu Gly His Ile Leu Lys Met Phe Pro Ser Thr Trp Tyr Val Asx Glx

A R N D C Q E G H I L K M F P S T W Y V B Z

S-au propus numeroase moduri de clasificare a aminoacizilor bazate pe  particularităţile structurale ale radicalilor α-aminoacizilor. Cea mai semnificativă din acest punct de vedere este clasificarea pe baza polarităţii radicalilor R. Astfel întâlnim  patru clase principale de α-aminoacizi: 1) Aminoacizi cu radicali nepolari (hidrofobi) (tabelul 2)

2

În tabelul 2 se prezintă formulele structurale şi conformaţiile spaţiale a opt aminoacizi cu radicali nepolari, împreună cu simbolurile lor. Această familie include cinci aminoacizi cu radicali R alifatici (alanina, leucina, izoleucina, valina şi prolina), doi amino-acizi cu ciclu aromatic (fenilalanina şi triptofanul) şi un aminoacid cu sulf  (metionina). Aminoacizii din această clasă sunt mai puţin solubili în apă decât aminoacizii cu radicali R polari. Componentul cel mai slab hidrofob al acestei clase este alanina, care este astfel aproape de graniţa dintre aminoacizii nepolari şi cei cu radicali polari neîncărcaţi. Prolina diferă de toţi ceilalţi aminoacizi standard, fiind de fapt un α-iminoacid;  poate fi privit şi ca un α-aminoacid în care radicalul R este un substituent în gruparea amino. 2) Aminoacizi cu radicali polari neîncărcaţi (tabelul 3)

Aceşti aminoacizi sunt relativ mai solubili în apă decât cei cu radicali R  nepolari. Radicalii lor conţin grupări funcţionale polare neutre (neîncărcate) care pot forma legături de hidrogen cu apa. Polaritatea serinei, treoninei şi tirozinei. este datorată grupărilor lor hidroxil, cea a asparaginei şi glutaminei grupărilor amidă şi cea a cisteinei grupării ei sulfhidril (—SH). Glicina, aminoacidul aflat la limita demarcaţiei acestei grupe, este clasificată uneori ca un aminoacid nepolar, dar  radicalul ei, un singur atom de hidrogen, este prea mic ca să poată influenţa gradul ridicat de polaritate al grupărilor a-amino şi α-carboxil. Asparagina şi glutamina sunt amidele acidului aspartic şi acidului glutamic. întrucât aceşti aminoacizi sunt uşor hidrolizaţi de acizi sau baze la acid aspartic, respectiv glutamic, simbolurile folosite pentru a desemna aceste perechi de aminoacizi înrudiţi, când cantităţile de amidă formată nu sunt cunoscute, sunt Asx şi Glx. Cisteina şi tirozina au cei mai polari substituenţi ai acestei clase de aminoacizi, şi anume grupările tiol şi, respectiv, hidroxilul fenolic. Aceste grupări tind să piardă  protoni prin ionizare, mult mai rapid decât radicalii R ai altor aminoacizi din această clasă, deşi ei sunt doar slab ionizaţi la  pH  7,0. Cisteina se întâlneşte deseori în  proteină în forma sa oxidată cistina, în care grupările tiol din două molecule de cisteină au fost oxidate la o grupare disulfurică, prin care se formează o legătură covalentă între ele. Structura cisteinei este dată în tabelul 3. 3

3) Aminoacizi cu radicali încărcaţi pozitiv (bazici) (tabelul 4)

Toţi aminoacizii bazici în care radicalii R prezintă sarcini net pozitive la  pH  7,0 au şase atomi de carbon. Această clasă de aminoacizi se compune din: lizină, care  prezintă o grupare amino încărcată pozitiv în poziţia ε din lanţul său alifatic; arginină, care prezintă gruparea guanidină încărcată pozitiv şi histidină, care conţine gruparea imidazol slab bazică. Prin proprietăţile sale, histidina este situată la limita de demarcaţie a acestei clase de aminoacizi. La pH 6,0 aproximativ 50% din moleculele de histidină posedă un radical R   protonat, încărcat pozitiv, dar la  pH  1,0 mai puţin de 10% din molecule au sarcină  pozitivă. Histidina este singurul aminoacid al cărui radical R are pK' aproape de 7,0. 4) Aminoacizi cu radicali încărcaţi negativ (acizi) (tabelul 5)

