Aldo ManuscritoFinal261113

UNIVERSIDAD POLITÉCNICA DE PUEBLA Programa Académico de Maestría en Ingeniería en Automatización de Procesos Industriales

MONITOREO Y CONTROL DE UN BIORREACTOR ESCALA LABORATORIO PARA PROCESOS DE FERMENTACIÓN DE CULTIVOS CELULARES TESIS QUE PARA OBTENER EL GRADO DE MAESTRO EN INGENIERÍA

PRESENTA: ING. ALDO HERNÁNDEZ DÍAZ

DIRECTOR DRA. MARÍA LETICIA RAMÍREZ CASTILLO

Juan C. Bonilla, Puebla

13 de Diciembre del 2013

El presente trabajo fue realizado en el Laboratorio de Investigación y Posgrado y en los

Departamentos

de

Biotecnología

y

Mecatrónica de la Universidad Politécnica de Puebla, con el apoyo del Consejo de Ciencia y

Tecnología

del

Estado

de

Puebla

(CONCYTEP). El programa de Maestría en Ingeniería pertenece al Programa Nacional de Posgrados de Calidad (PNPC-CONACYT).

1

La presente tesis titulada “Monitoreo y control de un biorreactor escala laboratorio para procesos de fermentación de cultivos celulares” y realizada por el Ing. Aldo Hernández Díaz, ha sido revisada y aprobada por el Jurado para obtener el Título de:

MAESTRO EN INGENIERÍA EN AUTOMATIZACIÓN DE PROCESOS INDUSTRIALES

PNPC-CONACYT UNIVERSIDAD POLITÉCNICA DE PUEBLA

Jurado integrado por: Firma

Director: Dra. María Leticia Ramírez Castillo

___________________________

Asesor:

___________________________

Asesor:

___________________________

Revisor:

___________________________

Juan C. Bonilla, Puebla, México.

Agosto 2013 2

Contenido Resumen ................................................................................................................. 8 Capítulo 1 Planteamiento del problema de investigación ...................................... 10 1.1 Introducción ................................................................................................. 10 1.2 Objetivos ...................................................................................................... 12 1.2.1 Objetivo general ..................................................................................... 12 1.2.2 Objetivos específicos ............................................................................. 12 1.3 Justificación ................................................................................................. 12 Capítulo 2 Estudio del estado del

arte ................................................... 15

2.1 Antecedentes ............................................................................................... 15 2.1.1 Características de un biorreactor ........................................................... 18 2.1.2 Parámetros de operación de un biorreactor ........................................... 20 2.1.3 Equipos existentes. ................................................................................ 22 2.1.3.1 BIOSTAT® ORB ................................................................................. 24 2.1.3.2 Biorreactor LAMBDA MINIFOR® ........................................................ 25 2.1.3.2 Biorreactor BIO FLO 310®.................................................................. 26 2.2 Modos de operación de cultivo..................................................................... 27 2.3. Parámetros de operación ............................................................................ 32 2.3.1 pH (potencial de Hidrógeno) ................................................................. 34 2.3.2 Oxígeno Disuelto (OD) ........................................................................... 35 2.3.3 Temperatura .......................................................................................... 37 2.3.4 Agitación del medio de cultivo ............................................................... 40 2.3.5 Alimentación de sustrato........................................................................ 41 2.4 Simulación de los sistemas de cultivo .......................................................... 43 La simulación de los sistemas de cultivo se basó en los puntos siguientes: .. 43 2.4.1 Cultivo lote ............................................................................................. 44 2.4.2 Cultivo continuo ..................................................................................... 46 2.4.3 Cultivos alimentados o cultivos lote alimentado ..................................... 48 3

2.4.3.2 Cultivo alimentado lineal ..................................................................... 50 Capítulo 3 Implementación del sistema ................................................................. 52 3.1 Biorreactor ................................................................................................... 52 3.2 Control para los cultivos ............................................................................... 54 3.2.1 Cultivo alimentado exponencial. ............................................................ 54 3.2.2 Alimentación lineal ................................................................................. 56 3.2.3 Cultivo continuo ..................................................................................... 57 3.3 Agitación de medio de cultivo....................................................................... 57 3.4 Medición de pH. ........................................................................................... 58 3.5 Medición del oxígeno disuelto ...................................................................... 59 3.6 Interfaz de usuario ....................................................................................... 60 Capítulo 4 Resultados y discusiones ..................................................................... 63 4.1 Medición de pH. ........................................................................................... 63 4.2 Medición del oxígeno disuelto ...................................................................... 66 4.5. Agitación del medio de cultivo. ................................................................ 70 4.5 Panorama general del equipo ...................................................................... 71 4.6Simulación de los cultivos ............................................................................. 72 4.6.1 Cultivo Lote ............................................................................................ 73 4.6.2 Cultivo Continuo..................................................................................... 74 4.6.3 Cultivo lote alimentado........................................................................... 77 Capítulo 5. Conclusiones ...................................................................................... 84 5.1 Conclusiones................................................................................................ 91 Capítulo 6 Referencias bibliográficas .................................................................... 93

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Índice de figuras Figura 1.1. Diagrama a bloques del proceso de fermentación. ............................. 14 Figura 2.1 Configuración de un biorreactor agitado (Ramírez 2004). .................... 19 Figura 2.2 Perspectivas de reacción y proceso involucrados en el crecimiento celular y formación de producto. ........................................................................... 22 Figura 2.3 Representación de cultivo lote, esquema general en (a) y cinética de cultivo en (b). ......................................................................................................... 29 Figura 2.4 Representación de cultivo continuo. 2.4a. Esquema del biorreactor. 2.4b. Cinética de cultivo continuo. ......................................................................... 30 Figura 2.5. Representación de cultivo lote alimentado. 2.4a. Esquema de biorreactor. 2.4b. Cinética del cultivo lote alimentado. .......................................... 31 Figura 2.6. Electrodo de vidrio para medir pH. ...................................................... 35 Figura 2.7. Electrodo de Oxígeno disuelto. Instrumento. ...................................... 36 Figura 2.8. Electrodo de Oxígeno disuelto. Conexiones. ...................................... 37 Figura 2.9. Termopar convencional. ...................................................................... 39 Figura 2.10. Agitación del medio de cultivo. .......................................................... 41 Figura 2.12. Bomba peristáltica. ............................................................................ 42 Figura 3.1. Procesos e fermentación en biorreactor escala laboratorio. ............... 53 Figura 3.2. Biorreactor de 4 litros de la UP-Puebla. .............................................. 53 Figura 3.3. Estructura del controlador PID y la planta a controlar. ........................ 56 Figura 3.4. Esquema del sistema de control como entrada al biorreactor de una bomba peristáltica. ................................................................................................ 56 Figura 3.5. Diagrama a bloques del controlador PID del motor de corriente directa. .............................................................................................................................. 57 Figura 3.6. Diagrama a bloques del controlador PID del motor de corriente directa. .............................................................................................................................. 58 Figura 3.7 Experimento de mediciones de porcentaje de saturación de oxígeno. 60 Figura 3.8. Diagrama general de interfaz de usuario. ........................................... 61 Figura 3.9 Diagrama de interfaz en Labview y mbed (http://mbed.org/cookbook/Homepage.). ............................................................... 62 Figura 4.1 Relación Voltaje-pH.............................................................................. 64 Figura 4.2 electrodo de pH. ................................................................................... 65 Figura 4.3. Gráfica de pH, datos tomados en línea. .............................................. 65 Figura 4.4. Datos obtenido y exportados en hoja de cálculo. ................................ 66 Figura 4.5. Mediciones de porcentaje de saturación de oxígeno, ......................... 67 aireación 1vvm. ..................................................................................................... 67 5

Figura 4.6. Control de velocidad dando un flujo constante como alimentación de sustrato ................................................................................................................. 67 Figura 4.7. Implementación de tarjeta de potencia................................................ 68 Figura 4.8. Termopar convencional. ...................................................................... 69 Figura 4.9. Circuito de conexiones del MAX6675 al microcontrolador MBED. ...... 70 Figura 4.10. Velocidad de agitación en medio de cultivo. ..................................... 71 Figura 4.11. Implementación de tarjeta de potencia. ............................................. 71 Figura 4.12 Panorama general de una fermentación. ........................................... 72 Figura 4.13 Dinámica del cultivo lote. .................................................................... 74 Figura 4.14.Comportamiento de la velocidad específica de crecimiento, en función del flujo para un tiempo dado. ............................................................................... 76 Figura 4.15. Simulación del cultivo continuo simple etapa. ................................... 77 Figura 4.16. El cultivo alimentado exponencialmente de Klebsiellapneumoniaesp pneumoniaeK63, 𝝁=0.05 h-1. ................................................................................. 79 Figura 4.17. Cultivo alimentado exponencialmente de Klebsiella pneumoniae sp. pneumoniae, 𝝁 =0.05 h-1. A) Evolución de la biomasa total y B) Concentración de biomasa. ................................................................................................................ 79 Figura 4.18. Cultivo alimentado creciente de Klebsiella pneumoniae sp. pneumoniae. Evolución del A) Flujo, B) Volumen. ................................................ 80 Figura 4.19 Incremento del volumen a diferentes flujos constantes en biorreactor. .............................................................................................................................. 82 Figura 4.20. Evolución de la concentración de biomasa para cultivos lote alimentado lineal. .................................................................................................. 83 Figura 4.21. Evolución de la biomasa total para cultivos lote alimentado lineal. ... 83

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Índice de tablas Tabla 2.1 Productos obtenidos por fermentación (Quintero 1997) ........................ 16 Tabla 2.2 Aplicaciones de las enzimas producidas por fermentación, extraído de Quintero (1997) ..................................................................................................... 17 Tabla 2.3 Variables comúnmente medidas en fermentadores y dispositivos utilizados para su determinación (Ramírez 2004). ................................................ 33 Tabla 2.4. Características de termopares de acuerdo al tipo. ............................... 39 Tabla 2.5. Clasificación de procesos de agitación. ................................................ 40 Tabla 3.1 Relaciones estándar del reactor de 4 litros utilizado. ............................ 54 Tabla 3.2 Voltajes obtenidos con sustancias buffer y amplificadas. ...................... 58 Tabla 4.2.Caracterización de la bomba peristáltica. .............................................. 68 Tabla 4.3. Características de termopares de acuerdo al tipo. ............................... 69 Tabla 4.4. Parámetros de simulación. ................................................................... 73 Tabla 4.5. Condiciones de operación. ................................................................... 74 Tabla 4.6 Condiciones de operaciónutilizadas en la simulación del cultivo continuo simple etapa. ......................................................................................................... 75 Tabla 4.7 Parámetros cinéticos utilizados en la simulación del cultivo continuo simple etapa .......................................................................................................... 75 Tabla 4.7. Condiciones de operación. ................................................................... 78 Tabla 4.8. Parámetros de simulación. ................................................................... 78 Tabla 4.9 Parámetros cinéticos utilizados en la simulación de cultivo lote alimentado lineal. .................................................................................................. 81 Tabla 4.10 Condiciones de operaciónutilizadas en la simulación de cultivo lote alimentado lineal. .................................................................................................. 82

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Resumen Los biorreactores son recipientes en los que se pueden realizar reacciones bioquímicas, con microorganismos, enzimas, células vegetales o células animales. Su función es proveer un medio controlado para llevara cabo las reacciones en las mejores condiciones y de esa forma lograr la transformación de sustratos y biosíntesis de productos con altos rendimientos. En la mayoría de los biorreactores comerciales, el control de los parámetros se lleva a cabo manualmente y la medición de estos datos no es almacenada, el costo se va incrementando conforme se aumentan los dispositivos para controlar los parámetros y adquirir los datos en línea, almacenarlos y graficarlos. En este trabajo se desarrolló un sistema de medición y control de los parámetros de operación así como de adquisición de los datos en línea que permite almacenarlos y graficarlos. Los parámetros medidos fueron pH, temperatura y oxígeno disuelto; los parámetros controlados fueron pH y alimentación de sustrato, este último mediante el flujo controlado por una bomba peristáltica que permite llevar a cabo cultivos alimentados y continuos. Se estudiaron los transductores que se utilizan para dichas tarea. Además se llevaron a cabo las simulaciones de los cultivos (cultivos lote, continuo, lote alimentado exponencial y lineal) realizando los balances de masa de acuerdo al modo de operación y utilizando los modelos de crecimiento y producción establecidos por la bibliografía. El desarrollo de este sistema fue menos costoso que un biorreactor comercial y presentar mayor flexibilidad al poder realizar cultivos alimentados.

Abstrac The bioreactors are containers in which biochemical reactions can be performed, using microorganisms, enzymes, plant cells or animal cells. Its function is to provide a controlled environment to carry out the reactions in the best condition and thus transform substrates and synthesize products with high yields. In most commercial bioreactors, the control of parameters is carried out manually and the measurement of such data is not stored, the cost will increase with the increase of devices to control the parameters, for online data acquisition, their storage and graphing. In this work a system for measuring and controlling the operating parameters was developed as well as acquisition of online data, storage and graphing. The measured parameterswere pH, temperature and dissolved oxygen; the controlledparameterswere pH and substrate feeding, the latter by the flow control of a peristaltic pump that allows to perform fed-batch and continuous cultures. The transducersfor these tasks were studied. Culture simulations were also carried out (batch, continuous, fed batch lineal and exponential cultures) by mass balances according to the operating mode and using models of growth and 8

production established in the bibliographic references. The development of this system was less expensive than a commercial bioreactor and provides greater flexibility, for example the fed-batch culture can be performed.

