alfa amilasa salival

UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE CHIRIQUÍ

FACULTAD DE CIENCIAS NATURALES Y EXACTAS

ESCUELA DE QUÍMICA

INFORME DE LABORATORIO DE BIOQUIMICA

DETERMINACIÒN DE LA ALFA AMILASA SALIVAL. ESTUDIANTES: DANIEL BEJERANO 4-777-1401 REINA RÍOS 4- 751-1141 KATHERIN MIRANDA 4-753-2207.

PROFESORA: ALBERTINA MONTENEGRO

FECHA DE ENTREGA: 10/05/2012.

Determinación de la Alfa Amilasa Salival. 3 de Mayo de 2012.

I.

Objetivos:  Determinar cómo puede afectar la temperatura, el pH entre otros factores la actividad enzimática.  Analizar el papel de la amilasa salival en el proceso de la digestión de los

carbohidratos.  Demostrar la actividad catalítica de la amilasa salival. II.

Marco Teórico:

La a-amilasa es una enzima proteica que se encuentra en la saliva humana y cataliza la degradación del almidón, que es un polisacárido de reserva vegetal. El almidón está formado por dos tipos de moléculas: la amilosa y la amilopectina, ambos polisacáridos de glucosa. La amilosa se conforma por cadenas lineales de glucosas unidas por enlaces a- C1-C4, mientras que la amilopectina tiene, además de estos últimos enlaces, uniones C1 con C6, formando cadenas ramificadas. La a-amilasa rompe uniones C1-C4, tanto en la amilasa como en la amilopectina, dejando dextrinas lineales y ramificadas (oligosacaridos) como productos.1 Para medir la actividad enzimática de la a-amilasa, se utilizara un test colorimétrico que detecta el almidón. Para ello se contara con una solución de yodo/ yoduro de potasio (I 2 / IK), ya que el almidón en presencia de esta solución adquiere una coloración azulada característica. Esto tiene una explicación física: el yodo se coloca en el interior de la hélice que forma la amilosa (en las regiones hidrofóbicos), formando un complejo de color azul. Cuando la a-amilasa actúa, degrada la amilosa, se desintegra la hélice y por tanto en presencia de I 2 / IK ya no dará una coloración azul. Por lo tanto, en este TP mediremos la desaparición de sustrato (evidenciada por el test colorimétrico) para determinar la actividad de la enzima. Además, analizaremos como afectan las distintas condiciones en que actúa la enzima (pH, temperatura, concentración de NaCl), así como los efectos que pueden causar diferentes pretratamientos (proteinasa, calor). 2 Factores que afectan la actividad enzimática:

1. Concentración del sustrato: .- A mayor concentración del sustrato, a una concentración fija de la enzima se obtiene la velocidad máxima. Después de que se alcanza esta velocidad, un aumento en la concentración del sustrato no tiene efecto en la velocidad de la reacción. 2. Concentración de la enzima: .- Siempre y cuando haya sustrato disponible, un aumento en la concentración de la enzima aumenta la velocidad enzimática hacia cierto límite. 3. Temperatura: .- Un incremento de 10°C duplica la velocidad de reacción, hasta ciertos límites. El calor es un factor que desnaturaliza las proteínas por lo tanto si la temperatura se eleva demasiada, la enzima pierde su actividad. 4. pH: - El pH óptimo de la actividad enzimática es 7, excepto las enzimas del estómago cuyo pH óptimo es ácido. 5. Presencia de cofactores: .- Muchas enzimas dependen de los cofactores, sean activadores o coenzimas para funcionara adecuadamente. Para las enzimas que tienen cofactores, la concentración del cofactor debe ser igual o mayor que la concentración de la enzima para obtener una actividad catalítica máxima.3 La α-amilosa en agua presenta una ordenación espiral característica, con 6 ó 7 residuos de glucosa por vuelta. En esta hélice los grupos hidroxilos quedan hacia fuera, mientras que en el interior se disponen los grupos hidrofóbicos. En este interior es donde se incluye el yodo, formando un complejo de intenso color azul que permite la identificación positiva de trazas de almidón. III.

Materiales:

 Vasos químicos 100 mL y 250 mL.