Cei doi membri ai acestei clase sunt acidul aspartic şi acidul glutamic, fiecare cu o a doua grupă carboxil complet ionizată şi astfel încărcată negativ între  pH  6,0 şi  pH 7,0.

Tabel 2. α-aminoacizi cu radical R nepolar

Denumire α-aminoacid

Simboluri

Structură OH

Alanină

Ala O

A

CH3 NH2

4

OH

Valină

CH3

Val O

V

CH3 NH2 OH

Leucină

Leu

CH3

O

L

NH2 OH

Izoleucină

CH3

CH3

Ile

CH3

O

I

NH2 OH

Prolină

H N

Pro O

P

OH

Fenilalanină

Phe

O

F

NH2 OH

Triptofan

Trp

O

W

NH2

N H

OH

Metionină

Met

S O

M

CH3 NH2

Tabel 3. α-aminoacizi cu radical R neîncărcat

Denumire α-aminoacid

Glicină

Simboluri

Structură OH

Gly G

O

5

NH2

OH

Serină

Ser O

S

OH NH2 OH

Treonină

CH3

Thr O

T

OH NH2 OH

Cisteină

Cys O

C

SH NH2

OH

Tirozină

Tyr

O

Y

NH2

OH

OH

Asparagină

Asn

NH2

O

N

NH2

O

OH

Glutamină

NH2

Gln O

Q

O NH2

Tabel 4. α-aminoacizi bazici (încărcaţi pozitiv la  pH 6,0)

Denumire α-aminoacid

Simboluri

Structură OH

Lizină

Lys

NH2

O

K 

NH2

6

OH

Arginină

NH2

Arg O

R 

NH

NH

NH2 OH

Histidină

H N

His O

H

NH2

N

Tabel 5. α-aminoacizi acizi (încărcaţi negativ la  pH 6,0)

Denumire α-aminoacid

Simboluri

Structură OH

Acid aspartic

Asp

OH O

D

NH2 OH

Acid glutamic

O OH

Glu O

E

O NH2

Proprietăţile acido-bazice ale aminoacizilor

Cunoaşterea proprietăţilor acido-bazice ale aminoacizilor este foarte importantă pentru înţelegerea şi analizarea proprietăţilor proteinelor. Mai mult, o mare parte din ştiinţa separării, identificării şi dozării diferiţilor aminoacizi şi determinării secvenţei lor în proteine este bazată pe comportarea lor acido-bazică.

7

În primul rând, să considerăm speciile ionice comune ale aminoacizilor. În stare cristalină, aminoacizii au puncte de topire sau de descompunere ridicate, de obicei peste 200°C. Ei sunt mult mai solubili în apă decât în solvenţi nepolari. Aceste proprietăţi sunt exact cele pe care ne aşteptăm să le întâlnim, considerând că reţeaua moleculară a aminoacidului în stare cristalină este stabilizată prin forţe electrostatice de atracţie între grupări cu sarcini opuse ca în cazul reţelelor  cristaline ale sărurilor cu puncte de topire ridicate, ca de exemplu clorura de sodiu. Dacă aminoacizii ar cristaliza într-o formă neionică, ei ar fi stabilizaţi de forţele van der Waals, mult mai slabe, şi ar avea puncte de topire joase. Aceste consideraţii, cât şi multe alte dovezi au dus la concluzia că aminoacizii se găsesc în soluţii apoase neutre şi cristalizează din aceste soluţii mai degrabă ca ioni dipolari sau amfioni, decât ca molecule nedisociate. Existenţa aminoacizilor ca ioni dipolari în soluţii apoase neutre este indicată şi de constantele dielectrice ridicate şi momentele de dipol mari, care reflectă prezenţa atât a sarcinilor negative cit şi a celor pozitive în aceeaşi moleculă. Când un aminoacid amfionic cristalin, de exemplu alanina, este dizolvat în apă, el poate acţiona atât ca un acid (donor de proton) cât şi ca o bază (acceptor de  proton): - ca un acid: H3N+CH(CH3)COO ─  ↔ H+ + H2NCH(CH3)COO ─  - ca o bază: H+ + H3N+CH(CH3)COO ─  ↔ H3N+CH(CH3)COOH Substanţele cu astfel de proprietăţi sunt amfotere (în greacă amphi înseamnă „ambii") şi sunt numite amfoliţi, forma prescurtată de la „electroliţi amfoteri". Comportarea acido-bazică a amfoliţilor este cel mai simplu formulată în termenii