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Capítulo 1 Planteamiento del problema de investigación 1.1 Introducción Una de las metas importantes en cualquier industria de los procesos, es el incremento de la producción asegurando que el producto fabricado sea de calidad, lo anterior sin importar cuál sea el proceso que se esté manejando; una de las maneras de conseguir esto es la implementación de técnicas de control para mantener las condiciones adecuadas necesarias para llevar a cabo el proceso. Familiarizado con el término de control de proceso está el término de automatización que es usado para describir la operación automática, en años recientes la automatización ha sido utilizada en la manufactura moderna de productos, operando de manera automática las máquinas, es decir, con la mínima interacción del humano (Bolton 2002). Las técnicas de control también son utilizadas para los procesos biológicos, mejor conocidos como bioprocesos. Las principales preocupaciones en la industria de los bioprocesos es poder controlar el proceso manteniendo las condiciones de la reacción biológica en todo el medio de cultivo. El control de un bioproceso está 10

definido como proveer las condiciones adecuadas para que los microorganismos puedan crecer, reproducirse y sintetizar el producto deseado en las cantidades esperadas, esto incluye: i) una concentración correcta de nutrientes en el cultivo (fuentes de carbono, nitrógeno, fósforo, oligoelementos y oxígeno); ii) remover las toxinas producidas por el propio metabolismo de las células (dado el caso del CO2), iii) controlar las condiciones de operación (temperatura, pH, aireación y agitación)(Alford2006, Wang y col. 2009). Lo anterior permitirá controlar al microorganismo y en el mejor de los casos su metabolismo para producir lo previsto.

El desarrollo del monitoreo y control de un biorreactores indispensable en el estudio de las condiciones adecuadas para llevar a cabo el metabolismo y reproducción celular, proporcionando al cultivo celular un medio adecuado de reproducción, detallando la dinámica de crecimiento celular y de los sustratos importantes para que ésta tarea sea llevada a cabo, tal es el objeto de este trabajo. En este la dinámica de crecimiento celular es representada por medio de modelos matemáticos establecidos y estudiados ampliamente por diversas bibliografías. También se muestran las diversas técnicas de control que pueden implementarse a los bioprocesos y los instrumentos que se utilizan para llevar a cabo el sensado de los parámetros más importantes, así como los mecanismos que ejecutan el control de dichos parámetros para propiciar a las células para su apto desarrollo. Se logró desarrollar un sistema de adquisición de datos para los parámetros de operación de pH y temperatura, asimismo se implementó un dispositivo que permitirá controlar los motores para el control de flujo y de agitación.

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1.2 Objetivos 1.2.1 Objetivo general Monitorear y controlar un biorreactor escala laboratorio para procesos de fermentación de cultivos celulares.

1.2.2 Objetivos específicos 

Identificar y caracterizar el biorreactor.



Establecer una estrategia para medir pH deseado en el rango de operación



Establecer una estrategia para medir temperatura a lo largo del proceso de fermentación.



Implementar un sistema para controlar la velocidad de un motor de corriente continua para la agitación del biorreactor.



Manipular el flujo de entrada de sustrato para realizar cultivos lote alimentados en modos exponencial, lineal e intermitente.



Desarrollar una interfaz en la que se puedan visualizar y almacenar los parámetros de operación.

1.3 Justificación El cultivo de microorganismos requiere de un ambiente controlado que sólo se logra con un biorreactor, los existentes en el mercado, además de alto costo son limitados en su funcionamiento. En su mayoría en estos biorreactores el control de los parámetros se lleva a cabo imponiendo manualmente un valor y la medición de estos datos no es almacenada en caso de que se varíe. El costo se va incrementando conforme se aumentan los dispositivos para adquirir los datos en línea, almacenarlos y graficarlos. Los biorreactores para llevar a cabo cultivos alimentados aún no se existen en el mercado. Por lo anterior es necesario desarrollar un biorreactor con mayor flexibilidad disminuyendo los costos; un biorreactor que no solamente cuente con sistema de medición y control de 12

temperatura y pH sino también de adquisición de datos en línea almacenarlos y observar directamente las gráficas con el fin de poder actuar rápido. Además en este Biorreactor también se podrán poder realizar cultivos alimentados al tener un sistema automático de adición de nutrientes. Se propondrá un diseño para los cultivos continuos en los que el flujo de entrada y salida deben ser similares sino es que iguales. Partiendo de la existencia de un biorreactor en el laboratorio de biotecnología, el trabajo a realizar es posible de alcanzar ya que se cuenta con el biorreactor con la funcionalidad de operar procesos de fermentación en diferentes modos de operación, así también cuenta con puertos para la medición de los parámetros de operación y entradas para realizar la tarea de mantener en un valor deseado dicho parámetro, en este caso sólo para pH y temperatura, y en el caso de oxígeno disuelto sólo llevar a cabo la medición. Ya que el biorreactor cuenta con entradas y salidas es posible manejar el modo de operación lote, lote alimentado y cultivo continuo. Debido a que los equipos existentes en el mercado son de alto costo, es necesario reducir los mismos mediante la implementación de sistemas capaces de realizar la medición y mantener parámetros de operación en valores deseados según el cultivo que se quiera realizar. La Figura 1.1 hace notar en el proceso de fermentación, identificando las entradas y salidas de las variables en el biorreactor.

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Figura 1.1. Diagrama a bloques del proceso de fermentación.

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Capítulo 2 Estudio del estado del arte 2.1 Antecedentes La ingeniería bioquímica es una disciplina que estudia el procesamiento de materiales de origen biológico para generar bienes y servicios, los materiales biológicos que competen a ésta disciplina son primordialmente aquellos derivados de microorganismos, células o sus partes. La contribución de la ingeniería bioquímica es generar productos a los menores costos, mejor calidad y mayor seguridad posibles tanto para el ser humano como para el medio ambiente, para esto, el tema central de atención es el diseño y operación de bioprocesos eficientes y reproducibles mediante la integración de las ciencias biológicas con diversas ingenierías como la mecánica, eléctrica, económica e industrial, por mencionar algunos (Aiba y col. 1973, Belter y col. 1988, Stanbury y Whitaker 1995, Ramírez 2004). En la Tabla 2.1 se observan los productos de interés industrial obtenidos por fermentación en biorreactor y en la Tabla 2.2 se observan las aplicaciones de las enzimas

que

son

de

los

productos

biotecnológicos

más

aceptados

y 15

comercializados. Muchos productos biotecnológicos ya han sido aceptados y algunos están en su etapa de desarrollo, las aplicaciones van desde alimentos, medicina, ambiental, vegetal, industrias textiles y del petróleo. Tabla 2.1 Productos obtenidos por fermentación (Quintero 1997) Compuesto

Ejemplo

Ácidos orgánicos

Acético,cítrico, fumárico, glucónico, itacónico, láctico

Aminoácidos

Glutamato de sodio, L-lisina, DL-metionina, L-triptofano, L-valina

Alcoholes y solventes

Etanol, acetona, glicerol, butanol, 2,3- butanodiol

Antibióticos

Bacitracina, estreptomicina, neomicina, penicilina, tetraciclina

Esteroides

Cortisona, hidrocortisona, prednisolona, testosterona, triamcinolona

Proteína unicelular

Alga, bacteria, levadura, hongo

Vitaminas

Ácido ascórbico, cianocobalamina, -caroteno, rivoflavina

Otros

Alcaloides, enzimas, insecticidas biológicos, metano, nucleótidos (saborizantes),promotores de crecimiento, recuperación de minerales (Fe, Cu, Pb, Zn, etc.).

Polisacáridos

Goma xantana

La generación del mejor ente biológico para un bioproceso en particular es materia de la biología celular, biología molecular, microbiología e ingeniería de proteínas, entre otras disciplinas. No obstante, para que el desempeño del material biológico (derivados de microorganismos, células o sus partes) sea el más adecuado es necesario proporcionarle un entorno adecuado, lo cual es el tema principal de la ingeniería bioquímica. Para lograr dar al ente biológico las condiciones adecuadas para su desarrollo, es necesario del diseño de reactores y sus estrategias para operarlos y controlarlos. 16

Tabla 2.2 Aplicaciones de las enzimas producidas por fermentación, extraído de Quintero (1997) Alimento

Enzima

Acción

Glucosa oxidasa/catalasa (hongo)

Elimina el oxígeno

Diacetilreductasa (levadura)

Convierte el radical diacetilo en acetoïna (requiere NADH)

Lactasa (hongo)

Rompe la lactosa

Amilasa

Hidroliza almidones

Naringinasa

Destruye la naringina

Gelatina

Lipasa (hongo)

Rompe grasa

Glucosa

Celulasa

Hidroliza la celulosa

Cerveza

Pan

Jugos de frutas

Posible utilidad Impide el crecimiento de microorganismos aeróbicos que generan ácidosvolátilesy empobrecen el sabor. Elimina el diacetilo que contribuye a la aparición de sabores indeseables en la cerveza. Provee de más azúcares fermentables a la levadura de pan a partir de la leche utilizada en la mezcla. Con pectinasa clarifica los jugos de fruta Elimina el sabor amargo del jugo cítrico y de las cáscaras Aumenta el rendimiento de gelatina de hueso de alta calidad por desengrasado Hidrólisis de pulpa de papel, periódico o desperdicio agrícola para producir glucosa o azúcares fermentables.

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El término biorreactor o fermentador se refiere al equipo donde se efectúa la transformación biológica, particularmente el crecimiento celular, y aunque generalmente los términos de biorreactor y fermentador se usan de forma indistinta, en general, el segundo se aplica sólo para el caso de cultivos microbianos. Los biorreactores son equipos donde se realiza el proceso de cultivo, sea en estado sólido o líquido. El diseño de un biorreactor debe ser tal que asegure homogeneidad en el sistema y condiciones óptimas para el crecimiento microbiano y la obtención del producto deseado (Ramírez 2004).

2.1.1 Características de un biorreactor Un biorreactor tiene como función principal contener al ente biológico en un entorno adecuado, garantizando la seguridad tanto del medio ambiente, el de los operadores y el del propio cultivo mismo, es por eso que los biorreactores están diseñados para ser esterilizados y mantener la esterilidad durante su operación, se construyen de acero inoxidable y vidrio que soporte las temperaturas y presión de la autoclave. Los reactores de escala laboratorio son construidos generalmente en vidrio (pero si los hay en acero inoxidable) y los de mayor escala, arriba de 15 litros, son en acero inoxidable. Los biorreactores pueden ser agitados de forma mecánica o neumática, los más comunes son los primeros. En la Figura 2.1 se observa la configuración de un reactor agitado mecánicamente (Ramírez 2004, Asenjo 2007).

18

Figura 2.1 Configuración de un biorreactor agitado (Ramírez 2004). Los criterios más importantes para el diseño de un biorreactor pueden resumirse a continuación. 

El tanque debe diseñarse para que funcione asépticamente durante varios días, para evitar la aparición de contaminantes en las operaciones de bioprocesos de larga duración.



Se debe proporcionar un sistema adecuado de aireación y agitación para cubrir las necesidades metabólicas de los microorganismos.



El consumo de energía debe ser el mínimo posible.



Debe contar con entradas para la adición de nutrientes y el control de pH.



El crecimiento microbiano es generalmente exotérmico, por lo que el biorreactor debe facilitar la transferencia de calor, del medio hacia las células y viceversa, a medida que se produce el crecimiento celular, además de mantener estable la temperatura deseada.



Mantener las células uniformemente distribuidas en todo el volumen de cultivo.



Suministrar oxígeno a una velocidad tal que satisfaga el consumo. 19



El diseño debe ser tal que permita mantener el cultivo puro; una vez que todo el sistema ha sido esterilizado y posteriormente inoculado con el microorganismo deseado (Ruiz 2007).

2.1.2 Parámetros de operación de un biorreactor El desarrollo de bioprocesos tiene como objetivo entender y mejorar dicho proceso midiendo la mayor cantidad de parámetros o variables posibles. En la práctica, durante la ejecución del proceso los parámetros críticos que se encuentran disponibles para su medición y que son los adecuados para controlar el proceso y con esto asegurar la mayor calidad y rendimiento, se encuentran limitados por la escasez de un sensor adecuado para su posterior manipulación. Aunque existen vigorosas investigaciones en el desarrollo de sensores, sólo una pequeña fracción de éstos es adecuada para su uso durante la fermentación, ya que los bioprocesos son sorprendentemente difíciles tanto de sensar y de controlar. Los sensores que se pueden utilizar a lo largo de una fermentación y que se encuentran dentro del cultivo celular no deben contaminar el bioproceso, por lo tanto éstos deben ser previamente esterilizados. Debido a que la producción de células debe efectuarse en condiciones adecuadas, es necesario otorgarle a éste un medio propicio para su desarrollo y que además se pueden medir durante una fermentación, en la práctica son: 

pH (potencial de hidrógeno). Es uno de los parámetros más comúnmente medidos, ya que las células durante la fermentación producen un cambio en el pH como producto de su propio metabolismo. Por lo cual para generar el mayor crecimiento celular depende altamente del pH.



Oxígeno disuelto. Ya que es un sustrato limitante para el crecimiento celular debido a su baja solubilidad en agua.

20



Temperatura. Debido a que el metabolismo del microorganismo es exotérmico, es necesario regular la temperatura dentro de la fermentación para una buena función celular (Harmsy col. 2002).



Biomasa. El mejor desempeño en una fermentación es logrando el mayor crecimiento celular, o la mayor producción de un metabolito; a la mayor cantidad de células producidas se le conoce como biomasa. La conversión de sustrato a biomasa es claramente el resultado de un largo número de reacciones químicas. (Nielseny col. 1994)



Agitación. Cabe destacar de igual manera que aunque no es un parámetro que se pueda medir dentro de la fermentación, también es de gran importancia controlar la velocidad de agitación en el medio de cultivo, ya que al mantener la distribución homogénea de todo el cultivo celular, también rompe las burbujas de oxígeno lo cual logra que éste se encuentre disponible para el consumo dentro del metabolismo celular.



Sustratos. De igual manera la adición de sustratos (dependiendo del tipo de cultivo) es de gran importancia a lo largo de una fermentación, ya que sin esta función dentro de un bioproceso no se llevaría a cabo el mejor crecimiento celular, por lo cual es importante añadir de manera automática nutrientes suficientes para el mejor desempeño metabólico de las células. La Figura 2.2 muestra la reacción y proceso envuelta en el crecimiento celular y formación de producto.