 Baño térmico  Balanza Analítica Digital. 

Pipeta 5 mL

 Placa de Porcelana.  6 Tubos de Ensayos.

Reactivos:

Almidón: Aspecto físico Polvo fino Color Blanco Olor: variable. Fórmula molecular (C6H10O5) x pH 5.0 a 7.0 (solución al 2%). Densidad 1,5 Gravedad específica 1,45 Presión de vapor No se aplica. Solubilidad en agua Soluble a 100° C. Puede provocar irritación de los ojos. Puede provocar irritación cutánea. Puede provocar irritación de la nariz, la garganta y los pulmones.

Lugol: Aspecto: líquido Color: amarillento Olor: picante (débil) Valor de pH: (30,5 g/l agua; 20 °C): 6,2 - 6,6. Solubilidad en agua: miscible. Puede provocar: Tras contacto con la piel: irritaciones de aparición local. Tras ingestión: trastornos gástricos e intestinales. Solución Amortiguadora: Aspecto: Líquido transparente, incoloro. ESTADO FISICO: Líquido. pH: 7,0. Presión del vapor: Indeterminado. Densidad del vapor (aire = 1): Indeterminado. Punto de ebullición: 100°C. Punto de congelación: Indeterminado

IV.

Procedimiento: A. Obtención de la Amilasa Salival: 1. Elegimos a dos voluntarios para salivar aproximadamente 4 mL de saliva. 2. Se diluyó en 18 mL de agua destilada.

B. Experimentación: I.

Efecto de la Concentración de la Enzima:

Sé colocó en 4 tubos de ensayos 2 mL de almidón al 0.5%, al primero se le colocó 0.4 mL de agua, al segundo 0.3 mL de agua, al tercero 0.2 mL de agua y al cuarto 0.1 mL de agua. 1.

2. Se le adicionó al tubo 1 0,1 mL de la enzima. Accionar el cronómetro, realizar la prueba de Lugol cada minuto. 3. Repetimos con el tubo 2 y adicionamos 0.2 mL de la enzima. Al tubo 3 adicionamos 0.3 mL de la enzima. Al tubo 4 adicionamos 0.4 mL. 4. Calculamos V= 1/t, [E] ≈ mL Enzima. Graficamos V vs [E] II. Efecto de la Concentración del Sustrato: 1. Se colocó en 4 tubos de ensayo distintos volúmenes de almidón 0.5 mL, 1.0 mL, 1.5

mL, 2.0 mL; después se colocó 1.5 mL de agua, 1.0 mL de agua, 0.5 mL de agua; y se homogenizó. 2. Se adicionó 0.5 mL de la enzima. Accionamos el cronómetro, y se realizamos la

prueba de Lugol cada minuto. 3. Calculamos V= 1/t. [S], graficar e interpretar.

III .Efecto de la Temperatura: 1. Se colocó en 4 tubos de ensayos 1 mL de la enzima + 5 mL de almidón y se

procedió a colocar en distintas temperaturas baño hielo, 31ºC, 55ºC y 80ºC. Accionamos el cronómetro y realizamos la prueba de Lugol cada minuto. 2. Graficamos t (ºC) vs V.

IV .Efecto de pH: 1. Se colocó en 3 tubos de ensayos 2 mL de amortiguador de pH 4.4, 6.1 y 9,9 + 2 mL

de almidón.

2. Se adicionó entonces 2 mL de la enzima a cada tubo de ensayo, accionamos el

cronómetro y realizamos entonces la prueba de Lugol cada minuto. 3. Graficamos V vs PH. V.

Resultados:

Tabla 1: Efecto de Concentración de Enzima: Tubo 1 2 3 4

[E] 0.1 0.2 0.3 0.4

T (min) +3o 25 21 15

V 0.033 0.04 0.048 0.067

Gráfica 1: [Concentración de la E] vs Velocidad de Reacción

Discusión: Para empezar, se ha de aclarar que las diluciones óptimas para salivas de diferentes personas son distintas porque las características y concentraciones de los compuestos varían de una persona a otra.