teoriei

acido-bazice

Brönsted-Lowry.

Un

α-aminoacid

simplu

monoaminomonocarboxilic ca alanina este considerat a fi un acid dibazic în formă complet protonată, care poate dona doi protoni în timpul titrării sale complete cu o  bază. Fig. 1Desfăşurarea unei asemenea titrări cu NaOH, care decurge în două trepte, Curbafidereprezentată titrare a alaninei.   poate în ecuaţiile următoare, ce indică fiecare specie ionică R = gruparea metil.

implicată:

H3N+CHRCOOH + HO ─  → H3N+CHRCOO ─  + H2O H3N+CHRCOO ─  + HO ─  → H3N+CHRCOO ─  + H2O

8

Figura prezintă curba de titrare difazică a alaninei, care poate fi comparată cu curbele de titrare ale acizilor slabi. Valorile  pK'  ale celor două etape de ionizare ale alaninei sunt destul de distanţate pentru a rezulta două trepte net separate. Fiecare treaptă prezintă un punct de echivalenţă, unde modificarea pHului când se adaugă cantităţi crescute de HO ─  este minimă. Valorile  pK'  aparente  pentru cele două trepte de disociere pot. fi determinate din punctele de echivalenţă ale fiecărei trepte; ele sunt  pK’ 1 = 2,34 şi  pK’ 2 = 9,69. La  pH  2,34, punctul de echivalenţă al primei trepte, donorul de protoni (H3 N+CHRCOOH) şi acceptorul de protoni (H3 N+CHRCOO ─ ) se găsesc în concentraţii echimolare.  La pH  9,69, speciile (H 3 N+CHRCOO ─ ) şi (H2 NCHRCOO ─ ) se găsesc în concentraţii echimolare. Fiecare dintre cele două trepte ale curbei pot fi bine aproximate matematic  prin ecuaţia Henderson-Hasselbach; aceasta înseamnă că se pot calcula raporturile speciilor ionice ale aminoacidului la orice  pH, dacă se cunosc valorile pentru  pK’ 1 ş i  p K 2’ .

La  pH  6,02 există un punct de inflexiune între cele două trepte ale curbei de titrare a alaninei. La acest  pH, molecula nu prezintă sarcină electrică netă şi nu migrează în câmp electric. Acesta este  pH-ul izoelectric (simbolizat prin  pH  )i care reprezintă media aritmetică a lui  pK’ 1 ş i  p K 2’ , adică  pH i = 1/2 (pK’ 1 +  p K 2 ’ ). Aceste relaţii sunt destul de exacte pentru majoritatea scopurilor. Totuşi, o cantitate mică din forma neîncărcată (H3 N+CHRCOOH) este prezentă în echilibru cu forma. încărcată.