Sin embargo, no sólo la medición y control adecuado de estos parámetros puede garantizar el mejor desempeño de un bioproceso, también hay que referirse al modo de operación, los cuales son, cultivos por lote, cultivo alimentado y cultivo continuo, estos modos de operación de un biorreactor se describen a continuación.

21

Figura 2.2 Perspectivas de reacción y proceso involucrados en el crecimiento celular y formación de producto.

2.2.3 Control de bioprocesos En la actualidad la industria biotecnológica necesita cumplir con estándares nacionales e internacionales de seguridad industrial, legislación ambiental y producción continua de alta calidad, por lo cual es de vital interés el desarrollo e implementación de sistemas de optimización lo cual lleva a implementar sistemas de optimización eficientes, principalmente con información en tiempo real de las variables críticas del proceso. Los procesos biotecnológicos implican la incorporación de microorganismos creciendo mediante la catálisis de reacciones bioquímicas. Los sistemas biológicos presentan comportamientos singulares tales como oscilaciones en las concentraciones de uno o más metabolitos, multiplicidad de estados estacionarios, histéresis y caos. Lo anterior es de especial interés para los sistemas biológicos con aplicación industrial, por ejemplo: la producción de enzimas, antibióticos, vacunas,

colorantes, combustibles o la remoción de

diversos contaminantes recalcitrantes, entre ellos la gran familia de pesticidas, herbicidas, metales pesados y derivados del petróleo, por mencionar algunos. 22

La estructura de estos esquemas se basa en la integración de un modelo matemático basado en balances de materia y energía que representen a nivel macroscópico y microscópico el comportamiento de las variables implicadas en el bioproceso, simulando y validando con la parte experimental el modelo propuesto utilizando diversas herramientas computacionales. Una vez representada la dinámica del bioproceso, se diseñan estructuras de estimación y lazos de control mediante pruebas analíticas asegurando su convergencia con el sistema experimental para una aplicación viable; estas estructuras se implementan en algoritmos computacionales en una unidad virtual (virtual instrument-software sensor) en una PC, en donde se alimentan las mediciones de los sensores en línea salidas de control hacia el biorreactor y mediante un mecanismo de tipo interface-operador se pueden modificar los objetivos de control, así como el diagnóstico del sistema buscando una mejora continua para cada etapa del bioproceso. La figura 2.3 muestra las características generales del control de un bioproceso, en ella se muestra, el biorreactor como planta, la parte del sensado, la interfaz y la parte de control.

Figura 2.3 Diagrama general del control de un biorreactor.

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2.1.3 Equipos existentes. Existen equipos existentes en el mercado, cada uno con diferentes características y funciones, además de capacidad y costo; algunos de estos equipos varían en precio de los $700,000 hasta llegar a los $2,000,000 el cual depende de las funciones y la capacidad de los biorreactores. Algunos de ellos se mencionan a continuación.

2.1.3.1 BIOSTAT® ORB El ORB BIOSTAT® 200 es una nueva generación de biorreactores de un solo uso con la tecnología contrastada de agitador y costos operativos excepcionalmente bajos. El principio de agitación orbital garantiza una alta capacidad de transferencia de oxígeno por aireación superficial y una mezcla eficiente con bajo cizallamiento. Al eliminar la necesidad de dispositivos de mezcla interna y aspersión, las bolsas constituyen una alternativa económica a la agitación con biorreactores de un solo uso. El biorreactor de este tipo se muestra en la figura 2.4 y es ideal para: 

Cultivos de células de mamíferos, insectos y plantas



Transición de frascos agitadores a un biorreactor de mayor tamaño



Suministro de proteínas



Sistemas piloto de producción a gran escala de hasta 200 litros



Cultivo de semillas para biorreactores a gran escala



Tiene sensores de pH, OD precalibrados y esterilizados.



Gran variedad de tubos y puertos que permiten gran flexibilidad para conectarse a otros biorreactores.

24

Figura 2.4 Biorreactor BIOSTAT® ORB.

2.1.3.2 Biorreactor LAMBDA MINIFOR® Un fermentador más con características diferentes al BIOSTAT es el LAMBA MINIFOR que varía en sus características así como en la funcionalidad y capacidad, el biorreactor se muestra en la figura 2.5 y las características se mencionan a continuación: 

Volúmenes de cultivo desde 35ml hasta 6 litros en un solo equipo.



Radiador patentado IR (Infrarrojo) con reflector parabólico bañado en oro se utiliza para calentar suavemente el medio de cultivo.



Nueva agitación “fish-tail” (cola de pez) para sueve mezclado en cultivos celulares.



Ideal para cultivos continuos, procesos batch y fed-batch.



Esterilizable en autoclave común.

25

Figura 2.5 Biorreactor LAMBDA MINIFOR®.

2.1.3.3 Biorreactor BIO FLO 310® El biorreactor BIO FLO 310 que se muestra en la figura 2.6 tiene las siguientes características:     

El recipiente de vidrio se puede intercambiar en autoclave y existen de 2.5, 5, 7.5 y 14 litros. Medición de Ph, OD por medio de software. Cuenta con sistema de transferencia de oxígeno al medio. Cuenta con 2 puertos USB, y conexiones input-output. Cuenta con sistemas de aireación.

26

Figura 2.6 Biorreactor BIO FLO 310®. Los precios de estos biorreactores oscilan entre los $600,000 pesos y $900,000 pesos dependiendo de las funciones que contenga, los mostrados anteriormente contienen

funciones superiores a los que contienen solamente la medición y

control de los biorreactores comunes. Los mostrados en la sección 2.2.3.1 a la 2.2.3.3 muestran características superiores, como lo es la supervisión de los datos adquiridos en línea, lo cual hace que el valor del biorreactor pueda alcanzar más de $1,200,000 pesos en el precio de ctálogo, aumentando su costo en la transportación hasta México.

2.2 Modos de operación de cultivo Una de las formas prácticas de controlar el desempeño de un bioproceso es manipulando la forma o modo en que se opera el cultivo celular, así como también éstos se deben apoyar en la elaboración de modelos matemáticos. Los modos de operación más comunes son: cultivo lote, cultivo continuo y cultivo alimentado o también llamado cultivo lote alimentado.

27

2.2.1 Cultivo lote Este es el modo de operación más sencillo, y por ende el más frecuentemente empleado en la industria debido a su bajo costo ya que no requiere de dispositivos adicionales para su funcionamiento; sin embargo es el menos productivo ya que las concentraciones celulares y producto alcanzadas son bajas y el tiempo muerto entre lotes puede ser significativo. En un cultivo lote se cargan inicialmente los nutrimentos los cuales se agotarán a medida que el cultivo crece, es decir, la concentración de sustratos decrece con el tiempo mientras que la formación de productos aumenta. Al final de la fermentación, el reactor es vaciado, limpiado y preparado para otro cultivo por lotes con diferente fermentación, de aquí viene el problema de los tiempos muertos entre fermentaciones. Un inconveniente más que se tiene con este modo de operación es, que la química y la reacción de crecimiento no son conocidas con precisión. En la Figura 2.6 se muestra un esquema general del funcionamiento del cultivo por lote, en la Figura 2.6a se muestra el comportamiento cinético típico de la biomasa (𝑋) y sustrato (𝑆), así como el valor del volumen del cultivo (𝑉). En la Figura 2.6b se muestra como el valor del volumen a lo largo de la fermentación permanece constante, esto se debe a que no existen entradas de sustrato o salidas producto, mientras que los valores de biomasa crecen durante un tiempo y decrecen (representando la muerte de las células) después de que se ha terminado el sustrato; de la misma forma se muestran los valores de sustrato, que decrecen debido al consumo de las células a lo largo de la fermentación.

28

(a)

(b)

Figura 2.6 Representación de cultivo lote, esquema general en (a) y cinética de cultivo en (b). Los modelos que rigen este modo de operación por medio de balances de materia son los denotados por las ecuaciones 2.1 para consumo de sustrato y la ecuación 2.2 el cultivo celular, la ecuación 2.3 representa el consumo de sustrato en relación al cultivo celular y la ecuación 2.4 representa la generación de producto. 𝑑𝑠 = − 𝑞𝑠 𝑥 𝑑𝑡 𝑑𝑥 = 𝜇𝑥 𝑑𝑡

(2.1) (2.2)

𝑑𝑠 𝜇 𝑞𝑃 = −( + + 𝑚𝑆 ) 𝑥 𝑑𝑡 𝑌𝑋/𝑆 𝑌𝑃/𝑆

(2.3)

𝑑𝑝 = 𝑞𝑃 𝑥 𝑑𝑡

(2.4)

2.2.2 Cultivo continuo Es uno de los modos de operación más poderosos ya que permite manipular las condiciones de crecimiento y al mismo tiempo mantener un ambiente constante durante todo el transcurso del cultivo. En este modo de cultivo se alimenta constantemente una corriente con medio de cultivo fresco y se cosecha al mismo 29

flujo de alimentación una corriente conteniendo células, medio agotado y productos. La gran utilidad del cultivo continuo radica en que permite operar un cultivo bajo régimen de estado estacionario, es decir aquella situación en que todas las variables permanecen constantes con respecto al tiempo (Doran1995, Ramírez 2004). La figura 2.7 representa de manera esquemática al cultivo continuo y la cinética de crecimiento celular.

(a)

(b)

Figura 2.7 Representación de cultivo continuo. 2.4a. Esquema del biorreactor. 2.4b. Cinética de cultivo continuo.

2.2.3 Cultivos alimentados En este modo de operación se suplementa uno o varios nutrimentos limitantes a lo largo del cultivo en vez de agregarlos todos al inicio. Existen además muchas formas de alimentar tales sustratos, como por ejemplo por pulsos, continuamente de forma constante (cultivo alimentado lineal) o de forma creciente (cultivo alimentado exponencial), con esto se evita, por un lado que se agoten los sustratos esenciales y por otro lado se previenen efectos negativos que resultarían si tales substratos fueran adicionados inicialmente a altas concentraciones. Entre los efectos negativos del cultivo alimentado se encuentran, la inhibición al crecimiento celular por la alta concentración de sustrato o el desvío del metabolismo hacia vías improductivas y que generan subproductos tóxicos. La

30

Figura 2.8 representa de manera esquemática el modo de operación

y el

comportamiento cinético del cultivo alimentado respectivamente; en la Figura 2.4b

(a)

(b)

Figura 2.8. Representación de cultivo lote alimentado. 2.4a. Esquema de biorreactor. 2.4b. Cinética del cultivo lote alimentado. Se puede ver que, mientras exista una entrada de sustrato constante, la cantidad de biomasa permanecerá constante y el volumen irá en aumento con forme dure el tiempo de la fermentación.

La ecuación 2.5 describe el comportamiento del cultivo celular, la ecuación 2.6 representa el consumo de sustrato en relación al cultivo celular y la ecuación 2.7 representa el cambio de volumen en el biorreactor a lo largo de la fermentación por una entrada de flujo de sustrato(Doran1995). 𝑑𝑥 = (𝜇 − 𝐷)𝑥 𝑑𝑡 𝑑𝑠 𝜇𝑥 = − − 𝐷(𝑠 − 𝑠𝑖 ) 𝑑𝑡 𝑌𝑥𝑠 𝑑𝑉 = 𝐹(𝑡) 𝑑𝑡

(2.5) (2.6) (2.7)

Por lo tanto, para generar el mayor crecimiento celular en unafermentación, no basta

con controlar las variables involucradas en dicho crecimiento (PH, 31

temperatura, etc.) sino que también depende del modo de operación del biorreactor (cultivo

lote,

cultivo

continuo

o

cultivo

alimentado), descrito

anteriormente.

2.3. Parámetros de operación Una vez identificados los parámetros a controlar, y los modos de operación de un biorreactor para el crecimiento celular, el trabajo inmediato es proponer la manera de cómo controlar dichas variables, la elección de sensores y actuadores capaces de dar al microorganismo las condiciones adecuadas de crecimiento; también, es necesario que los actuadores sean regidos por leyes de control para lograr la estabilización

de

dichas

variables

con

respecto

a

las

demandas

del

microorganismo. En la tabla 2.3 se muestran los parámetros que más comúnmente se manejan en una fermentación.

32

Tabla 2.3 Variables comúnmente medidas en fermentadores y dispositivos utilizados para su determinación (Ramírez 2004). Parámetro medido en línea Físicos Temperatura Presión Nivel del líquido Peso Flujo (volumétrico, másico) Velocidad Tamaño y velocidad de burbujas Hidrodinámica Potencia Fisicoquímicos pH Oxígeno disuelto

Dióxido disuelto

Capacitancia y conductancia Potencial redox Composición de gases a la salida Biológicos o bioquímicos NADH Y NADPH Densidad celular

Dispositivo/Instrumento Termopar Manómetro Manómetros, sensor de conductividad o capacitancia Balanza, celdas de carga Rotámetro, controladores de flujo másico Tacómetro Sensor de conductividad o fibra óptica, ultrasonido. Anemómetros Torquímetro y tacómetro

Electrodo de vidrio, electrodo de fibra óptica y agente fluorescente Electrodo galvánico/polarográfico, electrodo de fibra óptica y agente fluorescente Electrodo de fibra óptica y agente fluorescente, electrodo de pH y solución de bicarbonatos Monitor de biomasa Electrodo de referencia Espectrometría infrarroja o de masa.