Existe una relación lineal entre la velocidad de la reacción y la concentración de la enzima. En el gráfico se observa que al aumentar la concentración de la enzima, aumenta también la velocidad de la reacción proporcionalmente. Expresado teóricamente quiere decir que las velocidades de reacción dependen generalmente de las concentraciones de las sustancias reaccionantes. Para la mayoría de las reacciones, las velocidades son más elevadas cuando las concentraciones de los reactivos son elevadas. Altas concentraciones significan que un número relativamente grande de moléculas están juntas en un volumen dado, bajo estas condiciones, las colisiones entre moléculas reaccionantes que las convierten en moléculas de producto, son relativamente frecuentes y por consiguiente la reacción es más rápida.

Tabla 2: Efecto de Concentración del Sustrato: Tubo 1 2 3 4

mL (Sustrato) 0.5 1.0 1.5 2.0

T (min) 0.5 4.0 6.3 13

[S] 0.1 0.2 0.3 0.4

V 2 0.25 0.159 0.077

Gráfica 2: [Concentración del Sustrato] vs Velocidad de Reacción:

Discusión: La saturación con el sustrato. En general, podemos decir que al aumentar la concentración de sustrato en el medio, la velocidad de reacción de un enzima aumenta; por tanto, la influencia de la concentración de sustrato tiene un efecto positivo en la catálisis enzimática.

Esto es debido, simplemente, a que al aumentar el número de sustratos en el medio, será mayor la cantidad de producto producido por la reacción enzimática. Sin embargo, llega un momento en que la velocidad de la reacción enzimática no aumenta aunque aumentemos la concentración de sustrato, lo cual es debido a que en ese momento todos los enzimas presentes están actuando a pleno rendimiento y ya no pueden aumentar la producción de producto. En ese momento se dice que el enzima está saturado por el sustrato.

Tabla 3: Efecto de la Temperatura: Tubo 1 2 3 4

T (ºC) 9 ºC 31 ºC 55 ºC 80 ºC

t (min) +30 +30 +30 +30

V 0.033 0.033 0.033 0.033

Gráfica 3: Temperatura (ºC) vs Velocidad de Reacción

Discusión: Las amilasas son enzimas dependientes de cloruro, completamente afuncionales en ausencia de iones de cloruro. Actúan a lo largo de cualquier punto de la cadena de los carbohidratos, descomponiéndolos en dextrina desde la amilopectinan. La estructura terciaria de una proteína es muy sensible a los cambios de la temperatura ya que, como sabemos, se mantiene

gracias a fuerzas no covalentes altamente sensibles al calor. Esto hace que la actividad enzimática muestre una dependencia de la temperatura. A 9°C, 55°C, 31°C y a 80° C, no se presentaron cambios de color en la muestra es decir que el color azul nunca desapareció. Por lo tanto, se podría decir que la alfa amilasa no actuó. Mas sin embargo, a temperatura ambiente 31°C debió presentar cambios, esto era de esperarse, ya que esta enzima tiene un rango de temperatura óptima y, en el caso de la alfa amilasa, al encontrarse ésta en el cuerpo humano (que siempre tiene una temperatura de 37 ° C)2 , se supone que a temperatura ambiente no va a perder su actividad, pero sí disminuirla, ya que los choques intermoleculares van a ser menores. Sin embargo, al disminuir demasiado la temperatura, los choques entre las moléculas disminuyen también, por lo que la actividad enzimática baja hasta el punto en el que no se puede ver. Por el contrario, al aumentar la temperatura de incubación a 80° C, los choques entre las moléculas se van a acrecentar de tal forma que la enzima se va a desnaturalizar. Es por ello que se presume que no se observó cambios en las muestras. Tabla 4: Efecto de pH: Tubo 1 2 3

pH 4.4 6.1 9.9

Gráfica 4: pH vs Velocidad de Reacción:

Discusión:

t (min) 5.0 2.0 7.0

V 0.2 0.5 0.14

Todas las enzimas tienen un pH óptimo, en donde tienen mayor actividad, ya medida que se alejan de ese pH (para ambos la dos) disminuye en su actividad. Esto se debe a que algunos restos aminoácidicos de las enzimas (en el caso de que sean proteínas) tienen cargas y pueden ser los responsables tanto de mantener la estructura tridimensional de la proteína como de interaccionar con el sustrato. El pH del medio (es decir, la presencia de ion es H+ y OH-) puede modificar las cargas de estos aminoácidos y de este modo incluso desnaturalizar a la enzima. Debemos aclarar que aunque la enzima tenga actividad al pH salival de cada persona (siempre entre 6 y 8, según la tabla)4, esto no quiere decir que éste sea su pH óptimo. Para determinarlo experimentalmente, medimos la actividad enzimática a diferentes pH (4.4, 6.1 y 9.9) y así realizamos la curva, para determinar el pH óptimo de la α- amilasa a partir de los resulta dos de este. Las soluciones de proteínas tienen baja tensión superficial, lo cual determina que cuando estas soluciones se agitan violentamente, se forma espuma. La formación de espuma es un factor que favorece la desnaturalización. VI.

Conclusiones:

•

La función más importante de la saliva es humedecer y lubricar el bolo alimenticio, desde el punto de vista digestivo es importante por contener a la amilasa salival o ptialina, enzima que hidroliza diversos tipos de polisacáridos.

•

Con respecto a la influencia del pH del medio en la actividad enzimática de la αamilasa, podemos decir que a pH extremos (es decir, muy ácidos o muy básicos) la enzima no funciona, o al menos disminuye notablemente su actividad.

•

A partir de los resultados obtenidos se podría deducir que la α- amilasa se desnaturaliza al ser expuesta a una temperatura tan elevada, ya que se produce un exceso de choques entre las molé culas presentes en la saliva como consecuencia del aumento de la energía cinética, produciendo la ruptura de las uniones débiles (como puentes de hidrogeno, fuerza s de van der Waals , interacciones iónicas ) , que afecta la estructura terciaria de la enzima y a su vez la conformación de su sitio activo , perdiendo la capacidad de romper las uniones C1 - C4 de las glucosas. Y es por esto que e l color azul no desaparece.

• La enzima que utilizamos fue la amilasa salival y un sustrato de almidón, como todas las enzimas están en condiciones óptimas en donde su actividad enzimática es máxima, por lo cual utilizamos procesos en los cuales variamos estas condiciones para determinar el punto óptimo en cada condición en la cual esta actividad enzimática era mayor.

• Cualquier cambio brusco de pH, sabiendo que las enzimas son proteínas, puede alterar el carácter iónico de los grupos amino y carboxilo en la superficie proteica, afectando así las propiedades catalíticas de una enzima. A pH alto o bajo se puede producir la desnaturalización de la enzima y en consecuencia su inactivación. • La enzima (E), se combina con el substrato (S) formando en complejo de transición, enzima-substrato (E-S), mediante una reacción reversible, cuya energía de activación es menor que la de la reacción no catalizada. Cuando se forma el producto de la reacción (P), se regenera de nuevo la enzima (E) de forma libre, la que puede combinarse de nuevo con otra molécula de substrato (S).

VII.

Bibliografías:

1. Cox M. M. y Nelson, D.L. (2006).Lehninger. Principios de Bioquímica. Barcelona.

Editorial Omega. Página 126-131. 2. Price, N. and Stevens, L., (1999). Fundamentos de Enzimas: Biología Celular y

Molecular Catalítica de las Proteínas Oxford University Press. Página 1132-1140. 3. Rodwel. (2004). Bioquímica de Harper, 13ª ed., s.d. Página 215-223 4. Mathews, C.K., Van Holde K.E. and Ahern K.G. (2000). Bioquímica. Third edition.

Addison Wesley Longman Inc. USA.

Cuestionario:

1. Describa las características estructurales del almidón que permite su identificación con lugol.

Dado que el almidón está integrado por dos fracciones, la amilosa y la amilopectina, debe tenerse en cuenta las reacciones que ambas producen (así como sus respectivos productos de hidrólisis) con el reactivo de Lugol: AMILOSA AMILOPECTINA + Amilasa -------------- AMILODEXTRINAS +IODO = resultado Color azul violeta MALTOSA + GLUCOSA -----------------------+IODO No dan coloración Almidón. Es un polisacárido formado por moléculas de α-D-glucosa unidas por enlaces glucosídicos α (1→4) y α (1→6). En la molécula de almidón se distinguen dos tipos de polímero: •