9

Toţi acizii monoaminomonocarboxilici prezintă în esenţă aceeaşi comportare. Tabelul 6. Valorile pK’ pentru grupările ionizate ale unor aminoacizi la 25ºC

Aminoacid Glicină Alanină Leucină Serină Treonină Glutamină Acid aspartic Acid glutamic Histidină Cisteină Tirozină Lizină Arginină

 pK’ 1

 pK’ 2

 pK’  R

α-COOH

α-NH3+

radical R 

2,34 2,34 2,36 2,21 2,63 2,17 2,09 2,19 1,82 1,71 2,20 2,18 2,17

9,60 9,69 9,60 9,15 10,43 9,13 9,82 9,67 9,17 8,33 9,11 8,95 9,04

3,86 4,25 6,00 10,78 10,07 10,53 12,48

În tabelul 6 sunt date valorile pK' pentru grupările ionizate ale unor  aminoacizi. Din aceste date rezultă următoarele observaţii generale: 1. Gruparea carboxil din poziţia α a acizilor monoaminomonocarboxilici este un acid mai puternic decât gruparea carboxil a acizilor alifatici corespunzători, ca de pildă acidul acetic (pK' = 4,76). Aciditatea crescută a acestei grupări se datoreşte grupării amoniu din poziţia α şi sarcinii sale pozitive, care produce un puternic efect de câmp, crescând astfel tendinţa hidrogenului carboxilic de a disocia ca proton. 2. Gruparea α-amino a acizilor monoaminomonocarboxilici este un acid mai tare (sau o bază mai slabă) decât gruparea amino a aminelor alifatice corespunzătoare. 3. Toţi aminoacizii monoaminomonocarboxilici cu radicali R neîncărcaţi au valori  pK’ 1 şi valori  pK 2’

aproape identice.

4. Nici unul dintre aminoacizii monoaminomonocarboxilici nu are capacitate de tamponare semnificativă în jurul pH-ului fiziologic, între  pH  6,0 şi  pH  8,0. Ei  prezintă într-adevăr capacitate de tamponare la  pH -uri apropiate de valorile  pK' , şi anume între  pH 1,3 — 3,3 şi 8,6 — 10,6. Singurul aminoacid cu putere de tamponare semnificativă între pH 6 şi 8 este histidina. 5. Gruparea β-carboxil a acidului aspartic şi gruparea γ-carboxil a acidului glutamic, deşi complet ionizate la  pH 7,0, au valori  pK'  considerabil mai mari decât valorile  pK'  10

ale grupărilor α-carboxil şi aproape egale cu cele ale acizilor carboxilici simpli, de exemplu acidul acetic. 6. Gruparea tiol sau sulfhidril (—SH) a cisternei şi gruparea p-hidroxil a tirozinei sunt doar foarte slab acide. La pH  7,0, cea dintâi este ionizată în proporţie de aproximativ 8%, iar cea de-a doua în proporţie de 0,01%. 7. Gruparea ε-amino a lizinei şi gruparea guanidină a argininei sunt puternic bazice; aceste grupări cedează protoni numai la valori foarte ridicate ale  pH -ului. La  pH  7,0, aceşti aminoacizi prezintă o sarcină net pozitivă. Curbele de titrare ale aminoacizilor  cu radicali R ionizabili, de exemplu histidina, lizina, acidul glutamic, sînt mult mai complexe, ele fiind o combinaţie între curba care corespunde disocierii radicalului R  şi curbele corespunzătoare grupărilor amino şi carboxil din poziţia α. Formaldehida, în exces, se combină uşor cu grupările amino libere, neprotonate ale aminoacizilor, rezultând derivaţi metilol. În această reacţie, aminoacidul izoelectric pierde un proton de la gruparea — + NH3 a amfionului: H3N+CHRCOO —  ↔

H2NCHRCOO ─  + H+

H2NCHRCOO ─  + 2HCHO → (HOCH2)2NCHRCOO ─ 

Protonul astfel eliberat poate fi titrat direct cu NaOH până la  pH 8, punctul de viraj al fenolftaleinei. Titrarea aminoacizilor sau amestecurilor de aminoacizi în  prezenţa unui exces de formaldehidă (titrare cu formol) este o metodă analitică utilă în urmărirea formării aminoacizilor liberi în timpul hidrolizei proteinelor de către enzimele proteolitice.