Sensores de fluorescencia Sensores de turbidez, absorbancia, amperométricos o ultrasónicos. Parámetros medidos en sistemas de flujo inyectado Ácidos orgánicos Aminoácidos Carbohidratos Densidad y ciclo celular Actividades enzimáticas Contenido de ácidos nucleicos Equipos conectados a través de sistemas de flujo inyectado Cromatógrafo de gases, cromatógrafo de alta resolución (HPLC), cromatografía de proteínas (FLPC), Cromatografía de iones, espectrómetro de masas, espectrofotómetro, analizadores bioquímicos (basados en biosensores), citómetro de flujo, resonancia magnética nuclear. 33

Un recurso más que se tiene para lograr el mayor crecimiento microbiano, es basarse en los modelos de crecimiento celular establecidos, esto con el fin de conocer la dinámica del crecimiento celular, y por medio de éstos modelos consumir el mínimo de recursos (adición de álcali en el balance del pH, control de la temperatura tomando en cuenta las reacciones bioquímicas que generan temperatura adicional al bioproceso durante la fermentación, etc.) y así lograr un sistema adecuado de crecimiento celular de lo que se desea producir (Morris 1975,Macarullay Goñi1994, Haberman1998, Inghamy col 2000, Najafpour 2007).

2.3.1 pH (potencial de Hidrógeno) Es uno de los parámetros más comúnmente medidos, ya que las células durante la fermentación producen ácidos como producto de su propio metabolismo. Por lo cual para generar el mayor crecimiento celular depende altamente del pH. Para medir el potencial de hidrógeno (pH) es necesario constar con un transductor adecuado que pueda ser capaz de ofrecer una señal eléctrica como un nivel de voltaje a partir de la señal física que queremos medir, como lo es el pH, y uno de estos transductores es el electrodo de vidrio. Los electrodos de vidrio son “instrumentos de lectura directa”, leyéndose el pH de la disolución donde se introduce el electrodo de vidrio en una escala con unidades de pH, la cual se gradúa con valores de pH de referencia, suministrados por disoluciones tampón estándar. Po tanto, la determinación del pH de una disolución con este instrumento no requiere cálculos, pero debe tenerse en cuenta que: a) El instrumento mide actividades del ion 𝐻 + ; b) Debido a las restricciones propias de la composición química de las membranas de vidrio normales, los instrumentos de electrodo de vidrio pueden usarse solamente en una margen de valores de pH de 1 a 10;

34

c) La membrana de vidrio debe mantenerse limpia; cuando se use para determinar el pH de extractos celulares, etc., se debe tener mucho cuidado en no permitir la desecación de una película de proteína en su superficie. Un medidor de pH, mide en realidad una diferencia de potencial entre el llamado electrodo de referencia y un electrodo de vidrio. El electrodo de vidrio consiste en esencia en una membrana selectivamente permeable a los hidrogeniones (Douglas y col. 2001, Creus 2006). En la figura 2.9 se muestra el electrodo de pH.

Figura 2.9. Electrodo de vidrio para medir pH.

2.3.2 Oxígeno Disuelto (OD) Uno de los parámetros importantes a medir a lo largo de una fermentación es el oxígeno disuelto, ya que es un sustrato importante para que se lleve a cabo el metabolismo celular, y a partir de éste se calcule el coeficiente volumétrico global de transferencia de masa 𝑘𝐿 𝑎, y éste a su vez depende de otros factores en el diseño de operación como lo es la velocidad de agitación que modifica el régimen de turbulencia y disminuye el tamaño de burbuja manteniendo así el oxígeno disponible para la célula y su metabolismo; también es importante la temperatura del medio de cultivo ya que dependiendo esta, hará que varíe la cantidad de oxígeno disuelto, así como también lo es la presión del biorreactor a lo largo de la fermentación. Es así como la medición de oxígeno disuelto es muy importante para saber qué cantidad del oxígeno es transferido al medio de acuerdo con la 35

aireación suministrada al biorreactor y las revoluciones que permiten la agitación (Najafpour 2007,Mettler Toledo Operation manual transmitter M300).

Para medir la cantidad de oxígeno disuelto en el medio de se utiliza un electrodo del tipo Clark polarográfico que mide la concentración de oxígeno en agua o soluciones acuáticas, este a su vez contiene un cátodo de platino y un ánodo de cloruro de plata separados por una membrana de plástico permeable llena de gas(Mettler Toledo. Operation manual transmitter M300, Creus 2006).

La Figura 2.10 muestra de manera esquemática al electrodo de oxígeno disuelto, y las conexiones con las que cuenta, mientras que la Figura 2.11 muestra la configuración de las conexiones y la asignación de las mismas, así como la configuración interna del electrodo.

Figura 2.10. Electrodo de Oxígeno disuelto. Instrumento.

36

Figura 2.11. Electrodo de Oxígeno disuelto. Conexiones.

2.3.3 Temperatura La medición de temperatura es un parámetro del crecimiento celular muy importante debido a la relación que tiene con la cantidad de oxígeno disuelto en el biorreactor, así como permitir un funcionamiento adecuado en el mismo debido a las reacciones bioquímicas que se suscitan. El cambio de temperatura dentro de un biorreactor se produce debido al metabolismo celular, ya que mientras este se lleva a cabo se linera energía y esto le da condiciones inadecuadas al microorganismo para realizar su metabolismo, durante el análisis de crecimiento celular y producción de producto generalmente no se considera modelar el balance de energía, es decir el cambio de temperatura ya que si se mantiene la temperatura constante, puede considerarse despreciable. Una razón más de mantener la temperatura constante. 37

En el campo de la instrumentación, las mediciones de temperatura son de lo más común, sin embargo, si no se emplean las técnicas o los equipos adecuados, estas mediciones pueden ser erróneas. El termopar es por mucho el sensor de temperatura más usado en la industria por diferentes razones, podemos mencionar entre otras el amplio intervalo de temperatura de uso, su robustez, la relativa buena exactitud, rápida respuesta a cambios de temperatura, versatilidad de uso y bajo costo. De acuerdo al uso o aplicación en la cual se desea utilizar el termopar, es necesario recurrir a la información y especificaciones que el fabricante ofrece, para seleccionar el más conveniente (Creus 2006).

Una de las características que debe tomarse en cuanta es el rango de temperatura a la cual se trabajará a lo largo de la fermentación, además de que dependiendo el materia de construcción del termopar está la funcionalidad; ya que el material con el que esté construido está en función de la precisión de la medición de la temperatura, ofreciendo más fidelidad al momento de la medición. La tabla 2.4 muestra el tipo de termopar y el tipo de calibre, características de construcción específicas, y las temperaturas máximas que pueden manejar, dependiendo el tipo de termopar seleccionado. Mientras que la figura 2.12 muestra la imagen de un termopar convencional.

38

Tabla 2.4.Características de termopares de acuerdo al tipo. CALIBRES AWG = (mm) TERMOPAR TIPO

8 = 3.25

14 = 1.63

20 = 0.81

24 = 0.51

28 = 0.33

T

***

370° C

260° C

200° C

150° C

J

760° C

590° C

480° C

370° C

320° C

E

860° C

650° C

540° C

430° C

430° C

K

1260° C

1090° C

980° C

870° C

760° C

R

***

***

***

1480° C

***

S

***

***

***

1480 ° C

***

B

***

***

***

1700° C

***

N

1260° C

1090° C

980° C

870° C

760° C

La caracterización del termopar en cualquier experimento es fundamental, ya que aunque el fabricante ofrezca ciertas especificaciones, siempre es mejor constatar cada una de ellas, ya que al momento de fabricar puede que las características lleguen a variar, además de que es una tarea importante para obtener un polinomio de interpolación, el cual será utilizado posteriormente en la programación, indispensable para la visualización de la medición realizada en el hyperterminal

de Windows,

conectado

al

microcontrolador

(Rowe

1995,

Anatychuk1998).

Figura 2.12. Termopar convencional. 39

2.3.4 Agitación del medio de cultivo La mezcla de fluidos es un proceso importante en los procesos de fermentación, por lo general el más crítico, dado que es un parámetro importante en las fermentaciones aerobias, sin embargo también es utilizado en los procesos anaerobios. Los procesos de agitación pueden ser clasificados en dos grupos, el primero es aquel en el que se necesita algún tipo de uniformidad en el medio de cultivo y el segundo es para aquellos en los que se necesite algún tipo de transferencia de masa o reacción química como criterio de operación (Perry y col. 2001). La Tabla 2.5 muestra una clasificación de los procesos de agitación por tipo(VogelyTorado1997). Tabla 2.5. Clasificación de procesos de agitación. Tratamiento físico Suspensión Dispersión Emulsión Mezcla Bombeo

Tipo de aplicación en medio Líquido-sólido Líquido-gas Líquido inmisible Líquido misible Fluido en movimiento

Tratamiento químico Dissolving Absorción Extracción Reacción Transferencia térmica

En este contexto la agitación forma parte de los procesos de transferencia de masa, debido a que el oxígeno que es un sustrato importante para el metabolismo en las fermentaciones anaerobias, debe encontrarse disponible para el microorganismo en todo momento. La agitación permite que el oxígeno se disuelva en el medio de cultivo y así que el tamaño de burbuja sea los suficientemente pequeño para el consumo del microorganismo y permitir que exista el suficiente oxígeno a lo largo de la fermentación. La agitación puede llevarse a cabo de distintas maneras, la más utilizada para medios líquidos es por impulsores, los cuales son implementados con motores. La Figura 2.13 muestra un esquema de la agitación mecánica de un medio de cultivo.

40

Figura 2.13. Agitación del medio de cultivo.

2.3.5 Alimentación de sustrato. La alimentación de sustrato en un biorreactor a lo largo de una fermentación es importante cuando se trabaja en los modos de operación lote alimentado y continuo, las formas más comunes de alimentar un biorreactor según su modo de operación son de forma creciente, de forma constante y por pulsos, y se utilizan según el operador lo necesita; es decir, si lo que se quiere es producir algún metabolito como resultado del metabolismo celular o aumentar la producción de células, es necesario determinar el tipo de alimentación a utilizar Figura 2.14. La forma más común de suministrar sustrato es por medio de bombas peristálticas, dichas bombas simulan el movimiento peristáltico del sistema digestivo y funcionan básicamente con un motor eléctrico, y un cabezal con 2 o 3 rodillos que aprietan la manguera que suministra el sustrato generando así un vacío que empuja el líquido hacía el sentido donde se quiere suministrar el líquido. La Figura 2.15 muestra de manera esquemática la parte interna de una bomba peristáltica (Flinkingery Drew1999).

41

Figura 2.14. Tipos de alimentación en bioproceso.

Figura 2.15. Bomba peristáltica. 2.3.5.1 Alimentación de sustrato de forma creciente. El tipo de alimentación de forma creciente, como su nombre lo indica, es agregar sustrato limitante de manera exponencial para el microorganismo dando a este tipo de cultivo la propiedad de mantener la velocidad específica de crecimiento constante, en el biorreactor. Este cultivo es conocido como cultivo alimentado exponencial.

42

2.3.5.2 Alimentación de sustrato de forma constante. La alimentación de sustrato limitante que se agrega de forma constante es la más comúnmente utilizada, y consiste en suministrar sustrato en una cantidad en 𝑚𝑙/𝑠 que no varía a lo largo del proceso de fermentación. Este cultivo es conocido como cultivo alimentado lineal.

2.4 Simulación de los sistemas de cultivo La simulación de los sistemas de cultivo se basó en los puntos siguientes: 

Ecuaciones de balance de masa para biomasa, sustrato y producto



Modelos de crecimiento, consumo de sustrato y producción



Condiciones de operación.

La Ecuación General de Balance de masa se observa en la ecuación 2.8 que es válida para todos los sistemas de cultivo y dependiendo del tipo (lote, continuo, alimentado) y de la variable (biomasa, sustrato y producto) varían los términos. 𝐴𝑐𝑢𝑚𝑢𝑙𝑎𝑐𝑖ó𝑛 = 𝐸𝑛𝑡𝑟𝑎𝑑𝑎 – 𝑆𝑎𝑙𝑖𝑑𝑎 + 𝐺𝑒𝑛𝑒𝑟𝑎𝑐𝑖ó𝑛 – 𝐶𝑜𝑛𝑠𝑢𝑚𝑜

(2.8)

Esta ecuación se debe plantear para cada variable, es decir: biomasa, sustrato y producto. Una extensa revisión bibliográfica permitió desarrollar las ecuaciones para cada tipo de cultivo y revisar los principios de modelado (Pirt 1975, Levenspiel 1985, Atkinson 1986, Bailey 1986, Lee 1992, Geankoplis 1998, Jakymec y col. 2001, Najafpour 2007) y obtener la solución de las ecuaciones diferenciales para realizar la simulación (Cooker 2001, Zill 2002, Kreyszig 2003, Chung 2004, Yang y col. 2005).