Amilosa.- Es un polímero no ramificado formado por largas cadenas de unidades de

α-D-glucosa unidas por enlaces α-(1→4). Estas cadenas adoptan una disposición helicoidal con 6 moléculas por vuelta, y tienen masas moleculares relativas que oscilan entre unos pocos miles y 500.000 daltons. •

Amilopectina.- Es un polímero muy ramificado (Figura 7.14) formado por moléculas

de α-D-glucosa. Los sucesivos restos de glucosa a lo largo de las cadenas están unidos por enlaces α (1→4), y los puntos de ramificación, que se encuentran espaciados por un número de restos de glucosa que oscila entre 24 y 30, consisten en enlaces α (1→6) (Fig. 7.14). Su masa molecular relativa puede alcanzar hasta un millón de Dalton. El almidón actúa como sustancia de reserva en las células vegetales. Una parte sustancial de los glúcidos producidos en la fotosíntesis se almacenan en forma de almidón, dando lugar a unos agregados insolubles de gran tamaño, los granos de almidón, que se encuentran en todas las células vegetales, siendo especialmente abundantes en las de las semillas, frutos y tubérculos.

Las glándulas salivales secretan α- amilasa, la cual inicia la hidrólisis del almidón .Esta enzima es una endoglucosidasa que hidroliza enlaces α(1-4) glucosídicos internos, pero no ataca los enlaces α(1-6). Da como productos finales maltosa, algo de glucosa y dextrinas límites. El lugol es una disolución de yodo que tiene una reacción específica con el almidón. El reactivo de lugol se intercala por la molécula de almidón y esto se detecta por la coloración violeta que toma la mezcla. Este polisacárido está formado por moléculas de glucosa y es exclusivo de las células vegetales. En la digestión química aparece la acción de las glándulas salivales. Estas secretan saliva (agua, electrolitos (Na, K), enzimas (amilasa salival y lipasa salival)). La amilasa salival degrada el almidón, (h. De carbono complejo) hasta maltosa (h. De carbono con 2 glucosas). Pero no todo el almidón se degrada en la boca. La obtención de una sustancia colorida al reaccionar el yodo con el almidón se cree se debe a la formación de un complejo de coordinación entre las miscelas de almidón y de iodo. Estas miscelas están formadas por cadenas polisacáridas enrolladas en hélice. El iodo puede colocarse centralmente en estas hélices. El color depende del largo de la sección lineal de la molécula de almidón. Por eso la amilosa pura, que es el polisacárido exclusivamente lineal dará con el iodo el color más intenso de un azul profundo. La amilopectina dará un color azul violeta mientras que el glucógeno que es la molécula más ramificada dará un color café rojizo. La celulosa no da reacción de color con el iodo. Las dextrinas formadas por la hidrólisis del almidón dan un color que varía de café rojizo a la ausencia de color, dependiendo del tamaño de la molécula. El color disminuye cuando la temperatura aumenta, hasta desaparecer por completo, y se intensifica al bajar nuevamente la temperatura. Esto indica la formación y deformación de los complejos de coordinación formados entre el iodo y el almidón. La reacción del iodo con el almidón nos sirve para determinar el grado de hidrólisis del almidón.

2. Señale las dificultades en la realización del experimento. Las dificultades que se tuvieron al momento de realizar este experimento fue en parte porque se utilizo una concentración de almidón muy alta que se encontraba al 1%, lo que hiso que se demorara mas el momento final de la reacción, lo que quiere decir que para una próxima experiencia es recomendable utilizar una concentración más baja; también pudo haber afectado el hecho de que los voluntarios que procedieron a salivar no se encontraban en completo ayuno y esto pudo provocar que la amilasa salival no se encontrara muy pura.

3. ¿Qué otra prueba podría emplearse para la realización de este experimento? Explique. Otra prueba que se puede emplear para la realización de este experimento de alfaamilasa es mediante la técnica de espectrofotometría, tomando la absorvancia de cada prueba y realizar los gráficos al igual como se hizo en este experimento haciendo una relación respecto a la velocidad de reacción (pH, sustrato y temperatura) y concentración (enzima).