Reacţii chimice ale aminoacizilor

Reacţiile caracteristice ale aminoacizilor sunt cele ale grupărilor funcţionale, şi anume: grupările carboxil, grupările α-amino şi grupările funcţionale prezente în lanţurile laterale. Cunoaşterea acestor reacţii este folositoare în numeroase aspecte importante ale chimiei proteinelor: 1) identificarea şi analiza aminoacizilor în hidrolizatele proteice; 2) identificarea secvenţei de aminoacizi în moleculele proteice; 3) identificarea resturilor de aminoacizi specifice proteinelor native, care sunt esenţiale pentru funcţia lor biologică;

11

4) modificarea chimică a resturilor de aminoacizi din molecula proteică pentru a  produce schimbări în activitatea lor biologică sau în alte proprietăţi; 5) sinteza chimică a polipeptidelor.  Reacţiile grupărilor carboxil 

Grupările carboxil ale aminoacizilor dau reacţii binecunoscute conducând la formarea de amide, esteri şi halogenuri acide. Esterificarea aminoacizilor cu etanol sau alcool benzilic este deseori folosită pentru protejarea grupării carboxil a aminoacizilor în sinteza chimică a peptidelor. O altă reacţie a grupării carboxil foarte importantă în studiul secvenţei aminoacizilor este reacţia de reducere în mediu anhidru, cu un agent puternic reducător, borohidrura de litiu, formându-se alcoolul  primar corespunzător: COOH H2 N

H

LiBH 4

CH2 OH H2N

R 

H R 

 Reacţiile grupărilor amino

Gruparea α-amino a aminoacizilor poate fi acilată prin tratare cu halogenuri acide sau anhidride; această reacţie este utilizată curent pentru a bloca sau proteja gruparea α-amino în sinteza chimică a peptidelor. Un agent mult utilizat în acest scop este clorocarbonatul de benzil, care conduce la formarea derivatului benziloxicarbonil al aminoacidului, numit şi derivat carbobenzoxi: COOH

Cl

H R NH2

H

O

COOH + O

- HCl

NH R 

O O

Când acilarea este realizată în condiţii blânde, integritatea stereochimică a atomului de carbon a se păstrează; în condiţii drastice, la cald, poate apărea racemizarea. O reacţie a grupării α-amino foarte larg folosită, reacţia cu ninhidrină, poate fi utilizată pentru dozarea unor cantităţi foarte mici de aminoacizi. Prin încălzire, un α-aminoacid reacţionează cu două molecule de ninhidrină şi rezultă un produs intens colorat:

12

HO

OH

O HO

HO

OH

O

H

H O

O

O N

COOH +

R 

O

O

O

- RCHO - CO 2

NH2

- 2H 2O O

O

-

Aminoacizii şi peptidele cu grupări α-amino libere dau cu ninhidrina o coloraţie albastru-violetă, în timp ce prolina şi hidroxiprolina, în care gruparea α-amino este substituită, formează derivaţi cu o culoare galbenă caracteristică. Grupările α-amino ale aminoacizilor reacţionează reversibil cu aldehidele şi formează compuşi numiţi baze Schiff: COOH H

COOH

+ H2O +

NH2

H

RCHO - H2O

R 

N

CHR  

R 

Se pare că bazele Schiff sunt compuşi intermediari într-un număr de reacţii enzimatice care implică interacţia enzimei cu grupările amino sau carboxil ale substratului. O altă reacţie importantă a grupării amino este reacţia cu cianatul, din care se formează derivaţi carbamil: COOH H