43

2.4.1 Cultivo lote 2.4.1.1 Balance de biomasa Es un sistema cerrado como el cultivo lote, el balance para biomasa es: 𝐴𝑐𝑢𝑚𝑢𝑙𝑎𝑐𝑖ó𝑛 = 𝐺𝑒𝑛𝑒𝑟𝑎𝑐𝑖ó𝑛 𝑑𝑥 = 𝜇𝑥 𝑑𝑡

(2.9)

Utilizando el modelo de Monod para crecimiento 𝜇𝑚𝑎𝑥 𝑠 𝐾𝑠 + 𝑠 𝑥 − 𝑥0 𝑌𝑥𝑠 = 𝑠0 − 𝑠 𝜇=

(2.10) (2.11)

𝑑𝑥 𝜇𝑚𝑎𝑥 (𝑌𝑥𝑠 𝑠0 + 𝑥0 − 𝑥) = 𝑑𝑡 𝐾𝑠 𝑌𝑥𝑠 + 𝑌𝑥𝑠 𝑠0 + 𝑥0 − 𝑥

(2.12)

La ecuación diferencial se resuelve analíticamente para la obtener la evolución de la biomasa en función del tiempo. También se puede utilizar el modelo logístico para crecimiento quedando la ecuación la ecuación de la siguiente forma: 𝑑𝑥 𝑥 = 𝜇𝑚𝑎𝑥 𝑥 (1 − ) 𝑑𝑡 𝑥𝑚𝑎𝑥

(2.13)

Esta ecuación diferencial también se resuelve analíticamente para la obtener la evolución de la biomasa en función del tiempo. 2.4.1.2 Balance de Sustrato Es un sistema cerrado como el cultivo lote, el balance para sustrato es: 𝐴𝑐𝑢𝑚𝑢𝑙𝑎𝑐𝑖ó𝑛 = − 𝐶𝑜𝑛𝑠𝑢𝑚𝑜 𝑑𝑠 = −𝑞𝑠 𝑥 𝑑𝑡

(2.14) 44

Utilizando la ecuación de Aborhey y Williamson que incluye el modelo de crecimiento logístico y de producción de Luedekin-Piret, la ecuación diferencial queda de la siguiente forma: 𝑑𝑠 1 𝑑𝑥 1 𝑑𝑝 =− − – 𝑚𝑥 𝑑𝑡 𝑌𝑥𝑠 𝑑𝑡 𝑌𝑝𝑠 𝑑𝑡

(2.15)

𝑑𝑠 1 𝑑𝑥 1 𝑑𝑥 =− − (𝛼 + 𝛽𝑥) − 𝑚𝑥 𝑑𝑡 𝑌𝑥𝑠 𝑑𝑡 𝑌𝑝𝑠 𝑑𝑡

(2.16)

𝑑𝑠 1 𝛼 𝑑𝑥 𝛽 = −( + ) −( + 𝑚) 𝑥 𝑑𝑡 𝑌𝑥𝑠 𝑌𝑝𝑠 𝑑𝑡 𝑌𝑝𝑠

(2.17)

Utilizando el modelo logístico para crecimiento desarrollado en la parte de biomasa se resuelve la ecuación diferencial de forma analítica. 2.4.1.3 Balance de Producto Es un sistema cerrado como el cultivo lote, el balance para producto es: 𝐴𝑐𝑢𝑚𝑢𝑙𝑎𝑐𝑖ó𝑛 = 𝐺𝑒𝑛𝑒𝑟𝑎𝑐𝑖ó𝑛 𝑑𝑝 = 𝑞𝑝 𝑥 𝑑𝑡

(2.18)

Utilizando el modelo de producción parcialmente asociado crecimiento de Luedeking-Piret. 𝑑𝑝 𝑑𝑥 = 𝛽𝑥 + 𝛼 𝑑𝑡 𝑑𝑡

(2.19)

Utilizando el modelo logístico para crecimiento desarrollado en la parte de biomasa se resuelve la ecuación diferencial de forma analítica. También utilizó el modelo logístico para producción, dado por la ecuación: 𝑑𝑝 𝑝 = 𝑝0 (1 − )𝑝 𝑑𝑡 𝑝𝑚𝑎𝑥

(2.20)

45

2.4.2 Cultivo continuo 2.4.2.1 Balance de Biomasa Es un sistema abierto como el cultivo continuo, el balance para biomasa es: 𝐴𝑐𝑢𝑚𝑢𝑙𝑎𝑐𝑖ó𝑛 = 𝐺𝑒𝑛𝑒𝑟𝑎𝑐𝑖ó𝑛 − 𝑆𝑎𝑙𝑖𝑑𝑎 𝑑𝑥 = 𝑥(𝜇 − 𝐷) 𝑑𝑡

(2.21)

En estado de equilibrio dinámico la acumulación es 0 𝑑𝑥 =0 𝑑𝑡

(2.22)

Por lo tanto: 𝜇 = 𝐷 A 𝐷 se le llama velocidad de dilución, manipulando su valor se puede controlar la velocidad

específica

de

crecimiento,

,

es

decir

el

metabolismo

del

microorganismo. 𝐷se calcula con los parámetros de operación 𝐹 y 𝑉, 𝐹 es el flujo de entrada (dado por la bomba peristáltica) y 𝑉 es el volumen de operación del reactor. Dado que el volumen del reactor permanece constante, se puede manipular 𝐹 para variar 𝐷 mediante la fórmula siguiente: 𝐷=

𝐹 𝑉

(2.23)

2.4.2.2 Balance de Sustrato Es un sistema abierto como el cultivo continuo, el balance para sustrato es: 𝐴𝑐𝑢𝑚𝑢𝑙𝑎𝑐𝑖ó𝑛 = 𝐸𝑛𝑡𝑟𝑎𝑑𝑎 − 𝑆𝑎𝑙𝑖𝑑𝑎 − 𝐶𝑜𝑛𝑠𝑢𝑚𝑜 𝑑𝑠 = 𝐷𝑠𝐸 − 𝐷𝑠 − 𝑞𝑠 𝑥 𝑑𝑡 𝑑𝑠 = 𝐷(𝑠𝐸 − 𝑠) − 𝑞𝑠 𝑥 𝑑𝑡

(2.24) (2.25)

46

𝑑𝑠 𝜇𝑥 = 𝐷(𝑠𝐸 − 𝑠) − 𝑑𝑡 𝑌𝑥𝑠

(2.26)

En estado de equilibrio dinámico la acumulación es 0: 𝑑𝑠 =0 𝑑𝑡

(2.27)

𝑥 = 𝑌𝑥𝑠 (𝑠𝐸 − 𝑠)

(2.28)

Para el cálculo de s, dada una , se utilizó el modelo de Monod, despejando s y sustituyendo . Conocida la s se puede calcular x. 𝜇𝐾𝑠 𝜇𝑚𝑎𝑥 − 𝜇

𝑠=

(2.29)

2.4.2.3 Balance de Producto Es un sistema abierto como el cultivo continuo, el balance para producto es: 𝐴𝑐𝑢𝑚𝑢𝑙𝑎𝑐𝑖ó𝑛 = 𝐺𝑒𝑛𝑒𝑟𝑎𝑐𝑖ó𝑛 − 𝑆𝑎𝑙𝑖𝑑𝑎 𝑑𝑝 = 𝑞𝑝 𝑥 − 𝐷𝑝 𝑑𝑡

(2.30)

En estado de equilibrio dinámico la acumulación es 0: 𝑑𝑝 𝑑𝑡

=0

𝑝=

𝑞𝑝 𝑥 𝐷

(2.31) (2.32)

Para el cálculo de 𝑞𝑝 se usó el Modelo de la triple constante de Luedeking-Piret 𝑞𝑝 = 𝛼𝜇 𝑛 + 𝛽

(2.33)

47

2.4.3 Cultivos alimentados o cultivos lote alimentado Los cultivos lote alimentado son sistemas semicerrados, es decir, pueden existir tanto entrada como salidas del biorreactor existen 3 tipos de cultivos de a cuerdo a su modo de alimentación 

Cultivo alimentado exponencial. Caracterizado por el incremento del flujo en forma exponencial, bajo ciertas condiciones es posible mantener la velocidad específica decrecimiento constante, dado que el volumen se incrementa también de manera exponencial. Presenta

las ventajas del

cultivo lote por su bajo costo en implementarlo y del cultivo continuo por su alta productividad. 

Cultivo alimentado lineal. Se caracteriza por mantener un flujo de entrada de sustrato constante, y el incremento de volumen en el biorreactor aumenta de forma lineal.



Cultivo alimentado por pulsos. Se adiciona

el sustrato de manera

discreta, y esta operación se realiza cuando por ejemplo se observa una disminución en la medición del oxígeno disuelto. 2.4.3.1 Cultivo alimentado exponencial 2.4.3.1.1 Balance de Biomasa Es un sistema semicerrado como el cultivo lote alimentado exponencial, el balance para biomasa es: 𝐴𝑐𝑢𝑚𝑢𝑙𝑎𝑐𝑖ó𝑛 = 𝐺𝑒𝑛𝑒𝑟𝑎𝑐𝑖ó𝑛 En este cultivo tanto la biomasa como el volumen varían por lo que el crecimiento se expresa en dos diferenciales, el balance volumétrico queda expresado como:

𝑑(𝑉𝑥) 𝑑𝑉 𝑑𝑥 = 𝑥 ( ) + 𝑉 ( ) = 𝜇𝑥𝑉 𝑑𝑡 𝑑𝑡 𝑑𝑡 𝑑𝑉 =𝐹 𝑑𝑡

(2.34) (2.35) 48

𝑑𝑥 𝑑𝑉 = 𝜇𝑥𝑉 − 𝑥 ( ) 𝑑𝑡 𝑑𝑡 𝑑𝑥 𝑉 = 𝜇𝑥𝑉 − 𝑥𝐹 𝑑𝑡 𝑑𝑥 𝐹 = 𝑥 (𝜇 − ) 𝑑𝑡 𝑉 𝑉

El balance global se formula para la biomasa total, 𝑋 = 𝑥𝑉. 𝑑𝑋 = 𝜇𝑋 𝑑𝑡

(2.36) (2.37) (3.38)

(2.39)

Resolviendo la diferencial: 𝑋 = 𝑋0 𝑒 𝜇𝑡

(2.40)

𝑥𝑉 = 𝑥0 𝑉0 𝑒 𝜇𝑡

(2.41)

2.4.3.1.2 Balance de Sustrato Es un sistema semicerrado como el cultivo lote alimentado exponencial, el balance para sustrato es: 𝐴𝑐𝑢𝑚𝑢𝑙𝑎𝑐𝑖ó𝑛 = 𝐸𝑛𝑡𝑟𝑎𝑑𝑎 − 𝐶𝑜𝑛𝑠𝑢𝑚𝑜 En este cultivo tanto la biomasa como el volumen varían por lo que el crecimiento se expresa en dos diferenciales. 𝑑(𝑉𝑠) 𝑑𝑉 𝑑𝑠 𝜇𝑥𝑉 = 𝑠 ( ) + 𝑉 ( ) = 𝐹𝑠𝐸 − 𝑑𝑡 𝑑𝑡 𝑑𝑡 𝑌𝑥𝑠 𝑑(𝑉𝑠) 𝑑𝑉 𝑑𝑠 𝜇𝑥𝑉 = 𝑠 ( ) + 𝑉 ( ) = 𝐹𝑠𝐸 − 𝑑𝑡 𝑑𝑡 𝑑𝑡 𝑌𝑥𝑠

(2.42) (2.43)

𝑑𝑠 𝜇𝑥𝑉 = 𝐹𝑠𝐸 − − 𝐹𝑠 𝑑𝑡 𝑌𝑥𝑠

(2.44)

𝑑𝑠 𝐹 𝜇𝑥𝑉 𝐹 = 𝑠𝐸 − − 𝑠 𝑑𝑡 𝑉 𝑌𝑥𝑠 𝑉 𝑉

(2.45)

𝑑𝑠 𝐹 𝜇𝑥 = (𝑠𝐸 − 𝑠) − 𝑑𝑡 𝑉 𝑌𝑥𝑠

(2.46)

𝑉

49

𝑑𝑉 𝜇𝑥0 𝑉0 =𝐹= 𝑒 𝜇𝑡 𝑑𝑡 𝑌𝑥𝑠 (𝑠𝐸 − 𝑠)

(2.47)

2.4.3.1.3 Balance de Producto Es un sistema semicerrado como el cultivo lote alimentado exponencial, el balance para sustrato es: 𝐴𝑐𝑢𝑚𝑢𝑙𝑎𝑐𝑖ó𝑛 = 𝐺𝑒𝑛𝑒𝑟𝑎𝑐𝑖ó𝑛 En este cultivo tanto la biomasa como el volumen varían por lo que el crecimiento se expresa en dos diferenciales. 𝑑(𝑉𝑝) 𝑑𝑉 𝑑𝑝 = 𝑝 ( ) + 𝑉 ( ) = 𝜇𝑥𝑉𝑌𝑝𝑥 𝑑𝑡 𝑑𝑡 𝑑𝑡 𝑑𝑝 𝑉 = 𝜇𝑥𝑉𝑌𝑝𝑥 − 𝐹𝑝 𝑑𝑡 𝑑𝑝 𝐹 = 𝜇𝑥𝑌𝑝𝑥 − 𝑝 𝑑𝑡 𝑉

(2.48) (2.49) (2.50)

El balance global se formula para el producto total, P =pV. 𝑑𝑃 = 𝑞𝑝 𝑥0 𝑉0 𝑒 𝜇𝑡 𝑑𝑡

(2.51)

2.4.3.2 Cultivo alimentado lineal En este tipo de cultivo el Flujo, F, es contante y el volumen varía de acuerdo a la ecuación: 𝑑𝑉 (2.52) =𝐹 𝑑𝑡 𝑉 = 𝑉0 + 𝐹𝑡

(2.53)

Se establecen los balances de manera similar al cultivo exponencial: 

Balance de Biomasa: Acumulación = Generación



Balance de Sustrato: Acumulación = Entrada – Consumo



Balance de Producto: Acumulación = Generación

Las ecuaciones diferenciales para cada balance son: 50

𝑑𝑥 𝐹 = 𝑥 (𝜇 − ) 𝑑𝑡 𝑉 𝑑𝑠 𝐹 = (𝑠 − 𝑠) − 𝑞𝑠 𝑥 𝑑𝑡 𝑉 𝐸 𝑑𝑝 𝐹 = 𝑞𝑝 𝑥 − 𝑝 𝑑𝑡 𝑉

(2.54) (2.55) (2.56)

Considerando los modelos de, consumo de sustrato y formación de producto: 𝜇𝑚𝑎𝑥 𝑠 𝜇= (2.57) 𝐾𝑠 + 𝑠 𝑞𝑝 𝜇 𝑞𝑠 = + 𝑚 + (2.58) 𝑌𝑔 𝑌𝑝𝑠 𝑞𝑝 = 𝛼𝜇 𝑛 + 𝛽

(2.59)

La variación de x, s, p en función del tiempo, se obtienen resolviendo el sistema de ecuaciones diferenciales mediante el método numérico de Runge-Kutta de cuarto orden (Zill 2002). 𝐾1 + 2𝐾2 +2𝐾3 +𝐾4 6 𝐿1 + 2𝐿2 +2𝐿3 +𝐿4 (𝑠)𝑛 = (𝑠)𝑛−1 + 6 𝑀1 + 2𝑀2 +2𝑀3 +𝑀4 (𝑝)𝑛 = (𝑝)𝑛−1 + 6 (𝑥)𝑛 = (𝑥)𝑛−1 +

(2.60) (2.61) (2.62)

Las constantes K, L y M son evaluadas al tiempo 𝑡𝑛 = 𝑡𝑛 − 1 + ℎ. El valor de h es un intervalo de tiempo arbitrario.

51

Capítulo 3 Implementación del sistema 3.1 Biorreactor La figura 3.1 muestra el proceso de fermentación que actualmente se lleva a cabo en los biorreactores con los que se cuenta en el Departamento de Biotecnología de la UPP. En estos biorreactores todos los parámetros medidos, como el pH, temperatura, alimentación de sustrato agitación de medio de cultivo son registrados de manera manual y no existe ningún programa de adquisición de datos. Cabe mencionar que en el Departamento de Biotecnología contamos con varios biorreactores de diferentes capacidades que vas desde 0.5l a 900 l que requieren un sistema de adquisición automatizado, como el que aquí se propone.

52

Figura 3.1. Procesos e fermentación en biorreactor escala laboratorio. La Figura 3.2 muestra al biorreactor de 4 litros en vidrio con medidas estándar con sensores de oxígeno disuelto y pH, así como las bombas peristálticas para adición de sustrato y sustancias ácidas y álcali.

Figura 3.2. Biorreactor de 4 litros de la UP-Puebla.

La tabla 3.1 muestra las medidas estándar de un reactor de 4 litros (que se encuentra en la Universidad Politécnica de Puebla), y la relación entre todas las medidas que tiene, como lo es la altura el diámetro, la medida de las paletas, etc. Cuenta con 2 impulsores tipo Rushton de 6 paletas planas.

53

Tabla 3.1Relaciones estándar del reactor de 4 litros utilizado. Relación

Nomenclatura

Valor

Altura del líquido en el reactor/Altura del reactor

HL/Ht

~0.7-0.8

Altura del reactor/Diámetro del reactor

Ht/Dt

2

Diámetro del impulsor/Diámetro del reactor

Da/Dt

1/3

Diámetro del bafle/Diámetro del reactor

Db/Dt

0.1

Altura de la paleta del impulsor/Diámetro del impulsor

W/Da

0.2

Ancho de la paleta del impulsor/Diámetro del impulsor

L/Da

0.25

Distancia media de la paleta del impulsor al difusor/Diámetro del impulsor

E/W

1

3.2 Control para los cultivos 3.2.1 Cultivo alimentado exponencial. El problema consiste en suministrar una entrada de sustrato de forma creciente por medio de una bomba peristáltica que funciona con un motor de corriente directa, esto es, adicionar al biorreactor un flujo de entrada de sustrato de manera creciente. Para resolver este problema es necesario generar una estrategia de control que realice la tarea de aumentar las revoluciones del motor de corriente directa de la bomba peristáltica de forma exponencial. Además, hay que tener en cuenta el diámetro y tipo de material de la manguera con el que se realizará la alimentación (Astrom y Hagglund 2000). Para análisis de simulación podemos representar las ecuaciones 2.5, 2.6 y 2.7 en espacio de estados y utilizando el modelo de Monod de la ecuación 3.3(Nielsen y col. 1994, Inghamy col. 2000, Harms y col. 2002) se obtienen las ecuaciones 3.56, 3.57 y 3.258.

54

𝜇=

𝜇𝑚𝑎𝑥 𝑠 𝑘𝑠 + 𝑠

𝑥̇ 1 =

𝜇𝑥1 𝑥2 𝑥1 − 𝑢 𝑘𝑠 + 𝑥2 𝑥3 1

𝑥̇ 2 = −

1 𝜇𝑥1 𝑥2 𝑥2 − 𝑠𝑖 − 𝑢1 𝑌𝑥𝑠 𝑘𝑠 + 𝑥2 𝑥3

𝑥̇ 3 = 𝐹(𝑡) = 𝑢1

(3.1)

(3.2)

(3.3) (3.4)

donde𝑥1 , 𝑥2 y 𝑥3 son biomasa, sustrato y volumen respectivamente; y 𝑢 es el flujo de entrada de sustrato. Dado que la entrada 𝑢 puede ser de flujo constante y de flujo en incremento creciente es necesario relacionarla con la velocidad específica de crecimiento 𝜇, la concentración celular inicial 𝑥0 , el volumen de operación inicial en el biorreactor 𝑣0 , el rendimiento de biomasa sobre sustrato y la concentración de sustrato de entrada 𝑠𝑖 , mostrado en la ecuación 3.59. 𝐹(𝑡) =

𝜇𝑥0 exp(𝜇𝑡) 𝑌𝑥𝑠 𝑠𝑖

(3.5)

Esta deducción es posible si se considera que la fermentación se realiza inicialmente en cultivo lote hasta alcanzar una concentración celular alta, y posteriormente comenzar una fermentación en cultivo lote alimentado con entrada creciente, considerando una velocidad específica de crecimiento constante. Una de las maneras de controlar el flujo de una bomba peristáltica es controlar la velocidad del motor dado que el motor a utilizar es de corriente directa, la estrategia de control que se utiliza convencionalmente es un PID (Morris 1975). El diagrama de bloques que ilustra esta estrategia de control se encuentra en la figura 3.3 Se observa la estructura general de un controlador PID aplicado a un motor eléctrico.

55

PID

e

Referencia

Proceso

y

u Medición

Figura 3.3. Estructura del controlador PID y la planta a controlar. Mientras que la figura 3.4 muestra a la planta o biorreactor representada por ecuaciones de estado a la cual se le agrega un flujo de sustrato de entrada de manera creciente, dando como resultado a la salida del sistema un crecimiento de biomasa y un aumento en el volumen del biorreactor. u

Yref Control de Flujo

𝑑𝑥 = (𝜇𝐷)𝑥 𝑑𝑡

X

𝑑𝑉 = 𝐹(𝑡) 𝑑𝑡

V

Figura 3.4. Esquema del sistema de control como entrada al biorreactor de una bomba peristáltica.

3.2.2 Alimentación lineal Dado que la alimentación de un cultivo alimentado linealmente requiere una alimentación de sustrato constante, es necesario mantener la velocidad del motor que tiene la bomba a una velocidad constante, para lo cual se realizó una simulación con un control de velocidad PID al motor por medio de simulink. El diagrama se muestra en la figura 3.5. La simulación consistió en la sintonización del controlador por método de ZieglerNichols(Kuo2002), o método de respuesta en frecuencia.La dificultad de controlar los cultivos alimentados radica en las múltiples variables que se deben considerar que van desde la velocidad de la bomba peristáltica, el cabezal, el tipo de manguera, el material de la manguera, el microorganismo utilizado (parámetros

56

cinéticos), el volumen inicial y final de operación y la velocidad específica de crecimiento deseada.

Figura 3.5. Diagrama a bloques del controlador PID del motor de corriente directa.

3.2.3 Cultivo continuo Un cultivo continuo descrito en la sección 2.2.3 describe que existe tanto entrada de sustrato y salida de medio de cultivo, por lo cual debe considerarse en primer lugar que la entrada de sustrato al biorreactor es constante, así como también lo es la salida de medio de cultivo. Dado que la bomba que alimenta de sustrato al biorreactor funciona con un motor de corriente directa, así como también la bomba que sustrae medio de cultivo del mismo, es necesario controlar las revoluciones del motor para controlar el flujo de entrada y salida del biorreactor. Lo más conveniente es utilizar una estrategia de control PID; la simulación del control de las revoluciones del motor a una entrada constante de voltaje es la misma que para el modo de operación cultivo lote alimentado linealmente descrito en la sección 3.3.1.2.

3.3 Agitación de medio de cultivo Como se mencionó en la sección 2.3.4 la agitación en el medio de cultivo favorece los fenómenos de transferencia de masa y es así como es considerado de gran importancia en una fermentación, la intención de aumentar las revoluciones en el medio de cultivo es para aumentar el índice volumétrico de transferencia de masa, 57

que es un parámetro importante para conocer la cantidad de oxígeno que se transfiere al medio de cultivo y está disponible a manera de sustrato para el metabolismo celular del microorganismo. La agitación del medio de cultivo se lleva a cabo por un motor de corriente directa con reducción de velocidad que va de 0 a 1800 rpm ,el cual se controla de manera conveniente por medio de un controlador PID. Y la simulación de se muestra en la figura 3.6.

Figura 3.6. Diagrama a bloques del controlador PID del motor de corriente directa.

3.4 Medición de pH. Se cuenta con un electrodo de pH de vidrio, marca Conductronic, las lecturas de voltaje con sustancias buffer de pH conocido son en el orden de milivolts, pero amplificados posteriormente a la salida del electrodo por un amplificador TL081. La Tabla 3.2 muestra las mediciones con las sustancias buffer. Tabla 3.2 Voltajes obtenidos con sustancias buffer y amplificadas. pH Buffer 4 7 10

Voltaje con amplificación (V) 4.32 0.33 -3.55

Con los datos obtenidos se pretende conocer que voltajes serán medidos con cualquier sustancia de pH desconocido, una buena aproximación a partir de la 58

información obtenida mostrada en la tabla 3.2 es realizar una interpolación de Lagrange, y de éste modo obtener un polinomio que represente la relación voltajepH que es necesaria para ofrecer una medición durante el proceso de fermentación para el usuario. El polinomio que se obtuvo a partir de las tres sustancias base es el siguiente. 𝑃(𝑥) =

191 2 1943 𝑥 − 𝑥+7 10000 2500

(3.60)

3.5 Medición del oxígeno disuelto En los procesos aerobios, el oxígeno es un sustrato limitante, ya que sus características fisicoquímicas limitan su solubilidad en líquidos, por lo que el transporte de oxígeno del exterior al reactor es necesario para el crecimiento ideal de microorganismos. El transporte de oxígeno está directamente relacionado con las características físicas de cada biorreactor como: geometría, diseño, número de agitadores, tipo de dispersor de aire, etc. Se utilizó un electrodo de oxígeno disuelto marca Mettler Toledo de 30 cm de largo y media pulgada de diámetro en acero inoxidable, Figura 3.7. Se realizó la técnica dinámica para poder caracterizar el electrodo y el reactor, medición del coeficiente de transferencia de oxígeno (𝑘𝐿𝑎). Para la determinación de la transferencia de oxígeno en biorreactores es necesario calcular el coeficiente volumétrico de transferencia de oxígeno (𝑘𝐿𝑎) como lo describe (García-Ochoa y Gómez 2009) mediante el método de eliminación de oxígeno burbujeando nitrógeno en agua destilada, el medidor de oxígeno disuelto fue calibrado a 0% con una solución saturada de nitrógeno y a 100% con otra solución saturada con oxígeno al bombear aire. Todas las determinaciones fueron determinadas a una temperatura de 20°C, con condiciones de operación fijadas como la velocidad de agitación (350 y 700 rpm), aireación (1.33 y 2.66 vvm). Suponiendo que el sistema está bien agitado, el 𝑘𝐿𝑎 fue determinado midiendo el porcentaje de oxígeno disuelto medido por la sonda cada 15 segundos. La técnica de eliminación de oxígeno 59

consiste en la desorción de este por burbujeando nitrógeno, entonces la concentración de O2 está ahora en función del tiempo.

Figura 3.7 Experimento de mediciones de porcentaje de saturación de oxígeno.

3.6 Interfaz de usuario La interfaz del usuario es la relación que debe existir entre la máquina y el humano mediante una relación de entradas y salidas que deben existir de forma física, esto logra dar comunicación entre las dos partes involucradas, la parte informática y la parte humana, dando con ello el mejor desempeño en cuanto a comunicación se trata. La figura 3.8 muestra de manera general un diagrama de la interfaz con todo el sistema, es decir,

la parte física del sistema (fermentador, sensores,

actuadores, parámetros de operación, etc.) la parte informática (la programación necesaria de los componentes físicos, como actuadores, sensores, visualización, gráficos, etc.) y la parte de visualización (la parte visual para el humano, la manera en la cual ingresa parámetros de operación, establece parámetros de referencia como en el caso de la temperatura, además de poder monitorearlos de manera visual mediante gráficas o tablas de datos).

60

Figura 3.8. Diagrama general de interfaz de usuario. La interfaz fue programada en un microcontrolador de 32 bits el cual es un MBED NXP LPC11U24, el cual se programa en lenguaje C, especializado para microcontroladores, basándose en la arquitectura de este, la gran ventaja de este dispositivo es la gran cantidad de librerías con las que se cuenta, las cuales reducen la cantidad de código dentro de las instrucciones y comandos de programación. El MBED NXP LPC11U24 contiene puertos especializados para un mejor uso en cuanto a tratamiento de señales. dando la facilidad de conectar a programas de visualización como lo es LabVIEW, que en este caso funciona como visualizador de las variables manejadas en el proceso de fermentación, además de contar con un ADC interno de 16 bits, lo cual reduce la programación requerida para manejar señales analógicas.La instrumentación en Labview es virtual y para lalectura de los datos semuestra elsiguiente diagrama, el cual se puedeencontrar en la página del mbed.org, para que los usuarios que utilizan el microcontroladorMBED NXP LPC11U24 puedan utilizarlos.

61

Figura 3.9 Diagrama de interfaz en Labview y mbed(http://mbed.org/cookbook/Homepage.).

3.7 Puesta en marcha del sistema integrado Se llevó a cabo una fermentación con Saccharomyces cerevisiae para probar el sistema integrado.