NH2

+

CNO

+H

COOH

+

H

NH R 

R 

NH2

O

Această reacţie a fost folosită pentru a modifica proprietăţile hemoglobinei S  patologice (întâlnită în anemia falciformă cu hematii în formă de seceră), în sensul creşterii asemănării ei cu hemoglobina normală. În afară de aceste reacţii ale grupării amino, multe altele sunt deosebit de utile în marcarea restului de aminoacid de la acel capăt al lanţului polipeptidic la care gruparea amino este liberă sau necombinată, şi anume, capătul amino-terminal.  Reacţiile radicalilor R

Aminoacizii dau şi reacţii calitative de culoare, tipice pentru anumite funcţiuni  prezente în radicalii lor, de exemplu gruparea tiol a cisteinei, hidroxilul fenolic al 13

tirozinei şi gruparea guanidină a argininei. Deşi aceste reacţii de culoare sunt folositoare uneori pentru colorarea spoturilor sau pentru identificări calitative, aminoacizii sunt identificaţi mai precis şi măsuraţi în concentraţii foarte mici cu ajutorul metodelor cromatografice. Totuşi, unele grupări funcţionale din catenele laterale ale aminoacizilor joacă roluri importante în activitatea biologică a proteinelor,  printre ele numărându-se gruparea tiol sau sulfhidril a cisteinei. Această grupare înalt reactivă este susceptibilă de a fi oxidată la disulfură de oxigenul atmosferic în  prezenţa sărurilor de fier, sau de alţi agenţi oxidanţi blânzi. Produsul de oxidare este cistina: COOH H

NH2 SH

COOH

COOH +

H

H

NH2

COOH

NH2 H

- H2

S

S

HS

NH2

Legătura disulfurică formează o punte covalentă între două resturi de cisteină. O altă reacţie caracteristică şi importantă a grupării tiol a cisteinei este reacţia cu metale grele ca Hg2+ şi Ag+, care formează mercaptani: COOH

COOH H

NH2

+

Ag

+

-H

+

H

NH2 S

SH

Ag

Grupările tiol ale resturilor cisteinei şi cistinei din peptide şi proteine pot fi măsurate printr-o reacţie cantitativă, cu reactivul Ellman, în care se formează un  produs care poate fi măsurat colorimetric:

14

H

COOH

COOH

COOH

NO 2

NH 2 + O N 2

SH S

S

COOH

COOH

COOH H

NO 2

NH 2

S

+

O2 N

S

SH

Aceste grupări tiol ale resturilor specifice de cisteină, în anumite molecule enzimatice,  joacă un rol important în activitatea lor catalitică; modificarea unor asemenea grupări tiol prin reacţii ca cele descrise mai sus, deseori, inactivează enzima. Cistina, forma oxidată a cisteinei joacă un rol special în structura proteică, întrucât gruparea ei disulfurică serveşte ca o punte de legătură covalentă între două lanţuri polipeptidice sau între două puncte ale aceluiaşi lanţ. Puntea disulfurică poate fi desfăcută prin acţiunea agenţilor reducători, de exemplu mercaptoetanolul, COOH

care transformă cistina în două molecule de cisteină: COOH

COOH

NH2 H

NH2 +

2 H

2 HS

NH2

OH

+ S

OH S

HO

S

SH

S

Cistina poate fi oxidată şi de agenţi ca acidul performic, rezultând două molecule de acid cisteic.

Atât grupările sulfhidril cât şi cele disulfurice sunt distruse în soluţii

 puternic alcaline, cu formarea unor produşi de reacţie.

Bibliografie

1. Lehninger, A..L., „Biochimie”, Ed. Tehnică, Bucureşti

15

2. C. D. Neniţescu – „Tratat Elementar de Chimie Organică”, vol. II, Ed. Tehnică, Bucureşti, 1958 3. L. Bârsă – „Chimia Compuşilor Organici” (curs an III, sem. I), cap. „Aminoacizi” 4. V. Şunel – „Chimia Compuşilor Organici” (curs an III, sem. II), cap. „Aminoacizi”

16