2% de glucosa 0.1% de sulfato deamonio 0.1% de fosfato de potasio 0.05% de Sulfato de magnesio heptahidratado Para la fermentación la glucosa se sustituyo con sacarosa 62

se inicio con un volumen de 1.5 L y su pH inicio en 6 En el cultivo alimentado la alimentación fue de 150 g/L

Capítulo 4 Resultados y discusiones 4.1 Medición de pH. La figura 4.1 muestra la curva de interpolación voltaje-pH que fue implementada en un microcontrolador de 32 bits, de acuerdo al polinomio encontrado en la Ecuación 3.60. La figura 4.2 muestra al electrodo de pH utilizado. 63

Figura 4.1 Relación Voltaje-pH El trabajo posterior en el análisis de cada una de las secciones de implementación, es la instrumentación, ya sea física o virtual, dependiendo la complejidad y los costos. Como ya se había comentado, obtener los datos de forma automática es importante. Dentro de la etapa de instrumentación, hay dos formas de obtenerlas, de forma gráfica y en una tabla de datos, la figura 4.3, muestra la medición del pH de forma gráfica, ya que esto es más sencillo de visualizar para el operador, y así verificar si dicho parámetro de operación está dentro del rango usual de operación. También, es necesario obtener los datos en una tabla, para su posterior análisis, ya que es unos de los trabajos del operador del biorreactor, Esta tabla se obtiene en una hoja de cálculo de Excel, mostrado en la figura 4.4.

64

Figura 4.2 electrodo de pH.

Figura 4.3. Gráfica de pH, datos tomados en línea.

65

Figura 4.4. Datos obtenido y exportados en hoja de cálculo.

4.2 Medición del oxígeno disuelto En la Figura 4.5 se muestras las curvas características para la determinación del coeficiente de transferencia de oxígeno que permite observar el comportamiento de este a diferentes agitaciones.

66

60

% de saturación

50 N=6 (2)

40

N=8 (2)

30

N=8 (1)

20

N=6 (1)

10

Revoluciones (6)

0 0

200

400

600

800

Revoluciones (8)

Tiempo (s)

Figura 4.5.Mediciones de porcentaje de saturación de oxígeno, aireación 1vvm.

4.3 Flujo volumétrico Utilizando bomba peristáltica y manguera con diámetro conocido. Se realizó una simulación del flujo volumétrico a partir del control de velocidad de un motor de corriente directa. El cual se muestra en la figura 4.6 y la caracterización de la bomba peristáltica con la manguera que se indica en la tabla 4.2.

Figura 4.6. Control de velocidad dando un flujo constante como alimentación de sustrato 67

Tabla 4.2.Caracterización de la bomba peristáltica. Voltaje MangueraMasterflex®deneopreno Diámetro (V) (calibre) interior (mm) 3.6 2.5 1.7

25 25 14

4.5 4.5 5

Diámetro exterior (mm) 8 8 1.5

Flujo (l/h) 1.612 0.502 0.021

La implementación física de la tarjeta que suministra potencia a los motores de corriente continua se muestra en la figura 4.7 y en ella se tiene una parte de potencia y una parte de la señal de control que sirve para que las señales estén desacopladas y así se puedan controlar la velocidad que es lo que se requiere, ya que el flujo volumétrico está en función de la velocidad. Para controlar la velocidad del motor se utiliza una ley de control PI, ya que es la de uso común, y más funcional. Y para ello se utiliza un microcontrolador de 32 bits mbed.

Figura 4.7. Implementación de tarjeta de potencia.

68

4.4 Medición de temperatura Las mediciones adquiridas en un ensayo con agua se muestran en la tabla 4.3. Y la figura 4.8 muestra una gráfica de temperatura en grados centígrados contra voltaje en milivolts. Estas mediciones fueron realizadas con un termopar tipo K.

Tabla 4.3. Características de termopares de acuerdo al tipo. T(ºC) 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 V (mV) 0.13 0.36 0.6 0.87 1.15 1.32 1.58 1.85 2.32 2.4 2.61 2.39

Figura 4.8. Termopar convencional. El circuito integrado MAX6675 de Maxim/Dallas Semiconductor es un convertidor analógico-digital para termopares tipo K. Dentro de este pequeño circuito se encuentra la electrónica necesaria para amplificar, compensar y convertir a digital el voltaje generado por el termopar, lo que hace muy sencilla la tarea de conectar un termopar a un microcontrolador. La figura 4.9 muestra las conexiones al microcontrolador MBED.

69

Figura 4.9. Circuito de conexiones del MAX6675 al microcontrolador MBED.

4.5. Agitación del medio de cultivo. La simulación del medio de cultivo está en función de la velocidad de un motor de corriente continua, y así aumentar la aireación en el medio de cultivo; la cantidad de oxígeno disuelto se puede ver en la medición de oxígeno disuelto en medio. La figura 4.10 muestra la simulación de la velocidad del motor utilizando la ley de control PID, mientras que la figura 4.11 muestra la implementación de la tarjeta de potencia.

70

Figura 4.10. Velocidad de agitación en medio de cultivo.

Figura 4.11. Implementación de tarjeta de potencia.

4.5 Panorama general del equipo La figura 4.12 muestra un panorama general

del biorreactor junto con la

adquisición de datos, mostrando un poco de la instrumentación virtual. Es importante mantener la visualización de alguno de los parámetros operados en la fermentación, la importancia del manejo de los parámetros de operación radica en

71

la visualización inmediata, y de esta manera actuar rápidamente y evitar desviaciones en el metabolismo celular. Los datos pueden almacenarse a lo largo de la simulación para ser analizados posteriormente, aunadoa que se ahorran horas de mano de obra y la reducción de errores de medición, dando a los resultados una mayor fiabilidad, además de que se evita la contaminación del medio de cultivo entre la toma de muestras

Figura 4.12 Panorama general de una fermentación.

4.6 Simulación de los cultivos Para la simulación de los cultivos se tomaron los parámetros cinéticos obtenidos de Ramírez Castillo y Uribelarrea(2006)los cuales utilizaron la bacteria productora de exopolisacáridoKlebsiellapneumoniaesp. pneumoniae. 72

4.6.1 Cultivo Lote La figura 4.13 muestra la dinámica en el modo de operación en el cultivo lote, mostrando en éste, el crecimiento de biomasa, la producción de producto y el consumo de sustrato, esto se logra con las condiciones de operación de la tabla 4.5 y los parámetros de simulación de la tabla 4.4.En la figura 4.13 también se puede ver la simulación con los modelos de Monod y Logístico; endicha figura se observa que el modelo logístico es el que mejor se acerca a los datos experimentales, tanto en crecimiento como cuando se utiliza en los modelos para producto y consumo de sustrato. Hay que mencionar que en este modo de operación sólo es necesario el control de la temperatura, el del pH y el seguimiento de la medición del oxígeno disuelto, es decir, sin entrada o salida de sustrato y/o de medio de cultivo respectivamente. Las ecuaciones que se refieren a la producción de biomasa o crecimiento celular se enumeran en la sección 2.3 y son las ecuaciones numeradas de 2.9 a la 2.13. Las ecuaciones enumeradas de 2.14 a 2.17 representan al consumo de sustrato; Y las ecuaciones 2.18 a 2.20 representan a la producción de producto.

Tabla 4.4. Parámetros de simulación. Parámetros

Valor

Velocidad específica de crecimiento máxima, max(h-1)

0.5

Rendimiento celular teórico máximo, Yg(gx/gs)

0.5

Rendimiento celular, Yxs(gx/gs)

0.216

Constante de saturación, Ks(gs/l)

0.37

Rendimiento celular de producto, Yps(gp/gs)

0.4

Energía de mantenimiento, m (gs/gxh) Modelo de producción, qp=n+ 

0.226

 gp/gx)

0.6

n (adim)

1 73

 gp/gxh)

0.035

Tabla 4.5. Condiciones de operación. Condiciones de operación Concentración de sustrato de entrada, S0(gs/l)

Valor 40 2

Biomasa inicial, xo(gx/l)

0.11

Producto inicial, po (gp/l)

0.12

16

45

14

40

12

35 30

10

25

8

20

6

Sustrato (g/l)

Biomasa, Producto (g/l)

Volumen de operación, 𝑉0 (l)

15

4

10

2

5

0

0 0

5

10

15

20

25

Tiempo (h) x Experimental p con X logístico

x Monod Sustrato

x logístico s con X logístico

Producto

Figura 4.13 Dinámica del cultivo lote.

4.6.2 Cultivo Continuo En la Tabla 4.6 y 4.7 se observan las condiciones de operación y los parámetros de simulación respectivamente para el cultivo continuo, en el cual se hace un barrido de la velocidad específica de crecimiento (𝜇) por debajo de la velocidad específica de crecimiento máxima (𝜇𝑚𝑎𝑥 ). Para poder controlar y mantener un valor de 𝜇 constante se debe de controlar y mantener constante el flujo de 2 74

bombas peristálticas, una de entrada y otra de salida, el volumen de operación del reactor se mantiene constante. Tabla 4.6 Condiciones de operaciónutilizadas en la simulacióndel cultivo continuo simple etapa. Condiciones de operación Concentración de sustrato de entrada, so(gs/l)

Valor 10

2 Volumen de operación, 𝑉0 (l) Tabla 4.7 Parámetros cinéticos utilizados en la simulacióndel cultivo continuo simple etapa Parámetros

Valor

Velocidad específica de crecimiento máxima, max(h-1)

0.5

Rendimiento celular teórico máximo, Yg(gx/gs)

0.5

Rendimiento celular, Yxs(gx/gs)

0.216

Constante de saturación, Ks(gs/l)

0.37

Rendimiento celular de producto, Yps(gp/gs)

0.4

Energía de mantenimiento, m (gs/gxh) Modelo de producción, qp=n+ 

0.226

 gp/gx)

0.6

n (adim)

1

 gp/gxh)

0.035

En figura 4.14 se observa que variando el flujo y manteniendo éste constante sepuede controlar y mantenerconstante la velocidad específica decrecimiento celular, la cual es independientedel tiempo, en teoría si no hay contaminación, puedemantenerse laoperación indefinidamente. Para alcanzar un estado de equilibrio dinámicoo se deben cumplir 3 tiempos de residencia (tr) los cuales se obtienen con el inverso de la velocidad específica de crecimiento. El tiempo de residencia es el tiempo necesario para el recambio de volumen de operación delreactor. 75

1 1

tr9

0.8

tr8

0.8

0.7

tr7

Flujo, F (l/h)

0.9

0.6

tr6

0.6 0.5

tr5

0.4

tr4

0.4

0.3

tr3 tr2

0.2

0.2

tr1

F 0



0.1 0

Velocidad específica de crecimiento,  (h1)

tr10

Tiempo (h) Figura 4.14.Comportamiento de la velocidad específica de crecimiento, en función del flujo para un tiempo dado.

El la figura 4.15 se muestra la simulación del cultivo continuo simple etapa, en la cual se muestra la producción de biomasa que se mantiene aproximadamente constante. Se puede mencionar que a velocidades específicas de crecimiento bajas la producción de producto y el crecimiento celular tienen su mayor valor.

76

1.0 0.9

2.5

0.8 0.7

2.0

0.6 1.5

0.5 0.4

1.0

Flujo (l/h)

Sustrato, Biomasa, Producto (g/l)

3.0

0.3

0.2

0.5

0.1 0.0

0.0 0.0

0.1 0.2 0.3 0.4 Velocidad específica de crecimiento,  (h-1)

Sustrato, S

Biomasa, x

Producto, P

0.5

Flujo, F

Figura 4.15. Simulación del cultivo continuo simple etapa.

4.6.3 Cultivo lote alimentado 4.6.3.1 Cultivo alimentado exponencial La simulación se llevó a cabo con los parámetros cinéticos y las condiciones de operación que se muestran en las tablas 4.7 y 4.8. La figura 4.16 representa el flujo exponencial que alimentará el biorreactor, el cual depende de las condiciones iniciales en la fermentación, como lo es el volumen inicial, la concentración inicial de biomasa y la concentración de sustrato de entrada.

En la figura 4.16 se muestra como el flujo aumenta exponencialmente con respecto al tiempo y con la ayuda de los modelos matemáticos establecidos por las ecuaciones provenientes del modo de operación de cultivo lote alimentado en el apartado 2.2.2 se puede esperar una producción de biomasa como la que representa la figura 4.17 a manera de simulación. 77

Tabla 4.7. Condiciones de operación. Condiciones de operación Velocidad específica de crecimiento de operación, max(h-1)

Valor 0.05

Biomasa inicial, xo(gx/l)

4.5

Concentración de sustrato de entrada, s0(gs/l)

250

Concentración de sustrato de salida, s (gs/l)

0.01

Producto inicial, p0(gp/l)

4.43

Volumen inicial, V0 (l)

13.9

Volumen final, Vf (l)

17

Tabla 4.8. Parámetros de simulación. Parámetros

Valor

Velocidad específica de crecimiento máxima, max(h-1)

0.5

Rendimiento celular teórico máximo, Yg(gx/gs)

0.5

Rendimiento celular, Yxs(gx/gs)

0.216

Constante de saturación, Ks(gs/l)

0.37

Rendimiento celular de producto, Yps(gp/gs)

0.4

Energía de mantenimiento, m (gs/gxh) Modelo de producción, qp=n+ 

0.226

 gp/gx)

1.4

n (adim)

1

 gp/gxh)

0

78

0.3

0.25

Flujo (l/h)

0.2

0.15

0.1

0.05

0 0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

Tiempo (h)

Figura 4.16. El cultivo alimentado exponencialmente de Klebsiellapneumoniaesp pneumoniaeK63, 𝝁=0.05 h-1. 160 140

Biomasa total (g)

120

A

100 80 60 40

Simulado

20

Experimental

0 0

2

4

6

8 10 Tiempo (h)

12

14

16

18

9 8

Biomasa (g/l)

7

B

6

5 4

3 2

Simulado

1

Experimental

0

0

2

4

6

8 10 Tiempo (h)

12

14

16

18

Figura 4.17. Cultivo alimentado exponencialmente de Klebsiellapneumoniaesp.pneumoniae, 𝝁 =0.05 h-1. A) Evolución de la biomasa total y B) Concentración de biomasa. 79

Se realizaron simulaciones para diferentes velocidades específicas de crecimiento, mostradas en la Figura 4.18, en la cual se observó cómo se incrementa el flujo a altas velocidades específicas de crecimiento alcanzando el volumen final más rápido, lo cual implica una menor duración del proceso. Con respecto a la biomasa tanto la total como la concentración son mayores a altas velocidades específicas de crecimiento. 18

A Volumen (l)

17 16 0.25

15

0.1 0.05

14

0.025 0.01

13

0

5

10

15

20 25 Tiempo (h)

30

35

40

1.2

B

Flujo (l/h)

1.0

0.25 0.1

0.8

0.05 0.025

0.6

0.01

0.4 0.2 0.0

0

5

10

15

20 25 Tiempo (h)

30

35

40

Figura 4.18. Cultivo alimentado creciente de Klebsiellapneumoniaesp.pneumoniae. Evolución del A) Flujo, B) Volumen.

80

4.6.3.2 Cultivo alimentado lineal En la tabla 4.9 y 4.10 se muestran los parámetros y las condiciones de operación utilizados para el cultivo lote alimentado linealmente. La figura 4.19 muestra la evolución del volumen a diferentes flujos constantes, observándose que a flujos bajos el volumen final tarda más en alcanzarse y lo contrario sucede con los flujos altos. Cabe destacar que en este tipo de cultivo las velocidades específicas de crecimiento no son constantes dado que el flujo es constante y el volumen va variando. En la Figura 4.20se observa laconcentración de biomasa simulada, en la cual a flujos altos biomasas mayores y viceversa. Lo mismo pasa con la biomasa global, Figura 4.21. Tabla 4.9 Parámetros cinéticos utilizados en la simulación de cultivo lote alimentado lineal. Parámetros

Valor

Velocidad específica de crecimiento máxima, max(h-1)

0.5

Rendimiento celular teórico máximo, Yg(gx/gs)

0.5

Rendimiento celular, Yxs(gx/gs)

0.216

Constante de saturación, Ks(gs/l)

0.37

Rendimiento celular de producto, Yps(gp/gs)

0.4

Energía de mantenimiento, m (gs/gxh) Modelo de producción, qp=n+ 

0.226

 gp/gx)

1.4

n (adim)

1

 gp/gxh)

0

81

Tabla 4.10 Condiciones de operaciónutilizadas en la simulación de cultivo lote alimentado lineal. Condiciones de operación Biomasa inicial, xo(gx/l)

Valor 4.5

Concentración de sustrato de entrada, s0(gs/l)

250

Concentración de sustrato de salida, s (gs/l)

0.01

Producto inicial, p0(gp/l)

4.43

Volumen inicial, V0 (l)

13.9

Volumen final, Vf (l) 18

17

Volumen (l)

17 16

Flujo (l/h) 15 0.1 0.2 0.4 0.6 0.8

14

13 0

10

20 Tiempo (h)

30

40

Figura 4.19Incremento del volumen a diferentes flujos constantes en biorreactor.

82

Biomasa (g/l)

12 11 10 9 8 7 6 5 4

Flujo (l/h) 0.1 0.2 0.4 0.6 0.8

0

10

20 Tiempo (h)

30

40

Figura 4.20.Evolución de la concentración de biomasa para cultivos lote alimentado lineal.

Biomasa total (g)

200

Flujo (l/h)

175

0.1 0.2 0.4 0.6 0.8

150 125 100 75 50 0

10

20 Tiempo (h)

30

40

Figura 4.21.Evolución de la biomasa total para cultivos lote alimentado lineal.

83

Capítulo sistema

5.

Validación

del

5.1 Mediciones realizadas en línea Las mediciones fueron tomadas en dos partes, unas realizadas con la ayuda de instrumentos comerciales para medir pH y temperatura, y otras con el sistema de adquisición de datos que se realizó en este trabajo. Los instrumentos comerciales con los que se realizó la comparación con el sistema de adquisición de datos son confiables, ya que el fabricante garantiza su correcto funcionamiento. Para tomar dichas mediciones fue necesario lanzar una fermentación que consistió en dos modos de operación; el primero, un cultivo lote, esto para generar un crecimiento celular suficientemente alto para lanzar un segundo modo de operación que es un lote alimentado, esto para garantizar el correcto metabolismo celular respecto al consumo del sustrato de entrada al biorreactor, y averiguar cual era el comportamiento del microorganismo en cuanto su crecimiento. Mientras se realizaba la fermentación se realizaron diferentes medidas en diferentes tiempos, de forma manual y de forma automática, esto con el fin de validar el sistema que 84

se diseño para presentar este trabajo. Una imagen que muestra el lanzamiento de la fermentación, es la que se muestra en la figura 5.1, que muestra el biorreactor y todos los aditamentos que son necesarios para su correcto funcionamiento. Para llevar a cabo la fermentación es necesario seguir pasos estrictos para que esta sea un éxito, lo primero que debe hacerse es esterilizar, tanto el frasco que contendrá al microorganismo, así como los puertos de sensores y puertos de entrada y salida tanto de sustrato, como de sustancia ácida o álcali, y toma de muestra. Posterior a esto se procede a inocular o sembrar al microorganismo que en este caso se trató de Saccharomyces cerevisiae, como se mencionó al principio, la primera etapa de la fermentación es realizar un cultivo lote el cual tuvo un proceso de duración de 18 horas aproximadamente, para después agregar sustrato y el modo de operación sea cultivo lote alimentado.

Figura 5.1. Fermentación con aditamentos para su funcionamiento. 85

5.1.1 Medición de pH Las mediciones de pH se realizaron con un equipo

comercial demarca

Conductronic, y el realizado a lo largo de este trabajo mencionado en la sección 4.1. e implementado en un microcontrolador mbed de 32 bits y la interfaz gráfica Labview, el cual ofrece que los datos sean visualizados en tiempo de procesamiento, almacenados y que se pueden obtener en diferentes formatos como lo es Excel, para su posterior procesamiento y análisis, la figura 5.2 muestra los datos medidos de manera manual y automática, y así validando el sistema ya que muestra que no existe gran diferencia entre dichos datos. 7 6 5 4 pH auto

3

pHmanu

2 1

00:00 00:37 01:20 02:09 02:45 03:12 03:50 04:21 05:04 05:48 06:31 07:10 08:10 09:00 12:51 15:20 20:13 21:51 22:44 23:25

0

Figura 5.2. Comparación de datos de pH, manual y automático. En la figura 5.2 se puede observar que la diferencia entre el valor medido manualmente y el valor medido automáticamente son muy similares, comprobando así la funcionalidad del sistema, También es pertinente mencionar que se puede observa con la misma gráfica, que el metabolismo del microorganismo afecta el pH, esto quiere decir que las secreciones de la célula son ácidas, y esto puede afectar al crecimiento celular. 86

5.1.2 Medición de Temperatura La figura 5.3 muestra la diferencia entre la temperatura medida manualmente y la temperatura medida automáticamente, mostrando así un mínima diferencia entre el sistema comercial de la marca Conducronic. Dicha comparación muestra que el sistema que se realizó en este trabajo es confiable y seguro para la medición a lo largo de una fermentación. Una de las ventajas de este sistema es que la temperatura se adquiere automáticamente, al igual que se hizo con el pH. 32 31 30 29

Temperatura manu Temperatura auto

28 27

00:00 00:46 01:34 02:24 03:07 03:40 04:21 05:08 05:58 06:48 07:53 08:51 12:51 16:20 21:26 22:12 23:12

26

Figura 5.3. Comparación de datos de Temperatura, manual y automático.

5.1.3 Flujo volumétrico La tabla 5.1 muestra el flujo suministrado al biorreactor. Se agregaron 3 flujos volumétricos diferentes, uno diferente cada 2 horas, y en consecuencia se agregaron, 0.2664 litros las primeras dos horas, 0.3528 litros de la hora 2 a la 4 y 0.4384 litros en las últimas dos horas de la fermentación, esto para completar un litro de sustrato de entrada a lo largo del cultivo lote alimentado, el cul en su totalidad duro 6 horas. Durante la operación del reactor cultivo lote alimentado se 87

observaron diferencias significativas en el consumo de oxígeno disuelto, en palabras más precisas, se consumió el sustrato de forma rápida durante la entrada de sustrato, el consumo de oxígeno disuelto es un indicador de que el microorganismo está realizando su metabolismo. Los parámetros de pH y temperatura se mantuvieron sin cambio significativo. Tabla 5.1 Flujos de entrada en el cultivo lote alimentado. Flujo (l/h) Tiempo de aplicación Volumen aplicado al reactor en tiempo (h) de aplicación (l) 0.1332 2 0.2664 0.1764 2 0.3528 0.21924 2 0.4384

La gráfica de la figura 5.4 muestra el consumo de oxígeno disuelto, durante las primeras 21 horas la fermentación corrió en cultivo lote, a partir de la hora 21 se empezó el cultivo lote alimentado, la gráfica muestra como hasta antes de de agregar sustrato limitante al reactor no había consumo de oxígeno, mostrando así que el metabolismo celular se encontraba estancado en cuanto a crecimiento celular, y esto debe observarse en el crecimiento celular, es decir en la producción de biomasa.

5.1.3 Medición de agitación, pH y temperatura simultáneamente. La gráfica de la figura 5.5 muestra el comportamiento de los parámetros de operación en la fermentación, los cuales son, pH, temperatura y agitación, cada uno analizado por separado no ofrece mucha información del comportamiento del sistema el cual es el cultivo celular, sin embargo si se analizan simultáneamente puede obtenerse información del comportamiento del microorganismo, es decir, si se está consumiendo o no el sustrato en base al consumo de oxígeno disuelto, y si el aumento o disminución de pH está afectando el metabolismo celular así como la temperatura. 88

En la gráfica de la figura 5.5 muestra como la temperatura se mantiene en un rango de 28 a 32 ºC durante a fermentación, esto se debe a que el metabolismo celular provoca una reacción exotérmica, es decir, aumenta la temperatura. De igual manera la misma gráfica muestra como el valor de pH, disminuye gradualmente, de una valor de 7 hasta un valor de 2.6 a partir de la hora 15 y después de la hora 25 disminuyó hasta un valor de 2.2. Así mismo se muestra el aumento de las revoluciones, estas aumentan conforme disminuye el oxígeno disuelto, ya que la agitación, mediante el aumento de las revoluciones por minuto de un motor, se favorecen los fenómenos de transferencia de masa en el medio de cultivo, es decir el oxígeno que se encuentra dentro del biorreactor por encima del medio de cultivo, pasa al medio de cultivo y puede ser consumido por el

40

140

35

120

30

100

25

80

20 60

15

40

10 5

20

0

0 0

5

10

15 20 Tiempo (h)

Abs 600 nm

25

Oxpígeno Disuelto, pO2 (%)

Abs 600 nm

microorganismo.

30

pO2 (%)

Figura 5.4. Análisis simutaneo de los parámetros de operación.

89

1000 900 800 700 600 500 400 300 200 100 0

30 25 20 15 10 5 0 0

5

pH

10

15 20 Tiempo (h)

Temperatura (°C)

25

Agitación (rpm)

pH, Temperatura (°C)

35

30

Agitación (rpm)

Figura 5.5. Consumo de oxígeno disuelto en fermentación en modo de operación cultivo lote y cultivo lote alimentado.

90

Capítulo 6. Conclusiones 6.1 Conclusiones 

Se logró una interfaz que permite manipular los parámetros en pantalla.



La interfaz además permite la medición, el almacenamiento y la graficación de los parámetros.



Se construyó una tarjeta para la manipulación de los motores de las bombas peristálticas y del sistema de agitación.



La interfaz permitirá introducir datos metabólicos que se traducirán en el control del modo de operación.



Con el presente trabajo se da una percepción clara del diseño de los controladores y la manera de medir los parámetros que “pueden” conocerse en una fermentación, como lo son el pH, la temperatura y el oxígeno disuelto, además de que se conoció los mecanismos de funcionamiento de los transductores existentes para realizar dicha tarea. Una de las aportaciones importantes de este trabajo es la relación que se hizo con respecto a la parte bioquímica y la parte electrónica, además del tratamiento de las señales eléctricas que surgen por la parte biológica dentro del biorreactor. 91



Se pueden resaltar, la incursión de la instrumentación en el área de los bioprocesos, además de analizar los sistemas de control, ya que tienen gran potencial de aplicación. El sensado de manera automática de los parámetros de aplicación, resaltando su visualización en línea, son de gran interés para el experto en bioprocesos, ya que con esto, puede identificar en el menor tiempo posible alguna anomalía en la fermentación, y de esta manera ocupándose en el menor tiempo posible y corregir el error.



Sin duda la formación de recursos humanos en el área de control de bioprocesos es necesaria para nuestro país ya que existen pocos expertos en esta área.

92

Capítulo 7. Referencias bibliográficas Aiba S., Humphrey A.E., Mills N.F. (1973) Biochemical Engineering. 2nd edition.McGraw Hill, New York. Alford J.S. (2006). Bioprocess control: Advances and challenger. Computer and Chemical Engineering, 30: 1464-1475. Anatychuk L, (1998) Physics of Thermoelectricity. Institute of Thermoelectricity. Asenjo J.A., José C., Merchuk J.C. (2007) Bioreactor system design. Taylor & Francis. Astrom K., Hagglund T. (2000). PID Controllers: Theory, Desing, and Tunning. Second Edition. Atkinson B. (1986) ReactoresBioquímicos. Ed. Reverte. Atkinson B., Mavituna F. (1991) Biochemical Engineering and Biotechnology Handbook. Ed. Stockton press, New Cork. Bailey J.E., Ollis D.F. (1986) Biochemical Engineering Fundamentals. 2nd edition, McGraw Hill, New York. Belter P., Cussler E.L., Wei-Show HU.Bioseparations: Downstream Processing for Biotechnology. Wiley and Sons, USA. Bolton W. (2002) Control Systems. Elsevier Ltd. Chung C.A. (2004) Simulation Modeling Handbook, A Practical Approach. CRC Press LLC, Industrial and Manufacturing engineering series. 93

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